特表 2024-523033 新規の三重特異的結合分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-25

(54)【発明の名称】新規の三重特異的結合分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240618BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240618BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240618BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240618BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240618BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240618BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240618BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K39/395 Y

A61K45/00

A61P1/00

A61P1/18

A61P35/00

A61P43/00 111

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577390

(86)(22)【出願日】2022-06-15

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 EP2022066298

(87)【国際公開番号】W WO2022263507

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】21180033.9

(32)【優先日】2021-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503385923

【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】アダム，パウル

(72)【発明者】

【氏名】コミュー，スティーヴン・アール

(72)【発明者】

【氏名】ゴーマン，フィリップ・ニコラス

(72)【発明者】

【氏名】グプタ，パンカジ

(72)【発明者】

【氏名】グプタ，プリヤンカー

(72)【発明者】

【氏名】ハイダー，カール－ハインツ

(72)【発明者】

【氏名】カストゥリランガン，シュリナス

(72)【発明者】

【氏名】コノピツキー，レナート

(72)【発明者】

【氏名】キューンケル，クラウス－ペーター

(72)【発明者】

【氏名】クマール，サンディープ

(72)【発明者】

【氏名】マーク，タネーシャ・アン－タナラ

(72)【発明者】

【氏名】オステルマン，エーリンボーグ・カトリン

(72)【発明者】

【氏名】シャーバン，アブドゥルサラム

(72)【発明者】

【氏名】ヴァイスマン，デヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルニッツニヒ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ヤング，デヴィッド・エス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC01

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、新規の三重特異的結合分子に関する。本発明はまた、そのような結合分子をコードする核酸；そのような結合分子を調製するための方法；そのような結合分子を発現する、又は発現することが可能な宿主細胞；そのような結合分子を含む組成物；及び、特に癌疾患の分野における治療目的のための、そのような結合分子又はそのような組成物の使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）Ｋｄ≧１nMで栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、
（ｂ）カドヘリン－１７（ＣＤＨ１７）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位であって、ＣＤＨ１７に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）からなる群より選択される抗原結合部位：
（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３３（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３５（ＣＤＲ１）、配列番号３６（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｉｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３９（ＣＤＲ１）、配列番号４０（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位、及び
（ｃ）分化クラスター３（ＣＤ３）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む結合分子。

【請求項2】

ＴＲＯＰ２に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｖｉ）：
（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、及び配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）、及び配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｖｉ）配列番号２７（ＣＤＲ１）、配列番号２８（ＣＤＲ２）、及び配列番号２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３０（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号３１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位からなる群より選択される、請求項１に記載の結合分子。

【請求項3】

ＴＲＯＰ２に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｉｉ）：
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
又は
（ｘｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位からなる群より選択される、請求項１又は２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項4】

ＣＤＨ１７に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
ならびに
（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項5】

ＣＤ３に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｘｘｉ）：
（ｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号５８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６３（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７２（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７６（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７８（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｘｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項6】

ＣＤ３に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｖｉ）：
（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号：１１６、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２３、及び配列番号１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１１９及び配列番号１２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２５、配列番号１２６、及び配列番号１２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２８及び配列番号１３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３４及び配列番号１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号１３８及び配列番号１５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号１４４及び配列番号１４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５３、及び配列番号１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号１４９及び配列番号１５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１５０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；及び
（ｘｖｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項7】

前記結合分子が、修飾された免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは修飾されたＩｇＧ分子であり、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位及びＣＤＨ１７に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、前記Ｉｇ分子の可変領域中に存在し、ＣＤ３に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位が、前記ＴＲＯＰ２－ＣＤＨ１７特異的Ｉｇ分子に融合されたｓｃＦｖである、請求項１～６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項8】

前記ｓｃＦｖが、前記Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端、好ましくはＣＤＨ１７に特異的に結合する前記少なくとも１つの抗原結合部位を含む前記Ｉｇ分子の一部の重鎖に融合されている、請求項７に記載の結合分子。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載の結合分子であって、前記結合分子が：
（ａ）
（ａ－ｉ）～（ａ－ｘｉｉ）：
（ａ－ｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖ）配列番号１７７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｘ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ａ－ｘｉｉ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖より選択され、好ましくはペプチドリンカーにより一緒に連結された、第１の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の組み合わせ；
及び
（ｂ）
（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｘｉｉ）：
（ｂ－ｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ｂ－ｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖より選択され、好ましくはペプチドリンカーにより一緒に連結された、第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせ；
及び
（ｃ）配列番号２２２～２６４からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、好ましくは、前記第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせの免疫グロブリン重鎖のＣ末端に連結された、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む結合分子。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の結合分子であって、前記結合分子が：
（ａ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；又は
（ｋ）配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列を含む又はそれからなる結合分子。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子をコードする核酸分子、又はその一部。

【請求項12】

請求項１１に記載の１つ又は複数の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子を産生する方法であって、前記方法が、工程：
（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子の発現を可能にする条件下で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｂ）場合により、前記分子を回収すること；ならびに、場合により、
（ｃ）前記結合分子をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化することを含む方法。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の１つ又は複数の結合分子、及び場合により、医薬的に許容可能な担体を含む又はそれらからなる医薬組成物。

【請求項16】

医学における使用のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子、又は請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

癌を処置、寛解、又は予防する方法における使用のための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子、又は請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子、又は請求項１５に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を処置、予防、又は寛解する方法。

【請求項19】

癌を処置、予防、又は寛解するための医薬組成物を調製するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合分子の使用。

【請求項20】

前記癌が結腸直腸癌（ＣＲＣ）、胃癌（ＧＣ）、もしくは膵臓癌（ＰＡＣ）である、請求項１７に記載の使用のための結合分子もしくは医薬組成物、請求項１８に記載の方法、又は請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

前記結合分子が、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体もしくは抗ＰＤ－１－Ｌ１抗体との組み合わせにおいて使用される、請求項１７に記載の使用のための結合分子もしくは医薬組成物、請求項１８に記載の方法、又は請求項１９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規の三重特異的結合分子に関する。本発明はまた、そのような結合分子をコードする核酸；そのような結合分子を調製するための方法；そのような結合分子を発現する、又は発現することが可能な宿主細胞；そのような結合分子を含む組成物；及び、特に癌疾患の分野における治療目的のための、そのような結合分子又はそのような組成物の使用に関する。

【0002】

発明の背景
癌は、一般に、異常な細胞増殖及び癌性細胞が身体全体に侵入する又は広がる潜在力に基づいた疾患の群である。それは深刻な疾患であり、世界的に主要な死亡の原因となっている。

【0003】

処置の種々の方法が、癌を管理する、一部の場合では処置する試みにおいて、手術、化学療法、放射線治療、及びホルモン治療を含めて、使用されてきた。また、抗体は、癌の処置のための強力な治療薬剤となる潜在力を提供する。抗体は、細胞の表面上の特定のタンパク質、それらの標的抗原を認識して、結合するように設計されている。この結合は、例えば、標的抗原を発現する細胞型、標的抗原タンパク質の機能、又は抗体自体の構造に依存して、多数の異なる生物学的応答を誘発し得る。

【0004】

一部の抗体は、例えば、癌細胞に直接的に結合し、例えば、細胞経路に干渉することにより、これらの細胞の細胞分裂を停止又は低下させ、それにより、異常な細胞増殖を遅延又は防止することができる。あるいは、そのような癌細胞標的化抗体はまた、薬物や放射性粒子を付着させることができ、それにより、これらの治療薬を癌細胞に送達し、細胞の固有経路とは独立して作用する。これらの癌細胞標的化方法とは異なるアプローチは、免疫系を誘導して癌細胞を攻撃して殺傷することができる抗体に基づいている。これは、免疫細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞などを癌細胞に方向転換することにより、又は免疫系自体の活性に直接的に影響を及ぼすことにより達成することができる。

【0005】

癌細胞標的化アプローチならびに免疫細胞方向転換アプローチの両方が、癌の処置のための強力な作用機序（ＭｏＡ）を提供するが、それらは、しばしば、癌細胞特異的マーカー、即ち、非癌細胞により発現されない、又はほとんど発現されない標的タンパク質の発現に頼っている。そのような腫瘍特異的標的タンパク質は稀であり、この不足は依然として、癌特異的な治療法の開発において典型的に直面する主要な欠点のままである。

【0006】

免疫細胞を、より広範囲に発現する系統抗原に方向転換する試みがなされてきた一方で、これらの治療法の価値は、特定の正常組織におけるこれらの抗原の発現、例えば、胃腸管におけるＥｐｃａｍの発現などにより起こされる毒性により限定されてきた（Kebenko et al., Oncoimmunology 2018, Vol. 7, No. 8）。部位外抗原発現に関連する毒性を低下させるための種々のアプローチが現在追求されている一方で、毒性が、多くの化合物について依然として用量制限となっている。

【0007】

このように、近年中に特定の癌の処置における進歩があり、多数の異なるアプローチが現在追求されているとの事実にもかかわらず、癌の処置のための新規の治療的に適切な化合物を提供する必要性が依然としてある。このように、種々の癌疾患の処置において使用することができる、そのような薬理学的に活性な薬剤を提供することが、本発明の目的である。

【0008】

特に、現在使用されている及び／又は当技術分野において公知である薬剤、組成物、及び／又は方法と比較して特定の利点を提供する、そのような薬理学的に活性な薬剤、組成物、及び／又は処置の方法を提供することが、本発明の目的である。これらの利点は、特に当技術分野において既に公知の候補薬物と比較した場合の、インビボでの有効性、改善された治療特性及び薬理学的特性、より少ない副作用、ならびに他の有利な特性、例えば調製の改善された容易さ又は製品の低下したコストなどを含む。

【0009】

この必要性は、本明細書中で提供される実施形態により対処される。

【0010】

発明の簡単な概要
本発明は、単一の結合分子内で３つの抗原結合部位、すなわち、栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）に特異的に結合する第１の抗原結合部位、カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）に特異的に結合する第２の抗原結合部位、及び分化クラスター３（ＣＤ３）に特異的に結合する第三の抗原結合部位を組み合わせるという概念に基づいている。以下でより詳細に考察するように、本発明の分子の１つの利点は、標的細胞に対して優れた特異性を提供する、それらの低親和性、高結合力設計である。

【0011】

それ故に、本発明の第１の態様は、以下を含む結合分子を提供する：（ａ）Ｋｄ≧１ｎＭで栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、（ｂ）カドヘリン－１７（ＣＤＨ１７）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、それにおいて、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）からなる群より選択される：（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３３（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３５（ＣＤＲ１）、配列番号３６（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；（ｉｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３９（ＣＤＲ１）、配列番号４０（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗原結合部位、及び（ｃ）分化クラスター３（ＣＤ３）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位。

【0012】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｖｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、及び配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）、及び配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｖｉ）配列番号２７（ＣＤＲ１）、配列番号２８（ＣＤＲ２）、及び配列番号２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３０（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号３１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位。

【0013】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
又は
（ｘｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0014】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
及び
（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0015】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｘｘｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号５８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６３（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７２（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７６（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７８（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｘｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位。

【0016】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｖｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号：１１６、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２３、及び配列番号１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１１９及び配列番号１２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２５、配列番号１２６、及び配列番号１２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２８及び配列番号１３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３４及び配列番号１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号１３８及び配列番号１５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号１４４及び配列番号１４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５３、及び配列番号１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号１４９及び配列番号１５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１５０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；及び
（ｘｖｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0017】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、結合分子は修飾免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは修飾ＩｇＧ分子であり、それにおいて、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位及びＣＤＨ１７に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、当該Ｉｇ分子の可変領域中に存在し、それにおいて、ＣＤ３に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、当該ＴＲＯＰ２－ＣＤＨ１７特異的Ｉｇ分子に融合されたｓｃＦｖである。

【0018】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に、好ましくは、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇ分子の一部の重鎖に融合される。

【0019】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、結合分子は：（ａ）（ａ－ｉ）～（ａ－ｘｉｉ）より選択され、好ましくはペプチドリンカーにより一緒に連結された、第１の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の組み合わせを含む：
（ａ－ｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖ）配列番号１７７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｘ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ａ－ｘｉｉ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
ならびに（ｂ）（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｉ）より選択され、好ましくはペプチドリンカーにより一緒に連結された、第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせ：
（ｂ－ｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ｂ－ｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
（ｃ）配列番号２２２～２６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは当該第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせの免疫グロブリン重鎖のＣ末端に連結された単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）。

【0020】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、結合分子は、以下を含む又はそれらからなる：
（ａ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉｉ）配列番２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；又は
（ｋ）配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列。

【0021】

本発明のさらなる態様は、以下を含む又はそれらからなる結合分子を提供する：
（ａ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；；
（ｇ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；又は
（ｋ）配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列。

【0022】

本発明はさらに、本発明の結合分子をコードする核酸分子、又はその一部に関する。本発明はさらに、本発明の１つ又は複数の核酸分子を含む発現ベクターに関する。本発明はさらに、本発明の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。

【0023】

本発明はさらに、本発明の結合分子を産生する方法に関し、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）請求項１～１１のいずれか一項に記載の結合分子の発現を可能にする条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞を培養すること；
（ｂ）場合により当該分子を回収すること；ならびに、場合により
（ｃ）当該結合分子をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化すること。

【0024】

本発明はさらに、本発明の１つ又は複数の結合分子及び場合により医薬的に許容可能な担体を含む又はそれらからなる医薬組成物に関する。

【0025】

本発明はさらに、医学における使用のための本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物に関する。本発明はさらに、癌を処置、寛解、又は予防する方法における使用のための、本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物に関する。

【0026】

本発明はさらに、本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を処置、予防、又は寛解する方法に関する。

【0027】

本発明はさらに、癌を処置、予防、又は寛解するための医薬組成物を調製するための本発明の結合分子の使用に関する。

【0028】

本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物、又は本発明の方法、又は本発明の使用の好ましい実施形態では、癌は結腸直腸癌（ＣＲＣ）、胃癌（ＧＣ）又は膵臓癌（ＰＡＣ）である。

【0029】

本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物、又は本発明の方法、又は本発明の使用の好ましい実施形態では、結合分子は、免疫チェックポイント阻害剤、好ましくは抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－１－Ｌ１抗体との組み合わせにおいて使用される。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】ＧＩ癌組織での、しかし、正常組織ではない、ＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２の共発現。腫瘍及び重要な正常組織における遺伝子発現。スケールは、ＭＡＳ５標準化発現値のｌｏｇ２変換された任意の単位である。軸ラベルは遺伝子シンボル（ＴＡＣＳＴＤ２．２０２２８６＿ｓ＿ａｔ＝Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７．２０９８４７＿ａｔ＝ＣＤＨ１７）及びAffymetrixプローブセットである。

【図2】ＧＩ腫瘍における標的発現の確認。選択されたヒト癌組織でのＴｒｏｐ２（ＥＮＺ－ＡＢＳ３８０、Ｅｎｚｏ）及びＣＤＨ１７（７６０－４８６５、Roche Ventana）に結合する抗体を使用した免疫組織化学。

【図3】本発明の例示的な三重特異的結合分子の概略図。

【図4】結合能を伴うＣＤＨ１７結合剤の選択。フローサイトメトリーによりテストされた、ヒトＣＤＨ１７を組換え発現するＨＥＫ２９３細胞株への、示された４つの異なるＣＤＨ１７結合タンパク質（二価及び一価フォーマットのいずれか）の結合。抗ＴＮＰ結合アームは、テトラニトロフェノールに対して向けられた無関係な（非結合）コントロールである。

【図5】三重特異的フォーマットにおけるＣＤＨ１７結合剤の結合能の確認。ＣＤＨ１７だけを発現する（左パネル）又はＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７を共発現する（右パネル）のいずれかのＨＥＫ２９３細胞の存在における、異なるＣＤＨ１７抗原結合部位を伴うＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３分子により媒介されるＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の上方調節。

【図6】結合能を伴うＴｒｏｐ２結合剤の選択。フローサイトメトリーによりテストされた、ヒトＴｒｏｐ２を組換え発現するＨＥＫ２９３細胞株への、示された７つの異なるＴｒｏｐ２結合剤（二価又は一価フォーマットのいずれか）の結合。抗ＴＮＰ結合アームは、テトラニトロフェノールに対して向けられた無関係な（非結合）コントロールである。

【図7】三重特異的フォーマットでのＴｒｏｐ２結合剤の結合能の確認。ＣＤＨ１７だけ（Ｃ）、Ｔｒｏｐ２だけ（Ｂ）を発現する、又はＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７（Ａ）を共発現するＨＥＫ２９３細胞の存在において、異なるＣＤＨ１７抗原結合部位を伴うＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３分子により媒介されるＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の上方調節。

【図8】細胞結合アッセイにおける種々の三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤の組み合わせの結合能の分析。フローサイトメトリーによりテストされた、ヒトＴｒｏｐ２を組換え発現する（Ａ）又はヒトＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７を共発現するＨＥＫ２９３細胞株（Ｂ）への三重特異的フォーマットにおけるＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７結合剤の異なる組み合わせの結合。抗ＴＮＰ結合アームは、テトラニトロフェノールに対して向けられた無関係な（非結合）コントロールである。

【図9】ＣＤＨ１７、Ｔｒｏｐ２のいずれかを発現する、又は両方を共発現する細胞におけるＴ細胞誘導性溶解を媒介する際での潜在力。ＣＤＨ１７（左）、Ｔｒｏｐ２（中央）、又は両方（右）のいずれかを組換え発現するＨＥＫ２９３細胞の方向転換されたＴ細胞媒介性溶解（Ａ）を、種々のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤（Ａにおいて示されているのは、１つの例示的なＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤である）ならびに１つの標的だけに一価又は二価のいずれかで結合する種々のコントロール分子を使用して評価した。Ｔｒｏｐ２だけ（左）又はＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２の両方（右）のいずれかを発現するＤＬＤ－１由来細胞株（Ｂ）の方向転換されたＴ細胞媒介溶解を、異なるＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤の組み合わせ、ならびに一価のＴｒｏｐ２結合コントロールを使用して評価した。

【図10】結合力誘導性の効力増加に対するＣＤＨ１７結合の寄与の確認。ＳＫ－ＣＯ１細胞の方向転換されたＴ細胞媒介性溶解を、異なるＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３分子ならびにＴｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３コントロール分子を使用して評価した。

【図11】ノブ・イン・ホールフォーマットの比較。ＳＫ－ＣＯ１細胞の方向転換されたＴ細胞媒介性溶解を、２つの異なるノブ・イン・ホールフォーマットにおいて三重特異的分子を使用して評価した。レジェンドにおける括弧中の参照「ホール」又は「ノブ」は、ＣＤＨ１７／ＣＤ３アームの位置を示し、即ち、「ホール」は、ＣＤＨ１７／ＣＤ３がホールアーム上にあることを示す一方で（配列番号２７１、２７２、及び４２４～４２７を参照のこと）、「ノブ」は、ＣＤＨ１７／ＣＤ３がノブアーム上にあることを示す（配列番号４２８～４３３を参照のこと）。

【図12】インビボでの腫瘍成長阻害の確認。ヒト化マウスモデルにおけるＨＰＡＦ－ＩＩ由来異種移植片腫瘍の成長に対する、異なるＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤ならびに一価コントロール結合剤の効果。

【0031】

発明の詳細な説明
本明細書では、特許出願及び製造業者のマニュアルを含む多数の文書が引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性について関連するとは考えられない一方で、その全体において参照により本明細書に組み入れられる。より具体的には、全ての参照文書は、各々の個々の文書が、参照により組み入れられることが具体的に及び個々に示されているのと同じ範囲まで、参照により組み入れられる。

【0032】

定義
本発明の上に要約された態様、ならびに本発明の他の態様及び実施形態は、本明細書中のさらなる説明から明らかになるであろうが、それにおいて：
ａ）他に示されない又は定義されない限り、使用される全ての用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、それは当業者には明らかであろう。矛盾の場合では、定義を含む特許明細書が優先される。
参照が、標準的なハンドブック、例えば、Sambrook et al, “Molecular Cloning：A Laboratory Manual”（2nd Ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989);Lewin, “Genes IV”, Oxford University Press, New York,（1990)、及びRoitt et al., “Immunology”（2nd Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York（1989)など、ならびに本明細書中で引用される一般的な背景技術になされる。さらに、他に示されない限り、具体的に詳細に記載されていない全ての方法、工程、技術、及び操作が、当業者には明らかであるように、それ自体公知の様式において実施することができ、実施されてきた。参照が、例えば、再び標準的なハンドブック、上で参照した一般的な背景技術、及びそこで引用されるさらなる参考文献になされる。
ｂ）他に示されない又は定義されない限り、用語「抗体」は、当技術分野における定義に従って使用される。抗体は、典型的には、免疫グロブリン（Ｉｇと省略される）、好ましくはガンマグロブリンタンパク質（ＩｇＧ；さらに下記も参照のこと）である。天然抗体は、脊椎動物の血液又は他の体液中に見出すことができ、そこでそれらは、外来物、例えば細菌及びウイルスなどを同定して中和するために免疫系により使用され、この機能は、抗原として公知の他の分子又は構造との共有結合的な相互作用により結合するそれらの能力により媒介される。この結合は、抗体が、高い親和性を伴って特定の構造にだけ結合するという意味において特異的である。抗体により認識される抗原の固有の部分は、エピトープ、又は抗原決定基と呼ばれる。
天然抗体（例、古典的なＹ形状免疫グロブリン分子を含む）は、典型的には、基本的な構造単位で構成されている：各々が、２つの大きな重鎖及び２つの小さな軽鎖－又はラクダ科種もしくは軟骨魚のように２つの重鎖だけ（即ち、それぞれＶ_ＨＨフラグメント及びＶ_ＮＡＲフラグメント）を伴い－それらは、例えば、１つの単位を伴う単量体、２つの単位を伴う二量体、又は５つの単位を伴う五量体を形成する。各々の重鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に３つ又は４つ（ＩｇＥの場合）の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）、ならびにＣＨ１とＣＨ２の間でのヒンジ領域が続く。各々の軽鎖は、２つのドメイン、Ｎ末端可変ドメイン（ＶＬ）及びＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）を有する。エピトープへの結合を媒介する抗体の部分は、時折、パラトープと呼ばれ、抗体の可変ドメイン、又は可変領域（Ｆｖ）中に存在する。可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）により間隔をあけられた３つのいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。フレームワーク領域は、ベータシート立体構造をとり、ＣＤＲは、ベータシート構造を接続するループを形成し得る。各々の鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域により三次元構造中に保持され、典型的には、他の鎖（存在する場合）からのＣＤＲ と一緒に、抗原への結合を媒介する。本出願内で使用される用語「定常ドメイン」又は「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメインの要約を表示する。そのような定常ドメイン及び領域は、最先端技術において周知であり、例えば、Ｋａｂａｔら（“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）により記載されている。
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体と抗原の結合において直接的に含まれず、しかし、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンは、クラスにおいて分割される：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。重鎖定常領域に従って、免疫グロブリンの異なるクラスは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２中に分割され得る。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、及びＦｃ受容体結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）において直接的に含まれる。補体活性化（ＣＤＣ）は、大半のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃ１ｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響が、特定の条件に依存的であるのに対し、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ部分中の定義された結合部位により起こされる。そのような結合部位は最先端技術において公知であり、例えば、Kellner et al. Transfus Med Hemother. 44(5)(2017)327-336により記載されている。そのような結合部位の非限定的な例は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく番号付け）である。ＩｇＧ１におけるＣ１ｑ及びＦｃガンマ受容体の結合を媒介する際にこれらの残基の間で最も決定的なのは、Ｌ２３４及びＬ２３５である（Hezareh et al., J. Virology 75(2001)12161- 12168）。サブクラスＩｇＧ１及びＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化ならびにＣ１ｑ及びＣ３結合を示すのに対し、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３に結合しない。

