特表 2024-523401 コピー数情報に基づく組織起源分析のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】コピー数情報に基づく組織起源分析のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240621BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20240621BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6886 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577904

(86)(22)【出願日】2022-06-21

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 US2022034382

(87)【国際公開番号】W WO2022271730

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/213,050

(32)【優先日】2021-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515059083

【氏名又は名称】ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ケネディ， アンドリュー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QS34

(57)【要約】

本明細書では、コピー数変異体でもある差次的メチル化領域などの細胞タイプまたは組織タイプ特異的エピジェネティック可変領域を含むＤＮＡを検出するための、核酸を分析する方法が提供される。本明細書では、対象ががんなどの疾患または状態を有する可能性を決定するための方法も提供される。この方法は、血液試料またはその部分試料からＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉することであって、前記ＤＮＡを、前記エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液試料中のＤＮＡを分析するための方法であって、
ａ）前記血液試料またはその部分試料からＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉することであって、前記ＤＮＡを、前記エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含み、
前記エピジェネティック標的領域セットは、コピー数変異体である複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域を含み、前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域および／またはタイプ特異的断片であり、それにより捕捉されたＤＮＡが提供されること、ならびに
前記捕捉されたＤＮＡを配列決定し、前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルを決定すること
を含む方法。

【請求項2】

前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的高メチル化領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項4】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的低メチル化領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、前記血液試料中に存在する非免疫細胞タイプと比べて免疫細胞において高メチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて結腸において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて肺において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて乳房において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて肝臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて腎臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて膵臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて前立腺において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて皮膚において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて膀胱において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

高メチル化標的領域は、前記試料における前記標的領域の平均メチル化よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、または少なくとも４０％高い程度にメチル化されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、前記試料中の異なる細胞タイプまたは組織タイプの標的領域のメチル化レベルと比べて非免疫血液細胞において低メチル化されている標的領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、前記血液試料中に存在する非免疫細胞タイプと比べて免疫細胞に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて結腸に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて肺に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて乳房に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて肝臓に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて腎臓に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて膵臓に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて前立腺に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて皮膚に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、他の組織タイプと比べて膀胱に特異的な断片を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域の起源である少なくとも１つの細胞タイプまたは組織タイプを識別することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

細胞タイプまたは組織タイプを起源とするタイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルが決定される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項30】

免疫細胞、非免疫血液細胞、結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、前立腺、皮膚、膀胱、または膵臓を起源とするタイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルが決定される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項31】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域は、異常に高いコピー数を有するコピー数変異体を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、重複を含む少なくとも１つのコピー数変異体を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記血液試料は血漿試料である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記血液試料は全血試料である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記血液試料は、ＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉する前に分画される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＤＮＡはｃｆＤＮＡである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＤＮＡを、前記ＤＮＡ中のメチルシトシンを認識する作用剤と接触させることにより、前記ＤＮＡを複数の部分試料へと分配することを含み、前記複数は、第１の部分試料および第２の部分試料を含み、前記第１の部分試料は、前記第２の部分試料よりも高い割合でメチルシトシンを有するＤＮＡを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記分配することは、前記捕捉の前に実施される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項39】

前記分配することは、前記捕捉の後でおよび前記配列決定の前に実施される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項40】

前記メチルシトシンを認識する作用剤はメチル結合試薬である、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記メチル結合試薬は抗体である、直前の請求項に記載の方法。

【請求項42】

前記メチル結合試薬は、５－メチルシトシンを特異的に認識する、請求項４０～４１に記載の方法。

【請求項43】

前記メチル結合試薬は、固体支持体に固定化されている、請求項４０～４２に記載の方法。

【請求項44】

前記分配することは、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記分配することは、タンパク質との結合に基づき分配することを含み、必要に応じて、前記タンパク質は、メチル化タンパク質、アセチル化タンパク質、非メチル化タンパク質、非アセチル化タンパク質であり、および／または必要に応じて、前記タンパク質はヒストンである、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記分配することは、前記試料の前記ＤＮＡを、前記タンパク質に特異的であり、固体支持体に固定化されている結合試薬と接触させることを含む、直前の請求項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＤＮＡを、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）および／または少なくとも１つのメチル化依存性制限酵素（ＭＤＲＥ）と接触させることを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記試料または１つもしくは複数の部分試料を、前記ＤＮＡの第１の核酸塩基に対して第２の核酸塩基とは異なる影響を及ぼす手順に供することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

タイプ特異的差次的メチル化標的領域のメチル化レベルを決定することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記エピジェネティック標的領域セットは、ＣＴＣＦ結合部位および／または転写開始部位を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記捕捉は、前記ＤＮＡの配列可変標的領域を捕捉することを含み、前記ＤＮＡを前記配列可変標的領域に特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

アダプターを前記ＤＮＡにライゲートし、それによりアダプターライゲーションＤＮＡを生成することを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記アダプターライゲーションＤＮＡは、前記配列決定の前に増幅される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項54】

前記部分試料は、前記配列決定の前にプールされる、請求項３７～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記試料は対象から得られる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記対象ががんまたは前がんを有する可能性を決定することを含む、直前の請求項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象ががんを有する可能性を決定することを含む、直前の請求項に記載の方法。

【請求項58】

前記がんは、標的領域の起源である細胞タイプまたは組織タイプのがんである、直前の請求項に記載の方法。

【請求項59】

前記がんは、健常対象から得られる試料に存在するレベルよりも高いレベルの前記標的領域の起源である細胞タイプまたは組織タイプのがんである、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記がんはリンパ球がんである、直前の請求項に記載の方法。

【請求項61】

前記がんは、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、直前の請求項に記載の方法。

【請求項62】

前記がんは骨髄がんである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記がんは、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、膵臓がん、膀胱がん、または腎臓がんである、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記対象が前がんを有する前記可能性を決定することを含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項65】

前記前がんは腺腫である、直前の請求項に記載の方法。

【請求項66】

前記腺腫は進行性腺腫である、直前の請求項に記載の方法。

【請求項67】

前記前がんは、結腸直腸前がん、肺前がん、乳房前がん、前立腺前がん、皮膚前がん、胃前がん、膵臓前がん、膀胱前がん、または腎臓前がんである、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記配列決定は、複数の配列決定リードを生成することを含み、前記方法は、前記複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピング配列リードを生成すること、および前記マッピング配列リードを処理して、前記対象ががんまたは前がんを有する前記可能性を決定することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記試料は、以前にがんと診断され、１つまたは複数の以前のがん処置を受けた対象から得られ、必要に応じて、前記試料は、前記１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で得られる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

がん再発スコアを決定することをさらに含み、必要に応じて、前記対象のがん再発ステータスは、がん再発スコアが所定の閾値であるかもしくはそれを上回ると決定される場合にがん再発のリスクがあると決定されるか、または前記対象のがん再発ステータスは、前記がん再発スコアが前記所定の閾値を下回る場合にがん再発のリスクがより低いと決定される、直前の請求項に記載の方法。

【請求項71】

前記対象の前記がん再発スコアを所定のがん再発閾値と比較することをさらに含み、前記対象は、前記がん再発スコアが前記がん再発閾値を上回る場合にその後のがん処置の候補であると分類されるか、または前記がん再発スコアが前記がん再発閾値を下回る場合にその後のがん処置の候補ではないと分類される、直前の実施形態に記載の方法。

【請求項72】

前記試料を、第１の部分試料および第２の部分試料を含む複数の部分試料に分配することであって、前記第１の部分試料は、シトシン修飾を有するＤＮＡを前記第２の部分試料よりも高い割合で含むこと、
前記第２の部分試料をメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させ、それにより前記第２の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第２の部分試料を生成すること、および必要に応じて、前記第１の部分試料をメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより前記第１の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第１の部分試料を生成すること、ならびに
前記第１の部分試料または前記処理された第１の部分試料の少なくとも部分からエピジェネティック標的領域を含む第１の標的領域セットを捕捉すること
をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

試料中のＤＮＡを分析するための方法であって、
ａ）前記試料からＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉することであって、前記ＤＮＡを、前記エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含み、前記エピジェネティック標的領域セットは、コピー数変異体である複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域を含み、前記タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域および／またはタイプ特異的断片であり、それにより捕捉されたＤＮＡが提供されること、
ｂ）前記試料を、第１の部分試料および第２の部分試料を含む複数の部分試料に分配することであって、前記第１の部分試料は、シトシン修飾を有するＤＮＡを前記第２の部分試料よりも高い割合で含むこと、
ｃ）前記第２の部分試料をメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させ、それにより前記第２の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第２の部分試料を生成すること、および必要に応じて、前記第１の部分試料をメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより前記第１の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第１の部分試料を生成すること、ならびに
ｄ）前記第１の部分試料または前記処理された第１の部分試料の少なくとも部分からエピジェネティック標的領域を含む第１の標的領域セットを捕捉すること
を含む方法。

【請求項74】

前記シトシン修飾はメチル化である、請求項７２および７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記シトシン修飾は、シトシンの５位のメチル化である、請求項７２～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記第１の部分試料を、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させる、実施形態７２～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、非メチル化ＣｐＧ配列を切断する、直前の請求項に記載の方法。

【請求項78】

前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、およびＳｎａＢＩの１つまたは複数である、請求項７２～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｈａＩ、またはＡｃｃＩＩの１つまたは複数であり、必要に応じて、前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、（ｉ）ＢｓｔＵＩおよびＨｐａＩＩ、（ｉｉ）ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、およびＨｉｎ６Ｉ、または（ｉｉｉ）ＨｈａＩおよびＡｃｃＩＩである、直前の請求項に記載の方法。

【請求項80】

前記メチル化依存性エンドヌクレアーゼは、メチル化ＣｐＧ配列を切断する、請求項７２～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記メチル化依存性エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｐＥＩ、またはＭｃｒＢＣの１つまたは複数である、請求項７２～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記第１の部分試料は、前記ＤＮＡ中の第１の核酸塩基に対して前記第１の部分試料の前記ＤＮＡ中の第２の核酸塩基とは異なる影響を及ぼす手順に供され、前記第１の核酸塩基は、修飾または未修飾核酸塩基であり、前記第２の核酸塩基は、前記第１の核酸塩基とは異なる修飾または未修飾核酸塩基であり、前記第１の核酸塩基および前記第２の核酸塩基は同じ塩基対合特異性を有する、請求項７２～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、前記第２の核酸塩基の塩基対合特異性を実質的に変更させずに前記第１の核酸塩基の塩基対合特異性を変更する、直前の請求項に記載の方法。

【請求項84】

前記第１の核酸塩基は修飾または未修飾シトシンであり、前記第２の核酸塩基は修飾または未修飾シトシンである、請求項８２または８３に記載の方法。

【請求項85】

前記第１の核酸塩基は未修飾シトシン（Ｃ）を含む、請求項８２～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記第２の核酸塩基は、５－メチルシトシン（ｍＣ）を含む、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、亜硫酸水素塩変換を含む、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記第１の核酸塩基は、ｍＣを含む、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記第２の核酸塩基は、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、５ｈｍＣの保護を含む、請求項８６に記載の方法。

【請求項91】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、Ｔｅｔ支援亜硫酸水素塩変換を含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項92】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、置換ボラン還元剤を用いたＴｅｔ支援変換を含み、必要に応じて、前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、請求項８９に記載の方法。

【請求項93】

前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記第２の核酸塩基はＣを含む、請求項８２～８４、８８～９０、または９２～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、ｈｍＣの保護、それに続いて置換ボラン還元剤によるＴｅｔ支援変換を含み、必要に応じて、前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、請求項８８～９０または９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、ｈｍＣの保護、それに続いてｍＣおよび／またはＣの脱アミノ化を含む、請求項８５、８６、８８～９０、または９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

ｍＣおよび／またはＣの前記脱アミノ化は、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーＤＮＡデアミナーゼ酵素による処理を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

ｈｍＣの保護は、ｈｍＣのグルコシル化を含む、請求項９０または９４～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記第１の部分試料が供される前記手順は、置換ボラン還元剤による化学支援変換を含み、必要に応じて、前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、請求項９２～８４、８６、８８、または９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記第１の核酸塩基はｈｍＣを含む、請求項８２～８４、８６、８８、９４、または１００～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記第１の部分試料の前記ＤＮＡおよび前記第２の部分試料の前記ＤＮＡは差次的にタグ付けされ、差次的タグ付けの後、前記第２の部分試料に由来するＤＮＡの部分は、前記第１の部分試料もしくは前記処理された第１の部分試料、またはそれらの少なくとも部分に添加され、それによりプールが形成され、配列可変標的領域およびエピジェネティック標的領域は前記プールから捕捉される、請求項７２～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記プールは、前記第２の部分試料の前記ＤＮＡの約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％またはそれ未満を含む、直前の請求項に記載の方法。

【請求項105】

前記プールは、前記第２の部分試料の前記ＤＮＡの約７０～９０％、約７５～８５％、または約８０％を含む、直前の請求項に記載の方法。

【請求項106】

前記プールは、前記第１の部分試料の実質的にすべての前記ＤＮＡを含む、請求項８２～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記プールは、前記第１の部分試料または前記処理された第１の部分試料の実質的にすべての前記ＤＮＡを含む、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記第１の標的領域セットは、前記プールの形成後に、前記第１の部分試料または前記処理された第１の部分試料の少なくとも部分から捕捉される、請求項８２～８６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２１３，０５０号に基づく優先権の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本開示は、ＤＮＡなどの核酸の分析に関する方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、核酸は、がんなどの疾患または障害を有するかまたは有すると疑われる対象に由来する。一部の実施形態では、核酸としては、がん細胞に由来する核酸が挙げられる。一部の実施形態では、核酸は、細胞タイプまたは組織タイプ特異的差次的メチル化領域または断片およびコピー数変異体を含む。

【背景技術】

【0003】

緒言および要旨
がんは、世界で年間数百万人の死亡の原因である。早期がんは処置に対してより感受性である傾向があるため、がんの早期検出は転帰の向上をもたらすことができる。

【0004】

細胞増殖の不適切な制御は、がんの顕著な特徴である。がんは、通常、個体の正常細胞内の突然変異の蓄積により引き起こされ、そうした突然変異の少なくとも一部は、細胞分裂の不適切な制御をもたらす。そのような突然変異としては、一般的に、一塩基変異（ＳＮＶ）、遺伝子融合、挿入および欠失（インデル）、トランスバージョン、転座、および逆位が挙げられる。また、がんは、シトシンの修飾（例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、および他のより酸化された形態）ならびにＤＮＡにクロマチンタンパク質および転写因子が会合することなどを含むエピジェネティック変化の蓄積を呈する可能性がある。

【0005】

生検は、がんの可能性のある部位から細胞または組織を抽出し、関連する表現型および／または遺伝子型特徴を分析する、がんを検出または診断するための伝統的な手法を表す。生検は、侵襲的であるという欠点を有する。血液などの体液の分析（「液体生検」）に基づく疾患および障害の検出は、魅力的な代替手段である。液体生検は非侵襲的であり、場合によっては採血のみを必要とする。しかしながら、タンパク質を含む液体生検物質を分析するための正確で高感度な方法を開発することは、部分的には、体液中に放出される核酸の量が低く、また変動するため困難であり、そのような流体から分析可能な形態で核酸を回収することも同様に困難である。こうした変動の原因は、試料間の突然変異（例えば、転座およびインデルなどの再変性）の予測的価値（predictive value）を不明瞭にする可能性がある。そのような突然変異としては、がんと診断されたか、またはがんの兆候を有することが疑われる対象が、免疫腫瘍学的（Ｉ－Ｏ）療法など、特定のタイプのがん療法からの恩恵を受けることになるか否かを評価するために使用することができるバイオマーカーを挙げることができる。液体生検手順でのさらなる分析に有用な無細胞ＤＮＡの単離および処理は、こうした方法の重要な部分である。したがって、例えば液体生検中の無細胞ＤＮＡを分析するための方法および組成物の向上が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示の目的は、腫瘍細胞に由来するｃｆＤＮＡの分析など、ＤＮＡ分析の感度を向上させるという必要性を満たすことである。したがって、本明細書の方法は、ｃｆＤＮＡにおけるエピジェネティック変異、コピー数変異、および配列変異を含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ変異および修飾に関する情報を提供することができるステップを含んでいてもよい。ＤＮＡ分析を含むそのような方法は、対象の特定の疾患状態の可能性についてさらにより向上された情報を提供することができる。血液中のがんマーカーの検出の向上は、障害のより正確な検出（診断）を可能にし、したがって処置の向上を可能にする。したがって、以下の例示的な実施形態が提供される。

【0007】

実施形態１は、血液試料中のＤＮＡを分析するための方法であって、
ａ）血液試料またはその部分試料からＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉することであって、ＤＮＡを、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含み、
エピジェネティック標的領域セットは、コピー数変異体である複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域を含み、タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域および／またはタイプ特異的断片であり、それにより捕捉されたＤＮＡが提供されること、ならびに
捕捉されたＤＮＡを配列決定し、タイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルを決定すること
を含む方法である。

【0008】

実施形態２は、タイプ特異的エピジェネティック標的領域が、タイプ特異的差次的メチル化領域である、実施形態１に記載の方法である。

【0009】

実施形態３は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、タイプ特異的高メチル化領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0010】

実施形態４は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、タイプ特異的低メチル化領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0011】

実施形態５は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、血液試料中に存在する非免疫細胞タイプと比べて免疫細胞において高メチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0012】

実施形態６は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて結腸において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0013】

実施形態７は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて肺において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0014】

実施形態８は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて乳房において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0015】

実施形態９は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて肝臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0016】

実施形態１０は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて腎臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0017】

実施形態１１は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて膵臓において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0018】

実施形態１２は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて前立腺において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0019】

実施形態１３は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて皮膚において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0020】

実施形態１４は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて膀胱において差次的にメチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0021】

実施形態１５は、高メチル化標的領域が、試料における標的領域の平均メチル化よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、または少なくとも４０％高い程度にメチル化されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0022】

実施形態１６は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、試料中の異なる細胞タイプまたは組織タイプの標的領域のメチル化レベルと比べて非免疫血液細胞において低メチル化されている標的領域を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0023】

実施形態１７は、タイプ特異的エピジェネティック標的領域が、タイプ特異的断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１８は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、血液試料中に存在する非免疫細胞タイプと比べて免疫細胞に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0024】

実施形態１９は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて結腸に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0025】

実施形態２０は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて肺に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0026】

実施形態２１は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて乳房に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0027】

実施形態２２は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて肝臓に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0028】

実施形態２３は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて腎臓に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0029】

実施形態２４は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて膵臓に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0030】

実施形態２５は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて前立腺に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0031】

実施形態２６は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて皮膚に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0032】

実施形態２７は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、他の組織タイプと比べて膀胱に対して特異的な断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0033】

実施形態２８は、タイプ特異的エピジェネティック標的領域の起源である少なくとも１つの細胞タイプまたは組織タイプを識別することを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0034】

実施形態２９は、細胞タイプまたは組織タイプを起源とするタイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルが決定される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0035】

実施形態３０は、免疫細胞、非免疫血液細胞、結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、前立腺、皮膚、膀胱、または膵臓を起源とするタイプ特異的エピジェネティック標的領域のレベルが決定される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0036】

実施形態３１は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、異常に高いコピー数を有するコピー数変異体を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0037】

実施形態３２は、複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域が、重複を含む少なくとも１つのコピー数変異体を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0038】

実施形態３３は、血液試料が血漿試料である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0039】

実施形態３４は、血液試料が全血試料である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法である。

【0040】

実施形態３５は、血液試料が、ＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉する前に分画される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0041】

実施形態３６は、ＤＮＡがｃｆＤＮＡである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0042】

実施形態３６．１は、ＤＮＡの分析が、ＤＮＡの標的領域の少なくとも１つのエピジェネティック特徴を定量化することを含み、必要に応じて、エピジェネティック特徴はメチル化を含む、実施形態３５～３６のいずれか１つに記載の方法である。

【0043】

実施形態３６．２は、ＤＮＡの分析が、ＤＮＡの１つまたは複数の標的領域における１つまたは複数の遺伝子変異体を検出または定量化することを含む、実施形態３５～３６のいずれか１つに記載の方法である。

【0044】

実施形態３７は、ＤＮＡを、ＤＮＡ中のメチルシトシンを認識する作用剤と接触させることにより、ＤＮＡを複数の部分試料へと分配することを含み、複数は、第１の部分試料および第２の部分試料を含み、第１の部分試料は、第２の部分試料よりも高い割合でメチルシトシンを有するＤＮＡを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0045】

実施形態３８は、分配が、捕捉の前に実施される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0046】

実施形態３９は、分配が、捕捉の後および配列決定の前に実施される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0047】

実施形態４０は、メチルシトシンを認識する作用剤がメチル結合試薬である、実施形態３７～３９のいずれか１つに記載の方法である。

【0048】

実施形態４１は、メチル結合試薬が抗体である、直前の実施形態に記載の方法である。

【0049】

実施形態４２は、メチル結合試薬が、５－メチルシトシンを特異的に認識する、実施形態４０～４１に記載の方法である。

【0050】

実施形態４３は、メチル結合試薬が、固体支持体に固定化されている、実施形態４０～４２に記載の方法である。

【0051】

実施形態４４は、分配が、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0052】

実施形態４５は、分配が、タンパク質との結合に基づき分配することを含み、必要に応じて、タンパク質は、メチル化タンパク質、アセチル化タンパク質、非メチル化タンパク質、非アセチル化タンパク質であり、および／または必要に応じて、タンパク質はヒストンである、実施形態３７～４４のいずれか１つに記載の方法である。

【0053】

実施形態４６は、分配が、試料のＤＮＡを、タンパク質に特異的であり、固体支持体に固定化されている結合試薬と接触させることを含む、直前の実施形態に記載の方法である。

【0054】

実施形態４７は、ＤＮＡを、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）および／または少なくとも１つのメチル化依存性制限酵素（ＭＤＲＥ）と接触させることを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0055】

実施形態４８は、試料または１つもしくは複数の部分試料を、ＤＮＡの第１の核酸塩基に対して第２の核酸塩基とは異なる影響を及ぼす手順に供することを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0056】

実施形態４９は、タイプ特異的差次的メチル化標的領域のメチル化レベルを決定することを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0057】

実施形態５０は、エピジェネティック標的領域セットが、ＣＴＣＦ結合部位および／または転写開始部位を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0058】

実施形態５１は、捕捉が、ＤＮＡの配列可変標的領域を捕捉することを含み、ＤＮＡを配列可変標的領域に特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0059】

実施形態５２は、アダプターをＤＮＡにライゲートさせ、それによりアダプターライゲーションＤＮＡを生成することを含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0060】

実施形態５３は、アダプターライゲーションＤＮＡが、配列決定の前に増幅される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0061】

実施形態５４は、部分試料が、配列決定の前にプールされる、実施形態３７～５３のいずれか１つに記載の方法である。

【0062】

実施形態５５は、試料が対象から得られる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0063】

実施形態５６は、対象ががんまたは前がんを有する可能性を決定することを含む、直前の実施形態に記載の方法である。

【0064】

実施形態５７は、対象ががんを有する可能性を決定することを含む、直前の実施形態に記載の方法である。

【0065】

実施形態５８は、がんが、標的領域の起源である細胞タイプまたは組織タイプのがんである、直前の実施形態に記載の方法である。

【0066】

実施形態５９は、がんが、健常対象から得られる試料に存在するレベルよりも高いレベルの標的領域の起源である細胞タイプまたは組織タイプのがんである、実施形態５６～５８のいずれか１つに記載の方法である。

【0067】

実施形態６０は、がんがリンパ球がんである、直前の実施形態に記載の方法である。

【0068】

実施形態６１は、がんが、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である、直前の実施形態に記載の方法である。

【0069】

実施形態６２は、がんが骨髄がんである、実施形態５６～５９のいずれか１つに記載の方法である。

【0070】

実施形態６３は、がんが、結腸直腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、膵臓がん、膀胱がん、または腎臓がんである、実施形態５６～５９のいずれか１つに記載の方法である。

【0071】

実施形態６４は、対象が前がんを有する可能性を決定することを含む、実施形態５６に記載の方法である。

【0072】

実施形態６５は、前がんが腺腫である、直前の実施形態に記載の方法である。

【0073】

実施形態６６は、腺腫が進行性腺腫である、直前の実施形態に記載の方法である。

【0074】

実施形態６７は、前がんが、結腸直腸前がん、肺前がん、乳房前がん、前立腺前がん、皮膚前がん、胃前がん、膵臓前がん、膀胱前がん、または腎臓前がんである、実施形態６４～６６のいずれか１つに記載の方法である。

