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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-25
(54)【発明の名称】バイオマーカー及びそれらの使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240618BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20240618BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240618BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240618BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240618BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20240618BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240618BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C12Q1/6813 Z
C12N15/09 200
C07K14/705
C07K14/47
C12N9/12
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518952
(86)(22)【出願日】2022-05-20
(85)【翻訳文提出日】2024-01-23
(86)【国際出願番号】 EP2022063820
(87)【国際公開番号】W WO2022253604
(87)【国際公開日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】2150710-8
(32)【優先日】2021-06-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523457372
【氏名又は名称】メタキュラム バイオテック アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ランドストローム， マレーネ
(72)【発明者】
【氏名】ソング， ジイ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA26
2G045CB02
2G045DA36
2G045FA40
2G045FB01
2G045FB03
2G045FB08
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ53
4B063QR32
4B063QR35
4B063QS34
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA50
4H045EA51
(57)【要約】
本発明は、共局在する新規のバイオマーカーの測定を通じて、がんを有する対象を分類、診断、及びモニタリングするための方法を提供する。また、がん、特に侵襲性がんの診断、鑑別診断、並びにがんの進行をモニタリングするためのキット及びアレイも提供される。
【選択図】図４Ｂ
【選択図】図４Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象におけるがんを診断するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、前記バイオマーカーが、前記生物学的試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
前記生物学的試験試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、前記対象におけるがんを示す、方法。
【請求項2】
第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、前記バイオマーカーが、前記生物学的試験試料中のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、前記生物学的試料中の前記生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、前記対象におけるがんを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対象における侵襲性がんを診断及び／又は予後予測するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、前記バイオマーカーが、前記試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
前記生物学的試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、前記対象における侵襲性がんを示す、方法。
【請求項4】
第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、前記バイオマーカーが、前記生物学的試験試料中のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、前記生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、前記対象における侵襲性がんを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）が、ユビキチン化されている、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＡＵＲＫＢが、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及び／又はリジン８７（Ｋ８７）に対応する一方又は両方のリジン残基でユビキチン化されている、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記がんが、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断に関連し、及び／又はそれによって媒介される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記がんが、固形腫瘍である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記固形腫瘍が、前立腺がん、腎がん、肺がん、腎臓がん、胃がん、膀胱がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記試験試料が、腫瘍からの生検などの組織試料である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びに／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の存在又は非存在が、前記バイオマーカータンパク質を検出すること、及び／又は前記バイオマーカータンパク質の生物学的活性を検出することによって決定される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ステップ（ｂ）における前記バイオマーカーの存在及び／又は非存在を決定することが、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫沈降（ＩＰ）、ＥＬＩＳＡ技法（単一又は多重）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む）、インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、酵素法、画像分析、質量分析、アプタマー、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、マルチプレックスアッセイ（ＭＳＤ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）からなる群から選択される方法を使用して、又はオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型の細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）；並びにＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ６）に結合する指標物質によって行われる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記対象が、がん及び／又は侵襲性がんと診断された場合に、前記方法が、－がん療法を前記対象に投与するステップであって、任意選択で、前記がん療法が、手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、及び熱化学療法のうちの１つ以上を含む、投与するステップを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前立腺がんに罹患しているか、又は罹患している疑いのある対象におけるグリソンスコア（ＧＳ）を、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかであるとして決定するための方法であって、前記方法が、ａ）前記対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量を評価するステップと、
ｃ）（ｂ）における前記複合体の量を、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかのＧＳを有することが知られている参照試料からのオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量と比較するステップと、を含み、
前記比較が、前記対象における前記ＧＳを、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかであるとして決定することを可能にする、方法。
【請求項16】
前記複合体が、アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記複合体が、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記複合体が、細胞質分裂構造などの細胞構造に局在する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ＡＵＲＫＢが、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及びリジン８７（Ｋ８７）に対応するリジン残基のうちの一方又は両方でユビキチン化されている、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）が、前記細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
個体におけるがんの存在を決定するためのアレイであって、（ｉ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又はオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又はアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又はＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む、アレイ。
【請求項22】
対象におけるがんの診断及び／又は予後のためのキットであって、前記キットが、（ｉ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又はオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又はアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又はＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
任意選択で、請求項１～２０のいずれか一項に定義される方法を行うための説明書と、を含む、キット。
【請求項23】
ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後におけるバイオマーカーとして使用するための、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）であって、細胞内の細胞質分裂構造に対する３つのバイオマーカー全ての共局在が、前記疾患又は状態を示す、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）。
【請求項24】
請求項２２に記載の使用のための、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）であって、ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後におけるバイオマーカーとして使用するためのＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含み、細胞内の細胞質分裂構造に対する４つのバイオマーカー全ての共局在が、前記疾患又は状態を示す、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）。
【請求項25】
ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後におけるバイオマーカーとしての、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）の、使用。
【請求項26】
前記使用が、ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断におけるバイオマーカーとしてのＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項27】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む、複合体であって、ＡＵＲＫＢが、ユビキチン化されている、複合体。
【請求項28】
ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含む、請求項２７に記載の複合体。
【請求項29】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）が、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及び／又はリジン８７（Ｋ８７）に対応する一方又は両方のリジン残基でユビキチン化されている、請求項２７又は２８に記載の複合体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、共局在する新規のバイオマーカーの測定を通じて、がんを有する対象を分類、診断、及びモニタリングするための方法を提供する。また、がん、特に侵襲性がんの診断、鑑別診断、並びにがんの進行をモニタリングするためのキット及びアレイも提供される。
【背景技術】
【0002】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、いくつかの進行がんにおいて過剰発現され、腫瘍の進行を促進する。がん細胞がどのようにしてＴＧＦβ誘導成長阻害を避け、正常な恒常性を回避するかは不明である。標準的なＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達経路では、細胞応答は、ＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴβＲＩ）のキナーゼ活性に依存し、ＳＥＲＰＩＮＥ１、Ｓｎａｉｌ１、及びメタロプロテイナーゼタンパク質２を含む、ある特定の遺伝子の転写を調節するＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、及びＳｍａｄ４複合体の形成につながる。ＴβＲＩは、ＴＮＦ－α変換酵素（ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７）によってその細胞外ドメインで切断され、Ｓｍａｄタンパク質によって媒介されるＴＧＦβによって媒介される成長阻害効果の喪失をもたらす（Ｌｉｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ２００９；３５（１）：２６－３６）。
【0003】
対照的に、非標準的なＴＧＦβ誘導シグナル伝達経路では、細胞応答は、しばしば、Ｅ３－リガーゼ腫瘍壊死因子受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）によって調節される。このタンパク質は、ＴβＲＩと会合し、受容体へのリガンドの結合時に活性化され、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼＴＧＦβ活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）の活性化を促進する。ＴＲＡＦ６は、ホスファチジルイノシトール－３’－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－ＡＫＴ経路の活性化を、Ｋ１６０のエンドソームタンパク質であるアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）のＫ６３結合ポリユビキチン化によるインスリン刺激に応答し１１、１３～１５、及びＰＩ３Ｋ複合体における調節サブユニットｐ８５αのＫ６３結合ポリユビキチン化によるＴＧＦβ刺激に応答して促進する（Ｈａｍｉｄｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７；１０（４８６））。ＴＲＡＦ６はまた、γ－セクレターゼ複合体中のＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ及びプレセニリン１などのタンパク質分解酵素を活性化して、ＴβＲＩの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を切断し、ＴＲＡＦ６によるＫ１７８のユビキチン化後に、可溶性ＴβＲＩ－ＩＣＤが核内に入ることを可能にして、前侵襲性遺伝子及びＴＧＦＢＲ１の転写を促進する。
【0004】
本発明者らは最近、エンドソームアダプタータンパク質ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２が、ＴβＲＩ－ＩＣＤと会合し、細胞のＴＧＦβ刺激に応答してＴβＲＩ－ＩＣＤの核蓄積を増強し、インビトロで前立腺がん細胞の侵襲性を促進し、ヒト前立腺がんの侵襲性との強い相関を示すことを示した（Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｍｕ Ｙ，Ｌｉ Ｃ，Ｂｅｒｇｈ Ａ，Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ Ｍ，Ｈｅｌｄｉｎ Ｃ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ＴＧＦβ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７：２７９－９２）。
【0005】
ＷＯ２０１２／１２５６２３は、ＴβＲＩの切断阻害剤の使用及びがん療法におけるその使用、並びに診断方法を開示し、ＴβＲＩ－ＩＣＤの核局在が、試料中のがん細胞の存在、及び対象におけるがん侵襲性／転移の可能性を示す。
【0006】
ＴＧＦβシグナル伝達経路は、腫瘍進行において二重かつ極めて重要な役割を有する。正常細胞では、腫瘍発生の早期に、それは、増殖を阻害し、分化及びアポトーシスを誘導することによって、腫瘍抑制因子として作用する。ＴＧＦβは、上皮細胞及び内皮細胞、ケラチノサイト、並びに白血球を含むいくつかの細胞型の増殖を阻害する。ほとんどの正常な細胞型では、ＴＧＦβ刺激は、ＭＹＣの発現を下方制御し、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ及びｐ２１を含む、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の発現を上方制御することによって、Ｇ１における細胞周期の進行を停止させる（Ｓｉｎｔｉｃｈ ＳＭ，Ｌａｍｍ ＭＬ，Ｓｅｎｓｉｂａｒ Ｊ ａ，Ｌｅｅ Ｃ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＴＳＵ－Ｐｒ１：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９９；１４０：３４１１－５）。しかしながら、進行がんにおいては、がん細胞がＴＧＦβの抑制応答を避ける場合、サイトカインは、上皮－間葉移行を誘導し、腫瘍浸潤及び転移を促進し、免疫系を抑制することによって、腫瘍プロモーターになる（Ｂａｔｌｌｅ Ｅ，Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１９；５０： ９２４－９４０）。
【0007】
これらの知見にもかかわらず、有糸分裂におけるＴＧＦβの役割についてはほとんど知られていない。ＴＧＦβは、ある特定の間葉系及びがん細胞の増殖を促進することができるが、成長刺激のメカニズムにおけるその役割は、あまり理解されていない。ＴＧＦβは、増殖の刺激因子として、ヒト腎線維芽細胞における線維芽細胞成長因子２の発現、及び神経膠腫及び骨肉腫細胞における血小板由来成長因子の発現を誘導する。正常な前立腺上皮細胞では、ＴＧＦβは、増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することによって成長抑制因子として作用するが、ＴＧＦβ誘導の成長停止に対する感受性を失った前立腺がん細胞では、ＴＧＦβは、腫瘍細胞成長を促進する可能性がある。例えば、ＴＧＦβは、前立腺がん細胞株ＴＳＵ－Ｐｒ１における細胞増殖を刺激し（Ｓｉｎｔｉｃｈ ＳＭ，Ｌａｍｍ ＭＬ，Ｓｅｎｓｉｂａｒ Ｊ ａ，Ｌｅｅ Ｃ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＴＳＵ－Ｐｒ１：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９９；１４０：３４１１－５）、ＤＵ１４５及びＰＣ－３細胞株において一過性増殖阻害のみを引き起こすが、ＬＮＣａＰ前立腺がん細胞の増殖には影響を及ぼさない（Ｗｉｌｄｉｎｇ Ｇ，Ｚｕｇｍｅｉｅｒ Ｇ，Ｋｎａｂｂｅ Ｃ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ Ｋ，Ｇｅｌｍａｎｎ Ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９８９；６２： ７９－８７）。
【0008】
オーロラキナーゼは、細胞増殖に不可欠なセリン／スレオニンキナーゼである。これらは、分裂細胞がその遺伝物質を娘細胞に分配するのを助けるホスホトランスフェラーゼ酵素である。より具体的には、オーロラキナーゼは、クロマチド分離を制御することによって、細胞分裂において重要な役割を果たす。オーロラキナーゼＡ（ＡＵＲＫＡ）及びオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）などのオーロラキナーゼは、乳腫瘍、肺腫瘍、膵腫瘍、卵巣腫瘍、及び前立腺腫瘍を含む多くの腫瘍で過剰発現される。オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）は、３つの調節構成要素、すなわち、内側セントロメアタンパク質（ＩＮＣＥＮＰ）、サバイビン、及びボレアリンを含有する、染色体パッセンジャー複合体（ＣＰＣ）の構成要素である。ＡＵＲＫＢは、ＩＮＣＥＮＰの保存されたＣ末端ＩＮ－Ｂｏｘ領域に結合し（Ａｄａｍｓ ＲＲ，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ２０００；１０（１７）：１０７５－８）、そこで、ＡＵＲＫＢによってリン酸化される、Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒモチーフが位置しており（Ｂｉｓｈｏｐ ＪＤ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＪＭ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２；２７７（３１）：２７５７７－８０）、ＡＵＲＫＢの活性化及び複合体の安定化に寄与する。ＡＵＲＫＢがその結晶構造の研究において二量体を形成することが見出されたため、ＡＵＲＫＢ：ＩＮＣＥＮＰ複合体はまた、トランスにおけるＡＵＲＫＢの自己リン酸化を有利にすることが示唆されている（Ｅｌｋｉｎｓ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１２；５５（１７）：７８４１－８）。
【0009】
間期では、ＣＰＣは、ヘテロクロマチンに局在し、細胞が有糸分裂に入った後、Ｓｅｒ１０でのヒストンＨ３（Ｈ３Ｓ１０）のＡＵＲＫＢリン酸化は、染色体腕から内側セントロメアへのＣＰＣの除去を容易にする。後期開始時に、ＣＰＣは、染色体から放出され、紡錘体ミッドゾーンに再局在し、そこでＡＵＲＫＢのリン酸化勾配が形成される。細胞質分裂中、ＣＰＣは、分裂溝及び中心体を標的とする。ＡＵＲＫＢは、液胞タンパク質選別関連タンパク質４（ＶＰＳ４）の局在及び機能を制御することによって、脱離のタイミングを調節する（５）。簡潔に述べると、クロマチン修飾タンパク質／荷電多細胞体タンパク質（Ｃｈｍｐ）４ｃは、ボレアリンと相互作用し、Ｃｈｍｐ４ａ及びＣｈｍｐ４ｂパラログに欠如しているＣ末端のモチーフにおけるいくつかの残基でＡＵＲＫＢによってリン酸化される。中心体では、脱離／ノーカットチェックポイントレギュレータ（ＡＮＣＨＲ）がＣｈｍｐ４ｃ及びＶＰＳ４と相互作用して、三元複合体を形成する。ＡＵＲＫＢキナーゼの阻害剤による処置は、Ｃｈｍｐ４ｃからのＶＰＳ４の解離をもたらすため、ＡＵＲＫＢのキナーゼ活性は、この複合体を維持するために必要である（５）。ＶＰＳ４は、輸送ＩＩＩ媒介性収縮及び最終的な切断に必要なエンドソーム選別複合体に関与する。しかしながら、脱離におけるＶＰＳ４の活性の調節は、依然として不明である。いくつかの異なるがんタイプとの関連性のために、オーロラキナーゼの阻害剤は、臨床治験で試験されている（Ｋｅｅｎ Ｎ，Ｔａｙｌｏｒ Ｓ．Ａｕｒｏｒａ－ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００４；４：９２７－３６）。
【0010】
ＵＳ２０１６／０１５３０５２は、単剤療法として、又は併用療法の一部としてのいずれかで、１つ以上のオーロラキナーゼＢ阻害剤を用いたがん療法を選択するための患者の分類、及びそのような療法に対する患者の応答をモニタリングする際に有用な診断アッセイに関するものであり、ＣＮ１１０２６１６１２Ａは、結腸直腸がん診断キットを調製する際のオーロラＢ及びサルビビンの使用に関するものである。
【0011】
前立腺がんは、世界中、特に西洋諸国の男性において最も一般的ながんであり、毎年約３７５，０００人の死亡に関連している（Ｅｓｆａｈａｎｉ Ｍ，Ａｔａｅｉ Ｎ，Ｐａｎｊｅｈｐｏｕｒ Ｍ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．２０１５；１６：２６０１－１１及びＳｕｎｇ Ｈ ｅｔ ａｌ．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０２１；７１（３）：２０９－４９）。形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、胚発生中及びいくつかのタイプの悪性腫瘍における、その細胞の恒常性及び分化の文脈的調節のために、細胞運命の強力な決定因子である。
【0012】
今日、侵襲性がんのスクリーニング及び検出のための、組織、又は血液若しくは尿などの体液中において利用可能なバイオマーカーは存在しない。前立腺がんでは、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）がマーカーとして一般的に使用されているが、前立腺がんに対して信頼性がなく、特異的でもない。前立腺及び腎臓（ＲＣＣ）生検は、病理医によって視覚的に評価され、ＲＣＣにおけるグリソンスコアグレード（前立腺）又はファーマングレードが割り当てられる。両方のスコアは、主観的であり、病理医の経験に依存する。更に、７を超えるグリソンスコアとして分類される前立腺がんと、７未満のグリソンスコアとして分類される前立腺がんとを区別することができる利用可能な組織ベースのマーカーは現在存在しない。７を超えるグリソンスコア（ＧＳ）は、７未満よりも予後が悪いため、これは重要である（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，１６ Ｊｕｌｙ ２０１９）。バイオマーカーは、患者の選択／分類（特定の治療に応答することができる対象のみを含むため）、療法モードの作用及び有効性の検証、患者のモニタリング、並びに用量滴定及び製品の有効性の評価に必要である。これにより、医薬品開発プロセスが加速し、臨床試験に必要な患者数が削減され、コストが削減される。
【0013】
以上を考慮すると、非標準的なＴＧＦβシグナル伝達経路が関与し、そのため、このメカニズムを防止する薬剤を用いる抗がん治療に有益となるであろう患者を分類する、がんを診断するための新規のバイオマーカーに対するニーズが存在する。疾患の初期段階で侵襲性がんを予測するためのバイオマーカーのニーズも存在する。
【発明の概要】
【0014】
ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２の発現をノックダウンすることによって、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＵＲＫＢを、去勢抵抗性前立腺がん細胞（ＣＲＰＣ）におけるＡＰＰＬ１／ＡＰＰＬ２調節経路の標的遺伝子として識別した。本発明者らは、驚くべきことに、ＴＲＡＦ６が、有糸分裂進行中に自己ユビキチン化され、Ｋ８５及びＫ８７上でのＡＵＲＫＢのＫ６３結合ポリユビキチン化を通じて、ＡＵＲＫＢ活性に寄与したことを見出した。更に、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＵＲＫＢが、ＣＲＰＣ細胞における有糸分裂及び細胞質分裂中に、ＡＰＰＬ１及びＴβＲＩの細胞内ドメイン（ＴβＲＩ－ＩＣＤ）と複合体を形成し、神経芽腫細胞において、ＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩの共局在が、共焦点イメージングによっても観察されたことを見出した。本発明者らは、驚くべきことに、ＡＰＰＬ１及びＴβＲＩがＣＲＰＣ細胞の増殖に必要であることを見出した。更に、インサイチュＰＬＡ技術によって可視化されたＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩ－ＩＣＤ複合体の高発現は、臨床前立腺がん物質に存在し、予後不良と相関していた。本発明者らは、驚くべきことに、ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの発現が、ＣＲＰＣ腺がんよりも神経内分泌型のＣＲＰＣにおいて高く、神経内分泌型のＣＲＰＣを有する患者の予後不良と一致することを見出した。
【0015】
本発明は、対象におけるがんの治療を分類、診断、及びモニタリングするためのバイオマーカーを提供する。バイオマーカーは、侵襲性がん形態を識別及び予測するためにも有用である。
【0016】
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、いくつかのがんにおいてしばしば過剰発現され、腫瘍進行を引き起こす。有糸分裂におけるＴβＲＩの機能的意義の詳細な特徴付けは、細胞質分裂中の新たに特定された重要な役割を実証する。
【0017】
本発明の第１の目的は、対象におけるがんを診断するための方法を提供し、本方法は、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試験試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、対象におけるがんを示す。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試験試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、対象におけるがんを示す。
【0018】
したがって、ステップ（ｂ）は、試験試料内の第１、第２、及び第３のバイオマーカーの共局在を決定することを含み得ることが理解されるであろう。２つのタンパク質が共局在するかどうかを決定するために使用することができる技術の例としては、本明細書に記載のものが挙げられ、免疫組織化学、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫沈降、免疫蛍光、共焦点顕微鏡法が挙げられ、これらの多くは、実施例に例示される。
【0019】
誤解を避けるために、バイオマーカーの共局在は、バイオマーカーが互いに複合体にあることを必要とせず、単にバイオマーカーが空間的に互いに近接していることを必要とする。例えば、２つのタンパク質は、それらが互いに空間的に近いと観察される（例えば、ｚスタックを使用した免疫蛍光及びデジタルイメージングによって）場合、共局在し得、バイオマーカー間の直接相互作用は必要ではない。しかしながら、バイオマーカーは、直接相互作用するため、共局在し得、したがって、両方の状況は、「共局在」という用語によって包含される。
【0020】
本発明の全ての方法の一実施形態では、細胞構造に対するバイオマーカーの共局在は、対象におけるがんを示す。したがって、ステップ（ｂ）は、試験試料内の細胞構造における第１、第２、及び第３のバイオマーカーの共局在を決定することを含み得ることが理解されるであろう。
【0021】
「細胞構造」とは、細胞小器官のサブ部分を含む細胞小器官などの任意の定義された細胞の区画又はサブ区画の意味が含まれる。細胞構造としては、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、細胞質、及びミトコンドリアが挙げられる。例えば、小器官は核であり得、核のサブ部分は中心体であり得る。２つのタンパク質が細胞構造に共局在しているかどうかを決定するために使用され得る技法の例は、当該技術分野で既知である。例えば、免疫蛍光又は免疫組織化学を使用して、特定のバイオマーカーのマーカーに加えて、核のマーカーを使用することができ、当業者が、これらの別個のマーカーが全て核内で観察されるかどうか、したがって、バイオマーカーが核に共局在するかどうかを評価することを可能にする。同様に、細胞の集団を分画してもよく、免疫沈降を行って、バイオマーカーが、例えば、核画分内の複合体内にあるかどうかを決定することができる。
【0022】
本発明の全ての方法の一実施形態では、細胞構造は、核である。本発明の全ての方法の更なる実施形態では、細胞構造は、細胞質分裂構造である。
【0023】
一実施形態では、本発明は、対象におけるがんを診断するための方法であって、本方法は、
ａ）対象からの生物学的試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する３つのバイオマーカー全ての存在が、対象におけるがんを示す。
ａ）対象からの生物学的試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する３つのバイオマーカー全ての存在が、対象におけるがんを示す。
【0024】
そのため、ステップ（ｂ）が、試験試料内の細胞質分裂構造における第１、第２、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを含み得ることが理解されるであろう。
【0025】
