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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-24
(54)【発明の名称】急性骨髄性白血病の治療のためのＷＮＴ５Ａペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20240617BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240617BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240617BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240617BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240617BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20240617BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240617BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20240617BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240617BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20240617BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
A61K38/08
A61K38/10
A61P35/02
A61K45/00
A61K31/7068
A61K31/704
A61K31/407
A61K39/395 T
A61K31/497
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023574195
(86)(22)【出願日】2022-05-03
(85)【翻訳文提出日】2024-01-26
(86)【国際出願番号】 EP2022061843
(87)【国際公開番号】W WO2022253506
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】21177228.0
(32)【優先日】2021-06-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21209291.0
(32)【優先日】2021-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520144543
【氏名又は名称】ウントレサーチ・エービー
(74)【代理人】
【識別番号】110003708
【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所
(72)【発明者】
【氏名】サード、サラ・テレジーニャ
(72)【発明者】
【氏名】ロベルシ、フェルナンダ・マルコーニ
(72)【発明者】
【氏名】ブエノ、マウラ・リマ・ペレイラ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084BA31
4C084CA59
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC752
4C085AA14
4C085CC23
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC48
4C086CB22
4C086EA10
4C086EA17
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB27
4C086ZC75
4H045AA10
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA40
4H045EA20
(57)【要約】
それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。さらに、ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体は、それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するための、少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせてもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体であって、前記ＷＮＴ５Ａペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来し、アミノ酸配列ＸＡＤＧＸＢＥＬ（式中、ＸＡはメチオニン（Ｍ）又はノルロイシンであり、ＸＢはシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）である）（配列番号２）又はそのホルミル化誘導体を含む、ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項2】
前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料が、健康な対象と比較して、ＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路がアップレギュレートされている、請求項１に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項3】
前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料が、健康な対象と比較して、ｐ－ＥＲＫ及び／又はｐ－ＡＫＴのレベルが高い、請求項１又は２に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項4】
前記ペプチドの全長が、５０アミノ酸以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項5】
前記ＷＮＴ５Ａペプチドが、ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）、又はそのホルミル化誘導体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項6】
前記ＷＮＴ５Ａペプチドが、ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項7】
前記ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体が、前記対象に投与され：ａ）急性骨髄性白血病と診断された直後に、前記ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体の有効量を投与することを含み、場合によっては、投与は、週に少なくとも３回、２週間以上繰り返す、請求項１～６のいずれか一項に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項8】
前記ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体が、前記対象に投与され：ａ）急性骨髄性白血病と診断された直後に、前記ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体の有効量を投与することを含み、投与は、毎日、２週間以上繰り返す、請求項１～６のいずれか一項に記載のＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項9】
必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するための、少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体であって、前記ＷＮＴ５Ａペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来し、アミノ酸配列ＸＡＤＧＸＢＥＬ（式中、ＸＡはメチオニン（Ｍ）又はノルロイシンであり、ＸＢはシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）である）（配列番号２）又はそのホルミル化誘導体を含み、前記ペプチド及び前記腫瘍抑制化学療法薬は、組み合わせられているか、若しくは別々であり、及び／又は、同時に、若しくは逐次的に投与される、ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項10】
前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料が、健康な対象と比較して、ＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路がアップレギュレートされている、請求項９に記載の少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項11】
前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料が、健康な対象と比較して、ｐ－ＥＲＫ及び／又はｐ－ＡＫＴのレベルが高い、請求項９又は１０に記載の少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項12】
前記少なくとも１つの化学療法薬が、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミドスタウリン、ゲムツズマブオゾガミシン、ギルテリチニブ及びその組合せから選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項13】
前記ペプチドの全長が、５０アミノ酸以下である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【請求項14】
前記ＷＮＴ５Ａペプチドが、ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）又はそのホルミル化誘導体である、請求項９～１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせたＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体に関する。
【背景技術】
【0002】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、血液及び骨髄のがんである。ＡＭＬは、原始造血幹細胞（ＨＰＣ）又は前駆細胞に由来するクローン増殖によって特徴付けられる障害である。骨髄性細胞の異常分化は、高レベルの未熟悪性細胞並びにより少ない分化した赤血球、血小板及び白血球をもたらす。時には、ＡＭＬ細胞は、体内のどこでも発症しうる骨髄性肉腫又は緑色腫と呼ばれる固形腫瘍を形成しうる。ＡＭＬは、一般に、骨髄不全に起因する徴候を急激に出現し、無治療のままでは数週間又は数か月間以内に死に至る場合もある。疾患は全ての年齢で起こる。
