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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-25
(54)【発明の名称】新規なレプリカーゼサイクリング反応（ＲＣＲ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240618BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240618BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240618BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240618BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240618BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240618BHJP
A61K 39/29 20060101ALI20240618BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240618BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240618BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240618BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240618BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240618BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20240618BHJP
C12N 15/51 20060101ALN20240618BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12N15/88 Z
A61K39/00 H
A61K39/215
A61K39/29
A61K31/7105
A61K48/00
A61P35/00
A61P31/12
A61P37/04
C12N15/50
C12N15/51
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023575381
(86)(22)【出願日】2022-01-21
(85)【翻訳文提出日】2023-12-06
(86)【国際出願番号】 US2022013350
(87)【国際公開番号】W WO2022260718
(87)【国際公開日】2022-12-15
(31)【優先権主張番号】63/209,969
(32)【優先日】2021-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/210,988
(32)【優先日】2021-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/212,657
(32)【優先日】2021-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/222,398
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/489,357
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/270,034
(32)【優先日】2021-10-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/280,226
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522115192
【氏名又は名称】シー‐ラン リン
(71)【出願人】
【識別番号】522115206
【氏名又は名称】サム‐リン
(74)【代理人】
【識別番号】100087398
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 勝文
(74)【代理人】
【識別番号】100128783
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 真
(74)【代理人】
【識別番号】100128473
【弁理士】
【氏名又は名称】須澤 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100160886
【弁理士】
【氏名又は名称】久松 洋輔
(74)【代理人】
【識別番号】100192603
【弁理士】
【氏名又は名称】網盛 俊
(72)【発明者】
【氏名】シー‐ラン リン
(72)【発明者】
【氏名】サム‐リン
(72)【発明者】
【氏名】チュン‐ハン リン
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ52
4B063QQ53
4B063QR35
4B063QR36
4B063QS25
4B063QS40
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085BA71
4C085BA87
4C085CC08
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZB33
(57)【要約】
本発明は、概して、ウイルスＲＮＡレプリカーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）酵素ならびにそれらに関連するｍＲＮＡを用いる新規なＲＮＡ／ｍＲＮＡの製造および増幅方法に関する。本発明は、５’末端もしくは３’末端、またはその両方に少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を有するあらゆる種類のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の製造および増幅に用いることができる。このようにして得られたＲＮＡ／ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡワクチンおよび／またはＲＮＡベースの医薬を製造するだけでなく、ｉｎ－ｖｉｔｒｏおよびｉｎ－ｃｅｌｌにおける翻訳条件で、ｍＲＮＡ関連タンパク質、ペプチド、および／または抗体を生成するのにも有用である。主に、本発明は、新規なＲＮＡレプリカーゼを介したＲＮＡ／ｍＲＮＡ増幅法、すなわちレプリカーゼサイクリング反応（ＲＣＲ）である。ＲＣＲに関与するＲＮＡレプリカーゼとしては、ウイルスおよび／またはバクテリオファージのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、特にコロナウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲｄＲｐ酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）５’末端または３’末端のＲｄＲｐ結合部位の少なくともいずれか一方、若しくはその両方を含む少なくとも一つのＲＮＡ配列を提供し、（ｂ）コロナウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）から単離または改変された少なくとも一つのＲＮＡレプリカーゼを提供し、
（ｃ）ＲＮＡレプリカーゼを介在した前記ＲＮＡ配列の製造および増幅が生じるように、（ａ）のＲＮＡ配列と（ｂ）のＲＮＡレプリカーゼをバッファー条件下で混合する、ことを含み、
前記バッファー条件は、ＲＮＡ合成に必要なリボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰｓ）を含み、ｐＨが６．０～８．０の範囲であり、温度が２０℃～４５℃の範囲である、
ＲＮＡレプリカーゼを介した新規なＲＮＡ増幅方法。
【請求項2】
前記ＲＮＡ配列は、一本以上の鎖構造または１種類のＲＮＡ種を含むことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記５’末端のＲｄＲｐ結合部位は、配列番号１又は配列番号２の一方の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記５’末端のＲｄＲｐ結合部位は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６、若しくはそれらの組み合わせを含む配列から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記３’末端のＲｄＲｐ結合部位は、配列番号７又は配列番号８の一方の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記３’末端のＲｄＲｐ結合部位は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２、若しくはそれらの組み合わせを含む配列から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記出発ＲＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼとＲｄＲｐ／ヘリカーゼの混合活性を用いる新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写（ＰＣＲ－ＩＶＴ）法を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲｄＲｐのｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼとＲｄＲｐ／ヘリカーゼの混合活性を用いる新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写（ＰＣＲ－ＩＶＴ）法を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記バッファー条件は、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、または３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、若しくはそれらの組み合わせを任意に添加した１ｘ転写バッファーである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記リボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰｓ）は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記リボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰｓ）は、シュードウリジンまたは他の修飾ヌクレオチド類似体をさらに含むことができる、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ＲＮＡ配列のウリジン／ウラシル（Ｕ）成分は、シュードウリジンまたは他の修飾ヌクレオチド類似体で置換することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＲＮＡ配列は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）および／またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での細胞内トランスフェクションを促進するための少なくとも一つの送達剤とともにさらに製剤化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記送達剤は、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子（ＬＮＰ）、コンジュゲート分子、輸液用化学物質、遺伝子銃材料、エレクトロポレーション剤、トランスポゾン、およびそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記ＲＮＡ配列がｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ｍＲＮＡがｍＲＮＡワクチン及び医薬を生産及び開発するために有用である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ｍＲＮＡがタンパク質／ペプチドおよび抗体を生産するために有用である、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
前記ＲＮＡ配列がマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが抗がん剤を生産及び開発するために有用である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡがｉＰＳ細胞の生成に有用である、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記ＲＮＡ配列が医薬または治療の成分として使用される、請求項１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照：
本発明は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２０９，９６９号の優先権を主張する。また、本発明は、いずれも、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，９８８号、２０２１年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，６５７号、および２０２１年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，３９８号の優先権を主張する。さらに、本発明は、ともに「ｉＰＳ細胞作製における使用のための新規なＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」を発明の名称とする、２０２１年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，０３４号、および２０２１年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２８０，２２６号の優先権を主張する。さらに、本発明は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年９月２９日に出願された米国特許出願第１７／４８９，３５７号の優先権を主張する。本出願は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年９月２９日に出願された米国特許出願第１７／４８９，３５７号の一部継続出願である。各出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２０９，９６９号の優先権を主張する。また、本発明は、いずれも、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，９８８号、２０２１年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，６５７号、および２０２１年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，３９８号の優先権を主張する。さらに、本発明は、ともに「ｉＰＳ細胞作製における使用のための新規なＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」を発明の名称とする、２０２１年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，０３４号、および２０２１年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２８０，２２６号の優先権を主張する。さらに、本発明は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年９月２９日に出願された米国特許出願第１７／４８９，３５７号の優先権を主張する。本出願は、「抗ウイルスおよび抗癌ワクチンにおける使用のための新規なｍＲＮＡ組成物および製造方法（Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」を発明の名称とする、２０２１年９月２９日に出願された米国特許出願第１７／４８９，３５７号の一部継続出願である。各出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野：
