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▶ インペリアル・カレッジ・イノベ−ションズ・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】サブミクロン粒子
(51)【国際特許分類】
A61K 9/50 20060101AFI20240621BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240621BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240621BHJP
A61K 47/38 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/16 20060101ALI20240621BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240621BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
A61K9/50
A61P37/04
A61K39/00 H
A61K47/26
A61K47/10
A61K47/38
A61K47/16
A61K31/7088
A61K48/00
A61K9/127
A61K47/34
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577253
(86)(22)【出願日】2022-06-14
(85)【翻訳文提出日】2024-01-31
(86)【国際出願番号】 GB2022051493
(87)【国際公開番号】W WO2022263808
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】2108444.7
(32)【優先日】2021-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519340400
【氏名又は名称】インペリアル・カレッジ・イノベーションズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＰＥＲＩＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】ＩＢＣ一番町弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ロンジュン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，シュハン
(72)【発明者】
【氏名】シャトック，ロビン
(72)【発明者】
【氏名】ブラックニー，アンナ
(72)【発明者】
【氏名】リウ，イファン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA61
4C076AA95
4C076CC06
4C076DD38
4C076DD67
4C076EE24
4C076EE30
4C076EE31
4C076EE38
4C076FF70
4C076GG01
4C084AA13
4C084MA24
4C084MA38
4C084NA13
4C084ZB09
4C085AA03
4C085BB23
4C085EE01
4C086AA01
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA24
4C086MA38
4C086NA13
4C086ZB09
(57)【要約】
本発明は、ペイロード分子と、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれた脂質構造とを含むサブミクロン粒子に関する。本発明は、サブミクロン粒子を製造する方法に及ぶ。本発明はまた、サブミクロン粒子を含む医薬組成物およびワクチン、ならびにそれらの医学的使用も包含する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペイロード分子と、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれた脂質構造とを含む、サブミクロン粒子。
【請求項2】
１μｍ未満の最大寸法を有する、請求項１に記載のサブミクロン粒子。
【請求項3】
前記ペイロード分子が、生体分子および／または活性医薬成分（ＡＰＩ）である、請求項１または請求項２に記載のサブミクロン粒子。
【請求項4】
前記生体分子が核酸であり、前記核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列である、請求項３に記載のサブミクロン粒子。
【請求項5】
前記ＲＮＡが、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である、請求項４に記載のサブミクロン粒子。
【請求項6】
複数の脂質構造を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項7】
前記脂質構造が、脂質ナノ粒子またはリポソームであり、好ましくは脂質ナノ粒子である、請求項１～６のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項8】
脂質構造が、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項9】
１：５０～１，０００：１、１：１０～５００：１、１：５～２５０：１、１：２～１００：１、１：１～５０：１、２：１～４０：１、５：１～３０：１、８：１～２８：１、１０：１～２６：１、１２：１～２４：１、１４：１～２２：１、または１６：１～２０：１のＮ／Ｐモル比を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項10】
前記両親媒性コポリマー対前記ペイロード分子の重量比が、５：１～１０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～２５０：１、３０：１～２００：１、４０：１～１５０：１、５０：１～１２５：１、５５：１～１００：１、または６０：１～８５：１である、請求項１～９のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項11】
前記両親媒性コポリマーが、少なくとも１つの親水性部分および少なくとも１つの疎水性部分を含み、前記親水性部分が、前記両親媒性コポリマーの５～６０重量％を構成し、前記疎水性部分が、前記両親媒性コポリマーの４０～９５％を構成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項12】
前記両親媒性コポリマーが、１，０００～１００，０００Ｄａの分子量を有し得る、請求項１～１１のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項13】
前記両親媒性コポリマー対前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質の重量比が、１：１０～５０：１、１：８～２０：１、１：６～１５：１、１：４～１０：１、１：２～８：１、１：１．５～６：１、１：１～５．５：１、１．５：１～５：１、１．７５：１～４．５：１、２：１～４：１、２．２：１～３．５：１、２．４：１～３：１、または２．５：１～２．７：１である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項14】
少なくとも１つの安定化分子をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項15】
少なくとも１つの安定化分子が、前記両親媒性コポリマーを含む前記外層によって取り囲まれてもよい、請求項１４に記載のサブミクロン粒子。
【請求項16】
前記少なくとも１つの安定化分子対前記ペイロード分子の重量比が、１：１～１００，０００：１、２：１～５０，０００：１、４：１～１０，０００：１、６：１～５，０００：１、８：１～１，０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～４００：１、３０：１～３５０：１、または４０：１～３００：１である、請求項１４または請求項１５に記載のサブミクロン粒子。
【請求項17】
少なくとも１つの安定化分子が、前記両親媒性コポリマーを含む前記外層の外側に配置されてもよく、好ましくは、前記両親媒性コポリマーを含む前記外層の外側に配置された前記少なくとも１つの安定化分子が、１～１００，０００ｍｇ／ｍｌ、５～５０，０００ｍｇ／ｍｌ、１０～１０，０００ｍｇ／ｍｌ、２５～５，０００ｍｇ／ｍｌ、５０～１，０００ｍｇ／ｍｌ、１００～７５０ｍｇ／ｍｌ、１５０～５００ｎｍ／ｍｌ、２００～３００ｎｍ／ｍｌ、２２０～２８０ｎｍ／ｍｌ、または２４０～２６０ｍｇ／ｍｌの濃度で配置される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項18】
前記安定化分子または各安定化分子が、炭水化物および／またはポリオールであり、好ましくは、前記炭水化物が、単糖、二糖、三糖、多糖、デンプン、セルロースまたはポリオールであり、好ましくは、トレハロースまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子。
【請求項19】
サブミクロン粒子を製造する方法であって、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを接触させて、前記サブミクロン粒子を製造することを含む、方法。
【請求項20】
・前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質および前記両親媒性コポリマーならびに有機溶媒を含む第１の溶液を提供すること、・前記ペイロード分子および水を含む第２の溶液を提供すること、
・前記第１および第２の溶液を組み合わせて反応混合物を生成し、それによって、前記ペイロード分子と、前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、前記両親媒性コポリマーとを接触させること
を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ペイロード分子と、前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、前記両親媒性コポリマーとを同時に接触させることが、前記ペイロード分子と、前記カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、前記両親媒性コポリマーと、少なくとも１つの安定化分子とを接触させることを含む、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
得られたサブミクロン粒子と、少なくとも１つの安定化分子とを接触させることを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法によって得られるまたは得ることができる、サブミクロン粒子。
【請求項24】
請求項１～１８または２３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む、医薬組成物。
【請求項25】
請求項１～１８または２３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子を薬学的に許容されるビヒクルと接触させることを含む、請求項２４に記載の医薬組成物を調製する方法。
【請求項26】
医薬品として使用するための、請求項１～１８もしくは２３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子、または請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項27】
請求項１～１８もしくは２３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子または請求項２４に記載の医薬組成物を含む、ワクチン組成物。
【請求項28】
対象の免疫応答を刺激するのに使用するための、請求項１～１８もしくは２３のいずれか一項に記載のサブミクロン粒子、請求項２４に記載の医薬組成物、または請求項２７に記載のワクチン。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サブミクロン粒子に関し、特に、核酸または小分子薬物などのペイロード分子を含むサブミクロン粒子自体に関する。本発明は、サブミクロン粒子を製造する方法、サブミクロン粒子を含む医薬組成物およびワクチン、ならびにその医学的使用に及ぶ。
【背景技術】
【0002】
ワクチンは、感染性疾患を予防するための最も費用対効果の高い方法の１つである。世界保健機関は、ワクチン接種により年間２００万～３００万人の死亡を防ぐことができると報告した。従来のワクチンは、弱毒化ウイルス、またはウイルスの精製されたシグネチャータンパク質を含む。しかし、さらに近年では、迅速な開発および低コスト製造のために、ＲＮＡワクチンが有望な候補である。ＲＮＡワクチンは、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈおよびＭｏｄｅｒｎａの既に承認されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチン、ならびに臨床試験中のＩｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅの自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）ワクチンを含む、ＣＯＶＩＤ－１９に対する臨床試験の競争では、世界的な最有力候補の１つである。ＲＮＡワクチンはまた、インフルエンザ１、狂犬病ウイルス２、ＨＩＶ－１３、ジカウイルス４およびエボラウイルス５などの感染性疾患を含む様々な他のワクチン適応症、ならびに癌ワクチン６～９では、前臨床的に使用されてきた。ｍＲＮＡに基づくワクチンは、目的の抗原を典型的にコードし、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有するのに対して、ｓａＲＮＡに基づくワクチンは、抗原をコードするだけでなく、細胞内ＲＮＡ増幅と豊富なタンパク質発現とを可能にするウイルス複製機構もコードする１０。ｓａＲＮＡは、抗原コードＲＮＡの細胞内複製に起因して、極めて少ない用量（ｍＲＮＡの１０～１００分の１）から大量の抗原産生を可能にする１１。ｓａＲＮＡワクチンの用量節約型の品質は、規模拡大、および多数のワクチン用量の製造を容易にし得る。
【0003】
ｍＲＮＡおよびｓａＲＮＡは、新しいクラスのワクチンおよび治療薬として大いに有望であるが、それらの臨床移行および商品化は、２つの大きな課題のために依然として制限されている。１つの課題が、細胞内送達の問題に関する困難性であり、これは、ＲＮＡが、（１）細胞膜への反発を誘導する、その大きな分子量および負電荷のために不十分なエンドサイトーシス、（２）エンドソーム捕捉によって引き起こされる触媒的加水分解／酵素分解による制限された細胞内タンパク質発現、ならびに（３）抗原提示細胞（ＡＰＣ）の不十分な抗原負荷および成熟を有するためである。
【0004】
他の主な問題は、ＲＮＡが極めて脆弱であり、曝露環境で容易に分解する可能性があるため、ＲＮＡワクチンを極めて困難な低温流通体系で保存および輸送する必要があることである。「低温流通体系」のいかなる破綻も、ＲＮＡワクチンの有効性を顕著に低下させる可能性がある。例えば、世界で最初に承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンである、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈのｍＲＮＡワクチンは、－７０℃での保存を必要とする大きな障害を抱えている。２～８℃の冷蔵温度では、ｍＲＮＡワクチンが安定なのはわずか５日間であり得る（Ｐｆｉｚｅｒ．ｃｏｍ、２０２０／１１／２０）。同様に、ＣＯＶＩＤ－１９に対する既に承認されているＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡは、－２０℃で保存する必要がある。これは、ＲＮＡワクチンがワクチン接種のために必要な展開の速度および規模に達することを極めて困難にする。
【0005】
凍結乾燥は、水性条件を回避することによってＲＮＡ安定性を高め得る。しかし、凍結乾燥中に形成された氷晶は、核酸（配列）、および製剤の他の成分に対して物理的ストレスを示し、これにより、核酸の損傷（例えば、鎖の破損、スーパーコイル化の喪失など）、およびＲＮＡ添加製剤の不可逆的な凝集または沈殿がもたらされ得る。これらはいずれも、ＲＮＡ製剤の効力の不可逆的な低下をもたらし、ＲＮＡワクチンおよび治療薬の迅速な開発を制限する。
【0006】
したがって、２～８℃および非低温流通体系（特に後者）で安定な核酸ワクチンおよび治療薬（ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡである）の開発は、供給、流通および展開にとって重要であるが、非常に困難である。これらすべての課題を考慮すると、冷蔵温度だけでなく周囲温度でも、効率的な核酸送達および向上した安定性のための低コストおよび安全性プロファイルを有する新規なプラットフォームを開発することは、今までになく緊急である。
【0007】
過去数十年の間に、生物工学およびナノテクノロジーの進歩により、いくつかの送達技術が生み出された。広く試験されているＲＮＡ送達系としてのリポソームは、ＲＮＡを静電的に捕捉するために正に帯電させる必要があり、特定の膜電荷密度閾値が、効率的なエンドソーム脱出を確実にするための要件として特定されている１２～１４。ただし、リポソーム内のペイロードは容易に漏出し、負に帯電した細胞膜と相互作用すると脂質膜が破壊され得る。さらに、リポソームの表面電荷は、インビボで注射すると、それらの凝集挙動、および血清タンパク質の吸着に影響を及ぼす。これにより、ＲＮＡの迅速なクリアランスが引き起こされ、インビボでのトランスフェクション効率が低下する。ポリマーソームとして知られるポリマー小胞を生成するための両親媒性ジブロックコポリマーの使用は、カプセル化のための構造を作製するための別の戦略である。ポリマーソームはまた、リポソームよりも高い機械的強度および靭性を有することから、研究者によってオリゴヌクレオチド送達について試験されている１５、１６。しかし、カチオン性ポリマーの合成は、複雑な生物学的要件のために非常に難しい手順を必要とする。さらに、オリゴヌクレオチドよりもはるかに大きい分子量およびＲＮＡの不安定性のために、ｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡの効率的な送達はさらに困難である。一部の報告された製剤は、効率的なｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡ送達効果を示したが１７、１８、それらを生成してすぐに使用したかまたは後の使用のために－８０℃に維持したことから、熱安定性は依然として困難である。
【0008】
本発明は、先行技術に関連する問題を克服しようとする本発明者らの研究から生じる。
【発明の概要】
【0009】
本発明の第１の態様によれば、ペイロード分子と、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれた脂質構造とを含むサブミクロン粒子が提供される。
【0010】
有利には、本発明者らは、サブミクロン粒子が効率的な核酸送達（ｓａＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＤＮＡを含む）および非低温流通体系保存に使用され得ることを観察して驚いた。この送達系は、良好な生体適合性、製造の容易さ、小型サイズ、制御された表面電荷、高いＲＮＡ添加効率、エンドソーム溶解能力、低コスト、および優れた安定性を含む、意図された設計要件のすべてではないにしても多くに同時に対処する。さらに、サブミクロン粒子は、ＦＤＡによって承認された両親媒性ポリマー（例えば、ＰＥＧ－ＰＣＬ）と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質とを使用して生成され得る。両材料は低コストであり、容易に入手可能である。
【0011】
両親媒性コポリマーは、コロイド安定性シェルとして機能するカプセルを形成する。脂質構造は自己組織化して凝集体になり得、凝集体はカプセルのコアに包まれる。ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｓａＲＮＡ）などの核酸は、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質との静電相互作用によって、このナノ容器に効率的にカプセル化され得る。サブミクロン粒子は、ＲＮＡに対する二重保護、すなわち、（１）ＲＮＡの効率的な凝縮、ならびに（２）脂質二重層よりも機械的安定性が高く、透過性が低い外側小胞膜を提供する。現時点で報告されている脂質ナノ粒子と比較して、ポリマーから構成された親水性シェルの機械的強度は脂質二重層から構成されたものよりもはるかに高いことから、サブミクロン粒子のコロイド安定性を顕著に向上させ、保存および適用中のＲＮＡのさらに良好な保護を可能にすることができる。
【0012】
さらに、有利には、サブミクロン粒子は、数分間の混合、撹拌および溶媒蒸発に基づくワンポット法によって調製され得る。サブミクロン粒子の物理化学的特性および生物学的特性（例えば、粒径、表面電荷、トランスフェクション効率および安定性）は、混合比を変化させるだけで容易に調節され得る。
【0013】
用語「サブミクロン」は、本発明の粒子が１μｍ未満の最大寸法（ｌａｒｇｅｓｔ ｍａｘｉｍｕｍ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を有することを意味すると理解することができる。さらに好ましくは、粒子の最大寸法は、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満または６００ｎｍ未満、最も好ましくは５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満または２００ｎｍ未満である。サブミクロン粒子は、１０～９００ｎｍ、２０～８００ｎｍ、３０～７００ｎｍ、または４０～６００ｎｍ、さらに好ましくは５０～５００ｎｍ、または６０～４００ｎｍ、最も好ましくは８０～３００ｎｍ、または１００～２００ｎｍの最大寸法を有し得る。サブミクロン粒子の最大寸法は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ μＶ機器を使用して決定されるＺ－平均サイズに対応し得る。
【0014】
ペイロード分子は、脂質構造によってカプセル化され得る。
【0015】
ペイロード分子は、生体分子および／または活性医薬成分（ＡＰＩ）であり得る。ＡＰＩは、疎水性ＡＰＩまたは親水性ＡＰＩであり得る。ＡＰＩは、巨大分子または小分子であり得る。小分子は、９００ダルトン未満の分子量を有する分子であると考えることができることが理解され得る。いくつかの実施形態では、小分子は、８００ダルトン未満、７００ダルトン未満、６００ダルトン未満、５００ダルトン未満または４００ダルトン未満の分子量を有し得る。同様に、巨大分子は、少なくとも９００ダルトンの分子量を有する分子であると考えられ得る。
【0016】
好ましい実施形態では、ペイロード分子は生体分子である。例えば、生体分子は、アミノ酸、ペプチド、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、タンパク質、糖タンパク質、リポ多糖、抗体もしくはその断片、もしくは核酸であり得るか、またはそれらを含み得る。
【0017】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド配列であり得る。好ましくは、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【0018】
最も好ましくは、核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および小型ＲＮＡからなる群から選択され得る。
【0019】
好ましくは、ＲＮＡは、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当業者であれば、自己増幅ＲＮＡがｍＲＮＡの基本エレメント（キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、および可変長のポリ（Ａ）テール）を含有し得るが、大幅に長くてもよい（例えば、９～１２ｋｂ）ことを理解するであろう。
【0020】
核酸配列、好ましくはＲＮＡは、少なくとも１０塩基長、少なくとも２０塩基長、少なくとも５０塩基長、少なくとも１００塩基長、少なくとも２００塩基長、少なくとも３００塩基長、少なくとも４００塩基長、少なくとも５００塩基長、少なくとも６００塩基長少なくとも７００塩基長、少なくとも８００塩基長または少なくとも９００塩基長であり得る。好ましい一実施形態では、ＲＮＡは、ｓａＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【0021】
核酸配列、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｓａＲＮＡまたはｍＲＮＡは、少なくとも１０００塩基長、少なくとも２０００塩基長、少なくとも３０００塩基長、少なくとも４０００塩基長、少なくとも５０００塩基長、少なくとも６０００塩基長、少なくとも７０００塩基長、少なくとも８０００塩基長、少なくとも９０００塩基長少なくとも１００００塩基長、少なくとも１１０００塩基長または少なくとも１２０００塩基長であり得る。
【0022】
一実施形態では、核酸配列は少なくとも６０００塩基長である。一実施形態では、ＲＮＡは少なくとも６０００塩基長である。好ましい実施形態では、ｓａＲＮＡは少なくとも６０００塩基長である。
【0023】
代替的な実施形態では、核酸配列は少なくとも９００塩基長である。一実施形態では、ＲＮＡは少なくとも９００塩基長である。好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは少なくとも９００塩基長である。
【0024】
核酸配列、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｓａＲＮＡは、５０００～２００００塩基長、５０００～１５０００塩基長、５０００～１４０００塩基長、５０００～１３０００塩基長、５０００～１２０００塩基長、５０００～１１０００塩基長、５０００～１００００塩基長、６０００～２００００塩基長、６０００～１５０００塩基長、６０００～１４０００塩基長、６０００～１３０００塩基長、６０００～１２０００塩基長、６０００～１１０００塩基長、６０００～１００００塩基長、７０００～２００００塩基長、７０００～１５０００塩基長、７０００～１４０００塩基長、７０００～１３０００塩基長、７０００～１２０００塩基長、７０００～１１０００塩基長、７０００～１００００塩基長、８０００～２００００塩基長、８０００～１５０００塩基長、８０００～１４０００塩基長、８０００～１３０００塩基長、８０００～１２０００塩基長、８０００～１１０００塩基長、８０００～１００００塩基長、９０００～２００００塩基長、９０００～１５０００塩基長、９０００～１４０００塩基長、９０００～１３０００塩基長、９０００～１２０００塩基長、９０００～１１０００塩基長、または９０００～１００００塩基長であり得る。
【0025】
あるいは、核酸配列、好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡは、５０～１００００塩基長、１００～９０００塩基長、２００～８０００塩基長、３００～７０００塩基長、４００～６０００塩基長、５００～６０００塩基長、６００～５０００塩基長、７００～４０００塩基長、８００～３０００塩基長、または９００～２０００塩基長であり得る。
【0026】
一実施形態では、核酸配列は、６０００～１５０００塩基長である。核酸配列は、８０００～１２０００塩基長であり得る。ＲＮＡは、６０００～１５０００塩基長であり得る。ＲＮＡは、８０００～１２０００塩基長であり得る。好ましくは、ｓａＲＮＡは、６０００～１５０００塩基長である。好ましくは、ｓａＲＮＡは、８０００～１２０００塩基長である。
【0027】
代替的な実施形態では、核酸配列は、４００～１４０００、５００～１００００、６００～７５００、７００～５０００、８００～４０００、または９００～２０００塩基長である。ＲＮＡは、４００～１４０００、５００～１００００、６００～７５００、７００～５０００、８００～４０００、または９００～２０００塩基長であり得る。好ましくは、ｍＲＮＡは、４００～１４０００、５００～１００００、６００～７５００、７００～５０００、８００～４０００、または９００～２０００塩基長である。
【0028】
当業者であれば、核酸が二本鎖、例えば、二本鎖ＲＮＡである場合、「塩基長」は塩基対の長さを指すことを理解するであろう。
【0029】
核酸は、ウイルスの少なくとも一部をコードし得る。ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスまたはインフルエンザウイルスであり得る。核酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、さらに好ましくは融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードし得る。あるいは、核酸は、インフルエンザウイルスのＨ１赤血球凝集素としてコードし得る。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ｓａＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【0030】
サブミクロン粒子は、複数の脂質構造を好ましくは含む。例えば、サブミクロン粒子は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０個の脂質構造を含み得る。複数の脂質構造は、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれてもよい。
【0031】
脂質構造または各脂質構造は、脂質ナノ粒子またはリポソームであり得る。好ましくは、脂質構造または各脂質構造は、脂質ナノ粒子である。
【0032】
脂質構造または各脂質構造は、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質構造または各脂質構造は、複数の脂質を含み得る。複数の脂質のうちの少なくとも１つは、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含み得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質は、多価カチオン性脂質であり得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質は、ｐＨ感受性脂質であり得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質は、正に帯電した窒素原子またはイオン化可能窒素原子を含み得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質は、酸性溶液中で正電荷を示し得る。溶液は、２０℃で７未満、さらに好ましくは２０℃で６．５未満のｐＨを有する場合、酸性であると理解され得る。溶液は、２０℃で３．５～７、または２０℃で４～７、さらに好ましくは２０℃で４．５～６．５のｐＨを有する場合、酸性であると理解され得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質は、ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、エチルホスファチジルコリン（エチルＰＣ）、ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－コレステロール）、Ｎ４－コレステリル－スペルミン（ＧＬ６７）、１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、またはヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）であり得る。
【0033】
いくつかの実施形態では、脂質構造は、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含み得る。脂質構造は、少なくとも１重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％または少なくとも９９重量％のカチオン性脂質またはイオン化可能脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、脂質構造は、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質からなり得る。あるいは、脂質構造は、１～９９重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、１０～９０重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、２０～８５重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、３０～８０重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、４０～７５重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、５０～７０重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質、または５５～６５重量％のカチオン性脂質もしくはイオン化可能脂質を含み得る。
【0034】
いくつかの実施形態では、脂質構造は、ステロール、例えば、コレステロールを含み得る。脂質構造は、少なくとも１重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％または少なくとも４０重量％のステロールを含み得る。脂質構造は、９９重量％未満のステロール、９０重量％未満のステロール、８０重量％未満のステロール、７０重量％未満のステロール、６０重量％未満のステロール、５０重量％未満のステロール、または４５重量％未満のステロールを含み得る。脂質構造は、１～９９重量％のステロール、１０～９０重量％のステロール、１５～８０重量％のステロール、２０～７０重量％のステロール、２５～６０重量％のステロール、３０～５０重量％のコレステロール、または３５～４５重量％のステロールを含み得る。
【0035】
いくつかの実施形態では、脂質構造は、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、コレステロールなどのステロールとの組合せを含み得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質対ステロールの重量比は、１：９９～９９：１、１０：９０～９０：１０、２０：８０～８５：１５、３０：７０～８０：２０、４０：６０～７５：２２、５０：５０～７０：３０、または５５：４５～６５：３５であり得る。カチオン性脂質またはイオン化可能脂質対ステロールの重量比は、約６０：４０であり得る。
【0036】
サブミクロン粒子は、少なくとも１：５０、少なくとも１：２０、少なくとも１：１０、少なくとも１：５、少なくとも１：２、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１または少なくとも５：１、さらに好ましくは少なくとも６：１、少なくとも８：１または少なくとも１０：１、最も好ましくは少なくとも１１：１、少なくとも１３：１、少なくとも１５：１、少なくとも１６：１、少なくとも１７：１または少なくとも１８：１のＮ／Ｐモル比を有し得る。サブミクロン粒子は、１０００：１未満、５００：１未満、２５０：１未満、１００：１未満、５０：１未満、４０：１未満、３０：１未満、２８：１未満、２６：１未満、２４：１未満、２２：１未満、２１：１未満または２０：１未満のＮ／Ｐモル比を有し得る。サブミクロン粒子は、１：５０～１，０００：１、１：１０～５００：１、１：５～２５０：１、１：２～１００：１、１：１～５０：１、２：１～４０：１、５：１～３０：１、８：１～２８：１、１０：１～２６：１、１２：１～２４：１、１４：１～２２：１、１６：１～２０：１、または１７：１～１９：１のＮ／Ｐモル比を有し得る。好ましい実施形態では、サブミクロン粒子は、１１：１～１８：１のＮ／Ｐ比を有する。Ｎ／Ｐモル比は、脂質構造内のカチオン性アミンとペイロード分子内のアニオン性ホスフェートとの比であると理解され得る。
【0037】
両親媒性コポリマーは、好ましくは両親媒性ブロックコポリマーである。
【0038】
両親媒性コポリマーは、少なくとも１つの親水性部分と少なくとも１つの疎水性部分とを含み得ることが理解され得る。いくつかの実施形態では、両親媒性コポリマーは、１つの親水性部分と１つの疎水性部分とを含むか、またはそれらからなる。親水性部分または各親水性部分は、ポリエーテル、アミノ酸に基づくポリマーもしくはポリペプチド、ポリ（２－メチルオキサゾリン）（ＰＭＯＸＡ）、および／もしくはその誘導体を含み得るか、またはそれらであり得る。疎水性部分または各疎水性部分は、ポリエステル、酸不安定性ポリカーボネート、ポリ（エチルエチレン）（ＰＥＥ）、ポリ（ブタジエン）（ＰＢＤ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（スチレン）（ＰＳｔ）および／もしくその誘導体を含み得るか、またはそれらであり得る。
【0039】
好ましくは、両親媒性コポリマーは生分解性である。したがって、疎水性部分または各疎水性部分は、ポリエステル、酸不安定性ポリカーボネートおよび／もしくその誘導体を含み得るか、またはそれらであり得る。
【0040】
酸不安定性ポリカーボネートは、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）、ポリ（２，４，６－トリメトキシベンジリデンペンタエリスリトールカーボネート）（ＰＴＭＢＰＥＣ）またはその誘導体であり得る。アミノ酸に基づくポリマーまたはポリペプチドは、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）（ＰＧＡ）、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）またはその誘導体であり得る。
【0041】
任意の好適なポリエーテルを使用してもよい。いくつかの実施形態では、ポリエーテルまたは各ポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴ（エチレングリコール）（オリゴＥＧ）またはその誘導体であり得る。例えば、ＰＥＧの誘導体には、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルアクリレート（ｍＰＥＧＡ）、およびポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ｍＰＥＧＭＡ）が含まれ得る。あるいは、ポリエーテルは、本出願人の先の特許出願ＧＢ２００９７２０．０に開示されているポリエーテルであってよい。例えば、親水性部分は、以下を含み得るか、または以下からなり得る：
【0042】
【化1】
【0043】
ｎは整数であることが理解され得る。
【0044】
同様に、任意の好適なポリエステルを使用してもよい。いくつかの実施形態では、ポリエステルまたは各ポリエステルは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε－デカラクトン）（ＰＤＬ）またはその誘導体からなる一覧から選択され得る。あるいは、ポリエステルは、本出願人の先の特許出願ＧＢ２００９７２０．０に開示されているポリエステルであってよい。例えば、疎水性部分は、以下を含み得るか、または以下からなり得る：
【0045】
【化2】
【0046】
ｍおよびｎは整数であることが理解され得る。
【0047】
親水性部分は、両親媒性コポリマーの６０重量％未満、５０重量％未満、４５重量％未満、４０重量％未満、３５重量％未満または３２重量％未満を構成し得る。親水性部分は、両親媒性コポリマーの５～６０重量％、さらに好ましくは両親媒性コポリマーの１０～５０重量％、または２０～４５重量％、最も好ましくは両親媒性コポリマーの２５～４０重量％、２８～３５重量％、または３０～３２重量％を構成し得る。
【0048】
疎水性部分は、両親媒性コポリマーの少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％または少なくとも６８重量％を構成し得る。疎水性部分は、両親媒性コポリマーの４０～９５重量％、さらに好ましくは両親媒性コポリマーの５０～９０重量％、または５５～８０重量％、最も好ましくは両親媒性コポリマーの６０～７５重量％、６５～７２重量％、または６８～７０重量％を構成し得る。
【0049】
