特表 2024-523343 発現ベクター、細菌配列不含有ベクターならびにそれらの作製方法および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】発現ベクター、細菌配列不含有ベクターならびにそれらの作製方法および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20240621BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/09 110

A61K48/00

A61P43/00 105

A61K31/7088

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577551

(86)(22)【出願日】2022-06-16

(85)【翻訳文提出日】2024-02-08

(86)【国際出願番号】 IB2022055620

(87)【国際公開番号】W WO2022264095

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/211,343

(32)【優先日】2021-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/306,015

(32)【優先日】2022-02-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/331,638

(32)【優先日】2022-04-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522384732

【氏名又は名称】メディフェイジ・バイオシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＭＥＤＩＰＨＡＧＥ ＢＩＯＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】スラブチェフ，ロデリック

(72)【発明者】

【氏名】ナフィッシ，ナフィセー

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB21

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB21

(57)【要約】

本発明は、発現ベクター、ミニストリングＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）などの細菌配列不含有ベクター、およびベクター作製システムを含む細菌配列不含有ベクターの作製方法を提供する。本発明はまた、ベクターを含む組成物、ならびにベクターおよび組成物の使用を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）バックボーン配列、
（ｂ）（ｉ）目的の核酸配列を含む発現カセット、
（ｉｉ）前記発現カセットの５’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列、
（ｉｉｉ）前記発現カセットの３’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列、および
（ｉｖ）前記第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の非結合領域内に組み込まれた１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列
を含む配列、ならびに
（ｃ）（ｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列であって、前記エンドヌクレアーゼ標的配列が、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、エンドヌクレアーゼ標的配列、
（ｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー、
（ｉｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中のプロモーターの５’末端との間に組み込まれたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、
（ｉｖ）イントロンを含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）であって、前記５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、
（ｖ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれた脊椎動物のクロマチンインシュレーター、
（ｖｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、
（ｖｉｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたスキャフォールド／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）、または
（ｖｉｉｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたＤＮＡ核標的配列（ＤＴＳ）であって、前記ＤＴＳが、発現カセットと第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、ＤＴＳ
の１以上
を含む、発現ベクター。

【請求項2】

エンドヌクレアーゼ標的配列が、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列を含む請求項１に記載の発現ベクター、ここで、前記エンドヌクレアーゼ標的配列が、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび1以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある。

【請求項3】

第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列を含む、請求項１または２に記載の発現ベクター。

【請求項4】

エンドヌクレアーゼ標的配列がホーミングエンドヌクレアーゼに対するものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項5】

エンドヌクレアーゼ標的配列が、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉに対するものである、請求項１から４のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項6】

エンドヌクレアーゼ標的配列がＩ－ＳｃｅＩに対するものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項7】

エンドヌクレアーゼ標的配列がＰＩ－ＳｃｅＩに対するものである、請求項１から５のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項8】

エンドヌクレアーゼ標的配列がＣａｓエンドヌクレアーゼに対するものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項9】

ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項８に記載の発現ベクター。

【請求項10】

第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項11】

合成エンハンサーが、配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列の複数の連続したコピーを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。

【請求項12】

合成エンハンサーが配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項１１に記載の発現ベクター。

【請求項13】

合成エンハンサーが、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれる、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項14】

ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれた配列番号４７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むキメライントロンを含む、請求項１３に記載の発現ベクター。

【請求項15】

発現カセット中の第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端とプロモーターの５’末端との間に組み込まれたＣＭＶエンハンサーを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項16】

ＣＭＶエンハンサーが、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項１５に記載の発現ベクター。

【請求項17】

ＣＭＶプロモーターが、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている、請求項１５または１６に記載の発現ベクター。

【請求項18】

第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列と目的の核酸配列との間に組み込まれた配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項19】

イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、請求項１から９のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項20】

イントロンが、配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。

【請求項21】

イントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む、請求項１９または２０に記載の発現ベクター。

【請求項22】

配列番号１の位置２５から５５までのいずれか２個のヌクレオチドに対応するイントロン内の２個のヌクレオチドの間に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む、請求項２０に記載の発現ベクター。

【請求項23】

非コーディング配列がＳ／ＭＡＲである、請求項２１または２２に記載の発現ベクター。

【請求項24】

Ｓ／ＭＡＲがＭＡＲ－５である、請求項２３に記載の発現ベクター。

【請求項25】

５’ＵＴＲが、配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。

【請求項26】

５’ＵＴＲが、配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項１９に記載の発現ベクター。

【請求項27】

プロモーターが、ニワトリ β－アクチンプロモーターである、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項28】

プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項29】

プロモーターが、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項１９から２８のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項30】

ＣＭＶエンハンサーが、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項２９に記載の発現ベクター。

【請求項31】

ポリアデニル化シグナルが目的の核酸配列の３’末端に組み込まれている、請求項１から３０のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項32】

ポリアデニル化シグナルが、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項３１に記載の発現ベクター。

【請求項33】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項34】

脊椎動物のクロマチンインスレーターが、５’－ＨＳ４ ニワトリ－β－グロブリンインスレーター（ｃＨＳ４）である、請求項３３に記載の発現ベクター。

【請求項35】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥを含む、請求項１から３０または３３から３４のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項36】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲを含む、請求項１から３０または３３から３５のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項37】

Ｓ／ＭＡＲがＭＡＲ－５である、請求項３６に記載の発現ベクター。

【請求項38】

ポリアデニル化シグナルが、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項39】

第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各側に隣接するエンハンサー配列をさらに含む、請求項２から３８のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項40】

第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各側に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列を含む、請求項３９に記載の発現ベクター。

【請求項41】

エンハンサー配列がＳＶ４０エンハンサー配列である、請求項３９または４０に記載の発現ベクター。

【請求項42】

第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたＤＴＳを含み、前記ＤＴＳが、発現カセットと、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、請求項１から３８のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項43】

ＤＴＳがＳＶ４０エンハンサー配列である、請求項４２に記載の発現ベクター。

【請求項44】

ＤＴＳが細胞特異的である、請求項４２に記載の発現ベクター。

【請求項45】

第１および第２の標的配列ならびに１以上の追加の標的配列が、ＰＹ５４ ｐａｌ部位、Ｎ１５ ｔｅｌＲＬ部位、ｌｏｘＰ部位、φＫ０２ ｔｅｌＲＬ部位、ＦＲＴ部位、ｐｈｉＣ３１ ａｔｔＰ部位およびλ ａｔｔＰ部位からなる群より選択される、請求項１から４４のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項46】

発現ベクターが標的配列の各々を含む、請求項４５に記載の発現ベクター。

【請求項47】

発現ベクターが、ｐａｌ部位、ならびに該ｐａｌ部位内に組み込まれたｔｅｌＲＬリコンビナーゼ標的結合配列、ｌｏｘＰリコンビナーゼ標的結合配列およびＦＲＴリコンビナーゼ標的結合配列を含む、請求項４５または４６に記載の発現ベクター。

【請求項48】

第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列がそれぞれ、配列番号３３の核酸配列を含む、請求項１から４７のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項49】

発現ベクターが、細菌配列不含有ベクターを産生するためのものである、請求項１から４８のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項50】

細菌配列不含有ベクターが共有結合性閉鎖環状ベクターである、請求項４９に記載の発現ベクター。

【請求項51】

細菌配列不含有ベクターが共有結合性閉鎖直線状ベクターである、請求項４９に記載の発現ベクター。

【請求項52】

誘導性プロモーターの制御下でリコンビナーゼをコードする組換え細胞を含むベクター作製システムであって、該組換え細胞が、請求項１から５１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含み、かつ該リコンビナーゼが、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列、または発現ベクター中の１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列のうちの１つを標的とする、ベクター作製システム。

【請求項53】

リコンビナーゼが、ＴｅｌＮ、Ｔｅｌ、ＣｒｅまたはＦｌｐである、請求項５２に記載のベクター作製システム。

【請求項54】

組換え細胞が、誘導性プロモーターの制御下にエンドヌクレアーゼをさらにコードし、該エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ標的配列を含む発現ベクター中のエンドヌクレアーゼ標的配列を標的とする、請求項５２または５３に記載のベクター作製システム。

【請求項55】

エンドヌクレアーゼがホーミングエンドヌクレアーゼである、請求項５４に記載のベクター作製システム。

【請求項56】

ホーミングエンドヌクレアーゼが、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉである、請求項５５に記載のベクター作製システム。

【請求項57】

エンドヌクレアーゼがＩ－ＳｃｅＩである、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のベクター作製システム。

【請求項58】

エンドヌクレアーゼがＰＩ－ＳｃｅＩである、請求項５４から５６のいずれか一項に記載のベクター作製システム。

【請求項59】

組換え細胞が、エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼゲノム編集システムをコードする、請求項５４に記載のベクター作製システム。

【請求項60】

ヌクレアーゼゲノム編集システムが、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムである、請求項５９に記載のベクター作製システム。

【請求項61】

ＣａｓエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項６０に記載のベクター作製システム。

【請求項62】

誘導性プロモーターが、熱的調節性、化学的調節性、ＩＰＴＧ調節性、グルコース調節性、アラビノース誘導性、Ｔ７ポリメラーゼ調節性、低温衝撃誘導性、ｐＨ誘導性、またはそれらの組み合わせである、請求項５２から６１のいずれか一項に記載のベクター作製システム。

【請求項63】

リコンビナーゼの発現に好適な条件下において請求項５２から６２のいずれか一項に記載のベクター作製システムをインキュベートする工程を含む、細菌配列不含有ベクターを製造する方法。

【請求項64】

エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下において請求項３８から４６のいずれか一項に記載のベクター作製システムをインキュベートする工程を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

ヌクレアーゼゲノム編集システムの発現に好適な条件下で請求項５９から６２のいずれか一項に記載のベクター作製システムをインキュベートすることをさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項66】

細菌配列不含有ベクターを回収する工程をさらに含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法により作製される、細菌配列不含有ベクター。

【請求項68】

（ａ）目的の核酸配列を含む発現カセット、および
（ｂ）以下の１以上：
（ｉ）発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー、
（ｉｉ）発現カセット中のプロモーターの５’に位置するＣＭＶエンハンサー、
（ｉｉｉ）イントロンを含む５’ＵＴＲであって、該５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、
（ｉｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーター、
（ｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥ、
（ｖｉ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲ、または
（ｖｉｉ）発現カセットの５’に位置するＤＴＳ
を含む、細菌配列不含有ベクター。

【請求項69】

発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む、請求項６８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項70】

合成エンハンサーが、配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列の複数の連続したコピーを含んでなる、請求項６９に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項71】

合成エンハンサーが配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項７０に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項72】

合成エンハンサーが、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれている、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項73】

ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれた配列番号４７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むキメライントロンを含む、請求項７２に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項74】

発現カセット中のプロモーターの５’に位置するＣＭＶエンハンサーを含む、請求項６８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項75】

ＣＭＶエンハンサーが、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項７４に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項76】

ＣＭＶプロモーターが、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’に組み込まれている、請求項７４または７５に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項77】

目的の核酸配列に対して５’に位置する配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項６８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項78】

イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、該５’ＵＴＲが、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、請求項６８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項79】

イントロンが、配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項７８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項80】

イントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む、請求項７８または７９に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項81】

配列番号１のヌクレオチド位置２５から５５の何れか２つのヌクレオチドに対応するイントロン中のヌクレオチドの２つの間に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む、請求項７９に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項82】

非コーディング配列がＳ／ＭＡＲである、請求項８０または８１に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項83】

Ｓ／ＭＡＲがＭＡＲ－５である、請求項８２に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項84】

５’ＵＴＲが、配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項７８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項85】

５’ＵＴＲが、配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項７８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項86】

プロモーター がニワトリ β－アクチンプロモーターである、請求項７８から８５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項87】

プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項７８から８５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項88】

プロモーターが、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項７８から８７のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項89】

ＣＭＶエンハンサーが、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている、請求項８８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項90】

ポリアデニル化シグナルが、目的の核酸配列の３’末端に組み込まれている、請求項６８から８９のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項91】

ポリアデニル化シグナルが、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項９０に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項92】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む、請求項６８から８９のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項93】

脊椎動物のクロマチンインスレーターがｃＨＳ４である、請求項９２に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項94】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥを含む、請求項６８から８９または９２から９３のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項95】

発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲを含む、請求項６８から８９または９２から９４のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項96】

Ｓ／ＭＡＲがＭＡＲ－５である、請求項９５に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項97】

ポリアデニル化シグナルが、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む、請求項９２から９６のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項98】

発現カセットの両側に隣接するエンハンサー配列をさらに含む、請求項６８から９７のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項99】

発現カセットの両側に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列を含む、請求項９８に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項100】

エンハンサー配列がＳＶ４０エンハンサー配列である、請求項９８または９９に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項101】

発現カセットの５’に位置するＤＴＳを含む、請求項６８から９７のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項102】

ＤＴＳがＳＶ４０エンハンサー配列である、請求項１０１に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項103】

ＤＴＳが細胞特異的である、請求項１０１に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項104】

共有結合性閉鎖環ベクターである、請求項６８から１０３のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項105】

共有結合性閉鎖直線状ベクターである、請求項６８から１０３のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクター。

【請求項106】

請求項１から５１のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項６７から１０５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクターを含む、組換え細胞。

【請求項107】

請求項１から５１のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項６７から１０５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクターを含む、組成物。

【請求項108】

送達剤をさらに含む、請求項１０７に記載の組成物。

【請求項109】

送達剤がナノ粒子である、請求項１０８に記載の組成物。

【請求項110】

送達剤が標的化リガンドを含む、請求項１０８または１０９に記載の組成物。

【請求項111】

薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項１０７から１１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項112】

請求項１から５１のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項６７から１０５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクターまたは請求項１１１に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を処置する方法。

【請求項113】

配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項114】

配列番号２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項115】

配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項116】

配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項117】

配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項118】

配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項119】

配列番号１３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項120】

配列番号１４と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項121】

配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項122】

核酸配列の３’末端に１００個から１２０個のアデニンヌクレオチドをさらに含む、請求項８６から８８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項123】

配列番号１６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項124】

配列番号１７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項125】

配列番号１８と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項126】

配列番号３５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項127】

配列番号３６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項128】

配列番号３７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項129】

配列番号３８と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項130】

配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項131】

請求項１１３から１３０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項132】

請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドおよび請求項１１９から１２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項133】

請求項１から５１のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項６７から１０５のいずれか一項に記載の細菌配列不含有ベクターまたは請求項１０７から１１１のいずれか一項に記載の医薬組成物から、目的の核酸配列を遺伝子編集のための標的部位に挿入することを含む、遺伝子編集方法。

【請求項134】

遺伝子編集が非相同末端結合によるものである、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

遺伝子編集が相同性指向修復によるものである、請求項１３３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

ＥＦＳ－ＷＥＢにより電子的に提出された配列表の参照
電子的に提出された配列表（名称：4471_007PC03_Seqlisting_ST25.txt；サイズ：２１６，８９８バイト；および、作成日：２０２２年６月１５日）の内容は、引用によりその全体が本願明細書に包含される。

【0002】

発明の分野
本発明は、発現ベクター、細菌配列不含有ベクター、細菌配列不含有ベクターを作製するためのベクター作製システムおよびそれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0003】

背景
遺伝子療法は、重要な治療有望性を有するが、その可能性の実現には課題が残っている。

【0004】

ほとんどの臨床治験は、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルス送達系を利用している。進歩はしているが、ウイルス系は遺伝子導入および導入遺伝子の発現効率にばらつきがあり、炎症反応および免疫反応または挿入変異誘発などの望ましくない影響に関する懸念が残っている。さらに、ウイルスベクターの作製、精製および保存にはコストがかかり、変動性が高く、かつ非効率であることが多い。例えば、Lingelbach, D., Drug Development ＆ Delivery 20(5): 50-54 (2020); Wright, J.F., Gene Therapy 15:840-848 (2008)を参照のこと。

【0005】

非ウイルス性ベクターも遺伝子治療送達システムとして研究されてきた。非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターよりも安全ではあるが、導入遺伝子の発現レベルおよび発現の持続性が低いなどの理由で、その有効性が制限され得る。例えば、Kay, M., Nature Reviews Genetics 12: 316-328 (2011)を参照のこと。

【0006】

本明細書に記載のような改良されたベクターが必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

概要
本発明は、（ａ）バックボーン配列；（ｂ）（ｉ）目的の核酸配列を含む発現カセット、（ｉｉ）前記発現カセットの５’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列、（ｉｉｉ）前記発現カセットの３’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列、および（ｉｖ）前記第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の非結合領域内に組み込まれた１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列、を含む配列；ならびに、（ｃ）（ｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列であって、前記エンドヌクレアーゼ標的配列が、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、エンドヌクレアーゼ標的配列；（ｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー；（ｉｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中のプロモーターの５’末端との間に組み込まれたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー；（ｉｖ）イントロンを含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）であって、前記５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ；（ｖ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれた脊椎動物のクロマチンインシュレーター；（ｖｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；（ｖｉｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたスキャフォールド／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）；または、（ｖｉｉｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたＤＮＡ核標的配列（ＤＴＳ）であって、前記ＤＴＳが、発現カセットと第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、ＤＴＳ、の１以上、を含む、発現ベクターに関する。

【0008】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列を含み、ここで、前記エンドヌクレアーゼ標的配列は、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび1以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列内に組み込まれている。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、Ｉ－ＳｃｅＩに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、ＰＩ－ＳｃｅＩに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼに対するものである。ある局面において、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。

【0009】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列の複数の連続したコピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれている。ある局面において、配列番号４７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。

【0010】

ある局面において、発現ベクターは発現カセット中の第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端とプロモーターの５’末端との間に組み込まれたＣＭＶエンハンサーを含む。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。

【0011】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列と目的の核酸配列との間に組み込まれた配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0012】

ある局面において、発現ベクターは、イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、イントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号１の位置２５から５５までのいずれか２個のヌクレオチドに対応するイントロン内の２個のヌクレオチドの間に組み込まれた非コーディング配列を含む。ある局面において、非コーディング配列は、Ｓ／ＭＡＲである。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５である。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、プロモーターは、ニワトリ β－アクチンプロモーターである。ある局面において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。ある局面において、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。

【0013】

ある局面において、発現ベクターは、目的の核酸配列の３’末端に組み込まれているポリアデニル化シグナを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0014】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、５’－ＨＳ４ ニワトリ－β－グロブリンインスレーター（ｃＨＳ４）である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0015】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0016】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組込まれたＳ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0017】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各側に隣接するエンハンサー配列を含む。ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各側に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列を含む。ある局面において、エンハンサー配列は、ＳＶ４０エンハンサー配列である。

【0018】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたＤＴＳを含み、前記ＤＴＳは、発現カセットと、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある。ある局面において、ＤＴＳは、ＳＶ４０エンハンサー配列である。ある局面において、ＤＴＳは細胞特異的である。

【0019】

ある局面において、第１および第２の標的配列ならびに１以上の追加の標的配列は、ＰＹ５４ ｐａｌ部位、Ｎ１５ ｔｅｌＲＬ部位、ｌｏｘＰ部位、φＫ０２ ｔｅｌＲＬ部位、ＦＲＴ部位、ｐｈｉＣ３１ ａｔｔＰ部位およびλ ａｔｔＰ部位からなる群より選択される。ある局面において、発現ベクターは、標的配列の各々を含む。ある局面において、発現ベクターは、ｐａｌ部位、ならびに該ｐａｌ部位内に組み込まれたｔｅｌＲＬリコンビナーゼ標的結合配列、ｌｏｘＰリコンビナーゼ標的結合配列およびＦＲＴリコンビナーゼ標的結合配列を含む。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列はそれぞれ、配列番号３３の核酸配列を含む。

【0020】

ある局面において、発現ベクターは、細菌配列不含有ベクターを産生するためのものである。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは共有結合性閉鎖環ベクターである。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは共有結合性閉鎖直線状ベクターである。

【0021】

本発明は、誘導性プロモーターの制御下でリコンビナーゼをコードする組換え細胞を含むベクター作製システムに関し、ここで、該組換え細胞は、上記の何れかの発現ベクターを含み、かつ該リコンビナーゼは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列、または発現ベクター中の１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列のうちの１つを標的とする。ある局面において、リコンビナーゼは、ＴｅｌＮ、Ｔｅｌ、ＣｒｅまたはＦｌｐである。

【0022】

ある局面において、組換え細胞は、誘導性プロモーターの制御下にエンドヌクレアーゼをさらにコードし、該エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ標的配列を含む発現ベクター中のエンドヌクレアーゼ標的配列を標的とする。ある局面において、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼである。ある局面において、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉである。ある局面において、エンドヌクレアーゼはＩ－ＳｃｅＩである。ある局面において、エンドヌクレアーゼはＰＩ－ＳｃｅＩである。ある局面において、組換え細胞は、エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼゲノム編集システムをコードしている。ある局面において、ヌクレアーゼゲノム編集システムは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼを含むクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステムである。ある局面において、ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。ある局面において、誘導性プロモーターは、熱的調節性、化学的調節性、ＩＰＴＧ調節性、グルコース調節性、アラビノース誘導性、Ｔ７ポリメラーゼ調節性、低温衝撃誘導性、ｐＨ誘導性、またはそれらの組み合わせである。

【0023】

本発明は、リコンビナーゼの発現に好適な条件下において上記のベクター作製システムをインキュベートする工程を含む、細菌配列不含有ベクターを製造する方法に関する。ある局面において、前記方法は、エンドヌクレアーゼの発現に好適な条件下において、エンドヌクレアーゼをコードする上記のベクター作製システムをインキュベートする工程をさらに含む。ある局面において、前記方法は、ヌクレアーゼゲノム編集システムの発現に好適な条件下で上記のベクター作製システムの何れかをインキュベートすることをさらに含む。ある局面において、前記方法は、細菌配列不含有ベクターを回収する工程をさらに含む。

【0024】

本発明は、上記の細菌配列不含有ベクターの製造方法の何れかにより作製される細菌配列不含有ベクターに関する。

【0025】

本発明は、（ａ）目的の核酸配列を含む発現カセット、および（ｂ）以下の１以上：（ｉ）発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー、（ｉｉ）発現カセット中のプロモーターの５’に位置するＣＭＶエンハンサー、（ｉｉｉ）イントロンを含む５’ＵＴＲであって、該５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、（ｉｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーター、（ｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥ、（ｖｉ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲ、または（ｖｉｉ）発現カセットの５’に位置するＤＴＳ、を含む、細菌配列不含有ベクターに関する。

【0026】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列の複数の連続したコピーを含んでなる。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれている。ある局面において、配列番号４７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。

【0027】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中のプロモーターの５’に位置するＣＭＶエンハンサーを含む。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’に組み込まれている。

【0028】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列に対して５’に位置する配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0029】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、該５’ＵＴＲが、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、イントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号１のヌクレオチド位置２５から５５の何れか２つのヌクレオチドに対応するイントロン中のヌクレオチドの２つの間に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。ある局面において、非コーディング配列はＳ／ＭＡＲである。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５である。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。ある局面において、プロモーターは、ニワトリ β－アクチンプロモーターである。ある局面において、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。ある局面において、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２または配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。

【0030】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列の３’末端に組み込まれているポリアデニル化シグナルを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0031】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターはｃＨＳ４である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0032】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む。

【0033】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５である。

【0034】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットの両側に隣接するエンハンサー配列を含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットの両側に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列を含む。ある局面において、エンハンサー配列はＳＶ４０エンハンサー配列である。

