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特表2024-523123去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるスタキオースの使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるスタキオースの使用

(51)【国際特許分類】

A61K 31/702 20060101AFI20240621BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20240621BHJP

A61P 13/08 20060101ALI20240621BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240621BHJP

A61K 31/4166 20060101ALI20240621BHJP

A61K 31/085 20060101ALI20240621BHJP

A61P 5/28 20060101ALI20240621BHJP

A61K 31/58 20060101ALI20240621BHJP

A61K 31/501 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

A61K31/702

A61K45/00

A61P13/08

A61P35/00

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K31/4166

A61K31/085

A61P5/28

A61K31/58

A61K31/501

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023571898

(86)(22)【出願日】2021-07-26

(85)【翻訳文提出日】2024-01-19

(86)【国際出願番号】 CN2021108363

(87)【国際公開番号】W WO2023272831

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】202110744184.2

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１８００ＬｉｈｕＡｖｅｎｕｅ，ＢｉｎＨｕＤｉｓｔｒｉｃｔ，Ｗｕｘｉ，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】王栄

(72)【発明者】

【氏名】陳永泉

(72)【発明者】

【氏名】許▲ろ▼

(72)【発明者】

【氏名】王小英

(72)【発明者】

【氏名】朱升龍

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

4C084MA23

4C084MA24

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA38

4C084MA41

4C084MA44

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4C084MA66

4C084NA05

4C084NA12

4C084NA14

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4C084ZB261

4C084ZC421

4C084ZC751

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4C086MA05

4C086MA23

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4C086MA38

4C086MA41

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4C206AA02

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4C206NA12

4C206NA14

4C206ZA81

4C206ZB26

4C206ZC42

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明は去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるスタキオースの使用を開示し、生物医学の技術分野に属する。本発明は、スタキオースとアンドロゲン受容体拮抗薬を組み合わせてＣＲＰＣの治療薬を調製するための新たな戦略を初めて提案し、多角的且つ多段階の検証研究を行うものである。本発明のスタキオースとアンドロゲン受容体を組み合わせた医薬組成物は去勢抵抗性前立腺がんの治療に使用でき、去勢抵抗性前立腺がんに対するエンザルタミドの阻害効果を顕著に向上させることができ、天然化合物を末期がんに適用し、臨床治療上に重要な意義がある。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるスタキオースの使用。

【請求項2】

前記使用は、スタキオースを単独で、又はアンドロゲン受容体拮抗薬と組み合わせて去勢抵抗性前立腺がんの治療薬を調製することを含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記組成物はスタキオースとアンドロゲン受容体拮抗薬を含むことを特徴とする去勢抵抗性前立腺がんを治療するための医薬組成物。

【請求項4】

アンドロゲン受容体拮抗薬とスタキオースとの質量比は（１～８）：１であることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

アンドロゲン受容体拮抗薬は、エンザルタミド、ＥＰＩ、アビラテロン、オラパリブのいずれか１種以上を含むことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記医薬組成物は医薬賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記医薬賦形剤は、溶剤、噴射剤、可溶化剤、助溶剤、乳化剤、着色剤、接着剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、安定剤、流動助剤、矯味剤、防腐剤、懸濁助剤、コーティング材、香味剤、接着防止剤、統合剤、浸透促進剤、ｐＨ値調整剤、緩衝剤、可塑剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、包接剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤及び解膠剤、濾過助剤及び放出阻害剤を含むことを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記医薬組成物は医薬担体をさらに含んでもよいことを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記医薬担体はマイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子及びリポソームを含むことを特徴とする請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記医薬組成物の剤型は、注射液、注射用凍結乾燥粉末剤、徐放性注射剤、リポソーム注射剤、懸濁剤、植込剤、塞栓剤、カプセル剤、錠剤、丸剤及び経口液剤を含むことを特徴とする請求項３～９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生物医学の技術分野に属し、具体的には、去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるスタキオースの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アンドロゲン除去療法が進行前立腺がんの標準治療方法であるが、患者は平均１～３年の治療後に最終的に去勢抵抗性前立腺がん（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ＣＲＰＣ）を発症する。ＣＲＰＣとは、最初の連続的なアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）の後に疾患が依然として進行する前立腺がんを指す。２００４年に、ドセタキセルが転移性去勢抵抗前立腺がん（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ｍＣＲＰＣ）患者の全生存期間を延長できることが証明されて以来、アビラテロン酢酸エステル、エンザルタミド、カバジタキセル等のｍＣＲＰＣ疾患段階に対する薬剤が出現し、これらの患者の治療状況を変えたが、ＣＲＰＣを完全に回復させることは困難である。従って効果的な他の治療標的又は併用治療戦略を見つけることはＣＲＰＣの治療における別の研究のホットスポットとなる。