両親媒性コポリマーは、少なくとも１，０００Ｄａ、少なくとも２，０００Ｄａ、少なくとも３，０００Ｄａ、少なくとも４，０００Ｄａまたは少なくとも５，０００Ｄａの分子量を有し得る。好ましくは、両親媒性コポリマーは、少なくとも６，０００Ｄａまたは少なくとも７，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、両親媒性コポリマーは、少なくとも８，０００Ｄａ、少なくとも１０，０００Ｄａ、少なくとも１２，０００Ｄａ、少なくとも１４，０００Ｄａ、少なくとも１５，０００Ｄａまたは少なくとも１６，０００Ｄａの分子量を有する。
【0050】
両親媒性コポリマーは、１００，０００Ｄａ未満、８０，０００Ｄａ未満、７０，０００Ｄａ未満、６０，０００Ｄａ未満または５０，０００Ｄａ未満の分子量を有し得る。好ましくは、両親媒性コポリマーは、４０，０００Ｄａ未満または３０，０００Ｄａ未満の分子量を有する。最も好ましくは、両親媒性コポリマーは、２５，０００Ｄａ未満、２０，０００Ｄａ未満、１８，０００Ｄａ未満、１７，０００Ｄａ未満または１６，０００Ｄａ未満の分子量を有し得る。
【0051】
両親媒性コポリマーは、１，０００～１００，０００Ｄａ、２，０００～８０，０００、３，０００～７０，０００、４，０００～６０，０００、５，０００～５０，０００、さらに好ましくは６，０００～４０，０００、７，０００～５０，０００、８，０００～２５，０００、１０，０００～２０，０００、１２，０００～１８，０００、１４，０００～１６，０００Ｄａ、１５，０００～１７，５００Ｄａ、または１６，０００～１７，０００Ｄａの分子量を有し得る。
【0052】
疎水性部分は、少なくとも１，０００Ｄａ、少なくとも２，０００Ｄａ、少なくとも３，０００Ｄａ、少なくとも４，０００Ｄａまたは少なくとも５，０００Ｄａの分子量を有し得る。好ましくは、疎水性部分は、少なくとも６，０００Ｄａまたは少なくとも７，０００Ｄａの分子量を有する。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、少なくとも８，０００Ｄａ、少なくとも１０，０００Ｄａまたは少なくとも１１，０００Ｄａの分子量を有する。
【0053】
疎水性部分は、１，０００～７０，０００、２，０００～６０，０００、３０００～５０，０００、さらに好ましくは４，０００～４０，０００、５，０００～５０，０００、６，０００～２５，０００、７，０００～２０，０００、８，０００～１８，０００、９，０００～１５，０００Ｄａ、１０，０００～１３，０００Ｄａ、または１１，０００～１２，０００Ｄａの分子量を有し得る。
【0054】
上で定義された両親媒性コポリマーの分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）であると理解され得る。
【0055】
両親媒性コポリマーの分子量、疎水性部分の分子量、および／または親水性部分の分子量は、ＮＭＲまたはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して決定され得る。ＮＭＲおよびＧＰＣの使用方法は、実施例に記載される通りであり得る。いくつかの実施形態では、分子量は、ＮＭＲ、好ましくは１Ｈ ＮＭＲを使用して決定される。
【0056】
両親媒性コポリマー対ペイロード分子の重量比は、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１または少なくとも４０：１、さらに好ましくは少なくとも５０：１または少なくとも５５：１、最も好ましくは少なくとも６０：１であり得る。両親媒性コポリマー対ペイロード分子の重量比は、１０００：１未満、５００：１未満、２５０：１未満、２００：１未満または１５０：１未満、さらに好ましくは１２５：１未満、１００：１未満、最も好ましくは８５：１未満であり得る。両親媒性コポリマー対ペイロード分子の重量比は、５：１～１０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～２５０：１、３０：１～２００：１、または４０：１～１５０：１、さらに好ましくは５０：１～１２５：１、または５５：１～１００：１、最も好ましくは６０：１～８５：１であり得る。
【0057】
両親媒性コポリマー対カチオン性脂質またはイオン化可能脂質の重量比は、少なくとも１：１０、少なくとも１：８、少なくとも１：６、少なくとも１：４、少なくとも１：２または少なくとも１：１．５、さらに好ましくは少なくとも１：１、少なくとも１．５：１、少なくとも１．７５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．２：１または少なくとも２．４：１、最も好ましくは少なくとも２．５：１であり得る。両親媒性コポリマー対カチオン性脂質またはイオン化可能脂質の重量比は、５０：１未満、２０：１未満、１５：１未満、１０：１未満、８：１未満または６：１未満、さらに好ましくは５．５：１未満、５：１未満、４．５：１未満、４：１未満、３．５：１未満または３：１未満、最も好ましくは２．７：１未満であり得る。両親媒性コポリマー対カチオン性脂質またはイオン化可能脂質の重量比は、１：１０～５０：１、１：８～２０：１、１：６～１５：１、１：４～１０：１、１：２～８：１、または１：１．５～６：１、さらに好ましくは１：１～５．５：１、１．５：１～５：１、１．７５：１～４．５：１、２：１～４：１、２．２：１～３．５：１、または２．４：１～３：１、最も好ましくは２．５：１～２．７：１であり得る。
【0058】
両親媒性コポリマーを含む外層は、好ましくは少なくとも０．５ｎｍ、少なくとも１ｎｍまたは少なくとも１．５ｎｍ、さらに好ましくは少なくとも２ｎｍまたは少なくとも２．５ｎｍ、最も好ましくは少なくとも３ｎｍの厚さを含む。両親媒性コポリマーを含む外層は、好ましくは２５ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１５ｎｍ未満、さらに好ましくは１０ｎｍ未満または７．５ｎｍ未満、最も好ましくは５ｎｍ未満の厚さを含む。両親媒性コポリマーを含む外層は、好ましくは０．５～２５ｎｍ、１～２０ｎｍ、または１．５～１５ｎｍ、さらに好ましくは２～１０ｎｍ、または２．５～７．５ｎｍ、最も好ましくは３～５ｎｍの厚さを含む。
【0059】
サブミクロン粒子は、少なくとも１つの安定化分子をさらに含み得る。少なくとも１つの安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれてもよい。代替的または追加的に、少なくとも１つの安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置されてもよい。
【0060】
安定化分子対ペイロード分子の重量比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも４：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１または少なくとも９５：１であり得る。いくつかの実施形態では、安定化分子対ペイロード分子の重量比は、少なくとも１００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、少なくとも１，０００：１、少なくとも２，０００：１、少なくとも３，０００：１、少なくとも４，０００：１または少なくとも５，０００：１であり得る。安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１００，０００：１未満、５０，０００：１未満、１０，０００：１未満、９，０００：１未満、８，０００：１未満、７，０００：１未満または６，５００：１未満であり得る。いくつかの実施形態では、安定化分子対ペイロード分子の重量比は、５，０００：１未満、１，０００：１未満、５００：１未満、４００：１未満、３５０：１未満、３００：１未満、２５０：１未満、２００：１未満、１７５：１未満、１５０：１未満、１２５：１未満または１１０：１未満であり得る。安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１：１～１００，０００：１、２：１～５０，０００：１、４：１～１０，０００：１、６：１～９，０００：１、８：１～８，０００：１、１０：１～７，０００：１、または２０：１～６，５００：１であり得る。いくつかの実施形態では、安定化分子対ペイロード分子の重量比は、６：１～５，０００：１、８：１～１，０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～４００：１、３０：１～３５０：１、４０：１～３００：１、５０：１～２５０：１、６０：１～２００：１、７０：１～１７５：１、８０：１～１５０：１、９０：１～１２５：１、または９５：１～１１０：１であり得る。代替的な実施形態では、安定化分子対ペイロード分子の重量比は、９０：１～１００，０００：１、１００：１～５０，０００：１、５００：１～２５，０００：１、１，０００：１～１０，０００：１、２，０００：１～９，０００：１、３，０００：１～８，０００：１、４，０００：１～７，０００：１、または５，０００：１～６，５００：１であり得る。これらの重量比は、安定化分子対ペイロード分子の総重量に関連し得、すなわち、それらは、外層によって取り囲まれる任意の安定化分子と外層の外側に配置される任意の安定化分子との重量を含み得る。
【0061】
少なくとも１つの安定化分子が両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれる実施形態では、脂質構造にカプセル化されてもよい。代替的または追加的に、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれた少なくとも１つの安定化分子は、脂質構造の外側に配置されてもよい。サブミクロン粒子が複数の脂質構造を含む実施形態では、少なくとも１つの安定化分子は、複数の脂質構造の間に配置されてもよい。
【0062】
外層によって取り囲まれた安定化分子対ペイロード分子の重量比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも４：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１または少なくとも９５：１であり得る。外層によって取り囲まれた安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１００，０００：１未満、５０，０００：１未満、１０，０００：１未満、５，０００：１未満、１，０００：１未満、５００：１未満、４００：１未満、３５０：１未満、３００：１未満、２５０：１未満、２００：１未満、１７５：１未満、１５０：１未満、１２５：１未満または１１０：１未満であり得る。外層によって取り囲まれた安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１：１～１００，０００：１、２：１～５０，０００：１、４：１～１０，０００：１、６：１～５，０００：１、８：１～１，０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～４００：１、３０：１～３５０：１、４０：１～３００：１、５０：１～２５０：１、６０：１～２００：１、７０：１～１７５：１、８０：１～１５０：１、９０：１～１２５：１、または９５：１～１１０：１であり得る。
【0063】
代替的または追加的に、少なくとも１つの安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置されてもよい。両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置された少なくとも１つの安定化分子は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも２２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも２４０ｍｇ／ｍｌの濃度で配置され得る。両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置された少なくとも１つの安定化分子は、１００，０００ｍｇ／ｍｌ未満、５０，０００ｍｇ／ｍｌ未満、１０，０００ｍｇ／ｍｌ未満、５，０００ｍｇ／ｍｌ未満または１，０００ｍｇ／ｍｌ未満、さらに好ましくは７５０ｍｇ／ｍｌ未満、５００ｍｇ／ｍｌ未満、３００ｍｇ／ｍｌ未満または２８０ｍｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは２６０ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で配置され得る。両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置された少なくとも１つの安定化分子は、１～１００，０００ｍｇ／ｍｌ、５～５０，０００ｍｇ／ｍｌ、１０～１０，０００ｍｇ／ｍｌ、２５～５，０００ｍｇ／ｍｌ、または５０～１，０００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１００～７５０ｍｇ／ｍｌ、１５０～５００ｎｍ／ｍｌ、２００～３００ｎｍ／ｍｌ、または２２０～２８０ｎｍ／ｍｌ、最も好ましくは２４０～２６０ｍｇ／ｍｌの濃度で配置され得る。
【0064】
好ましい実施形態では、サブミクロン粒子は、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれた少なくとも１つの安定化分子を含み、少なくとも１つの安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置される。
【0065】
安定化分子または各安定化分子は、炭水化物および／またはポリオールであり得る。
【0066】
炭水化物は、糖と呼ばれ得る。炭水化物は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノースおよびキシロースまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体からなる群から選択され得る単糖であり得る。あるいは、炭水化物は、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、ラクチトール、ラクツロース、マンノビオースおよびイソマルトまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体からなる群から選択され得る二糖であり得る。さらなる代替例では、炭水化物は、ニゲロトリオース（ｎｉｇｅｒｏｔｒｉｏｓｅ）、マルトトリオース、メレチトース、マルトトリウロース（ｍａｌｔｏｔｒｉｕｌｏｓｅ）、ラフィノースおよびケストースまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体からなる群から選択され得る三糖であり得る。さらなる代替例では、炭水化物は、デキストラン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ガラクトゲン、イヌリン、カロース、セルロース、キトサンおよびキチンまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体からなる群から選択され得る多糖であり得る。
【0067】
炭水化物は、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、アルファ－Ｄ－グルコピラノシル－１－６－ソルビトール、アルファ－Ｄ－グルコピラノシル－１－６－マンニトール、マルトオリゴ糖、水素化マルトオリゴ糖、デンプンおよびセルロースまたはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体からなる群から選択され得るポリオールであり得る。
【0068】
代替的または追加的に、ポリオールは、複数のヒドロキシル基を含むオリゴマー、複数のヒドロキシル基を含むポリマー、またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体であり得る。
【0069】
少なくとも１つの安定化分子は、少なくとも２つの異なる安定化分子を含み得る。各安定化分子は炭水化物であり得る。一実施形態では、第１の安定化分子は二糖（例えば、トレハロース）であり得、第２の安定化分子は多糖（例えば、デキストラン）であり得る。
【0070】
いくつかの実施形態では、炭水化物は、二糖、最も好ましくはトレハロース、またはその薬学的に許容される複合体、塩、溶媒和物、互変異性型、立体異性体もしくは多形体である。トレハロースは、合成トレハロースまたは天然トレハロースであり得る。
【0071】
サブミクロン粒子は、少なくとも１つの標的化リガンドまたは標的化部分を含み得る。少なくとも１つの標的化リガンドまたは標的化部分は、サブミクロン粒子の外面に配置され得る。したがって、少なくとも１つの標的化リガンドまたは標的化部分は、両親媒性コポリマーを含む外層の外面に配置され得る。
【0072】
少なくとも１つの標的化リガンドまたは標的化部分は、ペプチド、タンパク質、アプタマー、炭水化物、オリゴ糖、葉酸もしくはフォレート、および抗体もしくはその抗原結合断片、ビタミンもしくはその誘導体のうちの少なくとも１つであり得るか、またはそれらを含み得る。ペプチドは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＣＲ）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）、またはその誘導体であり得る。タンパク質は、レクチン、トランスフェリンまたはその誘導体であり得る。アプタマーは、ＨＩＶ糖タンパク質に対するＲＮＡアプタマーまたはその誘導体であり得る。炭水化物は、上で定義された通りであり得る。特に、炭水化物は、マンノース、グルコース、ガラクトースまたはその誘導体であり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体またはその誘導体であり得る。ビタミンはビタミンＤであり得る。
【0073】
サブミクロン粒子は、溶液中で保存され得る。溶液は水溶液であってよい。サブミクロン粒子は、ペイロード分子の濃度が少なくとも０．００１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．０１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．０５μｇ／ｍｌ、少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌまたは少なくとも２０μｇ／ｍｌであるような濃度で存在し得る。サブミクロン粒子は、ペイロード分子の濃度が５００ｍｇ／ｍｌ未満、１００ｍｇ／ｍｌ未満、１０ｍｇ／ｍｌ未満、５ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、５００μｇ／ｍｌ未満、２００μｇ／ｍｌ未満、１００μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満または３０μｇ／ｍｌ未満であるような濃度で存在し得る。サブミクロン粒子は、ペイロード分子の濃度が０．００１μｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌ、５～５００μｇ／ｍｌ、１０～２００μｇ／ｍｌ、１５～１００μｇ／ｍｌ、２０～５０μｇ／ｍｌ、または２０～３０μｇ／ｍｌであるような濃度で存在し得る。
【0074】
あるいは、サブミクロン粒子は凍結乾燥され得る。
【0075】
好ましくは、第１の態様のサブミクロン粒子は、熱的に安定化される。
【0076】
「熱安定化」または「熱的に安定化される」という表現は、サブミクロン粒子が、一定の温度で一定期間にわたって保存された場合に、その生物学的活性を実質的に保持する（例えば、それを投与された対象において免疫応答および／またはタンパク質発現を誘発する）ことを意味し得ることが理解されるであろう。本発明者らは、いかなる仮説にも束縛されることを望まないが、熱安定化効果は、製剤中の脂質構造を安定化することによって、例えば、その凝集を防止もしくは低減することによって、ペイロード分子（好ましくはＲＮＡ）自体を安定化することによって、および／または改善されたコロイド安定性を有するようにサブミクロン粒子を安定化させることによって実現され得ると考えている。ペイロード分子（好ましくはＲＮＡ）の機能活性が保持されているかどうか、またはその程度は、例えば、ＲＮＡ構築物によってコードされる目的の抗原に対して産生された免疫特異的抗体（例えば、ＩｇＧ）の存在を検出すること、および／または目的のタンパク質の発現を検出することによって決定され得る。
【0077】
好ましくは、サブミクロン粒子は、－１００℃以上、－８０℃以上、－６０℃以上、－４０℃以上または－２０℃以上、さらに好ましくは－１５℃以上、最も好ましくは－１０℃以上の温度で保存した後に熱的に安定化される。好ましくは、サブミクロン粒子は、－５℃以上、さらに好ましくは０℃以上、最も好ましくは１℃以上の温度で保存した後に熱的に安定化される。最も好ましくは、サブミクロン粒子は、２℃以上、さらに好ましくは３℃以上、最も好ましくは４℃以上の温度で保存した後に熱的に安定化される。さらになお好ましくは、サブミクロン粒子は、５℃以上、さらに好ましくは６℃以上、最も好ましくは７℃以上の温度で保存した後に熱的に安定化される。
【0078】
サブミクロン粒子は、１００℃未満、８０℃未満、６０℃未満、５０℃未満、４０℃未満、３５℃未満または３０℃未満の温度で保存した後に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、２５℃未満、２０℃未満または１５℃未満の温度で保存した後に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、１０℃未満、８℃未満または７℃未満の温度で保存した後に熱的に安定化され得る。
【0079】
サブミクロン粒子は、－１００℃～１００℃、－８０℃～９０℃、－６０℃～８０℃、－４０℃～７０℃、－２０℃～６０℃、－２０℃～５０℃、－２０℃～４０℃、－２０℃～３５℃、－２０℃～３０℃、－１５℃～２５℃、または－１０℃～２０℃の温度で保存した的に熱的に安定化され得る。サブミクロン粒子は、－５℃～１５℃、０℃～１０℃、１℃～９℃、または２℃～８℃の温度で保存した的に熱的に安定化され得る。
【0080】
第２の態様によれば、サブミクロン粒子を製造する方法であって、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを接触させて、サブミクロン粒子を製造することを含む方法が提供される。
【0081】
有利には、方法は、第１の態様のサブミクロン粒子を提供するためのワンポット法を提供する。
【0082】
好ましくは、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとは、同時に接触させられる。ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとは、それらがいずれも同じ反応混合物中に存在する場合、同時に接触させられると理解され得る。
【0083】
ペイロード分子、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質、および両親媒性コポリマーは、第１の態様に関して定義された通りであり得る。さらに、ペイロード分子、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質、および両親媒性コポリマーは、第１の態様に関して定義された比で提供され得る。
【0084】
両親媒性コポリマーは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して合成され得る。例えば、両親媒性コポリマーは、本出願人の先の特許出願、ＧＢ２００９７２０．０に定義された方法を使用して合成され得る。ただし、代替方法が使用されてもよいことが理解されるであろう。
【0085】
方法は、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と両親媒性コポリマーとを含む第１の溶液を提供することを含み得る。第１の溶液は、有機溶媒を含み得る。有機溶媒は、エーテル、アルコールまたはニトリルであってよい。エーテルは、環状エーテルであってよい。有機溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール、メタノールおよびアセトニトリルであってよい。
【0086】
方法は、ペイロード分子を含む第２の溶液を提供することを含み得る。第２の溶液は、水、好ましくはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）不含水を含み得る。
【0087】
ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを接触させることは、第１および第２の溶液を組み合わせて（combining）反応混合物を生成し、それによって、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを接触させることを含み得る。
【0088】
方法は、反応混合物を撹拌することを含み得る。
【0089】
方法は、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを少なくとも１５秒間、少なくとも３０秒間、少なくとも４５秒間または少なくとも１分間接触させることを含み得る。方法は、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを１５秒～３０分間、３０秒～１０分間、４５秒～５分間、または１～２分間接触させることを含み得る。
【0090】
方法は、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを０℃～７５℃、５℃～５０℃、１０℃～３０℃１５℃～２５℃、または１９℃～２１℃の温度で接触させることを含み得る。
【0091】
方法は、有機溶媒を除去することを続いて含み得る。有機溶媒は、回転蒸発によって除去され得る。
【0092】
ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーとを接触させることは、ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーと、安定化分子とを接触させることを含み得る。ペイロード分子と、カチオン性脂質またはイオン化可能脂質と、両親媒性コポリマーと、安定化分子とは、同時に接触させられてもよい。
【0093】
有利には、得られたサブミクロン粒子では、安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層によって取り囲まれる。
【0094】
安定化分子は、第１の態様に関して定義された通りであり得る。
【0095】
方法が第２の溶液を提供することを含む実施形態では、第２の溶液は、安定化分子をさらに含み得る。
【0096】
第２の溶液中および／または反応混合物中の安定化分子対ペイロード分子の重量比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも４：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも６０：１、少なくとも７０：１、少なくとも８０：１、少なくとも９０：１または少なくとも９５：１であり得る。第２の溶液中および／または反応混合物中の安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１００，０００：１未満、５０，０００：１未満、１０，０００：１未満、５，０００：１未満、１，０００：１未満、５００：１未満、４００：１未満、３５０：１未満、３００：１未満、２５０：１未満、２００：１未満、１７５：１未満、１５０：１未満、１２５：１未満または１１０：１未満であり得る。第２の溶液中および／または反応混合物中の安定化分子対ペイロード分子の重量比は、１：１～１００，０００：１、２：１～５０，０００：１、４：１～１０，０００：１、６：１～５，０００：１、８：１～１，０００：１、１０：１～５００：１、２０：１～４００：１、３０：１～３５０：１、４０：１～３００：１、５０：１～２５０：１、６０：１～２００：１、７０：１～１７５：１、８０：１～１５０：１、９０：１～１２５：１、または９５：１～１１０：１であり得る。
【0097】
代替的または追加的に、方法は、得られたサブミクロン粒子と安定化分子とを接触させることを含み得る。安定化分子は、第１の態様に関して定義された通りであり得る。したがって、少なくとも１つの安定化分子は、両親媒性コポリマーを含む外層の外側に配置されてもよい。
【0098】
方法は、有機溶媒を除去した後に、得られたサブミクロン粒子と安定化分子とを接触させることを含み得る。
【0099】
方法は、得られたサブミクロン粒子と安定化分子とをある濃度で接触させて、第１の態様に関して定義された、安定化分子の濃度を得ることを含み得る。
【0100】
方法は、溶液中でサブミクロン粒子を保存することを含み得る。溶液は、第１の態様に関して定義された通りであり得る。
【0101】
あるいは、方法は、サブミクロン粒子を乾燥させることを含み得る。好ましくは、サブミクロン粒子を乾燥させることは、サブミクロン粒子を凍結乾燥させることを含む。
【0102】
第３の態様によれば、第２の態様の方法によって得られるまたは得ることができるサブミクロン粒子が提供される。
【0103】
第４の態様では、第１または第３の態様のサブミクロン粒子と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物が提供される。
【0104】
第５の態様では、第４の態様による医薬組成物を調製する方法であって、第１または第３の態様のサブミクロン粒子を薬学的に許容されるビヒクルと接触させることを含む方法が提供される。
【0105】
第６の態様では、医薬品として使用するための、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、または第４の態様の医薬組成物が提供される。
【0106】
第７の態様では、治療方法であって、それを必要とする対象に、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子または第４の態様の医薬組成物の治療量を投与することまたは投与したことがあることを含む方法が提供される。
【0107】
第８の態様では、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子または第４の態様の医薬組成物を含むワクチン組成物が提供される。
【0108】
ワクチンは、好適なアジュバントを含み得る。
【0109】
ワクチンは、ＣＯＶＩＤ－１９用のワクチンであり得る。ワクチンは、インフルエンザウイルス用のワクチンであり得る。
【0110】
第９の態様では、対象の免疫応答を刺激するのに使用するための、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、第４の態様の医薬組成物、または第８の態様のワクチンが提供される。
【0111】
免疫応答は、原虫、細菌、ウイルス、真菌または癌に対して刺激され得る。ウイルスはＣＯＶＩＤ－１９であり得る。ウイルスはインフルエンザウイルスであり得る。
【0112】
本発明の第１０の態様では、対象にワクチン接種する方法であって、それを必要とする対象に、第１もしくは第３の態様のサブミクロン粒子、第４の態様の医薬組成物または第８の態様のワクチンの治療量を投与することまたは投与したことがあることを含む方法が提供される。
【0113】
本発明のサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンは、特に、組成物が使用される様式に応じて、いくつかの異なる形態を有する組成物に組み合わせられ得る。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とする人もしくは動物に投与され得る任意の他の好適な形態であり得る。本発明による医薬品のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるであろう。
【0114】
本発明のサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンは、徐放装置または遅延放出装置内に組み込まれてもよい。そのような装置は、例えば、皮膚の上または下に挿入されてもよく、医薬品は、数週間または数ヶ月にわたって放出されてもよい。装置は、治療部位に少なくとも隣接して配置されてもよい。
【0115】
ただし、好ましい実施形態では、本発明による医薬品は、血流、筋肉、皮膚に、または治療を必要とする部位に直接注射することによって対象に投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）、皮下（ボーラスまたは注入）、皮内（ボーラスまたは注入）、筋肉内（ボーラスまたは注入）、髄腔内（ボーラスまたは注入）、硬膜外（ボーラスまたは注入）または腹腔内（ボーラスまたは注入）であり得る。
【0116】
必要とされるサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンの量は、その生物学的活性およびバイオアベイラビリティによって決定され、これは、投与様式、サブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンの物理化学的特性、および単剤療法として使用されているか、または併用療法で使用されているかに依存することが理解されるであろう。
【0117】
投与頻度はまた、治療される対象内での活性剤の半減期による影響を受ける。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中のサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチン、医薬組成物の強度、投与様式、および治療の種類によって変動する。対象の年齢、体重、性別、食事および投与時間を含む、治療される特定の対象に依存する追加の要因によって、投与量を調節することが必要になる。
【0118】
必要な用量は、限定するものではないが、投与される活性剤、治療されるおよび／またはワクチン接種される疾患、治療される対象などを含む多くの要因に依存し得る。
【0119】
一般に、使用される活性剤に応じて、０．００１μｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０１μｇ／ｋｇ体重～１ｍｇ／ｋｇ体重の、本発明のサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンの用量が使用され得る。用量は、送達されるペイロード分子の量に関連すると理解され得る。
【0120】
用量は、単回投与（例えば、単回注射）として与えられ得る。あるいは、サブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンは、複数の投与を必要とし得る。一例として、サブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンは、０．０７μｇ～７００ｍｇ（すなわち、７０ｋｇの体重を仮定する）の２つ以上の用量として投与され得る。あるいは、徐放装置を使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明によるサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンの最適用量を患者に提供してもよい。投与経路は、静脈内注射経路、皮内注射経路皮下注射経路、筋肉内注射経路、髄腔内注射経路、硬膜外注射経路または腹腔内注射経路を組み込み得る。
【0121】
公知の手順、例えば、製薬業界によって従来使用されている手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など）を使用して、本発明によるサブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチン特定の製剤、および正確な治療レジメン（例えば、薬剤の用量、および投与頻度）を形成してもよい。
【0122】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物または家畜であり得る。したがって、本発明による組成物および医薬品は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよいか、または他の獣医学的用途で使用されてもよい。ただし、最も好ましくは、対象はヒトである。
【0123】
サブミクロン粒子、医薬組成物またはワクチンの「治療有効量」は、対象に投与された場合、治療効果をもたらすために必要な上記の量である任意の量である。
【0124】
例えば、本発明のサブミクロン粒子、医薬組成物およびワクチンの治療有効量は、約０．００１ｍｇ～約８００ｍｇのペイロード分子、好ましくは約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇのペイロード分子を含み得る。
【0125】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の公知の化合物または公知の化合物の組合せである。
【0126】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であり得、組成物は粉末、カプセルまたは錠剤の形態であり得る。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存剤、染料、コーティングまたは錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、カプセル化材料であってもよい。粉末では、ビヒクルは、本発明による微粉化された活性剤と混合された微粉化された固体である。錠剤では、活性剤（例えば、本発明のサブミクロン粒子）は、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮され得る。医薬ビヒクルはゲルであり得、組成物はクリームなどの形態であり得る。
【0127】
あるいは、医薬ビヒクルは液体であってよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物の調製に使用される。本発明によるサブミクロン粒子は、薬学的に許容される液体ビヒクル、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪に溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、他の好適な医薬添加剤、例えば、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調整剤を含有することができる。経口投与および非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例には、水（上記のような添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えば、グリコールを含む）およびその誘導体、ならびに油（例えば、分画されたヤシ油および落花生油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、油性エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルであってもよい。非経口投与のための滅菌液体形態の組成物では、滅菌液体ビヒクルが有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【0128】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内注射、髄腔内注射、硬膜外注射、腹腔内注射、静脈内注射および皮下注射によって利用され得る。本発明のサブミクロン粒子は、任意の適切な滅菌注射用媒体として調製され得る。
【0129】
サブミクロン粒子は、吸入によって投与され得る。例えば、サブミクロン粒子は、エアロゾルの形態で提供されてもよい。
【0130】
本発明のサブミクロン粒子および／または医薬組成物は、他の溶質または懸濁化剤（例えば、溶液を等張性にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、ソルビタンモノオレート、ポリソルベート８０（ソルビトール、およびエチレンオキシドと共重合されたその無水物のオレイン酸エステル）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明のサブミクロン粒子、および／または本発明による医薬組成物は、液体または固体の組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、固体形態、例えば、丸剤、カプセル、顆粒、錠剤および粉末、ならびに液体形態、例えば、溶液、シロップ、エリキシルおよび懸濁液が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。
【0131】