【0075】

実施形態６８は、配列決定が、複数の配列決定リードを生成することを含み、この方法は、複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピング配列リードを生成すること、およびマッピング配列リードを処理して、対象ががんまたは前がんを有する可能性を決定することをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0076】

実施形態６９は、試料が、以前にがんと診断され、１つまたは複数の以前のがん処置を受けた対象から得られ、必要に応じて、試料は、１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で得られる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法である。

【0077】

実施形態７０は、がん再発スコアを決定することをさらに含み、必要に応じて、対象のがん再発ステータスは、がん再発スコアが所定の閾値であるかまたはそれを上回ると決定される場合にがん再発のリスクがあると決定されるか、または対象のがん再発ステータスは、がん再発スコアが所定の閾値を下回る場合にがん再発のリスクがより低いと決定される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0078】

実施形態７１は、対象のがん再発スコアを所定のがん再発閾値と比較することをさらに含み、対象は、がん再発スコアががん再発閾値を上回る場合にその後のがん処置の候補であると分類されるか、またはがん再発スコアががん再発閾値を下回る場合にその後のがん処置の候補ではないと分類される、直前の実施形態に記載の方法である。

【0079】

実施形態７２は、がんをスクリーニングするための方法であって、複数の対象に由来する試料に対して、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の方法を実施することを含み、少なくとも１つのエピジェネティック標的領域の存在またはレベルは、対応する対象ががんを有する可能性があることを示す、方法である。

【0080】

実施形態７３は、残留がんをモニターするための、または再発がんの存在もしくは非存在を検出するための方法であって、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の方法を実施することを含み、少なくとも１つのエピジェネティック標的領域の存在またはレベルは、がんのステータスまたは再発がんの存在もしくは非存在を示す、方法である。

【0081】

実施形態７４は、疾患を処置するための療法を識別するための方法であって、必要に応じて、疾患はがんであり、この方法は、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の方法を実施することを含み、少なくとも１つのエピジェネティック標的領域の存在またはレベルは、疾患を処置するための好適な療法を示す、方法である。

【0082】

実施形態７５は、試料を、第１の部分試料および第２の部分試料を含む複数の部分試料に分配することであって、第１の部分試料は、シトシン修飾を有するＤＮＡを第２の部分試料よりも高い割合で含むこと、
第２の部分試料をメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させ、それにより第２の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第２の部分試料を生成すること、および必要に応じて、第１の部分試料をメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより第１の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第１の部分試料を生成すること、ならびに
第１の部分試料または処理された第１の部分試料の少なくとも部分からエピジェネティック標的領域を含む第１の標的領域セットを捕捉すること
をさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

実施形態７６は、試料中のＤＮＡを分析するための方法であって、
ａ）試料からＤＮＡの少なくともエピジェネティック標的領域セットを捕捉することであって、ＤＮＡを、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含み、エピジェネティック標的領域セットは、コピー数変異体である複数のタイプ特異的エピジェネティック標的領域を含み、タイプ特異的エピジェネティック標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域および／またはタイプ特異的断片であり、それにより捕捉されたＤＮＡが提供されること、
ｂ）試料を、第１の部分試料および第２の部分試料を含む複数の部分試料に分配することであって、第１の部分試料は、シトシン修飾を有するＤＮＡを第２の部分試料よりも高い割合で含むこと、
ｃ）第２の部分試料をメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させ、それにより第２の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第２の部分試料を生成すること、および必要に応じて、第１の部分試料をメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより第１の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第１の部分試料を生成すること、ならびに
ｄ）第１の部分試料または処理された第１の部分試料の少なくとも部分からエピジェネティック標的領域を含む第１の標的領域セットを捕捉すること
を含む方法である。

【0084】

実施形態７７は、シトシン修飾がメチル化である、直前の実施形態に記載の方法である。

【0085】

実施形態７８は、シトシン修飾が、シトシンの５位のメチル化である、実施形態７５～７７のいずれか１つに記載の方法である。

【0086】

実施形態７９は、第１の部分試料を、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させる、実施形態７５～７８のいずれか１つに記載の方法である。

【0087】

実施形態８０は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、非メチル化ＣｐＧ配列を切断する、直前の実施形態に記載の方法である。

【0088】

実施形態８１は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、およびＳｎａＢＩの１つまたは複数である、実施形態７５～８０のいずれか１つに記載の方法である。

【0089】

実施形態８２は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｈａＩ、またはＡｃｃＩＩの１つまたは複数であり、必要に応じて、メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、（ｉ）ＢｓｔＵＩおよびＨｐａＩＩ、（ｉｉ）ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、およびＨｉｎ６Ｉ、または（ｉｉｉ）ＨｈａＩおよびＡｃｃＩＩである、直前の実施形態に記載の方法である。

【0090】

実施形態８３は、メチル化依存性エンドヌクレアーゼが、メチル化ＣｐＧ配列を切断する、実施形態７５～８２のいずれか１つに記載の方法である。

【0091】

実施形態８４は、メチル化依存性エンドヌクレアーゼが、ＭｓｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｐＥＩ、またはＭｃｒＢＣの１つまたは複数である、実施形態７５～８３のいずれか１つに記載の方法である。

【0092】

実施形態８５は、第１の部分試料が、ＤＮＡ中の第１の核酸塩基に対して第１の部分試料のＤＮＡ中の第２の核酸塩基とは異なる影響を及ぼす手順に供され、第１の核酸塩基は、修飾または未修飾核酸塩基であり、第２の核酸塩基は、第１の核酸塩基とは異なる修飾または未修飾核酸塩基であり、第１の核酸塩基および第２の核酸塩基は同じ塩基対合特異性を有する、実施形態７５～８４のいずれか１つに記載の方法。

【0093】

実施形態８６は、第１の部分試料が供される手順が、第２の核酸塩基の塩基対合特異性を実質的に変更させずに第１の核酸塩基の塩基対合特異性を変更する、直前の実施形態に記載の方法である。

【0094】

実施形態８７は、第１の核酸塩基が修飾または未修飾シトシンであり、第２の核酸塩基は修飾または未修飾シトシンである、実施形態８５または８６に記載の方法である。

【0095】

実施形態８８は、第１の核酸塩基が未修飾シトシン（Ｃ）を含む、実施形態８５～８７のいずれか１つに記載の方法である。

【0096】

実施形態８９は、第２の核酸塩基が５－メチルシトシン（ｍＣ）を含む、実施形態８５～８８のいずれか１つに記載の方法である。

【0097】

実施形態９０は、第１の部分試料が供される手順が、亜硫酸水素塩変換を含む、実施形態８５～８９のいずれか１つに記載の方法である。

【0098】

実施形態９１は、第１の核酸塩基がｍＣを含む、実施形態８５～８７のいずれか１つに記載の方法である。

【0099】

実施形態９２は、第２の核酸塩基が５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む、実施形態８５～８９のいずれか１つに記載の方法である。

【0100】

実施形態９３は、第１の部分試料が供される手順が、５ｈｍＣの保護を含む、実施形態８９に記載の方法である。

【0101】

実施形態９４は、第１の部分試料が供される手順が、Ｔｅｔ支援亜硫酸水素塩変換を含む、実施形態９２に記載の方法である。

【0102】

実施形態９５は、第１の部分試料が供される手順が、置換ボラン還元剤によるＴｅｔ支援変換を含み、必要に応じて、置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、実施形態９２に記載の方法である。

【0103】

実施形態９６は、置換ボラン還元剤が、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、実施形態９５に記載の方法である。

【0104】

実施形態９７は、第２の核酸塩基がＣを含む、実施形態８５～８７、９１～９３、または９５～９６のいずれか１つに記載の方法である。

【0105】

実施形態９８は、第１の部分試料が供される手順が、ｈｍＣの保護、それに続いて置換ボラン還元剤によるＴｅｔ支援変換を含み、必要に応じて、置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、実施形態９１～９３または９７のいずれか１つに記載の方法である。

【0106】

実施形態９９は、置換ボラン還元剤が、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、実施形態９８に記載の方法である。

【0107】

実施形態１００は、第１の部分試料が供される手順が、ｈｍＣの保護、それに続くｍＣおよび／またはＣの脱アミノ化を含む、実施形態８８、８９、９１～９３、または９７のいずれか１つに記載の方法である。

【0108】

実施形態１０１は、ｍＣおよび／またはＣの脱アミノ化が、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーＤＮＡデアミナーゼ酵素による処理を含む、実施形態１００に記載の方法である。

【0109】

実施形態１０２は、ｈｍＣの保護が、ｈｍＣのグルコシル化を含む、実施形態９３または９７～１０１のいずれか１つに記載の方法である。

【0110】

実施形態１０３は、第１の部分試料が供される手順が、置換ボラン還元剤による化学支援変換を含み、必要に応じて、置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである、実施形態８５～８７、８９、９１、または９７のいずれか１つに記載の方法である。

【0111】

実施形態１０４は、置換ボラン還元剤が、２－ピコリンボランまたはボランピリジンである、実施形態１０３に記載の方法である。

【0112】

実施形態１０５は、第１の核酸塩基がｈｍＣを含む、実施形態９５～９７、８９、９１、９７、または１０３～１０４のいずれか１つに記載の方法である。

【0113】

実施形態１０５．１は、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブが、プローブがハイブリダイズする配列中の少なくとも１つの塩基の修飾状態に特異的なプローブの少なくとも部分を含み、必要に応じて、修飾状態は、修飾（例えば、メチル化）状態、変換修飾（例えば、メチル化）状態、未修飾状態、または未変換状態である、実施形態８５～１０５のいずれか１つに記載の方法である。

【0114】

実施形態１０５．２は、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブが、修飾される可能性のある位置に変換塩基を含む配列、および修飾される可能性のある位置に未変換塩基を含む配列の両方にハイブリダイズすることができるプローブの少なくとも部分を含み、必要に応じて、プローブの少なくとも部分は、修飾される可能性のある位置に相補的である位置に無差別にハイブリダイズする塩基を含む、実施形態８５～１０５のいずれか１つに記載の方法である。

【0115】

実施形態１０６は、試料を、第１の部分試料および第２の部分試料を含む複数の部分試料に分配することをさらに含み、第１の部分試料のＤＮＡおよび第２の部分試料のＤＮＡは差次的にタグ付けされ；差次的なタグ付けの後、第２の部分試料に由来するＤＮＡの部分は、第１の部分試料もしくは処理された第１の部分試料、またはそれらの少なくとも部分に添加され、それによりプールが形成され、配列可変標的領域およびエピジェネティック標的領域はプールから捕捉される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0116】

実施形態１０７は、プールが、第２の部分試料のＤＮＡの約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％またはそれ未満を含む、直前の実施形態に記載の方法である。

【0117】

実施形態１０８は、プールが、第２の部分試料のＤＮＡの約７０～９０％、約７５～８５％、または約８０％を含む、直前の実施形態に記載の方法である。

【0118】

実施形態１０９は、プールが、第１の部分試料のＤＮＡの実質的にすべてを含む、実施形態１０６～１０８のいずれか１つに記載の方法である。

【0119】

実施形態１１０は、プールが、第１の部分試料または処理された第１の部分試料のＤＮＡの実質的にすべてを含む、実施形態１０６～１０９のいずれか１つに記載の方法である。

【0120】

実施形態１１１は、第１の標的領域セットが、プールの形成後に、第１の部分試料または処理された第１の部分試料の少なくとも部分から捕捉される、実施形態１０６～１１０のいずれか１つに記載の方法である。

【図面の簡単な説明】

【0121】

【図1】図１は、本開示の一部の実施形態での使用に好適なシステムの一例の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0122】

ある特定の実施形態の詳細な説明
これから、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照するものとする。本発明はそのような実施形態との関連で説明されることになるが、それらは、本発明をそうした実施形態に限定することを意図するものではないことが理解されるだろう。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明内に含まれ得るすべての代替、改変、および均等物を網羅することが意図されている。

【0123】

本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、それ自体が変化し得ることが理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明らかに別様に指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の参照を含むことが留意されるべきである。したがって、例えば、「核酸」への参照は複数の核酸を含み、「細胞」への参照は複数の細胞を含むなどである。

【0124】

数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。測定値および測定可能な値は、有効数字および測定に伴う誤差を考慮した近似値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含むこと（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定を意図したものではない。上述の一般的な説明および詳細な説明は両方とも例示的および説明的なものに過ぎず、教示を限定するものではないことが理解されるべきである。

【0125】

上記の明細書で特に注記されていない限り、種々の成分を「含む」と記載されている本明細書の実施形態は、記載の成分「からなる」かまたは「から本質的になる」ことも企図され、種々の成分「からなる」と記載されている本明細書の実施形態は、その記載の成分を「含む」かまたは「から本質的になる」ことも企図され、種々の成分「から本質的になる」と記載されている本明細書の実施形態は、その記載の成分「からなる」かまたは「含む」ことも企図される（この同義性は、特許請求の範囲におけるこうした用語の使用には適用されない）。

【0126】

本明細書で使用されるセクション見出しは、構造化を目的としたものであり、本開示の主題をいかなる点でも限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれているあらゆる文書または他の資料が、定義を含む本明細書の任意の明示的な内容と矛盾する場合は、本明細書が優先する。
Ｉ．定義

【0127】

「固形組織」または「固形組織細胞」は、本明細書で使用される場合、それぞれ固形組織中のまたはそれに由来する組織または細胞を意味する。固形組織細胞は、血液またはリンパに通常存在する細胞などの循環細胞タイプを除外する。固形組織細胞タイプの例としては、結腸、肺、乳房、皮膚、前立腺、胃、膵臓、膀胱、腎臓、および肝臓が挙げられるが、これらに限定されない。

【0128】

「無細胞ＤＮＡ」、「ｃｆＤＮＡ分子」、または単に「ｃｆＤＮＡ」としては、細胞外形態で対象に（例えば、血液、血清、血漿、またはリンパ液、脳脊髄液、尿、または痰などの他の体液中に）天然で存在するＤＮＡ分子が挙げられる。ｃｆＤＮＡは、大型で複雑な生物学的有機体、例えば哺乳動物の１つまたは複数の細胞に以前は存在していたが、細胞（複数可）から有機体内に見出される流体へと放出されており、流体の試料から得ることができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞溶解ステップを実施する必要がない。ｃｆＤＮＡ分子は、ＤＮＡ断片として生じてもよい。

【0129】

核酸の文脈における「標的領域」は、例えば、プローブを使用することにより（例えば、配列相補性により）捕捉、識別、および／または検出が追求される遺伝子座または複数の遺伝子座を含む遺伝子領域を指す。「標的領域セット」または「標的領域のセット」は、例えばプローブのセットを使用することにより（例えば、配列相補性により）識別および／または捕捉の標的とされる複数のゲノム遺伝子座を指す。

【0130】

「配列可変標的領域」は、正常細胞と比べて、新生物細胞（例えば、腫瘍細胞およびがん細胞）において、ヌクレオチド置換（つまり、一塩基変異）、挿入、欠失、または遺伝子融合もしくは転座など、配列に変化を呈し得る標的領域を指す。配列可変標的領域セットは、配列可変標的領域のセットである。一部の実施形態では、配列可変標的領域は、５０個未満もしくはそれと等しい連続ヌクレオチド、例えば、４０、３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個未満もしくはそれと等しいヌクレオチドに影響を及ぼすか、または１個のヌクレオチドに影響を及ぼす変化を呈し得る標的領域である。

【0131】

「エピジェネティック標的領域」は、異なる細胞タイプもしくは組織タイプにおいて配列非依存性差異を（例えば、造血細胞とは異なる固形組織タイプにおいてメチル化の程度が異なる標的領域）、または正常細胞と比べて腫瘍細胞またはがん細胞などの新生物細胞において差異を示す可能性がある標的領域を指す。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域は、造血細胞を起源とするｃｆＤＮＡなど、バックグラウンドｃｆＤＮＡと比べて、肺、結腸など、通常はｃｆＤＮＡに実質的に寄与しない組織タイプを起源とするｃｆＤＮＡにおいて配列非依存性差異を示す。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域は、健常対象に由来するｃｆＤＮＡと比べて、がんを有する対象に由来するｃｆＤＮＡにおいて配列非依存性差異を示す。配列非依存性変化の例としては、メチル化（増加または減少）、ヌクレオソーム分布、ｃｆＤＮＡ断片化パターン、ＣＣＣＴＣ結合因子（「ＣＴＣＦ」）結合、転写開始部位、および調節タンパク質結合領域における変化が挙げられるが、これらに限定されない。「エピジェネティック標的領域セット」は、エピジェネティック標的領域のセットである。したがって、エピジェネティック標的領域セットとしては、高メチル化可変標的領域セット、低メチル化可変標的領域セット、ならびにＣＴＣＦ結合部位および転写開始部位などの断片化可変標的領域セットが挙げられるが、これらに限定されない。本目的では、新生物、腫瘍、またはがんに関連付けられる局所増幅および／または遺伝子融合の影響を受け易い遺伝子座も、エピジェネティック標的領域セットと同様に分析することができる。なぜならば、配列決定によるコピー数の変化の検出、または参照ゲノム中の１つよりも多くの遺伝子座にマッピングされる融合配列の検出は、例えば、局所増幅および／または遺伝子融合は、それらの検出が１つまたは少数の個々の位置における塩基コールの正確性に依存しないため、比較的浅い深度の配列決定で検出することができるという点で、ヌクレオチド置換、挿入、または欠失の検出よりも、上記で考察されている例示的なエピジェネティック変化の検出とより類似する傾向があるからである。

【0132】

本明細書で使用される場合、「エピジェネティック特徴」は、一次配列（つまり、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ塩基の配列）以外のＤＮＡまたはクロマチンのあらゆる特徴を指す。エピジェネティック特徴としては、メチル化などの塩基の共有結合修飾、ならびにヒストンおよび他の安定的にＤＮＡに会合するタンパク質の修飾および位置が挙げられる。

【0133】

本明細書で使用される場合、「差次的メチル化領域」は、別のタイプの組織におけるメチル化の度合いと比べて少なくとも１つのタイプの組織において、または前がん、がん、もしくは新生物を有する対象におけるメチル化の度合いと比べて健常対象に由来する試料において検出可能な程度に異なる度合いのメチル化を有するＤＮＡの領域を指す。一部の実施形態では、差次的メチル化領域は、健常対象に由来する無細胞ＤＮＡにおけるメチル化の度合いと比べて、少なくとも１つのタイプの組織において検出可能により高い度合いのメチル化を有する。一部の実施形態では、差次的メチル化領域は、健常対象に由来する無細胞ＤＮＡにおけるメチル化の度合いと比べて、少なくとも１つのタイプの組織において検出可能により低い度合いのメチル化を有する。一部の実施形態では、差次的メチル化領域は、赤血球系列または未熟赤血球（例えば、網状赤血球）では低メチル化されており、少なくとも１つの非赤血球細胞タイプまたは組織タイプ（例えば、白血球、または上皮細胞、筋細胞などの固形組織細胞タイプ）では高メチル化されている。

【0134】

本明細書で使用される場合、エピジェネティック変異の文脈における「タイプ特異的」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプにおいて、検出可能に異なる度合いで存在するエピジェネティック変異を意味する。同様に、「タイプ特異的エピジェネティック標的領域」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプにおいてまたは複数の関連する細胞タイプもしくは組織タイプにおいて検出可能に異なるエピジェネティック特質を有するエピジェネティック標的領域である。例示的なエピジェネティック特質は、上記に示されているエピジェネティック標的領域の定義において考察されている。例えば、「タイプ特異的差次的メチル化領域」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプまたは複数の関連する細胞タイプもしくは組織タイプにおいて検出可能に異なる度合いのメチル化を有するＤＮＡの領域である。タイプ特異的差次的メチル化領域の例としては、早期がんにおけるコピー数増加に関連付けられるものを含む、組織特異的差次的メチル化領域が挙げられる。一部の実施形態では、タイプ特異的差次的メチル化領域の捕捉、識別、および／または検出は、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプの識別を容易にする。タイプ特異的差次的メチル化領域の起源である細胞または組織は、野生型の細胞もしくは組織または新生物細胞もしくは組織であってもよい。別の例では、ＤＮＡの「タイプ特異的断片」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプまたは複数の関連する細胞タイプもしくは組織タイプにおいて検出可能に異なる度合いで存在するタイプ特異的断片化パターンから生じるＤＮＡ断片である。一部の実施形態では、タイプ特異的断片は、特定の細胞タイプまたは組織タイプ（複数可）にのみ存在する。一部の実施形態では、タイプ特異的断片は、特定の細胞タイプまたは組織タイプ（複数可）に検出可能により多い程度に存在する。

【0135】

本明細書で使用される場合、「血液試料」は、全血またはその成分（例えば、血漿、血清、バフィーコート、血漿ペレット）を含む試料を指す。

【0136】

本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子などの核酸の「分配」は、複数の部分試料または部分集団の各々において異なる割合で存在する１つまたは複数の修飾または特徴に基づき、核酸の試料または集団を核酸の複数の部分試料または部分集団へと分離、分画、選別、または富化することを意味する。分配は、１つまたは複数のメチル化核酸塩基の存在または非存在に基づき、核酸分子を物理的に分配することを含んでいてもよい。試料または集団は、遺伝子変化もしくはエピジェネティック変化または疾患状態を示す特質に基づき、１つまたは複数の分配された部分試料または部分集団に分配することができる。

【0137】

本明細書で使用される場合、「単離された元の」試料の形態は、試料が単離された時点で、および単離された試料の化学構造を変化させる何らかの手順を受ける前の、試料の組成または化学構造を指す。同様に、分子に「元々存在する」特徴は、分子が分子の化学構造を変化させる何らかの手順を受ける前に「元の分子」に存在する特徴、または特徴を「元々含む」分子に存在する特徴を指す。

【0138】

本明細書で使用される場合、「塩基対合特異性」は、所与の塩基が最も優先的に対合する標準ＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）を指す。例えば、未修飾シトシンおよび５－メチルシトシンは同じ塩基対合特異性（つまり、Ｇに対する特異性）を有するが、ウラシルおよびシトシンは、ウラシルがＡに対して塩基対合特異性を有し、シトシンがＧに対して塩基対合特異性を有するため、異なる塩基対合特異性を有する。それにも関わらず、ウラシルは４つの標準ＤＮＡ塩基の中で最も優先的にＡと対合するため、Ｇとゆらぎ対を形成するウラシルの能力は無関係である。

【0139】

少なくとも１つの標的領域を含む１つまたは複数の核酸などの１つまたは複数の標的分子の「捕捉」は、１つまたは複数の標的分子を非標的分子から優先的に単離または分離することを指す。

【0140】

本明細書で使用される場合、「標識」は、捕捉部分、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、またはそれが付着しているものの検出、分離、もしくは単離を容易にする他の部分である。

【0141】

本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、捕捉部分に連結した分子を、捕捉部分を欠如する分子から親和性分離することを可能にする分子である。例示的な捕捉部分としては、固相に連結されているかもしくは連結可能なストレプトアビジンに結合することにより親和性分離を可能にするビオチン、または固相に連結されているかまたは連結可能な相補的オリゴヌクレオチドに結合することにより親和性分離を可能にするオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【0142】

本明細書で使用される場合、「標的特異的プローブ」は、エピジェネティック標的領域または配列可変標的領域などの標的領域に特異的に結合するプローブを意味する。一部の実施形態では、標的特異的プローブは、それが特異的に結合する標的領域の捕捉を容易にする捕捉部分を含む。

【0143】

本明細書で使用される場合、「タグ」は、タグが会合している分子の特徴を示す情報を含む、核酸、標識、フルオロフォア、またはペプチドなどの分子である。例えば、分子は、試料タグ（１つの試料中の分子を異なる試料中の分子と区別する）、分子タグ／分子バーコード／バーコード（異なる分子を互いに区別する（一意的タグ付けシナリオおよび非一意的タグ付けシナリオの両方において）、精製タグ、および／または検出可能なタグもしくは標識を有してもよい。

【0144】

本明細書で使用される場合、「標的分子」は、捕捉、識別、および／または検出の標的とされる、タンパク質、炭水化物、核酸、または脂質などの分子である。一部の実施形態では、標的分子は、エピジェネティック標的領域および／または配列可変標的領域を含む核酸である。

