特表 2024-523182 プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット及びそれを用いた菌種を同定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット及びそれを用いた菌種を同定するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240621BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/6806 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023574612

(86)(22)【出願日】2023-05-08

(85)【翻訳文提出日】2023-12-11

(86)【国際出願番号】 KR2023006187

(87)【国際公開番号】W WO2023234577

(87)【国際公開日】2023-12-07

(31)【優先権主張番号】10-2022-0067077

(32)【優先日】2022-05-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523453145

【氏名又は名称】チョングンダン ヘルスケア コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯＮＧＫＵＮＤＡＮＧ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＣＯＲＰ．

【住所又は居所原語表記】１７０， Ｉｎｄｅｏｓｅｕｐａｋｅｕ－ｒｏ， Ｈａｐｄｅｏｋ－ｅｕｐ Ｄａｎｇｊｉｎ－ｓｉ Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｎａｍ－ｄｏ ３１８１６ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミョンス

(72)【発明者】

【氏名】カン、ウンヨン

(72)【発明者】

【氏名】イム、ジョンヒョン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ビョンヨン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ06

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット及びそれを用いた菌種を同定するための方法に関し、さらに詳しくは、プロバイオティクス種及び病原性バクテリア菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間のＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域を標的とするプライマーセットを作製し、それを用いてプロバイオティクス組成物のメタゲノム分析を行うことにより、２１種のプロバイオティクス種及び４種の病原性バクテリア菌種を高解像度且つ高精度で同定できることを確認したので、前記プライマーセットは、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するために有用に用いることができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～９で表されるプライマーを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット。

【請求項2】

前記プライマーが、５'末端にアダプター（ａｄａｐｔｏｒ）配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット。

【請求項3】

前記プライマーが、配列番号１０～１８で表されることを特徴とする、請求項２に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット。

【請求項4】

前記プライマーセットが、菌種のＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域を標的とすることを特徴とする、請求項１に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット。

【請求項5】

前記菌種が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクチカゼイバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、リモシラクトバチルス・ルテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、リジラクトバチルス・サリバリウス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラティラクトバチルス・クルバトゥス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｐ．）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であることを特徴とする、請求項１に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のプライマーセットを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための組成物。

【請求項7】

１）プロバイオティクス組成物からＤＮＡを分離するステップと、
２）前記ステップ１）で分離したＤＮＡを鋳型として、請求項１～５のいずれかに記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、標的配列を増幅するステップと、
３）前記ステップ２）の増幅産物を検出するステップと、を含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法。

【請求項8】

前記ステップ２）の増幅産物を鋳型として、インデックスＰＣＲ（ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ）を行うことをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法。

【請求項9】

前記ＰＣＲ増幅産物の検出が、シーケンシングによって行われる、請求項７に記載のプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセット及びそれを用いた菌種同定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プロバイオティクスは、適切な量を摂取すると、宿主に健康上有益な影響を及ぼすことが知られている。免疫障害の緩和、炎症性腸疾患、２型糖尿病、動脈硬化症などの様々な方面で、人間の健康に対するプロバイオティクスの有益な影響についての科学的証拠は蓄積され続けている。

【0003】

しかしながら、プロバイオティクス関連製品に対する客観的な品質情報は不十分な状態であり、韓国で実際に製品に使用された菌株と申告された菌株との間に差異があることが判明した場合もあった。最初に許可された菌株以外の菌株を製品に用いると、その菌株の安全性や機能性を保証することができないため、製品内で使用されるプロバイオティクス菌株を正確に同定する必要があり、それに基づく安全性の確保が重要である。

【0004】

韓国では、プロバイオティクスは保健機能食品として分類され、「保健機能食品に関する法律」に基づいて管理されている。機能性を有する原料は、食品医薬品安全処長（以下、「食薬処長」）が告示（告示された原料）または別途認められた原料（個別認定された原料）に区分されるが、現在、韓国でプロバイオティクスとして使用できる告示型菌株は、全１９種である。

