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特表2024-523392生体アミンの分解のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の新規微生物ジアミンオキシダーゼ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】生体アミンの分解のためのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の新規微生物ジアミンオキシダーゼ
(51)【国際特許分類】
A23L 33/17 20160101AFI20240621BHJP
C12N 9/06 20060101ALI20240621BHJP
A61K 38/44 20060101ALI20240621BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240621BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20240621BHJP
A23K 20/189 20160101ALI20240621BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
A23L33/17 ZNA
C12N9/06 Z
A61K38/44
A61P37/08
A61P39/02
A23K20/189
C12N15/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577855
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2024-02-02
(86)【国際出願番号】 EP2022057431
(87)【国際公開番号】W WO2022263031
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】21179434.2
(32)【優先日】2021-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523471666
【氏名又は名称】ウニヴェルジテート ホーエンハイム
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フィッシャー ルッツ
(72)【発明者】
【氏名】ケトナー ルーカス
(72)【発明者】
【氏名】セイテル イネス
(72)【発明者】
【氏名】ルッツ－ヴェール サビーネ
【テーマコード（参考）】
2B150
4B018
4C084
【Ｆターム（参考）】
2B150DF09
4B018LB03
4B018LB05
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB10
4B018MD20
4B018MD81
4B018ME07
4B018ME11
4B018ME14
4B018MF01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA44
4C084CA05
4C084DC23
4C084MA35
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZB131
4C084ZB132
4C084ZC371
4C084ZC372
(57)【要約】
本発明は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来の特定のジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）酵素を含む機能性食品及び栄養補助食品、当該酵素の使用、及び生体アミン減少製品の製造のためのそれぞれの方法、並びに医薬品における使用のための、特に高レベルの生体アミンに関連する状態又は疾患の予防又は治療における使用のための当該酵素に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素を含む、機能性食品又は栄養補助食品であって、前記酵素が、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素を含む機能性食品又は栄養補助食品。
【請求項2】
酵素が、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、
生体アミン減少製品の産生におけるジアミンオキシダーゼ活性を有する前記酵素の使用。
【請求項3】
生体アミン減少製品の製造のための方法であって、（ｉ）生体アミン含有製品及び／又は（ｉｉ）前記製品の生体アミン含有中間体製品を、前記製品及び／又は前記製品の前記中間体製品中に存在する生体アミンを分解するのに適した条件下及び期間にわたって、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を含み、前記酵素が、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、生体アミン減少製品の製造のための方法。
【請求項4】
医薬品に使用するためのジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素であって、前記酵素が、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、医薬品に使用するためのジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素。
【請求項5】
前記酵素が、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
からなる、請求項１に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項２に記載の使用、請求項３に記載の方法、あるいは請求項４に記載の使用のための酵素。
【請求項6】
前記（ｉｉ）のアミノ酸配列が、配列番号１と、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．５５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．６５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．７５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．８５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９１％、少なくとも９９．９２％、少なくとも９９．９３％、少なくとも９９．９４％、少なくとも９９．９５％、少なくとも９９．９６％、少なくとも９９．９７％、少なくとも９９．９８％、又は少なくとも９９．９％配列同一性を有する、請求項１又は請求項５に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項２又は請求項５に記載の使用、請求項３又は請求項５に記載の方法あるいは請求項４又は請求項５に記載の使用のための酵素。
【請求項7】
前記酵素が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１、５及び６のいずれか一項に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項２、５及び６のいずれか一項に記載の使用、請求項３、５及び６のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４～６のいずれか一項に記載の使用のための酵素。
【請求項8】
前記製品が、食品及び飼料からなる群から選択される、請求項２、及び５～７のいずれか一項に記載の使用、又は請求項３、及び５～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記製品が、発酵食品、チーズ、ザワークラウト、ソーセージ、ワイン、チョコレート、酵母抽出物、魚、魚製品、生肉、野菜、乳製品、及び新鮮な乳からなる群から選択される食品である、請求項８に記載の使用又は請求項８に記載の方法。
【請求項10】
対象における生体アミンのレベルの増加に関連する状態又は疾患を予防又は治療する方法に使用するための、請求項４～７のいずれか一項に記載の使用のための酵素。
【請求項11】
前記生体アミンのレベルの増加が、前記生体アミンの摂取によるものである、請求項１０に記載の使用のための酵素。
【請求項12】
生体アミンのレベルの増加に関連する状態又は疾患が、アレルギー、急性及び慢性アレルギー疾患、アレルギー反応、アレルギー様反応、かゆみ（掻痒）、下痢、発赤（潮紅）、嘔吐（嘔吐症）、急性及び慢性生体アミン中毒、緊張低下、呼吸困難、生体アミン不耐性、アナフィラキシー、アナフィラキシーショック、急性及び慢性蕁麻疹、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、頭痛、片頭痛、アトピー性皮膚炎、肥満症、肥満細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）、妊娠子癇、妊娠悪阻、早期分娩、消化性潰瘍、酸逆流、敗血症、線維筋痛症、慢性疲労症候群及び脊椎炎からなる群から選択される、請求項１０又は請求項１１に記載の使用のための酵素。
【請求項13】
前記生体アミンが、ヒスタミン、チラミン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、スペルミジン及びトリプタミンからなる群から選択される、請求項１、及び５～７のいずれか一項に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項２、及び５～９のいずれか一項に記載の使用、請求項３、及び５～９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項４～７、及び１０～１２のいずれか一項に記載の使用のための酵素。
【請求項14】
前記生体アミンが、ヒスタミン、チラミン、プトレシン及びカダベリンからなる群から選択される、請求項１３に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項１３に記載の使用、請求項１３に記載の方法、又は請求項１３に記載の使用のための酵素。
【請求項15】
前記生体アミンがヒスタミンである、請求項１４に記載の機能性食品又は栄養補助食品、請求項１４に記載の使用、請求項１４に記載の方法、又は請求項１４に記載の使用のための酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来の特定のジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）酵素を含む機能性食品及び栄養補助食品、当該酵素の使用、及び生体アミン減少製品の製造のためのそれぞれの方法、並びに医薬品における使用のための、特に高レベルの生体アミンに関連する状態又は疾患の予防又は治療における使用のための当該酵素に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒスタミン等の生体アミンは、Ｌ－ヒスチジンデカルボキシラーゼを産生する微生物の存在により発酵プロセスを受ける食品に特に見られる。Ｌ－ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２２）は、食品の発酵又は貯蔵中に前駆体Ｌ－ヒスチジンの脱炭酸によってヒスタミンを生成する。ヒスタミンは、ヒトにおいて多数の生理学的機能を示し、重要なホルモン及び神経伝達物質として作用する。したがって、食物中の大量の外因性ヒスタミンの消費は、嘔吐、下痢又は低血圧症等の様々な生理学的症状を伴う重篤な中毒を引き起こし得る。チラミン、プトレシン又はカダベリン等の他の生体アミンも、食物中に頻繁に見られ、人体に毒物学的影響を引き起こす可能性がある。中程度又は更には少量のヒスタミンの消費もまた、いくつかの感受性個体において有害なアレルギー様反応を引き起こし得る。全集団の約１％がヒスタミンに対して不耐性であり、それによって少量の投与量に感受性であると推定される。この不耐性は、摂取したヒスタミンの量と、小腸で利用可能なヒスタミン分解酵素ＤＡＯ（ＥＣ１．４．３．２２）の活性との間の不均衡に由来すると思われる。この酵素は、酸化的脱アミノ化によってヒスタミンを分解し、反応生成物（イミダゾール－４－イル）アセトアルデヒド、過酸化水素及びアンモニアをもたらす。
【0003】
ヒスタミン等の生体アミンに対する不耐性に対する実際の治療法は現在のところない。罹患者には、小腸内の内因性ＤＡＯを補助すると考えられるブタＤＡＯを含む栄養補助食品を投与することができる。しかしながら、満足のいくヒスタミン低下に必要な活性は予想よりもかなり大きく、現在使用されているブタＤＡＯ製剤の代替物を見つけなければならないことが示されている。
【0004】
具体的には、ブタ腎臓から抽出されたＤＡＯは、栄養補助食品として市販されており、その有効性について臨床試験で既に調査されている。しかし、最近、この酵素を十分なヒスタミン減少を達成するのに十分な量で抽出及び投与することができないことが示された。特に、ブタ腎臓ＤＡＯに関する速度論的研究は、５６ｍｇ／Ｌ（０．５ｍＭ）を超えるヒスタミン濃度による基質阻害を示した。遊離ブタＤＡＯの安定性を模擬腸液中で試験し、約１９分の半減期を示した。約９０％のヒスタミンのインビトロ低下のために、合計５０ナノカタール（ｎｋａｔ）の遊離ブタＤＡＯが必要であった。これは、約１００ｇのブタ腎臓から単離された酵素の量に相当した。ブタ腎臓抽出物を含有する栄養補助食品は、ＤＡＯ活性を示さなかった。代わりに、実験で使用したヒスタミン（０．７５ｍｇ）は、５時間以内にカプセル成分に１８．９±２．３％吸着することによって明らかに減少した。カプセル調製物は、模擬胃液中で少なくとも９０分間その全体構造及び形状を保持したが、見かけのヒスタミン低下は、１２．１±２．３％に有意に低下した（Ｐ≦０．０５）。したがって、ヒスタミン不耐性個体に適切な補充を提供するために、ブタＤＡＯの代替物が緊急に必要とされている。
【0005】
これに関連して、微生物ＤＡＯは、適切な発現系で大量に容易に生成することができる。この目的のために、いくつかの微生物ＤＡＯが当技術分野で研究され、特徴付けられている。微生物ＤＡＯは様々な特性を示し、食品からの生体アミンの分解に関して特定の利点及び欠点をもたらす。例えば、アルスロバクター・クリスタロポイテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＫＡＩＴ－Ｂ－００７由来のヒスタミンオキシダーゼを使用すると、ヒスタミンを高い速度論的効率で分解することができる。しかしながら、この酵素は、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミンオキシダーゼと同様に、生体アミンであるプトレシン、カダベリン又はスペルミジンを分解するのに適していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、インビトロ及びインビボで広範囲の生体アミンを分解するための改善された手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施形態によって達成される。
【0008】
特に、一態様では、本発明は、医薬品に使用するためのジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素に関し、当該酵素は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
【0009】
好ましい実施形態では、上記酵素は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
からなる。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
からなる。
【0010】
特定の実施形態では、上記酵素は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【0011】
本明細書で使用される場合、「ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素」という用語は、一般的な反応
［数１］
Ｒ－ＣＨ２－ＮＨ２＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２→Ｒ－ＣＨＯ＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
による生体アミンの酸化を触媒する酵素に関する。
［数１］
Ｒ－ＣＨ２－ＮＨ２＋Ｈ２Ｏ＋Ｏ２→Ｒ－ＣＨＯ＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
による生体アミンの酸化を触媒する酵素に関する。
【0012】
本発明で使用されるジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を有し、その生体アミンの分解における有利な使用が本発明で発見されているヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆジアミンオキシダーゼ－１（ＤＡＯ－１）であるか、又は（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素の場合、それに由来するそれぞれのＤＡＯであるかのいずれかである。
【0013】
「配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、酵素」という用語は、得られるポリペプチドが配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼの生物学的活性を保持するという要件を満たすならば、配列番号１のアミノ酸配列に対して、任意の数のアミノ酸置換、付加若しくは欠失、例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は２００までの任意の数（すなわち、１≦ｎ≦２００である任意の整数ｎ）のアミノ酸置換、付加若しくは欠失を含むことができるポリペプチドに関する。これに関連して、本明細書で使用される「ジアミンオキシダーゼの生物学的活性を保持する」という用語は、当該技術分野で知られている標準的なジアミンオキシダーゼ活性アッセイで決定される場合、配列番号１のアミノ酸配列を有するＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ ＤＡＯ－１の活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、１００％、又は１００％超を有するポリペプチドに関する。
【0014】
アミノ酸の置換、付加又は欠失の数は、一般に、得られるポリペプチドの配列同一性、生物学的活性、及びアミノ酸の置換、付加又は欠失の絶対数に関する上記の条件によってのみ限定されるが、得られるポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．５５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．６５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．７５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．８５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９１％、少なくとも９９．９２％、少なくとも９９．９３％、少なくとも９９．９４％、少なくとも９９．９５％、少なくとも９９．９６％、少なくとも９９．９７％、少なくとも９９．９８％、又は少なくとも９９．９％の配列同一性を有することが好ましい。
【0015】
参照配列に対するアミノ酸配列の配列同一性を決定するための手段は、当技術分野で公知である。
【0016】
特定の実施形態では、上記酵素ＤＡＯ－１は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から精製することができる。他の特定の実施形態では、上記酵素は、適切な宿主細胞、例えば当技術分野で公知の適切な微生物宿主細胞、又は当技術分野で公知の適切な酵母宿主細胞で組換え生産することができる。この点で適切な酵母宿主細胞には、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）が含まれ、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）が特に好ましい。好適な宿主細胞における上記酵素の組換え発現のための手段は特に限定されず、当該分野で公知である。
【0017】
特定の実施形態では、上記酵素は、対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象における生体アミンのレベル増加に関連する状態又は疾患を予防又は治療する方法に使用するためのものである。
【0018】
これに関連して、本明細書で使用される「生体アミンのレベルの増加」という用語は、インビボ、例えば、生体アミンが血流に入る前に最初に蓄積する小腸、又は対象の血液中の生体アミンのレベルの増加を指す。対象における生体アミンのレベルを決定するための手段は、特に限定されず、当技術分野で公知である。
【0019】
生体アミンのインビボレベルの増加は、体内の病的状態、例えばアレルギー反応のような調節不全の免疫機能に起因し得るか、又は例えば高レベルの生体アミンを含有する食品を消費することによる対象による生体アミンの摂取に起因し得る。
【0020】
特定の実施形態では、生体アミンのレベルの増加に関連する状態又は疾患は、アレルギー、急性及び慢性アレルギー疾患、アレルギー反応、アレルギー様反応、かゆみ（掻痒）、下痢、発赤（潮紅）、嘔吐（嘔吐症）、急性及び慢性生体アミン中毒、緊張低下、呼吸困難、生体アミン不耐性、アナフィラキシー、アナフィラキシーショック、急性及び慢性蕁麻疹、喘息、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、頭痛、片頭痛、アトピー性皮膚炎、肥満症、肥満細胞活性化症候群（ＭＣＡＳ）、妊娠子癇、妊娠悪阻、早期分娩、消化性潰瘍、酸逆流、敗血症、線維筋痛症、慢性疲労症候群及び脊椎炎からなる群から選択される。
【0021】
本明細書で使用される「生体アミン」という用語は、植物、動物、真菌、又は微生物の構成成分であるか、それによって分泌されるか、又は代謝産物である任意のアミン化合物に関し、ただし、当該アミンが対象に有害作用を有し得ることを条件とする。しかしながら、好ましい実施形態では、生体アミンは、ヒスタミン、チラミン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、スペルミジン及びトリプタミンからなる群から、好ましくはヒスタミン、チラミン、プトレシン及びカダベリンからなる群から選択される。特定の実施形態では、生体アミンはヒスタミンである。
【0022】
関連する態様では、本発明は、対象における生体アミンのレベル増加に関連する状態又は疾患を予防又は治療する方法に関し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素を対象に投与する工程を含み、当該酵素は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
【0023】
この態様において、本発明の使用のための酵素について上に示した全ての関連する定義及び制限は、類似の様式で適用される。特に、酵素自体、対象における生体アミンのレベル増加に関連する状態又は疾患、対象、及び生体アミンは、上に定義した通りである。
【0024】
これに関連して、本発明で使用される酵素の投与量、投与レジメン、投与様式及び適切な製剤は特に限定されず、当業者に公知であり、及び／又は当業者によって容易に決定することができる。
【0025】
更なる態様では、本発明は、当該酵素が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、生体アミン減少製品の製造におけるジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素の使用に関する。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、生体アミン減少製品の製造におけるジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素の使用に関する。
【0026】
この態様において、本発明の使用のための酵素について上に示した全ての関連する定義及び制限は、類似の様式で適用される。特に、酵素自体及び生体アミンは上記で定義した通りである。
【0027】
本発明で使用される酵素を生体アミン減少製品の製造に使用する手段は特に限定されず、当該技術分野で公知である。それぞれの手段は、例えば、（ｉ）生体アミン含有製品及び／又は（ｉｉ）当該製品の生体アミン含有中間体製品を、当該製品及び／又は当該製品の当該中間体製品中に存在する生体アミンを分解するのに適した条件下及び期間で当該酵素と接触させる工程を含む。それぞれの条件及び／又は期間は特に限定されず、当業者に公知であり、及び／又は当業者によって容易に決定することができる。これらには、例えば、３７±１℃の温度及びｐＨ６～８のｐＨ範囲で最大５時間以内に０．１ｎｋａｔ／ｍＬ又は０．１ｎｋａｔ／ｍｇの酵素活性を提供する量の製品又はその中間製品と酵素のインキュベーションが含まれる。
【0028】
本明細書で使用される「生体アミン減少製品」という用語は、その生体アミン含有量がその元の生体アミン含有量に対して減少している製品を指す。特定の実施形態では、生体アミン含有量は、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．２％、少なくとも９７．４％、少なくとも９７．５％、少なくとも９７．６％、少なくとも９７．７％、少なくとも９７．８％、少なくとも９７．９％、少なくとも９８％、少なくとも９８．１％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．３％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％低下している。
【0029】
本発明による上記の使用に適した製品は、特に限定されず、生体アミン含有量の低下が関心の対象となり得る生体アミンを含有する任意の製品を含む。好ましくは、製品は、食品及び飼料からなる群から選択される。これに関連して、本明細書で使用される「食品」という用語は、栄養目的及び／又はレクリエーション目的で人間が摂取することができる任意の固体又は液体の可食物、例えば食物及び飲料を指す。同様に、本明細書で使用される「飼料」という用語は、栄養目的で動物が摂取することができる任意の固体又は液体の可食物、例えば食餌を指す。特定の実施形態では、上記製品は、発酵食品、チーズ、ザワークラウト、ソーセージ、ワイン、チョコレート、酵母抽出物、魚及び魚製品、生肉、野菜、乳製品、並びに新鮮な乳からなる群から選択される食品である。
【0030】