【0145】

「特異的に結合する」は、プライマー、プローブ、もしくは他のオリゴヌクレオチド、タンパク質、または他の結合分子および標的配列の文脈では、適切なハイブリダイゼーション条件下で、プライマー、オリゴヌクレオチド、またはプローブが、その標的配列もしくはその複製物にハイブリダイズして安定ハイブリッドを形成し、同時に安定非標的ハイブリッドの形成が最小限に抑えられることを意味する。したがって、プライマーまたはプローブは、非標的配列よりも十分により大きな程度に標的配列またはその複製物にハイブリダイズして、最終的に標的配列の捕捉または検出を可能にする。適切なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または日常的な試験方法を使用することにより決定することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）の１．９０～１．９１節、７．３７～７．５７節、９．４７～９．５１節、および１１．４７～１１．５７節、特に９．５０～９．５１節、１１．１２～１１．１３節、１１．４５～１１．４７節、および１１．５５～１１．５７節を参照。こうした文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0146】

分子は、腫瘍細胞を起源とする場合、「腫瘍により産生される」という。腫瘍細胞を起源とするｃｆＤＮＡは、「循環腫瘍ＤＮＡ」（「ｃｔＤＮＡ」）である。腫瘍細胞は、腫瘍に留まるかまたは腫瘍から分離されるか（例えば、転移性がん細胞および循環腫瘍細胞の場合のように）に関わりなく、腫瘍を起源とする新生物細胞である。

【0147】

所与の標的領域セットに対するプローブのコレクションの「捕捉収量」は、プローブのコレクションが典型的な条件下で捕捉する標的領域セットに対応する核酸の量（例えば、別の標的領域セットと比べた量または絶対量）を指す。例示的で典型的な捕捉条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液を含む少量の反応体積（約２０μＬ）中で、試料核酸およびプローブを６５℃で１０～１８時間インキュベートすることである。捕捉収量は絶対値で表してもよく、プローブの複数のコレクションの場合は相対値で表してもよい。複数のセットの標的領域の捕捉収量を比較する場合は、捕捉収量を、標的領域セットのフットプリントサイズに対して正規化する（例えば、１キロベース当たりの基準で）。したがって、例えば、第１および第２の標的領域のフットプリントサイズがそれぞれ５０ｋｂおよび５００ｋｂである場合（正規化係数は０．１となる）、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積当たりの質量濃度が、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積当たりの質量濃度の０．１倍よりも大きい場合、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡよりも高い収量で捕捉されている。さらなる例として、同じフットプリントサイズを使用して、第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡが、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積当たりの質量濃度の０．２倍の体積当たりの質量濃度を有する場合、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡよりも２倍大きな捕捉収量で捕捉されていた。

【0148】

「メチル化」または「ＤＮＡメチル化」という用語は、核酸分子の核酸塩基へのメチル基の付加を指す。一部の実施形態では、メチル化は、ＣｐＧ部位（シトシン－リン酸－グアニン部位（つまり、核酸配列の５’－＞３’方向でシトシンの後にグアニンが続く）におけるシトシンへのメチル基の付加を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化は、Ｎ^６－メチルアデニンなど、アデニンへのメチル基の付加を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化は、５メチル化（シトシンの６員炭素環の５位の炭素の修飾）である。一部の実施形態では、５－メチル化は、シトシンの５Ｃ位にメチル基を付加して５－メチルシトシン（５ｍＣ）を作出することを指す。一部の実施形態では、メチル化は５ｍＣの誘導体を含む。５ｍＣの誘導体としては、５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５－ｆＣ）、および５－カルボキシルシトシン（5-caryboxylcytosine）（５－ｃａＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化は、３Ｃメチル化（シトシンの６員炭素環の３位の炭素の修飾）である。一部の実施形態では、３Ｃメチル化は、シトシンの３Ｃ位にメチル基を付加して３－メチルシトシン（３ｍＣ）を作出することを含む。メチル化は、非ＣｐＧ部位でも生じる可能性があり、例えば、メチル化は、ＣｐＡ、ＣｐＴ、またはＣｐＣ部位で生じる可能性がある。ＤＮＡメチル化は、メチル化ＤＮＡ領域の活性を変化させる可能性がある。例えば、プロモーター領域のＤＮＡがメチル化されると、遺伝子の転写が抑制される可能性がある。ＤＮＡメチル化は正常な発生にとって重要であり、メチル化の異常はエピジェネティック調節を混乱させる可能性がある。エピジェネティック調節の混乱、例えば抑制は、がんなどの疾患を引き起こす可能性がある。ＤＮＡのプロモーターメチル化はがんを示す可能性がある。

【0149】

「高メチル化」という用語は、ＤＮＡ分子の集団（例えば、試料）内の他のＤＮＡ分子と比べて、ＤＮＡのメチル化のレベルまたは度合いが増加することを指す。一部の実施形態では、高メチル化ＤＮＡは、少なくとも１つのメチル化残基、少なくとも２つのメチル化残基、少なくとも３つのメチル化残基、少なくとも５つのメチル化残基、または少なくとも１０個のメチル化残基を含むＤＮＡ分子を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「タイプ特異的高メチル化」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプまたは複数の関連する細胞タイプもしくは組織タイプにおけるＤＮＡのメチル化のレベルまたは度合いが増加することを意味する。一部の実施形態では、タイプ特異的高メチル化領域の捕捉、識別、および／または検出は、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプの識別を容易にする。タイプ特異的高メチル化領域の起源である細胞または組織は、野生型細胞もしくは組織または新生物細胞もしくは組織であってもよい。

【0150】

「低メチル化」という用語は、核酸分子の集団（例えば、試料）内の他の核酸分子と比べて、核酸分子（複数可）のメチル化のレベルまたは度合いが減少することを指す。一部の実施形態では、低メチル化ＤＮＡは、非メチル化ＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、低メチル化ＤＮＡは、０個のメチル化残基、最大で１個のメチル化残基、最大で２個のメチル化残基、最大で３個のメチル化残基、最大で４個のメチル化残基、または最大で５個のメチル化残基を含むＤＮＡ分子を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「タイプ特異的低メチル化」は、他の細胞タイプまたは組織タイプと比べて、１つの細胞タイプもしくは組織タイプまたは複数の関連する細胞タイプもしくは組織タイプにおけるＤＮＡのメチル化のレベルまたは度合いが減少することを意味する。一部の実施形態では、タイプ特異的低メチル化領域の捕捉、識別、および／または検出は、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプの識別を容易にする。タイプ特異的低メチル化領域の起源である細胞または組織は、野生型細胞もしくは組織または新生物細胞もしくは組織であってもよい。

【0151】

「ＤＮＡの修飾核酸塩基を認識する作用剤」、例えば「ＤＮＡの修飾シトシンを認識する作用剤」という用語は、ＤＮＡの１つまたは複数の修飾核酸塩基、例えばメチルシトシンに結合または検出する分子または試薬を指す。「修飾核酸塩基」は、未修飾核酸塩基との化学構造の違いを含む核酸塩基である。ＤＮＡの場合、未修飾核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、またはチミンである。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。一部の実施形態では、修飾核酸塩基はメチル化核酸塩基である。一部の実施形態では、修飾シトシンはメチルシトシン、例えば５－メチルシトシンである。そのような実施形態では、シトシン修飾はメチルである。ＤＮＡのメチルシトシンを認識する作用剤としては、本明細書ではメチルシトシンに結合する試薬であることを指す「メチル結合試薬」が挙げられるが、これらに限定されない。メチル結合試薬としては、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）、メチル結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびメチルシトシンに特異的な抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、そのような抗体は、ＤＮＡの５－メチルシトシンに結合する。一部のそのような実施形態では、ＤＮＡは一本鎖であってもよくまたは二本鎖であってもよい。

【0152】

「またはそれらの組合せ（単数）」および「またはそれらの組合せ（複数）」という用語は、本明細書で使用される場合、この用語の前に列挙されている用語のありとあらゆる順列および組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、特定の文脈において順序が重要である場合は、さらにＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢの少なくとも１つを含むことが意図されている。この例で説明を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、およびＣＡＢＡＢＢなど、１つまたは複数の項目または用語の繰り返しを含む組合せが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈からそうでないことが明らかでない限り、典型的には、任意の組合せの項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

【0153】

「または」は、文脈が別様に要求しない限り、包括的な意味で、つまり「および／または」と等価的に使用される。
ＩＩ．例示的な方法
Ａ．向上された感度でＤＮＡを分析するための方法

【0154】

本明細書におけるＤＮＡを分析するための方法は、ＤＮＡを、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を有する標的領域を含むエピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を有する標的領域からなる。一部のそのような実施形態では、複数の標的特異的プローブは、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的なプローブからなる。一部の実施形態では、標的領域は、タイプ特異的差次的メチル化領域およびコピー数変異体を含む。一部の実施形態では、標的領域は、タイプ特異的断片化パターンおよびコピー数変異体から生じるタイプ特異的断片を含む。一部の実施形態では、タイプ特異的エピジェネティック変異は、他の細胞タイプまたは組織タイプの野生型ゲノムと比べて、１つまたは複数の細胞タイプまたは組織タイプの野生型ゲノムにおいてより高い割合で存在する。一部の実施形態では、ＤＮＡは、対象から得られる血液試料に由来する。一部の実施形態では、本明細書の方法は、試料中の、ｃｆＤＮＡなどのタイプ特異的ＤＮＡの異常レベルを検出する。例えば、血液試料中の固形組織を起源とする、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡの正常よりも高いレベルの検出は、固形組織に関する疾患の存在を示すことができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ分析は、対象ががんまたは前がんを有する可能性を決定するために使用される。

【0155】

一部の実施形態では、標的領域のコピー数は、増幅されているかまたは異常に高く、それにより標的領域の検出感度を増加させることが容易になる。一部の実施形態では、標的領域は、タイプ特異的高メチル化領域である。一部の実施形態では、標的領域は、タイプ特異的低メチル化領域である。一部の実施形態では、タイプ特異的差次的メチル化領域は、１つまたは複数の関連する細胞タイプにおいて差次的にメチル化されている。一部のそのような実施形態では、標的領域は、非免疫細胞と比べて免疫細胞において差次的にメチル化されている。一部の実施形態では、タイプ特異的差次的メチル化領域は、１つまたは複数の関連する組織タイプにおいて差次的にメチル化されている。一部のそのような実施形態では、標的領域は、血液試料などの試料中に通常見出される細胞タイプと比べて、１つまたは複数の固形組織タイプにおいて差次的にメチル化されている。一部のそのような実施形態では、標的領域は、血液試料などの試料中に通常見出される細胞タイプと比べて、膀胱組織以外の１つまたは複数の固形組織タイプにおいて差次的にメチル化されている。一部の実施形態では、標的領域は、膀胱において差次的にメチル化されている領域を除外する。一部の実施形態では、標的領域はタイプ特異的断片である。一部の実施形態では、タイプ特異的断片は、１つまたは複数の関連する細胞タイプに特異的な断片化パターンから生じる。一部のそのような実施形態では、断片化パターンは、非免疫細胞と比べて免疫細胞に特異的である。一部の実施形態では、タイプ特異的断片化パターンは、１つまたは複数の関連する組織タイプに特異的である。一部のそのような実施形態では、断片化パターンは、血液試料などの試料中に通常見出される細胞タイプと比べて、１つまたは複数の固形組織タイプに特異的である。

【0156】

一部の実施形態では、１つまたは複数の標的領域のコピー数変異は、局所増幅である。一部のそのような実施形態では、局所増幅はがんに関連付けられる。一部の実施形態では、複数の標的領域は、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＲＡＦ１の１つまたは複数の領域を含む。例えば、一部の実施形態では、複数の標的領域は、上述の遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個を含む。したがって、一部の実施形態では、複数の標的特異的プローブは、各々が少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の上述の遺伝子の１つに特異的に結合するプローブを含む。

【0157】

一部の実施形態では、標的領域は、非免疫細胞を起源とする、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡと比べて、免疫細胞を起源とする、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡに特異的なタイプ特異的エピジェネティック変異を含む。一部のそのような実施形態では、複数の標的領域は、非免疫細胞と比べて免疫細胞において差次的にメチル化されている標的領域を含む。一部のそのような実施形態では、複数の標的領域は、非免疫細胞と比べて少なくとも一部のタイプの免疫細胞において高メチル化されている標的領域を含む。一部の実施形態では、複数の標的領域は、非免疫細胞と比べて少なくとも一部のタイプの免疫細胞において低メチル化されている標的領域を含む。一部の実施形態では、複数の標的領域は、非免疫細胞と比べて免疫細胞においてより高い割合で存在する断片化パターンを含む。一部の実施形態では、標的領域は、試料中に存在する他の免疫細胞タイプおよび非免疫細胞と比べて、複数の免疫細胞タイプを起源とするｃｆＤＮＡに特異的なタイプ特異的エピジェネティック変異を含む。一部のそのような実施形態では、複数の免疫細胞タイプは、ナイーブリンパ球および活性化リンパ球；単球およびマクロファージ；または骨髄球、好中球、および好酸球を含む。一部の実施形態では、複数の免疫細胞タイプは、ナイーブＴ細胞、ナイーブＢ細胞、エフェクターＣＤ４ Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、形質細胞、およびメモリ細胞を含む。一部の実施形態では、複数の免疫細胞タイプは後骨髄球を含む。一部の実施形態では、複数の免疫細胞タイプはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。

【0158】

一部の実施形態では、標的領域は、試料中に見出される他の細胞タイプなどの他の細胞タイプまたは組織タイプを起源とする、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡと比べて、固形組織を起源とする、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡに特異的なタイプ特異的エピジェネティック変異を含む。一部のそのような実施形態では、複数の標的領域は、試料中の他の組織タイプまたは細胞タイプと比べて固形組織タイプにおいて差次的にメチル化されている標的領域を含む。一部の実施形態では、複数の標的領域は、試料中の他の組織タイプまたは細胞タイプと比べて固形組織タイプにおいて高い割合で存在する断片化パターンを含む。一部の実施形態では、固形組織タイプは、結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、前立腺、皮膚、膀胱、または膵臓である。

【0159】

一部の実施形態では、複数の標的領域は、タイプ特異的高メチル化領域を含む。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、試料中の標的領域の平均メチル化より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、試料中の標的領域の平均メチル化よりも５～１０％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、または１０～５０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、試料中のＤＮＡの平均メチル化より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、試料中のＤＮＡの平均メチル化よりも５～１０％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、または１０～５０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、タイプ特異的高メチル化標的領域の１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプよりも細胞タイプまたは組織タイプを起源とするＤＮＡにおいて対応する標的領域の平均メチル化よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、高メチル化標的領域は、タイプ特異的高メチル化標的領域の１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプよりも細胞タイプまたは組織タイプを起源とするＤＮＡにおいて対応する標的領域の平均メチル化よりも５～１０％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、または１０～５０％高い程度にメチル化されている。一部の実施形態では、タイプ特異的高メチル化標的領域は、健常細胞（例えば、１つまたは複数の固形組織タイプの健常細胞）または健常対象において高メチル化されている。そのような実施形態では、そのような標的領域のメチル化ステータス自体は、疾患の存在を直接的に示すものではない可能性がある。そのような標的領域のメチル化ステータスは、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプを示し、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプが、所与の試料に著しいレベルで存在することが予想されない場合、例えば、ＤＮＡが血液試料中の結腸組織に由来する場合、それは、試料が得られた対象に疾患が存在することを示すことができる。一部の実施形態では、タイプ特異的高メチル化標的領域は、健常細胞および対象において、ならびに疾患細胞、ならびに疾患を有する対象において高メチル化されている。一部のそのような実施形態では、メチル化の程度は、健常細胞と比較して疾患細胞においてさらに増加し、それにより、それが得られた対象における疾患を示す可能性があるタイプ特異的ＤＮＡの検出感度がさらに増加する。

【0160】

一部の実施形態では、複数の標的領域は、タイプ特異的断片化パターンを含む。一部の実施形態では、そのようなタイプ特異的断片化パターンにより産生される断片は、健常対象から得られる試料中の断片の平均レベルよりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％高いレベルで存在する。一部の実施形態では、そのようなタイプ特異的断片化パターンにより産生される断片は、健常対象から得られる試料中の断片の平均レベルよりも５～１０％、１０～２０％、１０～３０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、または１０～５０％高いレベルで存在する。一部の実施形態では、タイプ特異的断片化パターンは、健常細胞または健常対象に存在する。そのような実施形態では、対応する断片の存在は、疾患の存在を直接的に示すものではない可能性がある。そのような断片化の存在は、ＤＮＡの起源である細胞タイプまたは組織タイプを示し、所与の試料に存在することが予想されない細胞タイプまたは組織タイプを起源とするＤＮＡ、例えば血液試料中の結腸組織に由来するＤＮＡの存在は、試料が得られた対象に疾患が存在することを示すことができる。一部のそのような実施形態では、タイプ特異的断片化パターンに対応する断片のレベルは、健常細胞と比較して疾患細胞においてさらに増加し、それにより、それが得られた対象における疾患を示す可能性があるタイプ特異的ＤＮＡの検出感度をさらに増加させる。ＤＮＡ断片化パターンを分析するための例示的なアプローチは、例えば、ＷＯ２０２２０４０１６３Ａ１、ＵＳ１１３５２６７０Ｂ２、ＵＳ２０２０００５６２４５Ａ１、ＵＳ１０２９７３４２Ｂ２、ＵＳ１０７４１２７０Ｂ２、ＵＳ１０４５３５５６Ｂ２、ＵＳ９８９２２３０Ｂ２、ＥＰ３６１７３２４Ａ１、およびＥＰ２８６０２６６Ｂ１に提供されており、こうした文献は各々、あらゆる目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0161】

一部の実施形態では、複数の標的領域は、異常に高いコピー数を有するコピー数変異体、例えば局所増幅または重複を含む。一部のそのような実施形態では、標的領域のコピー数の増加は、本明細書に記載の方法の感度をさらに増加させる。一部の実施形態では、コピー数変異体は、タイプ特異的コピー数変異体である。一部の実施形態では、コピー数変異体は異常に高く、前がんまたはがんに関連付けられる。一部の実施形態では、コピー数変異体は、早期がんまたは前がんにおいて生じることが公知であるコピー数増幅である。一部のそのような実施形態では、コピー数変異体は、疾患を有する対象に存在する。一部の実施形態では、コピー数変異体は、健常細胞と比較して疾患細胞において異常に高く、それにより、それが得られた対象における疾患を示す可能性があるタイプ特異的ＤＮＡの検出感度が増加する。
Ｂ．対象

【0162】

一部の実施形態では、対象に由来するＤＮＡまたは核酸は、がんもしくは前がんを有する対象から得られ、および／またはがんもしくは前がんを有する対象から得られる試料に由来する。一部の実施形態では、試料は、がんまたは前がんを有することが疑われる対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、腫瘍を有する対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、腫瘍を有することが疑われる対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、新生物を有する対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、新生物を有することが疑われる対象から得られる。一部の実施形態では、試料は、腫瘍、がん、または新生物が寛解している（例えば、化学療法、外科的切除、放射線療法、またはそれらの組合せ後の）対象から得られる。上述の実施形態のいずれかでは、前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物、または前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物の疑いは、膀胱、頭頸部、肺、結腸、直腸、腎臓、乳房、前立腺、皮膚、または肝臓のものであってもよい。一部の実施形態では、前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物、または前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物の疑いは、肺のものである。一部の実施形態では、前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物、または前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物の疑いは、結腸または直腸のものである。一部の実施形態では、前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物、または前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物の疑いは、乳房のものである。一部の実施形態では、前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物、または前がん、がん、腫瘍、もしくは新生物の疑いは、前立腺のものである。上述の実施形態のいずれかでは、対象はヒト対象であってもよい。一部の実施形態では、試料は、ステージＩのがん、ステージＩＩのがん、ステージＩＩＩのがん、またはステージＩＶのがんを有する対象から得られる。
Ｃ．標的特異的プローブを使用した核酸の分析

【0163】

本明細書における、試料に由来するＤＮＡまたは核酸を分析するための方法は、ＤＮＡを、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を両方とも有する標的領域を含むかまたはそれからなるエピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含む。一部の実施形態では、タイプ特異的エピジェネティック変異は差次的メチル化である。一部の実施形態では、タイプ特異的変異は、タイプ特異的断片化パターンである。一部の実施形態では、コピー数変異は、異常に高いコピー数である。

【0164】

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、試料に由来するＤＮＡを、配列可変標的領域および／または第２のエピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブと接触させること、ならびに標的領域の配列可変セットおよび／または第２のエピジェネティックセットに特異的なプローブにアニーリングするＤＮＡを捕捉することをさらに含む。そのような実施形態は、本明細書で開示されるものなどの方法を使用して、捕捉されたＤＮＡを配列決定することをさらに含む。

【0165】

本方法は、対象における状態、特にがんまたは前がんの存在を診断し、状態を特徴付け（例えば、がんを病期分類するかまたはがんの不均質性を決定し）、状態の処置に対する応答をモニターし、状態の発症または状態のその後の経過の予後リスクをもたらすために使用することができる。本開示は、特定の処置選択肢の有効性を決定するためにも有用であり得る。処置が成功すると、ＤＮＡを排出するがん細胞はより少なくなるため、処置選択肢の成功は、対象の血液中で検出されるコピー数変異または希少突然変異の量を減少させる可能性がある。他の例では、これは生じない可能性がある。別の例では、おそらくは、ある特定の処置選択肢は、時間の経過と共にがんの遺伝子プロファイルと相関する可能性がある。この相関性は、療法を選択する際に有用であり得る。

【0166】

加えて、がんが処置後に寛解していることが観察された場合、本方法を使用して、残留疾患または疾患の再発をモニターすることができる。

【0167】

検出することができるがんのタイプおよび数としては、血液がん、脳がん、肺がん、皮膚がん、鼻がん、喉がん、肝臓がん、骨がん、リンパ腫、膵臓がん、皮膚がん、腸がん、直腸がん、結腸がん、前立腺がん、甲状腺がん、膀胱がん、頭頸部がん、腎臓がん、口腔がん、胃がん、固形腫瘍、不均質腫瘍、および均質腫瘍などを挙げることができる。がんのタイプおよび／または病期は、突然変異、希少突然変異、インデル、コピー数変異、トランスバージョン、転座、組換え、逆位、欠失、異数性、部分異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子切断、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常変化、エピジェネティックパターンの異常変化、および核酸５－メチルシトシンの異常変化を含む遺伝子変異から検出することができる。

【0168】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍（または新生物細胞、またはがん細胞）によりまたは前がん細胞により産生される、ＤＮＡなどの核酸の存在を識別することを含む。

【0169】

また、遺伝子データは、特定の形態のがんを特徴付けるために使用することができる。がんは、組成および病期が両方とも不均質であることが多い。遺伝子プロファイルデータは、がんの特定のサブタイプの特徴付けを可能にすることができ、それは、その特定のサブタイプの診断または処置に重要であり得る。また、この情報は、特定のタイプのがんの予後に関する手がかりを対象または担当医に提供し、対象または担当医が疾患の進行に応じて処置選択肢を適応させることを可能にすることができる。一部のがんは進行してより侵襲性になり、遺伝的に不安定になる可能性がある。他のがんは、良性、不活性、または休止状態のままである可能性がある。本開示の系および方法は、疾患進行の決定に有用であり得る。

【0170】

さらに、本開示の方法は、対象における異常状態の不均質性を特徴付けるために使用することができる。このような方法は、例えば、対象に由来するＤＮＡのプロファイルを生成することを含んでいてもよく、プロファイルは、エピジェネティックおよび突然変異分析から得られる複数のデータを含む。一部の実施形態では、異常状態は、がんまたは前がんである。一部の実施形態では、異常状態は、不均質なゲノム集団をもたらすものであってもよい。がんの例では、一部の腫瘍は、異なる病期のがんの腫瘍細胞を含むことが公知である。他の例では、不均質性は、複数の疾患病巣を含んでいてもよい。この場合も、がんの例では、複数の腫瘍病巣が存在する可能性があり、おそらくは１つまたは複数の病巣は、原発部位から広がった転移の結果である。

【0171】

本方法は、不均質疾患の異なる細胞に由来する情報の総和であるプロファイル、フィンガープリント、またはデータセットを生成するために使用することができる。このデータセットは、構造変異同一性およびレベル、コピー数変異、エピジェネティック変異、または他の突然変異分析を、単独でまたは組合せで含んでいてもよい。

【0172】

本方法は、前がん、がん、または他の疾患を、診断、予後予測、モニター、または観察するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書の方法は、胎児を診断、予後予測、またはモニターすることを含まず、したがって非侵襲的出生前検査に関するものではない。他の実施形態では、こうした方法論は、ＤＮＡおよび他のポリヌクレオチドが母体分子と共循環する可能性のある胎児対象におけるがんまたは他の疾患を診断、予後予測、モニター、または観察するために、妊娠対象において使用することができる。