本発明は、概して、ウイルスＲＮＡレプリカーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）酵素とそれらに関連するｍＲＮＡを用いる新規なＲＮＡ／ｍＲＮＡの製造および増幅方法に関する。本発明は、５’末端、３’末端、またはその両方に少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を有するあらゆる種類のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の製造および増幅に用いることができる。このようにして得られたＲＮＡ／ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡワクチンおよび／またはＲＮＡベースの医薬を製造するだけでなく、ｉｎ－ｖｉｔｒｏおよびｉｎ－ｃｅｌｌにおける翻訳条件（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でｍＲＮＡ関連タンパク質、ペプチドおよび／または抗体を生成するためにも有用である。主に、本発明は、ＲＮＡレプリカーゼを介した新規なＲＮＡ/ｍＲＮＡ増幅法、すなわちレプリカーゼサイクリング反応（Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＣＲ））である。ＲＣＲに関与するＲＮＡレプリカーゼとしては、ウイルスおよび／またはバクテリオファージのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、特にコロナウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲｄＲｐ酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、概して、ウイルスＲＮＡレプリカーゼおよび／またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）酵素とそれらに関連するｍＲＮＡを用いる新規なＲＮＡ／ｍＲＮＡの製造および増幅方法に関する。本発明は、５’末端、３’末端、またはその両方に少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を有するあらゆる種類のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の製造および増幅に用いることができる。このようにして得られたＲＮＡ／ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡワクチンおよび／またはＲＮＡベースの医薬を製造するだけでなく、ｉｎ－ｖｉｔｒｏおよびｉｎ－ｃｅｌｌにおける翻訳条件（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下でｍＲＮＡ関連タンパク質、ペプチドおよび／または抗体を生成するためにも有用である。主に、本発明は、ＲＮＡレプリカーゼを介した新規なＲＮＡ/ｍＲＮＡ増幅法、すなわちレプリカーゼサイクリング反応（Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＣＲ））である。ＲＣＲに関与するＲＮＡレプリカーゼとしては、ウイルスおよび／またはバクテリオファージのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、特にコロナウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲｄＲｐ酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【背景技術】
【0003】
背景技術：
従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから二本鎖ＤＮＡ配列を増幅する方法であり、ＲＮＡ材料は関与しない。ＰＣＲとは異なり、ＲＮＡレプリカーゼを介したサイクリング反応（ＲＣＲ）は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を用いて、ＲＮＡテンプレートから一本鎖ＲＮＡ配列を増幅する方法であり、ＤＮＡ材料は関与しない。明らかに、ＰＣＲとＲＣＲは大きく異なっており、比較できるものではない。したがって、これまでのＰＣＲ研究はＲＣＲには関係しない。
従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡテンプレートから二本鎖ＤＮＡ配列を増幅する方法であり、ＲＮＡ材料は関与しない。ＰＣＲとは異なり、ＲＮＡレプリカーゼを介したサイクリング反応（ＲＣＲ）は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を用いて、ＲＮＡテンプレートから一本鎖ＲＮＡ配列を増幅する方法であり、ＤＮＡ材料は関与しない。明らかに、ＰＣＲとＲＣＲは大きく異なっており、比較できるものではない。したがって、これまでのＰＣＲ研究はＲＣＲには関係しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
Ｌｉｎ等は２００２年にＲＣＲを初めて報告した（Ｌｉｎに対するＷ０２００２／０９２７７４）。Ｌｉｎは、特別なデザインの５’キャップキャプチャー分子連結プライマー（５’－ｃａｐ－ｃａｐｔｕｒｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を用いることで、一本鎖ＲＮＡテンプレートから、ウイルスおよび／またはバクテリオファージのレプリアーゼを介したＲＮＡ増幅を引き起こせることを発見した。このＲＣＲ機構は、いくつかのウイルスやバクテリオファージの複製／増幅機構を模倣したものである。しかしながら、多くのＲＮＡ種は５’キャップ分子（５’－ｃａｐ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を持たないため、特別な５’キャップキャプチャー分子連結プライマーが必要であることがその使用を制限する。また、連結された５’キャップキャプチャー分子（ｌｉｎｋｅｄ ５’－ｃａｐ－ｃａｐｔｕｒｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は、得られるＲＮＡ産物を不純にする。ｍＲＮＡワクチンの製造において、ＲＮＡ産物から５’キャップキャプチャー分子を除去するのは面倒であり、ＲＮＡの分解を引き起こす可能性もあるため、問題がある。従って、５’キャップキャプチャー分子連結プライマーを使用しない新規なＲＣＲ法が強く望まれている。
【0005】
今年２０２１年には、アルファウイルスのＲｄＲｐとその結合／認識部位である１９ヌクレオチド３’－保存配列要素（１９－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ （ｎｔ） ３’－ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ （３’－ＣＳＥ））を用いた別のＲＣＲ法がＢｌｏｏｍ等によって提案された（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８：１１７－１２９，２０２１）。ブルームの方法では、５’－キャップキャプチャープライマーを使用しないが、使用する３’－ＣＳＥが長すぎて構造的すぎるため、所望のＲＮＡテンプレートに効率よく組み込むことができない。日常業務では、ＲｄＲｐ増幅が可能なＲＮＡテンプレートを作製するために、従来の方法である、ポリメラーゼ連鎖反応－ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ））が一般的に用いられている（図１、Ｌｉｎに対する米国特許第７，６６２，７９１号、第８，０８０，６５２号、第８，３７２，９６９号、および第８，６０９，８３１号；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２１：９３－１０１、２００３、Ｌｉｎ等による）。しかしながら、１９－ｎｔの３’－ＣＳＥは、ＰＣＲプライマーに配置するには長すぎて構造的すぎる。また、３’－ＣＳＥは高度に構造化されたＲＮＡ配列であるため、ＲＮＡの転写を妨げ（ＭｃＤｏｗｅｌｌ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５、１９９４）、従来のＩＶＴ法では効率的に生産できない。また、最も問題なのは、３’－ＣＳＥがアルファウイルスＲｄＲｐによって特異的に認識されることであるが、これは市販されているものではないため、関連技術の開発がさらに妨げられてしまう。異なるウイルスのレプリカーゼ／ＲｄＲｐ種の性質が異なっていることを考慮すると、従来のＲＣＲ法の問題点を克服するためには、より簡潔で少ない構造的な結合／認識部位を有する別の種類のレプリカーゼ／ＲｄＲｐ酵素を探索して使用することが望ましい。
【0006】
これまでのＲＣＲ法の欠点に鑑み、本明細書では、レプリカーゼおよび／またはＲｄＲｐのより簡潔で少ない構造的な結合／認識部位を用いるだけでなく、高効率のＲＮＡ増幅および産生のために５’－キャップキャプチャープライマーを用いない、新規なＲＣＲ法を開発することが強く望まれている。
【発明を実施するための形態】
【0007】
発明の概要：
本発明の原理は、少なくともコロナウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合（認識）部位を所望のＲＮＡテンプレートの５’末端または３’末端、あるいはその両方に組み込み、所望のＲＮＡ配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、あるいはその両方のサイクリング増幅（ｃｙｃｌｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらすことに依拠する。ＲＣＲでは、定義されたレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位は、レプリカーゼ/ＲｄＲｐ活性のプロモーターおよび/またはエンハンサーとして機能する。図２に示すように、所望のＲＮＡテンプレートの５’末端および／または３’末端に少なくとも一つのレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を組み込んだ後、レプリカーゼ／ＲｄＲｐサイクリング反応（ＲＣＲ）の各サイクルで、所望のＲＮＡ配列を約１５倍から１０００倍以上に増幅することができる。ＲＣＲでは、センス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖を増幅するためのテンプレートとなり、アンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡを増幅するためのテンプレートとなる。ＲＣＲの各サイクルは、所望のＲＮＡ配列の長さおよび構造的複雑さに応じて、規定された時間内に約１５倍から１０００倍以上のＲＮＡ増幅率を提供することができるので、所望のＲＮＡ鎖は、センス鎖ＲＮＡまたはアンチセンス鎖ＲＮＡ、あるいはその両方のＲＣＲの停止点に応じて、比較的高い純度比（最大で１４／１５から＞９９９／１０００の純度）で得ることができる。注目すべきは、ＲＣＲにおける所望のＲＮＡ配列とテンプレートは一種類以上であることができ、得られるＲＮＡ産物は一本鎖でも二本鎖でもよいことである。
本発明の原理は、少なくともコロナウイルスおよび／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合（認識）部位を所望のＲＮＡテンプレートの５’末端または３’末端、あるいはその両方に組み込み、所望のＲＮＡ配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、あるいはその両方のサイクリング増幅（ｃｙｃｌｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をもたらすことに依拠する。ＲＣＲでは、定義されたレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位は、レプリカーゼ/ＲｄＲｐ活性のプロモーターおよび/またはエンハンサーとして機能する。図２に示すように、所望のＲＮＡテンプレートの５’末端および／または３’末端に少なくとも一つのレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を組み込んだ後、レプリカーゼ／ＲｄＲｐサイクリング反応（ＲＣＲ）の各サイクルで、所望のＲＮＡ配列を約１５倍から１０００倍以上に増幅することができる。ＲＣＲでは、センス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡのアンチセンス鎖を増幅するためのテンプレートとなり、アンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡを増幅するためのテンプレートとなる。ＲＣＲの各サイクルは、所望のＲＮＡ配列の長さおよび構造的複雑さに応じて、規定された時間内に約１５倍から１０００倍以上のＲＮＡ増幅率を提供することができるので、所望のＲＮＡ鎖は、センス鎖ＲＮＡまたはアンチセンス鎖ＲＮＡ、あるいはその両方のＲＣＲの停止点に応じて、比較的高い純度比（最大で１４／１５から＞９９９／１０００の純度）で得ることができる。注目すべきは、ＲＣＲにおける所望のＲＮＡ配列とテンプレートは一種類以上であることができ、得られるＲＮＡ産物は一本鎖でも二本鎖でもよいことである。
【0008】
