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▶ フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-26
(54)【発明の名称】環状ポリリボヌクレオチドを濃縮する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240619BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240619BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12Q1/6806 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023571506
(86)(22)【出願日】2022-05-18
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 US2022029831
(87)【国際公開番号】W WO2022245942
(87)【国際公開日】2022-11-24
(31)【優先権主張番号】63/190,060
(32)【優先日】2021-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520445473
【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デ ブール，アレクサンドラ・ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】ホバート，エリッサ・マグダレン
(72)【発明者】
【氏名】デピーター，ジョセフ・アーサー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR14
4B063QR50
4B063QS16
4B063QX02
(57)【要約】
本開示の方法を使用すると、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとの混合物中の環状ポリリボヌクレオチド集団を濃縮することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、（ａ）環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；
（ｂ）前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化すること；及び
（ｃ）前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化すること
を含み；
それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法。
【請求項2】
前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分の５’末端が一リン酸部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
消化するステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記消化するステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の後に実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
前記５’エキソヌクレアーゼが５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記５’エキソヌクレアーゼがＸｒｎ－１である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記３’エキソヌクレアーゼがＲＮアーゼＲである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記３’エキソヌクレアーゼがＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
消化するステップ（ｂ）が３０分～９０分間実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
消化するステップ（ｃ）が３０分～９０分間実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記消化するステップ（ｂ）が約３７℃の温度で実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記消化するステップ（ｃ）が約３７℃の温度で実施される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）が、Ｍｇ２＋を含む消化用緩衝液中で行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記消化用緩衝液中の前記Ｍｇ２＋が、０．０５ｍＭ～１ｍＭの濃度を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）が、ジチオスレイトールを含む消化用緩衝液中で行われる、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ジチオスレイトールが、０．１ｍＭ～５ｍＭの濃度を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
ステップ（ｂ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１２Ｕ～０．１Ｕの量である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（ｂ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０２５Ｕの量である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ステップ（ｃ）の前記３’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～２Ｕの量である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
ステップ（ｃ）の前記３’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．５Ｕの量である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ポリヌクレオチドの４０％～９５％である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ポリヌクレオチドの６０％～９０％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ヌクレオチドの７０％～９０％である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）が７０％～１００％である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、（ａ）環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；
（ｂ）前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること、及び
（ｃ）前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化すること
を含み、
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）が、０．０５ｍＭ～１ｍＭ Ｍｇ２＋及び／又は０．１ｍＭ～５ｍＭジチオスレイトールを含む消化用緩衝液中で実施され；
それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法。
【請求項27】
消化するステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記消化するステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の後に実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）が同時に実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
前記５’エキソヌクレアーゼが１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記３’エキソヌクレアーゼが１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量である、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分の５’末端が一リン酸部分を含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記５’エキソヌクレアーゼが５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記５’エキソヌクレアーゼがＸｒｎ－１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記３’エキソヌクレアーゼがＲＮアーゼＲである、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記３’エキソヌクレアーゼがＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔである、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
消化するステップ（ｂ）が３０分～９０分間実施される、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
消化するステップ（ｃ）が３０分～９０分間実施される、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記消化するステップ（ｂ）が約３７℃の温度で実施される、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記消化するステップ（ｃ）が約３７℃の温度で実施される、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
ステップ（ｂ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１２Ｕ～０．１Ｕの量である、請求項２６～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
ステップ（ｂ）の前記５’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０２５Ｕの量である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
ステップ（ｃ）の前記３’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～２Ｕの量である、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
ステップ（ｃ）の前記３’エキソヌクレアーゼが、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．５Ｕの量である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ポリヌクレオチドの４０％～９５％である、請求項２６～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ポリヌクレオチドの６０％～９０％である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、前記環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）が全ヌクレオチドの７０％～９０％である、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
消化するステップ（ｂ）及び（ｃ）の後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）が７０％～１００％である、請求項２６～４７のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが６，４３８バイトである２０２２年５月１８日に作成された５１５０９－０３４ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿１８＿２２＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが６，４３８バイトである２０２２年５月１８日に作成された５１５０９－０３４ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿５＿１８＿２２＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性の増加を示すため、線状ポリリボヌクレオチドと比較して半減期が長くなる。環状ポリリボヌクレオチドは内因的に発生することが公知であり、又は外因的に環状化することもできる。外因的な環状化反応では、結果として、環状化に成功したポリリボヌクレオチドに一部の残留している線状ポリリボヌクレオチドが加わった混合物が生じる。医薬品としての環状ポリリボヌクレオチド調製物中に線状ポリリボヌクレオチドが存在すると、予期せぬ望ましくない効果がもたらされ得る。したがって、線状ポリリボヌクレオチドと比べて環状ポリリボヌクレオチドを濃縮し、分離し、及び／又は精製する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。詳細には、本開示は、線状及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物から、線状ポリリボヌクレオチドを５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼで消化することによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。
【0004】
一態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕ（例えば、０．０１Ｕ～０．１６Ｕ、０．０１Ｕ～０．１２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０．８Ｕ、０．０１Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１Ｕ～０．０２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０１２Ｕ、０．０２Ｕ～０．２Ｕ、０．０４Ｕ～０．２Ｕ、０．０．０８Ｕ～０．２Ｕ、０．１２Ｕ～０．２Ｕ、及び０．１６Ｕ～０．２Ｕ）の量の５’エキソヌクレアーゼで消化すること；及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕ（例えば、０．４Ｕ～３．６Ｕ、０．４Ｕ～３．２Ｕ、０．４Ｕ～２．８Ｕ、０．４Ｕ～２．４Ｕ、０．４Ｕ～２Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．８Ｕ～４Ｕ、１．２Ｕ～４Ｕ、１．６Ｕ～４Ｕ、２Ｕ～４Ｕ、２４Ｕ～４Ｕ、２．８Ｕ～４Ｕ、３．２Ｕ～４Ｕ、３．６Ｕ～４Ｕ、及び０．４Ｕ～０．６Ｕ）の量の３’エキソヌクレアーゼで消化することを含み；それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法を提供する。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分の５’末端は、一リン酸部分を含む。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化することの前に実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化することの後に実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップと、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化することとは、同時に実施される。
【0005】
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＲである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔである。
【0006】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、７５分～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、７５分～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。
【0007】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0008】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を、２．５μｇのポリリボヌクレオチド当たり１Ｕ～１０Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、Ｍｇ２＋を含む消化用緩衝液中で行われる。一部の実施形態において、消化用緩衝液中のＭｇ２＋は、０．０５ｍＭ～１ｍＭ（例えば、０．０５ｍＭ～０．８ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．６ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．４ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．２ｍＭ～１ｍＭ、０．４ｍＭ～１ｍＭ、０．６ｍＭ～１ｍＭ、及び０．８ｍＭ～１ｍＭ）の濃度を有する。
【0009】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、ジチオスレイトールを含む消化用緩衝液中で行われる。一部の実施形態において、ジチオスレイトールは、０．１ｍＭ～５ｍＭ（例えば、０．１ｍＭ～４ｍＭ、０．１ｍＭ～３ｍＭ、０．１ｍＭ～２ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、０．５ｍＭ～５ｍＭ、１ｍＭ～５ｍＭ、２ｍＭ～５ｍＭ、３ｍＭ～５ｍＭ、又は４ｍＭ～５ｍＭ）の濃度を有する。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１２Ｕ～０．１Ｕ（例えば、０．０１２Ｕ～０．０８Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０６Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１２Ｕ～０．１Ｕ、０．０２Ｕ～０．１Ｕ、０．０４Ｕ～０．１Ｕ、０．０６Ｕ～０．１Ｕ、０．０８Ｕ～０．１５Ｕ）の量である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０２５Ｕの量である。
【0010】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～２Ｕ（例えば、１Ｕ～１．８Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．４Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～１Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．４Ｕ～０．６Ｕ、０．６Ｕ～２Ｕ、０．８Ｕ～２．５Ｕ、１Ｕ～２Ｕ、１．２Ｕ～２Ｕ、１．４Ｕ～２Ｕ、１．６Ｕ～約２Ｕ、１．８Ｕ～２Ｕ）の量である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．５Ｕの量である。
【0011】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの４０％～９５％（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの６０％～９０％（例えば、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～９０％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ヌクレオチドの７０％～９０％（例えば、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～１００％（例えば、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）である。
【0012】
別の態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること、及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化することを含む方法において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップが、０．０５ｍＭ～１ｍＭ（例えば、０．０５ｍＭ～０．８ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．６ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．４ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．２ｍＭ～１ｍＭ、０．４ｍＭ～１ｍＭ、０．６ｍＭ～１ｍＭ、及び０．８ｍＭ～１ｍＭ）Ｍｇ２＋及び／又は０．１ｍＭ～５ｍＭ（例えば、０．１ｍＭ～４ｍＭ、０．１ｍＭ～３ｍＭ、０．１ｍＭ～２ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、０．５ｍＭ～５ｍＭ、１ｍＭ～５ｍＭ、２ｍＭ～５ｍＭ、３ｍＭ～５ｍＭ、又は４ｍＭ～５ｍＭ）ジチオスレイトールを含む消化用緩衝液中で実施され；それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法を提供する。
【0013】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するステップの前に実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するステップの後に実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、同時に実施される。
【0014】
一部の実施形態において、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕ（例えば、０．０１Ｕ～０．１６Ｕ、０．０１Ｕ～０．１２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０．８Ｕ、０．０１Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１Ｕ～０．０２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０１２Ｕ、０．０２Ｕ～０．２Ｕ、０．０４Ｕ～０．２Ｕ、０．０．０８Ｕ～０．２Ｕ、０．１２Ｕ～０．２Ｕ、及び０．１６Ｕ～０．２Ｕ）の量の５’エキソヌクレアーゼ。一部の実施形態において、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕ（例えば、０．４Ｕ～３．６Ｕ、０．４Ｕ～３．２Ｕ、０．４Ｕ～２．８Ｕ、０．４Ｕ～２．４Ｕ、０．４Ｕ～２Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．８Ｕ～４Ｕ、１．２Ｕ～４Ｕ、１．６Ｕ～４Ｕ、２Ｕ～４Ｕ、２４Ｕ～４Ｕ、２．８Ｕ～４Ｕ、３．２Ｕ～４Ｕ、３．６Ｕ～４Ｕ、及び０．４Ｕ～０．６Ｕ）の量の３’エキソヌクレアーゼ。
【0015】
実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分の５’末端は、一リン酸部分を含む。
【0016】
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＲである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔである。
【0017】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、７５分～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、４５分～６０分（例えば、４５分～５５分、４５分～５０分、５０分～６０分、及び５５分～６０分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、７５分～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、４５分～６０分（例えば、４５分～５５分、４５分～５０分、５０分～６０分、及び５５分～６０分）にわたって実施される。
【0018】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、約３７℃の温度で実施される。