本明細書に記載のすべての特徴（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴および／または工程の少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除いて、任意の組合せで上記の態様のいずれかと組み合わされ得る。
【0132】
本発明をさらによく理解するために、および本発明の実施形態がどのように実施され得るかを示すために、ここで、例として、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0133】
【図1】（Ａ）ポリマー内包脂質ナノ粒子（ＰＥ－ＬＮＰ）の調製手順、および（Ｂ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ、括弧内に示されているその自己増幅工程）を含むＲＮＡのＰＥ－ＬＮＰ媒介細胞内送達の概略図である。指定されない限り、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋおよびＤＯＴＡＰを使用してＰＥ－ＬＮＰを調製した。
【図2】（Ａ）ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋポリマーの１Ｈ－ＮＭＲスペクトル；（Ｂ）ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ、ＤＯＴＡＰおよびｓａＲＮＡから構成されたＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の動的光散乱（ＤＬＳ）サイズ分布；ならびに（Ｃ）様々なＰＥ－ＬＮＰのＤＬＳサイズ、ゼータ電位および多分散性（ＰＤＩ）を示す。
【図3】異なるＮ／Ｐモル比（ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ／ｓａＲＮＡ重量比＝６５）を有するＰＥ－ＬＮＰの、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ Ａｓｓａｙによって決定されたカプセル化効率を示す。
【図4】ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’、ＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－８０’のＳＥＭおよびＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真を示す。アポストロフィ記号は、ＰＥ－ＬＮＰにペイロードが存在しないことを示唆している。
【図5】ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’。ＰＥ－ＬＮＰ １１’－８０’、ＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－８０’の熱勾配時の（Ａ）ＤＬＳサイズおよび（Ｂ）ＰＤＩの変化を示す。アポストロフィ記号は、ＰＥ－ＬＮＰにペイロードが存在しないことを示唆している。
【図6】（Ａ）は、純粋な脂質膜と比較して、ＮＢＤ（ドナー色素）とＲｈｏｄ（アクセプター色素）との間の同様の距離、したがって、同様の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）効率を示す均一なポリマー－脂質ハイブリッド膜の概略図である。（Ｂ～Ｄ）は、ＰＥ－ＬＮＰ（ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’）およびＤＯＴＡＰリポソームの蛍光スペクトルおよびＦＲＥＴ効率を示す。アポストロフィ記号は、ＰＥ－ＬＮＰにペイロードが存在しないことを示唆している。各試料群におけるＤＯＴＡＰの後の小さい数、すなわち、１４３、３５８および５７２は、それぞれ、対応するＰＥ－ＬＮＰに存在するＤＯＴＡＰの等モル濃度を示す。各試料群におけるＤＯＴＡＰの後の大きい数、すなわち、１８６、４０１および６１５は、それぞれ、対応するＰＥ－ＬＮＰに存在するＤＯＴＡＰおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋの総モル濃度を示す。ＰＥ－ＬＮＰまたはＤＯＴＡＰリポソーム内のＮＢＤ－ＰＥ（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）－１，２－ジヘキサデカノイル－ｓｎグリセロ－３－ホスホエタノールアミン、トリエチルアンモニウム塩）およびＲｈｏｄ－ＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）、アンモニウム塩）の濃度を４．０ｍＭに固定し、それらの蛍光強度を４６０ｎｍの励起波長で測定した。ＦＲＥＴ効率の顕著な差は、均一なポリマー－脂質ハイブリッド膜が存在しなかったことを示唆する。
【図7】（Ａ）は、ＤＯＴＡＰがＰＥ－ＬＮＰのコアに存在し、軽微なＦＲＥＴをもたらす場合の脂質混合の非存在の概略図である。（Ｂ、Ｃ）は、０、１および２時間の間隔でのＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’およびＤＯＴＡＰリポソームの蛍光スペクトルおよびＦＲＥＴ効率を示す。アポストロフィ記号は、ＰＥ－ＬＮＰにペイロードが存在しないことを示唆している。ＤＯＴＡＰの後の数、すなわち、３５８は、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’に存在するＤＯＴＡＰの等モル濃度を示す。ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’またはＤＯＴＡＰリポソーム内のＮＢＤ－ＰＥおよびＲｈｏｄ－ＰＥの濃度を４．０ｍＭに固定し、それらの蛍光強度を４６０ｎｍの励起波長で測定した。ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（ＮＢＤ－ＰＥ）とＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（Ｒｈｏｄ－ＰＥ）とを２時間混合した後の軽微なＦＲＥＴは、ＰＥ－ＬＮＰのコア内のＤＯＴＡＰ脂質の存在を示唆している。
【図8】（Ａ、Ｂ）ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイによって決定された相対発光単位（ＲＬＵ）として表される、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の非存在下での異なるＮ／Ｐモル比を有するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率、およびＦＢＳの非存在下（Ｃ、Ｄ）またはＦＢＳの存在下（Ｅ、Ｆ）での異なるＰＥＧ－ＰＣＬ／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）比を有するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率のグラフを示す。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図9】（Ａ）ＦＢＳの非存在下または（Ｂ）ＦＢＳの存在下での、および４℃で５日間保存した後の（Ｃ）ＲＮａｓｅ不含水または（Ｄ）ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳ中のｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０（ナノ粒子コア内のｓａＲＮＡ）およびｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０ Ｍ２（ナノ粒子表面上のｓａＲＮＡ）のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を比較する。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。単一（＊）、二重（＊＊）、三重（＊＊＊）および四重のアスタリスク記号（＊＊＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示し、ＮＳは、２群間に有意差がないことを表す。
【図10】（Ａ）６５および（Ｂ）８０のポリマー／ｓａＲＮＡ重量比（Ｎ／Ｐモル比＝１１または１８）を有するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのＨｅＬａ細胞トランスフェクション効率を示す。０．１、０．５、１、３、５および７μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量をホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイで試験した。
【図11】（Ａ）ＲＰＭＩ－１６４０培地中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を添加した様々なＰＥ－ＬＮＰによってトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞を示す蛍光顕微鏡画像；（Ｂ、Ｃ）ＯＰＴＩＭＥＭ培地中で４時間ＰＥ－ＬＮＰを処理した後、Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して測定した、陰性対照（培地のみによって処理した細胞）と比較したＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の割合、および平均蛍光強度（ＭＦＩ）および（Ｄ）細胞生存率のフローサイトメトリー分析を示す。ｍＲＮＡ用量は２μｇ ｍＬ－１に固定した。単一（＊）および四重のアスタリスク記号（＊＊＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０００１を示し、ＮＳは、２群間に有意差がないことを表す。
【図12】（Ａ）４または３７℃での４時間にわたるＨＥＫ２９３細胞内のＰＥ－ＬＮＰ １８－８０（１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡと５０μｇ ｍＬ－１のＦＩＴＣとを共添加（ｃｏｌｏａｄｅｄ））の細胞内分布を示す共焦点顕微鏡画像を示す。黄色の線は、ＩｍａｇｅＪを使用して（Ｂ）に示す強度プロファイルを生成するために使用した断面を示す。（Ｃ）エンドサイトーシス阻害剤ＭβＣＤの存在下でのＨＥＫ２９３細胞内のｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の細胞内分布を示す共焦点顕微鏡画像。（Ｄ）様々なエンドサイトーシス阻害剤の存在下でのｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０のエンドサイトーシスのフローサイトメトリー分析。二重のアスタリスク記号（＊＊）はｐ＜０．０１を示す。
【図13】（Ａ）１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡを添加した様々なＰＥ－ＬＮＰと３７℃で１時間インキュベートした後の溶血；および（Ｂ）ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して測定した、２４時間にわたってｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって処理したＨＥＫ２９３細胞の陰性対照（培地のみによって処理した細胞）と比較した生存率のグラフを示す。二重のアスタリスク記号（＊＊）はｐ＜０．０１を示す。
【図14】ＰＥ－ＬＮＰの内部または表面上に配合した５μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡを両後肢四頭筋に筋肉内（ＩＭ）注射した後７日目のＢａｌｂ／Ｃ雌マウスにおける（Ａ）ｆＬｕｃ生物発光の可視化および（Ｂ）ｆＬｕｃ発現の定量；（Ｃ）様々なＰＥ－ＬＮＰの内部に配合した、Ｃａｌ／０９ウイルスのＨ１赤血球凝集素をコードする１μｇのｓａＲＮＡ（ＨＡ ｓａＲＮＡ）によって後肢四頭筋１つにおいてＩＭ免疫し、４週間後に同一の製剤によってブーストしたＢａｌｂ／Ｃ雌マウスにおける免疫原性実験の概略図；（Ｄ）ＩＭ注射によるＨＡ ｓａＲＮＡ添加ｊｅｔＰＥＩおよび様々なＰＥ－ＬＮＰのプライムおよびブーストによるマウスの免疫後のＨＡ抗原特異的ＩｇＧ抗体力価；ならびに（Ｅ）ＩＭ注射したＢａｌｂ／Ｃ雌マウスに対するＣａｌ／０９インフルエンザウイルスによる鼻腔内（ＩＮ）負荷後の体重の変化を示す。単一のアスタリスク記号（＊）はｐ＜０．０５を示す。
【図15】ＩＭ注射によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－６５のプライムによるマウスの免疫後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）特異的ＩｇＧ抗体力価を示す。
【図16】ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋからそれぞれ構成されたｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のグラフを示す：（Ａ）新鮮試料のＤＬＳサイズ、（Ｂ）ＰＤＩおよび（Ｃ）ゼータ電位、ならびに（Ｄ）４℃の水溶液中で２１日間保存した後の試料のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図17】４℃の水溶液中の、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０にそれぞれ配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの安定な保存を示す。このグラフは、４℃の水溶液中で３ヶ月間保存した後のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図18】水溶液中、室温で２１日間保存した後のＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡのＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。ＮＳは、２群間に有意差がないことを表す。
【図19】室温の水溶液中の、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、１８－６５および１８－８０にそれぞれ配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの安定な保存を示す。水溶液中、室温で２８日間保存した後に、（Ａ）トランスフェクション効率、（Ｂ）ＤＬＳサイズ、（Ｃ）ＰＤＩおよび（Ｄ）ゼータ電位の変化を記録した。トランスフェクション効率では、ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図20】ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの構造および調製プロセスの概略図を示す。
【図21】トレハロースを含有する水溶液中のＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの４℃での安定な保存を示す：（ｉ）ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）；（ｉｉ）２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５。このグラフは、このグラフは、４℃の水溶液中で３８３日間保存した後のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図22】水溶液中、室温でのＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０それぞれにおける、トレハロースを共添加した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの安定な保存を示す（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）。水溶液中、室温で２８日間保存した後に、（Ａ）トランスフェクション効率、（Ｂ）ＤＬＳサイズ、（Ｃ）ＰＤＩおよび（Ｄ）ゼータ電位の変化を記録した。トランスフェクション効率では、ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図23】２００ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースの存在下でＰＥ－ＬＮＰに配合したｓａＲＮＡの濃度を変化させることによる凍結乾燥条件の効果を示す。このグラフは、ＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和後の凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を陰性対照として使用した。単一（＊）および三重のアスタリスク記号（＊＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１を示す。
【図24】４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡを添加したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の外部のトレハロースの濃度を変化させることによる凍結乾燥条件の効果を示す。このグラフは、ＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和後の凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を陰性対照として使用した。単一（＊）および二重のアスタリスク記号（＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。
【図25】２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースの存在下でＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの凍結乾燥後の４℃での安定な保存を示す。このグラフは、４℃で２８日間保存し、ＲＮａｓｅ不含水によって再水和した後の凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を陰性対照として使用した。ＮＳは、２群間に有意差がないことを表す。
【図26】トレハロース／ｓａＲＮＡ重量比を変化させることによる凍結乾燥条件の効果を示す。ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を調製するために、様々なトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比で、ＲＮａｓｅ不含脱イオン水中の４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ溶液にトレハロースを予備溶解した。次いで、得られたナノ粒子の外部に追加のトレハロースを加え、総トレハロース（ナノ粒子の内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充した。このグラフは、ＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和後の凍結乾燥ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を陰性対照として使用した。三重（＊＊＊）および四重のアスタリスク記号（＊＊＊＊）は、それぞれｐ ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【図27】トレハロースの存在下でＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの凍結乾燥後の４℃での安定な保存を示す。このグラフは、凍結乾燥、４℃で３８０日間の保存、およびその後の再水和後の２つの異なるＰＥ－ＬＮＰ １１－６５試料のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す：（ｉ）ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）；（ｉｉ）２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。
【図28】トレハロース含有ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの凍結乾燥後の４０℃での安定な保存を示す。このグラフは、３つの異なるＰＥ－ＬＮＰ １１－６５試料のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す：（ｉ）凍結乾燥、４０℃で０、１、３、５または７日間の保存、および外部トレハロースを除去しない再水和後のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）；（ｉｉ）凍結乾燥、４０℃で０、１、３、５または７日間の保存、および外部トレハロースを除去しない再水和後に、２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５；（ｉｉｉ）陰性対照として新たに調製したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。単一（＊）、二重（＊＊）、三重（＊＊＊）および四重のアスタリスク記号（＊＊＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０００１を示す。
【図29】内部トレハロースおよび外部トレハロースの存在下でＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの凍結乾燥後の４０℃での安定な保存を示す。このグラフは、凍結乾燥、４０℃で１４日間の保存、および外部トレハロースを除去しない再水和後のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す。１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を陰性対照として使用した。ＮＳは、２群間に有意差がないことを表す。
【図30】トレハロース含有ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５に配合した４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡの凍結乾燥後の４０℃での安定な保存を示す。このグラフは、３つの異なるＰＥ－ＬＮＰ １１－６５試料のＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を示す：（ｉ）凍結乾燥、４０℃で０、１、３、５または７日間の保存、再水和、次いで、限外濾過遠心分離による外部トレハロースの除去後のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）；（ｉｉ）凍結乾燥、４０℃で０、１、３、５または７日間の保存、再水和後、次いで、限外濾過遠心分離による外部トレハロースの除去後に、２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５；（ｉｉｉ）陰性対照として新たに調製したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）。ｓａＲＮＡ用量は１μｇ ｍＬ－１に固定した。単一（＊）および二重のアスタリスク記号（＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。
【図31】（Ａ）新たに調製したｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、またはｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５による処理の２時間後の４時間でのＨＥＫ２９３細胞の共焦点顕微鏡画像、ならびに（Ｂ）ＩｍａｇｅＪによって分析した共焦点顕微鏡画像におけるカルセインのＭＦＩを示す。四重のアスタリスク記号は、ｐ＜０．０００１を示す。
【図32】（Ａ）フローサイトメトリーによって測定した、新たに調製したｍＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｍＲＮＡ重量比＝１００、続いて、１０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロースに補充するために追加のトレハロースと混合）およびｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によってそれぞれ処理したＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３細胞の割合およびＭＦＩのグラフを示す。単一（＊）および二重のアスタリスク記号（＊＊）は、それぞれｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。
【図33】（Ａ）コレステロールを配合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率、（Ｂ）コレステロールを配合したＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’のゼータ電位、（Ｃ）ＰＤＩおよび（Ｄ）ＤＬＳサイズを示す。
【0134】
実施例１－様々な分子量を有するＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーの合成
触媒としてオクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）を使用した、ｍＰＥＧ－ＯＨによって開始されたε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）の開環重合によって、様々な分子量を有するＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーを合成した。要約すると、２００ｍｇのｍＰＥＧ５Ｋ－ＯＨ、４７０ｍｇのε－ＣＬ（または２００ｍｇのｍＰＥＧ２Ｋ－ＯＨ、５３０ｍｇのε－ＣＬ）および５０ｍｇのＳｎ（Ｏｃｔ）２を５ｍＬの無水トルエンに溶解し、反応系を乾燥窒素雰囲気下で４８時間かけて１１０℃に加熱した２２。反応後、混合物を脱気し、室温に冷却した。次いで、得られた生成物を過剰の冷ジエチルエーテルを使用して沈殿させた。ポリマーを濾過し、室温で一定重量になるまで真空乾燥させた。
触媒としてオクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）を使用した、ｍＰＥＧ－ＯＨによって開始されたε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）の開環重合によって、様々な分子量を有するＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーを合成した。要約すると、２００ｍｇのｍＰＥＧ５Ｋ－ＯＨ、４７０ｍｇのε－ＣＬ（または２００ｍｇのｍＰＥＧ２Ｋ－ＯＨ、５３０ｍｇのε－ＣＬ）および５０ｍｇのＳｎ（Ｏｃｔ）２を５ｍＬの無水トルエンに溶解し、反応系を乾燥窒素雰囲気下で４８時間かけて１１０℃に加熱した２２。反応後、混合物を脱気し、室温に冷却した。次いで、得られた生成物を過剰の冷ジエチルエーテルを使用して沈殿させた。ポリマーを濾過し、室温で一定重量になるまで真空乾燥させた。
【0135】
ＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーの特性評価
Ｊｅｏｌ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を用いて１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３において）を記録して、ＰＣＬブロックの化学組成および重合度を特性評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩを使用してゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、ポリマーの分子量および分子量分布を決定した。
Ｊｅｏｌ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計を用いて１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３において）を記録して、ＰＣＬブロックの化学組成および重合度を特性評価した。Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩを使用してゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、ポリマーの分子量および分子量分布を決定した。
【0136】
結果および考察
図１は、ポリマー内包脂質ナノ粒子（ＰＥ－ＬＮＰ）の調製手順、ならびにｍＲＮＡおよびｓａＲＮＡを含むＲＮＡのＰＥ－ＬＮＰ媒介細胞内送達の概略図である。ＰＥＧ－ＰＣＬは生分解性および生体適合性ポリマーであり、ＰＥＧおよびＰＣＬはともに、ヒトに対する適用についてＦＤＡによって承認されている。文献に報告されているように、両親媒性ポリマーの分子量は、自己組織化構造では重要な役割を果たす。両親媒性コポリマーは、親水性ブロックがその分子量の２５～４０％を占める場合、強固な小胞構造に自己組織化することができた２３～２５。両親媒性コポリマーの組成および分子量を変化させることができ、これにより、様々な表面特性、膜厚および安定性を有する小胞の形成が可能になる。２，０００および５，０００ＤａのＭｎを有するＰＥＧは、薬物送達系では最も広く使用されている親水性ブロックの１つであるため、本発明に記載される実施例では、市販のＰＥＧ（Ｍｎ＝２，０００および５，０００Ｄａ）を開始剤として選択した。触媒としてオクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）を使用した、ε－ＣＬの開環重合によって、２つの異なる分子量を有するＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーを合成することに成功した。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２Ａに示す。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．０６ｐｐｍのカプロラクトン単位（－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）のメチレンピークと３．６０ｐｐｍのエチレングリコール単位（－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）のエチレンピークとの積分から計算したＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、それぞれ７，８７３、１４，４７３および１６，５８０Ｄａであり、これらは理論分子量とよく一致していた（表１）。これは、所望の分子量を有するＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋコポリマー、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ８．５ｋコポリマーおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの合成に成功したことを示す。表１はまた、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋコポリマー、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ８．５ｋコポリマーおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの分子量、ならびにＧＰＣによって決定されたそれらの比較的低い多分散性（Ｄ＝Ｍｗ／Ｍｎ）を示す。
図１は、ポリマー内包脂質ナノ粒子（ＰＥ－ＬＮＰ）の調製手順、ならびにｍＲＮＡおよびｓａＲＮＡを含むＲＮＡのＰＥ－ＬＮＰ媒介細胞内送達の概略図である。ＰＥＧ－ＰＣＬは生分解性および生体適合性ポリマーであり、ＰＥＧおよびＰＣＬはともに、ヒトに対する適用についてＦＤＡによって承認されている。文献に報告されているように、両親媒性ポリマーの分子量は、自己組織化構造では重要な役割を果たす。両親媒性コポリマーは、親水性ブロックがその分子量の２５～４０％を占める場合、強固な小胞構造に自己組織化することができた２３～２５。両親媒性コポリマーの組成および分子量を変化させることができ、これにより、様々な表面特性、膜厚および安定性を有する小胞の形成が可能になる。２，０００および５，０００ＤａのＭｎを有するＰＥＧは、薬物送達系では最も広く使用されている親水性ブロックの１つであるため、本発明に記載される実施例では、市販のＰＥＧ（Ｍｎ＝２，０００および５，０００Ｄａ）を開始剤として選択した。触媒としてオクタン酸第一スズ（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）を使用した、ε－ＣＬの開環重合によって、２つの異なる分子量を有するＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーを合成することに成功した。生成物の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図２Ａに示す。１Ｈ－ＮＭＲスペクトルの４．０６ｐｐｍのカプロラクトン単位（－ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）のメチレンピークと３．６０ｐｐｍのエチレングリコール単位（－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）のエチレンピークとの積分から計算したＰＥＧ－ＰＣＬコポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、それぞれ７，８７３、１４，４７３および１６，５８０Ｄａであり、これらは理論分子量とよく一致していた（表１）。これは、所望の分子量を有するＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋコポリマー、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ８．５ｋコポリマーおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの合成に成功したことを示す。表１はまた、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋコポリマー、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ８．５ｋコポリマーおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの分子量、ならびにＧＰＣによって決定されたそれらの比較的低い多分散性（Ｄ＝Ｍｗ／Ｍｎ）を示す。
【0137】
表１：ＰＥＧ
２ｋ
－ＰＣＬ
５ｋ
、ＰＥＧ
５ｋ
－ＰＣＬ
８．５ｋ
およびＰＥＧ
５ｋ
－ＰＣＬ
１０ｋ
の理論分子量（Ｍ
ｎ，ｔｈ
）ならびに
１
Ｈ－ＮＭＲ（Ｍ
ｎ，ＮＭＲ
）およびＧＰＣ（Ｍ
ｎ，ＧＰＣ
、Ｍ
ｗ，ＧＰＣ
、多分散性Ｄ＝Ｍ
ｗ，ＧＰＣ
／Ｍ
ｎ，ＧＰＣ
）によって測定された分子量
【0138】
【表1】
【0139】
実施例２－ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの調製
単純なワンポット法によってＰＥ－ＬＮＰを調製した。典型的には、６５０μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋと２５０μｇのＤＯＴＡＰとを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解し、１０μｇのｓａＲＮＡを１ｍＬのＲＮａｓｅ不含水に溶解した。有機溶液と水溶液とを素早く混合し、混合物を室温で１～２分間撹拌し続けた。次いで、回転蒸発によってＴＨＦを除去した後、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（Ｎ／Ｐ＝１１、ポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝６５）を得た。様々なＮ／Ｐモル比またはポリマー／ｓａＲＮＡ重量比を有する様々なＰＥ－ＬＮＰを同様に調製した。チップおよびガラス器具はいずれも、ＲＮａｓｅ不含条件を保証するために使用前に処理するべきである。
単純なワンポット法によってＰＥ－ＬＮＰを調製した。典型的には、６５０μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋと２５０μｇのＤＯＴＡＰとを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解し、１０μｇのｓａＲＮＡを１ｍＬのＲＮａｓｅ不含水に溶解した。有機溶液と水溶液とを素早く混合し、混合物を室温で１～２分間撹拌し続けた。次いで、回転蒸発によってＴＨＦを除去した後、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（Ｎ／Ｐ＝１１、ポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝６５）を得た。様々なＮ／Ｐモル比またはポリマー／ｓａＲＮＡ重量比を有する様々なＰＥ－ＬＮＰを同様に調製した。チップおよびガラス器具はいずれも、ＲＮａｓｅ不含条件を保証するために使用前に処理するべきである。
【0140】
ＰＥ－ＬＮＰの特性評価
それぞれＺｅｔａｓｉｚｅｒ μＶ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）およびＺＥＴＡ ＰＡＬＳを使用して、２５℃で、様々なＰＥ－ＬＮＰのサイズ分布（Ｚ平均）およびゼータ電位（Ｓｍｕｌｏｃｈｏｗｓｋｉモデルに基づく）を決定した。ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ，ＵＫ）を使用して、ハイスループット動的光散乱（ＨＴ－ＤＬＳ）によって、２５℃から８５℃への温度上昇時にサイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）を測定することによって、ＰＥ－ＬＮＰの熱安定性を評価した。
それぞれＺｅｔａｓｉｚｅｒ μＶ機器（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）およびＺＥＴＡ ＰＡＬＳを使用して、２５℃で、様々なＰＥ－ＬＮＰのサイズ分布（Ｚ平均）およびゼータ電位（Ｓｍｕｌｏｃｈｏｗｓｋｉモデルに基づく）を決定した。ＤｙｎａＰｒｏ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩＩ（Ｗｙａｔｔ，ＵＫ）を使用して、ハイスループット動的光散乱（ＨＴ－ＤＬＳ）によって、２５℃から８５℃への温度上昇時にサイズおよび多分散性指数（ＰＤＩ）を測定することによって、ＰＥ－ＬＮＰの熱安定性を評価した。
【0141】
ＳＥＭを使用して、ＰＥ－ＬＮＰの形態を可視化した。１滴のＰＥ－ＬＮＰ懸濁液をグラファイト表面に置いた。乾燥後、Ｉｏｎ Ｓｐｕｔｔｅｒを使用して、試料を金によってコーティングした。その後、２０ｋＶの加速電圧でＪＳＭ－６４００走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して試料を観察した。
【0142】
半自動Ｖｉｔｒｏｂｏｔシステム（Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＩ，ＦＥＩ）を使用して、レース状カーボンによってコーティングされた銅グリッド（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＰＡ）上に、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ用のＰＥ－ＬＮＰ試料（２００ｋＶでＴｅｃｎａｉ Ｆ２０ Ｇ２）を調製した。要約すると、４μＬの１ｍｇ ｍＬ－１のＰＥ－ＬＮＰ溶液を炭素グリッドの上に流延した。次いで、グリッドを、湿度１００％および２０℃のＶｉｔｒｏｂｏｔチャンバに移した。１秒間のブロッティング後の液体エタンへのグリッドの迅速な浸漬により、試料を効果的にガラス化した。結晶氷の形成を防ぐために、Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ機器に首尾よく移すまで、Ｇａｔａｎ ６２６クライオホルダを使用して試料を－１７０℃下で保持した。画像は、約４，０００ｎｍの焦点ずれで得られた。
【0143】
ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ（Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって、ＰＥ－ＬＮＰのｓａＲＮＡカプセル化効率を決定した。製造業者の指示に従って、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を用いておよび用いずに、ＴＥ緩衝剤および水性ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ作業溶液を調製した。蛍光強度対ｓａＲＮＡ濃度の検量線を確立した。不含（非添加）ｓａＲＮＡ濃度（Ｃｕｎｌｏａｄｅｄ）を以下のように決定した：試料をＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００不含ＴＥ緩衝剤を用いて適切な濃度に希釈し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００不含ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ作業溶液と混合し、暗所で１５分間インキュベートした。次いで、各ウェルが２００μＬの最終混合物を含有する黒色９６ウェルプレートに、試料をピペットで移した。次いで、分光蛍光光度計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）によって、それぞれ４８０および５２０ｎｍの励起波長および発光波長で、３回繰り返して蛍光強度測定を行った。ナノ粒子を溶解するためのＴＥ緩衝剤と０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＲｉｂｏＧｒｅｅｎ作業溶液とを用いた同様の手順に従って、総ｓａＲＮＡ濃度（Ｃｔｏｔａｌ）を測定した。以下の式に従って、系のカプセル化効率を計算することができた：
【0144】
【数1】
【0145】
結果および考察
様々なＮ／Ｐモル比またはポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比を有する様々なｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを得た。Ｎ／Ｐ＝５およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝６５を有するＰＥ－ＬＮＰをＰＥ－ＬＮＰ ５－６５と命名する。同じ規則に従って他のＰＥ－ＬＮＰを割り当てる。様々な組成を有するＰＥ－ＬＮＰのサイズ分布、ＰＤＩおよびゼータ電位を図２Ｃに要約した。
様々なＮ／Ｐモル比またはポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比を有する様々なｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを得た。Ｎ／Ｐ＝５およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）＝６５を有するＰＥ－ＬＮＰをＰＥ－ＬＮＰ ５－６５と命名する。同じ規則に従って他のＰＥ－ＬＮＰを割り当てる。様々な組成を有するＰＥ－ＬＮＰのサイズ分布、ＰＤＩおよびゼータ電位を図２Ｃに要約した。
【0146】
ｓａＲＮＡ（約９，５００ｎｔ）は、保護をもたらし、ｓａＲＮＡの細胞内送達を促進することができる担体にカプセル化される必要がある。図２Ｂは、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰが単分散であったことを示す。図２Ｃに列挙されるように、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから組織化されたＰＥ－ＬＮＰは、直径１１３．１±０．３～１３４．２±０．６ｎｍの平均流体力学的サイズと、０．２１±０．０３～０．３５±０．０２の低いＰＤＩとを示した。ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰの方が、大きなサイズ（１３３．９±０．５～１４９．６±０．４ｎｍ）および高いＰＤＩ（０．４９±０．０９～０．５９±０．１０）を示した。これは、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから自己組織化したＰＥ－ＬＮＰの方が安定な構造を示し、これは親水性ＰＥＧ鎖長が長く、ポリマーカプセル層が厚いことに起因し得ることを示している。
【0147】
Ｎ／Ｐモル比は、ｓａＲＮＡ添加能力およびエンドソーム脱出効率を制御する重要な要素である。Ｎ／Ｐ比を５から１８に増加させると、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ（ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比＝６５）のゼータ電位は、カチオン性脂質の量の増加に起因して、＋２９．０±０．９ｍＶから＋４４．５±０．８ｍＶに顕著に増加した。ただし、ＰＥ－ＬＮＰのポリマー／ｓａＲＮＡ重量比が６５から８０に増加すると、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ（Ｎ／Ｐ＝１８）のゼータ電位は＋４４．５±０．８ｍＶから＋４０．２±０．９ｍＶに低下したが、これはポリマーカプセル層の遮蔽効果の増強に起因している可能性がある。ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰは、同じ傾向を示した。
【0148】
ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋおよびＤＯＴＡＰを使用して、特に指定されない限り例示的な研究でさらに調査するためにＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ ｍ－ｎを調製した。ここで、数ｍおよびｎは、それぞれＮ／Ｐモル比およびポリマー／ＲＮＡ重量比を示す。図３は、様々なＮ／Ｐモル比を有するＰＥ－ＬＮＰ（ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比＝６５）のカプセル化効率の変化を示す。Ｎ／Ｐモル比が５から１１に増加すると、カプセル化効率に２０％の有意な増加が観察された。ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のカプセル化効率は９３．６±３．３％であり、ナノ製剤の非常に高いＲＮＡ添加能力が示された。
【0149】
ペイロードを有しないＰＥ－ＬＮＰ ｍ－ｎの対応物をＰＥ－ＬＮＰ ｍ’－ｎ’と命名する。Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによって、ＲＮＡ添加を有しないＰＥ－ＬＮＰの構造を調査した。図４のＣｒｙｏ－ＴＥＭ顕微鏡写真は、ＰＥ－ＬＮＰが透明な外層を示したことを示す。両親媒性ＰＥＧ－ＰＣＬポリマーは、自己組織化して、親水性コアを含有するポリマーソーム構造になり得る。外層の方が暗いのは、コントラストが高い疎水性ＰＣＬポリマーに起因するはずである。コアには、凝集したＤＯＴＡＰ脂質ナノ粒子であると考えられる多数の黒い点があった。ＤＯＴＡＰは両親媒性であり、極性部分は水を好み、親水性とも呼ばれ、疎水性部分としての非極性部分は水から離れようとする。内側ＰＥＧ－ＰＣＬ小胞構造が親水性であることから、ＤＯＴＡＰ尾部の「疎水性効果」２６（脂質炭化水素尾部と水性環境との間の接触を最小限に抑えるように作用する）は、ファンデルワールス相互作用および頭部基水素結合を含む他のものとともに、ＤＯＴＡＰの自己組織化挙動を決定する。そのため、電子透過能が低いために暗いコントラストを示した黒い点は、ＤＯＴＡＰに存在する不飽和疎水性炭化水素尾部からなる可能性が高い。
【0150】
したがって、ＤＯＴＡＰは、「スポンジ状」凝集体に自己組織化し、これがポリマーソームの水性コアにカプセル化され、炭化水素尾部の疎水性相互作用によって内部空間をサブ区画に分割した。リポソームおよびポリマーソームと比較して、ＰＥ－ＬＮＰの内部構造は、核酸添加に有利な顕著に高い表面積を提供する。さらに、ＰＥＧ－ＰＣＬシェルは、ＲＮＡの分解を防止するだけでなく、脂質二重層よりも高い機械的強度に起因して、ＰＥ－ＬＮＰ系の安定性も高めることができる。
【0151】
本発明者らは、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’ １１’－８０’、１８’－６５’および１８’－８０’の熱安定性を評価した。図５に示すように、ＰＥ－ＬＮＰのＤＬＳサイズおよびＰＤＩは、２５℃～８５℃の範囲内の温度変化に応答せず、温度変化時の良好な構造安定性およびコロイド安定性が実証された。
【0152】
実施例３－蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析によるＰＥ－ＬＮＰ構造の調査
蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ－４、Ｈｏｒｉｂａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ構造をさらに調査するために、ＦＲＥＴ実験を行った。Ｎ－（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＮＢＤ－ＰＥ）／Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（Ｒｈｏｄ－ＰＥ）のドナー／アクセプター対について、励起波長を４６０ｎｍに設定し、４８０～６３０ｎｍの発光スペクトルを収集した。
蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ－４、Ｈｏｒｉｂａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ構造をさらに調査するために、ＦＲＥＴ実験を行った。Ｎ－（７－ニトロ－２－１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＮＢＤ－ＰＥ）／Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）－１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（Ｒｈｏｄ－ＰＥ）のドナー／アクセプター対について、励起波長を４６０ｎｍに設定し、４８０～６３０ｎｍの発光スペクトルを収集した。
【0153】
ドナーＮＢＤ－ＰＥ（４ｍＭ）およびアクセプターＲｈｏｄ－ＰＥ（４ｍＭ）とともにＰＥ－ＬＮＰを組み込んだ。要約すると、様々なＰＥ－ＬＮＰ、例えば、ｓａＲＮＡを添加しないＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’について、ＮＢＤ－ＰＥおよびＲｈｏｄ－ＰＥを所望の比でＴＨＦ（予備溶解したＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰを含有する）０．５ｍＬに共溶解し、続いて、Ｈ２Ｏ １ｍＬと迅速に混合した。混合物を室温で１～２分間撹拌し、次いで、回転蒸発によってＴＨＦを除去した（上記の実施例２のＰＥ－ＬＮＰ調製セクションを参照）。比較のために、ポリマーを有しない対照群（すなわち、ＤＯＴＡＰリポソーム）を調製した。対照リポソーム内のＤＯＴＡＰのモル濃度は、対応するＰＥ－ＬＮＰ内のＤＯＴＡＰのモル濃度（またはＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰの両方の総モル濃度）と同じであった。例えば、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’内のＤＯＴＡＰおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋのモル濃度は、それぞれ１４３ｍＭおよび４３ｍＭであった。したがって、対応する対照リポソームをそれぞれＤＯＴＡＰ－１４３およびＤＯＴＡＰ－１８６と表記した。さらに、それぞれのドナー標識（ＮＢＤ－ＰＥのみ）ＰＥ－ＬＮＰも調製して、以下の式に従ってＦＲＥＴ効率Ｅ１を計算した：
【0154】
【数2】
【0155】
式中、ＩＤおよびＩＤＡは、それぞれ、ドナーＮＢＤ－ＰＥのみによって標識されたＰＥ－ＬＮＰならびにドナーＮＢＤ－ＰＥおよびアクセプターＮＢＤ－ＰＥの両方によって共標識されたＰＥ－ＬＮＰの５３０ｎｍでのドナー蛍光強度である。
【0156】
別の実験では、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’をＮＢＤ－ＰＥ（４ｍＭ）およびＲｈｏｄ－ＰＥ（４ｍＭ）によって別個に標識した。次いで、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（ＮＢＤ－ＰＥのみ）を、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（Ｒｈｏｄ－ＰＥのみ）と等体積で、それぞれ１００ｒｐｍで５分間、１時間および２時間振盪しながら混合した。対照ＤＯＴＡＰリポソームも、それぞれＮＢＤ－ＰＥ（４ｍＭ）およびＲｈｏｄ－ＰＥ（４ｍＭ）によって別個に標識し、対照リポソーム内のＤＯＴＡＰのモル濃度は、対応するＰＥ－ＬＮＰ内のＤＯＴＡＰのモル濃度と同等であった。標識を有しないブランクＰＥ－ＬＮＰおよびＤＯＴＡＰリポソームを比較のために調製した。特定の時点でのＦＲＥＴ効率Ｅ２を以下の式に従って計算した：
【0157】
【数3】
【0158】
式中、ＩＤは、ブランク試料と混合した後にＮＢＤ－ＰＥによって標識されたＰＥ－ＬＮＰの５３０ｎｍでのドナー蛍光強度であり、ＩＤＭは、Ｒｈｏｄ－ＰＥによって標識されたＰＥ－ＬＮＰと混合した後にＮＢＤ－ＰＥによって標識されたＰＥ－ＬＮＰのドナー蛍光強度である。
【0159】
結果および考察
脂質ナノ粒子がナノ構造のコアに形成されることをさらに検証するために、ＮＢＤ－ＰＥおよびＲｈｏｄ－ＰＥ対を使用するＦＲＥＴ分析を適用して、ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰの空間的配置を調査した。ドナーフルオロフォアＮＢＤ（４．０ｍＭ）とアクセプターフルオロフォアＲｈｏｄ（４．０ｍＭ）との間のエネルギー移動の効率は、膜層上のそれらの距離に依存する。両親媒性ポリマーを脂質と混合することによって形成される最も一般的な構造は、混合膜組成物を有するハイブリッド小胞構造である２７～２９。図６Ｂに示すように、ドナーＮＢＤを４６０ｎｍで励起すると、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’ではアクセプターＲｈｏｄの発光強度が増強された蛍光スペクトルがもたらされ、９３．７±０．２％のＦＲＥＴ効率が示された。ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰが均一なハイブリッド膜に自己組織化したと仮定すると、対照ＤＯＴＡＰ－１８６リポソーム（ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’に存在するポリマーおよび脂質分子の組合せと同じモル濃度でＤＯＴＡＰから組織化した）のＦＲＥＴ効率は、ドナーＮＢＤとアクセプターＲｈｏｄとの間の距離が類似しているため、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率と同様のレベルであるはずである（図６Ａ）。実際、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率は、ＤＯＴＡＰ－１８６リポソームのＦＲＥＴ効率よりも顕著に高かった（８５．９±０．３％）。同様に、ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰが均一なハイブリッド膜に自己組織化したと仮定すると、対照ＤＯＴＡＰ－１４３リポソーム（ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’に存在するＤＯＴＡＰと同じモル濃度でＤＯＴＡＰから組織化した）のＦＲＥＴ効率は、ドナーＮＢＤとアクセプターＲｈｏｄとの間の距離が短くなっているため、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率よりも高いはずである。ただし、比較的少ない分子から自己組織化したＤＯＴＡＰ－１４３リポソームは、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’と同様のレベルのＦＲＥＴ効率（９２．９±０．３％）を示した。ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’についても同様の傾向が観察された（図６Ｃ～図６Ｄ）。ＦＲＥＴ効率の顕著な差は、ＰＥ－ＬＮＰに均一なポリマー－脂質ハイブリッド膜が存在しなかったことを示唆する。
脂質ナノ粒子がナノ構造のコアに形成されることをさらに検証するために、ＮＢＤ－ＰＥおよびＲｈｏｄ－ＰＥ対を使用するＦＲＥＴ分析を適用して、ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰの空間的配置を調査した。ドナーフルオロフォアＮＢＤ（４．０ｍＭ）とアクセプターフルオロフォアＲｈｏｄ（４．０ｍＭ）との間のエネルギー移動の効率は、膜層上のそれらの距離に依存する。両親媒性ポリマーを脂質と混合することによって形成される最も一般的な構造は、混合膜組成物を有するハイブリッド小胞構造である２７～２９。図６Ｂに示すように、ドナーＮＢＤを４６０ｎｍで励起すると、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’ではアクセプターＲｈｏｄの発光強度が増強された蛍光スペクトルがもたらされ、９３．７±０．２％のＦＲＥＴ効率が示された。ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰが均一なハイブリッド膜に自己組織化したと仮定すると、対照ＤＯＴＡＰ－１８６リポソーム（ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’に存在するポリマーおよび脂質分子の組合せと同じモル濃度でＤＯＴＡＰから組織化した）のＦＲＥＴ効率は、ドナーＮＢＤとアクセプターＲｈｏｄとの間の距離が類似しているため、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率と同様のレベルであるはずである（図６Ａ）。実際、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率は、ＤＯＴＡＰ－１８６リポソームのＦＲＥＴ効率よりも顕著に高かった（８５．９±０．３％）。同様に、ＰＥＧ－ＰＣＬおよびＤＯＴＡＰが均一なハイブリッド膜に自己組織化したと仮定すると、対照ＤＯＴＡＰ－１４３リポソーム（ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’に存在するＤＯＴＡＰと同じモル濃度でＤＯＴＡＰから組織化した）のＦＲＥＴ効率は、ドナーＮＢＤとアクセプターＲｈｏｄとの間の距離が短くなっているため、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’のＦＲＥＴ効率よりも高いはずである。ただし、比較的少ない分子から自己組織化したＤＯＴＡＰ－１４３リポソームは、ＰＥ－ＬＮＰ ５’－６５’と同様のレベルのＦＲＥＴ効率（９２．９±０．３％）を示した。ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’およびＰＥ－ＬＮＰ １８’－６５’についても同様の傾向が観察された（図６Ｃ～図６Ｄ）。ＦＲＥＴ効率の顕著な差は、ＰＥ－ＬＮＰに均一なポリマー－脂質ハイブリッド膜が存在しなかったことを示唆する。
【0160】
次いで、ＰＥ－ＬＮＰのコア内の脂質ナノ粒子の形成を検証するために、さらなる研究を行った。ドナーＮＢＤ－ＰＥ（４．０ｍＭ）または受容体Ｒｈｏｄ－ＰＥ（４．０ｍＭ）によって、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’を別個に標識した。次いで、１００ｒｐｍで最大２時間振盪しながら、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（ＮＢＤ）を等体積のＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（Ｒｈｏｄ）と混合した。対照ＤＯＴＡＰ－３５８リポソーム（ここで、数（すなわち、３５８）は、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’に存在する等モル濃度のＤＯＴＡＰを示す）も、比較のために別個にドナーＮＢＤ－ＰＥ（４．０ｍＭ）または受容体受容体Ｒｈｏｄ－ＰＥ（４．０ｍＭ）によって標識した。同じ条件下でのインキュベーションのためにＤＯＴＡＰ－３５８リポソーム（ＮＢＤ）をＤＯＴＡＰ－３５８リポソーム（Ｒｈｏｄ）と混合した後、１７．１％へのＦＲＥＴ効率の即時の増加が観察され、続いて、１時間後に２２．０％まで徐々に増加した（図７Ｂ～図７Ｄ）。これは、ＤＯＴＡＰリポソーム間の脂質混合によるものであり、これにより、ドナーＮＢＤとアクセプターＲｈｏｄとの間の距離の減少がもたらされた。ただし、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（ＮＢＤ）とＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’（Ｒｈｏｄ）とを１時間混合した後、明らかなＦＲＥＴ効率は観察されず、その後、２時間の長期インキュベーション後に３．４％までわずかに増加するにとどまった。軽微なＦＲＥＴ効率は、ＰＥ－ＬＮＰのコア内の脂質ナノ粒子の形成を示唆している（図７Ａ）。
【0161】
実施例４－ｓａＲＮＡ含有ＰＥ－ＬＮＰによるインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション
ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ（ナノ粒子コア内のｓａＲＮＡ）のトランスフェクション効率
ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイのために、ＨＥＫ２９３細胞を５×１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、トランスフェクション前に６０～８０％コンフルエンスに達するように、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。使用済み培地を除去した後、１００μＬの新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地または完全ＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、次いで、これを様々なＮ／Ｐモル比およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比（１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡと同等）で１０μＬのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを含む５つの複製物に加えた。４時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を新鮮な完全ＤＭＥＭ培地と交換した。５０μＬのｆＬｕｃ基質によって２４時間処理した後のトランスフェクト細胞から得られた、培地５０μＬ中の相対発光単位（ＲＬＵ）として表されるｆＬｕｃ活性を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。
ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ（ナノ粒子コア内のｓａＲＮＡ）のトランスフェクション効率
ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アッセイのために、ＨＥＫ２９３細胞を５×１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、トランスフェクション前に６０～８０％コンフルエンスに達するように、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。使用済み培地を除去した後、１００μＬの新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地または完全ＤＭＥＭ培地を各ウェルに加え、次いで、これを様々なＮ／Ｐモル比およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比（１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡと同等）で１０μＬのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを含む５つの複製物に加えた。４時間のインキュベーション後、トランスフェクション培地を新鮮な完全ＤＭＥＭ培地と交換した。５０μＬのｆＬｕｃ基質によって２４時間処理した後のトランスフェクト細胞から得られた、培地５０μＬ中の相対発光単位（ＲＬＵ）として表されるｆＬｕｃ活性を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。
【0162】
ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ（ナノ粒子表面上のｓａＲＮＡ）のトランスフェクション効率
比較のために、方法２（Ｍ２）によってｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰを調製した。要約すると、６５０μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋおよび４００μｇのＤＯＴＡＰを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解した。得られた有機溶液を１ｍＬのＲｎａｓｅ不含水に素早く加え、室温で１～２分間撹拌した。次いで、ＴＨＦを回転蒸発によって除去して、ブランクＰＥ－ＬＮＰを得た。その後、ブランクＰＥ－ＬＮＰ溶液に１０μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡを加えた。３０秒間ボルテックスした後、ｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰを得た。実施例４の上記の方法を使用して、ＦＢＳの非存在下または存在下でのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率を決定した。ＰＥＩ／ｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ複合体およびｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造を対照として調製した。
比較のために、方法２（Ｍ２）によってｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰを調製した。要約すると、６５０μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋおよび４００μｇのＤＯＴＡＰを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解した。得られた有機溶液を１ｍＬのＲｎａｓｅ不含水に素早く加え、室温で１～２分間撹拌した。次いで、ＴＨＦを回転蒸発によって除去して、ブランクＰＥ－ＬＮＰを得た。その後、ブランクＰＥ－ＬＮＰ溶液に１０μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡを加えた。３０秒間ボルテックスした後、ｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰを得た。実施例４の上記の方法を使用して、ＦＢＳの非存在下または存在下でのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率を決定した。ＰＥＩ／ｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ複合体およびｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造を対照として調製した。
【0163】
４℃での保存後のｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰおよびｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
１００μＬのＲｎａｓｅ不含ＰＢＳ（１０×）緩衝液（またはＲｎａｓｅ不含水）を９００μＬのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ溶液またはｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ溶液に加え、得られた試料を４℃で保存した。次いで、新たに調製したかまたは４℃で５日間保存したこれらの試料によってＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、実施例４の上記の方法に従ってトランスフェクション効率を測定した。
１００μＬのＲｎａｓｅ不含ＰＢＳ（１０×）緩衝液（またはＲｎａｓｅ不含水）を９００μＬのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ溶液またはｆＬｕｃ ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ溶液に加え、得られた試料を４℃で保存した。次いで、新たに調製したかまたは４℃で５日間保存したこれらの試料によってＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、実施例４の上記の方法に従ってトランスフェクション効率を測定した。
【0164】
結果および考察
ＨＥＫ２９３細胞を対象に、様々なＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率に対するＰＥＧ－ＰＣＬ分子量、Ｎ／Ｐモル比およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比の効果を評価した。図８Ａおよび図８Ｂは、６５の固定ポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比を有するがＮ／Ｐモル比が異なるＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率を示す。ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰでは、Ｎ／Ｐモル比が５から１６に増加した場合、トランスフェクション効率はほぼ４桁向上し、次いで、Ｎ／Ｐモル比がさらに増加するにつれて低下した。比較として、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰは、トランスフェクション効率の同様の傾向を示したが、５という低いＮ／Ｐモル比でトランスフェクション効率が高くなり、１８のＮ／Ｐモル比でピークトランスフェクション効率が高くなった。
ＨＥＫ２９３細胞を対象に、様々なＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率に対するＰＥＧ－ＰＣＬ分子量、Ｎ／Ｐモル比およびポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比の効果を評価した。図８Ａおよび図８Ｂは、６５の固定ポリマー／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比を有するがＮ／Ｐモル比が異なるＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率を示す。ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰでは、Ｎ／Ｐモル比が５から１６に増加した場合、トランスフェクション効率はほぼ４桁向上し、次いで、Ｎ／Ｐモル比がさらに増加するにつれて低下した。比較として、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰは、トランスフェクション効率の同様の傾向を示したが、５という低いＮ／Ｐモル比でトランスフェクション効率が高くなり、１８のＮ／Ｐモル比でピークトランスフェクション効率が高くなった。
【0165】
図８Ｃおよび図８Ｄは、固定Ｎ／Ｐモル比を有するがポリマー／ｓａＲＮＡ重量比が様々なＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率を示す。ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰでは、ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比が４０から６５に増加した場合、トランスフェクション効率が二桁増加した。ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比を９０までさらに増加させると、トランスフェクション効率の変化はわずかになった（図８Ｃ）。ただし、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰに関して、トランスフェクション効率は、試験したポリマー／ｓａＲＮＡ重量比範囲（４０～９０）内で同様のレベルであった（図８Ｄ）。これは、分子量が高いＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから得られた厚いポリマーシェル層の形成の増強に起因し得る。得られた厚いポリマーシェル層は、ｓａＲＮＡの改善された保護を提供することができ、これは、ＦＢＳの非存在下（図８Ｄ）および存在下（図８Ｆ）、６５～９０のポリマー／ｓａＲＮＡ重量比でのＰＥ－ＬＮＰ試料間のトランスフェクション効率のわずかな変化によって確認された。対照的に、ＰＥＧ２ｋ－ＰＣＬ５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰは、ＦＢＳの存在下で大幅に低下したトランスフェクション効率を示した（図８Ｅ）。高いインビトロトランスフェクション効率を有する多くの他のカチオン性核酸送達系は、血清タンパク質の吸着に起因して低いインビボ有効性を示したため、厚いポリマーシェル層を有するＰＥ－ＬＮＰの向上した安定性に起因する高い血清適合性が好ましい。したがって、さらなる研究では、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰを選択した。
【0166】
ＲＮＡ分子は、非常に不安定であり、容易に加水分解／分解され得る。コアに添加され、ＰＥ－ＬＮＰの表面に結合したＲＮＡの安定性を比較するために、２つの異なるＲＮＡ添加法を使用した。図９Ａに示すように、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０およびｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、ＦＢＳの非存在下で同等のトランスフェクション効率を示し、これは、ＰＥＩ／ｓａＲＮＡ複合体よりも１桁高く、ｓａＲＮＡ添加ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造よりも４～５桁高かった。ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０はＦＢＳ適合性であったが、ＦＢＳの存在は、ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０のトランスフェクション効率を１桁低下させたことに注目することは興味深い（図９Ｂ）。比較として、ＰＥＩ／ｓａＲＮＡ複合体のトランスフェクション効率は、ＦＢＳとのインキュベーション時に３桁低下した。すなわち、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、ＦＢＳの存在下でＰＥＩ／ｓａＲＮＡ複合体よりも４桁高いトランスフェクション効率を示した。
【0167】
本発明者らは、コアに添加され、４℃のＲＮａｓｅ不含水またはＰＢＳ中で保存した後のＰＥ－ＬＮＰの表面に結合したＲＮＡの安定性をさらに評価した。図９Ｃおよび図９Ｄに示すように、液体製剤中で５日間保存した後、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０はトランスフェクション効率の低下を示さなかったが、ｓａＲＮＡ結合ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０のトランスフェクションシグナルは、依然として比較的高い（＞１０６）が、新たに調製した試料と比較して半桁低かった。
【0168】
これらの結果は、ＰＥ－ＬＮＰ系が好ましい血清安定性を示し、ナノ粒子コアへの生物学的ペイロード、特に容易に加水分解／分解されるＲＮＡ分子の高いカプセル化が最適な保護を提供し得ることを示唆している。これは、ＰＥ－ＬＮＰの親水性ＰＥＧコロナがタンパク質吸収を減少させることができ、疎水性ＰＣＬ層がＲＮＡを過酷な外部環境から保護することができるためである。
【0169】
実施例５－ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによるインターフェロンコンピテント（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＨｅＬａ細胞におけるインビトロトランスフェクション
ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法によって、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部に、ｆＬｕｃによってコードされるｓａＲＮＡを配合した。ｓａＲＮＡ用量をそれぞれ０．１、０．５、１、３、５および７μｇ ｍＬ－１に変化させることによって滴定を行った実施例４の上記の方法に従って、ＨｅＬａ細胞を播種およびトランスフェクトした。
ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法によって、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部に、ｆＬｕｃによってコードされるｓａＲＮＡを配合した。ｓａＲＮＡ用量をそれぞれ０．１、０．５、１、３、５および７μｇ ｍＬ－１に変化させることによって滴定を行った実施例４の上記の方法に従って、ＨｅＬａ細胞を播種およびトランスフェクトした。
【0170】
結果および考察
ＲＮＡ系の臨床応用は、非効率的なタンパク質発現に加えて、それらの高い自然免疫原性によって制限される。タンパク質発現と自然免疫応答との間の良好なバランスを達成することが重要である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、７、８および９は、小胞体、エンドソームおよびリソソームに存在する、核酸の細胞内センサーである。外来核酸が検出されると、細胞内ＴＬＲは様々なシグナル伝達経路を活性化し、サイトカインの産生を誘発し、これにより、タンパク質発現の制限、または患者への有害作用さえももたらし得る。ＨｅＬａ細胞はＴＬＲ３を発現するため、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション効率を評価して、細胞内ＴＬＲによる認識を防止するＰＥ－ＬＮＰの能力を調査した。
ＲＮＡ系の臨床応用は、非効率的なタンパク質発現に加えて、それらの高い自然免疫原性によって制限される。タンパク質発現と自然免疫応答との間の良好なバランスを達成することが重要である。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、７、８および９は、小胞体、エンドソームおよびリソソームに存在する、核酸の細胞内センサーである。外来核酸が検出されると、細胞内ＴＬＲは様々なシグナル伝達経路を活性化し、サイトカインの産生を誘発し、これにより、タンパク質発現の制限、または患者への有害作用さえももたらし得る。ＨｅＬａ細胞はＴＬＲ３を発現するため、ＨｅＬａ細胞へのトランスフェクション効率を評価して、細胞内ＴＬＲによる認識を防止するＰＥ－ＬＮＰの能力を調査した。
【0171】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、インターフェロンコンピテントＨｅＬａ細胞に対するＰＥ－ＬＮＰの細胞トランスフェクション力価を示す。試験した４つの製剤、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １１－８０およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、トランスフェクション効率の同様の傾向を共有し、最大１０７のＲＬＵでの最大トランスフェクション効率に達する３μｇ ｍＬ－１の最適用量までｓａＲＮＡ用量とともに増加した。４つのＰＥ－ＬＮＰ製剤はいずれも、ＰＥ－ＬＮＰ構造によるＴＬＲ認識の効果的な防止を示す有望なレベルのトランスフェクション効率を示した。これは、親水性ブロックが水和層を提供し、ＴＬＲによる認識、およびカチオン性脂質コアと細胞との間の直接相互作用を防止し、インターフェロンコンピテント細胞への効果的なトランスフェクションをもたらすポリマーシェルに起因する。