【0173】

ＤＮＡを分析するための例示的な方法は、以下のステップを含む：
１．アダプターをＤＮＡにライゲートさせ、ＤＮＡを増幅することにより、抽出されたＤＮＡ試料（例えば、ヒト試料から抽出された血漿ＤＮＡ）を調製するステップ。
２．ＤＮＡを、ＤＮＡ中のメチルシトシンなどの修飾シトシンを認識する作用剤と接触させることにより、アダプターライゲーションＤＮＡを複数の差次的メチル化部分試料へと分配するステップ。
３．部分試料を、ビオチンを含む標的特異的プローブと接触させ、次いで部分試料を、ストレプトアビジンを含む固体支持体などの、捕捉部分の結合パートナーを含む固体支持体と接触させることにより、分配された部分試料に由来する異常に高いコピー数を有するタイプ特異的高メチル化標的領域を含むＤＮＡを捕捉するステップ。
４．捕捉されたＤＮＡを富化および／または溶出するステップ。
５．捕捉されたＤＮＡを再増幅し、ＮＧＳ機器によりマルチプレックスでアッセイするステップ。
６．一意的分子を識別するために使用されるアダプターの分子タグを用いて、ＮＧＳデータを分析するステップ。

【0174】

一部の実施形態では、ＤＮＡを捕捉する前に、分配されたＤＮＡをＰＣＲ増幅により増幅することができる。一部の実施形態では、捕捉配列のレベルの決定は、疾患診断または適切な処置の識別を容易にする。一部の実施形態では、１つまたは複数の捕捉配列の存在またはそのレベルの変化は、対象におけるがんまたは前がんなどの疾患または障害の存在を示す。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域における配列非依存性変化のｃｆＤＮＡ分析、例えば本明細書に記載のｃｆＤＮＡ分析と組み合わせた標的分子の検出は、対象における疾患または障害、例えば、がん、前がん、または健常対象と比べて核酸に変化を引き起こす他の障害が存在することを示す。
Ｄ．ＤＮＡの分析および／または分配

【0175】

本明細書で開示される方法は、試料中のＤＮＡを分析することを含む。そのような方法では、異なる形態のＤＮＡ（例えば、高メチル化ＤＮＡおよび低メチル化ＤＮＡ）を、ＤＮＡの１つまたは複数の特質に基づいて物理的に分配することができる。この手法は、例えば、ある特定の配列が高メチル化されているかまたは低メチル化されているかを決定するために使用することができる。

【0176】

メチル化プロファイリングは、ゲノムの異なる領域にわたってメチル化パターンを決定することを含んでいてもよい。例えば、メチル化の程度（例えば、１分子当たりのメチル化核酸塩基の相対数）および配列決定に基づき分子を分配した後、異なる分配画分中の分子の配列を参照ゲノムに対してマッピングすることができる。これにより、他の領域と比較して、より高度にメチル化されているか、またはそれほど高度にメチル化されていないゲノムの領域を示すことができる。このように、ゲノム領域は、個々の分子とは対照的に、メチル化の程度が異なる可能性がある。

【0177】

試料中の核酸分子を分配することにより、例えば、試料の１つの分配画分においてより多く存在する希少核酸分子を富化することにより、希少シグナルを増加させることができる。例えば、高メチル化ＤＮＡには存在するが、低メチル化ＤＮＡにはより少量で存在する（または存在しない）遺伝子変異は、試料を高メチル化核酸分子と低メチル化核酸分子とに分配することにより、より容易に検出することができる。試料の複数の分配画分を分析することにより、単一分子の多次元分析を実施することができ、したがってより高い感度を達成することができる。分配は、１つまたは複数のメチル化核酸塩基の存在または非存在に基づき、核酸分子を分配画分または部分試料へと物理的に分配することを含んでいてもよい。試料は、差次的遺伝子発現または疾患状態を示す特質に基づき、分配画分または部分試料へと分配することができる。試料は、核酸、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、非ｃｆＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、および無細胞核酸（ｃｆＮＡ）の分析中に、正常状態と疾患状態との間でシグナルの差異をもたらす特質またはその組合せに基づいて分配することができる。

【0178】

一部の実施形態では、高メチル化および／または低メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが、腫瘍細胞、または分析されているＤＮＡ試料（ｃｆＤＮＡなど）に通常は寄与しないタイプの細胞、および／または特定の免疫細胞タイプの異なるメチル化特質を示すか否かを決定する。

【0179】

一部の場合では、試料中の不均質ＤＮＡは、２つまたはそれよりも多くの分配画分（例えば、少なくとも３、４、５、６、または７つの分配画分）に分配される。一部の実施形態では、各分配画分は差次的にタグ付けされる。次いで、タグ付き分配画分は、集合的な試料調製および／または配列決定のために一緒にプールすることができる。分配－タグ付け－プール化ステップは１回よりも多く行ってもよい、各ラウンドの分配は、異なる特質（例は本明細書に提供されている）に基づいて行われ、他の分配画分および分配手段と区別される差次的タグを使用してタグ付けされる。他の例では、差次的タグ付き分配画分は別々に配列決定される。

【0180】

一部の実施形態では、差次的タグ付きプールＤＮＡに由来する配列リードが得られ、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで分析される。タグは、異なる分配画分に由来するリードを選別するために使用される。遺伝子変異を検出するための分析は、分配画分ごとのレベル、ならびに全核酸集団レベルで実施することができる。例えば、分析は、各分配画分の核酸におけるＣＮＶ、ＳＮＶ、インデル、融合などの遺伝子変異体を決定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を含んでいてもよい。一部の場合では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析は、クロマチン構造の決定を含んでいてもよい。例えば、配列リードの網羅範囲を使用して、クロマチンにおけるヌクレオソーム位置を決定することができる。より高い網羅範囲は、ゲノム領域におけるヌクレオソーム占有率がより高いことと相関する可能性があり、より低い網羅範囲は、ヌクレオソーム占有率がより低いことまたはヌクレオソーム枯渇領域（ＮＤＲ）と相関する可能性がある。

【0181】

分配に使用することができる特質の例としては、配列長、メチル化レベル、ヌクレオソーム結合、配列ミスマッチ、免疫沈降、および／またはＤＮＡに結合するタンパク質が挙げられる。得られる分配画分としては、以下の核酸形態：一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、短鎖ＤＮＡ断片、および長鎖ＤＮＡ断片の１つまたは複数が挙げられる。一部の実施形態では、一般に、シトシン修飾（例えば、シトシンメチル化）またはメチル化に基づく分配を実施し、必要に応じて、ＤＮＡの上述の特質または形態のいずれかに基づいていてもよい少なくとも１つの追加の分配ステップを組み合わせる。一部の実施形態では、核酸の不均質集団は、１つまたは複数のエピジェネティック修飾を有する核酸と、１つまたは複数のエピジェネティック修飾を有さない核酸とに分配される。エピジェネティック修飾の例としては、メチル化の存在または非存在、メチル化のレベル、メチル化のタイプ（例えば、５－メチルシトシン対アデニンメチル化および／またはシトシンヒドロキシメチル化などの他のタイプのメチル化）、ならびにヒストンなどの１つまたは複数のタンパク質との会合および会合のレベルが挙げられる。代替的にまたは加えて、核酸の不均質集団を、ヌクレオソームと会合している核酸分子とヌクレオソームを欠く核酸分子とに分配してもよい。代替的にまたは加えて、核酸の不均質集団を、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）と二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）とに分配してもよい。代替的にまたは加えて、核酸の不均質集団を、核酸長（例えば、最大１６０ｂｐの分子および１６０ｂｐよりも大きな長さを有する分子）に基づいて分配してもよい。

【0182】

試料内の核酸の集団を分配するために使用される作用剤は、所望の特異性を有する抗体、天然結合パートナー、もしくはそれらの変異体（Bock et al., Nat Biotech 28: 1106-1114 (2010)；Song et al., Nat Biotech 29: 68-72 (2011)）、または所与の標的に対する特異性を有するように例えばファージディスプレイにより選択された人工ペプチドなどの親和性作用剤であってもよい。一部の実施形態では、分配に使用される作用剤は、修飾核酸塩基を認識する作用剤である。一部の実施形態では、作用剤により認識される修飾核酸塩基は、メチルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）などの修飾シトシンである。一部の実施形態では、作用剤により認識される修飾核酸塩基は、ＤＮＡ中の第１の核酸塩基に対して、試料のＤＮＡ中の第２の核酸塩基とは異なるように影響を及ぼす手順の産物である。一部の実施形態では、修飾核酸塩基は、その塩基対合特異性が手順により変更されたことを意味する「変換された核酸塩基」であってもよい。例えば、ある特定の手順では、非メチル化もしくは未修飾のシトシンがジヒドロウラシルへと変換されるか、またはより一般には、少なくとも１つの修飾形態もしくは未修飾形態のシトシンが脱アミノ化を受け、ウラシル（ＤＮＡの文脈では修飾核酸塩基とみなされる）もしくはさらなる修飾形態のウラシルがもたらされる。分配作用剤の例としては、メチルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）などの修飾シトシンであってもよい修飾核酸塩基を認識する抗体などの抗体が挙げられる。一部の実施形態では、分配作用剤は、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）などの５－メチルシトシン以外の修飾シトシンを認識する抗体である。代替的な分配作用剤としては、ＭｅＣＰ２などのタンパク質を含む、本明細書に記載のメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）およびメチル結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられる。

【0183】

分配作用剤の追加の非限定的な例は、ヒストンに結合した核酸を、遊離または未結合核酸から分離することができるヒストン結合タンパク質である。本明細書で開示される方法で使用することができるヒストン結合タンパク質の例としては、ＲＢＢＰ４、ＲｂＡｐ４８、およびＳＡＮＴドメインペプチドが挙げられる。

【0184】

一部の実施形態では、分配は、バイナリ分配および修飾の度合い／レベルに基づく分配の両方を含んでいてもよい。例えば、メチル化断片を、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）により分配してもよく、またはすべてのメチル化断片を、メチル結合ドメインタンパク質（例えば、ＭｅｔｈｙｌＭｉｎｄｅｒメチル化ＤＮＡ富化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して非メチル化断片から分配してもよい。その後、追加の分配は、メチル結合ドメインおよび結合断片を有する溶液中の塩濃度を調整することにより、異なるレベルのメチル化を有する断片を溶出することを含んでいてもよい。塩濃度が増加すると共に、より高いメチル化レベルを有する断片が溶出される。

【0185】

ＤＮＡの分析は、目的のＤＮＡの検出または定量化を含んでいてもよい。ＤＮＡの分析は、遺伝子変異体および／またはエピジェネティック特徴（例えば、ＤＮＡメチル化および／またはＤＮＡ断片化）を検出することを含んでいてもよい。

【0186】

一部の実施形態では、メチル化レベルは、分配、亜硫酸水素塩変換などの修飾感受性変換、配列決定中の直接検出、メチル化感受性制限酵素消化、メチル化依存性制限酵素消化、または任意の他の好適な手法を使用して決定することができる。例えば、異なる形態のＤＮＡ（例えば、高メチル化ＤＮＡおよび低メチル化ＤＮＡ）を、ＤＮＡの１つまたは複数の特質に基づいて物理的に分配することができる。例えば、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４、またはＭｅＣＰ２などのＭＢＤ）または５－メチルシトシンに特異的な抗体（ＭｅＤＩＰなど）を使用して、ＤＮＡを分配することができる。この手法は、例えば、ある特定の配列が高メチル化されているかまたは低メチル化されているかを決定するために使用することができる。一部の実施形態では、ＤＮＡ断片化パターンは、ｃｆＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子の終点および／または中心点に基づいて決定することができる。

【0187】

一部の場合では、最終分配画分には、異なる程度の修飾（修飾の過剰存在または過少存在）を有する核酸が富化される。過剰存在および過少存在は、核酸に生じた修飾の数を、集団中の１鎖当たりの修飾数の中央値と比べることにより規定することができる。例えば、試料中の核酸の５－メチルシトシン残基数の中央値が２である場合、２つよりも多くの５－メチルシトシン残基を含む核酸では、この修飾が過剰存在し、５－メチルシトシン残基が１つまたはゼロである核酸では、過少存在する。親和性分離の効果は、結合相には修飾が過剰存在する核酸が富化され、非結合相（つまり、溶液中）には修飾が過少存在する核酸が富化されることである。結合相中の核酸は、その後の処理前に溶出することができる。

【0188】

ＭｅＤＩＰまたはＭｅｔｈｙｌＭｉｎｅｒ（登録商標）メチル化ＤＮＡ富化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用すると、連続溶出を使用して種々のレベルのメチル化を分配することができる。例えば、低メチル化分配画分（メチル化無し）は、核酸集団を、磁気ビーズに付着させたキットのＭＢＤと接触させることにより、メチル化分配画分から分離することができる。ビーズは、メチル化核酸を非メチル化核酸から分離するために使用される。続いて、１つまたは複数の溶出ステップを連続して実施して、異なるレベルのメチル化を有する核酸を溶出させる。例えば、メチル化核酸の第１のセットを、１６０ｍＭまたはそれよりも高い、例えば少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、または２０００ｍＭの塩濃度で溶出させてもよい。そのようなメチル化核酸を溶出させた後、磁気分離をもう一度使用して、より高レベルのメチル化核酸をメチル化のレベルがより低いメチル化核酸から分離する。溶出および磁気分離ステップを繰り返して、低メチル化分配画分（メチル化を含まない核酸が富化されている）、メチル化分配画分（低レベルのメチル化を含む核酸が富化されている）、および高メチル化分配画分（高レベルのメチル化を含む核酸が富化されている）など、種々の分配画分を作出することができる。

【0189】

一部の方法では、親和性分離に基づく分配に使用される作用剤に結合した核酸を洗浄ステップに供する。洗浄ステップでは、親和性作用剤に弱く結合した核酸を洗い流す。そのような核酸は、平均値または中央値に近い程度に修飾を有する核酸（つまり、試料と作用剤との初期接触時に固相に結合したままの核酸と固相に結合しない核酸との間の中間）に富化することができる。

【0190】

親和性分離は、修飾の程度が異なる少なくとも２つ、場合によっては３つまたはそれよりも多くの核酸の分配画分をもたらす。分配画分は依然として別々であるが、少なくとも１つの分配画分、通常は２つまたは３つ（またはそれよりも多く）の分配画分の核酸は、通常はアダプターの成分として提供される核酸タグに連結されており、異なる分配画分の核酸は、１つの分配画分のメンバーを別の分配画分のメンバーから区別する異なるタグを受け取る。同じ分配画分の核酸分子に連結されたタグは、互いに同じであってもよくまたは異なっていてもよい。しかしながら、互いに異なる場合、タグは、それらが付着している分子が特定の分配画分のものであることを識別するために、それらのコードの一部が共通していてもよい。

【0191】

メチル化などの特質に基づく核酸試料の分配に関するさらなる詳細は、ＷＯ２０１８／１１９４５２を参照されたい。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0192】

一部の実施形態では、分配は、ＤＮＡを、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）および／またはメチル化依存性制限酵素（ＭＤＲＥ）と接触させることを含む。ＭＳＲＥまたはＭＤＲＥによるＤＮＡの処理後、ＤＮＡをサイズに基づいて分配して、高メチル化（ＭＳＲＥ処理後の最長ＤＮＡ分子およびＭＤＲＥ処理後の最短ＤＮＡ断片）、中間（ＭＳＲＥまたはＭＤＲＥ処理後の中間長ＤＮＡ分子）、および低メチル化（ＭＳＲＥ処理後の最短ＤＮＡ分子およびＭＤＲＥ処理後の最長ＤＮＡ断片）部分試料を生成することができる。

【0193】

一部の実施形態では、分配は、核酸を、メチル結合タンパク質（「ＭＢＰ」）のメチル結合ドメイン（「ＭＢＤ」）と接触させることにより実施される。一部のそのような実施形態では、核酸をＭＢＰ全体と接触させる。一部の実施形態では、ＭＢＤは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）に結合し、ＭＢＰは、ＭＢＤを含み、本明細書では、メチル結合タンパク質またはメチル結合ドメインタンパク質と同義的に参照される。一部の実施形態では、ＭＢＤは、ビオチンリンカーを介して、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンなどの常磁性ビーズにカップリングされている。メチル化の程度が異なる画分への分配は、ＮａＣｌ濃度を増加させて画分を溶出させることにより実施することができる。

【0194】

一部の実施形態では、結合したＤＮＡは、抗体またはＭＢＤを、プロテイナーゼＫなどのプロテアーゼと接触させることにより溶出させる。これは、上記で考察されているようにＮａＣｌを使用した溶出ステップの代わりにまたはそれらに加えて実施してもよい。

【0195】

本明細書で企図される修飾核酸塩基を認識する作用剤の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。
（ａ）ＭｅＣＰ２は、未修飾シトシンよりも５－メチル－シトシンに優先的に結合するタンパク質である。
（ｂ）ＲＰＬ２６、ＰＲＰ８、およびＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭＨＳ６は、未修飾シトシンよりも５－ヒドロキシメチル－シトシンに優先的に結合する。
（ｃ）ＦＯＸＫ１、ＦＯＸＫ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ４、およびＦＯＸＩ３は、未修飾シトシンよりも、好ましくは５－ホルミル－シトシンに結合する（Iurlaro et al., Genome Biol. 14: R119 (2013)）。
（ｄ）１つもしくは複数のメチル化もしくは修飾核酸塩基またはそれらの変換産物、例えば５ｍＣ、５ｃａＣ、またはＤＨＵに特異的な抗体。

【0196】

一般に、溶出は、１分子当たりのメチル化部位の数など、修飾の数の関数であり、塩濃度が増加すると、より多くのメチル化を有する分子が溶出する。メチル化の程度に基づいてＤＮＡを異なる集団へと溶出するには、ＮａＣｌ濃度を漸増させた一連の溶出緩衝液を使用することができる。塩濃度は、約１００ｎｍ～約２５００ｍＭ ＮａＣｌの範囲であってもよい。一実施形態では、このプロセスは、３（三）つの分配画分をもたらす。分子を、修飾核酸塩基を認識する作用剤を含む分子を含む第１の塩濃度の溶液と接触させ、分子はストレプトアビジンなどの捕捉部分に付着していてもよい。第１の塩濃度では、作用剤に結合することになる分子の集団もあり、未結合のままであることになる集団もある。未結合集団は、「低メチル化」集団として分離することができる。例えば、低メチル化形態のＤＮＡが富化された第１の分配画分は、低塩濃度、例えば１００ｍＭまたは１６０ｍＭでは未結合のままである分配画分である。中間メチル化ＤＮＡが富化された第２の分配画分は、中間塩濃度、例えば１００ｍＭ～２０００ｍＭの濃度を使用して溶出される。これも試料から分離される。高メチル化形態のＤＮＡが富化された第３の分配画分は、高塩濃度、例えば少なくとも約２０００ｍＭを使用して溶出される。

【0197】

一部の実施形態では、５－メチルシチジン（５ｍＣ）に対して生じたモノクローナル抗体を使用して、メチル化ＤＮＡを精製する。一本鎖ＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡを、例えば９５℃で変性させる。標準ビーズまたは磁気ビーズにカップリングさせたプロテインＧ、ならびに抗５ｍＣ抗体とのインキュベーションに続く洗浄を使用して、抗体に結合したＤＮＡを免疫沈降する。次いで、そのようなＤＮＡを溶出させることができる。分配画分は、非沈殿ＤＮＡおよびビーズから溶出した１つまたは複数の分配画分を含んでいてもよい。

【0198】

一部の実施形態では、ＤＮＡの分配画分は、ライブラリー調製の酵素ステップの調製に備えて脱塩および濃縮される。

【0199】

異常に高いコピー数を含む配列は、高メチル化されている傾向がある可能性がある。したがって、一部の実施形態では、タイプ特異的差次的メチル化領域およびコピー数変異体の両方である複数の標的領域を含むエピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な標的特異的プローブと接触させたＤＮＡは、高メチル化分配画分の少なくとも部分を含む。高メチル化分配画分の少なくとも部分に由来するかまたはそれを含むＤＮＡは、中間分配画分または低メチル化分配画分などの１つまたは複数の他の分配画分の少なくとも部分に由来するかまたはそれを含むＤＮＡと一緒にしてもよくまたはしなくてもよい。

【0200】

一部の実施形態では、メチル化は、修飾感受性変換を使用して検出される。修飾感受性変換は、修飾依存的に、例えば、メチル化（またはヒドロキシメチル化、またはホルミル化、またはカルボキシル化など）対未修飾、および／または１つの様式での修飾対別の様式での修飾（例えば、メチル化対ヒドロキシメチル化）で、第１の核酸塩基を差次的に変更するが、第２の核酸塩基を変更しないあらゆる技法を指す。そのような変換技法の例としては、未修飾シトシンおよびある特定の修飾シトシン（例えば、５－ホルミルシトシン（ｆＣ）または５－カルボキシルシトシン（ｃａＣ））をウラシルに変換するが、他の修飾シトシン（例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシルメチルシトシン）は変換しない亜硫酸水素塩変換を含む。亜硫酸水素塩変換の実施は、配列リードを使用したｍＣまたはｈｍＣを含む位置の識別を容易にすることができる。亜硫酸水素塩変換の例示的な説明は、例えば、Moss et al., Nat Commun. 2018; 9: 5068を参照されたい。

【0201】

そのような変換技法の例としては、酸化的亜硫酸水素塩（Ｏｘ－ＢＳ）変換も挙げられる。Ｏｘ－ＢＳ変換の実施は、配列リードを使用してｍＣを含む位置を識別することを容易にすることができる。酸化的亜硫酸水素塩変換の例示的な説明は、例えば、Booth et al., Science 2012; 336: 934-937を参照されたい。

【0202】

そのような変換技法の例としては、Ｔｅｔ支援亜硫酸水素塩（ＴＡＢ）変換も挙げられる。例えば、Yu et al., Cell 2012; 149: 1368-80に記載のように、β－グルコシルトランスフェラーゼを使用してｈｍＣを保護し（５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン（ｇｈｍＣ）を形成する）、次いでｍＴｅｔ１などのＴＥＴタンパク質を使用してｍＣをｃａＣへと変換し、次いで亜硫酸水素塩処理を使用してＣおよびｃａＣをＵへと変換することができるが、ｇｈｍＣは影響を受けないままである。したがって、ＴＡＢ変換を使用する場合、第１の核酸塩基は、未修飾のシトシン、ｆＣ、ｃａＣ、ｍＣ、または亜硫酸水素塩により影響を受ける他のシトシン形態の１つまたは複数を含み、第２の核酸塩基はｈｍＣを含む。ＴＡＢ変換の実施は、配列リードを使用してｈｍＣを含む位置を識別することを容易にすることができる。

【0203】

そのような変換技法の例としては、置換ボラン還元剤を用いたＴｅｔ支援変換も挙げられ、必要に応じて、置換ボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、またはアンモニアボランである。例えば、Liu et al., Nature Biotechnology 2019; 37:424-429（例えば、添付の図１および添付の備考７）を参照されたい。ＴＡＰ変換の実施は、配列リードを使用して未修飾Ｃを含む位置を識別することを容易にすることができる。この手順は、上記のLiu et al. 2019にさらに詳細に記載されているＴｅｔ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）を包含する。

【0204】

代替的に、ｈｍＣの保護（例えば、βＧＴを使用した）を、置換ボラン還元剤によるＴｅｔ支援変換と組み合わせてもよい。そのようなＴＡＰＳβ変換の実施は、配列リードを使用して、未修飾ＣまたはｈｍＣを含む位置と、一方ではｍＣを含む位置とを区別することを容易にすることができる。このタイプの変換の例示的な説明は、例えば、Liu et al., Nature Biotechnology 2019; 37:424-429を参照されたい。

【0205】

そのような変換技法の例としては、ＡＰＯＢＥＣカップリングエピジェネティック（ＡＣＥ）変換も挙げられる。ＡＣＥ変換の実施は、配列リードを使用して、ｈｍＣを含む位置と、ｍＣまたは未修飾Ｃを含む位置とを区別することを容易にすることができる。ＡＣＥ変換の例示的な説明は、例えば、Schutsky et al., Nature Biotechnology 2018; 36: 1083-1090を参照されたい。

【0206】

そのような変換技法の例としては、例えばＥＭ－Ｓｅｑの場合と同様に、核酸塩基の酵素的変換も挙げられる。例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０１９．１２．２０．８８４６９２ｖ１にて入手可能な、Vaisvila R, et al. (2019) EM-seq: Detection of DNA methylation at single base resolution from picograms of DNA. bioRxiv; DOI: 10.1101/2019.12.20.884692を参照されたい。