【0019】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１２Ｕ～０．１Ｕ（例えば、０．０１２Ｕ～０．０８Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０６Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０２Ｕ、０．０２Ｕ～０．１Ｕ、０．０４Ｕ～０．１Ｕ、０．０６Ｕ～０．１Ｕ、０．０８Ｕ～０．１Ｕ）の量である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０２５Ｕの量である。
【0020】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～２Ｕ（例えば、０．４Ｕ～１．８Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．４Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～１Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．４Ｕ～０．６Ｕ、０．６Ｕ～２Ｕ、０．８Ｕ～２Ｕ、１～２Ｕ、１．２Ｕ～２Ｕ、１．４Ｕ～２Ｕ、１．６Ｕ～２Ｕ、１．８Ｕ～２Ｕ）の量である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．５Ｕの量である。
【0021】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの４０％～９５％（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。
【0022】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの６０％～９０％（例えば、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～９０％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ヌクレオチドの７０％～９０％（例えば、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップ及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップの後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～１００％である。
【0023】
定義
本発明の理解を容易にするため、以下にいくつもの用語を定義する。本明細書に定義される用語は、本発明が関係する領域の当業者が一般に理解するとおりの意味を有する。「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図するものではなく、説明のためにその具体的な例が用いられ得る一般的な分類を包含する。本明細書の用語法は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、特許請求の範囲に概要が示される場合を除いては、その用法が本発明を限定することはない。
本発明の理解を容易にするため、以下にいくつもの用語を定義する。本明細書に定義される用語は、本発明が関係する領域の当業者が一般に理解するとおりの意味を有する。「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみを指すことを意図するものではなく、説明のためにその具体的な例が用いられ得る一般的な分類を包含する。本明細書の用語法は、本発明の具体的な実施形態を記載するために用いられるが、特許請求の範囲に概要が示される場合を除いては、その用法が本発明を限定することはない。
【0024】
本明細書で使用されるとき、値の範囲として提供される任意の値は、上限及び下限の両方、並びに上限及び下限の範囲内に含まれる任意の値を包含する。
【0025】
本明細書で使用されるとき、用語「３’エキソヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の３’末端から始まり、ヌクレオチド鎖の５’末端に向かって連続的に進む加水分解を用いて酵素がヌクレオチド鎖からヌクレオチドを取り除くようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を指す。３’エキソヌクレアーゼとしては、限定はされないが、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔ、ＲＮアーゼＰＨ、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ、ＲＮアーゼＤ、ＲＮアーゼＲ、及びエキソリボヌクレアーゼＩＩが挙げられる。
【0026】
本明細書で使用されるとき、用語「５’エキソヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の５’末端から始まり、ヌクレオチド鎖の３’末端に向かって連続的に進む加水分解を用いて酵素がヌクレオチド鎖からヌクレオチドを取り除くようなエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を指す。５’エキソヌクレアーゼとしては、限定はされないが、Ｘｒｎ－１、及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼが挙げられる。
【0027】
本明細書で使用されるとき、用語「５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼ」は、５’から３’に進みながら５’一リン酸を有するポリヌクレオチドを消化するエキソヌクレアーゼを指す（例えば、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ及びＸｒｎ－１）。
【0028】
本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ」、「環状ポリリボヌクレオチド」、「環状ＲＮＡ」及び「環状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、遊離末端を有していない（即ち、遊離３’又は５’末端がない）構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。
【0029】
本明細書で使用されるとき、「環状化効率」という用語は、得られた環状ポリリボヌクレオチドのその非環状出発物質に対する測定値である。
【0030】
本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ調製物」、「環状ポリリボヌクレオチド調製物」及び「環状ＲＮＡ調製物」という用語は、互換的に使用され、ｃｉｒｃＲＮＡ分子と、希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はそれらの組み合わせを含む組成物を意味する。
【0031】
本明細書で使用されるとき、用語「消化された混合物」は、線状ポリリボヌクレオチド及び環状ポリリボヌクレオチドの混合物を消化用酵素（例えば、５’エキソヌクレアーゼ又は３’エキソヌクレアーゼ）と接触させることにより作製される線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとの混合物を指す。
【0032】
本明細書で使用されるとき、用語「消化用緩衝液」及び「消化緩衝液」は、その中でヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼ）が活性を示し、且つポリヌクレオチドの少なくとも一部分を消化する緩衝液を指す。消化用緩衝液は、緩衝剤、Ｍｇ２＋、及び／又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの成分を含み得る。
【0033】
本明細書で使用されるとき、用語「濃縮された集団」とは、環状及び線状ポリリボヌクレオチドの別の集団と比較して環状ポリリボヌクレオチドのパーセントが高いポリリボヌクレオチド集団を指す。
【0034】
本明細書で使用されるとき、用語「断片」及び「一部分」は、ポリヌクレオチド分子よりも少なくとも１ヌクレオチド短いポリヌクレオチド分子の任意の一部を意味する。例えば、ヌクレオチド分子は線状ポリリボヌクレオチド分子であってもよく、及びその断片は、モノリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチド分子の一部分である任意の数の隣接ポリリボヌクレオチドであってもよい。
【0035】
本明細書で使用されるとき、「不純物」という用語は、組成物、例えば、本明細書に記載の医薬組成物中に存在する望ましくない物質である。一部の実施形態において、不純物は、プロセス関連不純物である。一部の実施形態において、不純物は、最終組成物中の所望の産物以外、例えば活性薬物成分、例えば、本明細書に記載の環状又は線状ポリリボヌクレオチド以外の産物関連物質である。本明細書で使用されるとき、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド以外の最終組成物、調製物、又は製品では望ましくない、組成物、調製物、又は製品の製造で使用される、存在する、又は生成される物質である。一部の実施形態において、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化に使用される酵素である。本明細書で使用されるとき、「産物関連物質」という用語は、組成物、調製物、又は製品、又はそれらの任意の中間体の合成中に生成される物質又は副産物である。一部の実施形態において、産物関連物質はデオキシリボヌクレオチド断片である。一部の実施形態において、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。一部の実施形態において、産物関連物質は、１つ又は複数の本明細書に記載のポリリボヌクレオチドの誘導体又は断片、例えば、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、又は４つのリボ核酸、モノリボ核酸、ジリボ核酸、又はトリリボ核酸の断片である。
【0036】
本明細書で使用されるとき、「線状対応物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）をいう。一部の実施形態において、線状対応物（例えば、環状化前の型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び同じ又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。一部の実施形態において、線状対応物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び異なる核酸修飾を有するか、又は環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有するが核酸修飾を有しておらず、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。一部の実施形態において、線状対応物であるポリリボヌクレオチド分子の断片は、線状対応物ポリリボヌクレオチド分子よりも短い線状対応物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。一部の実施形態において、線状対応物は、５’キャップをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、３’ＵＴＲをさらに含む。一部の実施形態において、線状対応物は、５’ＵＴＲをさらに含む。
【0037】
本明細書で使用されるとき、「線状ＲＮＡ」、「線状ポリリボヌクレオチド」及び「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’末端及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であってもよいし、又は別の部分に結合していてもよい。線状ＲＮＡは、環状化されていない（例えば、事前に環状化されていない）ＲＮＡを含み、例えば、スプリントライゲーション、又は化学的、酵素的、リボザイム又はスプライシング触媒による環状化法による環状化のための出発物質として使用することができる。
【0038】
本明細書で使用されるとき、「混合物」という用語は、混合された２つ以上の異なる物質からなる材料を意味する。場合によっては、本明細書に記載の混合物は、２つ以上の異なる物質の均一な混合物であり得、例えば、混合物は、混合物の任意の所与のサンプル全体で、その成分（例えば、２つ以上の物質）が同じ割合を有し得る。場合によっては、本明細書で提供される混合物は、２つ以上の異なる物質の不均一な混合物であり得、例えば、混合物の成分（例えば、２つ以上の物質）の割合は、混合物全体で異なり得る。ある場合には、混合物は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含む。一部の実施形態において、この混合物は、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチドを含み、及び線状ポリデオキシリボヌクレオチドを含み得る。場合によっては、混合物は溶液であり、例えば、混合物は液相で存在する。場合によっては、液体溶液は、液体溶媒及び溶質を含むとみなすことができる。溶質を液体溶媒に混合することは、「溶解」プロセスと呼ぶことができる。場合によっては、液体溶液は、液体中に液体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した液体溶質）、液体中に固体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）、又は液体中に気体を含む溶液（例えば、液体溶媒に溶解した固体溶質）である。場合によっては、複数の溶媒及び／又は複数の溶質が存在する。場合によっては、混合物は、コロイド、液体懸濁液、又はエマルジョンである。場合によっては、混合物は固体混合物であり、例えば、混合物は固相で存在する。
【0039】
本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対して少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを意味する。
【0040】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド又はリボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。
【0041】
ポリデオキシリボヌクレオチド又はデオキシリボ核酸、又はＤＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグやマーカーなどの検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア）を含む、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択することができるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ、或いは、１つ又は複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ、又はその変異体）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、又はＵ、又はその変異体）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの誘導体若しくは変異体である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列、及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピンなどのその任意の構造的実施形態の両方を包含する。場合によっては、ポリヌクレオチド分子は環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離することができる。本明細書で具体化されるように、ポリヌクレオチド配列は、単離及び精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。
【0042】
ポリヌクレオチド、例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドは、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む１つ又は複数のヌクレオチド変異体を含み得る。修飾ヌクレオチドには、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分の修飾（例えば、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つ又は複数の原子で、及び／又は典型的には相補的なヌクレオチドとの水素結合を形成できない１つ又は複数の原子で）修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ ａｌｌｙ １）－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含み得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、高い１立方ｍｍ当たりのビット密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は下位二次構造を提供し得る。デノボ及び／又は増幅合成のための天然及び突然変異ポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４に記載されている。
【0043】
本明細書で使用されるとき、「疑似らせん状構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造であり、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれている。
【0044】
本明細書で使用されるとき、用語「全リボヌクレオチド分子」及び「全ポリリボヌクレオチド」は、リボヌクレオチド分子の全質量によって測定されるとおりの、線状ポリリボヌクレオチド分子、環状ポリリボヌクレオチド分子、単量体リボヌクレオチド、他のポリリボヌクレオチド分子、その断片、及びその修飾された変種を含めた、任意のリボヌクレオチド分子の総量を意味する。
【0045】
本明細書で使用されるとき、用語「単位」は、表１に酵素毎にまとめられるアッセイ方法の指定された方法の下、定義された触媒活性を果たすのに必要な酵素の量を指す。
【0046】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【0047】
【図1】ｇＬｕｃをコードする線状ポリリボヌクレオチドがＲＮアーゼＲによる消化後に分解されることを示す。
【図2】ｇＬｕｃをコードする線状ポリリボヌクレオチドがＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼによる消化後に分解されることを示す。
【図3】ｇＬｕｃをコードする線状ポリリボヌクレオチドがＸｒｎ－１による消化後に分解されることを示す。
【図4】Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼとＲＮアーゼＲとの組み合わせが、ｇＬｕｃをコードする線状ポリリボヌクレオチドを選択的に分解することを示す。
【図5】Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼとＲＮアーゼＲとの組み合わせを使用したライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドの濃縮を示す。
【図6】最適濃度の５’及び３’エキソヌクレアーゼで同時に消化すると、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の線状ポリリボヌクレオチドが選択的に分解され、濃縮環状ポリリボヌクレオチド調製物が作り出されることを示す。
【図7】５’及び３’エキソヌクレアーゼの２つの異なる組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮を示す。
【図8】様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中におけるＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼとＲＮアーゼＲとの組み合わせによるライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物の消化の結果を示す。
【図9】様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中におけるＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによるライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物の消化の結果を示す。
【図10】様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中におけるＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによるライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物の消化の結果を示す。
【図11】濃縮環状ポリリボヌクレオチドからのガウシアルシフェラーゼのインビトロ発現を示す。
【図12】幾つかの異なる分子量の環状ポリリボヌクレオチドの選択的濃縮の結果を示す。
【図13】幾つかの異なる組み合わせの５’及び３’エキソヌクレアーゼを使用した同時消化の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0048】
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。例えば、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕの量の５’エキソヌクレアーゼで消化すること；及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量の３’エキソヌクレアーゼで消化することにより作製されてもよい。本開示はまた、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること；及び線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化することにより環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、消化するステップが、０．０５ｍＭ～１ｍＭ Ｍｇ２＋を含む消化用緩衝液中で実施され、それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法も提供する。
【0049】
環状及び線状ポリリボヌクレオチドを含むポリリボヌクレオチド集団は、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分が消化されることを可能にするのに十分な濃度、時間、及び温度で５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼと反応させてもよい。
【0050】
環状ポリリボヌクレオチドを濃縮する方法
一態様において本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。ポリリボヌクレオチド集団を環状ポリリボヌクレオチドに関して濃縮する方法は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化することを含んでもよく、それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２５Ｕの量であってもよく、及び３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量であってもよい。
一態様において本開示は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法を提供する。ポリリボヌクレオチド集団を環状ポリリボヌクレオチドに関して濃縮する方法は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化することを含んでもよく、それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２５Ｕの量であってもよく、及び３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕの量であってもよい。
【0051】
別の態様において、本開示は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を提供すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化すること；線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化することの、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する方法であって、消化用緩衝液がＭｇ２＋及び／又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含み；それによって環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する、方法を提供する。
【0052】
エキソヌクレアーゼ消化
ある態様では、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼと反応させて、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。
