特表 2024-523394 異常な遺伝子発現を調節するためのシステムおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】異常な遺伝子発現を調節するためのシステムおよび方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240621BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20240621BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240621BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240621BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/863 Z

C12N15/861 Z

A61P21/00

A61K31/7088

A61K38/45

A61K48/00

C12N9/16 Z ZNA

C12N9/10

C12N5/077

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577861

(86)(22)【出願日】2022-06-16

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 US2022033797

(87)【国際公開番号】W WO2022266324

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/211,791

(32)【優先日】2021-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523471839

【氏名又は名称】エピクリスパー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】コリン ドゥ ロルテ， アレクサンドラ シルヴィー

(72)【発明者】

【氏名】ツォア， ローズマリー ウェンティング

(72)【発明者】

【氏名】アディカリ， アビナブ

(72)【発明者】

【氏名】ボレゴウダ， シッダラジュ

(72)【発明者】

【氏名】ハート， ダニエル オー．

(72)【発明者】

【氏名】ゲイナス， トーマス ブレア

(72)【発明者】

【氏名】カロッソ， ジョヴァンニ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， シャオ

(72)【発明者】

【氏名】デイリー， ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】ルオン， タオ グエン ヴ

(72)【発明者】

【氏名】リウ， ヤンシャ

(72)【発明者】

【氏名】コ， テンギュ

(72)【発明者】

【氏名】サルツマン， アンバー ルース

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA29

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084DC25

4C084NA14

4C084ZA94

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA94

(57)【要約】

本開示は、対象の疾患または状態（例えば、筋ジストロフィー、例えば顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ））を処置または回復させるための細胞（例えば、筋細胞）における標的遺伝子の異常発現を調節するためのシステム、組成物、方法を提供する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、複合体が形成されると、筋細胞における標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約２日間持続する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、２週間、４週間、または２か月間持続する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するためのシステムであって、
約９００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有するヌクレアーゼを含む異種ポリペプチド；および
前記異種ポリペプチドと複合体を形成するように構成されたガイド核酸分子であって、前記筋細胞におけるＤ４Ｚ４リピートアレイでのまたはそれに隣接する標的ポリヌクレオチド配列に対して特異的結合を示すガイド核酸分子
を含み、
前記複合体が形成されると、前記複合体が、前記標的ポリヌクレオチド配列に結合して、前記筋細胞における前記標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変をもたらすことが可能であり、前記標的遺伝子が前記Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内に存在する、システム。

【請求項2】

前記複合体が形成されると、前記筋細胞における前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが少なくとも約２日間持続する、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、２週間、４週間、または２か月持続する、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約１７日間持続する、請求項２に記載のシステム。

【請求項5】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが少なくとも約１８日間持続する、請求項２に記載のシステム。

【請求項6】

前記筋細胞が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有するまたは有することが疑われる対象に存在する、請求項１に記載のシステム。

【請求項7】

前記標的遺伝子がＤｕｘ４である、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

前記ヌクレアーゼが、約８００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する、請求項１に記載のシステム。

【請求項9】

前記ヌクレアーゼが、約７５０アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する、請求項１に記載のシステム。

【請求項10】

前記ヌクレアーゼがＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１またはその改変バリアントである、請求項１に記載のシステム。

【請求項11】

前記ヌクレアーゼが、配列番号４３のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項12】

前記ヌクレアーゼが、配列番号４４のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項13】

前記異種ポリペプチドが、転写調節因子をさらに含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項14】

前記転写調節因子が少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記転写調節因子が、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記転写調節因子がＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

前記転写調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項１４に記載のシステム。

【請求項18】

前記転写調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項１４に記載のシステム。

【請求項19】

前記転写調節因子が、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項１４に記載のシステム。

【請求項20】

前記転写調節因子が、ＤＮＭＴ－Ｌ、またはＫＲＡＢもしくはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項21】

前記転写調節因子が、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項22】

前記転写調節因子が、複数の異なる転写調節因子を含む、請求項１３に記載のシステム。

【請求項23】

前記標的遺伝子の前記発現レベルおよび／または前記メチル化レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下流の遺伝子の下方調節をもたらし、前記下流の遺伝子が、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＴＲＩＭ４３からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項24】

前記標的遺伝子の前記発現レベルおよび／または前記メチル化レベルの前記改変が、前記筋細胞におけるアポトーシスマーカーの下方調節をもたらす、請求項１に記載のシステム。

【請求項25】

前記アポトーシスマーカーがカスパーゼ３を含む、請求項２４に記載のシステム。

【請求項26】

前記複合体が、前記筋遺伝子における前記標的遺伝子の前記発現レベルの前記改変をもたらす、請求項１に記載のシステム。

【請求項27】

前記発現レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下方調節をもたらす、請求項２６に記載のシステム。

【請求項28】

前記複合体が、前記筋遺伝子における前記標的遺伝子の前記メチル化レベルの前記改変をもたらす、請求項１に記載のシステム。

【請求項29】

前記メチル化レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下方調節をもたらす、請求項２８に記載のシステム。

【請求項30】

前記ヌクレアーゼが、非活性化ヌクレアーゼである、請求項１に記載のシステム。

【請求項31】

先行請求項のいずれか一項に記載のシステムを含む組成物。

【請求項32】

先行請求項のいずれか一項に記載のシステムを含むウイルスベクター。

【請求項33】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはアデノウイルスを含む、請求項３２に記載のウイルスベクター。

【請求項34】

前記ＡＡＶが、ＡＡＶ血清型ＲＨ７４ ＡＡＶを含む、請求項３３に記載のウイルスベクター。

【請求項35】

筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するための方法であって、
（ａ）前記筋細胞を、（ｉ）約９００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有するヌクレアーゼを含む異種ポリペプチド、および（ｉｉ）前記筋細胞におけるＤ４Ｚ４リピートアレイでのまたはそれに隣接する標的ポリヌクレオチド配列に対して特異的結合を示すガイド核酸分子を含む複合体と接触させること；ならびに
（ｂ）前記接触させると、前記標的遺伝子と前記複合体との結合により、前記筋細胞における前記標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変をもたらすことであって、前記標的遺伝子が前記Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内に存在すること
を含む方法。

【請求項36】

前記複合体が形成されると、前記筋細胞における前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが少なくとも約２日間持続する、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、２週間、４週間、または２か月持続する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約１７日間持続する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約１８日間持続する、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

前記接触させることが、前記複合体を含む組成物を注射することを必要とする対象に前記複合体を含む組成物を注射することを含み、前記対象が、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有するかまたは有することが疑われる、請求項３５に記載の方法。

【請求項41】

前記標的遺伝子がＤｕｘ４である、請求項３５に記載の方法。

【請求項42】

前記ヌクレアーゼが、約８００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する、請求項３５に記載の方法。

【請求項43】

前記ヌクレアーゼが、約７５０アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する、請求項３５に記載の方法。

【請求項44】

前記ヌクレアーゼが、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１またはその改変バリアントである、請求項３５に記載の方法。

【請求項45】

前記ヌクレアーゼが、配列番号４３のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項46】

前記ヌクレアーゼが、配列番号４４のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項47】

前記異種ポリペプチドが転写調節因子をさらに含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項48】

前記転写調節因子が少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記転写調節因子が、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記転写調節因子がＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記転写調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記転写調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項53】

前記転写調節因子が、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項54】

前記転写調節因子が、ＤＮＭＴ－ＬまたはＫＲＡＢもしくはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項55】

前記転写調節因子が、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項56】

前記転写調節因子が、複数の異なる転写調節因子を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項57】

前記標的遺伝子の前記発現レベルおよび／または前記メチル化レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下流の遺伝子の下方調節をもたらし、前記下流の遺伝子が、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＴＲＩＭ４３からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項58】

前記標的遺伝子の前記発現レベルおよび／または前記メチル化レベルの前記改変が、前記筋細胞におけるアポトーシスマーカーの下方調節をもたらす、請求項３５に記載の方法。

【請求項59】

前記アポトーシスマーカーが、カスパーゼ３を含む、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記複合体が、前記筋遺伝子における前記標的遺伝子の前記発現レベルの前記改変をもたらす、請求項３５に記載の方法。

【請求項61】

前記発現レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下方調節をもたらす、請求項３５に記載の方法。

【請求項62】

前記複合体が、前記筋遺伝子における前記標的遺伝子の前記メチル化レベルの前記改変をもたらす、請求項３５に記載の方法。

【請求項63】

前記メチル化レベルの前記改変が、前記標的遺伝子の下方調節をもたらす、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記ヌクレアーゼが、不活性化ヌクレアーゼである、請求項３５に記載の方法。

【請求項65】

筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するためのシステムであって、
遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分であって、前記異種アクチュエーター部分が、前記筋細胞における前記標的遺伝子と複合体を形成することが可能であり、前記遺伝子調節因子が、前記筋細胞における前記標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルを改変することが可能である、異種アクチュエーター部分
を含み、
前記複合体が形成されると、前記筋細胞における前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが少なくとも約２日間持続する、システム。

【請求項66】

前記標的遺伝子の前記持続性の改変された発現レベルおよび／または前記メチル化レベルが、前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％を維持することによって特徴付けられる、請求項６５に記載のシステム。

【請求項67】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、または２か月間持続する、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項68】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルが、前記標的遺伝子の発現レベルの減少である、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項69】

前記標的遺伝子の前記改変されたメチル化レベルが、前記標的遺伝子のメチル化度の増加である、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項70】

前記遺伝子調節因子が、エピジェネティック調節因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項71】

前記エピジェネティック調節因子がクロマチン修飾因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項72】

前記エピジェネティック調節因子が、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項73】

前記エピジェネティック調節因子が、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項74】

前記エピジェネティック調節因子が、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項75】

前記エピジェネティック調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項76】

前記エピジェネティック調節因子が、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項77】

前記エピジェネティック調節因子が、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを構成する、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項78】

前記遺伝子調節因子が、複数の異なる遺伝子調節因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項79】

前記異種アクチュエーター部分を前記標的遺伝子に向けて、前記複合体を形成することが可能であるガイド核酸分子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項80】

前記異種アクチュエーター部分が筋調節遺伝子の第１の部分と複合体を形成することが可能であり、前記システムが追加の遺伝子調節因子に結合した追加の異種アクチュエーター部分をさらに含み、前記追加の異種アクチュエーター部分が、前記筋調節遺伝子の第２の部分と複合体を形成することが可能である、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項81】

前記追加の異種アクチュエーター部分を、前記筋調節遺伝子の第２の部分に向けることが可能な追加のガイド核酸分子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項82】

前記標的遺伝子が転写因子である、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項83】

前記標的遺伝子が、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内に存在する、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項84】

前記標的遺伝子がＤＵＸ４をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項85】

前記標的遺伝子がＣ９ｏｒｆ７２ではない、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項86】

前記筋細胞が骨格筋細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項87】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、エンドヌクレアーゼを含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項88】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項89】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、ｄＣａｓタンパク質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項90】

前記ガイド核酸分子または前記追加のガイド核酸分子が、ガイドＲＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項91】

筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するための方法であって、
（ａ）前記筋細胞を、遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分と接触させることであって、前記異種アクチュエーター部分が前記筋細胞における前記標的遺伝子と複合体を形成することが可能であり、および前記遺伝子調節因子が、前記筋細胞における前記標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルを改変することが可能であること；ならびに
（ｂ）前記複合体が形成されると、前記筋細胞における前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルを少なくとも約２日間持続させること
を含む方法。

【請求項92】

前記標的遺伝子の前記持続性の改変された発現レベルおよび／または前記メチル化レベルが、前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％を維持することによって特徴付けられる、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、または２か月間持続する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記標的遺伝子の前記改変された発現レベルが、前記標的遺伝子の発現レベルの減少である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記標的遺伝子の前記改変されたメチル化レベルが、前記標的遺伝子のメチル化度の増加である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記遺伝子調節因子がエピジェネティック調節因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記エピジェネティック調節因子が、クロマチン修飾因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記エピジェネティック調節因子が、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記エピジェネティック調節因子が、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記エピジェネティック調節因子が、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記エピジェネティック調節因子が、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記エピジェネティック調節因子が、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記エピジェネティック調節因子が、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記遺伝子調節因子が、複数の異なる遺伝子調節因子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記筋細胞を、前記異種アクチュエーター部分を前記標的遺伝子に向けて、前記複合体を形成することが可能であるガイド核酸分子と接触させることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記異種アクチュエーター部分が前記筋調節遺伝子の第１の部分と複合体を形成することが可能であり、前記方法が、前記筋細胞を、追加の遺伝子調節因子に結合した追加の異種アクチュエーター部分と接触させることをさらに含み、前記追加の異種アクチュエーター部分が、前記筋調節遺伝子の第２の部分と複合体を形成することが可能である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記筋細胞を、前記追加の異種アクチュエーター部分を前記筋調節遺伝子の前記第２の部分に向けることが可能な前記追加のガイド核酸分子と接触させることをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記標的遺伝子が転写因子である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記標的遺伝子が、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内に存在する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記標的遺伝子がＤＵＸ４をコードする、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記標的遺伝子がＣ９ｏｒｆ７２ではない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記筋細胞が骨格筋細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、エンドヌクレアーゼを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記異種アクチュエーター部分または前記追加の異種アクチュエーター部分が、ｄＣａｓタンパク質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記ガイド核酸分子または前記追加のガイド核酸分子が、ガイドＲＮＡ分子を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１１，７９１号の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景
１つまたは複数の遺伝子の異常発現は、疾患または状態をもたらし得る。一部の例では、対象の筋細胞における胚転写因子の異常発現は、筋ジストロフィーをもたらし得る。例えば、筋細胞における転写因子の異常発現（例えば、骨格筋細胞におけるＤＵＸ４の異常発現）は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）をもたらし得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

概要
細胞における標的遺伝子の異常発現を一過性に改変しても、標的遺伝子の異常発現によって現れる疾患を処置または治癒するために十分ではない場合がある。このように、標的遺伝子の異常発現を改変し、長期間にわたって標的遺伝子の改変された発現レベルを維持するためのシステムおよび方法がなおも実質的に必要である。

【0004】

一態様では、本開示は、筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するためのシステムであって、約９００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有するヌクレアーゼを含む異種ポリペプチド；および異種ポリペプチドと複合体を形成するように構成されたガイド核酸分子であって、筋細胞におけるＤ４Ｚ４リピートアレイでのまたはそれに隣接する標的ポリヌクレオチド配列に対して特異的結合を示すガイド核酸分子を含み、複合体が形成されると、複合体が、標的ポリヌクレオチド配列に結合して、筋細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変をもたらすことが可能であり、標的遺伝子がＤ４Ｚ４リピートアレイ内に存在する、システムを提供する。

【0005】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、複合体が形成されると、筋細胞における標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約２日間持続する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、２週間、４週間、または２か月間持続する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約１７日間持続する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約１８日間持続する。

【0006】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、筋細胞は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有するまたは有することが疑われる対象に存在する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子はＤｕｘ４である。

【0007】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、約８００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、約７５０アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する。

【0008】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１またはその改変バリアントである。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号４３のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号４４のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0009】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、転写調節因子をさらに含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－ＬまたはＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、複数の異なる転写調節因子を含む。

【0010】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変は、標的遺伝子の下流の遺伝子の下方調節をもたらし、下流の遺伝子は、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＴＲＩＭ４３からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む。

【0011】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変は、筋細胞においてアポトーシスマーカーの下方調節をもたらす。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、アポトーシスマーカーは、カスパーゼ３を含む。

【0012】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、複合体は、筋遺伝子における標的遺伝子の発現レベルの改変をもたらす。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、発現レベルの改変は、標的遺伝子の下方調節をもたらす。

【0013】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、複合体は、筋遺伝子における標的遺伝子のメチル化レベルの改変をもたらす。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、メチル化レベルの改変は、標的遺伝子の下方調節をもたらす。

【0014】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、非活性化ヌクレアーゼである。

【0015】

別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるシステムのいずれかを含む組成物を提供する。

【0016】

別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるシステムのいずれかまたは組成物のいずれかを含むウイルスベクターを提供する。

【0017】

本明細書に開示されるウイルスベクターのいずれかの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはアデノウイルスを含む。本明細書に開示されるウイルスベクターのいずれかの一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型ＲＨ７４ ＡＡＶを含む。

【0018】

別の態様では、本開示は、筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するための方法であって、（ａ）筋細胞を、（ｉ）約９００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有するヌクレアーゼを含む異種ポリペプチド、および（ｉｉ）筋細胞においてＤ４Ｚ４リピートアレイでのまたはそれに隣接する標的ポリヌクレオチド配列に対して特異的結合を示すガイド核酸分子を含む複合体と接触させること；ならびに（ｂ）接触させると、標的遺伝子と複合体との結合が、筋細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変をもたらすことを含み、標的遺伝子がＤ４Ｚ４リピートアレイ内に存在する、方法を提供する。

【0019】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、複合体が形成されると、筋細胞における標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約２日間持続する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、２週間、４週間、または２か月間持続する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約１７日間持続する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約１８日間持続する。

【0020】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、接触させることは、複合体を含む組成物を注射することを必要とする対象に複合体を含む組成物を注射することを含み、対象は顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有するまたは有することが疑われる。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子はＤｕｘ４である。

【0021】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、約８００アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、約７５０アミノ酸未満またはそれに等しい長さを有する。

【0022】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１またはその改変バリアントである。

【0023】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号４３のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、配列番号４４のポリペプチド配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0024】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、異種ポリペプチドは、転写調節因子をさらに含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＤＮＭＴ－ＬまたはＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、転写調節因子は、複数の異なる転写調節因子を含む。

【0025】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変は、標的遺伝子の下流の遺伝子の下方調節をもたらし、下流の遺伝子は、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＴＲＩＭ４３からなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む。

【0026】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルの改変は、筋細胞におけるアポトーシスマーカーの下方調節をもたらす。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、アポトーシスマーカーはカスパーゼ３を含む。

【0027】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、複合体は、筋細胞における標的遺伝子の発現レベルの改変をもたらす。

【0028】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、発現レベルの改変は、標的遺伝子の下方調節をもたらす。

【0029】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、複合体は、筋遺伝子における標的遺伝子のメチル化レベルの改変をもたらす。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、メチル化レベルの改変は、標的遺伝子の下方調節をもたらす。

【0030】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、非活性化ヌクレアーゼである。

【0031】

別の態様では、本開示は、筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するためのシステムであって、遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分を含み、異種アクチュエーター部分が、筋細胞における標的遺伝子と複合体を形成することが可能であり、遺伝子調節因子が、筋細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルを改変することが可能であり、複合体が形成されると、筋細胞における標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルが少なくとも約２日間持続するシステムを提供する。

【0032】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の持続性の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％を維持することによって特徴付けられる。

【0033】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、または２か月間持続する。

【0034】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルは、標的遺伝子の発現レベルの減少である。

【0035】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変されたメチル化レベルは、標的遺伝子のメチル化度の増加である。

【0036】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、遺伝子調節因子は、エピジェネティック調節因子を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、クロマチン修飾因子を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子（epigenetic regular）は、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを構成する。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、遺伝子調節因子は、複数の異なる遺伝子調節因子を含む。

【0037】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、システムは、異種アクチュエーター部分を標的遺伝子に向けて、複合体を形成することを可能にするガイド核酸分子をさらに含む。

【0038】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分は、筋調節遺伝子の第１の部分と複合体を形成することが可能であり、システムは、追加の遺伝子調節因子に結合した追加の異種アクチュエーター部分をさらに含み、追加の異種アクチュエーター部分は、筋調節遺伝子の第２の部分と複合体を形成することが可能である。

【0039】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、システムは、追加の異種アクチュエーター部分を筋調節遺伝子の第２の部分に向けることが可能な追加のガイド核酸分子をさらに含む。

【0040】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は転写因子である。

【0041】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内にある。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子はＤＵＸ４をコードする。

【0042】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｃ９ｏｒｆ７２ではない。

【0043】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、筋細胞は骨格筋細胞である。

【0044】

本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分または追加の異種アクチュエーター部分は、エンドヌクレアーゼを含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分または追加の異種アクチュエーター部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分または追加の異種アクチュエーター部分は、ｄＣａｓタンパク質を含む。本明細書に開示されるシステムのいずれかの一部の実施形態では、ガイド核酸分子または追加のガイド核酸分子は、ガイドＲＮＡ分子を含む。

【0045】

別の態様では、本開示は、筋細胞における標的遺伝子の異常発現を調節するための方法であって、（ａ）筋細胞を、遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分と接触させることであって、異種アクチュエーター部分が、筋細胞における標的遺伝子と複合体を形成することが可能であり、遺伝子調節因子が、筋細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはメチル化レベルを改変することが可能であること；ならびに（ｂ）複合体が形成されると、筋細胞における標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルを少なくとも約２日間持続させることを含む、方法を提供する。