【0033】

用語「抗体」は、本明細書中で使用されるように、また、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの、抗原結合特性を保持する免疫グロブリンのフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、免疫グロブリンの断片化により、例えば、タンパク質分解消化により、又はそのようなフラグメントの組換え発現により得てもよい。例えば、免疫グロブリン消化は、ルーチン的な技術を用いて、例えば、パパイン又はペプシンを使用して達成することができる（ＷＯ９４／２９３４８）。抗体のパパイン消化によって、典型的には、２つの同一の抗原結合フラグメント、いわゆるＦａｂフラグメントが産生され、各々が、単一の抗原結合部位、及び残りのＦｃフラグメントを伴う。ペプシン処理によって、Ｆ（ａｂ’）２がもたらされる。Ｆａｂ分子中では、可変ドメインは、各々が、好ましくはヒト由来の免疫グロブリン定常ドメインに融合されている。このように、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメイン（いわゆるＦｄフラグメント）に融合され得るが、軽鎖可変ドメインはＣＬドメインに融合され得る。そのような分子は、当技術分野において公知の方法を使用して、宿主細胞中でのそれぞれの核酸の組換え発現により産生され得る。

【0034】

天然抗体を修飾するための、ならびに免疫グロブリンの可変ドメイン、又はそのような可変ドメインから由来する分子を、異なる分子状況に配置するための多くのアプローチが、当技術分野において記載されており、例えば、Holliger, P., Hudson, P. Nat Biotechnol 23, 1126-1136(2005)又はNilvebrant, J. et al. Current pharmaceutical design vol. 22,43(2016)：6527-6537を参照のこと。典型的には、これらの修飾の目的は、抗体を、医学及び技術においてさらにより多用途なツールにすることである。これらのアプローチは、本明細書中では「抗体誘導体」又は「修飾免疫グロブリン」としても言及される、構造的に修飾された分子に導き、それらは、しばしば、天然抗体の基本構成（即ち、２つの大きな重鎖及び２つの小さな軽鎖で構成される抗体、又はラクダ科種又は軟骨魚のように２つの重鎖だけ）とは異なる。しばしば、これらの分子は、天然抗体と比較して、サイズがより小さく、単一のアミノ酸鎖又はいくつかのアミノ酸鎖を含み得る。例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合物であり、短いリンカー、通常はセリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）で一緒に連結されている（例、ＷＯ８８／０１６４９；ＷＯ９１／１７２７１を参照のこと）。「単一ドメイン抗体」又は「ナノボディ（登録商標）」は、単一のＩｇ様ドメイン中に抗原結合部位を持つ（例、ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ０３／０５０５３１を参照のこと）。同じ又は異なる抗原についての結合特異性を伴う単一ドメイン抗体を、一緒に連結してもよい。ダイアボディは、２つの可変ドメインを含む２つのアミノ酸鎖からなる二価抗体分子である（ＷＯ９４／１３８０４）。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体（ＩｇＳＦ；Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2)：185-96）である。異なる概念は、いわゆる小型モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）に導き、それは、定常ドメインＣＨ１を欠く単鎖ヒンジ及びエフェクタードメインに連結されたＦｖドメインを含む（ＷＯ０２／０５６９１０）。しかし、一部の場合では、修飾はまた、古典的なＩｇフォーマットが、例えば、ｓｃＦｖｓなどの形態において、追加の抗原結合部位と組み合わされる場合、天然抗体よりも大きな分子に導き得る。全てのそのような抗体誘導体又は修飾された免疫グロブリンがまた、本明細書中で使用される、より一般的な用語「抗体」により包含される。

【0035】

ヒトにおける適用については、しばしば、マウスなど他の種から本来由来する抗体の免疫原性を低下させることが望ましいため、キメラ抗体の構築、又はいわゆる抗体の「ヒト化」などの修飾アプローチが開発されてきた。この文脈において、「キメラ抗体」は、異なる種（例、ヒト）から由来する配列部分（例、定常ドメイン）に融合された、１つの種（例、マウス）から由来する配列部分（例、可変ドメイン）を含む抗体であると理解される。「ヒト化抗体」は、非ヒト種から本来由来する可変ドメインを含む抗体であり、それにおいて、特定のアミノ酸が変異して、その可変ドメインの全体的な配列が、ヒト可変ドメインの配列のアミノ酸により近く似るようになっている。抗体のキメラ化及びヒト化の方法は、当技術分野において周知である（Billetta R, Lobuglio AF. “Chimeric antibodies”. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76；Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G(1988). “Reshaping human antibodies for therapy”. Nature：332:323）。用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用されるように、例えば、ファージディスプレイ又はトランスジェニック動物の使用により、ヒトゲノムから由来する配列に基づいて作製された抗体に関する（例、ＷＯ９０／０５１４４を参照のこと）。用語「抗体」は、本明細書中で使用されるように、そのようなヒト化抗体、キメラ抗体、ならびにヒト抗体を明示的に含む。

【0036】

抗体はさらに、抗体の特性に対して所望の影響を有する他の分子実体に融合（融合タンパク質として）されている、又は他の方法で（共有結合又は非共有結合により）連結され得る。例えば、抗体の薬物動態学的特性、例えば体液、例えば血液など中で、特に単鎖抗体又はドメイン抗体の場合での安定性を改善することが望ましいであろう。この点に関して、特に、循環中のそのような抗体の半減期を延長するための多数の技術、例えばペグ化（ＷＯ９８／２５９７１；ＷＯ９８／４８８３７；ＷＯ２００４０８１０２６）、融合又は他の方法で、抗体を、アルブミンのような血清タンパク質に親和性を有する別の抗体に共有結合的に付着させる（ＷＯ２００４０４１８６５；ＷＯ２００４００３０１９）、あるいはアルブミン又はトランスフェリンのような血清タンパク質の全部又は一部との融合タンパク質としての抗体の発現（ＷＯ０１／７９２５８）などが開発されている。抗体の設計におけるリードの同定及びリードの最適化のための手段及び方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Goulet, D.R. and Atkins, W.M. J Pharm Sci 2020;109(1):74-103又はTiller, K. E., & Tessier, P. M.(2015). Annual review of biomedical engineering, 17, 191-216において概説されてきた。
ｃ）「抗体模倣物」がまた開発されており、それは、典型的には、免疫グロブリン可変ドメインと離れた構造的関係だけを有する、又はそのような関係を全く有さないが、しかし、免疫グロブリン可変ドメインと同等の特定の結合特異性及び親和性を示す。そのような非免疫グロブリン「抗体模倣体」は、時折「足場タンパク質」と呼ばれ、例えば、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、及びチオレドキシンの遺伝子に基づき得る（Skerra, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18(4)：295-304）。
ｄ）本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、それらは、当技術分野において及び本明細書中で以下「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」としてそれぞれ言及され；それらのフレームワーク領域が、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」により中断されており、それらは、当技術分野において及び本明細書中で以下「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」としてそれぞれ言及される。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下のとおりに示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。抗原結合部位を保有することにより、抗原について抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
ｅ）「結合する」、「に結合する」、「特異的に結合する」、又は「に特異的に結合する」ことができる、特定のエピトープ、抗原、もしくはタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、フラグメント、もしくはエピトープ）「について親和性を有する」及び／又は「について特異性を有する」分子（例えば、本発明の結合分子、又はそのフラグメントなど）は、当該エピトープ、抗原、もしくはタンパク質「に対する」もしくは「に対して向けられる」と言われる、又はそのようなエピトープ、抗原、もしくはタンパク質に関する「結合」分子である。
ｆ）用語「抗原結合部位」は、本明細書中で使用されるように、特定の抗原への結合を与える結合分子のドメインに関する。抗原結合部位は抗体から本来由来するが、この分野における進歩は、目的の標的に対する天然抗体を生成する必要性を伴うことなく、抗原結合部位を設計する及び／又は得る追加の可能性に導いている。その起源とは無関係に、本発明に従った「抗原結合部位」は、その特定の標的抗原への結合を可能にする少なくとも最小限の構造エレメント、即ち、必要で十分な構造エレメントを含む。このように、本発明に従った「抗原結合部位」は、少なくとも３つの重鎖ＣＤＲ配列（単一ドメイン抗体の場合では）、より好ましくは少なくとも３つの軽鎖及び３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む。上で考察したように、これらのＣＤＲは、典型的には、抗体のいわゆる可変ドメイン、又は可変領域（Ｆｖ）中に存在する。抗原結合部位は、少なくとも最小限の構造エレメントを含むが、典型的には、追加エレメント（例えば、フレームワーク領域など）を包含することが理解されるであろう。このように、本発明に従って使用されるように、抗原結合部位はまた、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのそれぞれの組み合わせの配列を介して定義することができる。「抗原結合部位」がポリペプチド中に含まれること、及び／又は当該ＣＤＲ又は当該可変ドメインの各々が、ポリペプチド又はペプチドであることが、本発明に従って特に好ましい。
ｇ）結合分子又は抗原結合部位の用語「特異的結合」は、例えば、それらの交差反応性の観点において記載され得る。好ましくは、本発明の結合分子の抗原結合部位は、標的抗原のエピトープとは異なるが、しかし、標的抗原の構造と同様の構造を有するエピトープとは交差反応しない、又は本質的に交差反応しない。好ましくは、「・・・に特異的に結合する」は、具体的に列挙される標的、即ち、それぞれ抗原ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３に対して６５%未満、好ましくは７０%未満、７５%未満、８０%未満、８５%未満、９０%未満、９５%未満、最も好ましくは９８%未満の同一性（当技術分野において公知の方法を使用して算出される）を伴って標的に結合しない抗原結合部位を指す。研究中の分子のパネルの交差反応性は、例えば、目的のエピトープへの、ならびに多数の、多かれ少なかれ（構造的に及び／又は機能に）密接に関連したエピトープへの従来の条件下での分子の当該パネルの結合を評価することによりテストされ得る。その関連する状況（例、タンパク質の構造中の特定のモチーフ）において目的のエピトープに結合するが、しかし、他のエピトープのいずれにも結合しない、又は本質的に結合しない分子だけが、特異的に結合すると考えられる。対応する方法は、テキストブック文献ならびに、例えば、Brooks BD. Curr Drug Discov Technol. 2014 Jun;11(2):109-12又はAbdiche YN, et al. PLoS One. 2014 Mar 20;9(3):e92451において記載されている。

【0037】

「特異性」は、しかし、また、それらの親和性及び／又は結合力の観点において記載又は特定され得る。

【0038】

親和性は、結合分子と抗原の解離についての平衡定数（Ｋｄ）により表される、エピトープと、結合分子上の抗原結合部位の間での結合強度についての測定値である：Ｋｄの値が小さいほど、エピトープと結合分子の間での結合強度が強い（あるいは、親和性はまた、１／Ｋｄである親和性定数（Ｋａ）として表現することができる）。

【0039】

その標的に特異的に結合する抗原結合部位が、それぞれの標的、即ち、抗原ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ１７、又はＣＤ３に対して、構造的に無関係な分子よりも有意に高い結合親和性を有することが特に好ましい。このように、ＴＲＯＰ２についての抗原結合部位は、任意の他の構造的に無関係な分子よりも ＴＲＯＰ２に対して有意に高い結合親和性を有する；ＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、任意の他の構造的に無関係な分子よりも ＣＤＨ１７に対して有意に高い結合親和性を有し、ＣＤ３についての抗原結合部位は、任意の他の構造的に無関係な分子よりもＣＤ３に対して有意に高い結合親和性を有する。本発明に従って、抗原結合部位は、それが、同一条件下で、無関係な抗原に対する親和性よりも、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍より大きい、好ましくは少なくとも２０倍より大きい、及び最も好ましくは少なくとも１００倍より大きい親和性を伴って当該標的抗原に結合する場合、その標的抗原に対して有意に高い結合親和性を有すると考えられる。

【0040】

好ましい結合親和性は、結合分子に依存して変動するが、しかし、例えば、当技術分野において公知の任意の標準的な方法論を介して、好ましくは、以下及び添付の実施例において記載されるようなBiacoreアッセイを介して測定される、少なくとも１０Ｅ－４モル／リットル又はそれ以下の解離定数（Ｋｄ）を伴うものを含む。１０Ｅ－４Ｍを上回る任意のＫｄ 値は、一般的に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、抗原結合部位は、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１００nM未満、及び最も好ましくは２０nM未満のＫｄを伴って、所望の抗原に特異的に結合する。特定の結合剤、例えば本明細書中に記載されるＣＤ３についての抗原結合部位などについて、本明細書中で他に定義されない限り、解離定数（Ｋｄ）は、１０nM未満、より好ましくは５ｎＭ未満、さらにより好ましくは２nM未満であることが好ましい。

【0041】

結合力は、結合分子（例えば、本発明の結合分子、又はそのフラグメントなど）と関連抗原の間での結合の強さの測定値である。結合力は、エピトープと、結合分子上のその抗原結合部位の間での親和性、及び結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。

【0042】

当業者には（例えば、本明細書中のさらなる開示に基づいて）明らかなように、特異的結合は、目的の特定の抗原に依存して、当技術分野においてそれ自体公知の手段及び方法を使用して決定することができる。そのような手段及び方法は、限定されないが、例えば、精製された野生型抗原を用いた、スキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ、ならびにプラズモン共鳴アッセイ（Malmqvist M., Curr Opin Immunol. 1993 Apr;5(2):282-6.）を含む。抗体親和性はまた、速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）技術を使用して測定することができる（Darling, R.J., and Brault P-A., ASSAY and Drug Development Technologies. 2004, Dec 2(6)：647-657）。好ましくは、特異的結合は、精製された野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイにより測定される。より好ましくは、Ｋｄ値を決定するための方法は、例えば、以下の実施例３．２において記載されるように、Biacoreアッセイに基づく。このように、本明細書中で言及される任意のＫｄ値は、Biacore 4000上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介して得られるＫｄ値であることが好ましく、それにおいて、目的の結合分子は、１０μl/分で６０秒間にわたり、プロテインＡ／Ｇを介してセンサー表面上に捕捉され、次に、それぞれの標的分子（例、ヒトＴｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、又はＣＤ３）を、好ましくは１００nMの濃度で、３０μl/分で１８０秒間の会合に適用し、その後にＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中での１２０秒間の解離が続いた。
ｈ）アミノ酸残基は、当技術分野で一般的に公知であり、合意されている、標準的な３文字又は１文字のアミノ酸コードに従って示される。２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸の差」は、第２の配列と比較した、参照配列の位置での示された数のアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換を指す。置換の場合では、そのような置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換であり、それは、アミノ酸残基が、同様の化学構造の別のアミノ酸残基で置換され、それが、ポリペプチドの機能、活性、又は他の生物学的特性に対するほとんど又は本質的に無の影響を有することを意味する。そのような保存的アミノ酸置換は、例えば、ＷＯ９８／４９１８５から当技術分野において周知であり、それにおいて、保存的アミノ酸置換は、好ましくは、以下の群（ｉ）～（ｖ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基により置換される置換である：（ｉ）小さな脂肪族、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；（ｉｉ）極性の負に帯電した残基及びそれらの（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｉｎ；（ｉｉｉ）極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；（ｉｖ）大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ；ならびに（ｖ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ。特に好ましい保存的アミノ酸置換は、以下のとおりである：
ＡｌａからＧＩｙ又はＳｅｒ；
ＡｒｇからＬｙｓ；
ＡｓｎからＧｉｎ又はＨｉｓ；
ＡｓｐからＧＩｕ；
ＣｙｓからＳｅｒ；
ＧｉｎからＡｓｎ；
ＧＩｕからＡｓｐ；
ＧＩｙからＡｌａ又はＰｒｏ；
ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｉｎ；
ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａＩ；
ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａＩ；
ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｉｎ、又はＧＩｕ；
ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、又はＩｌｅ；
ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ、又はＴｙｒ；
ＳｅｒからＴｈｒ；
ＴｈｒからＳｅｒ；
ＴｒｐからＴｙｒ；
ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；
ＶａＩからＩｌｅ又はＬｅｕ。
ｉ）用語「単離された」は、本明細書中で使用されるように、その本来の環境又は自然環境（例、それが天然で生じる場合は自然環境）から除去された物質を指す。例えば、生きた動物において存在する天然核酸分子又はポリペプチドは、単離されていないが、しかし、同じ核酸分子又はポリペプチドが、自然システムにおける共存物質の一部又は全てからのヒトの介入により分離されており、単離されている。そのような核酸分子は、ベクターの一部であり得る、及び／又はそのような核酸分子又はポリペプチドは、組成物の一部であり得るが、そのようなベクター又は組成物が、核酸分子又はポリペプチドが自然において見出される環境の一部ではないという点で依然として単離されている。例えば、核酸分子又はポリペプチドは、その天然の生物学的供給源及び／又はそれが得られた反応培地もしくは培養培地と比較して、それが、当該供給源又は培地中で通常会合する少なくとも１つの他の成分、例えば別の核酸分子、別のポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物もしくは微量成分などから分離されている場合、「本質的に単離された（形態）」であると考えられる。特に、核酸分子又はポリペプチドは、それが、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、及び１０００倍又はそれ以上まで精製された場合、「本質的に単離された」と考えられる。「本質的に単離された形態」である核酸分子又はポリペプチドは、好ましくは、適切な技術、例えば適切なクロマトグラフィー技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを使用して決定されるように、本質的に均質である。本発明の結合分子及び核酸は、好ましくは単離される。
ｊ）他に示さない限り、本明細書中で使用される用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「結合分子配列」、又は「ポリペプチド配列」のような用語）は、一般的に、文脈によって、より限定された解釈が要求されない限り、関連するアミノ酸配列ならびに核酸配列又は同をコードするヌクレオチド配列の両方を含むと理解すべきである。
ｋ）本明細書中で使用される場合、用語「同一」又は「同一性パーセント」は、２つ又はそれ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、最大の対応のために比較及び整列された場合に、同じである、あるいは同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ又はそれ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較目的のために整列させる（例、ギャップを、第２のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸の配列又は核酸配列中に導入することができる）。対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが次に、比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められている場合、次に分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一の位置の数の関数である（即ち、同一性%＝同一位置の数／位置の総数（例、重複する位置）×１００）。一部の実施形態では、比較される２つの配列は、ギャップが、適切な場合に、配列内に導入された後は同じ長さである（例、比較されている配列を超えて延びる追加の配列を除く）。例えば、可変領域配列を比較する場合、リーダー及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間の配列比較について、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列中の同じ位置にあるＣＤＲ（例、各々の配列のＣＤＲ－Ｈ１）を指す。

【0043】

２つの配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるように改変されている。そのようなアルゴリズムはAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み入れられる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）で実施して、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためにギャップアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴを、Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402において記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい、非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み入れられている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用することができる。配列分析のための追加のアルゴリズムが、当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5において記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；ならびにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8において記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ 内では、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定するコントロールオプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較されている２つの配列中の類似領域が、整列された残基のペアを調べることにより見出される；ｋｔｕｐ＝１の場合、単一の整列されたアミノ酸が検証される。ｋｔｕｐは、タンパク質配列については２又は１、あるいはＤＮＡ配列については１～６に設定することができる。ｋｔｕｐが特定されていない場合のデフォルトは、タンパク質については２及びＤＮＡについては６である。あるいは、タンパク質配列アラインメントは、Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402により記載されるように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行われ得る。好ましくは、上に記載されるＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムが使用される。
ｌ）用語「含む」は、本明細書中で使用されるように、さらなる成分及び／又は工程が、具体的に列挙された成分及び／又は工程に加えて、含まれ得ることを意味する。しかし、この用語はまた、特許請求の範囲に記載された主題が、正確に、列挙された成分及び／又は工程からなることを包含する。
ｍ）本明細書中で使用されるように、用語「少なくとも」は、具体的に列挙された数及びそれより大きい任意の数を含む任意の数を指す。例えば、「少なくとも１つ」は、正確に１、ならびに１を上回る、限定されないが、２、例えば、３又は４を含む、を包含する。さらに含まれるのは、例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、例えば２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００、ならびに、これらの具体的に列挙される数の間又はそれを上回る数字における任意の整数である。用語「少なくとも１つの抗原結合部位」に関しては、当該用語が、１、２、３、又は４つの抗原結合部位を包含することが特に好ましい。最も好ましくは、当該用語は、正確には、１つの抗原結合部位に関する。１を上回る抗原結合部位が、標的について選ばれる場合、これらの複数の抗原結合部位は、独立して選ぶことができ、即ち、それらは同一であることができる、又はそれらは互いに異なることができる。
ｎ）本明細書中で使用される用語「ポリペプチド」は、３０を上回るアミノ酸を含む、単鎖ポリペプチド又はそのフラグメントを含む、アミノ酸の直鎖分子鎖を記載する。他方で、本発明中で使用される用語「ペプチド」は、３０までのアミノ酸を含むアミノ酸の直鎖を記載する。本発明に従って使用される用語「（ポリ）ペプチド」は、３０までのアミノ酸からなるペプチドの群、ならびに３０を上回るアミノ酸からなるポリペプチドの群を含む分子群を指す。
ｏ）用語「リンカー」は、本明細書中で使用されるように、ペプチドリンカー、即ち、アミノ酸の配列、ならびに非ペプチドリンカーの両方を包含し、それらは、分子の個々の部分を共有結合的に又は非共有結合的に接続する。用語「非ペプチドリンカー」は、本明細書中で使用されるように、２つ又はそれ以上の反応性基を有するが、しかし、以下に定義するペプチドリンカーを除く連結基を指す。例えば、非ペプチドリンカーは、反応性基を両方の端に有するポリマーであり得るが、それは、本発明の分子の結合部分の反応性基、例えば、アミノ末端、リジン残基、ヒスチジン残基、又はシステイン残基に個々に結合する。ポリマーの反応性基は、アルデヒド基、プロピオン酸アルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、ケトン基、ビニルスルホン基、チオール基、ヒドラジド基、カルボニルジミダゾール（ＣＤＩ）基、ニトロフェニルカーボネート（ＮＰＣ）基、トリシレート基、イソシアネート基、及びスクシンイミド誘導体を含む。スクシンイミド誘導体の例は、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、スクシンイミジルブタン酸（ＳＢＡ）、スクシンイミジルカルボキシメチラート（ＳＣＭ）、スクシンイミジルスクシンアミド（ＳＳＡ）、スクシンイミジルコハク酸（ＳＳ）、スクシンイミジルカーボネート、及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む。非ペプチドポリマーの両方の端での反応性基は、同じであり得る又は異なり得る。例えば、非ペプチドポリマーは、１つの端にマレイミド基を、別の端にアルデヒド基を有し得る。

