特表 2024-523367 広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20240621BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240621BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20240621BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z

C12N1/21

C07K1/22

C12P21/02 A

A61K38/16

A61K48/00

A61P31/04

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577668

(86)(22)【出願日】2022-06-24

(85)【翻訳文提出日】2024-02-08

(86)【国際出願番号】 CN2022100968

(87)【国際公開番号】W WO2023279983

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】202110760643.6

(32)【優先日】2021-07-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520266513

【氏名又は名称】中国科学院武漢病毒研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100183564

【弁理士】

【氏名又は名称】西村 伸也

(72)【発明者】

【氏名】危宏平

(72)【発明者】

【氏名】楊航

(72)【発明者】

【氏名】李唱唱

(72)【発明者】

【氏名】余軍平

(72)【発明者】

【氏名】蒋夢薇

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG30

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA02

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA19

4C084BA20

4C084BA23

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZB351

4C084ZB352

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045DA83

4H045EA29

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用を提供する。前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りであり、前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りである。前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りであり、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りである。前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、インビトロで、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対し良好な溶解効果を有し、グラム陰性菌を広域的に溶解可能である。且つ、前記リシンＬｙｓＰ５３は大腸菌内で可溶性発現が可能であって、酵素の活性が高い。よって、前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、抗感染系薬の研究開発において優れた応用可能性を有している。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４において、
前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りであることを特徴とする抗菌ペプチドＰ１０４。

【請求項2】

前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りであることを特徴とする請求項１に記載の広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４。

【請求項3】

広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３において、
前記リシンＬｙｓＰ５３は請求項１に記載の抗菌ペプチドＰ１０４を含み、前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りであることを特徴とするリシンＬｙｓＰ５３。

【請求項4】

前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りであることを特徴とする請求項３に記載の広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３。

【請求項5】

前記リシンＬｙｓＰ５３のヌクレオチド配列を増幅するプライマーの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す通りであることを特徴とする請求項３又は４に記載の広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３。

【請求項6】

請求項４に記載のリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を含む組換え発現ベクターにおいて、
前記組換え発現ベクターは原核生物発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３であることを特徴とする組換え発現ベクター。

【請求項7】

請求項６に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞において、
前記宿主細胞は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする宿主細胞。

【請求項8】

前記リシンＬｙｓＰ５３の調製方法は、
Ｓ１：バクテリオファージＰ５３のゲノムからリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を増幅し、
Ｓ２：前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現させる組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を構築し、
Ｓ３：前記組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに形質転換し、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現する操作菌をスクリーニングし、
Ｓ４：ＩＰＴＧを用いて発現を誘導し、組換え遺伝子の発現産物を取得し、
Ｓ５：組換え遺伝子の発現産物をニッケルカラムで精製・分離することで、前記リシンＬｙｓＰ５３を取得する、
とのステップを含むことを特徴とする請求項３又は４に記載の広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３。

【請求項9】

グラム陰性菌の溶解における請求項１に記載の広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４及び／又は請求項３に記載の広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３の応用。

【請求項10】

前記グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌のうちのいくつかを含むことを特徴とする請求項９に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、具体的には、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

かつて、抗生物質は、細菌感染性疾患を治療するための最も有力な武器と考えられていたが、抗生物質の濫用が日々深刻化するにつれて、細菌の薬剤耐性の問題も深刻さを増している。ところが、薬剤耐性菌の発生速度に比べて、新抗生物質の研究開発速度は遥かに遅れを取っている。また、代替可能な新抗生物質は数が極めて少なく、費用も高騰することから、臨床では多くの薬剤耐性菌感染者が手の施しようもなく死亡している。こうした抗生物質に対する厳しい薬剤耐性の作用下において、抗生物質に代わって新型の抗菌剤となり得るバクテリオファージが国内外の学者の注目を集めている。

【0003】

バクテリオファージとは、微生物（細菌、真菌、放線菌又はスピロヘータ）を宿主とするウイルスの一種である。バクテリオファージは、細胞構造を有さず、ヌクレオカプシドタンパク質とその内部の遺伝物質のみで構成されており、複製及び増殖を宿主に依存せねばならない。バクテリオファージは、細菌のナチュラルキラーとして自然界に広く存在しており、地球上で最も豊富且つ多様な生物体とされている。また、バクテリオファージの数は細菌のおよそ１０倍である。ほぼ１世紀余りにわたり、バクテリオファージ療法の安全性と有効性は多くの動物実験において実証されてきた。溶菌性ファージは、宿主細菌の細胞に感染すると直ちに自身の初期遺伝子の発現を開始し、これら初期遺伝子の発現産物によって宿主のＤＮＡを分解する。そして、これにより宿主の遺伝子発現を停止させ、宿主のＤＮＡ複製装置を奪って自身の核酸を大量に合成する。十分なバクテリオファージが発生したあとは、これらの核酸が鋳型となって大量のバクテリオファージの構造タンパク質が産生される。これらの構造タンパク質は、バクテリオファージのゲノムを加工及び封入して次世代のバクテリオファージ粒子を産生する。バクテリオファージの調節タンパク質が一定のレベルまで蓄積されると、バクテリオファージのパーフォリンが大量に発現する。そして、パーフォリンが宿主細胞内に孔を形成することで、バクテリオファージのリシンが内膜を貫通して細胞壁に接近し、細胞壁を溶解する。これにより、細菌を溶解するとの目的が達成される。