ＲＣＲ対応のＲＮＡテンプレートを調製するために、まず逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、所望のＲＮＡ配列の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の５’末端または３’末端、あるいはその両方に、少なくともコロナウイルスおよび／またはＨＣＶのレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を組み込む。我々の特別な設計では、少なくとも一つのレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位がＰＣＲプライマー（ＲＣＲ対応ＰＣＲプライマーと呼ばれる）のそれぞれに合成的に組み込まれ、それゆえ、ＲＴ－ＰＣＲ後に、５’末端または３’末端、あるいはその両方に組み込まれた設計されたレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を有するＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡが形成される。なお、得られたｃＤＮＡをプラスミドやウイルスベクターにクローニングし、ＩＶＴ反応および／またはストレージ保存に利用することもできる。そして、ＩＶＴ反応を行い、ｃＤＮＡから目的のＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートを作製する。その後、得られたＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートをＲＣＲで使用し、所望のＲＮＡ配列を繰り返し増幅及び生産することができる。なお、実際の実施では、ＩＶＴとＲＣＲは全く同じバッファー条件下で同時に実施することもできるので、本明細書では、レプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を組み込んだｃＤＮＡ（ＲＣＲ対応ｃＤＮＡテンプレートと呼ばれる）は、組み合わせたＩＶＴ－ＲＣＲ反応において所望のＲＮＡ配列を増幅するための出発物質とすることも好ましい。
【0009】
本発明者等は、１７株以上のコロナウイルスおよびＨＣＶのＲＮＡゲノムをコンピュータースクリーニングした結果、５’末端および３’末端のＲｄＲｐ結合部位をそれぞれ含む、いくつかの保存されたＲｄＲｐ結合部位を同定した。具体的には、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＵ（Ｇ／Ｃ）（Ｕ／－）Ｇ（Ａ／Ｕ）－３’（すなわち、５’－ＡＵＳＵＧＷ－３’；配列番号１）又は５’－Ｕ（Ｃ／－）（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ｕ／Ｃ）（Ｕ／Ａ）Ａ－３’（すなわち、５’－ＵＣＷＣＹＷＡ－３’；配列番号２）の少なくともいずれか一方、又はその両方の配列を含む。好ましくは、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＵＣＵＧＵ－３’（配列番号３）、５’－ＵＣＵＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号５）、および／または５’－ＵＵＣＡＡ－３’（配列番号６）、若しくはそれらの組み合わせを含む配列から選択される。一方、３’末端のＲｄＲｐ結合部位は、５’－（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ａ／－）（Ｃ／Ｇ）ＡＵ－３’（すなわち、５’－ＷＣＡＳＡＵ－３’；配列番号７）、または５’－Ｕ（Ａ／Ｕ）（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｕ）（Ｇ／－）Ａ－３’（すなわち、５’－ＵＷＲＧＷＲ－３’；配列番号８）の少なくともいずれか一方、又はその両方の配列を含む。好ましくは、３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＣＡＧＡＵ－３’（配列番号９）、５’－ＵＵＡＧＡＧＡ－３’（配列番号１０）、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１１）、および／または５’－ＵＵＧＡＡ－３’（配列番号１２）、若しくはそれらの組み合わせを含む配列から選択される。また、ＲＣＲ対応ＰＣＲプライマーの設計を促進するために、これらのＲｄＲｐ結合部位のウリジン／ウラシル（Ｕ）成分（ｃｏｎｔｅｎｔｓ）をプライマー中のチミジン（ｄＴ）および／またはデオキシウリジン（ｄＵ）で置換することができる。また、ＲＮＡの安定性を高めるために、これらのＲｄＲｐ結合部位のウリジン／ウラシル（Ｕ）成分（ｃｏｎｔｅｎｔｓ）を、ＩＶＴおよび／またはＲＣＲの間に、シュードウリジンまたは他の修飾ヌクレオチド類似体でさらに置換することができる。これらＲｄＲｐ結合部位の新規な知見と設計により、現在利用可能なコロナウイルスＲｄＲｐ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、所望のＲＮＡ配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、あるいは両方を効率的に転写および増幅するために使用することができる。
【0010】
さらに、これら新たに同定された５’末端と３’末端のＲｄＲｐ結合部位は、異なるＲＮＡ増幅率をもたらす。例えば、配列番号１および配列番号７の増幅率は、所望のＲＮＡ配列の長さおよび構造的複雑さに応じて、ＲＣＲサイクルあたり約２５～１４００倍であると推定され、一方、配列番号２および配列番号８の増幅率は、ＲＣＲサイクルあたり約１０～９００倍であると推定される。このように増幅の優先傾向が異なるため、ＲｄＲｐ結合部位の組み合わせを変えて、一方のＲＮＡ鎖を他方のＲＮＡ鎖よりも選択的に増幅したり、ある種のＲＮＡ鎖を他種のＲＮＡ鎖より選択的に増幅したりすることができる。この手段により、所望のＲＮＡ配列の比較的純粋な一本鎖および／または二本鎖ＲＮＡ産物をＲＣＲにより生成および回収し、さらに他の方法で精製することができる。
【0011】
好ましい一実施形態では、所望のＲＮＡ配列（すなわち、ｍＲＮＡおよび／またはマイクロＲＮＡ、あるいは他種のＲＮＡ種）は、その５’および３’末端領域の両方に少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を含む。所望のＲＮＡの両末端は、レプリカーゼ／ＲｄＲｐ活性を有するＲＮＡ増幅のための少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を有するので、センス鎖ＲＮＡ配列は、その相補的アンチセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡまたはａＲＮＡ）を増幅するために使用することができ、一方、アンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、センスＲＮＡの増幅にも使用することができ、これによりセンス鎖ＲＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡの両方の増幅サイクルが形成されて、所望のＲＮＡの増幅率が最大となる。このようにして得られた所望のＲＮＡは、ＲＣＲの停止点に応じて、一本鎖または二本鎖のいずれかの構造になり得る。また、得られたセンス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡは、さらに二本鎖ＲＮＡを形成し、所望のＲＮＡ配列のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｐｉＲＮＡの生成を促進することができる。
【0012】
あるいは、別の好ましい実施形態では、所望のＲＮＡ配列は、その５’末端または３’末端領域のいずれか一方に少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を含む。このようにして、所望のＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを選択的に増幅することができ、所望のＲＮＡ鎖のより特異的な増幅が可能となる。特に、このアプローチは、特定の機能性タンパク質やウイルス抗原または抗体のｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）のいずれかを生成及び増幅するのに有用であり、ｍＲＮＡワクチンおよび／またはＲＮＡ／抗体ベースの医薬の開発を促進する。このようにして得られたｍＲＮＡワクチンおよびＲＮＡ／抗体ベースの医薬は、特に限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、脳卒中、糖尿病、心筋梗塞、血友病、貧血、白血病、および様々な癌、ならびに様々なウイルス感染症および細菌感染症を含む様々な人間の疾患の治療に役立つ可能性がある。
【0013】
考えられることは、我々の新しいＲＣＲ法は、少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を持つあらゆる種類のＲＮＡ種、特に、抗ウイルスおよび／または抗疾患ワクチンや医薬などの開発に有用なウイルス抗原ｍＲＮＡおよび／または既知の機能性ＲＮＡ/ｍＲＮＡを産生したり増幅したりするために使用することができる。例えば、ＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートと単離されたコロナウイルスＲｄＲｐ ｍＲＮＡをヒト体細胞にコトランスフェクション（共導入）することにより、我々の２つの米国優先権特許出願（Ｌｉｎに対する米国仮特許出願第６３／２７０，０３４号および第６３／２８０，２２６号）は、ｉＰＳ細胞作製の新規な方法を実証した。これに対して、当業者であれば、ｉＰＳ細胞作製のために、特許請求されたｍｉＲ－３０２マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）の代わりに、３－／４－山中因子ｍＲＮＡ（ｔｈｒｅｅ－／ｆｏｕｒ－Ｙａｍａｎａｋａ－ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡｓ）（すなわち、Ｏｃｔ４／３、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇおよび／またはＬｉｎ－２８）を使用することを予想することができる。あるいは、別の優先権特許出願（Ｌｉｎに対する米国特許出願第１７／４８９，３５７号）に示されているように、私たちは、新規なｍＲＮＡワクチンやウイルス感染症および癌を治療するための医薬をそれぞれ作製するための、ＲｄＲｐを介した自己増幅可能なＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の新しい設計を開発した。さらに、ＲＣＲで増幅されたｍＲＮＡは、コードされたタンパク質、ペプチドおよび／または抗体を産生するためのｉｎ－ｖｉｔｒｏの翻訳システムでさらに使用することができる。これらの先行発明で証明された成果を考慮すると、本発明の潜在的応用の多くの発展が大いに期待される。
【0014】
高度に構造化されたＲＮＡテンプレートとＲｄＲｐ ｍＲＮＡを効率的に生成するために、我々の優先権特許出願（Ｌｉｎに対する米国特許出願第１７／４８９，３５７号）では、高度に構造化されたＲＮＡ生成の低効率問題を克服するための新規なＰＣＲ－ＩＶＴ法を開発した。従来、ヘアピン様ＲＮＡ構造の存在はＲＮＡの転写を大きく阻害することがよく知られているため、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高度に構造化されたＲＮＡを効果的に生成することが当業者にとって予期できることだとするのは妥当ではない。事実、ヘアピンのようなステムループ構造は、原核生物のＲＮＡポリメラーゼにとって本質的な転写終結のシグナルである（ＭｃＤｏｗｅｌｌ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５、１９９４）。この問題を解決するために、我々の優先的方法は、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼ活性を混合した新しいＩＶＴシステムを採用する。ＩＶＴにおける（おそらくＲＣＲにおいても同様であろうが）追加のヘリカーゼ活性は、ＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートと得られるＲＮＡ産物の両方の二次構造を著しく減少させ、高度に構造化されたＲＮＡをはるかに効率的に生産する。したがって、ＩＶＴ（およびＲＣＲも同様）における混合したＲＮＡポリメラーゼ／レプリカーゼとヘリカーゼ活性の効率を高めるとともに維持するために、改良されたバッファーシステムも使用される。興味深いことに、いくつかの先行研究では、ヘリカーゼが原核生物の転写終結に関与している可能性が報告されていたが、我々の研究では、ＩＶＴ中のＲＮＡ増幅におけるヘリカーゼの機能は全く異なることが示された。
【0015】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内デリバリー／トランスフェクションを促進するために、ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートおよびＲｄＲｐ ｍＲＮＡは、特に限定されるものではないが、グリシルグリセリン由来化学物質、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子（ＬＮＰ）、コンジュゲート分子、輸液／輸血用化学物質、遺伝子銃材料、エレクトロポレーション剤、トランスポゾン／レトロトランスポゾン、およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも一つのデリバリー／トランスフェクション剤と混合、複合化、カプセル化、および／または製剤化することができる。
【0016】
ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートをＲＮＡ／ｍＲＮＡの生産および増幅に使用する利点には、（１）高いＲＮＡ収率、（２）高いＲＮＡ純度、（３）すべての反応材料を、ＲＣＲおよび/または組み合わせたＩＶＴ－ＲＣＲ反応を行うための生化学的酵素キットにすることができるという容易な調製、（４）他のＲＴ－ＰＣＲおよびＩＶＴ反応と互換性のある簡単な反応手順、（５）ＰＣＲ装置または温度制御インキュベーターを使用して容易に達成できる簡単な装置要件、および（６）様々な潜在的応用、が含まれる。その結果、本発明のＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートは、様々な所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の産生および増幅に非常に有用であり、特に限定されるものではないが、ｍＲＮＡワクチンおよびＲＮＡ／マイクロＲＮＡ関連の医薬の開発、ならびにタンパク質/ペプチド/抗体の生成を含むあらゆる種類の医薬および治療用途に使用できる。
【0017】
Ａ．定義
本発明の理解を容易にするため、以下に多くの用語を定義する。
本発明の理解を容易にするため、以下に多くの用語を定義する。
【0018】
核酸：一本鎖または二本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマー。
【0019】
ヌクレオチド：糖成分（ペントース）、リン酸、含窒素複素環式塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖成分に結合しており、塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ペントースの３'または５'位に少なくとも１つのリン酸基が結合したヌクレオシドがヌクレオチドである。ＤＮＡとＲＮＡは、それぞれデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドと呼ばれる異なるタイプのヌクレオチド単位から構成されている。