関連する更なる態様では、本発明は、（ｉ）生体アミン含有製品及び／又は（ｉｉ）当該製品の生体アミン含有中間体製品を、当該製品及び／又は当該製品の当該中間体製品中に存在する生体アミンを分解するのに適した条件下及び期間にわたって、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素と接触させる工程を含み、当該酵素が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、生体アミン減少製品の製造のための方法に関する。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む、生体アミン減少製品の製造のための方法に関する。
【0031】
この態様では、本発明の使用のための酵素及び／又は本発明の使用について上に示した全ての関連する定義及び制限が、類似の様式で適用される。特に、酵素自体、製品、「生体アミン減少製品」という用語、及び生体アミンは上で定義した通りである。
【0032】
本発明の方法に適用可能なそれぞれの条件及び／又は期間は特に限定されず、当業者に公知であり、及び／又は当業者によって容易に決定することができる。これらには、例えば、製品又はその中間製品と、本発明の使用のための上で定義した酵素とのインキュベーションが含まれる。
【0033】
更なる態様では、本発明は、上記方法によって得られた製品に関する。
【0034】
この態様では、本発明の使用のための酵素、本発明の使用、及び／又は本発明の方法について上に示した全ての関連する定義及び制限が、類似の様式で適用される。特に、酵素自体、製品、「生体アミン減少製品」という用語、及び生体アミンは上で定義した通りである。
【0035】
更なる態様では、本発明は、機能性食品、栄養補助食品又は医薬組成物に関し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素を含み、当該酵素は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
【0036】
この態様において、本発明の使用のための酵素について上に示した全ての関連する定義及び制限は、類似の様式で適用される。特に、酵素自体は上で定義した通りである。
【0037】
これに関連して、本明細書で使用される「機能性食品」という用語は、本発明で使用される酵素の添加によって「機能が付与された」、すなわち機能性食品の摂取時に対象、好ましくはヒト対象の生体アミンのレベルを低下させることができるという追加の効果を示すように改変された、任意の食品、例えば任意の固体又は液体商品、例えば食物及び飲料を指す。
【0038】
更に、本明細書で使用される「栄養補助食品」という用語は、ピル、カプセル、錠剤、粉末又は液体の形態の、対象の食事、好ましくはヒト対象の食事を補助することを意図した任意の製造製品を指し、錠剤、例えばスクロース系錠剤の形態が特に好ましい。それぞれの栄養補助食品は、追加の薬剤、例えばカタラーゼと共に製剤化することができる。
【0039】
特定の食品、栄養補助食品の形態、医薬組成物の形態、投与量、投薬レジメン、及び本発明で使用される酵素に適した製剤は、特に限定されず、当業者に公知であり、及び／又は当業者によって容易に決定することができる。
【0040】
注目すべきことに、本発明の生体アミン減少製品、機能性食品、栄養補助食品及び医薬組成物は、動物由来製品を使用せずに製造することができ、その結果、ベジタリアン及びビーガンの基準を満たすことができる。
【0041】
最終的な態様において、本発明は、機能性食品又は栄養補助食品における、ジアミンオキシダーゼ活性を有する酵素の使用に関し、当該酵素は、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列；又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有し、ジアミンオキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列
を含む。
【0042】
この態様では、本発明の使用のための酵素について上に示した全ての関連する定義及び制限、同様にまた、本発明の機能性食品又は栄養補助食品についても、類似の様式で適用される。特に、酵素自体、機能性食品及び栄養補助食品は、上で定義した通りである。
【0043】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」／「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」／「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」という用語を明示的に含み、すなわち、当該用語の全ては、本明細書では互いに交換可能である。
【0044】
更に、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、指定された値の±１０％、好ましくは指定された値の±７．５％、±５％、±３％、±２％、又は±１％の修飾語を表す。したがって、例として、「約１０」という用語は、９～１１、９．２５～１０．７５、９．５～１０．５、９．７～１０．３、９．８～１０．２、及び９．９～１０．１の範囲を含む。
【0045】
微生物に見られる酵素の多様性は、当技術分野で知られているように、例えばブタＤＯＡと比較して類似又は更に良好な属性を有する競合的ＤＡＯを提供する可能性を有することができる。栄養補助食品で投与されるか、又は食品産業で一般的に使用される場合、微生物ＤＡＯの利点は、費用対効果が高く便利な酵素生産である。したがって、本発明は、代替微生物ＤＡＯの有望な産生物質としてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｙ．リポリティカ）ＰＯ１ｆを同定した。この酵母は、生乳中に最も多く見られる酵母種の１つを表し、様々な種類のチーズにも見られる。それは、そのタンパク質分解活性及び脂肪分解活性のためにチーズの熟成中の風味及び香りの発生に寄与し、したがって、製品の望ましい重要な構成要素である。酵母は、様々な製造段階（生乳、空気、塩水、表面との接触）で汚染が起こり得るため、チーズ中で自然に発生し、食品中の一般的な環境条件下で良好に増殖する。しかしながら、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、２０１８年に欧州食品安全局によって日和見病原体として分類され、製造目的のためだけに安全状態の適格な推定が与えられた。これは、酵母が生細胞として最終食品中に存在すべきではなく、新規食品として不活性化バイオマスとして使用できることを意味する。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、生体アミン産生物質として同定されたが、食品の熟成中に生体アミンを分解することもできると疑われた。しかしながら、生体アミンのこの分解に関与する酵素は、本発明以前には同定も記載もされていなかった。
【0046】
本発明によれば、遺伝子改変ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのバイオリアクタ培養は、１３０１±５４．２ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性を達成し、これはＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおける天然ＤＡＯ－１産生と比較して比ＤＡＯ活性の９３倍の増加及びブタ腎臓からのＤＡＯ抽出と比較して比ＤＡＯ活性の１４５倍の増加に相当した。クロマトグラフィ精製を含むその後の後処理により、４７３８±３１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性が得られ、これは、ブタ腎臓から抽出及び精製されたＤＡＯと比較して、比ＤＡＯ活性のほぼ６０倍の増加に相当した。１リットルのバイオリアクタ培養は、５ｋｇのブタ腎臓からの抽出及び部分精製後に得られたほぼ同じＤＡＯ活性を生じた。更に、ＤＡＯ－１の微生物産生は、ブタ腎臓からの抽出よりもはるかに少ない作業しか必要としない。
【0047】
これに関連して、当技術分野で知られているような、特に栄養補助食品におけるブタＤＡＯ調製物は、不活性ＤＡＯ調製物であることが証明された。更に、当技術分野におけるブタＤＡＯの抽出及び部分精製は、８１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の低い比ＤＡＯ活性を有する１００ｇのブタ腎臓から、５０ｎｋａｔの総活性をもたらした。対照的に、本明細書に記載のコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）におけるＤＡＯ－１の産生により、２５００ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する５０．０００ｎｋａｔ／Ｌ培地が得られた。実証されるように、ＤＡＯ－１を更に７．２倍精製することができ、これにより、１８．０００ｎｋａｔ／ｇタンパク質のコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）において産生されるＤＡＯ－１の比ＤＡＯ－１活性が得られるであろう。これは、ブタの腎臓から得られた比ＤＡＯ活性よりも２００倍超高い。本明細書にも記載されるように、ＤＡＯ－１を模擬腸条件下でそのヒスタミン分解能力について評価し、それにより６９０ｎｋａｔ ＤＡＯ－１を錠剤に製剤化し、合計２２ｍｇのヒスタミンを分解した。それにより、本発明によるＤＡＯ－１は、インビボで関連する量のヒスタミンを分解することができると結論付けることができる。この全活性（６９０ｎｋａｔ）は、１４ｍＬの細胞懸濁液中でのコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）のバイオリアクタ培養で得られた。ＤＡＯ－１錠剤については、所望のＤＡＯ－１活性を達成するために４４ｍｇのタンパク質を製剤化した。
【0048】
部分的に精製されたブタＤＡＯ抽出物を使用して同等の錠剤を調製するためには、同じ全活性（６９０ｎｋａｔ）を適用するために約１．４ｋｇのブタ腎臓が必要とされるであろう。腎臓あたり１５０ｇの平均重量（３０ｋｇのブタの場合）では、ほぼ１０個の腎臓、したがって５匹のブタが、同等の錠剤を調製するために必要とされる。８１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性では、８ｇを超えるタンパク質を錠剤に製剤化しなければならない。
【0049】
結論として、ＤＡＯの微生物産生は、満足のいくＤＡＯ含有錠剤の調製にとって不可避である。ＤＡＯ錠剤の調製のためのブタ腎臓からのＤＡＯの抽出は、技術的、経済的、及び生態学的観点から妥当ではない。
【0050】
基質選択性に関して、本発明によるＤＡＯ－１及びブタＤＡＯは両方とも、ヒスタミン、プトレシン、カダベリン及びスペルミジンの酸化的脱アミノ化を触媒する。しかしながら、基質トリプタミン及びチラミンは、ブタＤＡＯに対して不十分な基質であるようである。対照的に、ＤＡＯ－１は両方の基質を効率的に脱アミノ化し、これはその基質選択性に関してブタＤＡＯを超える本発明によるＤＡＯ－１の利点である。これに関連して、チラミン及びトリプタミンは、食品において最も一般的に見出される生体アミンの１つであると考えられている。
【0051】
ＤＡＯ－１を、ヒスタミン分解の効率に関して本明細書においてインビトロ研究で調査した。使用した最初の１５０ｍｇ／Ｌ（１００％）のヒスタミンは、５時間（３７℃）以内に３７．４±０．６５ｍｇ／Ｌ（２５±１．７％）に分解された。ブタＤＡＯと比較して、本発明によるＤＡＯ－１は基質ヒスタミンに対してより低い親和性を有するが、ＤＡＯ－１はインビトロで同様の満足できるヒスタミン分解を示した。
【0052】
ＤＡＯ－１は、ヒスタミンに加えて、チラミン、プトレシン、カダベリン、アグマチン、スペルミジン及びトリプタミン等の他の関連する生体アミンも分解するという微生物ＤＡＯ間の特異性を示す。これらの生体アミンは発酵食品中にも存在し、ヒスタミンと同様にヒトに対する毒性特性を有するため、酵素によって同時に分解できると有利である。ブタ腎臓由来のＤＡＯはまた、ヒスタミン、プトレシン及びカダベリンを分解することができる。しかしながら、生体アミンのチラミンは、この酵素によって代謝されない。したがって、ブタ腎臓からのＤＡＯによる、幾分より効率的なヒスタミン分解は、ＤＡＯ－１のより効率的で単純な産生及び広い基質スペクトルの利点に勝る。
【0053】
要約すると、本発明は、（ｉ）優れた比活性、（ｉｉ）ヒスタミン等の生体アミンの良好なインビトロ分解、及び（ｉｉｉ）広範な基質選択性を有利かつ予想外に特徴とする、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ－１）の使用を提供する。更に、本発明で使用されるＤＡＯ－１酵素は、はるかにより簡単、迅速、効率的、及び経済的な方法で有利に製造することができる。更に、例えば動物由来のＤＡＯとは対照的に酵母由来のＤＡＯを使用することは、倫理的側面、並びにユーザの受入れ及びコンプライアンスに関して問題をあまり引き起こさない。
【図面の簡単な説明】
【0054】
【図1】（Ａ）相同組換えによるｄａｏ－１のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノム（ａｘｐ遺伝子座）へのインテグレーションのためのｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１プラスミドの図である。（Ｂ）相同組換えによるｄａｏ－２のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノム（ａｘｐ遺伝子座）へのインテグレーションのためのｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２プラスミドの図である。
【図2】Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来の２つの推定ＤＡＯ ＤＡＯ－１（Ａ；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ６ＣＧＴ２）及びＤＡＯ－２（Ｂ；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ａ０Ａ３７１ＢＸＮ９）とのブタＤＡＯのＢＬＡＳＴＰアミノ酸配列アラインメントの図である。
【図3】ＹＰＤＵｒａ培地中でのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及び参照株Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのバイオリアクタ培養の図である。作業体積：０．８Ｌ、２８℃、ｐＨ６．５。
【図4】ＤＡＯ－１の疎水性相互作用クロマトグラフィ精製の図である。カラム材料：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｐｈｅｎｙｌ ６５０Ｍ（ＣＶ＝２２ｍＬ）。
【図5】塩沈殿及び疎水性相互作用クロマトグラフィによるＤＡＯ－１精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の図である。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ（Ｍ）；破砕後の粗抽出物（ＣＥ）；２０％（ｗ／ｖ）塩沈殿後の上清（Ｓ２０％）；６０％（ｗ／ｖ）塩沈殿後の懸濁ペレット（Ｐ６０％）、ＨＩＣフロースルー（ＦＴ）；ＨＩＣ溶出画分（Ｄ２～Ｅ７）。
【図6】精製ＤＡＯ－１のネイティブＰＡＧＥ分析の図である。マーカ（Ｍ）：Ｓｅｒｖａネイティブマーカ（２１～７２０ｋＤａ）；レーンあたり５μｇタンパク質；基質としてヒスタミンを使用して、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０（Ｃ）及び活性物質（Ａ）で染色した。
【図7】ＤＡＯ－１の最大活性に対する温度の影響の図である。ＤＡ－６７アッセイを用いてＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ；ｐＨ７．２）中で測定されたＤＡＯ－１活性。最大ＤＡＯ－１活性（１００％）＝１．８８±０．０１ｎｋａｔ／ｍＬ。
【図8】ＤＡＯ－１の最大活性に対するｐＨ値及び緩衝液の影響の図である。３７℃でＤＡ－６７アッセイを用いてＤＡＯ－１活性を測定した。最大ＤＡＯ－１活性（１００％）＝１．８４±０．０３ｎｋａｔ／ｍＬ。
【図9】緩衝系（各２０ｍＭ）及び３７℃で５時間後のｐＨ値に応じたＤＡＯ－１の残存活性の図である。標準的なアッセイ条件下、３７℃でＤＡ－６７アッセイを用いてＤＡＯ－１活性を測定した。各データポイントの残存活性を最初に適用したＤＡＯ－１活性と比較し、パーセントで示す（１００％＝０．１５６±０．０１ｎｋａｔ／ｍＬ）。
【図10】ＤＡＯ－１のミカエリス・メンテン速度論の図である。ＤＡＯ－１活性を、３７℃のＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ；ｐＨ７．２）中のＤＡ－６７アッセイで測定した。
【図11】Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆに従って線状化したＤＡＯ－１のミカエリス・メンテン速度論の図であり、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ；ｐＨ７．２）中３７℃でヒスタミン（０．５ｍＭ～５０ｍＭ）を基質として用いたＤＡ－６７アッセイで決定された酵素活性。
【図12】３７℃で０．１ｎｋａｔ／ｍＬのＤＡＯ－１を使用した食品関連濃度（１５０ｍｇ／Ｌ；１．３５ｍＭ）でのヒスタミンのインビトロ低下の図である。
【図13】異なるアミンオキシダーゼのパーセント同一性マトリックス（Ｃｌｕｓｔａｌ２．１により作成）の図である。
【図14】ヒトＤＡＯ及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ ＤＡＯ－１のアミノ酸配列のアラインメントの図である。青色矢印は、ヒトＤＡＯの活性部位（位置３７３及び４６１）を示す。アライメントは、ＥＳＰｒｉｐｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｓｐｒｉｐｔ．ｉｂｃｐ．ｆｒ）を用いて行った。
【図15】自己構築型錠剤プレスを使用したＤＡＯ－１錠剤の調製の図である。
【図16】ＹＰＤＵｒａ培地でのヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１のバイオリアクタ培養；２８℃での作業体積５Ｌ（ｐＨ６．５）。ガラスビーズ（直径０．７５ｍｍ）を含むＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＤＡＯ－１活性測定のためにＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞を破壊した。ＤＡＯ－１活性を、ＤＡ－６７アッセイを使用して標準的なアッセイ条件下で測定した。
【図17】純粋なＳＩＦ及び異なる食品マトリックスを補充したＤＡＯ－１の安定性の図である。食品マトリックスＳＩＦ１は、５０ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロースを含有する。食品マトリックスＳＩＦ２は、それぞれ２５ｇ／Ｌ及び５０ｇ／ＬのスクロースのＢＳＡ及びＷＰＩを含有する。食品マトリックスＳＩＦ３は、ＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ１６．６７ｇ／Ｌ及び５０ｇ／Ｌのスクロースで含む。標準アッセイ条件下でＤＡ－６７アッセイを用いてＤＡＯ－１活性を決定した（１００％ＤＡＯ－１活性＝１．２５±０．１５ｎｋａｔヒスタミン／ｍＬ）。
【図18】非加水分解（Ａ）及び加水分解（Ｂ）食品マトリックスＳＩＦ３におけるＤＡＯ－１のミカエリス・メンテン速度論の図である。１．５６～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度。ＤＡＯ－１活性をＤＡ－６７アッセイで測定した。
【図19】３７℃の非加水分解（Ａ）及び加水分解（Ｂ）条件下での食品マトリックス模擬腸液中のＤＡＯ－１のミカエリス・メンテン速度論の図である。当該技術分野で知られているような線形化。１．５６～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度。
【図20】ＤＡＯ－１錠剤の調製に使用したＤＡＯ－１調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の図である。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ（Ｍ）。矢印は、ＤＡＯ－１タンパク質バンドを示す。
【図21】Ｋｎａｕｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製Ｐｌａｔｉｎｂｌｕｅ ＵＨＰＬＣシステムでＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製ＡｑｕａＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ；２００Å）での食品マトリックスＳＩＦ生体内変換試料（９０分）中のヒスタミン（１）及びチアミン（２）の分析のためのクロマトグラム例（ＲＰ－ＨＰＬＣ）の図である。２１０ｎｍでの検出。
【図22】Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｋｎａｕｅｒ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＰｌａｔｉｎｂｌｕｅ ＵＨＰＬＣシステム）からのＡｑｕａＣ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ；２００Å）での食品マトリックスＳＩＦ生体内変換試料（９０分）中のヒスタミンの定量のための例示的なヒスタミン較正の図である。２１０ｎｍでの検出。
【図23】ＤＡＯ－１錠剤（６９０ｎｋａｔ ＤＡＯ－１）による食品マトリックスＳＩＦ３中の７５ｍｇヒスタミンの生体内変換の図である。対照にはＤＡＯ－１錠剤を適用しなかった。ヒスタミン濃度をＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。
【図24】ＤＡＯ－１の生産のためのコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）のフェドバッチバイオリアクタ培養の培養プロセスの図である。矢印＝指数関数的グルコース供給の開始。
【0055】
本発明は、これに限定されることなく、以下の実施例によって更に説明される。
【実施例】
【0056】
材料及び方法：
材料及び試薬
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、トリス－塩化水素（－ＨＣｌ）、ヒスタミン二塩酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、２－プロパノール、Ｄ（＋）－スクロース及び過酸化水素３０％は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。リン酸二水素ナトリウム、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、オルト－リン酸（Ｈ３ＰＯ４）及びチアミンクロリド二塩酸塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、ｐＨ５．２）及びＳｅｒｖａ天然マーカ（２１～７２０ｋＤａ）は、Ｓｅｒｖａ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン、ＢＤ（商標）Ｄｉｆｃｏ（商標）酵母窒素塩基及びＴ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）から購入した。酵母Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ウラシル、ロイシン、及びトリプトファンなし）、Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ヒスタミン（分析的に純粋）、カダベリン、プトレシン二塩酸塩、スペルミジン三塩酸塩、トリプタミン、チラミン塩酸塩及びカタラーゼ（ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来；１１１７００Ｕ／ｍＬ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。アグマチン二塩酸塩はＳｙｎｔｈｏｎｉｘ Ｉｎｃ．（Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＵＳＡ）から購入した。ウラシルはＡｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＳＡ）から購入した。（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ－６７）は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｃｏｒｐ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＵＳＡ）から購入した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ並びに制限酵素ＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）から購入した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。樹脂材料Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）から購入した。
材料及び試薬
リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、トリス－塩化水素（－ＨＣｌ）、ヒスタミン二塩酸塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、２－プロパノール、Ｄ（＋）－スクロース及び過酸化水素３０％は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。リン酸二水素ナトリウム、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、オルト－リン酸（Ｈ３ＰＯ４）及びチアミンクロリド二塩酸塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、ｐＨ５．２）及びＳｅｒｖａ天然マーカ（２１～７２０ｋＤａ）は、Ｓｅｒｖａ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン、ＢＤ（商標）Ｄｉｆｃｏ（商標）酵母窒素塩基及びＴ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）から購入した。酵母Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ－ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（ウラシル、ロイシン、及びトリプトファンなし）、Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ヒスタミン（分析的に純粋）、カダベリン、プトレシン二塩酸塩、スペルミジン三塩酸塩、トリプタミン、チラミン塩酸塩及びカタラーゼ（ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来；１１１７００Ｕ／ｍＬ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。アグマチン二塩酸塩はＳｙｎｔｈｏｎｉｘ Ｉｎｃ．（Ｗａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＵＳＡ）から購入した。ウラシルはＡｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＳＡ）から購入した。（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ－６７）は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｃｏｒｐ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＵＳＡ）から購入した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ並びに制限酵素ＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＵＳＡ）から購入した。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ（Ｆｅｌｄｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。樹脂材料Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ）から購入した。
【0057】
株及び培地
推定ＤＡＯ及びプラスミド増殖の遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ－１にクローニングし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む溶原性ブロス培地で増殖させた。
推定ＤＡＯ及びプラスミド増殖の遺伝子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ－１にクローニングし、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む溶原性ブロス培地で増殖させた。
【0058】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓから入手し、酵母抽出ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのｂａｃｔｏ（商標）ペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）中で培養した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ中のｄａｏ－１及びｄａｏ－２の相同組換え組込みの陽性形質転換体のスクリーニングは、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素塩基（ＢＤ（商標）Ｄｉｆｃｏ（商標））、０．９ｇ／ＬのＣＳＭ（ウラシル、ロイシン及びトリプトファンを含まない酵母合成液滴培地補足物）、２０ｇ／Ｌのグルコース及び１５ｇ／Ｌの寒天を含有する選択寒天上で行った。
【0059】
相同組換え（ｐＨＲ）のためのベクターへのｄａｏ遺伝子のクローニング
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを、ガラスビーズ（直径０．５～０．７ｍｍ）を使用した機械的細胞破壊及びその後の当該分野で公知のＲＯＴＩ（登録商標）フェノール／クロロホルム／イソアミルでのＤＮＡ抽出によって単離した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆを試験管中５ｍＬのＹＰＤ中で３０℃で２０時間増殖させ、１８０ｒｐｍで撹拌し、ＤＮＡ単離のために完全に回収した。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡを、ガラスビーズ（直径０．５～０．７ｍｍ）を使用した機械的細胞破壊及びその後の当該分野で公知のＲＯＴＩ（登録商標）フェノール／クロロホルム／イソアミルでのＤＮＡ抽出によって単離した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆを試験管中５ｍＬのＹＰＤ中で３０℃で２０時間増殖させ、１８０ｒｐｍで撹拌し、ＤＮＡ単離のために完全に回収した。
【0060】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ（配列番号２（ｄａｏ－１）及び３（ｄａｏ－２））中の２つの推定ＤＡＯをコードする遺伝子を、製造業者の指示に従って、Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲによってゲノムＤＮＡから増幅した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからのｄａｏ－１の増幅に使用したプライマーは、（５｀－ＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＴＣＧＡＴＣＡＧ－３｀；配列番号４）及び（５｀－ＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＣＡＧＴＣＣＴＴＧ－３｀；配列番号５）であった。ｄａｏ－１のプライマーを６９℃で３０秒間アニーリングした（３５サイクル）。ＰＣＲ産物（２０１６ｂｐ）を２回目の連続ＰＣＲ増幅に直接使用し、ＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩの制限部位を追加した。この増幅に使用したプライマーは（５｀－ＣＴＴＧＣＧＣＧＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＴＣ－３｀；配列番号６）及び（５｀－ＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＧＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧ－３｀；配列番号７）であった。ゲノムＤＮＡからのｄａｏ－２（２１４５ｂｐ）の増幅に使用したプライマーは、ＢｓｓＨＩＩ（５｀－ＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣ ＡＡＣＴＡＧＣ－３｀；配列番号８）及びＮｈｅＩ（５｀－ＣＡＡＧＣＴＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＣ ＡＣＧＡ－３｀；配列番号９）の制限部位をＰＣＲ産物に直接導入した。ｄａｏ－２のプライマーを６８℃で３０秒間アニーリングした（３５サイクル）。得られたアンプリコンｄａｏ－１＿ＢｓｓＨＩＩ＿ＮｈｅＩ及びｄａｏ－２＿ＢｓｓＨＩＩ＿ＮｈｅＩを、ＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩ制限消化に使用する前に精製した（ＤＮＡ ｃｌｅａｎ＆ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５，ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＳＡ）。消化したアンプリコンを、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動分離後にＧｅｎｅＪＥＴゲル抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を用いて精製した。遺伝子を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆの酸性細胞外ペプチダーゼ（ａｘｐ）遺伝子座への相同組換え組込みのための１ｋｂのフランキング領域を含むＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩ消化ｐＨＲ＿ａｘｐベクター（図１）にライゲーションした（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）。その後、化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ－１細胞を、熱ショック形質転換によるライゲーションアプローチで形質転換した。細胞を溶原性ブロス寒天プレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）に播種し、３７℃で一晩増殖させた。コロニーを採取し、５ｍＬの溶原性ブロス培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン）中、３７℃で１６時間培養し、１８０ｒｐｍで撹拌した。プラスミドｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２を、ＧｅｎｅＪＥＴプラスミドミニプレップキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して単離した。当技術分野で公知のように、ａｘｐフランキング領域（５｀－ＣＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧＴＧ ＣＣ－３｀；配列番号１０）及び（５｀－ＣＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＡＡＴＡＣＡＡＣＡＣ－３｀；配列番号１１）のプライマーを使用して配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、ｄａｏ遺伝子を分析した。
【0061】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるｄａｏ遺伝子の相同組換え組込み
当技術分野で公知のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、推定ＤＡＯ ｄａｏ－１及びｄａｏ－２の遺伝子を、それぞれのｐＨＲベクター（ｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２；図１）からＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノム上のａｘｐ遺伝子座に相同組換え的に組み込んだ。
当技術分野で公知のように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、推定ＤＡＯ ｄａｏ－１及びｄａｏ－２の遺伝子を、それぞれのｐＨＲベクター（ｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びｐＨＲ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２；図１）からＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノム上のａｘｐ遺伝子座に相同組換え的に組み込んだ。
【0062】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１のバイオリアクタ培養
予備実験は、ＤＡＯ－２がヒスタミンに対しては酵素活性を示さず、アグマチンに対してのみ酵素活性を示すことを示した。したがって、ＤＡＯ－２は本発明では更に調査されなかった。
予備実験は、ＤＡＯ－２がヒスタミンに対しては酵素活性を示さず、アグマチンに対してのみ酵素活性を示すことを示した。したがって、ＤＡＯ－２は本発明では更に調査されなかった。
【0063】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ（陰性対照）を、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクタシステム（１Ｌリアクタ体積、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）で８００ｍＬの作業体積で培養した。７２０ｍＬのＹＰＤＵｒａ培地を含有するバイオリアクタ（ＹＰＤ培地＋０．２ｇ／Ｌのウラシル及び０．２ｍＬ／ＬのＡｎｔｉｆｏａｍ２０４）に８０ｍＬの前培養物を接種し、これを５００ｍＬの振盪フラスコ中のＹＰＤＵｒａで培養し、３０℃で２０時間インキュベートし、１１５ｒｐｍで撹拌した。バイオリアクタを常に０．５ｖｖｍを通気し、２８℃に加熱した。撹拌機の速度を段階的に増加させ（８００ｒｐｍから開始）、酸素分圧ｐＯ２を２０％超に維持した。２ＭのＨ３ＰＯ４及び２ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．５で一定に保った。バイオリアクタ培養中のｐＯ２及びｐＨ値を、それぞれＩｎＰｒｏ６９００及び４０５－ＤＰＡＳ－ＳＣ－Ｋ８Ｓ ｐＨセンサーを用いて監視した。培地中の光学密度（ＯＤ６００）、生物乾燥質量及びグルコース濃度を監視するために、バイオリアクタ培養の過程で試料を常に採取した。細胞内ＤＡＯ－１活性の測定のために、８時間毎に１５ｍＬの試料を採取した。これらの試料を遠心分離し（８０００ｇ、７分、４℃）、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で２回洗浄した後、細胞ペレットを－２０℃で保存した。遠心分離（６０００ｇ、１０分、４℃）による９６時間の培養後に細胞塊全体を回収した。ペレットを生理食塩水で２回洗浄し、最後に８０００ｇ、１５分、４℃で遠心分離した後、更に処理するまで－２０℃で保存した。
【0064】
タンパク質分析及びＤＡＯ活性決定のための細胞破壊及び脱塩
酵母細胞を氷上で解凍し、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（２－プロパノールに溶解）を含有するＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に懸濁した（２０％（ｗ／ｖ）細胞懸濁液）。バイオリアクタ培養の過程で採取した酵素試料を、Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ ＦＡ－０７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＳＡ）を用いて１ｋｂａｒで２つの連続工程で機械的に破壊した。培養終了時に採取した細胞塊を、高圧ホモジナイザ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ２０ ＫＰＳＩ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｄａｖｅｎｔｒｙ，ＵＫ）を用いて１．３５ｋｂａｒでの２回の連続工程で破壊した。細胞破壊後、遠心分離（８０００ｇ、５分、４℃）によって細胞残屑を除去した。酵素活性を決定するためのバイオリアクタ培養の過程で採取した試料を、製造業者の指示に従って、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に対してＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を使用して破壊後に脱塩した。
酵母細胞を氷上で解凍し、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（２－プロパノールに溶解）を含有するＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に懸濁した（２０％（ｗ／ｖ）細胞懸濁液）。バイオリアクタ培養の過程で採取した酵素試料を、Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ ＦＡ－０７８、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＳＡ）を用いて１ｋｂａｒで２つの連続工程で機械的に破壊した。培養終了時に採取した細胞塊を、高圧ホモジナイザ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ２０ ＫＰＳＩ，Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｄａｖｅｎｔｒｙ，ＵＫ）を用いて１．３５ｋｂａｒでの２回の連続工程で破壊した。細胞破壊後、遠心分離（８０００ｇ、５分、４℃）によって細胞残屑を除去した。酵素活性を決定するためのバイオリアクタ培養の過程で採取した試料を、製造業者の指示に従って、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に対してＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を使用して破壊後に脱塩した。
【0065】
ＤＡＯ－１の精製
ＤＡＯ－１を分画した（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びその後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製した。したがって、上記のように、１０ｇのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ｄａｏ－１細胞を懸濁し、破壊した。液体（ＮＨ４）２ＳＯ４（４Ｍ）を無細胞抽出物に２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで滴下し（２ｍＬ／分）、撹拌（３５０ｒｐｍ）しながら氷上で１時間更に平衡化した。その後、溶液を１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を再び沈殿させ、溶液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を２０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に増加させた。溶液を１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。得られたペレットを、１．３Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する４５ｍＬリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）に懸濁した。その後のＨＩＣ精製のために、樹脂Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（カラム体積（ＣＶ）＝２２ｍＬ）を用いて酵素溶液を濾過した（０．４５μｍ）。試料を２ｍＬ／分の流速でカラムに適用した。カラムを４ＣＶの結合緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液＋１．３Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨ７．０）で３ｍＬ／分で洗浄した。ＤＡＯ－１を、９ＣＶにわたって増加する（０から１００％（ｖ／ｖ））溶出緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０）の線形勾配で溶出し、その後の勾配遅延は５０ｍＬであった。各精製工程中に採取した試料を、製造業者の指示に従って、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を使用してＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に対して脱塩した。
ＤＡＯ－１を分画した（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びその後の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）によって精製した。したがって、上記のように、１０ｇのＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ｄａｏ－１細胞を懸濁し、破壊した。液体（ＮＨ４）２ＳＯ４（４Ｍ）を無細胞抽出物に２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで滴下し（２ｍＬ／分）、撹拌（３５０ｒｐｍ）しながら氷上で１時間更に平衡化した。その後、溶液を１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を再び沈殿させ、溶液中の（ＮＨ４）２ＳＯ４濃度を２０％（ｖ／ｖ）から６０％（ｖ／ｖ）に増加させた。溶液を１０，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。得られたペレットを、１．３Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する４５ｍＬリン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）に懸濁した。その後のＨＩＣ精製のために、樹脂Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（カラム体積（ＣＶ）＝２２ｍＬ）を用いて酵素溶液を濾過した（０．４５μｍ）。試料を２ｍＬ／分の流速でカラムに適用した。カラムを４ＣＶの結合緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液＋１．３Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４；ｐＨ７．０）で３ｍＬ／分で洗浄した。ＤＡＯ－１を、９ＣＶにわたって増加する（０から１００％（ｖ／ｖ））溶出緩衝液（２５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液；ｐＨ７．０）の線形勾配で溶出し、その後の勾配遅延は５０ｍＬであった。各精製工程中に採取した試料を、製造業者の指示に従って、ＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を使用してＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）に対して脱塩した。
【0066】
タンパク質分析
当技術分野で知られているように、ＢＳＡを標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄに従って酵素試料のタンパク質含有量を決定した。ＤＡＯ精製手順の試料を、当技術分野で公知のように、１０％分離ゲルでドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。５μｇのタンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。タンパク質分子量標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ）を分子量決定のために使用した。当技術分野で公知のように、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を使用してゲルを染色した。精製ＤＡＯ－１を天然ＰＡＧＥ分析によって更に調査した。精製されたＤＡＯ－１をネイティブＰＡＧＥ（それぞれ５μｇのタンパク質）に２回適用し、それにより、一方の部分をクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０で染色し、他方の部分を活性染色した。活性染色溶液は、３０ｍＭのヒスタミン、５０μＭのＤＡ－６７試薬、５．３２Ｕ／ｍＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）及び２５ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有していた。青色バンドが見えるようになるまで、活性染色を３７℃で継続した。
当技術分野で知られているように、ＢＳＡを標準として使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄに従って酵素試料のタンパク質含有量を決定した。ＤＡＯ精製手順の試料を、当技術分野で公知のように、１０％分離ゲルでドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析した。５μｇのタンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーンにロードした。タンパク質分子量標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ）を分子量決定のために使用した。当技術分野で公知のように、クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を使用してゲルを染色した。精製ＤＡＯ－１を天然ＰＡＧＥ分析によって更に調査した。精製されたＤＡＯ－１をネイティブＰＡＧＥ（それぞれ５μｇのタンパク質）に２回適用し、それにより、一方の部分をクーマシーブリリアントブルーＧ－２５０で染色し、他方の部分を活性染色した。活性染色溶液は、３０ｍＭのヒスタミン、５０μＭのＤＡ－６７試薬、５．３２Ｕ／ｍＬのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）及び２５ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．２）を含有していた。青色バンドが見えるようになるまで、活性染色を３７℃で継続した。
【0067】
ＤＡＯ活性測定
ＤＡＯ活性は、当技術分野で公知の比色ＤＡ－６７酵素アッセイを使用して決定した。７５０μＬのヒスタミン溶液（３０ｍＭ；２５ｍＭのＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２；Ｏ２で５分間フラッシングした）及び７２６μＬのＤＡ－６７試薬（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩；５０μＭ；２５ｍＭのＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）を含有する反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。その後、２４μＬ（２６６単位／ｍＬ）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）を添加した。５０μＬの酵素溶液を添加することによって反応を開始し、３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。５０μＬのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（３０ｍＭ）を添加して反応を停止させた。遠心分離（１０，０００ｇ、２０℃で３分間）後、吸収を６６８ｎｍで測定した。ヒスタミン溶液を参照のために緩衝液（２５ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７．２）と交換した。過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を較正に使用した。酵素活性をｎｋａｔで計算し、それによって１ｎｋａｔは３７℃で１ｎｍｏｌ基質／秒を変換する。