【0003】

近年来、細胞可塑性は標的診断回避モデルとして出現しており、多くのがん薬剤耐性の共通性である。新たな薬剤耐性経路をブロックすると持続細胞（ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｃｅｌｌ）を効果的に阻害することができ、例えば、ＧＰＸ４脂質過酸化経路は、多くのｐｅｒｓｉｓｔｅｒｃｅｌｌ状態で高度に発現する効果的な標的である。これまでのところ、ＣＲＰＣ腫瘍にｐｅｒｓｉｓｔｅｒｃｅｌｌがあるか否か、及び新たな効果的な標的を見つけることができるか否かは分かっていない。従って、この研究は、ＥＰＩ－００１及びＥｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅによって生成された前立腺がんＬＮＣａＰ－ｐｅｒｓｉｓｔｅｒｃｅｌｌから出発して、ＣＲＰＣを治療するための効果的な併用薬剤を見つけることに焦点を当てている。

【0004】

ＥＰＩ－００１（ＥＰＩ）は、臨床開発が待たれている、ＣＲＰＣの治療に用いられる可能性があるＡＲ及びＡＲ－スプライス変異体（ＡＲ－Ｖｓ）の阻害剤である。ＣＲＰＣに対するＥＰＩの標的は主にＮ－末端ドメイン（ＮＴＤ）である。エンザルタミド（Ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ、Ｅｎｚａ）は最初の承認された第２世代ＡＲアンタゴニストであり、従来の抗アンドロゲンに比べてＡＲに対する親和性が５～８倍高い。２０１２年に、米国ＦＤＡはこれに基づきＣＲＰＣ患者向けたＥｎｚａを承認した。しかし、ＥＰＩであれＥｎｚａであれ、ＣＲＰＣの治療に対する薬剤耐性は通常１８カ月前後に出現する。従って薬剤耐性を克服し、ＣＲＰＣを遅らせるための他の方法は緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明が解決しようとする技術的課題は、上記従来の薬剤に存在する薬剤耐性を克服し、ＥｎｚａとＳｔａｃを併用することによりＣＲＰＣの治療効果を顕著に向上させ、優れた相乗効果を発揮する効果的なＣＲＰＣ治療薬を提供することである。

【0006】

スタキオース（Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ、Ｓｔａｃ）は、ショ糖のグルコース基側に、１，６－グルコシド結合で２つのα－ガラクトースを結合した糖類であり、分子式はＣ２４Ｈ４２Ｏ２１である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の第１の目的は去勢抵抗性前立腺がんの治療薬の調製におけるＳｔａｃの使用を提供することである。

【0008】

本発明の一実施形態では、前記使用は、Ｓｔａｃとアンドロゲン受容体拮抗薬を組み合わせて去勢抵抗性前立腺がんの治療薬を調製することを含む。

【0009】

本発明の第２の目的は、Ｓｔａｃとアンドロゲン受容体拮抗薬を含む、去勢抵抗性前立腺がんを治療するための医薬組成物を提供することである。

【0010】

本発明の一実施形態では、アンドロゲン受容体拮抗薬とＳｔａｃの質量比は（１～８）：１である。好ましくは、ＥｎｚａとＳｔａｃの質量比は１～３：１である。

【0011】

本発明の一実施形態では、アンドロゲン受容体拮抗薬は、エンザルタミド（Ｅｎｚａ）、ＥＰＩ－００１（ＥＰＩ）、アビラテロン、オラパリブのいずれか１種以上を含む。

【0012】

本発明の一実施形態では、前記医薬組成物は医薬賦形剤をさらに含む。

【0013】

本発明の一実施形態では、前記医薬賦形剤は、溶剤、噴射剤、可溶化剤、助溶剤、乳化剤、着色剤、接着剤、崩壊剤、充填剤、潤滑剤、湿潤剤、浸透圧調整剤、安定剤、流動助剤、矯味剤、防腐剤、懸濁助剤、コーティング材、香味剤、接着防止剤、統合剤、浸透促進剤、ｐＨ値調整剤、緩衝剤、可塑剤、界面活性剤、発泡剤、消泡剤、増粘剤、包接剤、保湿剤、吸収剤、希釈剤、凝集剤及び解膠剤、濾過助剤及び放出阻害剤を含む。