【0020】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸塩（ｄＮＴＰｓ）：ＤＮＡ合成のためのビルディングブロック分子であり、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含み、さらに修飾されたデオキシリボヌクレオチド類似体を含むこともある。
【0021】
リボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）：ＲＮＡ合成のためのビルディングブロック分子であり、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰを含み、シュードウリジンおよび他の修飾リボヌクレオチド類似体を含むこともある。
【0022】
ヌクレオチド類似体：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）とは構造的に異なるが、核酸分子中の通常のヌクレオチドを置換するのに十分な類似性を持つプリンまたはピリミジンヌクレオチド。
【0023】
オリゴヌクレオチド：ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの２つ以上、好ましくは３つ以上、通常は１０個以上のモノマー単位からなる分子。１３個のヌクレオチドモノマーより長いオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとも呼ばれる。正確なサイズは多くの要因に依存し、それはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存して変わる。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、逆転写、またはそれらの組み合わせなど、どのような方法で生成されてもよい。
【0024】
核酸組成物：核酸組成物とは、一本鎖または二本鎖の分子構造で、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、あるいはＤＮＡ/ＲＮＡ混合配列などのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。
【0025】
遺伝子：そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列がＲＮＡおよび／またはポリペプチド（タンパク質）をコードする核酸組成物。遺伝子は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。遺伝子は、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびそれらのＲＮＡ前駆体ならびに誘導体などの非コードＲＮＡをコードすることができる。あるいは、遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそのＲＮＡ前駆体ならびに誘導体など、タンパク質／ペプチド合成に必須なタンパク質コードＲＮＡをコードしていてもよい。場合によっては、遺伝子は、少なくとも一つのマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列も含むタンパク質コードＲＮＡをコードすることもある。
【0026】
一次ＲＮＡ転写産物（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）：遺伝子から直接転写されたＲＮＡ配列であり、ＲＮＡプロセシングや修飾を伴わないものである。
【0027】
メッセンジャーＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）：タンパク質をコードする遺伝子の一次ＲＮＡ転写産物であり、真核生物のＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－ＩＩ）組織（ｔｙｐｅ－ＩＩ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ）によって、転写と呼ばれる細胞内機構を介して産生される。ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、エクソンおよびイントロンを含む。
【0028】
イントロン：インフレームイントロン（ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｉｎｔｒｏｎ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲなど、非タンパク質読み取りフレーム（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）をコードする遺伝子転写配列の一部または部分。
【0029】
エクソン：細胞遺伝子、成長因子、インスリン、抗体およびそれらの類似体／ホモログ、ならびに誘導体のためのｃＤＮＡなどの、タンパク質読み取りフレーム（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ （ｃＤＮＡ））をコードする遺伝子転写配列の一部または全部。
【0030】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソンの集合体であり、細胞内ＲＮＡスプライシング組織（例えばスプライソソーム）によってイントロンが除去された後に形成され、ペプチド／タンパク質合成のためのタンパク質コードＲＮＡとして機能する。ｍＲＮＡによってコードされるペプチド／タンパク質には、酵素、成長因子、インスリン、抗体およびそれらの類似体／ホモログ、ならびに誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0031】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）：ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を含み、イントロン配列を含まない一本鎖または二本鎖のＤＮＡ。
【0032】
センス：相同ｍＲＮＡ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍＲＮＡ）と同じ配列順序及び組成の核酸分子。センス型は「＋」、「ｓ」または「ｓｅｎｓｅ」の記号で表示される。
【0033】
アンチセンス：それぞれのｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子。アンチセンス型は、「－」の記号で表示されるか、または、「ａＤＮＡ」や「ａＲＮＡ」のように、ＤＮＡやＲＮＡの前に「ａ」や「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」を付けて表示される。
【0034】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の相互関係、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の相互関係のこと。ＲＮＡでは、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が使われている。一般に、相互関係は水素結合によって達成される。例えば、センスヌクレオチド配列「５’－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｕ－３’」は、アンチセンス配列「５’－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－３’」と完全に塩基対を形成することができる。
【0035】
５’末端：あるヌクレオチドの５’－水酸基が次のヌクレオチドの３’－水酸基とホスホジエステル結合で接合している連続するヌクレオチドにおける５’位のヌクレオチドが欠けた末端である。末端には、１つ以上のリン酸塩などの他の基が存在してもよい。
【0036】
３’末端：あるヌクレオチドの５’－水酸基が次のヌクレオチドの３’－水酸基にホスホジエステル結合で結合している連続するヌクレオチドの３’位のヌクレオチドが欠けた末端である。末端には他の基、多くの場合水酸基が存在してもよい。
【0037】
テンプレート：核酸ポリメラーゼによってコピーされる核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼに応じて、一本鎖、二本鎖、または部分二本鎖、ＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれでもよい。合成されたコピーは、テンプレートに相補的であるか、二本鎖または部分的に二本鎖のテンプレートの少なくとも一本の鎖に相補的である。ＲＮＡもＤＮＡも５’から３’の方向で合成される。核酸二重鎖の２本鎖は、常に２本鎖の５’末端が二重鎖の反対側の端になるように（必然的に３’端もそうなるように）整列している。
【0038】
核酸テンプレート：二本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、ＤＮＡ－ＲＮＡあるいはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドなどのハイブリッド分子、又は一本鎖ＤＮＡあるいは一本鎖ＲＮＡ分子である。
【0039】
保存：事前に選択された配列の正確な相補物に非ランダムにハイブリダイズする場合、事前に選択された（参照された）配列に対してヌクレオチド配列が保存されていると言える。
【0040】
相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｏｒ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）：ポリヌクレオチドと遺伝子又はｍＲＮＡ配列との類似性を示す用語である。核酸配列は、例えば、特定の遺伝子やｍＲＮＡ配列と部分的または完全に相同であることがある。相同性は、ヌクレオチドの総数に対する類似ヌクレオチドの数によって決定される割合で表すことができる。
【0041】
相補性又は相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）：前述の「塩基対（ｂｐ）」の規則で関連付けられた２つのポリヌクレオチド（すなわち、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの配列）間でマッチした塩基対（ｍａｔｃｈｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）を指す用語である。例えば、「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」という配列は、「５’－Ａ－Ｃ－Ｔ－３’」だけでなく「５’－Ａ－Ｃ－Ｕ－３’」にも相補的である。相補性は、２本のＤＮＡ鎖間、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖間、２本のＲＮＡ鎖間であり得る。相補性は「部分的」であっても「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」であっても「全体的（ｔｏｔａｌ）」であってもよい。部分的な相補性又は相補的（Ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、核酸塩基の一部のみが塩基対形成規則に従ってマッチする場合に生じる。完全又は全体的な相補性（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ ｔｏｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、塩基が核酸鎖間で完全にまたは完璧にマッチする場合に生じる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強さに大きな影響を与える。これは、増幅反応や、核酸同士の結合に依存する検出方法において特に重要である。相補性の割合は、核酸の１本の鎖の全塩基数に対するミスマッチ塩基（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅｓ）数の割合を指す。したがって、５０％の相補性は、半分の塩基がミスマッチで、半分がマッチしていることを意味する。塩基数が２本の鎖で異なっていても、核酸の２本鎖が相補的になることがある。この場合、長い方の鎖の塩基が短い方の鎖の塩基と対になっている部分の間で相補性が生じる。
【0042】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる際に、通常対になるヌクレオチドである。
【0043】
相補的ヌクレオチド配列：他の一本鎖上のヌクレオチドと十分に相補的で、二本鎖間で特異的にハイブリダイズし、結果として水素結合が生じる、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチド配列。
【0044】
ハイブリダイズおよびハイブリダイゼーション：塩基対を介して複合体を形成するのに十分な相補性を持つヌクレオチド配列間の二重鎖の形成を指す。プライマー（またはスプライステンプレート）が標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼに要求されるプライミング機能を果たすのに十分安定である。２つの相補的なポリヌクレオチドの間には、特異的な、すなわち非ランダムな相互作用が存在し、競合的に阻害されることがある。
【0045】
転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）：ｍＲＮＡの分解や翻訳抑制のレベルで標的遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする効果であり、通常、外来／ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡ導入遺伝子、若しくは低分子抑制ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡｓ）のいずれかが引き金となる。
【0046】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：真核生物における転写後の遺伝子サイレンシングで、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））などの低分子阻害性ＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が引き金となり得る。これらの低分子ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、低分子ＲＮＡに完全または部分的に相補な部分を含む細胞内遺伝子の発現を阻害する。
【0047】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：ｍｉＲＮＡと部分的に相補性を持つ標的遺伝子の転写産物に結合することができる一本鎖ＲＮＡ。ｍｉＲＮＡは通常１７－２７オリゴヌクレオチド程度の長さで、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの相補性に応じて、細胞内の標的ｍＲＮＡを直接分解（ｄｅｇｒａｄｅ）したり、標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を抑制したりすることが可能である。天然のｍｉＲＮＡは、ほぼ全ての真核生物に存在し、ウイルス感染に対する防御や、動植物の発達過程における遺伝子発現の制御を可能にしている。
