特表 2024-523386 アジュバント性及び抗体持続性のメカニズム及び予測因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】アジュバント性及び抗体持続性のメカニズム及び予測因子

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20240621BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240621BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20240621BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 P

A61K39/39

A61K35/76

A61K31/7105

A61P37/04

A61K39/12

A61P31/12

C12Q1/6837 Z

C12Q1/6869 Z

G01N33/48 M

G01N33/53 Y

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577808

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-02-15

(86)【国際出願番号】 US2022033428

(87)【国際公開番号】W WO2022266094

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/210,794

(32)【優先日】2021-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515158308

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100114557

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 英仁

(74)【代理人】

【識別番号】100078868

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 登夫

(72)【発明者】

【氏名】プレンドラン，バリ

(72)【発明者】

【氏名】ヘーガン，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】コルテス，マリオ

(72)【発明者】

【氏名】ウー，シェンヤン

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C085

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045CA24

2G045CA26

2G045DA14

2G045FA37

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR57

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS28

4B063QS34

4B063QX02

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA51

4C085CC08

4C085DD01

4C085DD86

4C085EE06

4C085FF24

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4C086EA16

4C086MA02

4C086NA05

4C086ZB09

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA05

4C087NA05

4C087ZB09

4C087ZB33

(57)【要約】

本明細書では、ワクチンの開発、特性評価、及び検証のための方法が提供される。本明細書に開示される応答シグネチャを使用して、ワクチン用アジュバントを含む、ワクチンの最適化、選択、及びベンチマークのための方法が提供される。方法は、候補ワクチン又はワクチンアジュバントの応答持続性、例えば、抗体応答の寿命の予測、及びベンチマーク参照ワクチンとの類似性の評価を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

候補アジュバントが高性能参照アジュバントと実質的に類似のコア応答を提供するか否かを決定するための方法であって、
前記候補アジュバントを含むワクチンを哺乳動物に投与することと、
免疫細胞からのコア応答シグネチャを決定することと、
発現における１日目の変化によって、前記候補アジュバントが前記コア応答を誘導するか否かを予測することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記コア応答が、ＴＧＭ２、ＡＮＫＲＤ２２、及びＫＲＥＭＥＮ１のうちの１つ以上における発現を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

臨床使用又は開発のための候補アジュバントを選択することを更に含み、前記候補アジュバントが、高性能参照アジュバントと実質的に類似している、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記哺乳動物が、マウス、非ヒト霊長類、又はヒトである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

候補ワクチンに対する免疫応答の持続性を予測するための方法であって、
前記候補ワクチンを哺乳動物に投与することと、
前記哺乳動物における免疫細胞を含む試料からのシグネチャ応答を決定することと、
前記シグネチャ応答から応答の持続性を予測することと
を含む、方法。

【請求項6】

前記候補ワクチンが、アジュバントを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記候補ワクチンが、ｍＲＮＡワクチンである、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記候補ワクチンが、ウイルスベクターワクチンである、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項9】

前記候補ワクチンが、生又は不活性化ウイルスワクチンである、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項10】

前記免疫細胞を含む試料が、前記候補ワクチンの投与の７～１０日後に得られ、前記シグネチャ応答を、ベースライン投与前値と比較する、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記免疫細胞を含む試料が、血小板を含む末梢血単核細胞試料（ＰＢＭＣ）である、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記免疫細胞を含む試料が、血小板リッチ血漿試料である、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

シグネチャ応答を決定することが、血小板ＲＮＡ含有量の一段階フローサイトメトリー分析を含み、血小板ＲＮＡの増加が、持続的応答を予測する、請求項５～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

シグネチャ応答を決定することが、
（ａ）前記試料中に存在する細胞を、前記試料中の他の細胞から血小板を区別する試薬で標識することと、
（ｂ）前記試料中に存在する細胞をＲＮＡ選択的染色で標識することと、
（ｃ）血小板にゲーティングされたフローサイトメトリーによって前記試料を分析し、ＲＮＡ含有量を決定することと
を含む、請求項５～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記試料中の他の細胞から血小板を区別する前記試薬が、ＣＤ４１に特異的な抗体及びＣＤ６１に特異的な抗体を含み、血小板が、ＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記試料中の他の細胞から血小板を区別する前記試薬が、抗ＴＥＲ１１９、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１４、及び抗ＣＤ５６抗体のうちの１つ以上を更に含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

持続的な免疫応答が、ベースラインと比較して、ＲＮＡ含有量の少なくとも約５倍の増加に関連する、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記シグネチャ応答が、ＧＰＲ１５、ＥＰＳ８Ｌ１、ＳＬＣ３８Ａ１、ＧＸＭＭ、ＭＧＬＬ、ＣＴＴＮ、ＸＫ、ＰＦ４、ＳＥＬＰ、ＣＤＨＲ５、ＭＹＬＫ、ＣＡＬＤ１、ＣＸＣＬ９、ＳＤＰＲ、ＳＰＴＢ、ＰＲＯＳ１、ＰＲＫＡＲ２Ｂ、ＰＰＢＰ、ＣＸＣＬ５、ＨＥＭＧＮ、ＥＧＦから選択される１つ以上の遺伝子からの発現レベルデータを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項19】

前記シグネチャ応答が、二次免疫又は一次免疫の約１～７日後、又は約１０日後に得られた試料から決定される、請求項５又は１８に記載の方法。

【請求項20】

臨床使用又は開発のための候補アジュバントを選択することを更に含み、前記候補アジュバントが、持続的な抗体応答を示すシグネチャを誘発する、請求項５～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記哺乳動物が、マウス、非ヒト霊長類、又はヒトである、請求項５～２０のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

２０２０年１２月現在、世界中で８，０００万人以上の症例があり、１７０万人が死亡しているＣＯＶＩＤ－１９は、世界的なパンデミックが公衆衛生に及ぼす深刻な脅威を示している。新規病原体に対する保護免疫を誘導するワクチンを迅速に開発する能力は、そのようなパンデミックを制御及び予防する上で重要である。免疫応答の大きさ、幅、及び持続性を向上させるワクチン成分として、アジュバントは現代のワクチン開発のための強力なツールである。抗原保存を可能にすることによって、アジュバントは、また、パンデミックに対する応答中の重要な要因であるより迅速なワクチン産生を可能にする。

【0002】

７０年以上にわたり、不溶性アルミニウム塩（ミョウバン）が唯一の認可されたアジュバントであったが、過去３０年間で、認可されたワクチンで利用可能なアジュバントが大幅に増加した。これらには、水中油型エマルション系アジュバント（ＭＦ５９、ＡＳ０３）、ＴＬＲ４アゴニスト３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（ＡＳ０１、ＡＳ０４）、及びＴＬＲ９アゴニストＣｐＧオリゴヌクレオチドであるＣｐＧ１０１８を含有するアジュバントが含まれる。ＡＳ０３、ＭＦ５９、及びＣｐＧ１０１８を含むこれらのアジュバントの多くは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンに使用するために所有者によって利用可能にされており、少なくとも１０人の開発者がアジュバントＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを作製する計画を示している。アジュバント技術のこの大幅な成長にもかかわらず、多くの場合、これらのアジュバントがワクチン接種に対する免疫応答を高める分子メカニズムは不明のままである。

【0003】

ＡＳ０３は、α－トコフェロール（ビタミンＥ）を含有するスクアレン系の水中油型エマルションであり、ＭＦ５９と比較しても、複数のインフルエンザ株に対するＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗体応答の幅及び大きさを増加させることが示されている。マウスにおける最近の研究は、ＡＳ０３が、排出リンパ節における脂質代謝関連遺伝子の発現の変化、及びマクロファージにおける増加した小胞体（ＥＲ）ストレスを誘導し、これが、サイトカイン産生の増加及び抗体応答の改善を駆動することを実証した。

【0004】

追加的に、類似の水中油型エマルションベースのアジュバントＭＦ５９は、細胞外ＡＴＰの局所放出を誘導し、インフラマソーム非依存的方式でＭｙＤ８８に機能的に依存することが示されており、これらの種類のアジュバントが、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の放出及び自然免疫応答の誘導をもたらすある程度の細胞損傷又はストレスをもたらすことを示唆している。しかしながら、ＡＳ０３がこれらの応答を促進する分子経路は、依然として定義が不十分である。

【0005】

ワクチン接種に対する最初の免疫応答を高めることに加えて、ＡＳ０３などを含むアジュバントは、また、結果として生じる免疫の寿命を改善することができる。いくつかのワクチン、特に天然痘又は黄熱などの生ウイルスワクチンは、生涯にわたる抗体応答を誘導することができるが、百日咳及びインフルエンザに対するものなどの他のワクチンは、経時的に減少する一過性応答及び免疫を促進するだけであり、その結果、保護の喪失及びブースターワクチンの必要性がもたらされる。体液性免疫に関して、長寿命の形質細胞は、持続的な抗体応答の主要な媒介物として特定されているが、堅牢な長寿命形質細胞分化及びワクチン接種に対する継続的抗体応答を駆動するために必要なメカニズムは、十分理解されていない。

【0006】

天然痘又は黄熱ワクチンなどの弱毒化生ワクチンは、生涯続くことができる持続的な抗体（Ａｂ）応答を誘導するが、免疫の低下は、ＣＯＶＩＤ－１９に対するｍＲＮＡワクチン、並びにインフルエンザ、マラリア、百日咳ボルデテラ、腸炎サルモネラ菌血清型チフス、及び髄膜炎ナイセリア、及び他の病原体に対するサブユニットワクチンを含むいくつかのワクチンに関して報告されている。いくつかのワクチンは生涯保護を提供し、他のワクチンはわずか数ヶ月間しか保護しない理由は、依然として免疫学の大きな謎の１つである。現在、新しいワクチンの免疫保護期間は、ワクチン製品開発中に予測することが困難であり、「様子見」的アプローチによってのみ確認することができる。したがって、ワクチン学の大きな課題は、ワクチン接種から数日以内に誘導され、免疫応答及び保護の持続性を予測する血液中の初期シグネチャ（遺伝子シグネチャ又は細胞ベースのシグネチャ）を定義することによって、ワクチンが保護する期間を予測することができることである。

【発明の概要】

【0007】

ワクチンの開発及び検証のための方法が提供される。本明細書に開示される遺伝子シグネチャを使用して、ワクチン用アジュバントを含む、ワクチンの最適化、及び抗体応答の持続性の予測のための方法が提供される。方法は、候補ワクチン又はワクチンアジュバントの応答持続性、例えば、抗体応答の寿命の予測を含む。目的のワクチンには、例えば、生ウイルスワクチン、サブユニットワクチン、ｍＲＮＡワクチン、ウイルスベクターワクチンなどが含まれる。

【0008】

方法は、免疫化後の短期間、例えば、約１４日未満、約１０日未満、例えば、７日まで又はそれを含む応答の持続性を予測する手段を提供する。この情報は、ワクチンの有効性の迅速なベンチマーク及び層別化を可能にし、評価に必要な時間を短縮するという大きな利点を提供する。

【0009】

一実施形態では、候補ワクチンに対する免疫応答の持続性を予測するための方法が提供され、方法は、アジュバントを含み得る候補ワクチンを哺乳動物に投与することと、免疫細胞、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの初期遺伝子シグネチャを決定することと、初期遺伝子シグネチャからの応答の持続性を予測することとを含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、血小板を含む。いくつかの実施形態では、初期遺伝子シグネチャは、血小板からのｍＲＮＡ含有量によって決定される。いくつかの実施形態では、初期遺伝子シグネチャは、免疫化の約７～約１０日後に決定される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、血漿メタボロミクスの分析は、哺乳動物に対して行われる。いくつかの実施形態では、候補ワクチン又はアジュバントは、より長い抗体寿命を示す初期の遺伝子シグネチャを提供する能力に基づいて、開発のために選択される。

【0010】

一実施形態では、候補ワクチンに対する免疫応答の持続性を予測するための方法が提供され、方法は、アジュバントを含み得る候補ワクチンを哺乳動物に投与することと、ワクチン接種後にレシピエントにおける血小板のＲＮＡ含有量を決定することとを含む。いくつかの実施形態では、血小板のＲＮＡ含有量は、免疫化の約７～約１０日後に決定される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、血小板ＲＮＡ含有量の分析は、フローサイトメトリーによって行われる。血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化は、ワクチン接種前のベースラインレベルと比較することができ、持続的な免疫応答は、ベースラインと比較して少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍の増加に関連付けられる。いくつかの実施形態では、血小板は、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ２０^＋及びＣＤ１４^＋細胞を除外した後のＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋細胞として定義される。いくつかの実施形態では、候補ワクチン又はアジュバントは、より長い抗体寿命を示す血小板ＲＮＡ含有量を増加させる能力に基づいて、開発のために選択される。

【0011】

他の実施形態では、候補アジュバントが標的高性能参照アジュバント、例えば、ＡＳ０３によって特異的に誘導されるコア応答を提供するか否かを決定するための方法が提供される。これらの遺伝子のうちの３つ、ＴＧＭ２、ＡＮＫＲＤ２２、及びＫＲＥＭＥＮ１の発現の１日目の変化を使用することによって、アジュバントの使用が予測された。いくつかの実施形態では、望ましい特性を有する候補アジュバントを選択する方法が提供され、方法は、候補アジュバントを含むワクチンを哺乳動物に投与することと、免疫細胞、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのコア応答シグネチャを決定することと、発現における１日目の変化によって、候補アジュバントがコア応答を誘導するか否かを予測することとを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、候補アジュバントは、ワクチン接種後１日目に高性能コア応答を提供する能力に基づいて、開発のために選択される。

【0012】

アジュバントあり、又はなしで、ワクチンに対する細胞応答、転写応答、及び代謝応答の詳細なマルチオミクス分析が行われ、免疫細胞におけるアジュバントによって特異的に誘導される遺伝子の重要なセットが特定された。これらの遺伝子の経路分析は、アジュバント作用メカニズムにおけるアポトーシスの役割を示し、血漿メタボロミクス分析は、脂質及び脂肪酸代謝におけるアジュバント誘導性撹乱がアポトーシスシグネチャの発現と高度に関連していたことを示した。抗体応答長寿を首尾よく予測することができる初期遺伝子シグネチャは、ワクチン接種者のコホートにおいて得られた。その後の単一細胞プロファイリングは、抗体応答の細胞接着関連持続性を反映する、このシグネチャの主要な駆動因子としての血小板間のＲＮＡ含有量の違いを明らかにした。

【0013】

ワクチン接種後の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）が決定され、大部分のＤＥＧは、プライム及びブースト後の１日目に観察された。ワクチン接種に応答して活性化された特異的経路を特定するために、血液転写モジュール（ＢＴＭ）のセットを使用して、ワクチン接種後の倍数変化によってランク付けされた遺伝子に対して遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を行った。高レベルの機能カテゴリーに従ってＢＴＭ濃縮スコアを併合すると、アジュバントが、プライム後１日目及び７日目に、広範な先天性及び適応性免疫細胞及び経路の発現を増加させ、各免疫化後の初期時点で、単球及び樹状細胞（ＤＣ）の活性化に関連するＢＴＭの強力な濃縮を伴ってワクチン接種を促進し、一方、７日目の応答は、主に、堅牢なＢ細胞及び形質細胞転写応答によって支配されていたことが明らかになった。

【0014】

継続的な抗体応答に関連する転写シグネチャに対して、１００日目／４２日目の残留抗体力価との相関によってランク付けされた遺伝子にＧＳＥＡを行った。プライム後７日目の細胞周期関連モジュール及びブースト後１～７日目の細胞接着／血小板活性化関連モジュールの発現は、継続性の増加と関連付けられた。具体的には、血小板活性化／アクチン結合モジュール内の遺伝子は、抗体継続性との相関において強い一致を示した。

【0015】

定量的及び定性的の両方の転写差は、アジュバントを用いたプライム及びブースト免疫化後の先天性免疫応答において観察された。アジュバントワクチン接種に対するより継続的な抗体応答に関連する細胞移動の血液転写シグネチャが特定され、抗体持続性を首尾よく予測するために使用された。ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析は、減弱抗体応答者が、より継続的な応答者と比較して、第２のワクチン接種後の血小板ＲＮＡ含有量のはるかに急激な減少を示すことを明らかにした。

【0016】

アジュバント及び非アジュバントワクチンデータセットのメタアナリシスを行うことによって、標的アジュバントによって特異的に誘導される共通の遺伝子セットが特定された。これらの遺伝子のうちの３つ、ＴＧＭ２、ＡＮＫＲＤ２２、及びＫＲＥＭＥＮ１の発現の１日目の変化を使用することによって、アジュバントの使用が予測された。「コア」遺伝子の初期転写変化は、ワクチン接種の７日後の末梢における活性化Ｔｆｈ細胞の頻度と強く関連しており、これらの遺伝子が免疫原性のメカニズムに関与していることを示している。

【図面の簡単な説明】

【0017】

本発明は、添付の図面と併せて読む場合に、以下の詳細な説明から最もよく理解される。慣例に従って、図面の様々な特徴が縮尺通りでないことが強調される。逆に、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小される。

【0018】

【図1】ＡＳ０３は、ブースターワクチン接種後にブーストされる強力な初期転写シグネチャを誘導する。Ａは、研究の概要を示す。２１～４５歳の合計５０人の健康な対象を２：１で無作為化し、ＡＳ０３アジュバントあり（ｎ＝３４）又はなし（ｎ＝１６）で投与された、２１日間隔で２回の一価、分割ビリオン、不活性化Ｈ５Ｎ１クレード２．１ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５インフルエンザワクチンを投与した。図に示すように、生物学的試料を収集し、定期的な間隔で分析を行った（灰色の正方形）。Ｂは、アジュバント（オレンジ）及び非アジュバント（緑）対象におけるワクチン接種後のＤＥＧ数（ｐ＜０．０１及びｌｏｇ_２ＦＣ＞０．２）。Ｃ及びＤは、プライム（Ｃ）及びブースト（Ｄ）後の１日目（暗）及び７日目（明）の細胞型／経路別の平均血液転写モジュール（ＢＴＭ）濃縮スコアを示す。Ｅは、プライム（上）及びブースト（下）後１～７日目のインターフェロン関連ＢＴＭの濃縮スコアを示す。Ｆは、プライムとブーストとの間の１日目のアジュバント対象におけるＢＴＭの差次的発現（ＦＤＲ＜０．０３）についての、１日目の倍数変化（ｘ－プライム、ｙ－ブースト）の散布図を示す。ＢＴＭは、凡例に示されるように色分けされる。ＧのＢＴＭ Ｍ１１１．１中の遺伝子；各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４に記載の通り）、色は、プライム（左）及びブースト（右）の後の１日目の倍数変化を表す。Ｈは、プライムとブーストとの間の３日目のアジュバント対象におけるＢＴＭの差異的発現（ＦＤＲ＜０．０３）についての、３日目の倍数変化（ｘ－プライム、ｙ－ブースト）の散布図を示す。ＢＴＭは、凡例に示されるように色分けされる。ＩのＢＴＭ８９．０中の遺伝子；各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し、色は、プライム（左）及びブースト（右）後の３日目の倍数変化を表す。

【図2】アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種は、細胞移動の転写シグネチャに関連する持続性を有する保護性Ｈ５ヘッド指向性抗体応答を促進する。Ａは、アジュバント（オレンジ色）及び非アジュバント（緑色）対象における、Ｈ５Ｎ１Ａ／インドネシアワクチン株に対する、微小中和（ＭＮ）力価を示す。幾何平均は太い線で示され、一方、影は幾何標準偏差（ＳＤ）に対するものである。Ｂは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたＨ５ヘッド：ステムＩｇＧ結合能比を示す。Ｃは、ＳＰＲによって測定された、Ｈ５ヘッド（左）及びステム（右）に対するＩｇＧ親和性における、ワクチン接種後４２日目の倍数変化を示す。Ｄは、ワクチン接種後の活性が、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３（オレンジ）及びＴＩＶ（ピンク）ワクチン応答の両方における抗体継続性と関連するＢＴＭのヒートマップを示す。遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ、ＦＤＲ＜０．０５；１，０００置換）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．２００４）を使用して、事前ランク付けされた遺伝子リスト内のＢＴＭの陽性（赤）、陰性（青）、又は無（灰色）濃縮を特定し、遺伝子を、１００日目の残留と４２日目（Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３）又は１８０日目と２８日目（ＴＩＶ）の抗体応答との相関に従ってランク付けした。Ｅ及びＦのＢＴＭ Ｍ１９６における遺伝子；各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４に記載の通り）、色は、７日目の遺伝子発現と１００日目（Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３、Ｅ）又は１８０日目（ＴＩＶ、Ｆ）の抗体応答残量（陽性－赤色、陰性－青色）ワクチン接種との相関を表す。Ｇは、ＣＣＨＩデータセットにおける実際の１００日目の抗体応答残量対予測された１００日目の抗体応答残量の散布図を示す。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３及びＴＩＶデータセットにおいて、７日目の継続的な抗体応答の転写相関に対して訓練された線形回帰ベースのアプローチを使用して、予測される１００日目の抗体応答残量を生成した。詳細については、方法セクションを参照されたい。Ｈは、７日目の発現が、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３及びＴＩＶデータセットにおける抗体寿命（１００日目又は１８０日目の応答残量）と有意に相関する、Ｇの予測モデルによって選択されるＢＴＭ由来の遺伝子の棒グラフを示す。バーは、両方のデータセットからのメタ相関係数を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。

【図3】ＣＩＴＥｓｅｑ分析は、抗体継続性の転写シグネチャのための血小板起源を明らかにする。Ａは、手動でアノテーションされた細胞型によって着色された、全ての分析された試料（ｎ＝１２、３人の「継続的」及び３人の「減弱」応答者、各対象からの２１日目及び２８日目の試料）からのＰＢＭＣのＵＭＡＰ表現を示す。Ｂは、抗体継続性の予測シグネチャにおける全ての遺伝子（図２Ｈ）についての細胞当たりの発現の合計を示す、全ての分析された試料からのＰＢＭＣのＵＭＡＰ表現。Ｃの左パネルは、継続的応答者及び減弱応答者の間の抗体継続性シグネチャの擬似バルク発現の箱ひげ図を示す。Ｃの右パネルは、所与の細胞クラスタが擬似バルク計算から除外されたときの抗体継続性シグネチャの擬似バルク発現における変化の折れ線グラフを示す。片側の対応がないｔ検定を使用して、群を比較した。Ｄは、第１のワクチン接種後２１日目及び２８日目の、継続的応答者及び減弱応答者における全細胞の血小板画分を示す。Ｅは、第１のワクチン接種後２１日目及び２８日目の、継続的応答者及び減弱応答者における血小板クラスタ内の総読み取りの割合を示す。Ｆは、ワクチン接種後２８日目の形質芽細胞内の継続的応答者と減弱応答者との間のＤＥＦの過剰提示試験（ｐ≦０．０５＆ｆｃ≧０．２５）による、有意に濃縮されたＢＴＭＢＴＭ（ＦＤＲ＜０．０５）の棒グラフを示す。Ｇは、Ｍ２３８、Ｍ２１９、及びＭ２１６（左）、Ｍ４．１（中央）、並びにＭ２５０（右）モジュール内の遺伝子のヒートマップを示す。色は、形質芽細胞内の平均発現の行ごとのｚスコアを表す。