【0046】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の持続性の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％を維持することによって特徴付けられる。

【0047】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルは、少なくとも約３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、４週間、または２か月間持続する。

【0048】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変された発現レベルは、標的遺伝子の発現レベルの減少である。

【0049】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子の改変されたメチル化レベルは、標的遺伝子のメチル化度の増加である。

【0050】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子調節因子は、エピジェネティック調節因子を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、クロマチン修飾因子を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、少なくとも１つのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、（ｉ）ＤＮＭＴ－ＡまたはＤＮＭＴ－Ｌ、および（ｉｉ）ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子は、ＤＮＭＴ－Ａ、ＤＮＭＴ－Ｌ、およびＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、エピジェネティック調節因子（epigenetic regular）は、ＫＲＡＢまたはＫＲＡＢのバリアントを構成する。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子調節因子は、複数の異なる遺伝子調節因子を含む。

【0051】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、筋細胞を、異種アクチュエーター部分を標的遺伝子へと向けることが可能なガイド核酸分子と接触させて、複合体を形成させることをさらに含む。

【0052】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分は、筋調節遺伝子の第１の部分と複合体を形成することが可能であり、方法は、筋細胞を、追加の遺伝子調節因子に結合した追加の異種アクチュエーター部分と接触させることをさらに含み、追加の異種アクチュエーター部分は、筋調節遺伝子の第２の部分と複合体を形成することが可能である。

【0053】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、方法は、筋細胞を、追加の異種アクチュエーター部分を筋調節遺伝子の第２の部分へと向けることが可能な追加のガイド核酸分子と接触させることをさらに含む。

【0054】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は転写因子である。

【0055】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内にある。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は、ＤＵＸ４をコードする。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、標的遺伝子は、Ｃ９ｏｒｆ７２ではない。

【0056】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、筋細胞は骨格筋細胞である。

【0057】

本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分、または追加の異種アクチュエーター部分は、エンドヌクレアーゼを含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分、または追加の異種アクチュエーター部分は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、異種アクチュエーター部分、または追加の異種アクチュエーター部分は、ｄＣａｓタンパク質を含む。本明細書に開示される方法のいずれかの一部の実施形態では、ガイド核酸分子または追加のガイド核酸分子は、ガイドＲＮＡ分子を含む。

【0058】

本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示して説明する以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなる。認識されるように、本開示は、全て本開示から逸脱することなく、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明白な点で改変することが可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であって、限定的ではないと見なされるべきである。

【0059】

参照による組み入れ
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されているのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0060】

本開示の新規特色を、添付の特許請求の範囲に詳細に記載する。本開示の特色および利点の良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られる。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】図１は、ＤＵＸ４をコードするＤ４Ｚ４リピートアレイ内の２つのＣｐＧアイランド間の異なる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ランク＃１～ランク＃９１）を提供する。

【0062】

【図2】図２は、ＤＵＸ４をコードするＤ４Ｚ４リピートアレイ内の様々なガイドＲＮＡ分子標的ポリヌクレオチド配列（例えば、ランク＃１～ランク＃９１）と複合体を形成した遺伝子調節因子（例えば、ｄＣａｓ－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ）に結合した異種アクチュエーター部分によって標的細胞集団（例えば、リンパ芽球）におけるＤＵＸ４発現の調節を提供する。

【0063】

【図3-1】図３Ａは、不死化患者由来ヒトＦＳＨＤ骨格筋芽細胞（ＳｋＭ）（１２ＡＢＩＣ／１２Ａおよび１５ＡＢＩＣ／１５Ａ）におけるＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子の遺伝子発現を示す。ＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子の遺伝子発現を、１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ未分化細胞、２日間分化後の１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞、ならびに７日間分化後の１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞において測定する。グラフ上の各々の灰色の階調は、右の凡例に対応する異なる遺伝子の遺伝子発現を示す。図３Ｂは、２日間分化後のその健康な同胞対照筋芽細胞１２ＵＢＩＣおよび１５ＶＢＩＣ（左のカラム）とそれぞれ比較したＦＳＨＤ筋芽細胞１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ（右のカラム）におけるアポトーシス細胞の割合を示す。左の画像上の白い点は、アポトーシス細胞を表す。右のグラフは左側の画像で示される２日間分化後の１２ＡＢＩＣ、１５ＡＢＩＣ、１２ＵＢＩＣ、および１５ＶＢＩＣ細胞培養におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。ＤＡＰＩ染色を使用して、核を染色する。図３Ｃは、７日間分化後の１２ＡＢＩＣ、１５ＡＢＩＣ、１２ＵＢＩＣ、および１５ＶＢＩＣ細胞におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。アポトーシス細胞のパーセンテージを分化の０日目、１日目、２日目、および７日目に測定する。図３Ｄは、７日間分化後の１２ＡＢＩＣ、１５ＡＢＩＣ、１２ＵＢＩＣ、および１５ＶＢＩＣ細胞におけるＭＹＨＣの発現を示す。ミオシン重鎖（ＭＹＨＣ）は、筋細胞分化のマーカーである。白色の点は、ＭＹＨＣの発現を示す。図３Ｅは、７日間分化後の１２ＡＢＩＣ、１５ＡＢＩＣ、１２ＵＢＩＣ、および１５ＶＢＩＣ細胞におけるＭＹＯＧ、ＭＹＨ２、およびＭＹＭＫの発現レベルを示す。ＭＹＯＧは、骨格筋分化を調節する筋原性調節因子であり、ＭｙｏＭａｋｅｒ（ＭＹＭＫ）は、筋細胞分化のマーカーである。ＤＡＰＩ染色を使用して、核を染色する。１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞の発現レベルを分化の２日目および７日目に測定する。１２Ａ ＵＤおよび１５Ａ ＵＤ：未分化の増殖する対照筋芽細胞。暗灰色の棒グラフは、ＭＹＯＧ発現レベルを示し、薄灰色の棒グラフは、ＭＹＨ２発現レベルを示し、灰色の棒グラフは、ＭＹＭＫ発現レベルを示す。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【図3-5】同上。

【0064】

【図4】図４は、Ｄ４Ｚ４リピート領域に関連する複数のｇＲＮＡのデザインを描写する。複数のＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡは、ＤＺ４Ｚリピート領域を超えて広がるように設計される。互いに関連するＤＺ４Ｚリピート領域およびＤＵＸ４遺伝子の位置を、図４の下部に示す。新たに設計されたｇＲＮＡを、図４の上部に示す。

【0065】

【図5】図５は、Ｃａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターベクターデザインを示す。Ｃａｓ１２ｆバリアント、ＫＲＡＢドメイン、およびＤＮＭＴ３Ｌドメインの発現は、筋特異的プロモーターＣＫ８ｅの制御下にある。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって駆動される足場を有するｓｇＲＮＡスペーサー配列の発現は、ヒトＵ６ｇプロモーターの制御下にある。ベクターはさらに、改変ＷＰＲＥおよびポリアデニル化調節配列を含む。

【0066】

【図6-1】図６Ａは、７８個のｇＲＮＡを１２ＡＢＩＣ筋芽細胞にヌクレオフェクト後にＣａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターを安定に発現する１２ＡＢＩＣ ＦＳＨＤ筋芽細胞におけるＤＵＸ４の相対的発現レベルを示す。ヌクレオフェクション後、細胞を分化条件で７日間培養した後、ＤＵＸ４の遺伝子発現を測定する。試験した７８個のｇＲＮＡをｘ軸に記載し、ｙ軸は、ＤＵＸ４の相対的倍数発現を表す。ＤＵＸ４の発現レベルを、対照遺伝子ＨＰＲＴ１の発現によって正規化した。図６Ｂは、７８個のｇＲＮＡを１２ＡＢＩＣ筋芽細胞にヌクレオフェクト後にＣａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターを安定に発現する１２ＡＢＩＣ ＦＳＨＤ筋芽細胞におけるＤＵＸ４の相対的発現レベルを示す。ヌクレオフェクション後、細胞を、分化条件で７日間培養後、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２の遺伝子発現を測定する。

【図6-2】同上。

【0067】

【図7-1】図７Ａは、６個のｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターをトランスフェクトした不死化患者由来ＦＳＨＤ筋芽細胞における、ＤＵＸ４ならびにＤＵＸ４標的遺伝子、ＤＢＥＴ／ＤＵＸ４、ＭＢＤ３Ｌ２、およびＴＲＩＭ４８の抑制を示す。Ｃａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターは、Ｃａｓ１２ｆバリアント、ＫＲＡＢドメイン、およびＤＮＭＴ－ＫＬａドメインを発現する。６個のｓｇＲＮＡのうちの１つは、ＤＺ４Ｚリピート領域を標的としなかった対照ｓｇＲＮＡ（Ｅｍｐｔｙ／ｔｒｃｒ）である。ＭＹＯＧの発現レベルを細胞において測定し、ＤＵＸ４ ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞の分化能が対照ｓｇＲＮＡトランスフェクト筋芽細胞と類似であるかどうかをアッセイする。ＤＵＸ４、ＤＵＸ４標的遺伝子、およびＭＹＯＧの発現レベルをトランスフェクション後１７日目に測定する。図７Ｂは、６個のｇＲＮＡおよびＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターをトランスフェクトした不死化患者由来ＦＳＨＤ筋芽細胞における、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子、ＤＢＥＴ／ＤＵＸ４、ＭＢＤ３Ｌ２、およびＴＲＩＭ４８の抑制を示す。Ｃａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターは、Ｃａｓ１２ｆバリアント、ＫＲＡＢドメイン、およびＤＮＭＴ－ＫＬｂドメインを発現する。６つのｓｇＲＮＡの１つは、ＤＺ４Ｚリピート領域を標的としなかった対照ｓｇＲＮＡ（空）である。ＭＹＯＧの発現レベルを細胞において測定し、ＤＵＸ４ ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞の分化能が、対照ｓｇＲＮＡトランスフェクト筋芽細胞と類似であるかどうかをアッセイする。ＤＵＸ４、ＤＵＸ４標的遺伝子、およびＭＹＯＧの発現レベルを、トランスフェクションの１８日後に測定する。

【図7-2】同上。

【0068】

【図8-1】図８Ａおよび８Ｂは、Ｃａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターおよびＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡをトランスフェクトしたＦＳＨＤ患者由来筋芽細胞のアポトーシスレベルを示す。アポトーシス陽性細胞のパーセンテージを、トランスフェクション後２日間分化させた後に測定する。図８Ａの画像は、対照１２ＵＢＩＣ細胞ならびにＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターおよびＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡをトランスフェクトした１２ＡＢＩＣ細胞におけるアポトーシス細胞の割合を示す。白色の点は、アポトーシス細胞を表す。図８Ｂのグラフは、左の画像において測定されたアポトーシス細胞のパーセンテージ、ならびにＤＵＸ４標的化ｇＲＮＡまたはＤＵＸ４を標的としない対照ｇＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした１２ＡＢＩＣ細胞におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを示す。ＤＡＰＩ染色を使用して核を染色する。

【図8-2】同上。

【0069】

【図9】図９は、ｅｘ ｖｉｖｏ ＦＳＨＤモデルのワークフローを示す。ｅｘ ｖｉｖｏモデルは、不死化した健康な同胞対照細胞およびＦＳＨＤ骨格筋芽細胞を培養し、その後細胞を３Ｄ組織へと操作する。３Ｄ組織を、対照ＡＡＶまたはＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターベクターを有するＡＡＶのいずれかによって処理する。次に、３Ｄ組織を、３Ｄ組織形態および遺伝子発現プロファイルを測定することに加え、機械力、強縮力、および疲労の表現型の差に関して試験する。

【0070】

【図10】図１０は、ｉｎ ｖｉｖｏ異種移植片モデルのワークフローを示す。ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、マウスの脚を放射線照射およびＴＡ筋カルジオトキシンによって処置することから始まり、ヒト筋芽細胞のマウス脚への移植のために準備する。移植後、マウスを、対照ＡＡＶまたはＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターベクターを有するＡＡＶのいずれかによって処置する。指定された時点で、マウスを安楽死させ、異種移植片および組織試料を分析のために収集する。収集した異種移植片を固定し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色する。残りの組織を遺伝子発現アッセイのため、ならびにマウス内のＡＡＶ指向性を決定するために使用する。

【発明を実施するための形態】

【0071】

詳細な説明
１つまたは複数の遺伝子の異常発現は、疾患または状態をもたらし得る。異常発現は、遺伝子（複数可）の異常に低い発現レベルによって特徴付けることができる。あるいは、異常発現は、遺伝子（複数可）の異常に高い発現レベルによって特徴付けることができる。一部の例では、遺伝子（複数可）を、遺伝子改変して（例えば、エンドヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素の作用を介して）異常発現を逆転させることができる（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の処置）。あるいは、異常発現を、目的のそのような遺伝子（複数可）を遺伝子改変することなく、例えば遺伝子エフェクターによって遺伝子（複数可）を標的化することによって（例えば、遺伝子エフェクターに結合した非活性化されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素）一過性に改変することができる。細胞における標的遺伝子の異常発現を一過性に改変しても、標的遺伝子の異常発現によって現れる疾患を処置または治癒するために十分ではない場合がある。このように、一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子の改変された発現レベルが長期間にわたって持続し得るように、標的遺伝子の異常発現を改変するためのシステムおよび方法を提供する。

【0072】

標的遺伝子の異常発現の改変

【0073】

本開示は、細胞（例えば、筋細胞）における標的遺伝子の異常発現を調節するための組成物、システム、および方法を提供する。例えば、標的遺伝子は、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ内に存在し得る。標的遺伝子は、ＤＵＸ４の少なくとも一部をコードし得る。本明細書に開示される組成物、システム、および方法は、少なくとも１つの異種ポリペプチド（例えば、必要に応じてガイド核酸分子などの異種ポリヌクレオチドと共に異種アクチュエーター部分）を利用して、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）を改変することができる。例えば、本明細書に開示される組成物、システム、および方法は、異種遺伝子エフェクターまたは調節因子（例えば、遺伝子アクチュエーター、遺伝子リプレッサー等）に動作可能に連結した（例えば、共有結合または非共有結合により結合した）異種アクチュエーター部分を利用して、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベルを改変することができる。

【0074】

一部の例では、細胞は、筋細胞であり得る。本明細書に開示される筋細胞は、任意の発生段階にある任意の分類の筋細胞であり得る。筋細胞は、未分化筋細胞（例えば、単核球、例えば筋幹細胞、筋サテライト細胞、筋芽細胞等）を含み得る。あるいはまたは加えて、筋細胞は、分化した筋細胞（例えば、多核筋細胞、例えば筋管）を含み得る。筋細胞は、骨格筋細胞、心筋細胞、または平滑筋細胞であり得る。例えば、骨格筋細胞は、初代培養筋芽細胞（例えば、不死化初代培養筋芽細胞株）であり得る。一部の例では、細胞は非筋細胞、例えばリンパ芽球であり得る。

【0075】

一部の例では、標的遺伝子は、本明細書に開示される細胞の４番染色体に存在し得る。一部の例では、標的遺伝子は、細胞の１０番染色体、例えば細胞の１０番染色体のｑ（長）腕の遠位部分に存在し得る。

【0076】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変の前に、標的遺伝子の異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれより高い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）によって特徴付けることができる。異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより多くて約５００％、４００％、３００％、２００％、１５０％、１００％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満高い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）によって特徴付けることができる。

【0077】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変前に、標的遺伝子の異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９９％、またはそれより多く低い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）によって特徴付けることができる。異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより多くて約１００％、７０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満低い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）によって特徴付けることができる。

【0078】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変の前に、標的遺伝子の異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれより多く長い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間によって特徴付けることができる。異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより多くて約５００％、４００％、３００％、２００％、１５０％、１００％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満長い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間によって特徴付けることができる。

【0079】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変の前に、標的遺伝子の異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９９％、またはそれより多く短い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間によって特徴付けることができる。異常発現は、対照細胞（例えば、健康な対象の健康な細胞）のものより多くて約１００％、７０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満短い標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間によって特徴付けることができる。

【0080】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子の異常発現の改変は、対照（例えば、改変を有しない）と比較して少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれより大きい標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の増加によって特徴付けることができる。標的遺伝子の異常発現の改変は、対照と比較して多くて約５００％、４００％、３００％、２００％、１５０％、１００％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の増加によって特徴付けることができる。

【0081】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子の異常発現の改変は、対照（例えば、改変を有しない）と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９９％、またはそれより大きい標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の減少によって特徴付けることができる。標的遺伝子の異常発現の改変は、多くて約１００％、７０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の減少によって特徴付けることができる。

【0082】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子の異常発現の改変は、対照（例えば、改変を有しない）と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれより大きい標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間の増加によって特徴付けることができる。標的遺伝子の異常発現の改変は、対照と比較して多くて約５００％、４００％、３００％、２００％、１５０％、１００％、５０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間の増加によって特徴付けることができる。

【0083】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子の異常発現の改変は、対照（例えば、改変を有しない）と比較して、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７０％、９９％、またはそれより大きい標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間の減少によって特徴付けることができる。標的遺伝子の異常発現の改変は、多くて約１００％、７０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、またはそれ未満の標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）の持続時間の減少によって特徴付けることができる。

【0084】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子（例えば、異常に発現された標的遺伝子）の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、少なくとも約１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、２か月間、３か月間、４か月間、５か月間、６か月間、７か月間、８か月間、９か月間、１０か月間、１１か月間、１２か月間、２年間、３年間、４年間、５年間、またはそれより長く持続し得る。本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子（例えば、異常に発現された標的遺伝子）の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、多くて約５年間、４年間、３年間、２年間、１２か月間、１１か月間、１０か月間、９か月間、８か月間、７か月間、６か月間、５か月間、４か月間、３か月間、２か月間、４週間、３週間、２週間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日、またはそれ未満持続し得る。

【0085】

本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子（例えば、異常に発現された標的遺伝子）の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、少なくとも約１回の細胞分裂、少なくとも約２回の細胞分裂、少なくとも約３回の細胞分裂、少なくとも約４回の細胞分裂、少なくとも約５回の細胞分裂、少なくとも約６回の細胞分裂、少なくとも約７回の細胞分裂、少なくとも約８回の細胞分裂、少なくとも約９回の細胞分裂、少なくとも約１０回の細胞分裂、少なくとも約１５回の細胞分裂、少なくとも約２０回の細胞分裂、少なくとも約２５回の細胞分裂、少なくとも約３０回の細胞分裂、少なくとも約４０回の細胞分裂、少なくとも約５０回の細胞分裂、または少なくとも約１００回の細胞分裂の間持続し得る。本明細書に開示される標的遺伝子の改変後、標的遺伝子（例えば、異常に発現された標的遺伝子）の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、多くて約１００回の細胞分裂、多くて約５０回の細胞分裂、多くて約４０回の細胞分裂、多くて約３０回の細胞分裂、多くて約２５回の細胞分裂、多くて約２０回の細胞分裂、多くて約１５回の細胞分裂、多くて約１０回の細胞分裂、多くて約９回の細胞分裂、多くて約８回の細胞分裂、多くて約７回の細胞分裂、多くて約６回の細胞分裂、多くて約５回の細胞分裂、多くて約４回の細胞分裂、多くて約３回の細胞分裂、多くて約２回の細胞分裂、または多くて約１回の細胞分裂の間持続し得る。

【0086】

本明細書で開示される場合、エピジェネティック改変の非限定的な例としては、メチル化、アセチル化、リン酸化、ＡＤＰ－リボシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、ヒストン構造の改変（例えば、ＡＴＰ加水分解依存的プロセスを介して）が挙げられ得る。例えば、エピジェネティック改変は、１つまたは複数の標的遺伝子の改変されたメチル化レベルをもたらし得る。

【0087】

本明細書で開示される場合、標的遺伝子の持続性の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を維持することによって特徴付けることができる。標的遺伝子の持続性の改変された発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベル（例えば、メチル化レベル）は、標的遺伝子の改変された発現レベルおよび／またはメチル化レベルの多くて約１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％を維持することによって特徴付けることができる。

【0088】

本明細書に開示されるシステム、組成物、および方法を使用して、対象の疾患（例えば、筋ジストロフィー、例えば顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ））を処置または回復させることができる。