ある態様では、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼと反応させて、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。
【0053】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分は、５’エキソヌクレアーゼで消化される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分は、３’エキソヌクレアーゼで消化される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分は、５’エキソヌクレアーゼで消化された後、３’エキソヌクレアーゼで消化される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分は、３’エキソヌクレアーゼで消化された後、５’エキソヌクレアーゼで消化される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分は、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼで同時に消化される。
【0054】
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、５’－リン酸依存性エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｘｒｎ－１又はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｘｒｎ－１である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＲである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＰＨである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドホスホリラーゼである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＤである。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、エキソリボヌクレアーゼＩＩである。
【0055】
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１Ｕ～０．２Ｕ（例えば、０．０１Ｕ～０．１６Ｕ、０．０１Ｕ～０．１２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０．８Ｕ、０．０１Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１Ｕ～０．０２Ｕ、０．０１Ｕ～０．０１２Ｕ、０．０２Ｕ～０．２Ｕ、０．０４Ｕ～０．２Ｕ、０．０．０８Ｕ～０．２Ｕ、０．１２Ｕ～０．２Ｕ、及び０．１６Ｕ～０．２Ｕ）の量である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０１２Ｕ～０．１Ｕ（例えば、０．０１２Ｕ～０．０８Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０６Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０４Ｕ、０．０１２Ｕ～０．０２Ｕ、０．０２Ｕ～０．１Ｕ、０．０４Ｕ～０．１Ｕ、０．０６Ｕ～０．１Ｕ、０．０８Ｕ～０．１Ｕ）の量である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．０２５Ｕの量である。
【0056】
一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～４Ｕ（例えば、０．４Ｕ～３．６Ｕ、０．４Ｕ～３．２Ｕ、０．４Ｕ～２．８Ｕ、０．４Ｕ～２．４Ｕ、０．４Ｕ～２Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．８Ｕ～４Ｕ、１．２Ｕ～４Ｕ、１．６Ｕ～４Ｕ、２Ｕ～４Ｕ、２４Ｕ～４Ｕ、２．８Ｕ～４Ｕ、３．２Ｕ～４Ｕ、３．６Ｕ～４Ｕ、及び０．４Ｕ～０．６Ｕ）の量である。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．４Ｕ～２Ｕ（例えば、０．４Ｕ～１．８Ｕ、０．４Ｕ～１．６Ｕ、０．４Ｕ～１．４Ｕ、０．４Ｕ～１．２Ｕ、０．４Ｕ～１Ｕ、０．４Ｕ～０．８Ｕ、０．４Ｕ～０．６Ｕ、０．６Ｕ～２Ｕ、０．８Ｕ～２Ｕ、１Ｕ～２Ｕ、１．２Ｕ～２Ｕ、１．４Ｕ～２Ｕ、１．６Ｕ～２Ｕ、１．８Ｕ～２Ｕ）の量である。一部の実施形態において、３’エキソヌクレアーゼは、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．５Ｕの量である。
【0057】
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼの濃度と３’エキソヌクレアーゼの濃度の比は、１μｇのポリリボヌクレオチド当たり０．２Ｕ ５’エキソヌクレアーゼ対４Ｕ ３’エキソヌクレアーゼである。
【0058】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との５’エキソヌクレアーゼの反応は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも３５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との５’エキソヌクレアーゼの反応は、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、４５分～６０分（例えば、４５分～５５分、４５分～５０分、５０分～６０分、及び５５分～６０分）にわたって実施される。
【0059】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との３’エキソヌクレアーゼの反応は、少なくとも３０分（例えば、少なくとも３５分、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも２４時間）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との５’エキソヌクレアーゼの反応は、３０分～９０分（例えば、３５分～９０分、４５分～９０分、１時間～９０分、３０分～７５分、３０分～１時間、３０分～４５分、又は３０分～３５分）にわたって実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を３’エキソヌクレアーゼで消化するという消化するステップは、４５分～６０分（例えば、４５分～５５分、４５分～５０分、５０分～６０分、及び５５分～６０分）にわたって実施される。
【0060】
一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との５’エキソヌクレアーゼの反応は、３０℃～４２℃（例えば、約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、及び４１℃）の温度で実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との５’エキソヌクレアーゼの反応は、約３７℃の温度で実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との３’エキソヌクレアーゼの反応は、３０℃～４２℃（例えば、約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、及び４１℃）の温度で実施される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドと環状ポリリボヌクレオチドとを含む環状ポリリボヌクレオチド集団との３’エキソヌクレアーゼの反応は、約３７℃の温度で実施される。
【0061】
消化用緩衝液
ある態様では、消化用緩衝液中で環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼと反応させて、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。
ある態様では、消化用緩衝液中で環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとを含むポリリボヌクレオチド集団を５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼと反応させて、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団を作製する。
【0062】
一部の実施形態において、消化用緩衝液は、０．０５ｍＭ～１ｍＭ（例えば、０．０５ｍＭ～０．８ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．６ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．４ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．２ｍＭ～１ｍＭ、０．４ｍＭ～１ｍＭ、０．６ｍＭ～１ｍＭ、及び０．８ｍＭ～１ｍＭ）Ｍｇ２＋を含む。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、０．０５ｍＭ～０．５ｍＭ（例えば、０．０５ｍＭ～０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．３ｍＭ、０．０５ｍＭ～０．４ｍＭ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、０．２ｍＭ～０．５ｍＭ、０．３ｍＭ～０．５ｍＭ、及び０．４ｍＭ～０．５ｍＭ）Ｍｇ２＋を含む。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、約０．１ｍＭ Ｍｇ２＋を含む。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、約０．５ｍＭ Ｍｇ２＋を含む。Ｍｇ２＋は、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、乳酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、又は任意のマグネシウム塩として消化用緩衝液に加えられてもよい。
【0063】
一部の実施形態において、消化用緩衝液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む。一部の実施形態において、ＤＴＴは、消化用緩衝液中０．１ｍＭ～５ｍＭ（例えば、０．１ｍＭ～４ｍＭ、０．１ｍＭ～３ｍＭ、０．１ｍＭ～２ｍＭ、０．１ｍＭ～１ｍＭ、０．１ｍＭ～０．５ｍＭ、０．５ｍＭ～５ｍＭ、１ｍＭ～５ｍＭ、２ｍＭ～５ｍＭ、３ｍＭ～５ｍＭ、又は４ｍＭ～５ｍＭ）の濃度を有する。一部の実施形態において、ＤＴＴは、消化用緩衝液中０．５ｍＭ～２ｍＭ（例えば、０．５ｍＭ～０．７ｍＭ、０．５ｍＭ～１ｍＭ、０．５ｍＭ～１．２ｍＭ、０．５ｍＭ～１．５ｍＭ、０．５ｍＭ～１．７ｍＭ、１．７ｍＭ～２ｍＭ、１．５ｍＭ～２ｍＭ、１．２ｍＭ～２ｍＭ、１ｍＭ～２ｍＭ、又は０．８ｍＭ～２ｍＭ）の濃度を有する。一部の実施形態において、ＤＴＴは、消化用緩衝液中１ｍＭの濃度を有する。
【0064】
一部の実施形態において、消化用緩衝液は、ＮａＣｌを含む。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、１０ｍＭ～１Ｍ ＮａＣｌを含む；例えば、消化用緩衝液は、１０ｍＭ～９００ｍＭ、１０ｍＭ～７００ｍＭ、１０ｍＭ～５００ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１Ｍ、１００ｍＭ～１Ｍ、２００ｍＭ～１Ｍ、５００ｍＭ～１Ｍ、又は７００ｍＭ～１Ｍ ＮａＣｌを含み得る。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、１０ｍＭ～２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む。
【0065】
一部の実施形態において、消化用緩衝液は、緩衝剤を含む。一部の実施形態において、緩衝剤は、トリス－ＨＣｌ、トリス塩基、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又はこれらの組み合わせを含む。例えば、緩衝剤は、トリス－ＨＣｌであってもよい。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、１０ｍＭ及び１Ｍの緩衝剤を含む；例えば、消化用緩衝液は、１０ｍＭ～９００ｍＭ、１０ｍＭ～７００ｍＭ、１０ｍＭ～５００ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～１Ｍ、１００ｍＭ～１Ｍ、２００ｍＭ～１Ｍ、５００ｍＭ～１Ｍ、又は７００ｍＭ～１Ｍの緩衝剤を含み得る。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、１０ｍＭ及び５００ｍＭの緩衝剤を含む；例えば、消化用緩衝液は、１０ｍＭ～４０ｍＭ、１０ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭ、１０ｍＭ～２５０ｍＭ、１０ｍＭ～２００ｍＭ、１０ｍＭ～１５０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、５０ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１５０ｍＭ～５００ｍＭ、２００ｍＭ～５００ｍＭ、２５０ｍＭ～５００ｍＭ、３００ｍＭ～５００ｍＭ、３５０ｍＭ～５００ｍＭ、４００ｍＭ～５００ｍＭ、及び４５０ｍＭ～５００ｍＭを含み得る。一部の実施形態において、消化用緩衝液は、５０ｍＭの緩衝剤を含む。
【0066】
一部の実施形態において、消化用緩衝液は、ｐＨ６～８を有する。例えば、消化用緩衝液のｐＨは、６～７．８、６～７．５、６～７．２、６～７、６～６．８、６～６．５、６～６．３、６．３～８、６．５～８、６．８～８、７～８、７．３～８、７．５～８、及び７．８～８であってもよい。
【0067】
環状ポリリボヌクレオチドの濃縮された集団
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの４０％～９５％（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの６０％～９０％（例えば、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～９０％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの７０％～９０％（例えば、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、６０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、６０％～９５％、６０％～９０％、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、８０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、８０％～９５％、８０％～９０％、８０％～８５％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。
一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの４０％～９５％（例えば、４０％～９０％、４０％～８０％、４０％～７０％、４０％～６０％、４０％～５０％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％、８０％～９５％、又は９０％～９５％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの６０％～９０％（例えば、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～９０％、７０％～９０％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント（ｗ／ｗ）は、全ポリヌクレオチドの７０％～９０％（例えば、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～９０％、８０％～９０％、又は８５％～９０％）である。一部の実施形態において、５’エキソヌクレアーゼ及び３’エキソヌクレアーゼによる消化後、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、６０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、６０％～９５％、６０％～９０％、６０％～８５％、６０％～８０％、６０％～７５％、６０％～７０％、６０％～６５％、６５％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドのパーセント収率（ｗ／ｗ）は、７０％～９５％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、８０％～１００％である；例えば、環状ポリリボヌクレオチドの総パーセント収率（ｗ／ｗ）は、８０％～９５％、８０％～９０％、８０％～８５％、８５％～１００％、９０％～１００％、及び９５％～１００％である。
【0068】
環状ポリリボヌクレオチド
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物から濃縮されてもよい環状ポリリボヌクレオチド集団を提供する。
本開示は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物から濃縮されてもよい環状ポリリボヌクレオチド集団を提供する。
【0069】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの要素のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いている）か、遊離３’末端を欠いているか、ＲＮＡポリメラーゼ認識モチーフを欠いているか、又はこれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に開示されるとおりの任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを含む。
【0070】
一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は１．２ｋｂ未満であり、１．２～１．４ｋｂであり、１．４～１．６ｋｂであり、３．５～４．５ｋｂであり、４．５～５．４ｋｂであり、又は５．４ｋｂ超である。
【0071】
一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、リボソームの結合部位を収容するのに十分なサイズであり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、環状ポリリボヌクレオチドを生成する、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内の大きさであり得る。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントをＤＮＡから生成し、それらの５’及び３’遊離末端をアニールしてＲＮＡの「ストリング」を生成することが可能であり、これが最終的に環状化して、１つの５遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残り得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングして標的に送達する能力によって制限され得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって、少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド、又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、又は少なくとも７０ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
【0072】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、つまり、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた程度、例えば、エキソヌクレアーゼが存在しないときと同等又は同様の程度にしか分解されないことを意味し得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドはエキソヌクレアーゼによって分解されない。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されたときの分解が低下している。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
【0073】
発現配列
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。かかるペプチドには、限定はされないが、小ペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が含まれ得る。ペプチドは線状又は分枝状であってもよい。かかるペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにかかる化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容可能な形態を有し得る。かかるペプチドには、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。かかるペプチドには、限定はされないが、小ペプチド、ペプチドミメティクス（例えば、ペプトイド）、アミノ酸、及びアミノ酸類似体が含まれ得る。ペプチドは線状又は分枝状であってもよい。かかるペプチドは、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約２，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量、１モル当たり約５００グラム未満の分子量、並びにかかる化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容可能な形態を有し得る。かかるペプチドには、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬物、毒素、ウイルス又は微生物粒子、合成分子、及びそのアゴニスト又はアンタゴニストが含まれ得る。
【0074】
コードされるポリペプチドは、約５～約４０，０００アミノ酸、約１５～約３５，０００アミノ酸、約２０～約３０，０００アミノ酸、約２５～約２５，０００アミノ酸、約５０～約２０，０００アミノ酸、約１００～約１５，０００アミノ酸、約２００～約１０，０００アミノ酸、約５００～約５，０００アミノ酸、約１，０００～約２，５００アミノ酸、又はこれらの間にある任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００アミノ酸未満、約３５，０００アミノ酸未満、約３０，０００アミノ酸未満、約２５，０００アミノ酸未満、約２０，０００アミノ酸未満、約１５，０００アミノ酸未満、約１０，０００アミノ酸未満、約９，０００アミノ酸未満、約８，０００アミノ酸未満、約７，０００アミノ酸未満、約６，０００アミノ酸未満、約５，０００アミノ酸未満、約４，０００アミノ酸未満、約３，０００アミノ酸未満、約２，５００アミノ酸未満、約２，０００アミノ酸未満、約１，５００アミノ酸未満、約１，０００アミノ酸未満、約９００アミノ酸未満、約８００アミノ酸未満、約７００アミノ酸未満、約６００アミノ酸未満、約５００アミノ酸未満、約４００アミノ酸未満、約３００アミノ酸未満の長さを有するか、又はそれ未満が有用であり得る。
【0075】
ポリペプチドは、相当量で作製されてもよい。このように、ポリペプチドは、作製することのできる任意のタンパク質性分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌させることのできる、又は細胞の細胞質、核、若しくは膜成分に局在させることのできるポリペプチドであってもよい。一部のポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部分、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節するもの）、抗原、サイトカイン、毒素、それが存在しないことが疾患に関連する酵素、及び動物では（例えば、動物の腸において）切断されるまで活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
【0076】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る治療用タンパク質は、抗酸化活性、結合、カーゴ受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節因子、分子伝達因子活性、栄養素貯蔵活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節因子活性、翻訳調節因子活性、又は輸送体活性を有する。治療用タンパク質の一部の例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補給用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば癌）、細胞リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害因子（例えば、オンコプロテインの阻害因子）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害因子、核内受容体活性化因子又は阻害因子、プロテアソーム阻害因子、酵素の競合阻害因子、タンパク質合成エフェクター又は阻害因子、ヌクレアーゼ、タンパク質断片又はドメイン、リガンド又は受容体、及びＣＲＩＳＰＲシステム又はその成分を挙げることができる。
