▶ キュー−ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】神経細胞を生産するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20240621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP
C12N 5/079 20100101ALI20240621BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240621BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240621BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
C12N5/10
C12N5/079
C12N15/12
C12N15/09 100
C12N15/31
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577652
(86)(22)【出願日】2022-06-16
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 US2022033830
(87)【国際公開番号】W WO2022266346
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/211,693
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516056971
【氏名又は名称】キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｑ－Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１７９ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ， ルイス
(72)【発明者】
【氏名】ジョシ， バイバブ
(72)【発明者】
【氏名】デンプシー， グラハム ティー．
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA46
(57)【要約】
本発明は、分化した神経細胞およびハイスループットアッセイに十分な工業的規模で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した神経細胞を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、数十億個のＰＳＣおよび／またはＰＳＣから分化した神経細胞を凍結保存し、複数の工程で拡大増殖させることを可能にする。したがって、ＰＳＣから神経細胞を生産するための既存の方法とは異なり、本発明は、アッセイにおいて使用するために新しい細胞株が必要とされるときには常に、新しい細胞株を作製するために最初からプロセスを開始する必要性をなくす。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経細胞を生産するための方法であって、多能性幹細胞を得る工程と；
前記細胞中に、神経細胞分化促進性転写因子をコードする誘導性遺伝要素を導入する工程と；
前記細胞中での前記遺伝要素の発現を誘導し、それにより、前記細胞の神経細胞への分化を引き起こす工程と；
前記神経細胞を凍結保存する工程と
を含む、方法。
【請求項2】
前記転写因子がニューロゲニン－２である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記凍結保存された細胞を解凍することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
生物学的アッセイにおいて前記細胞を使用することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
解凍後に、前記神経細胞をグリア細胞と共培養する、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記解凍された神経細胞を３０～６０日間培養して、成熟神経細胞を生産することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記解凍された神経細胞が、マルチウェルプレートのラミニン被覆されたウェルに播種および培養される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞が、ラミニンを補充された培地中で培養される、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記培養中に、前記培地が１または複数の回数交換され、交換培地は、前記交換培地が置き換える前記培地と比較して低下した濃度のラミニンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記解凍された神経細胞が、オルガノイド、３Ｄ細胞培養物、および成熟を誘導するために動物の脳内に前記神経細胞を注入することの１つまたは複数を使用して成熟される、請求項３に記載の方法。
【請求項11】
ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードするプラスミドで前記多能性幹細胞を形質移入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼが、少なくとも１つのノックインまたはノックアウト変異を引き起こすために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記変異が、前記分化した神経細胞に、神経障害に関連する表現型を呈示させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記変異がＫＣＮＱ２機能喪失変異である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記多能性幹細胞が、対象から得られた細胞に由来する人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記分化した神経細胞が細胞活動の１または複数の光学レポーターおよび／または細胞活動の光学アクチュエータを発現するように、前記分化した神経細胞中に１または複数の追加の遺伝的構築物を導入することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記導入する工程より前に、前記多能性幹細胞を拡大増殖させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記導入する工程より前に、前記得られた多能性幹細胞を凍結保存および解凍することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記誘導工程より前に、前記多能性幹細胞を拡大増殖させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記誘導工程より前に、前記得られた多能性幹細胞を凍結保存および解凍することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
ニューロンのパターン形成の収量を増加させるために発生経路の小分子モジュレータ（例えば、二重ＳＭＡＤ阻害剤）との組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、一般に、生物学的アッセイにおいて使用するための神経細胞を生産することに関する。
本発明は、一般に、生物学的アッセイにおいて使用するための神経細胞を生産することに関する。
【背景技術】
【0002】
背景
健康なニューロンおよび疾患型ニューロンを研究することができるように、多能性幹細胞（ＰＳＣ）のニューロンへの変換には、大きな科学的および医学的関心が存在する。いくつかのアプローチでは、統合失調症またはアルツハイマー病などのよく理解されていない疾患を有する患者由来の線維芽細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に変換し、次いでこれらの疾患の病因を研究するために人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をニューロンに分化させる。幹細胞および体細胞をニューロンに分化させるために利用可能な方法は満足のいくものではない。
健康なニューロンおよび疾患型ニューロンを研究することができるように、多能性幹細胞（ＰＳＣ）のニューロンへの変換には、大きな科学的および医学的関心が存在する。いくつかのアプローチでは、統合失調症またはアルツハイマー病などのよく理解されていない疾患を有する患者由来の線維芽細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に変換し、次いでこれらの疾患の病因を研究するために人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をニューロンに分化させる。幹細胞および体細胞をニューロンに分化させるために利用可能な方法は満足のいくものではない。
【0003】
多くの既存の技術は、低い収率を示し、シナプスを形成する能力が限られたニューロンを作り出し、インビトロアッセイにわたって使用された場合、一貫性のない結果をもたらした。
【0004】
ＰＳＣの分化によってニューロンを生成することには、数ヶ月を要し得る。さらに、ＰＳＣから神経細胞を作製するための多くの既存の技術は、ハイスループットアッセイに十分な工業的規模でＰＳＣまたは分化した神経細胞の培養を保存し、拡大させ、または延長する能力を含まない。したがって、神経細胞が必要とされるたびに、ＰＳＣを継続的に調製し、培養し、分化させなければならない。ＰＳＣから十分に成熟した神経細胞を調製するためのプロセス全体は数ヶ月を要し得るので、現在の技術は神経学的研究においてボトルネックを引き起こす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
本発明は、分化した神経細胞およびハイスループットアッセイに十分な工業的規模で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した神経細胞を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、数十億個のＰＳＣおよび／またはＰＳＣから分化した神経細胞を凍結保存し、複数の工程で拡大増殖させることを可能にする。したがって、ＰＳＣから神経細胞を生産するための既存の方法とは異なり、本発明は、アッセイにおいて使用するために新しい細胞株が必要とされるときには常に、新しい細胞株を作製するために最初からプロセスを開始する必要性をなくす。ＰＳＣを神経細胞に分化させるための既存の方法は、典型的には完了するのに３ヶ月以上かかるので、本発明は神経学的研究におけるこのボトルネックを劇的に緩和する。実際、本発明は、分化した神経細胞を生産するフルタイム当量（ＦＴＥ）コストを５０％またはそれを超えて低減させ、試薬コストを少なくとも４倍低減させ、スループットを工業的規模のレベルまで高め得る。
本発明は、分化した神経細胞およびハイスループットアッセイに十分な工業的規模で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した神経細胞を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、数十億個のＰＳＣおよび／またはＰＳＣから分化した神経細胞を凍結保存し、複数の工程で拡大増殖させることを可能にする。したがって、ＰＳＣから神経細胞を生産するための既存の方法とは異なり、本発明は、アッセイにおいて使用するために新しい細胞株が必要とされるときには常に、新しい細胞株を作製するために最初からプロセスを開始する必要性をなくす。ＰＳＣを神経細胞に分化させるための既存の方法は、典型的には完了するのに３ヶ月以上かかるので、本発明は神経学的研究におけるこのボトルネックを劇的に緩和する。実際、本発明は、分化した神経細胞を生産するフルタイム当量（ＦＴＥ）コストを５０％またはそれを超えて低減させ、試薬コストを少なくとも４倍低減させ、スループットを工業的規模のレベルまで高め得る。
【0006】
さらに、本発明の方法は、分化した神経細胞の培養を３０～６０日延長させる能力を提供する。これは、神経細胞の耐用寿命を延ばし、アッセイにおいて使用するための神経細胞の利用可能性を増大させる。さらに、培養を延長することは、十分な数の細胞が完全に成熟するための十分な時間を有することも保証する。例えば、内因性興奮性アッセイに使用される神経細胞は、成熟するのに約３０日を要し得、シナプスアッセイのための神経細胞は、４５日間以上を要し得る。
【0007】
さらに、本明細書でより詳細に説明されるように、本発明者らは、様々な神経状態を示すものを含む様々な神経細胞型を生産するために、本発明の方法が使用され得ることを発見した。これらの細胞は、アッセイにわたって一貫した反復可能な結果をもたらし、これらの細胞をモデルとして使用するのに特に適したものとする。さらに、凍結保存にもかかわらず、ＰＳＣ由来の神経細胞は堅牢であり、解凍された後に８０％を超える生存率で播種されることが示された。
【0008】
ある局面において、これらの分化した神経細胞は細胞性疾患モデルである。例えば、本発明は、ＰＳＣが、転写因子の強制的発現によって機能性ニューロンに分化され、その後、機能性ニューロンに神経活動の光遺伝学的レポーターまたはアクチュエータも発現させる方法を提供する。ある種の方法では、例えば遺伝子構築物を形質移入することによって、ニューロゲニン－２（Ｎｇｎ２）またはＮｅｕｒｏＤ１などの転写因子をコードする遺伝子をＰＳＣ中に導入する。転写因子の発現は、細胞をニューロンに分化させる。さらにまたは別個に、細胞活動の１または複数の光学レポーターおよび／または光学アクチュエータ－を含む光遺伝学的構築物が、分化したニューロン中に導入される。得られた光遺伝学的ニューロンは良好な収率で作製され、容易にシナプスを形成して、様々な状態について健康なおよび疾患型のニューロンを研究するためのモデル系を提供することができる。
【0009】
ある局面において、細胞は疾患関連遺伝子型を有し、細胞の機能および表現型は光遺伝学的技術を使用して研究され得る。分化したニューロンは、ニューロン疾患に罹患している患者からの体細胞に由来し得る。あるいは、疾患関連遺伝子型は、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用するゲノム編集を通じてニューロンに導入される。
【0010】
ある局面において、本発明は、ＰＳＣから神経細胞を生産するための方法を提供する。例示的な方法は、多能性幹細胞を得ること、および神経細胞分化促進性転写因子（pro-neuronal transcription factor）をコードする誘導可能な遺伝要素を細胞内に導入することを含む。次いで、遺伝要素が誘導され、ＰＳＣを神経細胞に分化させる転写因子の発現を引き起こす。次いで、分化した神経細胞は凍結保存される。
【0011】
好ましくは、転写因子はニューロゲニン－２（Ｎｇｎ２）である。
【0012】
本開示の方法では、凍結保存された神経細胞は解凍され、様々な神経アッセイにおいて使用され得る。例示的な方法では、解凍された神経細胞は培養される。解凍された細胞は、グリア細胞と共培養され得る。
【0013】
例示的な方法では、解凍された神経細胞は、成熟ニューロンを生産するために少なくとも３０～６０日間培養され、これはニューロンを生成するための既存の技術と比較して長期の培養に相当する。
【0014】
解凍された神経細胞は、マルチウェルプレートのラミニン被覆ウェルに播種され、培養され得る。ある局面において、細胞は、ラミニンが補充された培地中で培養される。この培地は、培養中に多数回交換され得、すべての交換は、低下したラミニン濃度を有する培地を使用する。本発明者らは、ラミニンを補充した培地で培養することが、プレートのウェルへの細胞の望まれない付着を低下させることを発見した。
【0015】
ある局面において、解凍された神経細胞は、オルガノイド、３Ｄ細胞培養物、および成熟を誘導するために動物の脳内に神経細胞を注入することの１つまたは複数を使用して成熟される。
【0016】
本発明の例示的な方法は、ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードするプラスミドで多能性幹細胞を形質移入することを含む。ガイドＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼは、例えば、得られた神経細胞に少なくとも１つのノックインまたはノックアウト変異を引き起こすために使用される。ある局面において、変異は、分化した神経細胞に、神経障害に関連する表現型を呈示させる。ある局面において、変異は、ＫＣＮＱ２機能喪失変異である。
【0017】
ある方法において、多能性幹細胞は、対象から得られた細胞に由来する人工多能性幹細胞である。
【0018】
本発明は、分化した神経細胞が細胞活動の１または複数の光学レポーターおよび／または細胞活動の光学アクチュエータを発現するように、分化した神経細胞中に１または複数の追加の遺伝的構築物を導入することを含む方法も提供する。
【0019】
ある局面において、本発明の例示的な方法は、導入する工程および／または誘導する工程より前に多能性幹細胞を拡大増殖させることをさらに含む。ニューロン生成誘導性構築物で遺伝的に改変されたＰＳＣを拡大増殖させるこの中間工程は、遺伝的発現構築物を既に含有するが未だ誘導されていない数百万個のＰＳＣの生産を可能にし、それによってニューロンの誘導のための出発材料を数千倍増加させ、ニューロン生産の収量を数十億個のニューロンに到達させる。
【0020】
ある特定の方法において、ニューロン生成誘導性構築物による多能性幹細胞の変換効率は、神経細胞分化促進性転写因子（例えば、ＮＧＮ２）の誘導を、ＴＧＦ－βおよびＢＭＰ４シグナル伝達経路などの重要な発達経路の小分子阻害剤媒介性調節（二重ＳＭＡＤ阻害）と組み合わせることによって増強される。
【0021】
例示的な方法は、さらにまたは別個に、導入する工程および／または誘導する工程より前に多能性幹細胞を凍結保存および解凍することを含み得る。
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
詳細な説明
本発明は、分化した神経細胞およびハイスループットアッセイに十分な工業的規模で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した神経細胞を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、数十億個のＰＳＣおよび／またはＰＳＣから分化した神経細胞を凍結保存し、複数の工程で拡大増殖させることを可能にする。