【0089】

異種ポリペプチド

【0090】

本明細書に開示される異種ポリペプチドは、単独でまたは１つまたは複数の共作用剤（co-agent）、例えば異種ポリヌクレオチド（例えば、ガイド核酸）と組み合わせて、本明細書に開示されるように標的ポリヌクレオチド配列に特異的に結合して、標的細胞における標的遺伝子（例えば、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ）の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルをモジュレートするように構成することができる。標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子に（例えば、標的遺伝子内に）存在し得る。あるいは、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子に隣接し得る。例えば、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の末端（例えば、５’末端または３’末端）に隣接し得る。標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の末端から少なくとも約５核酸塩基、少なくとも約１０核酸塩基、少なくとも約２０核酸塩基、少なくとも約３０核酸塩基、少なくとも約４０核酸塩基、少なくとも約５０核酸塩基、少なくとも約１００核酸塩基、少なくとも約１５０核酸塩基、少なくとも約２００核酸塩基、少なくとも約２５０核酸塩基、少なくとも約３００核酸塩基、少なくとも約４００核酸塩基、少なくとも約５００核酸塩基、少なくとも約１，０００核酸塩基、少なくとも約１，５００核酸塩基、少なくとも約２，０００核酸塩基、少なくとも約３，０００核酸塩基、少なくとも約４，０００核酸塩基、または少なくとも約５，０００核酸塩基離れ得る。標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の末端から、多くて約５，０００核酸塩基、多くて約４，０００核酸塩基、多くて約３，０００核酸塩基、多くて約２，０００核酸塩基、多くて約１，５００核酸塩基、多くて約１，０００核酸塩基、多くて約５００核酸塩基、多くて約４００核酸塩基、多くて約３００核酸塩基、多くて約２００核酸塩基、多くて約１５０核酸塩基、多くて約１００核酸塩基、多くて約５０核酸塩基、多くて約４０核酸塩基、多くて約３０核酸塩基、多くて約２０核酸塩基、多くて約１０核酸塩基、または多くて約５核酸塩基離れ得る。

【0091】

理論に拘束されることを望まないが、標的ポリヌクレオチド配列が、標的遺伝子内に存在しない場合、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の少なくとも一部（例えば、標的遺伝子のプロモーター配列）と相互作用することができ（例えば、直接または間接的結合を介して）、それによって少なくとも異種ポリペプチドによる（例えば、本明細書に開示される異種ポリペプチドおよび異種ポリヌクレオチドを含む複合体による）標的ポリヌクレオチド配列の結合または標的化は、標的遺伝子の少なくとも一部（例えば、プロモーター配列）を標的として、細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーションをもたらすことができる。

【0092】

一部の例では、標的ポリヌクレオチド配列は、複数の標的ポリヌクレオチド配列を含み得る。複数の標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子内に存在し得る。あるいは複数の標的ポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示される標的遺伝子の外部であるが隣接し得る。なお別の代替では、複数の標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子内（例えば、Ｄ４Ｚ４リピートドメイン内）の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の外部であるが隣接する少なくとも１つの追加の標的ポリヌクレオチド配列を含み得る。そのような場合、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列および少なくとも１つの追加の標的ポリヌクレオチド配列の両方を標的化することは、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列および少なくとも１つの追加の標的ポリヌクレオチド配列の１つのみを標的化する場合と比較して、より大きい効果（例えば、標的遺伝子の発現および／またはエピジェネティックレベルのより大きい程度のモジュレーション）（例えば、少なくとも０．１倍、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、またはそれより大きい）を生じ得る。

【0093】

本明細書に開示される異種ポリペプチドは、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクター（例えば、本開示の複合体中の遺伝子エフェクターおよび／または別の構成要素を含む細胞に対して異種である遺伝子エフェクター）を含み得る。異種遺伝子エフェクターは、例えば遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを活性化する、抑制する、上方調節する、下方調節する、または安定化する標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現をモジュレートすることができるか、またはモジュレートするための候補であるドメインを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、複合体に存在する別の構成要素、例えばガイド部分（例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼおよび／またはガイド核酸）に関して異種であり得る。一部の例では、異種遺伝子エフェクターは、それらが導入される宿主細胞に関して異種であり得る。

【0094】

異種遺伝子エフェクターは、任意の好適な起源、例えばヒトタンパク質、ウイルスタンパク質、または本明細書に開示される他のタンパク質からのアミノ酸配列であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、核に主に局在するタンパク質、例えばヒト核プロテオームのメンバーからの配列であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、１つまたは複数の天然のアミノ酸残基であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、１つまたは複数の合成アミノ酸残基であり得るか、またはそれを含み得る。

【0095】

異種遺伝子エフェクターは、哺乳動物タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ヒトタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ウイルスタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、非ヒト霊長類タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、非ヒト哺乳動物タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、非齧歯類哺乳動物タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、植物タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ブタタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、ウサギタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、イヌタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、トリタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、爬虫類タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、細菌タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、古細菌タンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。

【0096】

例えば、本明細書に開示される異種遺伝子エフェクターのアミノ酸配列は、細菌タンパク質（例えば、古細菌に由来し得る）に由来しなくてもよく、由来する必要はない。理論に拘束されることを望まないが、それを必要とする対象は、組成物が（ｉ）対象において細菌性の刺激を誘導しないように、および／または（ｉｉ）対象において細菌性の免疫応答を誘発しないように、非細菌タンパク質由来の異種遺伝子エフェクターを含む組成物によって処置され得る。

【0097】

異種アクチュエーター部分は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）を含み得る。例えば、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質であり得る。ヌクレアーゼは、閾値長さ未満である長さを有し得る。閾値長さは、多くて約１，０００アミノ酸、多くて約９５０アミノ酸、多くて約９００アミノ酸、多くて約８５０アミノ酸、多くて約８００アミノ酸、多くて約７５０アミノ酸、多くて約７００アミノ酸、多くて約６５０アミノ酸、多くて約６００アミノ酸、多くて約５５０アミノ酸、多くて約５００アミノ酸、多くて約４５０アミノ酸、多くて約４００アミノ酸、多くて約３５０アミノ酸、または多くて約３００アミノ酸であり得る。閾値長さは、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、少なくとも約８５０アミノ酸、少なくとも約９００アミノ酸、少なくとも約９５０アミノ酸、または少なくとも約１０００アミノ酸であり得る。

【0098】

理論に拘束されることを望まないが、閾値長さ未満であるヌクレアーゼサイズを使用することは、閾値長さより大きいサイズを有する対照ヌクレアーゼを使用する場合に対して１つまたは複数の利点を有し得る。限定的なサイズ（例えば、ヌクレアーゼを捕捉するために限定的な物理的サイズ、または限定的な発現カセットサイズ、例えばウイルスゲノム）を有する送達媒体を使用する場合は、１つまたは複数の（on or more）共作用剤、例えば１つまたは複数の遺伝子調節因子（例えば、転写因子）および／または１つまたは複数の異種ポリヌクレオチド（例えば、１つまたは複数のガイド核酸分子）のために十分な余地（または発現カセット内の十分なスペース）を残すことができる。あるいはまたは加えて、閾値サイズ未満またはそれに等しいサイズを有するヌクレアーゼを使用することは、閾値サイズより大きいサイズを有する対照ヌクレアーゼが標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーションに及ぼす効果と比較して、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーションに対してより大きい効果を誘発することができる。

【0099】

一部の例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼ（例えば、閾値未満または閾値に等しいサイズを有する）による標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーション（例えば、増加または減少）の程度は、対照ヌクレアーゼ（例えば、閾値サイズより大きいサイズを有する）による程度より少なくともまたは最大約０．１倍、少なくともまたは最大約０．５倍、少なくともまたは最大約１倍、少なくともまたは最大約２倍、少なくともまたは最大約３倍、少なくともまたは最大約４倍、少なくともまたは最大約５倍、少なくともまたは最大約６倍、少なくともまたは最大約７倍、少なくともまたは最大約８倍、少なくともまたは最大約９倍、少なくともまたは最大約１０倍、少なくともまたは最大約１５倍、少なくともまたは最大約２０倍、少なくともまたは最大約２５倍、少なくともまたは最大約３０倍、少なくともまたは最大約４０倍、少なくともまたは最大約５０倍、少なくともまたは最大約６０倍、少なくともまたは最大約７０倍、少なくともまたは最大約８０倍、少なくともまたは最大約９０倍、または少なくともまたは最大約１００倍大きくなり得る。

【0100】

一部の例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼ（例えば、閾値未満または閾値に等しいサイズを有する）による標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーション（例えば、増加または減少）の程度は、対照ヌクレアーゼ（例えば、閾値サイズより大きいサイズを有する）による程度より少なくともまたは最大約０．１倍、少なくともまたは最大約０．５倍、少なくともまたは最大約１倍、少なくともまたは最大約２倍、少なくともまたは最大約３倍、少なくともまたは最大約４倍、少なくともまたは最大約５倍、少なくともまたは最大約６倍、少なくともまたは最大約７倍、少なくともまたは最大約８倍、少なくともまたは最大約９倍、少なくともまたは最大約１０倍、少なくともまたは最大約１５倍、少なくともまたは最大約２０倍、少なくともまたは最大約２５倍、少なくともまたは最大約３０倍、少なくともまたは最大約４０倍、少なくともまたは最大約５０倍、少なくともまたは最大約６０倍、少なくともまたは最大約７０倍、少なくともまたは最大約８０倍、少なくともまたは最大約９０倍、または少なくともまたは最大約１００倍長く持続し得る。

【0101】

一部の例では、本明細書に開示されるヌクレアーゼ（例えば、閾値未満または閾値に等しいサイズを有する）による標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベルのモジュレーション（例えば、増加または減少）の程度は、対照ヌクレアーゼ（例えば、閾値サイズより大きいサイズを有する）による程度より少なくともまたは最大約１回の細胞分裂、少なくともまたは最大約２回の細胞分裂、少なくともまたは最大約３回の細胞分裂、少なくともまたは最大約４回の細胞分裂、少なくともまたは最大約５回の細胞分裂、少なくともまたは最大約６回の細胞分裂、少なくともまたは最大約７回の細胞分裂、少なくともまたは最大約８回の細胞分裂、少なくともまたは最大約９回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１０回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１１回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１２回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１３回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１４回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１５回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１６回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１７回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１８回の細胞分裂、少なくともまたは最大約１９回の細胞分裂、少なくともまたは最大約２０回の細胞分裂、少なくともまたは最大約２５回の細胞分裂、少なくともまたは最大約３０回の細胞分裂、少なくともまたは最大約４０回の細胞分裂、少なくともまたは最大約５０回の細胞分裂、または少なくとも約１００回の細胞分裂の間長く（または持続的に長く）持続し得る。本明細書に開示される場合、細胞分裂は、親細胞の、親細胞と実質的に同じ遺伝子材料を有する２つの娘細胞への分裂によって特徴付けることができる。

【0102】

異種遺伝子エフェクターは、クロマチン調節因子（ＣＲ）の配列であり得るか、またはそれを含み得る。。クロマチン調節因子は、様々なクラスのヒストンの機能的ドメインおよびＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＭＴ、ＨＡＴ、ＨＭＴ等）を含む。

【0103】

異種遺伝子エフェクターは、例えばＣ末端、Ｎ末端、またはポリペプチド配列内にタンデムまたは個別に位置するクロマチン調節因子からの２つまたはそれより多くのドメインを含み得る。

【0104】

一部の実施形態では、ヘテロクロマチン形成を容易にする異種遺伝子エフェクター。ヘテロクロマチン形成を容易にし得るタンパク質の非限定的な例としては、ＨＰ１α、ＨＰ１β、ＫＡＰ１、ＫＲＡＢ、ＳＵＶ３９Ｈ１、およびＧ９ａが挙げられる。

【0105】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、メチル化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アセチル化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、リン酸化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＡＤＰ－リボシル化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、グリコシル化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＳＵＭＯ化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ユビキチン化を通してヒストンをモジュレートする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、例えばＡＴＰ加水分解依存プロセスを介してヒストン構造をリモデリングすることによってヒストンをモジュレートする。

【0106】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、標的ポリヌクレオチド、例えば転写リプレッサー、転写因子、ヒストン等でのまたはその付近でのタンパク質の空間的配置を容易にする。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、例えば多様な細胞機能を調節するために、核および／または細胞質におけるゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ構成要素の時空間構成を操作するために有用である。

【0107】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼに由来する。ヒストンアセチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、ＧＮＡＴサブファミリー、ＭＹＳＴサブファミリー、ｐ３００／ＣＢＰサブファミリー、ＨＡＴ１サブファミリー、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、Ｔｉｐ６０、ＭＯＺ、ＭＯＲＦ、ＭＯＦ、ＨＢＯ１、ｐ３００、ＣＢＰ、ＨＡＴ１、ＡＴＦ－２、ＳＲＣ１、およびＴＡＦＩＩ２５０が挙げられる。

【0108】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼに由来する。ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、ＥＺＨサブファミリー、非ＳＥＴサブファミリー、他のＳＥＴサブファミリー、ＰＲＤＭサブファミリー、ＳＥＴ１サブファミリー、ＳＥＴ２サブファミリー、ＳＵＶ３９サブファミリー、ＳＹＭＤサブファミリー、ＡＳＨ１Ｌ、ＥＨＭＴ１、ＥＨＭＴ２、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１０、ＰＲＤＭ１１、ＰＲＤＭ１２、ＰＲＤＭ１３、ＰＲＤＭ１４、ＰＲＤＭ１５、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＤＭ４、ＰＲＤＭ５、ＰＲＤＭ６、ＰＲＤＭ７、ＰＲＤＭ８、ＰＲＤＭ９、ＳＥＴ１、ＳＥＴ１Ｌ、ＳＥＴ２Ｌ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤ３、ＳＥＴＤ４、ＳＥＴＤ５、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＤ７、ＳＥＴＤ８、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＳＥＴＭＡＲ、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、ＳＹＭＤ１、ＳＹＭＤ２、ＳＹＭＤ３、ＳＹＭＤ４、およびＳＹＭＤ５が挙げられる。

【0109】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、クロマチンリモデリング複合体の構成要素に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＢＡＦの構成要素、例えばアクチン、ＡＲＩＤＡ／Ｂ、ＢＡＦ１５５、ＢＡＦ１７０、ＢＡＦ４５ Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＢＡＦ５３ Ａ／Ｂ、ＢＡＦ５７、ＢＡＦ６０ Ａ／Ｂ／Ｃ、ＢＲＧ１／ＢＲＭ、ＩＮＩ１、またはＳＳ１８である。

【0110】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＰＢＡＦの構成要素、例えばアクチン、ＡＲＩＤ２、ＢＡＦ１５５、ＢＡＦ１７０、ＢＡＦ１８０、ＢＡＦ４５ Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ、ＢＡＦ５３ Ａ／Ｂ、ＢＡＦ５７、ＢＡＦ６０ Ａ／Ｂ／Ｃ、ＢＲＤ７、ＢＲＧ１、またはＩＮＩ１に由来する。

【0111】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＩＳＷＩファミリークロマチンリモデリング複合体の構成要素、例えば、ＡＣＦサブファミリー、ＲＳＦサブファミリー、ＣＥＲＦサブファミリー、ＣＨＲＡＣサブファミリー、ＮＵＲＦサブファミリー、ＮｏＲＣサブファミリー、ＷＩＣＨサブファミリー、ｂ－ＷＩＣＨサブファミリー、ＡＣＦ１、ＡＴＰａｓｅ、ＢＰＴＦ、ＣＥＣＲ２、ＣＨＲＡＣ１５、ＣＨＲＡＣ１７、ＣＳＢ、ＤＥＫ、ＭＹＢＢＰ１Ａ、ＮＭ１、ＲＢＡＰ４６／４８、ＲＨＩＩ／Ｇｕａ、ＲＳＦ１、ＳＡＰ１５５、ＳＮＦ２Ｈ、ＳＮＦ２Ｈ／Ｌ、ＳＮＦ２Ｌ、ＴＩＰ５、またはＷＳＴＦに由来する。

【0112】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＣＨＤファミリー複合体の構成要素、例えばＮｕＲＤ複合体、ＮｕＲＤ様複合体、またはＣＨＤ複合体に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＣＨＤ１／２／６／７／８／９、ＣＨＤ３／４、ＣＨＤ５、ＧＡＴＡＤ２ Ａ／Ｂ、ＧＡＴＡＤ２ Ｂ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ２、ＭＢＤ２／３、ＭＴＡ１／２／３、ＭＴＡ３、またはＲＢＡＰ４６、ＲＢＡＰ４６／４８に由来する。

【0113】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＩＮＯ８０ファミリー複合体の構成要素、例えばＩＮＯ８０複合体、Ｔｉｐ６０／ｐ４００複合体、ＳＲＣＡＰ複合体、ＡＭＩＤＡ、ＡＲＰ６、ＢＡＦ５３、ＢＡＦ５３、ＢＡＦ５３Ａ、ＢＲＤ８、ＤＭＡＰ１、ＤＭＡＰ１、ＥＰＣ１／２、ＦＬＪ１１７３０、ＧＡＳ４１、ＧＡＳ４１、ＩＥＳ２、ＩＥＳ６、ＩＮＧ３、ＩＮＯ８０、ＩＮＯ８０Ｅ、ＭＣＲＳ１、ＭＲＧ１５、ＭＲＧＢＰ、ＭＲＧＸ、ＮＦＲＫＢ、ｐ４００、ＲＵＶＢＬ１／２、ＲＵＶＢＬ１／２、ＲＵＶＢＬ１／２、ＳＲＣＡＰ、Ｔｉｐ６０、ＴＲＲＡＰ、ＵＣＨ３７、ＹＬ－１、ＹＬ－１、ＹＹ１、またはＺｎＦ－ＨＩＴ１に由来する。

【0114】

異種遺伝子エフェクターは、転写調節因子（ＴＲ）に由来する配列であり得るか、またはそれを含み得る。ＴＲ遺伝子エフェクターは、様々なファミリーの転写因子（例えば、ＫＲＡＢ、ｐ６５、ＭＥＤ、ＧＴＦ等）からの転写調節ドメインを含む。

【0115】

異種遺伝子エフェクターは、転写活性化ドメインを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、例えば、Ｃ末端、Ｎ末端、またはポリペプチド配列内に位置する２つまたはそれより多くのタンデム転写活性化ドメインを含み得る（can comprise can comprise）。

【0116】

転写活性化ドメインの非限定的な例としては、ＧＡＬ４、単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６、ＶＰ６４（単純ヘルペス活性化ドメインＶＰ１６の４量体）、ＮＦ－ＫＢ ｐ６５サブユニット、エプスタインバーウイルスＲトランス活性化因子（Ｒｔａ）が挙げられる。一部の実施形態では、そのような転写活性化ドメインは、本開示の方法の対照として使用される。一部の実施形態では、そのような転写活性化ドメインは、少なくとも１つの追加の異種遺伝子エフェクター（例えば、異なるエフェクター）を含む複合体における１つの異種遺伝子エフェクターとして使用される。

【0117】

異種遺伝子エフェクターは、転写リプレッサードメインを含み得る。異種遺伝子エフェクターは、例えばＣ末端、Ｎ末端、またはポリペプチド配列内にタンデムまたは個別に位置する２つまたはそれより多くの転写リプレッサードメインを含み得る。

【0118】

転写リプレッサードメインの非限定的な例としては、ＫｏｘｌのＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス）ドメイン、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、およびＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が挙げられる。一部の実施形態では、そのような転写リプレッサードメインは、本開示の方法の対照として使用される。一部の実施形態では、そのような転写リプレッサードメインは、少なくとも１つの追加の異種遺伝子エフェクター（例えば、異なるエフェクター）を含む複合体における１つの異種遺伝子エフェクターとして使用される。

【0119】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、転写因子である遺伝子産物に由来する。

【0120】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、造血幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。造血幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＨＲ、Ａｉｏｌｏｓ／ＩＫＺＦ３、ＣＤＸ４、ＣＲＥＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ１、ＦｏｘＯ３、ＧＡＴＡ－１、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＨＥＳ－１、ＨＨＥＸ、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＭＧＢ３、Ｉｋａｒｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＬＭＯ２、ＬＭＯ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭａｆＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ＰＩＴＸ２、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、Ｐｒｏｘ１、ＰＵ．１／Ｓｐｉ－１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、Ｓｐｉ－Ｂ、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ６、およびＴＳＣ２２が挙げられる。

【0121】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、間葉幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。間葉幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＤＵＸ４、ＤＵＸ４／ＤＵＸ４ｃ、ＤＵＸ４ｃ、ＥＢＦ－１、ＥＢＦ－２、ＥＢＦ－３、ＥＴＶ５、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＴＡ－４、ＧＡＴＡ－６、ＨＭＧＡ２、ｃ－Ｊｕｎ、ＭＹＦ－５、Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ＮＦＡＴＣ２、ｐ５３、Ｐａｘ３、ＰＤＸ－１／ＩＰＦ１、ＰＬＺＦ、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｍａｄ９、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ１８、Ｔｗｉｓｔ－１、およびＴｗｉｓｔ－２が挙げられる。

【0122】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、胚性幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。胚性幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ブラキウリ、ＥＯＭＥＳ、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＦ１、ＦｏｘＨ１、ＦｏｘＯ１／ＦＫＨＲ、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、ＧＢＸ２、グースコイド、ＨＥＳ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ｃ－Ｊｕｎ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－Ｍａｆ、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＩＸＬ１、ＭＴＦ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢインヒビター、ＮＦｋＢ１、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｔｘ２、ｐ５３、Ｐａｘ２、Ｐａｘ６、ＰＲＤＭ１４、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ４、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ６、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＨＡＰ１１、ＵＴＦ１、ＷＤＲ５、ＷＴ１、ＺＮＦ２０６、およびＺＮＦ２８１が挙げられる。