【0077】
一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体調節因子、及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関係があるとされているタンパク質、例えば、創傷治癒のための、治療用タンパク質）が挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、酵素、例えば、オキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、及びデサチュラーゼが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。一部の実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えば、分泌酵素（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｅｎｚｙｍｅ）が挙げられる。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、血中で半減期が短い治療薬を有し得るか、又は細胞内局在性シグナルを持つタンパク質、若しくは分泌シグナルペプチドを持つタンパク質であり得る分泌タンパク質（ｓｅｃｒｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質、例えば、蛍光タンパク質、エネルギー伝達アクセプター、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドから発現し得る例示的タンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ付加タンパク質、例えば、タンパク質タグ、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタメートタグ；Ｅ－タグ、ＦＬＡＧタグ）、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＮＥタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｐｏｔタグ、Ｓｔｒｅｐタグ；ＴＣタグ、Ｔｙタグ、Ｖ５タグ；ＶＳＶタグ；又はＸｐｒｅｓｓタグを含む融合タンパク質又は操作されたタンパク質を発現する。
【0078】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば、抗体断片、又はその一部分の発現をコードする。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが発現する抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、任意のアイソタイプであってよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、その更なる一部分など、抗体の一部分を発現する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部分を１つ以上発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、その各々が抗体の一部分を発現し、及びそれらが合わさったものが、抗体を構成することができる。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする一つの発現配列と、抗体の軽鎖をコードするもう一つの発現配列とを含む。ある場合には、この環状ポリリボヌクレオチドが細胞又は無細胞環境で発現すると、軽鎖及び重鎖が適切な修飾、折り畳み、又は他の翻訳後修飾に供され、機能性の抗体を形成することができる。
【0079】
調節要素
環状ポリリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を減少させることができる。一部の実施形態において、ある調節要素を用いて、ポリペプチドの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状ポリリボヌクレオチドに対する別のポリペプチドの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、ポリペプチド）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、ポリペプチド）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。一部の実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数のポリペプチドの発現を減少させることができる。一部の実施形態において、ある調節要素を用いて、ポリペプチドの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状ポリリボヌクレオチドに対する別のポリペプチドの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、ポリペプチド）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、ポリペプチド）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。一部の実施形態において、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。一部の実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。調節要素の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。
【0080】
翻訳を開始させるコドン、例えば、限定はされないが、開始コドン又は代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／又は構造に影響することは知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたい；その内容はその全体が参照により本明細書中に援用される）。翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変更してもよい。
【0081】
一実施形態では、コドンをマスクするか又は隠し、マスクされた開始コドン又は代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低減するため、マスキング剤を開始コドン又は代替的な開始コドンの近傍で用いてもよい。別の実施形態では、代替的な開始コドンで翻訳が開始する可能性を高めるため、マスキング剤を用いて、環状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスクしてもよい。
【0082】
翻訳開始配列
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。一部の実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば、開始コドンを含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えば、コザック配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。一部の実施形態において、翻訳開始配列、例えば、コザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。一部の実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列の更なる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。
【0083】
環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【0084】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン、例えば、ＡＵＧでないコドンで開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０１６４］に記載のような代替的な翻訳開始配列で開始し得る。
【0085】
一部の実施形態において、翻訳は、ロカグレートを伴う真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）の処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングを遮断し、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写物からの未成熟な上流の翻訳開始及びタンパク質発現低下を引き起こすことによって抑制される、例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照）。
【0086】
スタガー要素
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタガー要素又は切断配列）を含み得る。「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。一部の実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。一部の実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタガー要素又は切断配列）を含み得る。「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導する、ヌクレオチド配列などの部分を指す。一部の実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。一部の実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
【0087】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。一部の実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれが、後続の発現配列から隔てられる。一部の実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のうちの発現配列の一部を含む。
【0088】
スタガー要素の例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１７２］～［０１７５］に記載されている。
【0089】
連続的発現産物の産生を回避しながら、ローリングサークル翻訳を維持するため、スタガー要素を含めることで、翻訳中のリボソーム停止を誘導してもよい。一部の実施形態において、スタガー要素は、１つ又は複数の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳中にリボソームを停止させるように設計され得る。スタガー要素は、限定はされないが、２Ａ様、又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼエレメント）配列を含んでもよい。一部の実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（配列番号２２）（式中、Ｘ１は、不在又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、不在又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。一部の実施形態において、この配列は、強力なαらせん性を有するアミノ酸の非保存配列と、それに続くコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号２）（式中、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定例として、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３）、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ（配列番号４）、ＶＥＰＮＰＧＰ（配列番号５）、ＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号６）、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号７）、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号８）、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号９）、ＧＤＶＥＮＰＧＰ（配列番号１０）、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１１）、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ（配列番号１２）、ＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号１３）、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号１４）、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１５）、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号１６）、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ（配列番号１７）、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８）、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号１９）、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ（配列番号２０）、及びＤＳＥＦＮＰＧＰ（配列番号２１）が挙げられる。
【0090】
一部の実施形態において、本明細書に記載のスタガー要素は、本明細書に記載のコンセンサス配列のＧ及びＰの間などで、発現産物を切断する。１つの非限定例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するための少なくとも１つのスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接したスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に存在するスタガー要素を含むことで、各発現配列から個別のペプチド及び／又はポリペプチドの翻訳を引き起こす。
【0091】
一部の実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソーム停止を誘導する、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含んでもよい。これらなどの例は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと、分子の骨格に対する変化によって区別される。修飾は、翻訳中にリボソーム停止を誘導し得る、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の修飾、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、本明細書中の他の箇所に記載されている。
【0092】
一部の実施形態において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中に他の形態で存在する。例えば、いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終結配列、及び第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に連続する発現の第１の翻訳開始配列の上流（それに対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１の発現配列及び第１の発現配列に連続する発現配列は、環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別々の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその連続する発現配列の連続的翻訳を可能にし得る。一部の実施形態において、第１のスタガー要素は、終結配列を含み、第１の発現配列の発現産物をその連続する発現配列の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の連続する配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、第２の発現配列に連続する発現配列の第２の翻訳開始配列の上流に存在する第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中に発現配列が１つだけ存在し、第１の発現配列及びその連続する発現配列は、同じ発現配列である。いくつかの例示的な環状ポリリボヌクレオチドでは、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終結配列、及び下流の翻訳開始配列から終結配列を分離するヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかのそのような例では、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（に対する５’側）に存在する。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の連続する発現配列の継続的翻訳を可能にする。一部の実施形態において、第１のスタガー要素は、第１の発現配列の１回目の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から分離し、それにより分離した発現産物を作出する。いくつかの場合、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳される一方で、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、継続的に翻訳されない。いくつかの場合、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、対応する環状ポリリボヌクレオチドにおいて、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍大きい。いくつかの場合、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。一部の実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離よりも、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上大きい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
【0093】
ＩＲＥＳ
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２、３、４、及び５つの）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、結果として得られる１つ又は複数のペプチド及び／又は１つ又は複数のポリペプチドの分離につながる。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列の両側に隣接している。環状ポリリボヌクレオチドに含めるのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合する能力を有するＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルス（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳである。ＩＲＥＳの更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６６］～［０１６８］に記載されている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは配列内リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の（例えば、２、３、４、及び５つの）配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、結果として得られる１つ又は複数のペプチド及び／又は１つ又は複数のポリペプチドの分離につながる。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列の両側に隣接している。環状ポリリボヌクレオチドに含めるのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームと会合する能力を有するＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳである。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルス（ＣＶＢ３）ＩＲＥＳである。ＩＲＥＳの更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６６］～［０１６８］に記載されている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列内リボソーム進入部位を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは配列内リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
【0094】
翻訳
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。一部の実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。一部の実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回、又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
【0095】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、全ポリペプチドの少なくとも９９％が別々のポリペプチドであるように設計される。一部の実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。一部の実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。一部の実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
【0096】
非翻訳領域
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。一部の実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。一部の実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。一部の実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。一部の実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えば、ＺＫＳＣＡＮ１である。
【0097】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。
【0098】
ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。
【0099】
任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。例示的非翻訳領域については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。
【0100】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは５’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは３’－ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’－ＵＴＲを欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’－ＵＴＲを欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは終結要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。