【0004】

完成されたバクテリオファージ粒子が抗菌剤となり得るほか、バクテリオファージがコードするペプチドグリカン加水分解酵素（リシン（ｌｙｓｉｎ））もまた開発の潜在力に極めて優れた新型の抗菌分子の一つとなる。リシンとは、２本鎖ＤＮＡバクテリオファージが宿主への感染後期にコードする加水分解酵素の一種であり、細菌細胞壁のペプチドグリカンを加水分解することで、細菌を溶解して子孫バクテリオファージを放出可能とする。グラム陽性菌に対するリシンには比較系及び成熟した研究が存在し、動物感染モデルにおいて多くの天然型リシン及びキメラ型リシンの安全性及び有効性が実証されている。中でも、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染に対する複数のリシンはすでに臨床試験段階に進んでいる。リシンは、高効率性、特異性、低薬剤耐性及び従来の抗生物質とのシナジー効果等の優位性から、将来性に極めて優れた新たな抗菌薬となっている。

【0005】

現在のところ、バクテリオファージのリシンは、例えば、黄色ブドウ球菌、リステリア菌及び腸球菌等のグラム陽性菌の溶解に主に応用されており、グラム陰性菌に対して溶解活性を有するバクテリオファージのリシンについては研究が少ない。よって、グラム陰性菌に対し高効率の溶解活性を有する新たなバクテリオファージのリシンを開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、従来技術の瑕疵を解消するために、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用を提供することである。前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、インビトロで、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対し良好な溶解効果を有し、グラム陰性菌を広域的に溶解可能である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の目的の一つは、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４を提供することである。

【0008】

広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４において、前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りである。

【0009】

更に、前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りである。

【0010】

本発明のもう一つの目的は、広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３を提供することである。

【0011】

広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３において、前記リシンＬｙｓＰ５３は上記抗菌ペプチドＰ１０４を含む。前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りである。

【0012】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りである。

【0013】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３のヌクレオチド配列を増幅するプライマーの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す通りである。

【0014】

本発明は、更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0015】

前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を含む組換え発現ベクターにおいて、前記組換え発現ベクターは原核生物発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３である。

【0016】

本発明は、更に、前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0017】

前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞において、前記宿主細胞は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。

【0018】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の調製方法は以下のステップを含む。

【0019】

Ｓ１：バクテリオファージＰ５３のゲノムからリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を増幅する。

【0020】

Ｓ２：前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現させる組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を構築する。

【0021】

Ｓ３：前記組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに形質転換し、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現する操作菌をスクリーニングする。

【0022】

Ｓ４：ＩＰＴＧを用いて発現を誘導し、組換え遺伝子の発現産物を取得する。

【0023】

Ｓ５：組換え遺伝子の発現産物をニッケルカラムで精製・分離することで、前記リシンＬｙｓＰ５３を取得する。

【0024】

最後に、本発明は、グラム陰性菌の溶解における広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４及び／又は広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３の応用を提供する。

【0025】

更に、前記グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌のうちのいくつかを含む。

【発明の効果】

【0026】

従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。

【0027】

本発明は、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４と、広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３を提供する。前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、インビトロで、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対し良好な溶解効果を有し、グラム陰性菌を広域的に溶解可能である。且つ、前記リシンＬｙｓＰ５３は大腸菌内で可溶性発現が可能であって、酵素の活性が高い。よって、前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、抗感染系薬の研究開発において優れた応用可能性を有している。

【0028】

本発明の実施例の技術方案について更に明瞭に説明するために、以下に、実施例の記載において使用を要する図面につき簡単に述べる。なお、言うまでもなく、以下で記載する図面は本発明の一部の実施例にすぎず、当業者であれば、創造的労働を要さないことを前提にこれらの図面から更にその他の図面を得ることも可能である。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、本発明の実施例１における抗菌ペプチドＰ１０４をクロマトグラフィーにかけた際の純度の図である。

【図2】図２は、本発明の実施例２におけるリシンＬｙｓＰ５３を精製したあとのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの図である。

【図3】図３は、本発明の実施例３におけるリシンＬｙｓＰ５３でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の経時変化の結果の図である。

【図4】図４は、本発明の実施例４におけるリシンＬｙｓＰ５３で異なる成長期のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果の図である。

【図5】図５は、本発明の実施例５におけるリシンＬｙｓＰ５３により異なるｐＨでＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果の図である。

【図6】図６は、本発明の実施例６におけるリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果の図である。

【図7】図７は、本発明の実施例７におけるリシンＬｙｓＰ５３により異なるＥＤＴＡ濃度でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を死滅させた際の活性結果の図である。