【0005】

２００２年に発表されたＦＡＯとＷＨＯのプロバイオティクス製品ガイドラインでは、プロバイオティクスの効能が菌株特異的であるため、菌株の正確な同定がその菌株の効能との関連性、正確な追跡と疫学研究に非常に重要であると記載されている。特に、神経学的効果、免疫調節効果、内分泌学的効果、特定の生理活性物質の産生などは、同じ属（ｇｅｎｕｓ）と種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の菌株間であっても、プロバイオティクスの効能に非常に大きな差を示すためである。よって、プロバイオティクス製品中の特定の菌株を確認する技術は、製品管理のみならず、該当菌株を含む製品の摂取後、人体内における該当菌株の追跡にも不可欠である。最近では、選抜された菌株の全ゲノム（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ）分析が容易になったことから、比較ゲノム技術を用いた菌株特異的プライマーの設計やそれを用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって特定菌株の定量的・定性的分析が可能となった。しかしながら、菌種ごとにプライマーが必要であり、複数の菌種を対象に行う場合、実験過程が煩雑になる。

【0006】

韓国の食品医薬品安全評価院では、２０２１年に保健機能食品の機能性原料であるプロバイオティクスの安全性評価ガイドを配布し、ＮＧＳベースのメタゲノム／メタショットガン技術により、プロバイオティクス製品中または複合株中の菌株の種類の特定し、組成分析による安全性評価方法を提示した。よって、ＮＧＳ分析サービス機関が提供する１６ＳメタゲノムＮＧＳ分析法により、製品内の微生物菌種の同定を行う。そのうち代表的なサービスであるＭＴＰ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ；微生物群集に対する分類学的プロファイリング）は、長さ約４６０ｂｐの１６Ｓ Ｖ３Ｖ４を標的にしている。しかしながら、長い配列を確保するためには、ＭｉＳｅｑやＨｉＳｅｑなどの高価な機器を用いて２５０×２ ｐａｉｒｅｄ ｒｅａｄ分析を行わなければならず、約２週間の分析期間と、製品あたり２０万ウォン以上の費用が必要となる。もう１つの分析サービスであるＰＣＣ（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ；プロバイオティクス含有量証明書）には、ＷＧＳメタゲノム分析法による菌種同定を行うが、分析に十分なｃｏｖｅｒａｇｅを得るためにはＨｉＳｅｑなどの高価な機器が必要であり、約１ヶ月の分析期間と、製品あたり約１００万ウォン以上の費用が必要となる。

【0007】

また、１６Ｓメタゲノム分析法に基づくＭＴＰでは、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）などの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列類似度が９８％以上である、類似菌種を区別することが不可能であるため、属レベルの分析に制限される。ＷＧＳメタゲノム分析法であるＰＣＣでは、種レベルの分析が可能であるが、検出限界値が約１％であるため、含有率の低い菌種に対する検出力に劣っている。

【0008】

そこで、本発明者らは、高価な分析装置を必要とせず、分析技術が煩わしくなく、分析時間の短縮やコスト削減などの経済性を確保できるプロバイオティクス製品の品質管理技術の開発に努めた結果、プロバイオティクス種（ｓｐｅｃｉｅｓ）及び病原性バクテリア菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間の長さ約２００ｂｐのＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域を標的とするプライマーセットを作製し、それを用いてプロバイオティクス組成物のメタゲノム分析を行うことにより、２１種のプロバイオティクス種及び４種の病原性バクテリア菌種を高解像度且つ高精度で同定できることを確認した。よって、前記プライマー及びそれを用いた菌種を同定するための方法は、プロバイオティクス製品中の菌種同定に有用に利用することができ、それにより、プロバイオティクス製品の品質情報及び安全性に関する客観的且つ合理的な情報を提供できることを判明したことから、本出願に至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】大韓民国公開特許第１０－２０２０－００２９６８９号公報

【特許文献2】大韓民国公開特許第１０－２０２０－００２７９００号公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ソン・ヨンジェ、パク・ミョンス、韓国内外のプロバイオティクス製品の開発状況、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（Ｖｏｌ．５２ Ｎｏ．３）、２２９－２４０

【非特許文献2】イ・ジュフン、プロバイオティクス遺伝子特性及び安全性の確認方法の研究、韓国食品医薬品安全処（２０１０－１１）、ＴＲＫＯ２０２１００００７７３５

【非特許文献3】Ｍａｓｓｉｍｉｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００４、７０、６１４７－６１５６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