ＤＡＯ活性は、当技術分野で公知の比色ＤＡ－６７酵素アッセイを使用して決定した。７５０μＬのヒスタミン溶液（３０ｍＭ；２５ｍＭのＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２；Ｏ２で５分間フラッシングした）及び７２６μＬのＤＡ－６７試薬（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩；５０μＭ；２５ｍＭのＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）を含有する反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。その後、２４μＬ（２６６単位／ｍＬ）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）を添加した。５０μＬの酵素溶液を添加することによって反応を開始し、３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。５０μＬのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（３０ｍＭ）を添加して反応を停止させた。遠心分離（１０，０００ｇ、２０℃で３分間）後、吸収を６６８ｎｍで測定した。ヒスタミン溶液を参照のために緩衝液（２５ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７．２）と交換した。過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を較正に使用した。酵素活性をｎｋａｔで計算し、それによって１ｎｋａｔは３７℃で１ｎｍｏｌ基質／秒を変換する。
【0068】
ＤＡＯ－１の温度及びｐＨプロファイルの調査
ＤＡＯ－１の酵素活性に対する温度の影響を、標準的なアッセイ条件下で試験し、それにより、インキュベーション温度を２０℃～４７℃で変化させた。ＤＡＯ－１活性のｐＨ依存性を３７℃の標準アッセイ条件下で調査し、それによって異なる緩衝系（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２～７．８；５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ７～７．５；５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２～８．５）を使用した。それぞれの緩衝系を過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）で較正した。分析的に純粋なヒスタミンを温度及びｐＨプロファイルの基質として使用した。
ＤＡＯ－１の酵素活性に対する温度の影響を、標準的なアッセイ条件下で試験し、それにより、インキュベーション温度を２０℃～４７℃で変化させた。ＤＡＯ－１活性のｐＨ依存性を３７℃の標準アッセイ条件下で調査し、それによって異なる緩衝系（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．２～７．８；５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ７～７．５；５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．２～８．５）を使用した。それぞれの緩衝系を過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）で較正した。分析的に純粋なヒスタミンを温度及びｐＨプロファイルの基質として使用した。
【0069】
ＤＡＯ－１のｐＨ安定性の調査
ＤＡＯ－１の安定性に対する緩衝液及びｐＨ値の影響を調査して、ヒスタミン生体内変換実験のための適切な条件を決定した。その結果、ＤＡＯ－１を３７℃で５時間インキュベートし、以下の緩衝系において４００ｒｐｍで撹拌した：２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２、７．０、７．２、７．８、８．０）、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０、７．２、７．５）及び２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８、７．５、８．２）。その後、ＤＡＯ－１の残存酵素活性を標準アッセイ条件下で決定し、最初に適用されたＤＡＯ－１活性と比較した。
ＤＡＯ－１の安定性に対する緩衝液及びｐＨ値の影響を調査して、ヒスタミン生体内変換実験のための適切な条件を決定した。その結果、ＤＡＯ－１を３７℃で５時間インキュベートし、以下の緩衝系において４００ｒｐｍで撹拌した：２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２、７．０、７．２、７．８、８．０）、２０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ７．０、７．２、７．５）及び２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８、７．５、８．２）。その後、ＤＡＯ－１の残存酵素活性を標準アッセイ条件下で決定し、最初に適用されたＤＡＯ－１活性と比較した。
【0070】
ＤＡＯ－１の速度論的特性決定
ＤＡＯ－１の見かけの速度論的パラメータを、標準的なアッセイ条件下で基質としてヒスタミンを用いたミカエリス・メンテン速度論によって決定した。ヒスタミン濃度（分析的に純粋なヒスタミン）を０．５ｍＭ～５０ｍＭの間で変化させた。初期反応速度内で速度論的調査を行った。
ＤＡＯ－１の見かけの速度論的パラメータを、標準的なアッセイ条件下で基質としてヒスタミンを用いたミカエリス・メンテン速度論によって決定した。ヒスタミン濃度（分析的に純粋なヒスタミン）を０．５ｍＭ～５０ｍＭの間で変化させた。初期反応速度内で速度論的調査を行った。
【0071】
ＤＡＯ－１の基質選択性の調査
ＤＡＯ－１の基質選択性を、標準的なアッセイ条件下で基質として異なる食品産業関連の生体アミン（トリプタミン、カダベリン、プトレシン、アグマチン、スペルミジン、ヒスタミン、及びチラミン）を用いて試験した。アミノ酸Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン、及びＬ－アルギニンも試験した。最終アッセイアプローチでは、トリプタミンを除いて、各基質を１、１０及び５０ｍＭの濃度で使用したが、トリプタミンは、より高い濃度におけるその不溶性のために１ｍＭでのみ試験した。
ＤＡＯ－１の基質選択性を、標準的なアッセイ条件下で基質として異なる食品産業関連の生体アミン（トリプタミン、カダベリン、プトレシン、アグマチン、スペルミジン、ヒスタミン、及びチラミン）を用いて試験した。アミノ酸Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン、及びＬ－アルギニンも試験した。最終アッセイアプローチでは、トリプタミンを除いて、各基質を１、１０及び５０ｍＭの濃度で使用したが、トリプタミンは、より高い濃度におけるその不溶性のために１ｍＭでのみ試験した。
【0072】
ＤＡＯ－１によるヒスタミンの生体内変換
ヒスタミン低下実験は、当技術分野で公知のように、１５０ｍｇ／Ｌのヒスタミンの食品関連ヒスタミン濃度で行った。ヒスタミンの低下を、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）中３７℃で５時間行った。食品マトリックスをシミュレートするために、５ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロースの量をアプローチに添加した。更に、カタラーゼ（３０ｎｋａｔ／ｍＬ）を添加して過酸化水素を除去した。０．１ｎｋａｔ／ｍＬのＤＡＯ－１活性の添加によって実験を開始した。このＤＡＯ活性を、緩衝系（２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ７）、基質濃度（最終アッセイアプローチでは１．３５ｍＭのヒスタミン）及び添加剤（５ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロース）を生体内変換条件に調整した改変アッセイ条件下で測定した。ヒスタミン低下は、当技術分野で公知のように、チアミン（１．３５ｍＭ）を内部標準として用いた逆相高速液体クロマトグラフィによって決定した。
ヒスタミン低下実験は、当技術分野で公知のように、１５０ｍｇ／Ｌのヒスタミンの食品関連ヒスタミン濃度で行った。ヒスタミンの低下を、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）中３７℃で５時間行った。食品マトリックスをシミュレートするために、５ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロースの量をアプローチに添加した。更に、カタラーゼ（３０ｎｋａｔ／ｍＬ）を添加して過酸化水素を除去した。０．１ｎｋａｔ／ｍＬのＤＡＯ－１活性の添加によって実験を開始した。このＤＡＯ活性を、緩衝系（２０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ７）、基質濃度（最終アッセイアプローチでは１．３５ｍＭのヒスタミン）及び添加剤（５ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロース）を生体内変換条件に調整した改変アッセイ条件下で測定した。ヒスタミン低下は、当技術分野で公知のように、チアミン（１．３５ｍＭ）を内部標準として用いた逆相高速液体クロマトグラフィによって決定した。
【0073】
統計分析
バイオリアクタでのＤＡＯ－１産生を除く全ての実験を少なくとも２回行い、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＵＳＡ）で標準偏差を決定することによって評価した。データは、標準偏差を有する平均値として提示される。酵素速度論を、データ分析ソフトウェアＳｉｇｍａｐｌｏｔ １２．５（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して非線形回帰によって評価した。
バイオリアクタでのＤＡＯ－１産生を除く全ての実験を少なくとも２回行い、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＵＳＡ）で標準偏差を決定することによって評価した。データは、標準偏差を有する平均値として提示される。酵素速度論を、データ分析ソフトウェアＳｉｇｍａｐｌｏｔ １２．５（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して非線形回帰によって評価した。
【0074】
実施例１：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるｄａｏ遺伝子の同定及び振盪フラスコ実験におけるそれらの発現
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用して２つの推定ＤＡＯの所有者として同定された。どちらの遺伝子もイントロンを含有しなかった。ブタＤＡＯ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＴＲＣ７）と２つの推定ＤＡＯとのアミノ酸配列比較は、ＤＡＯ－１について５４％のクエリカバー及び２５％の同一性、並びにＤＡＯ－２について５３％のクエリカバー及び２５％の同一性を示した（図２Ａ、Ｂ）。両方の推定ＤＡＯを互いに比較すると、９７％のクエリカバー及び３５％の同一性が示された。更に、ブタ及びヒト（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１９８０１）ＤＡＯと２つの推定ＤＡＯとのアミノ酸配列比較は、ＤＡＯ－１及びＤＡＯ－２の両方について約２１％のコンセンサスを示した（図１３、図１４）。両方の推定ＤＡＯを互いに比較すると、約３４％の類似性が示された。両方の遺伝子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＰＯ１ｆのゲノムから増幅し、ゲノムのａｘｐ遺伝子座への組み込みに成功し（組み込み効率約２０％）、組換え株Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２が得られた。当技術分野で知られているように、相同組換え組込みのために選択された戦略で所望されるタンパク質の効率的な発現を可能にしたので、遺伝子をａｘｐ遺伝子座に組み込んだ。それにより、強力な構成的プロモータＵＡＳ１Ｂ８＿ＴＥＦ（１３６）を用いて遺伝子発現を行った。野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ細胞抽出物と比較して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２の細胞抽出物は、基質ヒスタミン、プトレシン、カダベリン、チラミン、スペルミジン及びトリプタミンについてＤＡＯ活性の増加を示さなかった。基質アグマチンについてのみ、活性の５．５倍の増加が測定された（約５０ｎｋａｔアグマチン（１４．５ｍＭ）／Ｌ培養）。組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるＤＡＯ－２の過剰発現はＳＤＳ－ＰＡＧＥでは見えず（データは示さず）、酵素はヒスタミンに対する活性を示さなかったので、ＤＡＯ－１のみをこの試験で更に調査した。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるｄａｏ遺伝子の同定及び振盪フラスコ実験におけるそれらの発現
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を使用して２つの推定ＤＡＯの所有者として同定された。どちらの遺伝子もイントロンを含有しなかった。ブタＤＡＯ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９ＴＲＣ７）と２つの推定ＤＡＯとのアミノ酸配列比較は、ＤＡＯ－１について５４％のクエリカバー及び２５％の同一性、並びにＤＡＯ－２について５３％のクエリカバー及び２５％の同一性を示した（図２Ａ、Ｂ）。両方の推定ＤＡＯを互いに比較すると、９７％のクエリカバー及び３５％の同一性が示された。更に、ブタ及びヒト（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１９８０１）ＤＡＯと２つの推定ＤＡＯとのアミノ酸配列比較は、ＤＡＯ－１及びＤＡＯ－２の両方について約２１％のコンセンサスを示した（図１３、図１４）。両方の推定ＤＡＯを互いに比較すると、約３４％の類似性が示された。両方の遺伝子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＰＯ１ｆのゲノムから増幅し、ゲノムのａｘｐ遺伝子座への組み込みに成功し（組み込み効率約２０％）、組換え株Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１及びＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２が得られた。当技術分野で知られているように、相同組換え組込みのために選択された戦略で所望されるタンパク質の効率的な発現を可能にしたので、遺伝子をａｘｐ遺伝子座に組み込んだ。それにより、強力な構成的プロモータＵＡＳ１Ｂ８＿ＴＥＦ（１３６）を用いて遺伝子発現を行った。野生型Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ細胞抽出物と比較して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－２の細胞抽出物は、基質ヒスタミン、プトレシン、カダベリン、チラミン、スペルミジン及びトリプタミンについてＤＡＯ活性の増加を示さなかった。基質アグマチンについてのみ、活性の５．５倍の増加が測定された（約５０ｎｋａｔアグマチン（１４．５ｍＭ）／Ｌ培養）。組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株におけるＤＡＯ－２の過剰発現はＳＤＳ－ＰＡＧＥでは見えず（データは示さず）、酵素はヒスタミンに対する活性を示さなかったので、ＤＡＯ－１のみをこの試験で更に調査した。
【0075】
実施例２：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるＤＡＯ－１の産生
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１を、０．２ｇ／Ｌのウラシルを補充したＹＰＤ培地中、８００ｍＬの作業体積で９６時間、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクタシステムで培養した。元のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ株を参照として同様に並行して培養した。両方の株は、図３に示すように、１６時間後に約２４ｇ／Ｌの最大生物乾燥質量に達する同様の増殖挙動を示した。これは、約６０の最大光学密度（０．３２ｈ－１の最大比増殖速度μ）に相当した。生物乾燥質量は、両方の株について９６時間後に約１５ｇ／Ｌに明らかに減少し、これはバイオリアクタ培養の過程で不均一な試料が採取されたことに起因した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１株の体積測定ＤＡＯ－１活性（細胞内）は、バイオリアクタ培養の過程にわたって直線的に増加し、５６時間後に最大２７８４±７５ｎｋａｔ／Ｌ培養に達した。その後、ＤＡＯ－１活性はわずかに減少し、１３０１±５４．２ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する２３４３±９８ｎｋａｔ／Ｌ培養の最終体積ＤＡＯ－１活性に達した。参照Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、５８±０．６ｎｋａｔ／Ｌ培養の最大体積ＤＡＯ活性を有し、４８時間の培養後に１４．１±０．１４ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性を有した。ＤＡＯ－２はＤＡＯ活性の測定に使用された基質ヒスタミンに対して活性を示さなかったので、参照株Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのＤＡＯ活性はネイティブＤＡＯ－１発現に起因することが示唆される。したがって、ｄａｏ－１遺伝子のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのａｘｐ遺伝子座への相同組換え組込みは、ＤＡＯ－１の効率的な発現を可能にした。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるＤＡＯ－１の産生
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１を、０．２ｇ／Ｌのウラシルを補充したＹＰＤ培地中、８００ｍＬの作業体積で９６時間、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓバイオリアクタシステムで培養した。元のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ株を参照として同様に並行して培養した。両方の株は、図３に示すように、１６時間後に約２４ｇ／Ｌの最大生物乾燥質量に達する同様の増殖挙動を示した。これは、約６０の最大光学密度（０．３２ｈ－１の最大比増殖速度μ）に相当した。生物乾燥質量は、両方の株について９６時間後に約１５ｇ／Ｌに明らかに減少し、これはバイオリアクタ培養の過程で不均一な試料が採取されたことに起因した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１株の体積測定ＤＡＯ－１活性（細胞内）は、バイオリアクタ培養の過程にわたって直線的に増加し、５６時間後に最大２７８４±７５ｎｋａｔ／Ｌ培養に達した。その後、ＤＡＯ－１活性はわずかに減少し、１３０１±５４．２ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する２３４３±９８ｎｋａｔ／Ｌ培養の最終体積ＤＡＯ－１活性に達した。参照Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、５８±０．６ｎｋａｔ／Ｌ培養の最大体積ＤＡＯ活性を有し、４８時間の培養後に１４．１±０．１４ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性を有した。ＤＡＯ－２はＤＡＯ活性の測定に使用された基質ヒスタミンに対して活性を示さなかったので、参照株Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのＤＡＯ活性はネイティブＤＡＯ－１発現に起因することが示唆される。したがって、ｄａｏ－１遺伝子のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのａｘｐ遺伝子座への相同組換え組込みは、ＤＡＯ－１の効率的な発現を可能にした。
【0076】
粗抽出物で得られた１３０１±５４．２ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性は、８１ｎｋａｔ／ｇタンパク質を有する当技術分野で公知の部分精製ブタＤＡＯのＤＡＯ活性よりも約１６倍高かった。ＤＡＯを栄養補助食品として使用する場合、ＤＡＯのかなり高い活性を使用して食品関連ヒスタミン量を分解しなければならない。７５ｍｇヒスタミンの分解に必要なブタＤＡＯの酵素活性は、インビトロ条件下で５時間以内で５０ｎｋａｔであった。このＤＡＯ活性を得るために、十分なＤＡＯ抽出のために１００ｇのブタ腎臓が必要であった。比較すると、ほぼ５ｋｇのブタ腎臓からのＤＡＯの単離及び部分的精製は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１の１リットルのバイオリアクタ培養から得られる同じ量のＤＡＯ－１活性をもたらすであろう。したがって、微生物ＤＡＯ産生は費用対効果が高いようであり、特に倫理的及び文化的考慮の点で、ブタ腎臓からのＤＡＯの使用と比較していくつかの利点を提供する。
【0077】
実施例３：
細胞破壊後の粗抽出物からのＤＡＯ－１の精製
酵母ＤＡＯ－１を、分画した（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びその後のＨＩＣによって精製した。１０ｇの湿酵母バイオマスから、高圧ホモジナイザを用いた細胞破壊後に１０８±５ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性（６６０±２８ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性）が得られた。（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びＨＩＣ（図４）の後、ＤＡＯ－１を７．２倍（４７３８±３１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比酵素活性）の収率４６．６±０．３１％で精製した。比較すると、ブタ腎臓からのＤＡＯの精製は、熱処理、塩沈殿及びＨＩＣを用いる同様の精製戦略で、８１±１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比酵素活性をもたらした。したがって、微生物産生宿主におけるＤＡＯの産生及びその後の精製は、はるかに高い比ＤＡＯ活性を達成した。ＤＡＯ－１の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図５）によって評価したところ、ＤＡＯ－１の理論的単量体分子量（アミノ酸配列から計算して７５．４ｋＤａ）に従った、約７５ｋＤａの精製手順にわたって強度が増加したタンパク質バンドを示していた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはまた、ＤＡＯ－１調製物が依然として他のタンパク質を含有することを示した。しかし、活性染色されたネイティブＰＡＧＥ（図６）では、約１４６ｋＤａの１つのタンパク質バンドのみが基質ヒスタミンに対して活性であることが示された。これは、ＤＡＯ－１調製物の純度が更なる生化学的特性決定に十分であることを示した。ＤＡＯ－１は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びネイティブＰＡＧＥ分析で観察されたサイズに基づいて、ホモ二量体酵素であると思われた。これは、当該分野で記載されているヒト及びブタのＤＡＯを含む銅アミンオキシダーゼの大部分で観察されたホモ二量体構造と一致していた。
細胞破壊後の粗抽出物からのＤＡＯ－１の精製
酵母ＤＡＯ－１を、分画した（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びその後のＨＩＣによって精製した。１０ｇの湿酵母バイオマスから、高圧ホモジナイザを用いた細胞破壊後に１０８±５ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性（６６０±２８ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性）が得られた。（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿及びＨＩＣ（図４）の後、ＤＡＯ－１を７．２倍（４７３８±３１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比酵素活性）の収率４６．６±０．３１％で精製した。比較すると、ブタ腎臓からのＤＡＯの精製は、熱処理、塩沈殿及びＨＩＣを用いる同様の精製戦略で、８１±１ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比酵素活性をもたらした。したがって、微生物産生宿主におけるＤＡＯの産生及びその後の精製は、はるかに高い比ＤＡＯ活性を達成した。ＤＡＯ－１の精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図５）によって評価したところ、ＤＡＯ－１の理論的単量体分子量（アミノ酸配列から計算して７５．４ｋＤａ）に従った、約７５ｋＤａの精製手順にわたって強度が増加したタンパク質バンドを示していた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥはまた、ＤＡＯ－１調製物が依然として他のタンパク質を含有することを示した。しかし、活性染色されたネイティブＰＡＧＥ（図６）では、約１４６ｋＤａの１つのタンパク質バンドのみが基質ヒスタミンに対して活性であることが示された。これは、ＤＡＯ－１調製物の純度が更なる生化学的特性決定に十分であることを示した。ＤＡＯ－１は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びネイティブＰＡＧＥ分析で観察されたサイズに基づいて、ホモ二量体酵素であると思われた。これは、当該分野で記載されているヒト及びブタのＤＡＯを含む銅アミンオキシダーゼの大部分で観察されたホモ二量体構造と一致していた。