【0172】
ｓａＲＮＡの用量が低下すると（ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比＝６５の場合、０．１～５μｇ ｍＬ－１；ポリマー／ｓａＲＮＡ重量比＝８０の場合、０．５μｇ ｍＬ－１～３μｇ ｍＬ－１）、Ｎ／Ｐモル比が１１から１８に増加した場合、トランスフェクション効率が約１桁増加した。これは、エンドソーム区画内でペイロードのさらに効率的な放出をもたらす高いＮ／Ｐモル比に起因し得る。したがって、これにより、エンドソームに局在するＴＬＲの活性化の可能性が低下し得る。
【0173】
これらの結果はまた、ＰＥ－ＬＮＰが、ヒト胎児由来腎臓細胞（実施例４）、癌細胞（実施例５）およびＴリンパ球細胞（実施例６）を含む様々な細胞型に核酸ペイロードを効果的に送達することができることを示す。
【0174】
実施例６－懸濁Ｊｕｒｋａｔ細胞へのｍＲＮＡのＰＥ－ＬＮＰ媒介細胞内送達
ＰＥ－ＬＮＰが様々なペイロードを様々な細胞株に送達する能力をさらに実証するために、本発明者らは、様々なＰＥ－ＬＮＰを使用し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を懸濁Ｊｕｒｋａｔ細胞に細胞内送達した。ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰについて実施例２に上述したのと同じ方法によって、ＧＦＰ ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを調製した。要約すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞を穏やかにピペッティングして再懸濁し、次いで、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）によって計数した。細胞を２回洗浄し、次いで、予熱した（３７℃）非補充無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地中に２×１０６細胞ｍＬ－１の密度で再懸濁した。１ｍＬの細胞懸濁液を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。次いで、ＧＦＰ ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを１ウェル当たり２μｇのｍＲＮＡで滴下し、その後直ちに穏やかにピペッティングして、培養物を完全に混合した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、３７℃で一晩さらにインキュベートするために１ｍＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒによる細胞計数を介した生存性試験に、試料ウェルの一部を使用した。残りの試料ウェルをＰＢＳによって２回洗浄し、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳによって洗浄した後、各試料を蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｆｌｏｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって観察し、フローサイトメトリー（Ｃａｎｔｏ，ＢＤ，ＵＳＡ）によって定量的に分析して、生存Ｊｕｒｋａｔ細胞のＧＦＰ発現を調査した。
ＰＥ－ＬＮＰが様々なペイロードを様々な細胞株に送達する能力をさらに実証するために、本発明者らは、様々なＰＥ－ＬＮＰを使用し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を懸濁Ｊｕｒｋａｔ細胞に細胞内送達した。ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰについて実施例２に上述したのと同じ方法によって、ＧＦＰ ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを調製した。要約すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞を穏やかにピペッティングして再懸濁し、次いで、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）によって計数した。細胞を２回洗浄し、次いで、予熱した（３７℃）非補充無血清ＲＰＭＩ－１６４０培地中に２×１０６細胞ｍＬ－１の密度で再懸濁した。１ｍＬの細胞懸濁液を１２ウェルプレートの各ウェルに播種した。次いで、ＧＦＰ ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを１ウェル当たり２μｇのｍＲＮＡで滴下し、その後直ちに穏やかにピペッティングして、培養物を完全に混合した。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、３７℃で一晩さらにインキュベートするために１ｍＬの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に再懸濁した。Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒによる細胞計数を介した生存性試験に、試料ウェルの一部を使用した。残りの試料ウェルをＰＢＳによって２回洗浄し、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、３０分間インキュベートした。ＰＢＳによって洗浄した後、各試料を蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｆｌｏｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって観察し、フローサイトメトリー（Ｃａｎｔｏ，ＢＤ，ＵＳＡ）によって定量的に分析して、生存Ｊｕｒｋａｔ細胞のＧＦＰ発現を調査した。
【0175】
結果および考察
図１１は、ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５によって処理したＪｕｒｋａｔ細胞では、ＧＦＰ発現が軽微であることを示す。ポリマー／ｍＲＮＡ重量比を６５に固定すると、ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の割合は、Ｎ／Ｐモル比が５から１１に増加するにつれて８０％超まで大幅に増加し、続いて、Ｎ／Ｐモル比が１８にさらに増加するにつれて約１０％さらに増強した（図１１Ｂ）。ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって処理したＪｕｒｋａｔ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、５から１１へのＮ／Ｐモル比の変化に対して同様の依存性を示した。ただし、Ｎ／Ｐモル比を１８までさらに増加させても、有意な増強は観察されなかった（図１１Ｃ）。図１１Ｄは、Ｊｕｒｋａｔ細胞がＰＥ－ＬＮＰによって十分に耐容されたことを示し、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、処理の４時間後に８０％を超える高い細胞生存率を示した。Ｎ／Ｐモル比を１８に増加させると細胞傷害性のわずかな増加が観察されたが、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５は、７０．４±１．８％で比較的高い細胞生存率を依然として示した。結果は、本発明者らのＰＥ－ＬＮＰがｍＲＮＡを懸濁細胞株に首尾よく送達することもできることを実証している。
図１１は、ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５によって処理したＪｕｒｋａｔ細胞では、ＧＦＰ発現が軽微であることを示す。ポリマー／ｍＲＮＡ重量比を６５に固定すると、ＧＦＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞の割合は、Ｎ／Ｐモル比が５から１１に増加するにつれて８０％超まで大幅に増加し、続いて、Ｎ／Ｐモル比が１８にさらに増加するにつれて約１０％さらに増強した（図１１Ｂ）。ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって処理したＪｕｒｋａｔ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、５から１１へのＮ／Ｐモル比の変化に対して同様の依存性を示した。ただし、Ｎ／Ｐモル比を１８までさらに増加させても、有意な増強は観察されなかった（図１１Ｃ）。図１１Ｄは、Ｊｕｒｋａｔ細胞がＰＥ－ＬＮＰによって十分に耐容されたことを示し、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、処理の４時間後に８０％を超える高い細胞生存率を示した。Ｎ／Ｐモル比を１８に増加させると細胞傷害性のわずかな増加が観察されたが、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５は、７０．４±１．８％で比較的高い細胞生存率を依然として示した。結果は、本発明者らのＰＥ－ＬＮＰがｍＲＮＡを懸濁細胞株に首尾よく送達することもできることを実証している。
【0176】
実施例７－ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰの細胞取込みおよびエンドソーム脱出の機構
５００μｇのＦＩＴＣと、８００μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋと、４００μｇのＤＯＴＡＰとを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解し、１０μｇのｓａＲＮＡを１ｍＬのＲｎａｓｅ不含水に溶解した。有機溶液と水溶液とを素早く混合し、混合物を室温で１～２分間撹拌し続けた。ＴＨＦを回転蒸発によって除去し、遊離ＦＩＴＣを限外濾過遠心チューブ（ＭＷＣＯ＝３０００）内、３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって除去して、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰを得た。
５００μｇのＦＩＴＣと、８００μｇのＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋと、４００μｇのＤＯＴＡＰとを０．５ｍＬのＴＨＦに共溶解し、１０μｇのｓａＲＮＡを１ｍＬのＲｎａｓｅ不含水に溶解した。有機溶液と水溶液とを素早く混合し、混合物を室温で１～２分間撹拌し続けた。ＴＨＦを回転蒸発によって除去し、遊離ＦＩＴＣを限外濾過遠心チューブ（ＭＷＣＯ＝３０００）内、３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって除去して、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰを得た。
【0177】
レーザー走査型共焦点顕微鏡によって、ナノスケール系の細胞取込み機構を調査した。２ｍＬ量のＨＥＫ２９３細胞（１皿当たり２×１０５細胞）を３５ｍｍガラス底培養皿に播種し、２４時間培養した。４℃で１時間のプレインキュベーション後、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ（１皿当たり２μｇの最終ｓａＲＮＡ濃度）を加え、細胞を４℃で４時間さらにインキュベートした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞をｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰによって３７℃で４時間処理した。４℃または３７℃で処理した後、細胞をＰＢＳによって洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液によって１０分間固定し、核およびリソソームをそれぞれＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ ｍＬ－１）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ－Ｒｅｄ（５０ｎＭ）によって５分間染色した。次いで、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化し、ＦＩＴＣおよびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ－Ｒｅｄの蛍光共局在をＩｍａｇｅ Ｊによって分析した。
【0178】
ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰの細胞取込みおよび細胞内輸送の機構をさらに調査するために、ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに５×１０５／ウェルの密度で２４時間かけて播種した。最初に、細胞を以下の阻害剤、すなわち、クロルプロマジン塩酸塩（１０μｇ ｍＬ－１）、メチル－β－シクロデキストリン（ＭβＣＤ、５ｍＭ）、フィリピン（５μｇ ｍＬ－１）、アミロライド（１ｍＭ）、ゲニステイン（４０μｇ ｍＬ－１）およびナイスタチン（４０μｇ ｍＬ－１）とそれぞれ１時間プレインキュベートした。次いで、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ（２μｇのｓａＲＮＡを含有する）を各ウェルに加え、阻害剤とさらに１時間共インキュベートした。最後に、細胞を予冷ＰＢＳ溶液によって３回洗浄し、フローサイトメトリー（Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｉ）によって分析した。
【0179】
ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰの取込みおよび細胞内輸送も共焦点顕微鏡によって試験した。２ｍＬ量のＨＥＫ２９３細胞（１皿当たり２×１０５細胞）を３５ｍｍガラス底培養皿に播種し、２４時間培養した。ＭβＣＤ（５ｍＭ）と１時間プレインキュベーションした後、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ（２μｇのｓａＲＮＡを含有する）を培養皿に加え、ＭβＣＤと４時間共インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳによって洗浄し、４％パラホルムアルデヒド溶液によって１０分間固定し、核およびリソソームをそれぞれＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（５μｇ ｍＬ－１）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ－Ｒｅｄ（５０ｎＭ）によって５分間染色した。最後に、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化した。
【0180】
結果および考察
形質膜陥入された生体分子が分解のためにリソソームに輸送される前にそれらをエンドソーム脱出によって細胞質に放出することができるナノ担体を設計することが重要である３０（図１Ｂ）。この研究では、エンドサイトーシス経路および細胞内輸送を調査するために、ＦＩＴＣをＰＥ－ＬＮＰ １８－８０内のｓａＲＮＡと共添加した。３７℃で４時間処理した後、共焦点顕微鏡によってＦＩＴＣの強力な拡散緑色蛍光を可視化した（図１２Ａ）。ＩｍａｇｅＪ分析から、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ（緑色）とエンドソーム／リソソーム（赤色）との間の蛍光共局在化のシグナルは軽微あることが示唆され、細胞質へのペイロードのＰＥ－ＬＮＰ媒介エンドソーム脱出の成功が示された（図１２Ｂ）。比較として、ＦＩＴＣの細胞内緑色蛍光強度は、４℃で４時間のインキュベーション後にかなり低いレベルに大幅に低下し、ＰＥ－ＬＮＰの細胞取込みがエネルギー依存性エンドサイトーシス経路を介したことが示唆された（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。さらに、様々なエンドサイトーシス阻害剤を使用して、ＰＥ－ＬＮＰの特異的なエンドサイトーシス機構をさらに調査した。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、細胞内緑色蛍光強度が阻害剤ＭβＣＤによる処理後に有意に低下したことを示しており、脂質－ラフト媒介エンドサイトーシスがＰＥ－ＬＮＰの主要な細胞取込み経路であることを示唆している。
形質膜陥入された生体分子が分解のためにリソソームに輸送される前にそれらをエンドソーム脱出によって細胞質に放出することができるナノ担体を設計することが重要である３０（図１Ｂ）。この研究では、エンドサイトーシス経路および細胞内輸送を調査するために、ＦＩＴＣをＰＥ－ＬＮＰ １８－８０内のｓａＲＮＡと共添加した。３７℃で４時間処理した後、共焦点顕微鏡によってＦＩＴＣの強力な拡散緑色蛍光を可視化した（図１２Ａ）。ＩｍａｇｅＪ分析から、ｓａＲＮＡおよびＦＩＴＣ共添加ＰＥ－ＬＮＰ（緑色）とエンドソーム／リソソーム（赤色）との間の蛍光共局在化のシグナルは軽微あることが示唆され、細胞質へのペイロードのＰＥ－ＬＮＰ媒介エンドソーム脱出の成功が示された（図１２Ｂ）。比較として、ＦＩＴＣの細胞内緑色蛍光強度は、４℃で４時間のインキュベーション後にかなり低いレベルに大幅に低下し、ＰＥ－ＬＮＰの細胞取込みがエネルギー依存性エンドサイトーシス経路を介したことが示唆された（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。さらに、様々なエンドサイトーシス阻害剤を使用して、ＰＥ－ＬＮＰの特異的なエンドサイトーシス機構をさらに調査した。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、細胞内緑色蛍光強度が阻害剤ＭβＣＤによる処理後に有意に低下したことを示しており、脂質－ラフト媒介エンドサイトーシスがＰＥ－ＬＮＰの主要な細胞取込み経路であることを示唆している。
【0181】
実施例８－溶血および細胞生存性試験
溶血法を使用して、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの生体適合性を調査した。要約すると、脱線維化ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）を１５００×ｇで１０分間にわたり４℃で遠心分離し、ＰＢＳによって３回洗浄した。細胞ペレットをＰＢＳを含む５％（ｖ／ｖ）赤血球懸濁液に再懸濁した。遠心管内の０．９ｍＬのＲＢＣ懸濁液に、１μｇのｓａＲＮＡを含有する、様々なＰＥ－ＬＮＰの１００μＬのアリコートを加えた。脱イオン水によるＲＢＣ懸濁液の処理を陽性対照として使用した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＢＣ懸濁液を遠心分離し、１００μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、分光蛍光光度計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して５４０ｎｍで吸光度（Ａ）を測定した。以下の式に従って、相対溶血を計算した：
溶血法を使用して、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの生体適合性を調査した。要約すると、脱線維化ヒツジ赤血球（ＲＢＣ）を１５００×ｇで１０分間にわたり４℃で遠心分離し、ＰＢＳによって３回洗浄した。細胞ペレットをＰＢＳを含む５％（ｖ／ｖ）赤血球懸濁液に再懸濁した。遠心管内の０．９ｍＬのＲＢＣ懸濁液に、１μｇのｓａＲＮＡを含有する、様々なＰＥ－ＬＮＰの１００μＬのアリコートを加えた。脱イオン水によるＲＢＣ懸濁液の処理を陽性対照として使用した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＲＢＣ懸濁液を遠心分離し、１００μＬの上清を９６ウェルプレートに移し、分光蛍光光度計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して５４０ｎｍで吸光度（Ａ）を測定した。以下の式に従って、相対溶血を計算した：
【0182】
【数4】
【0183】
ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを使用して、ＨＥＫ２９３細胞に対するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの細胞傷害性を測定した。ＨＥＫ２９３細胞を５×１０４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間のインキュベーション後、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡを添加した様々なＰＥ－ＬＮＰによって、細胞を４時間処理した。次いで、１０μＬのａｌａｍａｒＢｌｕｅ ＨＳ試薬（５ｍｇ ｍＬ－１）を各ウェルに加えた。製造業者の指示に従って、４時間さらにインキュベートした後、分光蛍光光度計（ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を使用して５７０ｎｍでの各ウェルの吸光度を測定した。吸光度読取り値から細胞傷害効果を決定した。
【0184】
結果および考察
溶血活性および非特異的細胞傷害性は、負に変化した細胞膜との強力な相互作用に起因してカチオン性担体に関連する典型的な問題である。様々なＰＥ－ＬＮＰの溶血率が、処理の１時間後にいずれも１０％未満であり（図１３Ａ）、高い生体適合性を示唆したことに注目することは興味深い。図１３Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞がｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって十分に耐容されたことを示す。１μｇ ｍＬ－１の固定ｓａＲＮＡ用量で、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、２４時間の処理後にそれぞれ９２．３±１．８％および８６．７±１．４％の非常に高い細胞生存率を示した。Ｎ／Ｐモル比を１８に増加させると細胞傷害性の増加が観察されたが、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、それぞれ７３．０±４．９％および７３．６±７．８％で比較的高い細胞生存率を依然として示した。これらの結果は、ＰＥ－ＬＮＰが低い細胞傷害性および良好な生体適合性を有し、これは、ＰＥ－ＬＮＰのコア内で生物学的ペイロードを取り囲む親水性ＰＥＧコロナおよび疎水性ＰＣＬ層によって提供される保護に起因し得ることを実証している。
溶血活性および非特異的細胞傷害性は、負に変化した細胞膜との強力な相互作用に起因してカチオン性担体に関連する典型的な問題である。様々なＰＥ－ＬＮＰの溶血率が、処理の１時間後にいずれも１０％未満であり（図１３Ａ）、高い生体適合性を示唆したことに注目することは興味深い。図１３Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞がｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって十分に耐容されたことを示す。１μｇ ｍＬ－１の固定ｓａＲＮＡ用量で、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、２４時間の処理後にそれぞれ９２．３±１．８％および８６．７±１．４％の非常に高い細胞生存率を示した。Ｎ／Ｐモル比を１８に増加させると細胞傷害性の増加が観察されたが、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、それぞれ７３．０±４．９％および７３．６±７．８％で比較的高い細胞生存率を依然として示した。これらの結果は、ＰＥ－ＬＮＰが低い細胞傷害性および良好な生体適合性を有し、これは、ＰＥ－ＬＮＰのコア内で生物学的ペイロードを取り囲む親水性ＰＥＧコロナおよび疎水性ＰＣＬ層によって提供される保護に起因し得ることを実証している。
【0185】
実施例９－インビボ生物発光イメージングおよび免疫原性
インビボ生物発光イメージング
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れ、完全に気候順応した部屋に収容し、食物および水を自由に摂取させた。内部倫理委員会、ならびに英国政府によって承認されたプロジェクトおよび個人ライセンスに従って、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ ｏｆ １９８６に従って全動物を取り扱った。実験開始の少なくとも７日前に、動物に適応時間を与えた。ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造（陰性対照）、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にそれぞれ配合した、またはＰＥ－ＬＮＰ １８－８０ Ｍ２（方法２により調製）の表面に配合した５μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡをマウスの両後肢四頭筋に筋肉内（ＩＭ）注射した。７日後、マウスに１００μＬのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＫ）を腹腔内注射し、１０分間静置した。次いで、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を装備したＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＦＸ Ｐｒｏ（Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて１０分間にわたって画像化した。各注射部位からのシグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、等しい検出面積を使用して定量し、ＲＬＵとして表した。
インビボ生物発光イメージング
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れ、完全に気候順応した部屋に収容し、食物および水を自由に摂取させた。内部倫理委員会、ならびに英国政府によって承認されたプロジェクトおよび個人ライセンスに従って、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ａｎｉｍａｌｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ａｃｔ ｏｆ １９８６に従って全動物を取り扱った。実験開始の少なくとも７日前に、動物に適応時間を与えた。ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造（陰性対照）、ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にそれぞれ配合した、またはＰＥ－ＬＮＰ １８－８０ Ｍ２（方法２により調製）の表面に配合した５μｇのｆＬｕｃ ｓａＲＮＡをマウスの両後肢四頭筋に筋肉内（ＩＭ）注射した。７日後、マウスに１００μＬのＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＫ）を腹腔内注射し、１０分間静置した。次いで、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０（Ｃａｒｅｓｔｒｅａｍ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を装備したＩｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ＦＸ Ｐｒｏ（Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて１０分間にわたって画像化した。各注射部位からのシグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、等しい検出面積を使用して定量し、ＲＬＵとして表した。
【0186】
ＨＡ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのインビボ免疫原性
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れた。１×ＰＢＳ中５０μＬの総注射容量まで、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にそれぞれ配合した、Ｃａｌ／０９ウイルスのＨ１赤血球凝集素をコードする１μｇのｓａＲＮＡ（ＨＡ ｓａＲＮＡ）によって後肢四頭筋１つにおいてマウスをＩＭ免疫し、４週間後に同一の製剤によってブーストした。ｊｅｔＰＥＩ／ＨＡ ｓａＲＮＡ複合体を対照として使用した。試験開始から４および６週間後に尾部出血を介して血液を採取した。血液を採取し、１０，０００×ＲＰＭで５分間遠心分離した。血清を採取し、－８０℃で保存した。
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れた。１×ＰＢＳ中５０μＬの総注射容量まで、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にそれぞれ配合した、Ｃａｌ／０９ウイルスのＨ１赤血球凝集素をコードする１μｇのｓａＲＮＡ（ＨＡ ｓａＲＮＡ）によって後肢四頭筋１つにおいてマウスをＩＭ免疫し、４週間後に同一の製剤によってブーストした。ｊｅｔＰＥＩ／ＨＡ ｓａＲＮＡ複合体を対照として使用した。試験開始から４および６週間後に尾部出血を介して血液を採取した。血液を採取し、１０，０００×ＲＰＭで５分間遠心分離した。血清を採取し、－８０℃で保存した。
【0187】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのインビボ免疫原性
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れた。１×ＰＢＳ中５０μＬの総注射容量まで、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－６５の内部に配合した、融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１μｇのｓａＲＮＡによって、後肢四頭筋１つにおいてマウスをＩＭ免疫した。試験開始から４週間の時点で尾部出血を介して血液を採取した。血液を採取し、１０，０００×ＲＰＭで５分間遠心分離した。血清を採取し、－８０℃で保存した。
６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，ＵＫ）をｎ＝５の群に入れた。１×ＰＢＳ中５０μＬの総注射容量まで、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－６５の内部に配合した、融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする１μｇのｓａＲＮＡによって、後肢四頭筋１つにおいてマウスをＩＭ免疫した。試験開始から４週間の時点で尾部出血を介して血液を採取した。血液を採取し、１０，０００×ＲＰＭで５分間遠心分離した。血清を採取し、－８０℃で保存した。
【0188】
ＨＡ特異的ＥＬＩＳＡ
免疫グロブリンＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、ＨＡ抗体力価を定量的に評価した。要約すると、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０のＰＢＳ溶液によって、０．５μｇ ｍＬ－１のＨＡコーティングＥＬＩＳＡプレートをブロックした。洗浄後、希釈血清試料をプレートに加え、２時間インキュベートし、洗浄し、１：４０００希釈の抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートウェルを抗マウスカッパ（１：１０００）およびラムダ（１：１０００）軽鎖（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）によってコーティングし、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０によってブロッキングし、洗浄し、精製ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を１０００ｎｇ ｍＬ－１で開始して加え、５倍希釈系列によって滴定することによって、標準を調製した。ＴＭＢ（３，３’；５，５’－テトラメチルベンジジン）を使用して試料および標準を展開し、Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）によって５分後に反応を停止させた。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ ｖ５ソフトウェアを用いて、分光光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を読み取った。
免疫グロブリンＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、ＨＡ抗体力価を定量的に評価した。要約すると、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０のＰＢＳ溶液によって、０．５μｇ ｍＬ－１のＨＡコーティングＥＬＩＳＡプレートをブロックした。洗浄後、希釈血清試料をプレートに加え、２時間インキュベートし、洗浄し、１：４０００希釈の抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートウェルを抗マウスカッパ（１：１０００）およびラムダ（１：１０００）軽鎖（Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＫ）によってコーティングし、ＰＢＳ／１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０によってブロッキングし、洗浄し、精製ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を１０００ｎｇ ｍＬ－１で開始して加え、５倍希釈系列によって滴定することによって、標準を調製した。ＴＭＢ（３，３’；５，５’－テトラメチルベンジジン）を使用して試料および標準を展開し、Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）によって５分後に反応を停止させた。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ ｖ５ソフトウェアを用いて、分光光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて吸光度を読み取った。
【0189】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＥＬＩＳＡ
ＨＡ特異的ＥＬＩＳＡと同様の手順に従って、免疫グロブリンＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体力価を定量的に評価した。
ＨＡ特異的ＥＬＩＳＡと同様の手順に従って、免疫グロブリンＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体力価を定量的に評価した。
【0190】
インフルエンザ負荷
ブースト注射の３週間後、マウスに、１００μＬのＰＢＳに懸濁した４．２×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のインフルエンザ（Ｃａｌ／０９）を負荷した。イソフルランを使用してマウスを麻酔し、鼻腔内（ＩＮ）負荷し、毎日体重を測定して体重減少を決定した。負荷プロトコルの人道的エンドポイントに従って、マウスが３日間を超えて２０％の体重減少、または１日の２５％の体重減少を持続した場合、マウスを安楽死させた。
ブースト注射の３週間後、マウスに、１００μＬのＰＢＳに懸濁した４．２×１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のインフルエンザ（Ｃａｌ／０９）を負荷した。イソフルランを使用してマウスを麻酔し、鼻腔内（ＩＮ）負荷し、毎日体重を測定して体重減少を決定した。負荷プロトコルの人道的エンドポイントに従って、マウスが３日間を超えて２０％の体重減少、または１日の２５％の体重減少を持続した場合、マウスを安楽死させた。
【0191】
結果および考察
インビボでのｓａＲＮＡ発現効率を試験するために、ルシフェラーゼｓａＲＮＡを様々なＰＥ－ＬＮＰに配合し、ただ１つの用量（５μｇ／脚）で筋肉内注射によってマウスに投与した。７日後、マウスを画像化し、相対蛍光強度を定量した。ｓａＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造によって処置したマウスのシグナルはほとんど検出することができず、これは、ｓａＲＮＡカプセル化能が限られており、ｓａＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造の安定性が低いことに起因する可能性がある。ただし、全ＰＥ－ＬＮＰ群がタンパク質発現を示した。ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５と比較して、３つの製剤ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、有意に高いルシフェラーゼ発現を示した（ｐ＜０．０５）（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０ Ｍ２（方法２によって調製され、ナノ粒子表面にｓａＲＮＡを有する）におけるルシフェラーゼ発現は、ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０（方法１によって調製され、ナノ粒子コア内にｓａＲＮＡを有する）のルシフェラーゼ発現よりも有意に低かったが（ｐ＜０．０５）、同様のインビトロトランスフェクション効率を示した（図９Ａ）。ＰＥ－ＬＮＰのコア内のｓａＲＮＡの配合が、ナノ粒子表面上の配合よりも好ましいことがさらに確認される。ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５のインビトロトランスフェクション効率はＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のインビトロトランスフェクション効率よりも１桁高かったが（図８Ｂ）、これらの２群のインビボルシフェラーゼ発現は同様のシグナルを示した。これは、Ｎ／Ｐモル比が低いＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の優れた細胞生存率のためであり得る。
インビボでのｓａＲＮＡ発現効率を試験するために、ルシフェラーゼｓａＲＮＡを様々なＰＥ－ＬＮＰに配合し、ただ１つの用量（５μｇ／脚）で筋肉内注射によってマウスに投与した。７日後、マウスを画像化し、相対蛍光強度を定量した。ｓａＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造によって処置したマウスのシグナルはほとんど検出することができず、これは、ｓａＲＮＡカプセル化能が限られており、ｓａＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ脂質ナノ構造の安定性が低いことに起因する可能性がある。ただし、全ＰＥ－ＬＮＰ群がタンパク質発現を示した。ＰＥ－ＬＮＰ ５－６５と比較して、３つの製剤ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０は、有意に高いルシフェラーゼ発現を示した（ｐ＜０．０５）（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０ Ｍ２（方法２によって調製され、ナノ粒子表面にｓａＲＮＡを有する）におけるルシフェラーゼ発現は、ＰＥ－ＬＮＰ １８－８０（方法１によって調製され、ナノ粒子コア内にｓａＲＮＡを有する）のルシフェラーゼ発現よりも有意に低かったが（ｐ＜０．０５）、同様のインビトロトランスフェクション効率を示した（図９Ａ）。ＰＥ－ＬＮＰのコア内のｓａＲＮＡの配合が、ナノ粒子表面上の配合よりも好ましいことがさらに確認される。ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５のインビトロトランスフェクション効率はＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のインビトロトランスフェクション効率よりも１桁高かったが（図８Ｂ）、これらの２群のインビボルシフェラーゼ発現は同様のシグナルを示した。これは、Ｎ／Ｐモル比が低いＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の優れた細胞生存率のためであり得る。