【図4】活性化されたワクチン誘導Ｔｆｈ細胞の血液循環は、中和抗体価及び抗体親和性成熟と相関する。Ａは、ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＰＤ１＋ＩＣＯＳ＋細胞のパーセンテージとして定義される、アジュバント（オレンジ）及び非アジュバント対象（緑）におけるワクチン接種後の活性化Ｔｆｈ細胞の頻度を示す。Ｂは、活性化Ｔｆｈ細胞頻度における２８／２１日目の倍数変化と、ＭＮ力価における４２／２１日目の倍数増加との相関を示す。Ｃは、活性化Ｔｆｈ細胞頻度の２８／２１日目の倍数変化と、Ｈ５ヘッドに対するＩｇＧ親和性の４２／２１日目の倍数増加との相関を示す。Ｄは、非活性化（ＰＤ－１－ＩＣＯＳ－）Ｔｆｈ１（ｘ軸）及びＴｆｈ２（ｙ軸）細胞に対する、活性化（ＰＤ－１＋ＩＣＯＳ＋）細胞における遺伝子の平均ｌｏｇ_２倍数変化を示す。最大の平均絶対倍数変化を有する上位２０個の遺伝子は、赤色で注釈される。Ｅは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを使用した転写プロファイルのデジタルサイトメトリーに基づく、非活性化及び活性化Ｔｆｈにおける単球の推定頻度を示す。ＦのＢＴＭは、活性化Ｔｆｈ細胞対非活性化Ｔｆｈ細胞において有意に濃縮された（ＦＤＲ＜０．０５）。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを使用して、ソートされたＴｆｈ転写プロファイルにおけるＣＤ４ Ｔ細胞特異的発現を推定し、次いで、ＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．２００４）を使用して、活性化Ｔｆｈと非活性化Ｔｆｈとの間のそれらの倍数変化によってランク付けされた遺伝子を用いて濃縮ＢＴＭを特定した。詳細については、方法セクションを参照されたい。Ｇでは、ＢＴＭ Ｍ２１９中の遺伝子；各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４に記載の通り）、色は、活性化Ｔｆｈ対非活性化Ｔｆｈの倍数変化を表す。Ｈでは、ＢＴＭ Ｍ４．２内の遺伝子；各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し、色は、活性化Ｔｆｈ対非活性化Ｔｆｈの倍数変化を表す。Ｉは、活性化Ｔｆｈと非活性化Ｔｆｈとの間の倍数変化による、上位４０個の遺伝子のクラスタ化ヒートマップ。

【図5】初期分子シグネチャは、ブースト後の免疫応答の複数のマーカーに関連付けられる。Ａは、１日目の遺伝子シグネチャと、２８日目の活性化Ｔｆｈ頻度、４２日目のＨ５ヘッドに対するＩｇＧ親和性、及び４２日目の微小中和力価の増加との間の特定された関連を示す概略図を示す。Ｂは、活性化Ｔｆｈ頻度（２８日目）、Ｈ５ヘッドに対するＩｇＧ親和性（４２日目）、及びアジュバント（オレンジ）及び非アジュバント（緑）対象における微小中和力価（４２日目）の、ブースト後の倍数変化の３Ｄ散布図を示す。Ｃは、３つ全てのパラメータ（２８日目の活性化Ｔｆｈ、４２日目のＨ５ヘッドＩｇＧ親和性、及び４２日目のＭＮ力価）と一般的に関連付けられているＢＴＭの棒グラフ（ＦＤＲ＜０．０５）を示す。ＧＳＥＡは、各パラメータとの相関によってランク付けされた遺伝子に対して行われた。Ｄは、各免疫パラメータのブースト後の倍数変化との１日目のＢＴＭ関連性の３Ｄ散布図を示す。軸は、事前にランク付けされた遺伝子リスト内のＢＴＭのＧＳＥＡ濃縮スコアを表し、遺伝子は、各免疫パラメータとのそれらの相関に従ってランク付けされた。Ｅは、１日目の発現が３つ全ての免疫パラメータと有意に相関する（ｐ＜０．００１）遺伝子のヒートマップを示す。色は、１／０日目の倍数変化を表す。

【図6】インフルエンザワクチン試験のメタアナリシスは、末梢における活性化Ｔｆｈ細胞頻度と相関するＡＳ０３特異的転写シグネチャを明らかにする。Ａは、ＡＳ０３特異的遺伝子シグネチャの特定を示す。本試験のプライム及びブースト用量の両方からのデータ、並びにＡＳ０３アジュバントＨ１Ｎ１ワクチン接種に対する応答の以前の研究からの公的に利用可能なデータを組み込み、複数のＴＩＶ試験からの遺伝子発現データとペアワイズで比較した。詳細については、方法セクションを参照されたい。Ｂは、ＡＳ０３アジュバントインフルエンザワクチン試験と非アジュバントインフルエンザワクチン試験との間の全てのペアワイズ比較における、差次的に発現された遺伝子のヒートマップ（（ｐ＜０．００５及びｌｏｇ_２ＦＣ＞０．２）を示す。これらのうち、３つの「コア」遺伝子（ＡＮＫＲＤ２２、ＫＲＥＭＥＮ１、及びＴＧＭ２）は、多数の共相関遺伝子を共有した。Ｃは、独立した試験における、アジュバント（オレンジ色）及び非アジュバント（緑色）ワクチンレシピエントの予測されたアジュバント状態を示す。人工ニューラルネットワークベースの機械学習分類アルゴリズムを、本研究内の「コア」ＡＳ０３特異的遺伝子の１日目の発現データを使用して、ワクチン状態（アジュバント対非アジュバント）を予測するために訓練し、ＡＳ０３あり、又はなしでのＨ５Ｎ１ワクチン接種に対する応答の以前に発表された研究からの発現データを含む独立したデータセットで試験した。ドットプロットは、１０の無作為化ブートストラップ試験の結果を表示し、各ドットは、単一の試験内の分類子（１－アジュバント、０－非アジュバント）のアンサンブル票を表している。詳細については、方法セクションを参照されたい。Ｄは、本研究内で訓練され、２つの独立したデータセットに適用された「コア」ＡＳ０３遺伝子分類子の分類精度を示す。詳細については、方法セクションを参照されたい。Ｅは、３つの「コア」ＡＳ０３特異的遺伝子の２２日目の発現と、活性化されたＴｆｈ細胞頻度の２８／２１日目の倍数変化との相関を示す。Ｆは、ＴＭＥＭ１５９遺伝子の１日目の発現と、ＭＮ力価の４２／０日目の倍数変化との相関を示す。Ｇは、ＴＭＥＭ１５９遺伝子の１日目の発現と、ＡＳ０３が一価Ｈ１Ｎ１ワクチンと同時投与された公的に利用可能なデータセットにおけるＭＮ力価の６３／－７日目の倍数変化との相関を示す。

【図7】ＡＳ０３ワクチン接種後の初期アポトーシスシグナルの生成は、脂肪酸代謝及び酸化の撹乱に関連する。Ａ及びＢは、ワクチン接種後１日目（Ａ）及び２２日目（Ｂ）のＡＳ０３＋Ｈ５Ｎ１群対Ｈ５Ｎ１とＴＩＶデータセット（ペアワイズ比較）との間の、アポトーシス関連経路（Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベース）における差次的発現遺伝子（ＦＤＲ＜０．０５）を示す。特定のアポトーシス部分経路に属する遺伝子は、緑色（内因性経路）、マゼンタ色（外因性経路）、青色（実行段階）、又はオレンジ色（調節）で色分けされる。Ｃは、０日目に対する、アジュバント及び非アジュバント対象の最初の２つの主成分に沿ったプライム後の代謝軌跡を示す。ここで、代謝軌跡は、主成分空間に投影された場合の時間経過（１～７日目）にわたる全ての差次的代謝産物特徴（ｐ＜０．０１）にわたる存在量の変化に従う、各対象の軌跡を指す。Ｄは、２１日目に対する、アジュバント及び非アジュバント対象の最初の２つの主成分に沿ったブースト後の代謝軌跡を示す。Ｅは、ワクチン接種後１日目に、アジュバント対象において有意に濃縮された代謝経路（ｐ＜０．０５）を示す。丸のサイズは、経路内で検出された異常に豊富な代謝産物の数を表す。Ｆは、２２日目の、アポトーシス遺伝子発現又はブースト後の免疫応答に関連する代謝経路のヒートマップを示す。Ｍｕｍｍｉｃｈｏｇソフトウェアを使用して、アポトーシス遺伝子発現又は免疫応答と相関する代謝産物特徴（Ｓｐｅａｒｍａｎ相関によりｐ＜０．０５）に基づいて、濃縮経路を特定した。色及び丸のサイズは、置換検定による有意経路濃縮（ｐ＜０．１）の－ｌｏｇ１０ ｐ値を表す。示される経路は、少なくとも１つの特徴を有する濃縮＜ｐ値０．０１を有するものである。

【図8】Ａは、１日目のアジュバント対象（ｘ軸）及び３日目の非アジュバント対象（ｙ軸）における全てのＢＴＭの平均ｌｏｇ２ ＦＣの散布図を示す。Ｂは、３日目のプライムとブーストとの間の差次的ＢＴＭの動態を示す。線は、アジュバント対象間の平均モジュール倍数変化を表す。２４日目に最大の倍数変化を有する１０個のＢＴＭがプロットされている（図１Ｇに標識されたものと同じ）。Ｃは、アジュバント（オレンジ色）及び非アジュバント（緑色）対象におけるＨ５Ｎ１Ａ／インドネシアワクチン株に対する血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を示す。幾何平均は太い線で示され、一方、影は幾何標準偏差（ＳＤ）に対するものである。Ｄは、異種クレード２ Ｈ５Ｎ１株に対するＭＮ力価を示す。幾何平均は太い線で示され、一方、誤差バーは幾何標準偏差（ＳＤ）を表す。Ｅは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、共鳴単位（ＲＵ）でのＨ５ヘッド及びステムＩｇＧ結合能を示す。中央値及び四分位範囲を箱ひげ図で示し、バイオリン図は試料分布を示す。Ｆは、Ｈ５ヘッドに対するＩｇＧ抗体結合の４２／２１日目の倍数変化と及びＭＮ力価との相関を示す。Ｇは、Ｈ５ヘッドに対するＩｇＧ親和性の４２／２１日目の倍数変化と及びＭＮ力価との相関を示す。

【図9】Ａは、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３及びＴＩＶワクチン接種に応答するＨＡＩ力価の動態を示す。線は幾何平均を表し、影付き領域は幾何標準偏差を表す。ＴＩＶ力価は、２０１０及び２０１１季節性インフルエンザワクチン（ｎ＝４２）でワクチン接種された若年成人（＜６５歳）からのものである（Ｎａｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｂは、１００日目及び４２日目のＨＡＩ力価の相関を示す。Ｃは、アジュバント対象における形質細胞及び細胞周期ＢＴＭの平均ｌｏｇ２ ＦＣのヒートマップを示す。Ｄは、アジュバント対象におけるＭ１５６．０の２８日目／２１日目の平均ｌｏｇ２ ＦＣ（ｘ軸）対１００日目／４２日目ＨＡＩ残量の散布図を示す。

【図10】Ａは、ＱＣフィルタリング前の全ての分析された細胞のクラスタ当たりの細胞割合を示す。左パネルは、２１日目及び２８日目の試料からの各クラスタ内の細胞の割合を示す。右パネルは、各対象からの各クラスタ内の細胞の割合を示す。Ｂは、各対象についてのマイクロアレイを介した２８日目のＤＥＧのうちの２８／２１日目のＦＣ（ｘ軸）及びＣＩＴＥｓｅｑ（ｙ軸）を介した擬似バルク推定値の散布図を示す。統計は、ピアソン相関を使用して生成された。Ｃは、細胞ごとの正規化された発現を使用して、各対象の抗体継続性シグネチャ遺伝子の血小板内の２８／２１日目のＦＣの箱ひげ図を示す。

【図11】Ａは、ＱＣフィルタリング前のクラスタ別のセル当たりのＱＣメトリクスを示す。Ｂは、他の全てのクラスタと比較されたＱＣフィルタリング前の各クラスタ内のＤＥＧを示す。Ｃは、ＱＣフィルタリング前の各細胞におけるＣＩＴＥ－ｓｅｑ抗体存在量を示す。

【図12】Ａは、４つの異なるＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋Ｔｆｈ集団：静止Ｔｆｈ１、静止Ｔｆｈ２、活性化Ｔｆｈ１、及び活性化Ｔｆｈ２のソーティングのためのゲーティング戦略を示す。Ｂは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを使用したデコンボリューションの前に、ソートされた活性化Ｔｆｈ細胞対非活性化Ｔｆｈ細胞において有意に濃縮された（ＦＤＲ＜０．０５及びＮＥＳ＞２．５）ＢＴＭのＮＥＳ（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）を示す。ＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ ｅｔ ａｌ．２００４）を使用して、ソートされた活性化Ｔｆｈ試料と非活性化Ｔｆｈ試料との間のそれらの平均倍数変化によってランク付けされた遺伝子を使用して、濃縮ＢＴＭを特定した。Ｃは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴを介してソートされたＴｆｈ試料中の様々な免疫細胞の推定される相対的な細胞画分（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）を示す。

【図13】Ａは、ワクチン接種後１日目又は７日目のＴＩＶ及びＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３（プライム又はブースト）の両方に応答して一般的に濃縮された（ＦＤＲ＜０．００１）ＢＴＭのヒートマップを示す。色はＮＥＳを表し、有意でないスコアはグレーの影が付けられている。Ｂは、ＡＳ０３データセットにおいて独自に濃縮されたＢＴＭのＡＳ０３データセットとＴＩＶデータセットとの間の平均ＮＥＳの差を示す。ＧＳＥＡ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５を参照されたい）を使用して、ランク付けされた遺伝子リストを用いてＢＴＭの濃縮を特定し、ここで、遺伝子は、ＡＳ０３及びＴＩＶデータセットにおける１日目対０日目の倍数変化に基づいて、ｔ統計学的に順序付けされた（図５Ａ及び方法を参照されたい）。示されるＢＴＭは、ＴＩＶデータセットではないが、全てのＡＳ０３データセットにおいて有意に濃縮されたもの（ＦＤＲ＜０．０５）である。Ｃは、ＢＴＭ Ｍ２３中の遺伝子を示す。各「エッジ」（灰色の線）は、共発現関係を表し、色は、全てのＡＳ０３又はＴＩＶ研究における１日目の平均倍数変化を表す（図５Ａ及び方法を参照されたい）。Ｄは、全ての「ＡＳ０３特異的」遺伝子間の１日目の有意に相関するパートナー遺伝子（ＦＤＲ＜０．１）の重複係数を示す。Ｅは、アジュバント群についての、１日目の異なる細胞型における「ＡＳ０３特異的」遺伝子の推定遺伝子発現を示す。

【図14】ヒト、アカゲザル及びマウスの研究における、最終免疫化後７日目対０日目の血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化と抗体応答の継続性との間の正の相関を示す。Ａは、季節性インフルエンザワクチン接種における血小板染色及びＨＡＩアッセイの実験的タイムラインを示す。対象を、１回の用量のＴＩＶ（Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｃ．、２０１０～１１のシーズン）でワクチン接種した。Ｂは、ワクチン接種した対象における全血小板のＲＮＡ含有量（ＲＮＡ染料強度の中央値）及びＲＮＡ^＋血小板の％の７日目／０日目のｌｏｇ_２倍数変化に対する、１８０日目／２８日目ＨＡＩ残量の散布図を示す。Ｃは、ＡＳ０３と混合されたＲＢＤ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原の六量体で免疫化されたアカゲザルにおける血小板染色及び中和アッセイの実験的タイムラインを示す。Ｄは、血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２０１９ウイルス中和抗体価の動態の折れ線グラフを示す。Ｅは、全血小板におけるＲＮＡ含有量及びアジュバント対象における％ＲＮＡ^＋血小板の２８日目（ｄ７）／ベースライン（ｄ０）ｌｏｇ２ ＦＣに対する１８０日目／４２日目のｎＡｂ残量の散布図を示す。Ｆは、Ｒ８４８又はＭＰＬ（ＴＬＲ－４標的モノホスホリル脂質Ａ）＋Ｒ８４８と混合したＨＩＶ－１クレードＣ由来の１０８６．Ｃ ｇｐ１４０免疫原で免疫化したアカゲザルにおける血小板染色、中和アッセイ、及びＥＰＩＳＰＯＴの実験的タイムラインを示す。Ｇは、血清中の階層１Ａ ＭＷ９６５．２６ ＨＩＶ－１疑似ウイルス中和抗体力価の動態の折れ線グラフを示す。Ｈ及びＩは、アジュバント対象における、全血小板中のＲＮＡ含有量の第１９週（ｄ７）／ベースライン（ｄ０）ｌｏｇ_２ＦＣ対第４２週／第２０週のｎＡｂ残量、及び骨髄ＡＳＣ数の散布図を示す。Ｊは、ＡＳ０３と混合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）スパイク免疫原で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血小板染色、ＥＬＩＳＡ、及びＥＬＩＳＰＯＴの実験的タイムラインを示す。Ｋは、血清中の抗スパイク結合抗体力価の動態の折れ線グラフを示す。Ｌ及びＭは、全血小板中のＲＮＡ含有量の７日目／０日目のｌｏｇ_２ＦＣ対４２日目／７日目の残量、及び骨髄ＡＳＣ数の散布図を示す。

【図15】Ａ、Ｄ、Ｆ、及びＨは、２０１０年の季節性インフルエンザワクチン接種におけるヒト対象の解凍されたＰＢＭＣ中の無細胞血小板（Ａ）、ＡＳ０３と混合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク免疫原で免疫化したアカゲザル（Ｄ）、Ｒ８４８又はＭＰＬ＋Ｒ８４８と混合されたＨＩＶ ｇｐ１４０免疫原で免疫化したアカゲザル（Ｆ）、又はＡＳ０３と混合された２０１９－ｎ－ＣｏＶスパイク免疫原で免疫化したＢ６マウスの新たに調製した血小板濃縮血漿中の無細胞血小板（Ｈ）のゲーティング戦略を示す。Ｂは、ゲーティングされた集団における０日目及び７日目の％血小板、並びに７日目対０日目の％血小板の倍数変化を示す。Ｃ、Ｅ、Ｇ、及びＩは、対最後の免疫化の日（Ｃ、Ｉ）又はベースライン（Ｅ、Ｇ）に対する、最後の免疫化後７日目のワクチン接種対象における全血小板中のＲＮＡ含有量（ＲＮＡ染料強度中央値）又は％ＲＮＡ^＋血小板の倍数変化を示す。

【0019】

（表１） この試験の２つの治療群に登録された５０人の対象の人口統計情報を示す。

（表２） 非アジュバント群及びＡＳ０３アジュバント群の両方のＨＡＩ及びＭＮ力価についての幾何平均力価（ＧＭＴ）、９５％信頼区間（ＣＩ）、及びセロコンバージョン率を示す。セロコンバージョン率は、ワクチン接種後、ベースラインレベルに対する力価の４倍以上の増加を有するワクチン接種者の割合として定義される。

【発明を実施するための形態】

【0020】

ワクチン接種後の初期時点における遺伝子発現の変化に基づいて、応答の質の持続性のための、特にワクチンアジュバントを含むワクチンの分類のための組成物及び方法が提供される。応答のパターンは、例えば、ワクチン接種後７日目を含む、ワクチン接種後１～１０日の期間後に、目的の免疫細胞サブセット中のシグナルを定量化することによって得られる。応答のパターンは、参照アジュバントに対してベンチマークされた応答を有する傾向を示し、抗体応答の寿命が１００日以上であることを示す。分類が行われると、それは、治療的使用のためのワクチンの選択及びベンチマークに使用され得る。分類は、薬剤又はレジメンの選択を更に含み得る。

【0021】

本発明の方法及び組成物を説明する前に、本発明は記載された特定の方法又は組成物に限定されるものではなく、それ自体が勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。

【0022】

値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の各々の介在する値も、下限の単位の１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。規定範囲における任意の規定値又は介在値と、その規定範囲における任意の他の規定値又は介在値との間のより小さい各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立してその範囲に含まれても、又は除外されてもよく、より小さい範囲に限度のいずれかが含まれる範囲、どちらも含まれない範囲、又は両方の限度が含まれる範囲の各々も、規定範囲内の任意の具体的に除外されている限度に従って本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。

【0023】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、いくつかの潜在的で好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示が、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先することを理解されたい。

【0024】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ（ペプチド）」への言及は、当業者に既知の１つ以上のペプチド及びその等価物、例えばポリペプチドなどへの言及を含む。

【0025】

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のために、そのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。

【0026】

「アジュバント」という用語は、一般に、個体の体液性又は細胞性免疫応答を増加させる組成物を指す。目的のアジュバントは、免疫系を刺激し、共投与抗原に対する応答性又は応答の持続性を増加させる。

【0027】

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、応答について評価される哺乳動物を指すために本明細書において互換的に使用される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、限定されないが、疾患を有する個体を包含する。対象はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒト疾患についての実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含む。本発明の方法は、獣医学的目的に適用することができる。

【0028】

本明細書で使用される場合、「セラノーシス」という用語は、１つ以上の治療剤の選択、用量レベルの変化、用量スケジュールの変化、投与様式の変化、及び製剤の変化を含むがこれらに限定されない、治療レジメンの選択、維持、又は変更を指示するための診断方法から得られる結果の使用を指す。セラノーシスを知らせるために使用される診断方法は、疾患、状態、又は症状の状態に関する情報を提供する任意の方法を含み得る。

【0029】

「療法剤」、「治療可能な薬剤」、又は「治療剤」という用語は、互換的に使用され、ワクチン及びワクチンアジュバントを含む、対象への投与にいくつかの有益な効果を与える分子又は化合物を指す。有益な効果は、治療的免疫応答の誘導、診断的決定の実行可能性、疾患、症状、障害、又は病理学的状態の改善、疾患、症状、障害、又は状態の発症の低減又は予防、並びに一般には疾患、症状、障害、又は病理学的状態の相殺を含む。

【0030】

本明細書で使用される場合、「治療」又は「治療する」、又は「緩和する」又は「改善する」は、互換的に使用される。これらの用語は、これらに限定されないが、治療的利益及び／又は予防的利益を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、治療中の１つ以上の疾患、状態、又は症状における任意の治療上関連する改善又は効果を意味する。予防的利益のために、組成物は、疾患、状態、又は症状がまだ発現されていない可能性がある場合でも、特定の疾患、状態、若しくは症状を発症するリスクがある対象、又は疾患の生理学的症状のうちの１つ以上を報告する対象に投与され得る。

【0031】

「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は所望の結果をもたらすために十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて変化し、これは、当業者によって容易に決定することができる。この用語は、また、本明細書に記載の画像化方法のうちのいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも適用される。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、それが他の化合物と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、画像化される組織、及びそれが運ばれる物理的送達系に応じて変化する。

【0032】

「好適な状態」は、この用語が使用される文脈に依存する意味を有するものとする。すなわち、抗体と関連して使用される場合、用語は、抗体が対応する抗原に結合することを可能にする状態を意味するものとする。細胞への薬剤の接触に関連して使用する場合には、そうすることができる薬剤が細胞に侵入し、意図した機能を実施することを可能にする状態を意味するものとする。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「好適な状態」という用語は、生理学的状態を意味する。