従来のプロバイオティクス製品中のプロバイオティクス菌種を同定する方法は、分析期間が長く、コストが高く、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）レベルの分析が難しいという課題がある。

【0012】

そこで、本発明は、前記課題を解決し、プロバイオティクス製品中のプロバイオティクス及び病原性バクテリアなど、様々な菌種を同時に同定できるプライマーセット及びそれを用いたプロバイオティクス製品中の菌種を同定するための方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１～９で表されるプライマーを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセットを提供する。

【0014】

また、本発明は、前記プライマーセットを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための組成物を提供する。

【0015】

さらに、本発明は、
１）プロバイオティクス組成物からＤＮＡを分離するステップと、
２）前記ステップ１）で分離したＤＮＡを鋳型として、前記プライマーセットを用いてＰＣＲを行い、標的配列を増幅するステップと、
３）前記ステップ２）の増幅産物を検出するステップと、を含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明では、プロバイオティクス種及び病原性バクテリア菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間の長さ約２００ｂｐのＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域を標的とするプライマーセットを作製し、それを用いてプロバイオティクス組成物のメタゲノム分析を行うことにより、２１種のプロバイオティクス種及び４種の病原性バクテリア菌種を高解像度且つ高精度で同定できることを確認したので、前記プライマーセットは、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するために有用に用いることができる。

【0017】

特に、本発明によるプライマーセットは、長さ約２００ｂｐのＩＴＳ領域を標的とすることにより、３００×１ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄデータであっても十分であり、ｉＳｅｑ１００を始めとする低価格ＮＧＳ装置を用いても十分なデータを得ることができ、それにより、プロバイオティクス製品を約３日、製品あたり５．５万ウォン程度で分析することができ、従来技術に比べて経済性が高まる効果がある。

【0018】

また、前記プライマーセットは、共通ＩＴＳ領域を標的とし、プロバイオティクス製品中に含まれる様々な菌種を種（ｓｐｅｉｃｅｓ）レベルで同時に同定できるため、菌種ごとのプライマーを作製しなければならないといった煩わしさがない効果がある。

【0019】

よって、本発明によるプライマーセット及びそれを用いたプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法を用いて、プロバイオティクス製品の品質情報及び安全性に関する客観的且つ合理的な情報を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明についてより詳細に説明する。

【0021】

本発明は、配列番号１～９で表されるプライマーを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセットを提供する。

【0022】

また、本発明は、前記プライマーセットを含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための組成物を提供する。

【0023】

本発明において、「プロバイオティクス」なる用語は、健康上の利益をもたらす生きた微生物、例えば、バクテリア菌を指す。また、「プロバイオティクス組成物」は、プロバイオティクスを含む組成物を指し、「プロバイオティクス製品」と組み合わせて用いることができる。

【0024】

本発明において、「ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）」なる用語は、ポリメラーゼを用いて核酸を連鎖的に合成し、開始核酸物質を幾何級数的に増幅する方法として一般的に用いられる。

【0025】

本発明において、「プライマー」なる用語は、複製しようとする核酸鎖に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド配列を指し、ＰＣＲにおいて複製・増幅されるプライマー伸長産物の合成のための開始点として機能し、順方向プライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）と逆方向プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）に分けられる。

【0026】

本発明において、前記プライマーセットは、順方向プライマーと逆方向プライマーとを含み、具体的には、配列番号１で表される順方向プライマーと、配列番号２～９で表される逆方向プライマーとを含む。

【0027】

また、プライマーの配列は、鋳型の一部の配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型と混成化してプライマー固有の作用をすることができる範囲内で十分な相補性を有していればよい。よって、本発明によるプライマーセットは、鋳型のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列であってもよく、鋳型のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列ではなく、本開示が目的とする標的遺伝子の増幅を妨げない範囲内で実質的に相補的な配列であってもよい。