【0207】

一部の実施形態では、メチル化は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）を使用して検出される。例えば、試料、部分試料、または試料の部分を、１つまたは複数のＭＳＲＥでの消化に供して、非メチル化配列を切断することができる。例示的なＭＳＲＥとしては、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、およびＳｎａＢＩが挙げられる。一部の実施形態では、少なくとも２つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、少なくとも３つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩおよびＨｐａＩＩを含む。一部の実施形態では、２つのメチル化感受性ヌクレアーゼは、ＨｈａＩおよびＡｃｃＩＩを含む。一部の実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、およびＨｉｎ６Ｉを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のＭＳＲＥと接触させる試料の部分は、高メチル化ＤＮＡを含むか、または本明細書の他所に記載のように得ることができる高メチル化ＤＮＡ分配画分であるかもしくはそれを含む。

【0208】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片化は、配列決定されたＤＮＡの断片（例えば、ｃｆＤＮＡ）の終点および／または中間点を決定することにより検出される。例えば、断片が腫瘍を起源とするかまたは健常細胞を起源とするかに応じて、断片化パターンに差異が生じる可能性がある。断片化に基づいてｃｆＤＮＡの腫瘍細胞由来ＤＮＡを検出するために、異常断片のレベルの増加の存在または非存在を、コピー数増幅（例えば、増幅の度合いに比例する）を有する領域において決定することができ、例えば、増加および異常性は、対照試料または健常試料と比べたものである。

【0209】

一部の実施形態では、試料または部分試料（例えば、試料を、シトシンなどのメチル化、例えば５－メチル化などの、シトシン修飾のレベルに基づいて本明細書に記載のように分配することにより調製される第１、第２、または第３の部分試料）を、メチル化依存性ヌクレアーゼまたはメチル化感受性ヌクレアーゼと接触させる。別様の指定がない限り、分配がシトシン修飾に基づいて実施される場合、第１の部分試料は、より高いレベルの修飾を有する部分試料であり、第２の部分試料は、より低いレベルの修飾を有する部分試料であり、第３の部分試料は、存在する場合、第１の部分試料と第２の部分試料との中間のレベルの修飾を有する。

【0210】

上記で考察されているように、分配手順は、部分試料間のＤＮＡ分子の不完全な選別をもたらす可能性がある。非特異的に分配されたＤＮＡを分解するように、メチル化依存性ヌクレアーゼまたはメチル化感受性ヌクレアーゼを選択することができる。例えば、第２の部分試料を、メチル化依存性制限酵素などのメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させることができる。これにより、第２の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡ（例えば、メチル化ＤＮＡ）が分解され、処理された第２の部分試料が生成される。代替的にまたは加えて、第１の部分試料を、メチル化感受性制限酵素などのメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させ、それにより第１の部分試料中の非特異的に分配されたＤＮＡを分解して、処理された第１の部分試料を生成することができる。第１の部分試料または第２の部分試料のいずれかまたは両方における非特異的に分配されたＤＮＡの分解は、例えば、試料中の異常修飾ＤＮＡの存在を検出するために、ＤＮＡの起源の組織を決定するために、および／または対象ががんを有するか否かを決定するために、シトシン修飾に基づいてＤＮＡを正確に分配することに依存する方法の性能を向上させるものとして提案される。例えば、そのような分解は、感度を向上および／または下流分析を簡素化することができる。一般に、非特異的に分配されたＤＮＡが、低メチル化分配画分中などで高メチル化されている場合、メチル化依存性制限酵素などのメチル化依存性ヌクレアーゼが使用されるべきである。逆に、非特異的に分配されたＤＮＡが、高メチル化分配画分中などで低メチル化されている場合、メチル化感受性制限酵素などのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用されるべきである。メチル化依存性制限酵素などのメチル化依存性ヌクレアーゼは、非メチル化ＤＮＡと比べてメチル化ＤＮＡを優先的に切断し、メチル化感受性制限酵素などのメチル化感受性ヌクレアーゼは、メチル化ＤＮＡと比べて非メチル化ＤＮＡを優先的に切断する。

【0211】

部分試料をヌクレアーゼと接触させる際には、１つまたは複数のヌクレアーゼを使用することができる。一部の実施形態では、部分試料を複数のヌクレアーゼと接触させる。部分試料を、ヌクレアーゼと逐次的に接触させてもよくまたは同時に接触させてもよい。ヌクレアーゼが同様の条件下（緩衝液組成など）で活性である場合、不必要な試料操作を回避するためにヌクレアーゼを同時に使用することが有利であり得る。第２の部分試料を、１つよりも多くのメチル化依存性制限酵素と接触させると、非特異的に分配された高メチル化ＤＮＡをより完全に分解することができる。同様に、第１の部分試料を、１つよりも多くのメチル化感受性制限酵素と接触させると、非特異的に分配された低メチル化および／または非メチル化ＤＮＡをより完全に分解することができる。

【0212】

一部の実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼは、ＭｓｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｐＥＩ、またはＭｃｒＢＣの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのメチル化依存性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、少なくとも３つのメチル化依存性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼはＦｓｐＥＩを含む。一部の実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼは、例えば逐次的に使用されるＦｓｐＥＩおよびＭｓｐＪＩを含む。

【0213】

一部の実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、およびＳｎａＢＩの１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、少なくとも３つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。一部の実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩおよびＨｐａＩＩを含む。一部の実施形態では、２つのメチル化感受性ヌクレアーゼは、ＨｈａＩおよびＡｃｃＩＩを含む。一部の実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、およびＨｉｎ６Ｉを含む。

【0214】

一部の実施形態では、ＦｓｐＥＩは、少なくとも１つの部分試料（例えば、低メチル化分配画分）中の核酸分子を消化するために使用される。一部の実施形態では、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、およびＨｉｎ６Ｉは、少なくとも１つの部分試料（例えば、高メチル化分配画分）中の核酸分子を消化するために使用され、ＦｓｐＥＩは、少なくとも１つの他の部分試料（例えば、低メチル化分配画分）中の核酸分子を消化するために使用される。中間的にメチル化された分配画分を含む実施形態では、その中の核酸分子は、メチル化感受性ヌクレアーゼまたはメチル化依存性ヌクレアーゼで消化することができる。一部の実施形態では、中間的にメチル化された分配画分中の核酸分子は、高メチル化分配画分と同じヌクレアーゼ（複数可）で消化される。例えば、中間的にメチル化された分配画分を高メチル化分配画分と共にプールしてもよく、次いでプールされた分配画分を消化に供してもよい。一部の実施形態では、中間的にメチル化された分配画分中の核酸分子は、低メチル化分配画分と同じヌクレアーゼ（複数可）で消化される。例えば、中間的にメチル化された分配画分を低メチル化分配画分と共にプールしてもよく、次いでプールされた分配画分を消化に供してもよい。

【0215】

一部の実施形態では、アダプターをＤＮＡの両末端にタグ付けまたは付着させるステップの後で、部分試料を、上記に記載のようにヌクレアーゼと接触させる。タグまたはアダプターは、上記に記載の手法のいずれかを使用するヌクレアーゼによる切断に耐性であってもよい。この手法では、切断産物は両末端にタグまたはアダプターを欠如するため、切断により、非特異的に分配された分子が分析中に持ち越されることを防止することができる。

【0216】

代替的に、アダプターをタグ付けまたは付着させるステップは、上記に記載のヌクレアーゼによる切断後に実施することができる。次いで、配列リード中の切断された分子を、ヌクレアーゼ認識部位に対応する末端（タグまたはアダプターとの付着点）を有することに基づいて識別することができる。この方法で分子を処理すると、切断された分子から情報を取得すること、例えば、体細胞突然変異の観察が可能になり得る。部分試料をヌクレアーゼと接触させた後でアダプターをタグ付けまたは付着させ、ｃｆＤＮＡなどの低分子量ＤＮＡを分析する場合、接触ステップの前に高分子量ＤＮＡ（夾雑ゲノムＤＮＡなど）を試料から除去することが望ましい場合がある。また、変性がその後のライゲーションステップを妨害する可能性があるため、ＤＮＡの変性を回避するために、比較的低い温度（例えば、６５℃もしくはそれよりも低い、または６０℃もしくはそれよりも低い）で熱不活化することができるヌクレアーゼを使用することが望ましい場合がある。

【0217】

試料を、中間的にメチル化された分子を含む第３の部分試料を含む３つの部分試料に分配する場合、一部の実施形態では、第３の部分試料をメチル化感受性ヌクレアーゼと接触させる。そのようなステップは、接触ステップに関して本明細書の他所に記載の特徴のいずれかを有してもよく、上記で考察されているようなタグ付けまたはアダプター付着ステップの前に実施してもよくまたは後で実施してもよい。一部の実施形態では、第１および第３の部分試料は、メチル化感受性ヌクレアーゼと接触させる前に一緒にされている。そのようなステップは、接触ステップに関して本明細書の他所に記載の特徴のいずれを有してもよく、上記で考察されているようなタグ付けまたはアダプター付着ステップの前に実施してもよくまたは後で実施してもよい。一部の実施形態では、第１および第３の部分試料は、一緒にする前に差次的にタグ付けされている。

【0218】

代替的に、試料を、中間的にメチル化された分子を含む第３の部分試料を含む３つの部分試料に分配する場合、一部の実施形態では、第３の部分試料をメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させる。そのようなステップは、接触ステップに関して本明細書の他所に記載の特徴のいずれを有してもよく、上記で考察されているようなタグ付けまたはアダプター付着ステップの前に実施してもよくまたは後で実施してもよい。一部の実施形態では、第２および第３の部分試料は、メチル化依存性ヌクレアーゼと接触させる前に一緒にされている。そのようなステップは、接触ステップに関して本明細書の他所に記載の特徴のいずれを有してもよく、上記で考察されているようなタグ付けまたはアダプター付着ステップの前に実施してもよくまたは後で実施してもよい。一部の実施形態では、第２および第３の部分試料は、一緒にする前に差次的にタグ付けされている。

【0219】

一部の実施形態では、ＤＮＡは、ヌクレアーゼと接触させた後、例えばＳＰＲＩビーズを使用して精製される。そのような精製は、ヌクレアーゼの熱不活化後に生じてもよい。代替的に、精製を省略してもよく、したがって、例えば、増幅などのその後のステップを、熱不活化ヌクレアーゼを含む部分試料に対して実施してもよい。別の実施形態では、接触ステップは、例えば、チューブ移送に伴う喪失を最小限に抑えるために、ＳＰＲＩビーズなどの精製試薬の存在下で生じてもよい。切断および熱不活化の後、ＳＰＲＩビーズは、分子密集試薬（例えば、ＰＥＧ）および塩を添加することによりクリーンアップして再使用することできる。

【0220】

一部の実施形態では、修飾感受性変換が試料または部分試料に対して実施される場合、その試料または部分試料に由来する１つまたは複数の標的領域セット（例えば、少なくともエピジェネティック標的領域セット）のその後の捕捉には、修飾状態（例えば、プローブがハイブリダイズする配列の少なくとも１つの塩基の）に特異的な、例えば、変換（例えば、修飾または未修飾シトシンの、ウラシル、またはアデニンと優先的に対合するＤＨＵなどのそれらの類似体への変換）を起こしているかまたは所望の場合は変換を起こしていない標的配列に相補的なプローブを含む標的特異的プローブが使用される。そのため、プローブは、メチル化などの目的の修飾が存在していたかまたは存在していなかった配列に特異的であってもよい。一部の実施形態では、修飾感受性変換が試料または部分試料に対して実施される場合、その試料または部分試料に由来する１つまたは複数の標的領域セット（例えば、少なくともエピジェネティック標的領域セット）のその後の捕捉には、修飾状態（例えば、修飾または未修飾シトシンの、ウラシル、またはアデニンと優先的に対合するＤＨＵなどのそれらの類似体への変換を起こしていてもよくまたは起こしていなくともよい位置に無差別に対合する核酸塩基を含み、例えば、イノシンはＣまたはＵと対合することができる）に関わらず標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを含む標的特異的プローブが使用される。

【0221】

一部の実施形態では、こうした方法は、第２の部分試料（低メチル化分配画分とも呼ばれる）のＤＮＡの少なくとも部分および第１の部分試料（高メチル化分配画分とも呼ばれる）のＤＮＡの少なくとも部分を含むプールを調製することを含む。例えば、エピジェネティック標的領域および／または配列可変標的領域を含む標的領域を、プールから捕捉することができる。本明細書の他所に記載の部分試料の少なくとも部分から標的領域セットを捕捉するステップは、第１および第２の部分試料に由来するＤＮＡを含むプールに対して実施される捕捉ステップを包含する。プール中のＤＮＡを増幅するステップは、プールから標的領域を捕捉する前に実施してもよい。捕捉ステップは、本明細書の他所に記載の特徴のいずれを有してもよい。

【0222】

エピジェネティック標的領域は、本明細書の他所で考察されているように、それらが腫瘍を起源とするかもしくは健常細胞を起源とするか、またはどのタイプの組織を起源とするかに応じて、メチル化レベルおよび／または断片化パターンに差異を示す可能性がある。配列可変標的領域は、それらが腫瘍を起源とするかまたは健常細胞を起源とするかに応じて配列に差異を示す可能性がある。

【0223】

低メチル化分配画分に由来するエピジェネティック標的領域の分析は、一部の応用では、高メチル化分配画分および低メチル化分配画分に由来する配列可変標的領域、ならびに高メチル化分配画分に由来するエピジェネティック標的領域の分析ほど有益ではない可能性がある。そのため、配列可変標的領域およびエピジェネティック標的領域が捕捉されている方法では、後者は、高メチル化分配画分および低メチル化分配画分に由来する配列可変標的領域ならびに高メチル化分配画分に由来するエピジェネティック標的領域の１つまたは複数よりも少ない程度で捕捉される可能性がある。例えば、配列可変標的領域は、高メチル化分配画分とプールされていない低メチル化分配画分の部分から捕捉することができ、プールは、高メチル化分配画分に由来するＤＮＡの一部（例えば、大部分、実質的にすべて、またはすべて）および低メチル化分配画分に由来するＤＮＡのゼロ量または一部（例えば、少量）を用いて調製することができる。そのような手法では、低メチル化分配画分に由来するエピジェネティック標的領域の配列決定を低減または排除することができ、それによりさらなる分析にとって十分である配列決定データの量が低減される。

【0224】

一部の実施形態では、低メチル化分配画分のＤＮＡの少量をプールに含むことにより、１つまたは複数のエピジェネティック特徴（例えば、メチル化または本明細書の他所で詳細に考察される他のエピジェネティック特徴（複数可））の、例えば相対的基準での定量化が容易になる。

【0225】

一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの少量、例えば、低メチル化分配画分のＤＮＡの約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％またはそれ未満など、例えば低メチル化分配画分のＤＮＡの約５０％未満を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの約５％～２５％を含む。一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの約１０％～２０％を含む。一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの約１０％を含む。一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの約１５％を含む。一部の実施形態では、プールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの約２０％を含む。

【0226】

一部の実施形態では、プールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの少なくとも約５０％であってもよい、高メチル化分配画分の部分を含む。例えば、プールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％を含んでいてもよい。一部の実施形態では、プールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～１００％を含む。一部の実施形態では、第２のプールは、高メチル化分配画分のすべてまたは実質的にすべてを含む。

【0227】

一部の実施形態では、こうした方法は、低メチル化分配画分のＤＮＡの少なくとも部分を含む第１のプールを調製することを含む。一部の実施形態では、こうした方法は、高メチル化分配画分のＤＮＡの少なくとも部分を含む第２のプールを調製することを含む。一部の実施形態では、第１のプールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの部分をさらに含む。一部の実施形態では、第２のプールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの部分をさらに含む。一部の実施形態では、第１のプールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの大部分を含み、必要に応じて、高メチル化分配画分のＤＮＡの少量を含む。一部の実施形態では、第２のプールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの大部分、および低メチル化分配画分のＤＮＡの少量を含む。中間的にメチル化された分配画分を含む一部の実施形態では、第２のプールは、中間的にメチル化された分配画分のＤＮＡの少なくとも部分、例えば、中間的にメチル化された分配画分のＤＮＡの大部分を含む。一部の実施形態では、第１のプールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの大部分を含み、第２のプールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの大部分および中間的にメチル化された分配画分のＤＮＡの大部分を含む。

【0228】

一部の実施形態では、こうした方法は、標的領域の少なくとも第１のセットを第１のプールから捕捉することを含み、例えば、第１のプールは、上記の実施形態のいずれかに示されている通りである。一部の実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域を含む。一部の実施形態では、第１のセットは、低メチル化可変標的領域および／または断片化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域および断片化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域、低メチル化可変標的領域、および断片化可変標的領域を含む。第１のプール中のＤＮＡを増幅するステップは、この捕捉ステップの前に実施してもよい。一部の実施形態では、標的領域の第１のセットを第１のプールから捕捉することは、第１のプールのＤＮＡを、標的特異的プローブの第１のセットと接触させることを含む。一部の実施形態では、標的特異的プローブの第１のセットは、配列可変標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。一部の実施形態では、標的特異的プローブの第１のセットは、配列可変標的領域、低メチル化可変標的領域、および／または断片化可変標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。

【0229】

一部の実施形態では、こうした方法は、標的領域の第２のセットまたは標的領域の複数のセットを第２のプールから捕捉することを含み、例えば、第１のプールは、上記の実施形態のいずれかに示されている通りである。一部の実施形態では、第２の複数は、高メチル化可変標的領域および／または断片化可変標的領域などのエピジェネティック標的領域を含む。一部の実施形態では、第２の複数は、高メチル化可変標的領域および／または断片化可変標的領域などの、配列可変標的領域およびエピジェネティック標的領域を含む。第２のプール中のＤＮＡを増幅するステップは、この捕捉ステップの前に実施してもよい。一部の実施形態では、標的領域の第２の複数のセットを第２のプールから捕捉することは、第１のプールのＤＮＡを、標的特異的プローブの第２のセットと接触させることを含み、標的特異的プローブの第２のセットは、配列可変標的領域に特異的な標的結合プローブおよびエピジェネティック標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。一部の実施形態では、標的領域の第１のセットおよび標的領域の第２のセットは同一ではない。例えば、標的領域の第１のセットは、標的領域の第２のセットには存在しない１つまたは複数の標的領域を含んでいてもよい。代替的にまたは加えて、標的領域の第２のセットは、標的領域の第１のセットには存在しない１つまたは複数の標的領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つの高メチル化可変標的領域は、第２のプールから捕捉されるが、第１のプールからは捕捉されない。一部の実施形態では、複数の高メチル化可変標的領域は、第２のプールから捕捉されるが、第１のプールからは捕捉されない。一部の実施形態では、標的領域の第１のセットは配列可変標的領域を含み、および／または標的領域の第２のセットはエピジェネティック標的領域を含む。一部の実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域および断片化可変標的領域を含み、標的領域の第２のセットは、高メチル化可変標的領域および断片化可変標的領域など、エピジェネティック標的領域を含む。一部の実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域、断片化可変標的領域を含み、低メチル化可変標的領域を含み、標的領域の第２のセットは、高メチル化可変標的領域および断片化可変標的領域など、エピジェネティック標的領域を含む。

【0230】

一部の実施形態では、第１のプールは、低メチル化分配画分のＤＮＡの大部分および高メチル化分配画分のＤＮＡの部分（例えば、約半分）を含み、第２のプールは、高メチル化分配画分のＤＮＡの部分（例えば、約半分）を含む。一部のそのような実施形態では、標的領域の第１のセットは配列可変標的領域を含み、および／または標的領域の第２のセットはエピジェネティック標的領域を含む。配列可変標的領域および／またはエピジェネティック標的領域は、本明細書の他所に記載の実施形態のいずれかに示されている通りであってもよい。
Ｅ．アダプターライゲーションまたは付加；タグ付け

【0231】

一部の実施形態では、本開示の方法は、試料中のＤＮＡを分析することを含む。そのような方法では、アダプターをＤＮＡに付加してもよい。これは、例えば、増幅ステップの前または後で、プライマーの５’部分にアダプターを提供することにより、増幅手順と同時に行うことができる（ＰＣＲを使用する場合、これは、ライブラリー調製ＰＣＲまたはＬＰ－ＰＣＲと呼ばれる場合がある）。一部の実施形態では、アダプターは、ライゲーションなどの他の手法により付加される。一部のそのような方法では、任意の分配または捕捉ステップ前に、第１のアダプターを、一本鎖ＤＮＡへのライゲーションを含んでいてもよいその３’末端へのライゲーションにより核酸に付加する。アダプターは、例えばユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用した第二鎖合成のプライミング部位として使用することができる。次いで、第２のアダプターを、今や二本鎖である分子の第二鎖の少なくとも３’末端にライゲートさせることができる。一部の実施形態では、第１のアダプターは、ビオチンなどの親和性タグを含み、第１のアダプターにライゲートした核酸は、ストレプトアビジンなどの親和性タグの結合パートナーを含んでいてもよい固体支持体（例えば、ビーズ）に結合する。関連手順のさらなる考察は、Gansauge et al., Nature Protocols 8:737-748 (2013)を参照されたい。一本鎖核酸と適合性である配列決定ライブラリー調製用の市販キット、例えば、Ｓｗｉｆｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑ ＤＮＡライブラリーキットが入手可能である。一部の実施形態では、アダプターライゲーション後、核酸が増幅される。

【0232】

好ましくは、アダプターは、タグの組合せの数が、同じ開始地点および終止地点を有する２つの核酸が同じタグの組合せを受け取る低い確率、例えば９５、９９または９９．９％の確率をもたらすような十分な数の異なるタグを含む。アダプターは、同じタグを有するかまたは異なるタグを有するかに関わらず、同じまたは異なるプライマー結合部位を含んでいてもよいが、好ましくは、アダプターは同じプライマー結合部位を含む。

【0233】

一部の実施形態では、アダプターの付着後、核酸は増幅に供される。増幅には、例えば、アダプターのプライマー結合部位を認識するユニバーサルプライマーを使用することができる。

【0234】

一部の実施形態では、アダプターの付着後、ＤＮＡまたはＤＮＡの部分試料もしくは部分を分配し、ＤＮＡを、エピジェネティック修飾を有する核酸に優先的に結合する作用剤と接触させることを含む。核酸は、作用剤との結合により、核酸が修飾を有する程度が異なる少なくとも２つの分配部分試料に分配される。例えば、作用剤が、修飾を有する核酸に対して親和性を有する場合、修飾が過剰存在する核酸（集団内の存在中央値と比較して）は、作用剤と優先的に結合するが、修飾が過少存在する核酸は結合しないか、または作用剤からより容易に溶出される。次いで、アダプター内のプライマー結合部位に結合するプライマーから核酸を増幅することができる。代わりに、アダプター付着前に分配を実施してもよく、その場合、アダプターは、分子がどの分配画分に存在していたかを識別する成分を含む差次的タグを含んでいてもよい。

【0235】

一部の実施形態では、核酸は、プライマー結合部位およびタグを含むＹ字形アダプターに両端が連結される。分子が増幅される。

【0236】

ＤＮＡ分子のタグ付けは、タグをＤＮＡ分子に付着または会合させる手順である。そのようなタグは、タグが会合している分子の特徴を示す情報を含む、核酸などの分子であってもよい。例えば、分子は、試料タグ（１つの試料中の分子を別の試料中の分子と区別する）、または分子タグ／分子バーコード／バーコード（異なる分子を互いに区別する（一意的タグ付けシナリオおよび非一意的タグ付けシナリオの両方において）を有してもよい。分配ステップを含む方法の場合、分配タグ（１つの分配画分中の分子を別の分配画分中の分子と区別する）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子に付加されるアダプターはタグを含む。ある特定の実施形態では、タグは、１つのバーコードまたはバーコードの組合せを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、文脈に応じて、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはヌクレオチド配列自体を指す。バーコードは、例えば、１０～１００個のヌクレオチドを有してもよい。バーコードのコレクションは、特定の目的に応じて、縮重配列を有してもよく、またはある特定のハミング距離を有する配列を有してもよい。そのため、例えば、分子バーコードは、１つのバーコードまたは各々が分子の異なる末端に付着している２つのバーコードの組合せで構成されていてもよい。加えてまたは代替的に、異なる分配画分および／または試料の場合、分子バーコードまたは分子タグの異なるセットを、バーコードが個々の配列により分子タグとしての役目を果たし、バーコードがメンバーであるセットに基づき、バーコードが対応する分配画分および／または試料を識別する役目も果たすように、使用することができる。