【0123】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子である遺伝子産物に由来する。ｉＰＳＣ転写因子の非限定的な例としては、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、およびＴＢＸ１８が挙げられる。

【0124】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、上皮幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。上皮幹細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＣＤＸ２、ＤＮＭＴ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＮ１、ＧＡＴＡ－６、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＮＦ－４アルファ／ＮＲ２Ａ１、ＩＲＦ６、ｃ－Ｍａｆ、ＭＩＴＦ、Ｍｉｚ－１／ＺＢＴＢ１７、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ニューロゲニン－３、ＮＦＡＴＣ１、ＮＫＸ３．１、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ２、Ｐａｘ３、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、およびＴＣＦ７／ＴＣＦ１が挙げられる。

【0125】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、がん幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。がん幹細胞転写因子の非限定的な例としては、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、ＡＰ－２ガンマ、ベータカテニン、ベータカテニンインヒビター、ブラキウリ、ＣＲＥＢ、ＥＲアルファ／ＮＲ３Ａ１、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＯ３、ＦＲＡ－１、ＧＬＩ－１、ＧＬＩ－２、ＧＬＩ－３、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ－２アルファ／ＥＰＡＳ１、ＨＭＧＡ１Ｂ、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ＭＩＴＦ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢインヒビター、ＮＦｋＢ１、ＮＫＸ３．１、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＰＲＤＭ１４、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１、ＴＢＸ３、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ＷＴ１、およびＺＥＢ１が挙げられる。

【0126】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、がん関連転写因子である遺伝子産物に由来する。がん関連転写因子の非限定的な例としては、ＡＳＣＬ１／Ｍａｓｈ１、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ４、ＢＬＩＭＰ１／ＰＲＤＭ１、ＣＤＸ２、ＣＤＸ４、ＤＬＸ５、ＤＮＭＴ１、Ｅ２Ｆ－１、ＥＧＲ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｏｘＣ１、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＤＤ１５３、ＧＡＴＡ－２、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ＨＮＦ－６／ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＳＦ１、ＩＤ１、ＩＤ２、ＪｕｎＤ、ＫＬＦ１０、ＫＬＦ１２、ＫＬＦ１７、ＬＭＯ２、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＣＬ１／Ｌ－Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－１、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ３、ＰＩＴＸ２、Ｐｒｏｘ１、ＲＡＰ８０、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、サーチュイン２／ＳＩＲＴ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂ、ＴＣＦ７／ＴＣＦ１、ＴＯＲＣ１、ＴＯＲＣ２、ＴＲＩＭ３２、ＴＲＰＳ１、およびＴＳＣ２２が挙げられる。

【0127】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、免疫細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。免疫細胞転写因子の非限定的な例としては、ＡＰ－１、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ａ、ＥＢＦ、Ｅｏｍｅｓ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＴＡ３、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＲＦ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、Ｐａｘ５、ＰＬＺＦ、ＰＵ．１、ＲＯＲ－ガンマ－Ｔ、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＦ７、およびＴｈＰＯＫが挙げられる。

【0128】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＲＮＡポリメラーゼ関連タンパク質である遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、塩基性ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヘリックスターンヘリックスドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アルファヘリックスＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ベータ構造によって露出したアルファヘリックスを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、免疫グロブリンフォールドを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、アルファ／ベータ足場構造によって露出したベータヘアピンを有する（with a with）転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＤＮＡに結合するベータシートを有する転写因子に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ベータバレルＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子に由来する。

【0129】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、核受容体、例えば核ホルモン受容体である遺伝子産物に由来する。核ホルモン受容体の非限定的な例としては、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ａ１、ＮＲ１Ａ２、ＮＲ１Ｂ１、ＮＲ１Ｂ２、ＮＲ１Ｂ３、ＮＲ１Ｃ１、ＮＲ１Ｃ２、ＮＲ１Ｃ３、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｆ１、ＮＲ１Ｆ２、ＮＲ１Ｆ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｈ５、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｉ１、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ａ１、ＮＲ２Ａ２、ＮＲ２Ｂ１、ＮＲ２Ｂ２、ＮＲ２Ｂ３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ａ１、ＮＲ３Ａ２、ＮＲ３Ｂ１、ＮＲ３Ｂ２、ＮＲ３Ｂ３、ＮＲ３Ｃ４、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ３Ｃ３、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、およびＮＲ６Ａ１によってコードされる受容体が挙げられる。

【0130】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヌクレオソームアセンブリに関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ＤＮＡ代謝に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、ヌクレオチド代謝に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、リボソーム生合成に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、タンパク質フォールディングに関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、翻訳に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、シグナル伝達に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、タンパク質分解に関与する遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、エンドペプチダーゼ活性の負の調節に関与する遺伝子産物に由来する。

【0131】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターまたは遺伝子調節因子は、本明細書において互換的に使用される場合、表３に提供される異種遺伝子エフェクターアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または実質的に約１００％配列同一性を示すポリペプチド配列を含み得る。
表3. 異種遺伝子エフェクターアミノ酸配列

【表3-1】

【表3-2】

【0132】

本明細書に開示される異種ポリヌクレオチドは、異種遺伝子エフェクターを標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に向けるために１つまたは複数のガイド部分（例えば、１つまたは複数のガイド核酸分子）を含み得る。ガイド部分は、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列を認識して特異的に結合する能力を付与することができる。ガイド部分は、異種ポリペプチドと複合体を形成するように構成することができ（例えば、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するガイド核酸）、複合体は、標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティック改変レベルを改変するために、本明細書に開示される標的ポリペプチド配列に対して特異的結合を示すように構成することができる。

【0133】

ガイド部分は、ガイド核酸を含み得る。ガイド部分は、本明細書に開示されるヌクレアーゼおよびガイド核酸を含み得る。ガイド部分は、ヌクレアーゼまたはその一部、例えばエンドヌクレアーゼ、例えば異種エンドヌクレアーゼを含み得る。ヌクレアーゼは、例えばＤＮＡヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡヌクレアーゼ、ヌクレアーゼが欠損しているかまたは野生型ヌクレアーゼと比較して低減されたヌクレアーゼ活性を有する改変ヌクレアーゼ、その誘導体、そのバリアント、もしくはその断片であり得る。一部の実施形態では、ガイド部分は、最小のヌクレアーゼ活性を有する。

【0134】

任意の好適なヌクレアーゼ、その断片、または誘導体を、ガイド部分に使用することができる。好適なヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチド、およびＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを含むＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；メガヌクレアーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）；ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ結合タンパク質；リコンビナーゼ；フリッパーゼ；トランスポザーゼ；アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、原核生物アルゴノート（ｐＡｇｏ）、古細菌アルゴノート（ａＡｇｏ）、および真核生物アルゴノート（ｅＡｇｏ））；その任意の誘導体；その任意のバリアントおよびその任意の断片が挙げられる。

【0135】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ＤＮＡヌクレアーゼ、例えばヌクレアーゼ欠損である操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＤＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとの複合体に存在しなければ、標的ＤＮＡ配列の転写の活性化または抑制を誘導しないＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＤＮＡ配列の転写の活性化または抑制を誘導することができる（例えば、本開示の異種遺伝子エフェクターの存在によって変更または増強することができる）ＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。

【0136】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡヌクレアーゼ、例えば操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的化可能な）ＲＮＡヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターとの複合体に存在しなければ、標的ＲＮＡ配列の転写の活性化または抑制を誘導しないＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＲＮＡ配列の転写活性化または抑制を誘導することができる（例えば、本開示の異種遺伝子エフェクターの存在によって変更または増強することができる）ＲＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。

【0137】

一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸ガイド標的化システムを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＤＮＡガイド標的化システムを含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡガイド標的化システムを含む。ガイド部分は、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系（例えば、そのヌクレアーゼ欠損型、例えばｄＣａｓ９）の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に対する特異的結合を容易にするガイド核酸配列を含み、利用することができる。結合特異性は、ガイド核酸、例えば単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはその一部を使用することによって決定することができる。一部の実施形態では、異なるｓｇＲＮＡを使用することにより、本開示の組成物および方法を、異なる標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列と共に使用する（例えば、標的化される）ことができる。

【0138】

原核生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）－ＣＲＩＳＰＲ関連）系、例えば、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、例えばＣａｓ９およびＣｐｆｌは、本開示の組成物および方法において遺伝子発現、エピゲノム編集、およびクロマチンルーピングを調節するためのツールとして転用することができる。異種遺伝子エフェクターと複合体を形成したヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質は、ｄＣａｓが結合した部位に隣接する標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現の調節を可能にし得る。

【0139】

一部の実施形態では、ガイド部分は、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系において機能するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質またはＣａｓヌクレアーゼを含む。細菌では、この系は、外来ＤＮＡに対する獲得免疫を提供することができる。

【0140】

多様な哺乳動物、動物、植物、微生物、および酵母を含む多種多様な生物において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、改変および／または非改変）を、ゲノム操作ツールとして利用することができる、または本明細書に開示されるとおり操作されたタンパク質の特異的結合を標的遺伝子座に向けるように改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、遺伝子発現および／または活性または核酸結合の標的化調節のためにＣａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などのガイド核酸を含み得る。ＲＮＡガイドＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）は、配列依存的に標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）に特異的に結合することができる。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を保有する場合、ＤＮＡを切断することができる。

【0141】

一部の例では、Ｃａｓタンパク質を、変異および／または改変させて、ヌクレアーゼ欠損タンパク質または野生型Ｃａｓタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を生じる。ヌクレアーゼ欠損タンパク質は、ＤＮＡの結合能を保持することができるが、核酸切断活性を欠如してもよく、または低減された核酸切断活性を有してもよい。

【0142】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ガイド核酸、例えばガイドＲＮＡまたはその一部と複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、単一のガイド核酸、例えば単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体を形成するＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成することができるガイド核酸、例えばガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）と必要に応じて複合体を形成するＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、標的ＤＮＡ配列の転写の活性化または抑制を誘導することができるＤＮＡヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼヌルＤＮＡ結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ガイド部分は、ＲＮＡに由来するヌクレアーゼヌルＲＮＡ結合タンパク質を含む。

【0143】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法に使用されるガイド核酸は、例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれより多いヌクレオチドであり得る。

【0144】

一部の実施形態では、本開示の組成物および方法に使用されるガイド核酸は、多くて（at most at most）１０、多くて９、多くて８、多くて７、多くて６、多くて５、多くて４、多くて３、多くて２、または多くて１ヌクレオチドである。

【0145】

ガイド核酸は、ガイドＲＮＡまたはその一部であり得る。

【0146】

任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、多様な命名系を使用して言及され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型系、または他の任意の好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、本明細書で使用される場合、クラス１、クラス２、または他の任意の好適に分類されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。クラス１またはクラス２の決定は、エフェクターモジュールをコードする遺伝子に基づき得る。クラス１系は一般的にマルチサブユニットｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体を有するが、クラス２系は一般的に、単一のタンパク質、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆｌ、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、またはｃｒＲＮＡ－エフェクター複合体を有する。クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して、調節をもたらすことができる。クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えばＩ型（例えば、Ｉ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＵ型）、ＩＩＩ型（例えば、ＩＩＩ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ型）、およびＩＶ型（例えば、ＩＶ、ＩＶＡ、ＩＶＢ型）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、単一の大きいＣａｓタンパク質を使用して、調節をもたらすことができる。クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えばＩＩ型（例えば、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ型）およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ型を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、互いに相補的であり得る、および／または機能的単位をトランスにしてＣＲＩＳＰＲ遺伝子座標的化を容易にすることができる。

【0147】

ガイド部分が、Ｃａｓタンパク質またはその誘導体を含む場合、Ｃａｓタンパク質またはその誘導体は、クラス１またはクラス２Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型Ｃａｓタンパク質、またはＶＩ型Ｃａｓタンパク質であり得る。Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のドメインを含み得る。ドメインの非限定的な例としては、ガイド核酸認識および／または結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅドメイン、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、および二量体形成ドメインが挙げられる。ガイド核酸認識および／または結合ドメインは、ガイド核酸と相互作用することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断のための触媒活性を含み得る。ヌクレアーゼドメインは、核酸切断を防止するために触媒活性を欠如し得る。Ｃａｓタンパク質は、他のタンパク質またはポリペプチドに融合されるキメラＣａｓタンパク質またはその断片であり得る。Ｃａｓタンパク質は、例えば異なるＣａｓタンパク質からのドメインを含む様々なＣａｓタンパク質のキメラであり得る。

【0148】

Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、ｃ２ｃ３、Ｃａｓｌ、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（ＣｓｎｌまたはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、ＣａｓｌＯｄ、Ｃａｓ１０、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｐｆｌ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｕｌ９６６、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３Ｘ、Ｃａｓ１３Ｙ、およびそのホモログまたは改変バージョンが挙げられる。

【0149】

一部の例では、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａでなくてもよく、その必要もない。本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２ａと比較してより小さいサイズを有し得る。本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（またはＣａｓ１４ａ１）に由来し得る。例えば、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、配列番号４３のポリペプチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または実質的に約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別の例では、本明細書に開示されるＣａｓタンパク質は、配列番号４４のポリペプチド配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または実質的に約１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。本明細書に開示される場合、配列番号４３は、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１（またはＣａｓ１４ａ１）のポリペプチド配列をコードする。本明細書に開示される場合、配列番号４４は、低減されたヌクレアーゼ活性を有するＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１の操作されたバリアントをコードする。

【0150】

配列番号４３（Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１）

【化1】

【0151】

配列番号４４（Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１の非活性化ヌクレアーゼバリアント）

【化2】

【化3】

【0152】

Ｃａｓタンパク質またはその断片または誘導体は、任意の好適な生物に由来し得る。非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐ ｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。一部の態様では、生物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。

【0153】

Ｃａｓタンパク質は、これらに限定されないが、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ、Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ． Ｊｅｊｕｎｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ． Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａを含む多様な細菌種に由来し得る。

【0154】

本明細書で使用されるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の野生型または改変型であり得る。Ｃａｓタンパク質は、活性バリアント、不活性バリアント、または野生型もしくは改変Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型バージョンのＣａｓタンパク質と比較してアミノ酸変化、例えば欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、またはその任意の組合せを含み得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％配列同一性または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。Ｃａｓタンパク質は、野生型の例示的なＣａｓタンパク質と多くて約５％、多くて約１０％、多くて約２０％、多くて約３０％、多くて約４０％、多くて約５０％、多くて約６０％、多くて約７０％、多くて約８０％、多くて約９０％、または多くて約１００％配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドであり得る。バリアントまたは断片は、野生型または改変Ｃａｓタンパク質またはその一部と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％配列同一性または配列類似性を含み得る。バリアントまたは断片は、ガイド核酸との複合体中の核酸遺伝子座に標的化され得るが、核酸切断活性を欠如している。

【0155】

Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン、例えばＤＮａｓｅドメインを含み得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよび／またはＨＮＨ様２０ヌクレアーゼドメインを含み得る。Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性型であるＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を作製する。Ｃａｓタンパク質は、１つのみのヌクレアーゼドメインを含み得る（例えば、ＣｐｆｌはＲｕｖＣドメインを含むがＨＮＨドメインを欠如する）。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在しない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在するが不活性であるか、または低減されたもしくは最小の活性を有する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは存在して活性である。

【0156】

Ｃａｓタンパク質の１つまたは複数のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ）を、それらがもはや機能的でないように、または低減されたヌクレアーゼ活性を含むように、欠失または変異させてもよい。例えば、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）において、ヌクレアーゼドメインの１つが欠失しているかまたは変異している場合、得られたＣａｓタンパク質はニッカーゼとして知られ、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）認識配列で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断を生成することはできない。そのようなニッカーゼは、相補鎖または非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはない。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９タンパク質におけるＲｕｖＣおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方；Ｃｐｆｌタンパク質におけるＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン）の全てが欠失または変異している場合、得られたＣａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する能力が低減しているかまたは能力を有しない場合がある。Ｃａｓ９タンパク質をニッカーゼに変換することができる変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパルテートのアラニンへの）変異である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンのアラニンへの）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンのアラニンへの）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９タンパク質を死んだＣａｓ９に変換することができる変異の例は、ＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の１０位でのアスパルテートのアラニンへの）変異およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸８３９位でのヒスチジンのアラニンへの）またはＨ８４０Ａ（アミノ酸８４０位でのヒスチジンのアラニンへの）である。

【0157】

ヌクレアーゼ死んだＣａｓタンパク質（例えば、任意のＣａｓタンパク質に由来するもの、例えばＵｎ１Ｃａｓ１２ｆ１）は、タンパク質の野生型バージョンと比較して１つまたは複数の変異を含み得る。変異は、野生型Ｃａｓタンパク質の複数の核酸切断ドメインの１つまたは複数において核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖を切断する能力を保持するが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力が低減している複数の核酸切断ドメインの１つまたは複数をもたらし得る。変異は、標的核酸の非相補鎖を切断する能力を保持しているが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力が低減している複数の核酸切断ドメインの１つまたは複数をもたらし得る。変異は、標的核酸の相補鎖および非相補鎖を切断する能力を欠如する複数の核酸切断ドメインの１つまたは複数をもたらし得る。ヌクレアーゼドメインにおける変異すべき残基は、ヌクレアーゼの１つまたは複数の触媒残基に対応し得る。例えば、野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基、例えばＡｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６を変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）の１つまたは複数を不活化することができる。Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインにおける変異すべき残基は、例えば、配列および／または構造アライメントによって決定した場合に、野生型Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４、およびＡｓｎ８５６に対応し得る。

【0158】

非限定的な例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（またはＣａｓタンパク質のいずれかの対応する変異）を変異させることができる。例えば、例えばＤ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａ。アラニン置換以外の変異は好適であり得る。

【0159】

Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異の１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠如するＣａｓ９タンパク質（例えば、死んだＣａｓ９タンパク質）を産生することができる。Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異の１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠如する部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１ＯＡ、またはＮ８５６Ａ変異の１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠如する部位特異的ポリペプチドを産生することができる。Ｎ８５６Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異の１つまたは複数と組み合わせて、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠如する部位特異的ポリペプチドを産生することができる。

【0160】

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、クラス２Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質の改変バージョンであるか、またはＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠如するＣａｓ９タンパク質。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ９９ＺＷ２）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｊ７ＲＵＡ５）である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ＡｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質の改変バージョンである。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ＡｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に由来する。例えば、切断活性を欠如するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ＡｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質。

【0161】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、一般的に、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９）と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）と多くて約５％、多くて約１０％、多くて約２０％、多くて約３０％、多くて約４０％、多くて約５０％、多くて約６０％、多くて約７０％、多くて約８０％、多くて約９０％、または約１００％配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型、またはアミノ酸変化、例えば欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、もしくはその任意の組合せを含み得るＣａｓ９タンパク質の改変型を指し得る。

【0162】

Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン）と少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％配列同一性または配列類似性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0163】

Ｃａｓタンパク質、そのバリアントまたは誘導体は、例えば本明細書に開示される複合体の一部として、本開示の組成物および方法による遺伝子発現の調節を増強するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質を、核酸結合親和性、核酸結合特異性、酵素活性、および／または他の因子、例えばヘテロ二量体形成もしくはオリゴマー形成ドメインに対する結合を増加または減少するように、およびリガンドを誘導するように改変することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、タンパク質の任意の他の活性または特性、例えば安定性を変化させるように改変することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つもしくは複数のヌクレアーゼドメインを、改変、欠失、もしくは不活化することができ、またはＣａｓタンパク質を切断して、タンパク質もしくは複合体の所望の機能にとって必須ではないドメインを除去することができる。Ｃａｓタンパク質を、異種遺伝子エフェクターを含む本開示の複合体による遺伝子発現を調節するためにＣａｓタンパク質の活性をモジュレートする（例えば、増強または低減する）ように改変することができる。

【0164】

例えば、Ｃａｓタンパク質を、異種遺伝子エフェクター（例えば、エピジェネティック改変ドメイン、転写活性化ドメイン、および／または転写リプレッサードメイン）に共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させることができる。Ｃａｓタンパク質を、本明細書に開示されるオリゴマー形成または二量体形成ドメイン（例えば、ヘテロ二量体形成ドメイン）に共役（例えば、融合する、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させることができる。Ｃａｓタンパク質を、増加したまたは減少した安定性を提供する異種ポリペプチドに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させることができる。Ｃａｓタンパク質を、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質を含有する複合体、例えばデグロン、例えば誘導型デグロン（例えば、オーキシン誘導型）の分解を容易にすることができる配列に共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させることができる。