本発明は、分化した神経細胞およびハイスループットアッセイに十分な工業的規模で多能性幹細胞（ＰＳＣ）から分化した神経細胞を作製するための方法を提供する。本発明の方法は、数十億個のＰＳＣおよび／またはＰＳＣから分化した神経細胞を凍結保存し、複数の工程で拡大増殖させることを可能にする。
【0028】
ある局面において、分化した神経細胞は細胞性疾患モデルとして使用される。疾患モデルを作製するための本発明の例示的な方法は、単一の転写因子の強制的発現によってＰＳＣを機能性ニューロンに変換すること、ならびにニューロンに神経活動の光遺伝学的レポーターおよび／またはアクチュエータを発現させることを含む。形質移入により多能性幹細胞中に導入されたニューロゲニン－２（Ｎｇｎ２）などの転写因子が発現され、細胞をニューロンに分化させる。
【0029】
図１は、本発明のいくつかの局面を示す、ＰＳＣから神経細胞を生成するための例示的なワークフローを提供する。示されているように、ＰＳＣ、この事例では、人工ＰＳＣに、誘導性遺伝的構築物が導入されている。示されているように、誘導性構築物は、Ｎｇｎ２などの転写因子を含み得る。構築物の誘導は、ＰＳＣに転写因子を発現させ、これによりＰＳＣを神経細胞に分化させる。図１では、神経細胞はＮｇｎ２ニューロンと表記されている。
【0030】
同じく図１に示されるように、本発明は、分化した神経細胞を凍結保存し、その後解凍する方法を初めて提供する。したがって、分化したニューロンは、工業的な量で保存され、解凍され、および特定のアッセイの要求に従って（例えば、光遺伝学的構築物を導入することによって）改変され得る。したがって、このように細胞を保存することにより、ＰＳＣを調製し、拡大増殖させ、誘導性構築物を導入および誘導し、ＰＳＣをニューロンに分化させる必要がなくなる。むしろ、本発明の神経細胞は、解凍され、操作され、オンデマンドで使用されることが可能である。
【0031】
解凍された後、神経細胞は、例えば、培養され、光学レポーターおよびアクチュエータで形質導入され、疾患モデルとしてバイオアッセイにおいて使用される。
【0032】
図１は、ＰＳＣが、誘導性構築物の導入前および／または導入後に拡大増殖および凍結保存され得ることも明らかにする。その結果、工業的な量の分化した神経細胞を迅速に分化させるために、分化の準備が整ったＰＳＣが大量に調製および保存され得る。図１に示されるものなどのある局面においては、これにより、試料から人工ＰＳＣを調製し、拡大増殖させる必要がなくなる。
【0033】
さらに、ＰＳＣおよび／または分化した神経細胞を保存することによって、本発明は、複数のアッセイおよび回数にわたって同じ細胞株の使用を可能にする。これは、神経細胞をバイオアッセイで使用する場合に一貫性および再現性を確保するのに役立つ。
【0034】
ある局面において、ＰＳＣ由来の神経細胞を作製するための方法は、例えばロボットプラットフォームを使用して１または複数の工程を実施するための生産自動化を組み入れる。
【0035】
図２は、ＰＳＣ由来の神経細胞を凍結保存するための方法の概要を提供する。例示的な方法では、複数のピペットチャネルを有するニューロン生産（解離）モジュールを含むロボットプラットフォームを使用して、未成熟なＰＳＣ由来神経細胞の単一細胞懸濁液を作製する。示されるように、これらの神経細胞は予め凍結保存されていてもよい。モジュールは、細胞を解離させて懸濁液を作製する。遠心分離後、ロボットプラットフォームは第２の細胞懸濁液を調製する。次いで、プラットフォームは、懸濁液を、例えば、マルチウェルプレートにおける凍結保存および／または播種に適した所望の密度に希釈する。
【0036】
同じく図２に示されるように、神経播種および維持モジュールは、ニューロン付着のためのマルチウェルプレートを調製する。これは、例えば、ラミニン被覆を提供することを含み得る。次いで、モジュールは、プレートのウェルに細胞懸濁液を配置する。その後、モジュールは、１または複数の細胞培地交換を行う。培地にはラミニンを補充してもよく、ラミニンの濃度は各培地交換中に低下する。
【0037】
本開示の方法は、ＰＳＣを、例えば、運動ニューロン、阻害性ニューロン、感覚ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、ニューロンと共培養されたヒトグリア、ミクログリア細胞および心筋細胞を含む多数の異なる神経細胞型に分化させるために使用され得る。
【0038】
ある局面において、細胞は、多能性幹細胞として、または対象からの体細胞（例えば、線維芽細胞または血液）として取得され得、体細胞は、その後、神経細胞への分化のために人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に変換することができる。
【0039】
例えば、本発明のある方法は、症状を有すると疑われる人から細胞を取得することを含む。遺伝性障害、精神的もしくは精神医学的症状、神経変性疾患または神経発達障害などの任意の適切な症状が評価され得る。さらに、本発明の方法および本明細書に記載されている分析パイプラインは、電気生理学的表現型が開発されている任意の症状に適用され得る。
【0040】
例示的な神経変性疾患には、アルツハイマー病の他、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、多発性硬化症、球脊髄性筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症が含まれる。例示的な精神および精神医学的症状には、統合失調症が含まれる。本発明の方法によって定義されるパイプラインによる分析に適した、神経発達障害を含む例示的な遺伝性障害には、コケイン症候群、ダウン症候群、ドラベ症候群、家族性自律神経失調症、脆弱Ｘ症候群、レット症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、遺伝性痙性対麻痺、マシャド・ジョゼフ病（脊髄小脳失調症３型とも呼ばれる）、フェラン・マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）、ポリグルタミン（ポリＱ）コードＣＡＧリピート、巨大軸索ニューロパチー、シャルコー・マリー・トゥース病、脊髄小脳失調症を含む様々な失調症、脊髄性筋萎縮症、チモシー症候群、ならびにＳＴＸＢＰ１、ＳＣＮ８ＡおよびＫＣＮＱ２を含む異なる遺伝子中の変異によって引き起こされる発達性およびてんかん性脳症の様々な遺伝型が含まれる。様々な症状についての電気生理学的表現型が開発され、文献に報告されている。
【0041】
１つの例示的な例において、線維芽細胞は、疾患を有することが知られているか、または疾患を有することが疑われる患者から採取され得る。任意の適切な細胞が取得され得、試料を取得する任意の適切な方法が使用され得る。ある局面において、皮膚線維芽細胞を得るために皮膚生検が行われる。患者の皮膚は洗浄され、局所麻酔薬の注射を与えられ得る。皮膚が完全に麻酔されたら、無菌３ｍｍパンチを使用する。臨床医は、パンチが表皮を貫通するまで圧力を加え、「穿孔」動作を使用し得る。パンチは、３ｍｍの円筒形の皮膚を抜き取る。臨床医は、鉗子を使用して、抜き取られた皮膚の真皮を持ち上げ、メスを使用してコアを切り取り得る。生検試料は、必要に応じたＰＢＳによる洗浄およびＰＢＳの蒸発の後、無菌ＢＭＥ線維芽細胞培地に移され得る。患者の生検部位は、（例えば、粘着性の包帯を用いて）手当てされる。細胞を取得するための適切な方法および装置は、米国特許第８，６０３，８０９号；米国特許第８，４０３，１６０号；米国特許第５，５９１，４４４号；米国特許出願公開第２０１２／０２６４６２３号；および米国特許出願公開第２０１２／０２１４２３６号に論述されており、これらの各々の内容は参照により組み入れられる。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ；およびＦｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８７，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで論述されているものなどの、生検標本を取得および増殖するのに適した任意の組織培養技術が使用され得、いずれも参照により組み入れられる。
【0042】
コケイン症候群は、ＥＲＣＣ６およびＥＲＣＣ８遺伝子中の変異によって引き起こされ、成長障害、神経系の発達障害、光感受性および早期老化によって特徴付けられる遺伝性障害である。コケイン症候群は、Ａｎｄｒａｄｅら、２０１２，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ａｇｉｎｇ ｄｕｅ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｉＰＳＣｓ ｆｒｏｍ Ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２１：３８２５－３８３４で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0043】
ダウン症候群は、２１番染色体の第３のコピーの全部または一部の存在によって引き起こされ、成長遅滞、特徴的な顔貌および知的障害を伴う遺伝性障害である。ダウン症候群は、Ｓｈｉら、２０１２ Ａ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（１２４）：１２４ｒａ１２９で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0044】
乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）としても知られているドラベ症候群は、乳児期に始まり、ＳＣＮ１Ａ遺伝子またはＳＣＮ９Ａ、ＳＣＮ２Ｂ、ＰＣＤＨ１９もしくはＧＡＢＲＧ２などのある種の他の遺伝子中の変異をしばしば伴う難治性てんかんの一形態である。ドラベ症候群は、Ｈｉｇｕｒａｓｈｉら、２０１３，Ａ ｈｕｍａｎ Ｄｒａｖｅｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ ６：１９で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0045】
家族性自律神経失調症は、ＩＫＢＫＡＰ遺伝子中の変異によって引き起こされる自律神経系の遺伝性障害であり、自律神経系および感覚神経系の感覚ニューロン、交感神経ニューロンおよびいくつかの副交感神経ニューロンの発達および生存に影響を及ぼし、疼痛に対する無感覚、涙液の産生不能、成長不良および不安定血圧を含む様々な症候をもたらす。家族性自律神経失調症は、Ｌｅｅら、２００９，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｍｉｌｉａｌ ｄｙｓａｕｔｏｎｏｍｉａ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉＰＳＣ，Ｎａｔｕｒｅ ４６１：４０２－４０６で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0046】
脆弱Ｘ症候群は、ＦＭＲ１遺伝子中の変異によって引き起こされ、学習障害および認知障害を含む様々な発育上の問題を引き起こす遺伝性症状である。脆弱Ｘ症候群は、Ｌｉｕら、２０１２，Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｐｒｅｍｕｔａｔｉｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２１：３７９５－３８０５で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0047】
フリードライヒ運動失調症は、９番染色体上の遺伝子座の変異に起因する常染色体潜性運動失調症である。フリードライヒ運動失調症の運動失調症は、脊髄内の神経組織、特に（小脳との接続を介して）腕および脚の筋肉運動を指示するために不可欠な感覚ニューロンの変性から生じる。脊髄はより細くなり、神経細胞はそれらのミエリン鞘の一部を失う。フリードライヒ運動失調症は、Ｋｕら、２０１０，Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｍｏｄｅｌ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ ＧＡＡ．ＴＴＣ ｔｒｉｐｌｅｔ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７（５）：６３１－７；Ｄｕら、２０１２，Ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ＧＡＡ．ＴＴＣ ｔｒｉｐｌｅｔ－ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ ａｔａｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７（３５）：２９８６１－２９８７２；およびＨｉｃｋら、２０１３，Ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ，Ｄｉｓ Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ ６（３）：６０８－２１で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0048】
ゴーシェ病は、１番染色体上に位置する遺伝子中の潜性変異によって引き起こされる遺伝性疾患であり、体内に脂質が蓄積する。ゴーシェ病は、Ｍａｚｚｕｌｌｉら、２０１１，Ｇａｕｃｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ ａｎｄ α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｆｏｒｍ ａ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｌｏｏｐ ｉｎ ｓｙｎｕｃｌｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ，Ｃｅｌｌ １４６（１）：３７－５２で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0049】
遺伝性痙性対麻痺（ＨＳＰ）は、家族性痙性対麻痺、フランス植民地病またはシュトリュンペル・ロレイン病とも呼ばれ、下肢の硬直および収縮（痙縮）をもたらす軸索の変性および機能障害によって特徴付けられる一群の遺伝性疾患を指す。遺伝性痙性対麻痺は、Ｄｅｎｔｏｎら、２０１４，Ｌｏｓｓ ｏｆ ｓｐａｓｔｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｘｏｎａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｓｐａｓｔｉｃ ｐａｒａｐｌｅｇｉａ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２（２）：４１４－２３で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0050】
脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）は、マシャド・ジョゼフ病としても知られており、後脳の緩やかな変性を特徴とする常染色体顕性遺伝性運動失調症である神経変性疾患である。マシャド・ジョゼフ病（脊髄小脳失調症３型とも呼ばれる）は、Ｋｏｃｈら、２０１１，Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｔａｘｉｎ－３ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ ４８０（７３７８）：５４３－５４６で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0051】
フェラン・マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）は、神経タンパク質であるＳｈａｎｋ３中の変異またはＳｈａｎｋ３の欠失に起因する進行性の神経発達障害であり、発育遅延、発話障害および自閉症によって特徴付けられる。フェラン・マクダーミド症候群（ＰＭＤＳ）は、Ｓｈｃｈｅｇｌｏｖｉｔｏｖら、２０１３，ＳＨＡＮＫ３ ａｎｄ ＩＧＦ１ ｒｅｓｔｏｒｅ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ２２ｑ１３ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ ５０３（７４７５）：２６７－７１で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0052】
トリプレットリピート病は、ポリグルタミン（ポリＱ）をコードするＣＡＧリピートを特徴とする。トリプレットリピート病は、トリプレットリピート伸長によって引き起こされる一連の遺伝性障害を指し、この障害には、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョゼフ病、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型および脊髄小脳失調症１７型、ならびに様々な他の運動失調症が含まれる。トリプレットリピート病は、ＨＤ ｉＰＳＣ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｈｏｗ ＣＡＧ－ｒｅｐｅａｔ－ｅｘｐａｎｓｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １１（２）：２６４－２７８で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0053】
巨大軸索ニューロパチーは、ニューロンの形状およびサイズを規定する構造的フレームワークを形成する神経線維の組織崩壊を引き起こす神経学的障害である。巨大軸索ニューロパチーは、タンパク質ギガキソニンをコードするＧＡＮ遺伝子中の変異に起因する。Ｍａｈａｍｍａｄら、２０１３，Ｇｉａｎｔ ａｘｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｉｇａｘｏｎｉｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｍｐａｉｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３（５）：１９６４－７５を参照されたい。
【0054】