【0101】
終結要素
環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含むことができ、各発現配列が終結要素を有しても、又は有しなくてもよい。終結要素の更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含むことができ、各発現配列が終結要素を有しても、又は有しなくてもよい。終結要素の更なる例については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１６９］～［０１７０］に記載されている。
【0102】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡ配列の長さは１０ヌクレオチド長より長い。一実施形態において、ポリＡ配列は１５ヌクレオチド長より長い（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド又はそれより長い）。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）の［０２０２］～［０２０４］にあるポリＡ配列の記載に従い設計される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いている）。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終結要素を欠いている。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドはポリＡ配列を欠いており（例えば、ＯＲＦの３’末端のポリＡ配列を欠いており）、及びその１つ以上の発現配列からのタンパク質発現に関してコンピテントである。
【0103】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、発現配列は終結要素を欠いているため、したがって環状ポリリボヌクレオチドは連続的に翻訳される。終結要素が除かれる結果、リボソームの停滞又は脱落がないため、ローリングサークル翻訳又は発現産物、例えば、ペプチド若しくはポリペプチドの連続発現が生じ得る。かかる実施形態において、ローリングサークル翻訳は、各発現配列を通して連続した発現産物を発現する。一部の他の実施形態において、発現配列の終結要素は、スタガー要素の一部であり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列が終結要素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチドにおけるローリングサークル翻訳又は続く（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の発現は実施される。かかる例では、リボソームが終結要素、例えば、終止コドンに出会うと発現産物からリボソームが脱落し、翻訳が終結し得る。一部の実施形態において、翻訳は、リボソーム、例えば、リボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触したまま残っている間に終結する。
【0104】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の終わりに終結要素を含む。一部の実施形態において、１つ以上の発現配列は、２つ以上の終結要素を連続して含む。かかる実施形態では、翻訳は終結し、ローリングサークル翻訳は終結する。一部の実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドとの会合から完全に遊離する。一部のかかる実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド中の続く（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の産生には、翻訳開始前にリボソームが環状ポリリボヌクレオチドと再び会合する必要があり得る。概して、終結要素は、翻訳の終結シグナルを送るインフレームのヌクレオチドトリプレット、例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結要素は、限定はされないが、オフフレームの、又は－１及び＋１シフトしたリーディングフレーム（例えば、隠れた終止）など、翻訳を終結させ得るフレームシフトした終結要素である。フレームシフトした終結要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレオチドトリプレット、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含む。フレームシフトした終結要素は、細胞にとって有害となることの多いｍＲＮＡの誤読の防止において重要であり得る。
【0105】
ＲＮＡ結合部位
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を修飾する標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。標的ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列、又はＤＮＡ結合若しくはＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合する標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）に結合し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸に結合し、ＲＮＡに結合し、遺伝子転写に干渉する配列に結合し、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列に結合し、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列に結合し、又はＤＮＡ結合又はＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合することができる。標的アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合することができる。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへの標的アプタマー配列の結合によってＲＮＡと複合体を形成することができる。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子の発現を修飾する標的ＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、宿主遺伝子の発現を調節する。標的ＲＮＡ結合部位は、内因性遺伝子にハイブリダイズする配列（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸にハイブリダイズする配列、ＲＮＡにハイブリダイズする配列、遺伝子転写に干渉する配列、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列、又はＤＮＡ結合若しくはＲＮＡ結合因子を調節する配列を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＲＮＡに結合する標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列は、内因性遺伝子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡに関する配列）に結合し、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外因性核酸に結合し、ＲＮＡに結合し、遺伝子転写に干渉する配列に結合し、ＲＮＡ翻訳に干渉する配列に結合し、分解の標的化によるなどしてＲＮＡを安定化させる若しくはＲＮＡを不安定化させる配列に結合し、又はＤＮＡ結合又はＲＮＡ結合因子を調節する配列に結合することができる。標的アプタマー配列の二次構造は、ＲＮＡに結合することができる。環状ＲＮＡは、ＲＮＡへの標的アプタマー配列の結合によってＲＮＡと複合体を形成することができる。
【0106】
一部の実施形態において、標的ＲＮＡ結合部位は、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ結合部位のうちの１つであり得る。標的ＲＮＡ結合部位は当業者に周知である。
【0107】
ある種の標的ＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的過程を通じて遺伝子発現を阻害することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的には１５～５０塩基対（約１８～２５塩基対など）を有し、且つ細胞内にある発現させる標的遺伝子のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を備えたＲＮＡｉ分子を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス、及びダイサー基質が挙げられる。標的結合部位の更なる例については、国際公開第２０２０／０２３６５５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１２９］～［０１４６］に記載されている。
【0108】
ＤＮＡ結合部位
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列など、標的ＤＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列の相補体を含む。不完全なエフェクター部分との結合に必要な標的結合配列及びゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列で構成されたｇＲＮＡ低分子合成ＲＮＡ。ガイドＲＮＡ配列は長さが１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）であり、標的化される核酸配列に相補的である。有効なガイドＲＮＡの設計においては、カスタムのｇＲＮＡ生成器及びアルゴリズムを使用することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、且つｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的となる配列へとヌクレアーゼを導くため）の両方を持つ操作された（合成の）シングルＲＮＡ分子であるキメラの「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用すると、遺伝子編集を達成することができる。化学的に修飾されたｇＲＮＡは、ゲノム編集において有効であり得る。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列など、標的ＤＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡ配列の相補体を含む。不完全なエフェクター部分との結合に必要な標的結合配列及びゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドのターゲティング配列で構成されたｇＲＮＡ低分子合成ＲＮＡ。ガイドＲＮＡ配列は長さが１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）であり、標的化される核酸配列に相補的である。有効なガイドＲＮＡの設計においては、カスタムのｇＲＮＡ生成器及びアルゴリズムを使用することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、且つｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集の標的となる配列へとヌクレアーゼを導くため）の両方を持つ操作された（合成の）シングルＲＮＡ分子であるキメラの「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を使用すると、遺伝子編集を達成することができる。化学的に修飾されたｇＲＮＡは、ゲノム編集において有効であり得る。
【0109】
ｇＲＮＡは、特異的なＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、又はリプレッサーに隣接するか又はその範囲内にある配列）を認識することができる。
【0110】
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部である。遺伝子編集には、環状ポリリボヌクレオチドが、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計することができる。ｇＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９又は他のエキソヌクレアーゼと相互作用してＤＮＡを切断するための少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド又はそれ以上を含んでもよく、例えば、Ｃｐｆ１は、検出可能なＤＮＡ切断用の少なくとも約１６ヌクレオチドのｇＲＮＡ配列と相互作用する。
【0111】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡに結合することのできる標的アプタマー配列を含む。標的アプタマー配列の二次構造は、ＤＮＡに結合することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、標的アプタマー配列によるＤＮＡへの結合によりＤＮＡと複合体を形成する。
【0112】
ＤＮＡに結合する環状ポリリボヌクレオチド配列の更なる例については、国際公開第２０２０／０２３６５５号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）の段落［０１５１］～［０１５３］に記載されている。
【0113】
タンパク質結合
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば、リボソームがＲＮＡ配列内の内部部位に結合することを可能にする、１つ又は複数のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えば、リボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に設計することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドを宿主の免疫系の成分からマスクすることによって、宿主の免疫系による検知を逃避し得るか又は低下させているか、分解を調節しているか、又は翻訳を調節している。
【0114】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含むことで、例えば、免疫応答、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を逃避する。一部の実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性としての環状ポリリボヌクレオチドのマスキングを補助するヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、外因性又は外来性としての環状ポリリボヌクレオチドの隠蔽を補助するヌクレオチド配列である。
【0115】
線状ＲＮＡへのリボソーム会合の伝統的機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端へのリボソーム結合を含む。リボソームは、５’末端から開始コドンに移動するとすぐに、第１のペプチド結合が形成される。本発明によると、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部開始（即ち、キャップ非依存性）は、遊離末端又はキャップ末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、ポリペプチド伸長を開始コドンで開始させる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば、開始コドンを含む、１つ又は複数のＲＮＡ配列を含む。
【0116】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を有する。それは、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを内包する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号２３）（ここでＲは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）である）を有し、それにもう一つの「Ｇ」が後続する。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
【0117】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを特異的標的に標的化し、又は局在化する。一部の実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
【0118】
一部の実施形態において、タンパク質結合部位として、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ－、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１、及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【0119】
修飾
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、詳細には、親ポリリボヌクレオチドと比べて１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよく、本発明の範囲内に包含される。
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、詳細には、親ポリリボヌクレオチドと比べて１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよく、本発明の範囲内に包含される。
【0120】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ又は複数の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定されている１００を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。一部の実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０３１１］中に記載されるような群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
【0121】
環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ）又は置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。更なる修飾は、本明細書中に記載されている。
【0122】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を増加させるための少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。一部の実施形態において、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを低下）させ得る。
【0123】
一部の実施形態において、修飾は、化学又は細胞誘導修飾を含んでもよい。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定例が、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０からのＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎ、“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”によって記載されている。
【0124】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫逃避を増強し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、又は、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（ここで参照により本明細書中に援用される）に記載されたものによって合成及び／又は修飾されてもよい。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ－、ジ－及びトリ－）、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基、又はパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対を形成する塩基との置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基を含む。修飾リボヌクレオチド塩基はまた、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンを含んでもよい。一部の実施形態において、塩基修飾は、いくつかの機能的効果を挙げると、環状ポリリボヌクレオチドの、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。一部の実施形態において、修飾は、双直交性のヌクレオチド、例えば、非天然塩基を含む。例えば、Ｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａ（ここで参照により援用される）を参照されたい。
【0125】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの１つ又は複数のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位又は４’位）又は糖の置換、並びに骨格修飾は、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドの具体例として、限定はされないが、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含む、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合、例えば、ヌクレオシド間修飾を含む、環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドは、特に、骨格内にリン原子を有しないものを含む。本願を意図して、また時として当該技術分野で参照されるとおり、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。特定の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有するリボヌクレオチドを含むことになる。
【0126】
修飾された環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’－５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接ペアが、３’－５’と５’－３’又は２’－５’と５’－２’で結合される、反転極性を有するものを含んでもよい。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負又は正に荷電され得る。
【0127】
環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸塩骨格）に対して修飾され得る。本明細書では、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」及び「リン酸ジエステル」という語句は、互換可能に用いられる。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ又は複数を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書に記載のような別のヌクレオシド間結合による大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例として、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ジチオリン酸は、硫黄によって置換された両方の非結合酸素を有する。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による結合酸素の置換によって修飾され得る。
【0128】
ａ－チオ置換リン酸部分は、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに非天然ホスホロチオエート骨格結合を介して安定性を与えるように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞環境下で、増強されたヌクレアーゼ抵抗性と、それに続く延長された半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫応答を低減することが予想される。
【0129】
具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α－チオヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジン）を含む。
【0130】