【0165】

Ｃａｓタンパク質を、任意の好適な数のパートナー、例えば少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８個のパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させることができる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、多くて２、多くて３、多くて４、多くて５、多くて６、多くて７、多くて８、または多くて１０個のパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、１～５、１～４、１～３、１～２、２～５、２～４、２～３、３～５、３～４、または４～５個のパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、１つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、２つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、３つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、４つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、５つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。一部の実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質を、６つのパートナーに共役（例えば、融合、共有結合により結合、または非共有結合により結合）させる。

【0166】

Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質であり得る。融合したドメインまたは異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部に位置し得る。

【0167】

Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質、例えばＣａｓタンパク質単独またはリボヌクレオタンパク質としてガイド核酸と複合体を形成したタンパク質の形態で提供され得る。Ｃａｓタンパク質は、例えばガイド核酸および／または本開示の１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターと複合体を形成した複合体で提供され得る。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えばＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））、またはＤＮＡの形態で提供され得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞または生物中のタンパク質に効率よく翻訳されるためにコドン最適化され得る。

【0168】

Ｃａｓタンパク質、その断片または誘導体をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、プロモーター、例えば細胞において構成的または誘導的に活性であるプロモーターに作動可能に連結され得る。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子または目的の他の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することが可能であり、目的のそのような核酸配列を標的細胞に移入することができる任意の核酸構築物を含み得る。

【0169】

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、そのバリアントまたはその誘導体は、ヌクレアーゼ死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質である。死んだＣａｓタンパク質は、核酸切断活性を欠如するタンパク質であり得る。

【0170】

Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質の改変型を含み得る。野生型Ｃａｓタンパク質の改変型は、Ｃａｓタンパク質の核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、Ｃａｓタンパク質の改変型は、野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９）の核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。Ｃａｓタンパク質の改変型は、実質的な核酸切断活性を有することができない。Ｃａｓタンパク質が、実質的な核酸切断活性を有さない改変型である場合、これは、酵素的に不活性である、「非活性化された」、および／または「死んだ（dead）」（「ｄ」によって略される）と呼ばれ得る。死んだＣａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ、ｄＣａｓ９）は、標的ポリヌクレオチドに結合することができるが、標的ポリヌクレオチドを切断しないかまたはほとんど切断しないことがある。一部の態様では、死んだＣａｓタンパク質は、死んだＣａｓ９タンパク質である。

【0171】

ｄＣａｓ９ポリペプチドは、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と会合して、例えば本明細書に開示される異種遺伝子エフェクター（複数可）と組み合わせた標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の転写を活性化または抑制することができる。ｓｇＲＮＡを、Ｃａｓまたは本開示のガイド部分構成要素を発現する細胞に導入することができる。一部の例では、そのような細胞は、同じ標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列を標的化する１つまたは複数の異なるｓｇＲＮＡを含有し得る。他の例では、ｓｇＲＮＡは、細胞における異なる核酸（例えば、異なる標的遺伝子、異なる標的遺伝子調節配列、または同じ標的遺伝子もしくは標的遺伝子調節配列内の異なる配列）を標的とする。

【0172】

酵素的に不活性とは、ポリヌクレオチド中の核酸配列に配列特異的に結合するが、標的ポリヌクレオチドを切断しない、または実質的に低減された頻度で切断するヌクレアーゼを指し得る。酵素的に不活性なガイド部分は、酵素的に不活性なドメイン（例えばヌクレアーゼドメイン）を含み得る。酵素的に不活性とは、活性がないことを指し得る。酵素的に不活性とは、実質的に活性がないことを指し得る。酵素的に不活性とは、本質的に活性がないことを指し得る。酵素的に不活性とは、比較可能な野生型活性（例えば、核酸切断活性、野生型Ｃａｓ９活性）と比較して１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、６％以下、７％以下、８％以下、９％以下、または１０％以下の活性を指し得る。

【0173】

一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸ガイド標的化システムを含有しない。例えば、ガイド部分は、タンパク質構造特色、例えば本明細書に開示されるある特定のヌクレアーゼに基づいて標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に結合するタンパク質を含み得る。

【0174】

一部の実施形態では、ガイド部分は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む。ＺＦＮは、切断ドメイン、例えばＦｏｋｌの切断ドメインと、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドに結合することができる少なくとも１つのジンクフィンガーモチーフ（例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５個のジンクフィンガーモチーフ）との間の融合体を指し得る。一部の実施形態では、ＺＦＮは、本開示の標的化部分において、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）に結合するために使用されるが、ＺＦＮは、ポリヌクレオチドを切断しないかまたは実質的に切断しない、例えば、ヌクレアーゼ死んだＺＦＮである。ＺＦＮまたはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の（one of more）異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0175】

特定の配向および間隔での２つの個々のＺＦＮのポリヌクレオチドにおけるある特定の位置でのヘテロ二量体形成は、ヌクレアーゼ活性ＺＦＮにおけるポリヌクレオチドの切断をもたらし得る。例えば、ＺＦＮがＤＮＡに結合すると、ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導することができる。２つの切断ドメインが二量体形成して、ＤＮＡを切断することを可能にするために、２つの個々のＺＦＮは、ある特定の距離離れたそのＣ末端でＤＮＡの反対鎖に結合することができる。一部の例では、ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間のリンカー配列は、各結合部位の５’端が約５～７塩基対離れることを必要とし得る。一部の例では、切断ドメインを、各ジンクフィンガードメインのＣ末端に融合させる。

【0176】

一部の実施形態では、ＺＦＮを含むガイド部分の切断ドメインは、野生型切断ドメインの改変型を含む。切断ドメインの改変型は、切断ドメインの核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、切断ドメインの改変型は、対応する野生型切断ドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。切断ドメインの改変型は、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。一部の実施形態では、切断ドメインは、酵素的に不活性である。

【0177】

一部の実施形態では、ガイド部分は、「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬ－エフェクターヌクレアーゼ」、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む。ＴＡＬＥＮは、一般的にＤＮＡ結合タンデムリピートの中心ドメインおよび切断ドメインを含有する操作された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって産生することができる。一部の例では、ＤＮＡ結合タンデムリピートは、３３～３５アミノ酸長を含み、少なくとも１つの特異的ＤＮＡ塩基対を認識することができる１２位および１３位で２つの超可変アミノ酸残基を含有する。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を、ヌクレアーゼ、例えば野生型または変異したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼ、またはＦｏｋ１の触媒ドメインに融合させることができる。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、本開示の標的化部分において、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）に結合するために使用されるが、ＴＡＬＥＮは、ポリヌクレオチドを切断しないか、または実質的に切断しない、例えばヌクレアーゼ死んだＴＡＬＥＮである。ＴＡＬＥＮ、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0178】

一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、低減されたヌクレアーゼ活性に関して操作されている。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの改変型を含む。ヌクレアーゼドメインの改変型は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減させるアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変型は、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変型は、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。ＴＡＬＥＮ、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0179】

例えば、切断特異性または活性を改善する、Ｆｏｋ１に対するいくつかの変異が、ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために作製されている。そのようなＴＡＬＥＮは、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。ＴＡＬＥＮを使用して、標的ＤＮＡ配列において二本鎖切断を作製し、次にＮＨＥＪまたはＨＤＲを受けることによって遺伝子改変（例えば、核酸配列編集）を生成することができる。

【0180】

ＴＡＬＥ、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質は、異種遺伝子エフェクターに融合し、ヌクレアーゼを含まない。一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、ポリヌクレオチドを切断しないかまたは実質的に切断しない、例えばヌクレアーゼ死んだＴＡＬＥである。ＴＡＬＥ、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0181】

一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質および異種遺伝子エフェクターの複合体は、転写活性化因子として機能するように設計される。一部の実施形態では、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質および異種遺伝子エフェクターの複合体は、転写リプレッサーとして機能するように設計される。例えば、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを、転写活性化ドメインを含む１つもしくは複数の異種遺伝子エフェクター、または転写抑制ドメインを含む１つもしくは複数の異種遺伝子エフェクターに融合（例えば、連結）させることができる。

【0182】

一部の実施形態では、ガイド部分は、メガヌクレアーゼを含む。メガヌクレアーゼは、一般的に非常に配列特異的であるレアカットエンドヌクレアーゼ、またはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、長さ少なくとも１２塩基対、例えば１２～４０塩基対、１２～５０塩基対、または長さ１２～６０塩基対の長さの範囲のＤＮＡ標的部位を認識することができる。メガヌクレアーゼは、モジュール性のＤＮＡ結合ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼの少なくとも１つの触媒ドメインおよび少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインまたは核酸標的配列を指定するタンパク質を含む任意の融合タンパク質であり得る。ＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを認識する少なくとも１つのモチーフを含有し得る。ヌクレアーゼ活性メガヌクレアーゼは、二本鎖切断を生成し得る。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、本開示の標的化部分において、ポリヌクレオチド（例えば、標的遺伝子または標的遺伝子調節配列）に結合するために使用されるが、メガヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを切断しないかまたは実質的に切断しない、例えばヌクレアーゼ死んだメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼ、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて、本開示の複合体を形成することができる。

【0183】

メガヌクレアーゼは、単量体または二量体であり得る。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、天然に存在する（自然界で見出される）または野生型であり、他の例では、メガヌクレアーゼは、非天然、人工、操作された、合成、合理的に設計された、または人の手で作られたものである。一部の実施形態では、本開示のメガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ、Ｉ－Ｍｓｏｌメガヌクレアーゼ、Ｉ－ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、そのバリアント、その誘導体、およびその断片を含む。

【0184】

一部の実施形態では、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインの改変型を含む。ヌクレアーゼドメインの改変型は、ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性を低減または除去するアミノ酸変化（例えば、欠失、挿入、または置換）を含み得る。例えば、ヌクレアーゼドメインの改変型は、野生型ヌクレアーゼドメインの核酸切断活性の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下を有し得る。ヌクレアーゼドメインの改変型は、実質的な核酸切断活性を有しない場合がある。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、酵素的に不活性である。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合することができるが、ＤＮＡを切断することはできない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ不活性メガヌクレアーゼを、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターに融合または会合させて本開示の複合体を生成する。

【0185】

一部の実施形態では、ガイド部分は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性を調節することができる。一部の実施形態では、ガイド部分は、核酸（例えば、遺伝子および／または遺伝子産物）の配列を編集することができる。ヌクレアーゼ活性Ｃａｓタンパク質は、標的ポリヌクレオチドにおいて二本鎖切断または一本鎖切断を生成することによって、核酸配列を編集することができる。

【0186】

一部の実施形態では、ヌクレアーゼを含むガイド部分は、標的ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡにおいて二本鎖切断を生成することができる。ＤＮＡにおける二本鎖切断は、遺伝子改変（複数可）の導入（例えば、核酸編集）を可能にするＤＮＡ切断修復をもたらし得る。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、部位特異的一本鎖ＤＮＡ切断またはニックを誘導し、このようにＨＤＲをもたらす。

【0187】

ＤＮＡにおける二本鎖切断は、遺伝子改変（複数可）の導入（例えば、核酸編集）を可能にするＤＮＡ切断修復をもたらし得る。ＤＮＡ切断修復は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組み換え修復（ＨＤＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲでは、標的ＤＮＡの部位に隣接する相同性アームを含有するドナーＤＮＡ修復鋳型または鋳型ポリヌクレオチドを提供することができる。

【0188】

一部の実施形態では、ガイド部分またはヌクレアーゼを含む複合体は、標的ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡにおいて二本鎖切断を生成しない。

【0189】

ＩＩＩ．複合体

【0190】

本明細書において、一部の態様では、異種ポリペプチドおよび異種ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の複合体が開示される。一部の例では、複合体は、異種遺伝子エフェクターおよびガイド部分、例えば、ガイド核酸および／またはヌクレアーゼ、例えば切断活性を欠如する、または実質的に欠如するエンドヌクレアーゼを含み得る。

【0191】

本開示の複合体は、例えば、１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列に近接させて、それによって標的遺伝子の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルのモジュレーションを容易にするために有用であり得る。

【0192】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡに結合する。一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または非コードＲＮＡに結合する。一部の実施形態では、本開示の複合体は、ＤＮＡおよびＲＮＡに結合する。

【0193】

一部の実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、オペレーター、またはサイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位、コード配列）の物理的妨害によって、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、増加または減少させる）ことができる。

【0194】

一部の実施形態では、複合体は、標的遺伝子の発現を抑制または増強するために有効な追加の因子の動員によって、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現および／または活性をモジュレートする（例えば、増加または減少させる）ことができる。

【0195】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）または標的遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、シス調節エレメント、トランス調節エレメント、エピジェネティック改変（例えば、ＤＮＡメチル化）部位）にエピジェネティック改変を導入するために使用される。一部の実施形態では、本開示の複合体は、三次元構造、位相学的に関連するドメイン、または標的遺伝子もしくは標的遺伝子調節配列（例えば、標的遺伝子から遠位または近位の遺伝子）を含むゲノム境界を産生するために使用される。

【0196】

一部の実施形態では、複合体は、異種遺伝子エフェクターおよびガイド部分を含む。一部の実施形態では、複合体は、１つの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド部分を含む。一部の実施形態では、複合体は、２つの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド部分を含む。一部の実施形態では、複合体は、３つまたはそれより多くの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド部分を含む。

【0197】

一部の実施形態では、複合体は、異種遺伝子エフェクターおよびガイド核酸を含む。一部の実施形態では、複合体は、１つの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド核酸を含む。一部の実施形態では、複合体は、２つの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド核酸を含む。一部の実施形態では、複合体は、３つまたはそれより多くの異種遺伝子エフェクターおよび１つのガイド核酸を含む。

【0198】

複合体に存在する、例えば融合タンパク質に存在する２つの構成要素を、共有結合により連結する、または架橋する、例えば架橋剤によって処理する、または本明細書に開示されるペプチドもしくは非ペプチドリンカーによって結合させることができる。

【0199】

一部の実施形態では、複合体に存在する２つの構成要素は、同じ融合タンパク質の一部である。構成要素を必要に応じて、リンカー、例えばペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって結合させることができる。

【0200】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、リンカーによって異種遺伝子エフェクターに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を、同じまたは異なる第２のリンカーによって第２の異種遺伝子エフェクターにさらに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、リンカーなしで異種遺伝子エフェクターに融合する。

【0201】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、リンカーによってオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を、同じまたは異なる第２のリンカーによって、第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインにさらに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、リンカーなしで第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに融合する。

【0202】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、リンカーによって第２の異種遺伝子エフェクターに結合させる。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、同じまたは異なる第２のリンカーによって第３の異種遺伝子エフェクターにさらに結合させる。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、リンカーなしで第２の異種遺伝子エフェクターに融合する。

【0203】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、リンカーによってオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに結合させる。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、同じまたは異なる第２のリンカーによって第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインにさらに結合させる。一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターを、リンカーなしで第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに融合する。

【0204】

任意の好適なリンカーを使用することができる。フレキシブルリンカーは、グリシンおよびセリン残基のストレッチを含有する配列を有し得る。グリシンおよびセリン残基の小さいサイズは、可撓性を提供し、接続された機能的ドメインのモビリティを可能にする。セリンおよびトレオニンを組み込むことにより、水分子と水素結合を形成することによって水溶液中でリンカーの安定性を維持することができ、それによってリンカーとタンパク質部分との間の不都合な相互作用を低減させる。フレキシブルリンカーはまた、可撓性を維持するためにトレオニンおよびアラニンなどの追加のアミノ酸も含有し、ならびに溶解度を改善するためにリシンおよびグルタミンなどの極性アミノ酸を含有し得る。リジッドリンカーは、例えばアルファヘリックス構造を有し得る。アルファヘリックスリジッドリンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサーとして作用することができる。

【0205】

リンカー配列は、例えば、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸残基であり得る。

【0206】

一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、少なくとも１３、少なくとも１５、または少なくとも２０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、多くて５、多くて７、多くて９、多くて１１、多くて１３、多くて１５、多くて２０、多くて２５、多くて３０、多くて４０、または多くて５０アミノ酸である。

【0207】

一部の実施形態では、非ペプチドリンカーを使用する。非ペプチドリンカーは、例えば化学リンカーであり得る。本開示の複合体の２つの部分を、化学リンカーによって接続することができる。本開示の各化学リンカーは、そのいずれも必要に応じて置換される、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり得る。一部の実施形態では、本開示の化学リンカーは、エステル、エーテル、アミド、チオエーテル、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、例えばリンカー（linked）によって連結されるアミノ酸配列が、ヘッド－テールではなくて、ヘッド－ヘッドであるように、化合物中のアミノ酸配列の順序を逆転させることができる。そのようなリンカーの非限定的な例としては、ジカルボン酸のジエステル、例えばオキサリルジエステル、マロニルジエステル、スクシニルジエステル、グルタリルジエステル、アジピルジエステル、ピメチルジエステル、フマリルジエステル、マレイルジエステル、フタリルジエステル、イソフタリルジエステル、およびテレフタリルジエステルが挙げられる。そのようなリンカーの非限定的な例としては、ジカルボン酸のジアミド、例えば、オキサリルジアミド、マロニルジアミド、スクシニルジアミド、グルタリルジアミド、アジピルジアミド、ピメチルジアミド、フマリルジアミド、マレイルジアミド、フタリルジアミド、イソフタリルジアミド、およびテレフタリルジアミドが挙げられる。そのようなリンカーの非限定的な例としては、ジアミノリンカーのジアミド、例えばエチレンジアミン、１，２－ジ（メチルアミノ）エタン、１，３－ジアミノプロパン、１，３－ジ（メチルアミノ）プロパン、１，４－ジ（メチルアミノ）ブタン、１，５－ジ（メチルアミノ）ペンタン、１，６－ジ（メチルアミノ）ヘキサン、およびピピリジン（pipyrizine）が挙げられる。必要に応じた置換基の非限定的な例としては、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、ハロゲン、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキシアルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、ハロアルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレイド基、エポキシ基、およびエステル基が挙げられる。

【0208】

複合体に存在する２つの構成要素は、例えば、イオン結合、水素結合、本明細書に開示されるオリゴマー形成または二量体形成ドメインによって媒介される相互作用等によって非共有結合により結合され得る。

【0209】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、非共有結合による結合により異種遺伝子エフェクターに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を、非共有結合による結合により第２の異種遺伝子エフェクターにさらに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を、共有結合により第１の異種遺伝子エフェクターに結合させ（例えば、必要に応じてリンカーと共に融合タンパク質）、およびガイド部分またはその一部を、非共有結合による結合により第２の異種遺伝子エフェクターにさらに結合させる。

【0210】

一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、非共有結合による結合によりオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部を、非共有結合による結合により第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインにさらに結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分またはその一部（例えば、ヌクレアーゼ、例えばｄＣａｓ９）を、共有結合による結合（例えば、必要に応じてリンカーを介して融合する）により第１のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに融合し、非共有結合による結合により第２のオリゴマー形成ドメインまたは二量体形成（例えば、ヘテロ二量体形成）ドメインに結合させる。

【0211】

一部の実施形態では、ガイド部分の第１の構成要素（例えば、ガイド核酸）を、ガイド部分の第２の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）に非共有結合により結合させる。一部の実施形態では、ガイド部分の第１の構成要素（例えば、ガイド核酸）を、ガイド部分の第２の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）に共有結合により結合させる。

【0212】

共有結合および非共有結合による結合の任意の組合せを、本開示の複合体に使用することができ、例えば１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを、非共有結合によりガイド部分に融合することができ、１つまたは複数のオリゴマー形成ドメインを、共有結合により複合体の構成要素（例えば、ヌクレアーゼ）に結合することができる。

【0213】

一部の実施形態では、増加または減少した安定性を提供するポリペプチドは、本開示の複合体の構成要素、例えばガイド部分または異種遺伝子エフェクターに融合するかまたはそれ以外の方法で会合する。融合ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、または融合タンパク質の内部に位置し得る。

【0214】

一部の実施形態では、本開示の複合体の１つまたは複数の構成要素は、所望の細胞下局在を指示するドメイン（a domain the directs desirable sub-cellular localization）、例えば核局在化シグナルまたは内部核膜、外部核膜、カハール体、核スペックル、核膜孔複合体、ＰＭＬ体、核小体、Ｐ顆粒、ＧＷ体、ストレス顆粒、スポンジ体、小胞体、ミトコンドリア等に標的化するためのタンパク質に融合される。

【0215】

一部の実施形態では、本開示の複合体は、第１のオリゴマー形成（例えば、二量体形成）ドメインに連結された第１のタンパク質、および第２のオリゴマー形成（例えば、二量体形成）ドメインに連結された第２のタンパク質を含む。一部の実施形態では、オリゴマー形成ドメインまたは二量体形成ドメインは、ペプチド相互作用ドメイン、例えばｓｇＲＮＡ２．０、ＳＡＭ、ＳｕｎＴａｇ、ＲＡＢ、ＦＬＡＧ－ｂｉｏｔｉｎ、または本明細書に開示される誘導型オリゴマー形成（例えば、二量体形成）システムを利用するシステムを含み得る。