【0035】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセットの５’に位置するＤＴＳを含む。ある局面において、ＤＴＳは、ＳＶ４０エンハンサー配列である。ある局面において、ＤＴＳは細胞特異的である。

【0036】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは共有結合性閉鎖環ベクターである。

【0037】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、共有結合性閉鎖直線状ベクターである。

【0038】

本発明は、上記の何れかの発現ベクターまたは上記の何れかの細菌配列不含有ベクターを含む組換え細胞に関する。

【0039】

本発明は、上記の何れかの発現ベクターまたは上記の何れかの細菌配列不含有ベクターを含む組成物に関する。ある局面において、組成物は送達剤をさらに含む。ある局面において、送達剤はナノ粒子である。ある局面において、送達剤は、標的化リガンドを含む。ある局面において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である。

【0040】

本発明は、上記の何れかの発現ベクター、上記の何れかの細菌配列不含有ベクターまたは上記の何れかの医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を処置する方法に関する。

【0041】

本発明は、配列番号１と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0042】

本発明は、配列番号２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0043】

本発明は、配列番号３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0044】

本発明は、配列番号５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0045】

本発明は、配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0046】

本発明は、配列番号４６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0047】

本発明は、配列番号１３と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0048】

本発明は、配列番号１４と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0049】

本発明は、配列番号１５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0050】

ある局面において、配列番号１３から１５の何れかと少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む上記の何れかのポリヌクレオチドは、核酸配列の３’末端に１００個から１２０個のアデニンヌクレオチドをさらに含む。

【0051】

本発明は、配列番号１６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0052】

本発明は、配列番号１７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0053】

本発明は、配列番号１８と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0054】

本発明は、配列番号３５と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0055】

本発明は、配列番号３６と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0056】

本発明は、配列番号３７と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0057】

本発明は、配列番号３８と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0058】

本発明は、配列番号３９と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。

【0059】

本発明は、上記の何れかのポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。

【0060】

本発明は、配列番号２、３または５の何れかの１つと少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド、および（ｉ）配列番号１３－１８の何れか１つと少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｉｉ）配列番号１３－１５の何れか１つと少なくとも約９０％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチド、および核酸配列の３’末端に１００個から１２０個のアデニンヌクレオチド、を含む発現ベクターに関する。

【0061】

本発明は、上記の何れかの発現ベクター、上記の何れかの細菌配列不含有ベクターまたは上記の何れかの医薬組成物から目的の核酸配列を遺伝子編集のための標的部位に挿入する工程を含む遺伝子編集方法に関する。ある局面において、遺伝子編集は、非相同末端結合によるものである。ある局面において、遺伝子編集は相同性指向修復によるものである。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】図１は、発現ベクター pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*のベクターマップを示す。

【図2】図２は、発現ベクター pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpAのベクターマップを示す。

【図3】図３は、ライブイメージングによるＨＥＫ－２９３細胞の蛍光を評価した写真を示す。（Ａ）はプラスミドなしでリポフェクタミンに曝露した陰性対照細胞を示し、（Ｂ）は図１の発現ベクターでトランスフェクトした細胞を示し、（Ｃ）は図２の発現ベクターでトランスフェクトした細胞を示し、（Ｄ）はＣＡＧプロモーターの制御下でｅＧＦＰを発現する親発現ベクターpGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS* (PP-CAG-GFP)でトランスフェクトした陽性対照細胞を示す。

【図4】図４は、図３（Ａ）～（Ｄ）に従って分けた細胞の相対蛍光強度の棒グラフを示す。図４および５における“pGL2-SecNLuc-eGFP”とは、図１のpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*発現ベクターでトランスフェクトした細胞を示す。図４および５における、“pcDNA-SecNLuc-eGFP”は、図２のpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA発現ベクターでトランスフェクトした細胞を示す。

【図5】図５は、図３（Ａ）～（Ｃ）に従ってトランスフェクトした細胞の培地中の相対ルシフェラーゼ強度の棒グラフを示す。

【図6】図６は、発現ベクターpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*のベクターマップを示す。

【図7】図７は、発現ベクターpGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*のベクターマップを示す。

【図8】図８は、発現ベクターpGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*のベクターマップを示す。

【図9】図９は、哺乳動物発現カセットを欠くpuc57プラスミドで細胞をエレクトロポレーションした陰性対照（Neg. Ctl. (プラスミドなし))と比較して、図１（pGL2-SecNLuc-eGFP)、図６（WPRE）、図７（5'UTR1+WPRE）および図８（5'UTR2+WPRE）の発現ベクターで細胞をエレクトロポレーションした２日後、６日後、１０日後、１４日後、１７日後、２０日後、２７日後および３４日後の、ＨＥＫ－２９３細胞の培地中の相対ルミノメーター単位（相対発光量、ＲＬＵとも呼ばれる）で示される長期間のルシフェラーゼ活性の折れ線グラフを示す。*＝ｐ＜０．０５、** ＝ｐ＜０．０１、*** ＝ｐ＜０．００１および **** ＝ｐ＜０．０００１．

【図10】図１０は、継代数１、２、３および５における、図９に記載のトランスフェクト細胞および陰性対照ＨＥＫ－２９３細胞の培地中のＲＬＵにおける発光で示されるルシフェラーゼ活性の棒グラフを示す。

【図11】図１１は、図７の発現ベクター（2nd gen pDNA (CMV+U1+W)）、図７の発現ベクター（2nd gen msDNA (CMV+U1+W)）から産生されたｍｓＤＮＡまたはルシフェラーゼ導入遺伝子を含む図２の発現ベクター（従来のｐｃＤＮＡ）を細胞にエレクトロポレーションした後の、それぞれ８日目、１５日目、２４日目、３１日目、３８日目、４５日目および５２日目に対応する、継代数１、２、３、４、５、６および７におけるＨＥＫ－２９３細胞における相対ルシフェラーゼ強度の折れ線グラフを示す。

【図12】図１２は、図９に記載したように、図１または図７の発現ベクターでトランスフェクトした細胞における蛍光を示す。（Ａ）は、継代数１、２、３および５におけるライブイメージングによってＨＥＫ－２９３細胞における蛍光を評価した写真を示す。（Ｂ）は、各継代数における３つのライブ蛍光画像から視野内に観察されたｅＧＦＰ陽性（ＧＦＰ^＋）細胞の折れ線グラフを示す；有意でない (ns) ＝ｐ＞０．０５。（Ｃ）継代数５における３つのライブ蛍光画像から測定したＧＦＰ^＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すドットプロットを示す。各コンストラクトの下にある棒グラフは、測定されたすべてのＧＦＰ^＋細胞からの平均ＭＦＩ値を示す。**** ＝ ｐ＜０．０００１。

【0063】

【図13】図１３は、５０μｇのpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (陽性対照, PSNLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pCAGLuc)またはpGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (pGSNLuc-WPRE)の単回のハイドロダイナミック尾静脈注射後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に野生型マウスから採取した血漿中のＲＬＵ／ｍｇタンパク質の折れ線グラフを示す。

【図14】図１４は、５０μｇのpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA（陽性対照, PSNLuc）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* （pCAGLuc）またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* （pCAGLucWPRE）の単回のハイドロダイナミック尾静脈注射後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に野生型マウスから採取した血漿中のＲＬＵ／ｍｇタンパク質の折れ線グラフを示す。

【図15】図１５は、５μｇのpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA （陽性対照, pDNA CMV-U (SSeqなし)）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* （SSeq pDNA CAG）またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* （SSeq pDNA CAG-W）の単回ハイドロダイナミック尾静脈注射後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に野生型マウスから採取した血漿中のＲＬＵ／ｍｇタンパク質の折れ線グラフを示す。

【図16】図１６は、５μｇのpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA （陽性対照, No-SSeq pDNA CMV-U）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* （2XSSeq pDNA CAG-W）またはmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA （2XSSeq msDNA CAG-W）の単回のハイドロダイナミック尾静脈注射後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に野生型マウスから採取した血漿中のＲＬＵ／ｍｇタンパク質の折れ線グラフを示す。

【図17】図１７Ａ～Ｄは、図１６に記載のベクター５μｇの単回のハイドロダイナミック尾静脈注射後５６日目の野生型マウスならびにベクターを注射しない陰性対照マウスの肝臓におけるＥＬＩＳＡによって決定されたＧＦＰ発現の棒グラフを示す。（Ａ）はＧＦＰ濃度をμｇ／ｍＬで示す。（Ｂ）は、ＧＦＰのμｇを全タンパク質のμｇに対して正規化したものを示す。（Ｃ）は、ＧＦＰのμｇを全組織のｇに対して正規化したものを示す。（Ｄ）は対照に対するＧＦＰの発現レベルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【図18】図１８は、図１６に記載したベクター５μｇの単回のハイドロダイナミック尾静脈注射後５６日目の野生型マウスならびにベクターを注射しない陰性対照マウスの肝臓における細胞質ＧＦＰタンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す棒グラフである。

【図19】図１９は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）担体（ビークル（対照））またはＬＮＰおよびmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA （LNP-2G msDNA-CAG-SecretedNanoLuc）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* （LNP-2G ppDNA-CAG-SecretedNanoLuc）、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA （LNP-2G msDNA-CMV-SecretedNanoLuc）、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* （LNP-2G ppDNA-CMV-SecretedNanoLuc）またはpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA （LNP-Conv.pDNA-CMV-SecretedNanoLuc）のリポプレックスをマウスに単回ハイドロダイナミック尾静脈注射後１日目、３日目、１０日目、３０日目、５８日目、９２日目、１１９日目および１７４日目のインビボ全身バイオルミネッセンスイメージングからの光子／秒の総フラックス(flux)の棒グラフを、各注射について左から右へ示す。LNP-2G msDNA-CAG-SecretedNanoLuc注射の棒グラフは、点線内に囲まれている。

【図20】図２０は、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射したマウスの大脳皮質、視床、脳幹および小脳からの矢状断脳切片（sagittal brain section）における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の顕微鏡写真を示す。白矢印は導入遺伝子の発現を示す。核は、ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）による染色によって示される。

【図21】図２１は、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射したマウスの大脳皮質および視床からの矢状断脳切片におけるＧＦＰ発現の顕微鏡写真を示す。神経細胞は神経細胞マーカーＮｅｕＮで示されている。

【図22】図２２は、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射したマウスの小脳および脳幹からの矢状断脳切片におけるＧＦＰ発現の顕微鏡写真を示す。神経細胞は神経細胞マーカーＮｅｕＮで示されている。

【図23】図２３は、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射したマウスの大脳皮質および視床からの矢状断脳切片におけるＧＦＰ発現の顕微鏡写真を示す。神経細胞は神経細胞マーカーＮｅｕＮで示されている。

【図24】図２４は、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射したマウスの小脳および脳幹からの矢状断脳切片におけるＧＦＰ発現の顕微鏡写真を示す。神経細胞は神経細胞マーカーＮｅｕＮで示されている。

【図25】図２５は、脂質ナノ粒子担体（ＬＮＰ）と、pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (陽性対照、LNP-Conv.pDNA-CMV-SecretedNLuc)、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CMV-SecretedNLuc)、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CMV-SecretedNLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CAG-SecretedNLuc)、またはmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CAG-SecretedNLuc) とのリポプレックス、ＰＢＳ対照、あるいは未処理細胞でトランスフェクションした３日後および５日後のヒトＴ細胞（Pan-T（TA+）細胞、図２５）におけるルシフェラーゼ発現に伴う発光の棒グラフを示す。

【図26】図２６は、脂質ナノ粒子担体（ＬＮＰ）と、pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA (陽性対照、LNP-Conv.pDNA-CMV-SecretedNLuc)、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CMV-SecretedNLuc)、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CMV-SecretedNLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (LNP-ppDNA-CAG-SecretedNLuc)、またはmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA (LNP-msDNA-CAG-SecretedNLuc) とのリポプレックス、ＰＢＳ対照、あるいは未処理細胞でトランスフェクションした３日後および５日後のヒト肝細胞（Huh7細胞、図２６）におけるルシフェラーゼ発現に伴う発光の棒グラフを示す。

【図27】図２７Ａ－Ｃは、ＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムならびに５’および３’ホモロジーアーム（HDR-GOI-HDR）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持する従来のプラスミドまたはｍｓＤＮＡをトランスフェクション後、３日目（図２７Ａ－Ｃ）におけるＧＯＩのノックイン（ＫＩ）効率（Ｑ３）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）散布図を示す。図２７の（Ａ）は、ＧＯＩのＨＤＲ ＫＩを含まない対照、野生型（ＷＴ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のＦＡＣＳ散布図を示す。図２７の（Ｂ）は、従来のプラスミド（プラスミドＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。図２７の（Ｃ）は、ｍｓＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。

【図28】図２８Ａ－Ｃは、ＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムならびに５’および３’ホモロジーアーム（HDR-GOI-HDR）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持する従来のプラスミドまたはｍｓＤＮＡをトランスフェクション後、７日目（図２８Ａ－Ｃ）におけるＧＯＩのノックイン（ＫＩ）効率（Ｑ３）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）散布図を示す。図２８の（Ａ）は、ＧＯＩのＨＤＲ ＫＩを含まない対照、野生型（ＷＴ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のＦＡＣＳ散布図を示す。図２８の（Ｂ）は、従来のプラスミド（プラスミドＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。図２８の（Ｃ）は、ｍｓＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。

【図29】図２９Ａ－Ｂは、ＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムならびに５’および３’ホモロジーアーム（HDR-GOI-HDR）が隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を担持する従来のプラスミドまたはｍｓＤＮＡをトランスフェクション後、１５日目（図２９Ａ－Ｂ）におけるＧＯＩのノックイン（ＫＩ）効率（Ｑ３）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）散布図を示す。図２９の（Ａ）は、従来のプラスミド（プラスミドＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。図２９の（Ｂ）は、ｍｓＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ HDR-GOI-HDR）を用いたＧＯＩのＨＤＲ ＫＩ後のｉＰＳＣにおけるＦＡＣＳ散布図を示す。

【図30】図３０は、発現ベクター SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【0064】

【図31】図３１は、発現ベクター SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図32】図３２は、発現ベクター SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図33】図３３は、発現ベクター SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図34】図３４は、発現ベクター SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図35】図３５は、発現ベクター SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図36】図３６は、発現ベクター SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図37】図３７は、発現ベクター SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図38】図３８は、発現ベクター SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*のベクターマップを示す。

【図39】図３９は、図２（従来のｐＤＮＡ ＣＭＶ－Ｕ）、図３０（Ａ：ＣＭＶ－Ｕ１－３’ＵＴＲ）、図３１（Ｂ：Ｅ１－ＣＭＶ－Ｕ１－３’ＵＴＲ）、および図３２（Ｃ：Ｅ１－ＣＭＶ－Ｕ１－ＷＰＲＥ－３’ＵＴＲ）の発現ベクターで細胞をエレクトロポレーション後、２日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目および２８日目のＨＥＫ－２９３細胞の培地中のＲＬＵの発光で示されるルシフェラーゼ活性の折れ線グラフを示す。＊＝ｐ＜０．０５ および ＊＊ ＝ｐ＜０．０１。

【図40】図４０は、図３９に記載の発現ベクターで０日目に細胞をエレクトロポレーションした後、７日毎に継代した後の、継代数１、２、３、４および５のＨＥＫ－２９３細胞における相対ルシフェラーゼ強度の折れ線グラフを示す。＊ ｐ＜０．０５ および ＊＊ ＝ ｐ＜０．０１。

【図41】図４１は、発現ベクターpGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin polyAのベクターマップを示す。

【図42】図４２は、発現ベクター4-1 pGL2-SS*-CAG［ＣＭＶエンハンサー＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］－SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108～120ポリA)-SS*のベクターマップを示す。

【図43】図４３は、発現ベクター4-2 pGL2-SS*-CAG ［Ｅ１ Ｘ３＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］－SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108～120 polyA)-SS*のベクターマップを示す。

【0065】

【図44】図４４は、発現ベクター4-3 pGL2-SS*-CAG ［Ｅ２（Ｕ１００）＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］－SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108～120 polyA)-SS*のベクターマップを示す。

【図45】図４５は、発現ベクター4-4 pGL2-SS*-CAG ［Ｅ１ Ｘ３＋ＣＢＡプロモーター＋ＵＴＲ１］－SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108～120 polyA)-SS*のベクターマップを示す。

【図46】図４６は、発現ベクター 4-5-pGL2-SS*-CAG [E2 (U100)+CBAプロモーター+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR (108 to 120 polyA)-SS*のベクターマップを示す。

【図47】図４７は、発現ベクター 4-6-pGL2-SS*-ＣＭＶエンハンサー-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108 to 120 polyA)-SS*のベクターマップを示す。

【図48】図４８は、図４１（従来のＳＳｅｑなしｐＤＮＡ ｃａｇ－Ｗ）および図４２から４７（それぞれ４－１～４－６）に示す発現ベクターによるトランスフェクションの３日後および６日後におけるＨＥＫ－２９３細胞の培地中のＲＬＵにおける発光によって示されるルシフェラーゼ活性の棒グラフを示す。

【図49】図４９は、フランキングスーパー配列（ＳＳｅｑ）、合成エンハンサー（Ｅ１）、ＣＭＶプロモーター（Ｐ_ＣＭＶ）、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ＰＡＭ挿入（ＵＴＲ－ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡ－ＰＡＭ－１）を有する最適化された内部イントロンを含む合成５’ＵＴＲ、Ｃａｓβ２遺伝子、ならびにヒトβグロビンポリアデニル化シグナルおよびｇＲＮＡ－ＰＡＭ挿入（ＨＢｇ３’ＵＴＲ－ｇＲＮＡ－ＰＡＭ）を含む３’ＵＴＲを含む、自己制限型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの例示的な配列の図を示す。

【図50】図５０は、相同性アームが隣接する治療用ＧＯＩを有する染色体ＤＮＡの相同性指向修復（ＨＤＲ）中の、図５２の配列からの自己制限的Ｃａｓ発現の図を示す。

【図51】図５１は、自己制限型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムによる２つの遺伝子編集シナリオの図を示す。シナリオ１では、ヒト発現カセット（例えば、治療用ＧＯＩ）を含むｍｓＤＮＡが、一過性発現のために最初にトランスフェクトされ、続いてＨＤＲノックインのために図４２の遺伝子編集システムが導入される。シナリオ２では、ＨＤＲノックインは、自己制限型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムおよび相同性アームが隣接するヒト発現カセットの両方を含む単一のｍｓＤＮＡによって仲介される。

【発明を実施するための形態】

【0066】

詳細な説明
本発明は、発現ベクター、細菌配列不含有のベクター（例えば、ミニストリングＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ））、ベクター作製システム、細菌配列不含有ベクターの作製方法、組成物およびその使用を提供する。

【0067】

これらに限定されるものではないが、本明細書において引用される全てのジャーナル論文、書籍、取扱説明書、特許出願および特許を含む、本明細書において引用される全ての刊行物は、それぞれ個々の刊行物が引用により具体的かつ個別に示されたかのような程度に、その内容全体が引用により本明細書中に包含される。

【0068】

Ｉ．用語
本発明をさらに容易に理解できるように、最初に、特定の複数の用語を定義する。本明細書において用いる場合、明細書中で特に明記されない限り、下記の用語のそれぞれは、以下において説明される意味を有し得る。さらなる定義は、本明細書を通じて説明される。

【0069】

用語“ａ”または“ａｎ”を伴う名詞は、その名詞が１以上であることを意味し；例えば、“ヌクレオチド配列”は、１以上のヌクレオチド配列を表すと理解されることが特記される。そのため、用語“１つの”（「ａ」（または「ａｎ」））、“１以上の”、および“少なくとも１つの”は、本明細書において互換的に用いられ得る。

【0070】

本明細書において用いる用語“および／または”は、他方を伴うかまたは伴わない特定の特徴または構成要素のそれぞれの特定の開示として理解されるべきである。したがって、用語“および／または”は、“Ａおよび／またはＢ”のような語句において用いるとき、“ＡおよびＢ”、“ＡまたはＢ”、“Ａ”（のみ）、および“Ｂ”（のみ）を含むことが意図される。同様に、用語“および／または”は、“Ａ、Ｂ、および／またはＣ”などの語句において用いるとき、以下の局面：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；Ａ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；およびＣ（のみ）、のそれぞれを包含することが意図される。

【0071】

局面が、言語“含む”によって本明細書において説明される場合、“からなる”および／または“から実質的になる”の用語において説明される別の類似の局面も提供されることは理解される。

【0072】

用語“約”または“を実質的に含む”は、当業者によって決定される特定の値または組成に対する許容可能な誤差範囲内である値または組成を意味し、それらは、値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界、に部分的に依存し得る。例えば、“約”または“を実質的に含む”は、当技術分野における１回の実施あたり１標準偏差以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、“約”または“を実質的に含む”は、最大で１０％まで（すなわち、±１０％）の範囲を意味し得る。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、最大で値の１桁までまたは最大で値の５倍までを意味し得る。本明細書または特許請求の範囲において特定の値または組成が提供される場合、特に明記しない限り、“約”または“を実質的に含む”の意味は、その特定の値または組成に対する許容可能な誤差範囲内であることが想定されるべきである。

【0073】

本明細書に記載されるように、何れかの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に明記されない限り、列記された範囲内の何れかの整数の値、ならびに適切であればその分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。

【0074】

特に明記されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本明細書が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 5th ed., 2013, Academic Press；および、Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, 2006, Oxford University Pressは、本明細書において用いられる用語の多くの一般的な辞書における技術の１つを提供する。

【0075】

単位、接頭語、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）に受け入れられた形態において示される。

【0076】

特に明記しない限り、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に左から右へと記載される。アミノ酸配列は、カルボキシ方向にアミノにおいて左から右へと記載される。

【0077】

本明細書において提供される見出しは、本明細書の様々な局面の限定ではなく、それらは、全体として本明細書を引用することにより得ることができる。したがって、このすぐ後に定義される用語は、本明細書を引用することによって、より完全に定義される。

【0078】

“アミノ酸”は、中心炭素原子（アルファ－炭素原子）が、水素原子、カルボン酸基（その炭素原子は、本明細書において“カルボキシル炭素原子”と呼ばれる）、アミノ基、（その窒素原子は、本明細書において“アミノ窒素原子”と呼ばれる）、および側鎖基Ｒに結合している構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に組み入れられるとき、アミノ酸は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に連結する脱水素反応においてそのアミノ酸カルボキシル基の１以上の原子を失う。結果として、タンパク質に組み入れられるとき、アミノ酸は、“アミノ酸残基”と呼ばれる。

【0079】

“タンパク質”または“ポリペプチド”は、ペプチド結合を介して連結された２以上の個別のアミノ酸の何れかのポリマー（天然に存在するかどうかにかかわらず）を意味し、１つのアミノ酸（またはアミノ酸残基）のアルファ－炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸の非アルファ－炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合するようになったときに生じる。用語“タンパク質”および“ポリペプチド”は、本明細書において互換的に用いられ得る。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も、本発明の範囲内であり、本明細書において“タンパク質”または“ポリペプチド”と呼ばれ得る。本発明の一局面において、ポリペプチドは、２以上の親ペプチドセグメントまたはタンパク質のキメラを含む。用語“ポリペプチド”はまた、ポリペプチドの翻訳後改変（“ＰＴＭ”）、例えば、これらに限定されるわけではないが、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、カルバミル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、天然には存在しないアミノ酸による改変、または何れかの他の操作または改変、例えば、ラベリング成分とのコンジュゲーションなど、の産物を意味しおよび包含することが意図される。ポリペプチドは、自然の生物学的供給源から得ることができるか、または組換え技術によって作製することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは、化学合成を含む何れかの方法において作製することができる。“単離された”ポリペプチドあるいはその断片、変異体、または誘導体は、その自然環境にはないポリペプチドを意味する。精製の特定のレベルは必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、単に、その天然環境または自然環境から取り出すことができる。宿主細胞において発現される、組換え的に産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、それが何れかの好適な技術によって分離、分画、または部分的にもしくは実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドであるとき、本発明の目的のために単離されたと見なされる。