【0044】

ペプチドリンカーは、本明細書中で想定されるように、少なくとも１アミノ酸の長さの（ポリ）ペプチドリンカーである。好ましくは、リンカーは１～１００アミノ酸の長さである。より好ましくは、リンカーは５～５０アミノ酸の長さであり、より好ましくは１０～４０アミノ酸の長さであり、さらにより好ましくは、リンカーは１５～３０アミノ酸の長さである。しばしば使用される小さなリンカーの非限定的な例は、ＧＳミニリンカーと呼ばれるグリシン及びセリンアミノ酸の配列を含む。これらのリンカー中のアミノ酸の数は変動し得るが、例えば、それらは、４（ＧＧＧＳ）（配列番号２７３）、又は６（ＧＧＳＧＧＳ）（配列番号２７４）、又はそれらの倍数、例えば、これらの４／６つのアミノ酸の２つあるいは３つ又はそれ以上のリピートなどであり得る。最も好ましくは、そのようなＧＳミニリンカーは、２０アミノ酸及び配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２７５）を有する。

【0045】

目的の分子が単一のポリペプチド鎖である場合、リンカーはペプチドリンカーであることが、当業者により理解されるであろう。

【0046】

性質、即ち、リンカーの長さ及び／又は組成、例えばアミノ酸配列などが、リンカーを含む分子の安定性及び／又は溶解性を改変又は増強し得ることは、当技術分野において公知である。典型的には、リンカーの長さ及び配列は、それぞれの目的の分子の組成に依存して選ばれる。当業者は、異なるリンカーの適合性を設計及びテストする方法を十分に知っており、例えば、Volkel, T. et al. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 14, Issue 10, 2001, Pages 815-823を参照のこと。例えば、分子の特性は、本発明の分子の結合部分の結合親和性を比較することにより簡単にテストすることができる。本発明の三重特異的分子の場合では、各々の結合部分についてのそれぞれの測定を、別々に行ってもよい。結果として得られた分子の安定性は、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用して測定し、ヒト血清中での３７℃で数時間にわたるインキュベーション後の分子の残留結合能力を決定することができる。他の適切なテストは、例えば、Brian R. Miller, B.R. et al. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 23, Issue 7, 2010, Pages 549-557又はKugler, M. et al. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 22, Issue 3, 2009, Pages 135-147において見出すことができる。
（ｐ）用語「核酸分子」は、本発明に従って、本明細書中で用語「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、ＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡなど、及びＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。さらに含まれるのは、当技術分野において公知の核酸模倣分子、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成又は半合成誘導体及び混合ポリマーなどである。本発明に従ったそのような核酸模倣分子又は核酸誘導体は、ホスホロチオエート核酸、ホスホロアミデート核酸、２’－Ｏ－メトキシエチルリボ核酸、モルホリノ核酸、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）及びロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、リボース環が、２’酸素と４’炭素の間でのメチレン連結により拘束されているＲＮＡ 誘導体である。それらは、当業者により容易に理解されるように、追加の非天然又は誘導体ヌクレオチド塩基を含み得る。

【0047】

本発明の三重特異的結合分子
本発明は、以下を含む結合分子に関する：（ａ）栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）、好ましくはヒトＴＲＯＰ２にＫｄ≧１nMを伴って特異的に結合する少なくとも １つの抗原結合部位、（ｂ）カドヘリン１７（ＣＤＨ１７）、好ましくはヒトＣＤＨ１７に、Ｋｄ≧１０nMを伴って、好ましくはＫｄ≧１００nMを伴って特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、及び（ｃ）分化クラスター３（ＣＤ３）、好ましくはヒトＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位。

【0048】

このように、本発明の結合分子（本明細書中では「本発明のタンパク質」又は「本発明の結合剤」としても言及される）は、少なくとも具体的に列挙された３つの異なる抗原結合部位、即ち、ＴＲＯＰ２についての少なくとも１つの結合部位、ＣＤＨ１７についての少なくとも１つの結合部位、及びＣＤ３についての少なくとも１つの結合部位を含む。これらの３つの特異性のため、本発明の結合分子はまた、本明細書中では本発明の「三重特異的結合分子」として言及される。

【0049】

用語ＴＲＯＰ２は、本明細書中で使用されるように、「栄養膜細胞表面抗原２」を指す。ＴＲＯＰ２は、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー（ＴＡＣＳＴＤ）のファミリーに属し、クローディン７及びクローディン１の安定性のために要求される。ヒトＴＲＯＰ２は、配列番号４１９ならびにデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０９７５８により表される。

【0050】

用語ＣＤＨ１７は、本明細書中で使用されるように、「カドヘリン１７」を指す。ＣＤＨ１７は、カルシウム依存性の膜関連糖タンパク質のカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。コードされたタンパク質は、カドヘリン様で、７つのカドヘリンドメインを含む細胞外領域、及び膜貫通領域からなるが、しかし、保存された細胞質ドメインを欠く。胃腸管及び膵管におけるタンパク質の発現が、報告されている。ヒトＣＤＨ１７は、配列番号４２０により、ならびにデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１２８６４において表される。

【0051】

用語ＣＤ３は、本明細書中で使用されるように、「分化クラスター３」を指す。ＣＤ３はタンパク質複合体であり、細胞傷害性Ｔ細胞、即ち、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞及びヘルパーＴ細胞、即ち、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の両方を活性化する際に含まれるＴ細胞共受容体である。ＣＤ３は、４つの異なる鎖で構成されており、それにおいて、複合体は、哺乳動物において、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含む。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖（ゼータ鎖）と一緒に、ＣＤ３は、Ｔリンパ球中で活性化シグナルを生成する。ヒトＣＤ３は、配列番号４２１により、ならびにＣＤ３ デルタ鎖、配列番号４２２についてはデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４２３４により、ならびにＣＤ３イプシロン鎖、配列番号４２３についてはデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０７７６６により、ならびにＣＤ３ガンマ鎖及び配列番号４２４についてはデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０９６９３により、ならびにＣＤ３ゼータ鎖についてはデータベースアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２０９６３により表される。

【0052】

抗原結合部位の一般的な構造は、当技術分野において周知であり、例えば、上の本明細書中で考察されるように、単一ドメイン、例えばエピトープ結合ドメイン、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメイン、又は対合ＶＨ／ＶＬドメインなどであり得る。好ましい実施形態では、抗原結合部位は、少なくとも軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含む。

【0053】

一般的な定義に関して考察されるように、抗原結合部位は、それぞれの標的抗原に特異的に結合することが要求される。また、本発明の結合分子は、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７にそれぞれ特異的に結合する抗原結合部位が、ＴＲＯＰ２の場合において１nMを下回るＫｄで、ＤＨ１７の場合において１０nMを下回る（好ましくは１００nMを下回る）Ｋｄで結合することにおいてさらに特徴付けられる。換言すれば、当該抗原結合部位は、それらの標的抗原について特異的であることが要求される一方で、それらは、強い結合親和性のために選択されるのではなく、しかし、代わりに、両方の標的の存在においてだけ、本発明の結合分子の強い結合を可能にするより低い親和性を伴って結合することが要求される。以下でさらに詳細に考察するように、及び実施例（特に実施例６～８）において示されるように、これらの２つの抗原結合部位が、それらのそれぞれの抗原に対する低下した親和性を有するという要件によって、低い一価の結合、しかし、両方の標的の存在において、結合力に起因して、本発明の結果として得られる三重特異的結合分子の増強された結合がもたらされることが見出された。ＴＲＯＰ２についての抗原結合部位は、１nM～２０nMの間、より好ましくは１nM～１０nMの間、さらにより好ましくは１nM～４nMの間のＫｄを有することが特に好ましい。最も好ましくは、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗原結合部位は、２nM～５nMの間のＫｄを有する。さらに、ＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、１０nM～２００nMの間、より好ましくは５０nM～１５０nMの間、さらにより好ましくは７５nM～１２５nMの間のＫｄを有することが特に好ましい。最も好ましくは、ＣＤＨ１７に特異的に結合する抗原結合部位は、１００nM～１２０nMの間であるＫｄを有する。好ましくは、当該Ｋｄは、Biacore 4000上のＳＰＲに関して上に記載されたように決定される。

【0054】

本発明に従って、そのような低下した親和性結合剤の要件は、ＣＤ３に結合する抗原結合部位については必要ない。このように、本明細書中で上に述べられているように、ＣＤ３を標的化する抗原結合部位については、結合剤が、５００nM未満、好ましくは２００nM未満、より好ましくは１０nM未満のＫｄを伴って、及び、最も好ましくは２ｎＭ未満のＫｄを伴って結合することが特に好ましい。ＣＤ３に特異的に結合する多数の抗原結合部位が、当技術分野において、例えば、ＷＯ２００４１０６３８３において記載されており、ここで、Ｘ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１ Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、ＷＴ３１、及びＦ１０１．０１．ｅ、ならびにＳＰ３４からなる群より選択される抗体から由来する周知の抗原結合部位が記載されている。特に、ＷＯ２００４１０６３８３は、ＶＨ領域及びＶＬ領域が、例えば、ヒトＣＤ３－ε鎖についてのトランスジェニックのマウス細胞において、他のＴＣＲサブユニットの状況においてヒトＣＤ３－ε鎖を特異的に認識することが可能である抗体／抗体誘導体及び同様のものから由来することを記載している。適切なＣＤ３特異的抗原結合部位のさらなる非限定的な例が、ＵＳ２０１８０１１８８４８、Ｗ０２０１１０９０７６２（例、ＣＲＩＳ－７、ＯＫＴ３、ＨＵ２９１、Ｇ１９－４）、ＵＳ９７８２４７８、ＵＳ２０１８０１１８８２７（ＳＰ３４改変）、ＵＳ２０１６０１４５３４０（ＳＰ３４改変）、ＵＳ９２１２２２５（例：ＳＰ３４ ＣＤＲの改変）、ＵＳ１０１７４１２４（クローン４０Ｇ５Ｃ及び３８Ｅ４．Ｖ１を含むＣＤ３ハイブリドーマクローン）、ＵＳ９９１４７７６及びＷＯ２０２０１２７６１９（ＳＰ３４改変）ＵＳ７，７２８，１１４、ＵＳ５９２９２１２、ＷＯ２０１４０４７２３１（ＯＫＴ３又はＣＲＩＳ－７に基づく）、ＷＯ２００４１０８１５８（ＯＫＴ３に基づく）、ＷＯ２００７０３３２０（ＣＤ３クローン２８Ｆ１１、２７Ｈ５、２３Ｆ１０、１５Ｃ３）、ＵＳ１００６６０１５（ＳＰ３４改変）、ＷＯ２０１８２０１０５１（ＳＰ３４改変）、ＷＯ２０１９１１８７１、ＵＳ９９７５９６６２、ＵＳ２０１８０３２６０５８、ＷＯ２０１９１３１９８８（ＳＰ３４（ｍｕ、ｈｕ）、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１．ｖ９、ＵＣＨＴ１、ｖ１、ＵＣＨＴ１．ｖＭ１、ＨＵ４０Ｇ５Ｃ、３８Ｅ４．Ｖ１、抗ＣＤ３クローンＡＮ１０４、ＡＮ１１９、ＡＮ１２１、ＡＮ３９５を含む）、ＵＳ２０１８０１６１４２８、ＷＯ２０１９０７５３７８（ＳＰ３４ ＣＤＲバリアント）、ＷＯ２０１６１８７５９４（例、ムロモナブ ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、Ｘ３５、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、及びＷＴ－３１）、ＵＳ１００６６０１６（ＳＰ３４ ＣＤＲバリアント）、ＷＯ２０１８０２０９２９８（ｔｒｉｔａｃ）、又はＵＳ１０５４４２２１（ＳＰ３４ ＣＤＲバリアント）において提供される。

【0055】

列挙された標的についての抗原結合部位は、本明細書中に記載される抗原結合部位から、当技術分野において記載される抗原結合部位（例えば、上で詳述されている、ＣＤ３について当技術分野において公知のものなど）から、又は新たに開発された抗原結合から当業者により選ばれ得るが、各々の場合において、特異性に関する、上に記載される前提条件（即ち、それぞれの標的についての、しかし、上で定義したようにＫｄが低すぎないという条件で、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７についての特異的結合）が満たされることを条件とする。これらの要件をテストするための手段及び方法が上で提供されており、さらなる面倒を伴うことなく、当業者により適用されることができる。

【0056】

本発明の結合分子の抗原結合部位が、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）として列挙されているのに対し、この列挙は、特定の順番又は配置を指示することを意図しない。このように、抗原結合部位は、本発明の結合分子内での任意の順番、例えば、（ａ）－（ｂ）－（ｃ）、（ｂ）－（ｃ）－（ａ）、（ｃ）－（ａ）－（ｂ）、（ｂ）－（ａ）－（ｃ）などの順番において配置することができる。本発明の結合分子内の抗原結合部位の好ましい配置が、以下でさらに詳述されている。

【0057】

重要なことは、本発明の結合分子は、全ての３つの標的（ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３）を（実質的に）同時に結合することが可能である。したがって、全ての３つの標的が存在する条件で、本発明の結合分子は、それらの全て３つに結合し、それにより、Ｔ細胞エンゲージャー（ＴｃＥ）として作用する：それは、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合し、このように、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７の両方を発現する腫瘍細胞にＴ細胞を近接させる。目的の結合分子が、標的細胞の表面上のＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７の両方に結合することが可能であり、Ｔ細胞活性を誘導することができるか否かは、例えば、抗原を内因的に発現する組換えＨＥＫ２９３細胞又は癌細胞株（例えば、結腸直腸癌 ＤＬＤ－１細胞株など）（それらの両方が、実施例９において記載されている）を使用して、添付の実施例において記載されるように決定することができる。

【0058】

好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３について具体的に列挙されている３つの抗原結合部位以外のさらなる抗原結合部位を含まない。さらにより好ましくは、本発明の結合分子は、三重特異的及び三価である、即ち、それは、３つの抗原標的の各々について１つの結合部位を含む。

【0059】

本発明の結合分子は、それが、少なくとも具体的に列挙される３つの異なる抗原結合部位（ＴＲＯＰ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３）を含み、本明細書中で定義されるように（実質的に）同時にこれらの３つの標的に結合することが可能であるという条件で、そのフォーマットに関して特に限定されない。そのようなものとして、フォーマットは、天然抗体の、抗体誘導体の、又はそのような抗体のフラグメントのフォーマット、ならびに抗体模倣物に基づくことができる。そのようなフォーマットは、例えば、さらなる抗体フラグメント、特にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、特に単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小型モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、又はナノボディを追加的に含むことにより、全ての３つの抗原結合部位を適応するように必要に応じて改変することができる。個々に又は全ての抗原結合部位について用いることができる適切なフォーマットのさらなる非限定的な例は、本明細書中で上に定義された抗体模倣物を含む。

【0060】

好ましくは、本発明の結合分子は、修飾された免疫グロブリン（また、本明細書中では修飾された免疫グロブリン分子として言及される）である。例えば、好ましい実施形態では、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、（古典的なＹ形状）免疫グロブリンフォーマットを有する結合分子の可変領域中に存在する。そのようなフォーマットでは、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の第１セットは、その可変領域中にＴＲＯＰ２についての抗原結合部位を含み、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の第２セットは、その可変領域中にＣＤＨ１７についての抗原結合部位を含み、両方の鎖のセットは、例えば、ジスルフィド架橋を介して互いに連結されて、免疫グロブリン分子を形成する。

【0061】

そのような免疫グロブリン分子を作製するための技術は、当技術分野において周知であり、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（例、Milstein and Cuello, Nature 305：537(1983)）、ＷＯ９３／０８８２９、及びTraunecker et al., EMBO J. 10：3655(1991)）；「ノブ・イン・ホール」操作（例、米国特許第５，７３１，１６８ 号）；抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電的ステアリング効果の工学的操作（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ又はそれ以上の免疫グロブリン又はフラグメントの架橋（例、米国特許第４，６７６，９８０号及びBrennan et al., Science, 229：81(1985)）；ロイシンジッパーを使用して二重特異的抗体を産生すること（例えば、Kostelny et al., Immunol., 148(5)：1547-1553(1992)を参照のこと）などを含む。当業者はそのような方法を十分に知っており、それらはまた、当技術分野において、例えば、Liu H. et al.(2017)Front. Immunol. 8:38. doi：10.3389/fimmu.2017.00038において、又はMoore, G.L., Methods, Volume 154, 2019, Pages 38-50において概説されている。

【0062】

当該免疫グロブリン分子は、ＣＤ３についての抗原結合部位を含む追加の成分の融合によりさらに修飾され、それにより、修飾された免疫グロブリンがもたらされる。好ましくは、ＣＤ３についての当該抗原結合部位は、免疫グロブリン分子の重鎖の一方又は両方のＣ末端に融合されているｓｃＦｖである。互いに対する種々の成分の融合は、当技術分野において周知である。当該融合は、例えば、ペプチドリンカーを介して、又は非ペプチドリンカーを介し得る。好ましくは、当該融合はペプチドリンカーを介している。

【0063】

より好ましくは、当該免疫グロブリン分子及び／又は当該修飾免疫グロブリン分子は、モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト免疫グロブリン（例、抗体）分子である。さらに好ましくは、当該免疫グロブリン分子の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ定常領域からなる群より選択される。別の好ましい実施形態では、当該免疫グロブリン分子の軽鎖定常領域はカッパ又はラムダである。

【0064】

本発明に従って、本発明の結合分子を構成する個々のエレメントは、１つ又は複数のリンカーを介して互いに接続することができる。好ましくは、これらのリンカーはペプチドリンカーであり、より好ましくは、それらは、共有結合を介して個々のエレメントを接続する。それぞれの軽鎖が、リンカーを介してそれぞれの重鎖に接続されていることが、本明細書中では特に好ましい。

【0065】

本発明の結合分子が１を上回るリンカーを含む実施形態では、当該リンカーは、同じ又は異なる長さを有することができ、同じ又は異なる構造で構成され得る、例えば、同じ又は異なるアミノ酸配列、あるいは同じ又は異なる非ペプチドポリマーを含むことが想定される。好ましい実施形態では、本発明の結合分子中に存在するリンカーは、長さ及び／又は構造（例、アミノ酸配列又は非ペプチドポリマーの性質）において互いに異なる。

【0066】

好ましくは、リンカーはペプチドリンカーである。より好ましくは、リンカーは、例えば、アミノ酸のアラニン及びセリン又はグリシン及びセリンを使用した柔軟なリンカー、例えば、配列番号２７５中に示されるリンカーである、あるいは、配列番号２６５及び２６６中に示されるリンカーの１つである。このように、本発明の結合分子は、完全にアミノ酸で構成される、即ち、それはポリペプチドであることが特に好ましい。

【0067】

本発明者らの知る限り、癌細胞上のＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７と免疫細胞上のＣＤ３を接続する三重特異的抗体又は組換え三重特異的抗体誘導体は、これまでに報告されておらず、それにおいて、Ｔｒｏｐ２特異的結合剤及びＣＤＨ１７特異的結合剤は、それぞれ１ｎＭ及び１０nMを上回るＫｄを伴ってそれらの標的に結合する。ＷＯ２１１１３７４８は、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及び／又はＣＤ３に結合する「ＴｒｉＡｘ－Ｅ」と呼ばれる分子を含む、種々のフォーマットの多重特異的抗体を記載する特許出願であり、しかし、当該分子を再現する本発明者らのいかなる試みも、不十分な安定性に起因して失敗した。古典的な抗体選択キャンペーンは、通常、高親和性結合剤をもたらすことに向けて適合されている。これはまた、ＷＯ２１１１３７４８において従われたアプローチである。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、これらの２つの標的に対して高い親和性を伴う抗原結合部位の組み入れによって、狭い治療ウィンドウがもたらされることを見出した。実施例において、特に実施例６～８において示されるように、より高い親和性の使用は、１つ又は他の標的だけを発現する細胞に対する一価の結合及び活性に導き、このように、不要な副作用のリスクを増加させる。また、多価フォーマットの使用も治療ウィンドウを減少させた。これらの知見は、２つの標的のいずれかについての増加した親和性が、特異性の喪失に導き、増加した結合価に伴ってさらに増強される効果を示す。従って、異なる選択戦略が、低親和性結合剤を得ることに焦点を合わせて選ばれた。以下の実施例から明らかなように、本発明の三重特異的結合分子は、標的細胞に対して優れた特異性を提供する。最良の結果が、低親和性及び一価の結合剤が組み合わされた結合分子について得られたが、以下の実施例に示すとおりである。

【0068】

本発明の結合分子の別の好ましい実施形態では、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位が、抗原結合部位（ｉ）～（ｖｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、及び配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）、及び配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
ならびに
（ｖｉ）配列番号２７（ＣＤＲ１）、配列番号２８（ＣＤＲ２）、及び配列番号２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３０（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号３１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位。

【0069】

本明細書中に開示され、配列番号１～３１において描写されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に従って提示され、以下の表１中に示されている。本明細書中で使用されるように、ＨＣＤＲは重鎖ＣＤＲを、ＬＣＤＲは軽鎖ＣＤＲを表す。

【0070】

追加の命名法が当技術分野において公知であるため、これらの命名法のうち最も一般に使用されるものに基づくＣＤＲ配列も、以下の表１中に示されているが、しかし、これらの代替の命名法の適用が、異なるアミノ酸配列をもたらした例についてだけである。これらの番号付けシステムは、（ｉ）ＣＣＧ（Almagro et al., Proteins 2011;79:3050-3066及びMaier et al, Proteins 2014;82:1599-1610において例証されるChemical Computing Group)、(ii）Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196：901-917）、（ｉｉｉ）ＩＭＧＴ（Lefranc MP, Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77）、及び（ｉｖ）Ｎｏｒｔｈ（North B, J Mol Biol.(2011)406:228-56）に基づいている。

【0071】

Ｋａｂａｔ、ＣＣＧ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、及びＮｏｒｔｈ位置に従って本明細書中のＣＤＲについて示されるアミノ酸位置（表１を参照のこと）は直線的である、即ち、それぞれの全長分子鎖のアミノ酸は、Ｎ末端の番号１から開始して連続的に番号付けされ、当該分子中のアミノ酸の総数に対応する数字で終わる。例えば、１１８のアミノ酸の長さからなる重鎖は、Ｎ末端の１番で始まり、最もＣ末端のアミノ酸の１１８番で終わる。このように、例えば、位置２５は、この分子のＮ末端から数えて２５番のアミノ酸を指すことを意味する。