【0216】

送達

【0217】

任意の異種ポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター）およびそれに動作可能に連結した任意の追加の分子（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えば１つまたは複数のガイド核酸分子）をコードする１つまたは複数の遺伝子は、本明細書に開示される場合、標的遺伝子の異常発現が改変されるべき細胞のゲノムに組み込まれ得る。あるいは、１つまたは複数の遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれなくてもよく、必ずしも組み込まれる必要はない。

【0218】

任意の異種ポリペプチド（例えば、異種遺伝子エフェクター）およびそれに動作可能に連結した任意の追加の分子（例えば、異種ポリヌクレオチド、例えば１つまたは複数のガイド核酸分子）を、様々な方法によって、例えばウイルスおよび非ウイルス送達法によって細胞に導入する（例えば、送達する、発現させる等）ことができる。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含み得、細胞への送達後、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有し得る。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達媒体、例えばリポソームと複合体を形成した核酸を含み得る。

【0219】

ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムを使用して、特定の細胞を標的化し、ウイルスペイロードを細胞の核へと輸送することができる。ウイルスベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処理することができ、改変された細胞を必要に応じて投与することができる（ｅｘ ｖｉｖｏ）。あるいは、ウイルスベクターを、対象に直接（ｉｎ ｖｉｖｏ）投与することができる。ウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法によって起こり得、それによって挿入されたトランスジーンの長期間の発現をもたらし得る。

【0220】

異種ポリペプチドおよび／または異種ポリヌクレオチド（または１つもしくは複数のそれをコードする遺伝子）を送達するために利用することができるウイルスベクターの非限定的な例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。ＡＡＶベクターの非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ． １１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ． １０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ． １７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ． １５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ． １６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ． １９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ １９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫＯ１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫＯ６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、日本ＡＡＶ １０、トゥルータイプ（true type）ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ １０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶシャッフル１００－１、ＡＡＶシャッフル１００－２、ＡＡＶシャッフル１００－３、ＡＡＶシャッフル１００－７、ＡＡＶシャッフル１０－２、ＡＡＶシャッフル１０－６、ＡＡＶシャッフル１０－８、ＡＡＶ ＳＭ １００－１０、ＡＡＶ ＳＭ １００－３、ＡＡＶ ＳＭ １０－１、ＡＡＶ ＳＭ １０－２、およびＡＡＶ ＳＭ １０－８が挙げられ得る。例えば、ＡＡＶｒｈ．７４をウイルスベクターとして使用して、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および異種ポリヌクレオチド（例えば、Ｃａｓタンパク質－遺伝子エフェクター融合体および１つまたは複数のガイド核酸分子）を送達することができる。

【0221】

核酸の非ウイルス送達法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用剤増強取り込みを含み得る。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションにとって好適であるカチオン性および中性脂質を使用することができる。

【0222】

本明細書に開示される組成物のいずれか（または組成物の任意の部分をコードする１つまたは複数の遺伝子）、例えば異種遺伝子エフェクター（複数可）および／またはガイド核酸分子（複数可）を、これらに限定されないが、非経口（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）、鼻孔内、頬側、舌下、経口、または直腸投与経路を含む任意の好適な投与経路によって投与することができる。一部の例では、医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化される。

【0223】

標的遺伝子

【0224】

本開示は、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現をモジュレートするための組成物、方法、およびシステムを提供する。例えば、本明細書において、ガイド部分および標的遺伝子の活性または発現レベルを増加または減少させることができる１つまたは複数の異種遺伝子エフェクターを含む複合体が開示される。

【0225】

一部の実施形態では、標的遺伝子またはその調節配列は、対象に対して内因性であり、例えば対象のゲノムに存在する。一部の実施形態では、標的遺伝子またはその調節配列は、操作されたレポーターシステムの一部ではない。

【0226】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、宿主対象に対して外因性であり、例えば、病原体標的遺伝子、または治療介入、例えば遺伝子治療および／もしくは細胞治療の結果として発現された外因性遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、外因性のレポーター遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、外因性の合成遺伝子である。

【0227】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、疾患または状態において過剰発現または過小発現された遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、遺伝性の遺伝子疾患において過剰発現されたまたは過小発現された遺伝子である。

【0228】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、自己免疫疾患において過剰発現または過小発現された遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、急性播種性脳脊髄炎、急性運動軸索性ニューロパチー、アジソン病、有痛脂肪症、成人発症スティル病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗糸球体基底膜腎炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、抗Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体脳炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、再生不良性貧血、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性脳炎、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性多発性内分泌症候群、自己免疫性多発性内分泌症候群２型、自己免疫性多発性内分泌症候群３型、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー同心円硬化症、ベーチェット病、ビッカースタッフ脳炎、水疱性類天疱瘡、セリアック病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素病、複合性局所疼痛症候群、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、円板状エリテマトーデス、子宮内膜症、付着部炎、付着部炎関連関節炎、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合クリオグロブリン血症、エバンス症候群、フェルティ症候群、線維筋痛症、胃炎、妊娠性類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、グレーヴス眼症、ギランバレー症候群、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、化膿性汗腺炎、特発性拡張型心筋症、特発性炎症性脱髄疾患、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連全身疾患、封入体筋炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、中間性ぶどう膜炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎病、ランバートイートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線状ＩｇＡ病、ループス腎炎、ループス血管炎、ライム病、メニエール病、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、混合結合組織病、モーレン潰瘍、強皮症、ムッハハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、視神経脊髄炎、神経筋緊張症、オプソクローヌスミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、腫瘍随伴性小脳変性症、パリーロンベルグ症候群、パーソナージターナー症候群、連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害、尋常性天疱瘡、悪性貧血、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性免疫不全症、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性ニューロパチー、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、リウマチ性血管炎、サルコイドーシス、シュニッツラー症候群、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スーザック症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少症、トロサハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、蕁麻疹、蕁麻疹性血管炎、血管炎、または白斑において過剰発現または過少発現された遺伝子である。

【0229】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、がん、例えば急性白血病、星状細胞腫、胆管がん（胆管癌）、骨がん、乳がん、脳幹部神経膠腫、細気管支肺胞細胞肺がん、副腎がん、肛門領域のがん、膀胱がん、内分泌系のがん、食道がん、頭部または頸部のがん、腎臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、胸膜／腹膜のがん、唾液腺がん、小腸がん、甲状腺がん、尿管がん、尿道がん、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵管癌、腎盂癌、膣癌、外陰癌、子宮頸がん、慢性白血病、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚黒色腫、上衣腫、類表皮腫瘍、ユーイング肉腫、胃がん、膠芽腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、血液の悪性疾患、肝細胞（肝臓）癌、ヘパトーマ、ホジキン病、眼内黒色腫、カポジ肉腫、肺がん、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経細胞がん（neuronal cancer）、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、小児悪性疾患、下垂体腺腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌、軟部組織肉腫、シュワン細胞腫、皮膚がん、脊髄軸腫瘍、扁平上皮癌、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、子宮がん、または上記のがんのいずれかの難治バージョンまたはその組合せを含む腫瘍およびその転移において過剰発現または過少発現された遺伝子である。

【0230】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、分化関連遺伝子、例えば、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＡＨＲ、Ａｉｏｌｏｓ／ＩＫＺＦ３、ＣＤＸ４、ＣＲＥＢ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＥＧＲ１、ＦｏｘＯ３、ＧＡＴＡ－１、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＨＥＳ－１、ＨＨＥＸ、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＭＧＢ１／ＨＭＧ－１、ＨＭＧＢ３、Ｉｋａｒｏｓ、ｃ－Ｊｕｎ、ＬＭＯ２、ＬＭＯ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭａｆＢ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＩＬ３／Ｅ４ＢＰ４、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ＰＩＴＸ２、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、Ｐｒｏｘ１、ＰＵ．１／Ｓｐｉ－１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＳＡＬＬ４、ＳＣＬ／Ｔａｌ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ７、Ｓｐｉ－Ｂ、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ６、ＴＳＣ２２、ＤＵＸ４、ＤＵＸ４／ＤＵＸ４ｃ、ＤＵＸ４ｃ、ＥＢＦ－１、ＥＢＦ－２、ＥＢＦ－３、ＥＴＶ５、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＦ１、ＧＡＴＡ－４、ＧＡＴＡ－６、ＨＭＧＡ２、ｃ－Ｊｕｎ、ＭＹＦ－５、Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、ＮＦＡＴＣ２、ｐ５３、Ｐａｘ３、ＰＤＸ－１／ＩＰＦ１、ＰＬＺＦ、ＰＲＤＭ１６／ＭＥＬ１、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｍａｄ９、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１１、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＴＢＸ１８、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ブラキウリ、ＥＯＭＥＳ、ＦｏｘＣ２、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＦ１、ＦｏｘＨ１、ＦｏｘＯ１／ＦＫＨＲ、ＧＡＴＡ－２、ＧＡＴＡ－３、ＧＢＸ２、グースコイド、ＨＥＳ－１、ＨＮＦ－３アルファ／ＦｏｘＡ１、ｃ－Ｊｕｎ、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－Ｍａｆ、Ｍａｘ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＩＸＬ１、ＭＴＦ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢインヒビター、ＮＦｋＢ１、ＮＦｋＢ２、Ｏｃｔ－３／４、Ｏｔｘ２、ｐ５３、Ｐａｘ２、Ｐａｘ６、ＰＲＤＭ１４、Ｒｅｘ－１／ＺＦＰ４２、ＳＡＬＬ１、ＳＡＬＬ４、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＢＸ６、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＨＡＰ１１、ＵＴＦ１、ＷＤＲ５、ＷＴ１、ＺＮＦ２０６、ＺＮＦ２８１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＴＢＸ１８、ＡＳＣＬ２／Ｍａｓｈ２、ＣＤＸ２、ＤＮＭＴ１、ＥＬＦ３、Ｅｔｓ－１、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＮ１、ＧＡＴＡ－６、Ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＮＦ－４アルファ／ＮＲ２Ａ１、ＩＲＦ６、ｃ－Ｍａｆ、ＭＩＴＦ、Ｍｉｚ－１／ＺＢＴＢ１７、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、ＭＹＢ、ｃ－Ｍｙｃ、ニューロゲニン－３、ＮＦＡＴＣ１、ＮＫＸ３．１、Ｎｒｆ２、ｐ５３、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、Ｐａｘ２、Ｐａｘ３、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ２／３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ７、Ｓｍａｄ８、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＳＵＺ１２、ＴＣＦ－３／Ｅ２Ａ、ＴＣＦ７／ＴＣＦ１、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、ＡＰ－２ガンマ、ベータカテニン、ベータカテニンインヒビター、ブラキウリ、ＣＲＥＢ、ＥＲアルファ／ＮＲ３Ａ１、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、ＦｏｘＭ１、ＦｏｘＯ３、ＦＲＡ－１、ＧＬＩ－１、ＧＬＩ－２、ＧＬＩ－３、ＨＩＦ－１アルファ／ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＦ－２アルファ／ＥＰＡＳ１、ＨＭＧＡ１Ｂ、ｃ－Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍａｆ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ７、ＭＩＴＦ、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＮＦｋＢ／ＩｋＢ活性化因子、ＮＦｋＢ／ＩｋＢインヒビター、ＮＦｋＢ１、ＮＫＸ３．１、Ｏｃｔ－３／４、ｐ５３、ＰＲＤＭ１４、Ｓｎａｉｌ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ９、ＳＴＡＴ活性化因子、ＳＴＡＴインヒビター、ＳＴＡＴ３、ＴＡＺ／ＷＷＴＲ１、ＴＢＸ３、Ｔｗｉｓｔ－１、Ｔｗｉｓｔ－２、ＷＴ１、またはＺＥＢ１である。

【0231】

一部の実施形態では、標的細胞（例えば、筋細胞）における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベル（例えば、メチル化レベル）のモジュレーションは、標的遺伝子の下流の遺伝子（例えば、１つまたは複数の下流の遺伝子）の改変（例えば、上方調節または下方調節）をもたらし得る。一部の例では、標的遺伝子は、Ｄ４Ｚ４リピートアレイ（例えば、標的遺伝子はＤＵＸ４である）によってコードされることができ、次にその発現が改変（例えば、下方調節）される下流の遺伝子は、これらに限定されないが、ＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、ＴＲＩＭ４３、ＤＥＦＢ１０３、ＺＦＮ２１７、ＲＮＡＳＥＬ、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＢＭＰ２、ＳＰ１ Ｐ２１、ＭＹＣ、ＭＵＲＦ１、ＡＴＲＯＧＩＮ１、ＣＲＹＭ、ＰＲＡＭＥＦ１、ＲＦＰＬ２、ＫＨＤＣ１、ＳＰＲＹＤ５、ＴＰＲＸ１、ＨＳＰＡ２、ＦＧＦＲ３、ＳＬＣ２Ａ１４、ＩＤ２、ＰＶＲＬ３、ＳＦＲＳ２Ｂ、ＴＨＯＣ４、ＺＮＨＩＴ６、ＤＢＲ１、ＴＦＩＰ１１、ＦＢＸＯ３３、ＵＳＰ２９、ＴＲＩＭ２３、ＳＬＣ３４Ａ２、ＣＳＡＧ３、および／またはＰＮＭＡ６Ｂを含み得る。

【0232】

一部の実施形態では、標的細胞における標的遺伝子の発現レベルおよび／またはエピジェネティックレベル（例えば、メチル化レベル）のモジュレーションは、標的細胞（例えば、筋細胞）のアポトーシスをもたらし得る。一部の例では、標的遺伝子のそのようなモジュレーションは、標的細胞におけるストレスを低減させることができる。例えば、標的遺伝子（例えば、ＤＵＸ４）のモジュレーションは、標的細胞における１つまたは複数のストレス関連マーカーの下方調節をもたらし得る。１つまたは複数のストレス関連マーカーの非限定的な例としては、ＡＣＴＨ、グルココルチコイド受容体、ＣＲＨＲ－１／２、ＰＯＭＣ、プロラクチン、アルギニンバソプレッシン受容体Ｖ１ａ、スーパーオキシドジスムターゼ１、スーパーオキシドジスムターゼ２、ペルオキシレドキシン－３、ＣＣＲ５、ｉＮＯＳ、ｅＮＯＳ、ヘムオキシゲナーゼ－２、シクロオキシゲナーゼ－２、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０ｉ、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１１０、ＧＲＰ７８／ＢＩＰ、ＡＩＦ、アネキシンＩＩ、アネキシンＩＶ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、サイトケラチン、Ｅ－カドヘリン、および／またはアネキシンＶ、カスパーゼ５、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、ＢＡＤ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＣＬ２、ＢＩＤ、ＰＡＲＰ－１、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＲＩＰＫ３、ＲＩＰＫ１、ＦＡＤＤ、ＡＰＡＦ１、ＤＦＦ４０、ＤＦＦ４５、ＲＯＣＫを挙げることができる。本明細書に開示される１つまたは複数のストレス関連マーカーは、アポトーシスマーカーであり得る。

【0233】

一部の実施形態では、異種遺伝子エフェクターは、造血幹細胞転写因子である遺伝子産物に由来する。一部の実施形態では、標的遺伝子は間葉幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は胚性幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は上皮幹細胞転写因子である。一部の実施形態では、標的遺伝子はがん幹細胞転写因子である。

【0234】

一部の実施形態では、標的遺伝子は加齢関連遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は老化関連タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は薬物標的である。