【0192】
さらに、本発明者らは、ＩＭ注射後にＰＥ－ＬＮＰの内部に配合した、ＨＡをコードするｓａＲＮＡの免疫原性および保護能力を評価した。ＲＮＡをインビボで効果的に送達することが以前に示されている１つの市販の直鎖ＰＥＩ、ｊｅｔＰＥＩ３１を陽性対照として使用した。マウスに、ｊｅｔＰＥＩ、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０を配合した１μｇのｓａＲＮＡのプライミングおよびブーストを投与した。初回プライムの４週間後にブーストを投与した。ブーストの２週間後にマウスにＣａｌ／０９インフルエンザウイルスをＩＮ負荷し、連日体重を測定して疾患の病態をモニタリングした（図１４Ｃ）。群間の体重減少を区別するために、４．２×１０５ｐｆｕという比較的高い用量を使用した。ナイーブ群の全マウスは、６日後に体重の＞２５％を失い、負荷プロトコルの人道的エンドポイントに従って安楽死させなければならなかったが、心強いことに、ｊｅｔＰＥＩ群およびＰＥ－ＬＮＰ群の全マウスが完全に保護された（図１４Ｅ）。３つすべてのＰＥ－ＬＮＰ群のマウスは、観察の全期間中に１０％未満の体重を失い、特に最小量の体重減少（約８％）を示すＰＥ－ＬＮＰ １１－６５群では、副作用が少なく、保護が良好であることが示された。ＨＡ ＩｇＧ抗体力価（図１４Ｄ）は、負荷結果を直接反映した。これらの３つのＰＥ－ＬＮＰ群、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０はいずれも、高い抗体力価を誘導し、有意差はなく（６週間後に約１×１０５ｎｇ ｍＬ－１）、これはｊｅｔＰＥＩと同等であった。これは、図１４Ｂに示すインビボタンパク質発現結果と一致していた。これにより、これらのＰＥ－ＬＮＰ群がいずれも、堅牢な免疫応答を刺激するのに必要なタンパク質発現の閾値に達したことが示される。この点で、ＰＥ－ＬＮＰは、有効性を保証しながら製剤組成物にさらに柔軟性を提供し、ＲＮＡワクチンおよび治療薬を含む生体分子を送達するのに有利であるはずである。
【0193】
本発明者らはまた、ＩＭ注射後にＰＥ－ＬＮＰの内部に配合した、ｎＣｏＶをコードするｓａＲＮＡの免疫原性を評価した。マウスに、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－６５に配合した１μｇのｓａＲＮＡのプライムを投与した。図１５に示すように、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－６５の両方は、プライム後に高い抗体力価を誘導し、有意差はなかった（４週間後に約１×１０４ｎｇ ｍＬ－１）。これにより、ＰＥ－ＬＮＰ系が、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的なパンデミックおよび上記のインフルエンザウイルスを含む様々な疾患に対処するためにＲＮＡワクチンを効果的に送達することができることが実証された。
【0194】
実施例１０－４℃の水溶液中で添加されたｓａＲＮＡを安定に保存するためのＰＥ－ＬＮＰ組成物の最適化
４℃の水溶液中で保存するためのＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のポリマー組成の最適化
実施例１に上述したのと同じ方法に従って、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ（表１）を合成し、特性評価した。実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、様々な分子量の両親媒性ポリマーを含むＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を４℃の水溶液中で保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０、７および２１日目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
４℃の水溶液中で保存するためのＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のポリマー組成の最適化
実施例１に上述したのと同じ方法に従って、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ（表１）を合成し、特性評価した。実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、様々な分子量の両親媒性ポリマーを含むＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を４℃の水溶液中で保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０、７および２１日目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
【0195】
４℃の水溶液中で保存した後の様々なｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を４℃の水溶液中で保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０および１および３ヶ月目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を４℃の水溶液中で保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０および１および３ヶ月目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
【0196】
結果および考察
図１６に示すように、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ（異なる疎水性ＰＣＬ鎖長を含有する）からそれぞれ構成された新鮮なＰＥ－ＬＮＰ １１－６５試料は、同様のＤＬＳサイズ、ＰＤＩ、ゼータ電位およびトランスフェクション効率を示した。ただし、図１６Ｄは、比較的長いＰＣＬ鎖を有するＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の方が、４℃での２１日間の保存中に堅牢な機能的安定性を示したことを示す。比較として、比較的短いＰＣＬ鎖を有するＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の機能的安定性は、４℃での７および２１日間の保存後のトランスフェクション効率の有意な低下によって示されるように、保存中に著しく損なわれた。保存中のトランスフェクション効率の差は、両親媒性ポリマーの疎水性ブロックの鎖長が、保存中にＲＮＡ安定性を維持するのに重要な役割を果たすことを示唆している。
図１６に示すように、ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋおよびＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋ（異なる疎水性ＰＣＬ鎖長を含有する）からそれぞれ構成された新鮮なＰＥ－ＬＮＰ １１－６５試料は、同様のＤＬＳサイズ、ＰＤＩ、ゼータ電位およびトランスフェクション効率を示した。ただし、図１６Ｄは、比較的長いＰＣＬ鎖を有するＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の方が、４℃での２１日間の保存中に堅牢な機能的安定性を示したことを示す。比較として、比較的短いＰＣＬ鎖を有するＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ８．５ｋから構成されたＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の機能的安定性は、４℃での７および２１日間の保存後のトランスフェクション効率の有意な低下によって示されるように、保存中に著しく損なわれた。保存中のトランスフェクション効率の差は、両親媒性ポリマーの疎水性ブロックの鎖長が、保存中にＲＮＡ安定性を維持するのに重要な役割を果たすことを示唆している。
【0197】
ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋポリマーが優れた選択肢であることが示されたことから、安定化分子が存在しないｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの液体製剤の４℃での保存のさらなる調査を行った。図１７は、４℃の水溶液中での３ヶ月間の保存中のＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０のトランスフェクション効率を示す。ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の機能的安定性は、保存の最初の１ヶ月以内に明らかな変化を示さなかったが、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率の低下が観察された。この結果は、１８という高いＮ／Ｐ比が、ＰＥ－ＬＮＰコア内のさらに小型の脂質ナノ構造の形成におそらく起因して、水溶液中での保存中に核酸ペイロードに対してさらに高いレベルの保護を提供し得ることを示唆している。
【0198】
実施例１１－室温の水溶液中のｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの安定な保存
室温の水溶液中で保存した後のｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を室温の水溶液中に保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、室温で２１日間保存した後の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定し、新たに調製したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較した。
室温の水溶液中で保存した後のｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を室温の水溶液中に保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、室温で２１日間保存した後の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定し、新たに調製したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較した。
【0199】
室温の水溶液中で保存した後の様々なｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を室温の水溶液中に保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０、１４、２１および２８日目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部にｓａＲＮＡを配合した。ナノ製剤を室温の水溶液中に保存した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、０、１４、２１および２８日目の１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
【0200】
結果および考察
図１８および図１９に示すように、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量を有する新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ製剤と比較して、室温の水溶液中で２１日間保存した後のＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部に配合したｓａＲＮＡのトランスフェクション効率の低下は観察されなかった。２８日後、高いトランスフェクション効率が維持されたが、新鮮試料と比較してわずかな低下が観察された。図１９Ｂ～図１９Ｄに示すように、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０はまた、室温での保存中に流体力学的サイズ、ＰＤＩおよびゼータ電位を良好に保持した。これにより、両親媒性ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの自己組織化によって形成されたポリマーシェル層が、ナノ粒子の安定性を改善し、生物学的ペイロード、特に容易に加水分解／分解されるＲＮＡ分子を液体製剤中で厳しい外部環境から最適に保護することができることがさらに確認される。
図１８および図１９に示すように、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量を有する新たに調製したＰＥ－ＬＮＰ製剤と比較して、室温の水溶液中で２１日間保存した後のＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部に配合したｓａＲＮＡのトランスフェクション効率の低下は観察されなかった。２８日後、高いトランスフェクション効率が維持されたが、新鮮試料と比較してわずかな低下が観察された。図１９Ｂ～図１９Ｄに示すように、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０はまた、室温での保存中に流体力学的サイズ、ＰＤＩおよびゼータ電位を良好に保持した。これにより、両親媒性ＰＥＧ５ｋ－ＰＣＬ１０ｋコポリマーの自己組織化によって形成されたポリマーシェル層が、ナノ粒子の安定性を改善し、生物学的ペイロード、特に容易に加水分解／分解されるＲＮＡ分子を液体製剤中で厳しい外部環境から最適に保護することができることがさらに確認される。
【0201】
実施例１２－４℃の水溶液中のトレハロースの存在下でのｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの安定な保存
４℃の水溶液中で保存した後のトレハロース含有ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同様の方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の調製に、１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比でｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１）およびトレハロースの水溶液を使用した。次いで、総トレハロース（内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために、追加のトレハロースを、得られたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と混合した。
４℃の水溶液中で保存した後のトレハロース含有ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率
実施例２に上述したのと同様の方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の調製に、１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比でｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１）およびトレハロースの水溶液を使用した。次いで、総トレハロース（内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために、追加のトレハロースを、得られたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と混合した。
【0202】
比較として、実施例２に上述したのと同じ方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡの水溶液（４０μｇ ｍＬ－１）を配合した。次いで、得られたナノ製剤を２５０ｍｇ ｍＬ－１の濃度で外部トレハロースと混合した。
【0203】
これらのナノ製剤を４℃で３８３日間水溶液中で保存し、次いで、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定し、新たに調製したｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較した。
【0204】
結果および考察
ＲＮＡ分子は極めて脆弱であり、曝露環境では容易に分解する可能性があるため、ＲＮＡワクチンおよび治療薬を極めて困難な低温流通体系で保存および輸送する必要がある。世界で最初に承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンである、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈのｍＲＮＡワクチンは、－７０℃での保存を必要とする大きな障害を抱えている。他のＲＮＡワクチンも同様の熱安定性の問題を有し、例えば、ＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡワクチンは、保存のために－２０℃に保持する必要がある。これは、ＲＮＡワクチンが集団免疫を確実にするために必要な展開の速度および規模に達することを極めて困難にする。
ＲＮＡ分子は極めて脆弱であり、曝露環境では容易に分解する可能性があるため、ＲＮＡワクチンおよび治療薬を極めて困難な低温流通体系で保存および輸送する必要がある。世界で最初に承認されたＣＯＶＩＤ－１９ワクチンである、Ｐｆｉｚｅｒ／ＢｉｏＮＴｅｃｈのｍＲＮＡワクチンは、－７０℃での保存を必要とする大きな障害を抱えている。他のＲＮＡワクチンも同様の熱安定性の問題を有し、例えば、ＭｏｄｅｒｎａのｍＲＮＡワクチンは、保存のために－２０℃に保持する必要がある。これは、ＲＮＡワクチンが集団免疫を確実にするために必要な展開の速度および規模に達することを極めて困難にする。
【0205】
ＲＮＡワクチンを配合したＰＥ－ＬＮＰは、上記の実施例９では、効率的なインビボタンパク質発現および優れた免疫原性を示した（図１４および図１５）。上記の実施例１０は、安定化分子を有しないｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ製剤が、４℃の水溶液中で３ヶ月間保存した後に高いトランスフェクション効率を維持することができることを実証した（図１７）。上記の実施例１１で実証されているように、室温で２１日間水溶液中で保存した後、ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ製剤は、同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製した対応物と比較して、トランスフェクション効率の低下を示さなかった（図１８および図１９）。これは、ナノ粒子コア内のＲＮＡペイロードの最適な保護を提供する独自のＰＥ－ＬＮＰナノ構造によるものであった。
【0206】
水溶液中のＲＮＡナノ製剤の貯蔵期限をさらに延ばすために、実施例１０の方法に従って、トレハロースなどの外部および／または内部安定化分子を含めた（図２０）。図２１に示すように、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびに混合外部トレハロースを含むｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、同等のトランスフェクション効率を示し、４℃の水溶液中で１年超（３８３日間）にわたって保存した後、新たに調製したｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較して有意差はなかった。
【0207】
実施例１３－室温の水溶液中のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの安定な保存
室温の水溶液中で保存した後のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例１２に上述したのと同じ方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １６－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の調製に、１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比でｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１）およびトレハロースの水溶液を使用し、続いて、２５０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロースに補充するために追加のトレハロースと混合した。
室温の水溶液中で保存した後のｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率
実施例１２に上述したのと同じ方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １６－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の調製に、１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比でｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１）およびトレハロースの水溶液を使用し、続いて、２５０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロースに補充するために追加のトレハロースと混合した。
【0208】
これらのナノ製剤を室温で水溶液中で保存し、次いで、０、１４、２１および２８日目に１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定し、新たに調製したｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １６－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０とそれぞれ比較した。
【0209】
結果および考察
次いで、本発明者らは、室温で保存するための水溶液中の安定化分子としてのトレハロースの効果を調査することに進む（図２０）。新鮮なｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰを陰性対照とした場合、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰは、２０℃で４週間保存した後に同等のトランスフェクション効率を示した（図２２Ａ）。陰性対照と比較して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰはまた、２０℃で４週間の保存中にＤＬＳサイズ（図２２Ｂ）、ＰＤＩ（図２２Ｃ）およびゼータ電位（図２２Ｄ）を良好に保持した。これらは、長期保存の可能性を示唆している。
次いで、本発明者らは、室温で保存するための水溶液中の安定化分子としてのトレハロースの効果を調査することに進む（図２０）。新鮮なｓａＲＮＡ添加トレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰを陰性対照とした場合、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰは、２０℃で４週間保存した後に同等のトランスフェクション効率を示した（図２２Ａ）。陰性対照と比較して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰはまた、２０℃で４週間の保存中にＤＬＳサイズ（図２２Ｂ）、ＰＤＩ（図２２Ｃ）およびゼータ電位（図２２Ｄ）を良好に保持した。これらは、長期保存の可能性を示唆している。
【0210】
実施例１４－トレハロースの存在下での凍結乾燥条件の最適化、および４℃での凍結乾燥ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの安定な保存
外部トレハロースの存在下でのｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥条件の最適化
実施例２に上述した方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部に様々な濃度のｓａＲＮＡ（例えば、２０、４０、６０および１００μｇ ｍＬ－１）を配合した。次いで、得られたナノ粒子を２００ｍｇ ｍＬ－１の固定濃度で外部トレハロースと混合した。製剤を－８０℃の冷凍庫内で凍結させ、４８時間凍結乾燥させ、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。凍結乾燥中のｓａＲＮＡ濃度を最適化するために、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量での再水和ＰＥ－ＬＮＰのＤＬＳ粒径分布およびインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を評価した。その後、最適化ｓａＲＮＡ濃度を添加したが様々な外部トレハロース濃度（例えば、１５０、２００、２５０、３００および４００ｍｇ ｍＬ－１）と混合したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、ＤＬＳおよびインビトロトランスフェクションによるさらなる分析のためにＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。したがって、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の凍結乾燥のための添加したｓａＲＮＡおよび混合トレハロースの最適濃度を同定した。
外部トレハロースの存在下でのｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥条件の最適化
実施例２に上述した方法を使用して、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部に様々な濃度のｓａＲＮＡ（例えば、２０、４０、６０および１００μｇ ｍＬ－１）を配合した。次いで、得られたナノ粒子を２００ｍｇ ｍＬ－１の固定濃度で外部トレハロースと混合した。製剤を－８０℃の冷凍庫内で凍結させ、４８時間凍結乾燥させ、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。凍結乾燥中のｓａＲＮＡ濃度を最適化するために、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量での再水和ＰＥ－ＬＮＰのＤＬＳ粒径分布およびインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を評価した。その後、最適化ｓａＲＮＡ濃度を添加したが様々な外部トレハロース濃度（例えば、１５０、２００、２５０、３００および４００ｍｇ ｍＬ－１）と混合したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、ＤＬＳおよびインビトロトランスフェクションによるさらなる分析のためにＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。したがって、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の凍結乾燥のための添加したｓａＲＮＡおよび混合トレハロースの最適濃度を同定した。
【0211】
トレハロースの存在下での凍結乾燥ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ ｓａＲＮＡの４℃での保存
２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースを含有するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびにｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）を凍結乾燥させ、次いで。４℃で保存した。その後、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率の測定のために、凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ製剤をＲＮａｓｅ不含水によって再水和した。
２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースを含有するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびにｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）を凍結乾燥させ、次いで。４℃で保存した。その後、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率の測定のために、凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ製剤をＲＮａｓｅ不含水によって再水和した。
【0212】
ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥条件の最適化
実施例２に上述した方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の調製に、様々なトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比（例えば、２５、５０、１００、２００、４００および６２５０）でＲＮａｓｅ不含水中のｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１に固定）およびトレハロースの水溶液を使用した。次いで、総トレハロース（内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために、追加のトレハロースを、得られたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と混合し、これを実施例１４の上記の実験から最適化した。トレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）比が６２５０であり、ｓａＲＮＡ濃度が４０μｇ ｍＬ－１であるｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の特定の場合、補充のために追加のトレハロースを加える必要はなかった。凍結乾燥、およびＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和の後、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のコロイド安定性をＤＬＳによって試験し、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロトランスフェクション効率を分析した。
実施例２に上述した方法を使用して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の調製に、様々なトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比（例えば、２５、５０、１００、２００、４００および６２５０）でＲＮａｓｅ不含水中のｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１に固定）およびトレハロースの水溶液を使用した。次いで、総トレハロース（内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために、追加のトレハロースを、得られたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と混合し、これを実施例１４の上記の実験から最適化した。トレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）比が６２５０であり、ｓａＲＮＡ濃度が４０μｇ ｍＬ－１であるｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の特定の場合、補充のために追加のトレハロースを加える必要はなかった。凍結乾燥、およびＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和の後、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のコロイド安定性をＤＬＳによって試験し、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロトランスフェクション効率を分析した。
【0213】
結果および考察
本発明者らが極めて困難な低温流通体系を必要とせずにＲＮＡワクチンおよび治療薬の安定な保存のために利用した別の戦略は、トレハロースなどの外部および／または内部安定化分子の存在下でのＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥である（図２０）。凍結乾燥プロセスは、ＲＮＡ送達ナノ製剤のコロイド安定性を潜在的に大幅に低下させ、効力の不可逆的な低下をもたらす可能性がある。トレハロースのガラス化は剛性の非晶質ガラス状糖マトリックス内にナノ粒子を固定化することができ、そのようにすることによってナノ粒子の凝集または破裂を劇的に減少させるため、凍結乾燥中にナノ粒子の外側でトレハロースを単に混合することによってナノ粒子のコロイド安定性を改善することができることが他の研究者によって報告されている２１。さらに、ＰＥ－ＬＮＰは内部親水性ドメインを含有する独自の構造を有することから、トレハロースは、ＰＥ－ＬＮＰの内部にＲＮＡと共添加され、ＲＮＡと直接相互作用を行うこともできる。トレハロースのヒドロキシル基は、ＲＮＡ分子と水素結合を形成し、それによって、凍結乾燥中のＲＮＡの水和を最小限に抑えることができる。したがって、ＲＮＡの熱安定性を顕著に向上させることができた。
本発明者らが極めて困難な低温流通体系を必要とせずにＲＮＡワクチンおよび治療薬の安定な保存のために利用した別の戦略は、トレハロースなどの外部および／または内部安定化分子の存在下でのＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥である（図２０）。凍結乾燥プロセスは、ＲＮＡ送達ナノ製剤のコロイド安定性を潜在的に大幅に低下させ、効力の不可逆的な低下をもたらす可能性がある。トレハロースのガラス化は剛性の非晶質ガラス状糖マトリックス内にナノ粒子を固定化することができ、そのようにすることによってナノ粒子の凝集または破裂を劇的に減少させるため、凍結乾燥中にナノ粒子の外側でトレハロースを単に混合することによってナノ粒子のコロイド安定性を改善することができることが他の研究者によって報告されている２１。さらに、ＰＥ－ＬＮＰは内部親水性ドメインを含有する独自の構造を有することから、トレハロースは、ＰＥ－ＬＮＰの内部にＲＮＡと共添加され、ＲＮＡと直接相互作用を行うこともできる。トレハロースのヒドロキシル基は、ＲＮＡ分子と水素結合を形成し、それによって、凍結乾燥中のＲＮＡの水和を最小限に抑えることができる。したがって、ＲＮＡの熱安定性を顕著に向上させることができた。
【0214】
最初に、２００ｍｇ ｍＬ－１の固定濃度の外部トレハロースとナノ粒子内部に添加された様々な濃度（２０～１００μｇ ｍＬ－１）のｓａＲＮＡとを含有するＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。次いで、再水和ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率を評価した。興味深いことに、図２３は、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較して、全凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤のトランスフェクション効率が１～１．５桁向上したことを示す、ＨＥＫ２９３細胞トランスフェクションに対する外部トレハロースの相乗効果を示している。図２３に従って、２００ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースの存在下でのｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の凍結乾燥のための最適なｓａＲＮＡ濃度として、４０μｇ ｍＬ－１を選択した。
【0215】
さらに、固定内部ｓａＲＮＡ濃度（４０μｇ ｍＬ－１）と様々な濃度の外部トレハロースとを含有するＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した。図２４に従って、４０μｇ ｍＬ－１の内部ｓａＲＮＡを添加したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の凍結乾燥のための最適な外部トレハロース濃度として、２５０ｍｇ ｍＬ－１を選択した。図２４に示すように、この条件下での凍結乾燥製剤は、即時の再水和時に、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５よりも１桁高い最も高いトランスフェクション効率を示した。
【0216】
図２５は、４０μｇ ｍＬ－１の内部ｓａＲＮＡと２５０ｍｇ ｍＬ－１の外部トレハロースとを含有するＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の凍結乾燥後の４℃での安定なＲＮＡ保存を示す。４℃で２８日間保存し、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって再水和した後、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較して、凍結乾燥製剤のトランスフェクション効率の低下は観察されなかった。これは、コア－シェルＰＥ－ＬＮＰナノ構造によって提供される固有の保護と外部トレハロースとの複合効果が、４℃での保存中にＲＮＡ安定性を良好に保持したことを示唆している。
【0217】
保存中のＲＮＡ安定性をさらに改善するために、本発明者らは、ナノ粒子の親水性コアにｓａＲＮＡ（４０μｇ ｍＬ－１の固定濃度）とトレハロース（様々なトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比）とを共添加したＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を調製した。
【0218】
次いで、総トレハロース（内部および外部の両方）を２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために、追加のトレハロースを、得られたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と混合し、続いて、製剤を凍結乾燥した。トレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比が４００を超えると、凍結乾燥、およびＲＮａｓｅ不含水による再水和後のナノ粒子のサイズが３００ｎｍよりも大きくなることが分かった。１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比が最も良好であり、新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（図２Ｃに示すサイズ＝１３１．３±０．５ｎｍおよびＰＤＩ＝０．２６５）と同等の１６７．７±３．６ｎｍの小さい均一なＤＬＳサイズと０．３１３±０．０１７のＰＤＩを有する良好な単分散性とを有する再水和ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の形成をもたらした。これは、内部トレハロースおよび外部トレハロースの両方の存在が、凍結乾燥および再水和プロセス中にＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のコロイド安定性を良好に保持したことを示唆している。さらに、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、８５．２±４．８％で高いｓａＲＮＡカプセル化効率を示し、これは、トレハロース不含ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のｓａＲＮＡカプセル化効率（９３．６±３．２％）と同等であった。