そのため、細胞質分裂構造に対する３つのバイオマーカーの共局在は、３つのバイオマーカーの各々が１つ以上の細胞質分裂構造において識別可能であるという意味が含まれる。特に好ましい実施形態では、細胞質分裂構造は、中心体であり、したがって、細胞質分裂構造における３つのバイオマーカーの共局在は、中心体に対する３つのバイオマーカーの各々の共局在である。誤解を避けるために、細胞質分裂構造に対するバイオマーカーの共局在とは、バイオマーカーが互いに複合体にあることが必要ではなく、単にバイオマーカーが細胞質分裂構造に共局在していることが必要である。例えば、２つのタンパク質は、免疫蛍光及びｚスタックを使用したデジタルイメージングによって、それらが互いに近接していると観察される場合、共局在し得る。
【0026】
一実施形態では、本方法は、生物学的試験試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象におけるがんを示す。
【0027】
本発明の方法の一実施形態では、細胞構造に対するバイオマーカーの共局在は、対象におけるがんを示す。したがって、ステップ（ｂ）は、試験試料内の細胞構造における第１、第２、及び第３のバイオマーカーの共局在を決定することを含み得ることを理解されたい。
【0028】
一実施形態では、本方法は、生物学的試験試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象におけるがんを示す。
【0029】
したがって、細胞質分裂構造に対する４つのバイオマーカーの共局在は、４つのバイオマーカーの各々が１つ以上の細胞質分裂構造において識別可能であるという意味が含まれる。特に好ましい実施形態では、細胞質分裂構造は、中心体であり、したがって、細胞質分裂構造における４つのバイオマーカーの共局在は、中心体に対する４つのバイオマーカーの各々の共局在である。
【0030】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。「ＴＧＦβ受容体１型」という用語は、本明細書において「ＴＧＦβ受容体Ｉ型」「ＴβＲ１」、「ＴＧＦβＲ１」、「ＴβＲＩ」、及び「ＴＧＦβＲＩ」と同義で使用され得る。
【0031】
バイオマーカーの存在及び／又は細胞内局在を評価するための方法は、当該技術分野において周知であり、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、細胞質分裂構造は、単離されてもよく、評価される細胞質分裂構造中のバイオマーカーの存在、又は細胞質分裂構造は、検出可能部分によって識別され得、その細胞質分裂構造内のバイオマーカーの局在は、バイオマーカーが同じ検出可能部分に局在するかどうかを評価することによって評価され得る。使用することができる技術の例には、本明細書に記載の技術が含まれ、免疫組織化学、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫沈降、免疫蛍光、共焦点顕微鏡法が含まれ、その多くは、実施例に例示される。
【0032】
いくつかの実施形態では、がんを診断することは、がんの悪性度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、がんを診断することは、がんの段階を決定することを含む。いくつかの実施形態では、がんを診断することは、がん再発のリスクを評価することを含む。いくつかの実施形態では、がんを診断することは、がんのグレードを評価することを含む。
【0033】
本発明はまた、
－対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含む、方法を含み、
生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象におけるがんを示す。
－対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含む、方法を含み、
生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象におけるがんを示す。
【0034】
本発明はまた、
－対象からの生体試験試料を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含む、方法を含み、
生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象におけるがんを示す。
－対象からの生体試験試料を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、バイオマーカーが、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含む、方法を含み、
生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象におけるがんを示す。
【0035】
したがって、第２のステップは、試験試料内のバイオマーカーの共局在を決定することを含み得ることが理解されるであろう。
【0036】
ＴβＲ１の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）は、健康な細胞においてＴβＲ１から切断されず、それによって、核内で検出されず、これは、細胞質分裂中に共局在する３つ又は４つのバイオマーカー（ＡＵＲＫＢ、ＡＰＰＬ１、ＴβＲ１（又はＴβＲ１－ＩＣＤ）、及びＴＲＡＦ６）が健康な細胞において検出されないことを意味する。
【0037】
バイオマーカーの存在、並びに／又は細胞質分裂及び／若しくは有糸分裂中にバイオマーカーが共局在するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、各有糸分裂段階でのタンパク質の免疫蛍光を検査するために、細胞は、細胞動態細胞を豊かにするために、二重チミジンブロック及び放出によって（Ｇ１－Ｓ遷移で）同期させることができる。病期分類システムを使用して、ＤＮＡ及び紡錘体形態、並びに染色体アラインメント及び分離の程度に基づいて、有糸分裂及び細胞質分裂の異なる段階を識別することができる。細胞質分裂における哺乳動物細胞の同期は、中期前停止から細胞を放出することによっても達成することができる。前中期相同期は、微小管重合／解重合剤（ノコダゾール及びタキソールなど）、並びにキネシン阻害剤（モナストロール及びＳ－トリチル－Ｌ－システインなど）を使用して達成することができる。
【0038】
対象における侵襲性がんを診断及び／又は予後判定するための方法を提供することが本発明の第２の目的であり、本方法が、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、対象における侵襲性がんを示す。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の３つのバイオマーカー全ての共局在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0039】
対象における侵襲性がんを診断及び／又は予後予測するための方法を提供することが本発明の第３の目的であり、本方法が、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の細胞質分裂構造に共局在する３つのバイオマーカー全ての存在が、対象における侵襲性がんを示す。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の細胞質分裂構造に共局在する３つのバイオマーカー全ての存在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0040】
侵襲性がん形態には、転移の高いリスクの意味が含まれる。侵襲性がんとしては、例えば、対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステム対がん米国合同委員会、及び国際がん対策連合によって決定される、ステージＩＩＩ及び／又はステージＩＶのがんを含むか、又はそれからなるがんが挙げられる。
【0041】
好ましくは、細胞質分裂構造は、細胞の中心体又はミッドゾーンである。
【0042】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。
【0043】
中心体は、中心体に結合する分子、例えば、中心体に局在することが知られているタンパク質に結合する分子、例えば、中心体ポリペプチド又はその抗原性断片に特異的に結合する抗体、例えば、有糸分裂性キネシン様プロテイン－１（ＭＫＬＰ－１）、キネシンファミリーメンバー４（ＫＩＦ４）、及び／又はβ－チューブリンを使用することによって検出することができる。ＭＫＬＰ－１は、紡錘体の赤道に局在し、紡錘体ミッドゾーンで反平行微小管を架橋させることによって、有糸分裂の後期Ｂの間の紡錘体極の分離に関与すると考えられる。本明細書に記載の方法における使用に好適ないくつかの抗体は、当該技術分野において既知であり、かつ／又は市販されている。例えば、抗ＭＫＬＰ１は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から入手可能である。中心体を単離するための方法は当該技術分野で既知である（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００４ Ｊｕｌ２；３０５（５６８０）：６１－６６）。次いで、中心体調製物中に存在するタンパク質は、タンデム液体クロマトグラフィー及びタンデム質量分析によって識別され得る。
【0044】
一実施形態では、本方法は、生物学的試験試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、生物学的試験試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0045】
一実施形態では、本方法は、生物学的試験試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、生物学的試験試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0046】
更に、本発明は、対象における侵襲性がんを診断及び／又は予後予測するための方法を提供し、本方法は、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象における侵襲性がんを示す。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の４つのバイオマーカー全ての共局在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0047】
更に、本発明は、対象における侵襲性がんを診断及び／又は予後予測するための方法を提供し、本方法は、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象における侵襲性がんを示す。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、当該試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
生物学的試料中の細胞質分裂構造に共局在する４つのバイオマーカー全ての存在が、対象における侵襲性がんを示す。
【0048】
好ましくは、ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されている。一実施形態では、本発明の方法は、生物学的試験試料中のユビキチン化されたＡＵＲＫＢの存在を検出することを含む。ユビキチン化されたＡＵＲＫＢの存在を検出するための方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示される。
【0049】
タンパク質ユビキチン化は、ユビキチン（Ｕｂ）活性化酵素（Ｅ１）、Ｕｂ結合酵素（Ｅ２）、及びＵｂリガーゼ（Ｅ３）を含む酵素反応のカスケードによって触媒される翻訳後修飾である。ＵｂのＣ末端グリシン残基のカルボキシル基と、基質中のリジン残基の
との間にイソペプチド結合を形成することによって、Ｕｂは、タンパク質基質上にコンジュゲートされる。更に、ポリユビキチン（ポリＵｂ）鎖は、ＵｂのＣ末端グリシン残基のカルボキシル基を、前述のＵｂにおける７つの内部リジンのうちの１つの
にコンジュゲートさせることによって形成される。
【0050】
言い換えれば、ポリＵｂは、前述のＵｂのＬｙｓ－４８及び／又はＬｙｓ－６３残基の
を介して連結される。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、コンセンサス配列－（疎水性）－Ｋ－（疎水性）－Ｋ－Ｘ－（疎水性）－（極性）－（疎水性）－（極性）－（疎水性）を含み、少なくとも１つのＫがユビキチン化されている。図３Ｉに示されるように、このモチーフは、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、マウス、及びラットのＡＵＲＫＢに保存される。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、＊Ｋ＊ＫＸ＊＆＊＆＊コンセンサス配列を含み、式中、＊＝疎水性、＆＝極性、Ｘ＝任意のアミノ酸、Ｋ＝アクセプターリジンであり、その中のリジン残基のうちの少なくとも１つがユビキチン化されている。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、ＧＫＧＫＦＧＮＶＹＬ（配列番号２３）コンセンサス配列を含み、その中のリジン残基のうちの少なくとも１つがユビキチン化されている。言い換えれば、一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及び／又はリジン８７（Ｋ８７）に対応する一方又は両方のリジン残基でユビキチン化されている。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）に対応するリジン残基でユビキチン化されている。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８７（Ｋ８７）に対応するリジン残基でユビキチン化されている。一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及びリジン８７（Ｋ８７）に対応するリジン残基の両方でユビキチン化されている。
【0051】
「に対応する」とは、ヒトＡＵＲＫＢの配列及び異なるＡＵＲＫＢの配列が比較される場合に、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、若しくはＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して整合されるか、又は参照により組み込まれるＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ４，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：３９（２００４）の図１に示されるように整合されるなど、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のＫ８５及び／又はヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のＫ８７に整合する別のＡＵＲＫＢ（ヒトＡＵＲＫＢのオルソログ又はバリアントなど）におけるリジン残基の意味が含まれる。
【表1】
【0052】
一実施形態では、ＡＵＲＫＢは、Ｌｙｓ４８結合及び／又はＬｙｓ６３結合ポリユビキチン化されている。
【0053】
添付の実施例では、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＵＲＫＢが、ＴＲＡＦ６によるユビキチン化のための認識部位として作用する少なくとも１つのアクセプターリジン残基を含有し、コンセンサス配列中のＫ８５及び／又はＫ８７上でのＡＵＲＫＢのＴＲＡＦ６媒介性ユビキチン化が、その活性に寄与し、細胞分裂中の中心体におけるＴβＲＩの局在を制御することを見出した。タンパク質がユビキチン化されているかどうかを決定するための方法は、当該技術分野で既知であり、実施例に記載されるように、インビボユビキチン化アッセイ、又は２つの抗体（ＡＵＲＫＢ及びＫ６３抗体）を用いたインサイチュＰＬＡアッセイを含む。
【0054】
本明細書に開示される方法は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断に関連し、及び／又はそれによって媒介されるがんタイプに好適である。
【0055】
「形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解的切断に関連し、及び／又はそれによって媒介される」がんとは、ＴβＲＩの細胞内ドメイン（ＩＣＤ）がタンパク質分解的に切断されており、核に入って、侵襲性の高い遺伝子の転写を促進するがんの意味が含まれる。ＴβＲＩ及びＴβＲＩ－ＩＣＤの局在を検出する方法は、本明細書に記載されている。
【0056】
がんは、例えば、固形腫瘍である。腫瘍は、前立腺がん、腎がん、肺がん、腎臓がん、胃がん、膀胱がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択され得る。
【0057】
好ましくは、がんは、前立腺がんである。更なる実施形態では、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である。「去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）」とは、低いテストステロンレベル（５０ｎｇ／ｍＬ未満）によって、がんがもはや停止しない前立腺がんの形態の意味が含まれる。去勢抵抗性前立腺がんは、ＰＳＡレベルの上昇、及び／又は症状の悪化、及び／又はスキャンによって検証される成長しているがんによって定義される。一実施形態では、ＣＲＰＣは、神経内分泌型である。一実施形態では、生物学的試験試料は、ＣＲＰＣ細胞を含む。添付の実施例に示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、有糸分裂及び細胞質分裂中に、ＴβＲＩ－ＡＵＲＫＢ複合体が、ＣＲＰＣ細胞及び神経芽腫ＫＥＬＬＹ細胞における中心体に形成されたことを見出した。
【0058】
好ましくは、生物学的試験試料は、腫瘍からの生検などの組織試料である。
【0059】
「試験される試料」、「生物学的試験試料」、「試験試料」、又は「対照試料」は、対象から採取されたか、又は対象に由来する組織又は流体試料であり得る。
【0060】
好ましくは、試験される試料は、哺乳動物から提供される。哺乳類は、任意の家畜又は農場の動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、又は霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【0061】
本明細書で使用される試料は、分子プロファイリング、例えば、外科的処置又は他の処置中に取り出された生検又は組織などの組織の切片、体液（例えば、液体生検）、剖検試料、及び組織学的目的のために採取された凍結切片に使用され得る任意の関連する生体学的試料、細胞を含む試料を含む。そのような試料には、血液又は血液の画分又は生成物（例えば、血清、バフィーコート、血漿、血小板、赤血球など）、痰、悪性滲出物、頬細胞組織、培養細胞（例えば、一次培養物、外植片、及び形質転換細胞）、便、尿、他の生物学的液体又は体液（例えば、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、脳脊髄液など）などが挙げられる。試料は、新鮮な凍結及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロック、ホルマリン固定パラフィン包埋であるか、又はＲＮＡ保存剤及びホルマリン固定剤内にある生物学的材料を含み得る。各対象に対して、２つ以上のタイプの２つ以上の試料を使用することができる。好ましくは、試料は、細胞又は組織試料（又はその派生物）、例えば、がん細胞を含むか、又はそれらからなるものである。好ましい実施形態では、試料は、固定腫瘍試料を含む。本明細書に記載の方法で使用される試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料であり得る。ＦＦＰＥ試料は、固定組織、染色されていないスライド、骨髄コア又は血餅、コア針生検、悪性液体、及び細針吸引（ＦＮＡ）のうちの１つ以上であり得る。一実施形態では、固定組織は、手術又は生検からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ブロックを含む腫瘍を含む。
【0062】
試料は、当業者によって理解される技術に従って処理され得る。試料は、新鮮な、凍結された、又は固定された細胞又は組織であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、新鮮な組織、又は新鮮な凍結（ＦＦ）組織を含む。試料は、対象からの試料に由来する一次又は不死化細胞株を含む、培養細胞を含み得る。試料はまた、対象からの試料からの抽出物を指し得る。例えば、試料は、組織又は体液から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質を含み得る。そのような目的のために、多くの技術及び市販のキットが利用可能である。対象からの新鮮な試料を、更なる処理、例えば、細胞溶解及び抽出の前に、ＲＮＡを保存するための薬剤で処理することができる。試料は、他の目的のために収集された凍結試料を含み得る。試料は、対象における年齢、性別、及び対象に存在する臨床症状、試料の供給源、並びに試料の収集及び保管の方法などの関連情報に関連付けられ得る。
【0063】
生検は、診断又は予後評価のために組織試料を除去するプロセス、及び組織試料自体を含む。当該技術分野で既知の任意の生検技術を本発明の方法に適用することができる。適用される生検技術は、評価される組織型（例えば、結腸、前立腺、腎臓、膀胱、リンパ節、肝臓、骨髄、血液細胞、肺、乳房など）、とりわけ、腫瘍のサイズ及びタイプ（例えば、固形又は懸濁、血液又は腹水）に依存し得る。代表的な生検技術には、切除生検、切開生検、針生検、外科的生検、及び骨髄生検が含まれるが、これらに限定されない。「切除生検」とは、周囲に正常組織の小さい縁を有する腫瘍塊全体を除去することを指す。「切開生検」は、腫瘍の断面直径を含む組織のくさび状のものの除去を指す。本方法は、腫瘍塊の「コア針生検生検」、又は一般に腫瘍塊内から細胞の懸濁液を得る「細針吸引生検」を使用し得る。生検技術は、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋａｓｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１６ｔｈ ｅｄ．，２００５，第７０章、及びＰａｒｔ Ｖ全体で考察されている。
【0064】
好ましくは、試験試料及び対照試料は、同じ種に由来する。好ましくは、試験試料及び対照試料は、年齢、性別及び／又はライフスタイルについて一致する。
【0065】
一実施形態では、組織試料は、生検などの腫瘍組織である。一実施形態では、細胞試料は、がん細胞の試料である。
【0066】
好ましくは、本方法は、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された３つのバイオマーカー全てが試験試料中で共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された３つのバイオマーカー全てが対照試料中で共局在していない場合に、がんが、診断される。
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された３つのバイオマーカー全てが試験試料中で共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された３つのバイオマーカー全てが対照試料中で共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0067】
好ましくは、本方法は、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された３つのバイオマーカー全てが試験試料中の細胞質分裂構造に共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された３つのバイオマーカー全てが対照試料中の細胞質分裂構造に共局在していない場合に、がんが、診断される。
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された３つのバイオマーカー全てが試験試料中の細胞質分裂構造に共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された３つのバイオマーカー全てが対照試料中の細胞質分裂構造に共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0068】
例えば、がんが１つの前立腺葉に厳密に局在化されている場合、対照と同じ個体からの別の葉の健康な（すなわち、非がん性の）組織を使用することが可能であり得る。
【0069】
一実施形態では、本方法は、（ｄ）対照試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中で共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中で共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0070】
一実施形態では、本方法は、（ｄ）対照試料中の第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定することを更に含み、当該バイオマーカーが、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）であり、ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中の細胞質分裂構造に共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中の細胞質分裂構造に共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0071】
したがって、好ましくは、方法は、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんである、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中で共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中で共局在していない場合に、がんが、診断される。
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんである、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中で共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中で共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0072】
したがって、好ましくは、方法は、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんである、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中の細胞質分裂構造に共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中の細胞質分裂構造に共局在していない場合に、がんが、診断される。
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんである、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在又は非存在を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を更に含み、
ステップ（ｂ）で測定された４つのバイオマーカー全てが試験試料中の細胞質分裂構造に共局在し、かつステップ（ｄ）で測定された４つのバイオマーカー全てが対照試料中の細胞質分裂構造に共局在していない場合に、がんが、診断される。
【0073】
好ましくは、ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されている。
【0074】
「対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであった」とは、対照試料が、がんに罹患した個体に由来するが、対照試料内に含まれるがんは、試験試料中のがんよりも進行していない（すなわち、より低いグレード又はスコア）という意味が含まれる。がんは、当該技術分野で既知の従来の臨床方法を使用して、がんに罹患している個体で診断され得る。
【0075】
「対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する」とは、対照試料が、がん性組織に隣接する健康な非がん性組織に由来し得るという意味が含まれる。
【0076】
添付の実施例に例示されるように、細胞分裂構造におけるオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）、アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の存在は、対象におけるがんを示す。
【0077】
好ましくは、がんに罹患していない個体は、試料を取得した時点で、任意の疾患又は状態に罹患していなかった。好ましくは、がんに罹患していない個体は、健康な個体である。
【0078】
好ましくは、細胞質分裂構造などの細胞構造に好ましくは共局在するバイオマーカー、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びに／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の存在又は非存在は、バイオマーカータンパク質を検出すること、及び／又はバイオマーカータンパク質の生物学的活性を検出することによって決定される。
【0079】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。
【0080】
バイオマーカータンパク質を検出するとは、バイオマーカータンパク質が直接存在するかどうかを、例えば、バイオマーカータンパク質に特異的に結合する結合パートナーを使用することによって検出するという意味が含まれる。バイオマーカータンパク質の生物学的活性を検出するとは、バイオマーカータンパク質の生物学的活性、例えば、酵素活性をアッセイするという意味が含まれる。バイオマーカータンパク質の生物学的活性を検出することは、バイオマーカーの存在又は非存在を間接的に決定するために使用され得ることが理解されるであろう。
【0081】
好ましくは、細胞分裂構造などの細胞構造に共局在する当該バイオマーカーの存在及び／又は非存在は、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫沈降（ＩＰ）、ＥＬＩＳＡ技法（単一又は多重複合体）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）及び免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を使用するサンドイッチアッセイを含む）、インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、酵素法、画像分析、質量分析、アプタマー、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、マルチプレックスアッセイ（ＭＳＤ、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）からなる群から選択される方法を使用して、又はオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型の細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）；並びにＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ６）に結合する指標物質によって決定され得る。
【0082】
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、抗体を組織中の抗原に特異的に結合させる組織の細胞中で抗原（例えば、タンパク質）を局在させるプロセスである。抗原結合抗体は、例えば、視覚化を介してその検出を可能にするタグにコンジュゲート又は融合され得る。いくつかの実施形態では、タグは、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどの発色反応を触媒することができる酵素である。酵素は、例えば、抗体に融合、又は例えば、ビオチン－アバジン系を使用して、非共有結合し得る。代替として、抗体は、フルオレセイン、ローダミン、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒなどの蛍光色素分子でタグ付けすることができる。抗原結合抗体は、直接タグ付けされてもよく、又はそれ自体が、タグを運ぶ検出抗体によって認識されることができる。ＩＨＣを使用して、１つ以上のタンパク質が検出され得る。遺伝子産物の発現は、対照レベルと比較して、その染色強度に関連し得る。いくつかの実施形態では、染色が、対照と比較して、試料中で少なくとも１．２、１．３、１．４、１．７、１．８、１．９、２．２、２．７、３．０、４、５、６、７、８、９、又は１０倍に変化する場合、その遺伝子産物は、差異的に発現されるとみなされる。
【0083】
ＩＨＣは、組織化学技術への抗原－抗体相互作用の適用を含む。例示的な例では、組織切片をスライド上に取り付け、抗原に特異的な抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）でインキュベートする（一次反応）。次いで、ペルオキシダーゼアンチペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）、アビジン－ビオチン－ペルオキシダーゼ（ＡＢＣ）、又はアビジン－ビオチンアルカリホスファターゼの複合体にコンジュゲートされた第２の抗体を使用して、抗原－抗体シグナルを増幅する。基質及び色素原の存在下で、酵素は、抗体－抗原結合部位で有色の堆積物を形成する。
【0084】
免疫蛍光は、標的タンパク質を視覚化するための代替アプローチである。この技法では、一次標的抗体シグナルを、蛍光色素にコンジュゲートされた第２の抗体を使用して増幅させる。紫外線吸収では、蛍光色素は、それ自体の光をより長い波長（蛍光）で放出するため、抗体抗原複合体の局在を可能にする。
【0085】
バイオマーカーの存在及び／又は量を検出するためのタンパク質ベースの技術は、バイオマーカーをコードするタンパク質に対して選択的に免疫反応性である抗体に基づく免疫親和性アッセイも含む。これらの技術には、限定されないが、免疫沈降、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫濾過測定（ＥＬＩＦＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などが挙げられる。例えば、試料中のバイオマーカーの存在及び／又は非存在を検出する任意選択の方法は、試料を、バイオマーカーに対する抗体、又はその抗体の免疫反応性断片、又はバイオマーカーに対する抗体の抗原結合領域を含有する組換えタンパク質と、抗体－バイオマーカー複合体を形成するのに十分な条件下で接触させることと、次いで、当該複合体を検出することと、を含む。そのような抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知である。ＥＬＩＳＡ法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２０００，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１３： ９７８－０８９６０３７２８１（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなアッセイ形式を使用する幅広い免疫アッセイ技術が利用可能であり、例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号、及び同第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらには、非競合型の単一部位及び２部位又は「サンドイッチ」アッセイの両方、並びに従来の競合結合アッセイが含まれる。これらのアッセイはまた、標的バイオマーカーへの標識された抗体の直接結合を含む。好適な結合剤（結合分子とも称される）は、所与のタンパク質に結合するそれらの能力に基づいて、ライブラリから選択することができる。