【0235】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）はがん関連遺伝子である。がん関連遺伝子の非限定的な例としては、Ａ１ＣＦ、ＡＢＩ１、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫＲ３、ＡＣＳＬ３、ＡＣＳＬ６、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ２Ａ、ＡＦＤＮ、ＡＦＦ１、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４、ＡＫＡＰ９、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＤＨ２、ＡＬＫ、ＡＭＥＲ１、ＡＮＫ１、ＡＰＣ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＲ、ＡＲＡＦ、ＡＲＨＧＡＰ２６、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ１０、ＡＲＨＧＥＦ１０Ｌ、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＲＩＤ１Ｂ、ＡＲＩＤ２、ＡＲＮＴ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、ＡＴＦ１、ＡＴＩＣ、ＡＴＭ、ＡＴＰ１Ａ１、ＡＴＰ２Ｂ３、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、Ｂ２Ｍ、ＢＡＰ１、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ７Ａ、ＢＣＬ９、ＢＣＬ９Ｌ、ＢＣＬＡＦ１、ＢＣＯＲ、ＢＣＯＲＬ１、ＢＣＲ、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ６、ＢＬＭ、ＢＭＰ５、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＩＰ１、ＢＴＧ１、ＢＴＫ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｃ１５ｏｒｆ６５、ＣＡＣＮＡ１Ｄ、ＣＡＬＲ、ＣＡＭＴＡ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＲＤ１１、ＣＡＲＳ、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＢＦＢ、ＣＢＬ、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＤＣ６、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＣＣＮＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ７、ＣＤ２０９、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１１、ＣＤＨ１７、ＣＤＫ１２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＸ２、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＰ８９、ＣＨＣＨＤ７、ＣＨＤ２、ＣＨＤ４、ＣＨＥＫ２、ＣＨＩＣ２、ＣＨＳＴ１１、ＣＩＣ、ＣＩＩＴＡ、ＣＬＩＰ１、ＣＬＰ１、ＣＬＴＣ、ＣＬＴＣＬ１、ＣＮＢＤ１、ＣＮＢＰ、ＣＮＯＴ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＮＴＲＬ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＰＥＢ３、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢ３Ｌ１、ＣＲＥＢ３Ｌ２、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＮＫＬ１、ＣＲＴＣ１、ＣＲＴＣ３、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ３Ｒ、ＣＳＭＤ３、ＣＴＣＦ、ＣＴＮＮＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＮＮＤ１、ＣＴＮＮＤ２、ＣＵＬ３、ＣＵＸ１、ＣＸＣＲ４、ＣＹＬＤ、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＳＬＴＲ２、ＤＡＸＸ、ＤＣＡＦ１２Ｌ２、ＤＣＣ、ＤＣＴＮ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＲ２、ＤＤＸ１０、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ５、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＤＧＣＲ８、ＤＩＣＥＲ１、ＤＮＡＪＢ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＲＯＳＨＡ、ＤＵＸ４Ｌ１、ＥＢＦ１、ＥＣＴ２Ｌ、ＥＥＤ、ＥＧＦＲ、ＥＩＦ１ＡＸ、ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ４Ａ２、ＥＬＦ３、ＥＬＦ４、ＥＬＫ４、ＥＬＬ、ＥＬＮ、ＥＭＬ４、ＥＰ３００、ＥＰＡＳ１、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ７、ＥＰＳ１５、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣ１、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＥＲＣＣ４、ＥＲＣＣ５、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＴＮＫ１、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＺＨ２、ＥＺＲ、ＦＡＭ１３１Ｂ、ＦＡＭ１３５Ｂ、ＦＡＭ４７Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＡＴ１、ＦＡＴ３、ＦＡＴ４、ＦＢＬＮ２、ＦＢＸＯ１１、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣＲＬ４、ＦＥＮ１、ＦＥＳ、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＨ、ＦＨＩＴ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ９、ＦＬＣＮ、ＦＬＩ１、ＦＬＮＡ、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＮＢＰ１、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＬ２、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３、ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＲ１、ＦＳＴＬ３、ＦＵＢＰ１、ＦＵＳ、ＧＡＳ７、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＧＬＩ１、ＧＭＰＳ、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＯＬＧＡ５、ＧＯＰＣ、ＧＰＣ３、ＧＰＣ５、ＧＰＨＮ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＭ３、Ｈ３Ｆ３Ａ、Ｈ３Ｆ３Ｂ、ＨＥＲＰＵＤ１、ＨＥＹ１、ＨＩＦ１Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｉ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＦ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＭＧＮ２Ｐ４６、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＯＯＫ３、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ１３、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＣ１１、ＨＯＸＣ１３、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＩＤ３、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＺＦ１、ＩＬ２、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＲＦ４、ＩＲＳ４、ＩＳＸ、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＡＺＦ１、ＪＵＮ、ＫＡＴ６Ａ、ＫＡＴ６Ｂ、ＫＡＴ７、ＫＣＮＪ５、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＫＤＳＲ、ＫＥＡＰ１、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ５Ｂ、ＫＩＴ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ６、ＫＬＫ２、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＮＬ１、ＫＮＳＴＲＮ、ＫＲＡＳ、ＫＴＮ１、ＬＡＲＰ４Ｂ、ＬＡＳＰ１、ＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２、ＬＣＫ、ＬＣＰ１、ＬＥＦ１、ＬＥＰＲＯＴＬ１、ＬＨＦＰＬ６、ＬＩＦＲ、ＬＭＮＡ、ＬＭＯ１、ＬＭＯ２、ＬＰＰ、ＬＲＩＧ３、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＳＭ１４Ａ、ＬＹＬ１、ＬＺＴＲ１、ＭＡＣＣ１、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＬＡＴ１、ＭＡＬＴ１、ＭＡＭＬ２、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＡＰ３Ｋ１、ＭＡＰ３Ｋ１３、ＭＡＰＫ１、ＭＡＸ、ＭＢ２１Ｄ２、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＤＳ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＥＤ１２、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＧＭＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＦ１、ＭＬＨ１、ＭＬＬＴ１、ＭＬＬＴ１０、ＭＬＬＴ１１、ＭＬＬＴ３、ＭＬＬＴ６、ＭＮ１、ＭＮＸ１、ＭＰＬ、ＭＲＴＦＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＩ２、ＭＳＮ、ＭＴＣＰ１、ＭＴＯＲ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ４、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＨ１１、ＭＹＨ９、ＭＹＯ５Ａ、ＭＹＯＤ１、Ｎ４ＢＰ２、ＮＡＢ２、ＮＡＣＡ、ＮＢＥＡ、ＮＢＮ、ＮＣＫＩＰＳＤ、ＮＣＯＡ１、ＮＣＯＡ２、ＮＣＯＡ４、ＮＣＯＲ１、ＮＣＯＲ２、ＮＤＲＧ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＡＴＣ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＦＩＢ、ＮＦＫＢ２、ＮＦＫＢＩＥ、ＮＩＮ、ＮＫＸ２－１、ＮＯＮＯ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、ＮＴ５Ｃ２、ＮＴＨＬ１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＮＵＭＡ１、ＮＵＰ２１４、ＮＵＰ９８、ＮＵＴＭ１、ＮＵＴＭ２Ｂ、ＮＵＴＭ２Ｄ、ＯＬＩＧ２、ＯＭＤ、Ｐ２ＲＹ８、ＰＡＢＰＣ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ２、ＰＡＬＢ２、ＰＡＴＺ１、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＡＸ７、ＰＡＸ８、ＰＢＲＭ１、ＰＢＸ１、ＰＣＢＰ１、ＰＣＭ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＥＲ１、ＰＨＦ６、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＬＣＧ１、ＰＭＬ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＯＬＤ１、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＧ、ＰＯＬＱ、ＰＯＴ１、ＰＯＵ２ＡＦ１、ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＦＩＢＰ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＰＰ６Ｃ、ＰＲＣＣ、ＰＲＤＭ１、ＰＲＤＭ１６、ＰＲＤＭ２、ＰＲＥＸ２、ＰＲＦ１、ＰＲＫＡＣＡ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢ、ＰＲＰＦ４０Ｂ、ＰＲＲＸ１、ＰＳＩＰ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＫ６、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ１３、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＲＢ、ＰＴＰＲＣ、ＰＴＰＲＤ、ＰＴＰＲＫ、ＰＴＰＲＴ、ＰＷＷＰ２Ａ、ＱＫＩ、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＣ１、ＲＡＤ１７、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＦ１、ＲＡＬＧＤＳ、ＲＡＮＢＰ２、ＲＡＰ１ＧＤＳ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ１５、ＲＥＣＱＬ４、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＦＷＤ３、ＲＧＰＤ３、ＲＧＳ７、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＨ、ＲＭＩ２、ＲＮＦ２１３、ＲＮＦ４３、ＲＯＢＯ２、ＲＯＳ１、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ５、ＲＰＮ１、ＲＳＰＯ２、ＲＳＰＯ３、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、Ｓ１００Ａ７、ＳＡＬＬ４、ＳＢＤＳ、ＳＤＣ４、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＡＦ２、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＣ、ＳＤＨＤ、４４４４４、４４４４５、４４４４８、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤＢ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＰ４、ＳＧＫ１、ＳＨ２Ｂ３、ＳＨ３ＧＬ１、ＳＨＴＮ１、ＳＩＲＰＡ、ＳＩＸ１、ＳＩＸ２、ＳＫＩ、ＳＬＣ３４Ａ２、ＳＬＣ４５Ａ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＣ１Ａ、ＳＭＯ、ＳＮＤ１、ＳＮＸ２９、ＳＯＣＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２１、ＳＰＥＣＣ１、ＳＰＥＮ、ＳＰＯＰ、ＳＲＣ、ＳＲＧＡＰ３、ＳＲＳＦ２、ＳＲＳＦ３、ＳＳ１８、ＳＳ１８Ｌ１、ＳＳＸ１、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＳＴＡＧ１、ＳＴＡＧ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＩＬ、ＳＴＫ１１、ＳＴＲＮ、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＡＦ１５、ＴＡＬ１、ＴＡＬ２、ＴＢＬ１ＸＲ１、ＴＢＸ３、ＴＣＥＡ１、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ３、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＣ、ＴＥＮＴ５Ｃ、ＴＥＲＴ、Ｔｅｔ１、Ｔｅｔ２、ＴＦＥ３、ＴＦＥＢ、ＴＦＧ、ＴＦＰＴ、ＴＦＲＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＨＲＡＰ３、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３、ＴＭＥＭ１２７、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＣ、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＭ３、ＴＰＭ４、ＴＰＲ、ＴＲＡ、ＴＲＡＦ７、ＴＲＢ、ＴＲＤ、ＴＲＩＭ２４、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＰ１１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、Ｕ２ＡＦ１、ＵＢＲ５、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ６、ＵＳＰ８、ＶＡＶ１、ＶＨＬ、ＶＴＩ１Ａ、ＷＡＳ、ＷＤＣＰ、ＷＩＦ１、ＷＮＫ２、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＴＲ１、ＸＰＡ、ＸＰＣ、ＸＰＯ１、ＹＷＨＡＥ、ＺＢＴＢ１６、ＺＣＣＨＣ８、ＺＥＢ１、ＺＦＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＭＹＭ３、ＺＮＦ３３１、ＺＮＦ３８４、ＺＮＦ４２９、ＺＮＦ４７９、ＺＮＦ５２１、ＺＮＲＦ３、およびＺＲＳＲ２が挙げられる。

【0236】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、免疫細胞関連遺伝子、例えばサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、共阻害性免疫受容体、共刺激性免疫受容体、免疫細胞転写因子等である。

【0237】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、サイトカイン、例えば、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１７８、ＣＤ７０、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＩＴＲＬ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０、ＩＬ－２３、ＬＩＦ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ－β、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ、ＯＳＭ、ＯＸ４０Ｌ、ＳＣＦ、ＴＡＬＬ－１、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＮＣＥ、またはＴＷＥＡＫである。

【0238】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、サイトカイン受容体、例えば、共通ガンマ鎖受容体、共通ベータ鎖受容体、インターフェロン受容体、ＴＮＦファミリー受容体、ＴＧＦ－Ｂ受容体、Ａｐｏ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ１３、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤｗ１１９、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤｗ１２５、ＣＤｗ１３１、ＣＤｗ１３６、ＣＤｗ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤｗ２１０、ＣＤｗ２１７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＬ－１１Ｒ、ＩＬ－１１Ｒａ、ＩＬ－１４Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１５Ｒａ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒβ、ＩＬ－２０Ｒ、ＩＬ－２０Ｒα、ＩＬ－２０Ｒβ、ＩＬ－９Ｒ、ＬＩＦＲ、ＬＴβＲ、ＯＰＧ、ＯＳＭＲ、ＯＸ４０、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＴＧＦ－βＲ１、ＴＧＦ－βＲ２、ＴＧＦ－βＲ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＴＲＡＩＬＲ３、またはＴＲＡＩＬＲ４である。

【0239】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、ケモカイン、例えば、ＡＣＴ－２、ＡＭＡＣ－ａ、ＡＴＡＣ、ＡＴＡＣ、ＢＬＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＫｂ－６、ＣＫｂ－８、ＣＴＡＣＫ、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＤＣ－ＣＫ１、ＥＬＣ、ＥＮＡ－７８、エオタキシン、エオタキシン－２、エオタキシン－３、エスカイン、エクソダス－１、エクソダス－２、エクソダス－３、フラクタルカイン、ＧＣＰ－２、ＧＲＯａ、ＧＲＯｂ、ＧＲＯｇ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－４、Ｉ－３０９、ＩＬ－８、ＩＬＣ、ＩＰ－１０、Ｉ－ＴＡＣ、ＬＡＧ－１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ－１、ＬＤ７８α、ＬＥＣ、Ｌｋｎ－１、ＬＭＣ、リンフォタクチン（lymphoactin）、リンフォタクチンｂ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、ＭＤＣ、ＭＤＮＣＦ、ＭＧＳＡ－ａ、ＭＧＳＡ－ｂ、ＭＧＳＡ－ｇ、Ｍｉｇ、ＭＩＰ－１ｄ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－２ａ、ＭＩＰ－２ｂ、ＭＩＰ－３、ＭＩＰ－３α、ＭＩＰ－３β、ＭＩＰ－４、ＭＩＰ－４ａ、ＭＩＰ－５、ＭＰＩＦ－１、ＭＰＩＦ－２、ＮＡＦ、ＮＡＰ－１、ＮＡＰ－２、オンコスタチン、ＰＡＲＣ、ＰＦ４、ＰＰＢＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ－１ａ、ＳＣＭ－１ｂ、ＳＤＦ－１α／β－、ＳＬＣ、ＳＴＣＰ－１、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、ＸＣＬ１、またはＸＣＬ２である。

【0240】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＸＣＲ１、またはＸＣＲ１である。

【0241】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、活性化ＮＫ受容体、例えば、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ１６（ＦｃｇＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ２７、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｅ、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ｈ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、Ｌｙ４９、ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ（ＫＬＲＫ１、ＣＤ３１４）、ＮＫｐ３０（ＮＣＲ３）、ＮＫｐ４４（ＮＣＲ２）、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１）、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１、ＣＬＥＣ５Ｃ）、ＮＴＢ－Ａ（ＳＬＡＭＦ６）、ＰＳＧＬ１、またはＳＬＡＭＦ７（ＣＲＡＣＣ、ＣＳ１、ＣＤ３１９）である。

【0242】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、阻害性ＮＫ受容体、例えば、ＣＤ１６１（ＮＫＲ－Ｐ１Ａ、ＮＫ１．１）、ＣＤ９４－ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ１、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ１、ＬＩＲ１（ＩＬＴ２、ＬＩＬＲＢ１）、Ｌｙ４９ａ、Ｌｙ４９ｂ、ＮＫＲ－Ｐ１Ａ（ＫＬＲＢ１）、ＳＩＧＬＥＣ－１０、ＳＩＧＬＥＣ－１１、ＳＩＧＬＥＣ－１４、ＳＩＧＬＥＣ－１６、ＳＩＧＬＥＣ－３（ＣＤ３３）、ＳＩＧＬＥＣ－５（ＣＤ１７０）、ＳＩＧＬＥＣ－６（ＣＤ３２７）、ＳＩＧＬＥＣ－７（ＣＤ３２８）、ＳＩＧＬＥＣ－８、ＳＩＧＬＥＣ－９（ＣＤ３２９）、ＳＩＧＬＥＣ－Ｅ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｆ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｇ、ＳＩＧＬＥＣ－Ｈ、またはＴＩＧＩＴである。

【0243】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、共阻害性免疫受容体、例えば、２Ｂ４、Ｂ７－１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ６、Ｆａｓ、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、Ｌｙ１０８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ２、またはＴＩＭ３である。

【0244】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、共刺激性免疫受容体、例えば、２Ｂ４、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８４、ＣＤ２２６、ＣＤ３５５、ＣＲＡＣＣ、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｙ９、Ｌｙ１０８、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ、ＴＩＭ１、またはＴＩＭ２である。

【0245】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、それ自身が遺伝子エフェクター、例えば本明細書に開示される遺伝子エフェクターのいずれか（例えば、本明細書に開示される転写因子）である。

【0246】

一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）は、免疫細胞転写因子、例えば、ＡＰ－１、Ｂｃｌ６、Ｅ２Ａ、ＥＢＦ、Ｅｏｍｅｓ、ＦｏｘＰ３、ＧＡＴＡ３、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、ＩＲＦ、ＩＲＦ１、ＩＲＦ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、Ｐａｘ５、ＰＬＺＦ、ＰＵ．１、ＲＯＲ－ガンマ－Ｔ、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ５Ａ、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＡＴ６、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＣＦ７、またはＴｈＰＯＫである。

【0247】

一部の実施形態では、標的遺伝子は、キナーゼ、例えばチロシンキナーゼまたはセリン／トレオニンキナーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ホスファターゼ、例えば、チロシンホスファターゼまたはセリン／トレオニンホスファターゼである。

【0248】

一部の実施形態では、標的遺伝子は受容体である。一部の実施形態では、標的遺伝子はイオンチャネルである。一部の実施形態では、標的遺伝子はＧＰＣＲである。一部の実施形態では、標的遺伝子は受容体チロシンキナーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子はリボソームタンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は膜タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は細胞質タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子は核タンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子はミトコンドリアタンパク質である。一部の実施形態では、標的遺伝子はユビキチンリガーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子はメチルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子はグリコシルトランスフェラーゼである。一部の実施形態では、標的遺伝子はヒドロラーゼである。

【0249】

一部の実施形態では、ＣＤ４５は、本開示の組成物および方法（例えば、遺伝子発現活性化スクリーニング）において使用される標的遺伝子である。一部の実施形態では、ＣＤ４５は、標的遺伝子として使用されない。ＣＤ４５発現をモジュレートする複合体を同定するための本明細書に開示される組成物および方法を同様に、本明細書に開示される遺伝子を含む他の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に改変を行いかつ適合させることができる。

【0250】

一部の実施形態では、ＣＤ７１は、本開示の組成物および方法（例えば、遺伝子発現減少スクリーニング）において使用される標的遺伝子である。一部の実施形態では、ＣＤ７１は、標的遺伝子として使用されない。ＣＤ７１発現をモジュレートする複合体を同定するための本明細書に開示される組成物および方法を同様に、本明細書に開示される遺伝子を含む他の標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）に改変を行いかつ適合させることができる。

【0251】

細胞

【0252】

本開示の組成物、方法、およびシステムを、様々なタイプの細胞、およびその集団に適用することができる。例えば、本開示の複合体を使用して、特定のタイプの細胞またはその集団における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルの変化を誘発することができる。本開示の方法を使用して、特定のタイプの細胞またはその集団における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現または活性の変化を誘発することが可能な複合体を同定することができる。

【0253】

一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された複合体または異種遺伝子エフェクターは、特定の細胞タイプに対して特異的な標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現における所望の変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された複合体または異種遺伝子エフェクターは、２つまたはそれより多くの細胞タイプに適用可能な標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現における所望の変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された複合体または異種遺伝子エフェクターは、３つまたはそれより多くの細胞タイプに適用可能な標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現における所望の変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された複合体または異種遺伝子エフェクターは、あるクラスの細胞タイプ、例えば類似の組織に存在する、または同じもしくは類似の分化系列に由来する、重複する機能的役割を有する細胞タイプ、例えば幹細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞等に適用可能である標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現における所望の変化をもたらす。一部の実施形態では、本開示の方法によって同定された複合体または異種遺伝子エフェクターは、多種多様な細胞タイプに広く適用可能であり、例えば好適な方法を使用して細胞に導入した場合に複数の標的細胞タイプのある特定の閾値より上または下である標的遺伝子の発現レベルを誘発する、標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現における所望の変化をもたらす。

【0254】

一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、システム、または方法は、初代細胞における標的遺伝子の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすために使用される。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、システム、または方法は、細胞系における標的遺伝子の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすために使用される。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、システム、または方法は、不死化細胞における標的遺伝子の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすために使用される。

【0255】

一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、システム、または方法は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、非齧歯類哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、イヌ細胞等における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすために使用される。一部の実施形態では、本開示の組成物、複合体、システム、または方法は、植物細胞、トリ細胞、爬虫類細胞、細菌細胞、または古細菌細胞における標的遺伝子の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすために使用される。

【0256】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、ヒト細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルの変化をもたらすことができる。

【0257】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、幹細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0258】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、分化した細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0259】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、疾患関連細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0260】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、がん細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0261】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、非がん細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0262】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、リンパ系細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞）、ナチュラルキラー細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞（例えば、ＵＳ２００８０２４１１９４を参照されたい）；骨髄系細胞、例えば顆粒球（好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球、好中球顆粒球／過分葉好中球）、単球／マクロファージ、赤血球、網状赤血球、肥満細胞、血小板／巨核球、樹状細胞；甲状腺（甲状腺上皮細胞、濾胞傍細胞）、副甲状腺（副甲状腺主細胞、オキシフィル細胞）、副腎（クロム親和性細胞）、松果体（松果体細胞）細胞を含む内分泌系に由来する細胞；グリア細胞（星状細胞、ミクログリア）、大細胞性神経分泌細胞、星細胞、ベッチャー細胞、および下垂体（ゴナドトロープ、コルチコトロープ、サイロトロープ、ソマトトロープ、プロラクチン産生）を含む神経系の細胞；肺細胞（Ｉ型肺細胞、ＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、塵埃細胞を含む呼吸器系の細胞；心筋細胞、周皮細胞を含む循環系の細胞；胃（胃主細胞、壁細胞）、杯細胞、パネート細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、Ｉ細胞、Ｋ細胞、Ｓ細胞を含む消化系の細胞；腸クロム親和性細胞、ＡＰＵＤ細胞、肝細胞（例えば、肝細胞、またはクッパー細胞）、軟骨／骨／筋肉を含む腸内分泌細胞；骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、歯細胞（セメント芽細胞、エナメル芽細胞）を含む骨細胞；軟骨芽細胞、軟骨細胞を含む軟骨細胞；発毛細胞、ケラチノサイト、メラノサイト（母斑細胞）を含む皮膚細胞；筋細胞を含む筋細胞；足細胞、傍糸球体細胞、糸球体内メサンギウム細胞／子宮体外メサンギウム細胞、腎近位尿細管刷子縁細胞、緻密斑細胞を含む尿路系の細胞；精子、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、卵子を含む生殖系の細胞；ならびに脂肪細胞、線維芽細胞、腱細胞、上皮ケラチノサイト、上皮基底細胞、指爪および足爪のケラチノサイト、爪床基底細胞、毛髄質細胞、毛皮質細胞、毛小皮細胞、毛根鞘小皮細胞、ハックスレー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞、湿潤重層バリア上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、および膣の上皮の基底細胞、尿路上皮細胞、外分泌上皮細胞、唾液腺粘液細胞、唾液腺漿液細胞、舌のフォンエブネル腺細胞、乳腺細胞、涙腺細胞、耳道腺細胞、エクリン汗腺暗調細胞、エクリン汗腺明調細胞、アポクリン汗腺細胞、眼瞼モル腺細胞、皮脂腺細胞、鼻のボウマン腺細胞、十二指腸のブルンナー腺細胞、精嚢細胞、前立腺細胞、球尿道腺細胞、バルトリン腺細胞、尿道腺細胞、子宮内膜細胞、呼吸器および消化管の孤立杯細胞、胃内壁粘液細胞、胃腺酵素原細胞、胃酸分泌細胞、膵腺房細胞、小腸パネート細胞、肺のＩＩ型肺細胞、肺クララ細胞、ホルモン分泌細胞、下垂体前葉細胞、ソマトトロープ、ラクトトロープ、サイロトロープ、ゴナドトロープ、コルチコトロープ、下垂体中葉細胞、大細胞性神経分泌細胞、腸および呼吸器管細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、濾胞傍細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、精巣のライディッヒ細胞、卵胞の内莢膜細胞、破裂した卵胞の黄体細胞、顆粒膜ルテイン細胞、黄体細胞、傍糸球体細胞、腎臓の緻密斑細胞、代謝および貯蔵細胞、バリア機能細胞（例えば、肺、消化管、外分泌腺および泌尿生殖器管）、腎臓、Ｉ型肺細胞、膵管細胞（腺房中心細胞）、非横紋管細胞（汗腺、唾液腺、乳腺等の）、管細胞（精嚢、前立腺等の）、閉鎖内部体腔を覆う上皮細胞、推進機能を有する繊毛細胞、細胞外基質分泌細胞、収縮細胞；骨格筋細胞、幹細胞、心筋細胞、血液および免疫系の細胞、赤血球、巨核球、単球、結合組織マクロファージ（様々なタイプ）、表皮ランゲルハンス細胞、破骨細胞、樹状細胞、ミクログリア細胞、好中球顆粒球、好酸球顆粒球、好塩基球顆粒球、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、幹細胞および血液および免疫系（様々なタイプ）の拘束前駆細胞、多能性幹細胞、全能性幹細胞、人工多能性幹細胞、成人幹細胞、知覚伝達細胞、ニューロン、自律神経細胞、感覚臓器および末梢ニューロン支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、水晶体細胞、色素細胞、メラノサイト、網膜色素上皮細胞、胚細胞、卵祖細胞／卵細胞、精子、精母細胞、精原細胞、精子、保育細胞、卵胞細胞、セルトリ細胞、胸腺上皮細胞、間質細胞、間質性腎細胞、共通の骨髄前駆細胞、共通のリンパ系前駆細胞、および本明細書に開示される任意の細胞タイプへと分化するまたは分化することになる幹細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0263】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、幹細胞、例えば単離された幹細胞（例えば、ＥＳＣ）または人工幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0264】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、造血幹細胞、例えば対象の、例えば骨髄または末梢血（例えば、動員された末梢血アフェレーシス産物、例えば、ＧＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、モゾビル、またはその組合せの投与によって動員された）の造血幹細胞における標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0265】