【0237】

一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くの分配画分、例えば各分配画分は、差次的にタグ付けされる。タグを使用して、タグ（またはタグ（複数））が特定の分配画分と相関するように、個々のポリヌクレオチド集団分配画分を標識することができる。代替的に、タグは、分配ステップを使用しない実施形態で使用してもよい。一部の実施形態では、単一のタグを使用して、特定の分配画分を標識することができる。一部の実施形態では、複数の異なるタグを使用して、特定の分配画分を標識することができる。特定の分配画分を標識するために複数の異なるタグが使用される実施形態では、１つの分配画分を標識するために使用されるタグのセットは、他の分配画分を標識するために使用されるタグのセットと容易に区別することができる。一部の実施形態では、タグは追加の機能を有してもよく、例えば、タグは、試料供給源をインデックス化するために使用することができるか、または一意的分子識別子として使用することができるか（これは、例えば、Kinde et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 108: 9530-9535 (2011)、Kou et al., PLoS ONE,11: e0146638 (2016)にあるように、配列決定エラーを突然変異と区別することにより配列決定データの品質を向上させるために使用することができる）、または例えば米国特許第９，５９８，７３１号に記載のような非一意的分子識別子として使用することができる。同様に、一部の実施形態では、タグは追加の機能を有してもよく、例えば、タグは、試料供給源をインデックス化するために使用することができるか、または非一意的分子識別子として使用することができる（これは、配列決定エラーを突然変異と区別することにより配列決定データの品質を向上させるために使用することができる）。

【0238】

一部の実施形態では、分配画分タグ付けは、各分配画分中の分子を分配タグでタグ付けすることを含む。分配画分を再混合し（例えば、必要な配列決定実行数を低減し、不必要なコストを回避するため）、分子を配列決定した後、供給源分配画分を分配タグにより識別する。別の実施形態では、異なる分配画分は、例えば、一対のバーコードで構成される分子タグの異なるセットでタグ付けされる。このように、各分子バーコードは、供給源分配画分を示し、ならびに分配画分内の分子の区別にも有用である。例えば、３５個のバーコードの第１セットを使用して第１の分配画分中の分子をタグ付けすることができ、３５個のバーコードの第２セットを使用して第２の分配画分中の分子をタグ付けすることができる。

【0239】

一部の実施形態では、分配および分配タグによるタグ付けの後、分子を、単一実行で配列決定するためにプールしてもよい。一部の実施形態では、試料タグを、例えば分配タグの付加およびプール化に続くステップにおいて分子に付加する。試料タグにより、単回の配列決定実行で配列決定を行うために複数の試料から生成された物質をプールすることが容易になり得る。

【0240】

代替的に、一部の実施形態では、分配タグを、試料ならびに分配画分と相関させることができる。簡単な例として、第１のタグは、第１の試料の第１の分配画分を示すことができ、第２のタグは、第１の試料の第２の分配画分を示すことができ、第３のタグは、第２の試料の第１の分配画分を示すことができ、第４のタグは、第２の試料の第２の分配画分を示すことができる。

【0241】

タグは、１つまたは複数の特質に基づいて既に分配された分子に付着させてもよいが、ライブラリー中の最終タグ付き分子は、もはやその特質を有していない可能性がある。例えば、一本鎖ＤＮＡ分子を分配およびタグ付けすることができるが、ライブラリー中の最終タグ付き分子は二本鎖である可能性が高い。同様に、ＤＮＡを、異なるレベルのメチル化に基づく分配に供することできるが、最終ライブラリーでは、そうした分子に由来するタグ付き分子はメチル化されていない可能性がある。したがって、ライブラリー中の分子に付着したタグは、典型的には、最終タグ付き分子が由来する「親分子」の特質を示し、必ずしもタグ付き分子自体の特質を示すわけではない。

【0242】

一例として、バーコード１、２、３、４などを使用して、第１の分配画分中の分子をタグ付けおよび標識する。バーコードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを使用して、第２の分配画分中の分子をタグ付けおよび標識する。バーコードａ、ｂ、ｃ、ｄなどを使用して、第３の分配画分中の分子をタグ付けおよび標識する。差次的にタグ付けされた分配画分を、配列決定前にプールしてもよい。差次的にタグ付けされた分配画分は、別々に配列決定してもよく、または例えばＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーの同じフローセル内で同時に一緒に配列決定してもよい。

【0243】

配列決定後、リードの分析は、分配画分ごとのレベルでならびに全ＤＮＡ集団レベルで実施することができる。タグを使用して、異なる分配画分のリードを選別する。分析は、配列情報、ゲノム座標長、網羅範囲、および／またはコピー数を使用して、遺伝子変異およびエピジェネティック変異（メチル化、クロマチン構造などの１つまたは複数）を決定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を含んでいてもよい。一部の実施形態では、より高い網羅範囲は、ゲノム領域におけるヌクレオソーム占有率がより高いことと相関する可能性があり、より低い網羅範囲は、ヌクレオソーム占有率がより低いことまたはヌクレオソーム枯渇領域（ＮＤＲ）と相関する可能性がある。

【0244】

分子タグ付けは、配列リードの起源であるＤＮＡ分子を区別することを可能にするタグ付け操作を指す。タグ付け戦略は、一意的タグ付け戦略と非一意的タグ付け戦略とに分けることができる。一意的タグ付けでは、試料中のすべてまたは実質的にすべての分子が異なるタグを有するため、リードを、タグ情報のみに基づいて元の分子に割り当てることができる。そのような方法で使用されるタグは、「一意的タグ」と呼ばれることがある。非一意的タグ付けでは、同じ試料中の異なる分子が同じタグを有し得るため、タグ情報に加えて他の情報を使用して、配列リードを元の分子に割り当てる。そのような情報には、開始座標および終止座標、分子がマッピングされる座標、開始座標単独または終止座標単独などを挙げることができる。そのような方法で使用されるタグは、「非一意的タグ」と呼ばれることがある。したがって、試料中のあらゆる分子を一意的にタグ付けする必要はない。試料内の識別可能なクラス内に分類される分子を一意的にタグ付けするだけで十分である。したがって、異なる識別可能なファミリーの分子は、タグ付き分子の同一性に関する情報を失うことなく、同じタグを有することができる。

【0245】

非一意的タグ付けのある特定の実施形態では、使用される異なるタグの数は、特定の群のすべてのＤＮＡ分子が異なるタグを有する可能性が非常に高くなる（例えば、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、または少なくとも９９．９９９％）のに十分な数であり得る。バーコードをタグとして使用する場合、およびバーコードを例えばランダムに分子の両末端に付着させる場合、バーコードの組合せが一緒になってタグを構成することができることに留意されたい。そしてこの数は、該当コールに分類される分子の数の関数である。例えば、クラスは、参照ゲノムの同じ開始－終止位置にマッピングされるすべての分子であってもよい。クラスは、特定の遺伝子座、例えば、特定の塩基または特定の領域（例えば、最大で１００個の塩基または遺伝子もしくは遺伝子のエクソン）にわたってマッピングされるすべての分子であってもよい。ある特定の実施形態では、クラス内の分子の数ｚを一意的に識別するために使用される異なるタグの数は、２＊ｚ、３＊ｚ、４＊ｚ、５＊ｚ、６＊ｚ、７＊ｚ、８＊ｚ、９＊ｚ、１０＊ｚ、１１＊ｚ、１２＊ｚ、１３＊ｚ、１４＊ｚ、１５＊ｚ、１６＊ｚ、１７＊ｚ、１８＊ｚ、１９＊ｚ、２０＊ｚ、または１００＊ｚ（例えば、下限）のいずれか～１００，０００＊ｚ、１０，０００＊ｚ、１０００＊ｚ、または１００＊ｚ（例えば、上限）のいずれかであり得る。

【0246】

例えば、約５ｎｇ～３０ｎｇの無細胞ＤＮＡの試料では、およそ３０００個の分子が特定のヌクレオチド座標にマッピングされ、任意の開始座標を有する約３～１０個の分子が同じ終止座標を共有すると予想される。したがって、約５０～約５０，０００個の異なるタグ（例えば、約６～２２０個のバーコードの組合せ）は、すべてのそのような分子を一意的にタグ付けするのに十分であり得る。ヌクレオチド座標にわたってマッピングされる３，０００個の分子すべてを一意的にタグ付けするには、約１００万～約２，０００万個の異なるタグが必要になるだろう。

【0247】

一般に、反応における一意的または非一意的タグバーコードの割り当ては、米国特許出願公開第２００１００５３５１９号、第２００３０１５２４９０号、第２０１１０１６００７８号、および米国特許第６，５８２，９０８号、米国特許第７，５３７，８９８号、および米国特許第９，５９８，７３１号に記載されている方法および系に従う。タグは、試料核酸にランダムに連結されていてもよくまたは非ランダムに連結されていてもよい。

【0248】

一部の実施形態では、タグ付き核酸は、マイクロウェルプレートに負荷した後に配列決定される。マイクロウェルプレートは、９６，３８４個または１５３６個のマイクロウェルを有してもよい。一部の場合では、それらを、予想される比の一意的タグで、マイクロウェルに導入する。例えば、一意的タグは、１ゲノム試料当たり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、または１，０００，０００，０００個よりも多くの一意的タグが負荷されるように負荷することができる。一部の場合では、一意的タグは、１ゲノム試料当たり約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、または１，０００，０００，０００個未満の一意的タグが負荷されるように負荷することができる。一部の場合では、１試料ゲノム当たりの負荷される一意的タグの平均数は、１ゲノム試料当たり約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００、または１，０００，０００，０００個未満のまたはそれよりも多くの一意的タグである。

【0249】

好ましい形式では、標的核酸の両末端にライゲートされた２０～５０個の異なるタグ（例えば、バーコード）が使用される。例えば、３５個の異なるタグ（例えば、バーコード）を標的分子の両末端にライゲートして３５×３５の順列を作出し、これは３５個のタグでは１２２５個に相当する。そのようなタグの数は、同じ開始地点および終止地点を有する異なる分子が、異なる組合せのタグを受け取る確率を高くする（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、９９．９９９％）のに十分である。他のバーコード組合せとしては、１０～５００の任意の数、例えば、約１５×１５、約３５×３５、約７５×７５、約１００×１００、約２５０×２５０、約５００×５００が挙げられる。

【0250】

一部の場合では、一意的タグは、所定のまたはランダムもしくは半ランダム配列のオリゴヌクレオチドであってもよい。他の場合では、複数のバーコードを使用してもよく、複数のバーコードは必ずしも互いに一意ではない。この例では、バーコードおよびそれがライゲートされ得る配列の組合せが、個々に追跡することができる一意的な配列を作出するように、バーコードを個々の分子にライゲートさせることができる。本明細書に記載のように、配列リードの、始まりの部分（開始部分）および停止（終止）部分との組合せでの配列データ非一意的バーコードの検出は、特定の分子への一意的同一性の割り当てを可能にすることができる。個々の配列リードの長さまたは塩基対数も、そのような分子に一意的同一性を割り当てるために使用することができる。本明細書に記載のように、一意的同一性が割り当てられた一本鎖の核酸に由来する断片は、それにより、親鎖に由来する断片のその後の識別を可能にすることができる。
Ｆ．富化／捕捉ステップ；増幅

【0251】

本明細書で開示される方法は、コピー数変異体でもあるタイプ特異的ｃｆＤＮＡ標的領域などのＤＮＡを富化または捕捉することを含んでいてもよい。一部の実施形態では、捕捉は、ＤＮＡを、標的領域に特異的なプローブと接触させることを含む。富化または捕捉は、当技術分野で公知の任意の好適な手法を使用して、本明細書に記載の任意の試料または部分試料に対して実施することができる。

【0252】

一部の実施形態では、標的領域に特異的なプローブ（つまり、標的特異的プローブ）は、プローブにハイブリダイズしたＤＮＡの富化または捕捉を容易にする捕捉部分を含む。一部の実施形態では、捕捉部分はビオチンである。一部のそのような実施形態では、磁気ビーズなどの固体支持体に付着したストレプトアビジンが、ビオチンとの結合に使用される。標的領域を含まない非特異的に結合したＤＮＡを、捕捉されたＤＮＡから洗い流す。一部の実施形態では、次いでＤＮＡをプローブから解離させ、塩洗浄または別のＤＮＡ変性剤を含む緩衝液を使用して固体支持体から溶出させる。一部の実施形態では、プローブは、例えばビオチン－ストレプトアビジン相互作用を破壊することによっても固体支持体から溶出される。一部の実施形態では、捕捉されたＤＮＡは、固体支持体からの溶出後に増幅される。一部のそのような実施形態では、アダプターを含むＤＮＡは、アダプターにアニーリングするＰＣＲプライマーを使用して増幅される。一部の実施形態では、捕捉されたＤＮＡは、固体支持体に付着したままで増幅される。一部のそのような実施形態では、増幅は、アダプター内の配列にアニーリングするＰＣＲプライマー、およびＤＮＡの標的領域にアニーリングするプローブ内の配列にアニーリングするＰＣＲプライマーの使用を含む。

【0253】

一部の実施形態では、本明細書の方法は、エピジェネティック標的領域および／または配列可変標的領域を含むＤＮＡを濃縮または捕捉することを含む。そのような領域は、試料のアリコート、部分、または部分試料（例えば、アダプターの付着および増幅を受けた試料）から捕捉してもよく、メチルシトシンを認識する作用剤を用いてＤＮＡを分配するステップが、試料の別々のアリコート、部分、または部分試料に対して実施される。エピジェネティック標的領域および／または配列可変標的領域を含むＤＮＡの富化または捕捉は、ＤＮＡを、標的特異的プローブの第１または第２のセットと接触させることを含んでいてもよい。そのような標的特異的プローブは、上記に示されている実施形態および下記のプローブに関するセクションにあるものを含むがそれらに限定されない、標的特異的プローブのセットについて本明細書に記載されている特徴のいずれを有してもよい。捕捉は、本明細書で開示される方法で調製される１つまたは複数の部分試料に対して実施してもよい。一部の実施形態では、ＤＮＡは、第１の部分試料または第２の部分試料から捕捉される。一部の実施形態では、部分試料は、差次的にタグ付けされ（例えば、本明細書に記載のように）、次いで捕捉を受ける前にプールされる。エピジェネティック標的領域および／または配列可変標的領域を含むＤＮＡを捕捉するための例示的な方法は、例えば、ＷＯ２０２０／１６０４１４に見出すことができる。この文献は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

【0254】

１つまたは複数の捕捉ステップは、一般に、長さ、塩基組成など、プローブの特徴にある程度依存する、特異的な核酸ハイブリダイゼーションに好適な条件を使用して実施することができる。当業者であれば、核酸ハイブリダイゼーションに関する技術分野における一般知識を考慮し、適切な条件に精通しているだろう。

【0255】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象から得られるｃｆＤＮＡの標的領域の複数のセットを捕捉することを含む。標的領域は、それらが腫瘍を起源とするかまたは健常細胞を起源とするかまたはある特定の細胞タイプを起源とするかに応じて差異を含む可能性がある。捕捉ステップでは、ｃｆＤＮＡ分子の捕捉セットが生成される。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子は、エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも、ｃｆＤＮＡ分子の捕捉セットにおいてより高い捕捉収量で捕捉される。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象から得られるｃｆＤＮＡを、標的特異的プローブのセットと接触させることを含み、標的特異的プローブのセットは、エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡよりも高い捕捉収量で、配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡを捕捉するように構成されている。捕捉ステップ、捕捉収量、および関連態様の追加の考察は、ＷＯ２０２０／１６０４１４を参照されたい。この文献は、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。

【0256】

エピジェネティック標的領域を分析するのに必要であり得るよりも十分な信頼性または正確性で配列可変標的領域を分析するには、より深い深度の配列決定が必要であり得るため、配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡを、エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡよりも高い捕捉収量で捕捉することは有益であり得る。断片化パターン（例えば、転写開始部位またはＣＴＣＦ結合部位の破損を調査するため）または断片存在量（例えば、高メチル化分配画分および低メチル化分配画分における）を決定するのに必要なデータ量は、一般に、がん関連配列突然変異の存在または非存在を決定するのに必要なデータ量よりも少ない。異なる収量で標的領域セットを捕捉することにより、同じ配列決定実行で（例えば、プールした混合物を使用して、および／または同じ配列決定セル内で）異なる配列決定深度まで標的領域を配列決定することが容易になり得る。局所増幅などのコピー数変異は、体細胞突然変異であるが、メチル化の変化など、ある特定のエピジェネティック変化を検出するための手法と同様にリード頻度に基づき配列決定することにより検出することができる。したがって、それらは、機能的な理由でエピジェネティック標的領域とみなすことができる。加えて、高メチル化可変標的領域または断片化可変標的領域でもあるコピー数変異を示す領域は、エピジェネティック変異を示す可能性があるため、エピジェネティック標的領域とみなされる。

【0257】

一部の実施形態では、ＤＮＡが増幅される。一部の実施形態では、増幅は、捕捉ステップの前に実施される。一部の実施形態では、増幅は、捕捉ステップの後で実施される。一部の実施形態では、増幅は、捕捉ステップの前および後で実施される。種々の実施形態では、こうした方法は、本明細書の考察と一致するように、例えば、エピジェネティック標的領域セットおよび配列可変標的領域セットについて異なる度合いの配列決定深度まで、捕捉されたＤＮＡを配列決定することをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡプローブが使用される。一部の実施形態では、ＤＮＡプローブが使用される。一部の実施形態では、一本鎖プローブが使用される。一部の実施形態では、二本鎖プローブが使用される。一部の実施形態では、一本鎖ＲＮＡプローブが使用される。一部の実施形態では、二本鎖ＤＮＡプローブが使用される。

【0258】

一部の実施形態では、捕捉ステップは、配列可変標的領域セットに対するプローブおよびエピジェネティック標的領域セットに対するプローブを用いて同じ容器にて同時に実施され、例えば、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットに対するプローブと捕捉用プローブは同じ組成物中にある。この手法は、比較的簡素なワークフローを提供する。

【0259】

一部の実施形態では、アダプターは、本明細書に記載のように、ＤＮＡに含まれている。一部の実施形態では、タグは、バーコードであってもよくまたはバーコードを含んでいてもよく、ＤＮＡに含まれている。一部の実施形態では、そのようなタグは、アダプターに含まれている。タグは、核酸の起源の識別を容易にすることができる。例えば、バーコードを使用すると、並列配列決定のために複数の試料をプールした後で、ＤＮＡの由来元となった起源（例えば、対象）の特定が可能になり得る。これは、例えば本明細書に記載のように、例えばプライマーの５’部分にバーコードを提供することにより、増幅手順と同時に行うことができる。一部の実施形態では、アダプターおよびタグ／バーコードは、同じプライマーまたはプライマーセットにより提供される。例えば、バーコードは、アダプターの３’およびプライマーの標的ハイブリダイゼーション部分の５’に位置してもよい。代替的に、バーコードは、必要に応じて、同じライゲーション基質のアダプターと共に、ライゲーションなどの他の手法により付加することができる。

【0260】

増幅、タグ、およびバーコードに関する追加の詳細は、本明細書で考察されており、それらは、そうした実施形態のいずれかと共に実行可能な程度に組み合わせることができる。
Ｇ．捕捉されたＤＮＡ；標的領域

【0261】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して捕捉または富化された核酸は、捕捉されたＤＮＡを含む。一部の実施形態では、捕捉されたＤＮＡは、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を両方とも含む領域を含む。一部の実施形態では、変異は、健常細胞には存在するが、血液試料などの試料タイプには通常存在しない。一部の実施形態では、変異は、異常細胞（例えば、過形成細胞、化生細胞、または新生物細胞）に存在する。

【0262】

一部の実施形態では、試料または第１の部分試料から捕捉された第１の捕捉エピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプに由来する健常ｃｆＤＮＡにおいてタイプ特異的高メチル化を示す。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、がん細胞の存在は、血流へのＤＮＡの排出（例えば、がんおよび／または周囲組織から）を増加させる可能性がある。そのため、ｃｆＤＮＡの起源である組織の分布は、発がんに際して変化する可能性がある。したがって、第１の部分試料における高メチル化可変標的領域のレベルの増加は、がんの存在（または対象の病歴に応じて再発）の指標であり得る。

【0263】

一部の実施形態では、本明細書の方法は、試料または第２の部分試料から第２の捕捉エピジェネティック標的領域セットを捕捉することを含む。一部の実施形態では、第２のエピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域を含む。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、がん細胞は、同じ組織タイプの健常細胞よりも多くのＤＮＡを血流へと排出する可能性がある。そのため、ｃｆＤＮＡの起源である組織の分布は、発がんに際して変化する可能性がある。したがって、第２の部分試料における低メチル化可変標的領域のレベルの増加は、がんの存在（または対象の病歴に応じて再発）の指標であり得る。

【0264】

加えて、捕捉された標的領域セットは、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡを含んでいてもよい。捕捉セットを一緒にして、一緒にした捕捉セットを提供することができる。

【0265】

配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡを含む捕捉セットが、上記で考察されている一緒にした捕捉セットを含む一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡは、エピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡよりも高い濃度で、例えば、１．１～１．２倍の濃度で、１．２～１．４倍の濃度で、１．４～１．６倍の濃度で、１．６～１．８倍の濃度で、１．８～２．０倍の濃度で、２．０～２．２倍の濃度で、２．２～２．４倍の濃度で、２．４～２．６倍の濃度で、２．６～２．８倍の濃度で、２．８～３．０倍の濃度で、３．０～３．５倍の濃度で、３．５～４．０、４．０～４．５倍の濃度で、４．５～５．０倍の濃度で、５．０～５．５倍の濃度で、５．５～６．０倍の濃度で、６．０～６．５倍の濃度で、６．５～７．０倍の濃度で、７．０～７．５倍の濃度で、７．５～８．０倍の濃度で、８．０～８．５倍の濃度で、８．５～９．０倍の濃度で、９．０～９．５倍の濃度で、９．５～１０．０倍の濃度で、１０～１１倍の濃度で、１１～１２倍の濃度で、１２～１３倍の濃度で、１３～１４倍の濃度で、１４～１５倍の濃度で、１５～１６倍の濃度で、１６～１７倍の濃度で、１７～１８倍の濃度で、１８～１９倍の濃度で、１９～２０倍の濃度で、２０～３０倍の濃度で、３０～４０倍の濃度で、４０～５０倍の濃度で、５０～６０倍の濃度で、６０～７０倍の濃度で、７０～８０倍の濃度で、８０～９０倍の濃度で、または９０～１００倍の濃度で存在してもよい。定義セクションで考察されているように、濃度の差異の度合いは、標的領域のフットプリントサイズの正規化に相当する。
１．標的領域

【0266】

一部の実施形態では、捕捉されたＤＮＡは、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を有する領域を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を有する標的領域からなる。一部の実施形態では、タイプ特異的エピジェネティック変異、例えば、差次的メチル化またはタイプ特異的断片化パターンは、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプに由来するＤＮＡと、試料または対象に存在する他の細胞タイプまたは組織タイプに由来するＤＮＡとを区別する可能性が高い。

【0267】

一部の実施形態では、試料または第１の部分試料から捕捉された捕捉エピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプにおいて差次的にまたは排他的に高メチル化されている。そのような高メチル化可変標的領域は、他の細胞タイプまたは組織タイプにおいて高メチル化されていてもよいが、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプで観察される程ではない。一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプの疾患細胞に由来するｃｆＤＮＡにおいてさらにより高度なメチル化を示す。一部の実施形態では、標的領域は、異常に高いコピー数を有する高メチル化領域を含む。一部のそのような実施形態では、標的領域は、健常および疾患結腸組織において高メチル化されており、前がん性またはがん性結腸組織において異常に高いコピー数を有する。そのような標的領域の例を以下の表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0268】

一部の実施形態では、試料または部分試料から捕捉された捕捉エピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、低メチル化可変標的領域は、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプにおいて排他的に低メチル化されている。そのような低メチル化可変標的領域は、他の細胞タイプまたは組織タイプにおいて低メチル化されていてもよいが、１つまたは複数の関連する細胞タイプまたは組織タイプで観察される程ではない。

【0269】

いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、がんを有する個体では、増殖中のまたは瀕死のがん細胞は、それぞれ、健常個体の細胞および／または同じ組織タイプの健常細胞よりも多くのＤＮＡを血流へと排出する可能性がある。そのため、ｃｆＤＮＡの起源である細胞タイプおよび／または組織の分布は、発がんに際して変化する可能性がある。したがって、ある特定の細胞タイプまたは組織タイプを起源とするｃｆＤＮＡの存在および／またはレベルは、疾患の指標であり得る。