【0033】

「炎症性」応答という用語は、体液性（抗体媒介）及び／又は細胞応答の発達であり、細胞応答は、抗原特異的Ｔ細胞又はそれらの分泌産物、及び先天性免疫細胞によって媒介され得る。「免疫原」は、哺乳動物への投与時、又は自己免疫疾患に起因して、それ自体に対する免疫応答を誘導することができる。

【0034】

本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、関連技術に従って定義され、病原体によって引き起こされる特定の疾患に対する個体の保護免疫を誘導又は増強する組成物に関する。理論に束縛されることを望むものではないが、保護免疫は、中和抗体の生成、又は免疫系の細胞傷害性細胞の活性化、又はその両方から生じると考えられる。保護免疫を誘導又は強化するために、ワクチンは、免疫原性抗原として、当該疾患を引き起こす病原体の一部又はこの免疫原性抗原をコードする核酸分子を含む。免疫原性抗原と接触すると、個体の免疫系は、免疫原性抗原を外来物として認識し、それを破壊するように誘発される。免疫系はその後、この免疫原性抗原との接触を記憶するため、疾患を引き起こす病原体との後の接触では、病原体の容易かつ効率的な認識及び破壊が確実となる。

【0035】

当該技術分野で既知であり、使用されるワクチンには、例えば、不活性化病原体ワクチン、弱毒化生病原体ワクチン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）ワクチン、サブユニット、組換え、多糖、及びコンジュゲートワクチン、トキソイドワクチン、並びにウイルスベクターワクチンが含まれる。不活性化ワクチンは、例えば、Ａ型肝炎、インフルエンザ、狂犬病などの疾患を引き起こす病原体の死滅型を使用する。生ワクチンは、疾患を引き起こす病原体、例えば、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹（ＭＭＲ併用ワクチン）、ロタウイルス、天然痘、水痘、黄熱の弱毒形態を使用する。ｍＲＮＡワクチンは、免疫応答を誘発する病原体タンパク質、例えば、ＳＲＳ－ＣｏＶ２をコードする。サブユニット、組換え、多糖、及びコンジュゲートワクチンは、特定の病原体分子、例えば、Ｈｉｂ（インフルエンザ菌ｂ型）、Ｂ型肝炎、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、百日咳ボルデテラ、肺炎球菌性疾患、髄膜炎菌性疾患、帯状疱疹ウイルスを使用する。トキソイドワクチンは、ジフテリア及び破傷風などの病原体によって形成された毒素を使用する。ウイルスベクターワクチンは、異なるウイルスの修飾バージョンをベクターとして使用して、病原体タンパク質をコードする配列を送達する。インフルエンザ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス、及びアデノウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスがベクターとして使用されている。ウイルスベクターは、現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン接種のために使用されている。

【0036】

本発明の目的のための「バイオマーカー」、「マーカー」という用語は、それらの関連する代謝産物、変異、バリアント、多型、修飾、断片、サブユニット、分解産物、要素、及び他の分析物又は試料由来の評価基準とともにタンパク質を指すが、これらに限定されない。マーカーは、目的の遺伝子の発現レベルを含む。マーカーは、また、時間的傾向及び差異を含む、前述の測定値のうちのいずれか１つ以上の組み合わせを含み得る。広く使用される場合、マーカーは、また、免疫細胞サブセットを指し得る。

【0037】

「分析する」ことは、試料中のマーカー（例えば、マーカー又は構成発現レベルの存在又は不在など）の測定によって試料に関連する一連の値を決定することと、測定値を、同じ対象又は他の対照対象由来の試料又は試料のセットにおける測定値と比較することとを含む。本教示のマーカーは、当技術分野で既知である様々な従来の方法のうちのいずれかによって分析され得る。「分析する」ことは、統計分析、例えば、データの正規化、統計的有意性の決定、統計的相関の決定、クラスタリングアルゴリズムなどを実行することを含み得る。

【0038】

本教示の文脈における「試料」は、対象から単離される任意の生体試料、一般には循環免疫細胞を含む試料を指す。試料は、体液、全血、ＰＢＭＣ（白血球細胞若しくは白血球）、組織生検、滑液、リンパ液、腹水、及び間質液又は細胞外液のアリコートを含み得るが、これらに限定されない。「血液試料」は、血液細胞、白血球細胞又は白血球を含む、全血又はその一部を指し得る。試料は、静脈穿刺、生検、針吸引、洗浄、掻爬、外科的切開若しくは介入、又は当該技術分野で既知の他の手段を含むがこれらに限定されない手段によって、対象から得ることができる。

【0039】

「データセット」は、所望の条件下での試料（又は試料の集団）の評価から得られる数値のセットである。データセットの値は、例えば、試料から評価基準を実験的に得て、これらの測定値からデータセットを構築することによって、あるいは代替的に、ラボなどのサービスプロバイダから、又はデータセットが格納されているデータベース若しくはサーバからデータセットを得ることによって得ることができる。同様に、「試料に関連付けられたデータセットを得る」という用語は、少なくとも１つの試料から決定されたデータのセットを得ることを包含する。データセットを得ることは、試料を得ること、及び試料を処理して、例えば抗体結合の測定、又はシグナル伝達応答を定量する他の方法を介して、データを実験的に決定することを包含する。この語句は、また、例えば、データセットを実験的に決定するために試料を処理した第三者から、データのセットを受け取ることを包含する。

【0040】

本教示の文脈における「測定すること」又は「測定」とは、臨床若しくは対象由来の試料中の物質の存在、非存在、若しくは濃度レベルを含む、そのような物質の存在、非存在、数量、量、若しくは有効量を決定すること、及び／又は対照、例えば、マーカーのベースラインレベルに基づいて、対象の臨床パラメータの値若しくは分類を評価することを指す。

【0041】

分類は、試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデリング方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％以上である。分類は、また、得られたデータセットと参照データセットとの間の比較が統計的に有意な差をもたらすか否かを決定することによって行うことができる。有意な差をもたらす場合、データセットが得られた試料は、参照データセットクラスに属さないものとして分類される。逆に、そのような比較が参照データセットと統計的に有意に異なるものではない場合、データセットが得られた試料は、参照データセットクラスに属するものとして分類される。

【0042】

モデルの予測能力は、特定の値、又は値の範囲の品質メトリクス、例えば、ＡＵＣ又は精度を提供するその能力に従って評価することができる。いくつかの実施形態では、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、又はそれ以上の精度で試料を分類する予測モデルである。代替の評価基準として、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、又はそれ以上のＡＵＣ（曲線下面積）を有する試料を分類する予測モデルを指すことができる。

【0043】

当技術分野で既知であるように、予測モデルの相対的な感度及び特異性は、選択性メトリクス又は感度メトリクスのいずれかに有利となるように「調整」され得、２つのメトリクスは逆の関係を有する。上記のようなモデルの限界は、実行される試験の特定の要件に応じて、選択された感度又は特異性レベルを提供するように調整され得る。感度及び特異性の一方又は両方は、少なくとも約少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、又はそれ以上であり得る。

【0044】

「親和性試薬」又は「特異的結合メンバー」は、本発明の遺伝子配列、タンパク質又はマーカーに選択的に結合するポリヌクレオチド、抗体、リガンドなどの親和性試薬を指すように使用され得る。「親和性試薬」という用語は、任意の分子、例えば、ペプチド、核酸、有機小分子を含む。いくつかの実施形態では、親和性試薬は、ポリヌクレオチドである。

【0045】

「抗体」という用語は、全長抗体及び抗体断片を含み、以下で更に定義されるように、任意の生物由来の天然抗体、操作された抗体、又は実験、治療、若しくは他の目的のために組換え的に生成された抗体を指し得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又は抗体の他の抗原結合部分配列などの当技術分野で既知である抗体断片の例は、全抗体の修飾によって産生されるか、又は組換えＤＮＡ技術を使用して新規に合成されたもののいずれかである。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。抗体は、拮抗剤、アゴニスト、中和剤、阻害剤、又は刺激剤であってもよい。それらは、ヒト化され、グリコシル化され、固体支持体に結合され、他の変形を有することができる。

【0046】

本発明は、他の出願及びテキストに開示された情報を組み込む。以下の特許及び他の刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ，２ｄ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，２００２、Ｍｉｃｈａｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｗａｙｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２００７、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．７ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ、及びＬｅｒｏｉｔｈ ａｎｄ Ｂｏｎｄｙ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ａ Ｍｕｌｔｉ Ｖｏｌｕｍｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １Ａ ａｎｄ ＩＢ，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，１９９６。

【0047】

文脈から別段明らかでない限り、本発明の全ての要素、ステップ又は特徴は、他の要素、ステップ又は特徴と任意に組み合わせて使用され得る。

【0048】

分子生化学及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９８）である。本開示で言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、及びキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商業的ベンダーから入手可能である。

【0049】

本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、又は提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正及び変更を行うことができることを理解されたい。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類又は量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変更を行うことができる。かかる修正は全て、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。

【0050】

本発明の方法は、予防的又は治療的目的のために使用される。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、再発の予防、及び既存の状態の治療の両方を指すために使用される。例えば、免疫の発達は、薬剤の投与によって達成され得る。治療が患者の臨床症状を安定化又は改善する、進行中の疾患の治療は、特に目的である。

【0051】

本発明の方法
免疫化に関連する免疫細胞遺伝子発現の変化の決定を得るために、個体から得られた細胞生物試料の単一細胞レベル又は複数細胞レベルでの分析が使用される。驚くべきことに、これらの免疫細胞の遺伝子発現における変化が、ワクチンに対する持続的な抗体応答を発達させる傾向を予測することが見出される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、血小板である。

【0052】

試料は、１つ以上の細胞、好ましくは血液試料、ＰＢＭＣ試料、又はそれらの画分、例えば、血小板の分析を可能にする任意の好適な種類であり得る。試料は、個体から１回又は複数回得ることができる。複数の試料は、個体内の異なる位置（例えば、血液試料、骨髄試料及び／若しくはリンパ節試料）から、個体から異なる時間に、又はこれらの任意の組み合わせで得ることができる。一実施形態では、ベースライン、又は「０日目」試料は、免疫化前に得られ、試験試料は、免疫化後約７～約１０日、例えば、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目に得られ、約６日目～約１１日目、約７日目～約１０日目、約７日目～約９日目、約７日目～約８日目であってもよい。

【0053】

試料が一連のもの、例えば、その間に得られた一連の血液試料として得られる場合、試料は、最新の試料（複数可）の状態によって、又は個体の他の特性によって、又はそれらのいくつかの組み合わせによって決定される間隔で、固定された間隔で得ることができる。間隔は、サンプリングのための個体の可用性及びサンプリング設備の可用性に従って厳密ではなくてもよく、したがって、意図される間隔スキームに対応するおおよその間隔が本発明によって包含されることが理解される。一般に、最も容易に得られる試料は、流体試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血液である。

【0054】

１つ以上の細胞又は細胞型、又は１つ以上の細胞又は細胞型を含有する試料は、身体試料から単離することができる。細胞は、赤血球溶解、遠心分離、溶出、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性選択、パニング、ＦＡＣＳ、Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離、結合抗体を有する固体支持体（磁性ビーズ、カラム内ビーズ、又は他の表面）などによって身体試料から分離することができる。特定の細胞型で特定されたマーカーに特異的な抗体を使用することによって、比較的均一な細胞集団を得ることができる。代替的に、不均一な細胞集団、例えば、循環末梢血単核細胞を使用することができる。

【0055】

本発明のいくつかの実施形態では、混合細胞集団の試料中の特定の細胞集団（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のみ、血小板のみなど）を分析するために、異なるゲーティング戦略が使用される。これらのゲーティング戦略は、１つ以上の特定の表面マーカーの存在に基づき得る。以下のゲートは、死んだ細胞と生細胞とを区別することができ、その後の生細胞のゲーティングは、それらを、例えば、骨髄芽球、単球、及びリンパ球に分類する。二次元輪郭プロット表現、二次元ドットプロット表現、及び／又はヒストグラムを使用することによって、明確な比較を行うことができる。

【0056】

試料は、１つ以上の時点で得ることができる。単一の時点での試料が使用される場合、目的のシグナル伝達タンパク質の活性化形態の存在についての参照「ベースライン」レベルと比較され、これは、正常対照、１つの個体又は個体集団から得られた所定のレベル、エクスビボ活性化のための陰性対照などから得ることができる。

【0057】

必要に応じて、細胞は、例えば、好適なプロテアーゼ、例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼなど、及び同様のものを用いた酵素消化によって、単一の細胞懸濁液に分散される。適切な溶液が、分散又は懸濁に使用される。そのような溶液は、一般に、低濃度、一般に５～２５ｍＭにおける許容可能な緩衝液と併せて、好都合に、ウシ胎児血清又は他の天然因子を補充された、平衡塩溶液、例えば、通常の生理食塩水、ＰＢＳ、ハンク平衡塩溶液などである。好都合な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ１リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが含まれる。細胞は、例えば、３％のパラホルムアルデヒドで固定され得、通常、例えば、当技術分野において既知であるように、かつ本明細書に記載の方法に従って、氷冷メタノール、０．１％のサポニン、３％のＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝ＰＢＳ、－２００℃でのアセトンで２分間の被覆などにより透過される。

【0058】

一実施形態では、候補ワクチンに対する免疫応答の持続性を予測するための方法が提供され、方法は、アジュバントを含み得る候補ワクチンを哺乳動物に投与することと、ワクチン接種後にレシピエントにおける血小板のＲＮＡ含有量を決定することとを含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、血小板ＲＮＡ含有量の分析は、一段階フローサイトメトリー分析、例えば、蛍光活性化フローサイトメトリーによって行われる。そのような方法では、試料、例えば、末梢血試料は、試料中の他の細胞から血小板を区別することができる試薬で標識され、ＲＮＡ選択的染色で標識される。次いで、細胞の集団がフローサイトメトリーによって分析され、血小板集団にゲーティングされて、血小板のＲＮＡ含有量が決定される。細胞は、新鮮であっても凍結されていてもよく、分析の前に固定されていてもよい。

【0060】

そのような実施形態では、個体由来の試料が、血小板を区別することができるマーカーに特異的な、直接的又は間接的に標識された結合剤、例えば、標識された抗体の１つ又はカクテルと接触される。いくつかの実施形態では、結合剤はＣＤ４１及びＣＤ６１に特異的であり、血小板はＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋である。いくつかの実施形態では、結合剤のカクテルは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６などのうちの１つ以上に特異的な薬剤を更に含み、これらのマーカーは、非血小板細胞を分析から除外するために使用される。例えば、染色のための抗体のカクテルは、検出可能な標識抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４１、及び抗ＣＤ６１抗体を含んでもよい。抗体の別のカクテルは、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ４１、及び抗ＣＤ６１抗体を含んでもよい。

【0061】

代替的に、血液試料が抗凝固されて、血小板が豊富な血漿が得られてもよく、血小板が豊富な血漿は、血小板を区別することができるマーカーに特異的である、直接的又は間接的に標識された結合剤、例えば、標識された抗体の１つ又はカクテルと接触される。いくつかの実施形態では、結合剤はＣＤ４１及びＣＤ６１に特異的であり、血小板はＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋である。一部の実施形態では、結合剤のカクテルは、ＴＥＲ１１９を含むがこれに限定されない、赤血球マーカーのうちの１つ以上に特異的な薬剤を更に含み、このマーカーは、非血小板ＲＢＣを分析から除外するために使用される。例えば、染色のための抗体のカクテルは、検出可能な標識抗ＴＥＲ１１９、抗ＣＤ４１、及び抗ＣＤ６１抗体を含んでもよい。

【0062】

試料は、ＲＮＡに対して選択的である染料と接触される。この目的のための好適な染料、例えばＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が市販されており、これは、ＲＮＡに結合した場合に明るい緑色の蛍光を示す（最大約４９０／５３０ｎｍの吸収／発光）が、ＤＮＡに結合した場合に弱い蛍光シグナルのみを示す。他のＲＮＡ選択染料、例えばＬｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ１３（６）：６１５－６２３（参照により本明細書に具体的に組み込まれる）によって説明されるスチリル染料Ｅ３６、Ｅ１４４及びＦ２２、並びにＬｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ２１５（８３）によって説明されるチアゾールオレンジ及びｐ－（メチルチオ）スチリル部分と統合されたＲＮＡ選択蛍光染料が、当技術分野において既知である。

【0063】

次いで、試料は、ＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋血小板をゲーティングし、任意選択でＲＢＣ及び他の免疫細胞を除外し、血小板ＲＮＡ含有量を決定することによって、フローサイトメトリーにより分析される。血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化は、ワクチン接種前のベースラインレベルと比較することができ、持続的な免疫応答は、ベースラインと比較して少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍の増加に関連付けられる。

【0064】

データ分析
シグネチャパターンは、例えば、以下に記載されるように、任意の好都合なプロトコルを使用して生体試料から生成され得る。読み出しは、平均値（ｍｅａｎ）、代表値（ａｖｅｒａｇｅ）、中央値、若しくは分散値、又は測定値に関連付けられた他の統計的若しくは数学的に導出された値、例えば、遺伝子発現、ＲＮＡ含有量などであり得る。マーカー読み出し情報は、対応する参照又は制御パターンと直接比較することによって、更に精査され得る。シグネチャは、参照値と比較してデータマトリックスの任意の点に統計的に有意な変化があるか否か、変化が結合の増加又は減少であるか否か、変化が１つ以上の生理学的状態に特異的であるか否かなどを決定するために、いくつかの点で評価することができる。同一の条件下で各マーカーについて得られた絶対値は、生体系に固有の可変性を示し、個体間に固有の可変性も反映する。

【0065】

アッセイされる試料からシグネチャパターンを得た後、シグネチャパターンは、参照又はベースラインプロファイルと比較され、試料が得られた／由来した患者の応答に関する分類が行われ得る。追加的に、参照又は制御シグネチャパターンは、参照アジュバントの試料から得られるシグネチャパターンであり得る。

【0066】

ある特定の実施形態では、得られたシグネチャパターンは、単一の参照／対照プロファイルと比較され、表現型に関する情報が得られる。更に他の実施形態では、得られたシグネチャパターンは、２つ以上の異なる参照／制御プロファイルと比較され、より詳細な深度情報が得られる。例えば、得られたシグネチャパターンは、正及び負の参照プロファイルと比較され、確認された情報が得られる。

【0067】

試料は、個体の組織又は体液から得ることができる。例えば、試料は、全血、組織生検、血清などから得ることができる。また、この用語には、そのような細胞及び体液の誘導体及び分画が含まれる。

【0068】

プロファイルを識別するために、統計試験は、試験プロファイルと参照プロファイルとの間のマーカーのレベルの変化が有意であるとみなされるための信頼レベルを提供することができる。生データは、通常、マーカーごとに２回、３回、４回、又は５～１０回の反復特徴で、各マーカーの値を測定することによって最初に分析することができる。試験データセットは、プロファイルのパラメータ値のうちの１つ以上が、事前定義された有意レベルに対応する限界値を超える場合、参照データセットとは異なるとみなされる。

【0069】

有意性の順序を提供するために、偽発見率（ＦＤＲ）を決定することができる。まず、非類似性値のヌル分布のセットが生成される。一実施形態では、観測されたプロファイルの値は、偶然に得られた相関係数の分布のシーケンスを形成するように置換され、それによって相関係数のヌル分布の適切なセットを形成する。ヌル分布のセットは、全ての利用可能なプロファイルについての各プロファイルの値を置換すること、全てのプロファイルについての対ごとの相関係数を計算すること、この置換についての相関係数の確率密度関数を計算すること、及び手順をＮ回（Ｎは大きな数、通常は３００である）繰り返すことによって得られる。Ｎ分布を使用して、所与の有意性レベルでの実験的に観察された類似性値の分布から得られた値（類似性の値）を超える相関係数値のカウントの適切な評価基準（平均、中央値など）を計算する。

【0070】

ＦＤＲは、予想される偽有意相関の数（ランダム化データのセットにおけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）と、経験データにおけるこの選択されたピアソン相関よりも大きい相関の数（有意相関）との比率である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間の相関に適用することができる。

【0071】

ＳＡＭについて、Ｚスコアは、データセット内の分散の別の評価基準を表し、ＸからＸの平均を引いた値を標準偏差で割った値に等しい。Ｚスコアは、単一のデータポイントが正規のデータ分布とどのように比較されるかを示す。Ｚスコアは、データポイントが平均を上回っているか下回っているかを示すだけでなく、測定値がどれほど異常であるかを示す。標準偏差は、データセット内の各値とデータセット内の値の平均との間の平均距離である。

【0072】

前述の分布を使用して、有意性について信頼レベルが選択される。これは、偶然に得られたであろう結果を超える相関係数の最小値を決定するために使用される。この方法を使用すると、正の相関、負の相関、又はその両方の閾値が得られる。この閾値を使用して、使用者は、ペアワイズ相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値を超えない値を除外することができる。更に、所与の閾値について、偽陽性率の推定値を得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、いくつの観測が閾値範囲外にあるかを見出すことができる。この手順は、カウントのシーケンスを提供する。配列の平均及び標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数及びその標準偏差を提供する。代替的に、任意の好都合な統計的検証方法が使用され得る。

【0073】

データは、プロファイル間の関係を明らかにするために、教師なし階層的クラスタリングに供され得る。例えば、ピアソン相関がクラスタリングメトリクスとして採用される、階層的クラスタリングを実行することができる。１つのアプローチは、患者疾患データセットを「教師あり学習」の問題における「学習サンプル」とみなすことである。ＣＡＲＴは、医学への応用における標準（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９９）Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）であり、これは、任意の定性的特徴を定量的特徴に変換することによって修正することができ、達成された有意性レベルによってそれらをソートして、ＨｏｔｅｌｌｉｎｇのＴ^２統計量のためのサンプル再利用法及び投げ縄法の好適な応用によって評価される。予測の問題は、回帰の質を評価する際に分類のためのＧｉｎｉ基準を適切に使用することによって、予測を見失うことなく回帰の問題に変化する。

【0074】

使用され得る他の分析方法は、ロジスティック回帰を含む。論理回帰の１つの方法は、Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎｄ Ｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ１２：４７５－５１２である。論理回帰は、その分類子がバイナリツリーとして表示され得るという点でＣＡＲＴに似ている。各ノードには、ＣＡＲＴによって生成される単純な「論理積」文よりも一般的な機能に関するブール文がある点で異なる。

【0075】

別のアプローチは、最近接縮小重心（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ（２００２）ＰＮＡＳ９９：６５６７－７２）のアプローチである。この技術は、ｋ平均に類似しているが、クラスタ中心を縮小することによって、（投げ縄のように）特徴を自動的に選択し、有益な少数の特徴に注意を集中させるという利点がある。このアプローチは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ用のソフトウェア「プラグイン」であるマイクロアレイの予測分析（ＰＡＭ）ソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。更に２つのアルゴリズムセットは、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ（２００１）Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ４５：５－３２及びＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ（２００１）Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）である。これらの２つの方法は、既に「委員会の方法」である。したがって、それらは、結果に「投票」する予測因子を含む。これらの方法のいくつかは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで開発された「Ｒ」ソフトウェアに基づいており、継続的に改善され更新されている統計的枠組みを提供している。