【0078】
実施例４：
ＤＡＯ－１の生化学的調査
精製されたＤＡＯ－１を、ＤＡＯ－１活性に対する温度、ｐＨ値及び緩衝液の影響に関して調べた。ＤＡＯ－１は４０℃で最大活性を有した（図７）。温度を４２℃又は４５℃に増加させると、相対ＤＡＯ－１活性がそれぞれ７６±１％及び３１．７±１％に減少した。相対ＤＡＯ－１活性は、３０℃～４２℃の温度範囲で５０％超であった。したがって、ＤＡＯ－１の温度プロファイルは、他のＤＡＯ、例えばブタ及びヒト由来のものの温度プロファイルに匹敵したが、これらのＤＡＯ活性は、プトレシンを基質として用いて決定された。ＤＡＯ－１は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ）中のｐＨ７．２で最大ＤＡＯ活性を示した（図８）。このｐＨ値でのＴｒｉｓ－ＨＣｌの緩衝能が限られているため、以下の実験をＰＩＰＥＳ緩衝液中で行ったところ、ｐＨ７．２でのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中の最大活性と比較して、９２．２±３．９％のわずかに低いＤＡＯ－１活性が得られた。ｐＨプロファイルはまた、ヒト及びブタのＤＡＯに匹敵するようである。先行技術は、基質としてプトレシンを用いたヒトＤＡＯ（血清由来）の最大ＤＡＯ活性がリン酸緩衝液中ｐＨ７．５であることを見出した。ブタ腎臓由来のＤＡＯは、それぞれ６．３及び７．４のｐＨ値でリン酸カリウム緩衝液中のヒスタミン及びカダベリンに対して最大ＤＡＯ活性を示した。ＤＡＯ－１の最も高い安定性は、３７℃で５時間のインキュベーション後に８９．５±０．８％の残存ＤＡＯ－１活性でｐＨ７．０のＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）中で決定された（図９）。ＤＡＯ－１は、３７℃で２４時間後もその活性の５３．７±１．２％を保持していた（データは示さず）。ＤＡＯ－１は、６．２～７．５のｐＨ範囲において３７℃で５時間のインキュベーション後に３９０のうち６０％超の活性を維持した。
ＤＡＯ－１の生化学的調査
精製されたＤＡＯ－１を、ＤＡＯ－１活性に対する温度、ｐＨ値及び緩衝液の影響に関して調べた。ＤＡＯ－１は４０℃で最大活性を有した（図７）。温度を４２℃又は４５℃に増加させると、相対ＤＡＯ－１活性がそれぞれ７６±１％及び３１．７±１％に減少した。相対ＤＡＯ－１活性は、３０℃～４２℃の温度範囲で５０％超であった。したがって、ＤＡＯ－１の温度プロファイルは、他のＤＡＯ、例えばブタ及びヒト由来のものの温度プロファイルに匹敵したが、これらのＤＡＯ活性は、プトレシンを基質として用いて決定された。ＤＡＯ－１は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ）中のｐＨ７．２で最大ＤＡＯ活性を示した（図８）。このｐＨ値でのＴｒｉｓ－ＨＣｌの緩衝能が限られているため、以下の実験をＰＩＰＥＳ緩衝液中で行ったところ、ｐＨ７．２でのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中の最大活性と比較して、９２．２±３．９％のわずかに低いＤＡＯ－１活性が得られた。ｐＨプロファイルはまた、ヒト及びブタのＤＡＯに匹敵するようである。先行技術は、基質としてプトレシンを用いたヒトＤＡＯ（血清由来）の最大ＤＡＯ活性がリン酸緩衝液中ｐＨ７．５であることを見出した。ブタ腎臓由来のＤＡＯは、それぞれ６．３及び７．４のｐＨ値でリン酸カリウム緩衝液中のヒスタミン及びカダベリンに対して最大ＤＡＯ活性を示した。ＤＡＯ－１の最も高い安定性は、３７℃で５時間のインキュベーション後に８９．５±０．８％の残存ＤＡＯ－１活性でｐＨ７．０のＰＩＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ）中で決定された（図９）。ＤＡＯ－１は、３７℃で２４時間後もその活性の５３．７±１．２％を保持していた（データは示さず）。ＤＡＯ－１は、６．２～７．５のｐＨ範囲において３７℃で５時間のインキュベーション後に３９０のうち６０％超の活性を維持した。
【0079】
実施例５：
ＤＡＯ－１の速度論的調査
ＤＡＯ－１の速度論的調査を、０．５～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度で行った（図１０）。Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆによるミカエリス・メンテン曲線の直線化を図１１に示す。ヒスタミンによる基質阻害は、１２．５ｍＭを超えるヒスタミン濃度で認識された。ヒスタミンに対するＤＡＯ－１のＫｍ値は２．３±０．２ｍＭ（Ｒ２＝０．９８５）であり、Ｖｍａｘは９．０９±０．３７ｎｋａｔ／ｍｇであった。更に、６１．８９±８．５１ｍＭのＫｉが決定された。したがって、基質ヒスタミンに対するＤＡＯ－１の親和性は、それぞれ０．０２７及び０．００２８ｍＭのヒスタミンに対するＫｍ値を有するブタ又はヒト由来の哺乳動物ＤＡＯと比較して低い。しかしながら、微生物アミンオキシダーゼは、一般に、哺乳動物ＤＡＯと比較してヒスタミンに対する親和性が低いようである。当技術分野では、アルスロバクター・クリスタロポイテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＫＡＩＴ－Ｂ－００７由来のヒスタミンオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミンオキシダーゼについて、ヒスタミンを基質としてそれぞれ０．５及び０．６ｍＭのＫｍ値が決定された。ヒスタミンに対する微生物ＤＡＯの比較的低い親和性は、哺乳動物ＤＡＯが非常に低い濃度において高効率で生体アミンを必ず分解することができる解毒酵素であるという事実に由来し得る。しかしながら、微生物におけるＤＡＯは、窒素代謝にとって主に重要であると思われ、したがって、ヒスタミンに対して非常に高い親和性を有する必要はない。
ＤＡＯ－１の速度論的調査
ＤＡＯ－１の速度論的調査を、０．５～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度で行った（図１０）。Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆによるミカエリス・メンテン曲線の直線化を図１１に示す。ヒスタミンによる基質阻害は、１２．５ｍＭを超えるヒスタミン濃度で認識された。ヒスタミンに対するＤＡＯ－１のＫｍ値は２．３±０．２ｍＭ（Ｒ２＝０．９８５）であり、Ｖｍａｘは９．０９±０．３７ｎｋａｔ／ｍｇであった。更に、６１．８９±８．５１ｍＭのＫｉが決定された。したがって、基質ヒスタミンに対するＤＡＯ－１の親和性は、それぞれ０．０２７及び０．００２８ｍＭのヒスタミンに対するＫｍ値を有するブタ又はヒト由来の哺乳動物ＤＡＯと比較して低い。しかしながら、微生物アミンオキシダーゼは、一般に、哺乳動物ＤＡＯと比較してヒスタミンに対する親和性が低いようである。当技術分野では、アルスロバクター・クリスタロポイテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＫＡＩＴ－Ｂ－００７由来のヒスタミンオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミンオキシダーゼについて、ヒスタミンを基質としてそれぞれ０．５及び０．６ｍＭのＫｍ値が決定された。ヒスタミンに対する微生物ＤＡＯの比較的低い親和性は、哺乳動物ＤＡＯが非常に低い濃度において高効率で生体アミンを必ず分解することができる解毒酵素であるという事実に由来し得る。しかしながら、微生物におけるＤＡＯは、窒素代謝にとって主に重要であると思われ、したがって、ヒスタミンに対して非常に高い親和性を有する必要はない。
【0080】
ブタ及びヒトのＤＡＯもまた、ヒスタミンによって阻害される基質であるが、それぞれＫｉ＝５．７１及び０．２８ｍＭの明確に低い濃度で阻害される。したがって、ＤＡＯ－１は、より高い反応速度でより高い濃度でヒスタミンを分解する。
【0081】
実施例６：
ＤＡＯ－１の基質選択性の調査
ＤＡＯ－１は、基質として異なる食品関連生体アミンを用いて広い基質選択性を示した（表１）。最も高いＤＡＯ－１活性を、基質として１ｍＭのチラミンを用いて測定した。ＤＡＯ－１は、基質濃度の増加がＤＡＯ－１活性の低下を引き起こすので、チラミンによって基質阻害されるようであった。他の基質：ヒスタミン、プトレシン、カダベリン、アグマチン及びスペルミジンについても同じ阻害効果が観察された。３番目に高いＤＡＯ－１活性は、基質としてヒスタミンを用いて１０ｍＭで測定され、これは、本発明との関連性が最も高い生体アミンであったため、参照（１００％）として設定された。ＤＡＯ－１は、試験したアミノ酸Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アルギニンに対していかなる活性も示さなかった。
ＤＡＯ－１の基質選択性の調査
ＤＡＯ－１は、基質として異なる食品関連生体アミンを用いて広い基質選択性を示した（表１）。最も高いＤＡＯ－１活性を、基質として１ｍＭのチラミンを用いて測定した。ＤＡＯ－１は、基質濃度の増加がＤＡＯ－１活性の低下を引き起こすので、チラミンによって基質阻害されるようであった。他の基質：ヒスタミン、プトレシン、カダベリン、アグマチン及びスペルミジンについても同じ阻害効果が観察された。３番目に高いＤＡＯ－１活性は、基質としてヒスタミンを用いて１０ｍＭで測定され、これは、本発明との関連性が最も高い生体アミンであったため、参照（１００％）として設定された。ＤＡＯ－１は、試験したアミノ酸Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン及びＬ－アルギニンに対していかなる活性も示さなかった。
【0082】
【表1】
【0083】
アミノ酸Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リジン、Ｌ－ヒスチジン、及びＬ－アルギニンを試験したが、ＤＡＯ－１活性を示さなかった。
【0084】
生体アミンであるチラミン、ヒスタミン、プトレシン及びカダベリンは、食品からの生体アミン誘発毒性に関して特に関連性が高い。ＤＡＯ－１は、これらの関連する生体アミンの全てを高効率で分解することができた。食品関連の生体アミンに対するこの広範な基質選択性は、微生物アミンオキシダーゼの稀にしか見られない特徴であるようである。例えば、アルスロバクター・クリスタロポイテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｏｉｅｔｅｓ）ＫＡＩＴ－Ｂ－００７由来のヒスタミンオキシダーゼ及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のアミンオキシダーゼは、基質プトレシン、カダベリン、スペルミン及びスペルミジンに対して活性を示さなかったが、ヒスタミンに対して活性を示した。アルスロバクター・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のフェニルエチルアミンオキシダーゼも、当該分野でチラミンに対して活性であるが、ヒスタミンに対してはあまり活性でなく、プトレシンに対しては活性でないことが見出された。
【0085】
ブタ腎臓由来の哺乳動物ＤＡＯは、いずれも１ｍＭで、当該技術分野において脂肪族ジアミンであるプトレシン及びカダベリンに対して最も高い活性を示した。ここで、ヒスタミンで測定されたＤＡＯ活性は、プトレシンで測定された最大活性と比較して１９％であった。
【0086】
実施例７：
ＤＡＯ－１によるヒスタミンの生体内変換
ＤＡＯ－１をヒスタミンの生体内変換実験において使用して、当技術分野で公知のように、緩衝系に関する改変（２０ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７）及び食品マトリックスをシミュレートするための添加物（５ｇ／ＬのＢＳＡ、２５ｇ／Ｌのスクロース、３０ｎｋａｔ／ｍＬのカタラーゼ）を用いて、食品関連濃度（１５０ｍｇ／Ｌ；１．３５ｍＭ）でのヒスタミンの低下に対するその有効性を評価した（図１２）。ＤＡＯ－１調製物は、０．１ｎｋａｔ／ｍＬを使用して３７℃で５時間以内にヒスタミンを７４．９±１．７３％減少させて３７．４±０．６５ｍｇ／Ｌ（０．３４±０．０１ｍＭ）にした。ヒスタミンの生体内変換実験を、ＤＡＯ－１のＫｍ値よりわずかに高いヒスタミン濃度（２．３±０．２ｍＭ）で行ったが、ヒスタミンは、４３．５±０．７６ｍｇ／Ｌ（０．３９±０．０１ｍＭ）のヒスタミン濃度で約４時間から始まって、停滞が認識されるまで着実に低下した。この５時間の生体内変換後のＤＡＯ－１の残存活性は５７．４±１．３％であった（ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定）。したがって、停滞は、ＤＡＯ－１の酵素速度論に起因しており、これは、低下したヒスタミン濃度で酵素触媒作用を減速させた。それにもかかわらず、ＤＡＯ－１速度論は、適用されたヒスタミンの約７５％の変換に十分であった。適用されたヒスタミン（１５０ｍｇ／Ｌ）の約９０％が、ブタＤＡＯを用いた以前の研究において本明細書で使用されたのと同じ酵素活性を用いて低下した。したがって、ブタＤＡＯはまた、実験設定においてヒスタミンを完全に分解することができず、これは（イミダゾール－４－イル）アセトアルデヒドによる潜在的な製品阻害効果に起因していた。しかし、この効果は、反応生成物が他の化合物と更に反応する可能性があり、したがって実際のヒスタミン変換を妨害しないので、実際の食品におけるヒスタミン変換について評価することが困難であるとも述べられた。
ＤＡＯ－１によるヒスタミンの生体内変換
ＤＡＯ－１をヒスタミンの生体内変換実験において使用して、当技術分野で公知のように、緩衝系に関する改変（２０ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７）及び食品マトリックスをシミュレートするための添加物（５ｇ／ＬのＢＳＡ、２５ｇ／Ｌのスクロース、３０ｎｋａｔ／ｍＬのカタラーゼ）を用いて、食品関連濃度（１５０ｍｇ／Ｌ；１．３５ｍＭ）でのヒスタミンの低下に対するその有効性を評価した（図１２）。ＤＡＯ－１調製物は、０．１ｎｋａｔ／ｍＬを使用して３７℃で５時間以内にヒスタミンを７４．９±１．７３％減少させて３７．４±０．６５ｍｇ／Ｌ（０．３４±０．０１ｍＭ）にした。ヒスタミンの生体内変換実験を、ＤＡＯ－１のＫｍ値よりわずかに高いヒスタミン濃度（２．３±０．２ｍＭ）で行ったが、ヒスタミンは、４３．５±０．７６ｍｇ／Ｌ（０．３９±０．０１ｍＭ）のヒスタミン濃度で約４時間から始まって、停滞が認識されるまで着実に低下した。この５時間の生体内変換後のＤＡＯ－１の残存活性は５７．４±１．３％であった（ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定）。したがって、停滞は、ＤＡＯ－１の酵素速度論に起因しており、これは、低下したヒスタミン濃度で酵素触媒作用を減速させた。それにもかかわらず、ＤＡＯ－１速度論は、適用されたヒスタミンの約７５％の変換に十分であった。適用されたヒスタミン（１５０ｍｇ／Ｌ）の約９０％が、ブタＤＡＯを用いた以前の研究において本明細書で使用されたのと同じ酵素活性を用いて低下した。したがって、ブタＤＡＯはまた、実験設定においてヒスタミンを完全に分解することができず、これは（イミダゾール－４－イル）アセトアルデヒドによる潜在的な製品阻害効果に起因していた。しかし、この効果は、反応生成物が他の化合物と更に反応する可能性があり、したがって実際のヒスタミン変換を妨害しないので、実際の食品におけるヒスタミン変換について評価することが困難であるとも述べられた。
【0087】
実施例８：
経口補充によるヒスタミン不耐性の治療のためのＤＡＯ錠剤
要約：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＤＡＯ－１を、模擬腸条件下（ＳＩＦ）でのそのヒスタミン分解能力について調べた。そこで、ＤＡＯ－１をカタラーゼと共にスクロース系錠剤として製剤化した。錠剤（９×７ｍｍ；４００ｍｇ）は、６９０ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性を含有しており、これは、下流処理が最適化された遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのバイオリアクタ培養から得られた。模擬食物マトリックスを添加したＳＩＦ条件下で、ＤＡＯ－１錠剤をヒスタミン生体内変換実験で試験したところ、２２ｍｇの最初に適用した７５ｍｇのヒスタミンが分解された。この量は、ヒスタミン不耐性の症状を回避するのに既に十分であり得る。更に、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の安定性は食品マトリックスの存在によって明確に影響を受けることが見出され、消費される食品の量及び種類がＤＡＯによる経口補給に影響を及ぼし得ることを示している。この研究は、微生物ＤＡＯが経口補充によるヒスタミン不耐性の治療の可能性を有し得ることを初めて示した。
経口補充によるヒスタミン不耐性の治療のためのＤＡＯ錠剤
要約：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＤＡＯ－１を、模擬腸条件下（ＳＩＦ）でのそのヒスタミン分解能力について調べた。そこで、ＤＡＯ－１をカタラーゼと共にスクロース系錠剤として製剤化した。錠剤（９×７ｍｍ；４００ｍｇ）は、６９０ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性を含有しており、これは、下流処理が最適化された遺伝子組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのバイオリアクタ培養から得られた。模擬食物マトリックスを添加したＳＩＦ条件下で、ＤＡＯ－１錠剤をヒスタミン生体内変換実験で試験したところ、２２ｍｇの最初に適用した７５ｍｇのヒスタミンが分解された。この量は、ヒスタミン不耐性の症状を回避するのに既に十分であり得る。更に、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の安定性は食品マトリックスの存在によって明確に影響を受けることが見出され、消費される食品の量及び種類がＤＡＯによる経口補給に影響を及ぼし得ることを示している。この研究は、微生物ＤＡＯが経口補充によるヒスタミン不耐性の治療の可能性を有し得ることを初めて示した。
【0088】
序論：
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＥＦＳＡ）及びｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＥＣＤＣ）によると、生体アミンヒスタミンは、欧州連合における食品媒介疾患のアウトブレイク数の増加に関連している。それにより、５００ｍｇ／ｋｇ以上のヒスタミンレベルを含有する食品は、ヒトの健康にとって有害であると考えられ得る。しかしながら、中程度又は更には低いヒスタミン濃度を有する食物の消費もまた、ヒスタミン不耐性に苦しむヒトに悪影響を及ぼし得る。これは、全人口の約１％に当てはまると思われる。この状態の典型的な症状は、胃腸障害、頭痛、喘息、潮紅及びくしゃみであり得る。少量の外来性ヒスタミンに対する不耐性は、ヒスタミンの取込みとヒスタミン分解酵素ＤＡＯとの間の不均衡に起因する。ＤＡＯは、主に小腸粘膜に位置するが、循環中にも見出すことができる分泌酵素である。これは、ヒスタミン又は他の生体アミンの、対応するアルデヒド、アンモニア及び過酸化水素への酸化的脱アミノ化を触媒する。いくつかの要因が、ヒトにおけるＤＡＯの利用可能な活性に影響を及ぼし得る。第１に、ＤＡＯのＤＮＡ配列における一塩基多型は、ＤＡＯの生産性又は速度論的を低下させ、血清ＤＡＯ活性を低下させる可能性がある。血清ＤＡＯ活性は、ヒスタミン不耐性の症状を患っている患者では有意に低いことが分かっており、ヒスタミン不耐性の診断ツールとして使用できることを示唆している。更に、血清ＤＡＯ活性は腸粘膜の状態と直接相関しているようであることが示された。したがって、様々な胃腸障害及び損傷について活性の低下を観察することができる。しかし、これは、化学療法を受けている患者では数週間以内に血清ＤＡＯ活性の低下から回復することができたことが示されたので、一時的な効果であり得る。更に、利用可能なＤＡＯ活性は、他の生体アミン、薬物、又はアルコールの摂取によって影響を受ける。外因性ヒスタミンは主に小腸で体内に入り、腸壁を通って循環を超えることができるので、現場でのＤＡＯによる効率的な分解は重要である。したがって、解決策アプローチは、小腸における不十分な内因性ＤＡＯを支援するためのＤＡＯの補充であり得る。ブタ腎臓抽出物由来のＤＡＯを含有する市販の栄養補助食品を、いくつかの臨床研究においてヒスタミン不耐性の治療における可能性について調べた。それにより、ヒスタミン不耐性関連症状の治療に有効であることが分かった。しかし、調製物は最近、インビトロヒスタミン生体内変換実験で試験され、ＤＡＯ活性は決定できなかった。更に、食物関連ヒスタミン量を分解するためには、かなり高いＤＡＯ活性（５０ｎｋａｔ）を補充しなければならないことが示された。したがって、ブタ腎臓等の天然源からの抽出によってこのレベルのＤＡＯ活性を提供することは困難であり得る。代替的なアプローチとして、微生物宿主における過剰発現及びその後の下流処理は、経口補充のための非常に効率的なＤＡＯ錠剤の製造に適したはるかに高いＤＡＯ生産性をもたらし得る。本明細書に記載のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＤＡＯ－１は、いくつかの食品関連の生体アミン（チラミン、プトレシン、カダベリン、ヒスタミン）を分解することができるため、食品産業での投与又は栄養補助食品としての投与に有望な特徴を示した。
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ＥＦＳＡ）及びｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＥＣＤＣ）によると、生体アミンヒスタミンは、欧州連合における食品媒介疾患のアウトブレイク数の増加に関連している。それにより、５００ｍｇ／ｋｇ以上のヒスタミンレベルを含有する食品は、ヒトの健康にとって有害であると考えられ得る。しかしながら、中程度又は更には低いヒスタミン濃度を有する食物の消費もまた、ヒスタミン不耐性に苦しむヒトに悪影響を及ぼし得る。これは、全人口の約１％に当てはまると思われる。この状態の典型的な症状は、胃腸障害、頭痛、喘息、潮紅及びくしゃみであり得る。少量の外来性ヒスタミンに対する不耐性は、ヒスタミンの取込みとヒスタミン分解酵素ＤＡＯとの間の不均衡に起因する。ＤＡＯは、主に小腸粘膜に位置するが、循環中にも見出すことができる分泌酵素である。これは、ヒスタミン又は他の生体アミンの、対応するアルデヒド、アンモニア及び過酸化水素への酸化的脱アミノ化を触媒する。いくつかの要因が、ヒトにおけるＤＡＯの利用可能な活性に影響を及ぼし得る。第１に、ＤＡＯのＤＮＡ配列における一塩基多型は、ＤＡＯの生産性又は速度論的を低下させ、血清ＤＡＯ活性を低下させる可能性がある。血清ＤＡＯ活性は、ヒスタミン不耐性の症状を患っている患者では有意に低いことが分かっており、ヒスタミン不耐性の診断ツールとして使用できることを示唆している。更に、血清ＤＡＯ活性は腸粘膜の状態と直接相関しているようであることが示された。したがって、様々な胃腸障害及び損傷について活性の低下を観察することができる。しかし、これは、化学療法を受けている患者では数週間以内に血清ＤＡＯ活性の低下から回復することができたことが示されたので、一時的な効果であり得る。更に、利用可能なＤＡＯ活性は、他の生体アミン、薬物、又はアルコールの摂取によって影響を受ける。外因性ヒスタミンは主に小腸で体内に入り、腸壁を通って循環を超えることができるので、現場でのＤＡＯによる効率的な分解は重要である。したがって、解決策アプローチは、小腸における不十分な内因性ＤＡＯを支援するためのＤＡＯの補充であり得る。ブタ腎臓抽出物由来のＤＡＯを含有する市販の栄養補助食品を、いくつかの臨床研究においてヒスタミン不耐性の治療における可能性について調べた。それにより、ヒスタミン不耐性関連症状の治療に有効であることが分かった。しかし、調製物は最近、インビトロヒスタミン生体内変換実験で試験され、ＤＡＯ活性は決定できなかった。更に、食物関連ヒスタミン量を分解するためには、かなり高いＤＡＯ活性（５０ｎｋａｔ）を補充しなければならないことが示された。したがって、ブタ腎臓等の天然源からの抽出によってこのレベルのＤＡＯ活性を提供することは困難であり得る。代替的なアプローチとして、微生物宿主における過剰発現及びその後の下流処理は、経口補充のための非常に効率的なＤＡＯ錠剤の製造に適したはるかに高いＤＡＯ生産性をもたらし得る。本明細書に記載のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＤＡＯ－１は、いくつかの食品関連の生体アミン（チラミン、プトレシン、カダベリン、ヒスタミン）を分解することができるため、食品産業での投与又は栄養補助食品としての投与に有望な特徴を示した。
【0089】
この研究の目的は、経口補充としてのヒスタミン不耐性の治療に対する、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から新たに発見されたＤＡＯ－１の可能性を調査することであった。したがって、ＤＡＯ－１を錠剤として製剤化し、模擬腸条件下で食品関連ヒスタミン量の変換に適用した。更に、これらの条件下でのＤＡＯ－１の安定性及び速度論を評価した。
【0090】
材料及び方法：
材料及び試薬：
１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ヒスタミン二塩酸塩、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、Ｄ（＋）－スクロース、一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）及び過酸化水素（３０％）は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。リン酸二水素ナトリウム、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、オルト－リン酸（Ｈ３ＰＯ４）及びチアミンクロリド二塩酸塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、ｐＨ５．２）は、Ｓｅｒｖａ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。カタラーゼ（ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来；１１１７００Ｕ／ｍＬ）及びブタ膵臓由来のパンクレアチン（８ｘ ＵＳＰ仕様）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ－６７）は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｃｏｒｐ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＵＳＡ）から購入した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ホエータンパク質単離物（９０％（ｗ／ｗ）タンパク質）をＳａｃｈｓｅｎｍｉｌｃｈ Ｌｅｐｐｅｒｓｄｏｒｆ ＧｍｂＨ（Ｌｅｐｐｅｒｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。カゼインナトリウム（９０．６％（ｗ／ｗ）タンパク質）は、ＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ（Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。