【0014】

本発明の一実施形態では、前記製剤の剤型は、注射液、注射用凍結乾燥粉末剤、徐放性注射剤、リポソーム注射剤、懸濁剤、植込剤、塞栓剤、カプセル剤、錠剤、丸剤及び経口液剤を含む。

【0015】

本発明の一実施形態では、前記医薬組成物は医薬担体をさらに含んでもよい。

【0016】

本発明の一実施形態では、前記医薬担体はマイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子及びリポソームを含む。

【0017】

本発明の一実施形態では、大量の研究と探索を行ったところ、本発明は、ＣＲＰＣ治療薬、すなわちＥｎｚａとＳｔａｃの併用を見出した。研究結果から分かるように、ＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して耐性のある前立腺がんＬＮＣａＰ－ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ（Ｌ－ＤＴＰ）細胞株を作成することにより、ＬＮＣａＰ細胞はＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して回復可能な薬剤耐性を獲得し、ＥｎｚａとＳｔａｃを併用すると細胞成長を顕著に阻害でき、薬剤併用効果がＣＣＫ８細胞増殖解析により検証され、その相乗作用がＣＩ値により判定される。同時に、Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルを構築し、動物でのＣＲＰＣの治療に対するＥｎｚａとＳｔａｃの単独使用と併用の効果の差を比較し、薬剤の併用による相乗作用はＣＲＰＣに対する単独のＥｎｚａ又はＳｔａｃ薬剤の阻害効果を大幅に向上させ、両者の相乗作用はｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏで検証されている。

【0018】

本発明の一実施形態では、本発明は、Ｌ－ＤＴＰ回復可能な薬剤耐性細胞株を作成し、ＣＣＫ８方法及びＣａｌｃｕｓｙｎソフトウェアでＣＩ値を計算した結果、この細胞株では、Ｅｎｚａ又はＳｔａｃの単独使用に比べて、ＥｎｚａとＳｔａｃのｉｎｖｉｔｒｏ併用がＣＲＰＣに対して相乗効果を有することが示された。Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルを確立することにより、Ｅｎｚａを長期間投与し薬剤耐性が発生するモデルで、動物におけるＥｎｚａとＳｔａｃの併用群は、単剤群に比べて、ｉｎｖｉｖｏでより顕著な抗ＣＲＰＣモデル効果を有することは判明した。

【発明の効果】

【0019】

本発明は以下の有益な効果を有する。

【0020】

本発明は、Ｓｔａｃを利用してＣＲＰＣ治療薬を調製し、及びＥｎｚａとＳｔａｃ薬剤併用に基づきＣＲＰＣを治療するための新たな戦略を初めて提案し、前立腺がんの臨床治療におけるＥｎｚａとＳｔａｃの使用を促進するものであり、重要な意義がある。薬剤研究は、化合物分子から臨床使用まで平均８～１０年かかり、且つ大量の人的及び物的支援が必要となり、時間コスト及び経済的コストが非常に大きい。本発明の解決手段は、天然化合物オリゴ糖の再利用を実現し、創薬から臨床転換までの時間を大幅に短縮することができる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１はＤＴＰ（ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ）とＤＴＥＰ（ｄｒｕｇ－ｔｏｌｅｒａｎｔｅｘｐａｎｄｅｄｐｅｒｓｉｓｔｅｒｓ）細胞の形成過程を示す。

【図2】図２はＤＴＰ及びＤＴＥＰ細胞におけるＡＲ関連タンパク質の発現変化の特徴を示す。

【図3】図３はＤＴＰとＤＴＥＰ細胞のサイクル効果を示す。

【図4】図４はＬ－ＤＴＰ細胞における、ＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＳｔａｃとの併用によるｉｎｖｉｔｒｏ薬効図を示し、図４ＡはＬ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａ細胞における薬剤併用細胞の相対生存率の棒グラフであり、図４ＢはＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＳｔａｃとの併用による、Ｌ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－Ｅｎｚａ細胞のそれぞれにおけるＣＩ値の棒グラフである。