【0270】

種々の細胞タイプを区別するために有用なさらなる例示的な高メチル化可変標的領域および低メチル化可変標的領域は、例えば、Scott, C.A., Duryea, J.D., MacKay, H. et al., "Identification of cell type-specific methylation signals in bulk whole genome bisulfite sequencing data," Genome Biol 21, 156 (2020) (doi.org/10.1186/s13059-020-02065-5)に記載のように、種々の細胞タイプから得られるＤＮＡを全ゲノム亜硫酸水素塩配列決定で分析することにより識別されている。全ゲノム亜硫酸水素塩配列データは、Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔコンソーシアムから入手可能であり、インターネットのｄｃｃ．ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ－ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ．ｅｕにて入手可能である。

【0271】

一部の実施形態では、第１および第２の捕捉標的領域セットは、例えば、ＷＯ２０２０／１６０４１４に記載のように、それぞれ、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡおよびエピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡを含む。第１および第２の捕捉セットを一緒にして、一緒にした捕捉セットを提供してもよい。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットは、ＷＯ２０２０／１６０４１４において、そのようなセットについて記載されている特徴のいずれを有してもよく、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域セットを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域セットを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、ＣＴＣＦ結合領域を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、断片化可変標的領域を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、転写開始部位を含む。

【0272】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットは、がんにおいて体細胞突然変異を起こすことが公知である複数の領域を含む。一部の態様では、配列可変標的領域セットは、がんを有する対象の決定された割合が、パネル中の１つまたは複数の異なる遺伝子またはゲノム領域において遺伝子変異体または腫瘍マーカーを呈するように選択された複数の異なる遺伝子またはゲノム領域（「パネル」）を標的とする。パネルは、配列決定のための領域を一定数の塩基対に制限するように選択することができる。パネルは、例えば、本明細書の他所に記載のようにプローブの親和性および／または量を調整することにより、所望量のＤＮＡを配列決定するように選択してもよい。パネルは、所望の配列リード深度を達成するようにさらに選択してもよい。パネルは、配列決定された塩基対の量に対して、所望の配列リード深度または配列リード網羅範囲を達成するように選択してもよい。パネルは、試料中の１つまたは複数の遺伝子変異体を検出するための理論的感度、理論的特異度、および／または理論的正確性を達成するように選択してもよい。

【0273】

領域のパネルを検出するためのプローブとしては、目的のゲノム領域（ホットスポット領域）を検出するためのプローブを挙げることができる。プローブの設計にはクロマチン構造に関する情報を考慮してもよく、および／またはプローブは、特定の部位（例えば、ＫＲＡＳコドン１２および１３）を捕捉することができる可能性を最大化するように設計してもよく、ヌクレオソーム結合パターンおよびＧＣ配列組成により影響を受けるｃｆＤＮＡ網羅範囲および断片サイズ変異の分析に基づき捕捉を最適化するように設計してもよい。本明細書で使用される領域として、ヌクレオソーム位置およびＧＣモデルに基づいて最適化された非ホットスポット領域を挙げることができる。

【0274】

領域のパネルを検出するためのプローブとしては、目的のゲノム領域（ホットスポット領域）を検出するためのプローブを挙げることができる。プローブの設計にはクロマチン構造に関する情報を考慮してもよく、および／またはプローブは、特定の部位（例えば、ＫＲＡＳコドン１２および１３）が捕捉され得る可能性を最大化するように設計してもよく、ヌクレオソーム結合パターンおよびＧＣ配列組成により影響を受けるｃｆＤＮＡ網羅範囲および断片サイズ変異の分析に基づき捕捉を最適化するように設計してもよい。また、本明細書で使用される領域は、ヌクレオソーム位置およびＧＣモデルに基づき最適化された非ホットスポット領域を含んでいてもよい。

【0275】

目的のゲノム位置のリストの例は、ＷＯ２０２０／１６０４１４の、例えば表４に見出すことができる。一部の実施形態では、本開示の方法で使用される配列可変標的領域セットは、ＷＯ２０２０／１６０４１４の表３の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、または７０個の少なくとも部分を含む。一部の実施形態では、本開示の方法で使用される配列可変標的領域セットは、ＷＯ２０２０／１６０４１４の表４の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、または７３個の少なくとも部分を含む。加えてまたは代替的に、好適な標的領域セットは文献から入手可能である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるGale et al., PLoS One 13: e0194630 (2018)には、配列可変標的領域セットの一部またはすべてとして使用することができる３５個のがん関連遺伝子標的のパネルが記載されている。こうした３５個の標的は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＤ１２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、およびＵ２ＡＦ１である。

【0276】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットは、上記およびＷＯ２０２０／１６０４１４に列挙されているがん関連遺伝子など、少なくとも１０、２０、３０、または３５個のがん関連遺伝子に由来する標的領域を含む。
Ｈ．配列決定

【0277】

一般に、アダプターによりフランキングされている核酸を含む試料核酸は、以前の増幅の有無に関わらず、配列決定に供することができる。配列決定法としては、例えば、サンガー配列決定法、ハイスループット配列決定法、ピロシーケンス法、合成による配列決定法、単一分子配列決定法、ナノポア配列決定法、半導体配列決定法、ライゲーションによる配列決定法、ハイブリダイゼーションによる配列決定法、デジタル遺伝子発現法（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定法（ＮＧＳ）、合成による単一分子配列決定法（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、酵素的メチル配列決定法（ＥＭ－Ｓｅｑ）、Ｔｅｔ支援ピリジンボラン配列決定法（ＴＡＰＳ）、超並列配列決定法、クローン単一分子アレイ法（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定法、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定法、プライマーウォーキング法、およびＰａｃＢｉｏ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、またはＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用した配列決定法が挙げられる。

【0278】

一部の実施形態では、配列決定は、未修飾および修飾核酸塩基を検出および／または区別することを含む。例えば、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定法およびナノポア配列決定法は、例えば、５－メチルシトシンおよび５－ヒドロキシメチルシトシンならびに未修飾シトシンの直接検出を容易にすることができる。例えば、Schatz., Nature Methods. 14(4): 347-348 (2017)；ＵＳ９，１５０，９１８；およびSimpson et al., Nature Methods. 14:407-410, doi:10.1038/nmeth.4184 (2017)を参照されたい。配列決定反応は、複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェル、または複数の試料セットを実質的に同時に処理する他の手段であってもよい、様々な試料処理ユニットで実施することができる。また、試料処理ユニットは、複数の実行を同時に処理することができるように複数の試料チャンバーを含んでいてもよい。

【0279】

配列決定反応は、がんまたは他の疾患のマーカーを含むことが既知である核酸など、１つまたは複数の形態の核酸に対して実施することができる。配列決定反応は、試料中に存在する任意の核酸断片に対して実施することもできる。一部の実施形態では、ゲノムの配列網羅範囲は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または１００％未満であってもよい。一部の実施形態では、配列決定反応は、ゲノムの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の配列網羅範囲を提供することができる。配列網羅範囲は、少なくとも５、１０、２０、７０、１００、２００、または５００個の異なる遺伝子、または最大で５０００、２５００、１０００、５００、または１００個の異なる遺伝子に対して実施することができる。

【0280】

同時配列決定反応は、マルチプレックス配列決定法を使用して実施することができる。一部の場合では、無細胞核酸は、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回の配列決定反応を用いて配列決定してもよい。他の場合では、無細胞核酸は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回未満の配列決定反応を用いて配列決定してもよい。配列決定反応は、逐次的に実施してもよくまたは同時に実施してもよい。その後のデータ分析は、配列決定反応のすべてまたは一部に対して実施してもよい。一部の場合では、データ分析は、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回の配列決定反応に対して実施してもよい。他の場合では、データ分析は、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、１００，０００回未満の配列決定反応に対して実施してもよい。例示的なリード深度は、１遺伝子座（塩基）当たり１０００～５００００個のリードである。
ＩＩＩ．ある特定の本開示の方法の追加特徴
Ａ．試料

【0281】

試料は、対象から単離された任意の生物学的試料であってもよい。試料は、身体試料であってもよい。試料としては、既知または疑わしい固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球細胞または白血球、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液 滑液、リンパ液、腹水、間質液または細胞外液、細胞間の空間にある流体、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水、胸膜液、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、および尿などの身体組織または流体を挙げることができる。試料は、好ましくは、体液、特に血液およびその画分、脳脊髄液、胸膜液、唾液、痰、または尿である。試料は、対象から単離された元の形態であってもよく、あるいは細胞などの成分を除去もしくは追加するための、または１つの成分を別の成分と比べて富化するためのさらなる処理に供されていてもよい。したがって、分析のための好ましい体液は、無細胞核酸を含む血漿または血清である。

【0282】

一部の実施形態では、核酸の集団は、新生物、腫瘍、前がん、もしくはがんを有することが疑われる対象、または新生物、腫瘍、前がん、もしくはがんと以前に診断された対象に由来する血清、血漿、または血液試料から得られる。集団は、様々なレベルの配列変異、エピジェネティック変異、および／または複製後修飾もしくは転写後修飾を有する核酸を含む。複製後修飾としては、特に核酸塩基の５位におけるシトシンの修飾、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン、および５－カルボキシルシトシンが挙げられる。

【0283】

試料は、対象から単離または得られ、試料分析の現場へと輸送することができる。試料は、望ましい温度、例えば、室温、４℃、－２０℃、および／または－８０℃で保存および発送することができる。試料は、試料分析の現場で対象から単離または得ることができる。対象は、ヒト、哺乳動物、動物、伴侶動物、介助動物、またはペットであってもよい。対象は、がん、前がん、感染症、移植拒絶反応、または免疫系の変化に関する他の疾患もしくは障害を有する可能性がある。対象は、がんも検出可能ながんの症状も有していない可能性がある。対象は、１つまたは複数のがん療法、例えば、化学療法、抗体、ワクチン、または生物製剤のいずれか１つまたは複数で処置されていてもよい。対象は、寛解状態にあってもよい。対象は、がんまたは任意のがん関連遺伝子突然変異／障害に罹り易いと診断されていてもよくまたはされていなくてもよい。

【0284】

一部の実施形態では、試料は血漿を含む。得られる血漿の体積は、配列決定された領域の所望のリード深度に依存する可能性がある。例示的な体積は、０．４～４０ｍｌ、５～２０ｍｌ、１０～２０ｍｌである。例えば、体積は、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ １０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、または４０ｍＬであってもよい。採取される血漿の体積は、５～２０ｍＬであってもよい。

【0285】

試料は、ゲノム相当物を含む種々の量の核酸を含んでいてもよい。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡの試料は、約１０，０００（１０^４）個の半数体ヒトゲノム相当物、およびｃｆＤＮＡの場合は、約２，０００億（２×１０^１１）個の個々のポリヌクレオチド分子を含んでいてもよい。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡの試料は、約３０，０００個の半数体ヒトゲノム相当物、およびｃｆＤＮＡの場合は、約６，０００億個の個々の分子を含んでいてもよい。

【0286】

試料は、異なる供給源に由来する、例えば、同じ対象の細胞および無細胞に由来する、異なる対象の細胞および無細胞に由来する核酸を含んでいてもよい。試料は、突然変異を有する核酸を含んでいてもよい。例えば、試料は、生殖系列突然変異および／または体細胞突然変異を有するＤＮＡを含んでいてもよい。生殖系列突然変異は、対象の生殖系列ＤＮＡに存在する突然変異を指す。体細胞突然変異は、対象の体細胞、例えばがん細胞を起源とする突然変異を指す。試料は、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変異）を有するＤＮＡを含んでいてもよい。試料は、エピジェネティック変異体（つまり、化学的修飾またはタンパク質修飾）を含んでいてもよく、エピジェネティック変異体は、がん関連突然変異などの遺伝子変異体の存在と関連付けられる。一部の実施形態では、試料は、遺伝子変異体の存在に関連付けられるエピジェネティック変異体を含み、試料は遺伝子変異体を含まない。

【0287】

増幅前の試料中の無細胞核酸の量の例は、約１ｆｇ～約１μｇ、例えば、１ｐｇ～２００ｎｇ、１ｎｇ～１００ｎｇ、１０ｎｇ～１０００ｎｇの範囲である。例えば、量は、最大で約６００ｎｇ、最大で約５００ｎｇ、最大で約４００ｎｇ、最大で約３００ｎｇ、最大で約２００ｎｇ、最大で約１００ｎｇ、最大で約５０ｎｇ、または最大で約２０ｎｇの無細胞核酸分子であってもよい。量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、または少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であってもよい。量は、最大で１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、または２００ｎｇの無細胞核酸分子であってもよい。本方法は、１フェムトグラム（ｆｇ）～２００ｎｇを得ることを含んでいてもよい。

【0288】

無細胞ＤＮＡは、対象から単離された時点で細胞内に含まれていないＤＮＡを指す。例えば、ｃｆＤＮＡは、細胞を溶解することも細胞内ＤＮＡを抽出することもせず、インタクト細胞を除去した後で試料中に残るＤＮＡとして、試料から単離することができる。無細胞核酸としては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）、またはこれらのいずれかの断片を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらのハイブリッドが挙げられる。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、またはそれらのハイブリッドであってもよい。無細胞核酸は、分泌または細胞死プロセス、例えば細胞壊死およびアポトーシスにより体液へと放出される可能性がある。一部の無細胞核酸、例えば循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、がん細胞から体液へと放出される。他のものは健常細胞から放出される。一部の実施形態では、ｃｆＤＮＡは無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）である。一部の実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞により産生される。一部の実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞および非腫瘍細胞の混合物により産生される。

【0289】

無細胞核酸は、約１００～５００ヌクレオチドの例示的なサイズ分布を有し、１１０～約２３０ヌクレオチドの分子が分子の約９０％を占め、最頻値は約１６８ヌクレオチドであり、２４０～４４０ヌクレオチドの範囲に第２のマイナーピークがある。

【0290】

無細胞核酸は、溶液中に見出される無細胞核酸がインタクト細胞および体液の他の不溶性成分から分離される分画または分配ステップにより体液から単離することができる。分配は、遠心分離または濾過などの技法を含んでいてもよい。代替的に、体液中の細胞を溶解し、無細胞核酸および細胞性核酸を一緒に処理してもよい。一般に、緩衝液の添加および洗浄ステップの後、核酸をアルコールで沈殿させることができる。夾雑物または塩を除去するために、シリカベースカラムなどのさらなるクリーンアップステップを使用してもよい。亜硫酸水素塩配列決定、ハイブリダイゼーション、および／またはライゲーションのための、Ｃ １ ＤＮＡ、ＤＮＡ、またはタンパク質などの非特異的バルクキャリア核酸を、反応の全体にわたって添加して、収量などの、手順のある特定の側面を最適化することができる。

【0291】

そのような処理の後、試料は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、および一本鎖ＲＮＡを含む種々の形態の核酸を含んでいてもよい。一部の実施形態では、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを二本鎖形態に変換することができ、それらは、その後の処理および分析ステップに含まれる。

【0292】

試料中の二本鎖ＤＮＡ分子、および二本鎖ＤＮＡ分子に変換された一本鎖核酸分子は、一方の末端または両方の末端のいずれかがアダプターに連結されていてもよい。典型的には、二本鎖分子は、４つすべての標準ヌクレオチドの存在下での、５’－３’ポリメラーゼおよび３’－５’エクソヌクレアーゼ（またはプルーフリーディング機能）を有するポリメラーゼでの処理により平滑末端化される。好適なポリメラーゼの例は、Ｋｌｅｎｏｗ大型断片およびＴ４ポリメラーゼである。平滑末端化ＤＮＡ分子は、少なくとも部分的に二本鎖のアダプター（例えば、Ｙ字形またはベル形アダプター）にライゲートされていてもよい。代替的に、ライゲーションを容易にするために、相補的ヌクレオチドを、試料核酸およびアダプターの平滑末端に追加してもよい。本明細書では、平滑末端ライゲーションおよび粘着末端ライゲーションの両方が企図される。平滑末端ライゲーションでは、核酸分子およびアダプタータグの両方が平滑末端を有する。粘着末端ライゲーションでは、典型的には、核酸分子は「Ａ」突出を有し、アダプターは「Ｔ」突出を有する。
Ｂ．増幅

【0293】

アダプターによりフランキングされている試料核酸は、ＰＣＲおよび他の増幅方法により増幅することができる。増幅は、典型的には、増幅しようとするＤＮＡ分子をフランキングするアダプターのプライマー結合部位に結合するプライマーによりプライミングされる。増幅方法は、熱サイクルにより生じる、変性、アニーリング、および伸長のサイクルを含んでいてもよく、または転写媒介増幅の場合のように等温であってもよい。他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応法、鎖置換増幅法、核酸配列ベース増幅法、および自己持続性配列ベース複製法が挙げられる。

【0294】

一部の実施形態では、本方法では、Ｔ尾部アダプターおよびＣ尾部アダプターによるｄｓＤＮＡライゲーションを実施し、それによりアダプターに連結される前に二本鎖核酸の少なくとも５０、６０、７０、または８０％の増幅がもたらされる。好ましくは、本方法は、Ｔ尾部アダプターのみを用いて実施される対照方法と比べて、増幅分子の量または数を少なくとも１０、１５、または２０％増加させる。
Ｃ．捕捉部分

【0295】

上記で考察されているように、試料中の核酸を、ある特定の特質を有する分子が捕捉および分析される捕捉ステップに供してもよい。標的捕捉は、ビオチンまたは下記に記載の他の例などの捕捉部分で標識されたオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセットの使用を含んでいてもよい。プローブは、遺伝子などの領域のパネルにわたって並べて配置されるように選択された配列を有してもよい。一部の実施形態では、ベイトセットは、本明細書の他所で考察されているように、それぞれ配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットの捕捉収量など、標的領域のセットに関してより高い捕捉収量およびより低い捕捉収量を有してもよい。そのようなベイトセットを、標的分子とベイトとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で試料と一緒にする。次いで、捕捉された分子を、捕捉部分を使用して単離する。ＤＮＡ捕捉は、ビオチンで標識された標的特異的プローブなどの捕捉部分、およびストレプトアビジンなどの、捕捉部分に結合する第２の部分または結合パートナーで標識されたオリゴヌクレオチドの使用を含んでいてもよい。一部の実施形態では、捕捉部分および結合パートナーは、本明細書の他所で考察されているように、それぞれ配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを捕捉するために使用されるものなど、プローブの異なるセットに関してより高い捕捉収量およびより低い捕捉収量を有してもよい。捕捉部分を含む方法は、例えば、２０１７年１２月２６日に発行されたＵＳ９，８５０，５２３にさらに記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0296】

捕捉部分としては、限定ではないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、特定のヌクレオチド配列を含む核酸、抗体により認識されるハプテン、および磁気誘引性粒子が挙げられる。抽出部分は、ビオチン／ストレプトアビジンまたはハプテン／抗体などの結合対のメンバーであってもよい。一部の実施形態では、分析物に付着する捕捉部分は、磁気誘引性粒子または遠心分離により沈降させることができる大型粒子などの分離可能部分に付着するその結合対により捕捉される。捕捉部分は、捕捉部分を有する核酸と捕捉部分を欠如する核酸との親和性分離を可能にする任意のタイプの分子であってもよい。例示的な捕捉部分は、固相に連結されているかもしくは連結可能なストレプトアビジンに結合することにより親和性分離を可能にするビオチン、または固相に連結されているかもしくは連結可能な相補的オリゴヌクレオチドに結合することにより親和性分離を可能にするオリゴヌクレオチドである。
Ｄ．標的特異的プローブのコレクション

【0297】

一部の実施形態では、標的特異的プローブのコレクションが、本明細書に記載の方法で使用される。一部の実施形態では、標的特異的プローブのコレクションは、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブおよびエピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量よりも高い（例えば、少なくとも２倍高い）。一部の実施形態では、標的特異的プローブのコレクションは、エピジェネティック標的領域セットに特異的なその捕捉収量よりも高い（例えば、少なくとも２倍高い）配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収量を有するように構成されている。

【0298】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量よりも少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍高い。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収量よりも１．２５～１．５、１．５～１．７５、１．７５～２、２～２．２５、２．２５～２．５、２．５～２．７５、２．７５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、４．５～５、５～５．５、５．５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１３～１４、または１４～１５倍高い。

【0299】

一部の実施形態では、標的特異的プローブのコレクションは、エピジェネティック標的領域セットに特異的なその捕捉収量よりも少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍高い、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収量を有するように構成されている。一部の実施形態では、標的特異的プローブのコレクションは、エピジェネティック標的領域セットに特異的なその捕捉収量よりも１．２５～１．５、１．５～１．７５、１．７５～２、２～２．２５、２．２５～２．５、２．５～２．７５、２．７５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、４．５～５、５～５．５、５．５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１３～１４、または１４～１５倍高い、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収量を有するように構成されている。

【0300】

プローブのコレクションは、濃度、異なる長さおよび／または化学的性質（例えば、親和性に影響を及ぼす）、ならびにそれらの組合せを含む様々な点で、配列可変標的領域セットに関してより高い捕捉収量を提供するように構成することができる。親和性は、プローブの長さを調整することにより、および／または下記に考察されているヌクレオチド修飾を含めることによりモジュレートすることができる。

【0301】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的特異的プローブよりも高濃度で存在する。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度よりも少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５倍高い。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度よりも１．２５～１．５、１．５～１．７５、１．７５～２、２～２．２５、２．２５～２．５、２．５～２．７５、２．７５～３、３～３．５、３．５～４、４～４．５、４．５～５、５～５．５、５．５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１３～１４、または１４～１５倍高い。そのような実施形態では、濃度は、各セットにおける個々のプローブの平均の体積当たりの質量濃度を指す場合がある。

【0302】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的特異的プローブよりも、それらの標的に対してより高い親和性を有する。親和性は、異なるプローブ化学を使用することによるなど、当業者に公知の任意の方法でモジュレートすることができる。例えば、シトシン５－メチル化（ある特定の配列文脈における）、２’糖位にヘテロ原子をもたらす修飾、およびＬＮＡヌクレオチドなどのある特定のヌクレオチド修飾は、二本鎖核酸の安定性を増加させることができ、これは、そのような修飾を有するオリゴヌクレオチドが、それらの相補的配列に対して比較的より高い親和性を有することを示す。例えば、Severin et al., Nucleic Acids Res. 39: 8740-8751 (2011)；Freier et al., Nucleic Acids Res. 25: 4429-4443 (1997)；米国特許第９，７３８，８９４号を参照されたい。また、より長い配列長は、一般に親和性の増加をもたらすことになる。グアニンを核酸塩基ヒポキサンチンに置換することなど、他のヌクレオチド修飾は、オリゴヌクレオチドとその相補配列間の水素結合の量を低減させることにより親和性を低減させる。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、それらの標的に対する親和性を増加させる修飾を有する。一部の実施形態では、代替的にまたは加えて、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、それらの標的に対する親和性を減少させる修飾を有する。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的特異的プローブよりも長い平均長および／または高い平均融解温度を有する。こうした実施形態を、互いに、および／または上記で考察されている濃度の差異と組み合わせて、例えば上記で考察されている任意の差異倍数またはその範囲などの、捕捉収量における所望の差異倍数を達成することができる。

【0303】

一部の実施形態では、標的特異的プローブは捕捉部分を含む。捕捉部分は、本明細書に記載の捕捉部分のいずれか、例えばビオチンであってもよい。一部の実施形態では、標的特異的プローブは、例えば、捕捉部分の結合対の相互作用などにより、共有結合または非共有結合で固体支持体に連結されている。一部の実施形態では、固体支持体は、磁気ビーズなどのビーズである。

【0304】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的特異的プローブおよび／またはエピジェネティック標的領域セットに特異的な標的特異的プローブは、上記で考察されているベイトセット、例えば、捕捉部分を含むプローブ、および遺伝子などの、領域のパネルにわたって並べて配置されるように選択された配列である。

【0305】

一部の実施形態では、標的特異的プローブは、単一の組成物で提供される。単一組成物は、溶液（液体状または凍結物）であってもよい。代替的に、凍結乾燥物であってもよい。

【0306】

代替的に、標的特異的プローブは、例えば、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブを含む第１の組成物、および配列可変標的領域セットに特異的なプローブを含む第２の組成物を含む、複数の組成物として提供してもよい。こうしたプローブを適切な割合で混合して、濃度および／または捕捉収量における上述の倍数差異のいずれかを有する組合せプローブ組成物を提供することができる。代替的に、それらを別々の捕捉手順で（例えば、試料のアリコートを用いて、または同じ試料で逐次的に）使用して、それぞれ、捕捉エピジェネティック標的領域および配列可変標的領域を含む第１および第２の組成物を提供してもよい。
１．エピジェネティック標的領域に特異的なプローブ