【0219】
総トレハロース濃度は２５０ｍｇ ｍＬ－１に固定したが、ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の凍結乾燥のためにトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比を５０～１００まで増加させること（すなわち、内部トレハロースの割合を増加させること）が好ましかった。図２６に示すように、この条件下で凍結乾燥されたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤は、ＲＮａｓｅ不含水による即時の再水和時に、トランスフェクション効率の劇的な改善を示し、これは、１μｇ ｍＬ－１の同等のｓａＲＮＡ用量で新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５よりも１．５桁高かった。１００を超えるトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比のさらなる増加は、トランスフェクション効率の顕著な低下をもたらしたが、新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５よりもなお１桁高かった。これは、外部トレハロースの存在と組み合わせたナノ粒子内部のｓａＲＮＡとトレハロースとの共存が、相乗効果を発揮し、ＲＮＡ安定性および有効性を大幅に改善し得ることを示唆している。
【0220】
図２７は、内部トレハロースを有するおよび有しない凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の安定性を比較している。４℃で１年超（３８０日間）にわたって保存し、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって再水和した後、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５は、トレハロース不含新鮮試料のトランスフェクション効率よりも有意に高いトランスフェクション効率（ｐ＜０．０５）を示した。トレハロースが、製剤の安定化に加えて、トランスフェクションの改善に対する相乗効果をもたらしたことから、これを説明することができる。内部トレハロースを有しない製剤は、４℃で１年超にわたって保存した後、トランスフェクション効率の２倍超の損失を示した。これは、内部トレハロースおよび外部トレハロースの両方の存在下で最適化されたＰＥ－ＬＮＰが、長期保存中に凍結乾燥製剤の機能的安定性を効果的に維持することができることを実証している。
【0221】
凍結乾燥製剤のさらなる熱負荷試験のために、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のために４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ、およびトレハロース／ｓａＲＮＡ重量比＝１００、続いて、総トレハロースを２５０ｍｇ ｍＬ－１まで補充するために追加のトレハロースと混合）の最適化された凍結乾燥条件を選択した。
【0222】
実施例１５－４０℃での安定な保存のための凍結乾燥ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの熱負荷試験
最適化されたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤を凍結乾燥させ、次いで、４０℃で保存するために保持した（熱帯条件）。外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を対照として凍結乾燥した。一定期間後の保存後、凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤をＲＮａｓｅ不含水によって再水和し、それらのインビトロトランスフェクション効率を測定した。
最適化されたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤を凍結乾燥させ、次いで、４０℃で保存するために保持した（熱帯条件）。外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を対照として凍結乾燥した。一定期間後の保存後、凍結乾燥ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤をＲＮａｓｅ不含水によって再水和し、それらのインビトロトランスフェクション効率を測定した。
【0223】
結果および考察
非低温流通体系保存のためのＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの可能性を評価するために、最適化されたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、４０℃でそれぞれ１、３、５、７または１４日間保存するために保持した。図２８は、凍結乾燥させ、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した後（０日目）、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびに外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率が、新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５よりも約１．５桁高いことを示し、トレハロースの相乗効果がさらに確認された。図３１および図３２に示すように、４０℃の高温で１４日間保存するために保持した後であっても、新たに調製したトレハロース不含ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ１１－６５と比較して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、または外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率の低下は観察されず、室温およびさらには熱帯条件下でＲＮＡの優れた熱安定性および有効性が示された。
非低温流通体系保存のためのＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰの可能性を評価するために、最適化されたｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を凍結乾燥させ、４０℃でそれぞれ１、３、５、７または１４日間保存するために保持した。図２８は、凍結乾燥させ、次いで、ＲＮａｓｅ不含水によって直ちに再水和した後（０日目）、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびに外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率が、新たに調製したトレハロース不含ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５よりも約１．５桁高いことを示し、トレハロースの相乗効果がさらに確認された。図３１および図３２に示すように、４０℃の高温で１４日間保存するために保持した後であっても、新たに調製したトレハロース不含ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ１１－６５と比較して、ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、または外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率の低下は観察されず、室温およびさらには熱帯条件下でＲＮＡの優れた熱安定性および有効性が示された。
【0224】
次いで、本発明者らは、凍結乾燥し、４０℃で７日間保存し、それぞれｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ならびに外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を再水和した後に、限外濾過遠心分離を利用して遊離（非添加）外部トレハロースを除去した。図３０は、外部トレハロースの除去後、特に４０℃での保存７日目に、内部トレハロースを有しない再水和ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率が、限外濾過遠心分離を用いないそれらの対応物と比較して大幅に低下したことを示す。比較として、外部トレハロースの除去後、ナノ粒子の親水性コアにｓａＲＮＡおよびトレハロースを共添加した再水和ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率が、４０℃で７日間保存した後に、新たに調製したトレハロース不含ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と同等であったことに注目することは興味深い。これらの結果から、ＰＥ－ＬＮＰに共添加したＲＮＡの熱安定性および有効性の向上に対する内部トレハロースの重要な役割がさらに確認される。
【0225】
実施例１６－様々なＲＮＡ分子のＰＥ－ＬＮＰ媒介細胞内送達に対するトレハロースの効果
実施例１２に上述した方法を使用して、トレハロースと５０μｇ ｍＬ－１のカルセインとを１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比で４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡのＲＮａｓｅ不含脱イオン水溶液に予備溶解し、ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を調製し、これに追加のトレハロースを混合し、２５０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロース（内部および外部の両方）に補充した。ｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を対照として調製した。レーザー走査型共焦点顕微鏡によって、２つのカルセイン含有ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の取込みおよび細胞内輸送を調査した。２ｍＬ量のＨＥＫ２９３細胞（１皿当たり２×１０５細胞）を３５ｍｍガラス底培養皿に播種し、２４時間培養した。ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、またはｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を培養皿に加えた（１皿当たり２μｇのｓａＲＮＡ）。２時間処理した後、細胞を洗浄し、さらに４時間インキュベートするために完全培地を補充した。Ｌｅｉｃａ ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化し、共焦点顕微鏡画像内のカルセインの平均蛍光強度をＩｍａｇｅＪによって分析した。
実施例１２に上述した方法を使用して、トレハロースと５０μｇ ｍＬ－１のカルセインとを１００のトレハロース／ｓａＲＮＡ（ｗ／ｗ）重量比で４０μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡのＲＮａｓｅ不含脱イオン水溶液に予備溶解し、ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を調製し、これに追加のトレハロースを混合し、２５０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロース（内部および外部の両方）に補充した。ｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（トレハロース不含）を対照として調製した。レーザー走査型共焦点顕微鏡によって、２つのカルセイン含有ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の取込みおよび細胞内輸送を調査した。２ｍＬ量のＨＥＫ２９３細胞（１皿当たり２×１０５細胞）を３５ｍｍガラス底培養皿に播種し、２４時間培養した。ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、またはｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を培養皿に加えた（１皿当たり２μｇのｓａＲＮＡ）。２時間処理した後、細胞を洗浄し、さらに４時間インキュベートするために完全培地を補充した。Ｌｅｉｃａ ＳＰ８倒立共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化し、共焦点顕微鏡画像内のカルセインの平均蛍光強度をＩｍａｇｅＪによって分析した。
【0226】
実施例１２に上述した方法を使用して、ＧＦＰ発現ｍＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５（共カプセル化のためにトレハロース／ｍＲＮＡ重量比＝１００、続いて、１０ｍｇ ｍＬ－１で総トレハロースに補充するために追加のトレハロースと混合）も調製した。トレハロース不含ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５を対照として調製した。ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに５×１０５／ウェルで播種し、４８時間培養し、インビトロトランスフェクションをフローサイトメトリー（Ｃａｎｔｏ，ＢＤ，ＵＳＡ）によって定量的に分析した。
【0227】
結果および考察
図２３～図３０に示すように、外部／内部トレハロースの存在に起因するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率の大幅な向上により、本発明者らは、加えたトレハロースの相乗効果をさらに調査するように促された。細胞取込みおよび細胞内輸送の指標として、膜不透過性色素であるカルセインを２つのＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の内部に共添加した。共焦点顕微鏡画像（図３１Ａ）に示すように、新たに調製したｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理したＨＥＫ２９３細胞は、新たに調製したｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理したものと比較して、細胞全体にわたってかなり強力な緑色の拡散染色を示した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＩｍａｇｅＪによって分析した。図３１Ｂは、ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理した細胞が、ｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理した細胞と比較して、有意に高いＭＦＩを有したことを示す。これにより、トレハロースの存在が細胞取込みおよびその後のエンドソーム脱出を増強し得ることが確認された。
図２３～図３０に示すように、外部／内部トレハロースの存在に起因するｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰのトランスフェクション効率の大幅な向上により、本発明者らは、加えたトレハロースの相乗効果をさらに調査するように促された。細胞取込みおよび細胞内輸送の指標として、膜不透過性色素であるカルセインを２つのＰＥ－ＬＮＰ １１－６５製剤の内部に共添加した。共焦点顕微鏡画像（図３１Ａ）に示すように、新たに調製したｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理したＨＥＫ２９３細胞は、新たに調製したｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理したものと比較して、細胞全体にわたってかなり強力な緑色の拡散染色を示した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＩｍａｇｅＪによって分析した。図３１Ｂは、ｓａＲＮＡ、トレハロースおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理した細胞が、ｓａＲＮＡおよびカルセイン共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によって処理した細胞と比較して、有意に高いＭＦＩを有したことを示す。これにより、トレハロースの存在が細胞取込みおよびその後のエンドソーム脱出を増強し得ることが確認された。
【0228】
ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５によるＨＥＫ２９３細胞へのＧＦＰコードｍＲＮＡの細胞内送達に対するトレハロースの効果も調査した。図３２に示すように、新たに調製したｍＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５による処理後、新たに調製したトレハロース不含ｍＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５と比較して、ＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３細胞の割合は、５１．９±４．９％から７４．２±２．２％に増加し、ＭＦＩは１．７倍増加した。これにより、ＰＥ－ＬＮＰに基づく製剤による様々な核酸の細胞内送達に対するトレハロースの相乗効果がさらに確認される。
【0229】
実施例１７ ＰＥ－ＬＮＰの脂質組成物の変形例
コレステロールをＤＯＴＡＰおよびＰＥＧ－ＰＣＬとともにＴＨＦに共溶解した、実施例２に上述したのと同様の方法に従って、コレステロールの存在下でＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。コレステロールおよびＤＯＴＡＰに対するコレステロールの重量百分率として、コレステロール含有量（重量％）を定義した。Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ，ＵＫ）を使用して、ナノ製剤のサイズ、ＰＤＩおよびゼータ電位を評価した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
コレステロールをＤＯＴＡＰおよびＰＥＧ－ＰＣＬとともにＴＨＦに共溶解した、実施例２に上述したのと同様の方法に従って、コレステロールの存在下でＰＥ－ＬＮＰ １１－６５の内部にｓａＲＮＡを配合した。コレステロールおよびＤＯＴＡＰに対するコレステロールの重量百分率として、コレステロール含有量（重量％）を定義した。Ｌｉｔｅｓｉｚｅｒ（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ，ＵＫ）を使用して、ナノ製剤のサイズ、ＰＤＩおよびゼータ電位を評価した。次いで、実施例４の上記の方法に従って、１μｇ ｍＬ－１のｓａＲＮＡ用量でのそれらのインビトロＨＥＫ２９３細胞トランスフェクション効率を測定した。
【0230】
結果および考察
ＰＥ－ＬＮＰ系の調製方法は、限定するものではないが、荷電性基を有するカチオン性／イオン化可能脂質、およびコレステロールなどのステロールを含む様々な脂質およびそれらの組合せをナノ粒子コアに組み込むように容易に適合可能である。本発明者らは、脂質組成物に対するナノ系の汎用性をさらに実証するために、ＰＥ－ＬＮＰ系に配合するコレステロールを選択した。
ＰＥ－ＬＮＰ系の調製方法は、限定するものではないが、荷電性基を有するカチオン性／イオン化可能脂質、およびコレステロールなどのステロールを含む様々な脂質およびそれらの組合せをナノ粒子コアに組み込むように容易に適合可能である。本発明者らは、脂質組成物に対するナノ系の汎用性をさらに実証するために、ＰＥ－ＬＮＰ系に配合するコレステロールを選択した。
【0231】
図３３は、ＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’の物理化学的特性評価、およびコレステロールを配合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰ １１－６５のトランスフェクション効率を示す。コレステロールの存在下でのＰＥ－ＬＮＰ １１’－６５’は、生体分子送達に適したサイズ、ＰＤＩおよびゼータ電位を示した。次いで、本発明者らは、トランスフェクション効率に対するコレステロール含有量の影響の調査に進んだ。コレステロール含有量を２０重量％から４０重量％に増加させると、トランスフェクション効率の１を超える有意な増加が観察された。これは、ＰＥ－ＬＮＰ系が様々な脂質分子およびそれらの組合せと適合性であることを実証している。ナノ製剤のトランスフェクション効率は、脂質組成物を調整することによって様々な用途に合わせて調整することができる。
【0232】
結論
本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、ＲＮＡを含む生体分子の効率的な細胞内送達を達成し、低温流通体系を必要とせずにワクチンおよび治療薬の安定な保存を可能にするポリマー内包脂質ナノ粒子（ＰＥ－ＬＮＰ）を開発した。このナノ製剤プラットフォームは、好ましい安全性プロファイル、小型サイズ、制御された電荷、高い添加効率、効率的なエンドソーム溶解活性、優れたコロイド安定性およびペイロード（ＲＮＡ）安定性、ならびに単純で、費用対効果が高く、容易に規模を拡大できる調製方法を含む、理想的な担体の特徴を有する。
本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方で、ＲＮＡを含む生体分子の効率的な細胞内送達を達成し、低温流通体系を必要とせずにワクチンおよび治療薬の安定な保存を可能にするポリマー内包脂質ナノ粒子（ＰＥ－ＬＮＰ）を開発した。このナノ製剤プラットフォームは、好ましい安全性プロファイル、小型サイズ、制御された電荷、高い添加効率、効率的なエンドソーム溶解活性、優れたコロイド安定性およびペイロード（ＲＮＡ）安定性、ならびに単純で、費用対効果が高く、容易に規模を拡大できる調製方法を含む、理想的な担体の特徴を有する。
【0233】
ＰＥ－ＬＮＰは、生体適合性であることが証明されており、ＦＤＡによって承認されている２つの主要な構造成分、すなわち、ＰＥＧ－ＰＣＬなどの両親媒性ポリマーと、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質またはイオン化可能脂質とから構成される。ＰＥ－ＬＮＰは、容易かつ迅速な混合および有機溶媒蒸発による単純なワンポット法を使用して調製することができる。Ｃｒｙｏ－ＴＥＭおよびＦＲＥＴ分析では、ＰＥ－ＬＮＰの内部構造が脂質ナノ構造からなり、効率的なペイロードカプセル化に有利であることが示された。内部脂質ナノ構造を取り囲む自己組織化ＰＥＧ－ＰＣＬ外層は、コロイド安定性および血清適合性を保証し、極めて不安定なＲＮＡなどのペイロードの機能を十分に保護することができる。ＰＥ－ＬＮＰは、優れた安定性と、ＦＢＳの存在下で市販のＰＥＩよりも４桁高くなり得る高いインビトロトランスフェクション効率とを示した。
【0234】
それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０をＩＭ注射によってトランスフェクトしたマウスは、強力なルシフェラーゼ発現を示した。さらに、ナノ製剤はいずれも高いＨＡ ＩｇＧ抗体力価を誘導したため、それぞれＰＥ－ＬＮＰ １１－６５、ＰＥ－ＬＮＰ １８－６５およびＰＥ－ＬＮＰ １８－８０の内部に配合したＨＡ ｓａＲＮＡによる免疫後のＣａｌ／０９インフルエンザ負荷では、全マウスが効果的に保護された。ＨＡ ｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰによって免疫したマウスの平均体重減少は１０％未満であり、特にＰＥ－ＬＮＰ １１－６５による体重減少の誘導は最小量であった（約８％）。
【0235】
本発明者らは、周囲温度で生物学的ペイロード、特に容易に加水分解／分解されるＲＮＡ分子を安定に保存するための２つの戦略を実証した。コア－シェルナノ粒子構造によって提供される最適な保護は、室温で水溶液中のＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰを安定に保存することを可能にした。安定なＲＮＡ保存のための別の戦略は、トレハロースなどの外部および／または内部安定化分子の存在下でのＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰの凍結乾燥である。ｓａＲＮＡおよびトレハロース共添加ＰＥ－ＬＮＰ、ならびに外部トレハロースと混合したｓａＲＮＡ添加ＰＥ－ＬＮＰは、凍結乾燥、４０℃もの高い周囲温度（熱帯条件）での保存、および再水和後にｓａＲＮＡの所望の熱安定性を示し、前者の方が良好な性能を示した。これらは、ＰＥ－ＬＮＰナノ製剤が、低温流通体系を必要とせずに周囲温度でワクチンおよび治療薬の安定な保存を可能にすることができることを実証している。これにより、ワクチンおよび治療製剤の世界的な配給を改善するための実行可能な解決策が提供される。
【0236】
さらに、本発明者らによって開発されたＰＥ－ＬＮＰは、様々な細胞型への効率的な細胞内送達、ならびに様々なワクチンおよび治療薬（限定するものではないが、ｓａＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む生体分子に基づく）の非低温流通体系保存のために普及させることが可能であることが実証された。
【0237】
材料
ｍＰＥＧ－ＯＨ（Ｍｎ＝５，０００および２，０００）、ε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）、トルエン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、４％パラホルムアルデヒド溶液、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（赤）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ－２０は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ、塩化物塩）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％、ｗ／ｖ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンは、Ｇｉｂｃｏ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＤＭＥＭ培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＴ，ＵＳＡ）から入手した。ＲＮａｓｅ不含水、ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳ（１０×）およびＴＰＣＫ－トリプシンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＫ）から購入した。Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉｔはＡｂｂｅｘａから購入した。ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ＳｕｂｓｔｒａｔｅはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。ホタルルシフェラーゼｓａＲＮＡ、およびＣａｌ／０９ウイルスのＨ１赤血球凝集素をコードするｓａＲＮＡはいずれも、Ｓｔ Ｍａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＬｏｎｄｏｎのＲｏｂｉｎ Ｓｈａｔｔｏｃｋ教授のグループの厚意によって寄贈された。
ｍＰＥＧ－ＯＨ（Ｍｎ＝５，０００および２，０００）、ε－カプロラクトン（ε－ＣＬ）、トルエン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、４％パラホルムアルデヒド溶液、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（赤）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ－２０は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ、塩化物塩）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％、ｗ／ｖ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンは、Ｇｉｂｃｏ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍは、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびＤＭＥＭ培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＴ，ＵＳＡ）から入手した。ＲＮａｓｅ不含水、ＲＮａｓｅ不含ＰＢＳ（１０×）およびＴＰＣＫ－トリプシンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＫ）から購入した。Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ Ａｓｓａｙ ＫｉｔはＡｂｂｅｘａから購入した。ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ ＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ＳｕｂｓｔｒａｔｅはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入した。ホタルルシフェラーゼｓａＲＮＡ、およびＣａｌ／０９ウイルスのＨ１赤血球凝集素をコードするｓａＲＮＡはいずれも、Ｓｔ Ｍａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ＬｏｎｄｏｎのＲｏｂｉｎ Ｓｈａｔｔｏｃｋ教授のグループの厚意によって寄贈された。
【0238】
細胞培養
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞）細胞およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球細胞（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２（商標））は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトアビジンおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｒ１０培地）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地またはＯＰＴＩＭＥＭ培地のいずれかで培養した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。
ＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞）細胞およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞株）細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｗｅｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球細胞（Ｃｌｏｎｅ Ｅ６－１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２（商標））は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１００Ｕ ｍＬ－１ペニシリン、１００μｇ ｍＬ－１ストレプトアビジンおよび２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｒ１０培地）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地またはＯＰＴＩＭＥＭ培地のいずれかで培養した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内でインキュベートした。
【0239】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．；Ｌａｎｇｅ，Ｅ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｂ．；Ｖｏｓｓ，Ｄ．；Ｓｃｈｌａｋｅ，Ｔ．；Ｔｈｅｓｓ，Ａ．；Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｓｔｉｔｚ，Ｌ．；Ｋｒａｍｐｓ，Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，３０（１２），１２１０－６．
２．Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．；Ｖｏｓｓ，Ｄ．；Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｂａｕｍｈｏｆ，Ｐ．；Ｋｒａｍｐｓ，Ｔ．；Ｓｔｉｔｚ，Ｌ．，Ａｎ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｌｅｔｈａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｐｉｇｓ．ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ ２０１６，１０（６），ｅ０００４７４６．
３．Ｂｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｍ．；Ｏｏｓｔｅｒｍｅｉｊｅｒ，Ｈ．；Ｍｏｏｉｊ，Ｐ．；Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｇ．；Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒ，Ｅ．Ｊ．；Ｄａｖｉｓ，Ｄ．；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．；Ｂｒｉｔｏ，Ｌ．Ａ．；Ｃｕ，Ｙ．；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｋ．；Ｏｔｔｅｎ，Ｇ．Ｒ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｂ．；Ｄｅｙ，Ａ．；Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｓｈｅｎ，Ｘ．；Ｔｏｍａｒａｓ，Ｇ．Ｄ．；Ｌａｂｒａｎｃｈｅ，Ｃ．；Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．；Ｌｉａｏ，Ｈ．Ｘ．；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．；Ｇｅａｌｌ，Ａ．Ｊ．；Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１５，２１１（６），９４７－５５．
４．Ｐａｒｄｉ，Ｎ．；Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｅｌｃ，Ｒ．Ｓ．；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｈ．；ＤｅＭａｓｏ，Ｃ．Ｒ．；Ｄｏｗｄ，Ｋ．Ａ．；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｌ．Ｌ．；Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｒ．Ｍ．；Ｐａｒｋｓ，Ｒ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｗ．；Ｇｒａｎａｄｏｓ，Ａ．；Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ，Ｊ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｅ．；Ｙｕ，Ｊ．Ｓ．；ＭｃＧｅｅ，Ｃ．Ｅ．；Ｓｅｍｐｏｗｓｋｉ，Ｇ．Ｄ．；Ｍｕｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｊ．；Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ，Ｄ．；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｖ．Ｍ．；Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｈ．；Ｓａｈｕ，Ｓ．；Ｌｉｆｔｏｎ，Ｍ．；Ｈｉｇｇｓ，Ｓ．；Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．；Ｓａｎｔｒａ，Ｓ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．；Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｇ．；Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７，５４３（７６４４），２４８－２５１．
５．Ｃｈａｈａｌ，Ｊ．Ｓ．；Ｋｈａｎ，Ｏ．Ｆ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｌ．；ＭｃＰａｒｔｌａｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｔｓｏｓｉｅ，Ｊ．Ｋ．；Ｔｉｌｌｅｙ，Ｌ．Ｄ．；Ｓｉｄｉｋ，Ｓ．Ｍ．；Ｌｏｕｒｉｄｏ，Ｓ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｂａｖａｒｉ，Ｓ．；Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－ＲＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ Ｅｂｏｌａ，Ｈ１Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ａｎｄ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１６，１１３（２９），Ｅ４１３３－４２．
６．Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，Ｍ．；Ｐａｐａｃｈｒｉｓｔｏｆｉｌｏｕ，Ａ．；Ｗｅｉｓｓ，Ｃ．；Ｆｒｕｈ，Ｍ．；Ｃａｔｈｏｍａｓ，Ｒ．；Ｈｉｌｂｅ，Ｗ．；Ｗｅｈｌｅｒ，Ｔ．；Ｒｉｐｐｉｎ，Ｇ．；Ｋｏｃｈ，Ｓ．Ｄ．；Ｓｃｈｅｅｌ，Ｂ．；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．；Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．；Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｇｎａｄ－Ｖｏｇｔ，Ｕ．；Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓ，Ａ．，Ｐｈａｓｅ Ｉｂ ｓｔｕｄｙ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｍＲＮＡ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ（ＲＮＡｃｔｉｖｅ（Ｒ））ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ＩＶ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ ２０１４，１４，７４８．
７．Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．；Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｓｃｈｌａｋｅ，Ｔ．；Ｔｈｅｓｓ，Ａ．；Ｂａｕｍｈｏｆ，Ｐ．；Ｓｃｈｅｅｌ，Ｂ．；Ｋｏｃｈ，Ｓ．Ｄ．；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ＲＮＡｃｔｉｖｅ（（Ｒ））ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１３，９（１０），２２６３－７６．