【図5】図５はＣ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａ、Ｓｔａｃ及びその併用による前立腺の重量の変化の効果図であり、図５Ａは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの前立腺の重量の変化図であり、図５Ｂは各群のマウスの前立腺を摘出し写真を撮影した比較写真であり、図５Ｃは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの体重の変化図である。

【図6】図６はＣ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａ、Ｓｔａｃ及びその併用による効果図であり、図６Ａは各群のマウスの前立腺組織切片のＨＥ染色写真であり、図６Ｂは各群のマウスの前立腺組織切片のＰＲＤＸ５、ＡＲ免疫組織化学写真であり、図６Ｃは免疫組織化学による陽性細胞の定量化の棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、明細書の図面及び具体的な実施例を組み合わせて本発明をさらに説明したが、実施例はいかなる形式で本発明を限定するものではない。特に説明しない限り、本発明に用いられる試薬、方法及び装置は本技術分野の従来の試薬、方法及び装置である。

【0023】

特に説明しない限り、以下の実施例で用いられる試薬及び材料は全て市販されている。

【0024】

実施例１ＥＰＩ、Ｅｎｚａを使用して前立腺がんＬＮＣａＰ細胞でＤＴＰ／ＤＴＥＰを生成するプロセス及びこのモデルの特徴
ＥＰＩ、Ｅｎｚａに耐性がある前立腺がんＬ－ＤＴＰ細胞株Ｌ－ＤＴＰ－ＥＰＩ、Ｌ－ＤＴＰ－ＥｎｚａはＡＲ及びその標的のタンパク質発現を阻害することができ、細胞成長阻害は、Ｇ０／Ｇ１期の周期停止として現れる。

【0025】

１、実験方法：
１×１０６個のＬＮＣａＰ細胞を１０ｃｍ細胞培養皿に播種し、翌日接着後、ＥＰＩ、Ｅｎｚａをそれぞれ添加して９日間処置し、この期間、薬剤を含む新鮮な培地を３日ごとに交換し、後続試験のために、９日後に一部の細胞（すなわちＤＴＰ細胞）を回収し、残りの細胞を薬剤で処置し続け、この期間、薬剤を含む新鮮な培地を３日ごとに交換し、後続試験のために、３３日後（すなわちＤＴＥＰ細胞）回収した。ＤＴＰ及びＤＴＥＰ細胞を生成した後、細胞を消化して計数し、１×１０６細胞量における細胞の割合を算出した。回収したＮＣ、ＤＴＰ、ＤＴＥＰ細胞は後続のＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ試験に用いられ、この３群の細胞に対して、細胞分解、タンパク質の抽出と定量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動、膜転写、ブロッキング、一次抗体のインキュベーション、二次抗体のインキュベーション、造影を行った後にＡＲ－ＦＬ及びその関連する標的タンパク質、ＡＲ－Ｖｓ及びその関連する標的タンパク質の発現変化、及び細胞周期関連タンパク質の発現の変化を観察した。フローサイトメトリー：ＰＩ染色サイクルキットで死細胞を染色し、フローサイトメトリーで細胞周期の変化を測定する。

【0026】

２、結果は図１、２、３に示された。図１はＤＴＰ及びＤＴＥＰ細胞のＧｉｅｍｓａ染色写真であり、図２はＮＣ、ＤＴＰ、ＤＴＥＰ細胞におけるＡＲ＆ｉｔｓｔａｒｇｅｔｓ、ＡＲ－Ｖｓ＆ｉｔｓｔａｒｇｅｔｓのタンパク質発現の変化を示し、図３はＮＣ、ＤＴＰ、ＤＴＥＰ細胞における細胞周期関連タンパク質の発現の変化を示す。