【0048】
マイクロＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＭｉｃｒｏＲＮＡ（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ））：ヘアピン状の一本鎖ＲＮＡであり、細胞内のＲＮａｓｅＩＩＩエンドリボヌクレアーゼと相互作用し、マイクロＲＮＡ配列と相補的な遺伝子又は標的遺伝子をサイレンシングできる１つまたは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生成するためのステムアーム領域とステムループ領域を持つ。Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムアームは、完全（１００％）または部分的（ミスマッチ）なハイブリッド二重鎖を形成することでき、ステムループはステムアーム二重鎖の一端を連結して円またはヘアピンループ構造を形成する。ただし、本発明では、マイクロＲＮＡの前駆体はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡも含むことができる。
【0049】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））：約１８～２７個の完全な塩基対リボヌクレオチド二重鎖（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｂａｓｅ－ｐａｉｒｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ）のサイズであり、ほぼ完全に相補的な標的遺伝子転写物を分解することができる短い二本鎖ＲＮＡである。
【0050】
スモール又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））：一本鎖ＲＮＡで、部分的または完全にマッチしたステムアームヌクレオチド配列のペアが、ミスマッチのループまたはバブルオリゴヌクレオチド（ｌｏｏｐ ｏｒ ｂｕｂｂｌｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で分割され、ヘアピン状の構造を形成したものである。多くの天然ｍｉＲＮＡは、スモールヘアピン様ＲＮＡ前駆体、すなわちマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に由来する。
【0051】
ベクター：異なる遺伝子環境（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）中を移動及び滞留可能な組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）などの組換え核酸組成物である。一般に、そこに別の核酸が作動可能に連結されている。ベクターは、細胞内で自律的に複製することが可能であり、その場合、ベクターおよび付随するセグメントが複製される。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が可能な核酸分子である。好ましいベクターは、核酸の自律的な複製および発現が可能なベクターである。１つ以上のポリペプチドおよび／またはノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」または「発現可能ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いて産生されたｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローニングすることを可能にする。ベクターは、ウイルスまたはＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－ＩＩまたはｐｏｌ－２）プロモーター、あるいはその両方、コザックコンセンサス翻訳開始点（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ポリアデニル化シグナル、複数の制限／クローニングサイト、ｐＵＣ複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製可能原核細胞（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ）において少なくとも抗生物質耐性遺伝子を発現するためのＳＶ４０アーリープロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、哺乳動物細胞における複製のためのオプショナルＳＶ４０起点（ｏｐｔｉｏｎａｌ ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ）、及び／又はテトラサイクリン応答性要素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）からなる構成要素を含むことができる。ベクターの構造は、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ導入遺伝子（ＤＮＡ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ジャンピング遺伝子（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される一本鎖または二本鎖ＤＮＡの線形または環状の形態であり得る。
【0052】
プロモーター：ポリメラーゼ分子が認識し、おそらく結合し、ＲＮＡの転写を開始する核酸。本発明の目的によると、プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサー等であり得、所望のポリメラーゼによるＲＮＡ転写産物の合成を開始させることができる任意の配列であり得る。
【0053】
ＲＮＡプロセシング：ＲＮＡの成熟、修飾、分解を担う細胞機構であり、ＲＮＡスプライシング、イントロン切除、エクソソーム消化、ナンセンス依存分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ （ＮＭＤ））、ＲＮＡ編集、ＲＮＡプロセシング、５’末端キャッピング、３’末端ポリ（Ａ）テーリング、およびそれらの組合せが含まれる。
【0054】
遺伝子導入：ポリソームトランスフェクション（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リポソームトランスフェクション、化学（ナノ粒子）トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ＤＮＡ組み換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、遺伝子銃ペネトレーション（ｇｅｎｅ－ｇｕｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子工学的方法である。
【0055】
遺伝子工学：ＤＮＡの制限およびライゲーション（ＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、相同組換え、導入遺伝子組み込み（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子組み込み（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるＤＮＡ組換え方法である。
【0056】
トランスフェクト細胞：体細胞、組織細胞、幹細胞、生殖細胞、腫瘍細胞、がん細胞、ウイルス感染細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される細胞内に、少なくとも一つの核酸配列またはタンパク質／ペプチド分子を人為的に挿入した後の単一または複数の真核細胞。
【0057】
抗体：あらかじめ選択されたリガンドと結合できる受容体をコードする、あらかじめ選択された保存ドメイン構造（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するペプチドまたはタンパク質分子である。
【0058】
医薬および/または治療用途：幹細胞作製、医薬/ワクチン開発、非トランスジェニック遺伝子治療、癌治療、疾患治療、創傷治癒、組織/臓器修復および再生、タンパク質/ペプチド/抗体、医薬成分、医薬、ワクチンおよび/または食品の高収率生産、ならびにこれらの組み合わせに有用な生物医学的利用および/または装置。
【0059】
Ｂ．組成物及び用途
（ａ）５’末端または３’末端のＲｄＲｐ結合部位の少なくともいずれか一方、若しくはその両方を含む少なくとも一つのＲＮＡ配列を提供し、
（ｂ）コロナウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）から単離または改変された少なくとも一つのＲＮＡレプリカーゼを提供し、
（ｃ）ＲＮＡレプリカーゼを介在した前記ＲＮＡ配列の製造および増幅を生じさせるように、（ａ）のＲＮＡ配列と（ｂ）のＲＮＡレプリカーゼをバッファー条件下で混合する、
ことを含み、
前記バッファー条件は、ＲＮＡ合成に必要なリボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰｓ）を含み、ｐＨが６．０～８．０の範囲であり、温度が２０℃～４５℃の範囲である、
ＲＮＡレプリカーゼを介した新規なＲＮＡ増幅方法。
（ａ）５’末端または３’末端のＲｄＲｐ結合部位の少なくともいずれか一方、若しくはその両方を含む少なくとも一つのＲＮＡ配列を提供し、
（ｂ）コロナウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）から単離または改変された少なくとも一つのＲＮＡレプリカーゼを提供し、
（ｃ）ＲＮＡレプリカーゼを介在した前記ＲＮＡ配列の製造および増幅を生じさせるように、（ａ）のＲＮＡ配列と（ｂ）のＲＮＡレプリカーゼをバッファー条件下で混合する、
ことを含み、
前記バッファー条件は、ＲＮＡ合成に必要なリボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰｓ）を含み、ｐＨが６．０～８．０の範囲であり、温度が２０℃～４５℃の範囲である、
ＲＮＡレプリカーゼを介した新規なＲＮＡ増幅方法。
【0060】
コロナウイルスおよび／またはＨＣＶ ＲｄＲｐ酵素の場合、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＵＳＵＧＷ－３’（配列番号１）または５’－ＵＣＷＣＹＷＡ－３’（配列番号２）の少なくともいずれか一方の配列、もしくは両方の配列を含む。好ましくは、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＵＣＵＧＵ－３’（配列番号３）、５’－ＵＣＵＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号５）、および／または５’－ＵＵＣＡＡ－３’（配列番号６）、またはそれらの組み合わせを含むＲＮＡ配列から選択される。一方、３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＷＣＡＳＡＵ－３’（配列番号７）または５’－ＵＷＲＧＷＲ－３’（配列番号８）の少なくともいずれか一方の配列、もしくはその両方の配列を含む。好ましくは、３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＣＡＧＡＵ－３’（配列番号９）、５’－ＵＵＡＧＡＧＡ－３’（配列番号１０）、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１１）、および／または５’－ＵＵＧＡＡ－３’（配列番号１２）、またはそれらの組み合わせを含むＲＮＡ配列から選択される。これらのＲｄＲｐ結合部位をＰＣＲプライマーに組み込むために、これらのＲｄＲｐ結合部位のウリジン／ウラシル（Ｕ）成分（ｃｏｎｔｅｎｔｓ）を、プライマー中のチミジン（ｄＴ）および／またはデオキシウリジン（ｄＵ）で置換することができる。また、ＲＮＡの安定性を向上させるために、これらのＲｄＲｐ結合部位のウリジン／ウラシル（Ｕ）成分（ｃｏｎｔｅｎｔｓ）および得られるＲＮＡ産物を、シュードウリジンまたは他の修飾ヌクレオチド類似体で置換することができる。
【図面の簡単な説明】
【0061】
図面を参照するが、説明を目的とするものであり、限定されるものではない。そこには以下の記載がある。
【0062】
【図1】従来のＰＣＲ－ＩＶＴ法の段階的な手順を示している。ＲＮＡ製造のためには、このＰＣＲ－ＩＶＴ法の一部または全部の手順を、所望のＲＮＡ産物の単一または複数サイクルの増幅のために採用することができる。
【0063】
【図2】本発明のＲＣＲ法の段階的な手順を示している。ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートを調製するために、従来のＲＴ－ＰＣＲ法を用いて、少なくとも一つのコロナウイルスおよび／またはＨＣＶレプリカーゼ／ＲｄＲｐ結合部位を所望のＲＮＡ配列のｃＤＮＡの５’末端または３’末端、あるいはその両方に組み込む。次に、この新規なＲＣＲ法の一部または全部の手順を用いて、単一または複数サイクルの増幅後に、ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートから所望のＲＮＡ配列を産生して増幅する。あるいは、ＩＶＴとＲＣＲ法は同じバッファー条件下で同時に行うことができるので、ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートは、組み合わせたＩＶＴ－ＲＣＲ反応において所望のＲＮＡ配列を増幅するための出発物質としても使用することができる。
【0064】
【図3】ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートの設計された構造を示している。ＲＣＲ対応ｃＤＮＡテンプレートは二本鎖ＤＮＡ構造（ＩＶＴおよび組み合わせたＩＶＴ－ＲＣＲ反応に有用）であり、一方で、ＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートは一本鎖ＲＮＡ構造（ＲＣＲに有用）であることに注意されたい。ＲＣＲ対応ＲＮＡテンプレートの安定性をさらに高めるために、テンプレートのウリジン／ウラシル（Ｕ）成分をシュードウリジンまたは他の修飾ヌクレオチド類似体で置き換えることができる。
【0065】
【図4】ＲＣＲ対応ｍｉＲ－３０２前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）およびウイルスＲｄＲｐ ｍＲＮＡテンプレート（最も右に示す）でコトランスフェクションした後のトランスフェクトされたヒト細胞におけるｍｉＲ－３０２マイクロＲＮＡ（すなわち、上から下：ｂ、ｃ、ｄ、ａ）及びＲｄＲｐ ｍＲＮＡの発現が、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２テンプレート（真ん中）のみでトランスフェクションした細胞の結果と比較して著しく増加したノーザンブロット分析結果を示し、細胞におけるＲＣＲの証拠を示している。
【0066】
【図5】ＲＣＲ対応ｃＤＮＡおよびＲＮＡテンプレート、ならびに得られた目的の増幅ＲＮＡ産物（すなわち、ウイルス抗原タンパク質／ペプチドのｍＲＮＡ配列）のノーザンブロット分析結果を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＣＲの証拠を示している。
