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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】抗ＴＧＦ－ベータ抗体製剤およびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240621BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240621BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240621BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 T
A61P35/00
A61K9/08
A61K47/26
A61K47/18
A61P35/02
C07K16/24 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577310
(86)(22)【出願日】2022-06-17
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 US2022034103
(87)【国際公開番号】W WO2022266510
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/212,473
(32)【優先日】2021-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500034653
【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100127926
【弁理士】
【氏名又は名称】結田 純次
(74)【代理人】
【識別番号】100140132
【弁理士】
【氏名又は名称】竹林 則幸
(74)【代理人】
【識別番号】100216105
【弁理士】
【氏名又は名称】守安 智
(72)【発明者】
【氏名】キラン・ラナ・バンガリ
(72)【発明者】
【氏名】ラミル・ラティポフ
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー・マッコイ
(72)【発明者】
【氏名】サンケット・パッケ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB13
4C076CC27
4C076DD38
4C076DD46
4C076DD51
4C085AA14
4C085CC23
4C085DD61
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
(57)【要約】
本開示は、抗ＴＧＦ－β抗体を含む医薬組成物およびそれらの使用の方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬組成物であって、組成物は、配列番号１の１～１２０残基に相当する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列および配列番号２の１～１０８残基に相当する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配を含む抗ＴＧＦβ抗体２０～２００ｍｇ／ｍｌ、
１０～５０ｍＭ酢酸、場合により２５ｍＭ酢酸、および
５～１５％ｗ／ｖスクロース、場合により８％ｗ／ｖスクロース
を含む水溶液であり、溶液はｐＨ５．０±０．２または５．０±０．３である、医薬組成物。
【請求項2】
抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
界面活性剤をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
界面活性剤は、ポリソルベート、場合によりポリソルベート８０（ＰＳ８０）である、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
ＰＳ８０は、０．０１～０．１０％ｗ／ｖ、場合により０．０６％ｗ／ｖの濃度である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
抗ＴＧＦβ抗体は、４０～１８０ｍｇ／ｍｌ、場合により５０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
場合によりＥＤＴＡおよびＤＰＴＡから選択されるキレート剤をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
キレート剤は、０～２０μＭ、場合により１０μＭの濃度である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
水溶液は、ｐＨ４．７～５．３である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項10】
抗ＴＧＦβ抗体５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸、
１０μＭ ＥＤＴＡ、
０．０６％ＰＳ８０、および
８％ｗ／ｖスクロース
を含み、ｐＨ５．０±０．３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
バイアルおよび使用説明書を含む製品であって、バイアルは約１６ｍｌの請求項１１に記載の組成物を含有する、製品。
【請求項13】
それを必要としている患者においてがんを処置する方法であって、治療有効量の請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項14】
さらなる抗がん治療を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
組成物は、５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇの用量で、場合により隔週、静脈内に投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法でのそれを必要としている患者の処置における使用のための組成物。
【請求項17】
請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法でのそれを必要としている患者の処置のための薬剤の製造のための請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１８日に出願した米国仮出願第６３／２１２，４７３号の優先権を主張するものである。この優先権出願の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
配列表
本出願は、２０２１年６月１８日に出願した米国仮出願第６３／２１２，４７３号の優先権を主張するものである。この優先権出願の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
配列表
【0002】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に出願され、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、配列表を含む。２０２２年６月１７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０６４＿ＳＬ.ｔｘｔと名付けられ、サイズは１９，４３７バイトである。
【背景技術】
【0003】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、増殖、分化、生存、遊走、および上皮間葉転換を含む多くの重要な細胞の機能を制御するサイトカインである。それは、細胞外マトリックス形成、創傷治癒、胚発生、骨発生、造血、免疫および炎症応答、および悪性形質転換のような種々の生物学的プロセスを調節する。ＴＧＦ－βの調節解除は、病的状態、例えば先天性欠損、がん、慢性炎症、ならびに自己免疫および線維性疾患をもたらす。
【0004】
ＴＧＦ－βは、公知の３つのアイソフォーム－ＴＧＦ－β１、２、および３がある。３つのアイソフォーム全てが、最初に前駆ペプチドとして転写される。切断後、成熟Ｃ末端はＮ末端と結合したままであり（潜在関連ペプチドまたはＬＡＰと呼ばれる）、細胞から分泌される小さい潜在型複合体（ＳＬＣ）を形成する。ＳＬＣがＴＧＦ－β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）に結合できないために、受容体エンゲージメントが妨げられる。Ｎ－およびＣ－末端の解離による活性化は、タンパク質切断、酸性ｐＨ、またはインテグリン構造変化（非特許文献１）を含む、いくつかのメカニズムの１つによって生じる。
【0005】
ＴＧＦ－β１、２および３は、その機能が多面的であり、細胞および組織型にわたって異なるパターンで発現される。それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性が類似しているが、特定の細胞型における個々のノックアウトは、それらが同じ受容体に結合する能力を共有するにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏでの同一ではない役割を示唆する（非特許文献２）。ＴＧＦ－βがＴＧＦβＲＩＩに結合すると、受容体の構成的なキナーゼ活性は、ＴＧＦ－β受容体Ｉ(ＴＧＦβＲＩ)をリン酸化および活性化し、ＳＭＡＤ２／３をリン酸化し、ＳＭＡＤ４への結合、核への局在、およびＴＧＦ－β応答遺伝子の転写を可能にする。同文献。この古典的シグナル伝達カスケードに加えて、非古典的な経路は、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＪＵＮ、ＪＮＫ、およびＮＦ－κＢを含む他の因子を介してシグナルを伝達する。ＴＧＦ－βシグナル伝達もまた、ＷＮＴ、ヘッジホッグ、ノッチ、ＩＮＦ、ＴＮＦ、およびＲＡＳを含む他の経路によって調節される。したがって、ＴＧＦ－βシグナル伝達の最終結果は、細胞の状態および環境を統合するこれらのシグナル伝達経路の全てのクロストークである。同文献。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Connolly et al., Int J Biol Sci. (2012) 8(7):964-78
【非特許文献2】Akhurst et al., Nat Rev Drug Discov. (2012) 11(10):790-811
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＴＧＦ－βには多様な機能があるので、有効な汎ＴＧＦ－β特異的抗体治療の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、抗ＴＧＦ－β抗体を含む医薬組成物を提供する。一態様では、本開示は、医薬組成物であって、組成物は、配列番号１の１～１２０残基に相当する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）アミノ酸配列および配列番号２の１～１０８残基に相当する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）アミノ酸配列を含む抗ＴＧＦβ抗体２０～２００ｍｇ／ｍｌ、１０～５０ｍＭ酢酸、場合により２５ｍＭ酢酸、および５～１５％ｗ／ｖスクロース、場合により８％ｗ／ｖスクロースを含む水溶液であり、水溶液はｐＨ５．０±０．２または５．０±０．３である、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ４．７～５．３の水溶液である。
【0009】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、４０～１８０ｍｇ／ｍｌ、場合により５０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【0011】
いくつかの実施形態では、組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０（ＰＳ８０））を含む。特定の実施形態では、組成物は、０．０１～０．１０％ｗ／ｖ、場合により０．０６％ｗ／ｖの濃度のＰＳ８０を含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、組成物は、場合によりＥＤＴＡおよびＤＰＴＡから選択されるキレート剤を含む。ある特定の実施形態では、キレート剤は、０～２０μＭ、場合により１０μＭの濃度である。
【0013】
特定の実施形態では、組成物は、抗ＴＧＦβ抗体５０ｍｇ／ｍｌ、７５ｍｇ／ｍｌ、または１５０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸、１０μＭ ＥＤＴＡ、０．０６％ＰＳ８０、および８％ｗ／ｖスクロースを含み、ｐＨ５．０±０．３である。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１に記載の重鎖アミノ酸配列（Ｃ末端リジン有りまたは無し）および配列番号２に記載の軽鎖アミノ酸配列を含む。
【0014】
本開示は、バイアルおよび使用説明書を含む製品であって、バイアルは約１６ｍｌの本組成物を含有する製品も提供する。
【0015】
本明細書では、治療有効量の本組成物を患者に投与する工程を含む、それを必要としている患者においてがんを処置する方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、さらなる抗がん治療を投与する工程をさらに含む。特定の実施形態では、組成物は、５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇの用量で、場合により隔週、静脈内に投与される。本開示は、これらの方法でのそれを必要としている患者の処置における使用のための本組成物および本開示の処置方法でのそれを必要としている患者の処置のための薬剤の製造のための本組成物の使用も提供する。