【図8】図８は、本発明の実施例８におけるリシンＬｙｓＰ５３によりマウスの皮膚表面でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を死滅させた際の活性結果の図である。

【図9】図９は、本発明の実施例８における抗菌ペプチドＰ１０４及びリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果の図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下では、本発明の実施例における図面を組み合わせて、本発明の実施例の技術方案につき明瞭簡潔に述べる。なお、言うまでもなく、記載する実施例は本発明の一部の実施例にすぎず、全ての実施例ではない。当業者が本発明の実施例に基づいて創造的労働を要さないことを前提に取得するその他全ての実施例は、いずれも本発明の保護の範囲に属する。

【0031】

特に説明がない場合、本発明で使用した試薬、グラム陰性菌株及び機器はいずれも市販のものから取得可能である。

【0032】

特に説明がない場合、本発明で使用した実験方法はいずれも一般的な実験方法である。また、使用したプライマー、シーケンシング操作はいずれも上海生工生物技術有限公司で完成され、抗菌ペプチドＰ１０４は上海強耀生物科技公司で合成された。

【0033】

本発明における抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列及びリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列は、バクテリオファージＰ５３のゲノムから取得した。当該ゲノム配列は、登録番号ＭＷ５９０６９８としてＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のウェブサイトにアップロードされている。

【0034】

実施例１ 抗菌ペプチドＰ１０４の合成

【0035】

発明者は、大量の実験及び分析を通じて、バクテリオファージＰ５３のゲノムから抗菌ペプチドＰ１０４を探し出した。前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りであり、前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りであった。前記抗菌ペプチドＰ１０４は上海強耀生物科技公司により合成された。合成された抗菌ペプチドＰ１０４は、純度が９８．５８％、分子量が３８８５．５７であった。前記抗菌ペプチドＰ１０４の純度は高速液体クロマトグラフィーで測定した。抗菌ペプチドＰ１０４をクロマトグラフィーにかけた際の純度の図については図１を参照する。また、その分析結果については下記の表１の通りとなった。

【0036】

【表1】

【0037】

前記高速液体クロマトグラフィーの液相条件は次の通りであった。

【0038】

クロマトグラフィーカラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００－５－Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）。

【0039】

移動相：移動相Ａを０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液、移動相Ｂを０．１％ＴＦＡ水溶液としてグラジエント溶離を行った。グラジエント溶離については表２を参照する。また、流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を２５℃、注入量を１０μＬ、検出波長を２２０ｎｍとした。

【0040】

【表2】

【0041】

実施例２ リシンＬｙｓＰ５３の発現及び精製

【0042】

発明者は、大量の実験及び分析を通じて、バクテリオファージＰ５３のゲノムからリシンＬｙｓＰ５３を探し出した。前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りであり、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りであった。

【0043】

２．１ 組換え発現ベクターの構築

【0044】

リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列に基づき、従来技術において一般的なプライマー設計ソフトを用いて以下のようなプライマー配列を設計した。

【0045】

５３Ｐ３７－Ｆ：ｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す通り。ＮｃｏＩ酵素切断部位を有する）。

【0046】

５３Ｐ３７－Ｒ：ｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇＣＣＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す通り。ＸｈｏＩ酵素切断部位を有する）。

【0047】

標的遺伝子断片は、バイオ企業により合成してもよいし、バクテリオファージＰ５３のゲノムを鋳型として標的遺伝子の増幅を行ってもよいが、本発明ではバクテリオファージＰ５３のゲノムを鋳型として標的遺伝子の増幅を行った。前記増幅系は５０μＬの反応系であり、具体的には、５μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、４μＬのｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２μＬの５３Ｐ３７－Ｆ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、２μＬの５３Ｐ３７－Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、０．５μＬの鋳型ＤＮＡ、０．２μＬのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、３６．３μＬのｄｄＨ２０を成分として含んでいた。

【0048】

ＰＣＲ反応の条件：９８℃で予備変形５ｍｉｎ、９８℃で変性１０ｓ、５５℃でアニーリング１５ｓ、７２℃で伸張５０ｓを３０サイクル実施し、７２℃で５ｍｉｎ伸張させた。反応終了後は、ＰＣＲ増幅産物について、アガロースゲル電気泳動検出、精製、配列検証を行ったあと、ＮｃｏＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて酵素切断を行った。そして、同じＮｃｏＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素で酵素切断を行ったベクターｐＥＴ２８ａと結合することで、組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を取得した。その後、組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、陽性クローンを選択して配列検証を行った。

【0049】

２．２ リシンＬｙｓＰ５３の発現及び精製

【0050】

５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬのＬＢ培地において、配列が正しく且つｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＯＤ６００が０．５～０．６となるまで培養したあと、０．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（サーモサイエンティフィック社）を用いて１６ｈ誘導した。その後、４℃、８０００ｒｐｍとの条件で１０ｍｉｎ遠心分離にかけて細胞を収集してから、２０ｍＭイミダゾールで１回洗浄し、２０ｍＭイミダゾールに再懸濁させた。細胞は細胞破砕機により氷上で破砕し、４℃、８０００ｒｐｍとの条件で２０ｍｉｎ遠心分離にかけた。そして、０．２２μｍのメンブレンフィルタを用いて上清液を濾過したあと、ニッケルカラムを通過させてアフィニティークロマトグラフィーを行うことで、２５０ｍＭイミダゾールで溶離された断片を収集した。これを４℃の条件下で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）内に置き、一晩透析することで、前記リシンＬｙｓＰ５３を取得した。前記リシンＬｙｓＰ５３を精製したあとのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの図については図２を参照する。