遺伝性運動感覚性ニューロパチー（ＨＭＳＮ）および腓骨筋萎縮症（ＰＭＡ）としても知られるシャルコー・マリー・トゥース病は、筋肉および感覚の進行性喪失を特徴とする末梢神経系のいくつかの遺伝性障害を指す。例えば、Ｈａｒｅｌ ａｎｄ Ｌｕｐｓｋｉ，２０１４，Ｃｈａｒｃｏｔ Ｍａｒｉｅ Ｔｏｏｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ＤＯＩ：１０．１１１１／ｃｇｅ．１２３９３を参照されたい。
【0055】
脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）は、運動ニューロンタンパク質の生存（ＳＭＮ）をコードするＳＭＮ１遺伝子中の変異によって引き起こされる遺伝性疾患であり、そのニューロンの存在量の減少は、脊髄における神経細胞の死および系全体の萎縮をもたらす。脊髄性筋萎縮症は、Ｅｂｅｒｔら、２００９，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ ｐａｔｉｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ ４５７（７２２７）：２７７－８０；Ｓａｒｅｅｎら、２０１２，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｓ ｈｕｍａｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７（６）：ｅ３９１１３；およびＣｏｒｔｉら、２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｉｎａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（１６５）：１６５ｒａ１６２で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0056】
チモシー症候群は、ＣＡＣＮＡ１Ｃと呼ばれるＣａ（ｖ）１．２カルシウムチャネル遺伝子中の変異から生じる遺伝性障害であり、異常に延長した心臓の「再分極」時間（ＱＴ間隔の延長）ならびに心臓のＱＴ延長、心不整脈、構造的心臓欠陥、合指症および自閉症スペクトラム障害を含む他の神経学的および発育上の欠陥を含む一連の問題を特徴とする。チモシー症候群は、Ｋｒｅｙら、２０１３，Ｔｉｍｏｔｈｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒｏｄｅｎｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６（２）：２０１－９で論述されており、その内容は参照により組み入れられる。
【0057】
統合失調症および自閉症などの精神および精神医学的障害は、幹細胞モデルを介して研究するのに適した細胞および分子の欠陥を含み得、本明細書の方法を使用して単離することができるある種の遺伝的構成要素によって引き起こされ得るか、またはこれに関連し得る。統合失調症は、Ｂｒｅｎｎａｎｄら、２０１１，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４７３（７３４６）：２２１－２２５；およびＣｈｉａｎｇら、２０１１，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＤＩＳＣ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈ １６：３５８－３６０で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0058】
アルツハイマー病は、（ある種の遺伝子中の変異がこの障害に関連付けられているが）原因が不確定な神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な形態の１つである。アルツハイマー病は、Ｉｓｒａｅｌら、２０１２，Ｐｒｏｂｉｎｇ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｎｄ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４８２（７３８４）：２１６－２０；Ｍｕｒａｔｏｒｅら、２０１４，Ｔｈｅ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ＡＰＰＶ７１７Ｉ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ＡＰＰ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｔａｕ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｋｏｎｄｏら、２０１３，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｉＰＳＣ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔｒｅｓｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｂｅｔａ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２（４）：４８７－４９６；およびＳｈｉら、２０１２，Ａ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅａｒｌｙ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｏｗｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（１２４）：１２４ｒａ１２９で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0059】
前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）は、脳の前頭葉および側頭葉における萎縮を伴う前頭側頭型認知症（これは、行動障害型前頭側頭型認知症（ｂｖＦＴＬＤ）；意味性認知症（ＳＤ）；および進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）を含むように細分化される）を含む、臨床的、病理学的および遺伝学的に不均一な一群の障害の名称である。前頭側頭葉変性症は、Ａｌｍｅｉｄａら、２０１３，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｋｅｙ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｗｉｔｈ Ｃ９ＯＲＦ７２ ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｎ ｉＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ １２６（３）：３８５－３９９；Ａｌｍｅｉｄａら、２０１２，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａ ｕｎｃｏｖｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２（４）：７８９－７９８；およびＦｏｎｇら、２０１３，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕｏｐａｔｈｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １（３）：１－９で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0060】
ハンチントン病は、脳内の神経細胞の進行性変性を引き起こす遺伝性疾患であり、第４染色体の短腕上に位置するハンチンチン（ＨＴＴ）と呼ばれる遺伝子の個々の２つのコピーのうちのいずれかにおける常染色体顕性変異によって引き起こされる。ハンチントン病は、ＨＤ ｉＰＳＣ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，２０１２，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｈｏｗ ＣＡＧ－ｒｅｐｅａｔ－ｅｘｐａｎｓｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １１（２）：２６４－２７８；Ａｎら、２０１２，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １１（２）：２５３－２６３；およびＣａｍｎａｓｉｏら、２０１２，Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ４６（１）：４１－５１で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0061】
多発性硬化症は、脳および脊髄の神経細胞の絶縁被覆が損傷を受ける神経変性疾患である。多発性硬化症は、Ｓｏｎｇら、２０１２，Ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ８（２）：２５９－７３で論じられており、その内容は参照により組み入れられる。
【0062】
球脊髄性（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂａｒ）筋萎縮症、球脊髄性（ｂｕｌｂｏ－ｓｐｉｎａｌ）萎縮症、Ｘ連鎖球脊髄性ニューロパチー（ＸＢＳＮ）、Ｘ連鎖脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡＸ１）およびケネディ病（ＫＤ）としても知られる球脊髄性（ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｂａｒ）筋萎縮症（ＳＢＭＡ）は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）遺伝子の変異を伴い、脳幹および脊髄中の運動ニューロンの変性による筋痙攣および進行性脱力をもたらす神経変性疾患である。球脊髄性筋萎縮症は、Ｎｉｈｅｉら、２０１３，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｂｕｌｂａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８（１２）：８０４３－５２で論じられており、その内容は参照により組み入れられる。
【0063】
レット症候群は、一般的にメチルＣｐＧ結合タンパク質２またはＭＥＣＰ２遺伝子中の変異によって引き起こされる神経発達障害であり、正常な初期の成長および発育後の発育の遅延、手の意図的な使用の喪失、特徴的な手の動き、脳および頭部の成長の遅延、歩行に伴う問題、発作ならびに知的障害を特徴とする。レット症候群は、Ｍａｒｃｈｅｔｔｏら、２０１０，Ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ，１４３（４）：５２７－３９およびＡｎａｎｉｅｖら、２０１１，Ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ｉＰＳＣ）ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｔｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（９）：ｅ２５２５５で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0064】
しばしば「ルー・ゲーリック病」と呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動ニューロンの進行性変性および死、ならびにその結果生じる筋制御の喪失または麻痺を伴う神経変性疾患である。筋萎縮性側索硬化症は、Ｋｉｓｋｉｎｉｓら、２０１４，Ｐａｔｈｗａｙｓ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＡＬＳ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＳＯＤ１，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（ｅｐｕｂ）；Ｗａｉｎｇｅｒら、２０１４，Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｙｐｅｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（１）：１－１１；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２０１３，ＲＮＡ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＡＬＳ／ＦＴＤ Ｃ９ｏｒｆ７２ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｓ ｍｉｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ ８０（２）：４１５－２８；Ａｌａｍｉ，２０１４，Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＴＤＰ－４３ ｍＲＮＡ ｇｒａｎｕｌｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｂｙ ＡＬＳ－ｃａｕｓｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｕｒｏｎ ８１（３）：５３６－５４３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２０１３，ＲＮＡ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＡＬＳ／ＦＴＤ Ｃ９ＯＲＦ７２ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｉｓ ｍｉｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎｅｕｒｏｎ ８０（２）：４１５－４２８；Ｂｉｌｉｃａｎ ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｍｕｔａｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ＴＤＰ－４３ ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｖｅａｌ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ＰＮＡＳ １０９（１５）：５８０３－５８０８；Ｅｇａｗａら、２０１２，Ｄｒｕｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ＡＬＳ ｕｓｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４（１４５）：１４５ｒａ１０４；およびＹａｎｇら、２０１３，Ａ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ＡＬＳ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １２（６）：７１３－７２６で論述されており、これらのそれぞれの内容は参照により組み入れられる。
【0065】
本発明の例示的な方法において、細胞は患者から得られ、ＰＳＣに変換され、ＰＳＣは特定の神経サブタイプに分化する。例示的な方法は、体細胞を得ること、および規定の転写因子の使用などの公知の方法を使用して細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラミングすることを含む。ｉＰＳＣは、３つの胚性胚葉のすべての派生体に分化する発生能を維持しながら、培養で無限に増殖する能力を特徴とする。ある局面において、線維芽細胞は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，２００６，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６およびＴａｋａｈａｓｈｉら、２００７，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ，Ｃｅｌｌ １３１：８６１－８７２で論じられている方法などの方法によってｉＰＳＣに変換される。
【0066】
成体線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導は、胚性幹（ＥＳ）細胞培養条件下で４つの因子、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－ＭｙｃおよびＫｌｆ４を導入することを含む方法によって行うことができる。ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を得る。ヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃを含有するレトロウイルスをＨＤＦに導入する。形質導入の６日後、トリプシン処理によって細胞を採取し、マイトマイシンＣで処理されたＳＮＬフィーダー細胞上に播種する。例えば、ＭｃＭａｈｏｎ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，１９９０，Ｃｅｌｌ ６２：１０７３－１０８５を参照されたい。約１日後、培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）を、４ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された霊長類ＥＳ細胞培養培地と交換する。Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｅｌｌ １３１：８６１を参照されたい。その後、ｈＥＳ細胞様コロニーを採取し、酵素消化なしで機械的に分解して小さな塊にする。各細胞は、大きな核および少ない細胞質を特徴とするヒトＥＳ細胞の形態と同様の形態を示すはずである。ＨＤＦの形質導入後の細胞はヒトｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞株がドナーと遺伝的に一致することを確認するために、ＤＮＡフィンガープリンティング、配列決定または他のこのようなアッセイが行われ得る。
【0067】