【0003】
急性骨髄性白血病は、急性骨髄白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球性白血病及び急性非リンパ球性白血病としても公知である。
【0004】
ほとんどの型のＡＭＬに対する主な治療は、集中的な、多くの場合多剤化学療法であり、時には標的療法薬物を併用する。幹細胞移植又は輸血を更に行ってもよい。ＡＭＬの治療を経験している患者は、多くの場合、重大な副作用を経験し、ＡＭＬを治療する研究の重要な部分は、治療による副作用を緩和することである。したがって、患者においてＡＭＬを治療するための毒性の低い治療法を開発する必要性が残っている。
【0005】
この背景から、副作用がより少なく、患者による忍容性が高い治療用薬剤を投与することを含む、急性骨髄性白血病の治療に使用するための改善された療法を提供することが本発明の目的である。再発性急性骨髄性白血病の患者の治療を改善することが、本発明のさらなる目的である。
【発明の概要】
【0006】
したがって、本発明の第１の側面は、それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体に関し、ＷＮＴ５Ａペプチドは、ＸＡＤＧＸＢＥＬ（配列番号２）又はそのホルミル化誘導体を含み、ＸＡはメチオニン（Ｍ）又はノルロイシンであり、ＸＢはシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）である。
【0007】
当業者は、急性骨髄性白血病を診断する方法を知っている。患者におけるＡＭＬの診断は、一般、血液又は骨髄の形態学的検査に基づく情報の総合的な評価及びフローサイトメトリーによる血液又は骨髄の評価に基づいて行われる。
【0008】
細胞外シグナルキナーゼ（ＥＲＫ）とも称されるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路及びホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－タンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）シグナル伝達経路は、いずれも複数の細胞事象、例えば細胞生存、増殖、分化、運動及びアポトーシスに関与し、白血病の病因に関係している。ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の異常な活性化が、ＡＭＬの患者において報告されている。ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の異常な活性化は、シグナル伝達経路に関係するタンパク質のリン酸化レベルに基づいて判断できる。そのような２つのタンパク質はＥＲＫタンパク質及びＡＫＴタンパク質であり、リン酸化されたタンパク質であるｐ－ＥＲＫ及びｐ－ＡＫＴと共にフローサイトメトリー及びウエスタンブロッティングを使用してそれぞれ定量的及び半定量的に測定できる。ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に関係する成分の有効な標的化は、例えばＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達カスケードの有効な下方調節により、ＡＭＬ治療に影響を及ぼす可能性があると仮定される。
【0009】
本発明の一態様によると、それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体が提供され、ＷＮＴ５Ａペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａタンパク質に由来し、アミノ酸配列ＸＡＤＧＸＢＥＬ（配列番号２）又はそのホルミル化誘導体を含み、ＸＡはメチオニン（Ｍ）又はノルロイシンであり、ＸＢはシステイン（Ｃ）又はアラニン（Ａ）であり、前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料は、健康な対象と比較して、ＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路がアップレギュレートされている。
【0010】
一態様において、前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料は、健康な対象と比較して、ｐ－ＥＲＫ及び／又はｐ－ＡＫＴのレベルが高い。
【0011】
発明者らは、ＷＮＴ５Ａタンパク質のホルミル化ヘキサペプチド断片であるＦｏｘｙ－５が、ＡＭＬ細胞においてＡＫＴ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化を減少させるのに有効であり、したがってＦｏｘｙ－５が、ＡＭＬの患者においてＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫシグナル伝達経路を下方調節することを驚くべきことに見いだした。
【0012】
本発明では、ＡＭＬ患者は、血液試料及び／又は骨髄試料が、健康な対象と比較して、ＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路がアップレギュレートされている。アップレギュレートされたＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路は、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫシグナル伝達経路の異常な活性化の尺度となる。異常な活性化は、例えば、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路に関係するタンパク質のリン酸化、すなわち活性化の増大として観察される。当業者は、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路に関係するタンパク質のリン酸化を測定する方法を知っているが、そのような２つの方法は、フローサイトメトリー又は半定量的なウエスタンブロットである。
【0013】
ＡＭＬ細胞が、高濃度の活性酸素種（ＲＯＳ）を産生して、成長及び遊走（走化性）を持続し、それにより白血病細胞を拡散させることも公知である。発明者らは、Ｆｏｘｙ－５、すなわちＷＮＴ５Ａタンパク質のホルミル化ヘキサペプチド断片が、ＡＭＬと診断された患者のＡＭＬ細胞においてＲＯＳ産生を効果的に減少させることを見いだした。
【0014】
薬物は大規模に生産されなければならないので、全長ＷＮＴ５Ａタンパク質は、薬物候補としていくつかの短所を示す。大きなタンパク質であるＷＮＴ５Ａタンパク質は、正しい一次アミノ酸配列及び翻訳後修飾を生成するためだけに複雑で長い合成を必要とし、加えてＷＮＴ５Ａは、体内での分布を限定する可能性があるヘパラン硫酸結合ドメインを有する。したがって、ＷＮＴ５Ａの効果を模倣するより小さなペプチドが、より好ましい。
【0015】
一態様において、ＷＮＴ５Ａペプチド又はその誘導体の全長は、５０アミノ酸以下である。
【0016】
アミノ酸配列ＸＤＧＸＥＬを含むＷＮＴ５Ａペプチドは、ＷＮＴ５Ａ模倣効果も含む。配列ＸＤＧＸＥＬ（配列番号２）を含むさまざまな長さのペプチドは、例えば液相又は固相ペプチド合成による合成によって製造してもよい。ペプチドの長さはさまざまで、２０アミノ酸又はより短い、より好ましくは１０アミノ酸又はより短い。最も好ましくは、ペプチドは、６アミノ酸からなるヘキサペプチドである。一態様において、アミノ酸配列は、ＸＤＧＸＥＬであり、１位のＸは、Ｍ又はノルロイシンであり、４位のＸは、Ｃ又はＡである。有利には、本発明によるＷＮＴ５Ａペプチドは：
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるペプチドである。
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）、
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）、
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）、
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）、
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）、
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）、
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）、
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）、
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）、
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）、
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）、
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）、
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）、
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１６）、及び
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１７）
からなる群から選択されるペプチドである。
【0017】
好ましい態様において、ＷＮＴ５Ａペプチドは、ＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）である。より好ましい態様において、１位のメチオニンは、ホルミル化メチオニン（N-ホルミルメチオニン）として誘導体化される。このホルミル化ヘキサペプチドは、Ｆｏｘｙ－５と示される。１アミノ酸の修飾／誘導体化（ホルミル化）が、ペプチドの効果を改善し、より有効でin vivoでの分解に対して抵抗性にする。
【0018】
更に別の態様において、本発明によるペプチドは、それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのものであることが企図され：急性骨髄性白血病と診断された直後に、ペプチドの有効量を投与することを含み、場合によっては、投与は、週に少なくとも３回、２週間以上繰り返す。あるいは、別の態様において、本発明によるペプチドは、それを必要とする対象において急性骨髄性白血病の治療に使用するためのものであり：急性骨髄性白血病と診断された直後に、ペプチドの有効量を投与することを含み、場合によっては、投与は、毎日、２週間以上繰り返す。前記ペプチドによる急性骨髄性白血病の治療の期間は、４、６、８、１２週間若しくは１、２若しくは３か月間まで、又はこれらよりも長くてもよい。