【0016】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、例示のためだけであり、制限ではないことが理解されるであろう。本発明の範囲内の様々な変更および改変は、詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ｐＨ範囲でのＡｂ１ ８０ｍｇ／ｍｌの酢酸またはヒスチジン緩衝液製剤中のタンパク石濁の程度を示す写真である。
【図2-1】図２Ａ～Ｃは、５℃、２５℃、または４０℃での４週間にわたる保存での酢酸およびヒスチジン製剤中の２μｍ（図２Ａ）、１０μｍ（図２Ｂ）、および２５μｍ（図２Ｃ）の肉眼では見えない粒子の進化を示す棒グラフのパネルである。
【図3】調製後すぐ（Ｔ０）および４０℃での保存の４週間後の酢酸およびヒスチジン製剤の粘度値（センチポイズ（ｃＰ））を示す棒グラフである。
【図5】Ｔ０ならびに５℃、２５℃、および４０℃での保存の４週間後の酢酸（ｐＨ４．７、５、および５．５）およびヒスチジン（ｐＨ５．５、６、および６．５）の吸光度値（３４０～３６０ｎｍ）を示す散布図である。
【図6-1】５℃での２週間にわたる保存（上－左のパネル）、４０℃での２週間にわたる保存（上－右のパネル）、４８時間の厳密な撹拌（下－左のパネル）、および－３０℃から室温での凍結／融解（ＦＴ）サイクル（下－右のパネル）の、異なるポリソルベート（ＰＳ８０）濃度での製剤中のＨＭＷＳ進化を示すグラフのパネルである。ＳＲ＿＃またはＣｈ＿＃：＃は、ＰＳ８０の％濃度である。ＳＲおよびＣｈは、ＰＳ８０の２つの異なるベンダーを表す。
【図7A-1】ポリオレフィン（ＰＯ）またはポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）ＩＶバッグ中の生理食塩水またはデキストロースに希釈後のＡｂ１濃度を示す一対の棒グラフである。
【図7B-1】ＰＯまたはＰＶＣ ＩＶバッグ中の生理食塩水（Ｓ）またはデキストロース（Ｄ）に希釈後の肉眼では見えない（≧１０μｍ）粒子を示す一対の棒グラフである。Ｔ０：ゼロ時間。Ｔ２４：２４時間。Ｔ４８：４８時間。
【図9-1】金属添加Ａｂ１製剤におけるＭ２５２酸化（左のパネル）およびＨＭＷＳ％（右のパネル）進化を示す一対のグラフである。
【図10-1】４０℃での１カ月保存（左のパネル）または２５℃での３カ月保存後、様々な製剤におけるＨＭＷＳおよび亜種進化を示す一対の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本開示は、水溶液中に汎ＴＧＦ－β特異的モノクローナル抗体を含む安定な医薬組成物を提供する。そのような抗体の１つはＡｂ１である。Ａｂ１は、ヒトＴＧＦ－βの３つアイソフォーム全て（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、およびＴＧＦ－β３）を標的とし、配列番号１の重鎖アミノ酸配列および配列番号２の軽鎖アミノ酸配列を有するＩｇＧ４モノクローナル抗体である。
【0019】
モノクローナル抗体の治療の成功は、一部には、抗体薬候補の製造可能性、安定性、および送達特性による。溶液の好ましくない挙動、例えば高い溶液の粘度またはタンパク石濁は、抗体薬の開発可能性に大きく影響する。Ａｂ１の製剤研究は、この抗体が表面活性であり、溶液撹拌時または他の界面ストレス条件下で、肉眼では見えないおよび目視できる粒子を形成する傾向が高いことを示した。本発明者らは、およそ５．０の酸性ｐＨを有する酢酸緩衝液に基づく本製剤が、粒子形成の減少を含めて、保存および輸送中の製剤の安定性を著しく改善することを発見した。本発明者らは、Ａｂ１が、高いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）でのタンパク石濁および好ましくないコロイド安定性のような望ましくない溶液挙動を示すことを発見した。本発明者らは、溶液中の粒子形成が界面活性剤の添加によってさらに軽減され、キレート剤の包括が製剤の改善も助けることも発見した。
【0020】
Ｉ．汎特異的抗ＴＧＦβモノクローナル抗体
本明細書で製剤化されるモノクローナル抗体は、Ａｂ１に相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。そのような抗体は、本明細書ではまとめて「Ａｂ１関連抗体」と呼ばれ、Ａｂ１自体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む完全ヒト抗体である。さらなる実施形態では（例えば、Ａｂ１）、ヒトＩｇＧ４定常領域は、２２８位（ＥＵナンバリング）に突然変異を有する。いくつかの実施形態では（例えば、Ａｂ１）、突然変異は、セリンからプロリンへの突然変異である（Ｓ２２８Ｐ）。
本明細書で製剤化されるモノクローナル抗体は、Ａｂ１に相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。そのような抗体は、本明細書ではまとめて「Ａｂ１関連抗体」と呼ばれ、Ａｂ１自体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域およびヒトκ軽鎖定常領域を含む完全ヒト抗体である。さらなる実施形態では（例えば、Ａｂ１）、ヒトＩｇＧ４定常領域は、２２８位（ＥＵナンバリング）に突然変異を有する。いくつかの実施形態では（例えば、Ａｂ１）、突然変異は、セリンからプロリンへの突然変異である（Ｓ２２８Ｐ）。
【0021】
Ａｂ１の重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２として以下に示す。Ｓ２２８Ｐ位は、配列番号１の配列において四角内およびボールド体である。可変ドメインはイタリック体である。ＣＤＲは四角内に示す。重鎖の定常ドメイン内のグリコシル化部位はボールド体である（Ｎ２９７）。
【0022】
【化1】
【0023】
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、上記のＣＤＲを有する抗体（例えば、ヒト抗体）を有する。すなわち、抗体は、以下の重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列：
ＨＣＤＲ１ ＳＮＶＩＳ（配列番号３）
ＨＣＤＲ２ ＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧ（配列番号４）
ＨＣＤＲ３ ＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹ（配列番号５）
ＬＣＤＲ１ ＲＡＳＱＳＬＧ ＳＳＹＬＡ（配列番号６）
ＬＣＤＲ２ ＧＡＳＳＲＡＰ（配列番号７）
ＬＣＤＲ３ ＱＱＹＡＤＳＰＩＴ（配列番号８）
を有する。したがって、抗体は、配列番号３、４、５、６、７、および８を含み得る。
ＨＣＤＲ１ ＳＮＶＩＳ（配列番号３）
ＨＣＤＲ２ ＧＶＩＰＩＶＤＩＡＮＹＡＱＲＦＫＧ（配列番号４）
ＨＣＤＲ３ ＴＬＧＬＶＬＤＡＭＤＹ（配列番号５）
ＬＣＤＲ１ ＲＡＳＱＳＬＧ ＳＳＹＬＡ（配列番号６）
ＬＣＤＲ２ ＧＡＳＳＲＡＰ（配列番号７）
ＬＣＤＲ３ ＱＱＹＡＤＳＰＩＴ（配列番号８）
を有する。したがって、抗体は、配列番号３、４、５、６、７、および８を含み得る。
【0024】
さらなる実施形態では、抗体は、上記の重鎖可変ドメイン（配列番号１のアミノ酸１～１２０）および軽鎖可変ドメイン（配列番号２のアミノ酸１～１０８）を有する。ある特定の実施形態では、本明細書で製剤化される抗体は、重鎖にＣ末端リジンを持たない。
【0025】
特定の実施形態では、本明細書で製剤化される抗体は、Ａｂ１である。Ａｂ１は、非グリコシル化の場合、推定分子量１４４ＫＤａである。Ａｂ１は、質量分析によって決定した場合、分子量１４７．０１１ｋＤａ、理論実験等電点（ｐＩ）６．７８、および実験ｐＩ 約５．９～７．１を有する。
【0026】
ＩＩ．抗体を作製する方法
Ａｂ１－関連抗体は、当技術分野で十分に確立された方法によって作製される。抗体の重および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子が転写および翻訳制御配列のような必要な発現制御配列に操作可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスのような植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列は、別々のベクターに挿入され、同じまたは異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。一実施形態では、両方のコード配列は同じ発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）に、別々の同じ発現制御配列（例えば、プロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。抗体コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的な制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。
Ａｂ１－関連抗体は、当技術分野で十分に確立された方法によって作製される。抗体の重および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、遺伝子が転写および翻訳制御配列のような必要な発現制御配列に操作可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスのような植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。抗体軽鎖コード配列および抗体重鎖コード配列は、別々のベクターに挿入され、同じまたは異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。一実施形態では、両方のコード配列は同じ発現ベクターに挿入され、同じ発現制御配列（例えば、共通のプロモーター）に、別々の同じ発現制御配列（例えば、プロモーター）に、または異なる発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。抗体コード配列は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的な制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。
【0027】
抗体鎖遺伝子に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有していてよい。哺乳動物宿主細胞発現の調節配列の例は、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーのような）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーのような）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターのような強力な哺乳動物プロモーター由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーのような哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。
【0028】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子のようなさらなる配列を有し得る。例えば、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートのような薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅によるｄｈｆｒ宿主細胞における使用のための）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）、およびグルタミン酸合成遺伝子を含み得る。
【0029】
本開示の抗体をコードする発現ベクターは、発現のため宿主細胞に導入される。宿主細胞は、抗体の発現に好適な条件下で培養され、次いで回収および単離される。宿主細胞は、哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞を含む。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当技術分野で周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系を含む。これらは、特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞系を含む。細胞系は、それらの発現レベルに基づいて選択される。使用される他の細胞系は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞系である。
【0030】
さらに、抗体の発現は、多くの公知の技術を使用して増強される。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現システム（ＧＳシステム）は、特定の条件下で発現を増強する一般的な手法である。
【0031】
宿主細胞の組織培養培地は、ウシ血清アルブミンのような動物由来成分（ＡＤＣ）を含むまたは含まない。いくつかの実施形態では、無ＡＤＣ培養培地が、ヒトの安全性のために好ましい。組織培養は、フェドバッチ法、連続的灌流法、または宿主細胞および所望の収率に適した任意の他の方法を使用して実施される。
【0032】
ＩＩＩ．抗体製剤