亜リン酸原子を含まないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられてもよい他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。
【0131】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－ｌ－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを含んでもよい。更なる例として、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－ｌ－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。
【0132】
環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ又は複数又はすべてのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵの任意の１つ若しくは複数若しくはすべて）は、環状ポリリボヌクレオチド、又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されてもされなくてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、イノシンを含み、それは環状ポリリボヌクレオチドを内因性ＲＮＡとウイルス性のＲＮＡとして特徴づける免疫系に寄与し得る。イノシンの組み込みはまた、ＲＮＡ安定性の改善／分解の減少を媒介し得る。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４（その全体が参照により援用される）を参照されたい。
【0133】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（又はその所与の配列領域）におけるすべてのヌクレオチドが、修飾される。一部の実施形態において、修飾は、発現を増強し得るｍ６Ａ；免疫応答を減弱し得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳リードスルー（スタガー要素）を増強し得るプソイドウリジン、安定性を増強し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転位（例えば、核局在化）を補助する２，２，７－トリメチルグアノシンを含んでもよい。
【0134】
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド中の様々な位置に存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることで、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下しないことを理解するであろう。修飾はまた、非コード領域修飾であってもよい。環状ポリリボヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量、又はヌクレオチドの１つ若しくは複数のタイプ、即ち、Ａ、Ｇ、Ｕ若しくはＣの任意の１つ若しくは複数のいずれかに対して）約１％～約１００％、又は任意の間の百分率（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【0135】
産生方法
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（例えば、ＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）、化学合成、又はそれらの組合せを用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
【0136】
ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態、又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含み得ることは、本開示の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
【0137】
一部の実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環化又はコンカテマー化の機構は、スプリントライゲーション方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’－／３’－結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
【0138】
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
【0139】
環状化
一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドが環化されるか、又はコンカテマー化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前にインビトロで環化されてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドとの混合物中にあってもよい。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ核酸配列を有する。
一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドが環化されるか、又はコンカテマー化されてもよい。一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達の前にインビトロで環化されてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドとの混合物中にあってもよい。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ核酸配列を有する。
【0140】
細胞外環状化
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’－アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’－アミノ末端ヌクレオチドが、５’－ＮＨＳ－エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’－／３’－アミド結合を形成するようになっている。
【0141】
一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’－リン酸化核酸分子（例えば、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’－ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成する。例の反応において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１～１０単位のＴ４ ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’－及び３’－領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一部の実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ、ＲＮＡリガーゼＩＩ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ又はＴ４ＤＮＡリガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状環状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
【0142】
一部の実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用される。一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる環状化のための線状ポリリボヌクレオチドが、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０～３７℃の温度で１～２４時間行われ得る。
【0143】
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化される。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
【0144】
一部の実施形態において、環状化用の線状ポリリボヌクレオチドは、ＩＶＴ及びＲＮＡポリメラーゼを使用して合成され、ここでＩＶＴに使用されるヌクレオチド混合物は、グアノシン三リン酸と比べて過剰なグアノシン一リン酸を含むため、５’一リン酸を有するＲＮＡを優先的に産生し得る；精製ＩＶＴ産物は、スプリントＤＮＡを使用して環状化されてもよい。
【0145】
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、環状化のための線状ポリリボヌクレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化される。非限定的な例として、１つ以上の環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子－双極子力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
【0146】
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【0147】
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分の５’末端は一リン酸部分を含む。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部分を５’エキソヌクレアーゼ及び／又は３’エキソヌクレアーゼで消化する前に、環状及び線状ポリリボヌクレオチドを含むポリリボヌクレオチド集団をＲｐｐＨと接触させる。代わりに、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ、又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つすべてのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
【0148】
一部の実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。一部の実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。一部の実施形態において、提供される環状化方法は、約１０％～約１００％の環状化効率を有し；例えば、環状化効率は、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及び約９９％であり得る。一部の実施形態において、環状化効率は、約２０％～約８０％である。一部の実施形態において、環状化効率は、約３０％～約６０％である。一部の実施形態において、環状化効率は、約４０％である。
【0149】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製されると、スプライスされた末端が一緒に結合される内部スプライシング要素を含む。いくつかの例は、スプライス部位配列及び短い逆方向反復（３０～４０ｎｔ）、例えばＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ、及びＡｌｕＳｚ、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌｕ要素、及びバックスプライス（ｂａｃｋｓｐｌｉｃｅ）事象に近接するｃｉｓ－配列要素に見られるモチーフ（サプタブル（ｓｕｐｔａｂｌｅ）４富化モチーフ）、例えば、隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上流の）又は後ろにある（下流の）配列を有する小型イントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部スプライシング要素として本明細書における他の箇所に記載される少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。一部の実施形態において、スプライシング反復リボソーム結合タンパク質が、環状ポリリボヌクレオチド生合成（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプライシング因子）を調節し得る。
【0150】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの頭－尾結合に隣接する標準スプライス部位を含み得る。
【0151】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３－ヌクレオチドバルジが隣接する４－塩基対ステムを含むバルジ－ヘリックス－バルジモチーフを含み得る。切断は、バルジ領域中の部位において生じ、末端５’－ヒドロキシル基及び２’、３’－環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、同じ分子の２’、３’－環状ホスフェートへの５’－ＯＨ基の求核攻撃によって進行して、３’、５’－ホスホジエステル架橋を形成する。
【0152】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲ要素を内包する多量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’－環状リン酸と５’－ＯＨ末端とを含む。ＨＰＲ要素は線状の環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を自己プロセシングして、それによりこれらの末端を一体にライゲートする。
【0153】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、ＧＧＣＵＣＡＵＣＵＣＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＡＡＧＵＵＣＧＡＧＣＡＵＧＡＧＣＣ（Ｂｅｅｈａｒｒｙ ｅｔ ａｌ ２００４）（配列番号２４）又はＧＧＣＵＡＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＵＣＣＵＣＡＧＵＡＣＵＣＵＵＡＣＵＣＵＵＵＵＣＵＧＵＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＵＧＣＵＧＧＡＣＵＣＧＣＣＧＣＣＣＧＡＧＣＣ（配列番号２５）））を含むことにより自己ライゲートし得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（例えばＰＳＴＶｄにおける）ループＥ配列を含むことにより自己ライゲートし得る。別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば、５’及び３’スプライスジャンクション（ｓｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、又はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例としては、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング並べ替えイントロン－エクソン配列、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを挙げることができる。
【0154】
他の環状化方法
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１～１０の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０）の反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。一部の実施形態において、相補的配列は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。一部の実施形態において、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１～１０の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０）の反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの反復核酸配列であって、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント内の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。一部の実施形態において、相補的配列は、環状化のための線状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。一部の実施形態において、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
【0155】
一部の実施形態において、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【0156】
一部の実施形態において、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。一部の実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
【0157】
環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４－２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８－１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
【0158】
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。例示的な複製要素が、全体が参照により本明細書に援用される国際特許公開番号国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２８０］～［０２８６］に記載されている。
【0159】
一部の実施形態において、線状の環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に、又は隣接するイントロンにわたって反復核酸配列又は非反復核酸配列のいずれかを含む相補配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドの一セグメント内に存在する配列である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。一部の実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメントにある相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ここでハイブリダイズしたセグメントは、内部的な二本鎖を形成する。一部の実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ここでハイブリダイズしたセグメントは、内部的な二本鎖を形成する。一部の実施形態において、相補配列は、線状の環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端に見られる。一部の実施形態において、相補配列は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、又はそれ以上の対合したヌクレオチドを含む。
【0160】
一部の実施形態では、化学的環状化方法を用いて環状ポリリボヌクレオチドが生成されてもよい。かかる方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法、又はクリック化学が可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホルアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾、及びこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
【0161】
複製要素
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドの生成によって行われ得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写を開始するためのモチーフを含み、ここで転写は、内因性細胞機構（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）か、又は環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼかのいずれかによってドライブされる。ローリングサークル転写イベントの産物がリボザイムにより切断されると、相補的な環状ポリリボヌクレオチド又は増殖した環状ポリリボヌクレオチドのいずれかが単位長さで生成され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、その相補体によるか、又はＲＮＡ配列によってトランスでコードされてもよい。一部の実施形態において、コードされるリボザイムは、リボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）ことにより環状ＲＮＡ増殖を制御する配列又はモチーフを含み得る。一部の実施形態において、単位長さ配列は、細胞ＲＮＡリガーゼにより環状の形態にライゲートされてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅を助ける複製要素を含む。かかる複製要素の例としては、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるＨＤＶ複製ドメイン、ジャガイモやせいもウイロイドのＲＮＡプロモーター（例えば、Ｋｏｌｏｎｋｏ ２００５ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照のこと）、及びアンチゲノム５’－ＣＧＧＧＵＣＧＧＣＡＵＧＧＣＡＵＣＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＧＣＧＧＵＣＣＧＡＣＣＵＧＧＧＣＡＵＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣＧＵＣＣＡＣＵＣＧＧＡＵＧＧＣＵＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡ－３’（配列番号２６）又はゲノム５’－ＵＧＧＣＣＧＧＣＡＵＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＧＣＵＧＧＣＧＣＣＧＧＣＵＧＧＧＣＡＡＣＡＵＵＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＡＵＧＧＣＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＣＡ－３’（配列番号２７）などの複製コンピテントな環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイムが挙げられる。
環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドの生成によって行われ得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写を開始するためのモチーフを含み、ここで転写は、内因性細胞機構（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）か、又は環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼかのいずれかによってドライブされる。ローリングサークル転写イベントの産物がリボザイムにより切断されると、相補的な環状ポリリボヌクレオチド又は増殖した環状ポリリボヌクレオチドのいずれかが単位長さで生成され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、その相補体によるか、又はＲＮＡ配列によってトランスでコードされてもよい。一部の実施形態において、コードされるリボザイムは、リボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）ことにより環状ＲＮＡ増殖を制御する配列又はモチーフを含み得る。一部の実施形態において、単位長さ配列は、細胞ＲＮＡリガーゼにより環状の形態にライゲートされてもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅を助ける複製要素を含む。かかる複製要素の例としては、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるＨＤＶ複製ドメイン、ジャガイモやせいもウイロイドのＲＮＡプロモーター（例えば、Ｋｏｌｏｎｋｏ ２００５ Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照のこと）、及びアンチゲノム５’－ＣＧＧＧＵＣＧＧＣＡＵＧＧＣＡＵＣＵＣＣＡＣＣＵＣＣＵＣＧＣＧＧＵＣＣＧＡＣＣＵＧＧＧＣＡＵＣＣＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣＡＣＧＵＣＣＡＣＵＣＧＧＡＵＧＧＣＵＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＡ－３’（配列番号２６）又はゲノム５’－ＵＧＧＣＣＧＧＣＡＵＧＧＵＣＣＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＧＣＵＧＧＣＧＣＣＧＧＣＵＧＧＧＣＡＡＣＡＵＵＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＧＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＡＵＧＧＣＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＣＡ－３’（配列番号２７）などの複製コンピテントな環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイムが挙げられる。