【0019】
前記ペプチドは、化学療法薬による治療期間中に投与してもよい。Ｆｏｘｙ－５は、化学療法の細胞傷害性効果を損なわない。化学療法薬は一般に非常に有毒であり、腫瘍細胞を標的化するのに加えて、健康な細胞も壊す。毒性のため、化学療法薬は、正常細胞に対する有害効果がどのような正の効果にも上回るので、がん細胞又は造血幹細胞の全てを壊す又は除去するのに十分長い間又は十分高い投薬量で投与しなくてもよい。
【0020】
一態様において、少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせた本発明によるペプチドを、対象に投与してもよく、前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料は、健康な対象と比較して、ＭＡＰＫ及び／又はＰＩ３Ｋ経路がアップレギュレートされている。別の態様において、少なくとも１つの化学療法薬又は輸血と組み合わせた本発明によるペプチドを、対象に投与してもよく、前記対象から得た血液試料及び／又は骨髄試料は、健康な対象と比較して、ｐ－ＥＲＫ及び／又はｐ－ＡＫＴのレベルが高い。
【0021】
化学療法薬による治療後に前記ペプチドを投与する優位性は、ペプチドが、健康な細胞に対して非毒性であると同時に、造血幹細胞が抵抗性である化学療法を用いた治療後に残存している造血幹細胞を排除する又は数を減らすことである。
【0022】
化学療法薬及び本発明によるペプチドの投与は、同時であってもよく、又はペプチドが、化学療法が開始されるまで若しくは化学療法治療の結果の後に、骨髄移植の前、途中及び後に投与してもよいことも企図される。
【0023】
したがって、そのような組合せ治療は、副作用を増大させることなくがん治療を改善できる。
【0024】
組合せ投与は、治療が進行中である期間を短縮できるので、患者の服薬順守に有益である。
【0025】
ペプチドは高コストなので、逐次投与、すなわち化学療法薬の前又は後にペプチドを投与することが、経済的な観点からより効率的になる。
【0026】
一態様において、少なくとも１つの化学療法薬は、シタラビン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミドスタウリン、ゲムツズマブオゾガミシン、ギルテリチニブ及びその組合せから選択される。好ましい態様において、化学療法薬は、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＷＮＴ５Ａペプチドのホルミル化誘導体と組み合わせて投与される。
【0027】
適切な化学療法薬の選択は、患者、診断、疾患の増悪によって決まる。
【0028】
本発明は、態様の非限定的な例により、及び図面を参照してより詳細に以下に記述される。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】図１は、急性骨髄白血病患者の骨髄から単離した単核細胞におけるＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現を示す。ＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現は、良好な及び中程度の細胞遺伝学的リスクを有するＡＭＬ患者における発現と比較した場合、有害な細胞遺伝学的リスクを有するＡＭＬ患者の骨髄から単離された単核細胞において減っている。Ohsuデータベース（Nature, 2018）を使用して遺伝子発現を分析し、診断時にＡＭＬである患者３７１名を含めた（Gao et al., 2013；Cerami et al., 2012）。統計分析：Ａｎｏｖａ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図2】図２は、Ｆｏｘｙ－５処置が、白血病細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を減少させることを示す。ＲＯＳの産生は、（Ａ）Ｕ９３７細胞、（Ｂ）ＨＬ６０細胞、（Ｃ）ＫＧ１ａ細胞、及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞の処置後に測定した。白血病細胞は、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ及び１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、ＲＯＳ産生は、ＤＦＣＨＡ（2’,7’-ジクロロフルオレセイン二酢酸）による染色を使用してフローサイトメトリーによって検出された（蛍光強度の平均－ＭＦＩ）。Ｆｏｘｙ－５による処置は、単独培養の白血病細胞においてＲＯＳの産生を減少させた。結果を、二組の実験の平均±標準偏差として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。統計分析：ｔ－スチューデント；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図3】図３は、白血病細胞成長を減少させるＦｏｘｙ－５処置の効果を示す。（Ａ）Ｕ９３７、（Ｂ）ＨＬ６０、（Ｃ）ＫＧ１ａ及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、細胞数を、単独培養における細胞の手作業での計数、又は２次元培養（ＨＳ－５間葉系間質細胞の存在）のImage Jソフトウェア分析で求めた。Ｆｏｘｙ－５による処置は、ビヒクル処置細胞と比較した場合、白血病細胞の成長を減少させた。結果を、倍率変化として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。統計分析：ｔ－スチューデント；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図4】図４は、Ｆｏｘｙ－５による白血病細胞の処置が細胞周期の進行に影響を及ぼすことを示す。（Ａ）Ｕ９３７、（Ｂ）ＨＬ６０、（Ｃ）ＫＧ１ａ及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞を、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ及び１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。その後、細胞周期の時期を、ＲＮＡｓｅ及びヨウ化プロピジウム緩衝液を使用してフローサイトメトリーによって検討した。Ｆｏｘｙ－５処置は、主に２次元培養系において、ビヒクル処置細胞と比較した場合、細胞周期Ｇ０／Ｇ１期の白血病細胞を増大させた。結果を割合（％）として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。統計分析：ｔ－スチューデント；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図5】図５は、Ｆｏｘｙ－５による処置後のタンパク質発現分析（ウエスタンブロット）を示す。（Ａ）Ｕ９３７及び（Ｂ）Ｋ５６２白血病細胞を、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ又は１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、全抽出物を得、ウエスタンブロット分析を行った。Ｆｏｘｙ－５処置がＡＫＴ及びＥＲＫ１／２レベルのリン酸化を減少させたことは、生存に関連するＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の下方調節を示唆した。結果を、二組の実験の平均±標準偏差として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。
【図6】図６は、Ｆｏｘｙ－５処置が、細胞走化性を低下させ、白血病細胞のアクチン重合を減少させることを示す。Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで処置した、（Ａ）Ｕ９３７、（Ｂ）ＨＬ６０、（Ｃ）ＴＨＰ－１及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞における走化性アッセイ。白血病細胞株を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置し、トランスウェルチャンバー内でＣＸＣＬ１２又はウシ胎児血清含有培地（陽性対照）若しくはウシアルブミン培地（陰性対照）に向けて遊走させた。２４時間後、下部チャンバー膜上の遊走した細胞を、フローサイトメトリーによって計数した。Ｆｏｘｙ－５処置は、ＣＸＣＬ１２に向かう白血病細胞の走化性を減少させることができた。 Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで処置した（Ａ）Ｕ９３７、（Ｂ）ＨＬ６０、（Ｃ）ＴＨＰ－１及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞におけるアクチン重合アッセイも、図６に示す。白血病細胞株を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置し、ＣＸＣＬ１２で３０秒間又は１２０秒間刺激した。細胞内Ｆアクチン含有量を、ファロイジン染色を使用してフローサイトメトリーによって測定した（蛍光強度の平均－ＭＦＩ）。データは、ＣＸＣＬ１２による刺激後のＦアクチン含有量の倍増を示す。結果を、倍率変化として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。統計分析：ｔ－スチューデント；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図7】図７は、Ｆｏｘｙ－５による処置が、白血病細胞における自己消化を減少させることを示す。白血病（Ａ）Ｕ９３７、（Ｂ）ＨＬ６０、（Ｃ）ＫＧ１ａ及び（Ｄ）Ｋ５６２細胞を、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ及び１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、自己消化を、アクリジンオレンジ染色によって測定し、フローサイトメトリーによって検出した（蛍光強度の平均－ＭＦＩ）。Ｆｏｘｙ－５処置は、２次元培養系において白血病細胞の自己消化を減少させた。結果を、二組の実験の平均±標準偏差として示し、少なくとも３つの独立した実験の代表例である。統計分析：ｔ－スチューデント；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図8】図８は、Ｆｏｘｙ－５による処置が、異種移植白血病モデルマウスにおいて腫瘍成長を減少させることを示す。（Ａ）Ｆｏｘｙ－５対ビヒクルで処置したマウスの腫瘍体積（ｍｍ３）；（Ｂ）Ｆｏｘｙ－５対ビヒクルで処置したマウスの摘出した腫瘍体積（ｍｍ３）；（Ｃ）Ｆｏｘｙ－５対ビヒクルで処置したマウスの腫瘍重量（ｇ）；及び（Ｄ）Ｆｏｘｙ－５又はビヒクルで処置した異種移植マウスの体重（ｇ）。Ｕ９３７細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの横腹に皮下移植した。少なくとも３匹のマウスが各群に含まれた。Ｕ９３７腫瘍を含むＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、２日に１回、９日間の間Ｆｏｘｙ－５（４０μｇ／μＬ）で処置した又はしなかった。腫瘍体積を、次の式：腫瘍体積（ｍｍ３）１／４（長さ×幅２）／２、に従って２日間ごとに求めた。結果を、平均±標準偏差として示す。統計分析：対応ありスチューデントＴ検定；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0030】