【0051】

図２から明らかなように、前記リシンＬｙｓＰ５３の大きさは約２４ｋＤａであった。

【0052】

実施例３ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性における時間の影響

【0053】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃の条件下で培養し、異なるタイミングでそれぞれサンプリングしてから、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図３を参照する。

【0054】

図３の結果から明らかなように、培養から１５ｍｉｎ後に、実験群のアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７は大幅に減少し、培養から１ｈ後には、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の濃度は１０ｃｆｕ／ｍｌまで低下した。結果より、リシンＬｙｓＰ５３はアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対し良好な溶解活性を有することが示された。

【0055】

実施例４ 異なる成長期のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性の結果

【0056】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）及び定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図４を参照する。

【0057】

図４の結果から明らかなように、対数期のアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高かった。

【0058】

実施例５ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性におけるｐＨの違いの影響

【0059】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物をｐＨの異なる上記緩衝液（ｐＨ５～８）に再懸濁させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図５を参照する。

【0060】

図５の結果から明らかなように、ｐＨが５．０～６．５の場合に、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高くなり、菌液濃度は１０ｃｆｕ／ｍｌまで低下した。また、溶液のｐＨが上昇するにつれて（７．０～８．０）、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性は低下した。結果より、リシンＬｙｓＰ５３は、酸性条件においてアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対する溶解活性がより高くなることが示された。

【0061】

実施例６ リシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果

【0062】

複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌の菌株を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）となるまで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図６を参照する。

【0063】

図６の結果から明らかなように、リシンＬｙｓＰ５３は、複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対しいずれも良好な溶解効果を有していた。結果より、リシンＬｙｓＰ５３はグラム陰性菌の溶解について広域性を有することが示された。

【0064】

実施例７ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性におけるＥＤＴＡ濃度の違いの影響

【0065】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合してから、ＥＤＴＡを終濃度がそれぞれ０μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭとなるまで添加した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃の条件下で培養し、異なるタイミングでそれぞれサンプリングしてから、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図７を参照する。

【0066】

図７の結果から明らかなように、ＥＤＴＡの濃度が高くなるにつれて、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高くなった。結果より、ＥＤＴＡはリシンＬｙｓＰ５３によるアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の溶解に対し顕著な促進作用を有することが示された。

【0067】

実施例８ リシンＬｙｓＰ５３によりマウスの皮膚表面でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果

【0068】

６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを腹腔注射して麻酔をかけたあと、電気カミソリで背部の２ｃｍ２を剃毛した。そして、露出した皮膚を６５℃の水中に１２ｓ曝露することで部分的に熱傷を負わせることができた。次に、濃度１０８ＣＦＵ／ｍｌのアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を１０μＬ採取して熱傷部位に接種し、２４ｈ定着させてから、マウスをランダムに３群に分けた。第１群のマウスは１２匹であり、各マウスの熱傷部位に１４μｇのリシンＬｙｓＰ５３を付与した。第２群のマウスは１２匹であり、各マウスの熱傷部位に４μｇのミノサイクリンを付与した。第３群のマウスは９匹であり、各マウスの熱傷部位に等量の緩衝液を付与した。治療から４時間後に、マウスを頸椎脱臼させて殺処分し、皮膚を採取した。感染した皮膚を切り取り、０．１％トリトンＸ－１００を含有する１ｍｌのＰＢＳＴを用いて２分間浸潤させてから、組織細胞破砕機（ＮｅｗＺｏｎｇＫｅ社、武漢）を用いて組織のホモジネートを行った。そして、これを希釈し、４μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２μｇ／ｍｌのメロペネムを含有するＬＢプレートに塗布して、一晩培養したあとカウントした。以上により得られた結果について図８を参照する。

【0069】

図８の結果から明らかなように、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はミノサイクリンよりも高く、両者の間には有意な差があった。

【0070】

実施例９ 抗菌ペプチドＰ１０４及びリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果

【0071】

複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌の菌株を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）となるまで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３及び実施例１で調製した抗菌ペプチドＰ１０４を取り、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４の終濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液とそれぞれ混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図９を参照する。

【0072】

図９の結果から明らかなように、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４はアシネトバクター・バウマニに対する溶解活性がより強く、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌のいずれに対しても一定の溶解効果を有していた。結果より、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４はグラム陰性菌の溶解について広域性を有することが示された。