【0086】
抗体を使用して、溶液試料から特異的タンパク質を免疫沈降させる、又は例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離されたタンパク質を免疫ブロッティングすることができる。
【0087】
好ましくは、ステップ（ｂ）及び／又は（ｄ）は、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーを検出可能部分で標識することによって行われる。
【0088】
好ましくは、ステップ（ｂ）及び／又は（ｄ）は、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーを検出可能部分で標識することによって行われる。
【0089】
「検出可能部分」とは、部分が、可視化される、存在するか否かとして認定される、及び／又は定量化されるなど、検出され得るものであるという意味が含まれる。検出可能である部分により、部分の相対量及び／又は位置が決定され得る。好適な検出可能部分は、当該技術分野において周知である。
【0090】
よって、検出可能部分は、特定の条件に曝露される場合に検出され得る、蛍光及び／又は発光及び／又は化学発光部分であり得る。例えば、蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長及び強度で放射線（すなわち、光）に曝露される必要があり、それによって、それが、検出され得る特定の波長で検出可能な蛍光を放射することを可能にし得る。
【0091】
代替として、検出可能部分は、（好ましくは検出不可能な）基質を可視化及び／又は検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であり得る。好適な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関して下記により詳細に考察される。
【0092】
代替として、検出可能部分は、イメージングに有用である放射性原子であり得る。好適な放射性原子としては、シンチグラフィック研究のための９９ｍＴｃ及び１２３Ｉが挙げられる。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用のスピン標識、例えば、再度１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガン、又は鉄が挙げられる。明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験試料及び／若しくは対照試料中のバイオマーカー、並びに／又は選択されたタンパク質の検出に使用される抗体分子など）は、検出可能部分が容易に検出可能となるために、適切な原子同位体を十分に有していなければならない。
【0093】
放射性又は他の標識は、既知の方式で本発明の薬剤（すなわち、本発明の方法の試料中に存在するタンパク質及び／又は本発明の結合剤）に組み込まれ得る。例えば、結合部分がポリペプチドである場合、それは、生合成されてもよく、又は例えば、水素の代わりにフッ素－１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用して化学アミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、及び１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、結合部位内のシステイン残基を介して付着することができる。イットリウム－９０は、リジン残基を介して付着され得る。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９－５７）は、１２３Ｉを組み込むために使用され得る。参考文献（“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ”，Ｊ－Ｆ Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。他の検出可能部分（酵素、蛍光、発光、化学発光、又は放射性部分など）をタンパク質にコンジュゲートさせるための方法は、当該技術分野で周知である。
【0094】
好ましくは、ステップ（ｂ）及び／又は（ｄ）は、当該バイオマーカーに結合することが可能な１つ以上の第１の結合剤を使用して行われる。第１の結合剤が、バイオマーカーのうちの１つに対して特異性を有する単一の種、又は各々が異なるタンパク質バイオマーカーに対して特異性を有する複数の異なる種を含むか、それらからなり得ることが当業者によって理解されるであろう。
【0095】
好ましくは、ステップ（ｂ）及び／又は（ｄ）は、当該第１の結合剤に結合することが可能な第２の結合剤を含むアッセイを使用して行われ、第２の結合剤は、検出可能部分を含む。
【0096】
結合剤のうちの少なくとも１タイプ、より典型的には全てのタイプは、抗体、その抗原結合断片、若しくはそのバリアントを含むか、又はそれからなり得る。
【0097】
好ましくは、第１の結合剤及び／又は第２の結合剤は、抗体若しくはその抗原結合断片を含むか、又はそれからなる。
【0098】
抗体又はその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は免疫グロブリン分子の結合ドメインであってもよい。
【0099】
好ましくは、検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、酵素部分からなる群から選択される。
【0100】
更に別の実施形態では、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びに／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の存在及び／又は非存在は、バイオマーカーをコードする核酸分子の存在及び／又は発現を測定することによって決定される。
【0101】
好ましくは、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子である。
【0102】
バイオマーカーをコードする核酸分子を検出及び／又は定量化する任意の方法は、原則として、バイオマーカーの存在及び／又は非存在を決定するために使用することができる。バイオマーカーをコードする核酸分子は、（例えば、ＲＮＡ配列決定によって）直接検出及び／又は定量化され得るか、又はバイオマーカー若しくはその相補体をコードする核酸分子の増幅されたコピーの検出を可能にするようにコピー及び／又は増幅され得る。
【0103】
好ましくは、ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び／又は（ｆ）においてバイオマーカーの存在及び／又は非存在を決定することは、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して行われる。
【0104】
逆転写は、当該技術分野で既知である任意の方法によって行うことができる。例えば、逆転写は、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してＲＴ－ＰＣＲのために行われ得る。標的特異的プライミングは、標的配列の検出の感受性を高め、標的特異的ｃＤＮＡを生成するために行われ得る。ＲＴ－ＰＣＲは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ（ＡＢＩ）７９００ ＨＴ機器、又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器、又は増幅の蛍光リアルタイム検出を伴う任意の他のサーモサイクラーを使用して、１ｎｇ以上の全ＲＮＡに相当する標的配列特異的なｃＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含む体積で行われ得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析のためのプライマー及びプローブ濃度を加えて、１サイクルに９５℃で１０分間、９５℃で２０秒間、及び４０サイクルに６０℃で４５秒間などのＰＣＲサイクル条件を使用して蛍光増幅子を増幅する。増幅反応はまた、元々Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離されたＴｔｈポリメラーゼなど、逆転写及びのＤＮＡ重合の両方を行うことが可能な単一の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのいずれかを使用して、ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲとして行われ得る。また、逆転写酵素と熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとの混合物を用いてワンステップｑＰＣＲを行うことも実行可能である。ＰＣＲ生成物は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、又は器具によって検出される任意の他の蛍光染料などの蛍光染料で標識することもできる。
【0105】
増幅を、単一のエンティティとして、又は多重ＰＣＲ若しくはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）など、組み合わせてのいずれかで、ステップ（ｂ）、（ｄ）、及び／若しくは（ｆ）における全てのバイオマーカーの存在及び／若しくは非存在を決定するように設計することができる参照試料をアッセイして、試薬及びプロセスの安定性を確保することができる。参照試料は、標的メッセンジャーＲＮＡを発現する細胞株から得ることができるか、又は合成メッセンジャーＲＮＡとして得ることができる。参照試料をアッセイして、試薬及びプロセスの安定性を確保することができる。陰性対照（例えば、鋳型なし）は、任意の外因性核酸汚染をモニタリングするためにアッセイされるべきである。
【0106】
インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、一般にＡｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：６４９－６６０（１９８７）に記載されている。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイでは、例えば、生検からの細胞は、固体支持体、典型的にはスライドガラスに固定される。ＤＮＡがプローブされる場合、細胞は、熱又はアルカリで変性される。その後、細胞は、適度な温度でハイブリダイゼーション溶液と接触して、標識されている特定のプローブのアニーリングを可能にする。プローブは、好ましくは、例えば、放射性同位体又は蛍光レポーターで標識されるか、又は酵素的に標識される。ＦＩＳＨ（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）は、高度の配列類似性を示す配列のそれらの部分のみに結合する蛍光プローブを使用する。ＣＩＳＨ（発色インサイチュハイブリダイゼーション）は、標準的な明視野顕微鏡下で可視化される従来のペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ反応を使用する。
【0107】
ヌクレオチドプローブの相補鎖を対象となる配列にハイブリダイズすることによって、組織切片又は細胞調製物中の特定の遺伝子配列を検出するために、インサイチュハイブリダイゼーションを使用することができる。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、蛍光プローブを使用して、インサイチュハイブリダイゼーションの感度を増加させる。
【0108】
ＦＩＳＨは、細胞内の特定のポリヌクレオチド配列を検出及び局在化するために使用される細胞遺伝学的技術である。例えば、ＦＩＳＨを使用して、染色体上のＤＮＡ配列を検出することができる。ＦＩＳＨはまた、組織試料内の特定のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを検出及び局在化するために使用することもできる。ＦＩＳＨでは、高度の配列類似性を示す特定のヌクレオチド配列に結合する蛍光プローブを使用する。蛍光顕微鏡を使用して、蛍光プローブが結合しているかどうか、及びどこで結合しているかを調べることができる。特定のヌクレオチド配列、例えば、転座、融合、切断、複製、及び他の染色体異常を検出することに加えて、ＦＩＳＨは、細胞及び組織内の特定の遺伝子コピー数及び／又は遺伝子発現の空間－時間的パターンを定義するのに役立ち得る。
【0109】
一実施形態では、ステップ（ｂ）及び／又は（ｄ）においてバイオマーカーの存在及び／又は非存在を決定することは、１つ以上の結合剤を使用して行われ、各々個別にバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することが可能である。
【0110】
好ましくは、１つ以上の結合部分は、各々、核酸分子を含むか、又はそれからなる。
【0111】
好ましくは、１つ以上の結合部分は、各々、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、又はＰＭＯを含むか、又はそれらからなる。
【0112】
好ましくは、１つ以上の結合部分は、検出可能部分を含む。好ましくは、検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、又は酵素部分からなる群から選択され得る。
【0113】
放射性原子は、テクネチウム－９９ｍ、ヨウ素－１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、リン－３２、硫黄－３５、重水素、トリチウム、レニウム－１８６、レニウム－１８８、及びイットリウム－９０であり得る。
【0114】
好ましくは、結合部分の検出可能部分は、蛍光部分である
【0115】
対象におけるがんを診断するための方法を提供することが本発明の更なる目的であって、本方法が、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
３つのバイオマーカー全てが試験試料中に存在し、３つのバイオマーカー全てが対照試料中に存在していない場合に、がんが診断され、かつ／又はステップ（ｂ）における試験試料中の３つのバイオマーカーの量が、ステップ（ｄ）で測定された対照試料中の３つのバイオマーカーの量に対して増加した場合に、がんが、診断される。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
３つのバイオマーカー全てが試験試料中に存在し、３つのバイオマーカー全てが対照試料中に存在していない場合に、がんが診断され、かつ／又はステップ（ｂ）における試験試料中の３つのバイオマーカーの量が、ステップ（ｄ）で測定された対照試料中の３つのバイオマーカーの量に対して増加した場合に、がんが、診断される。
【0116】
対象におけるがんを診断するための方法を提供することが本発明の更なる目的であって、本方法が、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）、並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
４つのバイオマーカー全てが試験試料中に存在し、４つのバイオマーカー全てが対照試料中に存在していない場合に、がんが診断され、かつ／又はステップ（ｂ）における試験試料中の４つのバイオマーカーの量が、ステップ（ｄ）で測定された対照試料中の４つのバイオマーカーの量に対して増加した場合に、がんが、診断される。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）、並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
（ｃ）
ｉ．がんに罹患していない個体、及び／又は
ｉｉ．がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、対照試料が、試験試料とは異なる段階のがんであるか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ｄ）第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの存在及び／又は量を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
４つのバイオマーカー全てが試験試料中に存在し、４つのバイオマーカー全てが対照試料中に存在していない場合に、がんが診断され、かつ／又はステップ（ｂ）における試験試料中の４つのバイオマーカーの量が、ステップ（ｄ）で測定された対照試料中の４つのバイオマーカーの量に対して増加した場合に、がんが、診断される。
【0117】
好ましくは、がんは、前立腺がんである。更なる実施形態では、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である。一実施形態では、ＣＲＰＣは、神経内分泌型である。
【0118】
本発明の本方法は、発現プロファイリングを含み、これは、本明細書に開示されるバイオマーカーの差次的発現を評価することを含む。差次的発現は、対照（又は参照物）と比較した、生物学的産物、例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ、又はタンパク質の過剰発現及び／又は過少発現を含み得る。当該バイオマーカーの存在及び／又は量を決定することは、本明細書に記載のタンパク質又は核酸ベースの技術のうちのいずれかによって行われ得る。対照試料は、試験試料と同様の細胞を含み得るが、疾患を伴わない（例えば、健康な個体からの試料から得られた発現プロファイル）。対照は、特定の疾患及び特定の薬物標的に関連する薬物標的の有効性を示す、事前に決定されたレベルであり得る。対照は、同じ対象、例えば、異常細胞と同じ臓器の正常な隣接部分に由来し得、対照は、他の個体からの健康な組織（すなわち、非がん性組織）に由来し得るか、又は特定の薬物標的に応答するか、若しくは応答しない疾患を示す、事前に決定された閾値に由来し得る。対照はまた、同じ試料中に見られる対照、例えば、ハウスキーピング遺伝子又はその産物（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）であり得る。例えば、対照核酸は、細胞のがん性状態又は非がん性状態に応じて異ならないことが知られているものであり得る。対照核酸の発現レベルは、試験及び参照集団におけるシグナルレベルを正規化するために使用することができる。例示的な対照遺伝子には、例えば、β－アクチン、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ、及びリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。複数の対照又は対照のタイプを使用することができる。差異発現の源は、変化し得る。例えば、遺伝子コピー数は、細胞において増加されてもよく、それによって、遺伝子の発現の増加がもたらされる。代替として、遺伝子の転写は、例えば、クロマチンリモデリング、差次的メチル化、プロモーター若しくは又はエンハンサー領域の変化、転写因子の差次的発現又は活性などによって修飾され得る。翻訳はまた、例えば、ｍＲＮＡを分解する因子、ｍＲＮＡを翻訳する因子、若しくは翻訳をサイレンスする因子、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡの差次的発現、又は代替的なスプライシングに起因する変化によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、差次的発現は、差次的活性を含む。例えば、タンパク質は、構成的活性化などのタンパク質の活性を増加させる変異を担うことができ、それによって病的状態に寄与する。活性の変化を明らかにする分子プロファイリングを使用して、治療選択を導くことができる。
【0119】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びに／又はＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の発現のレベルは、当該それぞれのバイオマーカー（オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６））をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ、及び／又はそれらの断片を測定することによって決定することができる。
【0120】
本発明の文脈において、当該バイオマーカー：対照試料中のバイオマーカーのレベルと比較した、試験試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の増加したレベルは、対象におけるがんを示す。例えば、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）のレベルが対照試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）のレベルと比較して試験試料中で増加する場合、アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）のレベルが対照試料中のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）のレベルと比較して試験試料中で増加する場合、レベルＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）が対照試料中のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）のレベルと比較して試験試料中で増加する場合、並びにレベルＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）が対照試料中のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）のレベルと比較して試験試料中で増加する場合、試験試料は、対象におけるがんを示す。
【0121】
「対照試料中の量と比較して増加する」とは、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーの量が１つ以上の対照試料のそれ（又は同じものを表す事前に定義された参照値に対して）から増加していることを含む。好ましくは、試験試料中の量は、１つ以上の対照試料中の量（又は対照試料の平均）と比較して、１つ以上の対照試料（例えば、陰性対照試料）の少なくとも５％、例えば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４１％、４２％、４３％、４４％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３５０％、４００％、５００％、又は少なくとも１０００％増加している。
【0122】
試験試料中の量は、対照試料中の量と比較して、統計的に有意な様式で増加され得る。ｚ検定、ｔ検定、スチューデントのｔ検定、ｆ検定、マン－ホイットニーＵ検定、ウィルコクソン符号順位検定、及びピアソンのカイ二乗検定を含む、当業者に知られるｐ値を判定するための任意の好適な手段を使用することができる。
【0123】
好ましくは、がんに罹患していない個体は、試料を取得した時点で、任意の疾患又は状態に罹患していなかった。好ましくは、がんに罹患していない個体は、健康な個体である。
【0124】
代替として、又は追加的に、本発明の方法は、
（ｅ）がんに罹患している個体（すなわち、陽性対照）、及び／又は
（ｆ）がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ段階のものであったか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ステップ（ｂ）で測定される３つのバイオマーカー全ての対照試料中の存在及び／又は量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを決定するステップと、を更に含むか、又はそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定されるバイオマーカーの試験試料中の存在及び／又は量が、ステップ（ｆ）で測定される３つのバイオマーカー全ての陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する場合に、がんが、診断又は検出される。
（ｅ）がんに罹患している個体（すなわち、陽性対照）、及び／又は
（ｆ）がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ段階のものであったか、又は対照試料が、がんに罹患している個体からの健康な組織に由来する、提供するステップと、
ステップ（ｂ）で測定される３つのバイオマーカー全ての対照試料中の存在及び／又は量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを決定するステップと、を更に含むか、又はそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定されるバイオマーカーの試験試料中の存在及び／又は量が、ステップ（ｆ）で測定される３つのバイオマーカー全ての陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する場合に、がんが、診断又は検出される。
【0125】
一実施形態では、代替として、又は追加的に、本発明の方法は、
（ｅ）がんに罹患している個体（すなわち、陽性対照）、及び／又は
（ｆ）がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ段階のものであった、提供するステップと、
ステップ（ｂ）で測定される４つのバイオマーカー全ての対照試料中の存在及び／又は量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを決定するステップと、を更に含むか、又はそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定されるバイオマーカーの、試験試料中の存在及び／又は量が、ステップ（ｆ）で測定される４つのバイオマーカー全ての、陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する場合に、がんが、診断又は検出される。
（ｅ）がんに罹患している個体（すなわち、陽性対照）、及び／又は
（ｆ）がんに罹患している個体からの１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ段階のものであった、提供するステップと、
ステップ（ｂ）で測定される４つのバイオマーカー全ての対照試料中の存在及び／又は量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを決定するステップと、を更に含むか、又はそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定されるバイオマーカーの、試験試料中の存在及び／又は量が、ステップ（ｆ）で測定される４つのバイオマーカー全ての、陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する場合に、がんが、診断又は検出される。
【0126】
代替として、又は追加的に、ステップ（ａ）、（ｃ）、及び／又は（ｅ）で提供される試料は、がんの治療（例えば、切除、化学療法、放射線療法）の前に提供される。
「陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する」とは、存在及び／又は量が、陽性対照試料の存在及び／若しくは量と同一であるか、又は１つ以上の陰性対照試料よりも、１つ以上の陽性対照試料の存在及び／又は量により近い（又は同じものを表す事前定義された参照値に）ことを意味するか、又は含む。好ましくは、存在及び／又は量は、１つ以上の対照試料の存在及び／又は量（又は対照試料の平均）の±４０％以内、例えば、１つ以上の対照試料（例えば、陽性対照試料）の±３９％、±３８％、±３７％、±３６％、±３５％、±３４％、±３３％、±３２％、±３１％、±３０％、±２９％、±２８％、±２７％、±２６％、±２５％、±２４％、±２３％、±２２％、±２１％、±２０％、±１９％、±１８％、±１７％、±１６％、±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．０５％、又は０％以内である。
「陽性対照試料中の存在及び／又は量に相当する」とは、存在及び／又は量が、陽性対照試料の存在及び／若しくは量と同一であるか、又は１つ以上の陰性対照試料よりも、１つ以上の陽性対照試料の存在及び／又は量により近い（又は同じものを表す事前定義された参照値に）ことを意味するか、又は含む。好ましくは、存在及び／又は量は、１つ以上の対照試料の存在及び／又は量（又は対照試料の平均）の±４０％以内、例えば、１つ以上の対照試料（例えば、陽性対照試料）の±３９％、±３８％、±３７％、±３６％、±３５％、±３４％、±３３％、±３２％、±３１％、±３０％、±２９％、±２８％、±２７％、±２６％、±２５％、±２４％、±２３％、±２２％、±２１％、±２０％、±１９％、±１８％、±１７％、±１６％、±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．０５％、又は０％以内である。
【0127】
試験試料中の存在又は量の差は、異なる及び対応するバイオマーカー発現についての標準偏差範囲が重ならない（例えば、隣接するが重ならない）ことを条件として、対照試料中の平均の存在又は量から５以下の標準偏差、例えば、対照試料中の平均の存在又は量からから≦４．５、≦４、≦３．５、≦３、≦２．５、≦２、≦１．５、≦１．４、≦１．３、≦１．２、≦１．１、≦１、≦０．９、≦０．８、≦０．７、≦０．６、≦０．５、≦０．４、≦０．３、≦０．２、≦０．１、又は０の標準偏差であり得る。
【0128】
「対照試料中の存在及び／又は量に相当する」とは、試験試料中の存在又は量が、統計的に有意な様式で対照試料中の量と相関するという意味が含まれる。例えば、試験試料中の存在又は量は、≦０．０５、例えば、≦０．０４、≦０．０３、≦０．０２、≦０．０１、≦０．００５、≦０．００４、≦０．００３、≦０．００２、≦０．００１、≦０．０００５、又は≦０．０００１のｐ値により対照試料の存在又は量と相関し得る。
【0129】
バイオマーカーの差次的発現（上方調節又は下方調節）、又はその欠如は、当業者に知られる任意の好適な手段によって判定することができる。差次的発現は、少なくとも０．０５未満（ｐ＝≦０．０５）、例えば、少なくとも≦０．０４、≦０．０３、≦０．０２、≦０．０１、≦０．００９、≦０．００５、≦０．００１、≦０．０００１、≦０．００００１、又は少なくとも≦０．０００００１のｐ値に対して決定される。代替として、又は追加的に、差次的発現は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して判定され得る。
【0130】
一実施形態では、ステップ（ｂ）で測定される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在及び／又は量は、ステップ（ｄ）及び／又は（ｆ）における測定を表す所定の参照値に対して比較される。
【0131】
がんに罹患している１つ以上の個体は、前立腺がん（去勢抵抗性前立腺がんなど）、腎がん、肺がん、腎臓がん、胃がん、膀胱がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択されるがんに罹患している個体であり得る。好ましくは、がんに罹患している個体は、診断又は検出されるがんと同じタイプのがんを有することが知られている個体である。がんに罹患している１つ以上の個体は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断に関連する及び／又はそれによって媒介されるがんに罹患し得る。
【0132】
一実施形態では、対象ががんと診断された場合、本方法は、
－対象にがん療法を提供するステップを更に含む。
－対象にがん療法を提供するステップを更に含む。
【0133】
好ましくは、がん療法は、手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、及び熱化学療法からなる群から選択される。したがって、がんの存在が示される一実施形態では、本方法は、現在の推奨に従って（例えば、がん細胞の外科的除去、放射線療法、及び／又は化学療法）がんに対して対象を治療することを含む。
【0134】
一実施形態では、がん療法は、手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、及び熱化学療法（例えば、ＡＣ化学療法；カペシタビン及びドセタキセル化学療法（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））；ＣＭＦ化学療法；シクロホスファミド；ＥＣ化学療法；ＥＣＦ化学療法；Ｅ－ＣＭＦ化学療法（Ｅｐｉ－ＣＭＦ）；エリブリン（Ｈａｌａｖｅｎ（登録商標））；ＦＥＣ化学療法；ＦＥＣ－Ｔ化学療法；フルオロウラシル（５ＦＵ）；ＧｅｍＣａｒｂｏ化学療法；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））；ゲムシタビン及びシスプラチン化学療法（ＧｅｍＣｉｓ又はＧｅｍＣｉｓｐｌａｔ）；ＧｅｍＴａｘｏｌ化学療法；イダルビシン（Ｚａｖｅｄｏｓ（登録商標））；リポソマルドキソルブリン（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ Ｋｙｏｗａ（登録商標））；ミトキサントロン；ＭＭ化学療法；ＭＭＭ化学療法；パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））；ＴＡＣ化学療法；タキソテール及びシクロホスファミド（ＴＣ）化学療法；ビブラスチン（Ｖｅｌｂｅ（登録商標））；Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））；Ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））；及びＶｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））からなる群から選択される。
【0135】
一実施形態では、抗がん剤は、抗体若しくはその抗原結合断片、又はＴβＲＩの切断を防止する小分子など、好ましくは細胞内ドメインが核に転座することができないように、ＴβＲＩの切断を防止する薬剤である。
【0136】
代替として、又は追加的に、本方法は、繰り返される。
【0137】
代替として、又は追加的に、本方法は、繰り返され、ステップ（ａ）では、試験される試料は、前の方法の反復における試料とは異なる時間に対象から得られたものである。
【0138】
本方法は、使用された前の試験試料とは異なる期間に採取された試験試料を使用して繰り返されることが理解されるであろう。
【0139】
代替として、又は追加的に、本方法は、使用された前の試験試料に対して１日～１０４週、例えば、１週～１００週、１週～９０週、１週～８０週、１週～７０週、１週～６０週、１週～５０週、１週～４０週、１週～３０週、１週～２０週、１週～１０週、１週～９週、１週～８週、１週～７週、１週～６週、１週～５週、１週～４週、１週～３週、又は１週～２週に採取された試験試料を使用して繰り返される。