【0067】
【0068】
実施例：
１．ヒト細胞の単離と培養
出発組織細胞は、Ａａｓｅｎのプロトコル（Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，３７１－３８２，２０１０）を用いて酵素的に解離した皮膚細胞か、単にヘパリン処理した末梢血細胞のバフィーコート画分から得ることができる。単離した組織サンプルは新鮮に保ち、４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼIと０．２５％のＴｒｙｐＬＥを１５～４５分間、細胞密度に応じて混合することで直ちに使用する必要があり、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回リンスした後、０．３ｍＬのフィーダーフリーＳＦＭ培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）を入れた滅菌済みマイクロチューブに移した。その後、マイクロチューブインキュベーターにより３７℃で１分間振盪して細胞をさらに解離させ、０．３ｍＬの細胞懸濁液全体を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、およびｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、またはその他の任意に定義した因子（ｏｔｈｅｒ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ）を添加したフィーダーフリーＳＦＭ培地１ｍＬを含む３５ｍｍマトリゲルコート培養皿に移した。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および他の任意に定義された因子の濃度は、細胞培養培地中でそれぞれにおいて、０．１～５００マイクログラム（μｇ）／ｍＬの範囲である。細胞培養培地と全ての添加物は２～３日ごとにリフレッシュする必要があり、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡに１分間さらし、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすぐことにより、約５０～６０％コンフルエントで継代する。ＡＳＣの増殖のために、製剤化されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の任意に定義された因子を添加した新鮮なフィーダーフリーＭＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ培養培地に、細胞を１：５～１：５００希釈で再播種した。ケラチノサイトを培養する場合、細胞を皮膚組織から単離し、ヒトケラチノサイト増殖サプリメント（ＨＫＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地中で、適切な抗生物質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養する。培養細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間さらし、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回すすぐことにより、５０～６０％のコンフルエントで継代し、剥離した細胞は、ＨＫＧＳサプリメントを添加した新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培地で１：１０の希釈率で再播種する。ヒトがん細胞および正常細胞株Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｌｏ－８２９およびＢＥＡＳ－２Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）または共同研究者から入手し、製造業者または提供者の提案に従って維持した。リプログラミング後、得られたｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）は、ＬｉｎのフィーダーフリーまたはＴａｋａｈａｓｈｉのフィーダーベースのｉＰＳＣ培養プロトコルに従って培養および維持した（Ｌｉｎ等、ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８；Ｌｉｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ＫおよびＹａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６）。
１．ヒト細胞の単離と培養
出発組織細胞は、Ａａｓｅｎのプロトコル（Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，３７１－３８２，２０１０）を用いて酵素的に解離した皮膚細胞か、単にヘパリン処理した末梢血細胞のバフィーコート画分から得ることができる。単離した組織サンプルは新鮮に保ち、４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼIと０．２５％のＴｒｙｐＬＥを１５～４５分間、細胞密度に応じて混合することで直ちに使用する必要があり、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回リンスした後、０．３ｍＬのフィーダーフリーＳＦＭ培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）を入れた滅菌済みマイクロチューブに移した。その後、マイクロチューブインキュベーターにより３７℃で１分間振盪して細胞をさらに解離させ、０．３ｍＬの細胞懸濁液全体を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、およびｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、またはその他の任意に定義した因子（ｏｔｈｅｒ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ）を添加したフィーダーフリーＳＦＭ培地１ｍＬを含む３５ｍｍマトリゲルコート培養皿に移した。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および他の任意に定義された因子の濃度は、細胞培養培地中でそれぞれにおいて、０．１～５００マイクログラム（μｇ）／ｍＬの範囲である。細胞培養培地と全ての添加物は２～３日ごとにリフレッシュする必要があり、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡに１分間さらし、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすぐことにより、約５０～６０％コンフルエントで継代する。ＡＳＣの増殖のために、製剤化されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の任意に定義された因子を添加した新鮮なフィーダーフリーＭＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ培養培地に、細胞を１：５～１：５００希釈で再播種した。ケラチノサイトを培養する場合、細胞を皮膚組織から単離し、ヒトケラチノサイト増殖サプリメント（ＨＫＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地中で、適切な抗生物質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養する。培養細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間さらし、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１回すすぐことにより、５０～６０％のコンフルエントで継代し、剥離した細胞は、ＨＫＧＳサプリメントを添加した新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培地で１：１０の希釈率で再播種する。ヒトがん細胞および正常細胞株Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｌｏ－８２９およびＢＥＡＳ－２Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）または共同研究者から入手し、製造業者または提供者の提案に従って維持した。リプログラミング後、得られたｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）は、ＬｉｎのフィーダーフリーまたはＴａｋａｈａｓｈｉのフィーダーベースのｉＰＳＣ培養プロトコルに従って培養および維持した（Ｌｉｎ等、ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８；Ｌｉｎ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ＫおよびＹａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６）。
【0069】
２．Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ ＲＮＡトランスフェクション
細胞内導入／トランスフェクションのために、０．５～２００μｇのＲＣＲ増幅ＲＮＡ／ｍＲＮＡ（すなわち、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２またはコロナウイルスＳタンパク質ｍＲＮＡ）とＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１から１：２０の範囲）を０．５ｍｌの新鮮な細胞培養培地に溶解し、１～５０μｌのＩｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩまたは他の同様のトランスフェクション試薬と混合する。１０～３０分間インキュベートした後、培養細胞の５０～６０％コンフルエントを含む細胞培地に混合物を加える。培地は、細胞の種類にもよるが、１２～４８時間ごとにリフラッシュする。このトランスフェクション手順は、トランスフェクション効率を上げるために繰り返し行うことができる。
細胞内導入／トランスフェクションのために、０．５～２００μｇのＲＣＲ増幅ＲＮＡ／ｍＲＮＡ（すなわち、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２またはコロナウイルスＳタンパク質ｍＲＮＡ）とＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１から１：２０の範囲）を０．５ｍｌの新鮮な細胞培養培地に溶解し、１～５０μｌのＩｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩまたは他の同様のトランスフェクション試薬と混合する。１０～３０分間インキュベートした後、培養細胞の５０～６０％コンフルエントを含む細胞培地に混合物を加える。培地は、細胞の種類にもよるが、１２～４８時間ごとにリフラッシュする。このトランスフェクション手順は、トランスフェクション効率を上げるために繰り返し行うことができる。
【0070】
３．ＲＣＲ対応ｃＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートの調製
所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、単離したＲＮＡ／ｍＲＮＡの約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）を、メーカーの提案に従い、２０～５０μＬのＲＴ反応液（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に加えて行う。ＲＮＡ／ｍＲＮＡの量にもよるが、ＲＴ反応混合物にはさらに約０．０１～２０ｎモルのＲＴプライマー、適量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸分子（ｄＮＴＰｓ）、及び逆転写酵素を１ｘＲＴバッファーに含む。次に、このＲＴ反応を、所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の長さと構造の複雑さに応じて、３７～６５℃で１～３時間インキュベートし、次のステップのＰＣＲのための相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを作成する。ウイルスＲｄＲｐ ｍＲＮＡの単離のために、我々はＲＴ－リバースプライマー５’－ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ－３’（配列番号１３）を設計し、コロナウイルスＲｄＲｐ ｃＤＮＡを生成するために使用した。
所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、単離したＲＮＡ／ｍＲＮＡの約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）を、メーカーの提案に従い、２０～５０μＬのＲＴ反応液（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に加えて行う。ＲＮＡ／ｍＲＮＡの量にもよるが、ＲＴ反応混合物にはさらに約０．０１～２０ｎモルのＲＴプライマー、適量のデオキシリボヌクレオシド三リン酸分子（ｄＮＴＰｓ）、及び逆転写酵素を１ｘＲＴバッファーに含む。次に、このＲＴ反応を、所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列の長さと構造の複雑さに応じて、３７～６５℃で１～３時間インキュベートし、次のステップのＰＣＲのための相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを作成する。ウイルスＲｄＲｐ ｍＲＮＡの単離のために、我々はＲＴ－リバースプライマー５’－ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ－３’（配列番号１３）を設計し、コロナウイルスＲｄＲｐ ｃＤＮＡを生成するために使用した。
【0071】