材料及び試薬：
１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、ヒスタミン二塩酸塩、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、Ｄ（＋）－スクロース、一塩基性リン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）及び過酸化水素（３０％）は、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。リン酸二水素ナトリウム、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、オルト－リン酸（Ｈ３ＰＯ４）及びチアミンクロリド二塩酸塩はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｏｈｎ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、ｐＨ５．２）は、Ｓｅｒｖａ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。カタラーゼ（ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来；１１１７００Ｕ／ｍＬ）及びブタ膵臓由来のパンクレアチン（８ｘ ＵＳＰ仕様）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）から購入した。（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ－６７）は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．Ｃｏｒｐ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＵＳＡ）から購入した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ホエータンパク質単離物（９０％（ｗ／ｗ）タンパク質）をＳａｃｈｓｅｎｍｉｌｃｈ Ｌｅｐｐｅｒｓｄｏｒｆ ＧｍｂＨ（Ｌｅｐｐｅｒｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。カゼインナトリウム（９０．６％（ｗ／ｗ）タンパク質）は、ＦｒｉｅｓｌａｎｄＣａｍｐｉｎａ（Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。
【0091】
ＤＡＯ－１の製造及び精製：
ＤＡＯ－１の産生は、遺伝子改変Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ株（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１）を使用して行った。ここでは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムを使用して、天然ＤＡＯ－１遺伝子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノム上のａｘｐ遺伝子座に組み込んだ。ＤＡＯ－１発現は、強力かつ恒常的なＵＡＳ１Ｂ８－ＴＥＦ（１３６）プロモータを使用して行った。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１を、Ｌａｂｆｏｒｓ５バイオリアクタシステム（Ｉｎｆｏｒｓ ＧｍｂＨ，Ｅｉｎｓｂａｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ）で５Ｌの作業体積で培養した。細胞を５６時間の培養後に回収し、破壊されるまで－２０℃で保存した。破壊のために、１５０ｇの細胞を氷上で解凍し、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）中の２０％（ｗ／ｗ）懸濁液を調製するために使用した。細胞破壊を、直径０．７５ｍｍのガラスビーズを使用して２５００ｒｐｍで撹拌媒体ミル（Ｄｙｎｏ（登録商標）－Ｍｉｌｌ Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ；Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ，Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｓｓ）で行った。Ｕｌｔｒａ－Ｋｒｙｏｍａｔ（登録商標）ＲＵＫ５０（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｌａｕｄａ－Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、システムを５℃に冷却した。細胞懸濁液を、約１４ｍＬ／分の速度の蠕動ポンプを備えたＤｙｎｏ（登録商標）－Ｍｉｌｌシステムに連続的に供給し、１８分の滞留時間を与えた。その後、ガラスビーズを７５０ｍＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）で約１４ｍＬ／分で、依然として２５００ｒｐｍで作動する撹拌媒体ミルで洗浄した。初期細胞溶解物並びにガラスビーズを洗浄するために使用した緩衝液をプールし、遠心分離した（８，０００ｇ、４℃、１０分）。約８００ｍＬの上清を回収し、当技術分野で公知の硫酸アンモニウム沈殿（６０％（ｖ／ｖ）４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）及び疎水性相互作用クロマトグラフィによって更に精製した。精製ＤＡＯ－１を－８０℃で保存した。
ＤＡＯ－１の産生は、遺伝子改変Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ株（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１）を使用して行った。ここでは、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムを使用して、天然ＤＡＯ－１遺伝子をＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノム上のａｘｐ遺伝子座に組み込んだ。ＤＡＯ－１発現は、強力かつ恒常的なＵＡＳ１Ｂ８－ＴＥＦ（１３６）プロモータを使用して行った。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ＿ａｘｐ＿ｄａｏ－１を、Ｌａｂｆｏｒｓ５バイオリアクタシステム（Ｉｎｆｏｒｓ ＧｍｂＨ，Ｅｉｎｓｂａｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ）で５Ｌの作業体積で培養した。細胞を５６時間の培養後に回収し、破壊されるまで－２０℃で保存した。破壊のために、１５０ｇの細胞を氷上で解凍し、ＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）中の２０％（ｗ／ｗ）懸濁液を調製するために使用した。細胞破壊を、直径０．７５ｍｍのガラスビーズを使用して２５００ｒｐｍで撹拌媒体ミル（Ｄｙｎｏ（登録商標）－Ｍｉｌｌ Ｔｙｐ ＫＤＬ Ａ；Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ，Ｍｕｔｔｅｎｚ，Ｓｗｉｓｓ）で行った。Ｕｌｔｒａ－Ｋｒｙｏｍａｔ（登録商標）ＲＵＫ５０（Ｌａｕｄａ Ｄｒ．Ｒ．Ｗｏｂｓｅｒ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｌａｕｄａ－Ｋｏｎｉｇｓｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、システムを５℃に冷却した。細胞懸濁液を、約１４ｍＬ／分の速度の蠕動ポンプを備えたＤｙｎｏ（登録商標）－Ｍｉｌｌシステムに連続的に供給し、１８分の滞留時間を与えた。その後、ガラスビーズを７５０ｍＬのＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７）で約１４ｍＬ／分で、依然として２５００ｒｐｍで作動する撹拌媒体ミルで洗浄した。初期細胞溶解物並びにガラスビーズを洗浄するために使用した緩衝液をプールし、遠心分離した（８，０００ｇ、４℃、１０分）。約８００ｍＬの上清を回収し、当技術分野で公知の硫酸アンモニウム沈殿（６０％（ｖ／ｖ）４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）及び疎水性相互作用クロマトグラフィによって更に精製した。精製ＤＡＯ－１を－８０℃で保存した。
【0092】
ＤＡＯ－１活性決定：
ＤＡＯ－１活性を、比色ＤＡ－６７酵素アッセイを使用して決定した。３７５μＬのヒスタミン溶液（３０ｍＭ；２５ｍＭＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）及び３６３μＬのＤＡ－６７試薬（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩；５０μＭ；２５ｍＭＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）を含有する反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。その後、１２μＬ（２６６単位／ｍＬ）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）を添加した。２５μＬのＤＡＯ溶液を添加することによって反応を開始し、３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。５０μＬのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（３０ｍＭ）を添加して反応を停止させた。遠心分離（１０，０００ｇ、２０℃で３分間）後、吸収を６６８ｎｍで測定した。ヒスタミン溶液を参照のために緩衝液（２５ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７．２）と交換した。過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を較正に使用した。酵素活性をｎｋａｔで計算し、それによって１ｎｋａｔは３７℃で１ｎｍｏｌ基質／秒を変換する。
ＤＡＯ－１活性を、比色ＤＡ－６７酵素アッセイを使用して決定した。３７５μＬのヒスタミン溶液（３０ｍＭ；２５ｍＭＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）及び３６３μＬのＤＡ－６７試薬（１０－（カルボキシメチル－アミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム塩；５０μＭ；２５ｍＭＰＩＰＥＳに溶解；ｐＨ７．２）を含有する反応混合物を３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。その後、１２μＬ（２６６単位／ｍＬ）のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（グレードＩ）を添加した。２５μＬのＤＡＯ溶液を添加することによって反応を開始し、３７℃で１０分間インキュベートし、７５０ｒｐｍで撹拌した。５０μＬのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム（３０ｍＭ）を添加して反応を停止させた。遠心分離（１０，０００ｇ、２０℃で３分間）後、吸収を６６８ｎｍで測定した。ヒスタミン溶液を参照のために緩衝液（２５ｍＭのＰＩＰＥＳ；ｐＨ７．２）と交換した。過酸化水素（０．５～１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）を較正に使用した。酵素活性をｎｋａｔで計算し、それによって１ｎｋａｔは３７℃で１ｎｍｏｌ基質／秒を変換する。
【0093】
タンパク質分析：
ＤＡＯ－１調製物のタンパク質含有量を、標準としてＢＳＡを使用してＢｒａｄｆｏｒｄに従って決定した。更に、錠剤の作製に使用したＤＡＯ－１調製物を、１０％分離ゲル上のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって調べた。５μｇの量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。タンパク質分子量標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ）を分子量決定のために使用した。クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を使用してゲルを染色した。
ＤＡＯ－１調製物のタンパク質含有量を、標準としてＢＳＡを使用してＢｒａｄｆｏｒｄに従って決定した。更に、錠剤の作製に使用したＤＡＯ－１調製物を、１０％分離ゲル上のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって調べた。５μｇの量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにロードした。タンパク質分子量標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）非染色タンパク質標準１０～２５０ｋＤａ）を分子量決定のために使用した。クーマシーブリリアントブルーＧ－２５０を使用してゲルを染色した。
【0094】
模擬腸液中のＤＡＯ－１の安定性：
模擬食物マトリックスの添加の有無にかかわらず、模擬腸液（ＳＩＦ）中でＤＡＯ－１の安定性を試験した。したがって、パンクレアチン含有ＳＩＦは、米国薬局方（ＵＳＰ４２）に記載されているように調製した。２００ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス１）、１００ｇ／ＬのＢＳＡ、１００ｇ／Ｌのホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）及び２００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス２）並びにＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ６６．６８ｇ／Ｌ及び２００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス３）として、異なる食品マトリックスストック溶液（４倍濃縮）を調製した。各ストック溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨで６．８に調整した。新たに調製した２倍濃縮ＳＩＦ、食品マトリックスストック溶液並びにＤＡＯ－１（ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムを使用してＨ２Ｏｄｄに対して脱塩；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を、サーモシェーカ中３７℃で５分間個々にインキュベートした。続いて、５００μＬの２倍濃縮ＳＩＦ、２５０μＬのＤＡＯ－１及び２５０μＬの食品マトリックスストック溶液を合わせ、サーモシェーカ中３７℃、５００ｒｐｍでインキュベートした。安定化化合物の存在なしでＤＡＯ－１の安定性を試験するために、食品マトリックスストック溶液の代わりにＨ２Ｏｄｄを添加した。溶液を合わせた直後に、１００μＬの試料を採取し、ＤＡ－６７アッセイを使用してＤＡＯ－１活性測定に使用した。
模擬食物マトリックスの添加の有無にかかわらず、模擬腸液（ＳＩＦ）中でＤＡＯ－１の安定性を試験した。したがって、パンクレアチン含有ＳＩＦは、米国薬局方（ＵＳＰ４２）に記載されているように調製した。２００ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス１）、１００ｇ／ＬのＢＳＡ、１００ｇ／Ｌのホエータンパク質単離物（ＷＰＩ）及び２００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス２）並びにＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ６６．６８ｇ／Ｌ及び２００ｇ／Ｌのスクロース（＝食品マトリックス３）として、異なる食品マトリックスストック溶液（４倍濃縮）を調製した。各ストック溶液のｐＨを１ＭのＮａＯＨで６．８に調整した。新たに調製した２倍濃縮ＳＩＦ、食品マトリックスストック溶液並びにＤＡＯ－１（ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムを使用してＨ２Ｏｄｄに対して脱塩；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を、サーモシェーカ中３７℃で５分間個々にインキュベートした。続いて、５００μＬの２倍濃縮ＳＩＦ、２５０μＬのＤＡＯ－１及び２５０μＬの食品マトリックスストック溶液を合わせ、サーモシェーカ中３７℃、５００ｒｐｍでインキュベートした。安定化化合物の存在なしでＤＡＯ－１の安定性を試験するために、食品マトリックスストック溶液の代わりにＨ２Ｏｄｄを添加した。溶液を合わせた直後に、１００μＬの試料を採取し、ＤＡ－６７アッセイを使用してＤＡＯ－１活性測定に使用した。
【0095】
模擬腸液中のＤＡＯ－１の速度論：
ＤＡＯ－１の見かけの速度論的パラメータは、非加水分解条件下（パンクレアチンなし）及び加水分解条件下でＳＩＦを含有する食品マトリックス中の基質としてヒスタミン（１．５６～５０ｍＭ）を用いたミカエリス・メンテン速度論によって決定した。ＤＡ－６７アッセイを使用してＤＡＯ－１活性を決定した。非加水分解条件のために、ＤＡ－６７試薬（５０μＭ）を、ＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ３５．６ｇ／Ｌ及び１０６．８ｇ／Ｌのスクロース（ｐＨ６．８）で含有するＳＩＦ中で調製した。ヒスタミン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼをＳＩＦに溶解した。ヒスタミンについては、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８に再調整した。ＤＡＯ－１を、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムを使用してＳＩＦに対して脱塩した。
ＤＡＯ－１の見かけの速度論的パラメータは、非加水分解条件下（パンクレアチンなし）及び加水分解条件下でＳＩＦを含有する食品マトリックス中の基質としてヒスタミン（１．５６～５０ｍＭ）を用いたミカエリス・メンテン速度論によって決定した。ＤＡ－６７アッセイを使用してＤＡＯ－１活性を決定した。非加水分解条件のために、ＤＡ－６７試薬（５０μＭ）を、ＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ３５．６ｇ／Ｌ及び１０６．８ｇ／Ｌのスクロース（ｐＨ６．８）で含有するＳＩＦ中で調製した。ヒスタミン及びセイヨウワサビペルオキシダーゼをＳＩＦに溶解した。ヒスタミンについては、１ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを６．８に再調整した。ＤＡＯ－１を、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムを使用してＳＩＦに対して脱塩した。
【0096】
加水分解された条件のために、ＢＳＡ、ＷＰＩ、カゼインナトリウムをそれぞれ１６．６７ｇ／Ｌ及び５０ｇ／Ｌスクロースで、最初にＳＩＦ（パンクレアチンを含む）中、３７℃及び１３０ｒｐｍで９０分間インキュベートした。溶液を９５℃で１５分間加熱することによって加水分解を停止した。その後、遠心分離した（８，０００ｇ、４℃、１０分）。次いで、上清を使用して、ＤＡ－６７試薬（５０μＭ）、ヒスタミン、セイヨウワサビペルオキシダーゼを溶解し、ＤＡＯ－１を希釈した。ヒスタミン溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨを使用して６．８に再調整した。較正のために、ヒスタミンを過酸化水素（０．５～２０ｎｍｏｌ／ｍＬ）に置き換えた。初期反応速度内で速度論的調査を行った。
【0097】
ＤＡＯ－１錠剤の調製：
精製ＤＡＯ－１を最初に硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した。したがって、液体硫酸アンモニウム（４Ｍ）を撹拌下及び氷上で３３５ｍＬの精製ＤＡＯ－１溶液に最終濃度６０％（ｖ／ｖ）になるように滴下した。液体硫酸アンモニウムの添加が完了した後、アプローチを氷上で更に６０分間インキュベートした。その後、遠心分離した（８，０００ｇ、４℃、２５分）。上清を完全に除去し、ペレットを３ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。スクロース粉末を４０ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。更に、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ６０μｋａｔを添加した。最終的なＤＡＯ－１溶液を４つの部分に分割し、それらを秤量した２ｍＬエッペンドルフ反応管で分離した。これらを凍結乾燥する前に－８０℃で凍結した。凍結乾燥粉末を５０／５０（ｗ／ｗ）の比でスクロースと混合した後、それらを使用して、自己構築型錠剤プレスを備えたＤＡＯ－１錠剤を調製した（図１５）。
精製ＤＡＯ－１を最初に硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮した。したがって、液体硫酸アンモニウム（４Ｍ）を撹拌下及び氷上で３３５ｍＬの精製ＤＡＯ－１溶液に最終濃度６０％（ｖ／ｖ）になるように滴下した。液体硫酸アンモニウムの添加が完了した後、アプローチを氷上で更に６０分間インキュベートした。その後、遠心分離した（８，０００ｇ、４℃、２５分）。上清を完全に除去し、ペレットを３ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。スクロース粉末を４０ｇ／Ｌの最終濃度まで添加した。更に、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ６０μｋａｔを添加した。最終的なＤＡＯ－１溶液を４つの部分に分割し、それらを秤量した２ｍＬエッペンドルフ反応管で分離した。これらを凍結乾燥する前に－８０℃で凍結した。凍結乾燥粉末を５０／５０（ｗ／ｗ）の比でスクロースと混合した後、それらを使用して、自己構築型錠剤プレスを備えたＤＡＯ－１錠剤を調製した（図１５）。
【0098】
ＤＡＯ－１錠剤を使用した食品マトリックスＳＩＦにおけるヒスタミンの生体内変換：
当技術分野で公知のように、１．３５ｍＭ（１５０ｍｇ／Ｌ）の食品関連ヒスタミン濃度でＤＡＯ－１錠剤を使用してヒスタミンの生体内変換を行った。食物マトリックスＳＩＦ３（ＳＩＦ（ｐＨ６．８）中のＢＳＡ、ＷＰＩ、１６．６７ｇ／Ｌのカゼインナトリウム及び５０ｇ／Ｌのスクロース）及び７５ｍｇヒスタミンを含有する１Ｌの三角フラスコ中、５００ｍＬアプローチ体積で実験を行った。生体内変換を３連で行った。アプローチを３７℃で２時間プレインキュベートした。パンクレアチン（ＳＩＦ中２０ｇ／Ｌ）を３７℃で５分間プレインキュベートし、１．２５ｇ／Ｌの最終濃度に添加した。アプローチを混合した直後に、２ｍＬの試料を採取し、水浴中で９５℃で５分間不活性化し、次いで、本明細書に記載のように処理した。更に、初期ヒスタミン濃度の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析のためのヒスタミン較正のその後の調製のために氷水浴で冷却した参照生体内変換アプローチ（ヒスタミンなし）から２０ｍＬの試料を採取した。したがって、ヒスタミンストック溶液を参照アプローチ培地で０．２５～２ｍＭのヒスタミン濃度に希釈した。これらの較正試料を水浴中で９５℃で５分間加熱し、次いで以下に記載されるように処理した。各アプローチに１つのＤＡＯ－１カプセルを添加することによって、ヒスタミンの生体内変換を開始した。更に、ＤＡＯ－１錠剤も参照アプローチに追加した。ＤＡＯ－１カプセルを陰性対照アプローチに添加しなかった。フラスコを回転シェーカ上、３７℃及び１３０ｒｐｍで９０分間インキュベートした。２ｍＬの試料を３０、５０、７０及び９０分後に採取し、水浴中９５℃で５分間不活性化し、以下に記載されるように処理した。９０分後、参照アプローチから２０ｍＬの試料を採取し、氷水浴で冷却した。その後、生体内変換試料（３０～９０分）中のヒスタミン濃度のＲＰ－ＨＰＬＣ分析のためのヒスタミン較正試料（０．１～１．５ｍＭ）を上記のように調製した。
当技術分野で公知のように、１．３５ｍＭ（１５０ｍｇ／Ｌ）の食品関連ヒスタミン濃度でＤＡＯ－１錠剤を使用してヒスタミンの生体内変換を行った。食物マトリックスＳＩＦ３（ＳＩＦ（ｐＨ６．８）中のＢＳＡ、ＷＰＩ、１６．６７ｇ／Ｌのカゼインナトリウム及び５０ｇ／Ｌのスクロース）及び７５ｍｇヒスタミンを含有する１Ｌの三角フラスコ中、５００ｍＬアプローチ体積で実験を行った。生体内変換を３連で行った。アプローチを３７℃で２時間プレインキュベートした。パンクレアチン（ＳＩＦ中２０ｇ／Ｌ）を３７℃で５分間プレインキュベートし、１．２５ｇ／Ｌの最終濃度に添加した。アプローチを混合した直後に、２ｍＬの試料を採取し、水浴中で９５℃で５分間不活性化し、次いで、本明細書に記載のように処理した。更に、初期ヒスタミン濃度の逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析のためのヒスタミン較正のその後の調製のために氷水浴で冷却した参照生体内変換アプローチ（ヒスタミンなし）から２０ｍＬの試料を採取した。したがって、ヒスタミンストック溶液を参照アプローチ培地で０．２５～２ｍＭのヒスタミン濃度に希釈した。これらの較正試料を水浴中で９５℃で５分間加熱し、次いで以下に記載されるように処理した。各アプローチに１つのＤＡＯ－１カプセルを添加することによって、ヒスタミンの生体内変換を開始した。更に、ＤＡＯ－１錠剤も参照アプローチに追加した。ＤＡＯ－１カプセルを陰性対照アプローチに添加しなかった。フラスコを回転シェーカ上、３７℃及び１３０ｒｐｍで９０分間インキュベートした。２ｍＬの試料を３０、５０、７０及び９０分後に採取し、水浴中９５℃で５分間不活性化し、以下に記載されるように処理した。９０分後、参照アプローチから２０ｍＬの試料を採取し、氷水浴で冷却した。その後、生体内変換試料（３０～９０分）中のヒスタミン濃度のＲＰ－ＨＰＬＣ分析のためのヒスタミン較正試料（０．１～１．５ｍＭ）を上記のように調製した。
【0099】
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析のための生体内変換試料の試料調製：