【0028】

ここで、「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」とは、配列内で十分に相補的な２本の核酸鎖がアニーリングされ、安定な二重鎖を形成することを意味する。前記相補性は完全である必要はない。例えば、２つの核酸の間にいくつかの塩基対のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）があってもよい。しかしながら、ミスマッチの数が多すぎて最低限の厳密な混成化条件下でさえ混成化が起こらない場合、前記配列は実質的に相補的な配列ではない。本発明において２つの配列が「実質的に相補的」であると解釈される場合、前記配列は、厳密な混成化条件下などの選択された反応条件下で、互いに混成化できる程度に十分に相補的であることを意味する。特異性を達成するのに十分な核酸の相補性と混成化の厳格性との関係は、当技術分野で周知である。２本の実質的に相補的な鎖は、例えば、完全に相補的であるか、あるいは対になっている配列と対になっていない配列との間の相違を十分に許容する限り、１から複数のミスマッチを含んでもよい。よって、「実質的に相補的な」配列は、二本鎖領域において、１００、９５、９０、８０、７５、７０、６０、５０％以上、または前記数字の間の任意の％の塩基対相補性を有する配列を意味してもよい。

【0029】

さらに、プライマーは、５'末端にアダプター配列をさらに含んでもよく、具体的には、配列番号１０～１８で表されるプライマーであってもよい。より具体的には、配列番号１で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１０で表されるプライマー、配列番号２で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１１で表されるプライマー、配列番号３で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１２で表されるプライマー、配列番号４で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１３で表されるプライマー、配列番号５で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１４で表されるプライマー、配列番号６で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１５で表されるプライマー、配列番号７で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１６で表されるプライマー、配列番号８で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１７で表されるプライマー、及び配列番号８で表されるプライマーの５'末端にアダプター配列をさらに含む配列番号１８で表されるプライマーであってもよい。

【0030】

本発明において、前記菌種は、プロバイオティクス種及び病原性バクテリア菌種であってもよい。具体的には、前記プロバイオティクス種は、韓国食品医薬品安全処で保健機能食品として認定且つ告示されたバクテリア菌種及び食品に使用できるバクテリア菌種であってもよい。

【0031】

より具体的には、前記食品医薬品安全処で保健機能食品として認定且つ告示されたバクテリア菌種は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉ ｓｓｐ．Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクチカゼイバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、リモシラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、リモシラクトバチルス・ルテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクチプランチバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、リジラクトバチルス・サリバリウス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌｏｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、及びビフィドバクテリウム・アニマリス・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）であってもよい。

【0032】

また、前記食品に使用できるバクテリア菌種は、ラティラクトバチルス・クルバトゥス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）であってもよい。

【0033】

さらに、前記病原性バクテリア菌種は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｐ．）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であってもよい。

【0034】

本発明において、前記プライマーセットは、前記菌種のＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域を標的とし、具体的には、長さ約２００ｂｐのＩＴＳ領域を標的とする。それにより、プロバイオティクス製品に含まれる前記菌種を同時に同定することができる。また、長さ約２００ｂｐのＩＴＳ領域を標的とすることで、ｉＳｅｑ１００などの低価格ＮＧＳ装置を用いても分析が可能であるため、プロバイオティクス製品中の菌種同定コスト及び期間を削減することができる。

【0035】

本発明において、前記組成物は、ＰＣＲを行うための試薬を含んでもよい。

【0036】

前記ＰＣＲを行うための試薬は、当技術分野で周知であれば如何なるものが含まれもよい。例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及びバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）などを含んでもよい。前記ｄＮＴＰは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを含み、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど、市販の耐熱性ポリメラーゼを用いてもよい。

【0037】

さらに、本発明は、
１）プロバイオティクス組成物からＤＮＡを分離するステップと、
２）前記ステップ１）で分離したＤＮＡを鋳型として、本発明に係るプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、標的配列を増幅するステップと、
３）前記ステップ２）の増幅産物を検出するステップと、を含む、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するための方法を提供する。

【0038】

本発明の方法において、前記プライマー、菌種等については上述したものと同様であるので、具体的な説明は前記内容を援用する。

【0039】

本発明の方法において、前記ステップ１）におけるＤＮＡ分離は、当技術分野で一般的に用いられている方法に従って行われてもよく、市販のＤＮＡ抽出キットを使用して行ってもよい。

【0040】

本発明の方法では、前記ステップ２）におけるＰＣＲは、当技術分野で一般的に用いられる方法に従って行われてもよく、市販のＰＣＲを実施するための試薬を使用して行われてもよい。