詳細な説明
Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ関連統合部位）タンパク質ファミリーは、胚発生、例えば体軸パターン形成、細胞増殖及び遊走に役割を果たす高度に保存されているタンパク質を含有する。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的又は非古典的のいずれかであり、これらは、細胞において古典的シグナル伝達による遺伝子転写及び増殖の増大の調節又は異なる非古典的シグナル伝達経路の活性化によるいくつかの非増殖機能の調節を主に誘発する。Ｗｎｔタンパク質は、成人の骨髄、皮膚及び腸における組織再生に更に関係する。Ｗｎｔシグナル伝達経路における遺伝的変異は、乳がん、前立腺がん、神経膠芽腫、２型糖尿病及び他の疾患を引き起こす場合がある。
Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ関連統合部位）タンパク質ファミリーは、胚発生、例えば体軸パターン形成、細胞増殖及び遊走に役割を果たす高度に保存されているタンパク質を含有する。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、古典的又は非古典的のいずれかであり、これらは、細胞において古典的シグナル伝達による遺伝子転写及び増殖の増大の調節又は異なる非古典的シグナル伝達経路の活性化によるいくつかの非増殖機能の調節を主に誘発する。Ｗｎｔタンパク質は、成人の骨髄、皮膚及び腸における組織再生に更に関係する。Ｗｎｔシグナル伝達経路における遺伝的変異は、乳がん、前立腺がん、神経膠芽腫、２型糖尿病及び他の疾患を引き起こす場合がある。
【0031】
古典的なＷｎｔ経路は、βカテニンを活性化し、正常な幹細胞の自己複製の調節に不可欠であり、古典的なＷｎｔシグナル伝達の破壊は、腫瘍形成に関わっている。対照的に、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達は、βカテニンシグナル伝達の増大がないことを特徴とし、胚パターン形成、原腸形成及び器官形成におけるその役割について研究されてきた。さらに、非古典的Ｗｎｔは、古典的シグナル伝達と拮抗することが提唱されている。ＷＮＴ５Ａは、非古典的Ｗｎｔリガンドの一例である。ＷＮＴ５Ａは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、大腸がん、乳がん及び前立腺がん並びに卵巣がんにおいて腫瘍抑制性である。Borcherding et al., Paracrine WNT5A signalling inhibits expansion of tumour-initiating cells, Cancer Research 75:1972-1982, 2015による研究において、ＷＮＴ５Ａホモ接合性モデルマウスにおけるＷＮＴ５Ａの過剰発現が、乳ＣＳＣ数の減少と相関することが示されたことは、ＷＮＴ５Ａのヘテロ接合性欠失が、乳がん患者のより短い生存と相関することを示唆している。興味深いことに、原発性悪性黒色腫におけるＷＮＴ５Ａの高発現が、生存期間の短縮と相関するという事実によって示されるように、ＷＮＴ５Ａは、悪性黒色腫、胃がん及び他のいくつかのがん型において反対の効果を有する。
【0032】
ＷＮＴ５Ａは、体内で多くの正常細胞によって発現されるタンパク質である。ＷＮＴ５Ａは、細胞から分泌され、主にＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体に関係する受容体複合体に結合し、活性化することによって同じ又は隣接する細胞でその作用を発揮する。ＷＮＴ５Ａタンパク質が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５と呼ばれる受容体を活性化することは公知である。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５受容体の活性化により、細胞内部の一連のシグナル伝達事象が活性化され、最初の事象のうちの１つは、細胞内部のカルシウムの短時間での増大、いわゆるカルシウムシグナルの生成である。カルシウムシグナルは、細胞の機能、例えば接着及び遊走に変化をもたらす一連のその後のシグナル伝達事象を次々に誘発する。したがって、そのようなＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体の活性化は、細胞内でシグナル伝達事象を引き起こし、その結果隣接する細胞への細胞の付着及び周囲の結合組織への接着が増大し、腫瘍細胞が、周辺構造、例えばリンパ節及び血管へ遊走する能力が低下する。例えば健康な乳上皮細胞においてＷＮＴ５Ａは高発現され、細胞間及び周囲の基底膜への堅固な付着を確実にし、それにより細胞の遊走を制限する。
【0033】
ＷＮＴ５Ａの内在性発現がないがん組織においてＷＮＴ５Ａシグナル伝達を再構成するために、ＷＮＴ５Ａ分子のアミノ酸配列に由来する低分子ペプチド、すなわち２０アミノ酸以下のペプチドが開発され、次いで更に修飾された。そのようなペプチドの例は、Ｆｏｘｙ－５であり、それは、ＷＮＴ５Ａと同じシグナル伝達事象及び機能的応答を誘発し、ＷＮＴ５Ａと比較して非常に単純な分子であり、全身的に投与してもなお腫瘍に達しうるという点で真のＷＮＴ５Ａアゴニストである。したがって、本明細書では用語シグナル伝達特性とは、主にＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体タンパク質（Ｆｚ）に対するＷＮＴ５Ａ又はＦｏｘｙ－５ペプチドの結合と、それに続く最終的にＡＭＬ細胞のモジュレーションに至る細胞における細胞内シグナル伝達カスケードを意味する。
【0034】
本明細書では、用語ＡＭＬ細胞のモジュレーションとは、ＡＭＬ細胞の増殖及び／又は遊走に影響を及ぼすことと理解される。本発明において、増殖は、細胞成長と同じ意味で使用される。
【0035】
本明細書では、用語輸血とは、幹細胞移植及び／又は骨髄移植と理解される。輸血又は幹細胞移植の間、血液幹細胞は、適切なドナーからの新しく、健康な幹細胞で置きかえられることになる。
【0036】
ＡＭＬ細胞系統は、高濃度のＲＯＳを産生することが公知であり（Sillar et al., 2019）、そのＲＯＳは、低酸素環境の確立を可能にし、白血病細胞の成長及び遊走を誘導する決定経路を活性化し、この新生物の進行に寄与する（Perilloら, 2020）。ＲＯＳ産生は、細胞成長、生存、遊走及び腫瘍の進行を持続するＤＮＡ損傷の誘導を刺激する能力によって腫瘍形成性であると考えられている（Liou & Storz, 2010）。ＷＮＴ５Ａ模倣化合物である本発明のＦｏｘｙ－５又はＷＮＴ５Ａペプチドは、白血病と診断された患者においてＲＯＳ産生をモジュレートし、したがってＦｏｘｙ－５を用いるこれら患者の治療は、ＲＯＳ産生の減少を引き起こす。Ｆｏｘｙ－５治療又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドによる治療後のＲＯＳ産生のより低い速度は、白血病誘発を防止するのに有用である。
【0037】
Ｆｏｘｙ－５化合物による治療は、白血病細胞の増殖速度を減少させる。細胞成長は細胞周期と密接に相関しており、Ｆｏｘｙ－５によるその調節及び処置は、Ｇ０／Ｇ１細胞周期停止を引き起こす。サイクリンＤ１は、Ｇ１期からＳ期への転換に必須の調節因子である。Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、Ｆｏｘｙ－５で処置された白血病細胞においてサイクリンＤ１のタンパク質レベルを減少させる。ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の活性は、血液悪性腫瘍において一般に過剰発現され、ＲＯＳ産生及び細胞成長の活性化と直接相関する（Braiacu et al., 2019；Sanches et al., 2019）。Ｆｏｘｙ－５は、Ｆｏｘｙ－５処置後のＡＫＴ及びＥＲＫタンパク質のリン酸化レベルも減少させ、したがってＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路を下方調節する。
【0038】
Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、白血病細胞のＣＸＣＬ１２誘導走化性を防止できる。
【0039】
Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、ＲＯＳ産生の誘導によって白血病細胞の成長を持続するのに必要なプロセスである自己消化プロセスを防止できる。このようにして、Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドによる治療は、骨髄ニッチにおける自己消化の減少を引き起こし、したがって白血病の成長及び維持を破綻させる。
【0040】
Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、この化合物が、ＲＯＳ産生、並びに細胞成長、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の活性化、走化性及び自己消化を下方調節するので、ＡＭＬの進行に関連する生物学的プロセスにおける重要なモジュレート因子である。
【0041】
Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、Ｕ９３７異種移植モデルマウスにおいてin vivoで腫瘍成長を減少させる。これは、ＡＭＬ患者細胞に対するＦｏｘｙ－５の抗増殖性及び抗白血病活性を更に示す。したがって、Ｆｏｘｙ－５又は本発明のＷＮＴ５Ａペプチドは、急性骨髄白血病の治療のための有望な治療用化合物である。
【実施例】
【0042】
ＡＭＬ患者におけるＷＮＴ５Ａ ｍＲＮＡの発現と臨床への影響を調査し、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）患者の細胞に対するＷＮＴ５Ａ模倣化合物であるＦｏｘｙ－５の効果をin vitro（白血病細胞株）及びin vivo（異種移植モデルマウス）で分析する。
【0043】
以下に、実施例１～９で使用した方法を最初に示し、続いて結果を示す。
【0044】
方法
試薬
Ｆｏｘｙ－５（WNT Research）を、ＮａＨＣＯ３（無菌ろ過した１４ｇ／Ｌ）に溶解して終濃度を５０ｍＭとし、次いで培地で希釈して終濃度を１μＭにした。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート（ＰＭＡ；Sigma）をＤＭＳＯで希釈して、１００ｎｇ／μＬのストック溶液を調製した。組換えヒトＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２、PeproTech）を生理食塩緩衝液で希釈して、１００ｎｇ／μＬのストック溶液を調製した。