【0027】

その結果は、ＥＰＩ、Ｅｎｚａによって生成されたＬＮＣａＰ－ＤＴＰ細胞の数が初期播種細胞量の１０３．１１％を占め、ＬＮＣａＰ－ＤＴＥＰ細胞が１１０．９２％を占めることを示している。これらの薬剤耐性細胞はいずれもＥＰＩ、Ｅｎｚａに対して薬剤耐性があり、ＤＴＰで細胞が紡錘形になり、成長が阻害され、ＤＴＥＰで細胞クローンの数が多くなり、細胞成長阻害に抵抗して、細胞が再増殖した。アンドロゲン受容体（ＡＲ）及びその標的のタンパク質発現に対するこのような細胞モデルの影響については、ＤＴＰ状態でＡＲタンパク質の発現が阻害され、ＤＴＥＰでＡＲ発現がある程度で回復し、ＡＲの標的ＴＭＰＲＳＳ２、ＰＳＡの発現はＡＲと一貫した傾向を維持した。アンドロゲン受容体スプライス変異体（ＡＲ－Ｖｓ）及びその標的タンパク質発現に対するに影響について、ＤＴＰ及びＤＴＥＰ状態で、ＡＲ－Ｖｓ及びその標的ＵＢＥ２Ｃ、ＣＤＣ２０タンパク質の発現はいずれも連続的な阻害として現れる。このような阻害は細胞周期の停止によって引き起こされ、具体的には、Ｐ２１（Ｇ１期ｍａｒｋｅｒ）がＤＴＰで上昇し、ＤＴＥＰはある程度で回復し、ＣｙｃｌｉｎＥ１（Ｇ１－Ｓ期ｍａｒｋｅｒ）、ＣＤＣ６（Ｇ１－Ｓ期ｍａｒｋｅｒ）がＤＴＰで下降し、ＤＴＥＰはある程度で回復し、ＣＤＣ２（Ｇ１－Ｓ及びＧ２－Ｍ期ｍａｒｋｅｒ）がＤＴＰで下降し、ＤＴＥＰは顕著に回復しなかった。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析から、ＤＴＰでＧ０／Ｇ１期が停止し、ＤＴＥＰで回復することが分かった。

【0028】

実施例２ＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＳｔａｃ薬剤の併用のｉｎｖｉｔｒｏ効果
さらにＣＣＫ８を用いて、薬剤耐性Ｌ－ＤＴＰ細胞にそれぞれ単独使用したり、併用したりすることによる、薬剤耐性Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）及びＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞におけるＳｔａｃ薬剤のｉｎｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を説明した。

【0029】

１、実験方法
薬剤耐性細胞Ｌ－ＤＴＰ（Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）及びＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）を含む）を９６ウェルプレートに播種し、接着させた後に、高濃度から低濃度まで一連のＳｔａｃ薬剤を調製することにより、最適なＳｔａｃ薬剤濃度を見つけ、続いて、この濃度で、単独使用（Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）－Ｓｔａｃ）、併用［Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＥＰＩ＋Ｓｔａｃ）］、［Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）－ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｅｎｚａ＋Ｓｔａｃ）］のそれぞれによる、薬剤耐性細胞Ｌ－ＤＴＰにおける生存率を測定した。最終的に、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェアを利用して、Ｌ－ＤＴＰ細胞でＣＩ値を計算した。

【0030】

２、結果は図４に示された。図４において、図４ＡはＬ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）薬剤耐性細胞における薬剤併用細胞の相対生存率の棒グラフであり、図４ＢはＥＰＩ、ＥｎｚａのそれぞれとＳｔａｃとの併用による、Ｌ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚ）薬剤耐性細胞のそれぞれにおけるＣＩ値の棒グラフである。

【0031】

その結果は以下を示している。ＥＰＩを９日間連続的に投与し薬剤耐性が発生したＬ－ＤＴＰ（ＥＰＩ）細胞において、ＥＰＩを継続投与しても有意な阻害効果が見つけられておらず、Ｓｔａｃを単独で投与すると有意な阻害効果が見つけられており、阻害率が６７．４８％に達することができ、次に、併用する（ＥＰＩ＋Ｓｔａｃ）と５１．１５％の阻害率に達することができる。同様に、Ｅｎｚａを９日間連続的に投与し薬剤耐性が発生したＬ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞において、Ｅｎｚａを継続投与しても有意な阻害効果が見つけられておらず、Ｓｔａｃを単独で投与すると有意な阻害率があり、阻害率が６２．４７％に達することができ、次に、併用する（Ｅｎｚａ＋Ｓｔａｃ）と５１．９７％の阻害率に達することができる。ＣＩ値を計算したところ、ＳｔａｃはＬ－ＤＴＰ－ＥＰＩ細胞において０．４９の高い相乗作用に達することができ、Ｌ－ＤＴＰ（Ｅｎｚａ）細胞において０．５４の高い相乗作用に達することができる。