【0140】
代替として、又は追加的に、本方法は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１５週、２０週、２５週、３０週、３５週、４０週、４５週、５０週、５５週、６０週、６５週、７０週、７５週、８０週、８５週、９０週、９５週、１００週、１０４週、１０５週、１１０週、１１５週、１２０週、１２５週、及び１３０週からなる群からの期間ごとに採取された試験試料を使用して繰り返され得る。
【0141】
代替として、又は追加的に、本方法は、少なくとも１回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３、２４回、又は２５回繰り返される。
【0142】
更なる目的において、本発明は、前立腺がんに罹患しているか、又は罹患している疑いのある対象におけるグリソンスコア（ＧＳ）を、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかであるとして決定するための方法を提供し、本方法は、
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量を評価するステップと、
ｃ）（ｂ）における複合体の量を、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかのＧＳを有することが知られている参照試料からのオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量と比較するステップと、を含み、
その比較が、対象におけるＧＳを、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかであるとして決定することを可能にする。
ａ）対象からの生物学的試験試料を提供するステップと、
ｂ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量を評価するステップと、
ｃ）（ｂ）における複合体の量を、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかのＧＳを有することが知られている参照試料からのオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体の量と比較するステップと、を含み、
その比較が、対象におけるＧＳを、（ｉ）ＧＳ≦６若しくは７（３＋４）、又は（ｉｉ）ＧＳ７（４＋３）若しくは≧８のいずれかであるとして決定することを可能にする。
【0143】
「オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む複合体」とは、２つ以上のタンパク質が、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む、同じ位置で多タンパク質構造を形成するために互いに相互作用する２つ以上のタンパク質の集合の意味が含まれる。好ましくは、複合体中のタンパク質は、非共有結合相互作用によって互いに相互作用する。
タンパク質複合体を検出する方法は、当該技術分野で周知であり、免疫沈降及びインサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、免疫蛍光及び共焦点顕微鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、当該技術分野において既知の方法及び付随する実施例に記載されるものを使用して、そのようなタンパク質複合体を定量化することができる。
タンパク質複合体を検出する方法は、当該技術分野で周知であり、免疫沈降及びインサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、免疫蛍光及び共焦点顕微鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、当該技術分野において既知の方法及び付随する実施例に記載されるものを使用して、そのようなタンパク質複合体を定量化することができる。
【0144】
本明細書に記載の方法のいずれかの一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。
【0145】
現在、前立腺がんのための最も一般的な採点システムは、腫瘍の顕微鏡的外観に基づいて腫瘍が広がる可能性を示すために使用されるグリソン採点システムである（Ｇｌｅａｓｏｎ ａｎｄ Ｍｅｌｌｉｎｇｅｒ，１９７４，Ｉｃｚｋｏｗｓｋｉ ＫＡ．Ｇｌｅａｓｏｎ ｇｒａｄｉｎｇ．ＰａｔｈｏｌｏｇｙＯｕｔｌｉｎｅｓ．ｃｏｍ ｗｅｂｓｉｔｅ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｈｏｌｏｇｙｏｕｔｌｉｎｅｓ．ｃｏｍ／ｔｏｐｉｃ／ｐｒｏｓｔａｔｅｇｒａｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）。組織は、α－メチルアシル－ＣｏＡラセマーゼ（α－ｍｅｔｈｙｌａｃｙｌ－ＣｏＡ ｒａｃｅｍａｓｅ、ＡＭＡＣＲ）、ｐ６３、及びサイトケラチン（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、ＣＫ）５に対する抗体で染色し、光学顕微鏡を使用して調査することができる。このシステムは、１～５の尺度を使用し、５は、より侵襲性の腫瘍パターンを表す。２つのグレードが与えられ、それぞれ、１つは最も一般的なエリアに、もう１つは２番目に一般的なエリアに与えられる。次いで、病理医は、２つのグレードを加算して、「グリソンスコア」（ＧＳ）を取得する。ＧＳは、２～１０の範囲であり、前立腺がんによる死亡の予測因子として非常に強い予後値を有する。高ＧＳ（８～１０）の患者は、より悪い生存転帰を有する。
【0146】
グリソンパターン３とグリソンパターン４の割合が異なるため、２０１４年に、７のＧＳを、以下の２つの異なるグループに分ける新しい採点システムが提案された：ＧＳ３＋４＝７（予後グレードグループＩＩ）及びＧＳ４＋３＝７（予後グレードグループＩＩＩ）、（Ｐｉｅｒｏｒａｚｉｏ ＰＭ，ｅｔ ａｌ．ＢＪＵ Ｉｎｔ．（２０１３）１１１：７５３－６０）。ＧＳ３＋４＝７とＧＳ４＋３＝７とを区別することができることは、ＧＳ３＋４＝７（グレードグループＩＩ）と４＋３＝７（グレードグループＩＩＩ）には異なる放射線療法アプローチがあるため、重要である（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．，１６ Ｊｕｌｙ ２０１９）。
【0147】
一実施形態では、本方法は、≦６又は７（３＋４）のグリソンスコアを有する対象からの試験試料と、７（４＋３）又は≧８のグリソンスコアを有する対象からの試験試料と区別することが可能である。添付の実施例に示されるように、本発明者らは、驚くべきことに、より低いグリソンスコア（７＝（３＋４）又は≦６）を有する前立腺がん患者の臨床材料と比較して、高いグリソンスコア（７＝（４＋３）又は≧８）を有する前立腺がん患者の臨床材料に多数のＡＵＲＫＢ－ＴβＲＩ－ＩＣＤ複合体が見られたことを見出した（図５Ｂ）。
【0148】
一実施形態では、複合体は、アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）を更に含む。
【0149】
一実施形態では、複合体は、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含む。
【0150】
一実施形態では、複合体は、細胞分裂構造などの細胞構造に局在する。
【0151】
好ましくは、ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されている。
【0152】
一実施形態では、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）は、ヒトＡＵＲＫＢ（配列番号１）のリジン８５（Ｋ８５）及び／又はリジン８７（Ｋ８７）に対応する一方又は両方のリジン残基でユビキチン化されている。
【0153】
一実施形態では、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）である。
【0154】
更なる態様では、本発明は、対象におけるがんの存在を決定するためのアレイであって、
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む、アレイを提供する。
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む、アレイを提供する。
【0155】
一実施形態では、アレイは、（ｉｖ）本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分を更に含む。
【0156】
更なる態様では、本発明は、対象におけるがんの存在を決定するためのアレイであって、
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む、アレイを提供する。
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む、アレイを提供する。
【0157】
がんは、侵襲性がんであり得る。
【0158】
好ましくは、結合剤は、ＴＧＦβ受容体１型細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）に結合することが可能である。
【0159】
一実施形態では、（ｉ）における結合剤は、本明細書に記載のユビキチン化されたオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能である。一実施形態では、（ｉ）における結合剤は、ユビキチン化されたオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）とユビキチン化されていないＡＵＲＫＢとを区別することが可能である。
【0160】
（上で考察された）好適な結合分子が識別及び単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を使用してアレイを製造することができる。アレイは、典型的には、固体支持体の表面上に形成された、各々無限の面積を有する、間隔があいた（すなわち、別々の）領域（「スポット」）を有する線形又は二次元構造で形成される。アレイはまた、各ビーズを分子コード若しくはカラーコードによって識別又は連続流において識別することができるビーズ構造とすることができる。分析はまた連続して行うことができ、試料は各々溶液から分子のクラスを吸着する一連のスポット上を通過させる。固体支持体は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、とりわけ、プラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマーピン、若しくは複数のマイクロタイターウェル、又はタンパク質、ポリヌクレオチド、及びタンパク質、ポリヌクレオチド、及び他の好適な分子を固定化するため、並びに／若しくは免疫アッセイを行うために好適である任意の他の表面の形態であり得る。結合プロセスは、当該技術分野において周知であり、一般に、タンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に共有結合又は物理吸着する架橋からなる。接触若しくは非接触プリント、マスキング、又はフォトリソグラフィーなどの、周知の技法を使用することによって、各スポットの位置を定義することができる。レビューについては、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１３－２９）及びＬａｌ ｅｔ ａｌ（２００２，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １５；７（１８ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３－９）を参照されたい。
【0161】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」とは、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の離散領域の密度を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ内の領域は、典型的な寸法、例えば、約１０～２５０μｍの範囲の直径を有し、アレイ内の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。アレイはまた、マクロアレイ又はナノアレイであり得る。
【0162】
（上で考察された）好適な結合分子が識別及び単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を使用してアレイを製造することができる。
【0163】
一実施形態では、アレイは、タンパク質レベルで、当該バイオマーカーである、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に（個別に又は集合的に）結合することが可能な、１つ以上の抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、アレイは、タンパク質レベルで、全てのバイオマーカーであるオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に（集合的に）結合することが可能なｓｃＦｖ分子を含み得る。
【0164】
アレイが本明細書に記載の対照試料などの１つ以上の陽性及び／又は陰性対照試料を含み得ることが理解されるであろう。
【0165】
対象における診断及び／又は予後のためのキットを提供することが更なる目的であって、当該キットが、
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＩＣＤ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む。
（ｉ）本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＩＣＤ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）又はその細胞内ドメイン（ＩＣＤ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む。
【0166】
一実施形態では、キットは、（ｉｖ）本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分を更に含む。
【0167】
対象における診断及び／又は予後のためのキットを提供することが更なる目的であって、当該キットが、
（ｉ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む。
（ｉ）オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉ）アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）に結合することが可能な結合剤、並びに／又は本明細書に記載のアダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）をコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｉｉ）ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、
（ｉｖ）ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能な結合剤、及び／又は本明細書に記載のＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）に結合することが可能なコードする核酸分子に選択的に結合することが可能な結合部分と、を含む。
【0168】
任意選択で、キットは、使用説明書を更に含む。
【0169】
キットは、例えば、がんの診断及び／又は予後に好適である。がんは、固形腫瘍であり得る。腫瘍は、例えば、前立腺がん、腎がん、肺がん、胃がん、膀胱がん、乳がん、子宮内膜がん、卵巣がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択され得る。がんは、侵襲性がんであり得る。
【0170】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。
【0171】
一実施形態では、（ｉ）において可能な結合剤は、本明細書に記載のユビキチン化されたオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）に結合することが可能である。一実施形態では、（ｉ）における結合剤は、ユビキチン化されたオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）とユビキチン化されていないＡＵＲＫＢとを区別することが可能である。
【0172】
アレイと同様に、キットが、例えば、本明細書に記載の１つ以上の陽性及び／又は陰性対照試料を含み得ることが理解されるであろう。
【0173】
ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後におけるバイオマーカーとして使用するための、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を提供することが更なる目的であり、細胞内の細胞質分裂構造に対する３つのマーカー全ての共局在が、当該疾患又は状態を示す。
【0174】
一実施形態では、バイオマーカーとして使用するためのオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後におけるバイオマーカーとして使用するためのＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含み、細胞内の細胞質分裂構造に対する４つのバイオマーカー全ての共局在が、当該疾患又は状態を示す。
【0175】
ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断におけるバイオマーカーとして使用するための、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を提供することが更なる目的であり、細胞内の細胞質分裂構造に対する４つのマーカー全ての共局在が、当該疾患又は状態を示す。
【0176】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態は、がんである。一実施形態では、がんは、本明細書に記載のがんのうちのいずれかである。好ましくは、ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されている。一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。
【0177】
ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後のためのバイオマーカーとしての、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；及びＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）の使用を提供することが更なる目的である。
【0178】
一実施形態では、使用は、ＴＧＦβ受容体１型のタンパク質分解切断を伴う疾患又は状態の診断及び／又は予後のためのバイオマーカーとしてのＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の使用を更に含む。
【0179】
対象におけるがんの存在を決定するためのバイオマーカーとしての、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）の使用を提供することが更なる目的である。
【0180】
一実施形態では、その使用は、本明細書に記載されるように、試験される対象からの生物学的試験試料、及び任意選択で対照試料を提供することを含む。
【0181】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）を含む、複合体であって、ＡＵＲＫＢがユビキチン化されている、複合体を提供することが更なる目的である。
【0182】
一実施形態では、複合体は、ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を更に含む。
【0183】
オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）を含む、複合体であって、ＡＵＲＫＢがユビキチン化されている、複合体を提供することが更なる目的である。
【0184】
一実施形態では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）は、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）である。好ましくは、ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されている。
【0185】
一実施形態では、対象ががん及び／又は侵襲性がんと診断される場合、本方法は、
－対象にがん療法を投与するステップを更に含む。
－対象にがん療法を投与するステップを更に含む。
【0186】
対象におけるがんを治療するための方法であって、対象が、本明細書に記載の方法に従ってがんを有すると診断されており、本方法が、対象にがん療法を投与することを含む、方法を提供することが更なる目的である。好適ながん療法は、当該技術分野で既知であり、本明細書で考察される。一実施形態では、抗がん剤は、抗体若しくはその抗原結合断片、又はＴβＲＩの切断を防止する低分子である。
【0187】
好ましくは、本方法は、以下のステップを含む：
（ａ）本発明の方法を使用して対象を、がんを有すると診断するステップ、及び
（ｂ）そのように診断された対象を、がん療法により治療するステップ。
（ａ）本発明の方法を使用して対象を、がんを有すると診断するステップ、及び
（ｂ）そのように診断された対象を、がん療法により治療するステップ。
【0188】
一実施形態では、抗がん剤は、同時又は順次のいずれかで、別のがん療法と組み合わせて投与される。
【0189】
一実施形態では、対象は、有効量のがん療法及び／又は抗がん剤を投与され得る。「有効量」とは、限定されないが、生存率の改善、より迅速な回復、又は症状の改善若しくは排除、及び／又は当業者によって選択される他の指標を含む、対象における改善を達成するのに有効である薬学的化合物又は組成物の量の意味が含まれる。
【0190】
更に、がんを有する対象の治療をモニタリングするための方法が提供される。本方法は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断によって媒介されるがんに好適である。本方法は、
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの発現レベルを表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの発現レベルを表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第２の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの発現レベルを表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの発現レベルを表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第２の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
【0191】
更に、がんを有する対象の治療をモニタリングするための方法が提供される。この方法は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断によって媒介されるがんに好適である。本方法は、
－試験される対象からの第１の生体試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの発現レベルを表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの発現レベルを表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
－試験される対象からの第１の生体試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの発現レベルを表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの発現レベルを表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
【0192】
参照値と比較した当該バイオマーカーの発現レベルの低下は、がん細胞の数の低減を示す。
【0193】
更に、がんを有する対象の治療をモニタリングするための方法が提供される。本方法は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断によって媒介されるがんに好適である。本方法は、
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの共局在を表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの共局在を表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第２の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの共局在を表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、及び第３のバイオマーカーの共局在を表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、当該バイオマーカーが、治療の第２の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；並びにＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
【0194】
更に、がんを有する対象の治療をモニタリングするための方法が提供される。この方法は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断によって媒介されるがんに好適である。本方法は、
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの共局在を表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの共局在を表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
－試験される対象からの第１の生物学的試料ｓ１を提供するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの共局在を表す第１の値ｖ１を決定するステップであって、バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ１における第１の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、
－治療を開始又は継続するステップと、
－治療の所定の時間ｔ２の後に、当該対象から第２の生物学的試料ｓ２を取得するステップと、
－第１のバイオマーカー、第２のバイオマーカー、第３のバイオマーカー、及び第４のバイオマーカーの共局在を表す第２の値ｖ２を決定するステップであって、バイオマーカーが、治療の第１の時点ｔ２における第２の生物学的試料中のオーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）である、決定するステップと、を含み、
－ｖ１のレベルがｖ２を超える場合、対照は、治療に応答しており、ｖ１がｖ２未満である場合、対象は、治療に応答していない。
【0195】
参照値と比較した当該バイオマーカーの共局在レベルの低下は、がん細胞の数の低減を示す。
【0196】
参照値は、例えば、治療の開始前、治療の変更、又はモニタリングの対照となり得る任意の変更後、すなわち開始値ｔ０であり得る。
【0197】
第２、第３、第４、第５などの値は、開始点ｔ０又は治療の変更後の所定の時点、治療中、又はモニタリングされるべき他の興味深いイベント中の所定の時点に設定されてもよい。
【0198】
上記の方法及びキットは、がん疾患の観点においてのみ使用されることに限定されず、方法及びキットは、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）のタンパク質分解切断に関連する、及び／又はそれによって媒介される任意の他の疾患若しくは状態に有用であり得る。
【0199】
ここで、以下の図面及び実施例を参照して、本発明が説明される。
【図面の簡単な説明】
【0200】
【図1】ＡＰＰＬ１及び２は、ＡＵＲＫＢ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣＡ８、及びＫＩＦ２Ｃの発現を促進する。（Ａ）ヒト前立腺がんＰＣ－３Ｕ細胞を、対照又は、Ｎｏ．１ ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＮＡを細胞から抽出し、マイクロアレイ解析を行った。（Ｂ（ｉ）及び（ｉｉ））Ｎｏ．１ ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２ ｓｉＲＮＡで処理したか、又は処理していない細胞のパネルａに示される遺伝子のｑＲＴ－ＰＣＲ分析。ｓｉＲＮＡによる阻害は、ｓｉＲＮＡ耐性構築物を発現することによって克服された。Ｎ＝４、平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。（Ｂ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ））ｑＲＴ－ＰＣＲを行って、第２のｓｉＲＮＡの対（Ｎｏ．２、Ｎ＝３）を使用して、図１ｂのマイクロアレイ結果を検証した。データは、平均値±ＳＤとして提示される［スチューデントｔ検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。（Ｃ（ｉ））Ｎｏ．１ ＡＰＰＬ１／２ ｓｉＲＮＡ及びＴＧＦβで処置した、又は処理していないＰＣ－３Ｕ細胞における免疫ブロッティングによって、サバイビン及びＡＵＲＫＢの発現を評価した。（Ｃ（ｉｉ））ＰＣ－３Ｕ細胞を二重チミジンブロックと同期させ、Ｎｏ．１ ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２ ｓｉＲＮＡで処理した。細胞を放出し、細胞溶解物を異なる時間に調製し、免疫ブロッティングに供した。（Ｄ）ＰＣ－３Ｕ細胞を、Ｎｏ．１ ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした、又はトランスフェクトせず、ノコダゾールで１２時間インキュベートし、免疫ブロッティングによって分析した。（Ｅ）終期及び細胞質分裂中のＡＵＲＫＢ（緑色）及びＡＰＰＬ１（赤色）の共局在を示す免疫蛍光及び共焦点イメージング。（Ｆ～Ｋ）パネルｅの２つのＺスタック画像の直交の図（ＸＹ、ＸＺ、及びＹＺ）。（Ｆ、Ｉ）ＸＹの図（ｚ－投影）。（Ｇ、Ｊ）ＸＺの図。（Ｈ、Ｋ）ＹＺの図。スケールバー、２０μｍ。（Ｌ）ＰＣ－３Ｕ細胞をＴＧＦβで異なる期間処理した後、細胞溶解物を、抗サバイビン抗体を使用する免疫沈降、及びＡＰＰＬ１及びＴβＲＩに対する抗体を使用する免疫ブロッティングに供した。ＩＢ、免疫ブロッティング；ＴＣＬ、全細胞溶解物。（Ｍ）ＰＣ－３Ｕ細胞を全長ＧＦＰ－ＡＰＰＬ１、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）－ＡＰＰＬ１－ΔＮ、又はＧＦＰ－ＡＰＰＬ１－ΔＣでトランスフェクトし、次いでＡＵＲＫＢ（赤）で染色した。緑のチャネルを選択して、ＧＦＰ及びＹＦＰの両方を示した。スケールバー、２０μｍ。ＡＰＰＬ１タンパク質及び変異体の概略図が含まれる。（Ｎ）ＡＰＰＬ１タンパク質及び変異体の概略図。（Ｏ）示されるようにＨＡ－ＡＵＲＫＢ及び異なるＡＰＰＬ１ドメインで一時的にトランスフェクトしたＰＣ－３Ｕ細胞を同期させ、次いでＨＡに対する抗体を用いる免疫沈降、及びＧＦＰ抗体を使用する免疫ブロッティングに供した。非トランスフェクト（ＮＴ）。
【図2】ＴβＲＩは、有糸分裂中にＡＵＲＫＢと共局在する。（Ａ、Ｂ、及びＤ）ヒト前立腺がん（ＰＣ－３Ｕ）（Ａ）細胞及びヒト神経芽腫（ＫＥＬＬＹ）（Ｂ）細胞における有糸分裂中のＡＵＲＫＢ（緑色）及びＴβＲＩ（Ｖ２２、赤色）、並びにＰＣ－３Ｕ有糸分裂（Ｄ）全体にわたるＴβＲＩ（Ｖ２２、緑色）及びβ－チューブリン（赤色）の共局在を示す免疫蛍光実験。スケールバー、２０μｍ。（Ｃ）有糸分裂全体にわたるＰＣ－３Ｕ細胞におけるサバイビン（緑色）及びＴβＲＩ（Ｖ２２、赤色）の局在（Ｅ）３０分間の氷上におけるＰＣ－３Ｕ細胞の処置後のＴβＲＩ及びＡＵＲＫＢの共局在の減少。スケールバー、２０μｍ。（Ｆ）ｓｉＲＮＡによるＴβＲＩのノックダウンを伴うか、若しくは伴わない、又はＴβＲＩキナーゼ阻害剤ＳＢ５０５１２４での処置を伴う緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－ＶＰＳ４Ａ（緑）及びβ－チューブリン（赤）の局在を示す代表的な共焦点画像。スケールバー、５μｍ。（Ｇ）ＴＧＦＢＲ１のノックダウン後、多核細胞をカウントした。平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ、Ｎ＝３［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５］。スケールバー、２０μｍ。（Ｈ）ＴＧＦＢＲ１発現との相関によってランク付けされた遺伝子の遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）は、３４個の著しく濃縮された遺伝子セットをもたらした（調節されたｐ値は０．０５以下であり、ｐ値は、ベンジャミニ－ホッホベルグ手順を使用して調節される）。リッジプロットは、コア濃縮遺伝子、すなわち、遺伝子セットの濃縮に最も貢献する遺伝子の相関係数の分布を示す。遺伝子セットは、正規化された濃縮スコアによって順序付けられる。色は、調整されたｐ値を示す。（Ｉ）特徴的な有糸分裂紡錘体（左）及びＧ２／Ｍチェックポイント（右）遺伝子セットのＧＳＥＡプロットは、ＴＧＦＢＲ１相関遺伝子とのそれらの強い関連性を示す。上のパネルは、全ての遺伝子のランク付けされたリスト内の遺伝子セット遺伝子の相関係数及び位置を示し、下のパネルは、実行中の濃縮スコアを示す。（Ｊ）ＰＣ－３Ｕ細胞を、ＳＢ５０５１２４及びＴＧＦβで、又はそれらなしで３０分間処理し、その後、細胞溶解物を免疫ブロッティングによって分析した。（Ｋ）ＡＵＲＫＢがＴβＲＩをリン酸化することができることを示すインビトロキナーゼアッセイ。（Ｌ）ＰＣ－３Ｕ細胞を、ｐ－Ｓｍａｄ２（赤色）及びＡＵＲＫＢ（緑色）に対する抗体で染色した。赤と緑のスケールバー、５μｍ；白のスケールバー、２０μｍ。