【0041】

また、前記ステップ２）の増幅産物を鋳型として、インデックスＰＣＲ（ｉｎｄｅｘ ＰＣＲ）を行うことをさらに含んでもよい。前記インデックスＰＣＲを行うことで、増幅産物にインデックスを付けてもよい。

【0042】

本発明の方法において、前記ステップ３）における増幅産物の検出は、シーケンシング、例えば、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＮＧＳ）によって行ってもよい。特に、ｉＳｅｑ１００などの小型ＮＧＳ機器を活用してシーケンシングを行うことができるので、シーケンシングコストを下げ、スピードを向上させることができる。

【0043】

以下、実施例を挙げ、本発明についてより詳細に説明する。

【0044】

但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。

【実施例1】

【0045】

プロバイオティクス製品中の菌種を同定するためのプライマーセット作製
プロバイオティクス製品に用いられるプロバイオティクス種で、１９種の食薬処告示種及び２種の食品添加種と、４種の病原性バクテリア菌種を同定できるプライマーを作製した。

【0046】

具体的には、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから、下記表１のように、１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種、及び４種の病原性バクテリア菌種のｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ情報を取得した。前記菌種に対するＮＣＢＩ ＧｅｎｅＢａｎｋデータベースにおけるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒは、下記表２のとおりである。

【0047】

【表1】

【0048】

【表2】

【0049】

次に、１６Ｓの後半約１００ｂｐ内に位置する共通配列及び２３Ｓの前半約１００ｂｐ内に位置する共通配列を利用した（非特許文献３）Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲによって、前記２５種の菌株の１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡの間に位置するＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）区間の配列を取得した。前記取得した配列を用いて、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ）のＣＬＣ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｍｏｄｕｌｅの手順に従い、メタゲノム分析用ＩＴＳ菌種同定データベースを生成し、下記表３のプライマーセットを導出した。また、下記表４のように、各プライマー配列の前にｉｌｌｕｍｉｎａ ａｄａｐｔｏｒ配列を設計し、標的配列を増幅すると同時に、ＮＧＳライブラリーの作製が可能なｆｕｓｉｏｎ形態で作製した。導出したプライマーセットは、マクロジェン社に依頼して作製した。

【0050】

【表3】

【0051】

【表4】

【実施例2】

【0052】

１９種の食薬処告示種間配列類似度の確認及び同定のためのＡＮＩ基準設定
＜実施例１＞で獲得した１９種の食薬処告示種のＩＴＳ区間配列間のＡＮＩ（平均塩基一致率；Ａｖｅｒａｇｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を確認するために、ＡＮＩを求めるプログラムｐｙａｎｉを活用した（１９種の配列情報が格納されたフォルダ［１９種ｆａｓｔｑ］によってＡＮＩ結果フォルダ［ＡＮＩ結果］を生成する命令：ａｖｅｒａｇｅ＿ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙ．ｐｙ－ｉ［１９種ｆａｓｔａ］－ｏ［ＡＮＩ結果］－ｍ ＡＮＩｂ－ｇ）。

【0053】

そのとき、プライマー領域の後に位置するＩＴＳ配列の１６０ｂｐ領域に対して、種間の菌株（ｓｔｒａｉｎ）別ＡＮＩのうち最大値を求めて、種同定のためのＡＮＩ基準を設定した。具体的に、種間のＡＮＩ最大値は、下記表５のとおりである。

【0054】

【表5】

【0055】

前記分析結果において、－は、いずれの種との計算結果でもＡＮＩ値が０％であることを意味し、その他は、他種とのＡＮＩ最大値のときのＡＮＩ出力値と、それに該当する種名を記載した。

【0056】

その結果、表５に示すように、ラクチカゼイバチルス属（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に該当するラクチカゼイバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクチカゼイバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）のいくつかの菌株において、ＩＴＳ区間配列のＡＮＩが９９％以上であることを確認し、他の残りの種については、いずれも９７％未満のＡＮＩであることを確認した。