ヒスタミン生体内変換からの熱不活性化試料を氷上で冷却した後、遠心分離した（１０，０００ｇ、４℃、３分）。上清（１ｍＬ）を、Ｈ２Ｏｄｄで平衡化したＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐＧ－２５カラムにロードした。未消化タンパク質及び大型ペプチドを、１．５ｍＬのＨ２Ｏｄｄを使用してカラムから溶出し、廃棄した。ヒスタミン及び低分子量の分子を２ｍＬのＨ２Ｏｄｄに溶出し、回収した。３５μＬのＨＣｌ（１Ｍ）を使用して、これらの試料のｐＨ値を約２に調整した。試料を更に精製するまで、サーモシェーカ中２０℃に保った。
ヒスタミン生体内変換からの熱不活性化試料を氷上で冷却した後、遠心分離した（１０，０００ｇ、４℃、３分）。上清（１ｍＬ）を、Ｈ２Ｏｄｄで平衡化したＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐＧ－２５カラムにロードした。未消化タンパク質及び大型ペプチドを、１．５ｍＬのＨ２Ｏｄｄを使用してカラムから溶出し、廃棄した。ヒスタミン及び低分子量の分子を２ｍＬのＨ２Ｏｄｄに溶出し、回収した。３５μＬのＨＣｌ（１Ｍ）を使用して、これらの試料のｐＨ値を約２に調整した。試料を更に精製するまで、サーモシェーカ中２０℃に保った。
【0100】
カチオン交換物質Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ１００（２７５ｍｇ）を１ｍＬのピペットチップに充填し、これを底部及び上部を綿ウールでゆるく密封した。次いで、材料を４ｍＬのＨ２Ｏｄｄで洗浄した。その後、これを４ｍＬのＨＣｌ（１０ｍＭ）で平衡化した。次いで、ｐＨ調整した生体内変換試料をカチオン交換材料に適用した（それぞれ１ｍＬ）。材料を５ｍＬのＨ２Ｏｄｄで洗浄した。次いで、６００μＬのアンモニア（４Ｍ）を材料に添加し、廃棄した。更に６００μＬのアンモニア（４Ｍ）を添加してヒスタミンを溶出した。アンモニア水をサーモシェーカ中、７０℃、５００ｒｐｍで一晩蒸発させた。残留物を２００μＬのＨＣｌ（１０ｍＭ）に溶解した。次いで、５０μＬの内部標準溶液（チアミンクロリド二塩酸塩；Ｈ２Ｏｄｄ中６ｍＭ）をＲＰ－ＨＰＬＣ分析のために添加した。５μＬのＨＣｌ（１Ｍ）を添加することによって、各試料のｐＨを約２に調整した。試料を遠心分離（２０，０００ｇ、４℃、５分）した後、ＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。
【0101】
生体内変換試料中のヒスタミンのＲＰ－ＨＰＬＣ分析：
当該分野で公知のＲＰ－ＨＰＬＣによって、生体内変換試料中のヒスタミン濃度を決定した。移動相は、９２．５％（ｖ／ｖ）の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１０ｍＭのオクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（４ＭのＨ３ＰＯ４を使用してｐＨを２．２に調整）及び７．５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルからなっていた。注入体積は５μＬに設定した。分離は、４０℃で１ｍＬ／分の一定流量で２５分間行った。
当該分野で公知のＲＰ－ＨＰＬＣによって、生体内変換試料中のヒスタミン濃度を決定した。移動相は、９２．５％（ｖ／ｖ）の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１０ｍＭのオクタン－１－スルホン酸ナトリウム塩（４ＭのＨ３ＰＯ４を使用してｐＨを２．２に調整）及び７．５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルからなっていた。注入体積は５μＬに設定した。分離は、４０℃で１ｍＬ／分の一定流量で２５分間行った。
【0102】
統計分析：
全ての実験を少なくとも２回行い、標準偏差をＥｘｃｅｌで決定することによって評価した。データは、標準偏差を有する平均値として提示される。酵素速度論を、データ分析ソフトウェアＳｉｇｍａｐｌｏｔ １２．５（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して非線形回帰によって評価した。
全ての実験を少なくとも２回行い、標準偏差をＥｘｃｅｌで決定することによって評価した。データは、標準偏差を有する平均値として提示される。酵素速度論を、データ分析ソフトウェアＳｉｇｍａｐｌｏｔ １２．５（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＧｍｂＨ，Ｅｒｋｒａｔｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して非線形回帰によって評価した。
【0103】
結果及び考察：
ＤＡＯ－１錠剤の調製のためのＤＡＯ－１の大規模生産：
以前の研究において、高いＤＡＯ活性（５０ｎｋａｔ）を有するＤＡＯ含有錠剤が、経口補充によってヒスタミン不耐性を治療するために必要とされるかもしれないことが示され得る。したがって、本明細書中に記載されるような、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＤＡＯ－１を、当該技術分野において知られているように、８００ｍＬの作業体積を有するバイオリアクタにおいて酵母Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ中で組換え産生した。回収した細胞塊をより小規模の高圧ホモジナイザで破壊して、合計で約８００ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性に等しい湿酵母細胞１グラム当たり１０．８ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性を得た。しかしながら、この活性は、高活性ＤＡＯ－１錠剤の調製には十分ではない。したがって、バイオリアクタ培養を５Ｌ規模で繰り返し、それによって培養５６時間後に光学密度（ＯＤ６００）５３、生物乾燥質量２２ｇ／Ｌ及び湿酵母質量９３ｇ／Ｌに達した（図１６）。これに続いて、撹拌培地ミルを使用して大規模な細胞破壊を行った。それにより、１５０ｇの湿酵母細胞を破壊し、約４．８μｋａｔのＤＡＯ－１活性を得た。これは、前の研究よりも約３倍高い湿細胞１グラム当たり３２ｎｋａｔの収率に相当した。ＤＡＯ－１を硫酸アンモニウム沈殿及び疎水性相互作用クロマトグラフィによって精製し、１５μｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する合計３μｋａｔを得た。したがって、比ＤＡＯ－１活性もまた、最近の研究（４．７ｎｋａｔ／ｇタンパク質）と比較して３倍増加した。この増加した比ＤＡＯ－１活性は、錠剤の限られた容量で高度に活性なＤＡＯ－１抽出物を提供するために重要である。
ＤＡＯ－１錠剤の調製のためのＤＡＯ－１の大規模生産：
以前の研究において、高いＤＡＯ活性（５０ｎｋａｔ）を有するＤＡＯ含有錠剤が、経口補充によってヒスタミン不耐性を治療するために必要とされるかもしれないことが示され得る。したがって、本明細書中に記載されるような、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＤＡＯ－１を、当該技術分野において知られているように、８００ｍＬの作業体積を有するバイオリアクタにおいて酵母Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ中で組換え産生した。回収した細胞塊をより小規模の高圧ホモジナイザで破壊して、合計で約８００ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性に等しい湿酵母細胞１グラム当たり１０．８ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性を得た。しかしながら、この活性は、高活性ＤＡＯ－１錠剤の調製には十分ではない。したがって、バイオリアクタ培養を５Ｌ規模で繰り返し、それによって培養５６時間後に光学密度（ＯＤ６００）５３、生物乾燥質量２２ｇ／Ｌ及び湿酵母質量９３ｇ／Ｌに達した（図１６）。これに続いて、撹拌培地ミルを使用して大規模な細胞破壊を行った。それにより、１５０ｇの湿酵母細胞を破壊し、約４．８μｋａｔのＤＡＯ－１活性を得た。これは、前の研究よりも約３倍高い湿細胞１グラム当たり３２ｎｋａｔの収率に相当した。ＤＡＯ－１を硫酸アンモニウム沈殿及び疎水性相互作用クロマトグラフィによって精製し、１５μｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する合計３μｋａｔを得た。したがって、比ＤＡＯ－１活性もまた、最近の研究（４．７ｎｋａｔ／ｇタンパク質）と比較して３倍増加した。この増加した比ＤＡＯ－１活性は、錠剤の限られた容量で高度に活性なＤＡＯ－１抽出物を提供するために重要である。
【0104】
模擬腸液（ＳＩＦ）中のＤＡＯ－１の安定性：
ＤＡＯ－１はヒトの腸内のヒスタミンを分解するために適用されるので、これらの条件下でのＤＡＯ－１の安定性は高い関連性を有する。腸内環境は、米国薬局方（ＵＳＰ４２）に記載されているように、模擬腸液（ＳＩＦ）で模倣することができる。このＳＩＦには、アミラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼのように酵素活性の異なる酵素製剤であるパンクレアチンが含まれている。精製ＤＡＯ－１を、３７℃で模擬食品マトリックスの存在の有無にかかわらず、このＳＩＦ中で試験した（図１７）。それにより、ＤＡＯ－１は、５分未満の半減期期間を有する純粋なＳＩＦにおいて弱い安定性を示した。５０ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロース（食品マトリックスＳＩＦ１）の添加は、ＤＡＯの安定性を約１５分の半減期期間に改善した。この安定性の改善は、膵臓ペプチダーゼに利用可能な基質の数が増加したためである可能性が最も高かった。２５ｇ／ＬのＢＳＡ、２５ｇ／ＬのＷＰＩ及び５０ｇ／Ｌのスクロース（食品マトリックスＳＩＦ２）の添加は、ＤＡＯ－１安定性を約３０分の半減期期間まで更に改善した。総スクロース及びタンパク質濃度を５０ｇ／Ｌに維持するが、第３のタンパク質（食品マトリックスＳＩＦ３；それぞれ１６．６７ｇ／Ｌ及び５０ｇ／ＬのスクロースのＢＳＡ、ＷＰＩ及びカゼインナトリウム）としてカゼインナトリウムを導入すると、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の長期安定性が更に改善された。それにより、９０分のインキュベーション後に８±０．１％の残存ＤＡＯ－１活性が測定された。この食品マトリックスＳＩＦでは、最初に適用されたＤＡＯ－１活性の約４３％が９０分にわたって利用可能であった。結果は、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の安定性が、添加されるタンパク質の量だけでなく、タンパク質の種類にも依存することを示している。例えば、ＢＳＡは、ホエータンパク質の部分画分であるα－ラクトアルブミン又はβ－ラクトグロブリンよりもＳＩＦにおいて高い安定性を示す。α－カゼインは、上述のホエータンパク質部分画分よりもＳＩＦにおいて更に弱い安定性を示した。β－ラクトグロブリンは、標的アミノ酸をペプシン消化から保護する現在のｐＨでのその立体配座状態のために、模擬胃液中で高い安定性を示した。より高いｐＨでは、β－ラクトグロブリンの立体配座状態により、β－ラクトグロブリンはトリプシン及びキモトリプシンのような膵臓酵素の消化を受けやすくなる。
ＤＡＯ－１はヒトの腸内のヒスタミンを分解するために適用されるので、これらの条件下でのＤＡＯ－１の安定性は高い関連性を有する。腸内環境は、米国薬局方（ＵＳＰ４２）に記載されているように、模擬腸液（ＳＩＦ）で模倣することができる。このＳＩＦには、アミラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼのように酵素活性の異なる酵素製剤であるパンクレアチンが含まれている。精製ＤＡＯ－１を、３７℃で模擬食品マトリックスの存在の有無にかかわらず、このＳＩＦ中で試験した（図１７）。それにより、ＤＡＯ－１は、５分未満の半減期期間を有する純粋なＳＩＦにおいて弱い安定性を示した。５０ｇ／ＬのＢＳＡ及び２５ｇ／Ｌのスクロース（食品マトリックスＳＩＦ１）の添加は、ＤＡＯの安定性を約１５分の半減期期間に改善した。この安定性の改善は、膵臓ペプチダーゼに利用可能な基質の数が増加したためである可能性が最も高かった。２５ｇ／ＬのＢＳＡ、２５ｇ／ＬのＷＰＩ及び５０ｇ／Ｌのスクロース（食品マトリックスＳＩＦ２）の添加は、ＤＡＯ－１安定性を約３０分の半減期期間まで更に改善した。総スクロース及びタンパク質濃度を５０ｇ／Ｌに維持するが、第３のタンパク質（食品マトリックスＳＩＦ３；それぞれ１６．６７ｇ／Ｌ及び５０ｇ／ＬのスクロースのＢＳＡ、ＷＰＩ及びカゼインナトリウム）としてカゼインナトリウムを導入すると、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の長期安定性が更に改善された。それにより、９０分のインキュベーション後に８±０．１％の残存ＤＡＯ－１活性が測定された。この食品マトリックスＳＩＦでは、最初に適用されたＤＡＯ－１活性の約４３％が９０分にわたって利用可能であった。結果は、ＳＩＦ中のＤＡＯ－１の安定性が、添加されるタンパク質の量だけでなく、タンパク質の種類にも依存することを示している。例えば、ＢＳＡは、ホエータンパク質の部分画分であるα－ラクトアルブミン又はβ－ラクトグロブリンよりもＳＩＦにおいて高い安定性を示す。α－カゼインは、上述のホエータンパク質部分画分よりもＳＩＦにおいて更に弱い安定性を示した。β－ラクトグロブリンは、標的アミノ酸をペプシン消化から保護する現在のｐＨでのその立体配座状態のために、模擬胃液中で高い安定性を示した。より高いｐＨでは、β－ラクトグロブリンの立体配座状態により、β－ラクトグロブリンはトリプシン及びキモトリプシンのような膵臓酵素の消化を受けやすくなる。
【0105】
結論として、ＤＡＯ－１の安定性は、食品マトリックス中に存在する各化合物の明確な影響のために、実際のインビボ条件下で評価することが困難である。しかしながら、最も複雑な食品マトリックスであり、十分なＤＡＯ－１安定性を提供するために、食品マトリックスＳＩＦ３を全ての更なる実験に使用した。
【0106】
模擬腸液中のＤＡＯ－１の速度論：
ＤＡＯ－１の安定性に加えて、ＳＩＦを含有する食品マトリックス中の速度論もまた、ヒスタミン分解能力にとって非常に重要である。したがって、ＤＡＯ－１を用いた速度論的研究を、１．５６～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度を有するパンクレアチンを含まない食品マトリックスＳＩＦ３（非加水分解ＳＩＦ）で行った（図１８Ａ）。Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆによるミカエリス・メンテン速度論の線形化を図１９に示す。更に、速度論的調査の前に、パンクレアチンによる加水分解を伴う食品マトリックスＳＩＦ３において３７℃で９０分間、速度論的調査も行った（図１８Ｂ）（加水分解ＳＩＦ）。ＤＡＯ－１の場合、基質阻害が、加水分解されていないＳＩＦ食品マトリックス及び加水分解されたＳＩＦ食品マトリックスの両方について、１２．５ｍＭを超えるヒスタミン濃度で認識された。非加水分解条件下でのヒスタミンに対するＤＡＯ－１のＫｍ値は５．７±０．５ｍＭ（Ｒ２＝０．９９）であり、それにより、２．３±０．２ｍＭのＫｍ値を有するＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）中の最適条件下でのＤＡＯ－１のＫｍ値よりも高い。加水分解ＳＩＦでは、ＤＡＯ－１は、非加水分解ＳＩＦと比較して、４．２±０．５ｍＭ（Ｒ２＝０．９７）のわずかに低いＫｍ値を示した。したがって、模擬食品マトリックスの膵臓消化からの遊離アミノ酸及びペプチドの蓄積は、ＤＡＯ－１の速度論に悪影響を及ぼさなかった。基質ヒスタミンに対するＤＡＯ－１の親和性は、０．００２８ｍＭのＫｍ値を有するヒト腎臓由来のＤＡＯと比較した場合、はるかに低い。しかしながら、ヒトＤＡＯは、小腸における外因性ヒスタミンの分解に関連するだけでなく、血漿中の内因性ヒスタミンの調節においても重要な役割を果たすようである。それぞれの研究では、１００ｎｇ／ｍＬの血漿ヒスタミン濃度は、ヒトにおいて重度のアナフィラキシー反応を誘発し得る濃度であると考えられた。したがって、ヒトＤＡＯは、高効率で低濃度のヒスタミンを分解することができなければならない。食品、特に発酵食品に見られるヒスタミン濃度は、ヒト血清中のヒスタミン濃度をはるかに超えている。様々な種類のチーズについて、＜０．１ｍｇ／ｋｇ～２５００ｍｇ／ｋｇの濃度が見出された。赤ワイン及び乾式発酵ソーセージの試料については、それぞれ５５ｍｇ／ｋｇ及び３５８ｍｇ／ｋｇの最大ヒスタミン濃度が報告された。ＤＡＯのその基質に対する高い親和性は、より高い変換率をもたらすので有利である。しかし、腸の条件下では、ＤＡＯの速度論は、存在するヒスタミン濃度がはるかに高いため、血清中のものと同じ関連性を有するようには見えない。
ＤＡＯ－１の安定性に加えて、ＳＩＦを含有する食品マトリックス中の速度論もまた、ヒスタミン分解能力にとって非常に重要である。したがって、ＤＡＯ－１を用いた速度論的研究を、１．５６～５０ｍＭの範囲のヒスタミン濃度を有するパンクレアチンを含まない食品マトリックスＳＩＦ３（非加水分解ＳＩＦ）で行った（図１８Ａ）。Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆによるミカエリス・メンテン速度論の線形化を図１９に示す。更に、速度論的調査の前に、パンクレアチンによる加水分解を伴う食品マトリックスＳＩＦ３において３７℃で９０分間、速度論的調査も行った（図１８Ｂ）（加水分解ＳＩＦ）。ＤＡＯ－１の場合、基質阻害が、加水分解されていないＳＩＦ食品マトリックス及び加水分解されたＳＩＦ食品マトリックスの両方について、１２．５ｍＭを超えるヒスタミン濃度で認識された。非加水分解条件下でのヒスタミンに対するＤＡＯ－１のＫｍ値は５．７±０．５ｍＭ（Ｒ２＝０．９９）であり、それにより、２．３±０．２ｍＭのＫｍ値を有するＰＩＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．２）中の最適条件下でのＤＡＯ－１のＫｍ値よりも高い。加水分解ＳＩＦでは、ＤＡＯ－１は、非加水分解ＳＩＦと比較して、４．２±０．５ｍＭ（Ｒ２＝０．９７）のわずかに低いＫｍ値を示した。したがって、模擬食品マトリックスの膵臓消化からの遊離アミノ酸及びペプチドの蓄積は、ＤＡＯ－１の速度論に悪影響を及ぼさなかった。基質ヒスタミンに対するＤＡＯ－１の親和性は、０．００２８ｍＭのＫｍ値を有するヒト腎臓由来のＤＡＯと比較した場合、はるかに低い。しかしながら、ヒトＤＡＯは、小腸における外因性ヒスタミンの分解に関連するだけでなく、血漿中の内因性ヒスタミンの調節においても重要な役割を果たすようである。それぞれの研究では、１００ｎｇ／ｍＬの血漿ヒスタミン濃度は、ヒトにおいて重度のアナフィラキシー反応を誘発し得る濃度であると考えられた。したがって、ヒトＤＡＯは、高効率で低濃度のヒスタミンを分解することができなければならない。食品、特に発酵食品に見られるヒスタミン濃度は、ヒト血清中のヒスタミン濃度をはるかに超えている。様々な種類のチーズについて、＜０．１ｍｇ／ｋｇ～２５００ｍｇ／ｋｇの濃度が見出された。赤ワイン及び乾式発酵ソーセージの試料については、それぞれ５５ｍｇ／ｋｇ及び３５８ｍｇ／ｋｇの最大ヒスタミン濃度が報告された。ＤＡＯのその基質に対する高い親和性は、より高い変換率をもたらすので有利である。しかし、腸の条件下では、ＤＡＯの速度論は、存在するヒスタミン濃度がはるかに高いため、血清中のものと同じ関連性を有するようには見えない。
【0107】
ＤＡＯ－１の打錠：
１つのＤＡＯ－１錠剤の調製のために、約３７０ｍＬのバイオリアクタ体積からの湿酵母細胞の破壊及び精製から得られたＤＡＯ－１活性を使用した（６９０ｎｋａｔ）（表２）。このＤＡＯ－１調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＤＡＯ－１を示す約７５ｋＤａの明確なバンドを示した（図２０）。精製されたＤＡＯ－１は、硫酸アンモニウム沈殿によってほぼ９０倍濃縮され、それによってＤＡＯ－１活性は失われなかった。凍結乾燥の前に、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼを添加して、蓄積している過酸化水素を除去することにより、生体内変換条件下でのＤＡＯ－１の安定性及び活性を改善した。予備実験では、使用したカタラーゼが凍結乾燥プロセスに耐え、大きな酵素活性の損失がないことが観察された。４０ｇ／Ｌスクロースを含むリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）中での精製ＤＡＯ－１の凍結乾燥は、ＤＡＯ－１活性の損失を何らもたらさなかった。ＤＡＯ－１含有粉末を、自己構築式錠剤プレスで錠剤長９ｍｍ（直径７ｍｍ）に圧縮した。完成したＤＡＯ－１錠剤は十分な安定性を示し、錠剤プレスから抽出した後にそれらの形状を維持した。
１つのＤＡＯ－１錠剤の調製のために、約３７０ｍＬのバイオリアクタ体積からの湿酵母細胞の破壊及び精製から得られたＤＡＯ－１活性を使用した（６９０ｎｋａｔ）（表２）。このＤＡＯ－１調製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ＤＡＯ－１を示す約７５ｋＤａの明確なバンドを示した（図２０）。精製されたＤＡＯ－１は、硫酸アンモニウム沈殿によってほぼ９０倍濃縮され、それによってＤＡＯ－１活性は失われなかった。凍結乾燥の前に、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼを添加して、蓄積している過酸化水素を除去することにより、生体内変換条件下でのＤＡＯ－１の安定性及び活性を改善した。予備実験では、使用したカタラーゼが凍結乾燥プロセスに耐え、大きな酵素活性の損失がないことが観察された。４０ｇ／Ｌスクロースを含むリン酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７）中での精製ＤＡＯ－１の凍結乾燥は、ＤＡＯ－１活性の損失を何らもたらさなかった。ＤＡＯ－１含有粉末を、自己構築式錠剤プレスで錠剤長９ｍｍ（直径７ｍｍ）に圧縮した。完成したＤＡＯ－１錠剤は十分な安定性を示し、錠剤プレスから抽出した後にそれらの形状を維持した。
【0108】
【表2】
【0109】
ＲＰ－ＨＰＬＣによる食品マトリックスＳＩＦ試料中のヒスタミンの定量：
ＳＩＦを含有する食品マトリックス中のヒスタミンの定量は、複雑な試料マトリックスのために困難な作業である。そこでは、高いサッカロース及びタンパク質含有量であるが、より重要なことには、タンパク質分解消化から生成された異なるペプチド及び遊離アミノ酸の数が、ＲＰ－ＨＰＬＣによるヒスタミンの分析を乱す。オルト－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）によるヒスタミンの誘導体化は、様々な加水分解製品の誘導体化をもたらし、それによってこの分析問題には適用できない。したがって、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の前に試料を精製して、外来化合物の大部分を除去しなければならない。
ＳＩＦを含有する食品マトリックス中のヒスタミンの定量は、複雑な試料マトリックスのために困難な作業である。そこでは、高いサッカロース及びタンパク質含有量であるが、より重要なことには、タンパク質分解消化から生成された異なるペプチド及び遊離アミノ酸の数が、ＲＰ－ＨＰＬＣによるヒスタミンの分析を乱す。オルト－フタルアルデヒド（ＯＰＡ）によるヒスタミンの誘導体化は、様々な加水分解製品の誘導体化をもたらし、それによってこの分析問題には適用できない。したがって、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の前に試料を精製して、外来化合物の大部分を除去しなければならない。
【0110】
ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５カラムを用いたサイズ排除によって、大きな分子を粗試料から除去した。次いで、この試料中のヒスタミンは、その正電荷のために酸性条件下でカチオン交換材料に結合することができる。それにより、全ての未結合化合物を洗い流し、アルカリ性条件へのｐＨシフトでヒスタミンを溶出することによって、ヒスタミンを他の物質から分離することができる。得られたヒスタミン試料を誘導体化せずにＲＰ－ＨＰＬＣで分離した（図２１）。較正のためのヒスタミン標準をそれぞれのＳＩＦマトリックス中で行い、上記のように処理した。較正は、０．１～２ｍＭのヒスタミン（Ｒ２＝＞０．９９４）の範囲内で十分な直線性を示した（図２２）。検出及び定量の限界は、それぞれ０．５及び０．６５ｍＭであった。ヒスタミン標準（１．３５ｍＭ）の回収率は１０６．７％であり、ＤＡＯ－１錠剤を使用したヒスタミンの生体内変換の調査に十分な精度を提供した。
【0111】
ＤＡＯ－１錠剤を使用した模擬腸液中でのヒスタミンの生体内変換：
小腸における内因性ＤＡＯを支持するためのブタＤＡＯの補充は、いくつかの臨床研究において評価されており、それは、ヒスタミン関連の生理学的症状を軽減するためのＤＡＯ補充を見出した。ある研究における知見とは対照的に、最近、インビトロ研究において、ＤＡＯ活性がブタＤＡＯ補充において検出可能でなく、少なくとも５０ｎｋａｔのＤＡＯ活性が食品関連ヒスタミン量（７５ｍｇ）の分解に必要であることが示された。このヒスタミン量は、ヒスタミン不耐性ヒトを同定するために臨床試験で使用されている。しかしながら、必要なＤＡＯ活性は、使用した緩衝系についてのみ推定され、ＳＩＦ条件下での低下したＤＡＯ活性及び速度論的、又は膵臓消化による低い安定性を含まなかった。したがって、ＳＩＦ条件下で満足のいくヒスタミン低下を得るためには、更に高いＤＡＯ－１活性が必要とされ得る。
小腸における内因性ＤＡＯを支持するためのブタＤＡＯの補充は、いくつかの臨床研究において評価されており、それは、ヒスタミン関連の生理学的症状を軽減するためのＤＡＯ補充を見出した。ある研究における知見とは対照的に、最近、インビトロ研究において、ＤＡＯ活性がブタＤＡＯ補充において検出可能でなく、少なくとも５０ｎｋａｔのＤＡＯ活性が食品関連ヒスタミン量（７５ｍｇ）の分解に必要であることが示された。このヒスタミン量は、ヒスタミン不耐性ヒトを同定するために臨床試験で使用されている。しかしながら、必要なＤＡＯ活性は、使用した緩衝系についてのみ推定され、ＳＩＦ条件下での低下したＤＡＯ活性及び速度論的、又は膵臓消化による低い安定性を含まなかった。したがって、ＳＩＦ条件下で満足のいくヒスタミン低下を得るためには、更に高いＤＡＯ－１活性が必要とされ得る。
【0112】