【図3】ＴＲＡＦ６は、ＡＵＲＫＢのＫ６３結合ポリユビキチン化を媒介し、ＡＵＲＫＢとＴβＲＩとの間の共局在は、ＴＲＡＦ６及び変異体ＡＵＲＫＢの特徴に依存する。（Ａ～Ｂ）ＰＣ－３Ｕ細胞を、ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡで処理したか、又は処理せず、二重チミジンブロックと同期させ、異なる期間（Ａ）の後の、ノコダゾールとの１２時間のインキュベーション（Ｂ）を伴うか、又は伴わない、免疫ブロッティング（ＩＢ）によって分析に供した。（Ｃ）同期ＰＣ－３Ｕ細胞の溶解物をＡＵＲＫＢ抗体で免疫沈降させ（ＩＰ）、続いてＴβＲＩ、ＡＰＰＬ１、及びＴＲＡＦ６に対する抗体で免疫ブロッティングを行った。（Ｄ（ｉ）及びＤ（ｉｉ））Ｆｌａｇ－ＡＵＲＫＢ及びＨＡタグ付き野生型（ＷＴ）又は変異ユビキチンでトランスフェクトされた同期ＰＣ－３Ｕ細胞の溶解物を、Ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降に供し、続いてＨＡ抗体を使用して免疫ブロッティングを行った。矢印は、重免疫グロブリン鎖を指す。（Ｅ）ＰＣ－３Ｕ細胞を二重チミジンブロックと同期させ、１０％ＦＢＳを含む新鮮な培地に放出し、示された時間に収集し、次いでインビボユビキチン化アッセイに供した。Ｓは、飢餓の略である。（Ｆ）ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡで処理したか、又は処理していない同期ＰＣ－３Ｕ細胞の溶解物を、Ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降に供し、続いてＨＡ抗体を使用して免疫ブロッティングを行った。矢印は、重免疫グロブリン鎖を指す。平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ、Ｎ＝３［スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１］（Ｇ～Ｈ）ＴＲＡＦ６発現がＰＣ－３Ｕ及びＭＥＦ細胞において減少した場合の、有糸分裂中のＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩの共局在の減少を示す免疫蛍光。（Ｉ）ＴＲＡＦ６によるユビキチン化のコンセンサスモチーフは、いくつかの種においてＡＵＲＫＢ中に存在する。同じタイプのアミノ酸は、（＊）疎水性、（＆）極性、（Ｘ）任意のアミノ酸残基として標識される。（Ｋ）は、アクセプターリジン残基である。（Ｊ（ｉ）及び（ｉｉ））ＨＡタグ付きＷＴユビキチン及びＦｌａｇタグ付きＷＴ又は変異型ＡＵＲＫＢでトランスフェクトされた同期ＰＣ－３Ｕ細胞の溶解物を、Ｆｌａｇ抗体を使用して免疫沈降に供し、続いてＨＡウサギ抗体を使用して免疫ブロッティングを行った。平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ、Ｎ＝３［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５］。（Ｋ）Ｆｌａｇタグ付きＷＴ及び変異型ＡＵＲＫＢでトランスフェクトしたＰＣ－３Ｕ細胞の溶解物を、示されるように、Ｆｌａｇ抗体で免疫沈降させ、次いで、ＴＲＡＦ６抗体で免疫ブロッティングに供した。（Ｌ（ｉ）及び（ｉｉ））ＰＣ－３Ｕ細胞を、ＷＴ又は変異型ＧＦＰ－ＡＵＲＫＢでトランスフェクトし、次いで、Ｈ３ｐＳ１０に対する抗体で免疫ブロッティングを行った。平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ、Ｎ＝３［スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１］。（Ｍ（ｉ）及び（ｉｉ））免疫沈降されたＦｌａｇ－ＡＵＲＫＢ又はその変異体をインビトロキナーゼアッセイに供した。Ｆｌａｇ－ＡＵＲＫＢ及びその変異体並びに均等負荷の発現は、示されるように、Ｆｌａｇ免疫沈殿物又は全細胞溶解物（ＴＣＬ）のアリコートを免疫ブロッティングすることによって制御された。組み込まれた放射能は、ホスフォイメージャーによって検出された。クマシーブリリアントブルーを有するゲルの染色後に検出されたリン酸化タンパク質及び総タンパク質の移動位置が矢印（Ｍ（ｉ））で示される。ヒストンＨ３を基質として使用し、Ｈ３ｐＳ１０を免疫ブロッティングによって検出した（Ｍ（ｉｉ））。（Ｎ）ＰＣ－３Ｕ細胞をＷＴ又は変異型ＧＦＰ－ＡＵＲＫＢでトランスフェクトし、次いでＴβＲＩ（赤色）で染色した。ｎ＝２０、Ｎ＝３、平均値±ＳＥＭとして提示されるデータ［スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。（Ｏ）ＰＣ－３Ｕ細胞をＷＴ又は変異型ＧＦＰ－ＡＵＲＫＢでトランスフェクトし、次いでＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した。Ｎ＝３［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５］。
【図4】ＡＵＲＫＢの発現は、異なるがんにおける予後不良、及び前立腺がんにおけるＲＢ１とＡＵＲＫＢの発現との間の関係、並びにＣＲＰＣにおけるＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＡ、及びＴＧＦＢＲ１の発現との間の相関と相関し、ＡＵＲＫＢは、異なるがんにおいてユビキチン化され、前立腺がんにおいてＴβＲＩと複合体を形成する。（Ａ（ｉ））ＴＭＡ上でインサイチュＰＬＡを行って、ＡＵＲＫＢとＬｙｓ６３結合ポリユビキチン（茶色のドット）との共局在を示した。（Ａ（ｉｉ））ＴＭＡ上でインサイチュＰＬＡを行って、ＡＵＲＫＢとＫ６３結合ユビキチン（茶色のドット）との共局在を調査した。正常な前立腺、腎臓、及び肺の数は、それぞれ２２、２４、及び２３であった。前立腺がん、ｃｃＲＣＣ、肺腺がんの数は、それぞれ４１、３８、及び３２であった。定量化は、平均値±ＳＥＭを示す［スチューデントｔ検定、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１］（Ｂ）患者材料（褐色の点）の前立腺がんＴＭＡにおけるＡＵＲＫＢとＴβＲＩとの間の関連を、インサイチュＰＬＡによって決定した。グリソンスコアが低い患者２９名、グリソンスコアが高い患者２８名を含んだ。正常な前立腺の数は２３であった。定量化は、平均±ＳＥＭ［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１］を示す。スケールバー、５０μｍ。（Ｃ）インサイチュＰＬＡによって決定される、陰性対照として機能する（一次抗体は添加されなかった）、正常前立腺組織（褐色点）中のＡＵＲＫＢとＴβＲＩとの間の会合の欠如。スケールバー、５０μｍ。（Ｄ（ｉ）及び（ｉｉ））原発腫瘍及び転移の両方を含む、１５のＣＲＰＣ－ＮＥ試料及び３４のＣＰＰＣ－アデノ試料を有する４９のＣＲＰＣ試料にわたる対象となる８つの遺伝子の発現。試料は、最初にそれらのサブタイプによってグループ化され、次に腫瘍の位置によってグループ化される。（Ｄ（ｉｉｉ））ＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－ＡｄｅｎｏにおけるＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの発現［マン－ホイットニーＵ検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。（Ｄ（ｉｖ））ＡＵＲＫＢ及びＴＧＦＢＲ１の発現は、ＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏの両方において相関した。データ分析にはピアソン相関分析が使用された。（Ｄ（ｖ））ＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－ＡｄｅｎｏにおけるＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＡ、及びＴＧＦＢＲ１発現の相関。データ分析にはピアソン相関分析が使用される。（Ｅ）前立腺がんにおけるＲＢ１変異。（Ｆ）前立腺がんにおけるＡＵＲＫＢ及びＲＢ１についてのｍＲＮＡの発現間の負の相関；ピアソン相関係数（ｒ）が提示される。データは、ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒ Ａｔｌａｓデータベースから取得した。（Ｇ）ＴＣＧＡにおける原発性前立腺腫瘍におけるＡＵＲＫＢの発現は、グリソン群間で異なる［スチューデントｔ検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。腫瘍は、グリソンスコアに基づいてグループ化した。（Ｈ～Ｊ）前立腺がん、ｃｃＲＣＣ、又は肺腺がんにおけるＡＵＲＫＢの低発現対高発現の患者の生存への影響を例示するカプラン・マイヤープロット。代表的な画像は、ＴＣＧＡ Ｐａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ａｔｌａｓデータベースのデータに基づく、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓから入手した。
【図5】細胞増殖及び生存に対するＡＰＰＬ１／２、ＴＧＦＢＲ１及びＴＲＡＦ６の効果。（Ａ）ＰＣ－３Ｕ細胞を対照（ｃｔｒｌ）ｓｉＲＮＡ又はＮｏ．１ ＡＰＰＬ１／２ ｓｉＲＮＡで処理し、培養物中で異なる日数後にＭＴＴアッセイに供した。（Ｂ）異なるｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の中で、アポトーシス細胞を数えた。（Ｃ～Ｄ）ＥＧＦ刺激細胞増殖に対するＰＣ－３Ｕ細胞中のＡＰＰＬ１／２遺伝子のサイレンシング（Ｃ）の効果、及び１０％ＦＢＳによって刺激された細胞数に対するｓｉＲＮＡによるＴＲＡＦ６又はＴＧＦＢＲ１遺伝子のサイレンシング（Ｄ）の効果。Ｎ＝３、定量化は、平均±ＳＥＭを示す［スチューデントｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１］。
【図6】ＴβＲＩ－ＩＣＤシグナル伝達経路、及び有糸分裂進行におけるその関与の模式図。ＴβＲＩが、活性化γセクレターゼ複合体中のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びプレセニリン１によるタンパク質分解切断を受ける非標準的な経路は、細胞内ドメイン（ＴβＲＩ－ＩＣＤ）を生成する。エンドソームタンパク質ＡＰＰＬ１／２及び無傷の微小管は、ＴβＲＩ－ＩＣＤの核トランスロケーションに必要である。核において、ＴβＲＩ－ＩＣＤは、転写共活性化因子ｐ３００と複合体を形成し、プロ侵襲性遺伝子、ＴＧＦＢＲ１、並びにＡＵＲＫＢ及びＢＩＲＣ５（サバイビンをコードする）の発現を促進する。細胞分裂中、ＴβＲＩ－ＩＣＤ及びＡＰＰＬ１は、ＡＵＲＫＢと複合体を形成する。ＴＲＡＦ６は、有糸分裂中に、Ｋ８５及びＫ８７上でのＡＵＲＫＢのＫ６３結合ポリユビキチン化を促進し、これは、ＴβＲＩ－ＩＣＤとともに、適切な細胞質分裂に必要とされる。
【発明を実施するための形態】
【0201】
本発明が、記載される特定の材料及び方法に限定されないことを理解されたく、それは、これらが変動し得るからである。本明細書で使用される用語が単に特定の実施形態を記載する目的のためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるであろう本発明の範囲を制限することは意図されないことも理解されたい。
【0202】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「抗体」への言及は、１つ以上の抗体、及び当業者に既知のそれらの均等物などへの言及である。
【0203】
「バイオマーカー」とは、自然に発生する生物学的分子、又はその構成要素若しくは断片の意味を含み、その測定は、がんの予後及び／又は診断に有用な情報を提供することができる。例えば、バイオマーカーは、天然に存在するタンパク質若しくは炭水化物部分、又はその抗原構成要素若しくは断片であり得る。
【0204】
「診断」とは、個体における病態の存在又は非存在を判定する（例えば、個体が、侵襲性がんを含むがんに罹患しているか否かを決定すること）という意味が含まれる。
【0205】
「がん」及び「がん性」という用語は、哺乳類における生理学的状態が、典型的には、規制されていない細胞成長を特徴とすることを指すか、又は説明する。がんの例としては、がん腫、前立腺がん、小細胞肺がん、腎臓がん、子宮内膜がん、卵巣がん、皮膚がん、及び結腸直腸がんが挙げられるが、これらに限定されない。グレードスコア（数値：Ｇ１～Ｇ４）は、細胞分化の欠如とともに増加し、これは、腫瘍細胞が、それらが起源とする正常組織の細胞とどの程度異なるかを反映する。腫瘍は、施設及び腫瘍タイプに応じて、４層、３層、又は２層のスケールで採点され得る。組織学的腫瘍グレードスコアは、転移性（全身レベルのがん蔓延）病期分類とともに、各特定のがん対象を評価し、個々の治療戦略を開発し、それらの予後を予測するために使用される。最も一般的に使用される採点システムは、対がん米国合同委員会のガイドラインに従う。それらのガイドラインに従って、以下の採点カテゴリがある：ＧＸ グレードは評価することができない；Ｇ１ 高分化（低グレード）；Ｇ２ 中分化（中級グレード）；Ｇ３ 低分化（高グレード）、；及びＧ４ 未分化（高グレード）。
【0206】
「新生物」又は「腫瘍」という用語は、同義で使用され、組織の異常な塊を指し、その塊の成長は、正常組織の増殖を上回り、協調していない。新生物又は腫瘍は、以下の特徴に応じて「良性」又は「悪性」と定義され得る：形態及び機能性を含む細胞分化の程度、成長速度、局所侵入、並びに転移。「良性」新生物は一般に、高分化型であり、悪性腫瘍よりも成長が特徴的に遅く、発生部位に局在化されたままである。加えて、良性新生物には、遠隔部位に浸潤、侵入、又は転移する能力を有さない。
【0207】
「悪性」新生物は一般に、低分化型（退形成）であり、周囲組織の進行性浸潤、侵入、及び破壊を伴い、特徴的に急速に成長する。更に、悪性新生物は、遠隔部位に転移する能力を有する。
【0208】
「前立腺がん」という用語は、所与の対象内の前立腺の悪性新生物を指し、その新生物は、上皮由来であり、前立腺のがんとも称される。前立腺がんは、そのタイプ、病期、及び／又はグレードに従って定義され得る。典型的な病期分類システムには、ジューエット・ホイットモアシステム及びＴＮＭシステム（対がん米国合同委員会及び国際対がん連合によって採用されたシステム）が含まれる。典型的な採点システムは、組織生検の病理学的検査に基づく腫瘍侵襲性の尺度であるグリソンスコアである。
【0209】
グリソンシステムは、前立腺がんにおける腺がん細胞を採点するために使用される。このシステムは、２～１０の範囲の採点スコアを使用するが、６未満のスコアはめったに使用されない。グリソンスコアは、顕微鏡的な外観に基づいて前立腺がんに与えられる。グリソンスコアが高いがんは、より攻撃的であり、予後が悪い。前立腺がんは、しばしば異なるグレードのエリアを有するため、がんの大部分を構成する２つのエリアにグレードが割り当てられる。グリソンスコアは、２つの数値の合計に基づき、第１の数値は、最も一般的な腫瘍パターンのグレードであり、第２の数値は、２番目に一般的なパターンのグレードである。病理医は、生検標本を調べ、２つのパターンに最終的なグリソンスコアを与えようとする。グリソンスコアが６以下のがんは、高分化型又は低度と呼ばれることがある。７のグリソンスコアを有するがんは、中分化型又は中度と呼ばれ得る。８～１０のグリソンスコアを有するがんは、低分化型又は高度と呼ばれ得る。
【0210】
「前立腺がん」という用語は、限定されずに使用される場合、局在化された前立腺がん及び転移した前立腺がんの両方を含む。「前立腺がん」という用語は、「局在した」又は「転移した」という用語によって限定されて、それらの単語本明細書で定義されるように、腫瘍の異なるタイプを区別する。「前立腺がん」及び「前立腺の悪性疾患」という用語は、本明細書では同義で使用される。
【0211】
「分化」という用語は、実質細胞が形態学的にも機能的にも同等な正常細胞に類似する程度を指す。
【0212】
「転移」という用語は、原発（元の）腫瘍から別の臓器又は組織へのがん細胞の拡散又は移動を指し、典型的には、原発（元の）腫瘍の組織型の「二次腫瘍」又は「二次細胞塊」の存在によって識別可能であり、二次（転移性）腫瘍が位置する臓器又は組織の存在によってではない。例えば、骨に移動した前立腺がんは、転移した前立腺がんと言われ、前立腺におけるがん性前立腺がん細胞、並びに骨組織において成長するがん性前立腺がん細胞からなる。
【0213】
「前立腺の非悪性疾患」、「非前立腺がん状態」、及び「良性前立腺疾患」という用語は、同義で使用されてもよく、直腸動悸、ＰＳＡスコアリング、経直腸超音波検査、及び組織生検を含むが、これらに限定されない特定の診断方法に従って、前立腺がんとして分類されていない前立腺の疾患状態を指す。そのような疾患としては、限定されないが、前立腺組織の炎症（すなわち、慢性細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎）及び良性前立腺増殖が挙げられる。
【0214】
「健康である」という用語は、いかなる悪性疾患又は非悪性疾患も存在しないことを指し、したがって、「健康な個体」は、通常「健康である」とはみなされないであろう他の疾患又は病態を有し得る。「健康な」個体は、いかなる悪性疾患又は非悪性疾患も存在しないことを実証する。
【0215】
前立腺がんの文脈において、「健康な」という用語は、いかなる前立腺の悪性疾患又は非悪性疾患も存在しないことを指し、したがって、「健康な個体」は、通常「健康な」とはみなされないであろう他の疾患又は状態を有し得る。「健康な」個体は、いかなる前立腺の悪性疾患又は非悪性疾患も存在しないことを実証する。
【0216】
「細胞質分裂」とは、親真核細胞の細胞質が２つの娘細胞に分割される細胞分裂中の物理的プロセスの意味が含まれる。それは、動物細胞で生じる、有糸分裂及び減数分裂と呼ばれる２つのタイプの核分裂と同時に生じる。有糸分裂は、単一の細胞内に含まれる２つの別個の核をもたらす。細胞質分裂は、細胞を半分に分離し、１つの核が各娘細胞の中にあることを確実にするための不可欠なプロセスを行う。細胞質分裂は、後期と呼ばれる核分裂期中に始まり、末期まで続く。収縮環と呼ばれるタンパク質フィラメントの環は、形質膜の直下の細胞の赤道の周りに形成される。収縮環は、細胞の赤道で縮小し、形質膜を内側につまみ、分裂溝と呼ばれるものを形成する。最終的に、収縮環は、２つの別々の細胞が存在し、各々がその独自の形質膜によって結合される時点まで縮小する。２つの新たに生成された細胞を接続する膜が切断され、姉妹の物理的分離をもたらすプロセスである脱離により、細胞質分裂が終了する。
【0217】
「中心体」とは、細胞質分裂の終わりに２つの娘細胞を接続する一過性構造の意味を含み、主な機能は、２つの娘細胞を物理的に分離する脱離の部位を局在化することである。中心体は、後期の間に分離する姉妹クロマチドの間に組み立てられる双極性微小管アレイであるミッドゾーンから形成される。分裂溝が形成された後、中央紡錘体ミッドゾーンが再構築されて、中心体を形成する。中心体は、２つの娘細胞の分離を調節する重要なタンパク質を動員し、組織化するための重要なプラットフォームを提供するミッドゾーンの中心体への変換は、溝の移入と正の相関がある。
【0218】
「共局在した」という用語には、同じ細胞位置、例えば、中心体に２つ以上の分子／タンパク質／化合物／バイオマーカーが存在するという意味が含まれる。「会合した」及び「共局在した」という用語とは、本明細書で使用される場合、これらの分子／化合物／タンパク質／バイオマーカー化合物は、空間的及び時間的に細胞の同じ領域に局在しているが、各構成要素が互いに直接相互作用する複合体に必ずしも存在するわけではないことが含まれる。
【0219】
細胞質分裂構造におけるバイオマーカーの共局在は、当該技術分野で知られている方法によって決定することができ、本明細書に記載されるものを含む。
【0220】
「存在」、「発現」、「レベル」、「量」、及び「発現レベル」という用語は、ＤＮＡ及びｍＲＮＡなどの核酸分子、並びに／又は例えばＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＢ、ＴβＲＩ、ＴβＲＩ－ＩＣＤ、及びＴＲＡＦ６などの定義された生体分子のタンパク質の量に関連し得る。ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されていてもよい。各生体分子のレベルは、例えば、核、サイトゾル、細胞膜、細胞質分裂構造などの細胞内の特定及び所定の部位で決定される。
【0221】
ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化されていなくても、ユビキチン化されていても、ポリユビキチン化されていてもよい。
【0222】
イベントという用語は、治療の開始、投薬の変更、及び治療の終了などの治療方法の任意の変更を意味する。形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）の異常な切断を伴う疾患若しくは状態、又は当該関連疾患若しくは状態の治療に関する情報を提供する、細胞質分裂構造において共局在されるバイオマーカー、すなわち、オーロラキナーゼＢ（ＡＵＲＫＢ）；アダプタータンパク質、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）；ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）；並びにＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）のレベルの変化。
【0223】
本明細書では、ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１－ＩＣＤ）の細胞内ドメインに（検出及び／又は視覚化のために）結合する抗体（Ｖ２２）が使用された。しかしながら、試料中でＴβＲ１－ＩＣＤ（約３４ｋＤａ）が検出され、可視化されても、それは、このドメインのみが存在することを意味するのではなく、存在し得るが、Ｖ２２は、無傷の全長タンパク質（５５．９６ｋＤａ）にも結合し、したがって、Ｖ２２によっても認識される。ＩＣＤのみ又は例えば全長タンパク質が存在するかどうかを評価するために、例えば、それぞれの分子量を決定してもよい。
【0224】
これは、バイオマーカーとしての「ＴＧＦβ受容体１型（ＴβＲ１）」という用語が、いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン（ＴβＲ１－ＩＣＤ）を意味し得ることを意味する。
【0225】
参照値は、生物学的試料中のＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＢ、ＴβＲＩ、ＴβＲＩ－ＩＣＤ、及びＴＲＡＦ６などのそれぞれのバイオマーカーの発現レベル、例えば、量（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）又は強度（例えば、免疫蛍光及び他の撮像方法、ウェスタンブロット）を表す値を意味する。試料は、基準点として使用するための開始／参照値ｔ０を定義し、例えば、投薬、用量、時間、投薬の追加（及び併用）などの時間及び／又は変更が、参照値ｔ１、２、３などにどのように正又は負の影響を及ぼすかを検出するために、良性又は悪性の固形腫瘍から採取された生検であり得る。非がん性組織は、０の参照値を示し、すなわち、マーカー（ＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＢ、ＴβＲＩ、及びＴＲＡＦ６）は、細胞質分裂中に共局在しない。
阻害剤又は遮断剤という用語は、タンパク質／酵素に結合し、それによってタンパク質／酵素活性を低下させ、又はタンパク質、膜、細胞などの部位を物理的に遮断し、それによって他の薬剤がその部位に到達するのを立体的に妨げる薬剤又は化合物を意味する。
阻害剤又は遮断剤という用語は、タンパク質／酵素に結合し、それによってタンパク質／酵素活性を低下させ、又はタンパク質、膜、細胞などの部位を物理的に遮断し、それによって他の薬剤がその部位に到達するのを立体的に妨げる薬剤又は化合物を意味する。
【0226】
本発明は、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）の切断を伴う非標準的なＴＧＦβ誘導性シグナル伝達経路に関連するがんに罹患している対象を選択／分類するための信頼性の高いバイオマーカーを提供し、治療への応答を予測し、ＴβＲＩの切断のための阻害剤／遮断薬による治療の結果をモニタリングすることは、がん治療を成功させるための貴重なツールを提供する。
【0227】
更に、本発明はまた、侵襲性がんの成長を識別し、それによって疾患の初期段階での転移を予防するための満たされていない高い医学的ニーズに応答している。
【0228】
材料及び方法
細胞培養
ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ－３Ｕ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０４８２）及びヒト神経芽腫細胞株ＫＥＬＬＹは、Ｓｉｇｍａ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿２０９２）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で成長させた。不死化野生型マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＴＲＡＦ６が欠損したＭＥＦ（Ｊｕｎ－ｉｃｈｉｒｏ Ｉｎｏｕｅから）を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地中で成長させた。ＴＧＦβ刺激実験では、ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍＬ）を、１％ＦＢＳを含有する培地で調製し、１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で１８時間飢えた細胞に添加した。一過性トランスフェクションを、製造業者の説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）で行った。細胞株は、ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃｓによって検証されている。
細胞培養
ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ－３Ｕ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０４８２）及びヒト神経芽腫細胞株ＫＥＬＬＹは、Ｓｉｇｍａ（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿２０９２）から購入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で成長させた。不死化野生型マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＴＲＡＦ６が欠損したＭＥＦ（Ｊｕｎ－ｉｃｈｉｒｏ Ｉｎｏｕｅから）を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭのＬ－グルタミン、並びに１００単位／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地中で成長させた。ＴＧＦβ刺激実験では、ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍＬ）を、１％ＦＢＳを含有する培地で調製し、１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地で１８時間飢えた細胞に添加した。一過性トランスフェクションを、製造業者の説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）で行った。細胞株は、ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃｓによって検証されている。
【0229】
免疫ブロッティングに使用される抗体及び試薬
以下のタンパク質に対する抗体を、免疫ブロッティングに使用した：ＡＰＰＬ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３８５８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０５６９８９）、ｐ－オーロラキナーゼ（ＡＵＲＫＡのＴｈｒ２８８；ＡＵＲＫＢのＴｈｒ２３２；ＡＵＲＫＣのＴｈｒ１９８；タンパク質の分子量は、それぞれ、４８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び３５ｋＤａである）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２９１４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０６１６３１）、サイクリンＢ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号４１３５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２３３９５６）、ＨＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３７２４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１５４９５８５、及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２３６７、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０６９１３１１）、ＧＦＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２９５６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１９６６１５）、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号５１７４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０６２２０２５）、ｐ３８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号８６９０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０９９９０９０）、サバイビン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２８０８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０６３９４８）、ＡＰＰＬ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－６７４０３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０５６３８３）、ＡＵＲＫＢ（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ２２５４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３０２９２３）、ＴＲＡＦ６（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ４０６７５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿７７８５７３）、Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｆ９２９１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４３９６９８）、β－アクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ａ５４４１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４４）、β－チューブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｔ０１９８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７７５５６、及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２１４６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２１０５４５）、Ｈ３ｐＳ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号０６－５７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１０１７７）、及びＴβＲＩ（Ｖ２２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－３９８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６３２４９３；この抗体は、前述のように、ＴβＲＩのＩＣＤを特異的に認識する１３）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体は、Ｄａｋｏ及びＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから購入し、ＥＣＬ免疫ブロッティング検出試薬はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＰｅｆａｂｌｏｃはＲｏｃｈｅから、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｄｄｅｒはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得した。