【0057】

以上の結果に基づき、食薬処告示プロバイオティクス１９種に対する同定によって、ラクチカゼイバチルス属と残りの１７種で行ってもよいことを確認した。具体的には、種同定のためにＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ）のＣＬＣ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｍｏｄｕｌｅの手順に従い、同定のための参照配列は、実施例１で得たＩＴＳ区間配列を用いた。同定のためのＡＮＩは９８％以上に設定し、ラクチカゼイバチルス・カゼイ、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイまたはラクチカゼイバチルス・ラムノーサスとして同定される配列のみをラクチカゼイバチルス属として同定し、残り１７種のプロバイオティクス種については、それぞれの単一種として同定した。

【実施例3】

【0058】

１９種の食薬処告示種とＮＣＢＩ登録された全菌種の全ゲノム間の相同性検査
＜実施例１＞で得られた１９種の食薬処告示種のＩＴＳ区間配列と、＜実施例２＞の菌種間配列類似度の確認法により、１９種の食薬処告示種とＮＣＢＩ登録された全菌種の全長ゲノムの相同性を確認した。

【0059】

具体的には、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから、フィルタ条件「"Ｓｅａｒｃｈ ａｌｌ［ｆｉｌｔｅｒ］ＡＮＤ ｂａｃｔｅｒｉａ［ｆｉｌｔｅｒ］ＡＮＤ ｌａｔｅｓｔ［ｆｉｌｔｅｒ］ＡＮＤ"ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ"［ｆｉｌｔｅｒ］ＡＮＤ ａｌｌ［ｆｉｌｔｅｒ］ＮＯＴ ａｎｏｍａｌｏｕｓ［ｆｉｌｔｅｒ］"」で検索し、合計２４，４８７個の菌種の全ゲノムを取得した。次に、表３のプライマーセットを利用したｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲにより、表３のプライマーセットから得られる全ての菌種の配列を取得した。その後、１９種の食薬処告示種と他種とのＩＴＳ配列比較により、相同性のある菌種を確認した。その結果を表６に示す。ここで、相同性があると判断する基準は、配列間ＡＮＩ値が９８％以上である場合とした。

【0060】

【表6】

【0061】

その結果、表６に示すように、ＮＣＢＩに登録された全菌種のうち９種に対してのみ、１９種の食薬処告示種との相同性を確認した。

【実施例4】

【0062】

混合菌株懸濁液からの菌種の同定
本発明の方法を用いて、混合菌株懸濁液から１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種を同定できるか否かを確認した。

【0063】

具体的には、下記表７のように、韓国国立農業科学院及び韓国微生物保存センターから１９種の食薬処告示種の標準菌株の分譲を受け、ＨＹとサビンサ社から２種の食品添加種原末の提供を受けて分離し、ＡＴＣＣから４種の病原性バクテリア菌種の分譲を受けた。その後、＜実施例１＞のｆｕｓｉｏｎプライマーセットを用い、混合菌株懸濁液から前記菌株の同定を行った。

【0064】

【表7】

【0065】

各菌株は分譲元で提示した方法に従って培養し、その後、分注平板法により生菌数を測定した。ＰＢＳで適当に希釈（１０^５～１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）した後、他の菌株と適当な割合で混合（０．０１～１０％）して試験体として使用した。

【0066】

次に、Ｏｍｅｇａ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｋｉｔ（Ｏｍｅｇａ，＃５１６０４）を用いてメーカーの手順に従ってＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡをＨｉＡｃｃｕＢｅａｄ（ＡｃｃｕＧｅｎｅ，＃ＡＣＮＯ１．５０）を用いてメーカーの手順に従って精製した。

【0067】

抽出した検体ＤＮＡを＜実施例１＞のｆｕｓｉｏｎプライマーセットを用いて、以下のようにＡｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲを行った。抽出した検体ＤＮＡに１０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．５を入れ、ＤＮＡ濃度を１２ｎｇ／μＬに希釈し、＜実施例１＞で作製したｆｕｓｉｏｎプライマーを用いて、下記表８のようにＰＣＲ反応液を調製した後、下記［表９］の条件でＰＣＲを行った。次に、ＨｉＡｃｃｕＢｅａｄを用いてメーカーの手順に従ってＰＣＲ済みの検体の精製を行った。