次いで、これらのｉＰＳ細胞を特定のニューロンサブタイプに分化させることができる。ｉＰＳ細胞などの多能性細胞は、定義により、異なる胚性胚葉に特徴的な細胞型に分化することができる。両方の胚性幹細胞ヒトｉＰＳ細胞の特性は、懸濁培養で播種された場合に、胚様体（ＥＢ）を形成する能力である。ｉＰＳ細胞から形成されたＥＢは、２つの小分子：ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路のアゴニストおよびレチノイン酸（ＲＡ）で処理される。より詳細には、Ｄｉｍｏｓら、２００８，Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＡＬＳ ｃａｎ ｂｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９３）：１２１８－２１；Ａｍｏｒｏｓｏら、２０１３，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｍｂ－ｉｎｎｅｒｖａｔｉｎｇ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（２）：５７４－８６；およびＢｏｕｌｔｉｎｇら、２０１１，Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｔｅｓｔ ｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２９（３）：２７９－２８６に記載されている方法を参照されたい。
【0068】
分化したＥＢをラミニン被覆表面に接着させると、ニューロン様突起成長が観察され、これは特定のニューロンサブタイプへの分化をもたらす。さらなる関連する考察は、Ｄａｖｉｓ－Ｄｕｓｅｎｂｅｒｙら、２０１４，Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｓｐｉｎａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１（３）：４９１－５０１；Ｓａｎｄｏｅ ａｎｄ Ｅｇｇａｎ，２０１３，Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｓ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １６（７）：７８０－９；およびＨａｎら、２０１１，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｎｅｕｒｏｎ ７０（４）：６２６－４４に見出され得る。
【0069】
本発明の方法では、ｉＰＳＣはニューロンに変換される。変換には、幹細胞に単一の転写因子を発現させることが含まれる。ニューロゲニン－２（Ｎｇｎ２）などの単一の転写因子を過剰発現させることによって、ＥＳおよびｉＰＳ細胞が神経細胞に迅速に変換される。Ｚｈａｎｇら、２０１３，Ｒａｐｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，Ｎｅｕｒｏｎ ７８（５）：７８５－７９８を参照されたい。転写因子は、レンチウイルス感染によって導入され得る（以下でより詳細に論じられる）。Ｚｈａｎｇ２０１３に報告されているように、ピューロマイシン耐性遺伝子は、選択のためにＮｇｎ２と共発現され得る。ＥＳまたはｉＰＳ細胞を－２日目に播種し、－１日目にレンチウイルスに感染させ、０日目にＮｇｎ２発現を誘導する。１日目に２４時間のピューロマイシン選択期間を開始し、２日目にマウスグリア（主にアストロサイト）を添加してシナプス形成を増強する。強制的なＮｇｎ２発現は、Ｚｈａｎｇ２０１３に報告されているように、ＥＳおよびｉＰＳ細胞を１週間未満でニューロン様細胞に変換し、２週間未満で明らかに成熟したニューロン形態を生成する。
【0070】
凍結保存の前または後に、運動ニューロンなどの分化細胞を解離させ、ポリ－ｄ－リジンおよびラミニンで被覆されたガラスのカバーガラス上に播種し得る。運動ニューロンには、Ｎ２、Ｂ２７、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＣＴＮＦが補充された神経基礎培地などの適切な培地が供給され得る。細胞は、すべて１０ｎｇ／ｍｌのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦがさらに補充されたＮ２培地（ラミニン［１μｇ／ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］、ＦＧＦ－２［１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ］およびＮ２サプリメント［１％；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２［１：１］）などの適切な培地中で維持され得る。適切な培地は、Ｓｏｎら、２０１１，Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｉｎｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｐｉｎａｌ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ９：２０５－２１８；Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎら、２０１０，Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ ４ ６３：１０３５－１０４１；Ｋｕｏら、２００３，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｋｅｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｎｅｕｒａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ６８：１７２７－１７３５；およびＷｅｒｎｉｇら、２００２，Ｔａｕ ＥＧＦＰ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓ ６９：９１８－２４に記載されており、それぞれは参照により組み入れられる。
【0071】
本発明の方法は、細胞に光学レポーターを発現させること、光学レポーターによって生成されたシグネチャを観察すること、および観察されたシグネチャを対照シグネチャと比較することを含み得る。対照シグネチャは、無疾患細胞であり得、同じく特定の神経サブタイプのものであり、試験細胞と遺伝的および表現型的に類似している対照細胞を得ることによって得ることができる。ある態様において、例えば、患者がある遺伝子座に既知の変異または対立遺伝子を有する場合、遺伝子編集を行って、既知の変異を除けば試験細胞株と同質遺伝子的である対照細胞株を生成する。例えば、患者がＳＮＣＡ遺伝子の重複を有することが知られている場合、遺伝子編集技術は、野生型ＳＮＣＡ遺伝子を細胞株に導入して、野生型遺伝子型および表現型を有する対照細胞株を作製することができる。さらに、ゲノム編集は、関心対象の変異をニューロンに導入して変異の表現型効果を評価するためにおよび疾患への潜在的な関連を調査するために使用され得る。遺伝子またはゲノム編集技術は、ジンクフィンガードメイン法、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを介して進行し得る。
【0072】
ゲノム編集技術（例えば、ジンクフィンガードメインの使用）は、関心対象の変異型を除けば同質遺伝子的である試験細胞および対照細胞を作製するために使用され得る。ある局面において、ゲノム編集技術がｉＰＳ細胞に適用される。例えば、ジンクフィンガードメインを使用して第２の矯正された系統が生成され得、２つのその他は同質遺伝子的な系統をもたらす。その後、上記の方法に従って胚様体を使用して、病的ｉＰＳ細胞および矯正されたｉＰＳ細胞を運動ニューロンに分化させ得る。
【0073】
ゲノム編集は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって実施され得る。例えば、ＴＡＬＥＮ技術を使用して、関心対象の標的遺伝子をコードする染色体配列が編集され得る。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工の制限酵素である。ある局面において、ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用して行われる。ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ法は、標的部位に１対１の関係を提供する、すなわち、ＴＡＬＥドメイン中のタンデムリピートの１つの単位は、標的部位中の１つのヌクレオチドを認識し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ＤＮＡ標的中の相補的配列にハイブリダイズする。方法は、１つのｇＲＮＡとともにＴＡＬＥＮの対またはＣａｓ９タンパク質を使用して標的中に二本鎖切断を生成することを含むことができる。次いで、切断は、非相同末端結合または相同組換え（ＨＲ）によって修復される。
【0074】
ＴＡＬＥＮは、本質的に任意の配列を標的とすることができるＤＮＡ結合ドメインに融合された非特異的ＤＮＡ切断ヌクレアーゼを使用する。ＴＡＬＥＮ技術では、標的部位が同定され、発現ベクターが作製される。Ｌｉｕら、２０１２，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｅｎｏｍｅ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ａｎ ｅａｓｙ ＴＡＬＥＮ ｓｔｒａｔｅｇｙ，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３９：２０９－２１５を参照されたい。（例えば、Ｎｏｔｌによって）直鎖化された発現ベクターおよびｍＲＮＡ合成のための鋳型として使用された。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ＳＰ６転写キットなどの市販のキットを使用してもよい。Ｊｏｕｎｇ＆Ｓａｎｄｅｒ，２０１３，ＴＡＬＥＮｓ：ａ ｗｉｄｅｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １４：４９－５５を参照されたい。
【0075】
ＣＲＩＳＰＲ方法は、ガイド（ｇＲＮＡ）としての低分子ＲＮＡと複合体を形成して、任意のゲノム位置においてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で配列特異的にＤＮＡを切断するヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）を用いる。ＣＲＩＳＰＲは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとして知られる別個のガイドＲＮＡを使用し得る。これらの２つの別個のＲＮＡは、単一のＲＮＡに組み合わされて、短いガイドＲＮＡの設計を介した部位特異的哺乳動物ゲノム切断を可能にしている。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、公知の方法により合成され得る。Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、非特異的ＤＮＡ切断タンパク質Ｃａｓ９およびＲＮＡオリゴを使用して、標的にハイブリダイズし、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を動員する。Ｃｈａｎｇら、２０１３，Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３：４６５－４７２；Ｈｗａｎｇら、２０１３，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１：２２７－２２９；Ｘｉａｏら、２０１３，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＴＡＬＥＮＳ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １－１１を参照されたい。
【0076】
ある局面において、ゲノム編集は、例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎの米国特許出願公開第２０１１／００２３１４４号に記載されているように、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって媒介されるプロセスを使用して行われる。
【0077】
典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、この遺伝子は、ｍＲＮＡ（例えば、５’キャップ化、ポリアデニル化、またはその両方）として導入され得る。ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された任意の核酸配列を認識して、これに結合するように改変操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ＆Ｂａｒｂａｓ，２００２，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏら、２００１，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎら、２００１，Ａ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒｓ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：６５６－６６０；およびＳａｎｔｉａｇｏら、２００８，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＰＮＡＳ １０５：５８０９－５８１４を参照されたい。改変操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新しい結合特異性を有し得る。改変操作する方法としては、合理的な設計および様々な種類の選択が挙げられるが、これらに限定されない。ジンクフィンガー結合ドメインは、ジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を介して標的ＤＮＡ配列を認識するように設計され得る。例えば、参照により組み入れられる米国特許第６，６０７，８８２号；同第６，５３４，２６１号および同第６，４５３，２４２号を参照されたい。ジンクフィンガー認識領域を選択する例示的な方法は、ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含み得、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，４１０，２４８号；米国特許第６，１４０，４６６号；米国特許第６，２００，７５９号；および米国特許第６，２４２，５６８号に開示されており、これらのそれぞれは参照により組み入れられる。
【0078】
融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのジンクフィンガー結合ドメインおよび方法は、当業者に公知であり、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号および米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号に詳しく記載されており、それぞれ参照により組み入れられる。ジンクフィンガー認識領域、マルチフィンガー型ジンクフィンガータンパク質またはこれらの組み合わせは、例えば、５またはそれを超えるアミノ酸の長さのリンカーを含む適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。参照により組み入れられる米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。
【0079】
ある局面において、ゲノム編集のための方法は、切断の部位において染色体配列と実質的に同一であり、少なくとも１つの特異的ヌクレオチド変化をさらに含む配列を有する交換ポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を細胞中に導入することを含む。細胞が神経変性疾患を有すると疑われる対象から得られた場合、対照細胞株を作製するために、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲまたはジンクフィンガーなどの方法が使用され得る。例えば、方法は、同質遺伝子であるが、疾患との関連が疑われる遺伝子中の変異を除いて同質遺伝子的である細胞株を作製するために使用され得る。任意のこのような技術が使用され得るが、以下は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを介したゲノム編集を示す。
【0080】
染色体配列を改変するためのゲノム編集を使用して、（関心対象の変異を除いて）同質遺伝子的な対照系統を作製することができる。ある局面において、対照細胞は、健康な個体から、すなわち対象から採取された細胞に対してゲノム編集を使用せずに取得される。対照系統は、試験データと比較するための対照シグネチャを生成するために、本明細書に記載されている分析方法において使用することができる。ある局面において、対照シグネチャは、以前に生成および保存された後にファイルに保存され、保存された対照シグネチャが使用される（例えば、コンピュータシステム内の非一時的メモリに保存されたグラフまたは一連の測定値などのデジタルファイル）。例えば、既知の表現型または遺伝子型の対象の大きな集団をアッセイし、後の下流の比較のための対照シグネチャとして集計結果を保存することによって、対照シグネチャを生成することができる。
【0081】
ＰＳＣ由来ニューロンおよび任意の必要に応じた対照系統に、神経活動または電気的活動の光学レポーターを発現させ得る。神経活動の例としては、ニューロンにおける活動電位または神経伝達物質を放出する小胞の融合が挙げられる。例示的な電気的活動には、ニューロン、アストロサイトまたは他の電気的に活性な細胞における活動電位が含まれる。神経活動または電気的活動のさらなる例としては、イオンポンピングもしくは放出または変化する、膜を横切るイオン勾配が挙げられる。細胞に神経活動の光学レポーターを発現させることは、小胞融合の蛍光レポーターを用いて行うことができる。神経または電気的活動の光学レポーターを発現させることは、光遺伝学的レポーターによる形質転換を含むことができる。例えば、細胞は、光遺伝学的レポーターを含むベクターで形質転換され得、また、形質転換によって光遺伝学的アクチュエータを細胞に発現させ得る。ある局面において、分化したニューロンは（例えば、約１５日間）培養され、次いで、神経活動の、遺伝的にコードされた光学レポーターおよび必要に応じて光学電圧アクチュエータを有するレンチウイルスに感染させる。
【0082】