本製剤は、Ａｂ１を含む、Ａｂ１関連抗ＴＧＦ－β抗体に優れた安定性を付与する。「安定」または「安定性」は、保存中、および／または物理的もしくは化学的ストレスにかけられた場合の、その物理的安定性、化学的安定性、および／または生物学的活性を保持する組成物中の抗体の能力を指す。安定性は、選択された温度、例えば、凍結条件下（例えば、－７０℃～－３０℃）、冷蔵条件下（例えば、２～８℃）、または室温（例えば、２３～２５℃）で、選択された期間、例えば１６週間、２４週間、３６週間、４カ月、６カ月、１年、２年、３年、またはそれ以上の文脈である。タンパク質の安定性は、より短い期間内で実施されるアッセイで測定されるが、その結果は臨床背景での安定性の指標である。そのようなアッセイは、タンパク質組成物が１回またはそれ以上の凍結融解サイクルにかけられる凍結／融解サイクリングアッセイ；またはタンパク質組成物が、事前に決定した期間にわたる機械撹拌処置にかけられる撹拌アッセイを含む。タンパク質安定性は、選択された期間にわたり指定した保存温度（例えば２～８℃）でタンパク質組成物を保存し、二量体化または凝集（例えばサイズ排除ＨＰＬＣまたはタンパク質ゲルによって測定する）の程度、タンパク質分解（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣまたはタンパク質ゲルによって測定する）、組成物の色変化、液体組成物の透明度、酵素活性、グリカン含量および組成物、受容体結合親和性、メチオニン残基酸化、および組成物の生物学的活性のような、その構造および機能特性を解析することによって決定される。抗体製剤の安定性を調べるための方法のより詳細な説明について、以下の実施例も参照されたい。
本製剤は、Ａｂ１を含む、Ａｂ１関連抗ＴＧＦ－β抗体に優れた安定性を付与する。「安定」または「安定性」は、保存中、および／または物理的もしくは化学的ストレスにかけられた場合の、その物理的安定性、化学的安定性、および／または生物学的活性を保持する組成物中の抗体の能力を指す。安定性は、選択された温度、例えば、凍結条件下（例えば、－７０℃～－３０℃）、冷蔵条件下（例えば、２～８℃）、または室温（例えば、２３～２５℃）で、選択された期間、例えば１６週間、２４週間、３６週間、４カ月、６カ月、１年、２年、３年、またはそれ以上の文脈である。タンパク質の安定性は、より短い期間内で実施されるアッセイで測定されるが、その結果は臨床背景での安定性の指標である。そのようなアッセイは、タンパク質組成物が１回またはそれ以上の凍結融解サイクルにかけられる凍結／融解サイクリングアッセイ；またはタンパク質組成物が、事前に決定した期間にわたる機械撹拌処置にかけられる撹拌アッセイを含む。タンパク質安定性は、選択された期間にわたり指定した保存温度（例えば２～８℃）でタンパク質組成物を保存し、二量体化または凝集（例えばサイズ排除ＨＰＬＣまたはタンパク質ゲルによって測定する）の程度、タンパク質分解（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣまたはタンパク質ゲルによって測定する）、組成物の色変化、液体組成物の透明度、酵素活性、グリカン含量および組成物、受容体結合親和性、メチオニン残基酸化、および組成物の生物学的活性のような、その構造および機能特性を解析することによって決定される。抗体製剤の安定性を調べるための方法のより詳細な説明について、以下の実施例も参照されたい。
【0033】
本明細書に記載の抗体は、所与の時間での化学的安定性が、以下に定義したように、抗体がその生物学的活性を維持すると考えられるような場合、医薬組成物において「その化学的安定性を保持する」。化学的安定性を評価するため、抗体の化学的に変更された形態が検出および定量される。化学的な変更は、サイズ改変を含み、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣＭＳ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法／飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）のような、当技術分野で公知の方法を使用して評価される。他のタイプの化学的変更は荷電変更を含み、例えば、脱アミド化または酸化の結果として生じ、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって評価される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を含む組成物の加速保存中に生じる化学的変更のタイプは、抗体の酸化を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１の残基Ｍ２５２およびＭ４２８は、加速保存での金属添加試料において酸化される。
【0034】
本開示の組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含有する。用語「賦形剤」または「担体」は、本発明の化合物（複数可）以外の任意の成分を記載するために本明細書で使用される。賦形剤は、薬物の活性成分（複数可）の希釈剤、ビヒクル、担体、保存剤、結合剤、または安定化剤として使用される不活性な物質であり得る。例えば、組成物は、緩衝剤、等張剤、および／または抗酸化剤のような安定化剤を含有し得る。いくつかの場合では、１つの薬剤がこれらの目的の１つより多くに寄与し得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載の抗ＴＧＦ－β抗体、酢酸のような緩衝剤、スクロースのような安定化剤、およびポリソルベート８０（ＰＳ８０）のような界面活性剤を含有する。本明細書に記載の抗ＴＧＦ－β抗体は、組成物中の特定の成分の組合せにより安定性が改善した。本発明の組成物は、水溶液または凍結乾燥調製物であり得る。好ましい実施形態では、本発明の組成物は水溶液である。
【0035】
いくつかの実施形態では、組成物は、Ｌ－メチオニンのような安定化剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、５～２０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）Ｌ－メチオニンを含む水溶液組成物である。
【0036】
いくつかの実施形態では、組成物は、マンニトールのような充填剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、１～１０％（例えば、３．５％）マンニトール（ｗ／ｖ）を含む水溶液組成物である。
【0037】
いくつかの実施形態では、組成物は、Ｌ－ヒスチジン緩衝液のような緩衝液を含む水溶液組成物である。特定の実施形態では、水溶液組成物は、５～２０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）Ｌ－ヒスチジンを含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは約４．０から約６．０の範囲である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは６．０である。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは５．０±０．３である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは水酸化ナトリウムによって調整される。
【0039】
いくつかの実施形態では、組成物は、Ａｂ１関連抗体（例えば、Ａｂ１）４０～１８０ｍｇ／ｍｌ（例えば、５０～１５０ｍｇ／ｍｌ）；１０～５０ｍＭ（例えば、１０～３０ｍＭ）酢酸；および１～１０％（例えば、６～８％）ｗ／ｖスクロースを含む水溶液組成物である。いくつかの他の実施形態では、組成物は、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体 １５～４０ｍｇ／ｍＬ、５～２０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）Ｌ－ヒスチジン、１～１０％（例えば、６～８％）スクロース（ｗ／ｖ）、１～１０％（例えば、３．５％）マンニトール（ｗ／ｖ）、および５～２０ｍＭ（１０ｍＭ）Ｌ－メチオニンを含む水溶液組成物である。水溶液組成物のｐＨは、４．０～６．０（例えば、４．７～５．５）であり得る。
【0040】
いくつかの実施形態では、水溶液組成物は、０．０１～０．０７％ｗ／ｖ界面活性剤（複数可）を含む。例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０および８０）ならびにポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）のような非イオン性デタージェントを含む。いくつかの実施形態では、水溶液組成物は、０．０１～０．０７％ポリソルベート８０（例えば、０．０２５％より多いかまたは０．０５～０．０６％ＰＳ８０）を含む。いくつかの場合では、界面活性剤（複数可）の存在は、液体組成物の濁度／タンパク石濁を減少させるのに役立ち得る。
【0041】
いくつかの実施形態では、水溶液組成物は、ＥＤＴＡまたはＤＰＴＡのような、０～５０μＭ（例えば、１０μＭ）キレート剤（複数可）を含む。
【0042】
好ましい実施形態では、組成物は、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体５０または１５０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭ酢酸、１０μＭ ＥＤＴＡまたはＤＰＴＡ、０．０６％ＰＳ８０、および８％ｗ／ｖスクロースを含む水溶液組成物である。特定の実施形態では、水溶液組成物は、ｐＨ５±０．３である。
【0043】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３．５％（ｗ／ｖ）マンニトール、１０ｍＭ Ｌ－メチオニン、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含む水溶液組成物であり、ｐＨ６．０である。特定の実施形態では、組成物は、ｐＨ６．０で、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体２５ｍｇ／ｍＬ、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩１．１８ｍｇ／ｍＬ、Ｌ－ヒスチジン０．６８ｍｇ／ｍＬ、Ｌ－メチオニン１．５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０ ０．１ｍｇ／ｍＬ、スクロース２０ｍｇ／ｍＬ、およびマンニトール３５．３ｍｇ／ｍＬを含む水溶液組成物である。
【0044】
【表1】
【0045】
水溶液組成物は、組換え技術によって産生され、続いて宿主細胞から精製されたＡｂ１を、水中で本明細書に記載の賦形剤と混合し、生じる混合物を所望のｐＨに合わせることによって調製される。例えば、抗ＴＧＦ－βモノクローナル抗体および所望の賦形剤は、所望のｐＨの酢酸緩衝液に添加されるか、または緩衝液交換される。
【0046】
いくつかの実施形態では、水溶液組成物は、本発明の凍結乾燥組成物を復元することによって調製される。復元は、滅菌水、生理食塩水（例えば、０．９％塩化ナトリウム）、または酢酸緩衝生理食塩水のような、薬学的に許容される液体によって行われる。
【0047】
ＩＶ．製品
本発明の組成物は、使用のための説明書および場合により、障害を処置するための他の治療剤を含む製品（例えば、キット）で供給される。製品内の活性医薬成分（ＡＰＩ）（例えば、Ａｂ１）は、本明細書に記載の投与レジメンに従って容易に投与される量で供給される。
本発明の組成物は、使用のための説明書および場合により、障害を処置するための他の治療剤を含む製品（例えば、キット）で供給される。製品内の活性医薬成分（ＡＰＩ）（例えば、Ａｂ１）は、本明細書に記載の投与レジメンに従って容易に投与される量で供給される。
【0048】
例えば、製品は、ｐＨ５．０±０．３で、２５ｍＭ酢酸、８％スクロース、１０μＭ ＥＤＴＡまたはＤＴＰＡ、０．０６％ＰＳ８０を含む１６ｍＬの水溶液中にＡｂ１ ８００ｍｇを含有するバイアルを含み得る。いくつかの実施形態では、バイアルは、Ａｂ１ ８００ｍｇ、酢酸１５ｍｇ、スクロース８００ｍｇ、およびＰＳ８０ ６ｍｇを含有する。いくつかの実施形態では、バイアルは、Ａｂ１ ８００ｍｇ、酢酸２４ｍｇ、スクロース１２８０ｍｇ、およびＰＳ８０ ９．６ｍｇを含有する。特定の実施形態では、バイアルは、標準的な蓋を備えた前処置したガラスバイアルである。例えば、バイアルは、蓋としてＷｅｓｔ ２０ｍｍストッパーを備えたＩＳＯ ２０Ｒ タイプ１チューブガラスバイアルであり得る。
【0049】
本組成物は、２年間またはそれ以上、－３℃～５℃で保存される。
【0050】
Ｖ．Ａｂ１および関連抗体の使用
ＴＧＦ－β受容体は免疫細胞上に広く発現され、自然および獲得免疫系の両方においてＴＧＦ－βの広範な効果をもたらす。ＴＧＦ－βは、多くの疾患状態、例えば、先天性欠損症、がん、慢性炎症、自己免疫、および線維性疾患と関連する。治療量のＡｂ１または関連抗体はこれらの状態の処置に使用される。「治療有効」量は、処置した状態の１つまたはそれ以上の兆候を緩和する本明細書に言及したＡｂ１、関連抗体、または別の治療剤の量を指す。この量は、処置される状態または患者に基づいて変わり、十分に確立された原理を使用して医療専門家によって決定される。
ＴＧＦ－β受容体は免疫細胞上に広く発現され、自然および獲得免疫系の両方においてＴＧＦ－βの広範な効果をもたらす。ＴＧＦ－βは、多くの疾患状態、例えば、先天性欠損症、がん、慢性炎症、自己免疫、および線維性疾患と関連する。治療量のＡｂ１または関連抗体はこれらの状態の処置に使用される。「治療有効」量は、処置した状態の１つまたはそれ以上の兆候を緩和する本明細書に言及したＡｂ１、関連抗体、または別の治療剤の量を指す。この量は、処置される状態または患者に基づいて変わり、十分に確立された原理を使用して医療専門家によって決定される。
【0051】