【0080】

本明細書において開示される２以上のタンパク質を含む組換えポリペプチド（すなわち、組換えタンパク質）は、各タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む単一のコード配列によってコードされ得る。明記されない限り、各ドメインおよび／またはタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、“インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）”であり、それにより、ポリヌクレオチド配列を含む単一のｍＲＮＡの翻訳は、結果として、各タンパク質を含む単一のポリペプチドを生じる。典型的には、本明細書において説明される組換えポリペプチドにおけるタンパク質は、お互いに直接的に融合されるか、またはペプチドリンカーによって分離されるであろう。ペプチドリンカーをコードする様々なポリペプチド配列は、当技術分野において既知であり、例えば、自己切断ペプチドなどを含む。

【0081】

本明細書で用いる“ポリヌクレオチド”または“核酸”は、ヌクレオチドの重合形態を意味する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、コード配列に直接的には隣接していないか、または直接的に隣接する（５’末端または３’末端において）配列を含み、この場合、コーディング配列は、それらが由来する有機体の天然に存在するゲノムに存する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自己複製プラスミドまたはウイルス、あるいは原核細胞または真核細胞のゲノムＤＮＡに組み入れられるか、または他の配列から独立して別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡを含む。本発明のヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかのヌクレオチドの改変形態であり得る。ポリヌクレオチドは、本明細書で用いるとき、中でも特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域、より典型的には二本鎖領域、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味する。用語ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ（有機体に応じて、すなわち、ウイルスのＲＮＡゲノム）、ならびにゲノムＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡを包含する。ある特定の局面では、ポリヌクレオチドは、従来的リン酸ジエステル結合または非従来的結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出される結合）を含む。“単離された”核酸またはポリヌクレオチドによって、その自然環境から取り出されている核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、が意図される。例えば、ベクターに含まれる組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、本発明の目的のために“単離された”と見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持されるかまたは溶液中において他のポリヌクレオチドから精製された（部分的にまたは実質的に）組換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本開示のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成によって作製されたポリヌクレオチドおよび核酸（例えば、核酸分子）をさらに含む。

【0082】

本明細書で用いるとき、“コーディング領域”または“コーディング配列”とは、アミノ酸へ翻訳可能なコドンからなる、ポリヌクレオチドの一部である。“停止コドン”（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、典型的には、が、コード領域の一部と見なされ得るが、何れかの隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、および同様のものは、コード領域の一部ではない。コーディング領域の境界は、典型的には、結果物のポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’末端の開始コドンと、結果物のポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、３’末端の翻訳停止コドンとによって決定される。

【0083】

本明細書で用いるとき、“発現カセット”とは、目的の核酸配列（例えば、ポリペプチドの発現のための核酸配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ）および発現制御領域を含む。

【0084】

本明細書で用いるとき、“導入遺伝子”は“目的の遺伝子（ＧＯＩ）”と互換的に用いられ、アミノ酸に翻訳可能なコドンを含むポリヌクレオチドの一部を意味する。“停止コドン”（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は通常アミノ酸に翻訳されないが、導入遺伝子の一部とみなすことができ、一方、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどの隣接配列は導入遺伝子の一部ではない。導入遺伝子の境界は、一般的に、５’末端の開始コドンによって決定され、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードしており、また３’末端の翻訳停止コドンによって決定され、得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードしている。

【0085】

本明細書で用いる用語“発現制御領域”とは、コーディング領域によってコードされる産物の発現を対象とするかまたは制御するようにコーディング領域に作動可能に連結されている転写制御エレメントを意味し、例えば、シス制御モジュール（ＣＲＭ）、プロモーター（例えば、組織特異的プロモーターおよび／または誘導性プロモーター）、エンハンサー、オペレーター、レプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、転写後エレメント、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステム－ループ構造および転写終結シグナル、ｍｉＲＮＡ結合部位ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。発現制御領域には、目的の核酸配列の上流（５’）、配列内、または下流（３’）に位置し、目的の関連核酸配列の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列が含まれる。導入遺伝子が真核細胞での発現を意図しているとき、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、導入遺伝子の３’に位置する。

【0086】

コーディング領域およびプロモーターは、プロモーター機能の導入が結果として、産物をコードするコーディング領域を含むｍＲＮＡの転写を生じる場合、ならびにプロモーターとコーディング領域との間の連結の性質が、プロモーターがコーディング領域によってコードされる産物の発現を対象とする能力を妨げないか、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力を妨げない場合、“作動可能に関連付けられる”（すなわち、“作動可能に連結される”）。発現制御領域は、コーディング領域の上流（５’非コード配列）、コーディング領域内、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコーディング領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を含む。コーディング領域が、真核細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、３’からコーディング領域までに位置し得る。

【0087】

本明細書で用いる用語“宿主細胞”および“細胞”は互換的に用いられ、ならびに、核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を担持するかまたは担持し得る、何れかのタイプの細胞または細胞集団、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞を意味し得る。宿主細胞は、原核細胞であってもよく、あるいは、宿主細胞は、真核細胞であってもよく、例えば、真菌細胞、例えば、酵母細胞など、および種々の動物細胞、例えば、昆虫細胞または哺乳動物物細胞などであり得る。

【0088】

本明細書で用いる“培養”、“培養する”および“培養すること”とは、細胞増殖または細胞分裂を可能にするインビトロ条件下において細胞をインキュベートすること、または細胞を生きた状態に維持することを意味する。本明細書で用いる“培養細胞”とは、インビトロにおいて増殖される細胞を意味する。

【0089】

“対象”は、何れかのヒトまたは非ヒト動物を包含する。用語“非ヒト動物”は、例えば、これらに限定されるわけではないが、脊椎動物、例えば、哺乳動物、トリ、ペット、家畜、非ヒト霊長動物、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、イヌ、ネコ、および齧歯動物、例えばマウス、ラットおよびモルモットなどを包含する。好ましい局面において、対象はヒトである。用語“対象”および“患者”は、本明細書中、互換的に用いられる。

【0090】

“投与すること”とは、当業者に既知の何れかの種々の方法および送達システムを用いる、対象への治療薬の物理的導入を意味する。

【0091】

対象を“処置する”、“処置すること”、対象の“処置”、または“治療”なる用語は、本明細書で用いるとき、症状、合併症、病状または疾患に関連する生化学的兆候の進行、発症、重症化または再発を逆転、軽減、改善、阻害、あるいは遅延または予防するか、あるいは全生存期間を延長する目的において、対象に対して実施される何れかのタイプの介入またはプロセス、あるいは対象に活性剤を投与することを意味する。処置は、疾患を有する対象または疾患を有さない対象（例えば、ワクチン接種など予防のため）に対して行われ得る。

【0092】

用語“有効用量”、“有効投与量”または“有効量”とは、所望の効果を達成するためまたは少なくとも部分的に達成するために十分な薬剤の量として定義される。薬物または治療薬の“治療有効量”または“治療的有効投与量”とは、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて用いたとき、疾患症状の重篤度の減少、疾患無症状期間の頻度および持続期間の増加、全生存期間の延長（疾患を有すると診断された患者が依然として生存している、疾患に対する診断日または治療の開始日からの時間の長さ）、または疾患の苦しみによる障害または身体障害の予防によって明示される疾患の逆行を促進する薬物の何れかの量である。薬物の治療有効量または治療有効投与量は、疾患を発症するリスクのある対象または疾患の再発に苦しむ対象に単独でまたは別の治療薬と組み合わせて投与されるとき、疾患の発症または再発を抑制する薬物の何れかの量である、“予防的有効量”または“予防的有効投与量”を包含する。治療薬が疾患の改善を促進する能力または疾患の発症または再発を抑制する能力は、例えば、臨床治験の際のヒト対象において、ヒトでの有効性を予測するための動物モデル系において、またはインビトロアッセイにおいて薬剤の活性を検査することによってなど、当業者に既知の種々の方法を用いて評価することができる。

【0093】

本開示の様々な局面は、以下のサブセクションにおいてより詳細に説明される。

【0094】

ＩＩ．細菌配列不含有ベクターを作製するための発現ベクターおよびベクター作製システム
細菌配列不含有ベクターおよびその作製は、引用によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号；Nafissi and Slavcev, Microbial Cell Factories 11:154 (2012)；およびNafissi et al., Nucleic Acids 3(6):e165 (2014)に記載される。これらの細菌配列非含有のベクターは、目的の核酸配列を含む発現カセットの各側（すなわち、５’側および３’側）に隣接するリコンビナーゼのための標的配列を含む特化された“スーパー配列”（“ＳＳ”あるいは“ＳＳｅｑ”）部位を含む発現ベクター（例えば、プラスミド）から作製される。具体的には、各ＳＳは、第１のリコンビナーゼのための非結合領域内に組み込まれた１以上の追加のリコンビナーゼに対するさらなる標的配列を有する、第１のリコンビナーゼに対する標的配列を含む。好適なリコンビナーゼを発現する組換え細胞に発現ベクターが存在するとき、発現カセットを含む細菌配列不含有のベクターは、発現ベクターのバックボーンＤＮＡから分離される。本明細書においてミニストリングＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ）とも呼ばれる、環状に共有結合によって閉鎖された（ＣＣＣ）細菌配列不含有のベクターを作製するために、発現ベクターを、例えばＳＳ中のその標的配列を介して作用するＴｅｌＮまたはＴｅｌのようなリコンビナーゼを発現する組換え細胞に入れる。その後、組換えから得られた細菌配列不含有ベクターを細胞から精製し、送達ベクターとして直接用い得る。米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５4号、Nafissi and Slavcev、およびNafissi et alを参照のこと。

【0095】

ＬＣＣ末端を有するｍｓＤＮＡは、ねじれがなく、ならびに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるそれらの作製の際にジャイレース指向性の負の超螺旋化を受けない。さらに、その二本鎖ＬＣＣトポロジーにより、細胞の染色体へのｍｓＤＮＡの挿入は、染色体切断を生じ、それにより、集団から細胞を排除する。したがって、ｍｓＤＮＡは、挿入突然変異誘発の全てのリスクを排除し、ｍｓＤＮＡを投与された患者を、潜在的遺伝毒性および癌から保護する（Nafissi et al.）。

【0096】

本発明は、細菌配列不含有ベクターの改良された作製法および改良された細菌配列不含有ベクターを提供する。いくつかの局面において、細菌配列不含有ベクターの作製は、汚染発現ベクター配列の除去によって改善される。いくつかの局面において、細菌配列不含有ベクターは、細胞における定着能力（すなわち、トランスフェクション効率）、改善された導入遺伝子発現（例えば、強化された転写および翻訳の組み合わせによって仲介される）、および細胞における改善された拡大（例えば、娘細胞へのベクターの複製および分割）によって改善される。

【0097】

いくつかの局面において、本明細書に記載された改良は、当技術分野において既知の他の方法に従って作製されたＣＣＣベクターまたはＬＣＣベクターに適合させ得る。

【0098】

Ａ．発現ベクター
本発明は、（ａ）バックボーン配列、（ｂ）（ｉ）目的の核酸配列を含む発現カセット、（ｉｉ）前記発現カセットの５’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列、（ｉｉｉ）前記発現カセットの３’側に隣接する第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列、および（ｉｖ）前記第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の非結合領域内に組み込まれた１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列、を含む配列、ならびに（ｃ）（ｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列であって、前記エンドヌクレアーゼ標的配列が、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、エンドヌクレアーゼ標的配列、（ｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー、（ｉｉｉ）第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中のプロモーターの５’末端との間に組み込まれたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、（ｉｖ）イントロンを含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）であって、前記５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、（ｖ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれた脊椎動物のクロマチンインシュレーター、（ｖｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、（ｖｉｉ）目的の核酸とポリアデニル化シグナルとの間の発現カセットに組み込まれたスキャフォールド／マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）、または（ｖｉｉｉ）第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたＤＮＡ核標的配列（ＤＴＳ）であって、前記ＤＴＳが、発現カセットと第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある、ＤＴＳ、の１以上、を含んでなる発現ベクターを提供する。

【0099】

本明細書で意味する“バックボーン”配列とは、発現カセットの配列ならびに第１のリコンビナーゼの第１および第２の標的配列を含む隣接ＳＳ部位を除く発現ベクターの配列である。バックボーン配列は、例えば、本明細書に記載されるような宿主細胞（例えば、大腸菌）における発現ベクターの増幅および抗生物質選択のための配列を含み得る。

【0100】

リコンビナーゼのための“非結合”領域とは、本明細書に記載されるように、リコンビナーゼによって作用されない（例えば、リコンビナーゼによって結合および／または切断されない）第１のリコンビナーゼに対する標的配列内の領域である。

【0101】

リコンビナーゼのための“切断部位”とは、リコンビナーゼが組換えに伴うＤＮＡの二本鎖切断または一本鎖ニックを開始する部位である。

【0102】

いくつかの局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列を含み、ここで、前記エンドヌクレアーゼ標的配列が、バックボーン配列と第１のリコンビナーゼおよび1以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列内に組み込まれている。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列内に組み込まれている。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列内に組み込まれている。ある局面において、同じエンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列内に組み込まれている。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列は、同じエンドヌクレアーゼに対するものである。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列内に組み込まれエンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列とは異なる。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列は、第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列内に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列とは異なるエンドヌクレアーゼに対するものである。

【0103】

エンドヌクレアーゼ標的配列が、発現ベクター中のバックボーン配列とリコンビナーゼの切断部位との間に位置することにより、本明細書に記載されるような組換えの後、エンドヌクレアーゼ標的配列が、細菌配列不含有ベクターではなく、バックボーン配列に結合したままであることが保証される。従って、組換え後、バックボーン配列およびエンドヌクレアーゼ標的部位を含む配列は、エンドヌクレアーゼへの曝露によって、細菌配列不含有ベクターを含む調製物から除去され得、細菌配列不含有ベクターを製造する方法においてバックボーン配列を除去するための精製工程の必要性を低減または回避できる。ある局面において、エンドヌクレアーゼは、本明細書に記載のベクター生産系の宿主細胞における組換え後に発現され、ここで、エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ標的部位でＤＮＡを切断し、バックボーン配列およびエンドヌクレアーゼ標的部位を含む配列は、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＶ）によって分解される。

【0104】

いくつかの局面において、発現ベクターはホーミングエンドヌクレアーゼのためのエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、Ｉ－ＳｃｅＩに対するものである。ある局面において、エンドヌクレアーゼ標的配列は、ＰＩ－ＳｃｅＩに対するものである。ホーミングエンドヌクレアーゼに対する標的配列は当技術分野でよく知られている。

【0105】

ある局面において、発現ベクターは、ヌクレアーゼゲノム編集システムの一部であるエンドヌクレアーゼを含む、ゲノム編集において用いられるエンドヌクレアーゼのためのエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。ある局面において、ヌクレアーゼゲノム編集システムは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲして規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、またはメガヌクレアーゼシステムである。

【0106】

ある局面において、発現ベクターは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのためのエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。ある局面において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（例えば、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（Staphlococcus aureus）のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Francisella novicida Ｃａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、または髄膜炎菌（Neisseria meningitides）のＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９））、Ｃａｓ９バリアント（例えば、Ｃａｓ９β２、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＲＨ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＣＨ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＴＨ、ＳｐＧ、ＳｐＲＹ）、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ア、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄまたはＣａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ア、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）、またはＣａｓ１４である。いくつかの局面において、本明細書で用いるＣａｓエンドヌクレアーゼのためのエンドヌクレアーゼ標的配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）標的化配列と相同であり、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＰＡＭ部位を有するｇＲＮＡ標的化配列に相同な配列は、周知のＣＲＩＳＰＲシステムに基づいて常套的に設計され得る。ｇＲＮＡは、ターゲティングＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）配列およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列の融合体を含み、これらは相互作用し、かつＣａｓエンドヌクレアーゼをエンドヌクレアーゼ標的部位に誘導して切断を触媒するように機能する。

【0107】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’末端との間に組み込まれた配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上の連続したコピーのような、核酸配列の複数の連続したコピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは核酸配列の３つの連続したコピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれている。ある局面において、配列番号４７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。ある局面において、配列番号４７の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。

【0108】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と発現カセット中のプロモーターの５’末端との間に組み込まれたＣＭＶエンハンサーを含む。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、例えば、合成エンハンサーの１、２、３、４、５またはそれ以上の連続したコピーの３’末端のような、合成エンハンサーの複数の連続したコピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの３つの連続コピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６の核酸配列の３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれている。

【0109】

ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列と目的の核酸配列との間に組み込まれた配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列と目的の核酸配列との間に組み込まれた配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列を含む。ある局面において、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列あるいは配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列は、目的の核酸配列の５’末端に位置する発現カセット中の全ての調節エレメントを含む。

【0110】

ある局面において、発現ベクターは、イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、ここで、前記５’ＵＴＲ（すなわち、イントロンを含む５’ＵＴＲ）は、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0111】

ある局面において、５’ＵＴＲは、５’ＵＴＲを欠く、同じ発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターとそれぞれ比較して、発現ベクターまたは発現ベクターから産生された細菌配列不含有ベクターからの導入遺伝子転写物スプライシングおよび翻訳を改善するためのものである。

【0112】

ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、イントロンは、配列番号１の核酸配列を含む。

【0113】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含み、これは、本明細書中で“５’ＵＴＲ１”とも称される内部最小イントロンを有する最適化された５’ＵＴＲである。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号２の核酸配列を含む。

【0114】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号４の核酸配列を含む。

【0115】

ある局面において、５’ＵＴＲはイントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。

【0116】

ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一であるか、または配列番号１を含み、また非コーディング配列は、配列番号１のヌクレオチド位置２５から５５の何れか２つのヌクレオチドに対応するイントロン中のヌクレオチドの２つの間に組み込まれている。

【0117】

ある局面において、非コーディング配列は、非原核生物かつ非ウイルス性である。ある局面において、非コーディング配列は真核生物配列である。いくつかの局面において、非コーディング配列は、イントロン、ユビキタスクロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）、Ｓ／ＭＡＲ、ＳＶ４０エンハンサー配列（例えば、２、３、４、５もしくはそれ以上のＳＶ４０エンハンサー配列のような１もしくはそれ以上のＳＶ４０エンハンサー配列）、脊椎動物のクロマチンインスレーター（例えば、ｃＨＳ４）、ＷＰＲＥ、またはそれらの何れかの組合せを含む。

【0118】

ある局面において、非コーディング配列はＳ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５であり、本明細書中、配列番号９に示される。

【0119】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号３を含む。

【0120】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号５を含む。

【0121】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいてニワトリ β－アクチンプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0122】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいて、ＣＭＶプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0123】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれており、ここで、プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、例えば、合成エンハンサーの１、２、３、４、５またはそれ以上の連続コピーの３’末端のような、合成エンハンサーの複数の連続したコピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの３つの連続コピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列の３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６の拡散’末端に組み込まれている。

【0124】

ある局面において、発現ベクターは、目的の核酸配列の３’末端に組み込まれたポリアデニル化シグナルを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、アフリカツメガエル（Xenopus leavis）ベータグロビンポリアデニル化シグナル、ヒトベータグロビンポリアデニル化シグナル、またはハイブリッド型アフリカツメガエルおよびヒト ベータグロビンポリアデニル化シグナルを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、アフリカツメガエル ベータグロビンポリアデニル化シグナル、ヒトベータグロビンポリアデニル化シグナル、またはハイブリッド型アフリカツメガエルおよびヒト ベータグロビンポリアデニル化シグナルの複数コピー、例えば１コピー、２コピー、３コピー、４コピーまたは５コピーなどを含み。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５の核酸配列を含む。ある局面において、ポリアデニル酸テイル（すなわち、ポリ（Ａ）テイル）は、ポリアデニル化シグナルの３’末端に位置する。ある局面において、ポリ（Ａ）テイルは、１００残基長、１０１残基長、１０２残基長、１０３残基長、１０４残基長、１０５残基長、１０６残基長、１０７残基長、１０８残基長、１０９残基長、１１０残基長、１１１残基長、１１２残基長、１１３残基長、１１４残基長、１１５残基長、１１６残基長、１１７残基長、１１８残基長、１１９残基長、１２０残基長またはそれ以上の残基長である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テイルを含む配列は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テイルを含む配列は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を含む。

【0125】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中に脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、５’－ＨＳ４ ニワトリ－β－グロブリンインスレーター（ｃＨＳ４）である。例えば、Benabdellah et al., PLoS ONE 9(1): e84268 (2014); Lu et al., FEBS Open Bio 10: 644-656 (2020); Hanawa et al., Mol. Ther. 17(4): 667-674 (2009); Walters et al., Mol. Cell. Biol. 19(5): 3714-3726 (1999)を参照のこと。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、発現カセットにおいて、本明細書に記載の通り、目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0126】

ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは配列番号８を含む。

【0127】

ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、脊椎動物のクロマチンインスレーターを含まない、同じ発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターとそれぞれ比較して、発現ベクターまたは発現ベクターから産生された細菌配列不含有ベクターの定着（すなわち、トランスフェクション効率）を改善するためのものである。

【0128】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＷＰＲＥを含む。例えば、Higashimoto et al., Gene Therapy 14: 1298-1304 (2007)を参照のこと。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいてＳ／ＭＡＲの３’末端およびポリアデニル化シグナルの５’末端に組み込まれている。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0129】

ある局面において、ＷＰＲＥは、配列番号１１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ＷＰＲＥは配列番号１１を含む。

【0130】

ある局面において、ＷＰＲＥは、発現ベクターまたは発現ベクターから産生された細菌配列不含有ベクターからの導入遺伝子の発現を、ＷＰＲＥを欠く、同じ発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターとそれぞれ比較して、改善する。

【0131】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＳ／ＭＡＲを含む。例えば、Martens et al., Mol. Cell. Biol. 22(8): 2598-2606 (2002); Narwade et al., Nucleic Acids Res. 47(14): 7247-7261 (2019)を参照のこと。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいて、目的の核酸配列の３’末端およびＷＰＲＥの５’末端に組み込まれている。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0132】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、ＭＡＲ－３、ＭＡＲ－４またはＭＡＲ－５であり、それらは、ヒト β－インターフェロンＭＡＲのフラグメントである。例えば、Wang et al., Mol. Biol. Cell 30: 2761-2770 (2019)を参照のこと。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、配列番号９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは配列番号９を含む。

【0133】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、ヒト細胞傷害性セリンプロテアーゼ－Ｂ（ＣＳＰ－Ｂ）ＭＡＲまたはＣＳＰ－Ｃ ＭＡＲである。例えば、Hanson and Ley, Blood 79(3):610-618 (1992); Klein et al., Tissue Antigens 35(5):220-228 (1990)を参照のこと。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは配列番号１０を含む。

【0134】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、Ｓ／ＭＡＲを欠く、同じ発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターとそれぞれ比較して、発現ベクターまたは（発現ベクターから産生された）細菌配列不含有ベクターの発現レベル、安定性および／または持続性（durability）（例えば、エピソームの維持および複製、例えば、ベクターの娘細胞への増殖および分割、ならびに／またはエピジェネティックサイレンシングの防止による）を改善するためのものである。