一部の例では、幹細胞（例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）の多能性は、部分的に細胞の多能性特徴を評価することによって決定することができる。多能性特徴は、これらに限定されないが、多能性幹細胞形態学；無限の自己再生能；これらに限定されないが、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０を含む多能性幹細胞マーカーの発現；３つ全ての体細胞系列（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）への分化能；３つの体細胞系列を含む奇形腫の形成能；および／または（ｖｉ）３つの体細胞系列からの細胞を含む胚様体の形成を含み得る。

【0266】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、免疫細胞、例えばリンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、アルファ－ベータＴ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、エフェクター－メモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、常在性メモリーＴ細胞（ＴＲＭ）、濾胞ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、ＩＬＣ１細胞、ＩＬＣ２細胞、ＩＬＣ３細胞、リンパ組織誘導（ＬＴｉ）細胞、Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、Ｂ２細胞、形質細胞、制御性Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、単球、マクロファージ、Ｍ１マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、組織関連マクロファージ、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、好中球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、共通の骨髄前駆体、共通のリンパ系前駆体、またはその任意の組合せにおける標的遺伝子（例えば、標的内因性遺伝子）の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【0267】

本開示の組成物、複合体、システム、または方法を使用して、生物製剤、例えば抗体または他のタンパク質ベースの治療剤を製造するために使用される操作された細胞の発現、エピジェネティック改変、または活性レベルに変化をもたらすことができる。

【実施例】

【0268】

（実施例１）
標的細胞集団におけるＤＵＸ４発現の調節
リンパ芽球集団を、本明細書に開示される組成物および方法によるＤＵＸ４発現レベルを調節するための例としての標的細胞集団として使用した。リンパ芽球の集団を、（ｉ）遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分、および（ｉｉ）異種アクチュエーター部分を、リンパ芽球集団においてＤＵＸ４をコードするＤ４Ｚ４リピートアレイ内の２つのＣｐＧアイランド間の標的ポリヌクレオチド配列に向けるように設計されたガイドＲＮＡ（表１を参照されたい）と接触させた。いくつかのガイドＲＮＡは、遺伝子調節因子に結合した異種アクチュエーター部分が、リンパ芽球集団におけるそのそれぞれの標的ポリヌクレオチド配列と複合体を形成することを可能にし、ＤＵＸ４発現レベルの約０．２倍～約０．８倍の間の低減をもたらすことができた（図２）。
表1. 図2で使用したガイドRNA分子

【表1-1】

【表1-2】

（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＳＨＤモデルの検証

【0269】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦＳＨＤモデルを開発するために、２つの不死化患者由来ＦＳＨＤ骨格筋芽細胞（ＳｋＭ）細胞、１２ＡＢＩＣ（１２Ａ）および１５ＡＢＩＣ（１５Ａ）を、完全成長培地中で増大させた。コンフルエンスになった後、完全成長培地を、２日間または７日間のいずれか（図３ＡにおけるＤ２またはＤ７）の間、分化培地条件に変化させた。実験は、未分化の増殖する筋芽細胞である陰性対象を含んだ（図３ＡのＵＤ）。分化後、総ＲＮＡを、筋芽細胞から抽出し、ＤＵＸ４、ならびにＤＵＸ４標的遺伝子ＺＳＡＣ４、ＬＥＵＴＺ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＴＲＩＭ４３に関するＴａｑＭａｎプローブを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨを、ｑＲＴ－ｐＣＲ測定の内部参照対象として含み、ダブルデルタＣｔ法を使用して、遺伝子の倍数変化を計算した。１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞は、患者におけるＦＳＨＤの症状と一致するＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子発現の増加を示した。

【0270】

次に、１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞を、それらが患者におけるＦＳＨＤ表現型と一致するアポトーシスの増加も示したかどうかに関して試験した。１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞、ならびに２つの対応する健康な対照細胞１２ＵＢＩＣおよび１５ＶＢＩＣをそれぞれ成長させた（were growth）後、２日間分化させ、アポトーシスマーカーであるカスパーゼ３に関して染色した。アッセイはまた、陽性対照としてＤＡＰＩ染色も含んだ。次に、細胞を、ＣｅｌｌＸｐｒｅｓｓ ＰＩＣＯイメージャーを使用して撮像し、分析した。図３Ｂに示すように、１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞は、２日間分化後のその健康な同胞対照筋芽細胞１２ＵＢＩＣおよび１５ＶＢＩＣと比較してアポトーシスレベルを増加させた。１２ＡＢＩＣ、１５ＡＢＩＣ、１２ＵＢＩＣ、および１５ＶＢＩＣ細胞を成長させ、分化させ、染色し、分化７日目にＣｅｌｌＸｐｒｅｓｓ ＰＩＣＯイメージャーを使用して撮像し、分析した。各細胞タイプのアポトーシス細胞のパーセントを、分化０、１、２、および７日目にプロットした（図３Ｃ）。１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞は、その対応する健康な対照と比較して２日目および７日目により高いアポトーシスレベルを有した。分化の間のアポトーシスのこの増加は、ＦＳＨＤのｉｎ ｖｉｖｏ表現型と一致した。

【0271】

１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞が、その健康な同胞対照と比較して類似の筋芽細胞分化を有したことを確実にするために、４つ全ての細胞タイプを、筋細胞分化のマーカーとして使用される後期筋遺伝子であるミオシン重鎖（ＭＹＨＣ）に関して免疫染色した（図３Ｄ）。免疫染色アッセイはまた、陽性対照としてＤＡＰＩ染色も含んだ。加えて、４つの細胞タイプを、ＭＹＨＣ、ＭＹＯＧ、およびＭｙｏＭａｋｅｒ（ＭＹＭＫ）の発現に関してｑＲＴ－ＰＣＲを介してアッセイした（図３Ｅ）。ＧＡＤＰＨを、ｑＲＴ－ＰＣＲに含め、これはｑＲＴ－ＰＣＲ測定のための内部対照であった。ＭＹＯＧは、骨格筋分化を調節する必須の筋原性調節因子であり、ＭＹＭＫは、筋細胞分化のマーカーとして使用される後期筋遺伝子であった。免疫染色およびｑＲＴ－ＰＣＲ実験の結果はいずれも、１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞が、その対応する健康な同胞対照と類似の分化を有したことを示した。

【0272】

全体として、これらの検証実験の結果は、１２ＡＢＩＣおよび１５ＡＢＩＣ細胞がＦＳＨＤ筋芽細胞のｉｎ ｖｉｖｏ表現型を提示し、このようにＦＳＨＤの適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルであったことを示した。
（実施例３）
発現の下方調節のためのＤＵＸ４の標的化

【0273】

下方調節のためにＤＵＸ４を標的化するために、Ｄ４Ｚ４遺伝子座の５’末端の長い非コードＲＮＡ、ＤＢＥＴをコードする領域を含む全ＤＺ４Ｚ領域遺伝子座にわたって、多数のｇＲＮＡを設計した。ＤＺ４Ｚ領域遺伝子座は、リピート単位の枯渇の際にＤＵＸ４遺伝子発現を上方調節することが公知であり、ＤＢＥＴ ｌｎｃＲＮＡは、ＤＺ４Ｚ遺伝子座からのＤＵＸ４の発現を正に調節することが示されている。ｇＲＮＡを、ＣｈｏｐＣｈｏｐ ＣＲＩＳＰＲガイド設計ツールを使用して設計した。ｇＲＮＡを設計する場合、Ｈｇ３８ヒトゲノムアセンブリを、ＰＡＭ配列必要条件としてＴＴＴＲと共に使用した。ＤＺ４Ｚ遺伝子座に設計されたｇＲＮＡのマップを図４に示す。

【0274】

ｇＲＮＡを設計した後、異なるｇＲＮＡを、ＫＲＡＢモジュレーターに結合したＣａｓ１２ｆバリアント構築物によって試験した。Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターを安定に発現する１２ＡＢＩＣ細胞を、１２ＡＢＩＣ筋芽細胞のレンチウイルス形質導入後に生成した。Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターベクターのデザインを図５に示す。ベクターは、Ｃａｓ１２ｆバリアントエフェクターの発現を駆動する筋特異的プロモーター（ＣＫ８ｅ）、ならびにＫＲＡＢおよびＤＮＭＴ３Ｌドメインを含んだ。ヒトＵ６ｇプロモーターを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって駆動される足場と共にｓｇＲＮＡスペーサー配列の発現を駆動するために含めた。ベクターはさらに、改変ＷＰＲＥおよびポリアデニル化調節配列を含んだ。Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターを、ｍＣｈｅｒｒｙによって標識し、そのため形質導入後、ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を富化のために選別した。富化後、７８個のガイドに関してアニールしたｃｒＲＮＡ：ｔｒｃｒＲＮＡ構築物を、Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーター発現１２ＡＢＩＣ細胞においてヌクレオフェクトした。筋芽細胞を７日間（for 7 cells）分化させた後、細胞を、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイプローブを使用してＤＵＸ４（図６Ａおよび６Ｂ）およびＭＤＢ３Ｌ２（図６Ｂ）の発現に関してアッセイした。ＤＵＸ４の相対的発現を、対照遺伝子ＨＰＲＴ１の発現に対して正規化した。実験は、異なるｇＲＮＡが、Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターを発現する細胞においてＤＵＸ４およびＭＤＢ３Ｌ２の発現を下方調節することが可能であったことを示した。加えて、異なるｇＲＮＡによるＤＵＸ４およびＭＤＢ３Ｌ２の下方調節は、正に相関した（図６Ｂ）。

【0275】

初回のスクリーニングから、６個のｇＲＮＡをさらに試験した。６個のｇＲＮＡを、２つの異なるＣａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターの１つと共に、不死化患者由来ＦＳＨＤ筋芽細胞にトランスフェクトした。２つの異なるＣａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢエフェクター－モジュレーターは、２つの異なるＤＮＭＴ３Ｌドメイン（例えば、ＤＮＭＴ３Ｌ－ＫｌａまたはＤＮＭＴ３Ｌ－Ｋｌｂ）の１つを含んだ。トランスフェクション後、細胞を分化させ、ＤＵＸ４、ならびにＤＵＸ４標的遺伝子、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、およびＭＹＯＧの発現をトランスフェクションの１７日後（図７Ａ）および１８日後（図７Ｂ）にｑＲＴ－ＰＣＲを使用してアッセイし、ＤＵＸ４抑制の持続に関して測定した。ＭＹＯＧは、ＤＵＸ４ ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞の分化能が、対照ｓｇＲＮＡトランスフェクト筋芽細胞と類似であったことを確実にするために陽性対照として含めた。全体として、Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌモジュレーターは、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子の持続性の抑制をもたらしたことが見出された。

【0276】

Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌモジュレーターによって処理した患者由来筋芽細胞におけるＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子の発現レベルを試験することに加えて、細胞を、処理した細胞のアポトーシスレベルに関しても試験した。処理した細胞を、分化の２日後にアポトーシスマーカーであるカスパーゼ３に関して染色した。染色後、アポトーシス陽性細胞を、ハイコンテントイメージャーを使用して計数し、パーセント陽性細胞を、ＤＡＰＩ（青色の細胞）によって染色した核の総数に基づいて計算した。Ｃａｓ１２ｆ－ＫＲＡＢ－ＤＮＭＴ３Ｌモジュレーターによって処理した細胞は、対照ｓｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較してアポトーシスの減少を示した（図８Ａおよび８Ｂ）。
（実施例４）
ｅｘ ｖｉｖｏ ＦＳＨＤモデルの確立および検証

【0277】

不死化した健康な同胞対照細胞およびＦＳＨＤ骨格筋芽細胞を融解し、ｅｘ ｖｉｖｏ ３Ｄ研究のために増大させた。骨格筋芽細胞を、２Ｄ表面上で分割した後、その全体が参照により本明細書に組み入れられるFayazi, M., "Passive-Stretch Induced Skeletal Muscle Injury Platform for Duchenne Muscular Dystrophy Modeling," Archives of Physical Medicine and Rehabilitation, volume 103, issue 3, March 2022, page e26に記載される確立されたＣｕｒｉ Ｂｉｏ ｌａｂのプロトコールに従って３Ｄ Ｍａｎｔａｒｒａｙ組織へと操作した。簡単に説明すると、３Ｄ骨格筋芽細胞組織を７日間培養して、コンパクション状態にすることができ、これをさらに１４日間培養した。機能の測定を、培養の間に週に３回行い、一定期間での収縮力を評価し、刺激して、機械力、強縮力、および疲労における表現型の差を評価した（図９）。モデルが確立された後、患者由来ＦＳＨＤ骨格筋芽細胞を使用して、３Ｄ組織形態のレスキュー、遺伝子発現プロファイル、および機械力評価に関する対照およびＤＺ４Ｚ遺伝子座を標的化するＣａｓ１２ｆエフェクター－モジュレーターＡＡＶの有効性を試験した。

【0278】

一部の例では、本明細書に開示されるシステム、組成物、または方法によって処理した３Ｄ骨格筋芽細胞組織（例えば、Ｄ４Ｚ４リピートアレイによってコードされる遺伝子、例えばＤＵＸ４の発現レベル、またはエピジェネティックレベルをモジュレートするため）を、対照の３Ｄ骨格筋芽細胞組織（例えば、本明細書に開示されるシステム、組成物、または方法によって処理されていない）と比較して、（ｉ）増強された機械力（例えば、最大機械力、一定期間にわたる平均機械力）、（ｉｉ）増強された強縮力（例えば、骨格筋を神経支配する運動神経が非常に高速で活動電位を放出する場合に誘発される持続性の筋の収縮を示す力）、および／または（ｉｉｉ）低減された疲労（例えば、固定された移動不可能な物体に対する収縮を介して（静的試験または等尺性測定）、または制御された速度での動的筋収縮を介して（繰り返し収縮または等速性評価）測定される）を示すことによって特徴付けることができる。

【0279】

一部の例では、本明細書に開示されるシステム、組成物、または方法によって処理される３Ｄ骨格筋芽細胞組織は、対照３Ｄ骨格筋芽細胞組織の機械力より少なくとももしくは最大約１％、少なくとももしくは最大約５％、少なくとももしくは最大約１０％、少なくとももしくは最大約１５％、少なくとももしくは最大約２０％、少なくとももしくは最大約３０％、少なくとももしくは最大約４０％、少なくとももしくは最大約５０％、少なくとももしくは最大約６０％、少なくとももしくは最大約７０％、少なくとももしくは最大約８０％、少なくとももしくは最大約９０％、少なくとももしくは最大約９５％、少なくとももしくは最大約１００％、少なくとももしくは最大約１２０％、少なくとももしくは最大約１５０％、少なくとももしくは最大約２００％、少なくとももしくは最大約３００％、少なくとももしくは最大約４００％、または少なくとももしくは最大約５００％大きい機械力を示すことによって特徴付けることができる。

【0280】

一部の例では、本明細書に開示されるシステム、組成物、または方法によって処理される３Ｄ骨格筋芽細胞組織は、対照３Ｄ骨格筋芽細胞組織の強縮力より少なくとももしくは最大約１％、少なくとももしくは最大約５％、少なくとももしくは最大約１０％、少なくとももしくは最大約１５％、少なくとももしくは最大約２０％、少なくとももしくは最大約３０％、少なくとももしくは最大約４０％、少なくとももしくは最大約５０％、少なくとももしくは最大約６０％、少なくとももしくは最大約７０％、少なくとももしくは最大約８０％、少なくとももしくは最大約９０％、少なくとももしくは最大約９５％、少なくとももしくは最大約１００％、少なくとももしくは最大約１２０％、少なくとももしくは最大約１５０％、少なくとももしくは最大約２００％、少なくとももしくは最大約３００％、少なくとももしくは最大約４００％、または少なくとももしくは最大約５００％大きい強縮力を示すことによって特徴付けることができる。

【0281】

一部の例では、本明細書に開示されるシステム、組成物、または方法によって処理される３Ｄ骨格筋芽細胞組織は、対照３Ｄ骨格筋芽細胞組織の疲労より少なくとももしくは最大約１％、少なくとももしくは最大約５％、少なくとももしくは最大約１０％、少なくとももしくは最大約１５％、少なくとももしくは最大約２０％、少なくとももしくは最大約３０％、少なくとももしくは最大約４０％、少なくとももしくは最大約５０％、少なくとももしくは最大約６０％、少なくとももしくは最大約７０％、少なくとももしくは最大約８０％、少なくとももしくは最大約９０％、少なくとももしくは最大約９５％、少なくとももしくは最大約９９％、または少なくとももしくは最大約１００％少ない疲労を示すことによって特徴付けることができる。
（実施例５）
ＤＵＸ４標的化のためのｉｎ ｖｉｖｏ ＦＳＨＤモデル

【0282】

指定された－７日目の朝に、マウスを、９０～２００ｍｇ／ｍｇのケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内投与を使用して麻酔することができる。マウスの後肢を、２５Ｇｙを２．２Ｇｙ／分で１１～１２分間のＸ線照射に供することができる。６日後、０．３ｍｇ／ｋｇカルジオトキシン６０μＬを、ＴＡ筋の長さに沿って投与して、分解を促進することができる。１日後、２Ｅ１０＾６個のヒト筋芽細胞６０μＬを、ＴＡ筋に沿って投与することができる。イソフルラン麻酔を、その後のカルジオトキシンおよびヒト筋芽細胞投与のために使用することができる。筋芽細胞の投与の１日後、以前の実施例のＣａｓ１２ｆモジュレーターベクターおよび対照ＡＡＶｒｈ７４ベクターを、後眼窩静脈叢注射を介して投与することができる。４および２１日目に、動物を安楽死させることができる。ＴＡ筋および他の主要な臓器（例えば、心臓、肺、肝臓）を採取することができる。採取したＴＡ筋を切片にして固定し、Ｈ＆Ｅ染色することができる。残りの臓器を処理し、総ＲＮＡ／ＤＮＡを抽出して、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用して遺伝子発現実験を実施することができる。遺伝子発現実験は、ＤＵＸ４およびＤＵＸ４標的遺伝子の発現を測定し、ＤＵＸ４抑制レベルを決定することができる。遺伝子発現実験は、ＤＵＸ４の１つまたは複数の下流の遺伝子、例えばＺＳＣＡＮ４、ＬＥＵＴＸ、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４８、および／またはＴＲＩＭ４３などの発現を測定することができる。遺伝子発現実験はまた、マウスにおけるヒト筋芽細胞の富化ならびに特定の組織へのＡＡＶ指向性も調べ得る。実験のワークフローを、図１０に示す。
表2. 標的細胞(例えば、筋細胞)におけるD4Z4リピートアレイによってコードされる遺伝子(例えば、DUX4)の発現レベルまたはエピジェネティックレベルを改変するために標的ポリヌクレオチド配列に結合するためのガイドRNA分子

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【表2-12】

【表2-13】

【表2-14】

【表2-15】

【0283】

本発明の異なる態様を、個々に、集合的に、または互いに組み合わせて認識することができると理解される。本明細書に記載した本発明の様々な態様を、本明細書に開示した特定の適用のいずれに適用してもよい。本開示の組成物の節において本明細書に開示した事象の組成物を、本明細書に開示される使用および産生方法を含む方法の節で利用してもよく、またはその逆も同様である。

【0284】

本発明の好ましい実施形態を、本明細書に示し、記載してきたが、そのような実施形態は、単なる例として提供されることは当業者に明白である。本発明は、本明細書内に提供された特定の例に限定されないと意図される。本発明は、前述の明細書を参照して記載してきたが、本明細書の実施形態の説明および例証は、限定的な意味であると解釈されることを意味しない。多数の変形形態、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想起される。さらに、本発明の全ての態様は、多様な条件および変数に依存する、本明細書に記載される特定の説明、形状、または相対的割合に限定されないと理解される。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替を、本発明の実践に使用してもよいと理解すべきである。したがって、本発明は、そのような任意の代替、改変、変形形態、または均等物をその範囲に含むと企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびその均等物内の方法および構造がそれによって含まれると意図される。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図3-5】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】