本明細書に記載の医薬組成物の適切な投与量レベルは、患者の年齢、体重、疾患状態、健康全般、および病歴、ならびに薬物投与の経路および頻度、薬物中のＡｂ１活性成分の薬力学および薬物動態、ならびに患者が同時に摂取する任意の他の薬物を含む、様々な因子に基づいて決定される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１または関連抗体は、４０、２０、または１５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以下（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ｍｇ／ｋｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１は、５ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇで投与される。投与頻度は、例えば、毎日、２日、３日、４日、または５日ごと、毎週、隔週、または３週毎、毎月、または隔月であり得る。いくつかの実施形態では、投与頻度は隔週である。継続的な投与の間隔は、２週間である、または医師によって適切であると決定される場合は２週間より短いかもしくは長い。
【0052】
抗体は、状態および製剤に適した、静脈内（例えば、０．５～８時間にわたる静脈点滴）、皮下、局所、または任意の他の投与経路によって投与される。
【0053】
Ａｂ１および関連抗体は、ヒト抗体遺伝子に由来し、したがってヒトにおいて低い免疫原性を有するが、患者をＡｂ１または関連抗体によって処置する場合、患者は有害事象をモニターされる。
【0054】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体の効能は、患者において（例えば、患者の腫瘍組織のような患部組織において）、以下の１つまたはそれ以上によって示される：（１）ＴＧＦ－βのレベルまたは活性の減少、（２）ＭＩＰ２および／またはＫＣ／ＧＲＯレベルの増加、（３）ＩＮＦ－γ－陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞のようなＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化または腫瘍組織への浸潤、および（４）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のクラスタリングの増加。
【0055】
患者は成人であり得る（例えば、６５歳またはそれ以上である老人患者を含む、１８歳またはそれ以上の患者）。患者は、小児患者であり得る（１８歳より若い患者、例えば新生児から６歳、６歳から１２歳、または１２歳から１８歳の患者）。
【0056】
ある特定の実施形態では、５０ｍｇ／ｍｌでＡｂ１を含有し、２５ｍＭ酢酸、８％スクロース、１０μＭ ＥＤＴＡまたはＤＰＴＡ、および０．０６％ＰＳ８０を含有する医薬Ａｂ１組成物（ｐＨ５．０±０．３）（例えば、１０ｍＬバイアル中で供給される）が、所望の治療終点が達成される時まで、５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇで、隔週、患者に静脈内投与される。ＩＶ投与のため、Ａｂ１組成物は、生理食塩水またはＩＶデキストロース液（典型的には、水中に５％デキストロースを含有する）中で希釈される。例えば、ＰＯまたはＰＶＣ ＩＶバッグが使用される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１製剤は、使用前にＰＶＣバッグ内で生理食塩水中に希釈される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１製剤は、使用前にＰＶＣバッグ内でＩＶデキストロース液中に希釈される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１製剤は、使用前にＰＯバッグ内で生理食塩水中に希釈される。いくつかの実施形態では、Ａｂ１製剤は、使用前にＰＯバッグ内でＩＶデキストロース液中に希釈される。
【0057】
Ａ．非腫瘍学的な疾患状態
Ａｂ１および関連抗体によって処置される状態としては、限定はされないが、骨欠損（例えば骨形成不全症）、糸球体腎炎、神経または皮膚の傷、肺または肺線維症（例えば、突発性肺線維症）、放射線誘発線維症、肝線維症、骨髄線維症、強皮症、免疫介在性疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、ベルガー病、および移植拒絶）、ならびにデュピュイトラン拘縮が挙げられる。
Ａｂ１および関連抗体によって処置される状態としては、限定はされないが、骨欠損（例えば骨形成不全症）、糸球体腎炎、神経または皮膚の傷、肺または肺線維症（例えば、突発性肺線維症）、放射線誘発線維症、肝線維症、骨髄線維症、強皮症、免疫介在性疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、ベルガー病、および移植拒絶）、ならびにデュピュイトラン拘縮が挙げられる。
【0058】
それらはまた、限定はされないが、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、糖尿病性（Ｉ型およびＩＩ型）腎症、放射線腎症、閉塞性腎症、びまん性全身性硬化症、先天性腎疾患（例えば、多発性嚢胞腎疾患、海綿腎、馬蹄腎）、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰化症、全身性または糸球体高血圧、尿細管間質性腎症、尿細管性アシドーシス、腎結核、および腎梗塞を含む、腎不全の発生のリスクを処置、予防および減少させるためにも有用である。特に、限定はされないが：レニン阻害剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニスト（「ＡｎｇＩＩ受容体遮断薬」としても公知）、およびアルドステロンアンタゴニストを含む、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系のアンタゴニストと組み合わせた場合に有用である。例えば、その開示がその全体を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２００４／０９８６３７号を参照。
【0059】
Ａｂ１および関連抗体は、全身性硬化症、術後癒着、ケロイドおよび肥厚性瘢痕、増殖性硝子体網膜症、緑内障手術、角膜損傷、白内障、ペイロニー病、成人呼吸促拍症候群、肝硬変、心筋梗塞後瘢痕、血管形成術後の再狭窄、くも膜下出血後の瘢痕、椎弓切除後の線維症、腱および他の修復後の線維症、胆汁性肝硬変（硬化性胆管炎を含む）、心膜炎、肋膜炎、気管切開術、穿通性ＣＮＳ損傷、好酸球性筋肉痛症候群、血管再狭窄、静脈閉塞症、膵炎および乾癬性関節症のような、ＥＣＭの沈着に関連する疾患および状態の処置に有用である。
【0060】
Ａｂ１および関連抗体は、再上皮化の促進が有益である状態においてさらに有用である。そのような状態としては、限定はされないが、静脈性潰瘍、虚血性潰瘍（褥瘡）、糖尿病性潰瘍、移植部位、移植ドナー部位、擦過傷および熱傷のような皮膚の疾患、喘息、ＡＲＤＳのような気管支上皮の疾患、細胞傷害性処置に関連する粘膜炎、食道潰瘍（反射性疾患）、胃食道逆流症、胃潰瘍、小腸および大腸病変（炎症性腸疾患）のような腸管上皮の疾患が挙げられる。
【0061】
Ａｂ１および関連抗体のさらなる使用は、内皮細胞増殖が望ましい状態においてであり、例えば、アテローム性動脈硬化症の安定化、血管吻合の治癒の促進、または動脈疾患、再狭窄および喘息のような平滑筋細胞増殖の阻害が望ましい状態においてである。
【0062】
Ａｂ１および関連抗体はまた、リーシュマニア菌種、クルーズトリパノソーマ、結核菌およびらい菌、ならびにトキソプラズマ原虫、ヒストプラズマ・カプスラーツム菌、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプロ－シス、およびクリプトコッカス・ネオフォルマンスによって引き起こされるもののような、マクロファージ媒介感染への免疫応答の増強にも有用である。それらは、例えば、腫瘍、ＡＩＤＳまたは肉芽腫症によって引き起こされる免疫抑制を減らすのにも有用である。
【0063】
Ａｂ１および関連抗体はまた、緑内障および線維性帯切除術後の瘢痕のような眼科的な状態の予防および／または処置にも有用である。
【0064】
Ｂ．腫瘍学的な疾患状態
ＴＧＦ－βは、細胞増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、マトリックスリモデリング、血管新生、および免疫機能を含む、いくつかの生物学的プロセスを調節する。これらのプロセスのそれぞれが腫瘍進行に貢献する。適応症にわたるがん患者におけるＴＧＦ－βの広範な有害な役割も、腫瘍微小環境内でのならびに全身的なその上昇によって示唆されている。例えば、Kadam et al., Mo Biomark Diagn. (2013) 4(3):1-8参照。研究は、悪性の状態で、ＴＧＦ－βがＥＭＴを誘導することができ、生じる間葉系の表現型は細胞の遊走および侵入の増加をもたらすことを示した。
ＴＧＦ－βは、細胞増殖、上皮間葉転換（ＥＭＴ）、マトリックスリモデリング、血管新生、および免疫機能を含む、いくつかの生物学的プロセスを調節する。これらのプロセスのそれぞれが腫瘍進行に貢献する。適応症にわたるがん患者におけるＴＧＦ－βの広範な有害な役割も、腫瘍微小環境内でのならびに全身的なその上昇によって示唆されている。例えば、Kadam et al., Mo Biomark Diagn. (2013) 4(3):1-8参照。研究は、悪性の状態で、ＴＧＦ－βがＥＭＴを誘導することができ、生じる間葉系の表現型は細胞の遊走および侵入の増加をもたらすことを示した。
【0065】
Ａｂ１を含む組成物および関連抗体は、限定はされないが、皮膚がん（例えば、切除不能なまたは転移性のメラノーマを含むメラノーマ、有棘細胞癌および角化棘細胞腫）、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、原発性腹膜がん、膀胱がん、腎がんまたは腎臓がん（例えば腎細胞癌）、尿路上皮癌、乳がん、卵巣がん、卵管がん、子宮頸がん、子宮がん、前立腺がん、精巣がん、頭頚部がん（例えば、頭頚部扁平上皮癌）、脳がん、神経膠芽腫、神経膠腫、中皮腫、白血病およびリンパ腫を含むがんのような、過剰増殖疾患の処置に有用である。
【0066】
いくつかの実施形態では、組成物Ａｂ１および関連抗体は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療剤に基づく先の治療が失敗した、または失敗すると予想される患者、すなわち、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療に非応答者であるまたは非応答者であると予想される患者におけるがんの処置に有用である。いくつかの実施形態では、Ａｂ１および関連抗体は、先の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療から再発した患者におけるがんの処置に有用である。本明細書で使用する場合、用語「予想される」は、医学分野の当業者が、彼／彼女の一般的な医学知識および患者の特定の状態に基づき、治療を施すことなく、患者が応答者であるか非応答者であるか、および治療が失敗するかまたは有効でないかについて、予期できることを意味する。
【0067】
いくつかの実施形態では、がんは、限定はされないが、間葉系結腸直腸がん、間葉系卵巣がん、間葉系肺がん、間葉系頭部がんおよび間葉系頸部がんを含む、固形腫瘍の間葉系サブタイプである。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、上皮細胞遺伝子を下方調節し、間葉系遺伝子発現を増強することによって細胞の遊走および侵入特性を促進する。ＥＭＴは、腫瘍進行および侵入のホールマークである。結腸直腸および卵巣がんの４分の１までが間葉系である。したがって、ＴＧＦ－βの阻害およびＥＭＴのその誘導により、Ａｂ１または関連抗体は、間葉系固形腫瘍を処置するために使用される。いくつかの遺伝子マーカーおよび病理試験によって固形腫瘍の間葉系サブタイプが同定される。マーカーはＡＣＡＴ２、ＶＩＭ、ＭＧＰ、ＺＥＢ２、およびＺＷＩＮＴを含み、これはｑＲＴ－ＰＣＲまたは免疫組織化学によって検出される。そのようなマーカーは、抗ＴＧＦ－β単独治療または本発明の組み合わせ治療のための患者を選択するために使用される。
【0068】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１および関連抗体は、進行した固形腫瘍を有する患者の処置に有用である。
【0069】
Ａｂ１を含む組成物および関連抗体は、造血障害または多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病、ならびにカポジ肉腫のような様々な肉腫のような悪性腫瘍の処置でも使用される。
【0070】
Ａｂ１を含む組成物および関連抗体は、シクロスポリン媒介悪性腫瘍またはがん進行（例えば、転移）の阻害にも有用である。
【0071】
がん治療の文脈では、「処置」は、がん増殖の減速、がん進行もしくは再発の遅延、またはがん転移の減少、ならびに患者の平均余命を延長するためのがんの部分緩解をもたらす任意の医療行為を含むことが、当然理解される。
【0072】
Ｃ．腫瘍学における組み合わせ治療
がんにおける細胞傷害性Ｔ細胞浸潤のレベルは、良好な臨床結果と関連付けられることが観察された（Fridman et al., Nat Rev Cancer (2012) 12(4):298-306; and Galon et al., Immunity (2013) 39(1):11-26）。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＴＨ１）を補助するヘルパーＴ細胞およびそれらが産生するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）は、同様に患者のポジティブな結果と関連付けられることが多い。これに対して、Ｔｒｅｇ細胞の存在は、患者の予後不良と関連付けられることが示された（Fridman、上記）。