【0135】

ある局面において、上記の（ｃ）（ｉ）－（ｃ）（ｖｉｉ）の何れか１以上を含む（すなわち、ＤＴＳを含まない）発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各鎖に隣接するエンハンサー配列をさらに含む。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各鎖に隣接するエンハンサー配列は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列の各鎖に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列である。ある局面において、エンハンサー配列はＳＶ４０エンハンサー配列である。

【0136】

ある局面において、発現ベクターは、ＤＴＳを含む。ある局面において、ＤＴＳは、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための非結合領域において、第１のリコンビナーゼに対する第１および／または第２の標的配列内に組み込まれており、ここで、前記ＤＴＳは、発現カセットと、第１のリコンビナーゼおよび１以上の追加のリコンビナーゼのための切断部位との間にある。ある局面において、ＤＴＳはＳＶ４０エンハンサー配列である。ある局面において、ＤＴＳは細胞特異的である。ある局面において、ＤＴＳは、平滑筋細胞、胚性幹細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、内皮細胞または骨芽細胞に特異的である。

【0137】

発現カセットと発現ベクター中のリコンビナーゼに対する切断部位との間に位置するＤＴＳは、本明細書に記載の通り、組換え後に、ＤＴＳが細菌配列不含有ベクターに結合したままであり、バックボーン配列には結合しないことを確実にする。

【0138】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＵＣＯＥを含む。例えば、Mueller-Kuller et al., Nucleic Acids Res. 43(3): 1577-1592 (2015); Skipper et al., BMC Biotechnol. 19:75 (2019); Rudina et al., bioRxiv, doi.org/10.1101/626713 (2019); Neville et al., Biotechnol. Adv. 35(5): 557-564 (2017)を参照のこと。ある局面において、ＵＣＯＥは、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と、発現カセット中のプロモーターまたは何れかのエンハンサーの５’末端との間に位置する。ある局面において、ＵＣＯＥは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0139】

ある局面において、ＵＣＯＥはＡ２ＵＣＯＥである。ある局面において、ＵＣＯＥは、配列番号６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ＵＣＯＥは配列番号６である。

【0140】

ある局面において、ＵＣＯＥはＳＲＦ－ＵＣＯＥである。例えば、国際特許出願第ＷＯ２０２０２２３１６０を参照のこと。ある局面において、ＵＣＯＥは、配列番号７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ＵＣＯＥは配列番号７である。

【0141】

ある局面において、ＵＣＯＥは、ＵＣＯＥを欠く、同じ発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターとそれぞれ比較して、発現ベクターまたは発現ベクターから産生された細菌配列不含有ベクター由来の導入遺伝子の発現を改善する。

【0142】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にエンハンサー－１を含む。ある局面において、エンハンサー－１は、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端と、発現カセット中のプロモーターまたは何れかのエンハンサーの５’末端との間に組み込まれている。ある局面において、エンハンサー－１は、ＵＣＯＥの３’末端とＣＭＶエンハンサーの５’末端との間に組み込まれている。ある局面において、エンハンサー－１は、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、エンハンサー－１は配列番号１２である。

【0143】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中に、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ｃａｇ、Ｒｈｏ、ＶＤＭ２、ＨＣＲまたはＨＬＰプロモーター、あるいはそれらの変異体を含む。ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＣＭＶプロモーター変異体を含む。例えば、国際公開 ＷＯ２０１２０９９５４０； Xu et al., Bioengineered 10(1): 548-560, DOI: 10.1080/21655979.2019.1684863 (2019)を参照のこと。

【0144】

ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＥＦ１－アルファプロモーターを含む。ある局面において、発現ベクターは、発現カセット中にＣＭＶエンハンサーおよびＥＦ１－アルファプロモーターを含む。

【0145】

ある局面において、発現ベクターは、ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２つのコピーを含む発現カセット中に３’ＵＴＲを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、目的の核酸配列と第１のリコンビナーゼに対する第２の標的配列の５’末端との間に組み込まれている。

【0146】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１３である。

【0147】

ある局面において、３’ＵＴＲは、ヒトベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１４である。

【0148】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーおよびヒトベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１５である。

【0149】

ある局面において、３’ＵＴＲは、１００個から１２０個のアデニンヌクレオチド、すなわち１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個または１２０個のアデニンヌクレオチドを含む、ポリ（Ａ）テイル（すなわち、３’ＵＴＲの３’末端に）をさらに含む。

【0150】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１６である。

【0151】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１７である。

【0152】

ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８である。

【0153】

発現ベクターは、本明細書に記載の通り、第１および／または第２の標的配列および／または発現カセットに対する上記の修飾の何れかの組合せを含み得る。ある局面において、組合せは相乗効果を提供する。

【0154】

ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列ならびに１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列は、ＰＹ５４ ｐａｌ部位、Ｎ１５ ｔｅｌＲＬ部位、ｌｏｘＰ部位、φＫ０２ ｔｅｌＲＬ部位、ＦＲＴ部位、ｐｈｉＣ３１ ａｔｔＰ部位およびλ ａｔｔＰ部位からなる群より選択される。ある局面において、発現ベクターは、標的配列の各々を含む。ある局面において、発現ベクターは、ｐａｌ部位ならびにｐａｌ部位内に組み込まれたｔｅｌＲＬ、ｌｏｘＰおよびＦＲＴリコンビナーゼ標的結合配列を含む。ある局面において、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列はそれぞれ、配列番号３３の核酸配列を含む。

【0155】

ある局面において、本明細書に記載の発現カセットの何れかにおける目的の核酸配列は、ポリペプチド、ＲＮＡ（メッセンジャー ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ （ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ （ｓｈＲＮＡ）、リボソームまたはアンチセンスＲＮＡ）、または非コーディングＤＮＡ （例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）をコードする配列を含む。ある局面において、目的の核酸配列は、イントロンおよび／またはエクソンを含むゲノムＤＮＡ配列である。ある局面において、目的の核酸配列は、抗癌剤、腫瘍抑制因子、アポトーシス剤、抗血管形成剤、酵素剤、細胞傷害性剤、自殺遺伝子、サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン、免疫調節薬、免疫促進剤、免疫抑制剤、ケモカイン、抗原提示細胞を刺激するための抗原抗体、抗体 （例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗またはヒト抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントなどの抗体の重鎖および／または軽鎖）、ゲノム編集システムまたはその一部（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはメガヌクレアーゼシステムまたはその一部（例えば、ＣａｓエンドヌクレアーゼまたはｇＲＮＡ））、または免疫原性物質（例えば、ＶＬＰおよび／またはワクチンとして）をコードする配列を含む。ある局面において、目的の核酸配列は、核酸配列が細胞内で発現されるとき、ＶＬＰを形成できるポリペプチドをコードする配列を含む。

【0156】

例示的な治療標的および適応症には以下が含まれる：例えば、肝臓、血液疾患または眼疾患を含む単一遺伝子疾患に関連する遺伝子、ガラクトシダーゼα（ＧＬＡ、例えば、ファブリー病を処置するため）、ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット１（ＳＣＮ１Ａ、例えば、ドラベ症候群を処置するためのもの）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４、例えば、スターガルト病を処置するためのもの）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ－Ｂ、例えば、サーファクタント機能障害疾患を処置するためのもの）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ－Ｃ、例えば、サーファクタント機能障害疾患を処置するためのもの）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３（ＡＢＣＡ３、例えば、サーファクタント機能障害疾患を処置するためのもの）、溶質担体ファミリー３４メンバー２（ＳＬＣ３４Ａ２、例えば、肺胞微石症および／または精巣微石症を処置するためのもの）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ、例えば、嚢胞性線維症を処置するためのもの）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ、例えば、ＧＡＤ６５またはＧＡＤ６７、例えば、パーキンソン病を処置するためのもの）、アスパルトアシラーゼ遺伝子（ＡＳＰＡ、アミノアシラーゼ（ＡＡＣ）としても知られる、例えば、カナバン病を処置するためのもの）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ、例えば、パーキンソン病を処置するため、および／またはＡＡＤＣ欠損症を処置するためのもの）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ、例えば、パーキンソン病を処置するためのもの）、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ、例えば、パーキンソン病を処置するためのもの）、神経増殖因子（ＮＧＦ、例えば、アルツハイマー病を処置するためのもの）、トリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ１、例えば、バッテン病、例えば、ＣＬＮ２病を処置するためのもの）、アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ、例えば、異染性白質ジストロフィーを処置するためのもの）、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ、例えば、サンフィリッポ症候群Ａ型を処置するためのもの）、スルファターゼ改変因子１（ＳＵＭＦ１、例えば、サンフィリッポ症候群Ａ型を処置するためのもの）、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ、例えば、サンフィリッポ症候群Ｂ型を処置するためのもの）、運動ニューロン１の生存因子（ＳＭＮ１、例えば、脊髄性筋萎縮症１を処置するためのもの)、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５、例えば、レーベル先天性黒内障を処置するためのレチノイドイソメロヒドロラーゼとしても知られる）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１、例えば、脈絡膜血症を処置するためのもの）、レチノスキシン１（ＲＳ１、例えば、Ｘ連鎖若年網膜分離症を処置するためのもの）、α－１抗トリプシン（ＡＡＴ、例えば遺伝性肺気腫またはＡＡＴ欠損症を処置するためのもの）、ミニジストロフィン（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置のためのもの）、α－サルコグリカン（αＳＧ、例えばα-サルコグリカン(αＳＧ、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたは肢帯型筋ジストロフィー２型を処置するためのもの）、β－サルコグリカン（βＳＧ）、γ－サルコグリカン（γＳＧ、例えば、肢帯型筋ジストロフィー２型を処置するためのもの)、δ－サルコグリカン（δＳＧ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ、例えば、家族性ＬＰＬ欠損症を処置するためのもの）、酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、例えば、ポンペ病を処置するためのもの）、腫瘍壊死因子受容体:Ｆｃ（ＴＮＦＲ：Ｆｃ、例えば関節炎、例えば炎症性関節炎を処置するためのもの）、筋小胞体／小胞体Ｃａ（２＋）ＡＴＰａｓｅ ２ａ（ＳＥＲＣＡ２ａ、例えば、うっ血性心不全を処置するためのもの）、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子（ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ、例えば、血友病Ｂを処置するためのもの）、ポルホビリノゲンデアミナーゼ遺伝子（ＰＢＧＤ、例えば、急性間欠性ポルフィリン症を処置するためのもの）、可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－１（ｓＦＬＴ１、例えば、加齢黄斑変性または癌、例えば、卵巣癌を処置するためのもの）、ＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦ－Ｒ２のドメインを含む可溶性キメラ血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体（例えば、癌、例えば、メラノーマまたは結腸癌を処置するためのもの）、可溶性ＶＥＧＦＲ３（例えば、癌、例えば子宮内膜癌を処置するためのもの）、可溶性ＶＥＧＦ－Ｃデコイ受容体（ｓＶＥＧＦＲ３－Ｆｃ、例えば癌、例えばメラノーマ、腎細胞癌、または前立腺癌を処置するためのもの）、色素上皮由来成長因子（ＰＥＤＦ、例えば癌、例えば、ルイス肺癌を処置するためのもの）、ＶＥＧＦＲ２に対する中和モノクローナル抗体（例えば癌、例えば、メラノーマまたは膠芽腫を処置するためのもの）、エンドスタチン（例えば癌、例えば、膀胱癌または膵癌を処置するためのもの）、アンジオスタチン（例えば癌、例えば、肝臓癌を処置するためのもの）、エンドスタチンおよびアンジオスタチンの両方（すなわち、二シストロン性配列として、例えば癌、例えば、卵巣癌を処置するためのもの）、エンドスタチン変異体（すなわち、Ｐ１２５４Ａ－エンドスタチン、例えば癌、例えば卵巣癌を処置するためのもの）、ＴＳＰ－１の抗血管新生ドメイン（３ＴＳＲ、例えば癌、例えば、膵癌を処置するためのもの）、組織因子経路阻害因子－２（ＴＦＰＩ－２、例えば癌、例えば、膠芽腫を処置するためのもの）、プラスミノゲンのフラグメント（例えば、クリングル５、例えば癌、例えば、卵巣癌を処置するためのもの）、プラスミノゲンクリングル１－５（例えば癌、例えばメラノーマまたは肺癌を処置するためのもの）、小胞体ストレス応答タンパク質（unfolded protein response protein）に対するｓｉＲＮＡ（ＵＰＲ； 例えば、ＩＲＥ１α、ＸＢＰ－１またはＡＴＦ６、例えば癌、例えば乳癌の処置のための）、バソスタチン（例えば癌、例えば肺癌を処置するためのもの）、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ、例えば癌、例えば乳癌を処置するためのもの）、ｓｃ３９ＴＫ（例えば癌、例えば子宮頸癌を処置するためのもの）、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ、例えば癌、例えば子宮頸癌または骨髄腫を処置するためのもの）、ｐ５３上方制御されたアポトーシスのモジュレーター（ＰＵＭＡ、例えば癌、例えば、子宮頸癌または骨髄腫を処置するためのもの）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、例えば癌、例えばリンパ種、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌（すなわち、頭頸部癌）、または膠芽腫を処置するためのもの）、可溶性ＴＲＡＩＬ（例えば癌、例えば肝臓癌または肺腺癌を処置するためのもの）、ＩＦＮ－β（例えば癌、例えば結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫または多形性膠芽腫を処置するためのもの）、ＩＦＮ－α（例えば癌、例えば転移性メラノーマを処置するためのもの）、ＣＤ－４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣＤ４０Ｌ変異体（例えば癌、例えば肺癌を処置するためのもの）、メラノーマ分化関連遺伝子－７およびインターロイキン２４（ｍｄａ－７およびＩＬ２４、例えば癌、例えばエールリッヒ腹水腫瘍を処置するためのもの）、アポプトチン（apoptotin）およびＩＬ２４（例えば癌、例えば肝臓癌を処置するためのもの）、ＩＬ２４（例えば癌、例えば、転移性ルイス肺癌を処置するためのもの）、ＩＬ１５（例えば癌、例えば、転移性肝細胞癌を処置するためのもの）、二次リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ、例えば癌、例えば肝臓癌を処置するためのもの）、Ｎｋ４（肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）のＮ末端ヘアピンおよびその後の４つのクリングルドメイン、例えば癌、例えば子宮頸癌を処置するためのもの）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４、ＬＩＧＨＴとしても知られる、例えば癌、例えば子宮頸癌を処置するためのもの）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、例えば癌を処置するためのもの）、ＴＮＦ－α（例えば癌、例えば神経こう腫を処置するためのもの)、サバイビン（survivin）のドミナントネガティブ変異体（例えば、Ｃ８４ＡまたはＴ３４Ａ、例えば癌、例えば結腸または胃の癌を処置するためのもの）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素のＣ末端フラグメント（ｈＴＥＲＴＣ２７、例えば癌、例えば、多形性膠芽腫を処置するためのもの）、マスピン（例えば癌、例えば、前立腺癌を処置するためのもの）、ｎｍ２３Ｈ１ （例えば、癌、例えば転移性卵巣癌）、ヒト肝細胞増殖因子のクリングル１ドメイン（ＨＧＦＫ１、例えば癌、例えば結腸直腸癌を処置するためのもの）、抗カルシトニンリボザイム（例えば癌、例えば、前立腺癌を処置するためのもの）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１、例えば癌、例えば肺癌を処置するためのもの）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）Ｃ－テイル配列（例えば癌、例えば膵臓癌を処置するためのもの）、α－トコフェロール関連タンパク質（ＴＡＰ、例えば癌、例えば前立腺癌を処置するためのもの）、トリコサンチン（例えば癌、例えば肝細胞癌を処置するためのもの）、デコリン（例えば癌、例えば多形性膠芽腫を処置するためのもの）、カテリシジン（例えば癌、例えば結腸癌を処置するためのもの）、ニーマン－ピックタイプＣ２（ＮＰＣ２、例えば癌、例えば肝細胞癌を処置するためのもの）、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ、例えば癌、例えば卵巣癌を処置するためのもの）、ｐ５３（例えば癌、例えば、気管支肺胞癌を処置するためのもの)、癌１で高度に発現されたｓｈＲＮＡ（Ｈｅｃ１、例えば癌、例えば神経膠腫を処置するためのもの）、エプスタインバールウイルス潜在膜タンパク質－１に対するｓｈＲＮＡ（ＥＢＶ ＬＭＰ－１、例えば癌、例えば、鼻咽頭癌を処置するためのもの）、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ７癌遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ（ＨＰＶ１６－Ｅ７、例えば癌、例えば子宮頸部癌を処置するためのもの）、アンドロゲン受容体に対するｓｈＲＮＡ（ＡＲ、例えば癌、例えば前立腺癌を処置するためのもの）、Ｓｎａｉｌに対するｓｉＲＮＡ（ＳＮＡ１としても知られている、例えば、癌、例えば、膵臓癌を処置するためのもの）、Ｓｌｕｇに対するｓｉＲＮＡ （すなわち、ＳＮＡＩ２のタンパク質産物、例えば癌、例えば胆管癌（肝臓癌）を処置するためのもの）、Four and a half LIMのみのタンパク質２に対するｓｈＲＮＡ（ＦＨＬ２、例えば癌、例えば、結腸癌を処置するためのもの）、ｍｉＲ－２６ａ（例えば癌、例えば肝細胞癌を処置するためのもの）、ＨＰＶ１６構造タンパク質Ｌ１（ＨＰＶ１６－Ｌ１、例えば癌、例えば子宮頸部癌を処置するためのもの）、ＨＰＶ１６ Ｅ５、Ｅ６およびＥ７癌遺伝子（ＨＰＶ１６ Ｅ５／Ｅ６／Ｅ７、例えば癌、例えば子宮頸部癌を処置するためのもの）、Ｂ細胞白血病／リンパ腫１（ＢＬＣ１）イディオタイプ（例えば、癌、例えばＢ細胞白血病／リンパ腫１を処置するためのもの）、熱ショックタンパク質に融合したＥＢＶ ＬＭＰ１およびＬＭＰ２（ＥＢＶ ＬＭＰ２/１－ｈｓｐ、例えば癌、例えば鼻咽頭癌を処置するためのもの）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、例えば癌、例えば、結腸癌を処置するためのもの）、熱ショックタンパク質と組み合わせた可溶性形態のＢ細胞およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡおよびＨＳＰ７０、例えば癌、例えば、メラノーマ肺転移を処置するための）、ＨＰＶ１６－Ｌ１／Ｅ７（例えば、癌、例えば、頸部癌を処置するための）、ＨＰＶ１６－Ｌ１（例えば、癌、例えば、頸部癌を処置するための）、抗ＥＧＦＲ抗体（１４Ｄ１、例えば癌、例えば、外陰癌を処置するための）、抗細胞死受容体５（ＤＲ５）抗体（ａｄｘｉｍａｂ、例えば癌、例えば、肝臓または結腸癌を処置するための）、抗エノラーゼ１（ＥＮＯＩ１）抗体（例えば、癌、例えば、膵管腺がんを処置するための）、抗ＶＥＧＦＡ抗体（ベバシズマブ、例えば癌、例えば、転移性肺癌または卵巣癌を処置するための）、ムチン１（ＭＵＣ１）抗原（例えば、癌、例えば胃癌を処置するための）、またはアク
アポリン（例えば、ｈＡＱＰ１、例えば放射線照射誘導性耳下腺唾液機能低下、すなわち、口腔乾燥症を治療するための）。

【0157】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集（例えば、遺伝子欠損、障害または疾患の処置を含む、遺伝子治療）における使用のためのものである。

【0158】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位（すなわち、遺伝子編集の標的であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列内の部位）への挿入のためのものである。遺伝子編集のための標的部位には、何れかのシスエレメントなどの何れかの遺伝子エレメントが含まれる。ある局面において、遺伝子編集のための標的部位は、遺伝子のエクソン、遺伝子のイントロン、または遺伝子の調節エレメント内に位置する。

【0159】

ある局面において、遺伝子編集は、エンドヌクレアーゼを含む。ある局面において、エンドヌクレアーゼは、ゲノム編集システムと関連している。ある局面において、エンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、構造誘導ヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ（例えば、トランスポゾンにコードされたＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ）である。

【0160】

ある局面において、遺伝子編集は、遺伝子編集のための標的部位内に二本鎖切断を生成するゲノム編集システムを含む。ある局面において、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮまたはメガヌクレアーゼ遺伝子編集システムである。

【0161】

ある局面において、目的の核酸配列は、二本鎖切断における非相同末端結合による遺伝子編集のための標的部位に挿入される。ある局面において、二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって生成される。ある局面において、本明細書に記載される発現ベクターは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列と目的の核酸配列との間（すなわち、５’スーパー配列と目的の核酸配列との間、および３’スーパー配列と目的の核酸配列との間）に位置するＣａｓエンドヌクレアーゼ標的配列（すなわち、ｇＲＮＡ標的化配列に相同な配列）を含み、ここで、遺伝子編集のための標的部位（例えば、染色体中の標的部位）は、同じＣａｓエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。例えば、発現ベクターから生成された細菌配列不含有ベクター（例えば、ｍｓＤＮＡ）中の核酸配列に隣接するＣａｓエンドヌクレアーゼ標的配列のプロセシングは、スーパー配列の除去をもたらし、代わりに、ｍｓＤＮＡのような直鎖状の共有結合的に閉じた細菌配列不含有ベクターを、非相同末端結合事象に従う反応性末端を有する直鎖状および開放末端（open-ended）にする。

【0162】

ある局面において、目的の核酸配列は、二本鎖切断に隣接する配列と目的の核酸配列に関連する相同配列との間の組換えを介して起こる、相同性指向修復による遺伝子編集のための標的部位に挿入される。

【0163】

ある局面において、目的の核酸配列は、相同性指向修復を支持するために二本鎖切断に隣接する配列と十分な相同性を有する。

【0164】

ある局面において、目的の核酸配列は、５’および３’相同アーム（すなわち、相同性指向修復を仲介するために二本鎖切断に隣接する配列と十分な相同性を有する配列）によって隣接される。

【0165】

ある局面において、相同性指向修復を仲介するのに十分な相同性は、目的の核酸配列と二本鎖切断に隣接する配列との間の、または目的の核酸配列に隣接する相同性アームと二本鎖切断に隣接する配列との間の、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の相同性を含む。ある局面において、二本鎖切断に隣接する配列は、二本鎖切断の約１００塩基、約９０塩基、約８０塩基、約７０塩基、約６０塩基、約５０塩基、約４５塩基、約４０塩基、約３５塩基、約３０塩基、約２５塩基、約２０塩基、約１５塩基、約１０塩基、または約５塩基内にあるか、または二本鎖切断のすぐ両側にある。