神経活動の任意の適切な光学レポーターが使用され得る。例示的なレポーターには、膜貫通電圧差の蛍光レポーター、シナプス小胞融合のｐＨｌｕｏｒｉｎベースのレポーターおよび遺伝的にコードされたカルシウム指示薬が含まれる。好ましい態様において、遺伝的にコードされた電圧指示薬が使用される。本発明の方法とともに使用され得るまたは本発明の方法との使用のために改変され得る遺伝的にコードされた電圧指示薬としては、ＦｌａＳｈ（Ｓｉｅｇｅｌ，１９９７，Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ．Ｎｅｕｒｏｎ １９：７３５－７４１）；ＳＰＡＲＣ（Ａｔａｋａ，２００２，Ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ｏｆ ｃｈａｎｎｅｌ ｇａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒａｐｉｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ８２：５０９－５１６）；およびＶＳＦＰ１（Ｓａｋａｉら、２００１，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｄ，ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅｕｒｏ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １３：２３１４－２３１８）が挙げられる。電位作動型ホスファターゼのパドルドメインをベースとした遺伝的にコードされた電圧指示薬は、ＣｉＶＳＰ（Ｍｕｒａｔａら、２００５，Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ａｎ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ ４３５：１２３９－１２４３）である。別の指示薬は、ハイブリッドｈＶＯＳ指示薬（Ｃｈａｎｄａら、２００５，Ａ ｈｙｂｒｉｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：１６１９－１６２６）であり、これは、膜を標的としたＧＦＰとの、膜葉を通った「ダークＦＲＥＴ」（蛍光共鳴エネルギー移動）へのジピクリルアミン（ＤＰＡ）の電圧依存性移動を伝達する。
【0083】
本発明との使用に適し得る光学レポーターには、公知の微生物ロドプシンのタンパク質のファミリーからのものが含まれる。微生物ロドプシンをベースとするレポーターは、高い感度および速度を提供し得る。適切な指示薬としては、ハロルバム・ソドメンス（Ｈａｌｏｒｕｂｕｍ ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ）由来の微生物ロドプシンタンパク質アーキロドプシン３（Ａｒｃｈ）の内因性蛍光を使用するものが挙げられる。Ａｒｃｈは、高い信号雑音比（ＳＮＲ）および低い光毒性で活動電位を分解する。Ａｒｃｈの変異型Ｄ９５Ｎは、いくつかの指示薬に伴う過分極電流を示さないことが示されている。ＱｕａｓＡｒ１およびＱｕａｓＡｒ２と呼ばれるＡｒｃｈの他の変異型は、改善された輝度、電圧に対する感度、応答速度およびニューロンの細胞膜への輸送を示すことが示されている。Ａｒｃｈおよび上述の変異型は真核生物の膜を標的とし、培養された哺乳動物ニューロンにおいて単一の活動電位および閾値を下回る脱分極を画像化することができる。Ｋｒａｌｊら、２０１２，Ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：９０－９５を参照されたい。したがって、ＡｒｃｈおよびＡｒｃｈ（Ｄ９５Ｎ）などのＡｒｃｈの変異型は、本発明の態様にしたがって、神経活動の優れた光学レポーターを提供し得る。
【0084】
ある局面において、ＱｕａｓＡｒ１またはＱｕａｓＡｒ２などのＡｒｃｈの改善された変異型が使用される。ＱｕａｓＡｒ１は、変異：Ｐ６０Ｓ、Ｔ８０Ｓ、Ｄ９５Ｈ、Ｄ１０６ＨおよびＦ１６１Ｖを有するＡｒｃｈを含む。ＱｕａｓＡｒ２は、変異：Ｐ６０Ｓ、Ｔ８０Ｓ、Ｄ９５Ｑ、Ｄ１０６ＨおよびＦ１６１Ｖを有するＡｒｃｈを含む。Ａｒｃｈの位置Ａｓｐ９５およびＡｓｐ１０６（これらは、バクテリオロドプシンの位置Ａｓｐ８５およびＡｓｐ９６と構造的に整列され、光サイクル中のプロトン移動において重要な役割を果たすことが報告されている）は、プロトン輸送鎖中のシッフ塩基に隣接し、電圧感度および速度を決定する上で重要である可能性が高いので、修飾の対象である。他の変異は、タンパク質の輝度を改善する。Ａｒｃｈ遺伝子から出発して、当技術分野で公知の方法に従って小胞体（ＥＲ）エクスポートモチーフおよび輸送配列（ＴＳ）を付加することが有益であり得る。
【0085】
ＱｕａｓＡｒ１およびＱｕａｓＡｒ２はそれぞれ、Ａｒｃｈの特定の変異型を指す。上述のように、アーキロドプシン３（Ａｒｃｈ）は、高速かつ高感度の電圧指示薬として機能する。改善されたバージョンのＡｒｃｈには、Ｈｏｃｈｂａｕｍら、２０１４に記載されているＱｕａｓＡｒｓ（「ｑｕａｌｉｔｙ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ Ａｒｃｈ」）が含まれる。ＱｕａｓＡｒ１は、変異Ｐ６０Ｓ、Ｔ８０Ｓ、Ｄ９５Ｈ、Ｄ１０６ＨおよびＦ１６１Ｖによって、野生型Ａｒｃｈと異なる。ＱｕａｓＡｒ２は、変異Ｈ９５Ｑによって、ＱｕａｓＡｒ１と異なった。ＱｕａｓＡｒ１およびＱｕａｓＡｒ２は、活動電位（ＡＰ）を報告する。
【0086】
Ａｒｃｈおよび上述の変異型は真核生物の膜を標的とし、培養された哺乳動物ニューロンにおいて単一の活動電位および閾値を下回る脱分極を画像化することができる。いずれも参照によって組み入れられる、Ｋｒａｌｊら、２０１２，Ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：９０－９５およびＨｏｃｈｂａｕｍら、Ａｌｌ－ｏｐｔｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１，８２５－８３３（２０１４）を参照されたい。したがって、ＡｒｃｈおよびＡｒｃｈの変異型は、本発明の態様にしたがって、電気的活動の優れた光学レポーターを提供し得る。
【0087】
本発明は、ヒト幹細胞由来ニューロンを含む哺乳動物細胞中で機能するアーキロドプシンをベースとする光学レポーターをＰＳＣまたはＰＳＣ由来の神経細胞に導入することを含む。これらのタンパク質は、サブミリ秒の時間分解能およびサブミクロンの空間分解能で電気的動態を示し、膜電位の光学測定を使用した細胞および組織における電気的動態の非接触、ハイスループットおよびハイコンテンツ研究において使用され得る。これらのレポーターは、特にヒト細胞を含む哺乳動物などの真核生物において広く有用である。
【0088】
本発明は、アーキロドプシン３（Ａｒｃｈ３）およびそのホモログをベースとする光学レポーターを導入することを含む。Ａｒｃｈ３は、Ｈ．ｓｏｄｏｍｅｎｓｅ由来のアーキロドプシンであり、高性能な黄色／緑色光神経サイレンシングのための遺伝的にコードされた試薬として知られている。ＧｅｎＢａｎｋにおける遺伝子配列：ＧＵ０４５５９３．１（合成構築物Ａｒｃｈ３遺伝子、完全なｃｄｓ、２００９年９月２８日提出）。これらのタンパク質は、真核細胞中の細胞膜に局在し、電圧依存性蛍光を示す。
【0089】
これらの光学レポーターは高い感度を示す。哺乳動物細胞においては、アーキロドプシンをベースとするレポーターは、－１５０ｍＶ～＋１５０ｍＶの間で蛍光の約３倍の増加を示す。応答は、この範囲の大部分で線形である。膜電圧は、１秒間隔で、＜１ｍＶの精度で測定することができる。本発明のレポーターは高い速度を示す。ＱｕａｓＡｒ１は、０．０５ｍｓでそのステップ応答の９０％を示す。心臓ＡＰの立ち上がりは約１ｍｓ続き、そのため、Ａｒｃｈに由来する指示薬の速度は、電気的活動を画像化するための基準を満たす。本発明のレポーターは、高い光安定性を示し、光退色の前に生成される蛍光光子の数においてＧＦＰに匹敵する。レポーターは、遠赤色スペクトルも示し得る。遺伝的にコードされた電圧指示薬（ＧＥＶＩ）と呼ばれることもある、Ａｒｃｈ由来の電圧指示タンパク質レポーターは、５９０～６４０ｎｍの波長のレーザーで励起され得、発光は近赤外であり、７１０ｎｍにピークを有する。発光は、すべての他の既存の蛍光タンパク質よりも赤色側に存在する。これらの波長は、低い細胞自己蛍光と一致する。スペクトルが高い信号雑音比での画像化および他の蛍光プローブと組み合わせたマルチスペクトル画像化を容易にするので、この特徴により、これらのタンパク質は活動電位の光学的測定において特に有用となる。
【0090】
他の光遺伝学的レポーターが、本発明の方法およびシステムとともに使用され得る。適切な光遺伝学的レポーターには、参照により組み入れられるＦｌｙｔｚａｎｉｓら、２０１４，Ａｒｃｈａｅｒｏｈｏｄｏｐｓｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｄ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ５：４８９４で報告された、Ａｒｃｈｅｒ１およびＡｒｃｈｅｒ２と呼ばれる２つのＡｒｃｈ変異型が含まれる。Ａｒｃｈｅｒ１およびＡｒｃｈｅｒ２は、Ａｒｃｈ ＷＴと比較して、６５５ｎｍの光に応答して増強された放射輝度を示し、３～５倍の増加した蛍光および５５～９９倍の低下した光電流を有する。Ａｒｃｈｅｒ１（Ｄ９５ＥおよびＴ９９Ｃ）およびＡｒｃｈｅｒ２（Ｄ９５Ｅ、Ｔ９９ＣおよびＡ２２５Ｍ）は、電圧感知のために使用され得る。これらの変異体は、最も最近報告されたＡｒｃｈ変異型よりも９倍低い光強度（６５５ｎｍで８８０ｍＷ ｍｍ－２）で画像化された場合に、高いベースライン蛍光（Ａｒｃｈ ＷＴの３～５倍）、長い照射時間にわたって安定な広いダイナミックレンジの感度（それぞれ、Ａｒｃｈｅｒ１およびＡｒｃｈｅｒ２について、１００ｍＶ当たり８５％ＤＦ／Ｆおよび６０％ＤＦ／Ｆ）および速い動態を示す。Ａｒｃｈｅｒ１の特徴により、単一のニューロン全体にわたるおよびニューロンの集団全体にわたる膜電圧の急速な変化をインビトロで監視するためにＡｒｃｈｅｒ１を使用することが可能となる。Ａｒｃｈｅｒ１は、蛍光励起のために使用される波長（６５５ｎｍ）で最小のポンピングを有するが、より低波長（５６０ｎｍ）で強いプロトンポンピング電流を維持する。Ａｒｃｈｅｒ１は、赤色光による電圧感知および緑色光による阻害能力の両方を有する二機能性ツールを提供する。Ａｒｃｈｅｒ１は、感覚刺激に応答した小さな電圧変化を検出することができる。
【0091】
適切な光遺伝学的レポーターには、増強された局在化のための輸送シグナルを有するＡｒｃｈ由来の電圧センサの他、参照により組み入れられる、Ｇｏｎｇら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｏｌｔａｇｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ、ＰＬｏＳＯｎｅ ８（６）：ｅ６６９５９で報告されたＡｒｃｈ－ＥＥＮおよびＡｒｃｈ－ＥＥＱと呼ばれるＡｒｃｈ変異体が含まれる。このようなレポーターには、二重変異Ｄ９５Ｎ－Ｄ１０６Ｅ（Ａｒｃｈ－ＥＥＮ）およびＤ９５Ｑ－Ｄ１０６Ｅ（Ａｒｃｈ－ＥＥＱ）を有するＡｒｃｈの変異型が含まれ得る。
【0092】
適切な光遺伝学的レポーターは、ロドプシンファミリーの電圧感知ドメインの迅速な動態および電圧依存性を遺伝的に改変操作されたタンパク質フルオロフォアの輝度と組み合わせるために蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用するセンサを含む。このようなＦＲＥＴ－オプシンセンサは、優れたスパイク検出忠実度、速い動態および高い輝度を提供する。ＦＲＥＴ－オプシンセンサは、参照により組み入れられる、Ｇｏｎｇら、Ｉｍａｇｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｓｐｉｋｉｎｇ ｉｎ ｂｒａｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｕｓｉｎｇ ＦＲＥＴ－ｏｐｓｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒｓ、Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ５：３６７４に記載されている。適切なＦＲＥＴ－オプシンとしては、Ｍａｃロドプシン分子へのＦＲＥＴドナーとして作用するための明るいフルオロフォアの、電圧感知ドメインとＦＲＥＴアクセプターを兼ねるサーバへの融合物が挙げられ得る。他のセンサとしては、ニワトリ電圧感受性ホスファターゼ内への循環置換されたＧＦＰの挿入によって形成された電圧センサである、活動電位の加速されたセンサ（ＡＳＡＰ１）が挙げられる。参照により組み入れられるＳｔ－Ｐｉｅｒｒｅ，２０１４，Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ａｎ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｖｏｌｔａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７（６）：８８４。他の適切なレポーターとしては、Ｂｏｎｇｗｏｏｒｉと呼ばれ、参照により組み入れられるＰｉａｏら、２０１５，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ－ｓｅｎｓｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｅｎａｂｌｅｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｆｉｒｉｎｇ ａｔ ６０Ｈｚ ｂｙ ａ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｅｎｓｏｒ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３５（１）：３７２－３８５に記載されているＡｒｃＬｉｇｈｔ由来のプローブが挙げられ得る。
【0093】
ある局面において、ＰＳＣ由来のニューロンは、光電圧アクチュエータで形質転換される。これは、例えば、光遺伝学的レポーターを含むベクターによる形質転換と同時に起こり得る。ＱｕａｓＡｒレポーターの遠赤色励起スペクトルは、全光型の電気生理学を達成するために、ＱｕａｓＡｒレポーターを青色光で活性化されるチャネルロドプシンと対にし得ることを示唆している。空間的に正確な光励起のために、チャネルロドプシンは、細胞のサブセクションのみが励起されたときにＡＰを誘導するのに十分な電流密度を有するべきである。好ましくは、レポーターを画像化するために使用される光は、アクチュエータを活性化すべきではなく、アクチュエータを活性化するために使用される光は、レポーターの蛍光シグナルを乱すべきではない。したがって、好ましい態様において、光学アクチュエータおよび光学レポーターは、クロストークを避け、同時使用を可能にするためにスペクトル的にオルソゴナルである。スペクトル的にオルソゴナルな系は、Ｃａｒｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｍｐｂｅｌｌ，２０１３，Ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍＣｈｅｒｒｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６（１２）：７６３－７７２に論述されている。
【0094】
好ましくは、遺伝的にコードされた光遺伝学的アクチュエータが使用される。１つのアクチュエータは、Ｎａｇｅｌ，Ｇ．ら、２００５，Ｌｉｇｈｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ｉｎ ｅｘｃｉｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｒａｐｉｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１５，２２７９－２２８４に記載されている光遺伝学的アクチュエータであるチャネルロドプシン２ Ｈ１３４Ｒである。
【0095】
植物ゲノムのスクリーニングにより、英国のＥｓｓｅｘの小さな池から初めて単離された淡水緑藻類に由来する光遺伝学的アクチュエータ、シェルフェリア・デュビア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ ｄｕｂｉａ）ＣｈＲ（ｓｄＣｈＲ）が同定された。Ｋｌａｐｏｅｔｋｅら、２０１４，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｎｅｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈ Ａｄｖａｎｃｅ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ １－１４を参照されたい。Ｍｅｌｋｏｎｉａｎ＆Ｐｒｅｉｓｉｇ，１９８６，Ａ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ ｄｕｂｉａ，ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃａｌｙ ｇｒｅｅｎ ｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（Ｐｒａｓｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）．Ｎｏｒｄ．Ｊ．Ｂｏｔ．６：２３５－２５６も参照されたい、いずれも参照により組み入れられる。ｓｄＣｈＲは、優れた感度および青色作用スペクトルを提供し得る。
【0096】
ＣｈｅＲｉｆｆと呼ばれるｓｄＣｈＲの改良版が、光学アクチュエータとして使用され得る。マウスコドン最適化をして、（その青色励起ピーク（４７４ｎｍ）およびＣｈＲ２に比して大きなその光電流についてのチャネルロドプシンのスクリーニングから選択された）シェルフェリア・デュビアチャネルロドプシン（ｓｄＣｈＲ）の遺伝子を合成し、輸送を改善するためにＫｉｒ２．１からの輸送配列を付加し、変異Ｅ１５４Ａを導入する。ＣｈｅＲｉｆｆは、（１０．５±２．８ｐＡへの）赤色照射からの著しく減少したクロストークを示し、本明細書に記載されている光遺伝学的レポーターとともに細胞内で使用することを可能にする。ＣｈｅＲｉｆｆは、培養されたラット海馬ニューロン中での良好な発現および膜輸送を示す。飽和照射下（４８８ｎｍ、５００ｍＷ／ｃｍ）での最大光電流は２．０±０．１ｎＡ（ｎ＝１０細胞）であり、ＣｈＲ２ Ｈ１３４ＲまたはＣｈＩＥＦのピーク光電流より約２倍大きい（Ｌｉｎら、２００９，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ９６：１８０３－１８１４）。ＣｈｅＲｉｆｆを発現するニューロンでは、わずか２２±１０ｍＷ／ｃｍの全細胞照射が１ｎＡの光電流を誘導する。標準的なチャネルロドプシン照射条件（４８８ｎｍ、５００ｍＷ／ｃｍ）下でのＣｈＲ２ Ｈ１３４ＲおよびＣｈＩＥＦと比較した。２３℃で、ＣｈｅＲｉｆｆは、４．５±０．３ｍｓでピーク光電流に達する（ｎ＝１０細胞）。５ｍｓの照射パルス後、チャネル閉鎖時定数は、ＣｈｅＲｉｆｆとＣｈＩＥＦの間で同程度であり（それぞれ、１６±０．８ｍｓ、ｎ＝９細胞および１５±２ｍｓ、ｎ＝６細胞、ｐ＝０．９４）、ＣｈＲ２ Ｈ１３４Ｒより速かった（２５±４ｍｓ、ｎ＝６細胞、ｐ＜０．０５）。連続照射下では、ＣｈｅＲｉｆｆは、４００ｍｓの時定数で部分的に感度が低下し、１．３±０．０８ｎＡの定常状態電流に達する（ｎ＝１０細胞）。ＣｈｅＲｉｆｆを発現するニューロンの照射は、高い信頼性および高い反復速度でＡＰの列を誘導する。