がんにおける細胞傷害性Ｔ細胞浸潤のレベルは、良好な臨床結果と関連付けられることが観察された（Fridman et al., Nat Rev Cancer (2012) 12(4):298-306; and Galon et al., Immunity (2013) 39(1):11-26）。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＴＨ１）を補助するヘルパーＴ細胞およびそれらが産生するサイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）は、同様に患者のポジティブな結果と関連付けられることが多い。これに対して、Ｔｒｅｇ細胞の存在は、患者の予後不良と関連付けられることが示された（Fridman、上記）。
【0073】
ＴＧＦ－βは、抗腫瘍免疫応答のほぼ全ての態様を抑制する。サイトカインは、ｉＴｒｅｇ分化を促進し、細胞傷害性（ＣＤ８＋）細胞増殖および浸潤を減少させる。Ａｂ１または関連抗体によるＴＧＦ－βの阻害は、上記のように免疫抑制腫瘍微小環境を緩和し、がん患者にポジティブな結果をもたらす。
【0074】
さらに、本発明者らは、免疫抑制腫瘍微小環境を緩和することによって、Ａｂ１および関連抗体は、抗ＰＤ－１抗体のような、チェックポイント修飾薬が免疫応答をより誘導することを可能にすることができることを発見した。結果として、より多くの患者が、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２処置のような免疫治療から恩恵を受ける。
【0075】
免疫チェックポイント分子を標的化する治療剤有りまたは無しで、Ａｂ１および関連抗体はまた、化学治療（例えば、プラチナまたはタキソイドベースの治療）、放射線治療、およびがん抗原または発がん性駆動体を標的化する治療のような他のがん治療と併せても使用される。
【0076】
Ａｂ１または関連抗体、および抗ＰＤ－１抗体のような免疫チェックポイント阻害剤を含む組み合わせによって処置されるがんは、上記の小節に列挙されるがんを含む。
【0077】
いくつかの実施形態では、進行性または転移性のメラノーマ、非小細胞肺がん、腎細胞癌、頭頚部扁平上皮癌、およびホジキンリンパ腫のように、がんは、先の抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２治療に難治性である。難治性患者は、応答のいかなる証拠もない、処置開始の１２週間以内に例えば放射線学的に確認される、疾患が進行する患者である。
【0078】
いくつかの実施形態では、Ａｂ１または関連抗体は、抗ＰＤ－１治療のような別のがん治療と併せて使用され、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膀胱がん、頭頚部扁平上皮癌、腎細胞癌、肝細胞癌、および有棘細胞癌のような間葉系のがんを処置する。上記の考察も参照。
【0079】
抗ＰＤ－１抗体の例は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＭＥＤＩ０６０８（以前はＡＭＰ－５１４；例えば、国際公開第２０１２／１４５４９３号および米国特許第９，２０５，１４８号参照）、ＰＤＲ００１（例えば、国際公開第２０１５／１１２９００号参照）、ＰＦ－０６８０１５９１（例えば、国際公開第２０１６／０９２４１９号参照）およびＢＧＢ－Ａ３１７（例えば、国際公開第２０１５／０３５６０６号参照）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、国際公開第２０１５／１１２８００号に開示されるものを含む（ＰＣＴ公開の表１のＨ１Ｍ７７８９Ｎ、Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ、Ｈ１Ｍ７８００Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８８Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９１Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９４Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９６Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ９０１９Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０３４Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３７Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１１９Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２０Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ８９９２Ｐ、Ｈ４ｘＨ８９９９ＰおよびＨ４ｘＨ９００８Ｐと呼ばれるもの、およびＰＣＴ公開の表３のＨ４Ｈ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２、Ｈ４Ｈ９００８ＰおよびＨ４Ｈ９０４８Ｐ２と呼ばれるものなど）。国際公開第２０１５／１１２８００号の開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【0080】
例えば、ＰＣＴ公開に開示されるＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列、または重および軽鎖配列、ならびにＰＣＴ公開に開示される抗体と同じＰＤ－１エピトープに結合する抗体および抗原結合断片を有する抗体および抗原結合断片を含む国際公開第２０１５／１１２８００号に開示の抗体および関連抗体は、本開示のＡｂ１または関連抗体と併せて使用され、がんを処置する。関連する実施形態では、有用な抗ＰＤ－１抗体は、それぞれ配列番号９および１０として以下に示した重および軽鎖アミノ酸配列；配列番号９および１０のＶＨおよびＶＬ配列（イタリック体で示す）；または配列番号９および１０の１つまたはそれ以上の（例えば、６個全て）ＣＤＲ（四角で示す）を含み得る。
【0081】
【化2】
【0082】
他の関連する実施形態では、有用な抗ＰＤ－１抗体は、それぞれ配列番号１１および１２として以下に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列；配列番号１１および１２のＶＨおよびＶＬ配列（イタリック体で示す）；または配列番号１１および１２における１つもしくはそれ以上（例えば、全部で６個）のＣＤＲ（四角内に示す）を含み得る。関連する実施形態では、有用な抗ＰＤ－１抗体は、それぞれ配列番号１１および１２として以下に示す重鎖および軽鎖アミノ酸配列；配列番号１１および１２のＶＨおよびＶＬ配列（イタリック体で示す）；または配列番号９および１０における１つもしくはそれ以上（例えば、全部で６個）のＣＤＲ（四角内に示す）を含み得る。
【0083】
【化3】
【0084】
いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体のような本開示の抗体は、重鎖にＣ末端リジンを持たない。Ｃ末端リジンは、製造中に、または組換え技術により取り除かれる（すなわち、重鎖のコード配列は、Ｃ末端リジンのコドンを含まない）。したがって、Ｃ末端リジンのない配列番号３の重鎖アミノ酸配列を含む抗体も本発明内で考慮される。
【0085】
Ｄ．処置の効能のバイオマーカー
Ａｂ１および関連抗体の効能は、バイオマーカーまたは標的占有率によって決定される。例えば、腫瘍組織において、標的占有率は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して、生検における活性なＴＧＦ－βのレベルを評価することによってアッセイされる。血液中で、ターゲットエンゲージメントは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球のような末梢血単核細胞上の循環ＴＧＦ－βの減少の効果を評価することによってアッセイされる。例えば、循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ４５＋ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋Ｋｉ６７＋を使用して評価される。循環ＮＫ細胞の活性化は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ３－ＣＤ５６ｈｉｇｈ／ｄｉｍＣＤ１６＋またはＣＤ１３７＋を使用して評価される。さらに、Ｋｉ－６７、ＰＤ－１、およびＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化に関連するＰＤマーカーとして使用される。
Ａｂ１および関連抗体の効能は、バイオマーカーまたは標的占有率によって決定される。例えば、腫瘍組織において、標的占有率は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して、生検における活性なＴＧＦ－βのレベルを評価することによってアッセイされる。血液中で、ターゲットエンゲージメントは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球のような末梢血単核細胞上の循環ＴＧＦ－βの減少の効果を評価することによってアッセイされる。例えば、循環ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の増加は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ４５＋ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ２８＋Ｋｉ６７＋を使用して評価される。循環ＮＫ細胞の活性化は、フローサイトメトリーのマーカーとしてＣＤ３－ＣＤ５６ｈｉｇｈ／ｄｉｍＣＤ１６＋またはＣＤ１３７＋を使用して評価される。さらに、Ｋｉ－６７、ＰＤ－１、およびＩＣＯＳは、Ｔ細胞活性化に関連するＰＤマーカーとして使用される。
【0086】
Ａｂ１または関連抗体による処置時の免疫調節は、例えば、ＮｅｏＧｅｎｏｍｉｃｓプラットフォームを使用するマルチプレックス免疫組織化学染色（ＩＨＣ）アッセイによる浸潤する免疫細胞および免疫マーカーの変化を評価することによってアッセイされる。特に、免疫マーカーのパネルのＮｅｏＧｅｎｏｍｉｃ’ｓ ＭｕｌｔｉＯｍｙｘ ＴＩＬ Ｐａｎｅｌ染色により、様々な免疫細胞の密度および局在の定量的な決定が可能になる。免疫マーカーは、ｉＴｒｅｇの分化；ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤および増殖；ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの生成を示すことができる。Ａｂ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの分化を阻害し（例えば、米国特許公開第２０１８／０２４４７６３号の実施例３参照）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖およびそれらのＩＦＮγの生成を増加させる（混合リンパ球反応アッセイに示すように；データは示さず）ことが示された。したがって、Ａｂ１または関連抗体による処置の効能は、ｉＴｒｅｇの阻害、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および腫瘍もしくは他の疾患組織への浸潤の誘導、ＩＦＮγ産生の増加、ならびに／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比の増加によって示される。Ａｂ１または関連抗体による処置時の免疫調節もまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、および他の免疫細胞のメチル化ＰＣＲベース定量的免疫細胞カウントによって末梢血においてアッセイされる。処置の効能は、腫瘍進行のような疾患進行における遅延または回復として臨床的に証明することができる。
【0087】
本明細書で他に記載しない限り、本開示に関係して使用した科学および技術用語は当業者に共通に理解される意味を有する。例示的な方法および材料は以下に記載したが、本明細書に記載のものと類似のまたは等しい方法および材料も本開示の実施または試験に使用される。抵触する場合には、定義を含む本明細書が制御する。一般に、本明細書に記載の神経学、医薬品、医および製薬化学、ならびに細胞生物学と関連して使用される命名法およびその技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の指示に従って実施した。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形用語は単数も含む。この明細書および実施形態を通して、単語「有する（have）」および「含む（comprise）」、または「has」、「having」、「comprises」または「comprising」のような変化形は、言及した整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないと理解される。本明細書に記載の全ての文献および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。多くの文章が本明細書に引用されるが、この引用は、これらの文章のいずれかが当技術分野の共通の一般的知識の一部を形成することを認めない。本明細書で使用する場合、用語「およそ」または「約」は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用する場合、言及した参照値と類似の値を指す。ある特定の実施形態では、用語は、他に記載しない限り、または文脈から明らかでない限り、言及した参照値のいずれかの方向（より多いまたは少ない）で、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下以内である値の範囲を指す。