【0076】

主成分分析、再帰的分割、予測アルゴリズム、ベイズネットワーク、及びニューラルネットワークを含む他の統計分析アプローチがある。

【0077】

これらのツール及び方法は、いくつかの分類問題に適用することができる。例えば、方法は、ｉ）全ての症例対全ての対照、ｉｉ）全ての症例対非持続的応答、ｉｉｉ）全ての症例対持続的応答の比較から開発することができる。

【0078】

第２の分析アプローチでは、断面分析で選択された変数は、予測因子として別々に用いられる。特定の転帰、各患者が観察される時間のランダムな長さ、並びにプロテオミクス及び他の特徴の選択を考慮すると、応答性を分析するパラメトリクスアプローチは、広く適用されているセミパラメトリクスコックスモデルよりも良好となり得る。生存のＷｅｉｂｕｌｌパラメトリクスフィットは、ハザード率が単調に増加、減少、又は一定であることを可能にし、比例ハザード表現（Ｃｏｘモデルと同様に）及び加速故障時間表現も有する。回帰係数及びそれらの関数の近似最大尤度推定量を得るために利用可能な全ての標準ツールは、このモデルで利用可能である。

【0079】

加えて、Ｃｏｘモデルを使用することができるが、これは特に、投げ縄で共変量の数を管理可能なサイズに減らすことで分析が大幅に簡素化され、生存に対する完全なノンパラメトリクスアプローチの可能性が可能になるためである。

【0080】

分析及びデータベース記憶は、ハードウェア若しくはソフトウェア、又はその両方の組み合わせで実装され得る。本発明の一実施形態では、機械可読記憶媒体が提供され、媒体は、機械可読データで符号化されたデータ記憶材料を含み、機械可読データは、当該データを使用するための命令でプログラムされた機械を使用する場合、本発明のデータセット及びデータ比較のいずれかを表示することができる。そのようなデータは、患者モニタリング、初期診断などの様々な目的のために使用することができる。好ましくは、本発明は、プロセッサ、データ記憶システム（揮発性及び不揮発性メモリ及び／又は記憶要素を含む）、少なくとも１つの入力デバイス、並びに少なくとも１つの出力デバイスを含む、プログラマブルコンピュータ上で実行されるコンピュータプログラムで実装される。プログラムコードは、上記の機能を実行し、出力情報を生成するために入力データに適用される。出力情報は、既知の方式で、１つ以上の出力デバイスに適用される。コンピュータは、例えば、従来の設計のパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、又はワークステーションであり得る。

【0081】

各プログラムは、コンピュータシステムと通信するために、高レベルの手続き型又はオブジェクト指向のプログラミング言語で実装されることが好ましい。しかしながら、必要に応じて、プログラムは、アセンブリ言語又は機械語で実装されてもよい。いずれの場合でも、言語は、コンパイルされた言語又は解釈された言語であり得る。そのような各コンピュータプログラムは、好ましくは、本明細書に記載される手順を実行するために記憶媒体又はデバイスがコンピュータによって読み取られるときに、コンピュータを構成及び操作するために、汎用又は特殊目的のプログラム可能なコンピュータによって読み取り可能な記憶媒体又はデバイス（例えば、ＲＯＭ又は磁気ディスケット）に記憶される。システムは、また、コンピュータプログラムで構成されたコンピュータ可読記憶媒体として実装されるとみなすことができ、そのように構成された記憶媒体は、コンピュータを、本明細書に記載された機能を実行するための特定の事前定義された方法で動作させる。

【0082】

入力及び出力手段のための様々な構造フォーマットは、本発明のコンピュータベースのシステム内の情報を入力及び出力するために使用され得る。出力の１つのフォーマットは、信頼できるプロファイルと異なる程度の類似性を有する試験データセットを意味する。そのような提示は、類似性のランク付けを当業者に提供し、試験パターンに含まれる類似性の程度を識別する。

【0083】

シグネチャパターン及びそのデータベースは、それらの使用を容易にするために多様な媒体で提供され得る。「媒体」は、本発明のシグネチャパターン情報を含む製造物を指す。本発明のデータベースは、コンピュータ可読媒体、例えば、コンピュータによって直接読み取り及びアクセスすることができる任意の媒体に記録され得る。そのような媒体としては、以下に限定されないが、磁気ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭなどの光学記憶媒体、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体、並びに磁気／光学記憶媒体などのこれらのカテゴリーのハイブリッドが挙げられる。当業者は、現在知られているコンピュータ可読媒体のいずれかが、本データベース情報の記録を含む製造物を形成するためにどのように使用され得るかを容易に理解することができる。「記録された」とは、当技術分野で既知の任意のそのような方法を使用して、コンピュータ可読媒体に情報を記憶するためのプロセスを指す。記憶された情報にアクセスするために使用される手段に基づいて、任意の便利なデータ記憶構造を選択することができる。多様なデータプロセッサプログラム及びフォーマットを、例えば、ワードプロセッサテキストファイル、データベースフォーマットなどを記憶するために使用することができる。

【0084】

「抗原」又は「免疫原」は、免疫応答を刺激する任意の物質を指す。この用語は、死滅した、不活性化された、弱毒化された、又は改変された生きた細菌、ウイルス、又は寄生虫を含む。抗原という用語は、また、個別に、又はこれらの任意の組み合わせで、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、合成ペプチド、タンパク質抽出物、細胞（細菌細胞を含む）、組織、多糖、若しくは脂質、又はこれらの断片を含む。抗原という用語は、また、抗イディオタイプ抗体又はその断片などの抗体、及び抗原又は抗原決定基（エピトープ）を模倣することができる合成ペプチドミモトープを含む。

【0085】

「細胞免疫応答」又は「細胞媒介免疫応答」は、Ｔリンパ球又は他の白血球細胞、又はその両方によって媒介されるものであり、活性化Ｔ細胞、白血球細胞、又はその両方によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び類似の分子の産生を含む。

【0086】

「乳化剤」とは、乳剤をより安定させるために使用される物質を意味する。

【0087】

「エマルション」は、一方の液体の小さな液滴が他方の液体の連続相に懸濁される２つの非混和性液体の組成物を意味する。

【0088】

対象における「免疫応答」とは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は抗原に対する体液性及び細胞性免疫応答の発生を指す。免疫応答は、通常、当技術分野で知られている標準的なイムノアッセイ及び中和アッセイを使用して決定することができる。

【0089】

「免疫原性」とは、免疫応答又は抗原応答を惹起することを意味する。したがって、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導する任意の組成物である。

【0090】

「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしに対象の組織と接触して使用するために好適であり、合理的な利益対リスク比に見合い、かつそれらの意図される使用に有効な物質を指す。

【0091】

「反応原性」は、アジュバント、免疫原性、又はワクチン組成物の投与に応答して対象において引き起こされる副作用を指す。それは、投与部位で生じる可能性があり、通常、いくつかの症状の発症の観点から評価される。これらの症状には、炎症、赤み、及び膿瘍が含まれ得る。また、発生、持続時間、及び重症度の観点からも評価される。「低い」反応は、例えば、動悸によってのみ検出可能であり、目によって検出されない、又は短時間の腫脹を伴う。より重度の反応は、例えば、目に見える反応、又はより長い持続時間の反応である。

【0092】

「免疫刺激組成物」は、本明細書に定義されるアジュバントを含む組成物を指し、任意選択で抗原を更に含み得、その場合、より従来的にはワクチンと呼ばれ得る。対象への組成物の投与は、骨髄免疫細胞の応答性状態の増加をもたらす。治療上有効な組成物の量は、抗原の存在、アジュバント、及び対象の状態に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。非抗原アジュバント組成物は、目的の疾患の抗原を含まない。

【0093】

アジュバント組成物
いくつかの実施形態では、アジュバント組成物は、使用又は更なる開発のために選択される。例示的なアジュバントは、水中油型エマルションであり、油相中のスクアレンを含み得る。例えば、ＡＳ０３は、水中油型エマルション中のα－トコフェロール、スクアレン、及びポリソルベート８０からなるアジュバント系である。ＭＦ５９は、スクアレンエマルションを含む別の免疫学的アジュバントである。投与されるアジュバントの用量は、抗原が存在するか否か、それが使用される抗原、及び適用される抗原投与量に依存し得る。また、意図される種及び所望の製剤にも依存する。通常、その量は、従来アジュバントに使用される範囲内である。例えば、アジュバントは、典型的には、約１μｇ～約１０００μｇ（これらを含む）の１ｍＬ用量を含む。

【0094】

アジュバント製剤は、均質化され得るか、又はマイクロ流体化され得る。製剤は、典型的には、１つ以上のホモジナイザーを１回以上通過させることによって、一次ブレンドプロセスに供される。任意の市販のホモジナイザー、例えば、Ｒｏｓｓ乳化機（Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、Ｎ．Ｙ．）、Ｇａｕｌｉｎホモジナイザー（Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓ．）、又はＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）を、この目的のために使用することができる。一実施形態において、製剤は、１０，０００ｒｐｍで３分間均質化される。マイクロ流体化は、市販のマイクロフルイダイザ、例えばＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓから入手可能なモデル番号１１０Ｙ（Ｎｅｗｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．、Ｅｖｅｒｅｔｔ、Ｍａｓｓ．）、及びＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ８．３０Ｈ Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって達成され得る。これらのマイクロフルイダイザは、２つの流体流が相互作用チャンバ内で高速で相互作用してサブミクロンサイズの液滴を有する組成物を形成するように、高圧下で流体を小さな開口部に押し通すことによって動作する。一実施形態では、製剤は、２００ミクロンの制限寸法チャンバを１０，０００＋／－５００ｐｓｉで通過させることによってマイクロ流体化される。

【0095】

アジュバント組成物の投与経路としては、非経口、経口、経鼻、鼻腔内、気管内、局所などが挙げられる。注射器、点滴器、無針注射デバイス、パッチなどを含む任意の好適なデバイスを使用して、組成物を投与してもよい。使用のために選択される経路及びデバイスは、アジュバント、抗原、及び対象の組成に依存し、そのようなものは当業者に周知である。

【0096】

アジュバント組成物は、例えば、四級アンモニウム化合物（例えば、ＤＤＡ）、及びインターロイキン、インターフェロン、又は他のサイトカインなどの１つ以上の免疫調節剤を更に含むことができる。これらの材料は、商業的に購入することができる。アジュバント組成物における使用に好適な免疫調節剤の量は、使用される免疫調節剤の性質及び対象に依存する。しかしながら、それらは一般に、用量当たり約１μｇ～約５，０００μｇの量で使用される。特定の例では、ＤＤＡを含有するアジュバント組成物は、抗原溶液を新たに調製したＤＤＡの溶液と単純に混合することによって調製することができる。

【0097】

アジュバント組成物は、例えば、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレングリコール、並びにポリアクリル酸及びポリメタクリル酸（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））などの１つ以上のポリマーを更に含むことができる。そのような材料は、商業的に購入することができる。アジュバント組成物における使用に好適なポリマーの量は、使用されるポリマーの性質に依存する。しかしながら、それらは一般に、約０．０００１％体積対体積（ｖ／ｖ）～約７５％ｖ／ｖの量で使用される。他の実施形態では、それらは、約０．００１％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ～約２５％ｖ／ｖ、約０．０１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、約０．０５％ｖ／ｖ～約２％ｖ／ｖ、及び約０．１％ｖ／ｖ～約０．７５％ｖ／ｖの量で使用される。別の実施形態において、それらは、約０．０２ｖ／ｖ～約０．４％ｖ／ｖの量で使用される。ＤＥＡＥ－デキストランは、５０，０００Ｄａ～５，０００，０００Ｄａの範囲内の分子サイズを有することができ、又は５００，０００Ｄａ～２，０００，０００Ｄａの範囲内であってもよい。そのような材料は、商業的に購入され得るか、又はデキストランから調製され得る。

【0098】

アジュバント組成物は、例えば、Ｂａｙ Ｒ１００５（商標）及びアルミニウムなどの１つ以上のＴｈ２刺激剤を更に含むことができる。アジュバント組成物における使用に好適なＴｈ２刺激剤の量は、使用されるＴｈ２刺激剤の性質に依存する。しかしながら、それらは一般に、用量当たり約０．０１ｍｇ～約１０ｍｇの量で使用される。他の実施形態では、これらは、用量当たり約０．０５ｍｇ～約７．５ｍｇ、用量当たり約０．１ｍｇ～約５ｍｇ、用量当たり約０．５ｍｇ～約２．５ｍｇ、及び用量当たり１ｍｇ～約２ｍｇの量で使用される。具体的な例は、「Ｎ－（２－デオキシ－２－Ｌ－ロイシルアミノ－β－Ｄ－グルコピラノシル）－Ｎ－オクタデシルドデカンアミドアセテート」という化学名の糖脂質であるＢａｙ Ｒ１００５（商標）である。これは、水溶液中でミセルを形成する両親媒性分子である。

【0099】

免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こす細菌のいくつかの例としては、例えば、Ａｃｅｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｅｒｕｉａｎｕｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ａｒｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｓｃｏｓｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉｅａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｉｓ、Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌｓａ ｓｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ．、ｍｙｃｏｉｄｅｓ ＬＣ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｕｌａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｉｖｏｓａ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｃ９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＩＫＷ１、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ Ｂ１１－１、Ａｌｃａｌｉｇｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｍｍｏｂｉｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｄｕｂｌｉｎ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｓｅｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｉｒｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｌｙｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｘｆｏｌｉａｔｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｙｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｒｅｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌａｄｉｕｍ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ種、例えば既知の病原菌Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｏｓａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ－ｂｏｖｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ ｈａｒｄｊｏ－ｐｒａｊｉｔｎｏ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

【0100】

免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こすウイルスの例としては、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ１、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２、及び他のコロナウイルス、トリヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、イヌヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコウイルス鼻気管炎ウイルス、マレク病ウイルス、ヒツジヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、トリパラミクソウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、ウシパランフルエンザウイルス３、ヒツジパラインフルエンザ３、牛疫ウイルス、ボーダー病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ＢＶＤＶ Ｉ型、ＢＶＤＶ ＩＩ型、古典的ブタ熱ウイルス、トリ白血病ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ結核、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヒツジ進行性肺炎ウイルス、ヒツジ肺腺がんウイルス、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、汎親和性ＣＣＶ、イヌ呼吸器コロナウイルス、ウシコロナウイルス、ネコカリシウイルス、ネコ腸管コロナウイルス、ネコ感染性腹膜炎、ウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス、ブタ血液凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）Ｉ型、ＰＣＶ ＩＩ型、ブタ生殖呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、トルココロナウイルス、ウシ一日熱ウイルス、狂犬病、ロトウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レンチウイルス、トリインフルエンザ、ライノウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、及び麻疹ウイルス、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。

【0101】

免疫応答性を得ることができる疾患を引き起こす寄生虫の例としては、例えば、Ａｎａｐｌａｓｍａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ（肝臓寄生吸虫）、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｇｉａｒｄｉａ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ（犬糸状虫）、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ（鉤虫）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ、Ｔａｅｎｉａ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ、Ａｓｃａｒｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ、Ｈａｍｍｏｎｄｉａ、及びＩｓｏｐｓｏｒａ、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。Ｉｘｏｄｅｓ、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ、Ａｍｂｌｙｏｍｍａ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｙａｌｏｍｍａ、及びＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ種、並びにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、ダニを含む外部寄生虫も企図される。

【0102】

油は、アジュバントの成分として添加されると、一般に、長く遅い放出プロファイルを提供する。本発明において、油は、代謝性又は非代謝性であり得る。油は、水中油、油中水、又は水中油中水エマルションの形態であり得る。

【0103】

本発明における使用に好適な油は、アルカン、アルケン、アルキン、並びにそれらの対応する酸及びアルコール、それらのエーテル及びエステル、並びにそれらの混合物を含む。油の個々の化合物は、軽炭化水素化合物であり、すなわち、そのような成分は、６～３０個の炭素原子を有する。油は、石油製品から合成的に調製又は精製することができる。部分は、直鎖又は分枝鎖構造を有し得る。これは、完全に飽和していてもよく、又は１つ以上の二重結合若しくは三重結合を有してもよい。本発明で使用するためのいくつかの非代謝性油は、例えば、鉱物油、パラフィン油、及びシクロパラフィンを含む。

【0104】

「油」という用語は、また、「軽鉱油」、すなわち、同様にワセリンの蒸留によって得られるが、白色鉱油よりもわずかに低い比重を有する油を含むことが意図される。

【0105】

代謝可能な油は、代謝可能で非毒性の油を含む。油は、アジュバントが投与される対象の体によって代謝され得、対象に毒性でない任意の植物油、魚油、動物油又は合成調製油であり得る。植物油の源は、ナッツ、種子、穀物を含む。

【0106】

組成物の他の成分は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、担体、溶媒、及び希釈剤、等張剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、血管収縮剤、抗菌剤、抗真菌剤などを含み得る。典型的な担体、溶媒、及び希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール、油などを含む。代表的な等張化剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどを含む。有用な安定剤は、ゼラチン、アルブミンなどを含む。

【0107】

界面活性剤は、アジュバント及び抗原の担体として機能するように選択されたエマルションの安定化を補助するために使用される。本発明で使用するために好適な界面活性剤は、天然の生物学的に適合する界面活性剤及び非天然の合成界面活性剤を含む。生物学的に適合する界面活性剤は、リン脂質化合物又はリン脂質の混合物を含む。好ましいリン脂質は、大豆又は卵レシチンなどのホスファチジルコリン（レシチン）である。レシチンは、粗植物油を水洗し、得られた水和ガムを分離して乾燥させることによって、ホスファチド及びトリグリセリドの混合物として得ることができる。精製製品は、アセトン洗浄によってトリグリセリド及び植物油を除去した後に残ったアセトン不溶性リン脂質及び糖脂質の混合物を分別することによって得ることができる。代替的に、レシチンは、様々な商業的供給源から得ることができる。他の好適なリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、及びホスファチジルエタノールアミンを含む。リン脂質は、天然源から単離され得るか、又は従来通り合成され得る。

【0108】

本発明で使用するために好適な非天然の合成界面活性剤は、ソルビタン系非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸置換ソルビタン界面活性剤、ポリエトキシル化ソルビトールの脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮ（商標））、ヒマシ油などの源からの脂肪酸のポリエチレングリコールエステル、ポリエトキシル化脂肪酸、ポリエトキシル化イソオクチルフェノール／ホルムアルデヒドポリマー、ポリオキシエチレン脂肪酸アルコールエーテル（ＢＲＩＪ（商標））、ポリオキシエチレンノンフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標））、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ）を含む。

【0109】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。担体は、組成物の他の成分と適合性があり、対象に有害でないという意味で、「許容される」必要がある。典型的には、担体は、滅菌され、発熱物質を含まず、使用される投与様式に基づいて選択される。組成物を含む製薬学的に許容可能な担体のための好ましい製剤は、米国（ＵＳ）農務省若しくは米国食品医薬品局、又は米国以外の国における同等の政府機関によって公布された適用可能な規制で承認された医薬品担体であることは、当業者に周知である。したがって、組成物の商業的製造のための薬学的に許容される担体は、既に承認されているか、又は米国又は外国の適切な政府機関によって承認されるであろう担体である。

【0110】

組成物は、任意選択で、薬学的ビヒクル、賦形剤、又は媒体として機能する、適合性がある薬学的に許容される（すなわち、無菌又は無毒）液体、半固体、又は固体希釈剤を含み得る。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含み得る。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含み得る。安定剤は、とりわけ、アルブミンを含む。

【0111】

組成物は、また、例えば、ゲンタマイシン、メルチオレート、又はクロロクレゾールを含む抗生物質又は保存剤を含有し得る。選択される様々なクラスの抗生物質又は保存剤は、当業者に周知である。

【0112】

キットが提供され得る。キットは、変換に備えて細胞を単離及び培養するために好適な細胞又は試薬、Ｔ細胞を培養するために好適な試薬、並びにワクチンアジュバントのエピゲノム効果を決定するために有用な試薬を更に含み得る。キットは、また、チューブ、緩衝液など、及び使用説明書を含み得る。

【0113】

実験
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われる全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に対する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別様に示されない限り、部とは重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。

【0114】

実施例１
ＡＳ０３でアジュバント添加されたワクチン接種のシステム生物学的分析は、ヒトにおけるアジュバント性及び抗体持続性のメカニズムを明らかにする。
ＡＳ０３がヒトにおいて堅牢で持続的な免疫応答を誘導する分子メカニズムを解明するために、ここでは、健康な成人のコホートにおいて、ＡＳ０３あり又はなしでの、大流行前のＨ５Ｎ１トリインフルエンザワクチンに対する細胞、転写、及び代謝応答の詳細なマルチオミクス分析を行った。インフルエンザワクチンデータセットのメタアナリシスを介して、ＡＳ０３によって特異的に誘導される遺伝子の重要なセットを特定することができた。これらの遺伝子の経路分析は、ＡＳ０３の作用メカニズムにおけるアポトーシスの重要な役割を示唆する。更に、血漿メタボロミクス分析は、脂質及び脂肪酸代謝におけるＡＳ０３誘導性撹乱が、ＡＳ０３特異的アポトーシスシグネチャの発現と高度に関連していることを明らかにした。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ワクチン接種者の独立した盲検コホートにおいて、抗体応答寿命を首尾よく予測することができる初期の遺伝子シグネチャを確立することができた。その後の単一細胞プロファイリングは、この細胞接着関連寿命シグネチャの主な駆動因子として、血小板間のＲＮＡ含有量の差異を明らかにした。総合的に、これらの結果は、パンデミックアジュバントＡＳ０３がワクチン接種に対する強力で永続的な免疫を誘導することができるメカニズムに関する重要な洞察を提供し、将来のパンデミックに対するワクチンを改善するための新しいアジュバントの標的化された開発を導くために役立ち得る。

【0115】

ＡＳ０３は、ブースターワクチン接種後に増強される強力な初期転写シグネチャを誘導する。我々は、２１～４５歳の合計５０人の健康な対象を２：１の比で無作為化し、ＡＳ０３アジュバントあり（ｎ＝３４）又はなし（ｎ＝１６）で投与された、２１日間隔で２回の一価、分割ビリオン、不活性化Ｈ５Ｎ１クレード２．１ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／２００５インフルエンザワクチンを投与した（図１Ａ及び補足表１）。図１Ａに示されるように、非アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種に対する先天性及び適応性免疫応答の包括的な全体像を得るために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）対して遺伝子発現分析を行い、ワクチン接種の初日及びその後の一定の間隔でワクチン誘導Ｂ細胞及びＴ細胞応答の主要な免疫学的パラメータを測定した。

【0116】

我々は、ＰＢＭＣにおける遺伝子発現に対するＡＳ０３の影響を調べることから調査を開始した。まず、アジュバント群及び非アジュバント群の両方において、ワクチン接種後の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を特定した。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３は、Ｈ５Ｎ１単独よりもはるかに堅牢な転写応答を誘導し、大部分のＤＥＧは、プライム及びブースト後の１日目に観察された（図１Ｂ）。異なる時点での両方の群間のＤＥＧにおける重複を調べることによって、プライム後３日目の非アジュバント群におけるピーク応答が、アジュバント群における１日目のプライム応答及びブースト応答と多くの遺伝子を共有したことが観察され（図８Ａ）、これは、非アジュバント対象では応答の動態が遅延していることを示している。