【0166】

ある局面において、相同性指向修復は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによるものである。ある局面において、本明細書に記載の発現ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。ある局面において、発現ベクターは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、イムノサイレント化（immunosilenced） Ｃａｓ９－ベータ２）をコードする配列の各側に隣接するｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。例示的な局面は、図４９に示される。ある局面において、発現ベクターは、イントロン中にｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む、本明細書に記載の５’ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲ１）を含む。ある局面において、発現ベクターは、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む、本明細書に記載のキメライントロンを含む。ある局面において、本明細書に記載のＥＦ１－αプロモーターは、固有のイントロン中にｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。ある局面において、本明細書に記載のポリアデニル化シグナルまたは３’ＵＴＲは、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。例えば、隣接するｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含むベクター（すなわち、発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクター（例えば、ｍｓＤＮＡ））からのＣａｓエンドヌクレアーゼの発現に際して、ｇＲＮＡは遊離ＲＮＡとして切り出され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを遺伝子編集のための標的部位（例えば、染色体中の標的部位）およびベクター上の隣接ｇＲＮＡ部位に標的化する。これは、ベクターからのＣａｓエンドヌクレアーゼの自己制限をもたらし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのさらなる発現を制限する。このプロセスの概略図は、図５０に示され、別のベクター上の相同性アームに隣接する目的の核酸（すなわち、目的の遺伝子、ＧＯＩ）による相同性指向修復の仲介も示す。ある局面において、本明細書に記載の発現ベクターは、例えば、図５１のシナリオ１に示されるように、相同性アームに隣接する目的の核酸配列を含む。ある局面において、本明細書に記載の目的の核酸配列および自己制限ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、図５１のシナリオ２に示されるように、本明細書に記載される単一の発現ベクター上に位置する。後者の局面において、自己制限ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む配列は、相同性アームに隣接する目的の核酸配列を含む配列の５’側に位置する。

【0167】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に相同であり、該標的部位と比較して、１以上のヌクレオチド挿入、欠失、逆位または再編成を含む。ある局面において、目的の核酸配列は、標的部位において相同配列を置換するゲノム配列、コーディング領域、エクソン、イントロン、またはそれらの何れかの部分である。

【0168】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に対して非相同である。

【0169】

ある局面において、目的の核酸配列は、失われた機能を回復するか、異常な機能を修正するか、または遺伝子編集のための標的部位に関連するさらなる機能を提供する。

【0170】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に関連する遺伝子発現のノックアウト（すなわち、遺伝子サイレンシング）のためのものである。

【0171】

ある局面において、目的の核酸配列は、インビボ遺伝子編集のためのものである。

【0172】

ある局面において、目的の核酸配列は、インビトロ遺伝子編集のためのものである。

【0173】

ある局面において、目的の核酸配列は、エクスビボ遺伝子編集（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のような細胞療法）のためのものである。

【0174】

ある局面において、遺伝子編集は、エピジェネティックな修飾を含み、本明細書に記載の発現ベクターは、目的の核酸配列としてエピジェネティックなエフェクター分子を含む。ある局面において、エピジェネティックなエフェクター分子は、例えば、アセチル化もしくは脱アセチル化、メチル化もしくは脱メチル化、またはリン酸化もしくは脱リン酸化を仲介する。ある局面において、エピジェネティックなエフェクター分子は、アセチル化もしくは脱アセチル化、メチル化もしくは脱メチル化、またはリン酸化もしくは脱リン酸化を阻害する。ある局面において、エピジェネティックな修飾は、ヒストン修飾である。ある局面において、ヒストン修飾は、ヒストンアセチル化であり、目的の核酸配列は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼである。ある局面において、エピジェネティックな修飾は、ＤＮＡ修飾である。ある局面において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡメチル化であり、目的の核酸配列は、ＤＮＡメチル化酵素である。ある局面において、ＤＮＡ修飾は、ＤＮＡ脱メチル化であり、目的の核酸配列は、ＤＮＡ脱メチル化酵素である。ある局面において、エピジェネティックなエフェクター分子は、染色体上の位置にエフェクターを標的化するために、ＤＮＡ結合分子などの標的化分子に融合されている。

【0175】

ある局面において、発現カセットは多遺伝子性であり、すなわち、発現カセットは、それぞれ、２以上のポリペプチドをコードする２以上の目的の核酸配列を含む。

【0176】

ある局面において、発現カセットは、発現カセットの翻訳産物が細胞内で２以上のポリペプチドに切断されるように、ポリペプチドをコードする各核酸配列の間に自己切断ペプチドをコードする核酸配列を含む単一のオープンリーディングフレームを含む。ある局面において、自己切断ペプチドは、２Ａ自己切断ペプチドである。ある局面において、２Ａ自己切断ペプチドは、ブタテシオウイルス－１由来のＰ２Ａである。ある局面において、２Ａ自己切断ペプチドは、テサアシグナウイルス２Ａ由来のＴ２Ａである。ある局面において、自己切断ペプチドは、２Ａ、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａのいずれか１以上を含む。ある局面において、自己切断ペプチドは、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａを含む。

【0177】

ある局面において、発現カセットは、遺伝子発現のためのマーカーをコードする核酸配列をさらに含む。ある局面において、遺伝子発現のためのマーカーは、蛍光レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、例えば増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ））、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、または近赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）など；ルシフェラーゼなどの生物発光性レポーター遺伝子（例えば、ナノルシフェラーゼ、すなわち、NanoLuc^{(登録商標)} (NLuc)、England et al., Bioconjug. Chem. 27(5):1175-1187 (2016), Promega Corporation）；選択可能な抗生物質マーカー；またはＬａｃＺである。ある局面において、発現カセットは、遺伝子発現のためのマーカーをコードする核酸配列とポリペプチドをコードする何れかの他の核酸配列との間に自己切断性ペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0178】

発現カセットは、目的の核酸配列に作動可能に連結された、当業者に既知の何れかの発現制御領域を含み得る。ある局面において、発現制御領域は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、転写停止シグナル、またはそれらの組み合わせである。

【0179】

ある局面において、発現ベクターは、細菌配列不含有ベクターを製造するためのものである。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、共有結合性閉鎖環ベクターである。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、共有結合性閉鎖直線状ベクターである。

【0180】

Ｂ．ベクター作製システム
本発明は、誘導性プロモーターの制御下においてリコンビナーゼをコードする組換え細胞を含むベクター作製システムであって、ここで、前記組換え細胞は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列ならびに１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列を含む、本明細書に記載の発現ベクターを含み、かつ前記リコンビナーゼは、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列、または１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列のうちの１つを標的とする、ベクター作製システムを提供する。

【0181】

ベクター作製システムで用いるのに適する宿主細胞には、微生物細胞、例えば、E. coli細胞のような細菌細胞、およびS. cerevisiaeのような酵母細胞が含まれる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｋ１系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）またはＰｒｏ５変異体（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２８１））；ＣＶ－１系統（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ－１系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、またはＣＯＳ－７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）のＳＶ４０形質転換アフリカミドリザル腎由来の線維芽細胞様細胞；マウスＬ細胞；マウス３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）；マウスＣ１２７細胞；２９３系統のヒト胎児腎細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）；ＨｅＬａ系統のものを含むヒト癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；および、ＩＭＲ－３２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２７）、ＳＫ－Ｎ－ＭＣ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １０）、またはＳＫ－Ｎ－ＳＨ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ １１）系の神経芽腫細胞を含む、哺乳動物宿主細胞も使用することができる。

【0182】

好適なリコンビナーゼ酵素は、ＴｅｌＮ、Ｔｅｌ、Ｔｅｌ（ｇｐ２６ Ｋ０２ファージ）、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ｐｈｉＣ３１、Ｉｎｔ、および他のλファージインテグラーゼ、例えばｐｈｉ ８０、ＨＫ０２２およびＨＰ１リコンビナーゼ酵素を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載のリコンビナーゼの標的配列におけるＤＮＡ置換を触媒する。ある局面において、リコンビナーゼは、ＴｅｌＮ、Ｔｅｌ、ＣｒｅまたはＦｌｐである。

【0183】

ある局面において、組換え細胞は、誘導性プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼをさらにコードし、前記エンドヌクレアーゼは、発現ベクター中のエンドヌクレアーゼ標的配列を標的とする。

【0184】

好適なエンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ標的配列でポリヌクレオチドを切断する。ある局面において、エンドヌクレアーゼはホーミングエンドヌクレアーゼである。ある局面において、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｈ－ＤｒｅＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｅｃＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、Ｉ－Ｔｓｐ０６１ＩまたはＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉである。ある局面において、エンドヌクレアーゼはＩ－ＳｃｅＩである。ある局面において、エンドヌクレアーゼはＰＩ－ＳｃｅＩである。ある局面において、組換え細胞は、エンドヌクレアーゼを含むヌクレアーゼゲノム編集システムをコードする。ある局面において、ゲノム編集システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮまたはメガヌクレアーゼシステムである。ある局面において、ヌクレアーゼゲノム編集システムはクラス１またはクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。ある局面において、ヌクレアーゼゲノム編集システムはタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。ある局面において、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９またはＮｍＣａｓ９）、Ｃａｓ９変異体（例えば、Ｃａｓβ９、ｘＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＮＧ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＲＨ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＣＨ、ＳｐＣａｓ９－ＮＲＴＨ、ＳｐＧ、ＳｐＲＹ）、Ｃａｓ３、Ｃａｓ１２（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄまたはＣａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１３（例えば、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃまたはＣａｓ１３ｄ）、またはＣａｓ１４である。

【0185】

リコンビナーゼをコードする組換え宿主細胞、またはリコンビナーゼおよびエンドヌクレアーゼは、周知の技術を用いて調製される。例えば、選択されたリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、細胞形質転換のための適切な条件下で適切なベクターを用いて細胞に導入される。組換え宿主細胞は、発現ベクターを介して、またはリコンビナーゼをコードするおよび／またはエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列の宿主細胞ゲノムへの組み込みによって形質転換することができる。エンドヌクレアーゼがヌクレアーゼゲノム編集システムと関連している態様では、宿主細胞は、ヌクレアーゼゲノム編集システムの成分の全てをコードするように設計することができ、これは、成分の全てを含む１以上の発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換、成分の全ての宿主細胞ゲノムへの組み込み、または形質転換と成分の組み込みの混合のいずれかによる。いくつかの態様では、宿主細胞は、ＣａｓまたはＣａｓ様エンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡをコードする。

【0186】

ヌクレアーゼゲノム編集システムのエンドヌクレアーゼを含むリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの発現は、誘導性プロモーター、すなわち、特定の物理的または化学的条件または刺激下で活性化されるプロモーターの制御下にある。ある局面において、誘導性プロモーターは、熱的に調節される、化学的に調節される、ＩＰＴＧ調節される、グルコース調節される、アラビノース誘導性である、Ｔ７ポリメラーゼ調節される、低温ショック誘導性である、ｐＨ誘導性である、またはそれらの組み合わせである。

【0187】

本発明は、第１のリコンビナーゼに対する第１および第２の標的配列、ならびに１以上の追加のリコンビナーゼに対する１以上の追加の標的配列を含む、本明細書に記載の発現ベクターを含む組換え細胞を提供する。ある局面において、組換え細胞は、本明細書中に記載の第１のリコンビナーゼおよび／または１以上の追加のリコンビナーゼをコードする。ある局面において、組換え細胞は、本明細書に記載の１以上のエンドヌクレアーゼをコードする。ある局面において、組換え細胞は、本明細書に記載のヌクレアーゼゲノム編集システムをコードする。

【0188】

本発明は、本明細書に記載のベクター作製システムを、リコンビナーゼの発現のための適切な条件下でインキュベートすることを含む、細菌配列不含有ベクターを産生する方法を提供する。ある局面において、本方法は、組換え細胞によってコードされるエンドヌクレアーゼの発現のための好適な条件下で、ベクター作製システムをインキュベートすることをさらに含む。ある局面において、本方法は、組換え細胞によってコードされるヌクレアーゼゲノム編集システムの発現のための好適な条件下で、ベクター作製システムをインキュベートすることをさらに含む。ある局面において、本方法は、細菌配列不含有ベクターを回収することをさらに含む。

【0189】

本発明は、本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターの製造方法により製造された細菌配列不含有ベクターを提供する。

【0190】

ＩＩＩ．細菌配列不含有ベクター
本発明は、（ａ）目的の核酸配列を含む発現カセット、および（ｂ）以下の１以上：（ｉ）発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターの５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％同一の核酸配列を含む合成エンハンサー、（ｉｉ）発現カセット中のプロモーターの５’に位置するＣＭＶエンハンサー、（ｉｉｉ）イントロンを含む５’ＵＴＲであって、該５’ＵＴＲが発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、（ｉｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれた脊椎動物のクロマチンインスレーター、（ｖ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＷＰＲＥ、（ｖｉ）発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれたＳ／ＭＡＲ、または（ｖｉｉ）発現カセットの５’に位置するＤＴＳ、を含む、細菌配列不含有ベクターを提供する。

【0191】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターに対して５’に位置する配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中の別のエンハンサーまたはプロモーターに対して５’に位置する配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の連続コピーのような、核酸配列の複数の連続コピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、核酸配列の３個の連続コピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの５’末端に組み込まれる。ある局面において、配列番号４７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’に組み込まれる。ある局面において、配列番号４７の核酸配列を含むキメライントロンは、ニワトリ β－アクチンプロモーターの３’末端および目的の核酸配列の５’に組み込まれる。

【0192】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中のプロモーターの５’側に位置するＣＭＶエンハンサーを含む。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの複数の連続コピーの３’末端、例えば、合成エンハンサーの１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の連続コピーの３’末端に組み込まれる。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの３個の連続コピーの３’末端に組み込まれる。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列の３’末端に組み込まれる。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６の核酸配列の３’末端に組み込まれる。ある局面において、ＣＭＶプロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端および目的の核酸配列の５’末端に組み込まれる。

【0193】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列の５’側に位置する配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列の５’側に位置する配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列を含む。ある局面において、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列、あるいは配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列は、目的の核酸配列の５’側に位置する発現カセット中の全ての調節エレメントを含む。

【0194】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、イントロンを含む５’ＵＴＲを含み、前記５’ＵＴＲ（すなわち、イントロンを含む５’ＵＴＲ）は、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0195】

ある局面において、５’ＵＴＲは、５’ＵＴＲを欠く同じ細菌配列不含有ベクターと比較して、細菌配列不含有ベクターからの導入遺伝子転写スプライシングおよび翻訳を改善するためのものである。

【0196】

ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、イントロンは、配列番号１の核酸配列を含む。

【0197】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号２の核酸配列を含む。

【0198】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号４の核酸配列を含む。

【0199】

ある局面において、５’ＵＴＲはイントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。

【0200】

ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一であるか、または配列番号１を含み、かつ非コーディング配列は、配列番号１の位置２５から５５の何れか２つのヌクレオチドに対応するイントロン中のヌクレオチドの２つの間に組み込まれている。

【0201】

ある局面において、非コーディング配列は非原核生物性かつ非ウイルス性である。ある局面において、非コーディング配列は真核生物性である。ある局面において、非コーディング配列は、イントロン、ＵＣＯＥ、Ｓ／ＭＡＲ、ＳＶ４０エンハンサー配列（例えば、１つまたは２以上のＳＶ４０エンハンサー配列、例えば２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＳＶ４０エンハンサー配列）、脊椎動物のクロマチンインスレーター（例えば、ｃＨＳ４）、ＷＰＲＥまたはそれらの何れかの組み合わせを含む。

【0202】

ある局面において、非コーディング配列は、Ｓ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５であり、本発明において配列番号９に示される。

【0203】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号３を含む。

【0204】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号５を含む。

【0205】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいて、ニワトリ β－アクチンプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0206】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいてＣＭＶプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている。

【0207】

ある局面において、５’ＵＴＲは、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれ、ここで、前記プロモーターは、ＣＭＶエンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの複数の連続したコピーの３’末端に組み込まれており、例えば、合成エンハンサーの１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の連続コピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、合成エンハンサーの３連続コピーの３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列の３’末端に組み込まれている。ある局面において、ＣＭＶエンハンサーは、配列番号４６の核酸配列の３’末端に組み込まれている。

【0208】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列の３’末端に組み込まれたポリアデニル化シグナルを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、アフリカツメガエル（Xenopus leavis）ベータグロビンポリアデニル化シグナル、ヒトベータグロビンポリアデニル化シグナル、またはハイブリッド型アフリカツメガエルおよびヒト ベータグロビンポリアデニル化シグナルを含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、アフリカツメガエル ベータグロビンポリアデニル化シグナル、ヒトベータグロビンポリアデニル化シグナル、またはハイブリッド型アフリカツメガエルおよびヒト ベータグロビンポリアデニル化シグナルの複数コピー、例えば１コピー、２コピー、３コピー、４コピーまたは５コピーなどを含み。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５の核酸配列を含む。ある局面において、ポリアデニル酸テイル（すなわち、ポリ（Ａ）テイル）は、ポリアデニル化シグナルの３’末端に位置する。ある局面において、ポリ（Ａ）テイルは、１００残基長、１０１残基長、１０２残基長、１０３残基長、１０４残基長、１０５残基長、１０６残基長、１０７残基長、１０８残基長、１０９残基長、１１０残基長、１１１残基長、１１２残基長、１１３残基長、１１４残基長、１１５残基長、１１６残基長、１１７残基長、１１８残基長、１１９残基長、１２０残基長またはそれ以上の残基長である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テイルを含む配列は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一である。ある局面において、ポリアデニル化シグナルおよびポリ（Ａ）テイルを含む配列は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８を含む。

【0209】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中に脊椎動物のクロマチンインスレーターを含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターはｃＨＳ４である。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0210】

ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、配列番号８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは配列番号８を含む。

【0211】

ある局面において、脊椎動物のクロマチンインスレーターは、脊椎動物のクロマチンインスレーターを含まない同じ細菌配列不含有ベクターと比較して、細菌配列不含有ベクターの定着（すなわち、トランスフェクション効率）を改善するためのものである。

【0212】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＷＰＲＥを含む。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいてＳ／ＭＡＲの３’末端およびポリアデニル化シグナルの５’末端に組み込まれている。ある局面において、ＷＰＲＥは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0213】

ある局面において、ＷＰＲＥは、配列番号１１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。

【0214】

ある局面において、ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥを欠く同じ細菌配列不含有ベクターと比較して、細菌配列不含有ベクターからの導入遺伝子の発現を改善する。

【0215】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＳ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、発現カセットにおいて目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に組み込まれている。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、本明細書に記載の通り、発現カセットにおいて、目的の核酸配列の３’末端およびＷＰＲＥの５’末端に組み込まれている。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、本明細書に記載の通り、５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0216】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、ＭＡＲ－３、ＭＡＲ－４またはＭＡＲ－５である。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、配列番号９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは配列番号９を含む。

【0217】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、ヒトＣＳＰ－Ｂ ＭＡＲまたはＣＳＰ－Ｃ ＭＡＲである。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、配列番号１０と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは配列番号１０を含む。

【0218】

ある局面において、Ｓ／ＭＡＲは、Ｓ／ＭＡＲを欠く、同じ細菌配列不含有ベクターと比較して、細菌配列不含有ベクターの発現レベル、安定性および／または持続性（durability）（例えば、エピソームの維持および複製、例えば、ベクターの娘細胞への増殖および分割、ならびに／またはエピジェネティックサイレンシングの防止による）を改善するためのものである。

【0219】

ある局面において、上記の（ｂ）（ｉ）－（ｂ）（ｖ）の何れか１以上を含む（すなわち、ＤＴＳを含まない）細菌配列不含有ベクターは、発現カセットの両側に隣接するエンハンサー配列をさらに含む。ある局面において、発現カセットの両側に隣接するエンハンサー配列は、発現カセットの各鎖に隣接する少なくとも２つのエンハンサー配列である。ある局面において、エンハンサー配列はＳＶ４０エンハンサー配列である。

【0220】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、ＤＴＳを含む。ある局面において、ＤＴＳは、発現カセットの５’側に位置する。ある局面において、ＤＴＳはＳＶ４０エンハンサー配列である。ある局面において、ＤＴＳは細胞特異的である。ある局面において、ＤＴＳは、平滑筋細胞、胚性幹細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、内皮細胞または骨芽細胞に特異的である。

【0221】

ある局面において、本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＵＣＯＥをさらに含む。ある局面において、ＵＣＯＥは、発現カセット中のプロモーターまたは何れかのエンハンサーに対して５’側に位置する。ある局面において、ＵＣＯEは、本明細書に記載の５’ＵＴＲのイントロン内に組み込まれている。

【0222】

ある局面において、ＵＣＯＥはＡ２ＵＣＯＥである。ある局面において、ＵＣＯＥは、配列番号６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、ＵＣＯＥは、配列番号６である。

【0223】

ある局面において、ＵＣＯＥは、ＳＲＦ－ＵＣＯＥである。ある局面において、ＵＣＯＥは、配列番号７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＣＯＥは、配列番号７である。

【0224】

ある局面において、ＵＣＯＥは、ＵＣＯＥを欠く同じ細菌配列不含有ベクターと比較して、細菌配列不含有ベクターからの導入遺伝子の発現を改善する。

【0225】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にエンハンサー－１を含む。ある局面において、エンハンサー－１は、発現カセット中のプロモーターまたは何れかの他のエンハンサーに対して５’側に組み込まれる。ある局面において、エンハンサー－１は、ＵＣＯＥの３’末端とＣＭＶエンハンサーの５’末端との間に組み込まれる。ある局面において、エンハンサー－１は、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。いくつかの態様において、エンハンサー－１は、配列番号１２である。

【0226】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ｃａｇ、Ｒｈｏ、ＶＤＭ２、ＨＣＲもしくはＨＬＰプロモーター、またはそれらの変異体を含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＣＭＶプロモーター変異体を含む。

【0227】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＥＦ１－αプロモーターを含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、発現カセット中にＣＭＶエンハンサーおよびＥＦ１－αプロモーターを含む。

【0228】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、β－グロビンポリアデニル化シグナルの２つのコピーを含む発現カセット中に３’ＵＴＲを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、目的の核酸配列に対して３’側に組み込まれる。

【0229】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエル ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１３である。

【0230】

ある局面において、３’ＵＴＲは、ヒトベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１４である。

【0231】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエル ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーおよびヒト ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列を含む。いくつかの態様において、３’ＵＴＲは配列番号１５である。

【0232】

ある局面において、３’ＵＴＲは、１００～１２０個のアデニンヌクレオチド、すなわち、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個または１２０個のアデニンヌクレオチドを含む、ポリ（Ａ）テイルをさらに含む。

【0233】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１６である。

【0234】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１７である。

【0235】

ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８である。

【0236】

本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターの目的の核酸配列は、細菌配列不含有ベクターを作製するための発現ベクターに関して本明細書中に記載される何れかの核酸配列を含む。

【0237】

ある局面において、本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターは、目的の核酸配列に対して５’側および３’側に位置するＣａｓエンドヌクレアーゼ標的配列（すなわち、ｇＲＮＡ標的化配列に相同な配列）を含み、ここで、遺伝子編集のための標的部位（例えば、染色体における標的部位）は、同じＣａｓエンドヌクレアーゼ標的配列を含む。

【0238】

ある局面において、本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、イムノサイレント化（immunosilenced） Ｃａｓ９－β２）をコードする配列の各側に隣接するｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、イントロン中にｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む、本明細書に記載の５’ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲ１）を含む。ある局面において、細菌配列不含有ベクターは、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む、本明細書に記載のキメライントロンを含む。ある局面において、本明細書に記載のＥＦ１－アルファプロモーターは、固有のイントロン中にｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。ある局面において、本明細書に記載のポリアデニル化シグナルまたは３’ＵＴＲは、ｔＲＮＡ－ｇＲＮＡポリシストロンを含む。ある局面において、本明細書に記載の目的の核酸配列および自己制限ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、本明細書に記載される単一の発現ベクター上に位置する。後者の局面において、自己制限ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む配列は、相同性アームに隣接する目的の核酸配列を含む配列の５’側に位置する。

【0239】

本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターは、上記の修飾の何れかの組合せを含み得る。ある局面において、組合せは、相乗効果を提供する。