【0097】
培養されたニューロンにおけるＱｕａｓＡｒｓとＣｈｅＲｉｆｆの間での光学的クロストークについて試験すると、ＡＰの高頻度の列を誘導するのに十分な照射（４８８ｎｍ、１４０ｍＷ／ｃｍ）は、ＱｕａｓＡｒｓの蛍光を１％未満乱した。高強度赤色光（６４０ｎｍ、９００Ｗ／ｃｍ）での照射は、１４．３±３．１ｐＡの、ＣｈｅＲｉｆｆを通る内向きの光電流を誘導し、これはニューロンを３．１±０．２ｍＶ脱分極させた（ｎ＝５細胞）。ＣｈＩＥＦおよびＣｈＲ２ Ｈ１３４Ｒは、同様の赤色光光電流および脱分極を生じた。ほとんどの用途では、このレベルの光学クロストークは許容され得る。
【0098】
ある局面においては、ＣｈｅＲｉｆｆよりもさらに青色側に、４００～４４０ｎｍの青紫光波長で最大となる活性化を有するアクチュエータを使用することが好ましい。青紫色で活性化されるチャネルロドプシンは、光刺激条件下でＣａ２＋および電圧を同時に監視するために、黄色で励起されるＣａ２＋指示薬（例えば、ｊＲＣａＭＰ１ａ、ｊＲＧＥＣＯ１ａおよびＲ－ＣａＭＰ２）および赤色で励起される電圧指示薬、例えばＱｕａｓＡｒ２と同時に組み合わせることができる。
【0099】
好ましい青紫色で励起されるチャネルロドプシンアクチュエータは、テトラセルミス・ストリアータ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｔｒｉａｔａ）由来のＴｓＣｈＲである（Ｋｌａｐｏｅｔｋｅら、２０１４，Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｎｅｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．１１，３３８－３４６（２０１４）を参照されたい）。このチャネルロドプシンアクチュエータは、４３５ｎｍにピークを有する青方偏移した作用スペクトルを有する。別の好ましい青紫色チャネルロドプシンアクチュエータは、プラチモナス・サブコーディフォルミス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＰｓＣｈＲである（Ｇｏｖｏｒｕｎｏｖａ，Ｅｌｅｎａら、２０１３，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂｌｕｅ－ｓｈｉｆｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ａｌｇａ Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８（４１）：２９９１１－２９９２２を参照されたい）。ＰｓＣｈｒは、４３７ｎｍにピークを有する青方偏移した作用スペクトルを有する。ＰｓＣｈＲおよびＴｓＣｈＲは、赤方偏移したＣａ２＋指示薬と有利に対にされ、光学的クロストークなしに、これらの赤方偏移したＣａ２＋指示薬と同じ細胞または同じ視野において使用することができる。
【0100】
光遺伝学的レポーターおよびアクチュエータは、発現ベクターの使用を通じて送達されるＯｐｔｏｐａｔｃｈ構築物として本明細書に記載される構築物に入れて送達され得る。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈは、従来はパッチクランプと結びつけられていたが、例えば、光学レポーターまたはアクチュエータによって提供されるように、光入力、読み取りまたはその両方を介して機能を発揮するシステムを指すと解釈され得る。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ構築物は、ＣｈｅＲｉｆｆ－ｅＧＦＰおよびＱｕａｓＡｒ１－またはＱｕａｓＡｒ２－ｍＯｒａｎｇｅ２を共発現するためのバイシストロン性ベクターを含み得る。ＱｕａｓＡｒおよびＣｈｅＲｉｆｆ構築物は別々に送達されてもよく、または均一な比率のアクチュエータ対レポーター発現レベルを得るためにバイシストロン性発現ベクターを使用してもよい。
【0101】
ある局面において、ＰＳＣ由来のニューロンは、光電圧アクチュエータおよび電圧レポーターで形質転換され、それらの活性は、ＰＳＣ由来のニューロン試薬の機能的品質を決定するために記録され、使用され得る。図４は、ニューロン調製物の機能的性質決定およびＱＣを可能にする光型電気生理学構築物でＰＳＣ由来のニューロン試薬が遺伝的に改変された場合の例示的な結果を提供する。図４は、全光型電気生理学（Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ）を使用して、同じ遺伝的背景のＰＳＣ細胞株（１１ａ）の６つの異なるクローンからのニューロン調製物を特徴付けると、何千もの個々のニューロンが複数の活動電位を発火することを示し、成熟した機能的特性を示唆している。
【0102】
図４は、６つの異なるニューロン調製物の平均機能的挙動が驚くほど類似していることも示し、本発明に記載されている方法で生産されたニューロン試薬の高い品質を実証する。
【0103】
図示されているように、図４は、１１ａ ｉＰＳ細胞クローンにおける転写因子ＮＧＮ２の過剰発現によって得られたヒトｉＰＳ細胞由来のニューロンの光学的生理学性質決定を提供する。簡潔に述べると、ニューロンを３０日間培養し、活動の（青色光による）刺激を可能にするために全光型電気生理学構築物で遺伝的に改変した。図はラスタープロットを示し、各列は測定された単一のニューロンを表し、各ドットは約１５秒の実験の過程でのそのニューロンについての単一の活動電位を表す。合計で約１０，０００個のニューロンについて、同じｉＰＳ細胞遺伝的背景（１１ａ）の６つの異なるクローンから得られたニューロン培養物から１，５００個を超えるニューロンを記録した。６つの異なるニューロン調製物の平均機能的挙動（発火率）は驚くほど類似しており、本発明に記載されている方法を用いて産生されたニューロン試薬の高い品質を実証している。
【0104】
遺伝的にコードされたレポーター、アクチュエータまたはその両方は、当技術分野で公知の方法を使用して任意の適切な発現ベクターによって送達され得る。発現ベクターは、宿主細胞における関心対象の遺伝子の発現のために必要とされる必要な調節領域を含有する特殊化されたベクターである。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は、ベクター中の別の配列に機能的に連結されている。ある局面においては、ウイルスベクターは複製欠損であることが好ましく、これは、例えば、複製をコードするすべてのウイルス核酸を除去することによって達成することができる。複製欠損ウイルスベクターは依然としてその感染特性を保持し、複製するベクターと同じように細胞に入るが、いったん細胞に入ると、複製欠損ウイルスベクターは複製または増殖しない。「機能的に連結された」という用語は、コード配列の発現のために必要な調節配列が、コード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置でＤＮＡ分子中において配置されていることを意味する。この同じ定義は、発現ベクター中でのコード配列および転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび終結エレメント）の配置に適用されることがある。
【0105】
多くのウイルスベクターまたはウイルス随伴ベクターが当技術分野で公知である。このようなベクターは、細胞内への核酸構築物のキャリアとして使用することができる。構築物は、細胞内への感染または形質導入のために、レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのような非複製欠損ウイルスゲノム中に組み込まれ、パッケージングされ得る。ベクターは、細胞のゲノム中に組み込まれていてもよいし、または組み込まれていなくてもよい。構築物は、所望であれば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＰＶまたはＥＢＶ）ベクターなどの、エピソーム複製能を有するベクター中に組み入れられ得る。発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する場合に、本明細書に記載されているベクターの挿入された物質は発現制御配列に機能的に連結され得る。いくつかの例では、挿入された物質の転写は、組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。
【0106】
ある局面においては、誘導性プロモーターを含有する組換え細胞が使用され、適切な環境条件または機能している病原体への曝露によって細胞または生物に制御因子または刺激を外部から適用することによって、制御因子または刺激に曝露される。誘導性プロモーターは、制御因子または刺激の存在下でのみ転写を開始する。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン応答エレメントおよびβ－インターフェロン遺伝子、熱ショック遺伝子、メタロチオネイン遺伝子またはステロイドホルモン応答性遺伝子から得ることができる任意のものに由来するプロモーターが挙げられる。本発明の方法を実施する際に使用され得る誘導性プロモーターとしては、プロゲステロン、エクジソンおよびグルココルチコイドなどのホルモンおよびホルモン類似体によって制御されるもの、ならびにテトラサイクリン、熱ショック、重金属イオン、インターフェロンおよびラクトースオペロン活性化化合物によって制御されるプロモーターが挙げられる。Ｇｉｎｇｒｉｃｈ ａｎｄ Ｒｏｄｅｒ，１９９８，Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１：３７７－４０５を参照されたい。組織特異的発現は遺伝子発現の分野で十分に特徴付けられており、組織特異的および誘導性プロモーターは当技術分野において周知である。これらのプロモーターは、外来遺伝子が標的細胞に導入された後に、外来遺伝子の発現を制御するために使用される。ある局面において、細胞型特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターが使用される。細胞型特異的プロモーターには、主に１つの細胞型において選択された核酸の発現を制御するが、他の細胞においても発現を引き起こす漏出性の細胞型特異的プロモーターが含まれ得る。神経細胞において特異的に外因性遺伝子を発現させるために、ニューロン特異的エノラーゼプロモーターを使用することができる。Ｆｏｒｓｓ－Ｐｅｔｔｅｒら、１９９０，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｎｅｕｒｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｎｅｕｒｏｎ ５：１８７－１９７を参照されたい。ドーパミン作動性ニューロンにおける外因性遺伝子の発現のために、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターを使用することができる。
【0107】
ある局面において、発現ベクターはレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、真核生物プロモーターを含み得る。プロモーターは、真核細胞においてプロモーターとして機能する、合成プロモーターを含む任意の誘導性プロモーターであり得る。例えば、真核生物プロモーターは、当技術分野で周知のように、ＣａｍＫＩＩαプロモーター、ヒトシナプシンプロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、Ｅ１ａ誘導性プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどであり得るが、これらに限定されない。さらに、本明細書で使用されるレンチウイルスベクターは、プロモーターおよび選択可能な形質に対するコード配列を含むことができる選択可能なマーカーをさらに含むことができる。選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列は当技術分野で周知であり、抗生物質または代謝拮抗物質に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードするもの、または栄養要求性の要求を供給するものが含まれる。このような配列の例としては、とりわけ、チミジンキナーゼ活性、またはメトトレキサート、アンピシリン、カナマイシンに対する耐性をコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスベクターの使用は、Ｗａｒｄｉｌｌら、２０１３，Ａ ｎｅｕｒｏｎ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（１０）：ｅ７７７２８；Ｄｏｔｔｏｒｉら、Ｎｅｕｒａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ－ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１２（８）：１９５５－６２；およびＤｉｅｓｔｅｒら、２０１１，Ａｎ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌｂｏｘ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １４（３）：３８７－９７で論述されている。培養されたラット海馬ニューロンにおいてＣａＭＫＩＩαプロモーター下で発現されると、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ構築物は、ＣｈｅＲｉｆｆおよびＱｕａｓＡｒ２の両方の高発現および良好な膜輸送を示す。
【0108】
いくつかの態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノム中に組み入れ得る。１つの適切なウイルスベクターは、ＣＮＳにおける遺伝子送達のために広く使用されている組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を使用する。
【0109】
ある局面において、本発明の方法は、Ｃｒｅ依存性発現系を使用する。Ｃｒｅ依存性発現には、Ｌｏｘ配列と呼ばれる短い標的配列の対を組み換える酵素Ｃｒｅリコンビナーゼを使用する部位特異的リコンビナーゼ技術であるＣｒｅ－Ｌｏｘ組換えが含まれる。この系は、余分な補助タンパク質または配列を一切挿入せずに実施することができる。Ｃｒｅ酵素およびＬｏｘＰ配列と呼ばれる元のＬｏｘ部位は、バクテリオファージＰ１に由来する。バクテリオファージＰ１は、Ｃｒｅ－ｌｏｘ組換えを使用して、そのゲノムＤＮＡを環状化し、複製する。この組換え戦略は、ゲノム操作のためにＣｒｅ－Ｌｏｘ技術において用いられ、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ技術はＣｒｅリコンビナーゼおよびＬｏｘＰ部位のみを必要とする。Ｓａｕｅｒ＆Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｃｒｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ１，ＰＮＡＳ ８５：５１６６－７０およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ＆Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９８１，Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｐ１ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｉ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＬｏｘＰ ｓｉｔｅｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：４６７－８６。方法は、信頼できる光刺激を可能にするのに十分な発現レベルでチャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）などのツールを特定のニューロンに標的化するために、Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性ウイルスベクターを使用し得る。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質がタグとして付加されたＣｈＲ２（例えば、ＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙ）などの光遺伝学的ツールまたは本明細書で論じられている任意の他のツールが、細胞を性質決定する上で使用するために、１つの細胞または複数の細胞に送達される。
【0110】
送達ベクターはＣｒｅおよびＬｏｘを含み得る。ベクターは、Ｃｒｅ媒介性組換えの非存在下での導入遺伝子の発現を防止するために、Ｌｏｘ－ストップ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを必要に応じてさらに含み得る。Ｃｒｅリコンビナーゼの存在下で、ＬｏｘＰ部位は組み換えを行い、除去可能な転写終結Ｓｔｏｐ要素は除去される。ストップ要素の除去は、発現のタイミングおよび位置の調節を可能にするＡｄｅｎｏＣｒｅの使用を通じて達成され得る。ＬＳＬカセットの使用は、Ｊａｃｋｓｏｎら、２００１，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｔｕｍｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｋ－ｒａｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ １５：３２４３－３２４８で論述されている。
【0111】