８．Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．；Ｋｉｎｏｈ，Ｈ．；Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．；Ｍａｔｓｕｉ，Ａ．；Ｔｏｃｋａｒｙ，Ｔ．Ａ．；Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．Ｍ．；Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．；Ｏｓａｄａ，Ｋ．；Ｉｔａｋａ，Ｋ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｏｉｅｔｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１６，８２，２２１－２２８．
９．Ｏｂｅｒｌｉ，Ｍ．Ａ．；Ｒｅｉｃｈｍｕｔｈ，Ａ．Ｍ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏ．Ｓ．；Ｊａｋｌｅｎｅｃ，Ａ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１７，１７（３），１３２６－１３３５．
１０．Ｐａｒｄｉ，Ｎ．；Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｆ．Ｗ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ－ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１８，１７（４），２６１－２７９．
１１．Ｆｌｅｅｔｏｎ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｈｅｎ，Ｍ．；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐ．；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｇ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．；Ａｔｋｉｎｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ，ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ａ ｔｉｃｋｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００１，１８３（９），１３９５－８．
１２．Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．；Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．；Ｌｅｎｚｅｎ，Ｇ．；Ｍａｇｎｅ，Ｒ．；Ｇｏｍａｒｄ，Ｅ．；Ｇｕｉｌｌｅｔ，Ｊ．Ｇ．；Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｐ．；Ｍｅｕｌｉｅｎ，Ｐ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｔｒａｐｐｅｄ ｍＲＮＡ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３，２３（７），１７１９－２２．
１３．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｔ．；Ｌｕｆｔ，Ｄ．；Ａｂｒａｈａｍ，Ｍ．Ｋ．；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｓ．；Ｓａｌｉｎａｓ Ｍｅｄｉｎａ，Ｍ．Ｌ．；Ｋｕｒｚ，Ｊ．；Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｍ．；Ａｖｃｉ－Ａｄａｌｉ，Ｍ．；Ｓｃｈｌｅｎｓａｋ，Ｃ．；Ｐｅｔｅｒ，Ｋ．；Ｗｅｎｄｅｌ，Ｈ．Ｐ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｍｅｅｔ ｍＲＮＡ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｈｅｍｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１７，８，４５９－４６８．
１４．ＭｃＫｉｎｌａｙ，Ｃ．Ｊ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｎ．Ｌ．；Ｈａａｂｅｔｈ，Ｏ．Ａ．；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｒ．Ｍ．；Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ－ｖａｒｉｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ－ａｌｔｅｒｉｎｇ ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１８，１１５（２６），Ｅ５８５９－Ｅ５８６６．
１５．Ｚｏｕ，Ｙ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．；Ｙａｎｇ，Ｗ．；Ｍｅｎｇ，Ｆ．；Ｍｉｙａｔａ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．，Ｖｉｒｕｓ－Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ Ｂｏｏｓｔ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ ２０１７，２９（４２）．
１６．Ｋｉｍ，Ｙ．；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．；Ｐａｊｅｒｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｄ．；Ｃａｉ，Ｓ．；Ｓｅｎ，Ｓ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｈ．；Ｓｉｒｓｉ，Ｓ．Ｒ．；Ｌｕｔｚ，Ｇ．Ｊ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９，１３４（２），１３２－４０．
１７．Ｉｓｌａｍ，Ｍ．Ａ．；Ｘｕ，Ｙ．；Ｔａｏ，Ｗ．；Ｕｂｅｌｌａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｌｉｍ，Ｍ．；Ａｕｍ，Ｄ．；Ｌｅｅ，Ｇ．Ｙ．；Ｚｈｏｕ，Ｋ．；Ｚｏｐｅ，Ｈ．；Ｙｕ，Ｍ．；Ｃａｏ，Ｗ．；Ｏｓｗａｌｄ，Ｊ．Ｔ．；Ｄｉｎａｒｖａｎｄ，Ｍ．；Ｍａｈｍｏｕｄｉ，Ｍ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．；Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．；Ｚｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ｒ．；Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ－ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２０１８，２（１１），８５０－８６４．
１８．Ｇｕａｎ，Ｓ．；Ｍｕｎｄｅｒ，Ａ．；Ｈｅｄｔｆｅｌｄ，Ｓ．；Ｂｒａｕｂａｃｈ，Ｐ．；Ｇｌａｇｅ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；Ｌｉｅｎｅｎｋｌａｕｓ，Ｓ．；Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ａ．；Ｈａｓｅｎｐｕｓｃｈ，Ｇ．；Ｇａｒｒｅｌｓ，Ｗ．；Ｓｔａｎｋｅ，Ｆ．；Ｍｉｓｋｅｙ，Ｃ．；Ｊｏｈｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．；Ｋｕｍａｒ，Ｙ．；Ｔｕｍｍｌｅｒ，Ｂ．；Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃ．；Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．；Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９，１４（３），２８７－２９７．
１９．Ｓｉｚｏｖｓ，Ａ．；Ｘｕｅ，Ｌ．；Ｔｏｌｓｔｙｋａ，Ｚ．Ｐ．；Ｉｎｇｌｅ，Ｎ．Ｐ．；Ｗｕ，Ｙ．；Ｃｏｒｔｅｚ，Ｍ．；Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｏｌｙ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：ｓｕｇａｒ－ｃｏａｔｅｄ ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｌｅｘ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１３，１３５（４１），１５４１７－２４．
２０．Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｌ．；Ｄｒａｎｅ，Ｄ．；Ｇｏｗａｎｓ，Ｅ．Ｊ．，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ ＲＮＡ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００７，４３（５），６７５－６８１．
２１．Ｚｈａｏ，Ｐ．；Ｈｏｕ，Ｘ．；Ｙａｎ，Ｊ．；Ｄｕ，Ｓ．；Ｘｕｅ，Ｙ．；Ｌｉ，Ｗ．；Ｘｉａｎｇ，Ｇ．；Ｄｏｎｇ，Ｙ．，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏａｃｔ Ｍａｔｅｒ ２０２０，５（２），３５８－３６３．
２２．Ｓｈｕａｉ，Ｘ．；Ａｉ，Ｈ．；Ｎａｓｏｎｇｋｌａ，Ｎ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｇａｏ，Ｊ．，Ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）ａｎｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｆｏｒ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００４，９８（３），４１５－２６．
２３．ＬｏＰｒｅｓｔｉ，Ｃ．；Ｌｏｍａｓ，Ｈ．；Ｍａｓｓｉｇｎａｎｉ，Ｍ．；Ｓｍａｒｔ，Ｔ．；Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ：ｎａｔｕｒｅ ｉｎｓｐｉｒｅｄ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ｓｉｚｅｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９，１９（２２）．
２４．Ｍａｉ，Ｙ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ２０１２，４１（１８），５９６９－８５．
２５．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．；Ｆｅｉｊｅｎ，Ｊ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｄｅｓｉｇｎ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２，１６１（２），４７３－８３．
２６．Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｉｐｉｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｏ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒｄｅｒｉｎｇ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ２０１２，４（１９），５７７９－９１．
２７．Ｃｈｅｍｉｎ，Ｍ．；Ｂｒｕｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｌｅｃｏｍｍａｎｄｏｕｘ，Ｓ．；Ｓａｎｄｒｅ，Ｏ．；Ｌｅ Ｍｅｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ／ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｆｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１２，８（１０），２８６７－２８７４．
２８．Ｄａｏ，Ｔ．Ｐ．Ｔ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｆ．；Ｅｒ－Ｒａｆｉｋ，Ｍ．；Ｓａｌｖａ，Ｒ．；Ｓｃｈｍｕｔｚ，Ｍ．；Ｂｒｕｌｅｔ，Ａ．；Ｐｒｉｅｔｏ，Ｍ．；Ｓａｎｄｒｅ，Ｏ．；Ｌｅ Ｍｅｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｎｏｄｏｍａｉｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ／Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｃｓ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１５，４（２），１８２－１８６．
２９．Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．Ｍ．；Ｕｅｄａ，Ｍ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｔｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ｕｎｉｆｏｒｍ－Ｓｉｚｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１８，１４０（５１），１７９５６－１７９６１．
３０．Ｑｉｕ，Ｃ．；Ｈａｎ，Ｈ．Ｈ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｔ．；Ｗｅｉ，Ｗ．；Ｃｕｉ，Ｓ．Ｈ．；Ｃｈｅｎ，Ｘ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｂｙ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄｅｃｏｒａｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９，１０（１），２７０２．
３１．Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．；Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｋ．；Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏ．Ｓ．；Ｗｅｂｂｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ，Ｍ．Ｗ．；ＤｅＲｏｓａ，Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｕｎｇｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ２０１６，５５（４４），１３８０８－１３８１２．
１．Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．；Ｌａｎｇｅ，Ｅ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｂ．；Ｖｏｓｓ，Ｄ．；Ｓｃｈｌａｋｅ，Ｔ．；Ｔｈｅｓｓ，Ａ．；Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｓｔｉｔｚ，Ｌ．；Ｋｒａｍｐｓ，Ｔ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２，３０（１２），１２１０－６．
２．Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｖｏｇｅｌ，Ａ．Ｂ．；Ｖｏｓｓ，Ｄ．；Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｂａｕｍｈｏｆ，Ｐ．；Ｋｒａｍｐｓ，Ｔ．；Ｓｔｉｔｚ，Ｌ．，Ａｎ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｌｅｔｈａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｄｕｌｔ ａｎｄ Ｎｅｗｂｏｒｎ Ｐｉｇｓ．ＰＬｏＳ Ｎｅｇｌ Ｔｒｏｐ Ｄｉｓ ２０１６，１０（６），ｅ０００４７４６．
３．Ｂｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｍ．；Ｏｏｓｔｅｒｍｅｉｊｅｒ，Ｈ．；Ｍｏｏｉｊ，Ｐ．；Ｋｏｏｐｍａｎ，Ｇ．；Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒ，Ｅ．Ｊ．；Ｄａｖｉｓ，Ｄ．；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．；Ｂｒｉｔｏ，Ｌ．Ａ．；Ｃｕ，Ｙ．；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｋ．；Ｏｔｔｅｎ，Ｇ．Ｒ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｂ．；Ｄｅｙ，Ａ．；Ｈｅｅｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．；Ｓｈｅｎ，Ｘ．；Ｔｏｍａｒａｓ，Ｇ．Ｄ．；Ｌａｂｒａｎｃｈｅ，Ｃ．；Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，Ｄ．Ｃ．；Ｌｉａｏ，Ｈ．Ｘ．；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．；Ｇｅａｌｌ，Ａ．Ｊ．；Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｗ．，Ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＨＩＶ ｔｙｐｅ １ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｗｉｔｈ ａ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２０１５，２１１（６），９４７－５５．
４．Ｐａｒｄｉ，Ｎ．；Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｅｌｃ，Ｒ．Ｓ．；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｈ．；ＤｅＭａｓｏ，Ｃ．Ｒ．；Ｄｏｗｄ，Ｋ．Ａ．；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｌ．Ｌ．；Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｒ．Ｍ．；Ｐａｒｋｓ，Ｒ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｗ．；Ｇｒａｎａｄｏｓ，Ａ．；Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ，Ｊ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｅ．；Ｙｕ，Ｊ．Ｓ．；ＭｃＧｅｅ，Ｃ．Ｅ．；Ｓｅｍｐｏｗｓｋｉ，Ｇ．Ｄ．；Ｍｕｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｊ．；Ｖａｎｌａｎｄｉｎｇｈａｍ，Ｄ．；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｖ．Ｍ．；Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｈ．；Ｓａｈｕ，Ｓ．；Ｌｉｆｔｏｎ，Ｍ．；Ｈｉｇｇｓ，Ｓ．；Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．；Ｓａｎｔｒａ，Ｓ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．；Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｇ．；Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．；Ｈａｙｎｅｓ，Ｂ．Ｆ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，Ｚｉｋａ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７，５４３（７６４４），２４８－２５１．
５．Ｃｈａｈａｌ，Ｊ．Ｓ．；Ｋｈａｎ，Ｏ．Ｆ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｃ．Ｌ．；ＭｃＰａｒｔｌａｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｔｓｏｓｉｅ，Ｊ．Ｋ．；Ｔｉｌｌｅｙ，Ｌ．Ｄ．；Ｓｉｄｉｋ，Ｓ．Ｍ．；Ｌｏｕｒｉｄｏ，Ｓ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｂａｖａｒｉ，Ｓ．；Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－ＲＮＡ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ Ｅｂｏｌａ，Ｈ１Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ａｎｄ Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１６，１１３（２９），Ｅ４１３３－４２．
６．Ｓｅｂａｓｔｉａｎ，Ｍ．；Ｐａｐａｃｈｒｉｓｔｏｆｉｌｏｕ，Ａ．；Ｗｅｉｓｓ，Ｃ．；Ｆｒｕｈ，Ｍ．；Ｃａｔｈｏｍａｓ，Ｒ．；Ｈｉｌｂｅ，Ｗ．；Ｗｅｈｌｅｒ，Ｔ．；Ｒｉｐｐｉｎ，Ｇ．；Ｋｏｃｈ，Ｓ．Ｄ．；Ｓｃｈｅｅｌ，Ｂ．；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．；Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．；Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｇｎａｄ－Ｖｏｇｔ，Ｕ．；Ｚｉｐｐｅｌｉｕｓ，Ａ．，Ｐｈａｓｅ Ｉｂ ｓｔｕｄｙ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｍＲＮＡ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ（ＲＮＡｃｔｉｖｅ（Ｒ））ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｌｏｃａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｓ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｇｅ ＩＶ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ ｃａｎｃｅｒ ２０１４，１４，７４８．
７．Ｋａｌｌｅｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，Ｒ．；Ｓｃｈｎｅｅ，Ｍ．；Ｐｅｔｓｃｈ，Ｂ．；Ｓｃｈｌａｋｅ，Ｔ．；Ｔｈｅｓｓ，Ａ．；Ｂａｕｍｈｏｆ，Ｐ．；Ｓｃｈｅｅｌ，Ｂ．；Ｋｏｃｈ，Ｓ．Ｄ．；Ｆｏｔｉｎ－Ｍｌｅｃｚｅｋ，Ｍ．，Ａ ｎｏｖｅｌ，ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ＲＮＡｃｔｉｖｅ（（Ｒ））ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１３，９（１０），２２６３－７６．
８．Ｕｃｈｉｄａ，Ｓ．；Ｋｉｎｏｈ，Ｈ．；Ｉｓｈｉｉ，Ｔ．；Ｍａｔｓｕｉ，Ａ．；Ｔｏｃｋａｒｙ，Ｔ．Ａ．；Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．Ｍ．；Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．；Ｏｓａｄａ，Ｋ．；Ｉｔａｋａ，Ｋ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｐｌｅｘ ｎａｎｏｍｉｃｅｌｌｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｍｏｉｅｔｙ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１６，８２，２２１－２２８．
９．Ｏｂｅｒｌｉ，Ｍ．Ａ．；Ｒｅｉｃｈｍｕｔｈ，Ａ．Ｍ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏ．Ｓ．；Ｊａｋｌｅｎｅｃ，Ａ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｂｌａｎｋｓｃｈｔｅｉｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓｉｓｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ ２０１７，１７（３），１３２６－１３３５．
１０．Ｐａｒｄｉ，Ｎ．；Ｈｏｇａｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｆ．Ｗ．；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｄ．，ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ－ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１８，１７（４），２６１－２７９．
１１．Ｆｌｅｅｔｏｎ，Ｍ．Ｎ．；Ｃｈｅｎ，Ｍ．；Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｐ．；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｇ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．；Ａｔｋｉｎｓ，Ｇ．Ｊ．；Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｐ．，Ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｌｉｃｉｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ，ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ，ａｎｄ ａ ｔｉｃｋｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００１，１８３（９），１３９５－８．
１２．Ｍａｒｔｉｎｏｎ，Ｆ．；Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．；Ｌｅｎｚｅｎ，Ｇ．；Ｍａｇｎｅ，Ｒ．；Ｇｏｍａｒｄ，Ｅ．；Ｇｕｉｌｌｅｔ，Ｊ．Ｇ．；Ｌｅｖｙ，Ｊ．Ｐ．；Ｍｅｕｌｉｅｎ，Ｐ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｔｒａｐｐｅｄ ｍＲＮＡ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３，２３（７），１７１９－２２．
１３．Ｍｉｃｈｅｌ，Ｔ．；Ｌｕｆｔ，Ｄ．；Ａｂｒａｈａｍ，Ｍ．Ｋ．；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｓ．；Ｓａｌｉｎａｓ Ｍｅｄｉｎａ，Ｍ．Ｌ．；Ｋｕｒｚ，Ｊ．；Ｓｃｈａｌｌｅｒ，Ｍ．；Ａｖｃｉ－Ａｄａｌｉ，Ｍ．；Ｓｃｈｌｅｎｓａｋ，Ｃ．；Ｐｅｔｅｒ，Ｋ．；Ｗｅｎｄｅｌ，Ｈ．Ｐ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｍｅｅｔ ｍＲＮＡ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ Ｕｓｉｎｇ Ｈｅｍｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ Ｓｔａｂｌｅ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１７，８，４５９－４６８．
１４．ＭｃＫｉｎｌａｙ，Ｃ．Ｊ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｎ．Ｌ．；Ｈａａｂｅｔｈ，Ｏ．Ａ．；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｒ．Ｍ．；Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｌｉｐｉｄ－ｖａｒｉｅｄ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｃｈａｒｇｅ－ａｌｔｅｒｉｎｇ ｒｅｌｅａｓａｂｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１８，１１５（２６），Ｅ５８５９－Ｅ５８６６．
１５．Ｚｏｕ，Ｙ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｍ．；Ｙａｎｇ，Ｗ．；Ｍｅｎｇ，Ｆ．；Ｍｉｙａｔａ，Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｈ．Ｊ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｋ．；Ｚｈｏｎｇ，Ｚ．，Ｖｉｒｕｓ－Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ Ｂｏｏｓｔ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ ２０１７，２９（４２）．
１６．Ｋｉｍ，Ｙ．；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．；Ｐａｊｅｒｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｄ．；Ｃａｉ，Ｓ．；Ｓｅｎ，Ｓ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｈ．；Ｓｉｒｓｉ，Ｓ．Ｒ．；Ｌｕｔｚ，Ｇ．Ｊ．；Ｄｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００９，１３４（２），１３２－４０．
１７．Ｉｓｌａｍ，Ｍ．Ａ．；Ｘｕ，Ｙ．；Ｔａｏ，Ｗ．；Ｕｂｅｌｌａｃｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．；Ｌｉｍ，Ｍ．；Ａｕｍ，Ｄ．；Ｌｅｅ，Ｇ．Ｙ．；Ｚｈｏｕ，Ｋ．；Ｚｏｐｅ，Ｈ．；Ｙｕ，Ｍ．；Ｃａｏ，Ｗ．；Ｏｓｗａｌｄ，Ｊ．Ｔ．；Ｄｉｎａｒｖａｎｄ，Ｍ．；Ｍａｈｍｏｕｄｉ，Ｍ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．；Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．；Ｚｅｔｔｅｒ，Ｂ．Ｒ．；Ｓｈｉ，Ｊ．，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ－ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＰＴＥＮ ｍＲＮＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２０１８，２（１１），８５０－８６４．
１８．Ｇｕａｎ，Ｓ．；Ｍｕｎｄｅｒ，Ａ．；Ｈｅｄｔｆｅｌｄ，Ｓ．；Ｂｒａｕｂａｃｈ，Ｐ．；Ｇｌａｇｅ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；Ｌｉｅｎｅｎｋｌａｕｓ，Ｓ．；Ｓｃｈｕｌｔｚｅ，Ａ．；Ｈａｓｅｎｐｕｓｃｈ，Ｇ．；Ｇａｒｒｅｌｓ，Ｗ．；Ｓｔａｎｋｅ，Ｆ．；Ｍｉｓｋｅｙ，Ｃ．；Ｊｏｈｌｅｒ，Ｓ．Ｍ．；Ｋｕｍａｒ，Ｙ．；Ｔｕｍｍｌｅｒ，Ｂ．；Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃ．；Ｉｖｉｃｓ，Ｚ．；Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９，１４（３），２８７－２９７．
１９．Ｓｉｚｏｖｓ，Ａ．；Ｘｕｅ，Ｌ．；Ｔｏｌｓｔｙｋａ，Ｚ．Ｐ．；Ｉｎｇｌｅ，Ｎ．Ｐ．；Ｗｕ，Ｙ．；Ｃｏｒｔｅｚ，Ｍ．；Ｒｅｉｎｅｋｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｏｌｙ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）：ｓｕｇａｒ－ｃｏａｔｅｄ ｎａｎｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｌｅｘ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１３，１３５（４１），１５４１７－２４．
２０．Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．Ｌ．；Ｄｒａｎｅ，Ｄ．；Ｇｏｗａｎｓ，Ｅ．Ｊ．，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ ＲＮＡ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００７，４３（５），６７５－６８１．
２１．Ｚｈａｏ，Ｐ．；Ｈｏｕ，Ｘ．；Ｙａｎ，Ｊ．；Ｄｕ，Ｓ．；Ｘｕｅ，Ｙ．；Ｌｉ，Ｗ．；Ｘｉａｎｇ，Ｇ．；Ｄｏｎｇ，Ｙ．，Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏａｃｔ Ｍａｔｅｒ ２０２０，５（２），３５８－３６３．
２２．Ｓｈｕａｉ，Ｘ．；Ａｉ，Ｈ．；Ｎａｓｏｎｇｋｌａ，Ｎ．；Ｋｉｍ，Ｓ．；Ｇａｏ，Ｊ．，Ｍｉｃｅｌｌａｒ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）ａｎｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｆｏｒ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００４，９８（３），４１５－２６．
２３．ＬｏＰｒｅｓｔｉ，Ｃ．；Ｌｏｍａｓ，Ｈ．；Ｍａｓｓｉｇｎａｎｉ，Ｍ．；Ｓｍａｒｔ，Ｔ．；Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｇ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ：ｎａｔｕｒｅ ｉｎｓｐｉｒｅｄ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ｓｉｚｅｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９，１９（２２）．
２４．Ｍａｉ，Ｙ．；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ２０１２，４１（１８），５９６９－８５．
２５．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．；Ｆｅｉｊｅｎ，Ｊ．，Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｄｅｓｉｇｎ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２，１６１（２），４７３－８３．
２６．Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｃ．Ｖ．，Ｌｉｐｉｄ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｏ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒｄｅｒｉｎｇ．Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ２０１２，４（１９），５７７９－９１．
２７．Ｃｈｅｍｉｎ，Ｍ．；Ｂｒｕｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｌｅｃｏｍｍａｎｄｏｕｘ，Ｓ．；Ｓａｎｄｒｅ，Ｏ．；Ｌｅ Ｍｅｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ／ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ｆｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１２，８（１０），２８６７－２８７４．
２８．Ｄａｏ，Ｔ．Ｐ．Ｔ．；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｆ．；Ｅｒ－Ｒａｆｉｋ，Ｍ．；Ｓａｌｖａ，Ｒ．；Ｓｃｈｍｕｔｚ，Ｍ．；Ｂｒｕｌｅｔ，Ａ．；Ｐｒｉｅｔｏ，Ｍ．；Ｓａｎｄｒｅ，Ｏ．；Ｌｅ Ｍｅｉｎｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｎｏｄｏｍａｉｎ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ／Ｌｉｐｉｄ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ａｃｓ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１５，４（２），１８２－１８６．
２９．Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．Ｍ．；Ｕｅｄａ，Ｍ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．；Ｉｔｏ，Ｙ．，Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｔｉｎｇ Ｌｉｐｉｄ Ｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ｕｎｉｆｏｒｍ－Ｓｉｚｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１８，１４０（５１），１７９５６－１７９６１．
３０．Ｑｉｕ，Ｃ．；Ｈａｎ，Ｈ．Ｈ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｔ．；Ｗｅｉ，Ｗ．；Ｃｕｉ，Ｓ．Ｈ．；Ｃｈｅｎ，Ｘ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．；Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｂｙ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｄｅｃｏｒａｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１９，１０（１），２７０２．
３１．Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．；Ｐａｔｅｌ，Ａ．Ｋ．；Ｋａｕｆｆｍａｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏ．Ｓ．；Ｗｅｂｂｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｈｅａｒｔｌｅｉｎ，Ｍ．Ｗ．；ＤｅＲｏｓａ，Ｆ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｕｎｇｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ２０１６，５５（４４），１３８０８－１３８１２．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【国際調査報告】