【0072】

本発明の結合分子のより好ましい実施形態では、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
又は
（ｘｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0073】

本発明に従って、用語「免疫グロブリン重鎖可変ドメイン」及び「免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン」は、当該技術分野における定義に従って使用される。

【0074】

本発明の結合分子の別の好ましい実施形態では、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３３（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３５（ＣＤＲ１）、配列番号３６（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｉｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３９（ＣＤＲ１）、配列番号４０（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位。

【0075】

また、本明細書中に開示され、配列番号３２～４０において描写されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に従って提示され、以下の表１中に示されている。再び、追加の命名法が当技術分野において公知であるため、これらの命名法のうち最も一般に使用されるものに基づくＣＤＲ配列も、以下の表１中に示されているが、しかし、これらの代替の命名法の適用が、異なるアミノ酸配列をもたらした例についてだけである。

【0076】

本発明の結合分子のより好ましい実施形態では、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｉｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
ならびに
（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0077】

本発明の結合分子の好ましい実施形態では、
（ａ）ＴＲＯＰ２に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、第１の免疫グロブリン重鎖定常ＣＨ１ドメイン、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、場合により第１のリンカー、第１の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、及び第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む第１のポリペプチド中に含まれ、ならびに／あるいは
（ｂ）ＣＤＨ１７に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、第２の免疫グロブリン重鎖定常ＣＨ１ドメイン、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、場合により第２のリンカー、第２の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン、及び第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む第２のポリペプチド中に含まれる。

【0078】

本発明に従って、また、用語「免疫グロブリン重鎖定常ＣＨ１ドメイン」及び「免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン」が、当技術分野における定義に従って使用される。好ましくは、上に列挙される順番は、Ｎ末端からＣ末端である。

【0079】

用語「第１」及び「第２」、ならびにさらに以下の用語「第３」は、本明細書中で特定のポリペプチド及び免疫グロブリン鎖の状況において使用される場合、これらの分子が異なる分子であることを示すことのみを意図している（それらが、異なる標的抗原に結合するため）。このように、これらの用語は、本発明の結合タンパク質内のポリペプチド又は免疫グロブリン鎖の正確な順番又は配列を指すとして理解されるべきではない。代わりに、用語「第１」は、ＴＲＯＰ２への結合に関連する態様を指す場合に使用され、用語「第２」は、ＣＤＨ１７への結合に関連する態様を指す場合に使用され、用語「第３」は、ＣＤ３への結合に関連する態様を指す場合に使用される。

【0080】

用語リンカーは、本明細書中で上記に定義されており、適切なリンカーが当技術分野において記載されている。本発明の結合分子の好ましい実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２７３、配列番号２７４、又は配列番号２７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、第１の及び／又は第２のリンカーは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。

【0081】

本発明の結合分子のこの実施形態に従って、ＴＲＯＰ２及び／又はＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、本明細書で上記に記載された抗原結合部位より選択されるのに対し、ＣＤ３についての抗原結合部位は、当技術分野において利用可能なそれらのＣＤ３特異的抗原結合部位から、又は本明細書に開示されるＣＤ３特異的抗原結合部位から当業者により選ばれる。より好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、本明細書中で以下に定義されるｓｃＦｖ配列（配列番号２２２～２６４、好ましくは配列番号２２２～２４５、より好ましくは配列番号２２２～２２４）の１つより選択される。

【0082】

本発明の結合分子は、Ｆｃ部分を含み得る、好ましくは含む。用語Ｆｃ部分は当技術分野において公知であり、本明細書中で上に定義されている。天然免疫グロブリン分子のＦｃ領域は、典型的には、多くのＦｃ受容体と相互作用し、それによって、多くの重要な機能的能力（「エフェクター機能」として言及される）がもたらされる。本発明に従って、本発明の結合分子は、標的抗原の関連部分への、本発明の結合分子の特異的結合に干渉しないＦｃ領域、又はＦｃ領域の一部を含むことが好ましい。さらに、当業者は、定常領域の種類及び長さの選択が、補体結合又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害のようなエフェクター機能が望ましい特徴であるか否かに、及び抗体タンパク質の望ましい薬理学的特性に依存することを十分に知っている。

【0083】

このように、本発明の結合分子の好ましい実施形態では、結合分子は、可溶性Ｆｃガンマ受容体及び／又は補体Ｃ１ｑによる意図しない架橋を回避するように操作されたＦｃ領域、又はその関連部分を有する。好ましくは、そのような結合分子は、非操作結合分子（即ち、変異（操作）分子が由来する非Ｆｃ操作結合分子）よりもＦｃガンマ受容体及び／又は補体Ｃ１ｑに対して、ずっと低い親和性を有する。そのような免疫グロブリン分子は、しばしば、Ｉｇ（ＫＯ）として言及される。

【0084】

本発明の結合分子の特に好ましい実施形態では、本発明における結合分子による補体産物Ｃ１ｑ又はＦｃガンマ受容体への結合は、位置２３４及び２３５での向けられたＬからＡ変異誘発を伴うＩｇＧ４定常領域の又はＩｇＧ１定常領域の利用により切断される（いわゆる「ＬＡ－ＬＡ変異」；Hezareh et al., J. Virology 75(2001)12161-12168）。好ましくは、本発明の結合分子は、当該ＬからＡ変異誘発を含む。

【0085】

本発明の結合分子の別の好ましい実施形態では、結合分子は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とのその相互作用を最適化することにより、ＣＨ２ドメイン中の位置Ｈ３１０Ａ（ＥＵ番号付けスキームに従う）の点変異により血清レベル（半減期）を改変するように操作されているＦｃ領域、又はその関連セクションを含む。そのようなＩｇ分子は、本明細書中ではＩｇＦｃ Ｒｎｍｕｔとして言及される。

【0086】

多量体結合分子の設計における１つの課題は、ランダムな鎖対合及び他のミスマッチを伴わない工業規模でのそれらの産生である。当業者は、特に重鎖ホモ二量体の形成を防止することを試みるための多数のアプローチを知っており、例えば、いわゆるノブ・イン・ホール（ＫｉＨ）戦略、静電的ステアリング効果を作るための反対電荷の使用、又は重鎖のヘテロ二量体化を促進する疎水性変異、ＣＨ３鎖交換操作ドメイン（SEED Technology）、及びヘテロ二量体モジュール、例えばＣＨ３ドメインのＣ末端における切断可能なロイシンジッパーなどの融合（ＬＵＺ－Ｙ技術）を含み、Amaralら（J Appl Bioanal 6(1), 26-51(2020)）により最近要約されているとおりである。

【0087】

このように、本発明の結合分子が、ノブ・イン・ホール形成をもたらす変異を少なくとも含むことが特に好ましい。好ましくは、本発明の結合分子は、修飾された免疫グロブリン分子に基づいており、それにおいて、Ｉｇ分子部分の重鎖は、以下の変異を含む：
（ｉ）第１の重鎖は、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第２の重鎖は、位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む；
（ｉｉ）第１の重鎖は、位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第２の重鎖は、位置４０７にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含む；
（ｉｉｉ）第２の重鎖は、位置３６６にトリプトファン（Ｗ）［Ｔ３６６Ｗ］を含み、第１の重鎖は、位置３６６にセリン（Ｓ）［Ｔ３６６Ｓ］、位置３６８にアラニン（Ａ）［Ｌ３６８Ａ］、及び位置４０７にバリン（Ｖ）［Ｙ４０７Ｖ］を含む；又は
（ｉｖ）第２の重鎖は、位置３６６にチロシン（Ｙ）［Ｔ３６６Ｙ］を含み、第１の重鎖は、位置４０７にスレオニン（Ｔ）［Ｙ４０７Ｔ］を含む、
及び、より好ましくは、第１の重鎖を含む免疫グロブリン分子の部分は、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗原結合部位も含む部分（本明細書中では、また、Ｉｇ分子のＴＲＯＰ２結合部分として言及される）であり、第２の重鎖を含む免疫グロブリン分子の部分は、ＣＤＨ１７に特異的に結合する抗原結合部位も含む部分（本明細書中では、また、Ｉｇ分子のＣＤＨ１７結合部分として言及される）である。

【0088】

この好ましい実施形態に従って、番号付けはそれぞれの重鎖に基づいており、重鎖の当該定常領域のＮ末端の第１のアミノ酸は、ＥＵ番号付けスキームに従って位置１１８である。言い換えれば、位置３６６のトリプトファンは、位置１１８のＮ末端から始まる、重鎖定常領域内の３６６番目のアミノ酸である。この番号付けは当業者には周知であり、また、文献中に記載されており、例えば、ＣＨ１についてのＥＵ番号付けシステムを参照したIMGT Scientificチャートを参照のこと。ここでは、ＩｇＧ１について、定常領域は、Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85(1969)に従って、アミノ酸１１８の「Ａ」で始まる。

【0089】

好ましくは、本発明の結合分子は、上記（ｉ）において引用される変異を含む、即ち、Ｉｇ分子の１つの結合部分がノブ変異（Ｔ３６６Ｗ）を含む一方で、Ｉｇ分子の他の結合部分はホール変異を含む（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）。より好ましくは、Ｉｇ分子のＴＲＯＰ２結合部分はノブ変異（Ｔ３６６Ｗ）を含む一方で、Ｉｇ分子のＣＤＨ１７結合部分はホール変異（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）を含む。当業者は、本明細書中に記載される標的特異的抗原結合部位（好ましくは、単鎖Ｆａｂを含む又は単鎖Ｆａｂからなる標的特異的結合部位）を、そのようなノブ変異又はホール変異を含むＦｃドメインとどのように組み合わせるかを知っている；例えば、配列番号４３４及び４３５中に示されるＦｃドメインを用いて、目的の任意の抗原結合部位、好ましくはＦａｂを、所望のノブ又はホール状況中に配置することができる。

【0090】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、ホール変異を含む重鎖は、追加でさらに以下の変異を含む：
ｖ）位置４３５のアルギニン［Ｈ４３５Ｒ］及び位置４３６のフェニルアラニン［Ｙ４３６Ｆ］（プロテインＡ結合部位の除去に導く）；及び／又は
ｖｉ）上で考察されるように、位置２３４［Ｌ２３４Ａ］及び位置２３５［Ｌ２３５Ａ］のアラニン。
上で定義した番号付けに関する同じ考慮事項が準用される。当業者により適用され得るさらなる変異は、当技術分野において周知であり、例えば、Saunders KO(2019). Front. Immunol. 10:1296において記載されている。

【0091】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は、
（ａ－ｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖ）配列番号１７７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｘ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ａ－ｘｉｉ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
及び／又は
（ｂ－ｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ｂ－ｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含む。

【0092】

本発明に従って、用語「免疫グロブリン重鎖」及び「免疫グロブリン軽鎖」は、当技術分野における定義に従って使用される。このように、これらの用語は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４のそれぞれの鎖又はドメインに関連する。

【0093】

特に、免疫グロブリン重鎖は、典型的には、列挙された順番において、重鎖可変ドメインＶＨ、第１の重鎖定常ＣＨ１ドメイン、及びＦｃドメインを含み、ヒンジ領域及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含むのに対し、免疫グロブリン軽鎖は、典型的には、列挙された順番において、軽鎖可変ドメインＶＬ及び第１の軽鎖定常ＣＬ１ドメインを含む。

【0094】

本発明の結合分子のこの実施形態に従って、ＴＲＯＰ２及び／又はＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、上に列挙される特定の配列中に含まれるのに対して、ＣＤ３についての抗原結合部位は、当業者により、当技術分野において入手可能なそれらのＣＤ３特異的抗原結合部位から、又は本明細書中に開示されるＣＤ３特異的抗原結合部位から選ばれる。より好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、本明細書中で以下に定義されるｓｃＦｖ配列（配列番号２２２～２６４、好ましくは配列番号２２２～２４５、より好ましくは配列番号２２２～２２４）の１つより選択される。

【0095】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は、少なくとも第１及び第２のポリペプチドを含む免疫グロブリン分子を含み、それにおいて
（ａ）当該第１のポリペプチドは、ＴＲＯＰ２に特異的に結合し、場合により第１のリンカーにより連結された、本明細書中で上に、（ａ－ｉ）～（ａ－ｘｉｉ）において定義される免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせを含み、ならびに
（ｂ）当該第２のポリペプチドは、ＣＤＨ１７に特異的に結合し、場合により第２のリンカーにより連結された、本明細書中で上に、（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｉ）において定義される免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせを含む。

【0096】

用語リンカーは、本明細書中で上に定義されており、適切なリンカーは、当技術分野において記載されている。本発明の結合分子の好ましい実施形態では、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２７３、配列番号２７４、又は配列番号２７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、第１及び／又は第２のリンカーは、配列番号２６６のアミノ酸配列を含む。

【0097】

また、本発明の結合分子のこの実施形態に従って、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、上で列挙される特定の配列中に含まれるのに対し、ＣＤ３についての抗原結合部位は、当業者により、当技術分野において入手可能なそれらのＣＤ３特異的抗原結合部位から、又は本明細書中に開示されるＣＤ３特異的抗原結合部位から選ばれる。より好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、本明細書中で以下に定義されるｓｃＦｖ配列（配列番号２２２～２６４、好ましくは配列番号２２２～２４５、より好ましくは配列番号２２２～２２４）の１つより選択される。

【0098】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は、
（ａ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列；
（ａ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列；
（ａ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列；もしくは
（ａ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列；
及び／又は
（ｂ－ｉ）配列番号２２０のアミノ酸配列；もしくは
（ｂ－ｉｉ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含む。

【0099】

また、本発明の結合分子のこの実施形態に従って、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７についての抗原結合部位は、上に列挙される特定の配列中に含まれるのに対して、ＣＤ３についての抗原結合部位は、当業者により、当技術分野において入手可能なそれらのＣＤ３特異的抗原結合部位から、又は本明細書中に開示されるＣＤ３特異的抗原結合部位から選ばれる。より好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、本明細書中で以下に定義されるｓｃＦｖ配列（配列番号２２２～２６４）の１つより選択される。さらにより好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、配列番号２２２～２４５のｓｃＦｖ配列の１つより選択される。さらにより好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、配列番号２２２～２４４のｓｃＦｖ配列の１つより選択される。

【0100】

本発明の結合分子のさらに好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｘｘｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４４（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５５（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号５８（ＣＤＲ２）、及び配列番号５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６０（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号６３（ＣＤＲ２）、及び配列番号５４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５６（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６１（ＣＤＲ１）、配列番号４５（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉ）配列番号４１（ＣＤＲ１）、配列番号４２（ＣＤＲ２）、及び配列番号４３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号５７（ＣＤＲ１）、配列番号５２（ＣＤＲ２）、及び配列番号５１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７２（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７３（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７５（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７６（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号７１（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７８（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｉｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
（ｘｘｘ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、及び配列番号６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号８０（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
及び
（ｘｘｘｉ）配列番号８２（ＣＤＲ１）、配列番号８１（ＣＤＲ２）、及び配列番号７０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号６６（ＣＤＲ１）、配列番号６７（ＣＤＲ２）、及び配列番号６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位。

【0101】

ＴＲＯＰ２及び／又はＣＤＨ１７についての抗原結合部位の状況において上に列挙される定義及び好ましい実施形態は、他に述べられない限り、ＣＤ３に特異的に結合するこの少なくとも１つの抗原結合部位にも適用される。特に、抗原結合部位内の特定のエレメントの順番、ＴＲＯＰ２又はＣＤＨ１７に特異的ではない用語の定義、ならびに本発明の結合分子のエレメントの一般的な設計及び構造の態様は、このＣＤ３特異的抗原結合部位にも適用される。さらに、また、このＣＤ３特異的抗原結合部位について、それが、完全にアミノ酸で構成されること、即ち、それが、ポリペプチド中に含まれること、及び／又はＣＤＲがペプチドもしくはポリペプチドであることが好ましい。これはまた、任意のリンカーが、存在する場合に、好ましくはペプチドリンカー、好ましくは本明細書中で上に定義される柔軟なリンカーであることを意味することが理解されるであろう。好ましくは、任意のそのようなリンカーは、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２７３、配列番号２７４、又は配列番号２７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、リンカーは、配列番号２６５のアミノ酸配列を含む。

【0102】

また、本明細書中で開示され、配列番号４１～８２において描写されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法に従って提示され、以下の表１中に示される。再び、追加の命名法が当技術分野において公知であるため、これらの命名法のうち最も一般に使用されるものに基づくＣＤＲ配列も、以下の表１中に示されているが、しかし、これらの代替の命名法の適用が、異なるアミノ酸配列をもたらした例についてだけである。

【0103】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、場合により第３のリンカーにより連結された、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。

【0104】

本発明の結合分子のより好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、抗原結合部位（ｉ）～（ｘｖｉ）からなる群より選択される：
（ｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２３、及び配列番号１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｖ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１１９及び配列番号１２２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２５、配列番号１２６、及び配列番号１２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖ）配列番号１２８及び配列番号１３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１２７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３４及び配列番号１３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｖｉｉｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１３７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｉｘ）配列番号１３８及び配列番号１５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１３９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘ）配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉ）配列番号１４４及び配列番号１４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉ）配列番号１４７、配列番号１５１、配列番号１５３、及び配列番号１６２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１４８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｉｉ）配列番号１４９及び配列番号１５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメインならびに配列番号１５０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｉｖ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；
（ｘｖ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１５８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位；及び
（ｘｖｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位。

【0105】

また、ＣＤ３に特異的に結合する当該抗原結合部位が、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であることが好ましい。より好ましくは、当該ｓｃＦｖは、重鎖可変ドメインがそのＮ末端にあり、軽鎖可変ドメインがそのＣ末端にあるように配置される。

【0106】

ｓｃＦｖ分子を含む、目的のポリペプチドを、例えば、ＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に連結する方法は、当技術分野において周知である。Ｉｇ分子へのｓｃＦｖの当該融合は、直接的な融合であってもよく、又はリンカー、好ましくは５～４０アミノ酸の長さを有するペプチドリンカーを介したものであってもよいことが理解されるであろう。より好ましくは、当該ペプチドリンカーは、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２７３、配列番号２７４、又は配列番号２７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、当該リンカーは、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む。実際には、通常、この連結は、目的のＩｇＧをコードする核酸分子を、所望のポリペプチド、例えば、ｓｃＦｖをコードする核酸と組み合わせることにより達成され、必要な場合、リンカー配列をコードする核酸分子により挟まれ、それにより、全ての３つのエレメントを含む単一の核酸分子を形成する。次に、この完全なＨＣ－ｓｃＦｖコード化核酸分子を発現ベクター内に配置し、完全なＩｇＧ重鎖－ｓｃＦｖ単一ポリペプチドが形成されるように適切な宿主細胞に導入する。

【0107】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、配列番号２２２～２６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらにより好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、配列番号２２２～２４５のｓｃＦｖ配列の１つより選択される。さらにより好ましくは、ＣＤ３特異的抗原結合部位は、配列番号２２２～２２４のｓｃＦｖ配列の１つより選択される。

【0108】

本明細書中で上に示されるように、本発明の結合分子の抗原結合部位についての番号付け（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、任意の特定の順番又はフォーマットを示すことを意図しない。

【0109】

しかし、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する第１の抗原結合部位及びＣＤＨ１７に特異的に結合する第２の抗原結合部位は、両方が、１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）分子内に含まれる、即ち、それらは、従来のＩｇＧ抗体のフォーマット中に配置され、例えば、図３中に示されるように、Ｙ形状構造を形成することが好ましく、ここで、Ｉｇ分子の１つの半分（例、第１の重鎖に連結された第１の軽鎖を含む）は、ＴＲＯＰ２に対する抗原結合部位を含み、Ｉｇ分子の第２の半分（例えば、第２の重鎖に連結された第２の軽鎖を含む）は、ＣＤＨ１７についての抗原結合部位を含む。好ましくは、当該Ｉｇ分子はＩｇＧである、又はＩｇＧから由来するフォーマットを有する。より好ましくは、当該免疫グロブリン分子は、好ましくは単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）として、ＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位がそれに融合されるように修飾される。

【0110】

したがって、本発明の結合分子の特に好ましい実施形態では、結合分子は、修飾された免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは修飾されたＩｇＧ分子であり、それにおいて、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位及びＣＤＨ１７に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、当該Ｉｇ分子の可変領域中に存在し、ＣＤ３に特異的に結合する当該少なくとも１つの抗原結合部位は、当該ＴＲＯＰ２－ＣＤＨ１７特異的Ｉｇ分子に融合された少なくとも１つのｓｃＦｖである。より好ましくは、当該ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に、好ましくは２つの重鎖のうちの１つだけのＣ末端に、より好ましくは、ＣＤＨ１７に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含むＩｇ分子の一部の重鎖に融合され、また、図３中に描写されるとおりである。

【0111】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は以下を含む：
（ａ）（ａ－ｉ）～（ａ－ｘｉｉ）より選択される第１の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖の組み合わせ：
（ａ－ｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉ）配列番号１７１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｖ）配列番号１７５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖ）配列番号１７７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉ）配列番号１７９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号１８１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号１８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｉｘ）配列番号１８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘ）配列番号１８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
（ａ－ｘｉ）配列番号１８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ａ－ｘｉｉ）配列番号１９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；
ならびに
（ｂ）（ｂ－ｉ）～（ｂ－ｉｉ）より選択される第２の免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の組み合わせ：
（ｂ－ｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖；又は
（ｂ－ｉｉ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖；
ならびに
（ｃ）配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）。

【0112】

好ましくは、当該第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のリンカー、好ましくは配列番号２６６のリンカーを介して第１の免疫グロブリン軽鎖に融合され、及び／又は当該第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のリンカー、好ましくは配列番号２６６のリンカーを介して第２の免疫グロブリン軽鎖に融合され、及び／又は当該ｓｃＦｖは、第３のリンカー、好ましくは配列番号２７５のリンカーを介して第２の免疫グロブリン重鎖のＣ末端に融合される。

【0113】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は以下を含む：
（ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｉｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｉｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｉｖ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｖ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｖｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｖｉｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｖｉｉｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｉｘ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｉｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｉｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｉｖ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｖ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｖｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｖｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｉｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｘｉｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖；又は
（ｘｘｉｖ）配列番号２１７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、配列番号２２１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、及び配列番号２２２～２６４からなる群より、より好ましくは配列番号２２２～２４５からなる群より、さらにより好ましくは配列番号２２２～２２４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖。

【0114】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は、配列番号２００、２０７～２１７、及び４３６からなる群より選択される第１のアミノ酸配列ならびに配列番号２６７～２７２、４２４～４２７、及び４３７からなる群より選択される第２のアミノ酸配列を含む又はそれらからなる。