【0068】

【表8】

【0069】

【表9】

【0070】

前記Ａｍｐｌｉｃｏｎ ＰＣＲで取得した検体を用いて、以下のようにＩｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。下記表１０のように、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，＃２０５２８３００）を用いて、ＰＣＲ反応液をメーカーの手順に従って調製し、下記表１１の条件でＰＣＲを行った。次に、ＨｉＡｃｃｕＢｅａｄを用いてメーカーの手順に従ってＰＣＲ済みの検体の精製を行った。

【0071】

【表10】

【0072】

【表11】

【0073】

以下のように、前記Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲで得られたＤＮＡライブラリーのシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。前記Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲで得られたＤＮＡライブラリーの濃度を１００ｎＭに希釈した後、ｐｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＲＧＴ２５９７５０５３）１００ｎＭと７：３の比で混合した。ｉＳｅｑ１００機器のシステムガイドに従ってＤＮＡライブラリをロードし、３００ ｂｐ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｄでシーケンシングを行うことで、ｆａｓｔｑファイルを取得した。次に、得られたｆａｓｔｑファイルを用いて、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ）のＣＬＣ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｍｏｄｕｌｅの手順に従って、ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ）分布分析を行い、表１の１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種を確認した。具体的には、下記表１２のように、２繰り返し試験により生菌数による検出能を確認し、下記表１３のように、検査体内に含まれる各種の割合による検出能を確認した。

【0074】

【表12】

【0075】

【表13】

【0076】

前記菌種同定法判定結果において、－は、検査体内に該当種を投入したが、種同定法によって菌検出ができなかったことを意味し、＋は、菌検出に成功したことを意味する。

【0077】

その結果、表１２及び表１３に示すように、混合菌株懸濁液から１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種を全て同定するための検出限界は、生菌数１０^５ＣＦＵ／ｍＬ以上、検査体内包含率は０．１％であることを確認した。

【実施例5】

【0078】

副原料を含む混合菌株懸濁液からの菌種同定
＜実施例１＞のｆｕｓｉｏｎプライマーセットと、＜実施例３＞の菌種を同定するための方法により、副原料を含む混合菌株懸濁液から菌種同定ができるか否かを確認した。

【0079】

具体的には、表７の１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種を分譲元で提示した方法に従って培養し、その後、分注平板法により生菌数を測定した。ＰＢＳで希釈して５×１０^６ＣＦＵ／ｍＬで作製及び混合して、同一ＣＦＵで混合した２５種の菌種混合液を作製した。作製した混合液に難消化性マルトデキストリン２ｇを加え、副原料を含む混合菌株懸濁液を作製した。その後、＜実施例３＞と同様の方法で２５種の菌種を確認した。

【0080】

その結果、副原料の有無にかかわらず、試験体に混合した１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種のいずれも同定に成功し、当該方法は、副原料を含む試験体でも可能であることを確認した。

【実施例6】

【0081】

菌種を同定するためのプライマーセットを用いたプロバイオティクス製品中の菌種同定
＜実施例１＞のｆｕｓｉｏｎプライマーセットと、＜実施例３＞の菌種を同定するための方法により、韓国及び海外で市販されているプロバイオティクス含有製品から１９種の食薬処告示種、２種の食品添加種及び４種の病原性バクテリア菌種を同定できるか否かを確認した。５種のプロバイオティクス製品に対して、菌種を同定するための方法を２繰り返しで行った。その結果を表１４に示す。

【0082】

【表14】

【0083】

前記菌種同定法判定結果において、－は、製品に成分表記がされておらず、菌種を同定したところ検出されなかったことを意味し、＋は、製品に成分表記がされており、菌種を同定したところ検出されたことを意味する。

【0084】

その結果、表１４に示すように、製品に表記されたプロバイオティクス成分と一致することが確認された。

【0085】

以上の結果により、本発明のプライマーセット及びそれを用いた菌種を同定するための方法では、製品に表記されたプロバイオティクス成分を全て同定することができ、故に、韓国及び海外で市販されているプロバイオティクス含有製品内の菌種同定を低コストで迅速に行えることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0086】

本発明に係るプロバイオティクス組成物中の菌種を同定するためのプライマーセットを用いて、２１種のプロバイオティクス種及び４種の病原性バクテリア菌種を高解像度且つ高精度で同定できることを確認したので、前記プライマーセットは、プロバイオティクス組成物中の菌種を同定するために有用に用いることができる。

【配列表】

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【国際調査報告】