次に、メーカーの提案に従って、２０～５０μＬのＰＣＲ調製用混合物（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に、約０．０１ｐｇ～１０μｇのＲＴ－由来ｃＤＮＡを加えることで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。その後、ＰＣＲ混合物は、まずインキュベートされて、所望のｃＤＮＡ配列の構造と長さに応じて、９４℃で１分間の変性、３０～５５℃で３０秒～１分間のアニーリング、そして７２℃で１～３分間の伸長を行うサイクルを５～２０サイクル行う。その後、得られたＰＣＲ産物の構造と長さに応じて、９４℃で１分間の変性、５０～５８℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１～３分間の伸長という一連のサイクリング手順を繰り返しながら、さらに１０～２０サイクルのＰＣＲを行う。最後に、得られたＰＣＲ産物をＩＶＴおよびＲＣＲのためのｃＤＮＡテンプレートとして使用する。ＩＶＴ－ＲＣＲテンプレートの調製のために、私たちは、同定されたＲｄＲｐ結合部位をＰＣＲ由来のＲｄＲｐ ｃＤＮＡテンプレートに組み込むための、配列番号１３および５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ－３’（配列番号１４）を含む特定のＲＣＲ対応ＰＣＲプライマー対を設計し使用する。その後、得られたＩＶＴ－ＲＣＲのｍＲＮＡ産物に５’キャップ分子がさらに組み込まれることがある。一方、私たちはまた、同定されたＲｄＲｐ結合部位をヒトｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ファミリアルクラスター（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）のＰＣＲ由来のｃＤＮＡテンプレートに組み込むための、５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１５）および５’－ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ－３’（配列番号１６）を含む別のＲＣＲ対応ＰＣＲプライマー対を設計して使用する。プライマー設計では、Ｔ７、Ｔ３、および／またはＳＰ６プロモーターなど、ＲＮＡプロモーターとＲｄＲｐ結合部位のさまざまな配列および組み合わせを使用することができ、少なくとも１つのＲｄＲｐ結合部位が５’末端および／または３’末端プライマーに組み込まれる。
【0072】
ＲＣＲ対応ＲＮＡ／ｍＲＮＡテンプレートを生成する場合、少なくとも一つのプロモーターと少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位が、得られたＰＣＲ由来ｃＤＮＡ産物（ＲＣＲ対応ｃＤＮＡテンプレートとして機能）に組み込まれるため、次にＩＶＴ－ＲＣＲ反応を実施することができ、ｃＤＮＡテンプレートから所望のＲＮＡ／ｍＲＮＡ配列が増幅される。ＩＶＴ－ＲＣＲ反応混合物には、０．０１ｎｇ～１０μｇのＰＣＲ由来ｃＤＮＡ産物、０．１～５０Ｕの単離されたコロナウイルスＲｄＲｐ／ヘリカーゼ（Ａｂｃａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ／Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＮＹ）、適切な量のリボヌクレオシド三リン酸分子（ｒＮＴＰ）およびＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）が１ｘ転写バッファーに含まれる。転写バッファーは市販されており、メーカーの提案に従ってさらに調整することができる。好ましくは、１ｘ転写バッファーは、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、および／またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。次に、使用するＲｄＲｐおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素の安定性と活性に応じて、ＩＶＴ－ＲＣＲ反応を３０～４０℃で１～６時間インキュベートする。
【0073】
４．新規なＲＣＲプロトコル
出発ＲＣＲ混合物には、１ｘ転写バッファー中に約０．０１ｎｇ～１０μｇのＲＣＲ対応ＲＮＡ／ｍＲＮＡテンプレート、約０．１～５０Ｕの単離したコロナウイルスＲｄＲｐ／ヘリカーゼ、および適量のｒＮＴＰが含まれる。ＲｄＲｐ／ヘリカーゼは、追加のＲＮＡ巻き戻し活性を有するＲｄＲｐ酵素、またはＲｄＲｐとヘリカーゼの混合物のいずれかである。転写バッファーは市販されており、メーカーの提案に従ってさらに調整することができる。また、１ｘ転写バッファーは、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、および／またはそれらの組み合わせをさらに含むことができ、これは、ヘアピンやステムループ構造などの高度に構造化されたＲＮＡ／ＤＮＡ配列の変性を促進する。その後、使用するＲｄＲｐ酵素の安定性と活性に応じて、ＲＣＲ反応を２０～４５℃で１～６時間インキュベートする。
出発ＲＣＲ混合物には、１ｘ転写バッファー中に約０．０１ｎｇ～１０μｇのＲＣＲ対応ＲＮＡ／ｍＲＮＡテンプレート、約０．１～５０Ｕの単離したコロナウイルスＲｄＲｐ／ヘリカーゼ、および適量のｒＮＴＰが含まれる。ＲｄＲｐ／ヘリカーゼは、追加のＲＮＡ巻き戻し活性を有するＲｄＲｐ酵素、またはＲｄＲｐとヘリカーゼの混合物のいずれかである。転写バッファーは市販されており、メーカーの提案に従ってさらに調整することができる。また、１ｘ転写バッファーは、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、および／またはそれらの組み合わせをさらに含むことができ、これは、ヘアピンやステムループ構造などの高度に構造化されたＲＮＡ／ＤＮＡ配列の変性を促進する。その後、使用するＲｄＲｐ酵素の安定性と活性に応じて、ＲＣＲ反応を２０～４５℃で１～６時間インキュベートする。
【0074】
５．ＲＮＡ精製とノーザンブロット分析
メーカーのプロトコルに従って、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）または同様の精製フィルターカラムを使用して、所望のＲＮＡ（１０μｇ）を単離し、５％～１０％ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドまたは１％～３．５％の低融点アガロースゲル電気泳動によってさらに精製する。ノーザンブロット分析では、ゲルで分画したＲＮＡをナイロン膜上にエレクトロブロットする。ＲＮＡとそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ由来のｃＤＮＡ産物）の検出は、所望のＲＮＡの標的配列に相補的な標識された［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブを使用して行われる。プローブは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製され、色素標識ヌクレオチド類似体または［３２Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の存在下で２０分間、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ユニット）によりテール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）される。
メーカーのプロトコルに従って、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）または同様の精製フィルターカラムを使用して、所望のＲＮＡ（１０μｇ）を単離し、５％～１０％ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドまたは１％～３．５％の低融点アガロースゲル電気泳動によってさらに精製する。ノーザンブロット分析では、ゲルで分画したＲＮＡをナイロン膜上にエレクトロブロットする。ＲＮＡとそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ由来のｃＤＮＡ産物）の検出は、所望のＲＮＡの標的配列に相補的な標識された［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブを使用して行われる。プローブは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製され、色素標識ヌクレオチド類似体または［３２Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の存在下で２０分間、ターミナルトランスフェラーゼ（２０ユニット）によりテール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）される。
【0075】
６．タンパク質抽出とウェスタンブロット分析
細胞（１０６）は、メーカーの推奨に従い、プロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ、およびＰＭＳＦを添加したＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ）で溶解する。溶解物は１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離され、上清を回収する。タンパク質濃度は、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）の改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質アッセイパッケージを使用して測定される。各細胞溶解物３０μｇを還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（ＤＴＴなし）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファに添加し、３分間煮沸してから６～８％ポリアクリルアミドゲルにロードする。タンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットされて、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング試薬（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＢ）により室温で２時間インキュベートされる。次に、一次抗体を試薬に適用し、混合物を４℃でインキュベートする。一晩インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで３回リンスし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性色素に対するヤギ抗マウスＩｇＧ結合二次抗体（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に室温で１時間曝露する。さらに３回のＴＢＳ－Ｔリンスの後、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ＩｍａｇｅｒおよびＯｄｙｓｓｅｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用してイムノブロットの蛍光スキャンと画像分析を実施する。
細胞（１０６）は、メーカーの推奨に従い、プロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ、およびＰＭＳＦを添加したＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ溶解／抽出試薬（Ｓｉｇｍａ）で溶解する。溶解物は１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離され、上清を回収する。タンパク質濃度は、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）の改良されたＳＯＦＴｍａｘタンパク質アッセイパッケージを使用して測定される。各細胞溶解物３０μｇを還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（ＤＴＴなし）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファに添加し、３分間煮沸してから６～８％ポリアクリルアミドゲルにロードする。タンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離され、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットされて、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング試薬（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＢ）により室温で２時間インキュベートされる。次に、一次抗体を試薬に適用し、混合物を４℃でインキュベートする。一晩インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで３回リンスし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応性色素に対するヤギ抗マウスＩｇＧ結合二次抗体（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に室温で１時間曝露する。さらに３回のＴＢＳ－Ｔリンスの後、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ＩｍａｇｅｒおよびＯｄｙｓｓｅｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を使用してイムノブロットの蛍光スキャンと画像分析を実施する。
【0076】
７．免疫染色アッセイ
細胞／組織サンプルは、１００％メタノール中で、４℃で３０分間固定され、その後４％パラホルムアルデヒド（１ｘＰＢＳ中、ｐＨ７．４）で、２０℃で１０分間固定される。その後、サンプルを０．１％～０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む１ｘＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、その後、１ｘＰＢＳで５分間３回洗浄する。免疫染色では、一次抗体をそれぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。色素標識ヤギ抗ウサギ抗体またはウマ抗マウス抗体を二次抗体として使用する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）。結果は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ）を備えた蛍光８０ｉ顕微鏡定量システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ８０ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）の下で１００倍または２００倍の倍率で検査および分析される。
細胞／組織サンプルは、１００％メタノール中で、４℃で３０分間固定され、その後４％パラホルムアルデヒド（１ｘＰＢＳ中、ｐＨ７．４）で、２０℃で１０分間固定される。その後、サンプルを０．１％～０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む１ｘＰＢＳ中で１０分間インキュベートし、その後、１ｘＰＢＳで５分間３回洗浄する。免疫染色では、一次抗体をそれぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。色素標識ヤギ抗ウサギ抗体またはウマ抗マウス抗体を二次抗体として使用する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）。結果は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ）を備えた蛍光８０ｉ顕微鏡定量システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ８０ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）の下で１００倍または２００倍の倍率で検査および分析される。