【0115】

本発明の結合分子のさらにより好ましい実施形態では、結合分子は以下を含む又はそれらからなる：
（ａ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ａ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｂ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６８のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｃ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２６９のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｄ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７０のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｅ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｆ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｇ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｈ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｉ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉ）配列番号２００のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｖ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｖｉｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｉｘ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；
（ｊ－ｘｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；又は
（ｋ）配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列。

【0116】

１つの特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列を含む。別の特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子は、配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列を含む。

【0117】

添付の実施例において示されるように、本発明のこれらの特に好ましい結合分子は、全ての３つの標的抗原に結合し、それにより、Ｔ細胞が、Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７の両方を保有する腫瘍細胞に近づけられる。驚くべきことに、高親和性を伴う抗原結合部位の組み入れによって、これら ２つの標的のうちの１つだけを発現する細胞での一価の結合及び活性に導かれ、このように、不要な副作用のリスクが増加することが見出された。このように、本発明は、腫瘍細胞抗原についての低親和性結合剤を含む三重特異的結合分子を提供する。以下の実施例から明らかなように、本発明のこれらの低親和性、高親和性の三重特異的結合分子は、標的細胞に対して優れた特異性を提供する。

【0118】

本発明はさらに、以下のものを含む又はそれらからなる三重特異的結合分子に関する：（ｉ）配列番号２０７のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；（ｉｉ）配列番号２０８のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；（ｉｉｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；（ｉｖ）配列番号２１０のアミノ酸配列及び配列番号２６７のアミノ酸配列；（ｖ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；（ｖｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；（ｖｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；（ｖｉｉｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；（ｉｘ）配列番号２１５のアミノ酸配列及び配列番号２７１のアミノ酸配列；（ｘ）本発明は、配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；（ｘｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；（ｘｉｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；（ｘｉｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列及び配列番号２７２のアミノ酸配列；；（ｘｉｖ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２４のアミノ酸配列；（ｘｖ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２５のアミノ酸配列；（ｘｖｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２６のアミノ酸配列；（ｘｖｉｉ）配列番号２１１のアミノ酸配列及び配列番号４２７のアミノ酸配列；又は（ｘｖｉｉｉ）配列番号４３６のアミノ酸配列及び配列番号４３７のアミノ酸配列を含む。
以下の表１は、本発明の結合分子、又はその一部の好ましいアミノ酸配列を要約する。

【表1】

【0119】

Ｔｒｏｐ２＃１、Ｔｒｏｐ２＃８～Ｔｒｏｐ２＃１８、ＣＤＨ１７＃１、ＣＤＨ１７＃８、ならびにＣＤ３＃１～ＣＤ３＃４３として本明細書中に開示される好ましい抗原結合部位は、全てが、本発明の三重特異的結合分子における使用のための適切な抗原結合部位として本発明者らにより同定され、テストされている。特に、当該抗原結合部位は、ポリペプチド鎖又はリンカーの柔軟なエレメントにより接続され、それは、当該抗原結合部位の構造的及び機能的完全性に干渉しない。

【0120】

ＴＲＯＰ２についての単一特異的結合分子。
さらに本明細書中で提供されるのは、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗体分子（例、２つの重鎖及び２つの軽鎖を伴うＹ形状構造を有する全長抗体／免疫グロブリン分子、又はそれらのフラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントなど、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））。一部の実施形態では、ＴＲＯＰ２について特異的な抗体分子は、組換えモノクローナル抗体、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体分子である。

【0121】

一部の実施形態では、ＴＲＯＰ２について特異的な抗体分子は、（ｉ）から（ｖｉ）において示される以下のＣＤＲの組み合わせのいずれか１つを含む：
（ｉ）配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）、及び配列番号３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）及び配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
（ｉｉ）配列番号７（ＣＤＲ１）、配列番号８（ＣＤＲ２）、及び配列番号９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１０（ＣＤＲ１）、配列番号１１（ＣＤＲ２）、及び配列番号１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
（ｉｉｉ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号１６（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
（ｉｖ）配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、及び配列番号１５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２０（ＣＤＲ１）、配列番号１７（ＣＤＲ２）、及び配列番号１８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
（ｖ）配列番号２１（ＣＤＲ１）、配列番号２２（ＣＤＲ２）、及び配列番号２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号２４（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号２６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
又は
（ｖｉ）配列番号２７（ＣＤＲ１）、配列番号２８（ＣＤＲ２）、及び配列番号２９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３０（ＣＤＲ１）、配列番号２５（ＣＤＲ２）、及び配列番号３１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ。

【0122】

一部の実施形態では、ＴＲＯＰ２について特異的な抗体分子は、以下を含む：
ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号８８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｉｖ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｖ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｉｘ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｘ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
（ｘｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
又は
（ｘｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン。

【0123】

一部の実施形態では、上で定義されているＴＲＯＰ２特異的抗体は、ヒト重鎖定常ドメイン（例、ＩｇＧ定常ドメイン）及びヒト軽鎖定常ドメイン（例、カッパ又はラムダ軽鎖定常ドメイン）をさらに含む。一部の実施形態では、重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１野生型（例、配列番号４１４において提供されている）、ＩｇＧ１ ＫＯ（例、配列番号４１５において提供されている）、ＩｇＧ４ Ｐｒｏ野生型（例、配列番号４１６において提供されている）、又はＩｇＧ１ ＦｃＲｎｍｕｔ（例、配列番号４１７において提供されている）である。一部の実施形態では、ヒト軽鎖定常ドメインはヒトカッパである（例、配列番号４１８において提供されている）。

【0124】

一部の実施形態では、ＴＲＯＰ２特異的抗体は、配列番号４１４、４１５、４１６、又は４１７のいずれか１つの配列に融合された配列番号８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、又は９８のいずれか１つの配列を含む重鎖及び配列番号４１８の配列に融合された配列番号８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９７、又は９９のいずれか１つの配列を含む軽鎖を有する。

【0125】

本明細書中で提供されるＴＲＯＰ２特異的抗体は、色素、薬物、又は異なる抗原についての結合特異性を伴う別の分子を付着させることにより、ＴＲＯＰ２を発現する細胞を（例、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、免疫組織学又は同様のものにおいて）インビトロ、インビボ、又はエクスビボで標識、局在化、同定、又は標的化するために使用され得る。本明細書中に記載されるＴＲＯＰ２特異的抗体は、単独で、ＴＲＯＰ２を発現する細胞の細胞生存率に対する効果を有さない。一部の実施形態では、ＴＲＯＰ２特異的抗体は、ＴＲＯＰ２発現細胞の表面に特異的に結合し、そのような細胞を局在化及び／又は同定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書中で提供されるＴＲＯＰ２抗体は、ＴＲＯＰ２を発現する細胞（例、腫瘍細胞）を同定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書中で提供されるＴＲＯＰ２抗体は、薬物又は細胞傷害性薬剤を、そのような薬物又は細胞傷害性薬剤を当該ＴＲＯＰ２抗体に付着させることにより、標的細胞（例、ＴＲＯＰ２を発現する腫瘍細胞）に送達し、それにより、例えば、当該標的細胞を死滅させるために使用される。

【0126】

また、本明細書中で提供されるのは、サンプル中の栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）を検出する方法であって、方法は、以下の工程を含む：
（ａ）サンプルを、本明細書中で上に定義されている抗ＴＲＯＰ２抗体分子と接触させること；
（ｂ）サンプル中での抗体－抗原複合体の形成を可能にすること；及び
（ｃ）抗ＴＲＯＰ２抗体を検出すること。

【0127】

抗体を検出するための手段及び方法は、当技術分野において周知であり、例えば、免疫組織化学、免疫ブロット法、及びＥＬＩＳＡを含む。

【0128】

さらに本明細書中で提供されるのは、栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）を検出するキットであって、それにおいて、このキットは、本明細書中で上に定義される抗ＴＲＯＰ２抗体分子及び使用のための説明書を含む。

【0129】

ＣＤＨ１７についての単一特異的結合分子。
さらに本明細書中で提供されるのは、ＣＤＨ１７に特異的に結合する抗体分子（例、２つの重鎖及び２つの軽鎖を伴うＹ形状構造を有する全長抗体／免疫グロブリン分子、又はそれらのフラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメントなど、単鎖抗体、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））である。一部の実施形態では、ＣＤＨ１７について特異的な抗体分子は、組換えモノクローナル抗体、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体分子である。

【0130】

一部の実施形態では、ＣＤＨ１７に特異的な抗体分子は、（ｉ）から（ｉｉ）において示される以下のＣＤＲの組み合わせのいずれか１つを含む：
（ｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３３（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３５（ＣＤＲ１）、配列番号３６（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ；
ならびに
（ｉｉ）配列番号３２（ＣＤＲ１）、配列番号３８（ＣＤＲ２）、及び配列番号３４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲならびに配列番号３９（ＣＤＲ１）、配列番号４０（ＣＤＲ２）、及び配列番号３７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ。

【0131】

一部の実施形態では、ＣＤＨ１７について特異的な抗体分子は、
（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン；
又は
（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン。

【0132】

一部の実施形態では、上で定義されているＣＤＨ１７特異的抗体は、ヒト重鎖定常ドメイン（例、ＩｇＧ定常ドメイン）及びヒト軽鎖定常ドメイン（例、カッパ又はラムダ軽鎖定常ドメイン）をさらに含む。一部の実施形態では、重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇＧ１野生型（例、配列番号４１４において提供されている）、ＩｇＧ１ ＫＯ（例、配列番号４１５において提供されている）、ＩｇＧ４ Ｐｒｏ野生型（例、配列番号４１６において提供されている）、又はＩｇＧ１ ＦｃＲｎｍｕｔ（例、配列番号４１７において提供されている）である。一部の実施形態では、ヒト軽鎖定常ドメインはヒトカッパである（例、配列番号４１８において提供されている）。

【0133】

一部の実施形態では、ＣＤＨ１７特異的抗体は、配列番号４１４、４１５、４１６、又は４１７のいずれか１つの配列に融合された配列番号１００又は１０２のいずれか１つの配列を含む重鎖及び配列番号４１８の配列に融合された配列番号１０１又は１０３のいずれか１つの配列を含む軽鎖を有する。

【0134】

本明細書中で提供されるＣＤＨ１７特異的抗体は、色素、薬物、又は異なる抗原についての結合特異性を伴う別の分子を付着させることにより、ＣＤＨ１７を発現する細胞を（例、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析、免疫組織学又は同様のものにおいて）インビトロ、インビボ、又はエクスビボで標識、局在化、同定、又は標的化するために使用され得る。本明細書中に記載されるＣＤＨ１７特異的抗体は、単独で、ＣＤＨ１７を発現する細胞の細胞生存率に対する効果を有さない。一部の実施形態では、ＣＤＨ１７特異的抗体は、ＣＤＨ１７発現細胞の表面に特異的に結合し、そのような細胞を局在化及び／又は同定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書中で提供されるＣＤＨ１７抗体は、ＣＤＨ１７を発現する細胞（例、腫瘍細胞）を同定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書中で提供されるＣＤＨ１７抗体は、薬物又は細胞傷害性薬剤を、そのような薬物又は細胞傷害性薬剤を当該ＣＤＨ１７抗体に付着させることにより、標的細胞（例、ＣＤＨ１７を発現する腫瘍細胞）に送達し、それにより、例えば、当該標的細胞を死滅させるために使用される。

【0135】

また、本明細書中で提供されるのは、サンプル中のカドヘリン－１７（ＣＤＨ１７）を検出する方法であって、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）サンプルを、本明細書中で上に定義される抗ＣＤＨ１７抗体分子と接触させること；
（ｂ）サンプル中での抗体－抗原複合体の形成を可能にすること；及び
（ｃ）抗ＣＤＨ１７抗体を検出すること。

【0136】

抗体を検出するための手段及び方法は、当技術分野において周知であり、例えば、免疫組織化学、免疫ブロット、及びＥＬＩＳＡを含む。

【0137】

さらに本明細書中で提供されるのは、栄養膜細胞表面抗原２（ＴＲＯＰ２）を検出するキットであって、それにおいて、このキットは、本明細書中で上に定義される抗ＴＲＯＰ２抗体分子及び使用のための説明書を含む。

【0138】

本発明の核酸分子、発現ベクター、及び宿主細胞
本発明はさらに、本発明の結合分子をコードする核酸分子、又はその一部に関する。本発明はさらに、本発明の結合分子をコードする核酸分子のセットを包含する。

【0139】

本発明に従って、当該核酸分子は、本発明の結合分子又はその一部を「コード」し、それは、核酸分子が、発現可能な形態において、即ち、本発明の結合分子（又はそのそれぞれの部分）が発現できることを確実にする形態において提供されることを意味する。

【0140】

用語「その一部」は、当業者により理解されるように、本発明の結合分子の全てのエレメントが、単一の核酸分子上にコードされる必要はないという事実を反映する。代わりに、２つ又はそれ以上の核酸分子は、本発明の結合分子の特定の部分を個々にコードすることに依存し得る。このように、本発明はまた、単離された核酸分子のセットを包含し、それにおいて、このセットは、一緒に、本発明の結合分子の全ての部分をコードし、単離された核酸分子のこのセットの発現が、本発明の完全な結合分子の生成をもたらす。換言すれば、１つ又は複数の核酸分子が本明細書中で提供され、それらは、重鎖、軽鎖、ｓｃＦｖ、ならびにそれらの組み合わせを含む、本発明の結合分子の個々のポリペプチド鎖を、個々の核酸分子上で別々に、又は１つの核酸分子中で組み合わせてコードする。

【0141】

好ましくは、本発明の結合分子は、２つの異なる単離された核酸分子によりコードされ、それにおいて、第１の核酸分子は、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗原結合部位（単鎖Ｆａｂ及びＦｃドメインを含む）を含む全長鎖をコードし、第２の核酸分子は、ＣＤＨ１７（単鎖Ｆａｂ及びＦｃドメインを含む）に特異的に結合する抗原結合部位を含む全長鎖をコードし、ＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む全長鎖に連結されている（好ましくは、ｓｃＦｖとして）。発現時には、両方の発現されたポリペプチドは、例えば、定常ドメイン間のジスルフィド結合などを介して、本発明の完全な結合分子を形成する。

【0142】

好ましくは、核酸分子は、コード配列を含むＤＮＡ分子である。より好ましくは、当該ＤＮＡ分子は、調節配列、及び場合により、天然又は人工イントロン（例えば、埋め込まれたｍｉＲＮＡ－５５７発現カセットを伴うホモサピエンスからのβ－グロビンイントロンなど）を追加で含む。それは、その本来のコドンを有し得る、あるいは意図される宿主細胞又は宿主生物における発現のために特に適合された最適化されたコドン使用を有し得る。本発明のそのような核酸分子は、当業者により、それ自体公知の方法に依存して、例えば、自動化された ＤＮＡ合成、自然供給源からの単離、及び／又は組換え ＤＮＡ 技術により、本明細書中に与えられる本発明の結合分子についてのアミノ酸配列に関する情報に基づいて、容易に調製される又は得られることができる。

【0143】

本発明の核酸分子は、限定されないが、配列表中に示されるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子を含む。本発明はさらに、ＷＯ２００７／０４２３０９において定義されているように、上で定義されたＤＮＡ分子に相補的な核酸分子、ならびに高ストリンジェントな結合及び洗浄条件下でそれにハイブリダイズする核酸分子を企図する。好ましい分子（ｍＲＮＡの観点から）は、本明細書中に記載されているＤＮＡ分子の１つと少なくとも７５%又は８０%（好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、最も好ましくは少なくとも９５%）の相同性又は配列同一性を有するものである。例として、目的が、真核細胞において本発明の結合分子を発現させることである場合、ＤＮＡ配列は、真核細胞におけるコドン使用に一致するように設計されなければならない。大腸菌、又は他の原核生物系において抗体を発現させることが望ましい場合、これらの配列は、コドン使用が大腸菌、又はそれぞれの原核生物系に一致するように設計しなければならない。本発明のＤＮＡ分子のバリアントは、例えば、ＷＯ２００７／０４２３０９において記載されているように、いくつかの異なる方法において構築することができる。

【0144】

好ましくは、核酸は単離されており、用語「単離された」は上でさらに定義されている。

【0145】

本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む発現ベクターに関する。

【0146】

本発明に従って、ベクターは、発現ベクター、即ち、インビトロ及び／又はインビボ（例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び発現系において）でコード核酸分子からのそれぞれのポリペプチドの発現を提供することができるベクターである。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来エピソーム、及び同様のものを含む。発現ベクター及び発現制御配列は、典型的には、宿主細胞と適合するように選択される。発現ベクターは、一般的に、１つ又は複数の適切な調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどに作動可能に連結された、本発明の少なくとも１つの核酸分子を含む。本発明のポリペプチドを発現させるために有用な又は必要な、そのような調節エレメント及び他のエレメント、例えば組込み因子、選択マーカー、シグナル配列又はリーダー配列、レポーター遺伝子、及び同様のものの具体例が、例えば、ＷＯ２００６／０４０１５３のｐｐ．１３１～１３３に開示されている。

【0147】

プロモーター配列についての非限定的な例（哺乳動物細胞における発現について例示される）は、ＣＭＶから由来するプロモーター及び／又はエンハンサー（例えばヒトサイトメガロウイルスのＣＭＶプロモーター／エンハンサー又はＣＭＶシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス、（例、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然免疫グロブリン及びアクチンプロモーターなどである。ポリアデニル化シグナルについての例は、ハムスター成長ホルモン又はウシ成長ホルモンのポリＡ、ＳＶ４０後期又は初期ポリＡであり；あるいは、免疫グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲ などを使用することができる。

【0148】

組換え発現ベクターはまた、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例、複製起点、例えばＣｏｌＥ１（ｐＵＣ）複製起点など）及び選択マーカー遺伝子（例えば、大腸菌におけるプラスミドの増幅についてのアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子など）を保有し得る。組換え発現ベクターはまた、結果として得られるポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。それぞれのポリペプチド鎖をコードする核酸分子を、シグナルペプチドが、成熟全長核酸分子鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、又は非免疫グロブリンタンパク質からの異種ペプチドであり得る。あるいは、本発明のタンパク質の全長鎖をコードするＤＮＡ配列は、シグナルペプチド配列を既に含み得る。

【0149】

上で示したように、ベクターにおいて挿入されるコード配列は、例えば、標準的な方法により合成される、あるいは天然供給源から単離される、又は半合成的に、即ち、化学合成及び組換え技術を組み合わせることにより産生される。転写調節エレメント及び／又は他のアミノ酸コード配列へのコード配列のライゲーションは、確立された方法を使用して行うことができる。しばしば用いられる１つのアプローチは、例えば、機能的に完全なヒトＣＨ（定常重鎖）免疫グロブリン配列をコードするベクターを使用することであり、操作された、適した制限部位を伴い、任意の抗原結合部位、例えば単鎖Ｆａｂ配列又は任意の重鎖／軽鎖可変ドメインなどが、簡単に挿入されて、発現できるようにする。抗体重鎖については、それは、限定されないが、任意のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又は対立遺伝子バリアントを含む他の免疫グロブリンであり得る。

【0150】

１を上回る核酸分子が、本発明の結合分子を構成するために要求される場合には、これらの１を上回る核酸分子を、異なる又は同じ発現ベクター中に挿入することができる。後者の場合では、それらは、同じ調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及び同様のものの制御下にあり得る、あるいは、それらは、各々が、それら自体の調節エレメントのセットを有し得る。本発明に従って、１を上回る核酸分子が、本発明の結合分子の個々のエレメント（即ち、ＴＲＯＰ２に特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチド鎖、ＣＨＤ１７に特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチド鎖、及びＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチド鎖）をコードする場合には、本発明の結合分子を形成するのに要求される全ての個々の核酸分子が、単一の発現ベクター上に存在しており、好ましくは、各々の核酸分子が、それ自体の調節エレメントのセットを有することが特に好ましい。

【0151】

これらのＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、宿主細胞、例えば、細菌細胞又は（高等）真核細胞、例えば、哺乳動物細胞中に、リポソーム媒介トランスフェクション、ポリカチオン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、又はウイルスベクターによる移入を含む、当技術分野において周知のトランスフェクション方法に従って導入することができる。

【0152】

したがって、本発明はまた、本発明の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に関する。

【0153】

宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌など、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞又は哺乳動物細胞などを含む、当技術分野において公知の任意の適切な細胞であり得る。哺乳動物細胞の非限定的な例は、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、及びげっ歯類の細胞株を含む。発現のための宿主細胞として利用可能な特定の哺乳動物細胞株が、当技術分野において周知であり、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト癌細胞（例、Ｈｅｐ Ｇ２細胞及びＡ－５４９細胞）、３Ｔ３細胞、又は任意のそのような細胞株の派生体／後代を含む。上記の宿主細胞のための適した培地及び条件は、当技術分野において公知である。

【0154】

本発明の結合分子を産生するための方法
本発明はまた、本発明の結合分子を産生する方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）本発明の結合分子の発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養すること；
（ｂ）場合により、当該分子を回収すること；ならびに、場合により、
（ｃ）当該結合分子をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化すること。

【0155】

本発明のタンパク質は、宿主細胞によるタンパク質の発現を可能にするのに十分な期間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。

【0156】

原核生物又は真核生物の宿主を培養するための適切な条件は、当業者に周知である。発現産物の収量及び溶解度を増加させるために、培地を緩衝化する、又は両方を増強もしくは促進することが公知である適切な添加剤を添加することができる。一般的に、当業者はまた、これらの条件が、宿主のニーズ及び発現される分子の要件に適合しなければならないであろうことを認識している。誘導性プロモーターが、宿主細胞中に存在するベクター中で本発明の核酸分子を制御する場合では、目的の分子の発現を、適した誘導剤の添加により誘導することができる。適切な発現プロトコール及び戦略が、当業者に公知である。

【0157】

その後に、本発明の結合分子が回収され、必要な場合に、さらに精製される。好ましくは、それらは、分泌分子として培養培地から回収される。しかし、それらはまた、例えば、それらが、分泌シグナルを伴わずに発現された場合には、宿主細胞溶解物から回収することができる。用語「当該分子を回収する」は、本発明の核酸分子によりコードされる本発明の結合分子、即ち、本発明の核酸分子又はベクターを用いた当該宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションに起因して本発明の宿主細胞中に存在する結合分子の単離を指すことが理解されるであろう。

【0158】

本発明の結合分子を精製する任意の工程は、分子の実質的に均質な調製物を得る際にさらに役立つ。目的の分子を精製するための手段及び方法は、周知であり、当業者は、例えば、組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質のために使用される標準的なタンパク質精製方法を使用し、それを、それぞれの分子について適した方法で調整することができる。例として、本発明の結合分子を得るために有用な最先端の精製方法は、第１の工程として、培養培地又は溶解物からの細胞及び／又は粒子状細胞破片の除去、それに続く、例えば、免疫親和性カラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、シリカでの又は陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィーによる混入可溶性タンパク質、ポリペプチド、及び核酸の除去を含む。