【0073】

以上の実施例は本発明の具体的実施形態にすぎず、本発明の技術方案を説明するためのものであって、制限するものではない。本発明の保護の範囲はこれに限らず、上記の実施例を参照して本発明につき詳細に説明したものの、当業者は以下の点を理解すべきである。即ち、当業者は、本発明が開示する技術範囲において、上記の実施例に記載した技術方案を修正可能である。或いは、容易に変形を想到したり、一部の技術的特徴について同等の置き換えを行ったりすることが可能である。しかし、これらの修正、変形又は置き換えは、対応する技術方案の本質を本発明の実施例の技術方案における精神及び範囲から逸脱させることはなく、いずれも本発明の保護の範囲内に網羅されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-02-26

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオ医薬品の分野に属し、具体的には、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

かつて、抗生物質は、細菌感染性疾患を治療するための最も有力な武器と考えられていたが、抗生物質の濫用が日々深刻化するにつれて、細菌の薬剤耐性の問題も深刻さを増している。ところが、薬剤耐性菌の発生速度に比べて、新抗生物質の研究開発速度は遥かに遅れを取っている。また、代替可能な新抗生物質は数が極めて少なく、費用も高騰することから、臨床では多くの薬剤耐性菌感染者が手の施しようもなく死亡している。こうした抗生物質に対する厳しい薬剤耐性の作用下において、抗生物質に代わって新型の抗菌剤となり得るバクテリオファージが国内外の学者の注目を集めている。

【0003】

バクテリオファージとは、微生物（細菌、真菌、放線菌又はスピロヘータ）を宿主とするウイルスの一種である。バクテリオファージは、細胞構造を有さず、ヌクレオカプシドタンパク質とその内部の遺伝物質のみで構成されており、複製及び増殖を宿主に依存せねばならない。バクテリオファージは、細菌のナチュラルキラーとして自然界に広く存在しており、地球上で最も豊富且つ多様な生物体とされている。また、バクテリオファージの数は細菌のおよそ１０倍である。ほぼ１世紀余りにわたり、バクテリオファージ療法の安全性と有効性は多くの動物実験において実証されてきた。溶菌性ファージは、宿主細菌の細胞に感染すると直ちに自身の初期遺伝子の発現を開始し、これら初期遺伝子の発現産物によって宿主のＤＮＡを分解する。そして、これにより宿主の遺伝子発現を停止させ、宿主のＤＮＡ複製装置を奪って自身の核酸を大量に合成する。十分なバクテリオファージが発生したあとは、これらの核酸が鋳型となって大量のバクテリオファージの構造タンパク質が産生される。これらの構造タンパク質は、バクテリオファージのゲノムを加工及び封入して次世代のバクテリオファージ粒子を産生する。バクテリオファージの調節タンパク質が一定のレベルまで蓄積されると、バクテリオファージのパーフォリンが大量に発現する。そして、パーフォリンが宿主細胞内に孔を形成することで、バクテリオファージのリシンが内膜を貫通して細胞壁に接近し、細胞壁を溶解する。これにより、細菌を溶解するとの目的が達成される。

【0004】

完成されたバクテリオファージ粒子が抗菌剤となり得るほか、バクテリオファージがコードするペプチドグリカン加水分解酵素（リシン（ｌｙｓｉｎ））もまた開発の潜在力に極めて優れた新型の抗菌分子の一つとなる。リシンとは、２本鎖ＤＮＡバクテリオファージが宿主への感染後期にコードする加水分解酵素の一種であり、細菌細胞壁のペプチドグリカンを加水分解することで、細菌を溶解して子孫バクテリオファージを放出可能とする。グラム陽性菌に対するリシンには比較系及び成熟した研究が存在し、動物感染モデルにおいて多くの天然型リシン及びキメラ型リシンの安全性及び有効性が実証されている。中でも、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染に対する複数のリシンはすでに臨床試験段階に進んでいる。リシンは、高効率性、特異性、低薬剤耐性及び従来の抗生物質とのシナジー効果等の優位性から、将来性に極めて優れた新たな抗菌薬となっている。

【0005】

現在のところ、バクテリオファージのリシンは、例えば、黄色ブドウ球菌、リステリア菌及び腸球菌等のグラム陽性菌の溶解に主に応用されており、グラム陰性菌に対して溶解活性を有するバクテリオファージのリシンについては研究が少ない。よって、グラム陰性菌に対し高効率の溶解活性を有する新たなバクテリオファージのリシンを開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、従来技術の瑕疵を解消するために、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４、リシンＬｙｓＰ５３及びその応用を提供することである。前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、インビトロで、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対し良好な溶解効果を有し、グラム陰性菌を広域的に溶解可能である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の目的の一つは、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４を提供することである。

【0008】

広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４において、前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りである。

【0009】

更に、前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りである。

【0010】

本発明のもう一つの目的は、広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３を提供することである。

【0011】

広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３において、前記リシンＬｙｓＰ５３は上記抗菌ペプチドＰ１０４を含む。前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りである。

【0012】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りである。

【0013】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３のヌクレオチド配列を増幅するプライマーの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す通りである。

【0014】

本発明は、更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0015】

前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を含む組換え発現ベクターにおいて、前記組換え発現ベクターは原核生物発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３である。