【0088】
この発明がよりよく理解されるように、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示のためだけであり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【0089】
以下の実施例は、最良の生物学的活性および長期安定性の製剤に到達するため、Ａｂ１の様々な製剤を評価する研究を記載する。本発明者らは、冷蔵保存、加速保存、およびストレス保存条件の間にＡｂ１液体製剤の物理的および化学的安定性への緩衝液の性質およびｐＨの効果を評価した。酢酸およびヒスチジン緩衝液系は、塩化ナトリウムの添加有りまたは無しでのこの研究のために選択された。
【0090】
本発明者らは、様々な保存温度、凍結融解サイクル、および撹拌誘導ストレスでのＡｂ１液体製剤の安定化に必要とされるポリソルベート８０（ＰＳ８０）の最適な濃度を評価した。
【0091】
本発明者らは、静脈内（ＩＶ）注入バッグ中、室温で４８時間までの間、希釈およびインキュベーション後、Ａｂ１薬物製品（ＤＰ）の物理的安定性も評価した。ＤＰは、０．５ｍｇ／ｍｌおよび１．０ｍｇ／ｍｌに希釈した。両方の濃度は、以下のバッグの組合せで評価した：ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）バッグ中の生理食塩水、ポリオレフィン（ＰＯ）バッグ中の生理食塩水、ＰＶＣバッグ中のデキストロース、およびＰＯバッグ中のデキストロース。液体ＤＰ中の最適なＰＳ８０濃度は、希釈後のＡｂ１を保護するその能力についても調べた。
【0092】
本発明者らは、タンパク質の化学的および物理的安定性への遷移金属の影響をさらに調べた。遷移金属は、製造中に原薬（ＤＳ）へと滲出することがある。ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡは、最悪の場合の実験セット中にタンパク質をキレートおよび保護するそれらの能力について評価した。
【0093】
提案した標的製剤マトリックスが、高濃度のＤＳおよび低濃度のＤＰ溶液を安定化するのに十分であることを確かめるため、本発明者らは、凍結融解サイクル中および凍結および液体保存条件下、およびＡＰＩを含む全ての賦形剤の濃度範囲にわたり、溶液の安定性を評価した。
【0094】
実験の材料および方法は以下の通りである。
【0095】
原薬
高濃度のＡｂ１原薬（ＤＳ）は、限外濾過／透析濾過法（ＵＦＤＦ）を使用して調製した。ＤＳ濃度は、一般に、最大１８０ｍｇ／ｍｌで調製した。ＵＦＤＦシミュレーターからの結果は、ドナン効果によるＵＦ方法工程中に蓄積または枯渇される緩衝液塩の濃度補正のために使用した。標的タンパク質および賦形剤濃縮物への薬物製品（ＤＰ）試料の製剤後、製剤は次いで、無菌充填包装前に層流下で、０．２２μｍフィルターよって精製した。
高濃度のＡｂ１原薬（ＤＳ）は、限外濾過／透析濾過法（ＵＦＤＦ）を使用して調製した。ＤＳ濃度は、一般に、最大１８０ｍｇ／ｍｌで調製した。ＵＦＤＦシミュレーターからの結果は、ドナン効果によるＵＦ方法工程中に蓄積または枯渇される緩衝液塩の濃度補正のために使用した。標的タンパク質および賦形剤濃縮物への薬物製品（ＤＰ）試料の製剤後、製剤は次いで、無菌充填包装前に層流下で、０．２２μｍフィルターよって精製した。
【0096】
肉眼で見える粒子の検査
肉眼で見える粒子は、目視検査ユニット下で解析した。ＤＰバイアルは、検査の前にレンズペーパーによって綺麗にし、外側表面から埃および指紋を除去した。
肉眼で見える粒子は、目視検査ユニット下で解析した。ＤＰバイアルは、検査の前にレンズペーパーによって綺麗にし、外側表面から埃および指紋を除去した。
【0097】
ｐＨ
緩衝液および製剤化ｍＡｂ溶液のｐＨは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｐＨプローブおよび計器を使用して測定した。結果は、繰り返し測定間の差が０．１ｐＨ単位内であった場合、同等と考えた。
緩衝液および製剤化ｍＡｂ溶液のｐＨは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｐＨプローブおよび計器を使用して測定した。結果は、繰り返し測定間の差が０．１ｐＨ単位内であった場合、同等と考えた。
【0098】
浸透圧
浸透圧測定は、凝固点降下浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＯｓｍｏＰＲＯ）を使用して、試料２０μＬ（ｎ＝２または３）で実施した。浸透圧標準は、試料解析の前後に実行し、測定精度を確実にした。
浸透圧測定は、凝固点降下浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＯｓｍｏＰＲＯ）を使用して、試料２０μＬ（ｎ＝２または３）で実施した。浸透圧標準は、試料解析の前後に実行し、測定精度を確実にした。
【0099】
総タンパク質濃度
総タンパク質濃度は、Ｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｏｌｏＶＰＥシステムによってＶａｒｉａｂｌｅ Ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度を測定することによって決定した。測定は、試料２０μＬ（ｎ＝２または３）で実施した。総タンパク質濃度は、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社のＢｉｇ Ｌｕｎａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍのマイクロ流体チップで、２８０ｎｍでの紫外線吸光度を測定することによっても決定した。測定は、試料２～５μＬで、２回ずつ実施した。
総タンパク質濃度は、Ｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｏｌｏＶＰＥシステムによってＶａｒｉａｂｌｅ Ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用して、２８０ｎｍでの紫外線（ＵＶ）吸光度を測定することによって決定した。測定は、試料２０μＬ（ｎ＝２または３）で実施した。総タンパク質濃度は、Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ社のＢｉｇ Ｌｕｎａｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍのマイクロ流体チップで、２８０ｎｍでの紫外線吸光度を測定することによっても決定した。測定は、試料２～５μＬで、２回ずつ実施した。
【0100】
構造および熱安定性のＤＳＣ
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、加熱速度０．５℃／分で、１５℃から１０５℃までの熱勾配によってＭａｌｖｅｒｎ Ｍｉｃｒｏｃａｌカロリメーターで実施した。タンパク質溶液は、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで測定した。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏソフトウェアを、解析および熱アンフォールディング温度（Ｔｍ）決定のために使用した。
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）は、加熱速度０．５℃／分で、１５℃から１０５℃までの熱勾配によってＭａｌｖｅｒｎ Ｍｉｃｒｏｃａｌカロリメーターで実施した。タンパク質溶液は、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで測定した。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏソフトウェアを、解析および熱アンフォールディング温度（Ｔｍ）決定のために使用した。
【0101】
溶液濁度および光学密度
試料濁度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで、３４０ｎｍから３６０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定することによって定量した。各試料につき、２００μＬをＵＶ－Ｖｉｓ透明９６ウェルプレートにロードした。ＯＤは、３４０ｎｍ、３４５ｎｍ、３５０ｎｍ、３５５ｎｍ、および３６０ｎｍでの吸光度値の平均として決定した。
試料濁度は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで、３４０ｎｍから３６０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定することによって定量した。各試料につき、２００μＬをＵＶ－Ｖｉｓ透明９６ウェルプレートにロードした。ＯＤは、３４０ｎｍ、３４５ｎｍ、３５０ｎｍ、３５５ｎｍ、および３６０ｎｍでの吸光度値の平均として決定した。
【0102】
高分子量種のためのサイズ排除ＨＰＬＣ
タンパク質凝集体（高分子量種またはＨＭＷＳ）の解析は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実施した。試料は、ＴＳＫ－ＧＥＬ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）解析カラムおよび適合するガードカラムを備えた１２６０シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ社，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で実行した。使用した移動相は、３０分間、流速０．５ｍＬ／分で、４０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２であった。各試料につき、３回注入を実施した。検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって行い、クロマトグラフピークを統合して各溶出種の相対パーセンテージを決定した。
タンパク質凝集体（高分子量種またはＨＭＷＳ）の解析は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実施した。試料は、ＴＳＫ－ＧＥＬ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）解析カラムおよび適合するガードカラムを備えた１２６０シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ社，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）で実行した。使用した移動相は、３０分間、流速０．５ｍＬ／分で、４０ｍＭリン酸および１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２であった。各試料につき、３回注入を実施した。検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって行い、クロマトグラフピークを統合して各溶出種の相対パーセンテージを決定した。
【0103】
肉眼では見えない粒子のマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）
肉眼では見えない粒子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＭＥＩ（商標）Ｍｏｄｅｌ ＤＰＡ－４２００を使用して解析した。システムは、２、１０、および２５μｍ標準を測定する前に、０．２２μｍ濾過し、脱気したＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水を広範にフラッシュした。試料（ｎ＝１または２）は、流速０．１７ｍＬ／分での１ｍＬ法を使用して実行した。試料がフローセルを通って流れると、光源によって照射され、カメラはすぐにフローセルを通過した試料として画像を撮った。粒子はＭＦＩ（商標）ソフトウェアによって同定し、次いで個々の粒子ごとのサイズ、透明性、および形態を算出した。
肉眼では見えない粒子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ ＭＥＩ（商標）Ｍｏｄｅｌ ＤＰＡ－４２００を使用して解析した。システムは、２、１０、および２５μｍ標準を測定する前に、０．２２μｍ濾過し、脱気したＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水を広範にフラッシュした。試料（ｎ＝１または２）は、流速０．１７ｍＬ／分での１ｍＬ法を使用して実行した。試料がフローセルを通って流れると、光源によって照射され、カメラはすぐにフローセルを通過した試料として画像を撮った。粒子はＭＦＩ（商標）ソフトウェアによって同定し、次いで個々の粒子ごとのサイズ、透明性、および形態を算出した。
【0104】
肉眼では見えない粒子の高精度液体粒子カウンター