【0117】

Ｈ５Ｎ１ワクチン接種に応答して活性化された特異的経路を特定するために、我々は、ワクチン接種後の倍数変化によってランク付けされた遺伝子に対して遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を行った。この分析の基礎として、我々は、公的に利用可能なヒト血液トランスクリプトームの大規模なネットワーク統合を通じて、我々のグループによって以前に特定された一連の血液転写モジュール（ＢＴＭ）を使用した。高レベルの機能カテゴリーに従ってＢＴＭ濃縮スコアを併合すると、ＡＳ０３が、プライム後１日目及び７日目の広範な先天性及び適応性免疫細胞及び経路の発現をそれぞれ増加させ、ワクチン接種を促進することが明らかになった（図１Ｃ及び図１Ｄ）。特に、我々は、各免疫化後の初期時点での単球及び樹状細胞（ＤＣ）活性化に関連するＢＴＭの強力な濃縮を見出したが、７日目の応答は、主に、堅牢なＢ細胞及び形質細胞転写応答によって支配された。一方、非アジュバント対象は、図１Ｅに詳述されるように、プライム用量の後に非常に少ない免疫活性化を示し、抗原提示及びインターフェロンシグナル伝達などの先天性応答の適度な濃縮を達成するためにブースト用量を必要とした。したがって、Ｂ細胞及び形質細胞モジュールは、プライムの７日後に非アジュバント群でのみ軽度に調節された（図１Ｃ）が、アジュバント群よりも程度が低いもののブースト後により強く調節された（図１Ｄ）。

【0118】

特に、遺伝子発現に対するＡＳ０３の効果を分析している間、アジュバントワクチンの各用量後に転写活性の有意な違いに気付いた。実際に、我々は、各用量後にＡＳ０３によって引き起こされる免疫応答の種類に全体的に広範な類似性があるにもかかわらず、ブースター投与後１日目（ｄ２２）において、プライム後１日目と比較してインターフェロンシグナル伝達及びＤＣ活性化に関連するいくつかのＢＴＭがより強く上方制御されることを見出した（図１Ｆ及び図１Ｇ）。しかしながら、３日目及び２４日目の応答に対する遺伝子発現分析は、プライム免疫化とブースト免疫化との間のより多くの定性的な違いを明らかにし、複数のＢＴＭは、第１の用量の後に負に濃縮されたが、ＡＳ０３を用いた第２のワクチン接種の後に正に濃縮された（図１Ｈ）。重要なことに、顆粒球、単球、並びにＩＬ－８及びＨＢＥＧＦなどのマクロファージの動員のための重要な化学療法機能を有する分子をコードする転写因子ＰＡＸ３の制御下にある遺伝子は、プライム後３日で下方制御されたが、ブースト後３日で依然として強力に上方制御されるようであり（図１Ｉ及び図８Ｂ）、したがって、Ｈ５Ｎ１ワクチン接種に対する先天性免疫応答の質、大きさ、及び持続性に関するＡＳ０３を用いたプライム－ブーストレジメンに対する以前に評価されていない含意が示唆された。

【0119】

アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種は、細胞移動の転写シグネチャに関連する持続性を有する保護性Ｈ５ヘッド指向性抗体応答を促進する。ＡＳ０３は、インフルエンザワクチン接種の文脈において、ヒトにおける抗体応答を増強することが以前に報告されている。したがって、ＡＳ０３を用いた免疫後の全ての測定された時点で、Ｈ５Ｎ１Ａ／インドネシア特異的微小中和（ＭＮ）力価の有意な増加が観察された（図２Ａ）。ブースターワクチン接種は、ＨＡＩ力価によって決定されたように、４２日目までに７０％のセロコンバージョン率をもたらした（図８Ｃ及び補足表２）。対照的に、非アジュバント群の対象は、ＭＮ及びＨＡＩ応答が有意に低いことを示し、ベースラインレベルに対するＨＡＩ力価の４倍の増加を達成したワクチンレシピエントはいなかった。ＡＳ０３アジュバントワクチン接種は、ワクチン株に対する中和抗体の誘導に加えて、クレード２に属する３つの異種Ｈ５Ｎ１株、すなわち、クレード２．２．１ Ａ／トルコ、クレード２．２．１ Ａ／エジプト、及びクレード２．３．４ Ａ／安徽（図８Ｄ）に対する広範なクロスクレード中和抗体を促進したが、クレード１Ａ／ベトナム株に対しては促進せず、ＡＳ０３が、系統的に近いが、遠くないＨ５Ｎ１ウイルスに対する広範な抗体媒介交差保護を誘導することを示した。

【0120】

更に、我々は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）リアルタイム動態アッセイを使用して、ブーストＨ５Ｎ１ワクチン株に由来する組換えＨＡ１（ヘッド）及びＨＡ２（ステム）ドメインに対する総抗体結合及びポリクローナル血清抗体親和性を定量化した。ＳＰＲ測定は、ＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチンを受けた対象が、非アジュバント群の対象と比較して、プライム及びブーストの両方の後、Ｈ５ヘッド及びステムサブユニットの両方に対して有意に高いレベルのＨＡ結合抗体を示すことを示した（図８Ｅ）。重要なことに、両方のコホートは、プライム免疫化後に主にＨ５ステムドメインを標的とする抗体を生成したが、Ｈ５ヘッド：ステム抗体比は、２回目の免疫化後にＡＳ０３群で劇的に変化し、Ｈ５ヘッドドメインに対して向けられたポリクローナル抗体の濃度の実質的な増加は、経時的に継続し（図２Ｂ）、ＭＮ力価と相関した（図８Ｆ）。対照的に、Ｈ５Ｎ１を単独で受けた研究参加者は、ワクチン接種後にＨ５ヘッド特異的抗体の濃度のわずかな増加しか生じず、このワクチン群における抗体応答は、主にＨ５ステム特異的抗体価の中程度の増加に限定された。更に、抗原－抗体複合体の解離速度は、プライム後の非アジュバント群と同等であるが、Ｈ５ヘッドドメインに対する抗体親和性は、ブースト後のＡＳ０３群で有意に高く（図２Ｃ）、ＭＮ力価と相関する（図８Ｇ）ことを明らかにした。予測可能なことに、Ｈ５Ｎ１単独では、Ｈ５ヘッド及びステムドメインに対して限定的な抗体親和性成熟のみを誘導することができ（図２Ｃ）、したがって、抗体レパートリーのエピトープ拡散ではなく、記憶想起応答の再発を示唆していた。

【0121】

最近のＣＯＶＩＤ－１９危機により、パンデミック発症の初期段階のように、特に複数の流行波が発生し、ワクチンの需要が供給を上回る可能性があるシナリオで、長期的な保護を誘導し得るパンデミックワクチンを開発することの重要性が強まった。ここで、我々は、プライムＨ５Ｎ１＋ＡＳ０３ワクチン接種後４２日目と１００日目との間の幾何平均ＭＮ及びＨＡＩ力価の４倍の減少を観察した（図２Ａ及び図８Ｃ）。Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３に対する抗体応答とＴＩＶに対する抗体応答との比較は、トリインフルエンザに対する抗体価が、ワクチン接種後数ヶ月以内に季節性インフルエンザ株に対するものと類似の大きさの減少を示すことを示した（図９Ａ）。抗体応答の相対的継続性の評価基準として、我々は、４２日目のＨＡＩ力価と１００日目のＨＡＩ力価との間の線形適合から残量を計算した（図９Ｂ）。このアプローチは、最初の４２日目の応答に対する１００日目の力価の依存性を除去し、残量は、「正規化された」１００日目の力価として見ることができ、正の値は、平均よりも持続的な応答を有する対象を示す。

【0122】

まず、我々は、２８日目のＨＡＩ力価と相関することが示された季節性インフルエンザワクチン接種を用いた以前の研究で我々及び他の研究者により観察された７日目の「形質芽細胞シグネチャ」が、抗体応答の持続性と相関するか否かを決定した。季節性インフルエンザワクチンに関する我々の研究で以前に見られたように、これと持続性との相関は観察されなかった（図２Ｃ及び図２Ｄ）。

【0123】

継続的な抗体応答に関連する転写シグネチャを特定するために、我々は、１００日目／４２日目残量との相関によってランク付けされた遺伝子に対してＧＳＥＡを実行した（図２Ｄ）。濃縮されたシグネチャは、用量間で異なるように見え、プライム後７日目の細胞周期関連モジュールの発現及びブースト後１～７日目の細胞接着／血小板活性化関連モジュールは、継続性の増加と関連付けられている。我々は、これらの結果を、ＴＩＶワクチン接種における継続性の以前に特定されたシグネチャと比較し、有意な重複があることを見出した（図２Ｄ）。具体的には、血小板活性化／アクチン結合モジュールＭ１９６内の遺伝子は、両方の研究（図２Ｅ及び図２Ｆ）において、抗体継続性との相関において強い一致を示し、インフルエンザワクチン接種に対する長寿命抗体応答の発達における共通のメカニズムを示していた。

【0124】

更に、抗体継続性のこれらのシグネチャの堅牢性を検証するために、機械学習アプローチを使用して、独立し盲検試験セットで抗体継続性を予測することができる分類子を訓練した。簡潔に述べると、我々は、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３データを訓練セットとして、及び２０１０／２０１１ＴＩＶデータを検証セットとして使用して、１００／４２日目のＨＡＩ残量を予測するために、ＢＴＭレベルの特徴に基づいて線形回帰モデルを訓練した（詳細については方法を参照されたい）。２８／２１日目の遺伝子発現データを用いて、予測された１００／４２日目のＨＡＩ残量が、盲検試験セットで測定された残量と有意に相関するモデルを構築することができた（図２Ｇ）。特に、これらの予測モジュール内の遺伝子の分析は、抗体継続性と最も高い関連性を有するそれらの多くが、細胞接着／移動（ＣＴＴＮ、ＣＤＨＲ５、ＭＹＬＫ）に関与し、かつ／又は血小板（ＳＥＬＰ、ＰＲＯＳ１、ＰＦ４、ＰＰＢＰ）で高発現したことを示し（図２Ｈ）、ＡＳ０３アジュバントワクチン接種に対する持続的な抗体応答の確立における細胞移動及び血小板の潜在的な役割を示していた。

【0125】

ＣＩＴＥｓｅｑ分析は、抗体継続性の転写シグネチャのための血小板起源を明らかにする。我々の発見によって促されて、我々は、抗体継続性のこの新たに特定された転写シグネチャの細胞起源を調べようとした。これを達成するために、我々は、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ（配列決定によるトランスクリプトーム及びエピトープの細胞インデックス化）を行い、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３ワクチン接種に対する３人の「継続的」及び３人の「減弱」抗体応答者（それぞれ、１００／４２日目のＨＡＩ残量＞０及び＜０）から、２１日目及び２８日目にＰＢＭＣの単一細胞タンパク質及びトランスクリプトームランドスケープを構築した。最初の前処理後、我々は、６２，７８９個の細胞についてのトランスクリプトームを得た。ＵＭＡＰ及びグラフベースのクラスタリングを介した次元削減（詳細については方法を参照）を介して、全ての試料及び時点に均等に分布した２６個の異なるセルクラスタを識別することができた（図１０Ａ）。低品質細胞を除外するための細胞型アノテーション及び細胞ごとの品質管理処理（方法セクション及び補足図４Ａ～図４Ｃを参照）に続いて、我々は単一免疫細胞ランドスケープ（図３Ａ）を構築し、予測シグネチャ（図２Ｈに報告されるように）における抗体寿命関連遺伝子が、バルクＰＢＭＣ遺伝子発現分析によって以前に示唆されたように、血小板において、並びに単球及び血小板の両方の特徴を共有する細胞の小さなクラスタにおいて、実際に高く発現したことを見出した（図３Ｂ）。

【0126】

我々は次に、継続性応答者と減弱応答者との間の予測遺伝子シグネチャの違いが、単一細胞レベルでどのように出現したかを調査することに着手した。ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析がマイクロアレイデータと同じ免疫応答ダイナミクスをキャプチャしたことを確認するために、マイクロアレイによって測定されたＤＥＧの２８／２１日目ＦＣをＣＩＴＥ－ｓｅｑからの擬似バルク推定値と比較した（図１０Ｂ）。この比較において、５人の対象は、２つの測定値の間に強い相関を示し、一方、１人の対象は、一致を示さず、したがって下流の分析から除外された。全体として、バルクＰＢＭＣマイクロアレイの結果に従って、継続性応答者は、減弱応答者と比較して、抗体持続性シグネチャの有意に高い偽バルク発現を有した（図３Ｃ、左パネル）。重要なことに、擬似バルク計算から一度に１個の細胞クラスタを除外することによって、我々は、分析から血小板クラスタを除外することが、継続性抗体応答者と減弱抗体応答者との間で観察される転写差のほぼ完全な喪失をもたらしたことを見出した（図３Ｃ、右パネル）。この「除外アプローチ」は、バルクＰＭＢＣ分析で観察された持続性シグネチャがほとんど血小板に由来することを再び実証した。

【0127】

しかし、継続的応答者と減弱応答者との間で、血小板頻度に明確な差は見られなかった（図３Ｄ）。追加的に、血小板集団内の細胞当たりの正規化された発現を比較すると、２つの群間の２８／２１日目の遺伝子シグネチャに有意差は観察されなかった（図１０Ｃ）。対照的に、我々は、２１日目と２８日目との間に、特に継続的応答者の間では生じなかった、血小板集団内の総読み取りの大幅な減少を記録し（図３Ｅ）、したがって、継続的応答者と減弱応答者との間の抗体持続性シグネチャに捕捉された転写差の主な原因として、血小板頻度ではなく血小板内のＲＮＡ含有量の減少が示された。

【0128】

予測抗体持続性シグネチャの細胞起源を特定することだけでなく、我々は、また、バルク発現測定によって最初に検出されなかった継続的応答者と減弱応答者との間の追加の細胞特異的差異を特定できるか否かを問うた。この目的のために、我々は、偏りがない比較を行い、各時点及び各クラスタ内での継続的応答者及び減弱応答者由来の細胞間のＤＥＧを決定し、続いて、ＢＴＭに含まれる遺伝子の過剰表現分析を行った。ワクチン接種に対する抗体応答を担う一次細胞型として、特に興味深かったことは、スプライセオソーム及び電子輸送発現における形質芽細胞間の差異であった（図３Ｆ）。これらのモジュール内の遺伝子を比較すると、継続的応答者の形質芽細胞が、減弱応答者と比較して、小さな核リボ核タンパク質及びミトコンドリア呼吸電子輸送複合体をコードする遺伝子の発現の上昇を有することが観察された（図３Ｇ）。これらの結果は、Ｂ細胞の活性化及び形質細胞による抗体産生に必要な重要な代謝プロセスとしての酸化的リン酸化及びミトコンドリア再構築を示す最近の知見と一致する。

【0129】

血液中のワクチン誘導Ｔ濾胞ヘルパー細胞の頻度は、中和抗体価及び抗体アビディティと相関する。ＡＳ０３によって促進されるＨ５抗原に対する高親和性を有する中和抗体の生成は、Ｈ５Ｎ１ワクチン接種の文脈におけるＴ濾胞ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞の役割を調査することを促した。Ｔｆｈ細胞は、胚中心（ＧＣ）におけるＢ細胞の親和性成熟にとって重要であり、動物モデルにおけるＡＳ０３を用いた免疫化後に以前にモニタリングされている。ボーンファイドＧＣ Ｔｆｈ細胞は、末梢血において一般的に検出されないが、我々は、Ｈ５Ｎ１ワクチン接種の前後に、以前にＧＣ Ｔｆｈ細胞と機能的に類似していると説明された循環Ｔｆｈ様ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を測定した。我々は、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３による免疫化が、各免疫化後７日目に、活性化された、ＰＤ－１＋ＩＣＯＳ＋、血液Ｔｆｈ細胞の頻度の増加をもたらすことを見出した（図４Ａ）。驚くべきことに、ブースト後に観察された活性化Ｔｆｈの増加は一貫しており、ＭＮ力価（図４Ｂ）及びＨ５ヘッドドメインに対する抗体親和性（図４Ｃ）の両方の増加と相関していた。逆に、我々は、非アジュバント群において、ワクチン接種後の活性化Ｔｆｈ細胞頻度の有意な変化を検出しなかった。

【0130】

ワクチン誘導血液Ｔｆｈ細胞を更に特性評価するために、我々は、７日目及び２８日目に、ＰＤ－１＋ＩＣＯＳ＋ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋活性化及びＰＤ－１－ＩＣＯＳ－静止ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳでソートし、Ｃｌａｒｉｏｍ Ｓ技術を使用してそれらの遺伝子発現をプロファイリングした。追加的に、以前の研究では、Ｂ細胞ヘルパー電位に基づいて、末梢非効率的Ｔｆｈ１（ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６－）細胞及び効率的Ｔｆｈ２（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６－）又はＴｆｈ１７（ＣＸＣＲ３－ＣＣＲ６＋）細胞を区別するＣＸＣＲ３及びＣＣＲ６マーカーの能力が説明されていたため（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、我々は、Ｔｆｈ細胞の分極が、免疫化後に２つのワクチン群間で観察された活性化Ｔｆｈ頻度の違いを説明できるか否かを探求しようとした。

【0131】

（図１２Ａに提示されるように）ソートされたＴｆｈサブセットの遺伝子発現分析は、Ｔｆｈ１及びＴｆｈ２の両方の集団で一貫していた、活性化Ｔｆｈ細胞と静止Ｔｆｈ細胞との間の有意な転写差を明らかにした（図４Ｄ）。活性化Ｔｆｈは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方によって構成的に分泌される自然応答及び適応応答の両方の重要な免疫調節因子であるフィブリノーゲン様タンパク質２をコードするＦＧＬ２遺伝子の発現を上方制御し（Ｍａｒａｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、また、その産物が細胞傷害能を有するリンパ球によって選択的に産生されるＦＧＦＢＰ２（以前はＫＳＰ３７として知られていた）も上方制御した。驚くべきことに、我々は、また、通常骨髄細胞に見られるＣ型レクチン受容体ＣＬＥＣ７Ａ、並びに単球に豊富に存在するＳ１００カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、及びＳ１００Ａ１２に加えて、リゾチーム（ＬＹＺ）及びＩＬ１βなどの自然免疫細胞に典型的な既知の抗菌特性を有するタンパク質をコードする遺伝子の強い調節に気付いた。したがって、ＤＥＧのＧＳＥＡ分析は、単球関連ＢＴＭの有意な濃縮を明らかにし、そして、我々のソートした集団における血液Ｔｆｈ以外の他の細胞型の浸潤の可能性を示唆した（図１２Ｂ）。我々の目的は、異なる活性化状態における末梢ＣＸＣＲ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの選択的単離であったため、これらの結果は明らかに予想外であった。これらの所見を更に調査するために、我々は、細胞型特異的遺伝子発現参照を使用して細胞型割合をデコンボリューションするために開発された計算方法であるＣＩＢＥＲＳＯＲＴを使用した。我々のＧＳＥＡ分析と一致して、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴアルゴリズムは、活性化Ｔｆｈ集団における単球特異的遺伝子の強力な濃縮を特定し（図１２Ｃ）、したがって、活性化されたが静止していないソートされた血液Ｔｆｈ細胞の間の単球の有意かつ選択的な存在を推定した（図４Ｅ）。最近の研究では、ヒト血液中のＣＤ４＋記憶Ｔ細胞－単球複合体の存在が初めて説明された。注目すべきことに、これらのＣＤ３＋ＣＤ１４＋Ｔ細胞－単球二重鎖は、従来のフローサイトメトリーを使用して観察された場合にライブシングレットゲートを追加し、活性免疫応答中に形成する。末梢循環におけるこれらの細胞会合の起源及び生物学的役割は、現在不明である。

【0132】

Ｔｆｈ活性化に関連する転写メカニズムに対する我々の当初の関心を考慮して、我々は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを使用して、ソートされたＴｆｈ細胞におけるＣＤ４ Ｔ細胞特異的発現を推定し（したがって単球成分を計算上除外し）、次いで、ＧＳＥＡを実行して、活性化Ｔｆｈ対静止Ｔｆｈで濃縮されたＢＴＭを特定した。驚くことではないが、我々は、細胞周期及びエネルギー代謝関連転写モジュールにおける強力な濃縮を見出したが、これは、活性化Ｔｆｈ細胞について、それらの静止した対応物と比較して、より高い代謝状態及び増殖の増加を示していた（図４Ｆ及び図４Ｇ）。我々の分析は、また、Ｔｆｈ細胞の活性化プロセスが、Ｔ細胞の生存、分化、及び拡大を制御する主要なキナーゼの１つであるポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）を中心に展開する可能性があることを示唆している（図４Ｆ及び図４Ｈ）。最後に、ソートされたＴｆｈ細胞集団の遺伝子レベル分析、続いて教師なしのクラスタリングが、それらの活性化状態に基づいてＴｆｈサブセットの分離に成功し、活性化Ｔｆｈ細胞におけるヒストンタンパク質及びインターフェロン刺激遺伝子（ＩＦＮ－γ産生を増強することで知られるＩＳＧ１５など）をコードする遺伝子の強い上方調節を強調した（図４Ｉ）。活性化されたＴｆｈ型（Ｔｆｈ１対Ｔｆｈ２）、又は異なる時点で活性化されたＴｆｈ（ｄ７対ｄ２８）を区別することができる主な遺伝子発現クラスタは観察されなかった。重要なことに、ＡＳ０３＋Ｈ５Ｎ１は、Ｈ５Ｎ１単独と比較して、ワクチン接種後の循環活性化Ｔｆｈの有意に高い頻度を誘導したが、２つのワクチン接種群の対象から単離された活性化Ｔｆｈ細胞間の転写レベルでの大きな差は見られなかった。総合すると、これらのデータは、非アジュバントワクチン接種と比較して、ＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種がプライムワクチン及びブーストワクチンの両方の後に循環する活性化Ｔｆｈ細胞のより高い頻度を促進することを示唆している。活性化Ｔｆｈ細胞の頻度は、アジュバント群におけるＨ５ヘッドドメインに対する中和抗体及び抗体親和性と正の相関があり、したがって、Ｂ細胞親和性成熟及び抗体産生のＡＳ０３駆動Ｔ細胞依存性メカニズムを示す。