【0159】

本発明の結合分子を得る過程における最後の任意の工程として、精製されたタンパク質分子を乾燥させる、例えば、治療適用については以下に記載されているように凍結乾燥させる、又は所望の場合には製剤化してもよい。さらに、結果として得られた本発明の結合分子は、例えば、不要な翻訳後修飾及び同様のものを除去するために、さらなる修飾に供してもよい。

【0160】

本発明の結合分子の又は医薬組成物の医薬組成物及び医療用途
本発明はさらに、本発明の１つ又は複数の結合分子を含む、あるいはそれらからなる医薬組成物に関する。一実施形態では、当該結合分子は、唯一の医薬的に活性な薬剤である。代わりの実施形態では、当該組成物は、当該結合分子に加えて、例えば、以下でさらに定義されるような１つ又は複数のさらなる医薬的活性薬剤を含む。

【0161】

本発明に従って、用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与のための組成物に関する。本発明の医薬組成物は、上に列挙される化合物を単独で又は組み合わせにおいて含む。それは、場合により、本発明の化合物の特性を変化させ、それにより、例えば、それらの機能を安定化、調節、及び／又は活性化することが可能なさらなる分子を含み得る。組成物は、固体、液体、又は気体の形態であり得る、とりわけ、粉末、例えば、凍結乾燥粉末、（ａ）溶液、（ａ）錠剤、又は（ａ）エアロゾルの形態であり得る。好ましくは、組成物は凍結乾燥粉末又は溶液である。

【0162】

治療において使用するために、本発明の結合分子又は抗体は、動物又はヒトへの投与を促進するために適した医薬組成物中に製剤化される。このように、本発明の医薬組成物はまた、好ましくは、医薬的に許容可能な担体を含む。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法により製剤化することができる。典型的には、本発明の結合分子を含む医薬組成物は、結合分子を、そのような医薬的に許容可能な担体、ならびに（場合により）賦形剤又は安定剤と混合することにより製剤化することができる。「医薬的に許容可能な担体」により、非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の種類の製剤補助剤を意味する。また、他の賦形剤、修飾剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度では無毒である。医薬的に許容可能な担体、賦形剤、修飾剤、及び安定剤は、限定されないが、緩衝系、例えばリン酸、クエン酸、酢酸、他の無機酸又は有機酸及びそれらの塩など；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤、例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリドなど；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなど；単糖類、二糖類、オリゴ糖、又は多糖類、及びグルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリン、又はデキストランを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はイオン性もしくは非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）（ポリソルベート）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテル又は糖エステルなどを含む。また、有機溶媒、例えばエタノール又はイソプロパノールなどを製剤中に含めることもできる。賦形剤はまた、放出調節機能又は吸収調節機能を有し得る。

【0163】

通常、水溶液又は懸濁液が好ましい。一般的に、治療用タンパク質、例えば本発明の結合分子などのための適切な製剤は、緩衝タンパク質溶液、例えば適切な濃度（例えば０．００１～４００mg/ml、好ましくは０．００５～２００mg/ml、より好ましくは０．０１～２００mg/ml、より好ましくは１．０～１００mg/ml、例えば１．０～１０．０mg/ml（静脈内投与）又は１００mg/ml（皮下投与）など）においてタンパク質を含む溶液、及び水性緩衝液、例えば：
－リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．４、
－他のリン酸緩衝液、ｐＨ ６．２～８．２、
－酢酸緩衝液、ｐＨ ３．２～７．５、好ましくは ｐＨ ４．８～５．５
－ヒスチジン緩衝液、ｐＨ ５．５～７．０、
－コハク酸緩衝液、ｐＨ ３．２～６．６、又は
－クエン酸緩衝液、ｐＨ ２．１～６．２などであり、
ならびに、場合により、溶液の等張性を提供するための塩（例、ＮａＣｌ）及び／又は安定化剤（例えば、例、スクロース、トレハロース、リジンなど）及び／又は他の多価アルコール（例えば、例、マンニトール及びグリセロール）、ならびに、場合により、凝集を防止するための界面活性剤（例、０．０２% Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０）である。

【0164】

静脈内投与のための好ましい緩衝タンパク質溶液は、１０mMクエン酸緩衝液、ｐＨ５．５、２０７mMスクロース、２５mMリジンＨＣｌ及び０．０２%ポリソルベート２０中に溶解された約１０mg/mlの本発明の結合分子を含む溶液である。皮下適用のための製剤は、有意に高い濃度、例えば、１００mg/mlまで又はさらに１００mg/mlを上回る、などの本発明の抗体を含み得る。しかし、上に与えられた成分及びその量は、１つの好ましい選択肢を表すだけであることが、当業者には明らかであろう。その代替案及びバリエーションは、当業者には直ちに明らかとなる、又は上の開示から始めて、簡単に想到できる。

【0165】

本発明の医薬組成物は、例えば、注入又は注射（静脈内、関節内、筋肉内、皮下、胸骨内、腹腔内、皮内）による非経口投与、ならびに経皮、鼻腔内、頬側、もしくは経口投与又は吸入による投与を含む、任意の適切な投与様式を使用して対象に投与することができる。溶液又は再構成凍結乾燥粉末の投与については、非経口投与様式が好ましい。

【0166】

一般的に、本明細書中で言及される疾患、障害、及び状態の処置、予防、及び／又は軽減のために、処置される特定の疾患、障害、又は状態に依存して、使用される本発明の特異的結合分子の効力、使用される特定の投与経路及び特定の医薬製剤又は組成物は、投与される実際の用量に対して影響を有する。さらに、実際の医薬的な有効量又は治療投与量はまた、当業者により公知の要因、例えば患者の年齢及び体重などに依存するであろう。いずれの場合でも、本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、医薬的に有効な量が、患者の固有の状態に基づいて送達されることを可能にする投与量及び様式において投与される。好ましくは、本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり０．００５～２０．０mg/用量の間、好ましくは０．０５～１０．０mg/kg/用量の間、より好ましくは０．５～５mg/kg/用量の間で、連続的に（例、注入による）、又はより好ましくは単一用量として投与されるであろう。投与間隔は、例えば、週２回、毎週、又は毎月の用量であり得るが、しかし、特に、前述のパラメータに依存して有意に変動し得る。このように、一部の場合では、上に与えられる最小用量未満を使用することが十分であり得るのに対し、他の場合では、上限を超えなければならないこともある。大量に投与する場合には、それらを、１日にわたり多数のより少ない用量に分割することが推奨される。好ましくは、投与は、体重１kgあたり０．００５～２０．０mg/用量の間からの用量範囲、好ましくは０．０５～１０．０mg/kg/用量の間、より好ましくは０．５～５mg/kg/用量の間の用量で週１回である。

【0167】

本発明の結合分子、及び同を含む組成物の有効性は、任意の適切なインビトロアッセイ、細胞ベースのアッセイ、インビボアッセイ及び／又はそれ自体公知の動物モデル、あるいはそれらの任意の組み合わせを、含まれる特定の疾患に依存して使用してテストすることができる。適切なアッセイ及び動物モデルは、当業者には明らかであり、例えば、以下の実施例において使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。

【0168】

本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、それ自体で、又は他の薬理学的に活性な成分、例えば最先端又は標準治療の化合物、例えば、例、細胞増殖抑制性又は細胞傷害性物質、細胞増殖阻害剤、抗血管新生物質、ステロイド、免疫調節剤／チェックポイント阻害剤、及び同様のものとの組み合わせにおいて使用してもよい。

【0169】

それ故に、本発明のさらなる態様は、本発明の結合分子、又は本発明の結合分子を、１つ又は複数のさらなる活性成分、及び場合により、医薬的に許容可能な担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。

【0170】

本発明に従って組み合わせパートナーとして投与され得る細胞増殖抑制性物質及び／又は細胞傷害性活性物質は、それに限定されないが、ホルモン、ホルモン類似体及び抗ホルモン、アロマターゼ阻害剤、ＬＨＲＨアゴニスト及びアンタゴニスト、成長因子の阻害剤（成長因子、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ヒト上皮成長因子（ＨＥＲ、例、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）など）を含み、阻害剤は、例えば、（抗）成長因子抗体、（抗）成長因子受容体抗体、及びチロシンキナーゼ阻害剤、例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、ニンテダニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ボスチニブ、及びトラスツズマブなど；代謝拮抗剤（例、葉酸拮抗剤）、例えばメトトレキサート、ラルチトレキセド、ピリミジン類似体など、例えば５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、ＴＡＳ－１０２、カペシタビン及びゲムシタビンなど、プリン及びアデノシン類似体、例えばメルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン及びペントスタチン、シタラビン（ａｒａ Ｃ）、フルダラビンなど）；抗腫瘍性抗生物質（例、アントラサイクリン）；プラチナ誘導体（例、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）；アルキル化剤（例、エストラムスチン、メクロレタミン、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ダカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、テモゾロミド、ニトロソウレア、例えばカルムスチン及びロムスチン、チオテパなど）；有糸分裂阻害剤（例、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びビンクリスチンなど；及びタキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセルなど）；ベバシズマブ、ラムシルマブ、及びアフリベルセプトを含む血管新生阻害剤、チューブリン阻害剤；ＤＮＡ合成阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（例、エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びエトポホス、テニポシド、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロンなど）、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤（例、ＰＤＫ１阻害剤、Ｒａｆ阻害剤、Ａ－Ｒａｆ阻害剤、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、Ｃ－Ｒａｆ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ｍＴＯＲＣ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋα阻害剤、二重ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＳＴＫ３３阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＰＬＫ１阻害剤（例えばボラセルチブなど）、ＣＤＫの阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤を含む）、チロシンキナーゼ阻害剤（例、ＰＴＫ２／ＦＡＫ阻害剤）、タンパク質タンパク質相互作用阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、ＦＬＴ３阻害剤、ＢＲＤ４阻害剤、ＩＧＦ－１Ｒ阻害剤、Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、Ｂｃｌ－２阻害剤、Ｂｃｌ－２／Ｂｃｌ－ｘＬ阻害剤、ＥｒｂＢ受容体阻害剤、ＢＣＲＡＢＬ阻害剤、ＡＢＬ阻害剤、Ｓｒｃ阻害剤、ラパマイシン類似体（例、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、シロリムス）、アンドロゲン合成阻害剤、アンドロゲン受容体阻害剤、ＤＮＭＴ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＡＮＧ１／２阻害剤、ＣＹＰ１７阻害剤、放射性医薬品、免疫療法剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３結合分子／免疫グロブリン、例えばイピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブなど）及び種々の化学療法剤、例えばアミホスチン、アナグレリド、クロドロナート、フィルグラスチン、インターフェロン、インターフェロンアルファ、ロイコボリン、リツキシマブ、プロカルバジン、レバミゾール、メスナ、ミトタン、パミドロネート及びポルフィマーなど；プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブなど）；Ｓｍａｃ及びＢＨ３模倣物；ｍｄｍ２－ｐ５３アンタゴニストを含むｐ５３機能性を回復する薬剤；Ｗｎｔ／ベータ－カテニンシグナル伝達経路の阻害剤；間質調節因子、例えばＣＤ１３７及びＦＡＰを標的化する（好ましくは二重特異性）分子など；及び／又はサイクリン依存性キナーゼ ９阻害剤である。

【0171】

本発明に従って好ましいのは、以下より選択される薬物との組み合わせにおける本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物を用いた処置である：
（ｉ）例えば、特に乳癌患者における化学療法の組み合わせ（ネオアジュバント設定におけるドキソルビシン／シクロホスファミドの組み合わせ及び／又はカペシタビン／ドセタキセルの組み合わせ；最初の及びその後のラインの処置におけるタキサン／プラチナレジメンを含む）を伴う又は伴わない抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ及び他の抗血管新生物質）；
（ｉｉ）ＣＲＣの処置のために使用される化学療法剤（５－フルオロウラシル、イリノテカン、ドキソルビシン、及びＴＡＳ－１０２を含む）；
（ｉｉｉ）例えば、ＣＲＣ患者の処置のための、化学療法の組み合わせ（イリノテカンを含む）、抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせ（ベバシズマブ及び他の抗血管新生物質）、又はレゴラフェニブの組み合わせを伴う又は伴わない抗ＥＧＦＲ抗体（ＫＲＡＳ野生型腫瘍におけるセツキシマブ及びパニツムマブ）；ならびに／あるいは
（ｉｖ）例えば、ＣＲＣ患者の処置のための、抗ＰＤ－１薬剤及び抗ＰＤ－Ｌ１薬剤ならびに抗ＬＡＧ３薬剤、例えばエザベンリマブ、ペンブロリズマブ、及びニボルマブ、ならびにＷＯ２０１７／１９８７４１において開示されている他の抗体を含む免疫療法剤；ならびに／あるいは
（ｖ）間質調節因子、例えばＣＤ１３７及びＦＡＰを標的化する（好ましくは二重特異性）分子など。

【0172】

特に好ましい実施形態では、本発明の結合分子又は本発明の医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤との、好ましくはＰＤ－１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤＬ－１抗体などとの組み合わせにおける癌の処置のために使用される。好ましくは、当該抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、又はＷＯ２０１７／１９８７４１（参照により本明細書中に組み入れられる）において記載されているＰＤ１－１、ＰＤ１－２、ＰＤ１－３、ＰＤ１－４、及びＰＤ１－５からなる群より選択され、より好ましくは、当該抗ＰＤ－１抗体はエザベンリマブである。好ましくは、当該抗ＰＤＬ－１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、及びデュルバルマブからなる群より選択される。

【0173】

本発明はさらに、医療における使用のための本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物に関する。本発明はさらに、医薬の調製における使用のための、本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物に関する。

【0174】

さらに、本発明はまた、癌を処置、寛解、又は予防する方法における使用のための、本発明の結合分子、又は本発明の医薬組成物に関する。本発明はさらに、本発明の結合分子の、又は本発明の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、癌を処置、予防、又は寛解する方法に関する。

【0175】

投与される分子の「治療有効量」は、癌の臨床症状を予防、寛解、又は処置するために必要な最小量、特に処置される特定の癌に対して有効である最小量である。

【0176】

本明細書中で使用される用語「癌」は、組織病理学的な型又は浸潤の段階に無関係に、全ての種類の癌性成長又は発癌過程、転移組織又は悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。このように、身体におけるそれらの特定の位置／起源により特徴付けられる、以下に言及される全ての癌、腫瘍、新生物などが、原発腫瘍及びそれから由来する転移性腫瘍の両方として含まれることを意味する。

【0177】

本明細書中に記載される多重特異的結合分子を使用して成長を阻害できる癌は、限定されないが、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄性白血病、乳癌、卵巣癌、口腔扁平上皮癌、消化器癌を含む、任意のＴＲＯＰ２／ＣＤＨ１７発現腫瘍である。胃腸癌は、限定されないが、食道癌（例、胃食道接合部癌）、胃（胃）癌、肝細胞癌、胆道癌（例、胆管癌）、胆嚢癌、膵臓癌、又は結腸直腸癌（ＣＲＣ）を含む。一部の実施形態では、以下の癌、腫瘍、及び他の増殖性疾患が、本発明の多重特異的結合分子で処置され得る：頭頸部癌、好ましくはＨＮＳＣＣ；肺癌；好ましくはＮＳＣＬＣ；乳癌；甲状腺癌；子宮頸癌；卵巣癌；子宮内膜癌；肝臓癌（肝芽腫又は肝細胞癌）；膵臓癌；前立腺癌；胃肉腫；胃腸間質腫瘍、食道癌；結腸癌；結腸直腸癌；腎臓癌；皮膚癌；脳腫瘍；膠芽腫；非ホジキンリンパ腫（Ｔ又はＢ細胞リンパ腫）；白血病（慢性又は急性骨髄性白血病、非リンパ球性白血病）、又は多発性骨髄腫。

【0178】

本発明に従った使用のための結合分子もしくは医薬組成物、又は本発明の癌を処置、予防、もしくは寛解する方法、又は本発明の使用の好ましい実施形態では、癌は結腸直腸癌（ＣＲＣ）であり、転移性ＣＲＣ（ｍＣＲＣ）、胃癌（ＧＣ）、膵臓癌（ＰＡＣ）、又は食道癌を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、癌はｍＣＲＣである。

【0179】

結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、ＩＣＤ－１０にリストされている明確な悪性疾患であり、世界中で癌の罹患及び死亡の主な原因の１つである。ＣＲＣ患者の約２５%が、顕性の転移を呈し、転移性疾患が、新たに診断された患者の４０～５０%において発生する。化学療法における最近の改善によって、転移性ＣＲＣの生存期間が延長されたが、大半の患者は、それらの疾患に屈するであろう。それ故に、この疾患を処置するためのさらなる治療薬剤についての大きな必要性がある。

【0180】

結腸直腸癌の約３０～５０%が、変異（異常）ＫＲＡＳ遺伝子を有することが公知である。新生物において頻繁に見出されるＫＲＡＳ変異は、エクソン２（コドン１２及び１３）及びエクソン３（コドン６１）での変異を含み、腫瘍生検から分析できる。それらは、継続的なシグナル伝達をもたらす活性化変異、細胞の成長、増殖、浸潤、及び転移において含まれる下流のシグナル伝達経路を刺激することを含む。このように、一実施形態では、本発明の結合分子は、ＫＲＡＳ変異型結腸直腸癌（即ち、ＫＲＡＳ変異型腫瘍を伴う患者）の処置における使用のためである。代わりの実施形態では、本発明の結合分子は、ＫＲＡＳ野生型結腸直腸癌（即ち、ＫＲＡＳ野生型腫瘍を伴う患者）の処置における使用のためである。

【0181】

胃癌は、また、胃癌として公知であり、癌関連死の第３の原因である。発生率は、２０世紀初頭以降、食料保存における改善に起因して減少している一方で、胃癌は依然として、不良な予後を伴う適応症である。なぜなら、大多数の患者は、既に進行性疾患を呈し、治療の選択肢が手術、化学療法、放射線療法、及び限定された量の標的治療に限定されているからである。

【0182】

膵臓癌（ＰＡＣ）は、世界中で年間４００，０００人以上の死亡を起こしている悪性疾患である。それは、先進国における癌関連死の最も一般的な原因の間にある。手術及び化学療法などの治療介入にもかかわらず、膵臓腺癌は、全ての膵臓癌症例の約９０%を占めており、典型的には、非常に不良な予後を有し、約２５%の人々が１年間生存し、わずか５%の人々が５年間にわたり生存する。

【0183】

食道癌は、世界中で最も頻繁に診断される癌の間にある。膵臓癌と同様に、診断は難しく、既に進行した段階で起こる傾向があるため、この適応症についての非常に不良な予後に導く。結果として、それは、癌関連死の約５%を占め、このように、６番目に最も多い癌関連死の原因となっている。

【0184】

食道癌の２つの主な型、すなわち、食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ、症例の６０～７０%）及び食道腺癌（ＥＡＣ、症例の２０～２３%）の発生率は、異なる地理的地域の間で大きく変動し、ＥＳＣＣは開発途上国においてより一般的であるのに対して、ＥＡＣは先進国において主流である。現在の処置選択肢は、ほとんど手術及び化学療法又は放射線療法に限定されている。局所的な腫瘍だけが、治癒を意図して処置されるのに対して、転移性疾患の治療はほとんど緩和的である。

【0185】

上で述べられるように、本発明者らは、本明細書中に記載される結合分子が癌細胞を標的化するための多くの有用性を有し、従って、ＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７の両方を発現する癌の治療において使用することができることを確認した。特定の腫瘍がＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７の両方を発現するか否かを同定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、免疫組織化学を使用して、腫瘍組織がＴＲＯＰ２及びＣＤＨ１７を発現し（例、本明細書中に記載されるＴＲＯＰ２及び／又はＣＤＨ１７抗体を使用）、それ故に本発明の結合分子での処置について適切であるか否かを決定することができる。

【0186】

本発明の結合分子は、第一選択、第二選択、又は任意のさらなるラインの処置及び維持処置の状況における治療レジメンにおいて使用してもよい。

【0187】

さらなる態様では、本発明の結合分子は、結合分子の投与のために有用なデバイス、例えばシリンジ、インジェクターペン、マイクロポンプ、又は他のデバイスとの組み合わせにおいて使用される。さらなる態様では、本発明の結合分子は、例えば、また、結合分子の使用のための説明書を伴う添付文書を含む、部品のキット中に含まれる。

【0188】

実施例：
本発明を、今回、以下の非限定的な実施例により記載する。

【0189】

実施例１：ＧＩ癌組織で、しかし、正常組織ではなく、共発現される膜タンパク質としてのＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７の同定
GeneLogicから得られた腫瘍及び重要な正常組織におけるＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７の遺伝子発現を、Affymetrix Chipset HGU133a及びHGU133bを用いて測定し、特定の適応症、例えば胃癌、膵臓癌、食道癌、及び結腸直腸癌などの腫瘍組織における共発現が確認された（図１中に示すとおり）。共発現は正常組織において検出されなかった。

【0190】

ＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２タンパク質の発現をさらに、単一染色及び二重染色プロトコールにおいてＴｒｏｐ２（ＥＮＺ－ＡＢＳ３８０、Enzo）及びＣＤＨ１７（７６０－４８６５、Roche Ventana）に結合する抗体を使用した免疫組織化学により、ヒト腫瘍組織切片において評価した。これによって、胃、膵臓、及び結腸直腸起源の腫瘍細胞上でこれらの標的の共発現が追加的に確認された（図２）。

【0191】

実施例２：本発明の三重特異的結合タンパク質の概略図
Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７を共発現する腫瘍細胞のＴ細胞媒介性溶解を達成するために、Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３に結合する多重特異的結合タンパク質が設計された。使用される１つの例示的な分子設計は、図３中に示されるように、ＩｇＧ抗体足場及びＩｇＧ様構造を有する。それは、抗Ｔｒｏｐ２結合アームでのノブ部分及び抗ＣＤＨ１７結合アームでのＨｏｌｅ部分を伴う、当技術分野において公知のヘテロ二量体化のためのＦｃドメイン中でのノブ・イン・ホール技術を特徴とする。また、結合タンパク質は、各々のアーム中の軽鎖と対応する重鎖の間に柔軟なペプチド配列を有する。ＣＤ３結合単鎖可変領域が、この例示的な設計において、ホール鎖のＦｃ部分に付着されている。このように、結合タンパク質は、３つの抗原結合部位を含み、１つはＴｒｏｐ２に結合し、他の１つはＣＤＨ１７に結合し、それにおいて、各々のアームは単鎖Ｆａｂ及びＦｃ領域を含み、第３の抗原結合部位は、ｓｃＦｖとしてＣＤ３に結合する。好ましい分子設計では、結合分子は三重特異的及び三価（即ち、３つの標的の各々についてそれぞれ一価）である。