肉眼では見えない粒子は、Ｈａｃｈ（登録商標）高精度（ＨＩＡＣ）液体粒子カウンターＭｏｄｅｌ ９７０３＋での光遮蔽によっても測定した。システムは、粒子数が２０粒子／ｍＬ以下になるまで、０．２２μｍ濾過し、脱気したＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水によってフラッシュした。２μｍ、１０μｍ、および２５μｍ標準を測定し、いずれのバックグラウンドも除去する広範な洗浄により正確な粒子数を確かめた。１ｍＬプロトコールを使用して、試料は、０．２ｍＬの５回の別々の注入によって測定した。最初の試料測定は無視し、その後の４回を平均した。
肉眼では見えない粒子は、Ｈａｃｈ（登録商標）高精度（ＨＩＡＣ）液体粒子カウンターＭｏｄｅｌ ９７０３＋での光遮蔽によっても測定した。システムは、粒子数が２０粒子／ｍＬ以下になるまで、０．２２μｍ濾過し、脱気したＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水によってフラッシュした。２μｍ、１０μｍ、および２５μｍ標準を測定し、いずれのバックグラウンドも除去する広範な洗浄により正確な粒子数を確かめた。１ｍＬプロトコールを使用して、試料は、０．２ｍＬの５回の別々の注入によって測定した。最初の試料測定は無視し、その後の４回を平均した。
【0105】
荷電バリアントのキャピラリー等電点電気泳動
タンパク質荷電異質性は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社のｉＣＥ３装置を使用してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって測定した。試料（１ｍＬ）および標準溶液は、水中で２．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。オンボード混合を使用して、解析の前に試料とＭａｓｔｅｒＭｉｘを混合した。試料の等電点電気泳動は、１５００Ｖで１分間、プレフォーカシング時間を含み、続いて３０００Ｖで１０分間にわたりフォーカシングした。検出は５回の曝露をカバーし、各製剤につき５５秒、試料ローディングを続けた。結果は、差が等しいかまたは１０％未満である場合、同等であると考えた。
タンパク質荷電異質性は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社のｉＣＥ３装置を使用してキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）によって測定した。試料（１ｍＬ）および標準溶液は、水中で２．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。オンボード混合を使用して、解析の前に試料とＭａｓｔｅｒＭｉｘを混合した。試料の等電点電気泳動は、１５００Ｖで１分間、プレフォーカシング時間を含み、続いて３０００Ｖで１０分間にわたりフォーカシングした。検出は５回の曝露をカバーし、各製剤につき５５秒、試料ローディングを続けた。結果は、差が等しいかまたは１０％未満である場合、同等であると考えた。
【0106】
ＬＣ－ＭＳによるＰＴＭ定量
タンパク質試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ボルテックスし、タンパク質４０μｇを使用して自動消化した。消化緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５であった。各試料につき、消化物１５μＬ（タンパク質約５μｇを含有する）を、ＬＣ－ＭＳ解析のためＣ１８カラムに注入した。試料は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）でＤＤＡ ｔｏｐ８ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して解析した。
タンパク質試料を２ｍｇ／ｍｌに希釈し、ボルテックスし、タンパク質４０μｇを使用して自動消化した。消化緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５であった。各試料につき、消化物１５μＬ（タンパク質約５μｇを含有する）を、ＬＣ－ＭＳ解析のためＣ１８カラムに注入した。試料は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）でＤＤＡ ｔｏｐ８ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して解析した。
【0107】
Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）で獲得したＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータは、Ｍｅｔ／Ｔｒｐ酸化、脱アミド化、Ａｓｐ異性化およびＨＣ Ｃ末端改変を含む改変の同定および相対定量のため、サーバーＷＬＳＤ５８でＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ（商標）３．０によって処理した。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ（商標）による同定のための良いＭＳ／ＭＳスペクトルを生成できない低レベルの改変のため、ＭＳのみのペプチドマッピングをペプチドアサインのために使用した。次いで、全てのデータは、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓを使用して処理し、保持時間アライメントおよびピークピッキング後のペプチド量を提供した。ピークピッキングの手動による調整は、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓがこのタスクを正確に実施できなかった場合に、いくつかの脱アミド化および異性化ペプチドに必要であった。
【0108】
効力
ＴＧＦ－βをミンク肺細胞とインキュベートする場合、それは細胞増殖を阻害する。Ａｂ１は、ＴＧＦ－βに結合した場合、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β細胞表面受容体への結合を阻害し、したがって細胞増殖を可能にする抗ＴＧＦβ抗体である。Ａｂ１効力アッセイでは、様々なレベルのＡｂ１をＴＧＦ－β２とインキュベートし、次いでミンク肺細胞に添加した。
ＴＧＦ－βをミンク肺細胞とインキュベートする場合、それは細胞増殖を阻害する。Ａｂ１は、ＴＧＦ－βに結合した場合、ＴＧＦ－βのＴＧＦ－β細胞表面受容体への結合を阻害し、したがって細胞増殖を可能にする抗ＴＧＦβ抗体である。Ａｂ１効力アッセイでは、様々なレベルのＡｂ１をＴＧＦ－β２とインキュベートし、次いでミンク肺細胞に添加した。
【0109】
細胞は、３日間、Ａｂ１およびＴＧＦ－β２とインキュベートし、次いで、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）試薬を添加した。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）は、細胞透過性の非蛍光化合物、レサズリンを含有し、それは生細胞によって代謝および低減され、蛍光産物、レソルフィンの産生をもたらす。したがって、細胞増殖は、蛍光シグナルの強度と直接関係する。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）添加の５時間後、蛍光はプレートリーダーを使用して測定した。バイオアッセイソフトウェアは、Ｌｏｇ１０変換し、４つのパラメーターモデルにフィットさせた。参照および試料曲線が好適であると決定された後、曲線が限定され、アッセイの最終結果は、試験試料のＥＣ５０によって割られた参照のＥＣ５０の比として決定され、パーセント相対効力（％ＲＰ）として報告した。
【実施例1】
【0110】
緩衝液およびｐＨスクリーニング
この実施例は、様々な緩衝液およびｐＨ条件がスクリーニングされ、Ａｂ１の好適な製剤を同定する実験を記載する。液体薬物製品は、病院および家庭の両方での調製および投与により便利であるため（凍結乾燥薬物製品と比較して）、様々な水性緩衝液を試験した。表１は、この研究で使用した製剤条件および試料コードを表す。
この実施例は、様々な緩衝液およびｐＨ条件がスクリーニングされ、Ａｂ１の好適な製剤を同定する実験を記載する。液体薬物製品は、病院および家庭の両方での調製および投与により便利であるため（凍結乾燥薬物製品と比較して）、様々な水性緩衝液を試験した。表１は、この研究で使用した製剤条件および試料コードを表す。
【0111】
【表2】
【0112】
タンパク石濁は、誘引性のタンパク質間相互作用が、肉眼で見えるかたちで現れたものである。Ａｂ１製剤が、顕著なｐＨ依存性のタンパク石濁を示したことが肉眼で観察された（図１）。溶液は、ｐＨ５．３以下ではほとんど澄んだ透明であるが、ｐＨ＞５．３では、ｐＨが増加するとタンパク石濁が増加した。酢酸製剤は、一般に、ヒスチジン製剤よりも低いタンパク石濁を示す（図１）。これらの肉眼で見える外観の画像は、緩衝液種として酢酸を使用して、最適な製剤ｐＨが４．７～５．０の範囲であることを示した。
【0113】
５℃および２５℃での最高４週間の保存の後、表１の溶液は、高分子量種（ＨＭＷＳ）％に顕著な変化を示さなかった。しかしながら、４０℃での保存の４週間後には、全ての製剤のＨＭＷＳ％に約０．５％の増加がみられた。この変化は、与えられたストレス条件では特に顕著ではなかった。さらに、製剤への塩化ナトリウムの添加は、タンパク質凝集およびＨＭＷＳ％の程度に顕著な影響を示さなかった。
【0114】
肉眼では見えない粒子に関して、ＨＩＡＣ粒子数は、肉眼では見えない粒子の増殖が緩衝液種および溶液ｐＨの性質に感受性であったことを示した（図２Ａ～２Ｃ）。ｐＨ４．７および５．０で緩衝した酢酸製剤は、酢酸製剤の任意の他のｐＨ、および全ての研究したヒスチジン製剤と比較して、経時的に最も少ない粒子の生成をもたらした。しかしながら、いずれの条件での粒子増殖へも識別可能なまたは明確な温度の効果はなかった。
【0115】
酢酸およびヒスチジン製剤は、塩化ナトリウムの添加有りまたは無しで、任意の所与のｐＨでのＴ０および４０℃で４週間後に、同等の粘度を示した（図３）。測定した粘度値は、全て２～３ｃＰ以内であり、患者へのＤＰ投与の間、または製造方法の間に難題を提示し得るいずれの制限よりも十分に低かった。粘度値にも顕著な変化はなく、試験した製剤が顕著な化学分解を受けなかったことを示している。４週間にわたり、３つの温度での保存後にいずれの製剤のｐＨ値にも顕著な変化はなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。これらの結果は、酢酸およびヒスチジンがいずれの顕著な化学分解も受けず、４０℃でのストレス保存の最高４週間後までも緩衝する能力を維持したことを示している。
【0116】
プレートＵＶ測定は、経時的に生じ得る濁度およびタンパク石濁の変化を追跡するために行った（図５）。Ｔ０での事前の目視検査中に観察された同じｐＨ依存性タンパク石濁が、分光測定により検出された。測定されるＯＤ値はｐＨによって増加し、ヒスチジン製剤は、酢酸製剤よりもより濁っていた。２５℃および４０℃での保存の４週間後、ほとんどの製剤のＯＤにわずかな増加が見られた。経時的なＯＤの増加は、肉眼では見えない粒子の形成によるものであった。結果は、４．７～５．０辺りのｐＨが最小量の肉眼では見えない粒子をもたらすことを確認した。
【0117】
緩衝液のみおよび緩衝タンパク質溶液の浸透圧値を比較した（表２）。酢酸製剤は、ヒスチジンよりも浸透圧がわずかに高かった。タンパク質の添加が、全ての製剤の浸透圧を増加させた。浸透圧値は、ＤＰがＩＶ注入バッグへと希釈後にのみ投与されることを考えると、全て合理的であった。
【0118】
【表3】
【0119】
Ａｂ１の化学的安定性は、酸性アイソフォームの量および単量体パーセンテージを比較した場合に見られたように、酢酸およびヒスチジン製剤で類似していた。４０℃で４週間後、ヒスチジン製剤の溶液のｐＨが６．０および６．５に達した場合に生成された酸性アイソフォームの相対量のわずかな増加がみられた。
【0120】
全ての製剤は、約１．０の同じ相対効力を有し、それらが全て許容可能であることを示している。これらの効力の結果は、先の凝集およびＨＭＷＳ％結果に則しており、全てのＨＭＷＳ％値は低く（＜２％）、したがって、効力は大きく変化しないと予想された。
【実施例2】
【0121】
界面活性剤スクリーニング
この実施例は、Ａｂ１製剤への界面活性剤ポリソルベート８０（ＰＳ８０）の添加を評価する実験を記載する。これらの実験で使用した製剤条件および試料コードを以下の表３に示す。
この実施例は、Ａｂ１製剤への界面活性剤ポリソルベート８０（ＰＳ８０）の添加を評価する実験を記載する。これらの実験で使用した製剤条件および試料コードを以下の表３に示す。
【0122】
【表4】
【0123】
製剤のプレート濁度および光学密度（ＯＤ；３４０～３６０ｎｍ）値は、５℃または４０℃で１週間保存した製剤、または強い撹拌の４８時間後の製剤について評価した。データは、ＰＳ８０を含有する製剤について、ＯＤ値が、５℃または４０℃のいずれかでの保存の１週間後、または撹拌の４８時間後に変化しなかったことを示す。２つの異なる市販の供給源のＰＳ８０（ＡおよびＢ）を使用して、様々な濃度０．０２５％、０．０５％および０．１％のＰＳ８０によっても違いは観察されなかった。しかしながら、５℃および４０℃の両方の保存で経時的に界面活性剤を添加しない製剤では、ＯＤ値はわずかに減少した。界面活性剤を含まない製剤では、わずかに高い濁度も観察された。これらの観察は、ＰＳ８０がＡｂ１タンパク質への可溶化効果を有することを示した。
【0124】
小さい可溶性の凝集体のレベルは、異なる保存および界面ストレス条件下で、ＳＥＣによってモニターした（図６）。保存温度は、わずかにのみ影響し、保存の最高２週間後に凝集の０．５％増加をもたらした；ＰＳ８０濃度の凝集レベルへの目立った効果はなかった。－３０℃と室温の間の１０回までの最悪の場合の凍結融解サイクルは、いずれもタンパク質安定性への負の影響を示さなかった（図６、下－右パネル）。
【0125】