【0133】

初期の分子シグネチャは、増強後の免疫応答の複数のマーカーに関連付けられる。アジュバント群におけるワクチン接種後に測定された抗体及びＴｆｈ細胞応答の強力な誘導によって、我々は、ＡＳ０３によって誘導される複数の適応免疫パラメータに共通する初期転写シグネチャ、具体的には、ｉ）活性化Ｔｆｈ周波数、ｉｉ）Ｈ５ヘッド指向性抗体親和性成熟、及びｉｉｉ）中和力価の増加を特定することが可能であるか否かを問うことになった（図５Ａ）。重要なことに、これらの３つの測定値だけで、図５Ｂに示されるように、ワクチン群によって対象を効率的に分離することができ、したがって、適応免疫の生成につながる生物学的メカニズムにおける実質的な分子及び細胞の違いを暗に意味している。３つのパラメータ全てとの相関によってランク付けされた遺伝子に対して行われたＧＳＥＡは、一般的に濃縮されたモジュールの最大数がプライム後１日目に生じたことを明らかにし（図５Ｃ）、ブースト用量に対するＡＳ０３によって誘導される堅牢な適応応答には強力な一次応答が必要であることを示唆している。プライム後１日目に一般的に濃縮されたモジュールの多くは、炎症性及びインターフェロンシグナル伝達、並びに単球及びＤＣ活性化に関連していた（図５Ｄ）。これらの結果は、ＡＳ０３アジュバントＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン接種後２４時間以内にインターフェロン調節及び単球活性化関連遺伝子が有意に上方制御されることが見出された、臨床環境におけるＡＳ０３を用いた以前のシステムベースの研究からのデータと一致する。興味深いことに、１日目のいくつかのＴ及びＢ細胞モジュールにおける強い下方調節も、調査中の３つの高度に相関する免疫パラメータと相関していた。

【0134】

遺伝子レベルでは、我々は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム遺伝子の堅牢な１日目の上方調節が、ＡＳ０３を用いたアジュバント接種によって誘導されるＢ細胞応答及びＴ細胞応答の両方と強く関連していることを見出した（図５Ｅ）。ミョウバン及びスクアレン系エマルションは、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を誘導することが以前に示されているが、適応免疫を促進するためのこれらのアジュバントに対するＮＲＬＰ３の要件は依然として議論されている。追加的に、我々は、インターフェロン関連遺伝子ＩＲＦ８及びＡＴＦ３の過剰発現も、また、ＡＳ０３によって促進される強力な適応性免疫特徴と正の関連があることに気付いた（図５Ｅ）。ＩＲＦ８は、その機能が共通する前駆細胞からの単球及び樹状細胞の発達に不可欠である、骨髄細胞において高度に発現される転写及びインターフェロン調節因子である。骨髄細胞において、ＩＲＦ８は、Ｂａｘ及びＦａｓの発現を調節して、アポトーシスを調節する。興味深いことに、最近２つの論文が、インビボで細菌感染を中和するためのＮＲＬＣ４及びＮＲＬＰ３インフラマソームの両方の活性化におけるＩＲＦ８の重要な役割を報告している。一方、ＡＴＦ３は、多種多様な生理的ストレスによって誘導され、炎症イベント、代謝ストレス応答、及びアポトーシスプロセスから生じる多様なシグナルを統合する。ＡＴＰの生成に重要であり、低酸素誘導細胞死の予防における役割を有する代謝調節因子をコードする電子輸送鎖遺伝子ＳＣＯ２も、また、ＡＳ０３を用いたワクチン接種後に高度に上方調節され、分析におけるＢ細胞及びＴ細胞の特徴と正に関連していた。興味深いことに、ＡＳ０３類似体であるスクアレン系アジュバントＭＦ５９は、そのアジュバント性のメカニズムについて、初期ＡＴＰ産生及び細胞外放出に依存することが示されている。現在のところ、このプロセスにおけるＳＣＯ２の潜在的な役割は不明である。更に、免疫細胞におけるＩＦＮ－ｇ及びＩＬ－６を含む炎症性サイトカインのためのマルチリガンド受容体としても機能する一方で、脂質代謝を調節するｔｒａｎｓ－Ｇｏｌｇｉネットワークのタンパク質トランスポーターをコードするＳＯＲＴ１の発現も、３つのＡＳ０３誘導適応性免疫パラメータの増加と並行している。最後に、１日目のＴＲＡＦ１の下方調節は、Ｔｆｈ活性化の増加、抗体媒介性中和、及び親和性成熟と負に関連付けられた。この遺伝子産物は、炎症の負の調節因子として機能し、ＴＲＡＦ２及びＩＡＰと協力して、ＴＮＦ受容体からの抗アポトーシスシグナルを媒介する。その抑制は、ＡＳ０３注射後の炎症促進性、アポトーシス促進性環境の初期形成が、ワクチン接種に対するＢ細胞及びＴ細胞の適応性免疫応答の両方に有利であるという更なる証拠を提供する。

【0135】

インフルエンザワクチン試験のメタ分析は、末梢における活性化Ｔｆｈ周波数と相関するＡＳ０３特異的転写シグネチャを明らかにする。本試験におけるＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種と非アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種との間の直接比較は、ＡＳ０３アジュバント性の細胞及び分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供したが、我々は、ワクチン接種に対する免疫応答の調節におけるＡＳ０３アジュバントの独自の役割を更に解析するために、文献で利用可能な追加のインフルエンザデータセットに我々の研究を拡大しようとした。これを念頭に置いて、我々が取り組みたかった重要な問題は、Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３に対する免疫応答が季節性インフルエンザ株に対する応答とどの程度共通しているかということであった。この目的のために、我々は、三価不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）に対する応答を調べる我々の以前の研究からのデータを使用して、複数のインフルエンザの時期にわたる１～７日目のワクチン接種後の倍数変化によってランク付けされた遺伝子に対してＧＳＥＡを行った。両方のワクチンに応答して、特に１日目及び７日目に、濃縮経路間に高い程度の重複があった（図１３Ａ）。これらの結果は、非アジュバントＨ５Ｎ１ワクチンとＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチンとの間の応答を比較した際に大きさ及び動態の両方においてはるかに大きな転写差を観察した、この試験における以前の所見とは異なり、そこから発展される。我々のデータは、ヒトが既存の免疫を持っていない鳥由来のインフルエンザ抗原に対するナイーブ免疫応答を高める一方で、免疫系の活性化状態を季節性ＴＩＶワクチン接種後に観察されたレベルに匹敵するレベルに迅速に上昇させるＡＳ０３の能力を反映している。

【0136】

Ｈ５Ｎ１＋ＡＳ０３及びＴＩＶに対する応答は、広いレベルで非常に類似していたが、我々は、ＡＳ０３に固有の転写シグネチャを特定することが可能であり、したがって、アジュバントが強力な免疫応答を誘導する特定のメカニズムを反映し得る季節性ＴＩＶ又は非アジュバントＨ５Ｎ１による免疫後に通常存在しないかどうかを疑問に思った。この目標を達成するために、本試験のプライム用量及びブースト用量の両方からのデータ、並びにＡＳ０３アジュバントＨ１Ｎ１ワクチン接種に対する応答の以前の研究からの公的に利用可能なデータを組み込み、これを複数のＴＩＶ試験からの遺伝子発現データと比較した（図６Ａ；補足方法も参照されたい）。ＡＳ０３と季節性応答との間の平均ｔ統計量によってランク付けされた遺伝子のＧＳＥＡは、複数の好中球関連モジュール、及びＷＮＴ／レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）シグナル伝達モジュール（図１３Ｂ）を明らかにしたが、これは、季節性応答と比較してＡＳ０３アジュバントで有意な濃縮を示した（図１３Ｃ）。

【0137】

我々は、また、このアプローチを、各季節的データセットと比較して、全てのＡＳ０３データセットにおいて差次的に発現した共通の遺伝子セットをペアワイズで特定することによって、遺伝子レベルに拡張した（図６Ａ）。我々は、ＡＮＫＲＤ２２、ＫＲＥＭＥＮ１、ＴＧＭ２、ＫＬＦ４、ＴＭＥＭ１５９、ＳＴＲＮなどのその多くがＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達に関与することが知られている１１個の遺伝子のリスト（図６Ｂ）を得、これはＡＳ０３の作用メカニズムにおけるこの経路の可能な役割を示唆している。重要なことに、私たちの知る限り、これらの１１個の遺伝子及びそれらの産物のいずれも、依然にＡＳ０３の作用メカニズムに関連付けられていないか、より一般的には、インフルエンザに対する免疫の生成に寄与すると説明されている。

【0138】

ＡＳ０３アジュバントワクチン接種への応答中のこれらの遺伝子の状況を更に探索するために、全てのＡＳ０３データセットにおける有意に相関するパートナー遺伝子のセットを、各ＡＳ０３固有ＤＥＧについて決定した。これらのパートナーセットは、ＤＥＧのうちの３つ、ＡＮＫＲＤ２２、ＫＲＥＭＥＮ１、及びＴＧＭ２が互いに強く相関し、多数の共相関遺伝子を共有していることを明らかにした（図１３Ｄ）。ＫＲＥＭＥＮ１は、ＷＮＴシグナル伝達を負に調節するために、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１（ＤＫＫ１）及びＬＤＬ受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）と複合体を形成することが知られているが、この遺伝子は、カスパーゼ３活性化を誘導することによって、ＷＮＴ非依存的な様式でプログラム細胞死を媒介する依存性受容体としても機能するように更に説明されている。免疫におけるＡＮＫＲＤ２２の機能についてはほとんど知られていないが、この遺伝子はいくつかのがん組織で高度に発現し、その産物は、がん細胞の代謝リプログラミングに有意に働くことによってがんの進行を促進することが報告されている。対照的に、免疫系におけるＴＧＭ２の役割はよりよく特性評価されている。この遺伝子は、プロアポトーシス及び抗アポトーシスの役割の両方を有するトランスグルタミナーゼに属する多機能酵素をコードする。ＤＣにおいて、ＴＧＭ２は、細菌ＬＰＳに応答して抗原提示細胞の成熟を媒介し、その阻害は、サイトカイン産生及びＤＣ分化を著しく低下させる。ＴＧＭ２活性は、また、マクロファージ及びＤＣへの単球分化にも重要な役割を果たす。これと一致して、我々の研究におけるデコンボリューション分析は、ＡＳ０３を用いたプライムワクチン接種及びブーストワクチン接種の１日後のＫＲＥＭＥＮ１、ＡＮＫＲＤ２２、及びＴＧＭ２の強い上方調節が、リンパ球ではなく、骨髄細胞遺伝子発現、特にＤＣ及び単球の変化にまでさかのぼることができることを示した（図１３Ｅ）。

【0139】

ＡＳ０３への初期応答の堅牢なマーカーとして使用され得る新規の遺伝子シグネチャの特定を確認するために、我々は、我々の研究から特定された３つの「コア」ＡＳ０３特異的遺伝子、ＫＲＥＭＥＮ１、ＡＮＫＲＤ２２、及びＴＧＭ２の発現データに対して訓練された人工ニューラルネットワークベースの機械学習分類アルゴリズムを使用して、ＡＳ０３あり又はなしでのＨ５Ｎ１ワクチン接種への応答の独立した臨床研究からの発現データを含む３つの盲検試験セットにおけるワクチン状態（アジュバント対非アジュバント）を予測した（補足方法を参照されたい）。分類子は、ソートされた単球及び総ＰＢＭＣからの遺伝子発現データで試験した場合に優れた予測精度（＞９０％）を達成したため、外部試験におけるこのＡＳ０３特異的シグネチャの再現性を検証した（図６Ｃ及び図６Ｄ）。

【0140】

注目すべきことに、ＫＲＥＭＥＮ１、ＴＧＭ２、及びＡＮＫＲＤ２２の増強後１日目の発現は、増強後７日目の活性化Ｔｆｈ頻度と正の相関があり（図６Ｅ）、ＡＳ０３誘導Ｔ細胞応答の調節におけるこれらの遺伝子の重要な役割を示唆している可能性がある。興味深いことに、これらの３つの遺伝子の発現は、ＭＮ力価と有意に関連していなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＡＳ０３が、複数の非重複メカニズムを介して強力なＴ細胞及びＢ細胞応答の生成につながった可能性があることを示していると思われる。したがって、ＡＳ０３がインフルエンザ抗原と同時投与された、我々のＡＳ０３特異的シグネチャにおける１つの遺伝子、ＴＭＥＭ１５９の発現のみが、我々の、及び他の公的に利用可能なデータセットの両方において、ＭＮ力価と強く相関した（ただし、活性化Ｔｆｈ頻度とは相関しなかった）（図６Ｆ及び図６Ｇ）。驚くべきことに、ＴＭＥＭ１５９の遺伝子産物の生物学的役割は、最近まで捉えがたいものであったが、Ｃｈｕｎｇらによる的確な研究により、現在脂質液滴アセンブリ第１因子（ＬＤＡＦ１）と改名されたこのタンパク質が、セイピン（ＢＳＣＬ２遺伝子によってコードされる）と複合体を形成して、部位を決定し、小胞体（ＥＲ）における脂質液滴形成を触媒することが明らかになった。これらの知見に照らして、ワクチン接種後の最初の２４時間以内のＴＭＥＭ１５９のＡＳ０３誘導下方調節は、おそらくは、ＡＳ０３アジュバントが主に構成されるコレステロールの天然前駆体であるスクアレン、及び免疫細胞のサイトゾル中の中性脂質の蓄積の結果として、新規の脂質液滴形成の阻害を示す可能性がある。これらのメカニズムは更なる調査を必要とするが、我々の結果は、ＴＭＥＭ１５９の下方調節の根底にある初期のＡＳ０３誘発生物学的現象が、数週間後に観察された強力な中和抗体応答の生成の決定要因を表す可能性があることを示唆していると思われる（図６Ｆ及び図６Ｇ）。

【0141】

ＡＳ０３は、免疫細胞代謝経路の調節を通して免疫原性を高める。アポトーシスに関連する生物学的イベントにおけるＫＲＥＭＥＮ１及びＴＧＭ２を含むＡＳ０３「コア」遺伝子のいくつかの関与は、ＡＳ０３アジュバントワクチンの作用メカニズムにおけるプログラム細胞死の潜在的な役割を探求することを促した。文脈上、Ｂ細胞及びＴ細胞の免疫原性の複数の測定値に関連する初期シグネチャのトランスクリプトームを解析しながら、我々は、ＩＲＦ８、ＳＣＯ２、及びＴＲＡＦ１などの細胞死及び生存の調節に関与することが知られているいくつかの遺伝子を特定したが、これはＡＳ０３駆動の適応免疫の生成の重要な因子としてアポトーシスシグナルを示す可能性がある（図５）。

【0142】

これらのメカニズムを更に調査するために、我々は、アポトーシスの異なる段階に関与する遺伝子の正規のリストについてＲｅａｃｔｏｍｅデータベースを検索し、非アジュバントＨ５Ｎ１又は季節性ＴＩＶワクチン接種の両方と比較して、ＡＳ０３データセット内のＤＥＧをペアワイズで探した。注目すべきことに、我々は、４０個のアポトーシス遺伝子の発現の有意な変化を発見し、その多くは、ブースト後１日目（２２日目）により強く調節され、ＡＳ０３を用いたワクチン接種後に特異的に誘導されたが、非アジュバントワクチンの投与後には誘導されなかったため、プログラム細胞死に関連するメカニズムを誘発するアジュバントの固有の役割を主張した（図７Ａ及び図７Ｂ）。興味深いことに、我々は、アポトーシスの内因性経路及び外因性経路の両方に関与することが知られている遺伝子の調節を観察したが、これは細胞内外からの複数の刺激がこのプロセスに寄与する可能性を示唆している。外因性アポトーシス経路の転写変化は、これらの遺伝子の強力な上方調節によって示されるように、細胞死受容体ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦＳＦ１０）及びＴＬＲ４／ＭＤ－２（ＬＹ９６）軸を伴うように思われたが、ミトコンドリア制御下のアポトーシスの内在的メカニズムは、抗アポトーシス分子ＢＣＬ－２、ＡＫＴ２、及びＡＫＴ３をコードする遺伝子の下方調節、並びにプロアポトーシス分子ＢＩＤ及びカスパーゼ活性化因子シトクロムＣ（ＣＹＣＳ）の上方調節を伴った（図７Ｂ）。実行型カスパーゼ７をコードするＣＡＳＰ７も、また、非アジュバントデータセットと比較して、プライム及びブースト後の両方の１日目に、ＡＳ０３＋Ｈ５Ｎ１群において大幅により上方制御された。これらの所見に一致して、我々は最近、スクアレンベースの水中油型エマルションワクチンアジュバントＭＦ５９による免疫化が、マウスモデルのワクチン接種におけるＭＦ５９取り込み後のリンパ節に存在するマクロファージにおいて細胞死関連シグナル伝達を誘導することを報告した。更に、我々はここで、ＡＳ０３ワクチン接種が、免疫プロテアソームに典型的な３つの触媒サブユニット、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＢ１０（それぞれ、ＬＭＰ７、ＬＭＰ２、及びＭＥＣＬ１としても知られる）の全てを含む、プロテアソームタンパク質をコードする遺伝子（ＰＳＭ－遺伝子）のはるかに強い上方調節を促進することを見出したが、これは、異なる免疫特性を有し、酸化ストレスの管理において確立された役割を有する非常に効率的なタンパク質分解メカニズムのアジュバント駆動型の関与を示唆している。

【0143】

これまでの文献では、ヒトにおけるインフルエンザワクチン応答性の陽性予測因子としてのアポトーシスのバイオマーカーが特定されている。我々の発見に照らして、我々は、免疫原性に寄与し得るＡＳ０３を用いた免疫化後に生じるプログラム細胞死シグナル伝達に関連する細胞イベントを調べようとした。主要な代謝プロセス、特に脂質蓄積及び代謝の制御におけるＡＮＫＲＤ２２、ＴＭＥＭ１５９、ＫＬＦ４、及びＴＧＭ２などのいくつかのＡＳ０３「コア」遺伝子の関与を考慮して、ＡＳ０３が免疫細胞代謝における重要な変化を促進し得ると仮定し、したがって、非標的高分解能メタボロミクスを通して血液メタボロームにおける撹乱を検出できるか否かを問うた。実際、ｍｕｍｍｉｃｈｏｇソフトウェアを使用して得られた示差的に豊富な代謝物ピークの倍数変化値に関する主成分分析（ＰＣＡ）は、ＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種後と非アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種後との代謝軌道の分枝を明らかにし、特に各免疫化後の最初の２４時間以内に、ワクチン群間の実質的な代謝差を強調した（図７Ｃ及び図７Ｄ）。示差的特徴の濃縮分析は、図７Ｅに示されるように、脂質代謝並びに脂肪酸代謝及び活性化に関連する複数の経路におけるＡＳ０３誘導変化を明らかにした。重要なことに、我々は、アポトーシス経路における遺伝子発現変化と特定の代謝産物の存在量との間に有意な相関関係があることに気付いた（図７Ｆ）。特に興味深いことは、アポトーシス関連遺伝子と脂肪酸及びカルニチンシャトル経路における代謝撹乱との間の強い関連性を見出したことである。カルニチンシャトルは、ミトコンドリア膜に不透過性である長鎖脂肪酸がミトコンドリアマトリックスに輸送されてβ－酸化を受け、アセチル－ＣｏＡの形態でエネルギーを生成する（その後、クエン酸サイクルに入る）系を表す。一貫して、ペルオキシソーム酸化を含む飽和脂肪酸のβ酸化に関連する他の代謝経路とアポトーシス遺伝子シグネチャとの間の有意な相関も特定され、これはＡＳ０３がワクチン接種後最初の２４時間以内に細胞脂肪酸代謝の急速かつ強い変化を誘導する可能性があることを示唆している。脂肪酸酸化は活性酸素種（ＲＯＳ）の生成の主な原因の１つであることが知られているため、我々は、脂肪酸酸化の増加の結果としての過剰なＲＯＳ産生は、ＡＳ０３アジュバントがプログラム細胞死の免疫原性メカニズムを誘発する主なシグナルの１つを表す可能性があるという仮説を立てている。この仮説と一致して、脂肪酸活性化及び代謝におけるＡＳ０３誘導代謝変化は、ワクチン特異的中和抗体の生成と強く関連していた（図７Ｆ）。

【0144】

我々はここで、健康なボランティアのコホートにおいて、スクアレンベースのエマルションアジュバントＡＳ０３あり及びなしで投与された大流行前のＨ５Ｎ１トリインフルエンザワクチンに対する細胞、転写、及び代謝応答の詳細なマルチオミクス分析を提示した。公共のリポジトリに保管されている他のいくつかのＡＳ０３アジュバント及び非アジュバントインフルエンザ研究データセットに我々の分析を拡張することによって、我々は、ヒトにおけるＡＳ０３の使用に関する以前のシステムの生物学的報告を大幅に拡大することができ、いくつかの遺伝子シグネチャ、代謝ネットワーク、及びこれまで評価されていない生物学的プロセスを特定したが、ＡＳ０３アジュバントを用いたワクチン接種後の最初の数日以内のそれらの独自の調節は、この臨床研究及び独立した臨床研究におけるワクチン免疫原性の１つ又は複数の評価基準に関連し、いくつかの場合には予測することができる。

【0145】

本研究における最初の知見の中には、ＡＳ０３を用いたプライム及びブースト免疫化後の先天性免疫応答で観察される、定量的及び定性的の両方の転写差がある。一例として、これは、重要な化学誘引物質及び先天性免疫細胞の調節因子をコードする転写因子ＰＡＸ３によって調整された遺伝子の場合であり、その上方調節は、プライム免疫化後の同じ時点と比較して、ブースト後により顕著であり、より長く持続した。「先天性免疫記憶」（又は「訓練された免疫」）という比較的新しい概念は、単球、マクロファージ、又はＮＫ細胞などの先天性免疫細胞が、エピジェネティック修飾を介して内因性又は外因性刺激への以前の曝露を一時的に「覚える」ことができるという現象であり、したがって、それらの挙動を後続の免疫化に変更することは、ＡＳ０３補助ワクチン接種戦略の文脈においてわずかに探求されているに過ぎない。しかしながら、以前の臨床研究では、類似のメカニズムが、ＡＳ０１及びＡＳ０２などの他のアジュバント、並びに抗原にどのように適用され得るかが示されている。この文脈では、アジュバントを組み込み、経時的に保護を誘導し維持するために複数の免疫化を必要とする開発の後期段階にあるいくつかのＣＯＶＩＤ－１９ワクチン技術プラットフォームでは、訓練された免疫関連の現象がワクチン接種の結果に及ぼす影響を世界規模で体系的に探求し定義する前例がない機会がある。これらの研究は、臨床診療に情報を提供し、最適な相同又は異種プライムブーストワクチン接種レジメンを特定するために戦略的に重要となり得、したがって、より効率的なグローバルワクチン接種キャンペーンを可能にする。