【0192】

実施例３：抗原結合部位及び三重特異的結合分子の設計、構築、及び検証
実施例３．１：ハイブリドーマ及び培養された単一Ｂ細胞からのハイスループットＶ遺伝子回収を使用した、Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７を認識する抗原結合部位の調製
抗Ｔｒｏｐ２結合剤を得るために、Ｔｒｏｐ２免疫化野生型マウス及びAlivaMabヒト化マウス（Ablexis、米国カリフォルニア州サンフランシスコ：ヒト免疫グロブリン遺伝子座を伴うAlivaMabトランスジェニックマウスプラットフォーム）から由来するハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞をインビトロで培養した。上清を、AlphaLISA（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）により、組換えヒトＴｒｏｐ２に対する反応性についてスクリーニングし、ヒトＴｒｏｐ２を発現する原発癌細胞株への結合を、フローサイトメトリーにより確認した。

【0193】

抗ＣＤＨ１７結合剤を得るために、野生型マウスの免疫化を Abpro（Abpro SOW#4）で実施した。免疫化マウスから由来するハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞をインビトロで培養した。上清を、AlphaLISA（PerkinElmer、米国マサチューセッツ州ウォルサム）により、組換えヒトＣＤＨ１７に対する、ならびにヒトＣＤＨ１７を発現するＡｓＰＣ－１膵臓腫瘍細胞株（ATCC（登録商標）、ＣＲＬ－１６８２）及び／又はＮＣＩ－Ｈ７１６結腸腫瘍細胞株（ATCC（登録商標）、ＣＣＬ－２５１）の細胞に対する反応性について、フローサイトメトリーによりスクリーニングした。リンパ節を標準的なAbproハイブリドーマ手順に従って処理した。一次スクリーニングは、ｈＣＤＨ１７－Ｈｉｓ（以下の実施例４．５において記載されるように調製）を使用したＥＬＩＳＡにより実施した。全てのＥＬＩＳＡ陽性ウェルを、上に列挙される２つの細胞株に対してフローサイトメトリーによりスクリーニングした。全てのＥＬＩＳＡ及び細胞株陽性ウェルを拡大し、両方の方法により再テストした。増殖させた陽性ハイブリドーマの親和性ランキングを、ForteBio Octetを使用して行った。

【0194】

Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７の両方について、免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ及びＶＬ遺伝子を次に、同定された陽性クローンから増幅させた。ハイブリドーマから ＲＮＡを単離するために、単一クローンからの約２×１０^６個細胞をペレット化し、材料として使用した。単一のＢ細胞について、単一に単離された Ｂ細胞から増殖させた１００～５００個の細胞を、供給材料として使用した。ＲＮＡを、RNeasy Plus（Qiagen、ドイツ、ヒルデン）を使用して単離した。ｃＤＮＡを次に、Smarter cDNA合成キット（Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー）を製造業者の指示に従って使用して合成した。

【0195】

ｃＤＮＡ合成を促進するために、オリゴｄＴを使用して全てのメッセンジャー ＲＮＡの逆転写をプライミングし、その後にSmarter IIAオリゴヌクレオチドを用いた「５’ キャッピング」が続いた。ＶＨ及びＶＬフラグメントのその後の増幅を、Ｓｍａｒｔｅｒ ＩＩＡキャップを標的化する５’プライマー及びＣＨ１中のコンセンサス領域を標的化する３’プライマーを使用した２ステップＰＣＲ増幅を使用して実施した。簡単には、各々の５０μlのＰＣＲ 反応は、２０μMのフォワード及びリバースプライマーミックス、２５μlのPrimeStar Max DNAポリメラーゼプレミックス（Clontech）、２μlの未精製ｃＤＮＡ、及び２１μlの２回蒸留水からなる。サイクリングプログラムは ９４℃で３分間にわたり開始し、その後に３５サイクル（３０秒間にわたる９４℃、１分間にわたる５０℃で、１分間にわたる６８℃）が続き、７分間にわたる７２℃で終了する。第２ラウンドのＰＣＲを、それらのそれぞれのｐＴＴ５マザーベクター中のそれぞれの領域（ＶＨ及びＶＬ）に「重複」する１５bpの相補的伸長を含むＶＬ及びＶＨの第２ラウンドプライマーを用いて実施した。第２ラウンドのＰＣＲを、以下のプログラムを用いて実施した：３分間にわたる９４℃；３５サイクル（３０秒間にわたる９４℃、１分間にわたる５０℃、１分間にわたる６８℃）、７分間にわたる７２℃で終了する。

【0196】

In-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（Clontech、米国）を、ｐＴＴ５ ｈｕＩｇＫ ベクター中へのＶＬ遺伝子の、ｐＴＴ５ ｈｕＩｇＧ１ＫＯベクター中へのＶＨ遺伝子の方向性クローニングするために使用した。In-Fusion（登録商標）HDクローニングを促進するために、ＰＣＲ産物を、In-Fusion HDクローニングの前に精製し、Cloning Enhancerで処理した。クローニング及び形質転換を、製造業者（Clontech、米国）のプロトコールに従って実施した。ミニプレップＤＮＡをサンガー配列決定に供して、完全なＶ遺伝子フラグメントが得られたことを確認した。

【0197】

この方法論を使用して、Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７についての特異性を伴う抗原結合部位をコードするＩｇ ＶＨ及びＶＬ遺伝子のペアを調製した。組換え抗体を、対応する重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドを用いたＣＨＯ－Ｅ３７細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。

【0198】

実施例３．２：組換え抗体の確認的スクリーニング
発現された組換え抗体を含む上清を、ヒト又はカニクイザルのＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７をそれぞれ発現する細胞株への結合についてフローサイトメトリーによりアッセイした。簡単には、細胞を組換え上清とインキュベートし、洗浄し、上清からの結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を抗ヒトＩｇＧ－ＡＰＣ（Jackson ImmunoResearch 109-136-098）で検出した。シグナル対バックグラウンド比率（Ｓ／Ｂ）を、サンプルの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、アイソタイプコントロール（無関係なタンパク質に対する可変領域及び異なる定常領域バックボーン）の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により割ることにより算出した。

【0199】

Biacore 4000上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を、組換え上清で実施した。簡単には、ＨＴＰ上清中の非最適化ＩｇＧを、プロテインＡ／Ｇを介して、１０μl/分で６０秒間にわたりセンサー表面上に捕捉した。捕捉されたＩｇＧへの１００nMヒトＴｒｏｐ２又は１００nMヒトＣＤＨ１７の結合を、３０μl/分で１８０秒間の会合、それに続くＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中での１２０秒間の解離についてモニタリングした。プロテインＡ／Ｇ 表面の再生を、各々の結合サイクルの間にグリシンｐＨ ２．１を用いて実施した。

【0200】

以下の材料を、このアッセイにおいて使用した：タンパク質試薬：組換え発現されたヒトＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７。システム泳動緩衝液：ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１０mM ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４、１５０mM ＮａＣｌ、３mM ＥＤＴＡ、及び０．００５% ｖ／ｖ ポリソルベート Ｐ２０）。捕捉試薬：プロテインＡ／Ｇ Ｇ（ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）、全てのヒトＩｇＧアイソタイプに向けられた特異性を伴う。

【0201】

目的のクローン（ｎＭ範囲中のＫｄを伴う）を多重特異的フォーマット用に選択した。多重特異的結合タンパク質をその後に生成し、以下に記載されるように機構的及び機能的スクリーニング（例えば、例、細胞結合、細胞毒性、及びＴ細胞活性化など）においてさらに評価した。

【0202】

実施例３．３：Ｔｒｏｐ２及びＣＤＨ１７結合剤のヒト化及び最適化
上に記載されるＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７結合剤の配列を、ヒト化及び／又は最適化した。抗体の配列最適化／ヒト化は、ヒトにおいて産生された抗体に似た治療薬としての使用のために、非ヒト種において産生された抗体（特定の抗原／エピトープに対する）を操作するための方法論であって、それにより、特異性を保持しながら潜在的な有害効果、例えば免疫原性などを排除する。本明細書で利用される配列最適化／ヒト化アプローチは、Singh et al., 2015（Singh S et al., mAbs 2015:7(4):778-91）により記載されているとおりであった。簡単には、密接にマッチするヒト生殖系列をインシリコで同定して、最適化／ヒト化バリアントを、ファージスクリーニング方法を使用して評価した。最終的なリード候補配列を、結合、パーセントヒトスコア、及びEpivax（潜在的な免疫原性についてのインシリコ予測ツール）スコアに基づいて選択した。

【0203】

実施例３．４：ＣＤ３結合剤のｓｃＦｖ変換
ＣＤ３ ｓｃＦｖをコードする遺伝子セグメントを構築するために、ＣＤ３結合可変ドメインをコードするＶＬ及びＶＨ遺伝子のペアを、文献（Pessano et al., EMBO J. 1985 Feb;4(2):337-44；Salmeron A et al., J Immunol. 1991 Nov 1;147(9):3047-52）において記載されているＣＤ３結合剤のヒト化から誘導し、ペプチド配列ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ（配列番号２６５）の柔軟なリンカーをコードする遺伝子セグメントにより連結させた。

【0204】

実施例３．５：Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３に結合する三重特異的タンパク質及びコントロールの構築
Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７結合剤、及びＣＤ３ ｓｃＦｖの可変領域ならびに対応するコントロールを、一般的な分子生物学技術を使用して発現ベクターｐＴＴ５（National Research Council、カナダ）中にクローニングし、１つのＴｒｏｐ２特異的結合単位を伴う三重特異的結合タンパク質を形成し、Ｔｒｏｐ２に結合する単鎖Ｆａｂ、及びＦｃ領域を含む１つのＴｒｏｐ２特異的結合単位（そのような結合単位はまた、本明細書中では「Ｔｒｏｐ２アーム」又は「Ｔｒｏｐ２鎖」として言及される）ならびにＣＤＨ１７に結合する単鎖Ｆａｂ、及びＦｃ領域を含むＣＤＨ１７特異的結合単位（そのような結合単位はまた、本明細書中で「ＣＤＨ１７アーム」又は「ＣＤＨ１７鎖」として言及される）、及びＣＤ３ ｓｃＦｖはアームの１つ、好ましくはＣＤＨ１７アームのＣ末端に付加される。２０アミノ酸のスペーサーを使用して、ｓｃＦｖをＦｃから分離した。Ｔｒｏｐ２アーム及びＣＤＨ１７アームのＦｃ領域は、「ノブ」又は「ホール」変異のいずれかを含み（Atwell et al, JMB, 1997, 270, 26-35）、それぞれの鎖はノブ鎖又はホール鎖として言及される。マルチフラグメントＤＮＡアセンブリについては、Gibsonアセンブリ及びNEBuilder HiFi DNAアセンブリアプローチを、製造元のプロトコール（New England Biolabs、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ）に従って使用した。ＤＮＡミニプレップを配列決定した。

【0205】

各々の発現ベクターは、鎖をコードする遺伝子（Ｔｒｏｐ２又はＣＤＨ１７アーム／鎖）、即ち、シグナル配列ならびに軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子のための真核生物プロモーターエレメント、原核生物の選択マーカー遺伝子、例えばアンピシリンなどのための発現カセット、及び複製起点を含んだ。これらのＤＮＡプラスミドを、アンピシリン耐性大腸菌のコロニー及び培養物において増殖させ、精製させた。

【0206】

Ｔｒｏｐ２／Ｔｒｏｐ２／ＣＤ３、ＣＤＨ１７／ＣＤＨ１７／ＣＤ３、Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３、ＴＮＰ／ＣＤＨ１７／ＣＤ３、及びＴＮＰ／ＴＮＰ／ＣＤ３を含む種々のアセンブリ中のコントロール分子を、上に記載されるGibsonアセンブリ及びNEBuilder HiFi DNAアセンブリアプローチを使用してクローニングし、一過性発現のためにｐＴＴ５ベクター中にクローニングした。

【0207】

実施例４：Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３に結合する三重特異的、三価結合タンパク質の発現及び精製
Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３に結合する三重特異的分子、ならびに対応するコントロールは、Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３鎖をコードする遺伝子を保有するｐＴＴ５ベクターを用いたＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより産生された。簡単には、無血清培地中の懸濁液において成長するトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｅ細胞を、振盪フラスコ中で、１４０rpm、３７℃、５% ＣＯ２での撹拌下で培養し、指数関数的成長の条件で保った。トランスフェクションの日に、細胞を、ノブ鎖プラスミドとホール鎖プラスミドを質量比１：３で化学的にトランスフェクトした。それらを 次に、１LのGibco（登録商標）FreeStyle（商標）ＣＨＯ発現培地（LifeTechnologies、米国ニューヨーク州）中に１～２×１０^６個細胞/mlで播種した。細胞を次に、軌道振盪下で、２００mlの市販の供給溶液の１回供給を伴って１０日間にわたりインキュベートして、タンパク質の発現を可能にした。細胞培養上清中の抗体力価を、Octet（登録商標）機器（Pall ForteBio、米国カリフォルニア州）及びｐｒｏｔＡバイオセンサーチップを製造元の指示に従って使用して測定した。

【0208】

組換えＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質は、２工程の過程において培養上清から精製した：第１に、MabSelect（商標）カラム（GE Healthcare）を使用したプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによる；第２に、Poros 50 HSカラム（Applied Biosystems、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用した陽イオン交換クロマトグラフィーによる。２工程精製した物質を、５０mM酢酸ナトリウム及び１００mM ＮａＣｌの最終緩衝液、ｐＨ５．０中に保存した。サンプルの純度及び不均一性の程度を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、及び分析的超遠心分離により評価した。機能テスト用に進められたサンプルは、＞９８%単量体含量を伴う２段階精製された材料を含んだ。

【0209】

実施例４．１：等電点の不均衡を低下させるための抗Ｔｒｏｐ２抗体のフレームワーク操作
抗Ｔｒｏｐ２、抗ＣＤＨ１７、及び抗ＣＤ３を含む三重特異的分子を、その後にさらに修飾して、観察される凝集量を最小限にした（単一段階ＰｒｏＡ精製後の約６５%の単量体）。個々のＦｖアームのインシリコ分析によって、抗Ｔｒｏｐ２抗体が、抗ＣＤＨ１７アーム（ｐＩ＝８．５）及び抗ＣＤ３アーム（ｐＩ＝８．８）よりも１単位低いｐＩ（ｐＩ＝７．７）を有することが示された。この操作戦略の仮説は、抗Ｔｒｏｐ２アームのｐＩを、抗ＣＤＨ１７アーム及び抗ＣＤ３アームとより一致するように上昇させることによって、凝集が減少し、単量体のパーセントが増加するということであった。変異は、ファミリーと無関係に、少なくとも１つの天然重鎖又はカッパ軽鎖中のフレームワーク位置においてリジン又はアルギニンのいずれかを有する残基のサブセットより選択された。重鎖（プラス親）における合計 ７つの点変異及び軽鎖（プラス親）における合計４つの点変異が選択された。電荷バリアントのモデリングは、単一点変異の組み入れによって、抗Ｔｒｏｐ２ ＦｖのｐＩが、平均８．３まで上昇し、二重変異体（重鎖上の１つ、軽鎖上の１つ）は、ｐＩが８．８まで上昇することを示した。

【0210】

以下の変異は、抗Ｔｒｏｐ２ ＦｖのｐＩを上昇させために適切として選択された：ＶＨ：Ｓ１９Ｋ、Ｔ２３Ｋ、Ｇ４３Ｒ、Ｓ６１Ｋ、Ｔ７２Ｒ、Ｓ８３Ｒ、Ｔ８５Ｒ及びＶＬ：Ｑ３Ｒ、Ｓ６５Ｋ、Ｓ７６Ｒ、Ｑ７９Ｋ。番号付けは、Ｋａｂａｔの番号付けスキームに基づき、ＶＨドメイン又はＶＬドメインの最初のアミノ酸は、それぞれ１番目としてカウントされる（即ち、変異Ｓ１９Ｋは、ＶＨドメインの１９番目のアミノ酸における変異、などである）。

【0211】

実施例４．２：改善された安定性のための抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの最適化
抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの安定性を改善させるために、構造モデリングに基づくアプローチを使用した。ＣＤ３＃１（配列番号２２２）のＦｖ部分についての分子モデルを、ＭＯＥ（Chemical Computing Group、ＵＬＣ）における抗体モデラーにより可能になるハイスループット抗体モデリングを介して作製した。構造モデルを使用して、Ｆｖ領域ならびにそれらの溶液及び分子表面におけるＶＬ及びＶＨ界面の安定性の記述子を計算した。インシリコで生物物理学的特性に影響を及ぼすと決定された位置を同定して、バリアントのライブラリーを生成し、三重特異的フォーマットにおける改善された血清安定性についてスクリーニングした。軽鎖中の８つの変異（Ｒ２３Ｇ、Ｅ４０Ｑ、Ｌ４５Ａ、Ｇ５９Ｗ、Ｖ６０Ｔ、Ｌ７７Ｉ、Ｅ８７Ｄ、及びＦ８９Ｙ）及び重鎖中の９つの変異（Ｋ１９Ｒ、Ｓ３０Ｎ、Ｇ４９Ａ、Ｄ６８Ｇ、Ｔ８０Ｓ、Ａ８１Ｌ、Ｎ８７Ｓ、Ｋ８９Ｒ、及びＴ９０Ａ）が同定され、それらは、個々に（例えば、ＣＤ３＃８において、配列番号２２９を参照のこと）、又は組み合わせにおいて（例えば、ＣＤ３＃２（配列番号２２３）、３（配列番号２２４）、５（配列番号２２６）、７（配列番号２２８）において、を参照のこと）のいずれかで生物物理学的特性に影響を及ぼした。再び、番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームに基づいており、ＶＨドメイン又はＶＬドメインの最初のアミノ酸は、それぞれ１番目としてカウントされる（即ち、変異Ｒ２３Ｇは、ＶＬドメインの２３番目のアミノ酸における変異、などである）。

【0212】

実施例４．３：Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質の単量体含量パーセント
単量体パーセントを、表２中に示すように、例示的なＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質について、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）により決定した。ａＳＥＣを、Protein BEH SECカラム２００A、１．７μm、４．６×１５０mm（カタログ番号１８６００５２２５）を使用したWaters（米国マサチューセッツ州ミルフォード）Acquity UPLCシステムで実行した。実行条件は以下のとおりである：移動相：５０mMリン酸ナトリウム、２００mMアルギニン、及び０．０５%アジ化ナトリウム；流量：０．５ml/分；実行時間：５分；サンプル負荷量：１０μg；ピーク検出：Ａ２８０nM；クロマトグラムの自動処理方法。

【表2】

表２：Ｔｒｏｐ２、ＣＤＨ１７、及びＣＤ３を含む三重特異的分子についての第１及び第２精製工程後の単量体パーセント。それぞれの結合剤の配列を表１中に示す。

【0213】

実施例４．４：熱安定性
熱安定性を熱シフト分析（ＴＳＡ）により決定し、代表的なＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質の最初の融解転移（Ｔｍ１）の結果を表３中に示している。温度の関数としての蛍光強度プロファイルを、外因性蛍光体としてSYPRO Orange（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）を用いたQuantStudio 6 FlexリアルタイムＰＣＲ システム（Applied Biosystems、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して取得した。サンプルを、４０mM塩化ナトリウム及び０．０２%アジ化ナトリウムを伴う１０mMヒスチジン、ｐＨ６．０中で０．４mg/mlに希釈した。融解曲線は、２５℃から９５℃まで２℃／分の速度での昇温で生成し、データを「ＲＯＸ」フィルターセット（例：５８０±１０nm、Ｅｍ：６２３±１４nm）を通じて約４℃毎に収集した。データを、Protein Thermal Shift Softwareバージョン１．３（ThermoFisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して分析した。

【表3】

表３：代表的なＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質の最初の融解転移（Ｔｍ１）により測定された熱安定性。

【0214】

実施例４．５：組換えタンパク質の産生
ヒトＴｒｏｐ２－Ｈｉｓ及びヒトＣＤＨ１７－Ｈｉｓ
ヒトＴｒｏｐ２－Ｈｉｓ及びヒトＣＤＨ１７－Ｈｉｓを産生する細胞株を、ＨＥＫ－２９３細胞（Thermo Fisher）、Lenti-X Lentiviral System（Clontech）、及びＨｕｍａｎ Ｔｒｏｐ２－Ｈｉｓ（ヒトＴｒｏｐ２アクセッション番号Ｐ０９７５８）及びヒトＣＤＨ１７－Ｈｉｓ（ヒトＣＤＨ１７アクセッション番号Ｑ１２８６４）をコードするプラスミドを使用して生成した。発現のために、細胞を、３７℃、５% ＣＯ２、１４０rpmでの振盪で培養及び増殖させた。発現の０日目に、細胞をペレット化し、Expi 293培地中に再懸濁した。発現の３日目に、馴化培養上清を、細胞を４７００rpmで４０分間にわたりペレット化することにより回収した。プロテアーゼ阻害剤を、精製前にバイオマスに加えた。発現をウェスタンブロットにより確認した。馴化培養上清を０．５mM ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、１０mMイミダゾールで調整した。精製を、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ ｅｘｃｅｌカラム及び緩衝液Ａ：５０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．５で行った。目的のタンパク質を、２０mMイミダゾールから５００mMイミダゾールまでの溶出勾配を使用して、０．５Mイミダゾールを添加した緩衝液Ａ（ｐＨ ８．５）中に溶出した。プールした画分を、緩衝液：５０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、１mM ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、０．２Mアルギニン、３%グリセロール、ｐＨ ６．５中で透析した。精製された物質を、質量分析及び分析的超遠心分離により定性した。

【0215】

Ｃｙｎｏ Ｔｒｏｐ２－Ｈｉｓ及びＣｙｎｏ ＣＤＨ１７－Ｈｉｓ
Ｃｙｎｏ Ｔｒｏｐ２－Ｈｉｓ及びＣｙｎｏ ＣＤＨ１７－Ｈｉｓを産生する細胞株は、ＨＥＫ－２９３細胞（Thermo Fisher）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘレンチウイルスシステム（Clontech）、及びＣｙｎｏ Ｔｒｏｐ２－Ｈｉｓ（Ｃｙｎｏ Ｔｒｏｐ２アクセッション番号：アクセッション＃ ＸＰ＿００１１１４５９９．１（ＲｅｆＳｅｑ））及びＣｙｎｏ ＣＤＨ１７－Ｈｉｓ（Ｃｙｎｏ ＣＤＨ１７アクセッション番号：ＸＰ＿００５５６３７６２．１（ＲｅｆＳｅｑ））をコードするプラスミドを使用して生成した。発現のために、細胞を、３７℃、５% ＣＯ２、１４０rpmでの振盪で培養及び増殖させた。発現の０日目に、細胞をペレット化し、Ｅｘｐｉ ２９３培地中に再懸濁した。発現の３日目に、馴化培養上清を、細胞を４７００rpmで４０分間にわたりペレット化することにより回収した。プロテアーゼ阻害剤を精製前にバイオマスに加えた。発現をウェスタンブロットにより確認した。馴化培養上清を０．５mM ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、１０mMイミダゾールで調整した。精製を、HisTrap Ni excelカラム及び緩衝液Ａ：５０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、０．５mM ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．５で行った。目的のタンパク質を、２０mMイミダゾールから５００mMイミダゾールまでの溶出勾配を使用して、０．５Mイミダゾールを添加した緩衝液Ａ（ｐＨ ８．５）中で溶出した。プールした画分を、緩衝液：５０mM ＭＥＳ、５０mM ＮａＣｌ、１mM ＴＣＥＰ、０．０２% ＣＨＡＰＳ、０．２Mアルギニン、３%グリセロール、ｐＨ ６．５中で透析した。精製された物質を、質量分析及び分析的超遠心分離により定性した。