ある局面において、本発明の構築物は、安定した導入遺伝子の反転を達成するために、「フリップ切除」スイッチまたはＦＬＥＸスイッチ（ＦＬｉｐ ＥＸｉｃｉｓｉｏｎ）を使用する。ＦＬＥＸスイッチは、Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎら、２００３，Ａ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｃｒｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：５６２－５６５で論述されている。ＦＬＥＸスイッチは、まずコード配列の反転を経た後に２つの部位を切除し、反対向きに配向されてさらなる組換えを行えないそれぞれのオルソゴナルな組み換え部位の１つをもたらす２対のヘテロタイプな逆平行のＬｏｘＰ型組換え部位を使用する。ＦＬＥＸスイッチは、高い効率および不可逆性を与える。したがって、いくつかの態様において、方法は、ｒＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ｒｅｖ－ＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙを含むウイルスベクターを使用する。これに加えてまたはこれに代えて、ベクターは、ＦＬＥＸおよび本明細書で論じられている任意の他の光遺伝学的ツール（例えば、ｒＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＱｕａｓＡｒ、ｒＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ＣｈｅＲｉｆｆ）を含み得る。実例としてｒＡＡＶ－ＦＬＥＸ－ｒｅｖ－ＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙを使用すると、ＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙコード配列のＣｒｅ媒介性反転は、Ｃｒｅが配列を反転させてＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙの転写を作動させるまで、コード配列を転写に関して誤った向き（すなわち、ｒｅｖ－ＣｈＲ２ｍＣｈｅｒｒｙ）にする。ＦＬＥＸスイッチベクターは、Ａｔａｓｏｙら、２００９，Ａ ＦＬＥＸ ｓｗｉｔｃｈ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｒａｎｇｅ ｃｉｒｃｕｉｔ ｍａｐｐｉｎｇ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２８（２８）：７０２５－７０３０で論述されている。
【0112】
ニューロンを標識および刺激するために、（必要に応じて、ＦＬＥＸスイッチおよび／またはＬｏｘ－ストップ－Ｌｏｘカセットとともに）光学レポーター、光学アクチュエータまたはその両方とともにＣｒｅ－Ｌｏｘ系などのウイルスベクターを使用することによって、１００μＷ未満の集束レーザー光または光ファイバからの光への短時間の曝露（１ｍｓ）のみによる効率的な光刺激が可能となる。このようなさらなる考察は、Ｙｉｚｈａｒら、２０１１，Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｅｕｒｏｎ ７１（１）：９－３４；Ｃａｒｄｉｎら、２０１０，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌ－ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ－２，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ５（２）：２４７－５４；Ｒｏｔｈｅｒｍｅｌら、２０１３，Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔａｒｇｅｔ－ｄｅｆｉｎｅｄ ｎｅｕｒｏｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３（３８）：１９５－２０６；およびＳａｕｎｄｅｒｓら、２０１２，Ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｎｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ，Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ６：４７に見出され得る。
【0113】
ある局面において、アクチュエータ、レポーターまたは他の遺伝物質は、化学的に修飾されたｍＲＮＡを使用して送達され得る。ある種のヌクレオチド修飾が、ｍＲＮＡとｔｏｌｌ様受容体、レチノイド誘導性遺伝子またはその両方の間での相互作用を妨害することが見出され、利用され得る。所望の産物をコードするｍＲＮＡへの曝露は、細胞中での所望のレベルの産物の発現をもたらし得る。例えば、Ｋｏｒｍａｎｎら、２０１１，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２９（２）：１５４－７；Ｚａｎｇｉら、２０１３，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３１：８９８－９０７を参照されたい。
【0114】
必要に応じてアクチュエータとともに、遺伝的にコードされた光学レポーターでの形質転換後に、ニューロンを培養または成熟させることが有益であり得る。ニューロンは、感染後に８～１０日間成熟させる。ある局面において、３０～６０日の長期培養が使用される。本明細書に記載されている顕微鏡法および分析方法を使用して、細胞およびその活動電位が観察され得る。さらなる考察については、参照によりその全体があらゆる目的のために組み入れられる米国特許出願公開第２０１３／０２２４７５６号を参照されたい。
【0115】
ある局面においては、プレートのウェル内で生細胞を観察し、画像化することを可能にする構成で、試料に近ＴＩＲ光を照射するマルチウェルプレート顕微鏡を使用して、ＰＳＣ由来の神経細胞をアッセイすることができる。この顕微鏡は、対物レンズを介してではなく側面から試料を照射し、これにより、より強い照射ならびに対応するより低い開口数およびより大きな視野が可能になる。蛍光の波長とは異なる波長の照射光を使用することにより、ＴＩＲ顕微鏡は、光学フィルタを用いて照射波長を画像からほぼ完全に除去することを可能にし、関心対象の領域が明るく、背景が暗い画像をもたらす。顕微鏡は、蛍光を観察して、活動電位の特徴／パラメータがそこから抽出される細胞の活動電位の指標尺度を提供することができる。
【0116】
ＱｕａｓＡｒ２およびＱｕａｓＡｒ３などの膜活動電位の蛍光レポーターは、蛍光を発するために強い励起光を必要とする。低い量子効率および迅速な動態は、電位を測定するために強い光を要求する。したがって、照射サブシステムは、高いワット数または高い強度で光を発するように構成される。量子効率およびピーク励起波長などのフルオロフォアの特徴は、それらの環境に応答して変化する。強い照射は、それを検出することを可能にする。強い光によって引き起こされる自己蛍光は、複数の方法で顕微鏡によって最小化される。近ＴＩＲ照射の使用は、各ウェルの底部のみを照射光に曝露し、それによって培養培地または装置の他の構成要素の励起を減少させる。さらに、顕微鏡は、画像化光とは異なる照射光を提供するように構成される。画像化サブシステム内の光学フィルタは、照射光を取り除き、画像から望まれない蛍光を除去する。細胞を培養するための環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）皿は、ガラスと比較して低下したバックグラウンド自己蛍光を可能にする。プリズムは、屈折率が一致する低自己蛍光オイルを介してマルチウェルプレートに結合される。プリズムも低自己蛍光性石英ガラスから構成される。
【0117】
顕微鏡は、細胞の動的特性を光学的に特徴付けるように構成される。顕微鏡は、以下を同時に達成することによって全光型の性質決定の可能性を最大限に実現する。（１）ネットワーク内の細胞間の相互作用の測定を可能にするためのまたはハイスループットのために多くの細胞を同時に測定するための広い視野（ＦＯＶ）；（２）ウェル中の個々の細胞の形態を検出し、シグナル処理における選択性を促進するための高い空間分解能；（３）個々の活動電位を区別するための高い時間分解能；および（４）正確なデータ分析を容易にするための高い信号雑音比。顕微鏡は、数十または数百の細胞を捕捉するのに十分な視野を提供することができる。顕微鏡および関連するコンピュータシステムは、少なくとも１キロヘルツのオーダーの画像取得速度を提供し、これは１ミリ秒のオーダーの非常に短い露光時間に対応し、それによってニューロンなどの電気的に活性な細胞において生じる急速な変化を記録することを可能にする。したがって、本顕微鏡は、従来技術の顕微鏡よりも実質的により短い期間で、列挙された光学系を使用して蛍光画像を取得することができる。
【0118】
顕微鏡は、細胞の動的特性を光学的に特徴付けることを容易にするために、これらの要求の厳しい要件のすべてを達成する。顕微鏡は、低開口数（ＮＡ）対物レンズを用いて、十分な分解能および集光能力を有する大きなＦＯＶを提供する。顕微鏡は、ｓＣＭＯＳカメラなどの高速検出器を用いて、２倍～６倍の範囲の倍率で画像化することができる。高速の画像化速度を達成するために、顕微鏡は、典型的には、約６３５ｎｍ～最大約２，０００Ｗ／ｃｍ２の波長で例えば５０Ｗ／ｃｍ２を超えるフルエンスを有する極めて強い照射を使用する。
【0119】
高い出力レベルにもかかわらず、顕微鏡は、それにもかかわらず、試料、細胞増殖培地、屈折率マッチング流体および試料容器中の非特異的バックグラウンド蛍光を励起することを回避する。近ＴＩＲ照射は、試料および試料媒体の望まれない領域の自己蛍光を制限する。画像化サブシステム内の光学フィルタは、望まれない光が画像センサに到達するのを防止する。さらに、顕微鏡は、照射光を対物ユニットに通すのではなく、試料を側方から照射することによって、対物レンズ内のガラス素子の望まれない自己蛍光を防止する。顕微鏡の対物レンズは、物理的に大きく、少なくとも５０ｍｍの前面開口部および少なくとも１００ｍｍの長さを有し、多数のガラス素子を含有し得る。
【0120】
顕微鏡を使用した画像化のためにＰＳＣ由来のニューロンのプレートを調製することは、例えば、０．１％ゼラチン中の１０μｇ／ｍＬフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆されたＭａｔＴｅｋディッシュ（ＭａｔＴｅｋ ｃｏｒｐ．；１０ｍｍのガラス直径、＃１．５）を４℃で一晩使用することを含み得る。まず、トリプシン処理されたＣａＶｉａｒおよびＣｈｅＲｉｆｆ発現細胞を５：１のＣａＶｉａｒ：ＣｈｅＲｉｆｆの比で混合し、次いでペレット化する。合わせた細胞を２．１ｍＬの維持培地に再懸濁し、１００μＬの播種培地に２．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ガラス表面全体を覆う。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で一晩維持してガラスに接着させる。維持培地（１．０ｍＬ）を各ディッシュに添加し、７５０μＬの培地をディッシュから除去し、７５０μＬの新鮮な維持培地と交換することによって、４８時間ごとに細胞に給餌する。培地にはラミニンを補充することができ、培地を交換するごとに減少した濃度を与える。
【0121】
電圧およびカルシウムを同時に画像化するために、ＣｈｅＲｉｆｆ発現細胞をＣａＶｉａｒ発現細胞から分離するようにＭａｔＴｅｋディッシュ（１０ｍｍのガラス直径）を調製することができる。これにより、２つの機能間での光学的クロストークなしに、ともに青色光を用いて、カルシウム画像化とＣｈｅＲｉｆｆ刺激を同時に行うことが可能になる。ある局面においては、０．１％ゼラチン中の１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンの溶液で、直径８ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ディスクの片側を室温で１０分間処理する。次いで、被覆されたディスクを乾燥させ、次いで、片側にわずかにずらしてＭａｔＴｅｋディッシュのガラス表面に押し付ける。次いで、ガラスの残りの露出された領域を、０．１％ゼラチン中の１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチンで被覆する。製造者のプロトコルに従って、ＣｈｅＲｉｆｆを発現する細胞をトリプシン処理し、ディッシュあたり５０μＬの維持培地に再懸濁する。播種のために、次いで、５０μＬのＣｈｅＲｉｆｆ細胞をガラス表面の露出された部分に添加し、５％ＣＯ２中、３７℃で４０分間静置して細胞を接着させる。次いで、ＰＤＭＳディスクを取り出し、ガラス表面を１５０μＬの維持培地で洗浄し、残りの体積を吸引する。次いで、トリプシン処理されたＣａＶｉａｒ細胞を、ディッシュあたり１００μＬの維持培地に再懸濁し、１００μＬ中に２．０×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、ガラス表面全体を覆う。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩維持してガラスに接着させる。１．００ｍＬの維持培地を各ディッシュに添加し、７５０μＬの培地をディッシュから除去し、７５０μＬの新鮮な維持培地を添加することによって、４８時間ごとに細胞に給餌する。
【0122】
ある局面において、本発明のニューロンおよび方法は、疾患をインビトロで研究するための疾患モデルを作製するために使用され得る。ニューロンは、ニューロン疾患に罹患している個体から採取されたｉＰＳＣに由来し得るか、またはニューロン疾患に関連する遺伝子型を組み入れることによるゲノム編集に由来し得る。ある例においては、ニューロン疾患に関連すると疑われる試験変異がゲノム編集によってニューロンに組み入れられ得、疾患との関連性について試験変異を評価するために、得られた修飾されたニューロンを疾患の徴候について観察し得る。
【0123】
ある局面においては、疾患表現型を対照状態（変異のない健康なＰＳＣニューロンの表現型）に復帰させることができる小分子化合物をスクリーニングするために、疾患モデルを表し、光学レポーターを発現するように遺伝的に改変されたＰＳＣ由来の神経細胞をマルチウェルプレート蛍光顕微鏡において使用することができる。図５は、約７０億個のニューロンの単一の凍結保存されたロット由来の試薬を使用したハイスループット表現型スクリーニングにおけるＰＳＣ由来のニューロンの有用性の一例を提供する。
【0124】
簡潔に述べれば、図５は、ヒトｉＰＳ細胞由来のニューロンにおける表現型スクリーニングを示す。この図は、単一遺伝子型のてんかんの機能喪失（ノックアウトまたはＫＯ）モデルにおける１２日間の表現型スクリーニングからの代表的なデータを示す。対照野生型（「ＷＴ」）および疾患「ＫＯ」ヒトｉＰＳ細胞由来の皮質興奮性ニューロンを作製し、本発明に記載されている方法を使用して大きな規模（合計約７０億ニューロン）で凍結した。ニューロン試薬のわずかな一部を高い生存率で解凍し、９６ウェルプレート上に播種し、３０日間培養した。電気生理学的活性の測定を可能にするために、光学レポーターを発現する遺伝子構築物でニューロンを改変した。ＷＴニューロンとＫＯニューロン間での機能的比較により、多くのパラメータの線形結合である疾患スコアによって定量化される多次元表現型が確立された。本発明者らは、表現型を元に戻す分子について３０，０００化合物のスクリーニングを実施した。最初の約９，０００ウェルからの結果が示されており、０．５の疾患スコア閾値で約１．５％のヒット率を有する。結果は、一貫した表現型および安定したアッセイ（平均Ｚ’＝０．４）を明らかにする。各破線は、１つの９６ウェルプレートに対応する。
【0125】
ある局面において、例えば、モデル化された疾患が非単一遺伝子性の、複雑な病因および／または遅発性である場合には、本発明のニューロンは、加齢をシミュレートするために、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月またはそれより長くなど、長期間培養され得る。Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｄａｎｅｓらを参照されたい。本発明の細胞は、膜電位の光学レポーター、細胞内カルシウムレベルのレポーター、光開口型イオンチャネルまたはこれらの組み合わせで形質転換され得る。疾患のニューロン効果を調べるために、疾患進行中に活動電位および細胞内カルシウムレベルの変化を誘導し、観察することによって、細胞を経時的に監視し得る。疾患モデルの対象細胞はまた、様々な治療の有効性を評価するために、様々な治療の適用前および適用後に監視され得る。
【0126】
本発明の細胞および方法は、観察される１つの細胞または複数の細胞に適用されるツール／試験化合物または他の介入ツールの使用を含み得る。試験化合物の適用は、細胞の電気生理学に対するそれらの化合物の効果を明らかにすることができる。ツール化合物の使用は、例えばある種のイオンチャネルを遮断することによって、診断においてまたは疾患機構を決定するためにより高い特異性を達成することができる。化合物の影響を定量化することにより、細胞内のそのチャネルのレベルを定量化することができる。
【0127】
ツールまたは試験化合物を用いて、細胞に神経活動または電気的活動の光学レポーターを発現させることができ、細胞はまた、薬物などの化合物に曝露され得る。細胞のシグネチャは、化合物を試験する前、試験している間または試験した後に観察することができる。異なる細胞および細胞型の任意の組み合わせを、異なる試験化合物対照を含む化合物の１つまたは任意の組み合わせに曝露させることができる。化合物および細胞型の任意の組み合わせを交差試験するために、マルチウェルプレート、スライド上の複数位置スポッティングまたは他の多区画実験ツールを使用することができる。
【0128】
ある局面において、ツール化合物が細胞に添加され、可能性のある疾患または疾患の原因もしくは機構を区別するために、細胞に対するツール化合物の効果が観察される。例えば、互いにシナプス結合している２またはそれを超える細胞が観察される場合、上流の細胞の外因性刺激は、下流の細胞において活動電位として現れるはずである。神経伝達物質の再取り込みを阻害することが知られている化合物は、ある神経サブタイプのみに作用し、したがって特定の疾患パターンを示すことが明らかになり得る。
【0129】
ある局面において、ＰＳＣ由来の神経細胞は、シナプス伝達を検出し、測定し、または評価するためにアッセイされる。直接的な刺激が加えられた細胞以外の細胞について、シグネチャが観察され得る。実際、本明細書で論じられている信号処理アルゴリズムを使用して、複数の細胞間でのシナプス伝達が検出され得、これにより神経接続のパターンが明らかになる。上流ニューロンを刺激した際に下流ニューロンの発火を首尾よく検出するアッセイを確立することにより、観察されるべき対象細胞が上流ニューロンの刺激に際して発火しない場合に、シナプス伝達の不全によって特徴付けられる疾患または症状を明らかにすることができる。
【0130】