【0240】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは共有結合性閉鎖環ベクターである。

【0241】

ある局面において、細菌配列不含有ベクターは共有結合性閉鎖直線状ベクターである。

【0242】

細菌配列非含有ベクターは、環状の共有結合閉鎖ベクターである。

【0243】

本発明は、本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターを含む組換え細胞を提供する。

【0244】

ＩＶ．その他の発現ベクター
上記の改良および改変はまた、限定されるものではないが、細菌配列不含有ベクターの産生ではなく、直接的な遺伝子発現のために利用される発現ベクターのような他の発現ベクターにも適用され得る。ある局面において、本明細書に記載の核酸配列は、ＤＮＡ配列として提供され、発現ベクターはＤＮＡ発現ベクターである。ある局面において、本明細書に記載の核酸配列は、ＲＮＡ配列として提供され、発現ベクターはＲＮＡ発現ベクターである。ＲＮＡ配列は、本明細書中のいずれかの配列番号として提供されるＤＮＡ配列に対応し得るか、または本明細書中のいずれかの配列番号として提供されるＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列に対応し得る。

【0245】

本発明は、本明細書に記載される核酸配列の何れかの組合せを含むポリヌクレオチドを提供する。

【0246】

本発明は、本明細書に記載されるイントロン、イントロンを含む５’ＵＴＲ、および／または３’ＵＴＲの核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0247】

本発明は、配列番号１、２、３、５、１３、１４、１５、１６、１７または１８の何れか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。ある局面において、ポリヌクレオチドは、核酸配列の３’末端に１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含む。ある局面において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３、１４または１５の何れか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列、ならびに核酸配列の３’末端に１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含む。ある局面において、ポリヌクレオチドは、配列番号１、２、３、５、１３、１４、１５、１６、１７または１８の何れか１つの核酸配列を含む。

【0248】

本発明は、本明細書に記載の１以上のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。ある局面において、発現ベクターは、配列番号１、２、３、５、１３、１４、１５、１６、１７または１８の何れか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある局面において、ポリヌクレオチドは、核酸配列の３’末端に１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含む。ある局面において、ポリヌクレオチドは、配列番号１３、１４または１５の何れか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列、ならびに核酸配列の３’末端に１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含む。ある局面において、発現ベクターは、配列番号１、２、３、５、１３、１４、１５、１６、１７または１８の何れか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある局面において、発現ベクターは、配列番号２、３または５の何れか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド、および（ａ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８の何れか１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド、または（ｂ）配列番号１３、１４または１５の何れか１つの核酸配列および核酸配列の３’末端に１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、を含む。

【0249】

本発明は、イントロンを含む５’ＵＴＲであって、前記５’ＵＴＲは、発現カセットにおいてプロモーターと目的の核酸配列との間に組み込まれている、５’ＵＴＲ、および／または発現カセットにおいて目的の核酸配列の３’側に組み込まれたベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む３’ＵＴＲ、を含む発現ベクターを提供する。

【0250】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号２の核酸配列を含む。

【0251】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号４の核酸配列を含む。

【0252】

ある局面において、５’ＵＴＲは、イントロン内に組み込まれた非コーディング配列をさらに含む。

【0253】

ある局面において、イントロンは、配列番号１と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であるか、配列番号１を含み、かつ非コーディング配列は、配列番号１の位置２５から５５の何れか２個のヌクレオチドに対応するイントロン内の２つのヌクレオチドの間に組み込まれている。

【0254】

ある局面において、非コーディング配列は、非原核生物性および非ウイルス性である。ある局面において、非コーディング配列は、真核生物配列である。ある局面において、非コーディング配列は、イントロン、ＵＣＯＥ、Ｓ／ＭＡＲ、ＳＶ４０エンハンサー配列（例えば、１つまたは２以上のＳＶ４０エンハンサー配列、例えば２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のＳＶ４０エンハンサー配列）、脊椎動物のクロマチンインスレーター（例えば、ｃＨＳ４）、ＷＰＲＥまたはそれらの何れかの組み合わせを含む。

【0255】

ある局面において、非コーディング配列は、Ｓ／ＭＡＲを含む。ある局面において、Ｓ／ＭＡＲはＭＡＲ－５であり、本発明において配列番号９に示される。

【0256】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号３を含む。

【0257】

ある局面において、５’ＵＴＲは、配列番号５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、５’ＵＴＲは配列番号５を含む。

【0258】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１３と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１３である。

【0259】

ある局面において、３’ＵＴＲは、ヒト ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの２コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１４と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１４である。

【0260】

ある局面において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーおよびヒト ベータ－グロビンポリアデニル化シグナルの１コピーを含む。ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１５である。

【0261】

ある局面において、３’ＵＴＲは、１００～１２０個のアデニンヌクレオチド、すなわち、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個または１２０個のアデニンヌクレオチドを含む、ポリ（Ａ）テイルをさらに含む。

【0262】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１６である。

【0263】

ある局面において、３’ＵＴＲは、配列番号１７と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１７である。

【0264】

ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、３’ＵＴＲは配列番号１８である。

【0265】

本発明は、配列番号１２と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む発現ベクターを提供する。ある局面において、発現ベクターは、配列番号１２の核酸配列を含む合成エンハンサーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上の連続したコピーのような、核酸配列の複数の連続したコピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは核酸配列の３つの連続したコピーを含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む。ある局面において、合成エンハンサーは、配列番号４６の核酸配列を含む。

【0266】

本発明は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列を含む発現ベクターを提供する。ある局面において、発現ベクターは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列を含む。ある局面において、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一の核酸配列、あるいは配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８または配列番号３９の核酸配列は、発現ベクター中の目的の核酸配列に対して５’側に位置する発現カセット中に全ての調節エレメントを含む。

【0267】

Ｖ．組成物
本発明は、本明細書に記載の発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターを含む組成物を提供する。

【0268】

様々な方法が、当技術分野において既知であり、また、細胞内への核酸の導入にとって好適である。例としては、これらに限定されるわけではないが、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム介在性移入、ヌクレオフェクション、超音波処理、ヒートショック、マグネトフェクション、リポソーム介在性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル介在性移入（ナノ粒子）、カチオンポリマー介在性移入（ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）、または細胞融合が挙げられる。

【0269】

様々なメカニズム、例えば、血管透過性および滞留性亢進（ＥＰＲ）効果など、による治療のバイオアベイラビリティおよび薬物動態特性を改良するために、ナノ粒子担体、例えば、リポソーム、ミセルおよび高分子ナノ粒子が検討されてきた。

【0270】

標的細胞への選択的送達を達成するための、ナノ粒子上への標的化リガンドのコンジュゲーションによって、さらなる改良を達成することができる。例えば、受容体－標的化ナノ粒子送達は、インビトロおよびインビボの両方において治療反応を向上させることが分かっている。調査されてきた標的化リガンドとしては、葉酸、トランスフェリン、抗体、ぺプチドおよびアプタマーが挙げられる。さらに、例えば、画像形成を可能にするため、および細胞内薬物放出を誘発するために、ナノ粒子の設計に複数の機能性を組み入れることができる。

【0271】

ある局面において、組成物は、送達剤をさらに含む。ある局面において、送達剤は、ナノ粒子である。ある局面において、送達剤は、リポソーム、非リピド高分子、エンドソーム、およびそれらの何れかの組合せからなる群より選択される。

【0272】

ある局面において、送達剤（例えば、ナノ粒子）は、標的化リガンドを含む。

【0273】

ある局面において、組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤をさらに含む。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd ed. (2013)を参照のこと。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、対象に対して無毒性であるものを含み得る。ある局面において、組成物あるいは組成物の１以上の成分は、無菌である。無菌成分は、例えば、ろ過によって（例えば、無菌ろ過膜によって）または放射線照射によって（例えば、ガンマ線照射によって）調製され得る。

【0274】

ある局面において、本明細書に記載の発現ベクターまたは細菌配列不含有ベクターを含む組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である。

【0275】

本発明の賦形剤は、医薬組成物に加えられるとき、“薬学的に許容される”賦形剤と説明することができ、それは、賦形剤が、妥当な利益／リスク比に見合う所望の接触期間にわたって、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題のある合併症なしに、健全な医学的判断の範囲内において、ヒトまたは動物の組織との接触に適した化合物、材料、組成物、塩および／または投薬形態であることを意味する。ある局面において、用語“薬学的に許容される”とは、動物、より詳細にはヒトでの使用のために、連邦政府または州政府の規制当局により承認されたか、または米国薬局方もしくは一般的に認可された他の国際薬局方に列挙されていることを意味する。様々な賦形剤を使用することができる。ある局面において、賦形剤は、これらに限定されるわけではないが、アルカリ化剤、安定化剤、酸化防止剤、付着剤、分離剤、コーティング剤、外相成分、制御放出成分、溶媒、界面活性剤、湿潤剤、緩衝剤、充填剤、皮膚軟化剤、またはそれらの組み合わせであり得る。賦形剤は、本明細書に議論したものに加えて、これらに限定されるわけではないが、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd ed. (2013)に列挙される賦形剤を含み得る。本明細書において特定の分類（例えば、“溶媒”など）に賦形剤を含めることは、賦形剤の役割を限定するのではなく、むしろ例示することを意図している。特定の賦形剤は、複数の分類に含まれ得る。

【0276】

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例としては、経腸、局所、非経腸、経口、経肺、鼻腔内、静脈内、表皮、経皮、皮下、筋肉内または腹腔内投与、あるいは吸入が挙げられる。本明細書で用いる“非経腸投与”とは、通常は注射または点滴による経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、その例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節間、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、胸膜内、および胸骨内注射および点滴、ならびにインビボエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。ある局面において、製剤は、経腸経路によって投与され、ある局面においては、経口投与される。他の経腸経路としては、鼻腔内、経膣、直腸、舌下、または局所による、投与の局所、表皮、または粘膜経路が挙げられる。

【0277】

ある局面において、医薬組成物は、凍結乾燥される。

【0278】

ＶＩ．治療的使用および方法
本発明は、本明細書に記載の発現ベクター、細菌配列不含有ベクターまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を処置する方法を提供する。

【0279】

発現ベクター、細菌配列不含有ベクターまたは組成物は、前記疾患または障害の処置において有効である何れかの投与経路によって対象に投与され得る。

【0280】

ある局面において、投与工程は、経腸、局所、非経腸、経口、経肺、鼻腔内、静脈内、表皮、経皮、皮下、筋肉内、くも膜下もしくは腹腔内投与、または吸入によるか、あるいは、脳室内(ＩＣＶ)注射、くも膜下槽(cisterna magna)投与（ＩＣＭ）または腰椎穿刺（ＬＩＴ）を介する脳脊髄液（ＣＳＦ）ベースの送達による。

【0281】

ある局面において、投与工程は、非経腸投与または経腸投与により行われる。

【0282】

ある局面において、非経腸投与は、注射または点滴によって行われる。

【0283】

ある局面において、非経腸投与は、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節間、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、胸膜内、または胸骨内注射または点滴、あるいはインビボエレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、マイクロバブルまたは超音波によって行われる。

【0284】

ある局面において、経腸投与は、経口、局所、表皮、経粘膜、鼻腔内、経膣、経直腸、または舌下投与である。

【0285】

ある局面において、投与工程は、経口、経肺、鼻腔内、静脈内、表皮、経皮、皮下、筋肉内、または腹腔内注射、あるいは吸入によって行われる。

【0286】

ある局面において、投与工程は、経口、経鼻投与、または肺内投与によって行われる。ある局面において、投与工程は、鼻腔内投与によって行われる。

【0287】

投与工程は、例えば、１回、複数回、および／または１回または複数回の長期間にわたって、実施することができる。ある局面において、投与工程は、１回、２回（例えば、第１の投与と、その約１週間後、約２週間後、約３週間後、約４週間後、またはそれ以降での第２の投与）、約１週間毎に１回、約１か月毎に１回、約２か月毎に１回、約３か月毎に１回、約４か月毎に１回、約６か月毎に１回、約１年毎に１回、または約１０年毎に１回である。

【0288】

本発明は、本明細書に記載の発現ベクター、細菌配列不含有ベクター、または医薬組成物からの目的の核酸配列を、遺伝子編集のための標的部位に挿入することを含む、遺伝子編集方法を提供する。

【0289】

ある局面において、挿入工程は非相同末端結合によって行われる。

【0290】

ある局面において、挿入工程は、相同性指向修復によって行われる。ある局面において、目的の核酸配列は、本明細書に記載の５’および３’相同性アームによって隣接されている。

【0291】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に対して相同であり、標的部位と比較して、１以上のヌクレオチド挿入、欠失、逆位または再編成を含む。

【0292】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に対して非相同である。

【0293】

ある局面において、目的の核酸配列は、失われた機能を回復し、異常な機能を修正し、または遺伝子編集のための標的部位に関連するさらなる機能を提供する。

【0294】

ある局面において、目的の核酸配列は、遺伝子編集のための標的部位に関連する遺伝子発現のノックアウトのためのものである。

【0295】

ある局面において、遺伝子編集の方法は、それを必要とする対象において疾患または障害を処置する方法である。

【0296】

ある局面において、目的の核酸配列は、インビボ遺伝子編集のためのものである。

【0297】

ある局面において、目的の核酸配列は、インビトロ遺伝子編集のためのものである。

【0298】

ある局面において、目的の核酸配列は、エクスビボ遺伝子編集（例えば、細胞療法、例えばＣＡＲ Ｔ細胞療法）のためのものである。

【0299】

ある局面において、本方法は、インビトロ法である。ある局面において、インビトロ法は、発現ベクター、細菌配列不含有ベクター、または医薬組成物を細胞に投与することをさらに含む（例えば、インビトロまたはエクスビボ遺伝子編集のために）。ある局面において、インビトロ法は、遺伝子編集のためのエンドヌクレアーゼ、またはゲノム編集システムもしくはその成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ）を細胞に投与することをさらに含む。ある局面において、ゲノム編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮまたはメガヌクレアーゼ遺伝子編集システムである。

【0300】

ある局面において、本方法は、インビボ法である。ある局面において、インビボ法は、発現ベクター、細菌配列不含有ベクター、または医薬組成物を対象に投与することをさらに含む。ある局面において、インビボ法は、遺伝子編集のためのエンドヌクレアーゼ、または遺伝子編集システムもしくはその成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのためのＣａｓエンドヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ）を対象に投与することをさらに含む。ある局面において、遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮまたはメガヌクレアーゼ遺伝子編集システムである。

【0301】

遺伝子編集のためのエンドヌクレアーゼ、またはゲノム編集システムもしくはその成分は、本明細書に記載される何れかの方法、あるいは核酸配列および／またはポリペプチドを細胞または対象に投与するための当技術分野で公知の何れかの方法（投与に適用される電気穿孔またはベクターを介することを含む）によって投与することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む局面では、Ｃａｓおよび／またはｇＲＮＡをコードするＲＮＡを投与することができ、Ｃａｓおよび／またはｇＲＮＡを直接投与することができ、Ｃａｓおよび／またはｇＲＮＡをコードする本明細書に記載の細菌配列不含有ベクターまたは発現ベクターを投与することができ、またはＣａｓおよび／またはｇＲＮＡをコードする当技術分野で公知の何れかの他の好適なベクターを投与することができる。

【0302】

ある局面において、目的の核酸配列は、本明細書に記載される通り、直鎖状の共有結合で閉じた細菌配列不含有ベクター（すなわち、ｍｓＤＮＡ）中に提供される。ある局面において、遺伝子編集における直鎖状の共有結合で閉じた細菌配列不含有ベクターの使用は、細菌配列不含有ベクターの末端が閉じており、二本鎖切断と非反応性であるため、望ましくない非相同末端結合を回避する。ある局面において、遺伝子編集における直鎖状の共有結合で閉じた細菌配列不含有ベクターの使用は、相同性指向修復を増強する。ある局面において、相同性指向修復のための組換え速度は、目的の核酸配列が環状スーパーコイルドベクターによって提供されるときよりも、本明細書に記載される通り、直鎖状の共有結合で閉じた細菌配列不含有ベクターによって提供されるときの方が高い。

【0303】

以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0304】

実施例
実施例１ － キメライントロンまたは５’ＵＴＲを含む発現ベクター
Ａ．発現ベクター
多遺伝子発現ベクターは、親ミニストリング発現ベクター（Mediphage Bioceuticals, Inc., Toronto, CA, 米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号）、pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*のｅＧＦＰコーディング配列を、増強した緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）および細胞外発現のための分泌配列で修飾されたNanoLuc^{（登録商標）}ルシフェラーゼレポーター（NLuc、Promega Corporation）をコードする発現カセットで、親ベクターの２つの特殊化したスーパー配列（ＳＳ＊）部位の間で置換することによって調製した。

【0305】

親ベクターおよび多遺伝子ベクターの発現カセットには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβ－アクチン由来のプロモーター、およびキメライントロンを含む合成プロモーターであるＣＡＧプロモーターが含まれていた。

【0306】

多遺伝子発現ベクターのマップを図１に示し（pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*)、これは、ＣＡＧプロモーターを含む多遺伝子発現カセットに隣接するリコンビナーゼ標的配列（ｔｅｌＬ、ＦＲＴ(最小)、およびｌｏｘＰ）、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａ自己切断ペプチドによって結合された増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）および分泌ナノルシフェラーゼ（ＳｅｃＮＬｕｃ）をコードする配列（SecNLuc-2A-eGFP）、ならびにウサギβ－グロビンポリアデニリル化シグナル（ＢＧｐＡ）を有する特異的スーパー配列部位（ＳＳ＊）を含む。ベクターの核酸配列は、配列番号１９として提供される。

【0307】

同じｅＧＦＰおよびＮｌｕｃ配列を５’ＵＴＲと共にｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Thermo Fisher Scientific）中にクローニングすることにより、第２の多遺伝子発現ベクターを調製した。ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含む多遺伝子発現カセット、Ｐ２Ａ自己切断ペプチドによって連結されたｅＧＦＰおよびＳｅｃＮＬｕｃをコードする配列(SecNLuc-P2A-eGFP)、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）を含む発現ベクターのマップを図２に示す（ベクターpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)。ベクターの核酸配列は、配列番号２０として提供される。

【0308】

Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション
付着性ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、１×１０^５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。

【0309】

発現ベクター（１μg）およびリポフェクトアミン（３μＬ）の複合体を調製し、（１）pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*、（２）pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA、および（３）pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*のそれぞれについて、標準操作手順を用いてインキュベートした。

【0310】

３つの複合体を用いて、個々のウェル中でエレクトロポレーション法によりＨＥＫ２９３細胞を別々にトランスフェクトし、次いで４８時間インキュベートした。他のウェル中のＨＥＫ２９３細胞を、陰性対照としてプラスミドを含まない３μＬのリポフェクトアミンで処理した。

【0311】

細胞を、トランスフェクションの４８時間後に細胞質ＧＦＰ発現およびルシフェラーゼ発現について評価した。

【0312】

Ｃ．細胞質ＧＦＰ発現
細胞質ＧＦＰ発現は、トランスフェクション効率および多遺伝子発現ベクターによる遺伝子の発現レベルの尺度として用いられた。発現は蛍光顕微鏡によって評価され、実験的発現ベクター（pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* および pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)の平均ＧＦＰ発現／強度は、陰性対照（リポフェクトアミンで処理され、プラスミドなしの細胞）および陽性対照（pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*）（本明細書中、親プラスミドCAG-GFP、すなわちPP-CAG-GFPとも呼ばれる）と比較して測定された。

【0313】

自動露光モード下での蛍光細胞のライブイメージングは、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*のキメライントロンおよびpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpAの５’ＵＴＲが同様の発現を有したことを示し、ＧＦＰを実験発現ベクターがＧＦＰを産生することを示した。図３および４を参照のこと。実験発現ベクターによる多遺伝子発現は、陽性対照と比較した平均相対蛍光強度に基づいてＧＦＰ発現に影響を及ぼさなかった（Id）。実験発現ベクターでトランスフェクトした細胞における平均蛍光強度は、陰性対照細胞よりも少なくとも３倍高かった。図４参照のこと。

【0314】

Ｄ．ルシフェラーゼ発現
ルシフェラーゼ発現を、Nano-Glo^{（登録商標）} ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を用いて、トランスフェクトした細胞および陰性対照細胞の培地中の分泌されたルシフェラーゼの強度を、製造業者のプロトコルに従って測定することによって評価した。両方の実験的発現ベクターは、ルシフェラーゼを発現した。図５参照。実験的発現ベクターでトランスフェクトした細胞の培地中の平均相対ルシフェラーゼ強度は、陰性対照細胞の培地中よりも少なくとも３００倍高かった（Id）。

【0315】

実施例２－ＷＰＲＥおよび遺伝子操作された５’ＵＴＲを含有する発現ベクター
Ａ．発現ベクター
多遺伝子発現ベクターを、図１の発現ベクター中のｅＧＦＰおよびＢＧｐＡをコードする配列の間にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をクローニングすることによって調製した。得られた発現ベクターのマップを図６に示す（pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*）。ベクターの核酸配列は配列番号２１として提供される。

【0316】

図６のＣＡＧプロモーターの代わりに、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよび内部最小イントロン配列（すなわち、５’ＵＴＲ１、配列番号２）を含有する遺伝子操作された５’ＵＴＲを含む別の多遺伝子発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターのマップを図７に示す（pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*）。ベクターの核酸配列は、配列番号２２として提供される。

【0317】

図６のＣＡＧプロモーターの代わりに、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターおよび組み込まれたＭＡＲ－５を有するイントロンを含有する遺伝子操作された５’ＵＴＲ（すなわち、５’ＵＴＲ２、配列番号５）を含有するさらなる多遺伝子発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターのマップを図８に示す（pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*）。ベクターの核酸配列は、配列番号２３として提供される。

【0318】

Ｂ． ルシフェラーゼ発現レベルおよび持続性
付着性ＨＥＫ２９３細胞を剥離し、エレクトロポレーション培地中で解析し、１×１０^６細胞／チューブで計数した。

【0319】

発現ベクター（１μｇ）を調製し、（１）pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* （実施例１参照）、（２）pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、（３） pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、および（４） pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、のそれぞれについての標準操作手順を用いて細胞と共にインキュベートした。

【0320】

哺乳動物発現カセットを欠くｐｕｃ５７プラスミドを用いてエレクトロポレーションしたＨＥＫ２９３細胞を陰性対照とした。

【0321】

エレクトロポレーション後、ＨＥＫ２９３細胞を播種し、３×１０^５細胞／ウェルでウェルに付着させた。

【0322】

エレクトロポレーションの２日後、６日後、１０日後、１４日後、１７日後、２０日後、２７日後および３４日後に、ルシフェラーゼ発現を、製造業者のプロトコルに従って、Nano-Glo^{（登録商標）}ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて、４つのトランスフェクションおよび陰性対照のそれぞれについて、２０μＬの細胞培養培地中の分泌されたルシフェラーゼの強度を３回測定することによって評価した。ルシフェラーゼ活性は、BioTek^{（登録商標）}プレートリーダーを用いて測定し、相対ルミノメーターユニット（ＲＬＵ）で表示した。ルシフェラーゼ活性の統計的分析は、スチューデントのＴ検定によって実施した。図９を参照のこと、これはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS* (pGL2-SecNLuc-eGFP)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (WPRE)、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (5'UTR1+WPRE)、またはpGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* (5'UTR2+WPRE)でトランスフェクトした細胞からの培地中の発現レベルを、陰性対照（Neg. Ctl. （プラスミドなし））と比較して示している。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１および＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【0323】

ルシフェラーゼ発現は、４つの発現ベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞から実験の期間を通して検出された。pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、およびpGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*はすべて、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*と比較して、有意に高いルシフェラーゼ発現を示し、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*は最も高い発現増強を示した。