【0216】

実施例５：結合剤選択のための細胞株生成
全長ヒトＣＤＨ１７を単独で又はＴｒｏｐ２との組み合わせにおいて発現する安定したＨＥＫ２９３細胞の生成のために、ＣＤＨ１７のコード配列（タンパク質アクセッションＱ１２８６４）をｐＣＭＶ６（Origene）中にクローニングした。全長ヒトＴｒｏｐ２を単独で又はＣＤＨ１７との組み合わせにおいて発現する安定したＨＥＫ２９３細胞の生成のために、Ｃ末端Ｍｙｃ－ＤＤＫタグを伴うＴｒｏｐ２のコード配列を含むｐＣＭＶ６を、Origeneから得た（＃ＲＣ２０２５１９）。ＨＥＫ２９３細胞を、製造元の指示に従って Cell Line Nucleofector Kit V（Amaxa）を使用してトランスフェクトし、安定したクローンを、それぞれジェネティシン及びピューロマイシン選択を使用して確立した。

【0217】

組換えタンパク質の発現を、抗Ｔｒｏｐ２（Ｒ＆Ｄ＃ ＭＡＢ６５０）及び抗ＣＤＨ１７（Ｒ＆Ｄ＃ ＭＡＢ１０３２）一次抗体、それに続くＰＥ 標識抗マウス二次抗体（Dako＃ Ｒ０４８０）を使用したフローサイトメトリーにより検証した。

【0218】

実施例６：結合能を伴うＣＤＨ１７結合剤の選択及び三重特異的フォーマットにおける結合能の確認
二価及び一価のいずれかのフォーマットにおける４つの異なるＣＤＨ１７結合タンパク質（即ち、ＣＤＨ１７＃６、ＣＤＨ１７＃４、ＣＤＨ１７＃７、及びＣＤＨ１７＃１；全てが実施例３において記載されるように産生される；それぞれの結合剤の配列を、表１中に見出すことができる）の結合をテストした。この目的のために、実施例５において記載されるように調製されたヒトＣＤＨ１７を組換え発現するＨＥＫ２９３細胞株へのそれらの結合を、フローサイトメトリーにより分析した。

【0219】

ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５%ＢＳＡ／０．０５%アジ化ナトリウム）中の増加濃度の２段階精製された二価又は一価ＣＤＨ１７結合タンパク質で染色した。結合分子を、ＦＩＴＣ結合抗ヒト二次抗体（Invitrogen 05-4211）で検出した。各々のＣＤＨ１７結合タンパク質の結合能を、それぞれの一価フォーマットの結合曲線を、二価フォーマットと比較することにより評価した（図４）。一価フォーマットから二価フォーマットへの有意な親和性シフトを示す結合タンパク質を、その後の実験のために選択した。

【0220】

Ｔ細胞を活性化する、これらのＣＤＨ１７結合剤の潜在力をさらにテストするために、種々のＣＤＨ１７結合剤を三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子中に組み立てて、Ｔ細胞活性化を、ＣＤＨ１７単独又はＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２の組み合わせを発現するＨｅｋ２９３細胞の存在において評価した。このアッセイでは、Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７陽性細胞株を、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞及び増加濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子と、エフェクター対標的細胞の比率１０：１で７２時間にわたり共培養した。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子を、実施例４において記載されているように、鎖をコードする遺伝子を保有するｐＴＴ５ベクターを用いたＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより産生された。

【0221】

凍結ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をStemcell Technologiesから得た。細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ－１６４０ ｗ／ｏ Phenolred（Gibco／Lonza ＃ ＢＥ １２－９１８－Ｆ）、５% ＨｉＦＢＳ（ＦＢＳ、HyClone（Thermo Scientific、カタログ：ＳＨ３００７１．０３））、熱不活化、５６℃、３０分）、Glutamax（Gibco ＃ ３５０５０－０６１）、２７．５μMベータ－メルカプトエタノール（Gibco ＃２１９８５－０２３）を含むアッセイ培地中に再懸濁した。Ｔ細胞を、Pan T Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec ＃１３０－０９１－１５６）を使用したネガティブ選択により、洗浄したＰＢＭＣから単離した。簡単には、末梢血単核細胞を、１０Ｍｉｏ細胞あたり４０μlの緩衝液 ＰＢＳ／０．５% ＢＳＡ（Gibco ｒｅｆ＃０４１－９４５５３ Ｍ）／２mM ＥＤＴＡ（Invitrogen ｒｅｆ＃ １５５７５－０３８）中に再懸濁し、１０Ｍｉｏ細胞あたり１０μlのビオチン抗体カクテルと４℃で５分間にわたりインキュベートした。その後、３０μlの緩衝液及び２０μlの抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅｄ／１０００万細胞を加えて、４℃で１０分間にわたりインキュベートした。その後、混合物を、適切なＭＡＣＳ分離器（Miltenyi Biotec）の磁場中で、予めリンスした２５ＬＳカラム（Miltenyi Biotec ＃１３０－０４２－４０１）中に置いた。Ｔ細胞を含むフロースルーを収集し、アッセイ培地中で洗浄した。

【0222】

その後、１：１０の比率の標的細胞とＴ細胞を、示された濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質と７２時間にわたりインキュベートした（図５を参照のこと）。

【0223】

Ｔ細胞の活性化を決定するために、細胞を遠心分離し、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃３１７４４）、ＣＤ８（ＢＤ ＃５６２４２８）、及びＣＤ６９（ＢＤ ＃５５７７４５）に対する抗体で染色し、蛍光を、フローサイトメトリーにより測定した。結果を図５中に描写する。

【0224】

結合能を、ヒトＣＤＨ１７だけを発現する（図５Ａ）又はＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２の組み合わせを発現する（図５Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞の存在において誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の量を比較することにより分析した。ＣＤＨ１７だけを発現するＨＥＫ２９３細胞の存在において１００nMで２０%未満のＴ細胞活性化を起こす結合剤だけを、さらなる評価のために選択した。

【0225】

実施例７：結合能を伴うＴｒｏｐ２結合剤の選択及び三重特異的フォーマットにおける結合能の確認
二価（ＩｇＧ）又は一価（ダミー結合アームを伴うノブ・イン・ホール・フォーマット）のいずれかの形態における７つの異なるＴｒｏｐ２結合剤（Ｔｒｏｐ２＃１～Ｔｒｏｐ２＃７；それぞれの結合剤の配列を、表１中に見出すことができる）の結合がテストされた。一価フォーマットでは、結合部位の１つが、真核生物の状況において存在しない無関係な抗原であるテトラニトロフェノール（ＴＮＰ；配列番号１６７及び１６８のＶＨ及びＶＬドメインを含む）に結合する結合部位により置換された。この目的のために、実施例５において記載されるように調製されたヒトＴｒｏｐ２を組換え発現するＨＥＫ２９３細胞株へのそれらの結合を、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔｒｏｐ２結合タンパク質を、実施例４中に記載されているように産生した。

【0226】

ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５%ＢＳＡ／０．０５%アジ化ナトリウム）中で増加濃度の２段階精製した二価又は一価のＴｒｏｐ２結合タンパク質で染色した。結合分子を、ＦＩＴＣ結合抗ヒト二次抗体（Invitrogen ０５－４２１１）で検出した。各々のＴｒｏｐ２結合タンパク質の結合能を、それぞれの一価フォーマットの結合曲線を、二価フォーマットと比較することにより評価した（図６）。一価フォーマットから二価フォーマットへの有意な親和性シフトを示す結合タンパク質を、以下の実験のために選択した。

【0227】

Ｔ細胞を活性化する、これらのＴｒｏｐ２結合剤の潜在力をさらにテストするために、種々のＴｒｏｐ２結合剤を三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子中に組み立て、Ｔ細胞の活性化を、ＣＤＨ１７単独、Ｔｒｏｐ２単独、又はＣＤＨ１７及びＴｒｏｐ２の組み合わせのいずれかを発現するＨｅｋ２９３細胞の存在において評価した。このアッセイでは、Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７陽性 ＨＥＫ２９３細胞株を、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞及び増加濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子と、エフェクター対標的細胞の比率１０：１で７２時間にわたり共培養した。変動する抗原親和性を伴う３つの異なるＴｒｏｐ２結合剤を、実施例６において同定されたＣＤＨ１７結合剤と三重特異的フォーマットにおいて組み合わせて（図５Ａ）、ＣＤＨ１７だけを発現するＨＥＫ２９３細胞の存在において最も低いＴ細胞活性化を誘導した。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子を、実施例４において記載されているように、鎖をコードする遺伝子を保有するｐＴＴ５ベクターを用いたＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。ヒトＴ細胞を、実施例６において記載されているように単離した。

【0228】

その後に、１：１０の比率の標的細胞とＴ細胞を、示された濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子と７２時間にわたりインキュベートした（図７を参照のこと）。

【0229】

Ｔ細胞活性化状態を、実施例６において記載されているように決定した。

【0230】

結合能を、ヒトＴｒｏｐ２だけ（図７Ｂ）、ヒトＣＤＨ１７だけ（図７Ｃ）、又はヒトＣＤＨ１７及びヒトＴｒｏｐ２の組み合わせのいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞の存在において誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ６９上方調節の量を比較することにより分析した（図７Ａ）。再び、一価結合の状況において、即ち、ＣＤＨ１７（だけ）又はＴｒｏｐ２（だけ）発現細胞で、１０nMで２０%未満のＴ細胞活性化を起こす結合剤を、その後の実験のために選択した。

【0231】

ＨＥＫ２９３細胞上で発現されたＴｒｏｐ２に対する結合親和性を、フローサイトメトリーに基づくスキャッチャード方法により評価し、Ｔｒｏｐ２＃１については２．２nM、Ｔｒｏｐ２＃５については０．６、及びＴｒｏｐ２＃７については０．４のＫｄを明らかにした。結合能は、この方法を通じて決定された親和性と逆相関し、低親和性結合剤だけが、二価フォーマットにおいて、二重陽性細胞から単一陽性細胞の識別を可能にすることを示しています。

【0232】

実施例８：細胞結合アッセイにおける種々の三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合剤の組み合わせの結合能の分析
結合力に基づく効力増加を確認するために、３つの異なるＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３三重特異的結合分子（Ｔｒｏｐ２＃１／ＣＤＨ１７＃１／ＣＤ３＃１ Ｔｒｏｐ２＃５／ＣＤＨ１７＃１／ＣＤ３＃１、Ｔｒｏｐ２＃７／ＣＤＨ１７＃１／ＣＤ３＃１、図８を参照のこと）の標的結合を、二重特異的Ｔｒｏｐ２／Ｔｒｏｐ２／ＣＤ３結合分子ならびに三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合分子の結合と比較した。この目的のために、ヒトＴｒｏｐ２を組換え発現する（図８Ａ）、又はヒトＴｒｏｐ２及びヒトＣＤＨ１７を共発現する（図８Ｂ）、のいずれかのＨＥＫ２９３細胞株へのこれらの分子の結合を、フローサイトメトリーによりテストした。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３ Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３及びＴｒｏｐ２／Ｔｒｏｐ２／ＣＤ３結合タンパク質を、実施例４において記載されるように産生した。

【0233】

ヒトＴｒｏｐ２を組換え発現する、又はヒトＴｒｏｐ２及びヒトＣＤＨ１７を共発現する、のいずれかのＨＥＫ２９３細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．５%ＢＳＡ／０．０５%アジ化ナトリウム）中の増加濃度の２ 段階精製されたＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３、Ｔｒｏｐ２／Ｔｒｏｐ２／ＣＤ３、及びＴｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合分子で染色した。結合分子を、ＦＩＴＣ結合抗ヒト二次抗体（Invitrogen ０５－４２１１）で検出した。各々の三重特異的結合分子の結合能を、一価結合曲線及び二価結合曲線を比較することにより評価した。Ｔｒｏｐ２単独に対して有意な結合を示す結合タンパク質は、結合力が最適化された二重特異的結合アプローチのために選択されなかった。結果を図８中に示す。それぞれの結合剤の配列を、表１中に見出すことができる。

【0234】

実施例９：ＣＤＨ１７、Ｔｒｏｐ２を発現する、又は両方を共発現する細胞におけるＴ細胞誘導性溶解を媒介する際での効力
Ｔｒｏｐ２タンパク質及びＣＤＨ１７タンパク質の両方を共発現するヒト細胞についてのＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質の選択性に対処するために、非刺激Ｔ細胞を、ヒトＣＤＨ１７及び／又はヒトＴｒｏｐ２を発現する細胞に向けて方向転換することにより、溶解を誘導する能力をテストした。

【0235】

Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７陽性細胞株のＴ細胞媒介性溶解の効力を、以下に記載されるように細胞溶解についての読み取り値として乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出を使用して決定した。このアッセイでは、Ｔｒｏｐ２もしくはＣＤＨ１７のいずれか又は両方を発現する細胞株を、エフェクター細胞としてのヒトＴ細胞及び増加濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子と７２時間にわたり、エフェクターと標的細胞の比率１０：１で共培養した。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子を、実施例４において記載されているように、鎖をコードする遺伝子を保有するｐＴＴ５ベクターを用いたＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。

【0236】

ヒトＴ細胞を、実施例６において記載されているように、凍結ＰＢＭＣから単離した。

【0237】

細胞傷害性活性を、細胞傷害性検出キットＰＬＵＳ（Roche）を製造元の指示に従って使用して決定した。簡単には、この方法は、死んだ又は形質膜が損傷した細胞からのＬＤＨの放出に基づいている。細胞培養上清を、キットからの反応混合物と３０分間にわたりインキュベートし、ホルマザンの形成を、ＬＤＨ活性の結果として、細胞溶解についての代用として分光光度計において５００nMで測定する。最大溶解コントロールに対する細胞傷害性のパーセンテージを、以下の式に従って算出した：

【数1】

バックグラウンド：標的細胞 ＋ エフェクター細胞
最大溶解：標的細胞 ＋ ５% Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００
最小溶解：標的細胞

【0238】

GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して、最大溶解コントロールに対する細胞傷害性のパーセンテージを、対応するＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子濃度に対してプロットした。用量反応曲線を、シグモイド用量反応曲線の評価のために、４パラメータロジスティック方程式モデルを用いて分析した。

【0239】

三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子は、Ｔｒｏｐ２＋／ＣＤＨ１７＋細胞の溶解を、良好な有効性を伴って媒介したのに対し、これは、それぞれ Ｔｒｏｐ２ だけ又はＣＤＨ１７だけを発現する細胞株については該当せず、このように、当該三重特異的分子の結合力の増強された生物学的活性が確認された（図９Ａを参照のこと）。結合力アプローチの特異性を、Ｔｒｏｐ２（Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３）又はＣＤＨ１７（ＴＮＰ／ＣＤＨ１７／ＣＤ３）のいずれかに一価で結合するコントロール分子が、有意な標的細胞溶解を誘導できないという事実によりさらに裏付けた。同じフォーマットにおけるＴｒｏｐ２及びＣＤＨ１７についての二価結合剤をコントロールとして使用した。

【0240】

癌設定における結合力アプローチを確認するために（図９Ｂを参照のこと）、方向転換されたＴ細胞の細胞傷害性を、Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７を共発現する結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ－１、ならびにＣＤＨ１７を欠くように操作され、このように、Ｔｒｏｐ２だけを発現するように設計されたＤＬＤ－１クローンにおいて評価した。ＤＬＤ－１細胞をATCCから得て、レポータータンパク質ＧＦＰが導入されたＣＤＨ１７欠損ＤＬＤ－１クローンを生成した。４８時間後、ＧＦＰ陽性トランスフェクタントをフローサイトメトリー（Sonysorter）により単離し、クローンを限界希釈により分離した。ＣＤＨ１７欠損を、ＣＤＨ１７特異的抗体を使用したウェスタンブロッティングによりＣＤＨ１７含量についてクローンタンパク質抽出物を分析することにより確認した。

【0241】

Ｔｒｏｐ２＋ＣＤＨ１７－クローンの細胞溶解は、Ｔｒｏｐ２＋ＣＤＨ１７＋親細胞株に対する効果と比較して有意に減少し、それにより、結合力ベースの効力増加が確認された。Ｔｒｏｐ２＋ＣＤＨ１７－クローンに対するＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子の活性は、一価のＴｒｏｐ２結合剤（Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３）の活性に対応し、このように、Ｔｒｏｐ２＋／ＣＤＨ１７－標的細胞に対する効果が、Ｔｒｏｐ２媒介性であることが確認された。

【0242】

図９は、Ｔｒｏｐ２結合剤（Ｔｒｏｐ２＃１、＃８、＃９、＃１０、＃１１、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５、＃１６、＃１７、＃１８）と ＣＤＨ１７結合剤（ＣＤＨ１７＃１、＃８）及びＣＤ３結合剤（ＣＤ３＃１、＃２、＃３）のいくつかの例示的な組み合わせを代表する分子の選択を用いて得られた機能データを示し、それについて、結合力ベースの効力増加が示されている。それぞれの結合剤の配列を、表１中に見出すことができる。

【0243】

実施例１０：結合力誘導性の効力増加に対するＣＤＨ１７結合の寄与の確認
結合力誘導性の効力増加に対するＣＤＨ１７結合の寄与を確認するために、５つの異なるＴｒｏｐ２結合剤を、ＣＤＨ１７結合アーム、又はＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３もしくはＴｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合分子中の無関係な標的テトラニトロフェノール（ＴＮＰ）についての結合剤のいずれかとそれぞれ組み合わせた。このアッセイでは、Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７陽性結腸直腸癌細胞株ＳＫ－ＣＯ１を、エフェクター細胞としての未刺激ヒトＴ細胞及び増加濃度のＴｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３又はＴｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合分子と、エフェクターと標的細胞の比率１０：１で７２時間にわたり共培養した。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子を、実施例４中に記載されるように、鎖をコードする遺伝子を保有するｐＴＴ５ベクターを用いたＣＨＯ－Ｅ細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。細胞傷害活性は、実施例９中に記載されるように決定した。Ｔ細胞を、実施例６中に記載されているように、健常なドナーＰＢＭＣから単離した。ＣＤＨ１７結合アームは、Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３ ｖｓ．Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３から、ＥＣ５０における４０～６０倍増加を伴って、有意な効力増加に導いた；図１０中に示されるとおり（それぞれの結合剤の配列を、表１中に見出すことができる）。

【0244】

実施例１１：ノブ・イン・ホールフォーマットの比較
三重特異的分子を２つの異なるノブ・イン・ホールフォーマット（即ち、ホールアーム上のＴｒｏｐ２及びノブアーム上のＣＤＨ１７／ＣＤ３、又はその逆）において産生し、Ｔ細胞媒介性細胞毒性に対するそれらの効果を、実施例９中に記載されるように評価した。両方の型のフォーマットが十分に機能したのに対し、驚くべきことに、ＣＤ３及びＣＤＨ１７結合部分の両方が分子のホール部分に位置付けられる構築物は、使用された結合剤に無関係に一貫してより高い効力を有することが見出された（例示的な結果については図１１を参照のこと；対応する結合剤を表１中に見出すことができる）。

【0245】

実施例１２：インビボでの腫瘍成長阻害の確認
有効性試験を、ヒトＴ細胞を用いて再構成されたヒト異種移植マウスモデルを使用して実施した。詳細には、ヒトＨＰＡＦ－ＩＩ 膵臓癌細胞（５×１０^７個）をＮＯＧマウスの右背側腹部中に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。並行して、ヒトＴ細胞を、上に記載されるように、Pan T Cell Isolation Kit II（Miltenyi Biotec ＃１３０－０９１－１５６）を使用したネガティブ選択によりＰＢＭＣから単離した。

【0246】

その後に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞活性化／増殖キットヒト（Miltenyi Biotec Ｃａｔ＃１３０－０９１－４４１、Ｌｏｔ＃５１７０７２０８４３）を使用して ２０日間にわたり増殖させた。簡単には、抗ビオチンMACSiBead（商標）粒子を、ＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ２８ ビオチンを用いてロードし、粒子あたり２細胞の比率において精製Ｔ細胞に移し、２０単位の組換えＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ＃２０２－ＩＬ－０５０／ＣＦ）の存在において０．５～１×１０^６個細胞/mlの密度で２０日間にわたりインキュベートした。細胞に、３日毎に２０単位の新鮮ＩＬ－２を添加した。動物中への注射前の３日に、Ｔ細胞を、ＣＤ２－、ＣＤ３－、ＣＤ２８ビオチンを４個の細胞あたり１ビーズの比率でロードした抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ（商標）粒子を用いて、追加の３日間にわたり再刺激した。最後に、ビーズを、MACSiMAG Separator（Miltenyi Biotec）を用いて除去し、Ｔ細胞をＰＢＳ中で洗浄した。

【0247】

１４日目に、動物を、腫瘍容積に基づいて処置群中に無作為化し、２×１０^７個のヒトＴ細胞を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。三重特異的分子を用いた処置を１７日目に開始した。Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質、Ｔｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合タンパク質、ＴＮＰ／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合タンパク質、又は溶媒緩衝液（５０mM ＮａＯＡｃ、１００mM ＮａＣｌ、ｐＨ ５．０）を、外側尾静脈中への静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラス注射による週１回の投与計画において投与した。腫瘍成長を外部キャリパー測定によりモニターし、腫瘍容積を、標準的な半楕円体式を使用して算出した。

【0248】

ヒトＴ細胞生着が、試験の最後に、ヒトＣＤ３についての免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、脾臓において確認された。試験の終了時にヒトＴ細胞生着を示した動物だけを統計分析中に含めた。屠殺基準に達した動物は、倫理的な理由のため試験の間での早期に安楽死させた。

【0249】

図１２中に示されるように、三重特異的Ｔｒｏｐ２／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子（配列番号４３６と４３７の組み合わせ又は配列番号２１４と２７１の組み合わせのいずれかにより表される）を用いた週１回の腫瘍担持マウスの処置によって、有意な腫瘍退縮が誘導されたが、しかし、同じ用量及び処置間隔でのコントロールＴｒｏｐ２／ＴＮＰ／ＣＤ３結合分子又はＴＮＰ／ＣＤＨ１７／ＣＤ３結合分子ではされなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図9-8】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図11-4】

【図11-5】

【図11-6】

【図12-1】

【図12-2】

【配列表】

2024523033000001.app

【国際調査報告】