試薬
Ｆｏｘｙ－５（WNT Research）を、ＮａＨＣＯ３（無菌ろ過した１４ｇ／Ｌ）に溶解して終濃度を５０ｍＭとし、次いで培地で希釈して終濃度を１μＭにした。ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート（ＰＭＡ；Sigma）をＤＭＳＯで希釈して、１００ｎｇ／μＬのストック溶液を調製した。組換えヒトＳＤＦ－１α（ＣＸＣＬ１２、PeproTech）を生理食塩緩衝液で希釈して、１００ｎｇ／μＬのストック溶液を調製した。
【0045】
細胞培養
ヒト骨髄性白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｋ５６２、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ１及びＵ９３７）及びＨＳ－５間葉系間質細胞系統のパネルを、１０％ウシ胎児血清（Gibco）、グルタミン（２ｍＭ；Sigma）、ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ；Sigma）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ；Sigma）及びアムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ；Gibco）を含有するロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ；Sigma）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中に維持し、指数増殖に達したら実験を行った。アッセイのために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、Ｆｏｘｙ－５で７２時間処置し、又は処置しなかった。
ヒト骨髄性白血病細胞株（ＨＬ６０、Ｋ５６２、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ１及びＵ９３７）及びＨＳ－５間葉系間質細胞系統のパネルを、１０％ウシ胎児血清（Gibco）、グルタミン（２ｍＭ；Sigma）、ペニシリン（１００μｇ／ｍＬ；Sigma）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ；Sigma）及びアムホテリシンＢ（０．２５μｇ／ｍＬ；Gibco）を含有するロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ；Sigma）中で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中に維持し、指数増殖に達したら実験を行った。アッセイのために、細胞を２４ウェルプレートに播種し、Ｆｏｘｙ－５で７２時間処置し、又は処置しなかった。
【0046】
活性酸素種（ＲＯＳ）産生
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、細胞内ＲＯＳ生成を、ＤＣＦＤＡ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ；Sigma）による染色後にフローサイトメトリーで測定した。FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を取得し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、細胞内ＲＯＳ生成を、ＤＣＦＤＡ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ；Sigma）による染色後にフローサイトメトリーで測定した。FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を取得し、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
【0047】
自己消化アッセイ
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、酸小胞を、アクリジンオレンジ（０．０１ｍｇ／ｍＬ；Sigma）による染色後にフローサイトメトリーで測定した。FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を取得し、FlowJoソフトウェア４を使用して分析した。
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、酸小胞を、アクリジンオレンジ（０．０１ｍｇ／ｍＬ；Sigma）による染色後にフローサイトメトリーで測定した。FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を取得し、FlowJoソフトウェア４を使用して分析した。
【0048】
細胞成長アッセイ
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、細胞数を、単独培養においては手作業で計数し、２次元培養においてはImage Jソフトウェア分析を用いる顕微鏡検査で求めた。
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、細胞数を、単独培養においては手作業で計数し、２次元培養においてはImage Jソフトウェア分析を用いる顕微鏡検査で求めた。
【0049】
細胞死／アポトーシスアッセイ
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を試験し、細胞死をアネキシンＶ及びＰＩアッセイによって測定した。簡潔に説明すると、細胞を処置した後、洗浄し、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ；Sigma）及びＡＰＣアネキシンＶ（１μｇ／ｍＬ；ＢＤ）で標識した。室温、遮光下で１５分間のインキュベーション後に、FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を、各試料について１００００イベント取得した。FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を試験し、細胞死をアネキシンＶ及びＰＩアッセイによって測定した。簡潔に説明すると、細胞を処置した後、洗浄し、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ；Sigma）及びＡＰＣアネキシンＶ（１μｇ／ｍＬ；ＢＤ）で標識した。室温、遮光下で１５分間のインキュベーション後に、FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で細胞を、各試料について１００００イベント取得した。FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
【0050】
細胞分化アッセイ
ＰＭＡ（２００ｎＭ）の有無における、Ｆｏｘｙ－５又はビヒクルで、細胞を処置した。７２時間後、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、その形態構造をZeiss Axioskope2プラス顕微鏡（Carl Zeiss AG）を使用して検査した。プログラムImageJを使用して、分化を評価した。
ＰＭＡ（２００ｎＭ）の有無における、Ｆｏｘｙ－５又はビヒクルで、細胞を処置した。７２時間後、付着細胞をＰＢＳで洗浄し、その形態構造をZeiss Axioskope2プラス顕微鏡（Carl Zeiss AG）を使用して検査した。プログラムImageJを使用して、分化を評価した。
【0051】
細胞周期アッセイ
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、７０％エタノール中で少なくとも２４時間固定した。ＤＮＡを、ヨウ化プロピジウム（２０μｇ／ｍＬ；Sigma）及びＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／ｍＬ；Sigma）を含有する緩衝液で染色した。細胞蛍光を、FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で検出した。細胞周期の各時期にある細胞の割合を、ＤＮＡ分布に基づき、Modifit（Verify Software House Inc）によって分析した。
Ｆｏｘｙ又はビヒクルで処置した細胞を採集し、７０％エタノール中で少なくとも２４時間固定した。ＤＮＡを、ヨウ化プロピジウム（２０μｇ／ｍＬ；Sigma）及びＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／ｍＬ；Sigma）を含有する緩衝液で染色した。細胞蛍光を、FACScaliburフローサイトメーター（ＢＤ）で検出した。細胞周期の各時期にある細胞の割合を、ＤＮＡ分布に基づき、Modifit（Verify Software House Inc）によって分析した。
【0052】
ウエスタンブロッティング
等量のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）上に転写した。ＥＣＬプラス（GE-Healthcare）を使用して化学発光基質で検出した。Ｐ７０Ｓ６Ｋに対するモノクローナル抗体（ｓｃ－８４１８）、並びにアクチン（ｓｃ－１６１６）、ＡＫＴ１／２／３（ｓｃ－８３１２）、ＢＡＸ（ｓｃ－４９３）、ＢＣＬ－ＸＬ（ｓｃ－８３９２）、ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－３２，２３３）、ｐ－ＡＫＴ１／２／３（ｓｃ－３３，４３７）及びｐ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｓｃ－７９８４）に対するポリクローナル抗体を、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。ＥＲＫ１／２（［ｐＴ１８５／Ｙ１８７］；４４－６８０Ｇ）及びＥＲＫ１／２（４４－６５４Ｇ）を、Invitrogenから購入した。UN-SCAN-IT密度計ソフトウェアを使用して定量的なブロットを行った。
等量のタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）上に転写した。ＥＣＬプラス（GE-Healthcare）を使用して化学発光基質で検出した。Ｐ７０Ｓ６Ｋに対するモノクローナル抗体（ｓｃ－８４１８）、並びにアクチン（ｓｃ－１６１６）、ＡＫＴ１／２／３（ｓｃ－８３１２）、ＢＡＸ（ｓｃ－４９３）、ＢＣＬ－ＸＬ（ｓｃ－８３９２）、ＧＡＰＤＨ（ｓｃ－３２，２３３）、ｐ－ＡＫＴ１／２／３（ｓｃ－３３，４３７）及びｐ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｓｃ－７９８４）に対するポリクローナル抗体を、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。ＥＲＫ１／２（［ｐＴ１８５／Ｙ１８７］；４４－６８０Ｇ）及びＥＲＫ１／２（４４－６５４Ｇ）を、Invitrogenから購入した。UN-SCAN-IT密度計ソフトウェアを使用して定量的なブロットを行った。