【0032】

実施例３Ｃ－ＭＹＣ過剰発現前立腺がんマウスモデルにおける、Ｅｎｚａを連続的に投与し薬剤耐性が発生した後のＥｎｚａとＳｔａｃの併用による効果
さらに、前立腺がんマウスモデルにおいて、化学的去勢（すなわち、Ｅｎｚａを連続的に投与した）後に再発したマウスに対するＥｎｚａとＳｔａｃの併用の効果を説明した。

【0033】

１、実験方法
Ｃ－ＭＹＣ（Ｈｉ－Ｍｙｃ）を過剰発現する自然発生前立腺がんマウスモデルを構築し、４ヵ月で、マウスはｍＰＩＮ／Ｃａｎｃｅｒｔｒａｎｓｉｔｉｏｎに発症し、このとき、ＮＣ対照群（溶媒の胃内投与）、Ｅｎｚａ投与群にランダムに分け、その後、３日ごとに１回胃内投与し、Ｅｎｚａが１０ｍｇ／Ｋｇであり、合計３０日間投与し、その後、数匹のマウスの首を切断し、前立腺がんの写真を撮影して、重量を測定し、Ｅｎｚａが症状を有意に軽減でき、ＮＣ対照群に対して前立腺の重量が半分に減少したことが分かり、その後、上記方法で残りのマウスに３０日間継続投与し、Ｅｎｚａ群に再発があることが分かり、その後（すなわち、ラットが生後６ヶ月の時）、ＮＣ対照群（常に溶媒の胃内投与）、Ｅｎｚａ単剤群、Ｓｔａｃ単剤群、及びＥｎｚａとＳｔａｃ併用群にランダムに分け、対応する投与処置を行い、全て、３日ごとに１回胃内投与し、毎回Ｅｎｚａが１０ｍｇ／Ｋｇであり、Ｓｔａｃが８０ｍｇ／Ｋｇであり、合計３０日間投与した。その後、マウスの首を切断し、その前立腺がんに対して写真撮影、重量測定、及び免疫組織化学等の実験を行った。

【0034】

２、結果は図５及び図６に示された。図５において、図５Ａは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの前立腺の重量の変化図であり、図５Ｂは各群のマウスの前立腺を摘出し写真を撮影した比較写真であり、図５Ｃは薬物投与の進行に伴う各群のマウスの体重の変化図である。図６において、図６Ａは各群のマウスの前立腺組織切片のＨＥ染色写真であり、図６Ｂ、Ｃは各群のマウスの前立腺組織切片のＡＲ、ＰＲＤＸ５免疫組織化学写真及び陽性細胞の定量化の棒グラフである。

【0035】

Ｅｎｚａを３０日間連続的に投与したマウスの前立腺の重量の平均値は４３．９ｍｇであり、このときＮＣ対照群の平均値は８８．７ｍｇであり、９０日間継続投与したところ、Ｅｎｚａ群のマウスの前立腺の重量の平均値は７７．１ｍｇになり、このときＮＣ対照群の平均値は９８．２ｍｇであり、薬剤耐性再発が発生し、ＣＲＰＣが引き起こされたのを示し、このとき、すぐに群別に投与し薬剤併用の効果を説明した。

【0036】

群別併用及び単独使用の結果は表１に示された。

【0037】

図５及び表１を組み合わせて分かるように、Ｅｎｚａの単独使用及びＳｔａｃの単独使用に比べてＥｎｚａとＳｔａｃの併用は非常に顕著な効果があり、前立腺の重量は約３７．０６８ｍｇに減少することができ、それと同時に、薬剤耐性後のＥｎｚａの単独使用に比べてＳｔａｃの単独使用の治療効果はより高く、Ｓｔａｃの単独使用が薬剤耐性のあるＣＲＰＣに対して阻害効果を有することを示している。

【0038】

組織切片のＨＥ染色結果（図６）から、併用治療後に、ＣＲＰＣの前立腺腫瘍は有意な変形及び線維化が見られることが分かる。免疫組織化学から、ＥｎｚａとＳｔａｃの併用は、Ｅｎｚａの単独使用及びＳｔａｃの単独使用に比べて、ＡＲ及びＰＲＤＸ５の発現が顕著に減少したことが分かる。併用の効果が顕著であることを証明する。

【0039】

群別併用及び単独使用の結果は表２に示された。

【0040】