【0077】
８．Ｉｎ Ｖｉｖｏトランスフェクションアッセイ
ＲＣＲで増幅されたＲＮＡ／ｍＲＮＡとＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１～１：２０の範囲）は、メーカー推奨のプロトコルに従って、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬または他の類似のＬＮＰベースの送達／トランスフェクション剤などの適切な量の送達剤とよく混合し、その後、目的の用途に応じて、動物の静脈または筋肉に注射する。送達／トランスフェクション剤は、ＲＮＡ内容物を分解から保護するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける目的とする特定の標的細胞へのＲＮＡ／ｍＲＮＡとＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物の送達／トランスフェクションを促進するよう、増幅されたＲＮＡ／ｍＲＮＡおよびＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物を混合、結合、カプセル化、または製剤化するために使用される。
ＲＣＲで増幅されたＲＮＡ／ｍＲＮＡとＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１～１：２０の範囲）は、メーカー推奨のプロトコルに従って、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩトランスフェクション試薬または他の類似のＬＮＰベースの送達／トランスフェクション剤などの適切な量の送達剤とよく混合し、その後、目的の用途に応じて、動物の静脈または筋肉に注射する。送達／トランスフェクション剤は、ＲＮＡ内容物を分解から保護するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおける目的とする特定の標的細胞へのＲＮＡ／ｍＲＮＡとＲｄＲｐ ｍＲＮＡの混合物の送達／トランスフェクションを促進するよう、増幅されたＲＮＡ／ｍＲＮＡおよびＲｄＲｐ ｍＲＮＡ混合物を混合、結合、カプセル化、または製剤化するために使用される。
【0078】
９．統計分析
すべてのデータは平均および標準偏差（ＳＤ）として示した。各試験群の平均値はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥにより算出した。ＳＤはＳＴＤＥＶによって実施した。データの統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより実施した。ＴｕｋｅｙおよびＤｕｎｎｅｔｔのｔ事後検定（Ｔｕｋｅｙ ａｎｄ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を使用して、各グループのデータ差異の有意性を特定した。ｐ＜０．０５が有意であるとみなした（ＳＰＳＳ ｖ１２．０、Ｃｌａｒｉｔａｓ Ｉｎｃ）。
すべてのデータは平均および標準偏差（ＳＤ）として示した。各試験群の平均値はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥにより算出した。ＳＤはＳＴＤＥＶによって実施した。データの統計分析はＯｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより実施した。ＴｕｋｅｙおよびＤｕｎｎｅｔｔのｔ事後検定（Ｔｕｋｅｙ ａｎｄ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）を使用して、各グループのデータ差異の有意性を特定した。ｐ＜０．０５が有意であるとみなした（ＳＰＳＳ ｖ１２．０、Ｃｌａｒｉｔａｓ Ｉｎｃ）。
【0079】
参照文献:
１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＷＯ２００２／０９２７７４。
２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対する米国特許第７，６６２，７９１号。
３．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対する米国特許第８，０８０，６５２号。
４．Ｙｉｎｇ ＳＹ及びＳｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎに対する米国特許第８，３７２，９６９号。
５．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＹｉｎｇ ＳＹに対する米国特許第８，６０９，８３１号。
６．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＪｉ Ｈ；ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２１：９３－１０１，２００３。
７．Ｂｌｏｏｍ等；Ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ ２８：１１７－１２９，２０２１。
８．ＭｃＤｏｗｅｌｌ等；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４。
９．Ａａｓｅｎ等；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｏｒ ｐｌｕｃｋｅｄ ｈａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５：３７１－３８２，２０１０。
１０．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｍｉｒ－３０２ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｈｕｍａｎｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ＥＳ－ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ．ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８。
１１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｉｒ－３０２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１。
１２．Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ及びＹａｍａｎａｋａ Ｓ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６。
１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＷＯ２００２／０９２７７４。
２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対する米国特許第７，６６２，７９１号。
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４．Ｙｉｎｇ ＳＹ及びＳｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎに対する米国特許第８，３７２，９６９号。
５．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＹｉｎｇ ＳＹに対する米国特許第８，６０９，８３１号。
６．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＪｉ Ｈ；ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２１：９３－１０１，２００３。
７．Ｂｌｏｏｍ等；Ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ ２８：１１７－１２９，２０２１。
８．ＭｃＤｏｗｅｌｌ等；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４。
９．Ａａｓｅｎ等；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｏｒ ｐｌｕｃｋｅｄ ｈａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５：３７１－３８２，２０１０。
１０．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｍｉｒ－３０２ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｈｕｍａｎｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ＥＳ－ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ．ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８。
１１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｉｒ－３０２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１。
１２．Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ及びＹａｍａｎａｋａ Ｓ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６。
【0080】
配列表
（１）全般情報：
（ｉｉｉ）配列の数：１６
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１：
ＡＵＳＵＧＷ ６
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２：
ＵＣＷＣＹＷＡ ７
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号３：
ＡＵＣＵＧＵ ６
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号４：
ＵＣＵＣＵＡＡ ７
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号５：
ＵＣＵＣＣＵＡ ７
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号６：
ＵＵＣＡＡ ５
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号７：
ＷＣＡＳＡＵ ６
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号８：
ＵＷＲＧＷＲ ６
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号９：
ＡＣＡＧＡＵ ６
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１０：
ＵＵＡＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１１：
ＵＡＧＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１２：
ＵＵＧＡＡ ５
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１３：
ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ ２３
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１４：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１５：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ ５６
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１６：
ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ ３２
（１）全般情報：
（ｉｉｉ）配列の数：１６
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１：
ＡＵＳＵＧＷ ６
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２：
ＵＣＷＣＹＷＡ ７
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号３：
ＡＵＣＵＧＵ ６
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号４：
ＵＣＵＣＵＡＡ ７
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号５：
ＵＣＵＣＣＵＡ ７
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号６：
ＵＵＣＡＡ ５
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号７：
ＷＣＡＳＡＵ ６
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号８：
ＵＷＲＧＷＲ ６
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号９：
ＡＣＡＧＡＵ ６
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１０：
ＵＵＡＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１１：
ＵＡＧＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１２：
ＵＵＧＡＡ ５
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１３：
ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ ２３
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１４：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１５：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ ５６
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１６：
ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ ３２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】