【0053】
走化性アッセイ
Ｆｏｘｙ－５で前処置した（７２時間刺激）、又はしなかった白血病細胞株を、走化性のためのトランスウェルに基づくアッセイ（直径６．５ｍｍ、細孔サイズ８μｍ；Corning）において走化性について試験した。ポリカーボネート膜を、ポリ-L-リジン（１ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１時間インキュベートし、続いて生理食塩緩衝液で洗浄した。簡潔に説明すると、細胞を採集し、ウシ血清アルブミン（０．１％ＢＳＡ；Sigma）を有する培地で洗浄し、トランスウェルの上部チャンバー内に密度５×１０５細胞で播種した。下部チャンバーを、０．５％ＢＳＡを有する培地（陰性対照）、１０％ＦＢＳを有する培地（陽性対照）及びＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を含む０．５％ＢＳＡを有する培地５で満たした（Melo et al., 2014）。３７℃で６時間又は２４時間のインキュベーション後、下部チャンバー内に遊走した細胞を採集し、遠心分離し、生理食塩緩衝液中に再懸濁し、計数した。遊走した細胞の数を、投入量、すなわち、並列するウェルにおいて下部区画に直接適用した細胞数の割合（％）として表した。細胞の遊走を、３つ組の１００％±標準偏差（ＳＤ）に標準化した（Favaro et al., 2013）。
Ｆｏｘｙ－５で前処置した（７２時間刺激）、又はしなかった白血病細胞株を、走化性のためのトランスウェルに基づくアッセイ（直径６．５ｍｍ、細孔サイズ８μｍ；Corning）において走化性について試験した。ポリカーボネート膜を、ポリ-L-リジン（１ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で１時間インキュベートし、続いて生理食塩緩衝液で洗浄した。簡潔に説明すると、細胞を採集し、ウシ血清アルブミン（０．１％ＢＳＡ；Sigma）を有する培地で洗浄し、トランスウェルの上部チャンバー内に密度５×１０５細胞で播種した。下部チャンバーを、０．５％ＢＳＡを有する培地（陰性対照）、１０％ＦＢＳを有する培地（陽性対照）及びＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）を含む０．５％ＢＳＡを有する培地５で満たした（Melo et al., 2014）。３７℃で６時間又は２４時間のインキュベーション後、下部チャンバー内に遊走した細胞を採集し、遠心分離し、生理食塩緩衝液中に再懸濁し、計数した。遊走した細胞の数を、投入量、すなわち、並列するウェルにおいて下部区画に直接適用した細胞数の割合（％）として表した。細胞の遊走を、３つ組の１００％±標準偏差（ＳＤ）に標準化した（Favaro et al., 2013）。
【0054】
アクチン重合アッセイ
Ｆ－アクチン重合を、AlexaFluor 633標識ファロイジン（A22284、Invitrogen）を使用して、ＣＸＣＬ１２刺激の前後に、処置した白血病細胞株において分析した。細胞を、無血清培地中のＣＸＣＬ１２（３００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）により３７℃で３０秒間及び１２０秒間刺激した。反応を、パラホルムアルデヒド３容積（３．７％）を室温で１０分間添加することによって停止させ、次いで洗浄し、氷上で透過化処置した。細胞を、６３３ファロイジン（２ｍｇ／ｍＬ）で染色した。フローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析し、続いてFlowJoソフトウェアで分析した。得られたＦ－アクチン含有量を、対照細胞の基礎レベルから、刺激した各細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値と非刺激細胞のＭＦＩの間の比を算出して標準化し、倍率変化として表した。
Ｆ－アクチン重合を、AlexaFluor 633標識ファロイジン（A22284、Invitrogen）を使用して、ＣＸＣＬ１２刺激の前後に、処置した白血病細胞株において分析した。細胞を、無血清培地中のＣＸＣＬ１２（３００ｎｇ／ｍＬ；Peprotech）により３７℃で３０秒間及び１２０秒間刺激した。反応を、パラホルムアルデヒド３容積（３．７％）を室温で１０分間添加することによって停止させ、次いで洗浄し、氷上で透過化処置した。細胞を、６３３ファロイジン（２ｍｇ／ｍＬ）で染色した。フローサイトメトリーデータを、ＦＡＣＳフローサイトメーター（ＢＤ）を使用して分析し、続いてFlowJoソフトウェアで分析した。得られたＦ－アクチン含有量を、対照細胞の基礎レベルから、刺激した各細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値と非刺激細胞のＭＦＩの間の比を算出して標準化し、倍率変化として表した。
【0055】
異種移植モデルマウス
異種移植モデルマウスでは、濃度４０μｇ／μＬのＦｏｘｙ－５を使用した。ブラジルのカンピーナス大学、Animal Facility Centreで、特定病原体未感染条件下で飼育されたThe Jackson Laboratoryの８週齢雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（NOD.CB17Prkdcscid/JUnib）マウスを、使用前に体重を合わせた。マウスを、イソフルラン（４％）で麻酔し、Ｕ９３７細胞（５００００００細胞／マウス）を皮下注入によってマウス背面に接種した。腫瘍が、１００ｍｍ３に達したら、処置を開始した。Ｆｏｘｙ－５を、２日に１回腹腔内注射によって投与した。対照群は、等量のビヒクル溶液を投与した。腫瘍体積を、２日ごとに測定し、式：腫瘍体積（ｍｍ３）１／４（長さ×幅２）／２で求めた。９日後にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出し、腫瘍寸法［腫瘍体積（ｍｍ３）及び腫瘍重量（ｇ）］を求めた。
異種移植モデルマウスでは、濃度４０μｇ／μＬのＦｏｘｙ－５を使用した。ブラジルのカンピーナス大学、Animal Facility Centreで、特定病原体未感染条件下で飼育されたThe Jackson Laboratoryの８週齢雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（NOD.CB17Prkdcscid/JUnib）マウスを、使用前に体重を合わせた。マウスを、イソフルラン（４％）で麻酔し、Ｕ９３７細胞（５００００００細胞／マウス）を皮下注入によってマウス背面に接種した。腫瘍が、１００ｍｍ３に達したら、処置を開始した。Ｆｏｘｙ－５を、２日に１回腹腔内注射によって投与した。対照群は、等量のビヒクル溶液を投与した。腫瘍体積を、２日ごとに測定し、式：腫瘍体積（ｍｍ３）１／４（長さ×幅２）／２で求めた。９日後にマウスを屠殺し、腫瘍を摘出し、腫瘍寸法［腫瘍体積（ｍｍ３）及び腫瘍重量（ｇ）］を求めた。
【0056】
統計分析
統計分析は、GraphPad Prism5ソフトウェアを使用して行った。データを、中央値［最小値～最大値］として表した。比較のために、Ａｎｏｖａ検定又はスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ＜．０５の値を、統計的に有意であると見なした。全ての実験を、独立して少なくとも３回反復した。
統計分析は、GraphPad Prism5ソフトウェアを使用して行った。データを、中央値［最小値～最大値］として表した。比較のために、Ａｎｏｖａ検定又はスチューデントｔ検定を使用した。Ｐ＜．０５の値を、統計的に有意であると見なした。全ての実験を、独立して少なくとも３回反復した。
【0057】
実施例１ 急性骨髄白血病患者の単核細胞におけるＷＮＴ５Ａ遺伝子発現
最初に、診断時にＡＭＬである患者３７１名の骨髄から単離した単核細胞におけるＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現を、Ohsuデータベース（Nature, 2018）を使用して検討した。有害な細胞遺伝学的リスクのあるＡＭＬ患者の試料９４個、良好な細胞遺伝学的リスクのＡＭＬ患者の試料９４個、及び中程度の細胞遺伝学的リスクのＡＭＬ患者の試料１４７個で遺伝子発現を分析した。ＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現は、良好な細胞遺伝学的リスク（平均：１．１４９４、範囲：０．００７７～３．７０１０）及び中程度の細胞遺伝学的リスク（平均：１．２６２、範囲：０．０３１９～８．６９３０）のＡＭＬ患者における発現と比較した場合、有害な細胞遺伝学的リスクのある患者から単離した骨髄単核細胞において減少していた（平均：１．１４４、範囲：０．００９３～５．５１５０）（Ｐ＜０．０５）（図１）。
最初に、診断時にＡＭＬである患者３７１名の骨髄から単離した単核細胞におけるＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現を、Ohsuデータベース（Nature, 2018）を使用して検討した。有害な細胞遺伝学的リスクのあるＡＭＬ患者の試料９４個、良好な細胞遺伝学的リスクのＡＭＬ患者の試料９４個、及び中程度の細胞遺伝学的リスクのＡＭＬ患者の試料１４７個で遺伝子発現を分析した。ＷＮＴ５Ａ遺伝子の発現は、良好な細胞遺伝学的リスク（平均：１．１４９４、範囲：０．００７７～３．７０１０）及び中程度の細胞遺伝学的リスク（平均：１．２６２、範囲：０．０３１９～８．６９３０）のＡＭＬ患者における発現と比較した場合、有害な細胞遺伝学的リスクのある患者から単離した骨髄単核細胞において減少していた（平均：１．１４４、範囲：０．００９３～５．５１５０）（Ｐ＜０．０５）（図１）。
【0058】
Ohsuデータベース（Nature, 2018）を使用して、有害な細胞遺伝学的リスクのあるＡＭＬ患者の骨髄から単離した単核細胞におけるＷＮＴ５Ａ遺伝子発現が、良好な及び中程度の細胞遺伝学的リスクのＡＭＬ患者と比較した場合に、有意に低下していることが検証され、このことは、ＷＮＴ５Ａ発現とＡＭＬ予後の間の相関を示している可能性がある。
【0059】
実施例２ ＷＮＴ５Ａ模倣化合物であるＦｏｘｙ－５による生物学的効果
白血病病態生理学及び疾患の増悪に対するＷＮＴ５Ａの役割を検討するために、WNT Research社が合成したＷＮＴ５Ａタンパク質模倣化合物であるＦｏｘｙ－５を使用した。Ｆｏｘｙ－５の効果を、単独培養、及び不死化した間葉系間質系統であるＨＳ－５を用いる２次元培養において、骨髄性白血病細胞株であるＵ９３７、ＨＬ６０、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ－１及びＫ５６２で分析した。５つの骨髄性白血病細胞株のうち、４つは急性骨髄白血病（Ｕ９３７、ＫＧ１ａ／ＣＤ３４＋、ＨＬ６０、及びＴＨＰ－１）に、１つは慢性骨髄白血病／赤白血病（Ｋ５６２）に由来するものであった。