【0016】

本発明は、更に、前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0017】

前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞において、前記宿主細胞は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。

【0018】

更に、前記リシンＬｙｓＰ５３の調製方法は以下のステップを含む。

【0019】

Ｓ１：バクテリオファージＰ５３のゲノムからリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を増幅する。

【0020】

Ｓ２：前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現させる組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を構築する。

【0021】

Ｓ３：前記組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに形質転換し、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子を発現する操作菌をスクリーニングする。

【0022】

Ｓ４：ＩＰＴＧを用いて発現を誘導し、組換え遺伝子の発現産物を取得する。

【0023】

Ｓ５：組換え遺伝子の発現産物をニッケルカラムで精製・分離することで、前記リシンＬｙｓＰ５３を取得する。

【0024】

最後に、本発明は、グラム陰性菌の溶解における広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４及び／又は広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３の応用を提供する。

【0025】

更に、前記グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌のうちのいくつかを含む。

【発明の効果】

【0026】

従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。

【0027】

本発明は、広域溶解活性を有する抗菌ペプチドＰ１０４と、広域溶解活性を有するリシンＬｙｓＰ５３を提供する。前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、インビトロで、アシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対し良好な溶解効果を有し、グラム陰性菌を広域的に溶解可能である。且つ、前記リシンＬｙｓＰ５３は大腸菌内で可溶性発現が可能であって、酵素の活性が高い。よって、前記抗菌ペプチドＰ１０４及び前記リシンＬｙｓＰ５３は、抗感染系薬の研究開発において優れた応用可能性を有している。

【0028】

本発明の実施例の技術方案について更に明瞭に説明するために、以下に、実施例の記載において使用を要する図面につき簡単に述べる。なお、言うまでもなく、以下で記載する図面は本発明の一部の実施例にすぎず、当業者であれば、創造的労働を要さないことを前提にこれらの図面から更にその他の図面を得ることも可能である。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】図１は、本発明の実施例１における抗菌ペプチドＰ１０４をクロマトグラフィーにかけた際の純度の図である。

【図2】図２は、本発明の実施例２におけるリシンＬｙｓＰ５３を精製したあとのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの図である。

【図3】図３は、本発明の実施例３におけるリシンＬｙｓＰ５３でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の経時変化の結果の図である。

【図4】図４は、本発明の実施例４におけるリシンＬｙｓＰ５３で異なる成長期のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果の図である。

【図5】図５は、本発明の実施例５におけるリシンＬｙｓＰ５３により異なるｐＨでＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果の図である。

【図6】図６は、本発明の実施例６におけるリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果の図である。

【図7】図７は、本発明の実施例７におけるリシンＬｙｓＰ５３により異なるＥＤＴＡ濃度でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を死滅させた際の活性結果の図である。

【図8】図８は、本発明の実施例８におけるリシンＬｙｓＰ５３によりマウスの皮膚表面でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を死滅させた際の活性結果の図である。

【図9】図９は、本発明の実施例８における抗菌ペプチドＰ１０４及びリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果の図である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下では、本発明の実施例における図面を組み合わせて、本発明の実施例の技術方案につき明瞭簡潔に述べる。なお、言うまでもなく、記載する実施例は本発明の一部の実施例にすぎず、全ての実施例ではない。当業者が本発明の実施例に基づいて創造的労働を要さないことを前提に取得するその他全ての実施例は、いずれも本発明の保護の範囲に属する。

【0031】

特に説明がない場合、本発明で使用した試薬、グラム陰性菌株及び機器はいずれも市販のものから取得可能である。

【0032】

特に説明がない場合、本発明で使用した実験方法はいずれも一般的な実験方法である。また、使用したプライマー、シーケンシング操作はいずれも上海生工生物技術有限公司で完成され、抗菌ペプチドＰ１０４は上海強耀生物科技公司で合成された。

【0033】

本発明における抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列及びリシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列は、バクテリオファージＰ５３のゲノムから取得した。当該ゲノム配列は、登録番号ＭＷ５９０６９８としてＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のウェブサイトにアップロードされている。

【0034】

実施例１ 抗菌ペプチドＰ１０４の合成

【0035】

発明者は、大量の実験及び分析を通じて、バクテリオファージＰ５３のゲノムから抗菌ペプチドＰ１０４を探し出した。前記抗菌ペプチドＰ１０４のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示す通りであり、前記抗菌ペプチドＰ１０４の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示す通りであった。前記抗菌ペプチドＰ１０４は上海強耀生物科技公司により合成された。合成された抗菌ペプチドＰ１０４は、純度が９８．５８％、分子量が３８８５．５７であった。前記抗菌ペプチドＰ１０４の純度は高速液体クロマトグラフィーで測定した。抗菌ペプチドＰ１０４をクロマトグラフィーにかけた際の純度の図については図１を参照する。また、その分析結果については下記の表１の通りとなった。

【0036】

【表1】

【0037】

前記高速液体クロマトグラフィーの液相条件は次の通りであった。

【0038】

クロマトグラフィーカラム：Ｋｒｏｍａｓｉｌ １００－５－Ｃ１８（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ）。