【0324】

Ｃ．娘細胞へのベクター増殖およびルシフェラーゼ発現
ＨＥＫ２９３細胞を、本実施例のパートＢに記載されているように、４つの発現ベクターまたは陰性対照としてｐｕｃ５７プラスミドでトランスフェクトした。細胞を毎週５回継代した。細胞継代の時点で、継代数１－３については元の細胞密度の１／６で、継代数４－５については元の細胞密度の１／１０で細胞を再播種した。各細胞継代について、分泌されたルシフェラーゼ発現を、本実施例のパートＢに記載されているように、細胞再播種の６－８日後に測定した。図１０を参照のこと、これは、各継代数における陰性対照と比較した、ベクターでトランスフェクトした細胞からの培地中の発現レベルを示している。統計的分析およびｐ値は、本実施例のパートＢに記載のとおりであった。

【0325】

ルシフェラーゼ発現は、各継代数で４つの発現ベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞から検出され、ベクターがルシフェラーゼの持続的な発現を有する娘細胞に受け継がれたことを示した。pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、およびpGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*はすべて、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*と比較して、各継代数で有意に高いルシフェラーゼ発現を示し、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*は最も高い発現増強を示した。

【0326】

その後の研究では、ルシフェラーゼの持続的な発現を伴う娘細胞へのｍｓＤＮＡの増殖も観察された。

【0327】

簡単に説明すると、ｍｓＤＮＡは、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*から、本明細書および米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号に記載された方法を用いて、誘導性E. coliベクター産生系において産生された。リポフェクトアミンとの別個の複合体は、（１）ｍｓＤＮＡ（すなわち、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA）、（２）親プラスミド（すなわち、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*）、および（３）ルシフェラーゼ発現カセットを有する従来のプラスミド（すなわち、pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA）を用いて調製された。ＨＥＫ２９３細胞を、個々のウェル中でエレクトロポレーション法により、合計０．２５ ｐｍｏｌのベクター／ウェルで別々にトランスフェクトした。細胞を７回継代し、各継代で１０倍の細胞希釈を行った。８日目、１５日目、２４日目、３１日目、３８日目、４５日目および５２日目に、それぞれ継代数１、２、３、４、５、６および７について、相対的ルシフェラーゼ強度を測定した。

【0328】

図１１に示すように、pGL 2-SecNLuc*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*（すなわち、ｐＤＮＡ（ＣＭＶ＋Ｕ１＋Ｗ））およびmsDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（すなわち、ｍｓＤＮＡ（ＣＭＶ＋Ｕ１＋Ｗ））は、pcDNA-CMV-5'UTR-SS-P2A-eGFP-bGhPa（すなわち、スーパー遺伝子を含まない従来のプラスミド（従来のｐｃＤＮＡ））よりも、すべての継代数にわたってはるかに高いレベルで持続的な導入遺伝子発現を示した。従来のプラスミドデータセットと比較して、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１および＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【0329】

Ｄ．娘細胞へのベクター増殖およびｅＧＦＰ発現
pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*（pGL2-SecNLuc-eGFP）またはpGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*（5'UTR1+WPRE）でトランスフェクトし、かつ本実施例のパートＣに従って継代した細胞を、ｅＧＦＰ発現について分析した。

【0330】

各継代培養の６～８日後に画像化を行った。BioTek^{（登録商標）}Cytation^（商標） ５プレートリーダーを用いて生細胞イメージングを行った。図１２Ａを参照のこと、これは、継代数１、２、３および５におけるＨＥＫ－２９３細胞における蛍光の代表的な顕微鏡写真を示している。ｅＧＦＰ発現は、各継代数において発現ベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞から検出され、ベクターがｅＧＦＰの持続的な発現を有する娘細胞に受け継がれたことを示した。pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*は、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*と比較して、各継代数においてより強い蛍光シグナルを示し、より高いトランスフェクション効率を示した。

【0331】

各発現ベクターについて各トリプリケートのウェルから１つの代表画像を取得し、ｅＧＦＰ発現細胞（ＧＦＰ＋）を、ＩｍａｇｅＪコンピュータソフトウェアを用いた手動の細胞計数によって定量した。ＧＦＰ^＋細胞の統計的分析は、スチューデントのｔ検定を用いて実施した。図１２Ｂを参照のこと、これは各継代数におけるトリプリケート生蛍光画像から視野内で観察されたＧＦＰ^＋細胞の折れ線グラフを示す（トリプリケート画像の分散のため、有意でない（ｎｓ）＝ｐ＞０．０５）。

【0332】

ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、各ＧＦＰ^＋細胞を手動で選択し、画素強度に基づいて各細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。各細胞の最終ＭＦＩ値を計算するために、以下の式を用いた（最終ＭＦＩ＝細胞ＭＦＩ－バックグラウンドＭＦＩ）。ＭＦＩ測定値は、各処置群について撮影した３枚の画像のそれぞれから少なくとも５０個の細胞について得た。次いで、すべてのＭＦＩ測定値をプールし、ドットプロットを作成するために使用した。スチューデントのｔ検定を用いて統計的分析を行った。継代数５におけるＭＦＩのドットプロットを示す図１２Ｃを参照のこと、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*についてはｎ＝２５７細胞、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*についてはｎ＝４１４細胞、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。図１２Ｃの下にある棒グラフは、測定されたすべてのＧＦＰ^＋細胞についての平均ＭＦＩ値を示す。pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*のＭＦＩは、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*よりも約３倍高いと測定された。

【0333】

実施例４－動物モデルにおけるｍｓＤＮＡによる非ウイルス送達
肝臓、網膜および脳へのｍｓＤＮＡの標的化送達を評価するための研究を実施した。各標的組織について、異なる投与経路（ＲＯＡ）、用量、投与レジメン、および送達技術が評価された。分泌されたルシフェラーゼ発現動態、細胞質ｅＧＦＰ発現レベル、およびトランスフェクション効率（ＴＥ）が評価された。さらに、ｍｓＤＮＡへの耐容性は、生理学的評価、組織形態分析、血漿サイトカインアッセイ、および肝毒性分析によって、単回または複数回の注射後に評価した。

【0334】

すべての送達技術にわたって、ｍｓＤＮＡは、複数の脳室内（ＩＣＶ）またはハイドロダイナミック注射（ＨＤＩ）および静脈内（ＩＶ）注射によって、それぞれ脳および肝臓組織において強力な有効性および耐容性プロファイルを示した。ｍｓＤＮＡで処理した成体マウスは、１回のＩＶ注射後に持続的な分泌ルシフェラーゼレベル（＞１０^８ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示した。ｍｓＤＮＡは、１回のＩＶ注射後に肝臓組織において持続的な（＞１００日）発現を示した。深部組織領域への有意な生体内分布も実証され、脳幹、小脳、皮質および視床で８０％～９７％のＴＥが認められた。ナノ担体－ｍｓＤＮＡ複合体を用いたトリプルＩＣＶ注射は、副作用を示さなかった。

【0335】

Ａ．肝臓
１．２ｍｇ／ｋｇ（５０μｇ）の単回高用量、担体を含まないそのままのプラスミドのハイドロダイナミック注射によるルシフェラーゼの発現
８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊオス野生型成体マウスに、２ｍｇ／ｋｇ（５０μｇ）の高用量を、担体を含まないpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA（スーパー配列を含まない陽性対照）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*を、尾静脈からのハイドロダイナミック注射（ＨＤＩ）により投与した。ＨＤＩ後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に処理マウスの血漿を採取し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を調べた。ベクター投与後１日目に、すべてのマウスは高レベルのルシフェラーゼ発現（１０^８～１０^９ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示した。ベクター投与後７日目に、ｐＣＡＧＬｕｃおよびｐＣＡＧＬｕｃ－ＷＰＲＥ処理マウスは１０^７～１０８ ＲＬＵ／ｍｇ細胞質タンパク質を示したが、ｐＧＳＮＬｕｃ－ＷＰＲＥ処理マウスは、低レベルのルシフェラーゼ発現（約１０^６ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示した。ベクター投与の８週間後、すべてのマウスは低レベルのルシフェラーゼ発現（約１０^５ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を示した。ルシフェラーゼレベルの急速な低下は、プラスミド処理マウスで誘導された体液性または細胞性免疫応答に起因する可能性がある（図１３－１４参照のこと）。

【0336】

２．０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）の単回低用量、担体を含まないそのままのプラスミドのハイドロダイナミック注射によるルシフェラーゼの発現
動物モデルにおける非ウイルス遺伝子送達後のプラスミドＤＮＡの用量応答を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオス野生型成体８～１２週齢マウスに、担体を含まないpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA（スーパー配列を含まない陽性対照、２匹のマウス）、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*（２匹のマウス）、またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*（２匹のマウス）の０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）の低用量を、尾静脈を介してＨＤＩにより投与した。さらに２匹のマウスには注射せず、陰性対照とした。ＨＤＩ投与後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目にマウスの血漿を採取し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を調べた。pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*およびpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*で処理したマウスは、ベクター投与後８週間以上にわたって持続的な高レベルのルシフェラーゼ発現（１０^７～１０^８ ＲＬＵ/ｍｇタンパク質）を示し、同質遺伝子発現カセットを有するがスーパー配列（ＳＳ）を含まない従来の対照プラスミドよりも１００倍以上高い発現を示した。図１５参照のこと。

【0337】

ＩＶＩＳを用いたインビボ全身バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）は、ベクターのＨＤＩの２４時間後にfluorofurimazine(FFz)の１：５希釈を腹腔内注射することによって実施した。ＢＬＩは、血漿サンプル中のルセリフェラーゼのレベルと相関することが示された（データは示さず）。

【0338】

３．０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）の単回低用量、担体を含まないそのままのｍｓＤＮＡのハイドロダイナミック注射によるルシフェラーゼの発現
ｍｓＤＮＡを、本明細書中ならびに米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号に記載の方法を用いて、誘導性E. coliベクター産生システムにおいて、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* および pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*から作製した。

【0339】

８～１２週齢のＣ５７ＢＬ/６Ｊオス野生型成体マウスに、０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）の低用量の担体を含まないpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA（陽性対照、５匹のマウス）、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（５匹のマウス）、またはmsDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（５匹のマウス）を、尾静脈を介したハイドロダイナミック注射（ＨＤＩ）により単回投与した。さらに２匹のマウスには注射せず、陰性対照とした。ＨＤＩ投与後１日目、３日目、７日目、１０日目、１５日目、２２日目、２８日目、４２日目および５６日目に処理マウスの血漿を採取し、ルシフェラーゼ遺伝子発現を調べた。

【0340】

プラスミド処理マウスと同様に、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA処理マウスは、ベクター投与後８週間以上にわたって持続的な高レベルのルシフェラーゼ発現（１０^７～１０^８ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）を生じたが、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA処理マウスにおけるルシフェラーゼ発現は、１ヶ月未満で低レベル（約１０^６ ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）に低下した。msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA処理マウスにおけるルシフェラーゼ発現の急速な低下は、肝細胞におけるＣＭＶプロモーターのサイレンシングによるものと考えられた。

【0341】

ルシフェラーゼ遺伝子発現は、ＩＶＩＳを用いた全身ライブイメージングによって確認した。

【0342】

以下の表１は、血漿試料中のルシフェラーゼ発現（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）およびＢＬＩ（光子／秒）によって検出されるような、１日目、７日目および２８日目の個々のマウスからのデータを提供する。

【0343】

【表1】

【0344】

図１６に示すように、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAで処理したマウスは、ＨＤＩ後５６日目に、親プラスミドpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*と比較して、ルシフェラーゼ発現の１０倍の増加を示した。

【0345】

このデータは、マウスにおけるｍｓＤＮＡによる非ウイルス性送達が高度に効率的であり、得られた遺伝子発現が２ヶ月以上安定であったことを示している。

【0346】

４． ０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）の単回低用量からのｅＧＦＰの発現、担体を含まないそのままのｍｓＤＮＡのハイドロダイナミック注射
細胞内細胞質ｅＧＦＰ発現レベルをＥＬＩＳＡで評価した。簡単に言えば、パート３に記載されるように、０．２ｍｇ／ｋｇ（５μｇ）のベクターの単回低用量でＨＤＩの５６日後にマウスから肝臓サンプルを採取し、タンパク質抽出のためにホモジナイズした。肝臓溶解物から総タンパク質濃度を測定し、ＧＦＰタンパク質レベルをＥＬＩＳＡで分析した。

【0347】

図１７のデータをルシフェラーゼのデータと比較することによって明らかなように、細胞質ＧＦＰ発現レベルは、同じ構築物からのルシフェラーゼの分泌レベルと直接的に相関した。

【0348】

図１８に示すように、５μｇの担体を含まないmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BgpAの単回のＨＤＩ尾静脈注射は、ＨＤＩ後少なくとも５６日間、肝臓組織において強力かつ持続的な細胞質ｅＧＦＰ発現を示した。

【0349】

５．低用量単回静脈内投与時の肝臓におけるｍｓＤＮＡの発現および耐容性
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊオス野生型成体８～１２週齢マウスに、０．３ｍｇ／ｋｇのpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA（スーパー配列を含まない陽性対照）、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA、またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*を、脂肪ナノ粒子担体でリポプレックスした状態で、単回静脈内尾静脈注射により投与した。担体はまた、陰性ビークル対照としても用いた。

【0350】

ＩＶＩＳを用いたインビボ全身バイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）を、ベクターの単回ＩＶ注射後１日目、３日目、１０日目、３０日目、５８日目、９２日目、１１９日目および１７４日目に上記の通りに実施した。図１９に示すように、ｍｓＤＮＡ構築物は、前駆体プラスミドおよび従来のプラスミドよりも優れており、高度かつ持続的なルシフェラーゼ分泌を示す。

【0351】

血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、肝毒性およびサイトカイン応答も、ベクターの注射後に評価した。前駆体プラスミドおよびｃａｇプロモーターを含むｍｓＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターを含む構築物と比較して高い耐容性プロファイルを示した。しかしながら、ＣＭＶプロモーターを含むｍｓＤＮＡは、ＣＭＶ前駆体親プラスミドおよび従来のプラスミドと比較して、顕著に低いサイトカインおよび肝毒性応答を示した。以下の表２を参照のこと、これは注射後４時間および１４日目における肝機能マーカーのサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）および酵素濃度（Ｕ／Ｌ）を示す。

【0352】

【表2】

【0353】

Ｂ．脳
本明細書ならびに米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号に記載の方法を用いて、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS* および pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*から、誘導性E. coliベクター産生システムにおいてｍｓＤＮＡを産生した。

【0354】

成体野生型マウスに、ナノ担体を用いて調製したmsDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（３匹のマウス）またはナノ担体を用いて調製したmsDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（３匹のマウス）を、移植後０日目、１４日目および２８日目に、それぞれ１μｇのＤＮＡを埋め込みカニューレを介して３回脳室内（ＩＣＶ）注射することによって投与した。動物を、移植後４２日目に安楽死させ、矢状脳切片を皮質、視床、脳幹および小脳から採取した。

【0355】

図２０は、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射した処置群のマウス＃１の皮質、視床、脳幹および小脳の切片を示す。切片におけるｍｓＤＮＡのトランスフェクション効率は、皮質、視床、脳幹および小脳（プルキンエ細胞）でそれぞれ８１．９％、７３．０％、６９．２％および９６．０％であると測定された。トランスフェクション効率は、すべてのＤＡＰＩ陽性細胞の中でＧＦＰおよびＤＡＰＩの両方に対して陽性である細胞の割合として計算した。

【0356】

msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射した処置群のマウス＃１よび対照プラスミドpcDNA-CMV-５’UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpAを注射したマウスからの皮質、視床および脳幹切片におけるＧＦＰ発現の比較により、トランスフェクション効率および結果として生じるＧＦＰ発現が、従来のプラスミドと比較してｍｓＤＮＡの方が高いことが示された（データは示さず）。

【0357】

図２１は、皮質および視床からの切片を示し、図２２は、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射した処置群のマウス＃２からの脳幹および小脳からの切片を示す。ニューロンをニューロンマーカーＮｅｕＮで標識し、トランスフェクトした細胞はＧＦＰを発現することが示された。トランスフェクション効率は、皮質、視床、脳幹、および小脳（プルキンエ細胞）でそれぞれ９９．６％、９８．８％、９８．５％、および８０．８％であると決定された。トランスフェクション効率は、すべてのＮｅｕＮ陽性細胞の中でＧＦＰおよびＮｅｕＮの両方に対して陽性である細胞の割合として計算した。

【0358】

図２３は、皮質および視床からの切片を示し、図２４は、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpAを注射した処置群のマウス＃１からの脳幹および小脳からの切片を示す。ニューロンをニューロンマーカーＮｅｕＮで標識し、トランスフェクトした細胞はＧＦＰを発現することが示された。トランスフェクション効率は、皮質、視床、脳幹、および小脳（プルキンエ細胞）でそれぞれ９１．１％、８８．８％、７３．７％、および９２．１％であると測定された。トランスフェクション効率は、すべてのＮｅｕＮ陽性細胞の中でＧＦＰおよびＮｅｕＮの両方に対して陽性である細胞の割合として計算した。

【0359】

以下の表３に、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（“ＣＡＧ－ＷＰＲＥ”）またはmsDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA（“ＣＭＶ－ＷＰＲＥ”）を注射したマウスについて上記で議論したトランスフェクション効率をまとめる。

【0360】

【表3】

【0361】

移植されたカニューレを介したＩＣＶの反復注射は、細胞毒性または神経変性の徴候なしに、良好な全体的な組織完全性をもたらした。

【0362】

データは、ｍｓＤＮＡが再投与可能（redosable）であり、形態的な悪影響を及ぼすことなく、複数の脳領域において高いトランスフェクション効率、生体内分布、および導入遺伝子の発現をもたらしたことを示す。

【0363】

実施例５－ヒト細胞における有効性及び安全性
pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA （陽性対照）、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA、またはpGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*を脂肪ナノ粒子担体と共にそれぞれリポプレックスとした（lipoplexed）。

【0364】

ヒトＴ細胞（Ｐａｎ－Ｔ（ＴＡ＋））および肝細胞（Ｈｕｈ７）に、０．３μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ用量のリポプレックス化ベクターをトランスフェクトした。

【0365】

リポプレックス化されたｍｓＤＮＡベクターは、トランスフェクション後３日目および５日目に、親プラスミドおよび従来のプラスミドと比較して、両方の細胞タイプにおいて高い発現を示した。図２５および２６を参照のこと。

【0366】

リポプレックス化されたｍｓＤＮＡはまた、エクスビボでヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において十分に許容された。特に、ｍｓＤＮＡは、従来のプラスミドと比較して、ヒトＰＢＭＣにおいて有意に低いサイトカインプロファイルレベルを示した（データは示さず）。

【0367】

実施例６－ｍｓＤＮＡでの相同性指向修復
従来のプラスミドＤＮＡと比較して、ｍｓＤＮＡによって仲介される相同性指向修復を評価するために試験を実施した。

【0368】

５’および３’相同アームに隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含む発現カセットを用いて、従来のプラスミドを作製した（プラスミドＤＮＡ ＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲ）。

【0369】

２つのスーパー配列部位に隣接する従来のプラスミドで用いたのと同じＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲ配列を用いて、ｍｓＤＮＡ発現ベクターを作製した。次いで、ＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲを含有するｍｓＤＮＡ（ｍｓＤＮＡ ＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲ）を、本明細書および米国特許第９，２９０，７７８号および同第９，８６２，９５４号に記載の方法を用いて、誘導性大腸菌ベクター産生システムにおいて作製した。

【0370】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムとともに、等モル濃度のプラスミドＤＮＡ ＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲまたはｍｓＤＮＡ ＨＤＲ－ＧＯＩ－ＨＤＲのいずれかをトランスフェクトして、ＧＯＩの相同性指向修復ノックイン（ＨＤＲ ＫＩ）を仲介した。

【0371】

ＧＯＩのホモロジー指向性修復ノックイン（ＨＤＲ ＫＩ）効率は、トランスフェクション後３日目、７日目および１５日目に、トランスフェクトされた細胞の総数と比較して、それらの表面にＧＯＩを発現した、組み込まれた健康なｉＰＳＣの総数を計数することによって、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で評価した。図２７Ｂ、２８Ｂおよび２９ＡのＱ３に示されるように、ＨＤＲ ＫＩ効率は、トランスフェクション後３日目、７日目および１５日目に、従来のプラスミドについて、それぞれ８．６０％、７．７６％および８．０５％であった。図２７Ｃ、２８Ｃおよび２９ＢのＱ３に示されるように、トランスフェクション後３日目、７日目および１５日目に、それぞれ１５．４％、１５．４％および１５．７％のより高いＨＤＲ ＫＩ効率が、ｍｓＤＮＡについて観察された。

【0372】

実施例７－調節配列修飾を含有する発現ベクター
Ａ．発現ベクター
２つのスーパー配列部位、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、内部最小イントロン配列を含有する遺伝子操作された５’ＵＴＲ、ならびに実施例１および２に記載されたｅＧＦＰおよびＮｌｕｃをコードする多遺伝子性発現カセットを含有する発現ベクターはまた、ヒトβ－グロビンポリアデニリル化シグナルおよび１２０アデニンヌクレオチドの２つのコピーを含有する３’ＵＴＲ（すなわち、2huBGpA-A120、配列番号１７）、ならびに（１）ＣＭＶエンハンサーの５’末端に位置する合成エンハンサー（すなわち、エンハンサー－１（Ｅ１）、配列番号１２）、（２）３’ＵＴＲの５’末端に位置するＷＰＲＥ、（３）５’スーパー配列の３’末端に位置するＳＲＦ－ＵＣＯＥ、および（４）ｅＧＦＰの３’末端に位置するヒトＣＳＰ－Ｂ ＭＡＲ（ｈｕＭＡＲ）、の１以上を含有するように設計された。設計されたベクターのマップを図３０から３８に示す。図３０は、３’ＵＴＲ（SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２４）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３１は、Ｅ１および３’ＵＴＲ（SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２５）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３２は、Ｅ１、ＷＰＲＥおよび３’ＵＴＲ（SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２６）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３３は、ＵＣＯＥ、Ｅ１、ＷＰＲＥおよび３’ＵＴＲ（SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２７）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３４は、Ｅ１、ｈｕＭＡＲおよび３’ＵＴＲ（SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２８）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３５は、ＵＣＯＥ、Ｅ１、ｈｕＭＡＲ、および３’ＵＴＲ（SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号２９）を含有する発現ベクターのマップを示す。図３６は、ＵＣＯＥ、Ｅ１、ＷＰＲＥおよび３’ＵＴＲ（SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号３０）を含む発現ベクターのマップを示す。図３７は、Ｅ１、ｈｕＭＡＲ、ＷＰＲＥおよび３’ＵＴＲ（SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号３１）を含む発現ベクターのマップを示す。図３８は、ＵＣＯＥ、Ｅ１、ｈｕＭＡＲ、ＷＰＲＥおよび３’ＵＴＲ（SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、配列番号３２）を含む発現ベクターのマップを示す。

【0373】

Ｂ．ルシフェラーゼ発現レベル
ＨＥＫ２９３細胞を、（１）図２に示すような従来のプラスミドpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA、（２）SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、（３）S*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*、および（４）SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*で、標準操作手順を用いて別個にトランスフェクトした。