白血病病態生理学及び疾患の増悪に対するＷＮＴ５Ａの役割を検討するために、WNT Research社が合成したＷＮＴ５Ａタンパク質模倣化合物であるＦｏｘｙ－５を使用した。Ｆｏｘｙ－５の効果を、単独培養、及び不死化した間葉系間質系統であるＨＳ－５を用いる２次元培養において、骨髄性白血病細胞株であるＵ９３７、ＨＬ６０、ＫＧ１ａ、ＴＨＰ－１及びＫ５６２で分析した。５つの骨髄性白血病細胞株のうち、４つは急性骨髄白血病（Ｕ９３７、ＫＧ１ａ／ＣＤ３４＋、ＨＬ６０、及びＴＨＰ－１）に、１つは慢性骨髄白血病／赤白血病（Ｋ５６２）に由来するものであった。
【0060】
Ｗｎｔ５ａタンパク質の下方調節は、ＡＭＬを含めた広範ながんにおいて上昇することが示されているＲＯＳ生成を媒介するので、Ｆｏｘｙ－５が、白血病細胞においてＲＯＳ産生をモジュレートできるかどうか単独培養アッセイにおいて最初に調査した。白血病細胞株を、用量５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５又はビヒクルで７２時間処置し、ＤＣＦＨＡ色素で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、ＲＯＳ産生（平均蛍光強度［ＭＦＩ］）の有意な減少を示した：それぞれ、Ｕ９３７細胞、７．３２（４．８０～８．６７）及び７．０９（４．７０～８．４０）対１３．７０（９．００～１６．２３）、ＨＬ６０細胞、１７．４５（１６．４０～１９．３０）及び１０．３２（１０．１０～１０．８０）対１９．５０（１９．２４～２０．７４）、ＫＧ１ａ細胞、３６．３０（３５．８０～３６．８０）及び２９．７２（２８．１０～３１．３３）対４２．０３（４０．５５～４３．５０）、並びにＫ５６２細胞、８３．９０（７５．８０～８８．４０）及び６８．７５（６４．４０～７２．７５）対８４．６５（７９．５０～８９．８０）（Ｐ＜０．０５）（図２）。
【0061】
加えて、骨髄性白血病細胞を、単層の間葉系間質細胞（ＨＳ５）上に播種し、用量５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５化合物又はビヒクルで７２時間処置した。これら２次元培養でも、ＲＯＳ産生（ＭＦＩ）の有意な低下が観察された：それぞれ、Ｕ９３７細胞、２０．９０（１９．９０～２２．６３）及び２３．５０（２１．７０～２３．８０）対２３．２０（２２．００～２３．８０）、ＨＬ６０細胞、２８．５２（２６．３７～３０．００）及び２８．５０（２５．０３～３０．３０）対３３．５０（３０．９７～３５．２０）、ＫＧ１ａ細胞、７５．０３（７５．０３～７７．７０）及び６９．００（６８．００～７２．００）対８７．００（８５．８０～８７．２０）並びにＫ５６２細胞、１２６．００（１２５．０００～１２８．２０）及び９８．２５（９８．２５～１０４．００）対１２９．８０（１２５．００～１２９．８０）（Ｐ＜０．０５）（図２）。
【0062】
単独培養及び２次元培養アッセイに基づいて、Ｆｏｘｙ－５が、白血病細胞においてＲＯＳ産生を減少させるのに有効であることが結論された。
【0063】
実施例３ Ｆｏｘｙ－５による処置は、白血病細胞成長を減少させる
次に、増殖プロセスはＲＯＳによってモジュレートされるので、増殖速度を測定した。細胞をＦｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で７２時間処置し、次いで細胞成長を、単独培養では細胞を手作業で計数することによって、又は２次元培養のImage Jソフトウェア分析によって分析した。単独培養系において、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）による処置は、ビヒクル処置細胞と比較した場合、Ｕ９３７細胞（１／１．７５に減少）、ＨＬ６０細胞（１／１．２２に減少）、ＫＧ１ａ細胞（１／１．３７に減少）及びＫ５６２細胞（１／３．１２に減少）の細胞成長を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）（図３）。類似の結果が、白血病細胞とＨＳ－５間葉系間質細胞を使用する２次元培養系において得られた。Ｆｏｘｙ－５は、ビヒクル処置細胞と比較した場合、Ｕ９３７細胞（１／１．７２に減少）、ＨＬ６０細胞（１／１．５６に減少）、ＫＧ１ａ細胞（１／２．６３に減少）及びＫ５６２細胞（１／１．７９に減少）の細胞成長を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）（図３）。
次に、増殖プロセスはＲＯＳによってモジュレートされるので、増殖速度を測定した。細胞をＦｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）で７２時間処置し、次いで細胞成長を、単独培養では細胞を手作業で計数することによって、又は２次元培養のImage Jソフトウェア分析によって分析した。単独培養系において、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）による処置は、ビヒクル処置細胞と比較した場合、Ｕ９３７細胞（１／１．７５に減少）、ＨＬ６０細胞（１／１．２２に減少）、ＫＧ１ａ細胞（１／１．３７に減少）及びＫ５６２細胞（１／３．１２に減少）の細胞成長を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）（図３）。類似の結果が、白血病細胞とＨＳ－５間葉系間質細胞を使用する２次元培養系において得られた。Ｆｏｘｙ－５は、ビヒクル処置細胞と比較した場合、Ｕ９３７細胞（１／１．７２に減少）、ＨＬ６０細胞（１／１．５６に減少）、ＫＧ１ａ細胞（１／２．６３に減少）及びＫ５６２細胞（１／１．７９に減少）の細胞成長を有意に減少させた（Ｐ＜０．００１）（図３）。
【0064】
単独培養及び２次元培養アッセイに基づいて、Ｆｏｘｙ－５が、白血病細胞の細胞増殖を減少させるのに有効であることが結論された。
【0065】
実施例４ Ｆｏｘｙ－５処置は、白血病細胞の細胞周期のＧ０／Ｇ１期における停止を誘導する
Ｆｏｘｙ－５処置後に白血病の増殖の減少を観察したので、細胞周期の時期も分析した。白血病細胞株を、用量５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５又はビヒクルで７２時間処置し、ＲＮＡｓｅ及びヨウ化プロピジウムを含有するパイパー緩衝液で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
Ｆｏｘｙ－５処置後に白血病の増殖の減少を観察したので、細胞周期の時期も分析した。白血病細胞株を、用量５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５又はビヒクルで７２時間処置し、ＲＮＡｓｅ及びヨウ化プロピジウムを含有するパイパー緩衝液で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【0066】
単独培養では、結果は、Ｕ９３７細胞：平均５５．０７％（５４．５２～５５．６２％）及び平均５６．６４％（５６．１７～５７．１０％）対平均５１．６６％（５１．４１～５１．７０％、ＨＬ６０細胞：平均５１．５７％（５１．５６～５１．５８％）及び平均５３．０２％（５３．０１～５３．０３％）対平均４７．３１％（４７．３０～４７．３２％）、ＫＧ１ａ細胞：平均６９．９５％（６９．６９～７０．２０％）及び平均７３．７９％（７２．３２～７５．２６％）対平均６５．０２％（６４．１９～６５．８５％）、Ｋ５６２細胞：平均５９．００％（５９．００～５９．６２％）及び平均８３．５１％（８３．５０～８３．５２％）対平均５９．４０％（５８．８１～５９．５０％）で、有意なＧ０／Ｇ１細胞周期停止が明らかとなった（Ｐ＜０．００１）（図４）。
【0067】
同様に、骨髄性白血病細胞を、ＨＳ５間葉系間質細胞と共培養し、用量５０及び１００μＭのＦｏｘｙ－５又はビヒクルで７２時間処置した場合も、フローサイトメトリー分析は、Ｕ９３７細胞：平均７７．３７％（７７．３７～８１．７５％）及び平均９１．５２％（９０．９３～９３．９２％）対平均７４．８８％（７２．２３～７７．５２％）、ＨＬ６０細胞：平均５３．４７％（５３．４７～５４．００％）及び平均７０．６８％（６６．３３～７５．０３％）対平均４７．３１％（４７．３０～４７．３２％）、ＫＧ１ａ細胞：平均７８．５８％（７８．２３～７９．３７％）及び平均７６．５３％（７５．０５～８７．３８％）対平均７２．７２％（７２．３８～７４．４５％）、Ｋ５６２細胞：平均６５．３２％（６０．３０～６３．３２％）及び平均８３．５２％（８３．５０～８３．５２％）対平均５９．１２％（５９．１２～５９．１８％）のように、共培養したＨＳ－５細胞における有意なＧ０／Ｇ１細胞周期停止を明らかにした（Ｐ＜０．００１）（図４）。
【0068】
したがって、Ｆｏｘｙ－５化合物による白血病細胞の処置は、Ｇ０／Ｇ１細胞停止を誘導し、細胞がＳ期に入ることを防ぎ、このことが細胞増殖の減少と関連している可能性がある。
【0069】
実施例５ Ｆｏｘｙ－５処置は、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を下方調節する
これまでの結果に基づいて、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路のタンパク質の活性を、ウエスタンブロットにおいて調査した。簡潔に説明すると、Ｕ９３７及びＫ５６２細胞を播種し、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ又は１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、等量のタンパク質を、全抽出物に使用し、続いて還元条件下で１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ－０．１％Tween（登録商標）中の１０％スキムミルクで１時間ブロッキングし、適切な一次及び二次抗体を用いて染色した。膜を、ＥＣＬプラス（GE-Healthcare）を使用して化学発光で可視化した。タンパク質バンドの光学強度の定量分析を、Un-Scan-It Gel 6.1（Silk Scientific Inc.）で決定した。
これまでの結果に基づいて、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路のタンパク質の活性を、ウエスタンブロットにおいて調査した。簡潔に説明すると、Ｕ９３７及びＫ５６２細胞を播種し、Ｆｏｘｙ－５（５０μＭ又は１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置した。次いで、等量のタンパク質を、全抽出物に使用し、続いて還元条件下で１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写し、ＴＢＳ－０．１％Tween（登録商標）中の１０％スキムミルクで１時間ブロッキングし、適切な一次及び二次抗体を用いて染色した。膜を、ＥＣＬプラス（GE-Healthcare）を使用して化学発光で可視化した。タンパク質バンドの光学強度の定量分析を、Un-Scan-It Gel 6.1（Silk Scientific Inc.）で決定した。
【0070】