一方、強い撹拌または震盪は、凝集に大きな影響を示す（図６、下－左パネル）。界面活性剤を添加しない製剤は、撹拌の４８時間後に最大８％ＨＭＷＳを生成した。これらの凝集レベルは、界面活性剤の存在および濃度に高度に感受性であった。０．０２５％まで低いＰＳ８０濃度は、ＰＳ８０を含まない製剤の凝集レベルの２％より低くまで凝集レベルを減少させるのに十分であった。０．０５または０．１％よりもさらに高くＰＳ８０濃度を増加させると、ＨＭＷＳ％をわずかに減少させた。これらのデータは、０．０５％がＡｂ１製剤を安定化することを標的としたＰＳ８０濃度の下限として使用されることを示した。
【0126】
上記のＳＥＣデータは、Ａｂ１が、この節で研究したほとんどの条件で高リスクの凝集を示さなかった。したがって、ＨＩＡＣは、肉眼では見えない粒子範囲のサイズである、ＳＥＣによって濾過された大きな可溶性および不溶性の凝集体の追跡に必要な重要なアッセイである。ＨＩＡＣデータは、任意の与えられた保存または界面ストレス条件下で、いずれのＰＳ８０も含有しない製剤が、実質的により多くの肉眼で見えない粒子を生成したことを示す。データは、ＰＳ８０が、Ａｂ１製剤中の粒子の数の減少に濃度依存的な効果を有したことをさらに示す。０．０２５％まで低いＰＳ８０濃度は、粒子数の減少を始めるのに十分であった。０．０５％およびそれ以上高くＰＳ８０濃度を増加させると、粒子数が継続的に減少した。
【0127】
製剤のｐＨ値は、Ｔ０および保存の２週間後に測定した。いずれの時点または温度でも、製剤のｐＨに顕著な変化はなかった。製剤ｐＨにも濃度特異的なＰＳ８０の影響はなかった。ＰＳ８０の濃度は、Ａｂ１製剤１５０ｍｇ／ｍｌのｐＨを維持する酢酸緩衝液の能力へのいずれの変化も誘導しなかった。
【0128】
この実施例の全ての研究では、いずれの試験条件についても製剤安定性へのＰＳ８０供給源の効果はみられなかった。
【実施例3】
【0129】
ＩＶバッグ希釈研究
この実施例は、異なるＩＶバッグ中でのＡｂ１製剤の安定性を試験する実験を記載する。これらの実験で使用した製剤条件は、以下の表４に示す。
この実施例は、異なるＩＶバッグ中でのＡｂ１製剤の安定性を試験する実験を記載する。これらの実験で使用した製剤条件は、以下の表４に示す。
【0130】
【表5】
【0131】
ＩＶ注入の前に、ＤＰはＩＶバッグで希釈した。ＤＰに十分な濃度の界面活性剤がないと、タンパク質分子はＩＶバッグが作製された材料のタイプによってはバッグに吸収される可能性があった。結果として、ＩＶバッグ中で希釈したＤＰは、患者に投与される意図した用量よりも低いＡＰＩ濃度であった。
【0132】
本発明者らは、異なる濃度のＰＳ８０を添加およびコートしたバッグで希釈したＡｂ１の吸収挙動および物理的安定性を追跡した。ＰＳ８０は、ＤＰ製剤を開始するのに必要な最適な濃度を決定するため、０．００１％、０．０００５％、０．０００３％、および０．０００２％の濃度に添加することによって希釈した。前述のＰＳ８０濃度は、開始ＤＰの５０～３００倍希釈のＰＳ８０濃度に相当する。次いで、ＰＳ８０を含有しないＤＰ １５０ｍｇ／ｍｌは、０．５または１．０ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＩＶバッグ材料の４つの異なる組合せへの製剤の希釈の効果および希釈を評価した：ＰＶＣバッグ中の生理食塩水、ＰＯバッグ中の生理食塩水、ＰＶＣバッグ中のデキストロース、およびＰＯバッグ中のデキストロース。
【0133】
次いで、希釈した製剤をインキュベートし、２４および４８時間後に測定した。データは、ＰＯおよびＰＶＣバッグ中の生理食塩水が、研究したいずれの添加した界面活性剤濃度でも、タンパク質吸収に顕著に影響しなかったことを示す（図７Ａ）。しかしながら、希釈剤としてデキストロースを使用することは、バッグ材料に応じてわずかに吸収に影響した。特に、ＰＶＣデキストロースバッグの組合せは、ＰＳ８０濃度が減少すると目立ったタンパク質吸収を引き起こした（図７Ａ）。結果は、ＤＰ投与について行われる推奨に直接影響した。
【0134】
ＤＰ希釈後の肉眼では見えない（＞１０μｍ）粒子生成は、使用した希釈液のタイプに高度に感受性であった。生理食塩水ベースの溶液は、デキストロースベースの溶液よりも高レベルの粒子を生成した（図７Ｂ）。これは、製剤中に使用したＰＳ８０の濃度によらなかった。０．００１％と０．００３％の間のＰＳ８０の肉眼では見えない粒子数の差は顕著ではなかった。ＩＶバッグの材料は、粒子形成には顕著な影響を持たないようであり、粒子数は同等であった。
【0135】
ＰＯおよびＰＶＣバッグと組み合わせたデキストロースおよび生理食塩水中でのインキュベーション後、希釈したＤＰ試料の凝集も評価した。生理食塩水バッグへと希釈したタンパク質は、デキストロースバッグのものよりもわずかに多くＨＭＷＳ％を生成した。ＰＯバッグも、ＰＶＣバッグより多く凝集体を生成した。タンパク質安定性にもタンパク質濃度依存性があり、より低い０．５ｍｇ／ｍｌ希釈は、一般に１．０ｍｇ／ｍｌ希釈よりも高い凝集レベルを示した。しかしながら、ＰＳ８０濃度は、タンパク質安定性に顕著な影響を示さなかった。
【実施例4】
【0136】
ＤＳおよびＤＰ安定性
この実施例は、原薬（ＤＳ）および薬物製品（ＤＰ）の長期安定性を評価するための研究を記載する。表５は、試験した製剤を示し、スクロースは抗凍結剤として使用し、ＰＳ８０は界面活性剤として使用し、ＤＴＰＡはキレート剤として使用した。
この実施例は、原薬（ＤＳ）および薬物製品（ＤＰ）の長期安定性を評価するための研究を記載する。表５は、試験した製剤を示し、スクロースは抗凍結剤として使用し、ＰＳ８０は界面活性剤として使用し、ＤＴＰＡはキレート剤として使用した。
【0137】
【表6】
【0138】
５０μＭ ＤＴＰＡを含有する２０ｍＭ酢酸緩衝液でのこれらのデータにより、同じｐＨ範囲を提供する２５ｍＭ酢酸、および１０μＭ ＥＤＴＡを含有するＵＦ／ＤＦ精製Ａｂ１の製剤は、同じ溶液挙動を示すであろうと決定された。そのため、本発明者らは、ＤＳおよびＤＰのこの予備的に提案した標的製剤を試験した：２５ｍＭ酢酸、８％スクロース、０．０６％ＰＳ８０、１０μＭキレート剤（ＤＴＰＡを試験したが、ＥＤＴＡも等価である）、ｐＨ５．０（表５）。ＤＳおよびＤＰ濃度の全範囲にわたる濃度でＡｂ１を安定化するこの製剤マトリックスの能力は、保存安定性について評価した。５℃または２５℃での保存の３カ月後、いずれの製剤でもＨＭＷＳ％に顕著な変化がなかった（図８Ａ）。４０℃では、最大約０．５％増加したが、この増加は、これらのタイプの加速するストレス保存条件下ではわずかであると考えられ、安定性および貯蔵寿命を最適化する提案した製剤マトリックスの全体的な能力を反映する。
【0139】
Ａｂ１製剤はまた、－８０℃で凍結し、次いで－２０℃で保存した。これらの条件下での保存の６カ月後、ＨＭＷＳ％の顕著な変化はなかった（図８Ｂ）。低分子量種（ＬＭＷＳ）％も、ＳＥＣによって追跡し、いずれの製剤または保存条件下でも観察された断片化に顕著な変化はなかった。さらに、全ての製剤は、１０および２５μｍ両方の肉眼では見えない粒子について、ＵＳＰ＜７８７＞規格内であった。
【0140】
いずれの条件下でもＡｂ１の化学的安定性にも劇的な変化はなかった。要するに、提案した製剤マトリックスは、５０ｍｇ／ｍｌの、可能な最低のＤＰ濃度および１６５ｍｇ／ｍｌの、可能な最高のＤＳ濃度の範囲を安定化する能力を有する。
【実施例5】
【0141】
金属添加研究およびキレート剤適合性
バイオ医薬品の製造中、ＤＳおよびＤＰへの遷移金属夾雑のリスクがわずかにある。夾雑がある場合、遷移金属は、化学的不安定性および液体溶液中の凝集をもたらし得る。この実施例は、Ａｂ１製剤への金属およびキレート剤の影響を評価した研究を記載する。表６は、金属添加を試験するために使用した製剤を示す：
バイオ医薬品の製造中、ＤＳおよびＤＰへの遷移金属夾雑のリスクがわずかにある。夾雑がある場合、遷移金属は、化学的不安定性および液体溶液中の凝集をもたらし得る。この実施例は、Ａｂ１製剤への金属およびキレート剤の影響を評価した研究を記載する。表６は、金属添加を試験するために使用した製剤を示す：
【0142】
【表7】
【0143】
表に示すように、キレート剤ＤＴＰＡの添加有りおよび無しで、Ａｂ１試料は鉄および銅を添加した。キレート剤を添加しない場合、鉄添加試料では、顕著なＭ２５２酸化および凝集がみられ、銅添加試料も酸化および凝集の増加を示したが低程度であった（図９）。しかしながら、ＤＴＰＡの存在下では、タンパク質分解の劇的な減少がみられた。
【0144】
本発明者らは、別のキレート剤、ＥＤＴＡも試験した。Ａｂ１製剤の保存安定性は、１０μＭ ＤＴＰＡまたは１０μＭ ＥＤＴＡを添加し、比較した。データは、これら２つのキレート剤が溶液中のタンパク質分子に同様のレベルの保護を提供したことを示した。これらのキレート剤は、金属誘導性の粒子形成または凝集を選択的に軽減した。
【実施例6】
【0145】
ＡＰＩおよび賦形剤のための濃度範囲を有する製剤頑強性
この実施例は、抗体ならびに賦形剤の濃度範囲にわたり、Ａｂ１製剤の安定性を評価する研究を記載する。研究のために使用した製剤は、以下の表７に示す。
この実施例は、抗体ならびに賦形剤の濃度範囲にわたり、Ａｂ１製剤の安定性を評価する研究を記載する。研究のために使用した製剤は、以下の表７に示す。
【0146】
【表8】
【0147】
本発明者らは、二量体、三量体、および四量体の亜種としてＨＭＷＳを解析することによって凝集を評価した。これは、直接凝集の詳細への製剤成分のバリエーションの影響を追跡する能力を可能にした。ｐＨ４．７およびｐＨ５．３が最も安定であり、大量のＨＭＷＳを生成せず、さらに、優勢であるＨＭＷ種は二量体であった（図１０）。ｐＨ５．０の製剤は、およそ０．６％多い全凝集体を生成し、二量体レベルはｐＨ４．７および５．３に匹敵し、０．６％は主に三量体種を示した。にもかかわらず、全ＨＭＷＳ％レベルは許容可能であった。
【0148】
時間または保存温度のいずれに対しても、異なる製剤にわたり肉眼では見えない粒子（１０および２５μｍ）の数に劇的な変化はなかった（データは示さない）。凝集または凍結融解サイクルストレス後の肉眼では見ない粒子（１０および２５μｍ）の数にも劇的な変化はなかった（データは示さない）。
【0149】
結論として、酢酸緩衝製剤は、ヒスチジンと比較して、最適な物理的および化学的安定性を提供した。肉眼では見えない粒子の数は、緩衝液種の性質およびｐＨに高度に感受性であり、低ｐＨ（４．７および５．０）の酢酸製剤は、最も少ない粒子数を生成した。濁度およびタンパク石濁もｐＨ依存性であり、低ｐＨ酢酸条件では製剤はタンパク石濁がずっと少なく、低ｐＨではタンパク質間相互作用を誘引しにくいことを示している。タンパク石濁が少ない溶液は、ＵＦＤＦ操作中に短いプロセシング時間を要することも示され、高濃度の原薬を生成するために必要な重要な製造上考慮すべき事柄である。
【0150】
最終製剤へのＰＳ８０の添加は、凝集または凍結／融解サイクルのような界面ストレスによって加速することが示された、凝集、特に粒子形成リスクを軽減するために必要である。ＰＳ８０は、ＩＶ注入成分（例えば、ＩＶバッグ）へのタンパク質吸収の軽減または減少にも有効であった。ＰＳ８０濃度≧０．０５％は、最適な安定性を提供した。
【0151】
金属添加試料の顕著な酸化および中程度の凝集レベルは、加速保存条件下で観察された。金属キレート剤を製剤に添加し、起こり得る可能性のある金属誘導性タンパク質および賦形剤分解からの保護を提供する。１０μＭ ＥＤＴＡおよび１０μＭ ＤＴＰＡは同等のレベルの保護を提供し、ＨＭＷＳ、酸化、およびＰＳ８０濃度に同様の変化をもたらした。
【0152】
およそ８０ｍｇ／ｍｌと同等である８％スクロースは、それぞれ５０ｍｇ／ｍｌおよび１５０ｍｇ／ｍｌの濃度のＤＰおよびＤＳの両方の保護に好適な割合であることが見出された。
【0153】
これらの安定性研究からの結果は、様々な保存および他のストレス条件下で、凍結ＤＳならびに液体ＤＰを安定化する標的製剤の頑強性を実証した。
【実施例7】
【0154】
Ａｂ１の代替製剤［注入のための溶液のための粉末］
さらなる例示的なＡｂ１製剤は、滅菌凍結乾燥製品である。薬物製品は、ＵＳＰ Ｔｙｐｅ１ホウケイ酸ガラスバイアルに、０．３ｍＬ過剰の１０．３ｍＬ／バイアルで充填された。バイアルは、シリコン処理した灰色のブチルゴム栓によって蓋をされ、アルミニウムシールおよびフリップオフキャップでシールした。表８は、Ａｂ１薬物製品の例示的な組成物の情報を提供する。
さらなる例示的なＡｂ１製剤は、滅菌凍結乾燥製品である。薬物製品は、ＵＳＰ Ｔｙｐｅ１ホウケイ酸ガラスバイアルに、０．３ｍＬ過剰の１０．３ｍＬ／バイアルで充填された。バイアルは、シリコン処理した灰色のブチルゴム栓によって蓋をされ、アルミニウムシールおよびフリップオフキャップでシールした。表８は、Ａｂ１薬物製品の例示的な組成物の情報を提供する。
【0155】
投与のため、各バイアルは、９．７ｍＬの注射用水によって復元し、２２℃で、ｐＨ６．０の、１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、２％（ｗ／ｖ）スクロース、３．５％（ｗ／ｖ）マンニトール、１０ｍＭ Ｌ－メチオニン、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０を含有する水溶液中、２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を生じた（表８）。
【0156】
賦形剤スクリーニングは、２％スクロースが凍結および融解中の凝集の形成を減少させることを示した。充填剤、マンニトールは、タンパク質安定性に顕著に影響しなかったが、優れた凍結乾燥ケーキの産生を助けた。
【0157】
【表9】
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図4-4】
【図4-5】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7A-1】
【図7A-2】
【図7B-1】
【図7B-2】
【図8A-1】
【図8A-2】
【図8A-3】
【図8B】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【配列表】
【国際調査報告】