以下のタンパク質に対する抗体を、免疫ブロッティングに使用した：ＡＰＰＬ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３８５８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０５６９８９）、ｐ－オーロラキナーゼ（ＡＵＲＫＡのＴｈｒ２８８；ＡＵＲＫＢのＴｈｒ２３２；ＡＵＲＫＣのＴｈｒ１９８；タンパク質の分子量は、それぞれ、４８ｋＤａ、４０ｋＤａ、及び３５ｋＤａである）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２９１４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０６１６３１）、サイクリンＢ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号４１３５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２３３９５６）、ＨＡ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３７２４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１５４９５８５、及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２３６７、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０６９１３１１）、ＧＦＰ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２９５６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１９６６１５）、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号５１７４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０６２２０２５）、ｐ３８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号８６９０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０９９９０９０）、サバイビン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２８０８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０６３９４８）、ＡＰＰＬ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－６７４０３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０５６３８３）、ＡＵＲＫＢ（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ２２５４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３０２９２３）、ＴＲＡＦ６（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ４０６７５、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿７７８５７３）、Ｆｌａｇ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｆ９２９１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４３９６９８）、β－アクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ａ５４４１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７６７４４）、β－チューブリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｔ０１９８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４７７５５６、及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号２１４６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２２１０５４５）、Ｈ３ｐＳ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号０６－５７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１０１７７）、及びＴβＲＩ（Ｖ２２；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－３９８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６３２４９３；この抗体は、前述のように、ＴβＲＩのＩＣＤを特異的に認識する１３）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体は、Ｄａｋｏ及びＰｒｏｔｅｉｎ－Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから購入し、ＥＣＬ免疫ブロッティング検出試薬はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＰｅｆａｂｌｏｃはＲｏｃｈｅから、ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｄｄｅｒはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得した。
【0230】
タンパク質分析
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、氷冷溶解緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５％（ｖ／ｖ）のデオキシコール酸塩、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤］中で溶解した。遠心分離後、上清を採取し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。各全細胞溶解物からの等量のタンパク質を、免疫沈降に使用した。免疫沈降タンパク質を、ニトロセルロース膜上でブロットしたＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミンド電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分解し、前述のように免疫ブロッティングに共した（Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｍｕ Ｙ，Ｌｉ Ｃ，Ｂｅｒｇｈ Ａ，Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ Ｍ，Ｈｅｌｄｉｎ Ｃ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ＴＧＦβ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７：２７９－９２）。
細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、氷冷溶解緩衝液［１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５％（ｖ／ｖ）のデオキシコール酸塩、１％（ｖ／ｖ）のＮＰ４０、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、及びプロテアーゼ阻害剤］中で溶解した。遠心分離後、上清を採取し、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。各全細胞溶解物からの等量のタンパク質を、免疫沈降に使用した。免疫沈降タンパク質を、ニトロセルロース膜上でブロットしたＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミンド電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分解し、前述のように免疫ブロッティングに共した（Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｍｕ Ｙ，Ｌｉ Ｃ，Ｂｅｒｇｈ Ａ，Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ Ｍ，Ｈｅｌｄｉｎ Ｃ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ＴＧＦβ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７：２７９－９２）。
【0231】
インビボユビキチン化アッセイ
ＰＣ－３Ｕ細胞を氷冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に採取し、次いで３００×ｇで、４℃で５分間遠心分離した。非共有結合性タンパク質相互作用を、ＰＢＳ中の作りたての１％ＳＤＳ中で、１０分間沸騰させることによって解離した。試料を、ＰＢＳ中のプロテアーゼ阻害剤を用いて、０．５％のＮＰ－４０を含有する１．５ｍｌの溶解緩衝液中で希釈した。試料を免疫沈降に供し、その後、前述のように免疫ブロッティングを行った（Ｈａｍｉｄｉ Ａ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｔｈａｋｕｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－β ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＴＲＡＦ６－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ８５α．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７；１０：ｅａａｌ４１８６）。
ＰＣ－３Ｕ細胞を氷冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、１ｍｌの氷冷ＰＢＳ中に採取し、次いで３００×ｇで、４℃で５分間遠心分離した。非共有結合性タンパク質相互作用を、ＰＢＳ中の作りたての１％ＳＤＳ中で、１０分間沸騰させることによって解離した。試料を、ＰＢＳ中のプロテアーゼ阻害剤を用いて、０．５％のＮＰ－４０を含有する１．５ｍｌの溶解緩衝液中で希釈した。試料を免疫沈降に供し、その後、前述のように免疫ブロッティングを行った（Ｈａｍｉｄｉ Ａ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｔｈａｋｕｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－β ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＴＲＡＦ６－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ８５α．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７；１０：ｅａａｌ４１８６）。
【0232】
免疫蛍光及び顕微鏡画像取得
以下のタンパク質に対する他の一次抗体を、免疫蛍光実験で使用した：ＡＵＲＫＢ（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号ＮＢＰ２－５００３９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３７）、及びｐ－Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３１０８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４９０９４１）。二次抗体は、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－３１５７２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１６２５４３）、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－３１５７０、ＲＩＤ：ＡＢ＿２５３６１８０）、並びにヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－１１０２９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５３４０８８）、及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ３２７３１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６３３２８０）であった。免疫蛍光アッセイを、前述のように行った（Ｓｏｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６；７： ２７９－２９２）。簡潔には、細胞をカバースリップ上に播種し、４％のパラホルムアルデヒド中に３０分間固定し、次いで、ＰＢＳ中の０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間処理し、１０ｍＭのグリシンでブロックした。一次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行い、続いてＰＢＳ中で洗浄し、二次抗体とインキュベーションした。６３×／１．４ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を備えた共焦点顕微鏡ＬＳＭ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して、顕微鏡写真を得た。画像は、Ｚｅｎ ２０１１ソフトウェアを使用して、室温で油浸した状態で取得した。
以下のタンパク質に対する他の一次抗体を、免疫蛍光実験で使用した：ＡＵＲＫＢ（Ｎｏｖｕｓ、カタログ番号ＮＢＰ２－５００３９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３７）、及びｐ－Ｓｍａｄ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号３１０８、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿４９０９４１）。二次抗体は、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－３１５７２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１６２５４３）、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－３１５７０、ＲＩＤ：ＡＢ＿２５３６１８０）、並びにヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ－１１０２９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５３４０８８）、及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号Ａ３２７３１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６３３２８０）であった。免疫蛍光アッセイを、前述のように行った（Ｓｏｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６；７： ２７９－２９２）。簡潔には、細胞をカバースリップ上に播種し、４％のパラホルムアルデヒド中に３０分間固定し、次いで、ＰＢＳ中の０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で５分間処理し、１０ｍＭのグリシンでブロックした。一次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行い、続いてＰＢＳ中で洗浄し、二次抗体とインキュベーションした。６３×／１．４ＮＡ対物レンズ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を備えた共焦点顕微鏡ＬＳＭ７１０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して、顕微鏡写真を得た。画像は、Ｚｅｎ ２０１１ソフトウェアを使用して、室温で油浸した状態で取得した。
【0233】
プラスミド及び部位指向された変異誘発
ｐＣＲ３－Ｆｌａｇ－ＡＵＲＫＢ Ｋ１０６Ｒキナーゼデッド（ＫＤ）は、Ｓｕｓａｎｎｅ Ｌｅｎｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１０８４８８；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０８４８８；ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０８４８８）４４からの親切な贈り物であり、内容物の最適化、及びＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による、Ｆｌａｇタグ付き野生型ＡＵＲＫＢタンパク質を発現するために使用した。変異誘発のためのプライマーは、ｏＪＳ５、ｏＪＳ８、ｏＪＳ１７、及びｏＪＳ１８であった（表２）。改変されたＦｌａｇ－ＡＵＲＫＢ（すなわち、Ｋ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５Ｒ／Ｋ８７Ｒ二重変異体）を発現するプラスミドを、それぞれオリゴｏＪＳ９、ｏＪＳ１０、及びｏＪＳ１１を使用して、ＰＣＲ変異誘発によって生成した。同様のアプローチを用いて、ｐＥＧＦＰ－ＡＵＲＫＢ Ｋ１０６Ｒ（ＫＤ）を変異誘発のためのテンプレートとして使用して、野生型ＡＵＲＫＢに融合した増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するプラスミド、並びにＫ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５Ｒ／Ｋ８７Ｒ変異体を構築した（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１０８４９３；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０８４９３；ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０８４９３）。４４タグの組み込み及びＡＵＲＫＢ配列の改変は、個々のプラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認された。
ｐＣＲ３－Ｆｌａｇ－ＡＵＲＫＢ Ｋ１０６Ｒキナーゼデッド（ＫＤ）は、Ｓｕｓａｎｎｅ Ｌｅｎｓ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１０８４８８；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０８４８８；ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０８４８８）４４からの親切な贈り物であり、内容物の最適化、及びＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による、Ｆｌａｇタグ付き野生型ＡＵＲＫＢタンパク質を発現するために使用した。変異誘発のためのプライマーは、ｏＪＳ５、ｏＪＳ８、ｏＪＳ１７、及びｏＪＳ１８であった（表２）。改変されたＦｌａｇ－ＡＵＲＫＢ（すなわち、Ｋ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５Ｒ／Ｋ８７Ｒ二重変異体）を発現するプラスミドを、それぞれオリゴｏＪＳ９、ｏＪＳ１０、及びｏＪＳ１１を使用して、ＰＣＲ変異誘発によって生成した。同様のアプローチを用いて、ｐＥＧＦＰ－ＡＵＲＫＢ Ｋ１０６Ｒ（ＫＤ）を変異誘発のためのテンプレートとして使用して、野生型ＡＵＲＫＢに融合した増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するプラスミド、並びにＫ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５Ｒ／Ｋ８７Ｒ変異体を構築した（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１０８４９３；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１０８４９３；ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿１０８４９３）。４４タグの組み込み及びＡＵＲＫＢ配列の改変は、個々のプラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認された。
【0234】
６Ｈｉｓ－ＡＰＰＬ１及び６Ｈｉｓ－ＡＰＰＬ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を担持するプラスミドを、変異誘発のためのテンプレートとして使用して、ｓｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングに耐性のある転写物を産生する構築物を生成した。ＡＰＰＬ１のｓｉＲＮＡ耐性構築物の配列は、５’－ＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡ－３’（配列番号３）であり、ＡＰＰＬ２のｓｉＲＮＡ耐性構築物の配列は、５’－ＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣ－３’（配列番号４）であった。ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２配列の改変をＤＮＡ配列決定によって確認された。ＹＦＰ－ＡＰＰＬ１－ΔＮ及びＧＦＰ－ＡＰＰＬ１－ΔＣは、Ｍａｒｔａ Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａからの親切な贈り物であった。４５ ｐＥＧＦＰＣ１－ヒトＡＰＰＬ１は、Ｐｉｅｔｒｏ Ｄｅ Ｃａｍｉｌｌｉ（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃２２１９８；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２１９８；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２１９８）４６からの贈り物であり、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってそれぞれＢＡＲメイン、ＰＨドメイン、及びＰＴＢドメインを有する構築物を生成するために使用した。変異誘発のためのプライマーは、ｏＹＺ８６、ｏＹＺ８７、ｏＹＺ８８、ｏＹＺ９１、及びｏＹＺ９２であった（表２）。ＡＰＰＬ１配列の改変は、個々のプラスミドのＤＮＡ配列決定によって確認された。
【表2】
【0235】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
Ｏｎ ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＡＰＰＬ１（Ｎｏ．１：標的配列、５’－ＧＧＡＡＡＵＧＧＡＣＡＧＵＧＡＵＡＵＡ－３’（配列番号１７）；Ｎｏ．２：標的配列、５’－ＧＡＵＣＵＧＡＧＵＣＵＡＣＡＡＡＵＵＵ－３’）（配列番号１８）、ＡＰＰＬ２（Ｎｏ．１：標的配列、５’－ＡＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＣＣＧＡＣＡＡ－３’（配列番号１９）；Ｎｏ．２：標的配列、５’－ＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＵＧＣＧＧＧＵＧＵ－３’）（配列番号２０）、ＴβＲＩ ｓｉＲＮＡ（標的配列、５’－ＣＡＵＡＵＵＧＣＵＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡ－３’）（配列番号２１）、ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡ、及びｓｉＧＥＮＯＭＥ非標的化対照ｓｉＲＮＡ ＃１（標的配列、５’－ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡ－３’）（配列番号２２）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから取得した。ｓｉＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞内にトランスフェクションした。
Ｏｎ ＴＡＲＧＥＴ ｐｌｕｓ ＡＰＰＬ１（Ｎｏ．１：標的配列、５’－ＧＧＡＡＡＵＧＧＡＣＡＧＵＧＡＵＡＵＡ－３’（配列番号１７）；Ｎｏ．２：標的配列、５’－ＧＡＵＣＵＧＡＧＵＣＵＡＣＡＡＡＵＵＵ－３’）（配列番号１８）、ＡＰＰＬ２（Ｎｏ．１：標的配列、５’－ＡＧＡＵＣＵＡＣＣＵＧＡＣＣＧＡＣＡＡ－３’（配列番号１９）；Ｎｏ．２：標的配列、５’－ＧＣＧＧＡＡＡＡＧＡＵＧＣＧＧＧＵＧＵ－３’）（配列番号２０）、ＴβＲＩ ｓｉＲＮＡ（標的配列、５’－ＣＡＵＡＵＵＧＣＵＧＣＡＡＣＣＡＧＧＡ－３’）（配列番号２１）、ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡ、及びｓｉＧＥＮＯＭＥ非標的化対照ｓｉＲＮＡ ＃１（標的配列、５’－ＵＡＧＣＧＡＣＵＡＡＡＣＡＣＡＵＣＡＡ－３’）（配列番号２２）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから取得した。ｓｉＲＮＡは、製造業者のプロトコルに従って、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞内にトランスフェクションした。
【0236】
総ＲＮＡ抽出及びマイクロアレイアッセイ
ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２のノックダウン後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＰＣ－３Ｕ細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの純度及び完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ナノキット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。総ＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＴａｒｇｅｔＡｍｐ（商標）－Ｎａｎｏ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｅａｄｃｈｉｐ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いてビオチン標識されたアンチセンスＲＮＡ標的を生成した。ＲＮＡ（７５０ｎｇ）をＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ－１２ビーズチップアレイに１７時間ハイブリダイゼーションした。チップを洗浄し、製造業者の説明書に従ってＣｙ３－ストレプトアビジンで染色した。画像データは、ｉＳｃａｎシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して取得した。マイクロアレイデータを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ及びＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ６．７を使用して分析し、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検証した。
ＡＰＰＬ１及びＡＰＰＬ２のノックダウン後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＰＣ－３Ｕ細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの純度及び完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ナノキット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で評価した。総ＲＮＡ（５００ｎｇ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＴａｒｇｅｔＡｍｐ（商標）－Ｎａｎｏ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｂｅａｄｃｈｉｐ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）を用いてビオチン標識されたアンチセンスＲＮＡ標的を生成した。ＲＮＡ（７５０ｎｇ）をＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ－１２ビーズチップアレイに１７時間ハイブリダイゼーションした。チップを洗浄し、製造業者の説明書に従ってＣｙ３－ストレプトアビジンで染色した。画像データは、ｉＳｃａｎシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して取得した。マイクロアレイデータを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ及びＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ６．７を使用して分析し、ｑＲＴ－ＰＣＲによって検証した。
【0237】
インビトロキナーゼアッセイ
インビトロキナーゼアッセイのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｆｌａｇタグ付きＡＵＲＫＢ若しくはその変異体Ｋ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５／８７Ｒのためのベクター、又は対照空ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトした。タンパク質をＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中で抽出し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｆ１８０４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６２０４４）及びプロテインＧセファロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫沈降させた。ビーズをＲＩＰＡ緩衝液中で４回洗浄し、キナーゼ緩衝液（１５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、７．５ｍＭのグリセロール２－リン酸塩、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＥＧＴＡ、０．１５ｍＭのジチオスレイトール）中で平衡化した。
インビトロキナーゼアッセイのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｆｌａｇタグ付きＡＵＲＫＢ若しくはその変異体Ｋ８５Ｒ、Ｋ８７Ｒ、及びＫ８５／８７Ｒのためのベクター、又は対照空ｐｃＤＮＡ３ベクターでトランスフェクトした。タンパク質をＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ））中で抽出し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｆ１８０４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６２０４４）及びプロテインＧセファロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で免疫沈降させた。ビーズをＲＩＰＡ緩衝液中で４回洗浄し、キナーゼ緩衝液（１５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、７．５ｍＭのグリセロール２－リン酸塩、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＥＧＴＡ、０．１５ｍＭのジチオスレイトール）中で平衡化した。
【0238】
リン酸化反応は、基質、ヒストンＨ３（１μｇ）、及びＡＴＰの添加によって開始した。非放射性キナーゼアッセイでは、ＡＴＰの濃度は、０．５ｍＭであったが、０．５μＣｉ［γ－３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いたアッセイでは５μＭであった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分析のために、反応を、５分の１体積の６×ＳＤＳ試料緩衝液を添加することによって停止させ、９６℃で５分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用した。
【0239】
ヒストンＨ３のリン酸化を、抗ホスホヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号０６－５７０、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿３１０１７７）を用いた免疫ブロッティングによって検出した。等しい発現及び負荷は、抗ヒストンＨ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号４４９９、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０５４４５３７）及び抗フラグ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ カタログ番号Ｆ１８０４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２６２０４４）による膜の免疫ブロッティングによって制御した。
【0240】
細胞数及び死亡の評価
細胞数は、Ｒｏｃｈｅの細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ）又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの自動細胞計数器Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）を使用して測定した。細胞アポトーシスを、Ｔａｌｉ（商標）アポトーシスキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した後、Ａｒｔｈｕｒ（商標）を使用して解析した。
細胞数は、Ｒｏｃｈｅの細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ）又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの自動細胞計数器Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）を使用して測定した。細胞アポトーシスを、Ｔａｌｉ（商標）アポトーシスキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した後、Ａｒｔｈｕｒ（商標）を使用して解析した。
【0241】
インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）
ＰＬＡ明視野については、前立腺がん組織マイクロアレイ（ＴＭＡ、ＢｉｏＣａｔ）を最初に脱パラフィン化し、次いで抗原検索、及び透過化に供した。ＰＬＡは、ＡＵＲＫＢ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ カタログ番号ＮＢＰ２－５００３９，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３７））、Ｋ６３結合ポリユビキチン（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ１７９４３４，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３９）、及びＴβＲＩ（Ｖ２２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－３９８，ＲＲＩＤ： ＡＢ＿６３２４９３）に対する抗体を使用して、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ２５０ Ｆｌａｓｈで画像を取得し、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌソフトウェアを使用してＰＬＡシグナルを解析した。
ＰＬＡ明視野については、前立腺がん組織マイクロアレイ（ＴＭＡ、ＢｉｏＣａｔ）を最初に脱パラフィン化し、次いで抗原検索、及び透過化に供した。ＰＬＡは、ＡＵＲＫＢ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ カタログ番号ＮＢＰ２－５００３９，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３７））、Ｋ６３結合ポリユビキチン（Ａｂｃａｍ カタログ番号ａｂ１７９４３４，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２８９５２３９）、及びＴβＲＩ（Ｖ２２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログ番号ｓｃ－３９８，ＲＲＩＤ： ＡＢ＿６３２４９３）に対する抗体を使用して、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ（Ｓｉｇｍａ）を用いて行った。Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ ２５０ Ｆｌａｓｈで画像を取得し、Ｄｕｏｌｉｎｋ Ｉｍａｇｅ Ｔｏｏｌソフトウェアを使用してＰＬＡシグナルを解析した。