タンパク質発現分析により、ビヒクル処置細胞と比較して、Ｆｏｘｙ－５で処置したＵ９３７及びＫ５６２細胞においてＡＫＴ及びＥＲＫのリン酸化レベルがより低いことが実証され、したがって、生存に関連するＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路の下方調節が示唆された（図５）。
【0071】
加えて、ビヒクル処置細胞と比較して、Ｆｏｘｙ－５で処置したＵ９３７及びＫ５６２細胞においてサイクリンＤ１のみタンパク質レベルの減少が観察された。Ｇ１期からＳ期への転換に必須の調節因子であるサイクリンＤ１タンパク質レベルの減衰、その結果の、細胞周期の進行の減衰は、Ｆｏｘｙ－５処置後の細胞周期停止の結果を補強する（図５）。
【0072】
結論として、Ｆｏｘｙ－５は、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達経路を下方調節するのに有効である。
【0073】
実施例６ Ｆｏｘｙ－５は、ＣＸＣＬ１２刺激に対する走化性応答性及びアクチン重合を減少させる
ＷＮＴ５Ａの回復が、白血病細胞のＣＸＣＬ１２誘導走化性をモジュレーションできる可能性があるか調査した。白血病細胞を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間前処置し、次いで、ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍＬ）刺激の有無でのトランスウェルに基づく遊走アッセイを２４時間行った。ＫＧ１ａ細胞はＳＤＦ－１受容体（ＣＸＣＲ－４）を発現しないので、ＳＤＦ－１は、ＫＧ１ａ細胞の遊走を誘導しなかった。ＣＤ３４陰性細胞で遊走アッセイを実行したが、ＣＸＣＲ－４陽性白血病細胞株ＴＨＰ－１では実行しなかった。Ｆｏｘｙ－５処置は、ビヒクルと比較してＣＸＣＬ１２誘導走化性の減少をもたらした：Ｕ９３７細胞では平均４０．３５％（３３．３０～４５．８０％）対平均５６．００％（４８．７０～６７．８０％）；ＨＬ６０細胞では平均４．３１％（２．８１～５．８２％）対平均７．５１％（７．４５～７．５７％）；Ｋ５６２細胞では平均１．５２％（１．１０～２．０４％）対平均２．７７％（２．４１～３．５３％）、ＴＨＰ１細胞では平均１１．１７％（１０．６８～１１．６５％）対平均５６．６７％（５０．００～６３．３３％）（Ｐ＜．０１）（図６）。
ＷＮＴ５Ａの回復が、白血病細胞のＣＸＣＬ１２誘導走化性をモジュレーションできる可能性があるか調査した。白血病細胞を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間前処置し、次いで、ＣＸＣＬ１２（１００ｎｇ／ｍＬ）刺激の有無でのトランスウェルに基づく遊走アッセイを２４時間行った。ＫＧ１ａ細胞はＳＤＦ－１受容体（ＣＸＣＲ－４）を発現しないので、ＳＤＦ－１は、ＫＧ１ａ細胞の遊走を誘導しなかった。ＣＤ３４陰性細胞で遊走アッセイを実行したが、ＣＸＣＲ－４陽性白血病細胞株ＴＨＰ－１では実行しなかった。Ｆｏｘｙ－５処置は、ビヒクルと比較してＣＸＣＬ１２誘導走化性の減少をもたらした：Ｕ９３７細胞では平均４０．３５％（３３．３０～４５．８０％）対平均５６．００％（４８．７０～６７．８０％）；ＨＬ６０細胞では平均４．３１％（２．８１～５．８２％）対平均７．５１％（７．４５～７．５７％）；Ｋ５６２細胞では平均１．５２％（１．１０～２．０４％）対平均２．７７％（２．４１～３．５３％）、ＴＨＰ１細胞では平均１１．１７％（１０．６８～１１．６５％）対平均５６．６７％（５０．００～６３．３３％）（Ｐ＜．０１）（図６）。
【0074】
したがって、フローサイトメトリー分析を実行して、Ｆｏｘｙ－５処置が、アクチン重合を破綻させうるかどうかを検討した。白血病細胞株を、Ｆｏｘｙ－５（１００μＭ）又はビヒクルで７２時間処置し、ＣＸＣＬ１２（３００ｎｇ／ｍＬ）で３０秒間又は１２０秒間刺激し、フローサイトメトリーによってアクチン重合を検出するために抗ファロイジン抗体で染色した。全ての白血病細胞株において、ビヒクル処置細胞のＣＸＣＬ１２刺激（３０秒間）は、Ｆｏｘｙ刺激した細胞と比較して、球状アクチンのＦ－アクチンへのより顕著な転換を誘導した：Ｕ９３７細胞（４．３８及び３．０３倍の増大）、ＨＬ６０細胞（２．３４及び１．１４倍の増大）、Ｋ５６２細胞（１．８０及び１．３７倍の増大）及びＴＨＰ１細胞（４．６０及び３．５６倍の増大）。特に、ビヒクル処置細胞は、ＣＸＣＬ１２刺激の１２０秒後でも、Ｆｏｘｙ刺激した細胞と比較して同量のＦ－アクチンを維持した：Ｕ９３７細胞（１．５２及び１．２６倍）、ＨＬ６０細胞（１．５０及び１．０７倍の増大）、Ｋ５６２細胞（１．５３及び１．３１倍の増大）及びＴＨＰ１細胞（１．９１及び１．５９倍）（図６）。したがって、３０秒間のＣＸＣＬ１２誘導後の無処置細胞と比較した場合、Ｆｏｘｙ－５処置後にアクチン重合の有意な減少が示された（Ｐ＜．００１）。
【0075】
結論として、Ｆｏｘｙ－５は、白血病細胞におけるアクチン重合及び走化性を減少させるのに有効である。
【0076】
実施例７ Ｆｏｘｙ－５による処置は、白血病細胞における自己消化を減少させる
自己消化は、ＲＯＳ産生の誘導によって白血病細胞の成長を持続するのに必要なので、Ｆｏｘｙ－５又はビヒクル処置後にフローサイトメトリーによって酸性顆粒形成のレベルを測定した。２次元培養において、５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５化合物又はビヒクルによる７２時間の処置は、Ｕ９３７細胞［平均９．４０（７．６８～１１．００）及び平均６．３０（４．８０～８．３１）対平均９．８４（７．４０～１０．６０）］、ＨＬ６０細胞［平均１０．０４（７．２０～１１．９３）及び平均６．６０（５．４２～６．６９）対平均１０．３０（８．３２～１０．４０）］、ＫＧ１ａ細胞［平均２７．３０（２７．２０～２９．８３）及び平均２１．５５（１９．０５～２２．４０）対平均２９．４０（２９．３０～３３．８５）］、及びＫ５６２細胞［平均２１．３２（２０．４６～２２．２８）及び平均１９．８０（１９．７０～２０．４０）対平均２２．２０（２１．３０～２３．２０）］において自己消化をそれぞれ減少させた（全てＰ＜０．０５）（図７）。
自己消化は、ＲＯＳ産生の誘導によって白血病細胞の成長を持続するのに必要なので、Ｆｏｘｙ－５又はビヒクル処置後にフローサイトメトリーによって酸性顆粒形成のレベルを測定した。２次元培養において、５０μＭ及び１００μＭのＦｏｘｙ－５化合物又はビヒクルによる７２時間の処置は、Ｕ９３７細胞［平均９．４０（７．６８～１１．００）及び平均６．３０（４．８０～８．３１）対平均９．８４（７．４０～１０．６０）］、ＨＬ６０細胞［平均１０．０４（７．２０～１１．９３）及び平均６．６０（５．４２～６．６９）対平均１０．３０（８．３２～１０．４０）］、ＫＧ１ａ細胞［平均２７．３０（２７．２０～２９．８３）及び平均２１．５５（１９．０５～２２．４０）対平均２９．４０（２９．３０～３３．８５）］、及びＫ５６２細胞［平均２１．３２（２０．４６～２２．２８）及び平均１９．８０（１９．７０～２０．４０）対平均２２．２０（２１．３０～２３．２０）］において自己消化をそれぞれ減少させた（全てＰ＜０．０５）（図７）。
【0077】
したがって、Ｆｏｘｙ－５治療後の骨髄ニッチにおける自己消化の減少は、白血病の成長及び維持の破綻を引き起こす。
【0078】
実施例８ Ｆｏｘｙ－５処置は細胞分化を損なう
ＰＭＡ試薬は、ＲＯＳの生成によるＡＭＬ細胞分化の代表的な誘導物質である。Ｕ９３７白血病細胞系統は、ＰＭＡによる処置後の分化した単球及び／又はマクロファージのモデルに相当するので、Ｕ９３７分化を誘導するＰＭＡに対するＦｏｘｙ－５処置の効果を検討した。ＰＭＡによる７２時間の処置後、細胞を顕微鏡で検査し、形態構造を検出した。ビヒクルで処置し、ＰＭＡで刺激した細胞の大多数は、マクロファージに分化し、プレートに付着した。Ｆｏｘｙ－５によるＵ９３７細胞の処置は、ビヒクルで処置したＰＭＡ刺激細胞と比較した場合、ＰＭＡ媒介分化を減少させた。
ＰＭＡ試薬は、ＲＯＳの生成によるＡＭＬ細胞分化の代表的な誘導物質である。Ｕ９３７白血病細胞系統は、ＰＭＡによる処置後の分化した単球及び／又はマクロファージのモデルに相当するので、Ｕ９３７分化を誘導するＰＭＡに対するＦｏｘｙ－５処置の効果を検討した。ＰＭＡによる７２時間の処置後、細胞を顕微鏡で検査し、形態構造を検出した。ビヒクルで処置し、ＰＭＡで刺激した細胞の大多数は、マクロファージに分化し、プレートに付着した。Ｆｏｘｙ－５によるＵ９３７細胞の処置は、ビヒクルで処置したＰＭＡ刺激細胞と比較した場合、ＰＭＡ媒介分化を減少させた。
【0079】
Ｆｏｘｙ－５で処置したＵ９３７細胞は、ＰＭＡ誘導性分化に対する応答性が低いと結論された。
【0080】
実施例９ Ｆｏｘｙ－５は、Ｕ９３７異種移植モデルマウスにおいて腫瘍成長を減少させる
本研究の目的は、異種移植モデルマウスをin vivoで使用して、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）患者細胞に対するＷＮＴ５Ａ模倣化合物であるＦｏｘｙ－５の効果を調査することであった。
本研究の目的は、異種移植モデルマウスをin vivoで使用して、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）患者細胞に対するＷＮＴ５Ａ模倣化合物であるＦｏｘｙ－５の効果を調査することであった。
【0081】
Ｆｏｘｙ－５が、Ｕ９３７細胞株を含めた白血病細胞の増殖速度を減少させることが、in vitroで示されてきた。in vivoでのＦｏｘｙの役割を検討するために、Ｕ９３７白血病細胞がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの横腹に接種した異種移植モデルマウスを開発した。腫瘍の生着及び成長後、Ｆｏｘｙ－５を、２日に１回腹腔内注射によって投与した。Ｆｏｘｙ－５で処置した異種移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、ビヒクルで処置した対照群（中央値：１０５３ｍｍ３、範囲：１００６～１１７２ｍｍ３）と比較して、腫瘍体積の有意な低下（中央値：４６９ｍｍ３、範囲：４１１～８５９ｍｍ３）を示した、図８を参照。４０μｇ／μＬのＦｏｘｙ－５によるマウス処置は、９日目に対照群と比較した場合、Ｕ９３７異種移植片の腫瘍成長を５５．４６％阻害し（図８Ａ及び図８Ｂを参照）、腫瘍重量を４５．５１％阻害した（図８Ｃを参照）。異種移植マウスの体重は、９日後に処置群間で有意な変動がなかった、図８Ｄを参照。
【0082】
結論として、Ｕ９３７異種移植モデルマウスを使用するin vivo研究に基づくと、Ｆｏｘｙ－５による処置が、ビヒクルで処置した対照群と比較して腫瘍体積の減少をもたらすことが示され、したがって、ＡＭＬ患者細胞に対するＦｏｘｙ－５の抗増殖性及び抗白血病活性が示された。したがって、Ｆｏｘｙ－５は、急性骨髄白血病の治療のための有望な治療用化合物である。
【0083】
参考文献
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【図1】
【図2A-2B】
【図2C-2D】
【図3A-3B】
【図3C-3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】