【0039】

移動相：移動相Ａを０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液、移動相Ｂを０．１％ＴＦＡ水溶液としてグラジエント溶離を行った。グラジエント溶離については表２を参照する。また、流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を２５℃、注入量を１０μＬ、検出波長を２２０ｎｍとした。

【0040】

【表2】

【0041】

実施例２ リシンＬｙｓＰ５３の発現及び精製

【0042】

発明者は、大量の実験及び分析を通じて、バクテリオファージＰ５３のゲノムからリシンＬｙｓＰ５３を探し出した。前記リシンＬｙｓＰ５３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示す通りであり、前記リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示す通りであった。

【0043】

２．１ 組換え発現ベクターの構築

【0044】

リシンＬｙｓＰ５３の遺伝子配列に基づき、従来技術において一般的なプライマー設計ソフトを用いて以下のようなプライマー配列を設計した。

【0045】

５３Ｐ３７－Ｆ：ｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃｃａｔｇｇＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示す通り。ＮｃｏＩ酵素切断部位を有する）。

【0046】

５３Ｐ３７－Ｒ：ｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇＣＣＣＣＧＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示す通り。ＸｈｏＩ酵素切断部位を有する）。

【0047】

標的遺伝子断片は、バイオ企業により合成してもよいし、バクテリオファージＰ５３のゲノムを鋳型として標的遺伝子の増幅を行ってもよいが、本発明ではバクテリオファージＰ５３のゲノムを鋳型として標的遺伝子の増幅を行った。前記増幅系は５０μＬの反応系であり、具体的には、５μＬの１０×ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋の濃度が２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、４μＬのｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２μＬの５３Ｐ３７－Ｆ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、２μＬの５３Ｐ３７－Ｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）、０．５μＬの鋳型ＤＮＡ、０．２μＬのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）、３６．３μＬのｄｄＨ２０を成分として含んでいた。

【0048】

ＰＣＲ反応の条件：９８℃で予備変形５ｍｉｎ、９８℃で変性１０ｓ、５５℃でアニーリング１５ｓ、７２℃で伸張５０ｓを３０サイクル実施し、７２℃で５ｍｉｎ伸張させた。反応終了後は、ＰＣＲ増幅産物について、アガロースゲル電気泳動検出、精製、配列検証を行ったあと、ＮｃｏＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて酵素切断を行った。そして、同じＮｃｏＩ制限酵素及びＸｈｏＩ制限酵素で酵素切断を行ったベクターｐＥＴ２８ａと結合することで、組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を取得した。その後、組換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、陽性クローンを選択して配列検証を行った。

【0049】

２．２ リシンＬｙｓＰ５３の発現及び精製

【0050】

５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５００ｍＬのＬＢ培地において、配列が正しく且つｐＥＴ２８ａ－ＬｙｓＰ５３を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＯＤ６００が０．５～０．６となるまで培養したあと、０．５ｍＭイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（サーモサイエンティフィック社）を用いて１６ｈ誘導した。その後、４℃、８０００ｒｐｍとの条件で１０ｍｉｎ遠心分離にかけて細胞を収集してから、２０ｍＭイミダゾールで１回洗浄し、２０ｍＭイミダゾールに再懸濁させた。細胞は細胞破砕機により氷上で破砕し、４℃、８０００ｒｐｍとの条件で２０ｍｉｎ遠心分離にかけた。そして、０．２２μｍのメンブレンフィルタを用いて上清液を濾過したあと、ニッケルカラムを通過させてアフィニティークロマトグラフィーを行うことで、２５０ｍＭイミダゾールで溶離された断片を収集した。これを４℃の条件下で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．８）内に置き、一晩透析することで、前記リシンＬｙｓＰ５３を取得した。前記リシンＬｙｓＰ５３を精製したあとのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの図については図２を参照する。

【0051】

図２から明らかなように、前記リシンＬｙｓＰ５３の大きさは約２４ｋＤａであった。

【0052】

実施例３ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性における時間の影響

【0053】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃の条件下で培養し、異なるタイミングでそれぞれサンプリングしてから、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図３を参照する。

【0054】

図３の結果から明らかなように、培養から１５ｍｉｎ後に、実験群のアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７は大幅に減少し、培養から１ｈ後には、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の濃度は１０ｃｆｕ／ｍｌまで低下した。結果より、リシンＬｙｓＰ５３はアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対し良好な溶解活性を有することが示された。

【0055】

実施例４ 異なる成長期のＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性の結果

【0056】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）及び定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図４を参照する。

【0057】

図４の結果から明らかなように、対数期のアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高かった。

【0058】

実施例５ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性におけるｐＨの違いの影響

【0059】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を対数期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．４～０．６）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物をｐＨの異なる上記緩衝液（ｐＨ５～８）に再懸濁させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図５を参照する。

【0060】

図５の結果から明らかなように、ｐＨが５．０～６．５の場合に、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高くなり、菌液濃度は１０ｃｆｕ／ｍｌまで低下した。また、溶液のｐＨが上昇するにつれて（７．０～８．０）、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性は低下した。結果より、リシンＬｙｓＰ５３は、酸性条件においてアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対する溶解活性がより高くなることが示された。