【0146】

ヒトにおけるインフルエンザウイルスによる自然感染に対する免疫応答は、比較的広範かつ長寿命であるが、ワクチン誘導免疫は、主に、経時的に減少する傾向がある全身抗体応答を誘導する。我々の研究の主な目的は、ワクチン誘発持続性抗体応答の基礎となる分子メカニズムの調査であった。ここで我々は、ＡＳ０３アジュバントＨ５Ｎ１ワクチン接種へのより継続的な抗体応答に関連する細胞移動の血液転写シグネチャを特定し、後に、同じワクチンを使用した独立した臨床研究で、盲目的な様式で抗体の持続性を首尾よく予測するために使用した。特に、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ実験は、この長寿シグネチャの細胞起源として血小板を特定し、したがって、これらの細胞がワクチン接種に対する長寿命抗体応答の形成において潜在的に役割を果たすことを示した。マウスにおける以前の研究は、血小板前駆体である骨髄に存在する巨核球が、形質細胞生存因子ＡＰＲＩＬ及びＩＬ－６を相互作用及び産生することによって長寿命形質細胞の生成及び維持に重要である微小環境ニッチの機能成分を構成することを実証している。類似のメカニズムが、ヒトにおけるワクチン接種に対する長寿命抗体応答の生成に関与し得るか否かは、現時点では不明である。更に、ＣＩＴＥ－ｓｅｑ分析は、減弱抗体応答者が、より継続的な応答者と比較して、第２のワクチン接種後の血小板ＲＮＡ含有量のはるかに急激な減少を示すことを明らかにした。血小板は、ゲノムＤＮＡ及び新しいｍＲＮＡを合成する能力を欠いているが、それらは、末梢循環において新たに放出されるときに、前駆骨髄に存在する巨核球からｍＲＮＡ及びリボソームを継承する。したがって、減弱抗体応答者で観察される血小板ＲＮＡ含有量の全体的な減少は、より成熟した血小板表現型に有利な初期の巨核球特徴の進行性の喪失を伴う、細胞成熟及び老化のプロセスを反映し得る。しかしながら、血小板は、また、単球及び内皮細胞などの他の細胞にＲＮＡを水平に移動させ、その後、レシピエント細胞の発現プロファイルを変化させて炎症及び血管恒常性を調節する能力を有する。血小板及び巨核球がヒトにおける長期にわたる抗体応答に寄与するメカニズムを明らかにするためには、更なる研究が必要である。

【0147】

最後に、ＡＳ０３アジュバント及び非アジュバントインフルエンザワクチンデータセットのメタアナリシスを行うことによって、アジュバントの作用メカニズムに以前に関連付けられていなかったか、又はインフルエンザに対する免疫の生成に寄与することが知られていなかった、ＡＳ０３によって特異的に誘導される共通の遺伝子セットを特定することができた。これらの遺伝子のうちの３つ、ＴＧＭ２、ＡＮＫＲＤ２２、及びＫＲＥＭＥＮ１の発現の１日目の変化を使用することによって、９０％以上の精度で外部試験におけるアジュバントの使用を予測することができた。注目すべきことに、ＡＳ０３「コア」遺伝子の初期転写変化は、ワクチン接種の７日後の末梢における活性化Ｔｆｈ細胞の頻度と強く関連しており、これらの遺伝子が免疫原性のメカニズムに関与している可能性があることを示唆している。文脈的には、経路分析は、ＡＳ０３の作用様式におけるアポトーシスの内因性（ミトコンドリア）及び外因性経路の重要な役割を支持した。これと一致して、我々は以前、スクアレン系エマルションアジュバントＭＦ５９による免疫化が、マウスにおけるアジュバント取り込み後のリンパ節に存在するマクロファージにおいてアポトーシスシグナルを誘導することを見出した。重要なことに、汎カスパーゼ阻害剤及びＭＦ５９のインビボ同時投与は、アジュバントによって増強されたＩｇＧ抗体応答の産生を著しく抑制し、スクアレンエマルションアジュバントの作用メカニズムにおけるアポトーシス及びカスパーゼの重要な役割を強調した。ＤＮＡ損傷、低酸素症、ＲＯＳの過剰産生、又は代謝機能障害などの内因性ストレスは全て、ミトコンドリアアポトーシスの潜在的な原因として確立されている。したがって、血漿メタボロミクス分析は、脂質及び脂肪酸の酸化及び代謝におけるＡＳ０３誘導初期撹乱が、ミトコンドリアアポトーシスに関与するＡＳ０３誘導遺伝子の発現、並びに数週間後の中和抗体価と非常に関連することを明らかにした。注目すべきは、我々は既に、脂肪酸代謝がインフルエンザワクチンに対する抗体応答の重要なオーケストレータであることを見出したことである。全体的に、我々の結果は、脂質代謝の変化の遺伝子シグネチャがワクチン接種後２時間以内に免疫化されたマウスのＬＮの排出において検出され得る、ＡＳ０３を用いたマウスにおける以前の研究とも一致する。同様に、貪食性及び非貪食性細胞による他のスクアレン含有エマルションアジュバントのインビトロ取り込みが、細胞質脂質液滴の形態での脂質変化及び中性脂質の蓄積をもたらすことが以前に示された。

【0148】

結論として、我々の所見は、ヒトにおけるパンデミック前のＨ５Ｎ１ワクチン接種後のＡＳ０３アジュバント性及び抗体持続性に関連するこれまで評価されていなかった生物学的メカニズムを明らかにし、したがって、ワクチンの研究開発を加速するシステム生物学的アプローチの極めて大きな可能性を再び明確化した。

【0149】

実施例２
免疫応答の持続性を予測するための血小板の使用
結果
血小板ＲＮＡ含有量は、ワクチン接種に対する抗体応答の継続と正の相関がある。我々のＣＩＴＥ－ｓｅｑ所見を検証するために（図３）、フローサイトメトリー分析を使用して、２０１０～１１年のインフルエンザの時期の間にＴＩＶで免疫化した対象由来の血小板中のＲＮＡ含有量を評価した（図１４Ａ）。解凍されたＰＢＭＣ試料のＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットは、ＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋血小板集団を示し、これは、低いＳＳＣ及びＦＳＣ値を特徴とし、サイズによってＰＢＭＣと容易に区別され得る（図１５Ａ）。これらの試料中の血小板の頻度は、ＰＢＭＣ全体と同等であり、ＴＩＶワクチン接種後０日目と７日目との間に差はなかった（図１５Ｂ）が、これは、血小板の数が異なるのではなく、血小板内の固有の差異に起因して血小板のシグネチャが生じているという考えを裏付けている。重要なことに、ワクチン接種者における７日目対０日目の全血小板中のＲＮＡ含有量及び％ＲＮＡ^＋血小板の倍数変化（図１５Ｃ）は、１８０日目／４２日目残量（図１４Ｂ）と正の相関があり、血小板ＲＮＡ含有量とワクチン接種に対する抗体応答の継続性との間の関連性が確認された。

【0150】

この関連性の基礎となるメカニズムをより詳細に探求するために、我々は次に、アカゲザルにおけるＡＳ０３アジュバントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットＳｐｉｋｅタンパク質に対する応答を調べた（図１４Ｃ）。ヒト試料と同様に、ＮＨＰ試料のＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットも、また、有意な血小板数を示した（図１５Ｄ）。中和抗体応答は、４２日目にピークに達し、次いで徐々に低下した（図１４Ｄ）。ベースラインに対する７日目の全血小板中のＲＮＡ含有量及び％ＲＮＡ^＋血小板の倍数変化は、１８０日目／４２日目残量と相関した（図１４Ｅ及び図１５Ｅ）。一貫して、Ｒ８４８アジュバントＨＩＶサブユニットｇｐ１４０（図１４Ｆ～Ｈ、図１５Ｆ、及び図１Ｇ）でワクチン接種されたＮＨＰ対象において、７日目の血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化と、４２週目／２０週目残量との間に正の相関が観察された（図１４Ｆ～Ｈ、図１５Ｆ、及び図１Ｇ）。長期抗体価は、骨髄に存在する長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）によって主に生成されるため、骨髄抗原特異的形質細胞の頻度は、持続的中和抗体応答の指標となり得る（Ｋａｓｔｕｒｉ ｅｔ ａｌ，２０１５，ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。我々のデータは、７日目の血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化も、４８週目の骨髄ＡＳＣの数と関連付けられることを示した（図１４Ｉ）。ヒト及びＮＨＰにおける我々の所見を裏付けるために、ＡＳ０３アジュバントＳＡＲＳ－ＣｏＶ２サブユニットＳｐｉｋｅでワクチン接種したマウスを用いて、血小板ＲＮＡ含有量を評価し（図１４Ｊ、図１４Ｋ、図１５Ｈ、及び１５Ｉ）、７日目の血小板ＲＮＡ含有量の倍数変化が、ブースト後４２日目／７日目残量又は４２日目のＡＳＣの数と相関することを見出した（図１４Ｌ、図１４Ｋ）。

【0151】

マウスにおける以前の研究は、血小板前駆体である骨髄に存在する巨核球が、形質細胞生存因子ＡＰＲＩＬ及びＩＬ－６を相互作用及び産生することによって長寿命形質細胞（ＬＬＰＣ）の生成及び維持に重要である微小環境ニッチの機能成分を構成することを実証している（Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１０，Ｂｌｏｏｄ）。我々の結果は、末梢血小板ＲＮＡ含有量が、ＬＬＰＣ生存に寄与する骨髄における巨核球及び他のプロセスの状態を反映することができ、ワクチンに対する抗体応答の持続性を予測するためのバイオマーカーとして血小板ＲＮＡ含有量を指摘することができることを実証している。

【0152】

方法
ヒト及びアカゲザル由来の事前に凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、ＰＢＳで１回洗浄し、１．５μＭのＳＹＴＯ（商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光細胞染色（Ｓ３２７０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１００μｌのＰＢＳ中で、適切な抗体カクテルで室温で染色した。２０分後、３００μｌの１％パラホルムアルデヒドを試料に直接添加した。同日に、ＦＡＣＳ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を分析した。血小板集団の可視化を確実にするために、ＦＳＣ値の閾値を４０００に設定した。フローサイトメトリーファイルの分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を使用して行った。解凍したヒトＰＢＭＣ中のＰＢＭＣ不含血小板の特定のために、抗ＣＤ３－ＢＵＶ７３７、抗ＣＤ１９－ＡＰＣ、抗ＣＤ１４－ＢＶ６０５、抗ＣＤ５６－ＰＥ、及び抗ＣＤ４１－ＢＶ４２１、抗ＣＤ６１－ＰＥ－Ｃｙ７抗体のカクテルを使用した。血小板は、ＣＤ３^＋、ＣＤ１９^＋、ＣＤ１４^＋及びＣＤ５６^＋細胞を除外した後のＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋細胞として定義された。解凍したＮＨＰ ＰＢＭＣ中のＰＢＭＣ不含血小板の特定のために、抗ＣＤ３－ＰＥ－ＣＦ５９４、抗ＣＤ８－ＢＵＶ５６３、抗ＣＤ２０－ＢＵＶ７３７、抗ＣＤ１４－ＢＵＶ８０５、及び抗ＣＤ４１－ＢＶ４２１、抗ＣＤ６１－ＰＥ－Ｃｙ７抗体のカクテルを使用した。血小板は、ＣＤ３^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ２０^＋及びＣＤ１４^＋細胞を除外した後のＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋細胞として定義された。

【0153】

クエン酸デキストロース溶液（ｓｃ－２１４７４４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で抗凝固させたマウス血液を、６～８：１の比率で、室温で１５０×ｇで１０分間遠心分離し、血小板に富む血漿を得た。２０μｌの新たに調製された血小板に富む血漿を、０．６μｌの抗ＴＥＲ１１９－ＰＥ、抗ＣＤ４１－ＢＶ４２１、及び抗ＣＤ６１－ＰＥ－Ｃｙ７抗体とともに、室温で２０分間、１．５μＭのＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）染料を含有する８０μｌのＰＢＳと混合した。マウス血小板は、ＴＥＲ１１９^＋赤血球を除外した後のＣＤ４１^＋ＣＤ６１^＋細胞として定義された。

【0154】

参考文献
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【0158】

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【0160】

Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｎ．，Ｊａｒｒｏｓｓａｙ，Ｄ．，Ｈｏ，Ｅ．，Ａｖｅｒｙ，Ｄ．Ｔ．，Ｍａ，Ｃ．Ｓ．，Ｙｕ，Ｄ．，Ｓａｌｌｕｓｔｏ，Ｆ．，Ｔａｎｇｙｅ，Ｓ．Ｇ．，ａｎｄ Ｍａｃｋａｙ，Ｃ．Ｒ．（２０１１）．ＣＸＣＲ５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｆｏｒ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１８６，５５５６－５５６８．

【0161】

Ｃｈｕ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｉｍ，Ｆ．Ｓ．，Ｏｈ，Ｈ．Ｍ．，Ｔｈｏｎｇｃｈａｒｏｅｎ，Ｐ．，Ｙａｎｇ，Ｐ．Ｃ．，Ｂｏｃｋ，Ｈ．Ｌ．，Ｄｒａｍｅ，Ｍ．，Ｇｉｌｌａｒｄ，Ｐ．，Ｈｕｔａｇａｌｕｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ ＡＳ０３（Ａ）－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｐｒｅｐａｎｄｅｍｉｃ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ：ａ ｐｈａｓｅ ＩＩＩ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｉａｎ ａｄｕｌｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ２７，７４２８－７４３５．

【0162】

Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｌａｉ，Ｚ．Ｗ．，Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｔ．Ｃ．，ａｎｄ Ｆａｒｅｓｅ，Ｒ．Ｖ．，Ｊｒ．（２０１９）．ＬＤＡＦ１ ａｎｄ Ｓｅｉｐｉｎ Ｆｏｒｍ ａ Ｌｉｐｉｄ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ５１，５５１－５６３ ｅ５５７．

【0163】

Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｍ．，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ａ．Ｃ．，Ｒｏｕｐｈａｅｌ，Ｎ．Ｇ．，ａｎｄ Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０２０）．Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ．

【0164】

Ｃｏｕｃｈ，Ｒ．Ｂ．，Ｂａｙａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｓｏ，Ｃ．，Ｍｂａｗｕｉｋｅ，Ｉ．Ｎ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｃ．Ｎ．，Ｃｌａｅｙｓ，Ｃ．，Ｅｌ Ｉｄｒｉｓｓｉ，Ｍ．，Ｈｅｒｖｅ，Ｃ．，Ｌａｕｐｅｚｅ，Ｂ．，Ｏｏｓｔｖｏｇｅｌｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ＡＳ０３－ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒｉｖａｌｅｎｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｄｕｌｔｓ ａｇｅｄ６５ ａｎｄ ｏｌｄｅｒ．ＢＭＣ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ１４，４２５．

【0165】

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【0166】

Ｃｒｏｔｔｙ，Ｓ．，Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｈ．，Ｇｌｉｄｅｗｅｌｌ，Ｊ．，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，Ｌ．，ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｒ．（２００３）．Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ Ｂ ｃｅｌｌ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｆｔｅｒ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７１，４９６９－４９７３．

【0167】

Ｄａｉ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｙａｏ，Ｈ．，Ｘｉ，Ｙ．，Ｘｉａｏ，Ｚ．Ｄ．，Ｙｏｕ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．，Ｓｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．ＢＡＰ１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１１４，３１９２－３１９７．

【0168】

Ｅｃｋｅｒｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｋａａｒｔｉｎｅｎ，Ｍ．Ｔ．，Ｎｕｒｍｉｎｓｋａｙａ，Ｍ．，Ｂｅｌｋｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｃｏｌａｋ，Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇ．Ｖ．，ａｎｄ Ｍｅｈｔａ，Ｋ．（２０１４）．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ９４，３８３－４１７．

【0169】

Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，Ｓ．Ｃ．，Ｃｏｌｅｇｉｏ，Ｏ．Ｒ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｗ．，Ｓｕｔｔｅｒｗａｌａ，Ｆ．Ｓ．，ａｎｄ Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｒ．Ａ．（２００８）．Ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｎａｌｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ４５３，１１２２－１１２６．

【0170】

Ｅｌｌｅｂｅｄｙ，Ａ．Ｈ．，Ｎａｃｈｂａｇａｕｅｒ，Ｒ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．Ｌ．，Ｄａｉ，Ｙ．Ｎ．，Ｈａｎ，Ｊ．，Ａｌｓｏｕｓｓｉ，Ｗ．Ｂ．，Ｄａｖｉｓ，Ｃ．Ｗ．，Ｓｔａｄｌｂａｕｅｒ，Ｄ．，Ｒｏｕｐｈａｅｌ，Ｎ．，Ｃｈｒｏｍｉｋｏｖａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｏｔｈ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎａｉｖｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１１７，１７９５７－１７９６４．

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Ｆｕｒｍａｎ，Ｄ．，Ｊｏｊｉｃ，Ｖ．，Ｋｉｄｄ，Ｂ．，Ｓｈｅｎ－Ｏｒｒ，Ｓ．，Ｐｒｉｃｅ，Ｊ．，Ｊａｒｒｅｌｌ，Ｊ．，Ｔｓｅ，Ｔ．，Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，Ｌｕｎｄ，Ｐ．，Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ９，６５９．

【0176】

Ｇａｒｃｏｎ，Ｎ．，Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｗ．，ａｎｄ Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＳ０３，ａｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｌｐｈａ－ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ ａｎｄ ｓｑｕａｌｅｎｅ ｉｎ ａｎ ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ１１，３４９－３６６．

【0177】

Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ，Ｍ．，Ｔｈｏｒｓｓｏｎ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｂ．，Ｒｕｓｔ，Ａ．Ｇ．，Ｋｏｒｂ，Ｍ．，Ｒｏａｃｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｋ．，Ｈａｉ，Ｔ．，Ｂｏｌｏｕｒｉ，Ｈ．，ａｎｄ Ａｄｅｒｅｍ，Ａ．（２００６）．Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＡＴＦ３ ａｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４．Ｎａｔｕｒｅ４４１，１７３－１７８．

【0178】

Ｇｉｖｏｒｄ，Ｃ．，Ｗｅｌｓｂｙ，Ｉ．，Ｄｅｔｉｅｎｎｅ，Ｓ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．，Ａｓｓａｂｂａｎ，Ａ．，Ｌｉｍａ Ｓｉｌｖａ，Ｖ．，Ｍｏｌｌｅ，Ｃ．，Ｇｉｎｅｓｔｅ，Ｒ．，Ｖｅｒｍｅｅｒｓｃｈ，Ｍ．，Ｐｅｒｅｚ－Ｍｏｒｇａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｓｅｎｓｏｒ ＩＲＥ１ａｌｐｈａ ｂｙ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ＡＳ０３ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ３，２０．

【0179】

Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０２０）．Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ５０，１０１４２２．

【0180】

Ｈａｇａｎ，Ｔ．，Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｍ．，Ｒｏｕｐｈａｅｌ，Ｎ．，Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｃ．，Ｌｉｎｄｅ，Ｃ．，Ｍａｄｄｕｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｄａｓ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｇｕｔｈｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｎ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－Ｄｒｉｖｅｎ Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ Ａｌｔｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎｓ．Ｃｅｌｌ１７８，１３１３－１３２８ ｅ１３１３．

【0181】

Ｈａｇａｎ，Ｔ．，ａｎｄ Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０１８）．Ｗｉｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｉｔｓ Ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗ ｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ？Ｆｒｏｍ Ｄａｔａ ｔｏ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ１０．

【0182】

Ｈａｍｍａｒｌｕｎｄ，Ｅ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｗ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｌ．Ｉ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｘｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｈａｎｉｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｓｌｉｆｋａ，Ｍ．Ｋ．（２００３）．Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｓｍａｌｌｐｏｘ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ９，１１３１－１１３７．

【0183】

Ｈａｒｔｍａｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｌｕ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｌ．，Ｋｏｃｉｂａ，Ｇ．Ｊ．，Ｓｈｕｋｒｉ，Ｔ．，Ｂｕｔｅａｕ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｗ．Ｌ．，Ｇｕｔｔｒｉｄｇｅ，Ｄ．，Ｐｒｅｎｔｋｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ３ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２４，５７２１－５７３２．

【0184】

Ｈｅ，Ｊ．，Ｔｓａｉ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｅｏｎｇ，Ｙ．Ａ．，Ｈｕ，Ｘ．，Ｍａ，Ｃ．Ｓ．，Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｎ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．，Ｒｏｃｋｍａｎ，Ｓ．，Ｄｉｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＣＣＲ７（ｌｏ）ＰＤ－１（ｈｉ）ＣＸＣＲ５（＋）ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｔｆｈ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｕｐｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３９，７７０－７８１．

【0185】

Ｈｏｗａｒｄ，Ｌ．Ｍ．，Ｈｏｅｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｏｌｌ，Ｊ．Ｂ．，Ｓａｍｉｒ，Ｐ．，Ｇａｌａｓｓｉｅ，Ａ．，Ａｌｌｏｓ，Ｔ．Ｍ．，Ｎｉｕ，Ｘ．，Ｇｏｒｄｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｃｒｅｅｃｈ，Ｃ．Ｂ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＡＳ０３－Ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ Ｈ５Ｎ１ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１２，ｅ０１６７４８８．

【0186】

Ｈｕ，Ｘ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｋａｎｎａｎ，Ｓ．，Ｂｕｒｃｈｅｒｔ，Ａ．，Ｓｚｕｌｃ，Ｚ．，Ｂｉｅｌａｗｓｋａ，Ａ．，Ｏｚａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．ＩＲＦ８ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｃｉｄ ｃｅｒａｍｉｄａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｍｅｄｉａｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｍｙｅｌｏｇｅｎｅｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ７１，２８８２－２８９１．

【0187】

Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．，Ｆｒｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｅｉｔｅｌ，Ｗ．Ａ．，Ｋｏｔｌｏｆｆ，Ｋ．Ｌ．，Ｂｅｒｒｙ，Ａ．Ａ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｉ．，Ａｔｍａｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｃｒｅｅｃｈ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ａ Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ Ｈ７Ｎ９ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｗｉｔｈ ａｎｄ Ｗｉｔｈｏｕｔ ＡＳ０３ ａｎｄ ＭＦ５９ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：Ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ３１４，２３７－２４６．

【0188】

Ｋａｌｖｏｄｏｖａ，Ｌ．（２０１０）．Ｓｑｕａｌｅｎｅ－ｂａｓｅｄ ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｐｅｒｔｕｒｂ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｉｐｉｄｓ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ３９３，３５０－３５５．

【0189】

Ｋａｒｋｉ，Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｅ．，Ｐｌａｃｅ，Ｄ．，Ｓａｍｉｒ，Ｐ．，Ｍａｖｕｌｕｒｉ，Ｊ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．Ｒ．，Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ．，Ｍａｌｉｒｅｄｄｉ，Ｒ．Ｋ．Ｓ．，Ｇｅｉｇｅｒ，Ｒ．，Ｚｈｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．ＩＲＦ８ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｉｐｓ ｆｏｒ ＮＬＲＣ４ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ１７３，９２０－９３３ ｅ９１３．

【0190】

Ｋａｒｋｉ，Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｅ．，Ｓｈａｒｍａ，Ｂ．Ｒ．，Ｂａｎｏｔｈ，Ｂ．，ａｎｄ Ｋａｎｎｅｇａｎｔｉ，Ｔ．Ｄ．（２０２０）．ＩＲＦ８ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｇｒａｍ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＮＬＲＰ３ Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０４，２５１４－２５２２．

【0191】

Ｋａｓｔｕｒｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｓｋｏｕｎｔｚｏｕ，Ｉ．，Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｒ．Ａ．，Ｋｏｕｔｓｏｎａｎｏｓ，Ｄ．，Ｈｕａ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａ，Ｈ．Ｉ．，Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，Ｒ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．，Ａｌａｍ，Ｍ．，Ｋｗｉｓｓａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ４７０，５４３－５４７．