【0162】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製の助けとなる本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つのスタガー要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド内にあるスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドから複製される長い転写物を特異的な長さに切断することができ、続いてそれが環状化して環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成することができる。
【0163】
別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドから複製される長い転写物を特異的長さに切断するための少なくとも１つのリボザイム配列を含み、ここでは別のコードされるリボザイムが、その転写物をリボザイム配列において切断する。環状化により、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体が形成される。
【0164】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えばエキソヌクレアーゼによる分解に実質的に抵抗性である。
【0165】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは細胞内で複製する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは細胞内で約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～７５％、７５％～８０％、８０％～８５％、８５％～９０％、９０％～９５％、９５％～９９％、又は間にある任意のパーセンテージの速度で複製する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは細胞内で複製し、娘細胞に受け継がれる。一部の実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に受け継ぐ。一部の実施形態において、減数分裂中の細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に受け継ぐ。一部の実施形態において、有糸分裂中の細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に受け継ぐ。
【0166】
一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは宿主細胞内で複製する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳類細胞、例えば、ヒト細胞において複製する能力を有する。
【0167】
一部の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは宿主細胞において複製するが、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば宿主の染色体では、宿主のゲノムに組み込まれない。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば宿主の染色体では、無視できる程度の組換え頻度しか呈しない。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば宿主の染色体では、例えば、約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満、又はそれより低い組換え頻度を呈する。
【0168】
線状及び環状ＲＮＡの検出
環状ＲＮＡ医薬調製物中の線状ＲＮＡの存在は、予期せぬ、時に望ましくない効果を及ぼし得る。したがって、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡと比べて濃縮し、分離し、及び／又は精製し得る；線状ＲＮＡをモニタし、評価し、及び／又は制御することのできる方法（例えば、環状ＲＮＡ調製物の製造方法）；及びかかる医薬組成物及び調製物を使用する方法。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ調製物は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ調製物は、線状ＲＮＡと比べて濃縮されるか、又は線状ＲＮＡが減少するように精製される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド集団は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物に閾値レベルの環状ポリリボヌクレオチドが含まれるように濃縮される。
環状ＲＮＡ医薬調製物中の線状ＲＮＡの存在は、予期せぬ、時に望ましくない効果を及ぼし得る。したがって、環状ＲＮＡを線状ＲＮＡと比べて濃縮し、分離し、及び／又は精製し得る；線状ＲＮＡをモニタし、評価し、及び／又は制御することのできる方法（例えば、環状ＲＮＡ調製物の製造方法）；及びかかる医薬組成物及び調製物を使用する方法。一部の実施形態において、環状ＲＮＡ調製物は、閾値レベル以下の線状ＲＮＡを有し、例えば、環状ＲＮＡ調製物は、線状ＲＮＡと比べて濃縮されるか、又は線状ＲＮＡが減少するように精製される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド集団は、環状ポリリボヌクレオチドと線状ポリリボヌクレオチドとの混合物に閾値レベルの環状ポリリボヌクレオチドが含まれるように濃縮される。
【0169】
概して、医薬調製物中の要素の検出及び定量化は、目的の成分（例えば、環状ＲＮＡ、線状ＲＮＡ、断片、不純物等）若しくは類似の材料（例えば、環状ＲＮＡの標準として環状ＲＮＡ構造と同じ配列の線状ＲＮＡ構造を使用する）のいずれかである参照標準の使用を含み、又は試験試料からの内部標準若しくはシグナルの使用を含む。一部の実施形態において、標準を使用して、既知量又は相対量の材料についての検出器からの応答（レスポンスファクター）を確立する。一部の実施形態において、レスポンスファクターは、１つ又は複数の濃度の標準から（例えば、線形回帰分析を用いて）決定される。一部の実施形態において、次にレスポンスファクターを使用して、その成分に起因するシグナルから目的の材料の量が決定される。一部の実施形態において、レスポンスファクターは、１の値であるか、又は１の値を有すると仮定される。
【0170】
一部の実施形態において、医薬組成物中の環状ＲＮＡと比べた線状ＲＮＡの検出及び定量化が、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドとの比較を用いて決定される。一部の実施形態において、線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドを使用し、及び１のレスポンスファクターを仮定して作成した検量線を使用して、医薬組成物中の全リボヌクレオチドの質量が決定される。一部の実施形態において、複数の既知量の線状バージョンの環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度によって作成した検量線を医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのバンド強度と比較することにより、医薬調製物中の環状ポリリボヌクレオチドのｗ／ｗパーセンテージが決定される。一部の実施形態において、ゲルベースの電気泳動法の間にバンドが生成され、バンド強度がゲルイメージャ（例えば、Ｅ－ｇｅｌイメージャ）によって測定される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）の線状ポリリボヌクレオチド分子を含む。
【0171】
一部の実施形態において、医薬組成物中の全ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。一部の実施形態において、医薬組成物中の線状ＲＮＡと比べたニックＲＮＡの検出及び定量化が、環状ＲＮＡを含む調製物のゲル抽出後にシーケンシングすることにより決定される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド調製物は、本明細書に記載されるとおり評価したとき閾値量未満（例えば、ここで閾値量は、参照基準、例えば、環状ポリリボヌクレオチド調製物の医薬品出荷規格である）のニックＲＮＡ、線状ＲＮＡ、又は線状ＲＮＡとニックＲＮＡとの組み合わせを含む。例えば、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下の線状ポリリボヌクレオチド分子、又はこれらの間にある任意のパーセンテージである。一部の実施形態において、調製物中に存在するニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージのニックポリリボヌクレオチド分子である。一部の実施形態において、調製物中に存在する線状及びニックポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、調製物中の総リボヌクレオチド分子を基準として４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、１％、０．５％、又は０．１％以下、又はこれらの間にある任意のパーセンテージの線状ポリリボヌクレオチド分子とニックポリリボヌクレオチド分子との組み合わせである。
【0172】
一部の実施形態において、標準は、試料と同じ条件下で実行される。例えば、標準は、試料と同じ種類のゲル、同じ緩衝液、及び同じ露光量で実行される。更なる実施形態では、標準は、試料と並行して実行される。一部の実施形態において、要素の定量化は対象調製物からの複数の試料で（例えば、２回又はトリプリケートで）繰り返され、平均結果が求められる。一部の実施形態において、線状ＲＮＡの定量化は、並列キャピラリー電気泳動法を用いて（例えば、Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ又はＵＶ検出を伴う分析的ＨＰＬＣを用いて）測定される。
【0173】
或いは、存在する線状及び環状ＲＮＡの量を測定するため、２組のプライマー：ライゲーション部位にわたる１つと、ＯＲＦに特異的な１つとを使用したｑＰＣＲ逆転写（ＲＴ－ｑＰＣＲ）。ライゲーション部位にわたるプライマーは、環状ＲＮＡのレベルに関して報告する一方、ＯＲＦに特異的なプライマーは、環状及び線状両方のＲＮＡに関して報告する。一部の実施形態において、逆転写反応は、逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ：ＲＮアーゼＨ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びランダムヘキサマーで製造者の指示に従い実施される。一部の実施形態において、増幅されたＰＣＲ産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析され、臭化エチジウム染色によって可視化される。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮倍数を推定するために、デンシトメトリーを用いてＰＣＲ産物を定量化してもよく、全ＲＮＡ試料の濃度を紫外吸光度により測定してもよい。
【0174】
他の実施形態
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。
【0175】
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれることが具体的且つ個々に示されたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0176】
本開示を限定するのではなく例示することが意図される以下の実施例は、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作製され、評価され得るかの説明を当業者に提供するために提示される。実施例は、本開示を純粋に例示するものであることが意図されており、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【0177】
実施例１：線状ポリリボヌクレオチドの分解のためのエキソヌクレアーゼ濃度の最適化
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼを使用して線状ポリリボヌクレオチドを分解できることを実証する。
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼを使用して線状ポリリボヌクレオチドを分解できることを実証する。
【0178】
この実験では、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）をコードする２．５μｇの線状ポリリボヌクレオチドを０Ｕ、０．５Ｕ、０．６２５Ｕ、１Ｕ、１．２５Ｕ、２．５Ｕ又は５Ｕの３’エキソヌクレアーゼであるＲＮアーゼＲにより３７℃で９０分間消化した。各消化はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で実施し、ＥＤＴＡでクエンチし、及びゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。この実験の結果は、３’エキソヌクレアーゼＲＮアーゼＲにより線状ポリリボヌクレオチドが分解されたことを示している（図１）。実施例５及び７においては、１μｇのＲＮＡ当たり０．５ＵのＲＮアーゼＲを選択し、使用した（図６、図８～図１０）。
【0179】
この実験では、ｇＬｕｃをコードする２．５μｇの線状ポリリボヌクレオチドを０Ｕ、０．０２５Ｕ、０．０３Ｕ、０．０５Ｕ、０．０６２５Ｕ、０．１２５Ｕ又は０．２５Ｕの５’エキソヌクレアーゼであるＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼにより３７℃で６０分間消化した。各消化はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で実施し、ＥＤＴＡでクエンチし、及びゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。この実験の結果は、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）５’エキソヌクレアーゼにより線状ポリリボヌクレオチドが分解されたことを示している（図２）。実施例５及び７においては、１μｇのＲＮＡ当たり０．０２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼを選択し、使用した（図６、図８～図１０）。
【0180】
この実験では、ｇＬｕｃをコードする２．５μｇの線状ポリリボヌクレオチドを０Ｕ、０．０２５Ｕ、０．０３Ｕ、０．０５Ｕ、０．０６２５Ｕ、０．１２５Ｕ又は０．２５Ｕの５’エキソヌクレアーゼであるＸｒｎ－１により３７℃で６０分間消化した。各消化はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で実施し、ＥＤＴＡでクエンチし、及びゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。この実験の結果は、５’エキソヌクレアーゼＸｒｎ－１により線状ポリリボヌクレオチドが分解されたことを示している（図３）。実施例５及び７においては、１μｇのＲＮＡ当たり０．０５ＵのＸｒｎ－１を選択し、使用した（図６、図８～図１０）。
【0181】
この実施例１により、５’及び３’エキソヌクレアーゼが線状ポリリボヌクレオチドを分解することが実証された。
【0182】
実施例２：ガウシアルシフェラーゼをコードする環状ポリリボヌクレオチドのインビトロ産生
本例は、環状ポリリボヌクレオチドのインビトロ産生について記載する。
本例は、環状ポリリボヌクレオチドのインビトロ産生について記載する。
【0183】
環状ポリリボヌクレオチドを、ＩＲＥＳ及びガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ、及びＩＲＥＳ－ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素で設計した。以下の２つの方法のうちの一方を使用したインビトロ合成（ＩＶＴ）を用いて環状ポリリボヌクレオチドを生成した。
【0184】
第１の方法では、上記の要素を含むＤＮＡセグメントからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＩＶＴにより未修飾の線状ポリリボヌクレオチドを合成した。転写されたポリリボヌクレオチドをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理し、及びＲＮＡ精製システムで再び精製した。ＲｐｐＨ処理した線状ポリリボヌクレオチドをスプリントＤＮＡを使用して環状化した。
【0185】
第２の方法では、上記の要素を含むＤＮＡセグメントからのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したＩＶＴにより未修飾の線状ポリヌクレオチドを合成した。ＩＶＴに使用したヌクレオチド混合物には、５’一リン酸を持つＲＮＡが優先的に産生されるように、グアノシン三リン酸と比べて過剰量のグアノシン一リン酸が含まれた。転写されたポリリボヌクレオチドをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）で製造者の指示に従い精製した。精製したＩＶＴ産物をスプリントＤＮＡを使用して環状化した。
【0186】
環状ポリリボヌクレオチドを以下のとおりのスプリントライゲーションにより生成した：転写された線状ポリリボヌクレオチド及びＤＮＡスプリント（５’－ＧＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧ－３’；配列番号１）を混合してアニールし、ＲＮＡリガーゼで処理することにより、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を作製した。この環状化反応の副産物は、未反応の線状ポリリボヌクレオチドである。
【0187】
実施例３：５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した線状ポリリボヌクレオチドの選択的分解
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して線状ポリリボヌクレオチドを選択的に分解できることを実証する。
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して線状ポリリボヌクレオチドを選択的に分解できることを実証する。
【0188】
環状化反応後の未反応の線状ポリリボヌクレオチドを分解するため、５’エキソヌクレアーゼと３’エキソヌクレアーゼとの組み合わせを使用した。この実施例では、実施例２に記載されるとおり作製した環状及び線状の両方のポリリボヌクレオチドを含む２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を０．５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）５’エキソヌクレアーゼ及び１Ｕ、２Ｕ、４Ｕ、６Ｕ、８Ｕ又は１０Ｕの３’エキソヌクレアーゼＲＮアーゼＲによって同時に３７℃で９０分間消化した。各消化はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）中で実施し、ＥＤＴＡでクエンチし、及びゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。本実施例の結果は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせがライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の線状ポリリボヌクレオチドを選択的に分解したことを示している（図４）。
【0189】
実施例４：５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮
本例は、スケールアップした反応で５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチドを濃縮できることを実証する。
本例は、スケールアップした反応で５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチドを濃縮できることを実証する。
【0190】
この実施例では、実施例２に記載されるとおり作製した１ｍｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を４０００ＵのＲＮアーゼＲ及び２００ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼによって同時に３７℃で６０分間消化した。消化は、Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液中で実施し、ＥＤＴＡでクエンチし、及びゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。本実施例の結果は、組み合わせの５’及び３’エキソヌクレアーゼを使用してライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドが濃縮されたことを示している（図５）。
【0191】
実施例５：低濃度の５’及び３’エキソヌクレアーゼを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮
本例は、低濃度の５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを用いて環状ポリリボヌクレオチドを濃縮できることを実証する。
本例は、低濃度の５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを用いて環状ポリリボヌクレオチドを濃縮できることを実証する。
【0192】
この実施例では、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を（ｉ）１．２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ；又は（ｉｉ）１．２５Ｕ ＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＸｒｎ－１のいずれかによって同時にＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液中３７℃で６０分間消化した。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、ゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで画像化した エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。本実施例の結果は、最適濃度の５’及び３’エキソヌクレアーゼで同時に消化すると、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の線状ポリリボヌクレオチドが選択的に分解され、濃縮環状ポリリボヌクレオチド調製物が作り出されることを示している（図６）。
【0193】
実施例６：５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮
本実施例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの２つの異なる組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮を比較する。
本実施例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの２つの異なる組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮を比較する。
【0194】
この例では、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を１μｇのＲＮＡ当たり０．５ＵのＲＮアーゼＲ（Ｌｕｃｉｇｅｎ又はＭＣ Ｌａｂｓ）及び０．０２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）エキソヌクレアーゼ；又は（ｉｉ）１μｇのＲＮＡ当たり０．５ＵのＲＮアーゼＲ（Ｌｕｃｉｇｅｎ又はＭＣ Ｌａｂｓ）及び０．２ＵのＸｒｎ－１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって同時にＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液中３７℃で６０分間消化した。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、ゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。