【0242】
バイオインフォマティクス
前立腺がんにおけるＴＧＦβＲ１と相関する遺伝子を、ＴＣＧＡ ＰＲＡＤコホートのｌｏｇ２ ＣＰＭ正規化発現データを使用してピアソンの相関係数を計算することによって識別した。全ての遺伝子を、ＴＧＦＢＲ１とのそれらの相関によってランク付けし、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を、分子署名データベース（ＭＳｉｇＤＢ）４８のホールマーク遺伝子セットを用いて、Ｒパッケージクラスタープロファイラー４７を使用して行った。３４個の遺伝子セットを、０．０５以下の調整されたｐ値で濃縮した。
前立腺がんにおけるＴＧＦβＲ１と相関する遺伝子を、ＴＣＧＡ ＰＲＡＤコホートのｌｏｇ２ ＣＰＭ正規化発現データを使用してピアソンの相関係数を計算することによって識別した。全ての遺伝子を、ＴＧＦＢＲ１とのそれらの相関によってランク付けし、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を、分子署名データベース（ＭＳｉｇＤＢ）４８のホールマーク遺伝子セットを用いて、Ｒパッケージクラスタープロファイラー４７を使用して行った。３４個の遺伝子セットを、０．０５以下の調整されたｐ値で濃縮した。
【0243】
Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ ＡｔｌａｓからのＲＮＡ－ｓｅｑ発現データ及び臨床メタデータを、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ Ｃｏｍｍｏｎｓ４９及びＲパッケージＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓ５０、ｖ．２．１６．４を使用してダウンロードした。各前立腺腫瘍の一次及び二次グリソングレードを、ファイルＰＲＡＤ＿ｃｌｉｎｄａｔａ．ｘｌｓから取得した。腫瘍は、グリソンスコアに基づいてグループ化した。対象となる各遺伝子のｌｏｇ２ ＣＰＭ（１００万分の１のカウント）正規化発現値を、Ｒパッケージｇｇｐｕｂｒ５１を使用して、グリソン群ごとにプロットした。発現差の統計的有意性は、ｔ検定を使用して計算した。
【0244】
公開された研究５２からの４９個の去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）試料からの試料についてのＲＮＡ－ｓｅｑ発現データ及びコピー数データを、ｃＢｉｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ）からダウンロードした。臨床データは、ファイルｄａｔａ＿ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｓａｍｐｌｅ．ｔｘｔから、発現データは、ｄａｔａ＿ＲＮＡ＿Ｓｅｑ＿ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｍｅｄｉａｎ．ｔｘｔから、コピー数データは、ｄａｔａ＿ｌｏｇ２ＣＮＡ．ｔｘｔから取得した。データを読み取り、Ｒ，ｖ．４．０．２５３を使用して、全ての更なる分析に供した。発現データをｌｏｇ２変換し、サブタイプ及び腫瘍位置によって選別された試料、並びにそれらの発現プロファイルによって階層的にクラスタリングされた遺伝子を用いて、行正規化されたヒートマップをプロットした。ＲＢ１コピー数ステータスは、０．４以上のＲＢ１ ｌｏｇ２コピー数値については獲得、－０．４以下の値については喪失、及びそうでなければコピーニュートラルとして定義された。３つの腺がん試料については、コピー数データは利用不可であった。Ｒパッケージｇｇｐｕｂｒ５１のｇｇｂｏｘｐｌｏｔ機能によって生成されたボックスプロットを用いて、マン－ホイットニーＵ検定ｐ値とともに、神経内分泌ＣＲＰＣ群対腺がんＣＲＰＣ群における対象となる遺伝子の発現差を可視化した。ＴＧＦＢＲ１の発現と他の遺伝子との間のピアソンの相関を、神経内分泌ＣＲＰＣ試料及び腺がんＣＲＰＣ試料内で計算した。
【0245】
統計分析
図の凡例に示されるように、スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニーＵ検定を使用して、２つの独立した群間の差を分析した。値は、少なくとも３つの独立した実験の、±標準誤差（ＳＥＭ）又は±標準偏差（ＳＤ）として表される。０．０５未満のＰ値を、を統計学的有意とみなした。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図の凡例に示されるように、スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニーＵ検定を使用して、２つの独立した群間の差を分析した。値は、少なくとも３つの独立した実験の、±標準誤差（ＳＥＭ）又は±標準偏差（ＳＤ）として表される。０．０５未満のＰ値を、を統計学的有意とみなした。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【実施例】
【0246】
実施例１．ＡＰＰＬタンパク質は、増殖及びアポトーシスに関与する遺伝子を調節する
本発明者らは、エンドソームアダプタータンパク質である、アダプタータンパク、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）並びにＡＰＰＬ２が、細胞のＴＧＦβ刺激に応答してＴβＲＩ－ＩＣＤの核蓄積に必要であることを見出した１６。核ＴβＲＩ－ＩＣＤ－ＡＰＰＬ１複合体の標的遺伝子を調査するために、本発明者らは、ＡＰＰＬ１／２をノックダウンすることの遺伝子発現に対する効果を評価するためにマイクロアレイ分析を行った（表１及び図１ａ）。
本発明者らは、エンドソームアダプタータンパク質である、アダプタータンパク、ＰＨドメインと相互作用するホスホチロシン、及びロイシンジッパー１（ＡＰＰＬ１）並びにＡＰＰＬ２が、細胞のＴＧＦβ刺激に応答してＴβＲＩ－ＩＣＤの核蓄積に必要であることを見出した１６。核ＴβＲＩ－ＩＣＤ－ＡＰＰＬ１複合体の標的遺伝子を調査するために、本発明者らは、ＡＰＰＬ１／２をノックダウンすることの遺伝子発現に対する効果を評価するためにマイクロアレイ分析を行った（表１及び図１ａ）。
【0247】
ＡＰＰＬ１／２ノックダウン細胞における影響を受けた遺伝子の中で、細胞増殖及びアポトーシスに関与するタンパク質、すなわち、ＣＰＣ［ＡＵＲＫＢ、サバイビン（ＢＩＲＣ５によってコードされる）、及びボレアリン（ＣＤＣＡ８によってコードされる）］並びにそれらの下流基質、有糸分裂セントロメア関連キネシン（ＫＩＦ２Ｃによってコードされる）の構成要素をコードする遺伝子の発現の低下が観察された（表１及び図１ａ）３３、３４、５４。ＩＮＣＥＮＰの発現に対する効果は観察されなかった。
【表3】
【0248】
本発明者らは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用してマイクロアレイデータを検証した。具体的には、２つの異なるＡＰＰＬ１／２低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞において、ＡＵＲＫＢ、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣＡ８、及びＫＩＦ２Ｃの発現が低下したことが確認された（図１Ｂ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ））。ｓｉＲＮＡ耐性構築物からの野生型ＡＰＰＬ１／２タンパク質の再発現は、ＡＰＰＬ１／２ ｓｉＲＮＡによる阻害をかなりの程度克服した（図１Ｂ）。
【0249】
ＣＰＣ複合体中でＡＵＲＫＢが機能するため、１０％ＦＢＳ中で成長した細胞の有糸分裂進行中、又は以下に特定されるように、タンパク質及びタンパク質－タンパク質相互作用のレベルを決定した。免疫ブロッティングを使用して、ＡＰＰＬ１／２ノックダウン細胞において、ＡＵＲＫＢ及びサバイビンプロテインレベルの低下が観察された（図１Ｃ（ｉ））。ＡＵＲＫＢ発現レベルがＡＰＰＬ１／２タンパク質に関連しているかどうかを調べるために、二重チミジンブロックを使用して、ＰＣ－３Ｕ細胞を同期させ、次にそれらを１０％ＦＢＳの正常培地に放出して、細胞周期の進行を追跡した。細胞をＡＰＰＬ１／２ ｓｉＲＮＡで処理すると、ＡＵＲＫＢの発現、及びその基質、Ｓｅｒ１０におけるヒストンＨ３（Ｈ３ｐＳ１０）のリン酸化は、細胞周期において劇的に減少した（図１Ｃ（ｉｉ））。サイクリンＢ１及びＴβＲＩの発現は、ＡＰＰＬ１／２の発現をサイレンシングした後に顕著に低下した（図１Ｃ（ｉｉ））。ＡＰＰＬ１／２ ｓｉＲＮＡで処理された細胞におけるＴβＲＩの発現の低減は、核ＴβＲＩ－ＩＣＤがそれ自身の発現を促進するという以前の報告と一致している１４、５５。これらの所見を確認すると、ノコダゾール処置によってＧ２／Ｍ期で停止された細胞もまた、ＡＵＲＫＢ及びＨ３ｐＳ１０のレベルの低下を示した（図１Ｆ）。興味深いことに、免疫蛍光顕微鏡及びｚスタックイメージング分析を使用して、ＡＰＰＬ１が、細胞動態構造（例えば、中心体）でＡＵＲＫＢと共局在することが観察された（図１Ｅ～Ｋ）。更に、共免疫沈降アッセイは、ＡＰＰＬ１がＴＧＦβ依存性様式でサバイビンと複合体を形成し、４８時間でピークに達することを示した（図１Ｌ）。
【0250】
本発明者らは、ＡＰＰＬ１がＴβＲＩ－ＩＣＤの核蓄積に必要であり、ＡＰＰＬ１のＣ末端部分がＴβＲＩに結合することを以前に報告した１６。これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＡＰＰＬ１のＮ末端及びＣ末端欠失がＡＵＲＫＢのレベルに与える効果を調査した。実際、Ｃ末端欠失ＡＰＰＬ１変異体の発現は、ＡＵＲＫＢのレベルを抑制したが、Ｎ末端欠失変異体は、そのような作用を及ぼさなかった（図１Ｍ）。更に、共免疫沈降実験により、ＢＡＲドメイン、ＰＨドメイン、及びＰＴＢドメインを含むＡＰＰＬ１の３つのドメイン全てに関連するＡＵＲＫＢを見出した（図１Ｎ～Ｏ）。４５、５６まとめると、これらのデータは、ＡＰＰＬ１がＡＵＲＫＢの発現に関連し、ＡＵＲＫＢの発現を調節し、核ＴβＲＩ－ＩＣＤに依存するＴＧＦＢＲ１の発現は、細胞周期依存性である１４、５５という見解を支持する。
【0251】
実施例２．ＴβＲＩは、有糸分裂中の細胞動態構造におけるＡＵＲＫＢと会合する
本発明者らは、ＡＰＰＬ１がＡＵＲＫＢと相互作用し（図１Ｅ～Ｋ及び１Ｏ）、ＴβＲＩと複合体を形成することを観察した。ＴβＲＩの発現は、細胞周期依存性であるため、ＴβＲＩが有糸分裂及び細胞質分裂中にＣＰＣとも会合するかどうかを調査した。ＰＣ－３Ｕ前立腺がん細胞及びＫＥＬＬＹ神経芽腫細胞で実施された免疫染色実験は、ＴβＲＩが細胞動態構造（ミッドゾーン及び中心体における）においてＡＵＲＫＢと共局在することを明らかにした（図２Ａ及びＢ）。終期中に、ＴβＲＩとサバイビンとの間で部分的な共局在が検出され（図２Ｃ）、ＴβＲＩとβ－チューブリンは、細胞動態構造（中心体）において明確に共局在した（図２Ｄ）。
本発明者らは、ＡＰＰＬ１がＡＵＲＫＢと相互作用し（図１Ｅ～Ｋ及び１Ｏ）、ＴβＲＩと複合体を形成することを観察した。ＴβＲＩの発現は、細胞周期依存性であるため、ＴβＲＩが有糸分裂及び細胞質分裂中にＣＰＣとも会合するかどうかを調査した。ＰＣ－３Ｕ前立腺がん細胞及びＫＥＬＬＹ神経芽腫細胞で実施された免疫染色実験は、ＴβＲＩが細胞動態構造（ミッドゾーン及び中心体における）においてＡＵＲＫＢと共局在することを明らかにした（図２Ａ及びＢ）。終期中に、ＴβＲＩとサバイビンとの間で部分的な共局在が検出され（図２Ｃ）、ＴβＲＩとβ－チューブリンは、細胞動態構造（中心体）において明確に共局在した（図２Ｄ）。
【0252】
ＡＰＰＬ１は、エンドソームから核に微小管を介してＴβＲＩ－ＩＣＤを輸送することが報告されている。したがって、無傷の微小管がＴβＲＩ局在に重要であるかどうかを調査し、微小管が冷間処理によって解重合されたとき、ＡＵＲＫＢとＴβＲＩとの間の相互作用は、細胞動態構造において見られなかった（図２Ｅ）。動的微小管は、後期中のＡＵＲＫＢの局在化にも重要であり、これは、以前の報告５８と一致している。注目すべきことに、ＴβＲＩの発現をサイレンシングすることは、細胞質分裂細胞の約４２％において異常な脱離をもたらしたが、ＳＢ５０５１２４によるＴβＲＩのキナーゼ活性の阻害は、脱離に影響しなかった（図２Ｆ）。更に、ＴβＲＩのノックダウンは、多核化をもたらし（図２Ｇ）、細胞分裂中のＴβＲＩの重要な機能の可能性を更に支持した。更に、ＴβＲＩ（ＴＧＦＢＲ１の発現）は、前立腺がんにおける有糸分裂紡錘体及びＧ２／Ｍチェックポイント遺伝子セットと強く相関した（図２Ｈ、Ｉ）。
【0253】
ｐ－Ｓｍａｄ２が中心体に局在することは見られず（図２Ｌ）、標準的なＴＧＦβシグナル伝達経路がそこで活性ではないことを示す。まとめると、これらの結果は、ＴβＲＩ及びＡＵＲＫＢが中心体で共局在し、この共局在が無傷の微小管細胞骨格に依存することを示唆する。
【0254】
ＳＢ５０５１２４によるＴβＲＩのキナーゼ活性の阻害がＡＵＲＫＢリン酸化を抑制したことも観察され（図２Ｌ、２Ｊ）、ＴβＲＩキナーゼ活性がＡＵＲＫＢ活性に重要であることが示唆された。相互に、インビトロキナーゼアッセイにおいて、Ｈｉｓ－ＡＵＲＫＢがグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）－ＴβＲＩをリン酸化したことが観察された（図２Ｋ）。細胞動態構造（例えば、中心体）（図２Ｌ）には、ｐＳｍａｄ２の局在は見られず、これは、標準的なＴＧＦβシグナル伝達経路がそこで活性ではないことを示している。まとめると、これらの結果は、ＴβＲＩ及びＡＵＲＫＢが細胞動態構造（例えば、中心体）で共局在し、この共局在が無傷の微小管細胞骨格に依存することを示唆する。
【0255】
実施例３．ＴＲＡＦ６は、Ｌｙｓ８５及びＬｙｓ８７上でのＡＵＲＫＢのポリユビキチン化を促進する
次に、ＡＵＲＫＢの発現に対するユビキチンＥ３－リガーゼＴＲＡＦ６の役割を調査した。ｓｉＲＮＡによるＴＲＡＦ６ノックダウンが、免疫ブロッティングによって実証されるように、細胞周期中にＨ３ｐＳ１０及びＡＵＲＫＢの両方の発現の低下をもたらすことが観察された（図３Ａ、Ｂ）。ＡＵＲＫＢは、共免疫沈殿アッセイによって決定されたように、ＴβＲＩ、ＡＰＰＬ１、及びＴＲＡＦ６と会合する（沈殿する）ことが見出された（図３Ｃ）。
次に、ＡＵＲＫＢの発現に対するユビキチンＥ３－リガーゼＴＲＡＦ６の役割を調査した。ｓｉＲＮＡによるＴＲＡＦ６ノックダウンが、免疫ブロッティングによって実証されるように、細胞周期中にＨ３ｐＳ１０及びＡＵＲＫＢの両方の発現の低下をもたらすことが観察された（図３Ａ、Ｂ）。ＡＵＲＫＢは、共免疫沈殿アッセイによって決定されたように、ＴβＲＩ、ＡＰＰＬ１、及びＴＲＡＦ６と会合する（沈殿する）ことが見出された（図３Ｃ）。
【0256】
ＡＵＲＫＢは、ユビキチン化を受けることが報告されており、これは、セントロメアから微小管への再局在５９及びクロマチン脱縮合及び核エンベロープ形成への関与に重要である６０。本発明者らは、ＰＣ－３Ｕ細胞が有糸分裂で停止したときに、ＡＵＲＫＢが、Ｌｙｓ４８結合（Ｋ４８結合）及びＬｙｓ６３結合（Ｋ６３結合）の両方のポリユビキチン化を受けたことを見出した（図３Ｄ（ｉ）及び３Ｄ（ｉｉ））。本発明者らはまた、ＴＲＡＦ６が、二重チミジンブロックから放出された後、有糸分裂進行中に自己ユビキチン化され、活性化され得るかどうかを調査した。内因性ＴＲＡＦ６は、ＰＣ－３Ｕ細胞が二重チミジンブロックから放出された１０～１２時間後に、すなわち、ＡＵＲＫＢが活性であるときと同時に自己ユビキチン化され（図３Ｅ）、ＴＲＡＦ６のユビキチン化がその触媒活性を可能にしているという現在の知識と一致している６２。
ＰＣ－３Ｕ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＴＲＡＦ６のノックダウンは、ＡＵＲＫＢのポリユビキチン化を抑制した（図３Ｆ）。免疫染色もまた、内因性ＴβＲＩが、ＰＣ－３Ｕ及びＭＥＦ細胞株の両方において、ＴＲＡＦ６依存性様式でＡＵＲＫＢと共局在することを明らかにした（図３Ｇ、３Ｈ）。
ＰＣ－３Ｕ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＴＲＡＦ６のノックダウンは、ＡＵＲＫＢのポリユビキチン化を抑制した（図３Ｆ）。免疫染色もまた、内因性ＴβＲＩが、ＰＣ－３Ｕ及びＭＥＦ細胞株の両方において、ＴＲＡＦ６依存性様式でＡＵＲＫＢと共局在することを明らかにした（図３Ｇ、３Ｈ）。
【0257】
ＴＲＡＦ６によるユビキチン化のコンセンサスパターン、すなわち、－（疎水性）－Ｋ－（疎水性）－Ｘ－Ｘ－（疎水性）－（極性）－（疎水性）－（極性）－（疎水性）であって、Ｋがユビキチン化部位であり、Ｘが任意の他のアミノ酸６３であるパターンは、ＡＵＲＫＢ（８４ＧＫＧＫＦＧＮＶＹＬ）（配列番号２３）に見られ、異なる種の間で保存される（図３Ｉ）。ＡＵＲＫＢ中のＫ８５及び／又はＫ８７がユビキチン化されているかどうか、及びその場合のその機能的結果（複数可）を調査するために、本発明者らは、Ｌｙｓ８５及び／又はＬｙｓ８７がアルギニン残基に変異した変異体を生成し、本発明者らは、これらの変異体において、ＡＵＲＫＢのユビキチン化が実際に減少したことを示すことができた（図３Ｊ（ｉ）及び３Ｊ（ｉｉ））。ＴＲＡＦ６とＡＵＲＫＢ変異体Ｋ８５、Ｋ８５／Ｋ８７、及びより少ない程度のＫ８７との間の相互作用もまた、共免疫沈降アッセイによって決定されたように、野生型ＡＵＲＫＢとの相互作用と比較して減少した（図３Ｋ）。更に、ＡＵＲＫＢによるＳ１０におけるＨ３のリン酸化は、ＡＵＲＫＢ Ｋ８５／８７Ｒ二重変異体を過剰発現する細胞において減少し（図３Ｌ（ｉ）及び３Ｌ（ｉｉ））、ＡＵＲＫＢのユビキチン化がそのキナーゼ活性に影響を及ぼすことを示唆している。Ｋ８５及びＫ８７は、ＡＴＰに結合するＡＵＲＫＢのグリシンリッチループに局在するため、本発明者らは、インビトロキナーゼアッセイにおいてＡＵＲＫＢ変異体を調査した。単一変異体及び二重Ｋ８５／８７Ｒ変異体の両方が、放射性リン酸塩を組み込むことが見出され（図２Ｍ（ｉ））、これらの変異体が、ＡＴＰの結合を妨害しなかったことを実証した。ＡＵＲＫＢ変異体がキナーゼ活性に本質的に欠陥があるかどうかを調査するために、組換えヒストンＨ３を基質として使用するインビトロキナーゼアッセイを行った。実験の対照として機能したキナーゼデッドＫ１０６Ｒを除く全てのＡＵＲＫＢ野生型及び変異体は、ヒストンＨ３をＳｅｒ１０でリン酸化することができ、それによってＡＵＲＫＢ変異体の保存された固有の活性を実証した（図３Ｍ（ｉｉ））。
【0258】
興味深いことに、ＴβＲＩは、細胞がＡＵＲＫＢ変異体を過剰発現したときには、細胞動態構造に局在せず（図３Ｎ）、これは、細胞動態構造（中心体）におけるＴβＲＩの動員には、ＡＵＲＫＢのユビキチン化が必要であることを示唆している。二重ＡＵＲＫＢ変異体（Ｋ８５／８７Ｒ）発現細胞は、野生型と比較して、より少ない４Ｎ ＤＮＡ含有量を示し、細胞の複製中のＫ８５及びＫ８７上のＡＵＲＫＢのポリユビキチン化の生物学的関連性を支持した（図３Ｏ）。全体として、これらの結果は、ＴＲＡＦ６が有糸分裂進行中に自己ユビキチン化され、Ｋ８５／Ｋ８７上でのＡＵＲＫＢのＴＲＡＦ６媒介性ユビキチン化がその活性に寄与し、細胞分裂中の細胞動態構造におけるＴβＲＩの局在を制御するという見解を支持する。
【0259】
実施例４．ＡＵＲＫＢの発現、及びＡＵＲＫＢ－ＴβＲＩ複合体の形成は、いくつかの腫瘍型において予後不良と相関する
注目すべきことに、ＡＵＲＫＢ ｍＲＮＡの高発現はまた、前立腺がん、ｃｃＲＣＣ、及び肺腺がんにおける予後不良と相関していた（図４Ｈ、Ｉ、Ｊ）。ＡＵＲＫＢ発現は、前立腺がん試料中の組織病理学的スコアリングに基づいて、グリソンスコアによって決定されたように、前立腺がんの悪性度と相関していた（より高いグリソンスコアは、より侵襲性の疾患を示す）（図４Ｇ）。
注目すべきことに、ＡＵＲＫＢ ｍＲＮＡの高発現はまた、前立腺がん、ｃｃＲＣＣ、及び肺腺がんにおける予後不良と相関していた（図４Ｈ、Ｉ、Ｊ）。ＡＵＲＫＢ発現は、前立腺がん試料中の組織病理学的スコアリングに基づいて、グリソンスコアによって決定されたように、前立腺がんの悪性度と相関していた（より高いグリソンスコアは、より侵襲性の疾患を示す）（図４Ｇ）。
【0260】
がん進行に対するＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩの重要性を調査するために、本発明者らは次に、臨床由来の試料におけるそれらの活性、発現、及び複合体形成を決定した。インサイチュ近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を使用することによって、ＡＵＲＫＢのＬｙｓ６３結合Ｋ６３結合）ポリユビキチン化が、前立腺がん、明細胞腎がん（ｃｃＲＣＣ）、又は肺がん（腺がん）を有する患者由来の組織において可視化され得るかどうかを調査した。全ての３つのがんタイプにおいて、対応する正常組織と比較して、多数のＬｙｓ６３結合ポリユビキチン化ＡＵＲＫＢ分子を観察した（図４Ａ（ｉ）及び４Ａ（ｉｉ））。更に、インサイチュＰＬＡによって、また、正常な前立腺組織、シグナルがほとんど観察されなかった（図４Ｃ）において侵襲性の低い疾患（図４Ｂ）を有する患者からのものと比較して、侵襲性前立腺がんを有する患者からの切片では著しくより多い数のＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩ複合体を識別した。
【0261】
異なる前立腺がんタイプにおける対象となる遺伝子の発現を更に調査するために、公開データベースを使用してバイオインフォマティクス分析を行った（図４Ｄ（ｉ）～（ｖ））。ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの両方の発現は、ＣＲＰＣ－腺がん（ＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏ）よりもＣＲＰＣ－神経内分泌（ＣＲＰＣ－ＮＥ）で高く、ＣＲＰＣ－ＮＥ患者が予後不良であるという観察と一致する（図４Ｄ（ｉｉｉ）。更に、ＡＵＲＫＢの発現は、ＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏの両方におけるＴＧＦＢＲ１の発現と相関した（図４Ｄ（ｉｖ））。原発腫瘍及び転移の両方を含むＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－ＡｄｅｎｏにおけるＴＧＦＢＲ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＴＲＡＦ６、ＶＰＳ４Ａ／Ｂ、及びＡＰＰＬ１／２の相対発現も示される（図４Ｄ（ｉ）及び（ｉｉ）。興味深いことに、ＡＰＰＬ１及びＡＵＲＫＡの発現は、ＣＲＰＣ－ＮＥにおいてはＴＧＦＢＲ１と相関したが、ＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏにおいては相関しなかった（図Ｓ４Ｄ（ｖ））。
【0262】
いくつかの肺がん及び乳がん細胞株において、ＲＢ１の喪失により、細胞は、それらの生存のためにＡＵＲＫＢに高度に依存することが報告されている６５。したがって、本発明者らは、前立腺がん組織におけるＲＢ１及びＡＵＲＫＢの発現を調査した。本発明者らは、ＲＢ１が、前立腺がんの１０％において欠失していること（図４Ｅ）、及び興味深いことに、ＡＵＲＫＢの発現が、神経内分泌前立腺がん（図４Ｄ（ｉｖ））を含む、前立腺がん（図４Ｆ）において、ＲＢ１と負の相関があることを見出した。ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの両方の発現は、ＣＲＰＣ－腺がん（ＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏ）よりもＣＲＰＣ－神経内分泌ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ（ＣＲＰＣ－ＮＥ）で高く、ＣＲＰＣ－ＮＥ患者が予後不良であるという観察と一致する（図４Ｄ（ｉｉｉ）。更に、ＡＵＲＫＢの発現は、ＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏの両方におけるＴＧＦＢＲ１の発現と相関した（図４Ｄ（ｉｉｉ））。原発腫瘍及び転移の両方を含むＣＲＰＣ－ＮＥ及びＣＲＰＣ－ＡｄｅｎｏにおけるＴＧＦＢＲ１、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＴＲＡＦ６、ＶＰＳ４Ａ／Ｂ、及びＡＰＰＬ１／２の相対発現も示される（図Ｄ（ｉ）及び（ｉｉ））。興味深いことに、ＡＰＰＬ１及びＡＵＲＫＡの発現は、ＣＲＰＣ－ＮＥにおいてＴＧＦＢＲ１と相関したが、ＣＲＰＣ－Ａｄｅｎｏにおいては相関しなかった（図４Ｄ（ｖ））。
【0263】
実施例５．ＡＰＰＬタンパク質、ＴβＲＩ、及びＴＲＡＦ６は、細胞の成長及び生存に影響を及ぼす
ＴβＲＩは、細胞の増殖及び生存において役割を果たすエンドサイトーシスアダプタータンパク質ＡＰＰＬ１と会合する。ＡＰＰＬ１とＴβＲＩとの間の相互作用は、がんの進行中に重要であるため、ＡＰＰＬタンパク質がＰＣ－３Ｕ細胞の増殖又は生存に影響を与えるかどうかを調査した。この目的のために、相対細胞数を測定するＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用した。結果は、ＡＰＰＬ１／２のノックダウンが細胞数の減少をもたらしたことを示し、ＡＰＰＬ１／２が細胞の増殖又は生存（生存能力）に必要であることを示唆する（図５Ａ）。
ＴβＲＩは、細胞の増殖及び生存において役割を果たすエンドサイトーシスアダプタータンパク質ＡＰＰＬ１と会合する。ＡＰＰＬ１とＴβＲＩとの間の相互作用は、がんの進行中に重要であるため、ＡＰＰＬタンパク質がＰＣ－３Ｕ細胞の増殖又は生存に影響を与えるかどうかを調査した。この目的のために、相対細胞数を測定するＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用した。結果は、ＡＰＰＬ１／２のノックダウンが細胞数の減少をもたらしたことを示し、ＡＰＰＬ１／２が細胞の増殖又は生存（生存能力）に必要であることを示唆する（図５Ａ）。
【0264】
細胞生存におけるＡＰＰＬ１／２の可能性な役割を更に調査するために、アポトーシス細胞を定量化し、それらのより多くが、対照よりもＴβＲＩ及びＡＰＰＬ１／２ノックダウン細胞培養物中にあることを見出した（図５Ｂ）。比較のために、上皮成長因子（ＥＧＦ）に対する細胞応答におけるＡＰＰＬ１／２の役割を調査し、これは、細胞増殖を促進し、ＡＰＰＬタンパク質の核トランスロケーションを促進する４５。ｓｉＲＮＡによるＡＰＰＬ１／２のノックダウンは、ＥＧＦで処理されたＰＣ－３Ｕ対照細胞と比較した場合、細胞数の低減をもたらし（図５Ｃ）、ＡＰＰＬタンパク質がＥＧＦ刺激細胞の増殖又は生存に重要であることを示唆し、前立腺がんの開始及び進行中のＡＰＰＬ１遺伝子発現及びタンパク質発現の増加の観察と一致する。ＰＣ－３Ｕ細胞のＴＲＡＦ６及びＴβＲＩノックダウン培養における細胞数の低減も観察され、ＴＲＡＦ６及びＴβＲＩが細胞の増殖又は生存に必要であることが示唆される（図５Ｄ）。
【0265】
要約すると、本発明者らは、形質転換成長因子βＩ型受容体（ＴβＲＩ）の切断を伴う非標準的なＴＧＦβ誘導性シグナル伝達経路に関連するがんタイプを有する患者を識別するための方法を提供する。
【0266】
考察
本発明者らは、ＴβＲＩがＴＲＡＦ６に依存する様式でタンパク質分解切断を受け、ＴβＲＩが残基Ｋ１７８上でＴＲＡＦ６によってポリユビキチン化されるときに核に入るＴβＲＩ－ＩＣＤを生成する、がん特異的シグナル伝達経路を以前に識別している１３～１５。また、ＡＰＰＬ１がそのＣ末端を介してＴβＲＩ－ＩＣＤと相互作用し、複合体がＴＲＡＦ６に依存する様式で微小管を介して核へ輸送することを報告している１６。核に入ると、ＴβＲＩ－ＩＣＤは、ＴβＲＩ及び他の遺伝子の発現を、それらのプロモーター領域に結合することによって誘導する１４。
本発明者らは、ＴβＲＩがＴＲＡＦ６に依存する様式でタンパク質分解切断を受け、ＴβＲＩが残基Ｋ１７８上でＴＲＡＦ６によってポリユビキチン化されるときに核に入るＴβＲＩ－ＩＣＤを生成する、がん特異的シグナル伝達経路を以前に識別している１３～１５。また、ＡＰＰＬ１がそのＣ末端を介してＴβＲＩ－ＩＣＤと相互作用し、複合体がＴＲＡＦ６に依存する様式で微小管を介して核へ輸送することを報告している１６。核に入ると、ＴβＲＩ－ＩＣＤは、ＴβＲＩ及び他の遺伝子の発現を、それらのプロモーター領域に結合することによって誘導する１４。
【0267】
ここで、インビトロでは、ＡＵＲＫＢを、ＣＲＰＣ細胞におけるＡＰＰＬ１／ＡＰＰＬ２依存性経路の標的遺伝子として特定した。ＴＲＡＦ６が、有糸分裂進行中にＣＲＰＣ細胞において自己ユビキチン化され、ＡＵＲＫＢの保存されたグリシンリッチ部分におけるＫ８５／Ｋ８７上でのＫ６３結合ポリユビキチン化を通じて、ＡＵＲＫＢキナーゼ活性に寄与することを見出した。更に、本発明者らは、驚くべきことに、ＡＰＰＬ１及びＴβＲＩ－ＩＣＤが、ＣＲＰＣ細胞での有糸分裂及び細胞質分裂中にＡＵＲＫＢと複合体を形成したことを見出した。加えて、ＡＰＰＬ１、ＴＲＡＦ６、又はＴＧＦＢＲ１のノックダウンは、ＣＲＰＣ細胞の増殖又は生存を阻害し、それらがインビトロでのＣＲＰＣの成長に必要であることを示唆している。
【0268】
有糸分裂は、非常に複雑で高度に制御された生物学的プロセスであり、オーロラキナーゼファミリーのメンバーは、染色体分離に必要であることが示されている４１、７５、７６。理論に拘束されることなく、本発明者らは、ＴβＲＩ－ＩＣＤが、Ｋ８５及びＫ８７上でのＡＵＲＫＢのポリユビキチン化を伴う、ＴＲＡＦ６に依存する様式で、有糸分裂及び細胞質分裂の調節に関与するために、ＡＵＲＫＢとともに作用するという仮説を立てる。Ｋ８５及びＫ８７の二重変異は、ＡＵＲＫＢのキナーゼ活性を抑制し、これらの残基のユビキチン化が、そのキナーゼ活性に寄与することを示唆する。しかしながら、２つのリジン残基の変異は、ＡＵＲＫＢの自己リン酸化を妨げなかった。これらのリジン残基は、ＡＵＲＫＢキナーゼのサブドメインＩにおける保存されたグリシンリッチモチーフＧ－Ｘ－Ｇ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｇに位置し、Ｋ８５は、第１のグリシン残基の後に位置し、Ｋ８７は、第２のグリシン残基の後に位置する７７。重要なことに、ＴＲＡＦ６は、自己ユビキチン化されていることが見出され、これは、ＡＵＲＫＢが活性であるのと同時に、有糸分裂進行中のその活性化と一致し、活性ＴＲＡＦ６が、がん細胞の増殖を調節するようにＡＵＲＫＢに影響を及ぼすという本発明者らの仮説と一致している。
【0269】
共焦点イメージングによって、ＡＰＰＬ１及びＡＵＲＫＢ、並びにＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩが、有糸分裂及び細胞質分裂中に中心体に共局在することを見出した。ＡＵＲＫＢ及びＴβＲＩの共局在は、ＴＲＡＦ６に依存する。更に、共免疫沈降によって、ＡＵＲＫＢが、ＡＰＰＬ１、ＴβＲＩ、及びＴＲＡＦ６と相互作用することが示された（図３Ｃ）。ＡＵＲＫＢがＡＰＰＬ１の３つのドメイン全てに結合することが見出され（図１Ｏ）、一方で、ＴβＲＩは、ＡＰＰＬ１のＰＴＢドメインに結合する。これらの相互作用は、有糸分裂進行及び細胞質分裂中に動的であり、時間の経過とともにこれらの複合体の正確な構成は、決定されていないままである。しかしながら、我々のデータは、有糸分裂進行中にＡＵＲＫＢ及びＴＲＡＦ６が会合して、ＡＵＲＫＢ活性に寄与し、後期終末期及び細胞質分裂中に、ＡＰＰＬ１、ＡＵＲＫＢ、及びＴβＲＩが中心体に局在したことを示唆する。更に、中心体でのＴβＲＩ局在は、ＡＵＲＫＢのＫ８５及びＫ８７上でのＫ６３結合ポリユビキチン化に依存しており、ＴβＲＩがユビキチン化されたＡＵＲＫＢに関連することが示唆された（図６）。
【0270】
以前の研究では、ヒトアンドロゲン依存性前立腺がん細胞株であるＬｎＣａＰにおけるＡＵＲＫＢのノックダウンが、腫瘍細胞の生存に影響を及ぼさないことが示されている。対照的に、より侵襲性のアンドロゲン非依存性ＰＣ３細胞におけるＡＵＲＫＢのノックダウンは、インビトロでのアポトーシスをもたらし、インビボでの異種移植片ヌードマウスモデルにおける腫瘍成長を低減させ８１、アンドロゲン非依存性前立腺がん細胞におけるＡＵＲＫＢの重要な役割を示唆する。以前の研究では、ＣＰＲＣにおけるＡＵＲＫＢ関連の腫瘍促進効果及び生存促進効果が記載された８２。この結果、及びＴβＲ１－ＡＰＰＬ１経路がＡＵＲＫＢ発現を制御し、ＴβＲＩがＡＵＲＫＢと相互作用するという現在の知見により、本発明者らは、ＴβＲＩが、細胞質分裂及び細胞分裂中のその役割を通じて部分的に細胞増殖を促進するという仮説を立てる。したがって、正常上皮細胞における標準的なＴβＲＩ－Ｓｍａｄシグナル伝達経路によって形質導入される成長阻害効果は、本明細書で報告されるように、有糸分裂進行及び細胞質分裂中の、ＡＵＲＫＢとの複合体におけるＴβＲＩ－ＩＣＤの役割とは異なる。ＴβＲＩのノックダウンが、がん細胞の多核化をもたらしたという観察は、がん細胞の細胞質分裂におけるＴβＲＩの機能的役割を強調する。
【0271】
ＡＵＲＫＢは、前立腺がんを含む様々ながんにおいてしばしば過剰発現される。有糸分裂の誤りは、腫瘍形成の重要な特徴であるゲノム不安定性をもたらし得る８３。述べたように、オーロラキナーゼは、中心体成熟、双極紡錘体アセンブリ、染色体縮合、アラインメント、及び細胞質分裂を含む、有糸分裂の複数のステップに関与する。有糸分裂を調節するそれらの特定の役割のため、それらは、がん治療における標的候補であり、阻害剤は、臨床試験で試験される３０、３１、４１。ＡＵＲＫＢのより高い発現はまた、前立腺がんのより高い侵襲性及びより低い患者生存を示した（図４）。ＴＧＦβは、細胞増殖を阻害し、正常な上皮細胞においてアポトーシスを誘導するが、しばしば進行がんの成長を促進し、ＴβＲＩキナーゼ阻害剤は、異なるがん細胞株の成長をブロックすることが見出されている。更に、前立腺がん患者では、ＴＧＦβＲＩの発現は、有糸分裂紡錘体及びＧ２／Ｍチェックポイントと高度に相関した（図２）。更に、ＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの発現は、ＣＲＰＣ腺がんよりも神経内分泌型のＣＲＰＣで高く、神経内分泌型のＣＲＰＣ患者の予後不良と一致した（図４）。ＴβＲＩ及びＡＵＲＫＢ複合体の量は、より侵襲性の疾患を示す、より高いグリソンスコアを有する前立腺がん患者からの切片においてより頻繁に観察された（図４）。要約すると、本データは、ＡＵＲＫＢ Ｋ８５及びＫ８７Ｒ変異体がＴβＲＩを中心体に動員しなかったため、ＡＵＲＫＢとＴβＲＩが、細胞の有糸分裂及び細胞質分裂中に機能的複合体を形成して、細胞増殖に関与する及びＡＵＲＫＢのＴＲＡＦ誘導ユビキチン化が重要な役割を果たすという仮説を支持する（図３）。
【0272】
まとめると、本明細書で提示される知見は、がん細胞増殖を調節する際の、すなわち、細胞が有糸分裂に入るときにＡＵＲＫＢとの相互作用によるＴβＲＩの以前に知られていなかった機能を実証する。この機能は、ＴＧＦβに応答する、標準的なＴＧＦβ－Ｓｍａｄシグナル伝達経路を介した転写応答の上流調節因子としてのＴβＲＩの周知の機能とは明らかに異なる。ＴβＲＩと会合するＴＲＡＦ６は、特定の残基（Ｌｙｓ８５及びＬｙｓ８７）（Ｋ８５及びＫ８７）上でのＡＵＲＫＢのポリユビキチン化を引き起こし、それによってＨ３ｐＳ１０によって測定されるＡＵＲＫＢ活性に寄与する（図６）。がん細胞の細胞質分裂におけるＴβＲＩ－ＴＲＡＦ６－ＡＰＰＬ１－ＡＵＲＫＢ複合体に対する重要な機能の識別は、この経路に依存する侵襲性がんのための新規のバイオマーカー及び治療戦略を開発するための基礎を提供する。
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１２ Ｈａｍｉｄｉ Ａ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｔｈａｋｕｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－β ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＴＲＡＦ６－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ８５α．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７；１０：ｅａａｌ４１８６．