調製されたＤＡＯ－１錠剤は、食品マトリックスＳＩＦ３中の最初に適用されたヒスタミン濃度（１．３５ｍＭ；１５０ｍｇ／Ｌ；７５ｍｇ）を３７℃で９０分で２９．３±０．８％低下させた（図２３）。これは、２２ｍｇのヒスタミンの総分解に相当した。ＤＡＯ－１は、類似の生体内変換実験において緩衝液条件下で以前に試験されている。これにより、ヒスタミンは７５％低下した。ＤＡＯ－１の速度論のために、ヒスタミンの完全な変換は不可能であった。タンパク質分解消化によるＤＡＯ－１活性の損失を補償するために、１つの錠剤の代わりに２つの錠剤を投与することができる。これは、より効率的な総ヒスタミン分解をもたらす可能性が最も高い。しかしながら、この必要とされるＤＡＯ－１活性を得るためには、最初に、ＤＡＯ－１産生のための代替発現宿主を調査して、産生を更に改善すべきである。７５ｍｇヒスタミンの適用されたベンチマークは理論値にすぎず、ヒスタミン含有食事の消費はより低い総ヒスタミン量を伴い得ることを理解することが重要である。更に、この量は、健康な個体においてヒスタミン不耐性の典型的な症状を引き起こすのに十分であるとさえ思われる。したがって、１つのＤＡＯ－１錠剤を使用して達成された２２ｍｇの総分解は、ヒト小腸における内因性ＤＡＯ媒介性ヒスタミン分解を支持するのに既に十分であり得る。臨床研究を含む更なる研究を行って、ヒスタミン不耐性ヒトにおけるＤＡＯ－１錠剤の実際の影響を評価しなければならない。
【0113】
実施例９：
コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）におけるＤＡＯ－１の組換え産生
酵母コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）を、ＤＡＯ－１（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来）の産生のために遺伝子改変した。この目的のために、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）にコドン最適化されたＤＡＯ－１遺伝子を、ＧＡＰプロモータの制御下でＧＡＰ遺伝子座に組み込んだ。組込み後、最も強いＤＡＯ－１発現能について活性ベースのスクリーニングによって異なるクローンを選択した。次いで、得られたＫ．ｐｈａｆｆｉｉ＿ＤＡＯ－１クローンをＤＡＯ－１の組換え発現に使用することができた。構成的で強力なＧＡＰプロモータの制御下でのＤＡＯ－１の発現は、グルコース含有最小培地中で行うことができる。更に、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）のゲノムへの組込みは、産生中の抗生物質の必要性を完全に排除することができる。
コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）におけるＤＡＯ－１の組換え産生
酵母コマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）を、ＤＡＯ－１（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来）の産生のために遺伝子改変した。この目的のために、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）にコドン最適化されたＤＡＯ－１遺伝子を、ＧＡＰプロモータの制御下でＧＡＰ遺伝子座に組み込んだ。組込み後、最も強いＤＡＯ－１発現能について活性ベースのスクリーニングによって異なるクローンを選択した。次いで、得られたＫ．ｐｈａｆｆｉｉ＿ＤＡＯ－１クローンをＤＡＯ－１の組換え発現に使用することができた。構成的で強力なＧＡＰプロモータの制御下でのＤＡＯ－１の発現は、グルコース含有最小培地中で行うことができる。更に、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）のゲノムへの組込みは、産生中の抗生物質の必要性を完全に排除することができる。
【0114】
Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）はまた、ＥＦＳＡ－ｉｓｓｕｅｄ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）ＱＰＳ（Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｆｅｔｙ）ステータス及びＦＤＡ（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）ＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）ステータスを有し、したがってヒトへの投与を目的としたＤＡＯ－１産生に使用することができる。
【0115】
Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ＿ＤＡＯ－１をグルコース含有最小培地中のバイオリアクタで培養した。グルコース溶液及び微量元素からなる指数関数的フィード（フェドバッチ培養）を使用して、それぞれ約４５０ｇ／Ｌ及び１１５ｇ／Ｌの最大生物湿潤質量及び生物乾燥質量を、わずか３６時間未満の培養期間後に達成することができた。２５００ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ－１活性を有する約５０，０００ｎｋａｔ／Ｌ培地の最大ＤＡＯ－１活性を達成することができた。したがって、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるＤＡＯ－１産生と比較して、最大ＤＡＯ－１活性を達成するための培養時間を２０時間短縮することができただけでなく、活性収率も１８倍増加させることができた。
【0116】
ＤＡＯ－１の生産性は、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモータを使用することによって、Ｋ．ファフィイ（Ｋ．ｐｈａｆｆｉｉ）において更に増加させることができる。β－ガラクトシダーゼ参照酵素を使用すると、ＧＡＰプロモータと比較してＡＯＸ１プロモータを使用することによって発現能力を２倍増加させることができることが既に示され得る。したがって、１００，０００ｎｋａｔ／Ｌ培地 ＤＡＯ－１までの生産性が期待できる。
【0117】
考察：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、最も関連する生体アミンであるヒスタミン、プトレシン、カダベリン及びチラミンを含む広い基質選択性を示すＤＡＯ（ＤＡＯ－１）の産生物質として同定された。これは、微生物ＤＡＯには稀にしか見られない特徴のようであり、ＤＡＯ－１を食品産業における投与のための興味深い酵素にしている。ＤＡＯ－１は、ブタ及びヒトＤＡＯと比較して、温度及びｐＨプロファイルに関して同様の生化学的特性を示した。他の微生物ＤＡＯについて観察されたように、ＤＡＯ－１は、哺乳動物のブタ及びヒトＤＡＯと比較して、基質ヒスタミンに対してより低い親和性（Ｋｍ＝２．３±０．２ｍＭ）を示した。それにもかかわらず、ＤＡＯ－１は、ヒスタミンの生体内変換実験において適用されたヒスタミン（１５０ｍｇ／Ｌ）の約７５％を低下させることができた。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるＤＡＯ－１の費用対効果が高く簡便な生産及びその生化学的特徴により、ＤＡＯ－１は、ヒスタミン等の生体アミンの分解のための食品産業における用途、並びに生体アミンの摂取に関連する状態及び疾患の予防及び治療における一連の医療用途のための興味深い酵素となる。
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆは、最も関連する生体アミンであるヒスタミン、プトレシン、カダベリン及びチラミンを含む広い基質選択性を示すＤＡＯ（ＤＡＯ－１）の産生物質として同定された。これは、微生物ＤＡＯには稀にしか見られない特徴のようであり、ＤＡＯ－１を食品産業における投与のための興味深い酵素にしている。ＤＡＯ－１は、ブタ及びヒトＤＡＯと比較して、温度及びｐＨプロファイルに関して同様の生化学的特性を示した。他の微生物ＤＡＯについて観察されたように、ＤＡＯ－１は、哺乳動物のブタ及びヒトＤＡＯと比較して、基質ヒスタミンに対してより低い親和性（Ｋｍ＝２．３±０．２ｍＭ）を示した。それにもかかわらず、ＤＡＯ－１は、ヒスタミンの生体内変換実験において適用されたヒスタミン（１５０ｍｇ／Ｌ）の約７５％を低下させることができた。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆにおけるＤＡＯ－１の費用対効果が高く簡便な生産及びその生化学的特徴により、ＤＡＯ－１は、ヒスタミン等の生体アミンの分解のための食品産業における用途、並びに生体アミンの摂取に関連する状態及び疾患の予防及び治療における一連の医療用途のための興味深い酵素となる。
【0118】
具体的には、本発明では、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ（ＤＡＯ－１）由来の推定ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）を、バイオリアクタにおけるその後のＤＡＯ産生のためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムに相同組換え的に組み込んだ。これにより、製造されたＤＡＯ－１が実際に機能性ＤＡＯであることが証明された。培養により、１３０１±５４．２ｎｋａｔ／ｇタンパク質の比ＤＡＯ活性を有する２３４３±９８ｎｋａｔ／Ｌ培養物が得られ、これは天然のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ ＤＡＯ－１産生と比較して比ＤＡＯ活性の９３倍の増加であった。ＤＡＯ－１は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ）（基質としてヒスタミンを含む）中、４０℃、ｐＨ７．２で最も活性であり、これはヒト及びブタのＤＡＯに匹敵する。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのＤＡＯ－１は、食品中の最も関連性の高い生体アミンに対するその広範な選択性により、生体アミンの分解のための食品産業における用途、並びに生体アミンの摂取に関連する状態及び疾患の予防及び治療における一連の医療用途のための興味深い酵素である。
【0119】
更に、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＤＡＯ－１を、模擬腸条件下でのヒスタミンの低下におけるその可能性について調べた。したがって、精製ＤＡＯ－１を、６９０ｎｋａｔのＤＡＯ－１活性を含有するスクロース系錠剤として製剤化した。錠剤はまた、ミクロコッカス・リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼを含有し、蓄積する過酸化水素がヒスタミン分解中にＤＡＯ－１を不活性化しないことを確実にした。このＤＡＯ－１錠剤を使用して、実際の食品関連ヒスタミン量（２２ｍｇ）がＳＩＦ条件下で微生物ＤＡＯによって分解され得ることが初めて示された。これは、ヒスタミン不耐性の症状を回避するために既に十分であり得る量であり、内因性ヒスタミン分解を支持する。
【0120】
本発明は、以下のアミノ酸及びヌクレオチド配列に関する。
配列番号１
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来のＤＡＯ－１のアミノ酸配列
MTPHPFDQLSVQEMESVVRVVKSNHSGKSLHLKSIGTEEPPKALMAPFLAAKRAGKNPVPPPRIAHVIYYVLEDKLVNQCWVDVPSAKVVKSEVLKKGIHPPIDPWEANEAFEAAFDHPLVKDAIKKCGVEHLIDNLTIDGWMYGCDSEIDMPRYLQMLVYCRDPKTNHQDSNMYAFPVPFVPVYDVLEKKLVRVDYCATGGDDDDAAVEGVGNYDTRPEGKNCIEHCVTNDYLPELQDKMRTDLKPYNVLQPEGPSYHIDSDGYINWQKWHFKVGFTPREGLVIHDVHYDGRSTFYRLSMSEMAVPYADPRPPLHRKMAFDFGDCGGGKCANELTLGCDCLGTIRYFDGNVCDPEGNVFTRKNVICMHEQDDGIGWKHTNYRTDVVAITRRRILVLQTILTVGNYEYIFAWHFDQSAGIQLEIRATGIVSTQLIDAGKKSKFGTIVSPGVMAASHQHIFNVRMDPAIDGHQNTVVVNDTVALPWDAKNPHGIAFENTKTPIEKSCYLDSDIQKNRYLKICNENKINPISGNPVGYKIGGLATAMLYAQPGSVSRNRAAFATHHYWVTKYKDQELFAGGVWTNQSANEVGGVQDAVARNENVRNDDVVLWHSFGLTHHPRVEDFPVMPCEIMKIHLSPNDFFTGNPSVDVPKSNQTFNRSVEVKDCRSCKI
配列番号２
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆの遺伝子ｄａｏ－１
配列番号１
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来のＤＡＯ－１のアミノ酸配列
MTPHPFDQLSVQEMESVVRVVKSNHSGKSLHLKSIGTEEPPKALMAPFLAAKRAGKNPVPPPRIAHVIYYVLEDKLVNQCWVDVPSAKVVKSEVLKKGIHPPIDPWEANEAFEAAFDHPLVKDAIKKCGVEHLIDNLTIDGWMYGCDSEIDMPRYLQMLVYCRDPKTNHQDSNMYAFPVPFVPVYDVLEKKLVRVDYCATGGDDDDAAVEGVGNYDTRPEGKNCIEHCVTNDYLPELQDKMRTDLKPYNVLQPEGPSYHIDSDGYINWQKWHFKVGFTPREGLVIHDVHYDGRSTFYRLSMSEMAVPYADPRPPLHRKMAFDFGDCGGGKCANELTLGCDCLGTIRYFDGNVCDPEGNVFTRKNVICMHEQDDGIGWKHTNYRTDVVAITRRRILVLQTILTVGNYEYIFAWHFDQSAGIQLEIRATGIVSTQLIDAGKKSKFGTIVSPGVMAASHQHIFNVRMDPAIDGHQNTVVVNDTVALPWDAKNPHGIAFENTKTPIEKSCYLDSDIQKNRYLKICNENKINPISGNPVGYKIGGLATAMLYAQPGSVSRNRAAFATHHYWVTKYKDQELFAGGVWTNQSANEVGGVQDAVARNENVRNDDVVLWHSFGLTHHPRVEDFPVMPCEIMKIHLSPNDFFTGNPSVDVPKSNQTFNRSVEVKDCRSCKI
配列番号２
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆの遺伝子ｄａｏ－１
【0121】
下線付きの太字の大文字のヌクレオチドは、ＮＣＢＩデータベースに示されている推定ＤＮＡ配列に関してサイレント変異を示す。
配列番号３
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来の遺伝子ｄａｏ－２
atgcacagactatcacaactagctacacaaacaaccgcggccaccatcaccgcaggtcatcctcttgatcctctctctccctccgaaatcgaacatgccgcttccatcgtcaaatcgcagatgcgagactcgtctccgtaccggttcaatctcatcacgctgatcgagccgcccaaggccgagcttcttgcgtgggaggcgtcgccttcctcggtggccaaacctcctcgacgagcggaggtcgtactcgttgtgagaggcaagaagggcgtcaccgagggccgggtctgtctcaccggctcaaaggtgctttcgtggtccgaaattgagggcgtccagcctattcttaccgttgacgacctccaaaaggtcgaggaaattgtgcgacaggaccccgaagtcatcaagcagtgcaaactcattggagttgacaacatgtcccaggtgtactgtgatccctggactattggctatgacgaaagatggggtgccgaacgacgtctacagcaggcgttcctctacttccgagcccaccaggacgactcccagtactcccatcctcttgacttcactccaatctacgacgccacggagcagaaagtcatctttattgatattcctcccgttcgtcgacctctctccaagcttaagaattccaacttcaaccctcaggatatctccaagactaccggttacagagacgtgaagcccatcgacgtgtctcagcccgaaggagtcaacttcaagatgaccggtcgaatcatggagtggcagggattccgatttcacgtgggattcaactacagagagggaattgtgctgtctcagatctctttcaacgaccatggtaaccagcgaaacatgttccatcgtctctctctcgttgaaatggttgttccctacggaaaccccgagcaccctcaccagcgaaagcacgcctttgatctgggagagtacggagccggtctcatgaccaatcctctttccctcggatgtgattgcaagggagtcattcactaccttgatgcgcacttttccgacgccgaaggaaagcctctcactgttcccaacgctgtgtgtatccacgaggaggacaatggtctgcttttcaagcactctgacttccgagacgagttccagacttcgatcgtcactcgagctaccaagctcattttgtcgcagattttcaccgccgcaaactacgaatactgcgtctactggattttccaccaggacggtaccatccagctggagattaagctcaccggcatcctcaacactttcccctgcaatcccggagaagatttgcatggctggggcacagaggtgtaccctggtaccaacgcccacaaccatcagcatctcttttctctgcgaatccatcctgccattgattcccagctgcatccaggtaattctgtggcaatggtggacgctgagcggtcacccttcccgcctggacacccagaaaacctgcacggcaatggtttccggcccaagcgaacggtcttcaacaacccgatcgaggctatgacggattatgatggtaatacatcgcgaacttgggactttttcaacccgaagtccatcaaccagtactccaagaagcccgcttcttacaagctggtgtctcgtgagtgccctcctctgcttcctcagcctggtggactggtttggaaccgagctggttttgcacgacaccatatgcatgttgttccgtatgtggacggccagctgtaccctgctggacggtttgtttgccagacaagtggaaagccctcaaggggtctccccgagtggattgagcagtgcggagagaaggccaatatcaacgataccgatgttgttgcctatcacacttttggtctgacccatttccctgctcccgaggacttccctttgatgcctgccgagcccatgactctacttttgcgacccagaaacttcttcctgcagaacccggctttggacgtgcctccttcgcatgctcgaaccaccacagaggcccaggctgcttccggtgctaaggttgtctctcttaccgacaaggtgtcgcagctggctttcaataagtcgtgctgttccaagtag
配列番号４：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからｄａｏ－１を増幅するためのフォワードプライマー
atgactccccaccctttcgatcag
配列番号５
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからｄａｏ－１を増幅するためのリバースプライマー
ctagatcttgcaagatcgacagtccttg
配列番号６
ｄａｏ－１の第２の増幅及び制限部位の付加のためのフォワードプライマー
cttgcgcgcatgactccccaccctttc
配列番号７
ｄａｏ－１の第２の増幅及び制限部位の付加のためのリバースプライマー
ggcgctagcctagatcttgcaagatcg
配列番号８
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからのｄａｏ－２の増幅及び制限部位の付加のためのフォワードプライマー
gaagcgcgcatgcacagactatcacaactagc
配列番号９
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからのｄａｏ－２の増幅及び制限部位の付加のためのリバースプライマー
caagctagcctacttggaacagcacga
配列番号１０
ｄａｏ遺伝子用のフォワード配列決定プライマー
ctaaagatgttgatctccttgtgcc
配列番号１１
ｄａｏ遺伝子用のリバース配列決定プライマー
cctctgggccgaatacaacac
配列番号３
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆ由来の遺伝子ｄａｏ－２
atgcacagactatcacaactagctacacaaacaaccgcggccaccatcaccgcaggtcatcctcttgatcctctctctccctccgaaatcgaacatgccgcttccatcgtcaaatcgcagatgcgagactcgtctccgtaccggttcaatctcatcacgctgatcgagccgcccaaggccgagcttcttgcgtgggaggcgtcgccttcctcggtggccaaacctcctcgacgagcggaggtcgtactcgttgtgagaggcaagaagggcgtcaccgagggccgggtctgtctcaccggctcaaaggtgctttcgtggtccgaaattgagggcgtccagcctattcttaccgttgacgacctccaaaaggtcgaggaaattgtgcgacaggaccccgaagtcatcaagcagtgcaaactcattggagttgacaacatgtcccaggtgtactgtgatccctggactattggctatgacgaaagatggggtgccgaacgacgtctacagcaggcgttcctctacttccgagcccaccaggacgactcccagtactcccatcctcttgacttcactccaatctacgacgccacggagcagaaagtcatctttattgatattcctcccgttcgtcgacctctctccaagcttaagaattccaacttcaaccctcaggatatctccaagactaccggttacagagacgtgaagcccatcgacgtgtctcagcccgaaggagtcaacttcaagatgaccggtcgaatcatggagtggcagggattccgatttcacgtgggattcaactacagagagggaattgtgctgtctcagatctctttcaacgaccatggtaaccagcgaaacatgttccatcgtctctctctcgttgaaatggttgttccctacggaaaccccgagcaccctcaccagcgaaagcacgcctttgatctgggagagtacggagccggtctcatgaccaatcctctttccctcggatgtgattgcaagggagtcattcactaccttgatgcgcacttttccgacgccgaaggaaagcctctcactgttcccaacgctgtgtgtatccacgaggaggacaatggtctgcttttcaagcactctgacttccgagacgagttccagacttcgatcgtcactcgagctaccaagctcattttgtcgcagattttcaccgccgcaaactacgaatactgcgtctactggattttccaccaggacggtaccatccagctggagattaagctcaccggcatcctcaacactttcccctgcaatcccggagaagatttgcatggctggggcacagaggtgtaccctggtaccaacgcccacaaccatcagcatctcttttctctgcgaatccatcctgccattgattcccagctgcatccaggtaattctgtggcaatggtggacgctgagcggtcacccttcccgcctggacacccagaaaacctgcacggcaatggtttccggcccaagcgaacggtcttcaacaacccgatcgaggctatgacggattatgatggtaatacatcgcgaacttgggactttttcaacccgaagtccatcaaccagtactccaagaagcccgcttcttacaagctggtgtctcgtgagtgccctcctctgcttcctcagcctggtggactggtttggaaccgagctggttttgcacgacaccatatgcatgttgttccgtatgtggacggccagctgtaccctgctggacggtttgtttgccagacaagtggaaagccctcaaggggtctccccgagtggattgagcagtgcggagagaaggccaatatcaacgataccgatgttgttgcctatcacacttttggtctgacccatttccctgctcccgaggacttccctttgatgcctgccgagcccatgactctacttttgcgacccagaaacttcttcctgcagaacccggctttggacgtgcctccttcgcatgctcgaaccaccacagaggcccaggctgcttccggtgctaaggttgtctctcttaccgacaaggtgtcgcagctggctttcaataagtcgtgctgttccaagtag
配列番号４：
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからｄａｏ－１を増幅するためのフォワードプライマー
atgactccccaccctttcgatcag
配列番号５
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからｄａｏ－１を増幅するためのリバースプライマー
ctagatcttgcaagatcgacagtccttg
配列番号６
ｄａｏ－１の第２の増幅及び制限部位の付加のためのフォワードプライマー
cttgcgcgcatgactccccaccctttc
配列番号７
ｄａｏ－１の第２の増幅及び制限部位の付加のためのリバースプライマー
ggcgctagcctagatcttgcaagatcg
配列番号８
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからのｄａｏ－２の増幅及び制限部位の付加のためのフォワードプライマー
gaagcgcgcatgcacagactatcacaactagc
配列番号９
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＯ１ｆのゲノムＤＮＡからのｄａｏ－２の増幅及び制限部位の付加のためのリバースプライマー
caagctagcctacttggaacagcacga
配列番号１０
ｄａｏ遺伝子用のフォワード配列決定プライマー
ctaaagatgttgatctccttgtgcc
配列番号１１
ｄａｏ遺伝子用のリバース配列決定プライマー
cctctgggccgaatacaacac
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】