【0061】

実施例６ リシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果

【0062】

複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌の菌株を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）となるまで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図６を参照する。

【0063】

図６の結果から明らかなように、リシンＬｙｓＰ５３は、複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌に対しいずれも良好な溶解効果を有していた。結果より、リシンＬｙｓＰ５３はグラム陰性菌の溶解について広域性を有することが示された。

【0064】

実施例７ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性におけるＥＤＴＡ濃度の違いの影響

【0065】

アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）まで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３を取り、リシンＬｙｓＰ５３の終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液と混合してから、ＥＤＴＡを終濃度がそれぞれ０μＭ、６２．５μＭ、１２５μＭ、２５０μＭ、５００μＭとなるまで添加した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃の条件下で培養し、異なるタイミングでそれぞれサンプリングしてから、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図７を参照する。

【0066】

図７の結果から明らかなように、ＥＤＴＡの濃度が高くなるにつれて、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はより高くなった。結果より、ＥＤＴＡはリシンＬｙｓＰ５３によるアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の溶解に対し顕著な促進作用を有することが示された。

【0067】

実施例８ リシンＬｙｓＰ５３によりマウスの皮膚表面でＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を溶解した際の活性結果

【0068】

６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールを腹腔注射して麻酔をかけたあと、電気カミソリで背部の２ｃｍ２を剃毛した。そして、露出した皮膚を６５℃の水中に１２ｓ曝露することで部分的に熱傷を負わせることができた。次に、濃度１０８ＣＦＵ／ｍｌのアシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７を１０μＬ採取して熱傷部位に接種し、２４ｈ定着させてから、マウスをランダムに３群に分けた。第１群のマウスは１２匹であり、各マウスの熱傷部位に１４μｇのリシンＬｙｓＰ５３を付与した。第２群のマウスは１２匹であり、各マウスの熱傷部位に４μｇのミノサイクリンを付与した。第３群のマウスは９匹であり、各マウスの熱傷部位に等量の緩衝液を付与した。治療から４時間後に、マウスを頸椎脱臼させて殺処分し、皮膚を採取した。感染した皮膚を切り取り、０．１％トリトンＸ－１００を含有する１ｍｌのＰＢＳＴを用いて２分間浸潤させてから、組織細胞破砕機（ＮｅｗＺｏｎｇＫｅ社、武漢）を用いて組織のホモジネートを行った。そして、これを希釈し、４μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２μｇ／ｍｌのメロペネムを含有するＬＢプレートに塗布して、一晩培養したあとカウントした。以上により得られた結果について図８を参照する。

【0069】

図８の結果から明らかなように、アシネトバクター・バウマニ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７に対するリシンＬｙｓＰ５３の溶解活性はミノサイクリンよりも高く、両者の間には有意な差があった。

【0070】

実施例９ 抗菌ペプチドＰ１０４及びリシンＬｙｓＰ５３によりインビトロで異なるグラム陰性菌の菌株を溶解した際の広域性の結果

【0071】

複数種類のアシネトバクター・バウマニ、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌の菌株を定常期（ＯＤ６００ｎｍ＝１．２～１．４）となるまで培養し、低温で遠心分離にかけて沈殿物を収集したあと、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で１回洗浄した。そして、洗浄後の沈殿物を上記緩衝液に溶解させて、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＷＨＧ４０１３７の菌液を取得した。次に、実施例２で調製したリシンＬｙｓＰ５３及び実施例１で調製した抗菌ペプチドＰ１０４を取り、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４の終濃度がそれぞれ１００μｇ／ｍｌとなるように上記菌液とそれぞれ混合した。また、等量の緩衝液と上記菌液との混合液を陰性対照とした。これらを３７℃で１ｈ培養したあと、セルカウントプレートによるカウントを行った。以上により得られた結果について図９を参照する。

【0072】

図９の結果から明らかなように、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４はアシネトバクター・バウマニに対する溶解活性がより強く、緑膿菌、肺炎桿菌及び大腸菌のいずれに対しても一定の溶解効果を有していた。結果より、リシンＬｙｓＰ５３及び抗菌ペプチドＰ１０４はグラム陰性菌の溶解について広域性を有することが示された。

【0073】

以上の実施例は本発明の具体的実施形態にすぎず、本発明の技術方案を説明するためのものであって、制限するものではない。本発明の保護の範囲はこれに限らず、上記の実施例を参照して本発明につき詳細に説明したものの、当業者は以下の点を理解すべきである。即ち、当業者は、本発明が開示する技術範囲において、上記の実施例に記載した技術方案を修正可能である。或いは、容易に変形を想到したり、一部の技術的特徴について同等の置き換えを行ったりすることが可能である。しかし、これらの修正、変形又は置き換えは、対応する技術方案の本質を本発明の実施例の技術方案における精神及び範囲から逸脱させることはなく、いずれも本発明の保護の範囲内に網羅されるべきである。

【国際調査報告】