【0374】

エレクトロポレーション後２日目、３日目、７日目、１０日目、１４日目、２１日目および２８日目に、実施例２Ｂに記載のように、培養細胞の培地から分泌されたルシフェラーゼの強度を測定することによって、ルシフェラーゼ発現を評価した。図３９を参照のこと、これはpcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA （従来のpDNA CMV-U）、SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* （Ａ： CMV-U1-3'UTR）、SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* （Ｂ： E1-CMV-U1-3'UTR）、およびSS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS* （Ｃ： E1-CMV-U1-WPRE-3'UTR）でトランスフェクトした細胞からの培地における発現レベルを示す。

【0375】

図３９に示すように、ルシフェラーゼ発現は、同一のプロモーターおよび多遺伝子発現カセットを有する従来のプラスミドと比較して、３’ＵＴＲを含有するｍｓＤＮＡ発現ベクターにおいて増加し、持続した。発現は、Ｅ１（Ａ対Ｂ）およびＷＰＲＥ（Ｂ対Ｃ）遺伝子エレメントをｍｓＤＮＡ発現ベクターに添加するとさらに増加し、Ｅ１およびＷＰＲＥ遺伝子エレメントの相加作用は、構築物Ｃに関連する最も高いルシフェラーゼ発現をもたらした。ｔ検定を用いて統計解析を実施した。＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１。

【0376】

Ｃ．娘細胞へのベクター増殖およびルシフェラーゼ発現
ＨＥＫ２９３細胞を、本実施例のパートＢに記載した４つの発現ベクターでトランスフェクトした。細胞を７日毎に５継代した。細胞継代時に、細胞を元の細胞密度の１／１０で再播種した。各細胞継代について、分泌されたルシフェラーゼ発現を実施例２Ｂに記載の通りに測定した。図４０を参照のこと、これは従来のプラスミドと比較した、ｍｓＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細胞からの培地中の発現レベルを示す。統計解析およびｐ値は、本実施例のパートＢに記載したとおりであった。

【0377】

ルシフェラーゼ発現は、各継代数においてｍｓＤＮＡ発現ベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞から検出され、このことは、ベクターが、ルシフェラーゼの持続的な発現を伴う娘細胞に受け継がれたことを示している。

【0378】

図４０に示すように、Ｅ１およびＷＰＲＥ遺伝子エレメントの相加作用は、各継代数において構築物Ｃに関連する最も高いルシフェラーゼ発現、および複数継代後の最も持続的な発現をもたらした。

【0379】

実施例８－合成プロモーター配列を含有する発現ベクター
Ａ．発現ベクター
５つの合成プロモーター配列が作製された：(１）３コピーの合成エンハンサーＥ１（すなわち、３コピーの配列番号１２）、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含むＣＡＧ［Ｅ１Ｘ３＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］（配列番号３５）、（２）Ｅ２（Ｕ１００）、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロンを含むＣＡＧ［Ｅ２＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］（配列番号３６）、（３）３コピーの合成エンハンサーＥ１、ニワトリβ－アクチンプロモーター、および５’ＵＴＲ１を含むＣＡＧ［Ｅ１Ｘ３＋ＣＢＡプロモーター＋ＵＴＲ１］（配列番号３７）、（４）Ｅ２（Ｕ１００）、ニワトリβ－アクチンプロモーター、および５’ＵＴＲ１を含むＣＡＧ［Ｅ２（Ｕ１００）＋ＣＢＡプロモーター＋ＵＴＲ１］（配列番号３８）、および（５）ＣＭＶエンハンサー、ＥＦ１ａ短いプロモーター、および５’ＵＴＲ１を含むＣＭＶエンハンサー－ＥＦ１－ＵＴＲ１（配列番号３９）。

【0380】

実施例１および２に記載したように、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、およびキメライントロン、ならびにｅＧＦＰおよびＮｌｕｃをコードする多遺伝子発現カセットを含有する従来のプラスミドを作製した。従来のプラスミドのマップを図４１に示す（pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobinポリA、配列番号３４）。

【0381】

２つのスーパー配列部位、ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ－アクチンプロモーター、キメライントロン、ｅＧＦＰおよびＮｌｕｃをコードする多遺伝子発現カセット、ＷＰＲＥ、および３’ＵＴＲを含むｍｓＤＮＡ発現ベクターを作製した。ベクターのマップを図４２に示す（4-1 pGL2-SS*-CAG［ＣＭＶエンハンサー＋ＣＢＡプロモーター＋イントロン］－SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ ポリＡ）-SS*、配列番号４０）。

【0382】

図４３（４－２ pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBAプロモーター＋イントロン］-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ポリＡ）-SS*、配列番号４１）、図４４（４－３ pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBAプロモーター＋イントロン］-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ポリＡ）－SS*、配列番号４２）、図４５（４－４ pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBAプロモーター+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ポリＡ）-SS*、配列番号４３）、図４６（４－５-pGL2-SS*-CAG[E2(U100)＋CBAプロモーター+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ポリＡ）-SS*、配列番号４４）、および図４７（４－６-pGL2-SS*-CMVエンハンサー-EF 1-UTR1-SecNLuc-2 A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ポリＡ）-SS*、配列番号４５）に示すそれぞれのベクターマップを用いて、２つのスーパー配列部位、ｅＧＦＰおよびＮｌｕｃをコードする多遺伝子性発現カセット、ＷＰＲＥ、および３’ＵＴＲを、上述の合成プロモーター（１）～（５）の１つとともに含有する５つのｍｓＤＮＡ発現ベクターを作製した。

【0383】

Ｂ．ルシフェラーゼ発現レベル
ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに１×１０^５細胞/ウェルで播種し、リポフェクトアミンおよび本実施例のパートＡに記載したベクターの複合体を０．２５ｐｍｏｌ ＤＮＡ／ウェルで別々にトランスフェクトした。分泌されたルシフェラーゼ発現を、トランスフェクションの３日後および６日後に実施例２Ｂに記載したように測定した。図４８を参照のこと、これは、従来のプラスミドと比較した、ｍｓＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした細胞からの培地中の発現レベルを示す。統計解析を、従来のプラスミドと比較して、二元配置分散分析を用いて実施した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。

【0384】

ルシフェラーゼ発現レベルは、従来のプラスミドと比較して、すべてのｍｓＤＮＡ発現ベクターで高かった。最も高い発現は、4-6-pGL2-SS*-CMVエンハンサー-EF 1-UTR1-SecNLuc-2 A-eGFP-WPRE-3'UTR（１０８～１２０ ポリＡ（4-6:CMV-EF1-UTR1-W-3'UTR））で観察され、これは、ＣＭＶエンハンサーおよび５’ＵＴＲ１と組み合わせてＥＦ－１プロモーターエレメントを含む。

【0385】

実施例９－ＳＳおよび発現カセット修飾
本明細書に記載の発現ベクターのスーパー配列（ＳＳ）および発現カセットに対する改変の影響は、トランスフェクション効率、目的の核酸配列（実施例１および２に記載される多遺伝子ＧＦＰおよびルシフェラーゼ発現カセットのようなレポーター遺伝子を含む）の発現、および分裂細胞（急速および緩徐分裂細胞を含む）におけるベクターの耐久性／増殖に関して評価される。ＳＳに対する改変はまた、これらの部位における制限酵素活性についても評価される。

【0386】

修飾は、限定されるものではないが、ベクターバックボーンとリコンビナーゼの切断部位との間のＳＳ中のリコンビナーゼの非結合領域に組み込まれたエンドヌクレアーゼ標的配列、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端（すなわち、５’ＳＳの３’末端）と発現カセット中のプロモーターの５’との間に組み込まれたＣＡＧプロモーター、第１のリコンビナーゼに対する第１の標的配列の３’末端（すなわち、５’ＳＳの３’末端）と発現カセット中のプロモーターの５’との間に組み込まれたＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサーの５’および／またはＵＣＯＥの３’に位置するエンハンサー－１配列、ＣＭＶ、ＥＦ１、ＳＶ４０、ＣＡＧ、Ｒｈｏ、ＶＤＭ２、ＨＣＲまたはＨＬＰプロモーターもしくはその改変体、ＣＭＶプロモーター改変体、ＥＦ１－αプロモーター、合成プロモーター、イントロン内に組み込まれた非コード配列を伴うまたは伴わないプロモーターと目的の核酸配列との間に発現カセット中に組み込まれたイントロンを含む５’ＵＴＲ（例えば、配列番号２～５のいずれか１つの核酸配列を含む５’ＵＴＲ）、目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に発現カセット中に組み込まれた脊椎動物クロマチンインスレーター、目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に発現カセット中に組み込まれたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、目的の核酸配列とポリアデニル化シグナルとの間に発現カセット中に組み込まれた足場／マトリックス付着領域、発現カセット中のプロモーターの５’に位置する（例えば、５’ＳＳの３’において、かつ発現カセット中の他の配列の前に）ユビキタスなクロマチン開口エレメント、終止コドンの直後（例えば、配列番号１３～１６のいずれか１つの核酸配列を含む３’ＵＴＲ）のような目的の核酸と３’ＳＳとの間に発現カセット中に組み込まれた３’ＵＴＲ、および/または１００～１２０個のアデニンヌクレオチドを含むポリ（Ａ）テイル（例えば、３’ＵＴＲの３’末端として）などの個々の修飾および組合せを含む。

【0387】

配列
配列番号１ 人工イントロン
gtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcag

配列番号２ ５’ＵＴＲ１
ctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttcca

配列番号３ ＭＡＲ－５挿入を有する５’ＵＴＲ１
ctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatagtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttcca

配列番号４ ５’ＵＴＲ
attgggatcttcacacagcaggtaaggttgcgggccgggcctgggccgggtccgggccgggccgcactgacccctggtgttgctttttttttttaggccgcaagctgaagcgtgtcc

配列番号５ ５’ＵＴＲ２ （ＭＡＲ－５挿入を有する配列番号４の５’ＵＴＲ）
attgggatcttcacacagcaggtaaggttgcgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatagccgcactgacccctggtgttgctttttttttttaggccgcaagctgaagcgtgtcc

配列番号６ Ａ２ＵＣＯＥエレメント
gcggccgcacgcgtggccctccgcgcctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcgcgcggggccgccggggggaggggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgcgcgcgcggcggggggaggggccggcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcgccgacgaccgcggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggcggggcgaggacagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgccaaaaccggactccgcccacttcctcgcccgccggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagggggagttgggagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccaggggtcagttccacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttgattcgggtgtttccggaaggggccgagtcaatccgccgagttggggcacggaaaacaaaaagggaaggctactaagatttttctggcgggggttatcattggcgtaactgcagggaccacctcccgggttgagggggctggatctccaggctgcggattaagcccctcccgtcggcgttaatttcaaactgcgcgacgtttctcacctgccttcgccaaggcaggggccgggaccctattccaagaggtagtaactagcaggactctagccttccgcaattcattgagcgcatttacggaagtaacgtcgggtactgtctctggccgcaagggtgggaggagtacgcatttggcgtaaggtggggcgtagagccttcccgccattggcggcggatagggcgtttacgcgacggcctgacgtagcggaagacgccttagtgggggggaaggttctagaaaagcggcggcagcggctctagcggcagtagcagcagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcagagttgtttctccagcagcggcagttctcactacagcgccaggacgagtccggttcgtgttcgtccgcggagatctctctcatctcgctcggctgcgggaaatcgggctgaagcgactgagtccgcgatggaggtaacgggtttgaaatcaatgagttattgaaaagggcatggcgaggccgttggcgcctcagtggaagtcggccagccgcctccgtgggagagaggcaggaaatcggaccaattcagtagcagtggggcttaaggtttatgaacggggtcttgagcggaggcctgagcgtacaaacagcttccccaccctcagcctcccggcgccatttcccttcactgggggtgggggatggggagctttcacatggcggacgctgccccgctggggtgaaagtggggcgcggaggcgggacttcttattccctttctaaagcacgctgcttcgggggccacggcgtctcctcggacggccgggcgcgcc

配列番号７ ＳＲＦ－ＵＣＯＥ
gcacacgaccacaattccactgaaagcattttaatacggaacttgtcactcccagggagcctccgctcagccggcagttggttcatttcaatccccacgacaacccttcaaagtgcagggcagacagcaggtggctctgcccaggcgcctggatcacagcccggcctgcagccctcacctgggcgcggggagaccctgaggacgctcctccaggcggcgctggccggggcctgcggacacggacgggcgggctgagctccgggacccctccccgcgccccgcaccccgcaccccgcaccccgcaccccgcacccggcgctcacccgtcccagccccgccgcccgcagccccagctgcaacgcagccaccgccgccatcgcacccggccccgcgggcgcttccgggacgcaggaggcatctgcatccggggcgccgctgagtcccgcccagagccccgcccccggctccaggttctgcgagcggcttccgccgggctgctccgcgggcgcgtcggccatgagcgagttgccgggcgacgtgcgggcgtttctgcgggagcacccgagcctgcggctccagacggacgcccgcaaggttcgcagcgcgggaggggaacggagtggcggagaagggcgcagttgggatgaggggctgaggggagggcagggga gaggagagggcaggggagaggggagaggggagagcaggagagaggggaaggcaggggagagggcgcggcgggatcaggggaggagagggaa

配列番号８ ｃＨＳ４インスレーター
ggggagctcacggggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgaccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatcccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctgggggatacggggaaaaggggagctcacggggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgaccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatcccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctgggggatacggggaaaa

配列番号９ ＭＡＲ－５
tatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatag

【0388】

配列番号１０ ヒトＣＳＰ－Ｂ ＭＡＲ (huMAR)
ggatcccattctccttgatgtactaatttttctttaaaagtgataataatagctcccatttagaatttttaaataacacaacaaatgtaaagtaactaatgtgtcctctggatcatggtaagtaatgaataaatttaactccctttaccttctccctttgctattttttccatgctaggatttatacatttttaaaaaactaaatctgctatcaaatgacagctttaaatttactttttaaaatttgttattgtatatatttatggggtataaagtgatgttatgatatatatatacacaatgtacactgattaaatcaagccaattaacattttatcatctcaaatacttaacattttttgtagtgagaacatttgaaatttacttttagcaatttcaaaacatacattattattattaactatagtcaccatgatgtaccatagatctttaaaaacttattcttcctgcctaactgaaactttgtactctttgactaacatcttttcattcccccacttcccagcctctggtaatcaccattacacactctgcttctatgagttcaattgctttagactccacgtaataaatgagatcatgcagcatttggctttctgtgcctggcttatccttgcttagcatggtgtcttacaggttcatccatgttgcaacaaataacagaatctcattctttgttaaggctgaatactattccattgggtatatataccacattttccttatccattaatccactgatggacccttaggttgttgattccatatattggctattgtaaatagtgcagcaatgaacatgagagtgcaactatctcttcaatgtactgatttcgaatccttcggatctatctcagaagtgagattgcaggatcatataattctacttttagtcttttgaggagctccatacagctttccatatggccatactaattacattctcatcaacagtgtacaatggtttccttttctccacatcctcaccaacatttataattttttgtctttttgataatagccatctgacaggtgtaaagtgatagctcattgcagttttaatttgcattttttgatgattagtaatgttgagaattttttcatatatctcttggccagttgcatgtcttctttggaaaaatgtctattcagttcctttgcccattttttaattgggatttttggtttcttgctattgagttgtttgaattc

配列番号１１ ＷＰＲＥ
Tcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg

配列番号１２ エンハンサー－１
gggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcac

配列番号１３ ２コピーのアフリカツメガエルベータグロブリンポリアデニル化シグナル (2xlBGpA)
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcac

配列番号１４ ２コピーのヒトベータグロブリンポリアデニル化シグナル (2huBGpA)
gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa

配列番号１５ ハイブリッドアフリカツメガエルおよびヒトベータグロブリンポリアデニル化シグナル (xlhuBGpA)
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa

配列番号１６ 2xlBGpA-A120
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

配列番号１７ 2huBGpA-A120
gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

配列番号１８ xlhuBGpA-A120
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

配列番号１９ pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*
ccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaag
ggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagcggccgcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaattggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgtggaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatggtactgtaactgagctaacataa

【0389】

配列番号２０ pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA
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【0390】

配列番号２１ pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
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配列番号２２ pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
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【0391】

配列番号２３ pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
aattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctattgggatcttcacacagcaggtaaggttgcgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatagccgcactgacccctggtgttgctttttttttttaggccgcaagctgaagcgtgtccgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaattggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacca

配列番号２４ SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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配列番号２５ SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt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【0392】

配列番号２６ SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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配列番号２７ SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgcacacgaccacaattccactgaaagcattttaatacggaacttgtcactcccagggagcctccgctcagccggcagttggttcatttcaatccccacgacaacccttcaaagtgcagggcagacagcaggtggctctgcccaggcgcctggatcacagcccggcctgcagccctcacctgggcgcggggagaccctgaggacgctcctccaggcggcgctggccggggcctgcggacacggacgggcgggctgagctccgggacccctccccgcgccccgcaccccgcaccccgcaccccgcaccccgcacccggcgctcacccgtcccagccccgccgcccgcagccccagctgcaacgcagccaccgccgccatcgcacccggccccgcgggcgcttccgggacgcaggaggcatctgcatccggggcgccgctgagtcccgcccagagccccgcccccggctccaggttctgcgagcggcttccgccgggctgctccgcgggcgcgtcggccatgagcgagttgccgggcgacgtgcgggcgtttctgcgggagcacccgagcctgcggctccagacggacgcccgcaaggttcgcagcgcgggaggggaacggagtggcggagaagggcgcagttgggatgaggggctgaggggagggcaggggagaggagagggcaggggagaggggagaggggagagcaggagagaggggaaggcaggggagagggcgcggcgggatcaggggaggagagggaagggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggccta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【0393】

配列番号２８ SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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配列番号２９ SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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【0394】

配列番号３０ SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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【0395】

配列番号３２ SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgcacacgaccacaattccactgaaagcattttaatacggaacttgtcactcccagggagcctccgctcagccggcagttggttcatttcaatccccacgacaacccttcaaagtgcagggcagacagcaggtggctctgcccaggcgcctggatcacagcccggcctgcagccctcacctgggcgcggggagaccctgaggacgctcctccaggcggcgctggccggggcctgcggacacggacgggcgggctgagctccgggacccctccccgcgccccgcaccccgcaccccgcaccccgcaccccgcacccggcgctcacccgtcccagccccgccgcccgcagccccagctgcaacgcagccaccgccgccatcgcacccggccccgcgggcgcttccgggacgcaggaggcatctgcatccggggcgccgctgagtcccgcccagagccccgcccccggctccaggttctgcgagcggcttccgccgggctgctccgcgggcgcgtcggccatgagcgagttgccgggcgacgtgcgggcgtttctgcgggagcacccgagcctgcggctccagacggacgcccgcaaggttcgcagcgcgggaggggaacggagtggcggagaagggcgcagttgggatgaggggctgaggggagggcaggggagaggagagggcaggggagaggggagaggggagagcaggagagaggggaaggcaggggagagggcgcggcgggatcaggggaggagagggaagggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaggatcccattctccttgatgtactaatttttctttaaaagtgataataatagctcccatttagaatttttaaataacacaacaaatgtaaagtaactaatgtgtcctctggatcatggtaagtaatgaataaatttaactccctttaccttctccctttgctattttttccatgctaggatttatacatttttaaaaaactaaatctgctatcaaatgacagctttaaatttactttttaaaatttgttattgtatatatttatggggtataaagtgatgttatgatatatatatacacaatgtacactgattaaatcaagccaattaacattttatcatctcaaatacttaacattttttgtagtgagaacatttgaaatttacttttagcaatttcaaaacatacattattattattaactatagtcaccatgatgtaccatagatctttaaaaacttattcttcctgcctaactgaaactttgtactctttgactaacatcttttcattcccccacttcccagcctctggtaatcaccattacacactctgcttctatgagttcaattgctttagactccacgtaataaatgagatcatgcagcatttggctttctgtgcctggcttatccttgcttagcatggtgtcttacaggttcatccatgttgcaacaaataacagaatctcattctttgttaaggctgaatactattccattgggtatatataccacattttccttatccattaatccactgatggacccttaggttgttgattccatatattggctattgtaaatagtgcagcaatgaacatgagagtgcaactatctcttcaatgtactgatttcgaatccttcggatctatctcagaagtgagattgcaggatcatataattctacttttagtcttttgaggagctccatacagctttccatatggccatactaattacattctcatcaacagtgtacaatggtttccttttctccacatcctcaccaacatttataattttttgtctttttgataatagccatctgacaggtgtaaagtgatagctcattgcagttttaatttgcattttttgatgattagtaatgttgagaattttttcatatatctcttggccagttgcatgtcttctttggaaaaatgtctattcagttcctttgcccattttttaattgggatttttggtttcttgctattgagttgtttgaattcaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcat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配列番号３３ (スーパー配列, SS*)
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配列番号３４ pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin ポリA
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagcctgggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagcggccgcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacattggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagta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【0396】

配列番号３５ CAG [E1X3+CBAプロモーター＋イントロン]
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配列番号３６ CAG [E2+CBAプロモーター＋イントロン]
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配列番号３７ CAG [E1X3+CBAプロモーター+UTR1]
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配列番号３８ CAG [E2 (U100)+CBAプロモーター+UTR1]
Tgggactttccactagacatgacacagcaatctgatatgcttgcgtgagaagaggattcatatcctgggactttccacagattttaccggaagttgttagatgcttgcgtgagaagatctaacatgacacagcaatccttagtgggactttccaagtatgtggggcggggagtatacatgacacagcaattgatcattaccggaagtttataggtgggactttccagacctatgcttgcgtgagaagaaaggtctgggactttccagtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtc

配列番号３９ ＣＭＶエンハンサー－ＥＦ１－ＵＴＲ１
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配列番号４０ 4-1 pGL2-SS*-CAG [ＣＭＶエンハンサー+CBAプロモーター+イントロン]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108～120ポリA)-SS*
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配列番号４１ 4-2 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBAプロモーター＋イントロン]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108～120ポリA)-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgc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【0397】

配列番号４２ 4-3 pGL2-SS*-CAG [E2(U100)+CBAプロモーター＋イントロン]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108～120ポリA)-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgactgggactttccactagacatgacacagcaatctgatatgcttgcgtgagaagaggattcatatcctgggactttccacagattttaccggaagttgttagatgcttgcgtgagaagatctaacatgacacagcaatccttagtgggactttccaagtatgtggggcggggagtatacatgacacagcaattgatcattaccggaagtttataggtgggactttccagacctatgcttgcgtgagaagaaaggtctgggactttccagtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctc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配列番号４３ 4-4 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBAプロモーター＋UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108～120ポリA)-SS*
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配列番号４４ 4-5-pGL2-SS*-CAG [E2 (U100)＋CBAプロモーター+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR (108～120ポリＡ)-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgactgggactttccactagacatgacacagcaatctgatatgcttgcgtgagaagaggattcatatcctgggactttccacagattttaccggaagttgttagatgcttgcgtgagaagatctaacatgacacagcaatccttagtgggactttccaagtatgtggggcggggagtatacatgacacagcaattgatcattaccggaagtttataggtgggactttccagacctatgcttgcgtgagaagaaaggtctgggactttccagtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagt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【0398】

配列番号４５ 4-6-pGL2-SS*-ＣＭＶエンハンサー-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108～120ポリＡ)-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatg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配列番号４６ ３コピーのエンハンサー－１
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配列番号４７ キメライントロン
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【0399】

本発明は、本明細書において説明される特定の局面によって範囲を限定されるものではない。実際、上記の説明および添付の図面から、本明細書に記載されたもの以外の本発明の様々な変更は、当業者に明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
他の局面は、以下の特許請求の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【配列表】

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【国際調査報告】