【0192】

Ｋｈｕｒａｎａ，Ｓ．，Ｃｏｙｌｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｍａｎｉｓｃｈｅｗｉｔｚ，Ｊ．，Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ｒ．，Ｇａｏ，Ｊ．，Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｔｓａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｇｏｌｄｉｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ ａｎｄ ｔｈｅ，Ｃ．Ｈ．Ｉ．Ｃ．（２０１８）．ＡＳ０３－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ Ｈ５Ｎ１ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ＮＡＩ ｔｉｔｅｒｓ，ｃｒｏｓｓ－ｃｌａｄｅ Ｈ５Ｎ１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ Ｈ１Ｎ１ ｃｒｏｓｓ－ｓｕｂｔｙｐｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ３，４０．

【0193】

Ｋｉｍ，Ｅ．Ｈ．，Ｗｏｏｄｒｕｆｆ，Ｍ．Ｃ．，Ｇｒｉｇｏｒｙａｎ，Ｌ．，Ｍａｉｅｒ，Ｂ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．，Ｍａｎｄａｌ，Ｐ．，Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｍ．，Ｎａｔｒａｊａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｒａｖｉｎｄｒａｎ，Ｒ．，Ｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｓｑｕａｌｅｎｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ，ｂｕｔ ｎｏｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＲＩＰＫ３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ．Ｅｌｉｆｅ９．

【0194】

Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆ．（２０１９）．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９，３８３－３９７．

【0195】

Ｋｕｒｏｔａｋｉ，Ｄ．，Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｈ．，Ｋａｗａｓｅ，Ｗ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｎ．，Ｏｃｈｉａｉ，Ｋ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｋ．，Ｏｚａｔｏ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＲＦ８ Ｇｏｖｅｒｎｓ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ２２，２６２８－２６４１．

【0196】

Ｋｕｒｏｔａｋｉ，Ｄ．，Ｏｓａｔｏ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｂａｎ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｈ．，Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｊ．，Ｕｍｅｈａｒａ，Ｍ．，Ｍｉｙａｋｅ，Ｎ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＩＲＦ８－ＫＬＦ４ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｃａｓｃａｄｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１２１，１８３９－１８４９．

【0197】

Ｌａｎｇｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｒｅｎｅｔｔｅ，Ｌ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ｌ．，Ｒｉｆｆ，Ｄ．，Ｓｈｅｌｄｏｎ，Ｅ．，Ｒｉｓｉ，Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｐ．，Ｋｅｎｎｅｙ，Ｒ．，Ｉｎｎｉｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ＡＳ０３－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｐｒｅｐａｎｄｅｍｉｃ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｈａｓｅ１／２ ｔｒｉａｌ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ２０１，１６４４－１６５３．

【0198】

Ｌｅｒｏｕｘ－Ｒｏｅｌｓ，Ｉ．，Ｒｏｍａｎ，Ｆ．，Ｆｏｒｇｕｓ，Ｓ．，Ｍａｅｓ，Ｃ．，Ｄｅ Ｂｏｅｖｅｒ，Ｆ．，Ｄｒａｍｅ，Ｍ．，Ｇｉｌｌａｒｄ，Ｐ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｏｓｔ，Ｒ．，Ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，Ｍ．，Ｈａｎｏｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｐｒｉｍｉｎｇ ｗｉｔｈ ＡＳ０３ Ａ－ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｍａｇｎｉｔｕｄｅ ａｎｄ ｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ａ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｂｏｏｓｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ａｎ ｏｐｅｎ ｎｏｎ－ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｕｄｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ２８，８４９－８５７．

【0199】

Ｌｉ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｙ．，Ｄｕｒａｉｓｉｎｇｈａｍ，Ｓ．，Ｓｔｒｏｂｅｌ，Ｆ．Ｈ．，Ｋｈａｎ，Ｎ．，Ｓｏｌｔｏｗ，Ｑ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｐ．，ａｎｄ Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０１３）．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ９，ｅ１００３１２３．

【0200】

Ｌｏｃｃｉ，Ｍ．，Ｈａｖｅｎａｒ－Ｄａｕｇｈｔｏｎ，Ｃ．，Ｌａｎｄａｉｓ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｋｒｏｅｎｋｅ，Ｍ．Ａ．，Ａｒｌｅｈａｍｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｕ，Ｌ．Ｆ．，Ｃｕｂａｓ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｓｅｔｔｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｈｕｍａｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＰＤ－１＋ＣＸＣＲ３－ＣＸＣＲ５＋ｍｅｍｏｒｙ Ｔｆｈ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ＨＩＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３９，７５８－７６９．

【0201】

Ｍａｏ，Ｂ．，Ｗｕ，Ｗ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｇ．，Ｍａｒｈｏｌｄ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｍ．，Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｄｅｌｉｕｓ，Ｈ．，Ｈｏｐｐｅ，Ｄ．，Ｓｔａｎｎｅｋ，Ｐ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｋｒｅｍｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ Ｄｉｃｋｋｏｐｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ４１７，６６４－６６７．

【0202】

Ｍａｒａｚｚｉ，Ｓ．，Ｂｌｕｍ，Ｓ．，Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｒ．，Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ，Ｄ．，Ｓｃｈｒｅｙｅｒ，Ｍ．，Ａｒｇｒａｖｅｓ，Ｓ．，ｖｏｎ Ｆｌｉｅｄｎｅｒ，Ｖ．，Ｐｙｔｅｌａ，Ｒ．，ａｎｄ Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．（１９９８）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｌｅｕｋｉｎ，ａ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６１，１３８－１４７．

【0203】

Ｍａｔｉｃ，Ｉ．，Ｓａｃｃｈｉ，Ａ．，Ｒｉｎａｌｄｉ，Ａ．，Ｍｅｌｉｎｏ，Ｇ．，Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．，Ｆａｌａｓｃａ，Ｌ．，ａｎｄ Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｉ，Ｍ．（２０１０）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｏｌｅ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ８８，１８１－１８８．

【0204】

Ｍｉｌｌｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｒ．，ａｎｄ Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．（２０１７）．Ｓｌｏｗｅｄ ｄｅｃａｙ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ１２９，ｅ３８－ｅ４８．

【0205】

Ｍｏｎａｔｈ，Ｔ．Ｐ．（２００５）．Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ４，５５３－５７４．

【0206】

Ｍｏｒｉｓ，Ｐ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｏｓｔ，Ｒ．，Ｌｅｒｏｕｘ－Ｒｏｅｌｓ，Ｉ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｆ．，Ｄｒａｍｅ，Ｍ．，Ｈａｎｏｎ，Ｅ．，Ｌｅｒｏｕｘ－Ｒｏｅｌｓ，Ｇ．Ｇ．，ａｎｄ Ｖａｎ Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，Ｍ．（２０１１）．Ｈ５Ｎ１ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡＳ０３ Ａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｔｒｏｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ４ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ３１，４４３－４５４．

【0207】

Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｋｊｏｌｂｙ，Ｍ．，Ｇｕｎｎｅｒｓｅｎ，Ｓ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｊ．Ｖ．，Ｐａｌｍｆｅｌｄｔ，Ｊ．，Ｆａｌｋ，Ｅ．，Ｎｙｋｊａｅｒ，Ａ．，ａｎｄ Ｂｅｎｔｚｏｎ，Ｊ．Ｆ．（２０１４）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｏｒｔｉｌｉｎ ｉｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１２４，５３１７－５３２２．

【0208】

Ｍｙｎｅｎｉ，Ｖ．Ｄ．，Ｍｅｌｉｎｏ，Ｇ．，ａｎｄ Ｋａａｒｔｉｎｅｎ，Ｍ．Ｔ．（２０１５）．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ２－－ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ ６，ｅ１８６８．

【0209】

Ｎａｋａｙａ，Ｈ．Ｉ．，Ｈａｇａｎ，Ｔ．，Ｄｕｒａｉｓｉｎｇｈａｍ，Ｓ．Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｅ．Ｋ．，Ｋｗｉｓｓａ，Ｍ．，Ｒｏｕｐｈａｅｌ，Ｎ．，Ｆｒａｓｃａ，Ｄ．，Ｇｅｒｓｔｅｎ，Ｍ．，Ｍｅｈｔａ，Ａ．Ｋ．，Ｇａｕｊｏｕｘ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｙｅａｒｓ ａｎｄ ｉｎ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｓｈａｒｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４３，１１８６－１１９８．

【0210】

Ｎａｋａｙａ，Ｈ．Ｉ．，Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊ．，Ｌｅｅ，Ｅ．Ｋ．，Ｒａｃｉｏｐｐｉ，Ｌ．，Ｍａｒｉｅ－Ｋｕｎｚｅ，Ｓ．，Ｈａｉｎｉｎｇ，Ｗ．Ｎ．，Ｍｅａｎｓ，Ａ．Ｒ．，Ｋａｓｔｕｒｉ，Ｓ．Ｐ．，Ｋｈａｎ，Ｎ．，Ｌｉ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｅａｓｏｎａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ１２，７８６－７９５．

【0211】

Ｎｅｔｅａ，Ｍ．Ｇ．，Ｊｏｏｓｔｅｎ，Ｌ．Ａ．，Ｌａｔｚ，Ｅ．，Ｍｉｌｌｓ，Ｋ．Ｈ．，Ｎａｔｏｌｉ，Ｇ．，Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｇ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ Ｘａｖｉｅｒ，Ｒ．Ｊ．（２０１６）．Ｔｒａｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５２，ａａｆ１０９８．

【0212】

Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｇｅｎｔｌｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｆｅｎｇ，Ｗ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｈｏａｎｇ，Ｃ．Ｄ．，Ｄｉｅｈｎ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｌｉｚａｄｅｈ，Ａ．Ａ．（２０１５）．Ｒｏｂｕｓｔ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｒｏｍ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１２，４５３－４５７．

【0213】

Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｔｅｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｌ．，Ｇｅｎｔｌｅｓ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ａ．Ａ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｆ．，Ｋｈｏｄａｄｏｕｓｔ，Ｍ．Ｓ．，Ｅｓｆａｈａｎｉ，Ｍ．Ｓ．，Ｌｕｃａ，Ｂ．Ａ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｕｌｋ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｇｉｔａｌ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ３７，７７３－７８２．

【0214】

Ｏｂｅｒｍｏｓｅｒ，Ｇ．，Ｐｒｅｓｎｅｌｌ，Ｓ．，Ｄｏｍｉｃｏ，Ｋ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ａｎｇｕｉａｎｏ，Ｅ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．，Ｒａｎｇａｎａｔｈａｎ，Ｒ．，Ｚｅｉｔｎｅｒ，Ｂ．，Ｂｊｏｒｋ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｓｙｓｔｅｍｓ ｓｃａｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｄ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３８，８３１－８４４．

【0215】

Ｏｇａｗａ，Ｋ．，Ｔａｎａｋａ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｉ，Ａ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｓ．，Ｓｕｇａｍｕｒａ，Ｋ．，Ｔａｋａｎｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｎａｇａｔａ，Ｋ．（２００１）．Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１６６，６４０４－６４１２．

【0216】

Ｐａｎ，Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｓ．，Ｙｕ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｓｕｎ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈｕ，Ｙ．（２０２０）．ＡＮＫＲＤ２２，ａ ｎｏｖｅｌ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ１０，５１６－５３６．

【0217】

Ｐｒｉｃｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｓｃｈａｒｅｒ，Ｃ．Ｄ．，ａｎｄ Ｂｏｓｓ，Ｊ．Ｍ．（２０１８）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ａ Ｔ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ２３，３１５２－３１５９．

【0218】

Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．（２０１４）．Ｓｙｓｔｅｍｓ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ：ｐｒｏｂｉｎｇ ｈｕｍａｎｉｔｙ’ｓ ｄｉｖｅｒｓｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１１１，１２３００－１２３０６．

【0219】

Ｑｉｕ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｐａｎ，Ｔ．，Ｙｕ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｙ．，ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｈ．（２０１９）．ＡＮＫＲＤ２２ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ１８，４１０６－４１１３．

【0220】

Ｒａａｂ，Ｍ．，Ｓｔｒｅｂｈａｒｄｔ，Ｋ．，ａｎｄ Ｒｕｄｄ，Ｃ．Ｅ．（２０１９）．Ｉｍｍｕｎｅ ａｄａｐｔｏｒ ＳＫＡＰ１ ａｃｔｓ ａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ １（ＰＬＫ１）ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｉｎｇ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ９，１０４６２．

【0221】

Ｒｉｓｉｔａｎｏ，Ａ．，Ｂｅａｕｌｉｅｕ，Ｌ．Ｍ．，Ｖｉｔｓｅｖａ，Ｏ．，ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｅ．（２０１２）．Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｌｏｏｄ１１９，６２８８－６２９５．

【0222】

Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｎ．，Ｂｅｎｔｅｂｉｂｅｌ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ Ｕｅｎｏ，Ｈ．（２０１４）．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ Ｔｆｈ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ３５，４３６－４４２．

【0223】

Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｋ．Ｌ．，Ｋｗｏｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｅｅｋｓ，Ｓ．Ｌ．，Ｃａｍｐｉｔｅｌｌｉ，Ｍ．Ａ．，Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ｆ．Ｂ．，Ｍａｒｃｈａｎｄ－Ａｕｓｔｉｎ，Ａ．，Ｓｔｕｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｒｏｓｅｌｌａ，Ｌ．，Ｄａｎｅｍａｎ，Ｎ．，Ｂｏｌｏｔｉｎ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＣＭＡＪ１８８，Ｅ３９９－Ｅ４０６．

【0224】

Ｓｅｉｆｅｒｔ，Ｕ．，Ｂｉａｌｙ，Ｌ．Ｐ．，Ｅｂｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｂｅｃｈ－Ｏｔｓｃｈｉｒ，Ｄ．，Ｖｏｉｇｔ，Ａ．，Ｓｃｈｒｏｔｅｒ，Ｆ．，Ｐｒｏｚｏｒｏｖｓｋｉ，Ｔ．，Ｌａｎｇｅ，Ｎ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｊ．，Ｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｓ ｐｒｅｓｅｒｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｕｐｏｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｃｅｌｌ１４２，６１３－６２４．

【0225】

Ｓｅｕｂｅｒｔ，Ａ．，Ｃａｌａｂｒｏ，Ｓ．，Ｓａｎｔｉｎｉ，Ｌ．，Ｇａｌｌｉ，Ｂ．，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ，Ａ．，Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，Ｓ．，Ａｐｒｅａ，Ｓ．，Ｃｏｌａｐｒｉｃｏ，Ａ．，Ｄ’Ｏｒｏ，Ｕ．，Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｉｌ－ｉｎ－ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ＭＦ５９ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｎｌｒｐ３ ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ ｂｕｔ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｙＤ８８．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１０８，１１１６９－１１１７４．

【0226】

Ｓｌｉｆｋａ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｒ．（１９９８）．Ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ１０，２５２－２５８．

【0227】

Ｓｌｉｆｋａ，Ｍ．Ｋ．，Ａｎｔｉａ，Ｒ．，Ｗｈｉｔｍｉｒｅ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ Ａｈｍｅｄ，Ｒ．（１９９８）．Ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｄｕｅ ｔｏ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ８，３６３－３７２．

【0228】

Ｓｏｂｏｌｅｖ，Ｏ．，Ｂｉｎｄａ，Ｅ．，Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓ．，Ｌｏｒｅｎｃ，Ａ．，Ｐｒａｄｉｎｅｓ，Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｄｕｆｆｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｒ．，Ｃａｓｏｎ，Ｊ．，Ｚａｍｂｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ－Ｈ１Ｎ１ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７，２０４－２１３．

【0229】

Ｓｔｏｅｃｋｉｕｓ，Ｍ．，Ｈａｆｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｃ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｗ．，Ｈｏｕｃｋ－Ｌｏｏｍｉｓ，Ｂ．，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｐ．Ｋ．，Ｓｗｅｒｄｌｏｗ，Ｈ．，Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．，ａｎｄ Ｓｍｉｂｅｒｔ，Ｐ．（２０１７）．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ１４，８６５－８６８．

【0230】

Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ，Ａ．，Ｐｏｍｅｒｏｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１０２，１５５４５－１５５５０．

【0231】

Ｓｕｇａｎａｍｉ，Ｔ．，Ｙｕａｎ，Ｘ．，Ｓｈｉｍｏｄａ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｏ－Ｙａｍａｄａ，Ｋ．，Ｎａｋａｇａｗａ，Ｎ．，Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ｉ．，Ｕｓａｍｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｋａｈａｒａ，Ｔ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．，Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ３ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｈａｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ／ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ４ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｂｅｓｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ１０５，２５－３２．

【0232】

Ｔａ，Ｍ．Ｔ．，Ｋａｐｔｅｒｉａｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｆｅｉ，Ｗ．，Ｄｕ，Ｘ．，Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｊ．，Ｄａｗｅｓ，Ｉ．Ｗ．，ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｈ．（２０１２）．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｑｕａｌｅｎｅ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔｓ．ＦＥＢＳ Ｊ２７９，４２３１－４２４４．

【0233】

Ｔａｔｓｕｋａｗａ，Ｈ．，Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｙ．，Ｈｉｔｏｍｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｏｊｉｍａ，Ｓ．（２０１６）．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ２ ｈａｓ ｏｐｐｏｓｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅａｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ７，ｅ２２４４．

【0234】

Ｔｈａｎｈ Ｌｅ，Ｔ．，Ａｎｄｒｅａｄａｋｉｓ，Ｚ．，Ｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｇｏｍｅｚ Ｒｏｍａｎ，Ｒ．，Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ，Ｓ．，Ｓａｖｉｌｌｅ，Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｙｈｅｗ，Ｓ．（２０２０）．Ｔｈｅ ＣＯＶＩＤ－１９ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ１９，３０５－３０６．

【0235】

Ｖｏｎｏ，Ｍ．，Ｔａｃｃｏｎｅ，Ｍ．，Ｃａｃｃｉｎ，Ｐ．，Ｇａｌｌｏｔｔａ，Ｍ．，Ｄｏｎｖｉｔｏ，Ｇ．，Ｆａｌｚｏｎｉ，Ｓ．，Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｅ．，Ｐａｌｌａｏｒｏ，Ｍ．，Ｒａｐｐｕｏｌｉ，Ｒ．，Ｄｉ Ｖｉｒｇｉｌｉｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ＭＦ５９ ｉｎｄｕｃｅｓ ＡＴＰ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｕｓｃｌｅ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ１１０，２１０９５－２１１００．

【0236】

Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｍａｙｏ，Ｍ．Ｗ．，Ｋｏｒｎｅｌｕｋ，Ｒ．Ｇ．，Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．，ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．Ｓ．，Ｊｒ．（１９９８）．ＮＦ－ｋａｐｐａＢ ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＲＡＦ１ ａｎｄ ＴＲＡＦ２ ａｎｄ ｃ－ＩＡＰ１ ａｎｄ ｃ－ＩＡＰ２ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｃａｓｐａｓｅ－８ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１，１６８０－１６８３．

【0237】

Ｗａｎｋａ，Ｃ．，Ｂｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｐ．，Ｂａｈｒ，Ｏ．，Ｒｏｎｅｌｌｅｎｆｉｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｗｅｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ Ｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．（２０１２）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｏｘｉｄａｓｅ２：ａ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｇｌｉｏｍａ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ３１，３７６４－３７７６．

【0238】

Ｗａｔｅｒｓ，Ｌ．Ｒ．，Ａｈｓａｎ，Ｆ．Ｍ．，Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｈｉｒｉｈａｉ，Ｏ．，ａｎｄ Ｔｅｉｔｅｌｌ，Ｍ．Ａ．（２０１８）．Ｉｎｉｔｉａｌ Ｂ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．ｉＳｃｉｅｎｃｅ５，９９－１０９．

【0239】

Ｗｉｎｔｅｒ，Ｏ．，Ｍｏｓｅｒ，Ｋ．，Ｍｏｈｒ，Ｅ．，Ｚｏｔｏｓ，Ｄ．，Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｈ．，Ｓｚｙｓｋａ，Ｍ．，Ｒｏｔｈ，Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｄａｍｅ，Ｃ．，Ｔａｒｌｉｎｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅｓ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ａ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ ｎｉｃｈｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ．Ｂｌｏｏｄ１１６，１８６７－１８７５．

【0240】

Ｙａｎｇ，Ｐ．，Ｙｕ，Ｄ．，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｓ．，ａｎｄ Ｊｉａｎｇ，Ｔ．（２０１９）．ＴＧＭ２ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｖｉａ Ｗｎｔ／ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ１８，１１２２－１１３４．

【0241】

Ｙｉｎ，Ｊ．，Ｆｕ，Ｗ．，Ｄａｉ，Ｌ．，Ｊｉａｎｇ，Ｚ．，Ｌｉａｏ，Ｈ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｐａｎ，Ｌ．，ａｎｄ Ｚｈａｏ，Ｊ．（２０１７）．ＡＮＫＲＤ２２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ２Ｆ１．Ｓｃｉ Ｒｅｐ７，４４３０．

【0242】

Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｈａｎ，Ｎ．，ａｎｄ Ｓｈｅｎ，Ｙ．（２０２０）．Ｓ１００Ａ１２ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＡＲＤＳ ｖｉａ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＬＲＰ３ ｉｎ ｆｌ ａｍｍａｓｏｍｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ１２２，３８－４８．

【0243】

Ｚｈａｏ，Ｆ．，Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｂ．，Ｄｕｆｆｙ，Ａ．，Ｇａｍｒｅｋｅｌａｓｈｖｉｌｉ，Ｊ．，Ｆｉｏｒａｖａｎｔｉ，Ｓ．，Ｍａｎｎｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｇｒｅｔｅｎ，Ｔ．Ｆ．，ａｎｄ Ｋｏｒａｎｇｙ，Ｆ．（２０１２）．Ｓ１００Ａ９ ａ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３６，１７６－１８３．

【0244】

Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｊｅａｎ，Ｍ．，Ｋｏｎｇ，Ｗ．，Ｆｉｃｈｅｓ，Ｇ．，Ｂｉｓｗａｓ，Ａ．，Ｌｉｕ，Ｓ．，Ｙｏｓｉｅｆ，Ｈ．Ｏ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｂｒａｄｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｏ－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ１（ＰＬＫ１）ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｖｉｒａｌ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ ｉｎ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｘ ｖｉｖｏ．Ｓｃｉ Ａｄｖ６，ｅａｂａ１９４１．

【0245】

前述した内容は、本発明の原理を単に例示しているに過ぎない。当業者は、本明細書に明示的に記載又は示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨及び範囲内に含まれる様々な配置を考案することができることが理解される。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件付き言語は、主に、読者が本発明の原理及び当該技術を更に進めるために発明者が寄与する概念を理解することを助ける点を意図しており、そのような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態を記載する、本明細書の全ての記述、並びにそれらの具体例は、それらの構造的及び機能的等価物の両方を包含することが意図されている。追加的に、かかる等価物は、現在既知の等価物及び将来開発される等価物の両方、すなわち、構造に関係なく、同じ機能を実施する開発される任意の要素を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され、説明された例示的な実施形態に限定されることを意図されていない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。

【0246】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，７９４号の利益及び優先権を主張し、その全体の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0247】

連邦政府による資金提供の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって授与された契約ＡＩ０９００２３下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【国際調査報告】