【0195】
図７は、本実施例の結果を示す（レーン１：ＮＥＢ ｓｓＲＮＡラダー；レーン２：２．５μｇ未処理ライゲーション後混合物；レーン３：ＲＮアーゼＲ＋Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼで処理した２．５μｇのライゲーション後混合物；レーン４：ＲＮアーゼＲ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）＋Ｘｒｎ－１エキソヌクレアーゼで処理した２．５μｇのライゲーション後混合物；レーン５：Ｘｒｎ－１で処理した２．５μｇのライゲーション後混合物；レーン６：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）単独で処理した２．５μｇのライゲーション後混合物；レーン７：ＲＮアーゼＲ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）単独で処理した２．５μｇライゲーション後混合物；レーン８：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ及びＲＮアーゼＲ（ＭＣ Ｌａｂｓ）で処理した２．５μｇライゲーション後混合物；レーン９：Ｘｒｎ－１及びＲＮアーゼＲ（ＭＣ Ｌａｂｓ）で処理した２．５μｇライゲーション後混合物混合物；レーン：１０：ＲＮアーゼＲ（ＭＣ Ｌａｂｓ）で処理した２．５μｇライゲーション後混合物）。ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物は、６４％環状ポリリボヌクレオチドからなった（レーン２）。ＲＮアーゼＲ及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼによる消化後、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドは、８０％（レーン３及びレーン８）環状ポリリボヌクレオチドに濃縮された。ＲＮアーゼＲ＋Ｘｒｎ－１による消化後、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドは、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＲＮアーゼＲで７６％（レーン４）及びＭＣ Ｌａｂｓ ＲＮアーゼＲで８１％（レーン９）に濃縮された。Ｘｒｎ－１又はＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼのみを単独で使用したとき、環状ポリリボヌクレオチドのライゲーション後混合物は、それぞれ６９％（レーン５）又は７４％（レーン７）に濃縮された。Ｌｕｃｉｇｅｎ ＲＮアーゼＲ又はＭＣ Ｌａｂｓ ＲＮアーゼＲのみを単独で使用したとき、環状ポリリボヌクレオチドのライゲーション後混合物は、それぞれ６１％（レーン６）又は７４％（レーン１０）に濃縮された。
【0196】
実施例７．環状ポリリボヌクレオチドの濃縮のためのエキソヌクレアーゼ反応時間の同定
本例は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮に使用した５’及び３’エキソヌクレアーゼによる線状ポリリボヌクレオチドの消化の反応時間を比較する。
本例は、環状ポリリボヌクレオチドの濃縮に使用した５’及び３’エキソヌクレアーゼによる線状ポリリボヌクレオチドの消化の反応時間を比較する。
【0197】
この実験では、実施例２に記載されるとおり作製した３．７５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を（ｉ）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液中１５ＵのＲＮアーゼＲ及び１．５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼのいずれかによって同時に消化した：反応は３７℃で１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、又は１２０分にわたって実施した。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、ゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージをＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。本実施例の結果は、反応時間が９０及び分以下になると、ライゲーション後及びエキソヌクレアーゼによる消化前に残留した環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも５０％が、５’及び３’エキソヌクレアーゼの両方による消化後にもなお残留したままであったことを示している。本実施例の結果はまた、反応時間が１５分以上になると、結果として得られる全ポリリボヌクレオチド（ｐｏｌｙ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｅｓ）には少なくとも８０％の環状ポリリボヌクレオチドが含まれることも示している。試験した各反応時間の結果は、表２に要約する。
【0198】
【表2】
【0199】
実施例８：環状ポリリボヌクレオチドの濃縮のための緩衝液条件の同定
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮のための緩衝液条件の同定について記載する。
本例は、５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮のための緩衝液条件の同定について記載する。
【0200】
実験１
この実験では、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を（ｉ）１．２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ；又は（ｉｉ）１．２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＸｒｎ－１のいずれかによって同時に３７℃で６０分間、以下の緩衝液のうちの１つの中で消化した：
緩衝液Ｔ：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ；有標）
緩衝液１：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）
緩衝液２：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
緩衝液３：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＤＴＴ
緩衝液４：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ
この実験では、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を（ｉ）１．２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ；又は（ｉｉ）１．２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＸｒｎ－１のいずれかによって同時に３７℃で６０分間、以下の緩衝液のうちの１つの中で消化した：
緩衝液Ｔ：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ；有標）
緩衝液１：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）
緩衝液２：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
緩衝液３：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＤＴＴ
緩衝液４：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ
【0201】
対照として、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を緩衝液１、緩衝液２、緩衝液３又は緩衝液４中にエキソヌクレアーゼ消化なしに混合した（緩衝液対照）。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、ゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション（ｌｉｇａｔｔｉｏｎ）後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。
【0202】
図８は、様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中でのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼとＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化の結果を示す（レーン１：ＮＥＢ ｓｓＲＮＡラダー；レーン２：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）＋ＲＮアーゼＲ）；レーン３：緩衝液１対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン４：緩衝液１（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）＋ＲＮアーゼＲ）；レーン５：緩衝液２対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン６：緩衝液２（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）＋ＲＮアーゼＲ）；レーン７：緩衝液３対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン８：緩衝液３（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）＋ＲＮアーゼＲ）；レーン９：緩衝液４対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン１０：緩衝液４（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）＋ＲＮアーゼＲ））。ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドは、緩衝液２中でのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼとＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化後に８３％に濃縮された（レーン６）。
【0203】
図９は、様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中でのＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化の結果を示す（レーン１：ＮＥＢ ｓｓＲＮＡラダー；レーン２：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン３：緩衝液１対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン４：緩衝液１（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン５：緩衝液２対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン６：緩衝液２（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン７：緩衝液３対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン８：緩衝液３（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン９：緩衝液４対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン１０：緩衝液４（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ））。これらの結果は、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドが緩衝液２中でのＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化後に８５％に濃縮されたことを示している（レーン６）。
【0204】
実験２
この実験では、実施例２に記載されるとおり調製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を０．０６２５ＵのＸｒｎ－１及び１．２５Ｕ ＲＮアーゼＲによって同時に３７℃で６０分間、以下の緩衝液のうちの１つの中で消化した：
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ；有標）
Ｘｒｎ－１緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ；ｐＨ７．９）
ＲＮアーゼＲ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２）
緩衝液２：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
この実験では、実施例２に記載されるとおり調製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を０．０６２５ＵのＸｒｎ－１及び１．２５Ｕ ＲＮアーゼＲによって同時に３７℃で６０分間、以下の緩衝液のうちの１つの中で消化した：
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ；有標）
Ｘｒｎ－１緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ；ｐＨ７．９）
ＲＮアーゼＲ緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ２）
緩衝液２：１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
【0205】
対照として、実施例２に記載されるとおり作製した２．５μｇのライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を各緩衝液中にエキソヌクレアーゼ消化なしに混合した（緩衝液対照）。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、ゲル電気泳動により分析した。ＴＢＥ－尿素ゲルをＳＹＢＲ Ｓａｆｅで染色し、ｉＢｒｉｇｈｔイメージャー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で画像化した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状）、及びライゲーション後に存在した環状ポリリボヌクレオチドの量と比較してエキソヌクレアーゼによる消化後に残留している環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージ（％ｅＲＮＡ残留）をＩｍａｇｅ Ｌａｂにより分析した。図１０は、様々な緩衝液及び対応する緩衝液対照中でのＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化の結果を示す（レーン１：ＮＥＢ ｓｓＲＮＡラダー；レーン２：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液対照（エキソヌクレアーゼなし）；レーン３：Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ａ緩衝液（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン４：Ｘｒｎ－１緩衝液対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン５：Ｘｒｎ－１緩衝液（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン６：ＲＮアーゼＲ緩衝液対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン７：ＲＮアーゼＲ緩衝液（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）；レーン８：緩衝液２対照（エキソヌクレアーゼ消化なし）；レーン９：緩衝液２（Ｘｒｎ－１＋ＲＮアーゼＲ）。これらの結果は、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドがＲＮアーゼＲ緩衝液２中でのＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化後に８７％に濃縮されたことを示している（レーン７）。ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドは、緩衝液２中でのＸｒｎ－１とＲＮアーゼＲとの組み合わせによる消化後に８５％に濃縮された（レーン９）。
【0206】
実施例９：濃縮した環状ＲＮＡからのガウシアルシフェラーゼのインビトロ発現
本例は、二重エキソヌクレアーゼを使用して濃縮した環状ポリリボヌクレオチドが、二重エキソヌクレアーゼを使用せずに逆相クロマトグラフィーを使用して精製した環状ポリリボヌクレオチドと同等のレベルでＧＬｕｃを発現することを実証する。
本例は、二重エキソヌクレアーゼを使用して濃縮した環状ポリリボヌクレオチドが、二重エキソヌクレアーゼを使用せずに逆相クロマトグラフィーを使用して精製した環状ポリリボヌクレオチドと同等のレベルでＧＬｕｃを発現することを実証する。
【0207】
二重エキソヌクレアーゼ、逆相精製試料を生成するため、実施例２に記載されるとおり作製したライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を１μｇのＲＮＡ当たり０．０２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼ及び１μｇのＲＮＡ当たり０．５Ｕ ＲＮアーゼＲによって同時に３７℃で６０分間消化した。消化をＥＤＴＡでクエンチし、逆相クロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィー及び緩衝液交換後、精製した環状ポリリボヌクレオチドの発現をインビトロ発現により試験した。
【0208】
逆相精製試料を生成するため、ライゲーション後ポリリボヌクレオチド混合物を逆相クロマトグラフィーにより精製した。クロマトグラフィー及び緩衝液交換後、精製した環状ポリリボヌクレオチドの発現をインビトロ発現により試験した。
【0209】
ＨｅＬａ細胞（１０，０００個）に０．１ｐｍｏｌの精製環状ポリリボヌクレオチドをトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＬＭＲＮＡ０１５））を使用してトランスフェクトした。６時間、２４時間、４８時間及び７２時間の時点でガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（１６１５９））を使用してガウシアルシフェラーゼの活性を測定することにより上清を分析した。
【0210】
この実施例により、濃縮した環状ＲＮＡからのタンパク質発現の成功が実証された（図１１）。
【0211】
実施例１０：様々な分子量の環状ポリリボヌクレオチドの選択的濃縮
本例は、広範囲の分子量サイズにわたって５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチドを選択的に濃縮する能力を実証する。
本例は、広範囲の分子量サイズにわたって５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチドを選択的に濃縮する能力を実証する。
【0212】
この例では、１５０．０μｇの様々なポリリボヌクレオチドを１μｇのＲＮＡ当たり０．６２５ＵのＲＮアーゼＲ及び０．０６２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）エキソヌクレアーゼによって同時に緩衝液２中３７℃で６０分間消化した。評価したコードされるポリリボヌクレオチドＯＲＦの各々について分子量は様々であった。ＲＮＡ１～ＲＮＡ６の各々は、分子量が左から右に増加する、１．２ｋｂ未満から５．４ｋｂ超までの範囲の異なるサイズの発現配列を持つ同一の環状ポリリボヌクレオチドである。いずれの場合も、消化をＥＤＴＡでクエンチし、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）により分析した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状ＲＮＡ）を消化前の混合物の環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージと比較した。図１２は、１．２ｋｂ未満のサイズ、１．２～１．４ｋｂ、１．４～１．６ｋｂ、３．５～４．５ｋｂ、４．５～５．４ｋｂの範囲、及び５．４ｋｂ超のサイズの環状ポリリボヌクレオチドの選択的濃縮に関する本例の結果を示す。消化前の全ポリリボヌクレオチドの環状集団は、それぞれ、７１．４、５９．０、６４．１、２１．９、２１．２、及び１７．６パーセントと決定された。ＲＮアーゼＲ及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）による消化後、これらの同じポリリボヌクレオチドの環状集団は、それぞれ、８６．０、７９．４、８０．２、３２．０、４８．９、及び２５．７パーセントにまで濃縮されたことが分かった。
【0213】
実施例１１：様々な５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用した環状ポリリボヌクレオチドの濃縮
本例は、４つの５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチド集団を選択的に濃縮する能力を実証する
本例は、４つの５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせを使用して環状ポリリボヌクレオチド集団を選択的に濃縮する能力を実証する
【0214】
この例では、１５０．０μｇのポリリボヌクレオチドを１μｇのＲＮＡ当たり（ｉ）０．６２５ＵのＲＮアーゼＲ（ａ）及び０．０６２５ＵのＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）；（ｉｉ）０．６２５Ｕ ＲＮアーゼＲ（ａ）及び０．０６２５ＵのＸｒｎ－１；（ｉｉｉ）０．６２５Ｕ ＲＮアーゼＲ（ｂ）及び０．０６２５Ｕ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）；又は（ｉｖ）０．６２５Ｕ ＲＮアーゼＲ（ｂ）及び０．０６２５Ｕ Ｘｒｎ－１エキソヌクレアーゼによって同時に３７℃で６０分間消化した。各消化をＥＤＴＡでクエンチし、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＡＥＸ－ＨＰＬＣ）により分析した。エキソヌクレアーゼによる消化後の全ポリリボヌクレオチドのうち環状ポリリボヌクレオチドであるパーセンテージ（％環状ＲＮＡ）を消化前の環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージと比較した。本例の結果は、様々な５’及び３’エキソヌクレアーゼの組み合わせで環状ポリリボヌクレオチド種の選択的濃縮を実現できることを実証している。図１３は、（ｉ）ＲＮアーゼＲ（ａ）及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）；（ｉｉ）ＲＮアーゼＲ（ａ）及びＸｒｎ－１；（ｉｉｉ）ＲＮアーゼＲ（ｂ）及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）；及び（ｉｖ）ＲＮアーゼＲ（ｂ）及びＸｒｎ－１を使用した同時消化の結果を示す。ＩＶＴ後ポリリボヌクレオチド混合物中の環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージは、同時消化プロセス前は僅か１８．２％であった。同時消化後、環状ポリリボヌクレオチドのパーセンテージは、それぞれ、（ｉ）３６．０±０．９１；（ｉｉ）３９．０±０．０３；（ｉｉｉ）３０．２±０．７０；及び（ｉｖ）３６．５±２．２３パーセントに濃縮されたことが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
配列表
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが６，３０７バイトである２０２３年３月１５日に作成された５１５０９－０３４ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３＿１５＿２３＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されるものである。この配列表は、サイズが６，３０７バイトである２０２３年３月１５日に作成された５１５０９－０３４ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿３＿１５＿２３＿＿ＳＴ２５という表題のファイルとして提供される。この配列表の電子形式での情報は、全体として参照により本明細書に援用される。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】