試験化合物は、患者への適用前に処置の適合性を決定するための候補処置として評価することができる。例えば、発火パターンを野生型に復帰させ、疾患発症を予防もしくは遅延し、または疾患症候を軽減する薬物を見出すために、アルツハイマー病薬を試験することができる。
【0131】
ある局面において、ＰＳＣ由来の神経細胞は、化合物を試験することによって患者に対する可能な治療を同定するためのシステムおよび方法において使用することができ、このシステムおよび方法は個別化医療として使用され得る。本明細書中に記載されているアッセイの性質のために、候補治療化合物の効果を患者ごとに評価することが可能であり得、したがって、真の個別化医療のためのツールを提供する。例えば、本明細書に記載されているアッセイは、ある疾患に罹患している患者が、本明細書に記載されているアッセイの下で疾患型生理学的表現型を示すニューロンまたは神経サブタイプを有することを明らかにし得る。１つまたはいくつかの異なる化合物が、それらのニューロンまたは神経サブタイプに適用され得る。それらの異なる化合物の１つ（または化合物の組み合わせ）に曝露された細胞は、疾患型から正常への生理学的表現型の変化を示し得る。したがって、疾患型から正常への表現型の変化に影響を及ぼす化合物または化合物の組み合わせは、その患者に対する候補処置化合物として同定される。
【0132】
ある局面において、試験化合物は、Ａ２Ａ受容体アンタゴニスト、レボドパ、アマンタジン、ドーパミンアゴニスト、選択的ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、抗コリン作動薬またはカテコールＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤を含み得る。
【実施例】
【0133】
実施例１
製造業者のプロトコルに従って、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングを使用して、対照ｉＰＳ細胞株を培養して維持する。転写プログラミングアプローチを使用してｉＰＳ細胞株をＮｇｎ２興奮性ニューロンに分化させ、それによりｉＰＳ細胞株は、最初に、リバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を発現する構築物ならびに神経細胞分化促進性転写因子ＮＧＮ２およびピューロマイシン耐性酵素の発現を駆動するテトラサイクリン応答性（ＴｅｔＯｐ）構築物のレンチウイルス送達を介して改変される。
製造業者のプロトコルに従って、ｍＴｅＳＲ１（商標）培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングを使用して、対照ｉＰＳ細胞株を培養して維持する。転写プログラミングアプローチを使用してｉＰＳ細胞株をＮｇｎ２興奮性ニューロンに分化させ、それによりｉＰＳ細胞株は、最初に、リバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を発現する構築物ならびに神経細胞分化促進性転写因子ＮＧＮ２およびピューロマイシン耐性酵素の発現を駆動するテトラサイクリン応答性（ＴｅｔＯｐ）構築物のレンチウイルス送達を介して改変される。
【0134】
図３は、ニューロン転換のためにヒトｉＰＳ細胞を遺伝的に改変するために使用される例示的な誘導性発現構築物の概略図を提供する。２つの構築物が使用される。一方の構築物は、構成的プロモーター（例えば、ユビキチンプロモーター：ＵＢ）からリバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）を発現する。他方の構築物は、テトラサイクリン応答性制御要素（ＴｅｔＯｐ）によって駆動される、抗生物質耐性遺伝子（例えば、ピューロマイシン）に翻訳的に融合された転写因子（Ｔ．Ｆ．）、例えばニューロゲニン－２（Ｎｇｎ２）を発現する。両構築物は、レンチウイルス形質導入を介してヒトｉＰＳ細胞に導入する。遺伝的に改変されたｉＰＳ細胞は、大規模生産のために出発材料を増やすために拡大増殖させることができる。ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下で、ｒｔＴＡタンパク質はＴｅｔＯｐを結合し、活性化して、転写因子および抗生物質耐性遺伝子の高レベル発現を駆動する。３～５日間のドキシサイクリンおよび抗生物質処置の後、未成熟ニューロンの均質な調製物を得ることができる。
【0135】
ＮＧＮ２の誘導前に３～５継代にわたって、遺伝的に改変されたｉＰＳ細胞株をｍＴｅＳＲ１（商標）培地中で拡大増殖させる。ニューロン生産のために、製造者の推奨に従ってＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）でｉＰＳ細胞を解離させ、１０μＭ Ｒｏｃｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｉｇｍａ）および２μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を補充したｍＴｅＳＲ１（商標）培地を使用して３００，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種してＮＧＮ２過剰発現を開始させる。その後、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×非必須アミノ酸、１×Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｂ－２７、２μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）および２μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した１：１ ＤＭＥＭ／Ｆ１２：Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３日間、分化している細胞を維持する。このプロセスは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で解離されたニューロンの純粋な集団をもたらす。
【0136】
ニューロンを凍結保存し、続いて解凍し、長期培養のためにポリ－ｄ－リジン／ラミニンで予め被覆されたシングルウェル（ＭａｔＴｅｋ（商標））または８ウェル（Ｉｂｉｄｉ）皿上に８０，０００細胞／ｃｍ２で播種する。１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１×非必須アミノ酸、１×Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、１×Ｂ－２７、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ Ｍｅｄｉｕｍ中で、ニューロン培養物をＤＩＶ１８まで維持する。播種の３日後、ニューロン培養物に４０，０００細胞／ｃｍ２の初代マウスグリア細胞を補充する。
【0137】
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ成分のＣｈｅＲｉｆｆおよびＱｕａｓＡｒをコードするレンチウイルス粒子を作製する。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ成分の発現を成熟興奮性ニューロンに標的化するために、ＤＩＶ１０に、ＣＡＭＫ２Ａプロモーターによって駆動されるＣｈｅＲｉｆｆ－ｍＯｒａｎｇｅ２およびＱｕａｓＡｒ３ Ｃｉｔｒｉｎｅ構築物でニューロン培養物を形質導入する。ＱｕａｓＡｒ３－Ｃｉｔｒｉｎｅは、複数のＫｉｒ２．１輸送配列および１７１位のリジン（推定ユビキチン化部位）からアルギニンへの置換を組み入れたＱｕａｓＡｒ２の変異型であり、改善された発現および輸送をもたらす。処理の１６～２４時間後（ＤＩＶ１１）に２×培地交換によってウイルスを洗浄しながら、ニューロン培養物の形質導入を行う。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ画像化を使用してニューロンが記録されたＤＩＶ２５まで、ニューロン培養物を維持する。
【0138】
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ測定の１週間前に、ニューロン培養物を、１×Ｎ２－Ａ、１×ＳＭ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替えた。
【0139】
したがって、本発明は、ＰＳＣを神経細胞に分化させ、凍結保存し、培養し、光遺伝学的タンパク質を形質導入し、光遺伝学的アッセイを使用してアッセイする方法を提供する。
実施例２
実施例２
【0140】
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈプラットフォームを用いてヒトｉＰＳ細胞由来興奮性ニューロンの内因性興奮性活性を特徴付けるために、実施例１からの２つのｉＰＳ細胞株「１１ａ」および「２０ｂ」を使用した。これらの２つのｉＰＳ細胞株は、２人の神経学的に健康な男性対象に由来した。実施例１に記載されているようにドキシサイクリン応答性レンチウイルス構築物を使用して神経細胞分化促進性転写因子ＮＥＵＲＯＧＥＮＩＮ２（ＮＧＮ２）を過剰発現させる転写プログラミングアプローチを使用して、１１ａおよび２０ｂ ｉＰＳ細胞を興奮性ニューロンに変換する。このプロセスは、皮質興奮性ニューロンに似たニューロンへのｉＰＳ細胞の迅速な変換を誘導する。
【0141】
得られたニューロンを凍結保存し、続いて解凍する。
【0142】
解凍した細胞を初代齧歯類グリアと共培養して、ニューロンの電気生理学的成熟を促進する。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ測定を可能にするために、ニューロン興奮性プロモーターＣＡＭＫ２Ａによって駆動されるＯｐｔｏｐａｔｃｈ成分を発現するレンチウイルス構築物を細胞に形質導入し、２週間後に細胞からのシグナルを記録する。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ測定の時点で、ＮＧＮ２興奮性ニューロンは均質で電気生理学的に活性であり、細胞、ディッシュ、分化のラウンドおよび細胞株にわたって高度に定型化された再現性のあるデータをもたらす。
【0143】
両遺伝的背景からのｉＰＳ細胞の、興奮性ニューロンへの効果的な変換を確認するために、電気生理学的測定の時（ＤＩＶ２５－ＤＩＶ３０）にニューロン調製物を使用する。
【0144】
ニューロン生産効率を決定するために、ヒト特異的核抗原（ｈＮｕｃｌｅｉ）および成熟汎ニューロン細胞骨格タンパク質微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）に対する抗体を使用して培養物を免疫染色する。培養物中のヒト分化細胞のパーセンテージを推定し、ｈＮｕｃｌｅｉ＋細胞に対するＭＡＰ２＋細胞のパーセンテージを計算することによってニューロンと相関させる。ｈＮｕｃｌｅｉ免疫試薬で染色されない大きな核は、支持性の単層として使用されるマウスグリア細胞の核に対応する。ヒト分化細胞の９４％超がＭＡＰ２タンパク質を発現し、これは近位神経突起への予想された局在化を示し、ニューロン生産の成功を示す。
【0145】
抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡに対する抗体を使用して、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ測定の時点での培養物中のＧＡＢＡ作動性ニューロンの割合を決定する。Ｎｇｎ２によって媒介されるプログラミングアプローチを使用した場合に興奮性ニューロンの濃縮を報告する以前の研究と一致して、Ｎｇｎ２ニューロン／マウスグリア共培養物中のヒト分化したニューロン（ＭＡＰ２＋細胞）の＜４％未満がＧＡＢＡ抗体に対して強い免疫反応性を示す。
【0146】
潜在的な薬理学的標的をコードする遺伝子のサブセットに対して、相対的転写物存在量のｑＰＣＲに基づく評価を行う。これらの標的には、ナトリウムおよびカリウムチャネルならびに過分極活性化型および環状ヌクレオチド開口型（ＨＣＮ）チャネルが含まれる。平均Ｃｑ値のヒートマップは、Ｃｑ＞３４であるＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＡ１およびＣＨＲＭ１を除いて、選択された薬理学的標的をコードする遺伝子のほとんどが低いレベル（Ｃｑ＞２８）で検出されることを示唆する。
【0147】
電気生理学の全光型測定であるＯｐｔｏｐａｔｃｈは、青色光刺激に際して活動電位を誘発する電圧アクチュエータＣｈｅＲｉｆｆおよび膜電位の変化の結果として近赤外蛍光発光を生成する電圧レポーターＱｕａｓＡｒの発現に依存する。これらの２つの成分の各々は、レポーター発現レベルおよび膜輸送を監視するために使用される蛍光タンパク質に融合される。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ性質決定時に、ニューロン調製物中での、ＣｈｅＲｉｆｆに融合された蛍光レポーターｍＯｒａｎｇｅ２およびＱｕａｓＡｒに融合したＣｉｔｒｉｎｅの堅牢かつニューロン特異的な発現が観察される。
【0148】
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ測定は、本明細書に記載されているように、特注の超広視野蛍光顕微鏡で行われる。このプラットフォームを使用して、それぞれＡＭＰＡ、ＮＭＤＡおよびＧＡＢＡ電流を遮断するためのシナプス遮断薬ＮＢＱＸ、Ｄ－ＡＰ５およびガバジンの存在下で、ＤＩＶ２５における１１ａおよび２０ｂ ＮＧＮ２ニューロン培養物について内因性興奮性特性を記録する。増加する強度の３つの５００ｍｓの青色光段階（１、１５および７５ｍＷ／ｃｍ２）とそれに続く直線的に増加する強度の２つの２秒間の傾斜（０．５～１０ｍＷ／ｃｍ２および０．５～１１０ｍＷ／ｃｍ２）の仕様変更した青色光刺激プロトコルを使用して、個々のニューロンから一定範囲の活動を誘発する。約５０～１００個のニューロンが同時に刺激され、単一の視野で記録される。
【0149】
高い信号雑音比（ＳＮＲ）の蛍光－時間トレースが生成され、活動電位を高い忠実度で検出することができる。個々の活動電位が数百のニューロンのそれぞれについて検出され、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈで記録され、各列は単一のニューロンを表し、各ドットは検出されたスパイクを表すスパイクラスタープロットにプロットされる。個々のニューロンは刺激プロトコル全体を通してスパイク挙動の多様性を示すが、集団の平均発火率は両細胞株で著しく類似している。
【0150】
これらのデータは、凍結保存され、その後解凍される電気生理学的に活性な細胞を生成する上での、２つの細胞株間でのニューロン生産の全体的な一貫性を実証する。
【0151】
スパイク幅を増加させ、スパイク活性を低下させることが報告されている、十分に特徴付けられた化合物であるキニジンを使用してＮＧＮ２ニューロンにおける薬理学的調節を検出することについての興奮性アッセイの感度を試験する。予想される効果と一致して、ＮＧＮ２ニューロンへのキニジンの急性添加は、スパイク波形および発火率の両方に劇的な変化をもたらす。これらの変化は、１０μＭおよび３０μＭキニジンで個々のトレースにおいて観察することができる。異なる濃度のキニジンで処理されたニューロン培養物の平均発火率をビヒクルで処理された培養物の平均発火率と比較すると、青色光刺激の増加に伴って、スパイク率の劇的な低下が示される。
【0152】
Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ興奮性アッセイを使用して、キニジンおよびレチガビンに対する応答の両方のさらなる定量化を決定する。キニジンは、２つの細孔形成チャネルならびに電圧開口型Ｎａ＋チャネルを含む、いくつかの電位、Ｎａ＋およびＣａ＋＋開口型カリウムチャネル（ＫＮａ１．１、ＫＣａ５．１、Ｋ２Ｐ１６．１、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．７、Ｋｖ１０．１、Ｋｖ１０．２）を遮断することが報告されている。ＫＮａ１．１をコードするＫＣＮＴ１遺伝子は、出発ｉＰＳ細胞株と比較してＮＧＮ２ニューロンにおいて検出可能な発現レベルを示す。キニジンの複雑な薬理学的活性は、スパイクの濃度依存的な広がりを引き起こす。
【0153】
いずれも試験した最大濃度（３０μＭ）において、スパイク幅（活動電位の基部から測定）が増加し、スパイク上昇時間（活動電位の開始からピークまで測定）が増加し、過分極後（ＡｈＰ）深度の最大までの時間が増加し、ＡｈＰ深度の大きさ（活動電位前のベースライン蛍光から測定）が減少する。より高い刺激強度（１５および７５ｍＷ／ｃｍ２）では、スパイク速度の濃度依存性低下も観察される。
【0154】
レチガビンは、低マイクロモル濃度およびナノモル濃度範囲（例えば、Ｋｖ７．３ ＥＣ５０６．３１×１０－７Ｍ；Ｋｖ７．２ ２．５×１０－６Ｍ）に有効濃度を有するＫｖ７．２／３／４／５カリウムチャネルの活性化剤である。ＮＧＮ２ニューロンのレチガビンでの処理は、反復性のスパイクおよびバースト発生に対するブレーキとして作用する増強されたＭ電流を介して、後過分極後の深まりをもたらす。Ｍ電流のこの調節的役割と一致して、１５および７５ｍＷ／ｃｍ２の刺激強度でのスパイク頻度の濃度依存的低下が観察される。レチガビンの最高濃度（３０μＭ）およびピーク強度（７５ｍＷ／ｃｍ２）では、スパイク頻度が低下する。
【0155】
ＮＧＮ２ニューロンにおけるＫＣＮＱ２およびＫＣＮＱ３転写物の検出可能な発現レベルは、レチガビンの強い薬理学的効果と一致する。全体として、ｑＰＣＲおよびＯｐｔｏｐａｔｃｈ興奮性アッセイの結果は、ＮＧＮ２ニューロンにおいて発現されるイオンチャネル標的を介したキニジンおよびレチガビンの両方からの薬理学的調節の検出と一致している。
参照による組み入れ
参照による組み入れ
【0156】
特許、特許出願、特許公報、学術誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書の参照および引用が、本開示を通じて為されている。このようなすべての文書は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
均等物
均等物
【0157】
本明細書で示され、記述されるものに加えて、本発明の種々の改変および多くのそのさらなる態様が、本明細書で引用される科学的文献および特許文献への参照を含む本文書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題には、その種々の態様およびその均等物において、本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスが含まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】