１３ Ｍｕ Ｙ，Ｓｕｎｄａｒ Ｒ，Ｔｈａｋｕｒ Ｎ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｅｓ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｏ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｔｓ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１１；２：３３０．
１４ Ｇｕｄｅｙ ＳＫ，Ｓｕｎｄａｒ Ｒ，Ｍｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ－Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＴＧＦβ Ｔｙｐｅ Ｉ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ ２０１４；７：ｒａ２．
１５ Ｓｕｎｄａｒ Ｒ，Ｇｕｄｅｙ ＳＫ，Ｈｅｌｄｉｎ ＣＨ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＴＧＦβ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ Ｌｙｓ６３－ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｙｓ１７８ ｉｎ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２０１５；１４：５５４－５６５．
１６ Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｍｕ Ｙ，Ｌｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ＴＧＦβ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＴＧＦβ ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６；７：２７９－２９２．
１７ Ｓｉｔａｒａｍ ＲＴ，Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ Ｐ，Ｌａｎｄｓｔｒｏｍ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１６；７：３５９１７－３５９３１．
１８ Ｄａｖｉｄ ＣＪ，Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ．Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ＴＧＦβ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１８；１９：４１９－４３５．
１９ Ｄａｔｔｏ ＭＢ，Ｌｉ Ｙ，Ｐａｎｕｓ ＪＦ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐ２１ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐ５３－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９５；９２：５５４５－５５４９．
２０ Ｓｅｏａｎｅ Ｊ，Ｐｏｕｐｏｎｎｏｔ Ｃ，Ｓｔａｌｌｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．ＴＧＦβ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｍｙｃ，Ｍｉｚ－１ ａｎｄ Ｓｍａｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ＣＤＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐ１５ＩＮＫ４ｂ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；３：４００－４０８．
２１ Ｄｅｒｙｎｃｋ Ｒ，Ｔｕｒｌｅｙ ＳＪ，Ａｋｈｕｒｓｔ ＲＪ．ＴＧＦβ ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０２１；１８：９－３４．
２２ Ｍｏｕｓｔａｋａｓ Ａ，Ｈｅｌｄｉｎ ＣＨ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＴＧＦβ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ ２０１６；５：６３．
２３ Ｄｏｎｇｒｅ Ａ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１９；２０：６９－８４．
２４ Ｓｔｒｕｔｚ Ｆ，Ｚｅｉｓｂｅｒｇ Ｍ，Ｒｅｎｚｉｅｈａｕｓｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＴＧＦ－β１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｖｉａ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＦＧＦ－２）．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ２００１；５９：５７９－５９２．
２５ Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｓ，Ｉｗａｄａｔｅ Ｍ，Ｋｏｎｄｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＳＢ－４３１５４２ ａｎｄ Ｇｌｅｅｖｅｃ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：７７９１－７７９８．
２６ Ｉｋｕｓｈｉｍａ Ｈ，Ｍｉｙａｚｏｎｏ Ｋ． ＴＧＦβ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ：ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｅｂ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１０；１０：４１５－４２４．
２７ Ｓｉｎｔｉｃｈ ＳＭ，Ｌａｍｍ ＭＬ，Ｓｅｎｓｉｂａｒ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β１－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，ＴＳＵ－Ｐｒ１：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９９；１４０：３４１１－３４１５．
２８ Ｗｉｌｄｉｎｇ Ｇ，Ｚｕｇｍｅｉｅｒ Ｇ，Ｋｎａｂｂｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９８９；６２：７９－８７．
２９ Ｍａｌｌｉｋａｒｊｕｎａ Ｐ，Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ ＴＳ，Ａｒｉｐａｋａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＴＧＦ－β ｔｙｐｅ Ｉ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－α ｍｅｄｉａｔｅｓ ａ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｃｒｏｓｓｔａｌｋ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ２０１９；１８：２１４１－２１５６．
３０ Ｂｏｒａｈ ＮＡ，Ｒｅｄｄｙ ＭＭ．Ａｕｒｏｒａ Ｋｉｎａｓｅ Ｂ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０２１；２６．
３１ Ｍｏｕ ＰＫ，Ｙａｎｇ ＥＪ，Ｓｈｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ Ａ，ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０２１；５３：８３５－８４７．
３２ Ｙｏｏ Ｓ，Ｓｉｎｈａ Ａ，Ｙａｎｇ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓ ｉｎｔｅｒｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０２２；１３：１５９２．
３３ Ｃａｒｍｅｎａ Ｍ，Ｗｈｅｅｌｏｃｋ Ｍ，Ｆｕｎａｂｉｋｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ （ＣＰＣ）：ｆｒｏｍ ｅａｓｙ ｒｉｄｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ｇｏｄｆａｔｈｅｒ ｏｆ ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１２；１３：７８９－８０３．
３４ Ｔｒｉｖｅｄｉ Ｐ，Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ ＰＴ．Ａ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｐａｓｓｅｎｇｅｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０２０；３０：６７６－６８７．
３５ Ａｄａｍｓ ＲＲ，Ｗｈｅａｔｌｅｙ ＳＰ，Ｇｏｕｌｄｓｗｏｒｔｈｙ ＡＭ，ｅｔ ａｌ．ＩＮＣＥＮＰ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ Ａｕｒｏｒａ－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ＡＩＲＫ２ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｉｔ ｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ，ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｐｉｎｄｌｅ ａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｕｒｒｏｗ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ２０００；１０：１０７５－１０７８．
３６ Ｂｉｓｈｏｐ ＪＤ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＪＭ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ Ｉｎｎｅｒ Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＩＮＣＥＮＰ） ｂｙ ｔｈｅ Ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２；２７７：２７５７７－２７５８０．
３７ Ｅｌｋｉｎｓ ＪＭ，Ｓａｎｔａｇｕｉｄａ Ｓ，Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ＩＮＣＥＮＰ ａｎｄ ＶＸ－６８０．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１２；５５：７８４１－７８４８．
３８ Ａｂｄｕｌ Ａｚｅｅｚ ＫＲ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ Ｓ，Ｙｕ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ Ｂ／Ｃ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ＩＮＣＥＮＰ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９；１０：３１６６．
３９ Ｇｏｌｄｅｎｓｏｎ Ｂ，Ｃｒｉｓｐｉｎｏ ＪＤ．Ｔｈｅ ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１５；３４：５３７－５４５．
４０ Ｆｕｌｌｅｒ ＢＧ，Ｌａｍｐｓｏｎ ＭＡ，Ｆｏｌｅｙ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｄｚｏｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｒｏｒａ Ｂ ｉｎ ａｎａｐｈａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５３：１１３２－１１３６．
４１ Ｔａｎｇ Ａ，Ｇａｏ Ｋ，Ｃｈｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ：ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：２３９３７－２３９５４．
４２ Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｓ，Ｈａｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｒｕｕｔｈ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ （ＡＬＫ） ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ：ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＡＬＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｔｕｍｏｒｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１５；５４：９９－１０９．
４３ Ｆｒａｎｚｅｎ Ｐ，Ｉｃｈｉｊｏ Ｈ，Ｍｉｙａｚｏｎｏ Ｋ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β１－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９９３；２０７：１－７．
４４ Ｈｅｎｇｅｖｅｌｄ ＲＣ，Ｈｅｒｔｚ ＮＴ，Ｖｒｏｍａｎｓ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｋｉｎａｓｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｐａｓｓｅｎｇｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１２；１１：４７－５９．
４５ Ｍｉａｃｚｙｎｓｋａ Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉｄｉｓ Ｓ，Ｇｉｎｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｌｉｎｋ Ｒａｂ５ ｔｏ ｎｕｃｌｅａｒ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉａ ａｎ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ ２００４；１１６：４４５－４５６．
４６ Ｅｒｄｍａｎｎ ＫＳ，Ｍａｏ Ｙ，ＭｃＣｒｅａ ＨＪ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｏｗｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＯＣＲＬ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２００７；１３：３７７－３９０．
４７ Ｙｕ Ｇ，Ｗａｎｇ ＬＧ，Ｈａｎ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ：ａｎ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｍｅｓ ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ．ＯＭＩＣＳ ２０１２；１６：２８４－２８７．
４８ Ｌｉｂｅｒｚｏｎ Ａ，Ｂｉｒｇｅｒ Ｃ，Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｈａｌｌｍａｒｋ Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ ２０１５；１：４１７－４２５．
４９ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ＲＬ，Ｈｅａｔｈ ＡＰ，Ｆｅｒｒｅｔｔｉ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｓｈａｒｅｄ Ｖｉｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｄａｔａ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６；３７５：１１０９－１１１２．
５０ Ｃｏｌａｐｒｉｃｏ Ａ，Ｓｉｌｖａ ＴＣ，Ｏｌｓｅｎ Ｃ，ｅｔ ａｌ．ＴＣＧＡｂｉｏｌｉｎｋｓ：ａｎ Ｒ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＴＣＧＡ ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１６；４４：ｅ７１．
５１ Ｋａｓｓａｍｂａｒａ Ａ． ｇｇｐｕｂｒ：‘ｇｇｐｌｏｔ２’ Ｂａｓｅｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｄｙ Ｐｌｏｔｓ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．４．０．２０２０． ｈｔｔｐｓ：／／ＣＲＡＮ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｇｇｐｕｂｒ．
５２ Ｂｅｌｔｒａｎ Ｈ，Ｐｒａｎｄｉ Ｄ，Ｍｏｓｑｕｅｒａ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｃｌｏｎａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１６；２２：２９８－３０５．
５３ Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．２０１３． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．
５４ Ｒａｆａｔｍａｎｅｓｈ Ａ，Ｂｅｈｊａｔｉ Ｍ，Ｍｏｂａｓｓｅｒｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｓ ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｅｄｇｅｄ ｓｗｏｒｄ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０２０；２３５：７２５－７４４．
５５ Ｇｕｄｅｙ ＳＫ，Ｓｕｎｄａｒ Ｒ，Ｈｅｌｄｉｎ ＣＨ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ－ｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｎａｉｌ１ ａｒｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＴＧＦβ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：９７７０３－９７７２６．
５６ Ｌｉｕ Ｚ，Ｘｉａｏ Ｔ，Ｐｅｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．ＡＰＰＬｓ：Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｊｕｓｔ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ２０１７；３２：７６－８４．
５７ Ｆａｂｂｒｏ Ｍ，Ｚｈｏｕ ＢＢ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｄｋ１／Ｅｒｋ２－ ａｎｄ Ｐｌｋ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｅｐ５５，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｍｉｄｂｏｄｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２００５；９：４７７－４８８．
５８ Ｍｏｒａ－Ｂｅｒｍｕｄｅｚ Ｆ，Ｇｅｒｌｉｃｈ Ｄ，Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｊ．Ｍａｘｉｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ｏｃｃｕｒｓ ｂｙ ａｘｉａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｉｎ ａｎａｐｈａｓｅ ａｎｄ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７；９：８２２－８３１．
５９ Ａｆｏｎｓｏ Ｏ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ＡＣ，Ｍａｉａｔｏ Ｈ． Ｌａｔｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ２０１７；１２６：９３－１０３．
６０ Ｒａｍａｄａｎ Ｋ，Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｒ，Ｓｐｉｇａ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｄｃ４８／ｐ９７ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４５０：１２５８－１２６２．
６１ Ｈｏｎｄａ Ｒ，Ｋｏｒｎｅｒ Ｒ，Ｎｉｇｇ ＥＡ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｕｒｏｒａ Ｂ，ＩＮＣＥＮＰ，ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｉｎ ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００３；１４：３３２５－３３４１．
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４１ Ｔａｎｇ Ａ，Ｇａｏ Ｋ，Ｃｈｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ：ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：２３９３７－２３９５４．
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５７ Ｆａｂｂｒｏ Ｍ，Ｚｈｏｕ ＢＢ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｄｋ１／Ｅｒｋ２－ ａｎｄ Ｐｌｋ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｅｐ５５，ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｔｓ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｔｏ ｍｉｄｂｏｄｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ ２００５；９：４７７－４８８．
５８ Ｍｏｒａ－Ｂｅｒｍｕｄｅｚ Ｆ，Ｇｅｒｌｉｃｈ Ｄ，Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｊ．Ｍａｘｉｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ｏｃｃｕｒｓ ｂｙ ａｘｉａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ ｉｎ ａｎａｐｈａｓｅ ａｎｄ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００７；９：８２２－８３１．
５９ Ａｆｏｎｓｏ Ｏ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ＡＣ，Ｍａｉａｔｏ Ｈ． Ｌａｔｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ．Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ ２０１７；１２６：９３－１０３．
６０ Ｒａｍａｄａｎ Ｋ，Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｒ，Ｓｐｉｇａ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．Ｃｄｃ４８／ｐ９７ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｋｉｎａｓｅ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４５０：１２５８－１２６２．
６１ Ｈｏｎｄａ Ｒ，Ｋｏｒｎｅｒ Ｒ，Ｎｉｇｇ ＥＡ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｕｒｏｒａ Ｂ，ＩＮＣＥＮＰ，ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｉｎ ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ ２００３；１４：３３２５－３３４１．
６２ Ｗａｎｇ Ｃ，Ｄｅｎｇ Ｌ，Ｈｏｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＴＡＫ１ ｉｓ ａ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ ＭＫＫ ａｎｄ ＩＫＫ．Ｎａｔｕｒｅ ２００１；４１２：３４６－３５１．
６３ Ｊａｄｈａｖ Ｔ，Ｇｅｅｔｈａ Ｔ，Ｊｉａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｉｔｅ ｆｏｒ ＴＲＡＦ６／ｐ６２ ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００８；３７１：５２１－５２４．
６４ Ｋｉｍ Ｗ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＥＪ，Ｈｕｔｔｌｉｎ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０１１；４４：３２５－３４０．
６５ Ｏｓｅｒ ＭＧ，Ｆｏｎｓｅｃａ Ｒ，Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ＡＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｓ Ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ＲＢ１ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｇｅｎｅ Ａｒｅ Ｈｙｐｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ａｕｒｏｒａ Ｂ Ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１９；９：２３０－２４７．
６６ Ａｌａｎｅｅ Ｓ，Ｍｏｏｒｅ Ａ，Ｎｕｔｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１５；３５：４１４５－４１５０．
６７ Ｔｓａｕｒ Ｉ，Ｈｅｉｄｅｇｇｅｒ Ｉ，Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ － Ａｒｅ ｗｅ ｒｅａｄｙ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｉｇｈｔ ｎｏｗ？ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ２０１９；７５：２０－２６．
６８ Ｄｅｅｐａ ＳＳ，Ｄｏｎｇ ＬＱ．ＡＰＰＬ１：ｒｏｌｅ ｉｎ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００９；２９６：Ｅ２２－３６．
６９ Ｊｏｈｎｓｏｎ ＩＲＤ，Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ－Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＥＪ，Ｋｅｅｇａｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ？ Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１５；６：３７９１９－３７９２９．
７０ Ｓｔａｒｃｚｙｎｏｗｓｋｉ ＤＴ，Ｌｏｃｋｗｏｏｄ ＷＷ，Ｄｅｌｅｈｏｕｚｅｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ ｉｓ ａｎ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｔｈｅ ＲＡＳ ａｎｄ ＮＦ－κＢ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１１；１２１：４０９５－４１０５．
７１ Ａｒｉｐａｋａ Ｋ，Ｇｕｄｅｙ ＳＫ，Ｚａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｏ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｗｎｔ３ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ２０１９；４５：１９２－２０７．
７２ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ．ＴＧＦＢＲ１ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１０６７９９－ＴＧＦＢＲ１／ｐａｔｈｏｌｏｇｙ／ｂｒｅａｓｔ＋ｃａｎｃｅｒ （ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｍａｙ １６ ２０２２）．
７３ Ｙａｎｇ ＷＬ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｃｈａｎ ＣＨ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｅ３ ｌｉｇａｓｅ ＴＲＡＦ６ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ａｋｔ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００９；３２５：１１３４－１１３８．
７４ Ｒｏｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｄ，Ｗｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．ＴＲＡＦ６ ｉｓ ｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ ２０１４；３１：２６０．
７５ Ｋｒｅｎｎ Ｖ，Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ Ａ． Ｔｈｅ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｉ－ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｉｎｄｌｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ ２０１５；５：２２５．
７６ Ｗｉｌｌｅｍｓ Ｅ，Ｄｅｄｏｂｂｅｌｅｅｒ Ｍ，Ｄｉｇｒｅｇｏｒｉｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ ｋｉｎａｓｅｓ：ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｖ ２０１８；１３：７．
７７ Ｈａｎｋｓ ＳＫ，Ｈｕｎｔｅｒ Ｔ． Ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：ｋｉｎａｓｅ （ｃａｔａｌｙｔｉｃ） ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９５；９：５７６－５９６．
７８ Ｂｏｓｅ Ａ，Ｓｕｄｅｖａｎ Ｓ，Ｒａｏ ＶＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ Ｔｉｐ６０ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｋｉｎａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ ２０１９；４４：１４７．
７９ Ｃｈｅｅｔｈａｍ ＧＭ，Ｋｎｅｇｔｅｌ ＲＭ，Ｃｏｌｌ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ－２，ａｎ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００２；２７７：４２４１９－４２４２２．
８０ Ｙａｓｕｉ Ｙ，Ｕｒａｎｏ Ｔ，Ｋａｗａｊｉｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｓｉｔｅ ｏｆ Ａｕｒｏｒａ－Ｂ ｉｓ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００４；２７９：１２９９７－１３００３．
８１ Ａｄｄｅｐａｌｌｉ ＭＫ，Ｒａｙ ＫＢ，Ｋｕｍａｒ Ｂ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡｉ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ ＡＵＲＫＢ ａｎｄ ＥＧＦＲ ｓｈｏｗｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０；１７：３５２－３５９．
８２ Ｃｈｉｅｆｆｉ Ｐ，Ｃｏｚｚｏｌｉｎｏ Ｌ，Ｋｉｓｓｌｉｎｇｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｕｒｏｒａ Ｂ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２００６；６６：３２６－３３３．
８３ Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ．Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ２０１１；１４４：６４６－６７４．
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図2-8】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図4-6】
【図4-7】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】