【0307】

エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、新生物（例えば、腫瘍またはがん）細胞のＤＮＡと、健常細胞、例えば非新生物循環細胞とを区別する可能性が高い１つまたは複数のタイプの標的領域に特異的なプローブを含んでいてもよい。そのような領域の例示的なタイプは、本明細書、例えば捕捉セットに関する上記のセクションにおいて詳細に考察されている。また、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、例えば本明細書に記載の、１つまたは複数の制御領域に対するプローブを含んでいてもよい。

【0308】

一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、少なくとも１００ｋｂｐ、例えば、少なくとも２００ｋｂｐ、少なくとも３００ｋｂｐ、または少なくとも４００ｋｂｐのフットプリントを有する。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、１００～２０Ｍｂｐ、例えば、１００～２００ｋｂｐ、２００～３００ｋｂｐ、３００～４００ｋｂｐ、４００～５００ｋｂｐ、５００～６００ｋｂｐ、６００～７００ｋｂｐ、７００～８００ｋｂｐ、８００～９００ｋｂｐ、９００～１，０００ｋｂｐ、１～１．５Ｍｂｐ、１．５～２Ｍｂｐ、２～３Ｍｂｐ、３～４Ｍｂｐ、４～５Ｍｂｐ、５～６Ｍｂｐ、６～７Ｍｂｐ、７～８Ｍｂｐ、８～９Ｍｂｐ、９～１０Ｍｂｐ、または１０～２０Ｍｂｐの範囲のフットプリントを有する。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、少なくとも２０Ｍｂｐのフットプリントを有する。
ａ．高メチル化可変標的領域

【0309】

一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つまたは複数の高メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。高メチル化可変標的領域は、本明細書では高メチル化ＤＭＲ（差次的メチル化領域）と呼ばれる場合もある。高メチル化可変標的領域は、上記に示されているもののいずれであってもよい。例えば、一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１に列挙されている複数の遺伝子座、例えば、表１に列挙されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表２に列挙されている複数の遺伝子座、例えば、表２に列挙されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１または表２に列挙されている複数の遺伝子座、例えば、表１または表２に列挙されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、標的領域として含まれる各遺伝子座には、遺伝子の転写開始部位と終止コドン（代替的にスプライシングされる遺伝子の最後の終止コドン）との間に結合するハイブリダイゼーション部位を有する１つまたは複数のプローブが存在してもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のプローブは、列挙されている位置の３００ｂｐ以内、例えば２００または１００ｂｐ以内に結合する。一部の実施形態では、プローブは、上記に列挙されている位置と重複するハイブリダイゼーション部位を有する。一部の実施形態では、高メチル化標的領域に特異的なプローブは、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、および肺がんの１、２、３、４、または５つにおいて集合的に高メチル化を示す、高メチル化標的領域の１、２、３、４、または５つのサブセットに特異的なプローブを含む。
ｂ．低メチル化可変標的領域

【0310】

一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つまたは複数の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。低メチル化可変標的領域は、本明細書では低メチル化ＤＭＲ（差次的メチル化領域）と呼ばれる場合もある。低メチル化可変標的領域は、上記に示されているもののいずれであってもよい。例えば、１つまたは複数の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブとしては、反復エレメント、例えば、ＬＩＮＥ１エレメント、Ａｌｕエレメント、セントロメアタンデムリピート、セントロメア周囲タンデムリピート、およびサテライトＤＮＡなどの領域、ならびに健常細胞では通常はメチル化されており、腫瘍細胞ではメチル化の低減を示す可能性がある遺伝子間領域に対するプローブを挙げることができる。

【0311】

一部の実施形態では、低メチル化可変標的領域に特異的なプローブとしては、反復エレメントおよび／または遺伝子間領域に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、反復エレメントに特異的なプローブとしては、ＬＩＮＥ１エレメント、Ａｌｕエレメント、セントロメアタンデムリピート、セントロメア周囲タンデムリピート、および／またはサテライトＤＮＡの１、２、３、４、または５つに特異的なプローブが挙げられる。

【0312】

がん関連低メチル化を示すゲノム領域に特異的な例示的プローブとしては、ヒト１番染色体のヌクレオチド８４０３５６５～８９５３７０８および／または１５１１０４７０１～１５１１０６０３５に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、低メチル化可変標的領域に特異的なプローブとしては、ヒト１番染色体のヌクレオチド８４０３５６５～８９５３７０８および／または１５１１０４７０１～１５１１０６０３５と重複するかまたはそれらを含む領域に特異的なプローブが挙げられる。
ｃ．ＣＴＣＦ結合領域

【0313】

一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブとしては、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブは、例えば、上記において記載されている、またはＣＴＣＦＢＳＤＢもしくは上記で引用されているCuddapah et al., Martin et al.もしくはRhee et al.論文の１つまたは複数において記載されているＣＴＣＦ結合領域など、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、もしくは５００個のＣＴＣＦ結合領域、または１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、もしくは５００～１０００個のＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、ＣＴＣＦ結合部位の上流および下流領域の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐを含む。
ｄ．転写開始部位

【0314】

一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブとしては、転写開始部位に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、転写開始部位に特異的なプローブは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、もしくは５００個の転写開始部位、または１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、もしくは５００～１０００個の転写開始部位、例えば、ＤＢＴＳＳに列挙されている転写開始部位などに特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、転写開始部位の上流および下流領域の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、または少なくとも１０００ｂｐの配列に対するプローブを含む。
ｅ．局所増幅

【0315】

上記で述べたように、局所増幅は体細胞突然変異であるが、メチル化の変化など、ある特定のエピジェネティック変化を検出するための手法と同様の様式で、リード頻度に基づく配列決定により検出することができる。そのため、上記で考察されているように、がんにおいて局所増幅を示す可能性のある領域がエピジェネティック標的領域セットに含まれていてもよい。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブとしては、局所増幅に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、局所増幅に特異的なプローブとしては、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、およびＲＡＦ１の１つまたは複数に特異的なプローブが挙げられる。例えば、一部の実施形態では、局所増幅に特異的なプローブは、上述の標的の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の１つまたは複数に特異的なプローブが挙げられる。
ｆ．制御領域

【0316】

データ検証を容易にするために制御領域を含むことが有用であり得る。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブとしては、本質的にすべての試料においてメチル化されていることが予想される対照メチル化領域に特異的なプローブが挙げられる。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブとしては、本質的にすべての試料において低メチル化されていることが予想される対照低メチル化領域に特異的なプローブが挙げられる。
２．配列可変標的領域に特異的なプローブ

【0317】

配列可変標的領域セットに対するプローブは、がんにおいて体細胞突然変異を起こすことが公知である複数の領域に特異的なプローブを含んでいてもよい。プローブは、本明細書に記載の任意の配列可変標的領域セットに特異的であってもよい。例示的な配列可変標的領域セットは、本明細書において、例えば捕捉セットに関する上記のセクションにおいて詳細に考察されている。

【0318】

一部の実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、少なくとも０．５ｋｂ、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、または少なくとも４０ｋｂのフットプリントを有する。一部の実施形態では、エピジェネティック標的領域プローブセットは、０．５～１００ｋｂ、例えば、０．５～２ｋｂ、２～１０ｋｂ、１０～２０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～４０ｋｂ、４０～５０ｋｂ、５０～６０ｋｂ、６０～７０ｋｂ、７０～８０ｋｂ、８０～９０ｋｂ、および９０～１００ｋｂの範囲のフットプリントを有する。一部の実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、少なくとも５０ｋｂｐ、例えば、少なくとも１００ｋｂｐ、少なくとも２００ｋｂｐ、少なくとも３００ｋｂｐ、または少なくとも４００ｋｂｐのフットプリントを有する。一部の実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、１００～２０００ｋｂｐ、例えば、１００～２００ｋｂｐ、２００～３００ｋｂｐ、３００～４００ｋｂｐ、４００～５００ｋｂｐ、５００～６００ｋｂｐ、６００～７００ｋｂｐ、７００～８００ｋｂｐ、８００～９００ｋｂｐ、９００～１，０００ｋｂｐ、１～１．５Ｍｂｐ、または１．５～２Ｍｂｐの範囲のフットプリントを有する。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットは、少なくとも２Ｍｂｐのフットプリントを有する。

【0319】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、または７０個の少なくとも部分に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３のＳＮＶの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、または７０個に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３の融合物の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つに特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３のインデルの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの少なくとも部分に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、または７３個の少なくとも部分に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４のＳＮＶの少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、または７３個に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４の融合物の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または６つに特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４のインデルの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、または１８個の少なくとも部分に特異的なプローブを含む。一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表５の遺伝子の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０個の少なくとも部分に特異的なプローブを含む。

【0320】

一部の実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＤ１２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、およびＵ２ＡＦ１などの、少なくとも１０、２０、３０、または３５個のがん関連遺伝子に由来する標的領域に特異的なプローブを含む。
Ｅ．コンピュータシステム

【0321】

本開示の方法は、コンピュータシステムを使用してまたはその支援を受けて実施することができる。図１は、本開示の方法を実施するようにプログラムまたは別様に構成されたコンピュータシステム１０１を示す。コンピュータシステム１０１は、試料調製、配列決定、および／または分析という種々の側面を調節することができる。一部の例では、コンピュータシステム１０１は、例えば、本明細書で開示される方法のいずれかに従って、試料調製、および（該当する場合は）核酸配列決定することを含む試料分析を実施するように構成されている。

【0322】

コンピュータシステム１０１は、中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」ともいう）１０５を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサであってもよく、または並列処理用の複数のプロセッサであってもよい。また、コンピュータシステム１０１は、メモリまたはメモリ位置１１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１１５（例えば、ハードディスク）、１つまたは複数の他のシステムとの通信のための通信インターフェース１２０（例えば、ネットワークアダプタ）、およびキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１２５を含む。メモリ１１０、記憶装置１１５、インターフェース１２０、および周辺デバイス１２５は、マザーボードなどの通信ネットワークまたはバス（実線）を介してＣＰＵ１０５と通信する。記憶装置１１５は、データを記憶するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であってもよい。コンピュータシステム１０１は、通信インターフェース１２０の支援を受けてコンピュータネットワーク１３０に動作可能に接続されていてもよい。コンピュータネットワーク１３０は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信するイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであってもよい。コンピュータネットワーク１３０は、一部の場合では、電気通信ネットワークおよび／またはデータネットワークである。コンピュータネットワーク１３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる１つまたは複数のコンピュータサーバを含んでいてもよい。コンピュータネットワーク１３０は、一部の場合では、コンピュータシステム１０１の支援を受けて、コンピュータシステム１０１に接続されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にすることができるピアツーピアネットワークを実装してもよい。

【0323】

ＣＰＵ１０５は、プログラムまたはソフトウェアで具現化することができる機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ１１０などのメモリ位置に記憶されていてもよい。ＣＰＵ１０５により実施される動作の例としては、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを挙げることができる。

【0324】

記憶装置１１５は、ドライバ、ライブラリー、および保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶装置１１５は、ユーザにより生成されたプログラムおよび記録されたセッション、ならびにプログラムに関連付けられる出力（複数可）を記憶することができる。記憶装置１１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザ選択およびユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム１０１は、一部の場合では、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム１０１と通信するリモートサーバに位置するなど、コンピュータシステム１０１の外部にある１つまたは複数の追加のデータ記憶装置を含んでいてもよい。データは、例えば、通信ネットワークまたは物理的データ転送を使用して（例えば、ハードドライブ、サムドライブ、または他のデータ記憶機構を使用して）、１つの場所から別の場所に転送することができる。

【0325】

コンピュータシステム１０１は、ネットワーク１３０を介して１つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。実施形態では、コンピュータシステム１０１は、ユーザ（例えば、オペレータ）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、または携帯情報端末が挙げられる。ユーザは、ネットワーク１３０を介してコンピュータシステム１０１にアクセスすることができる。

【0326】

本明細書に記載の方法は、例えば、メモリ１１０または電子記憶装置１１５など、コンピュータシステム１０１の電子記憶場所に記憶されている機械（例えばコンピュータプロセッサ）実行可能コードにより実施することができる。機械実行可能コードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、プロセッサ１０５はコードを実行することができる。一部の場合では、コードは、記憶装置１１５から取り出され、プロセッサ１０５が直ちにアクセスすることができるようにメモリ１１０に記憶されてもよい。一部の場合では、電子記憶装置１１５は除外することができ、機械実行可能命令は、メモリ１１０に記憶される。

【0327】

一態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサにより実行されると、本明細書に記載の方法の少なくとも部分を実施するコンピュータ実行可能命令を含む非一過性コンピュータ可読媒体を提供する。例えば、この方法は、対象から試料を収集すること、および必要に応じて試料を分画すること；部分試料または試料を標的特異的プローブと接触させること；プローブに会合しているＤＮＡを捕捉すること；捕捉ＤＮＡ分子のレベルを検出、配列決定、および／または識別すること；対象ががんもしくは別の疾患を有する可能性および／またはがんもしくは他の疾患に対する適切な処置を決定することを含んでいてもよい。

【0328】

コードは、コードを実行するように適合したプロセッサを有する機械で使用するために事前コンパイルおよび構成されていてもよく、または実行時にコンパイルされてもよい。コードは、事前コンパイル様式または同時コンパイル様式でコードを実行することができるように選択することができるプログラミング言語で提供することできる。

【0329】

コンピュータシステム１０１など、本明細書で提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングで具現化することができる。この技術の種々の態様は、典型的には、あるタイプの機械可読媒体で搬送または具現化されている機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形態の「製品」または「物品」であると考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に記憶させることができる。「記憶」型媒体としては、コンピュータもしくはプロセッサなどの有形メモリ、またはソフトウェアプログラミングのために任意の時点で非一過性記憶を提供することができる種々の半導体メモリ、テープドライブ、およびディスクドライブなどの、それらの関連モジュールのいずれかまたはすべてを挙げることができる。

【0330】

ソフトウェアのすべてまたは部分は、インターネットまたは種々の他の電気通信ネットワークを介して随時通信することができる。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のコンピュータまたはプロセッサへと、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへとソフトウェアをロードすることを可能にすることができる。したがって、ソフトウェアエレメントを保持することができる別のタイプの媒体としては、有線および光地上回線ネットワークを介して、ならびに種々の無線リンクを通じてローカルデバイス間の物理的インターフェイス間で使用されるものなど、光、電気、および電磁波が挙げられる。有線もしくは無線リンクまたは光リンクなどの、そのような波動を伝送する物理的エレメントも、ソフトウェアを保持する媒体であるとみなすことができる。本明細書で使用される場合、非一過性有形「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、プロセッサに実行のための命令を提供することに関与するあらゆる媒体を指す。

【0331】

したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとることができる。不揮発性記憶媒体としては、例えば、図面に示されている、データベースなどを実装するために使用することができるものなど、任意のコンピュータ（複数可）などの記憶デバイスのいずれかなどの、光ディスクまたは磁気ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体としては、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが挙げられる。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成する有線を含む、銅線および光ファイバーが挙げられる。搬送波伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に発生するものなど、電気信号もしくは電磁信号、または音響波または光波の形態をとってもよい。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、フラッシュ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読み取ることができる任意の他の媒体が挙げられる。こうした形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つまたは複数の命令の１つまたは複数のシーケンスを、実行のためにプロセッサに搬送することに関与することができる。

【0332】

コンピュータシステム１０１は、例えば、試料分析の１つまたは複数の結果を提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）を備える電子ディスプレイを含むかまたはそれと通信することができる。ＵＩの例としては、限定ではないが、グラフィカルユーザインターフェイス（ＧＵＩ）およびウェブベースユーザインターフェイスが挙げられる。

【0333】

コンピュータシステムおよびネットワーク、データベース、ならびにコンピュータプログラム製品に関する追加の詳細は、例えば、Peterson, Computer Networks: A Systems Approach, Morgan Kaufmann, 5th Ed. (2011)、Kurose, Computer Networking: A Top-Down Approach, Pearson, 7^th Ed. (2016)、Elmasri, Fundamentals of Database Systems, Addison Wesley, 6th Ed. (2010)、Coronel, Database Systems: Design, Implementation, & Management, Cengage Learning, 11^th Ed. (2014)、Tucker, Programming Languages, McGraw-Hill Science/Engineering/Math, 2nd Ed. (2006)、およびRhoton, Cloud Computing Architected: Solution Design Handbook, Recursive Press (2011)にも提供されている。こうした文献の各々は、その全体が参照によりここに組み込まれる。
Ｆ．応用
１．がんおよび他の疾患

【0334】

本方法は、対象における状態、特にがんまたは前がんの存在を診断し、状態を特徴付け（例えば、がんを病期分類することまたはがんの不均質性を決定すること）、状態の処置に対する応答をモニターし、状態の発症または状態のその後の経過の予後リスクをもたらすために使用することができる。本開示は、特定の処置選択肢の有効性を決定する際にも有用であり得る。処置が成功すると、より多くのがんが死滅し、核酸を排出し得るため、処置選択肢の成功は、対象の血液中で検出されるコピー数変異または任意の他の体細胞突然変異の量を増加させる可能性がある。他の例では、これは生じない可能性がある。別の例では、ある特定の処置選択肢は、時間の経過と共にがんのプロファイル（例えば、遺伝子プロファイル）と相関する可能性がある。この相関性は、療法を選択する際に有用であり得る。一部の実施形態では、高メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが、腫瘍細胞または通常はｃｆＤＮＡに著しくは寄与しない細胞の高メチル化特質を示すか否かを決定し、および／または低メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが、腫瘍細胞または通常はｃｆＤＮＡに著しくは寄与しない細胞の低メチル化特質を示すか否かを決定する。

【0335】

一部の実施形態では、本方法は、がんのスクリーニングに、またはがんをスクリーニングするための方法に使用される。例えば、試料は、以前にがんと診断されていない対象に由来してもよい。一部の実施形態では、対象は、がんを有していてもよくまたは有していなくてもよい。一部の実施形態では、対象は、早期がんを有していてもよくまたは有していなくてもよい。一部の実施形態では、対象は、タバコ使用（例えば、喫煙）、体重過剰もしくは肥満、高い体格指数（ＢＭＩ）を有すること、高齢であること、栄養不良、高アルコール消費、またはがんの家族歴など、がんの１つまたは複数のリスク因子を有する。

【0336】

一部の実施形態では、対象は、例えば、少なくとも１、５、１０、または１５年間、タバコを使用している。一部の実施形態では、対象は、高いＢＭＩ、例えば、２５もしくはそれよりも高い、２６もしくはそれよりも高い、２７もしくはそれよりも高い、２８もしくはそれよりも高い、２９もしくはそれよりも高い、または３０もしくはそれよりも高いＢＭＩを有する。一部の実施形態では、対象は、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０歳である。一部の実施形態では、対象は、栄養不良であり、例えば、赤身肉および／または加工肉、トランス脂肪、飽和脂肪、および精製糖の１つまたは複数の消費量が多く、ならびに／または果物および野菜、複合炭水化物、および／もしくは不飽和脂肪の消費量が少ない。高消費量および低消費量は、例えば、それぞれ、ｗｗｗ．ｄｉｅｔａｒｙｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／２０２１－０３／Ｄｉｅｔａｒｙ＿Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ＿ｆｏｒ＿Ａｍｅｒｉｃａｎｓ－２０２０－２０２５．ｐｄｆにて入手可能なＤｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ ２０２０－２０２５の推奨値を超えるかまたは下回るかで規定することができる。一部の実施形態では、対象は、アルコール消費量が多く、例えば、１日当たり平均で少なくとも３、４、または５杯のドリンクを飲む（ドリンクは、約１オンスまたは３０ｍＬの８０プルーフの蒸留酒または同等物である）。一部の実施形態では、対象は、がんの家族歴を有し、例えば、少なくとも１人、２人、または３人の血縁親族が以前にがんと診断されていた。一部の実施形態では、親族は、少なくとも三親等親族（例えば、曽祖父母、大叔母または叔父、いとこ）、少なくとも二親等親族（例えば、祖父母、叔母もしくは叔父、または異母兄弟）、または一親等親族（例えば、親または実兄弟）である。

【0337】

加えて、がんが処置後に寛解していることが観察された場合、本発明の方法を使用して、残留疾患または疾患の再発をモニターすることができる。

【0338】

一部の実施形態では、本明細書で開示される方法およびシステムは、１つもしくは複数の目的のタンパク質の存在および／または体細胞起源であるかもしくは生殖系列起源であるかの核酸変異体の分類に基づいて、患者における所与の疾患または状態を処置するための個別化または標的化療法を識別するために使用することができる。典型的には、検討されている疾患は、がんの一タイプである。そのようながんの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：胆道がん、膀胱がん、頭頸部がん、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生癌、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮癌、直腸がん、結腸直腸癌、結腸がん、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん、結腸直腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼黒色腫、ブドウ膜黒色腫、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、移行細胞癌、尿路上皮癌、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓がん、肝臓癌、肝細胞腫、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺がん、前立腺腺癌、皮膚がん、黒色腫、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、小腸癌、胃がん、胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、または子宮肉腫。がんのタイプおよび／または病期は、突然変異、希少突然変異、インデル、再編成、コピー数変異、トランスバージョン、転座、組換え、逆位、欠失、異数性、部分異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子切断、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体損傷、ＤＮＡ損傷、核酸化学修飾の異常変化、エピジェネティックパターンの異常変化、および核酸５－メチルシトシンの異常変化を含む遺伝子変異から検出することができる。

【0339】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍（または新生物細胞、またはがん細胞）によりまたは前がん細胞により産生される標的領域および／またはＤＮＡの存在を識別することを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍（または新生物細胞、またはがん細胞）によりもしくは前がん細胞により産生される標的領域のレベルを決定することおよび／またはＤＮＡの存在を識別することを含む。一部の実施形態では、標的領域のレベルの決定は、標的領域のレベルの増加またはレベルの減少のいずれかを決定することを含み、標的領域のレベルの増加または減少は、標的領域のレベルを閾値レベル／値と比較することにより決定される。

【0340】

遺伝子データは、特定の形態のがんを特徴付けるために使用することもできる。がんは、組成および病期が両方とも不均質であることが多い。遺伝子プロファイルデータは、特定のサブタイプのがんの特徴付けを可能にすることができ、それは、その特定のサブタイプの診断または処置において重要であり得る。また、この情報は、特定のタイプのがんの予後に関する手がかりを、対象または担当医に提供し、対象または担当医のいずれかが、疾患の進行に応じて処置選択肢を適応させることを可能にすることができる。一部のがんは、進行して、より侵襲性になり、遺伝的に不安定になる可能性がある。他のがんは、良性、不活性、または休止状態のままである可能性がある。本開示のシステムおよび方法は、疾患進行の決定に有用であり得る。

【0341】

さらに、本開示の方法は、対象における異常状態の不均質性を特徴付けるために使用することができる。そのような方法は、例えば、対象に由来する核酸の遺伝子プロファイルを生成することを含んでいてもよく、遺伝子プロファイルは、配列可変およびエピジェネティック分析から得られる複数のデータを含む。一部の実施形態では、異常状態はがんである。一部の実施形態では、異常状態は、不均質なゲノム集団をもたらすものであってもよい。がんの例では、一部の腫瘍は、異なる病期のがんの腫瘍細胞を含むことが公知である。他の例では、不均質性は、複数の疾患病巣を含んでいてもよい。この場合も、がんの例では、複数の腫瘍病巣が存在する可能性があり、おそらくは１つまたは複数の病巣は、原発部位から広がった転移の結果である。

【0342】

本方法は、がん、前がん、または他の疾患を、診断、予後判定、モニター、または観察するために使用することができる。一部の実施形態では、本明細書の方法は、胎児を診断、予後判定、またはモニターすることを含まず、したがって非侵襲的出生前検査に関するものではない。他の実施形態では、こうした方法論は、ＤＮＡおよび他のポリヌクレオチドが母体分子と共循環する可能性のある胎児対象におけるがんまたは他の疾患を診断、予後判定、モニター、または観察するために、妊娠対象において使用することができる。

【0343】

本明細書で開示される方法および系を使用して必要に応じて評価される他の遺伝子に基づく疾患、障害、または状態の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：軟骨無形成症、アルファ－１抗トリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）病、ネコ鳴き症、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン血小板増加症、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド異常（Poland anomaly）、ポルフィリン症、早老症、網膜色素変性症、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、テイ－サックス病、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、またはウィルソン病など。

【0344】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、以前にがんと診断された対象の以前のがん処置後の予め選択された時点で、腫瘍細胞を起源とするかまたは由来する核酸（例えば、ｃｆＤＮＡなどのＤＮＡ）の存在または非存在を検出することを含む。この方法は、対象の腫瘍細胞を起源とするかまたは由来するＤＮＡの存在またはレベルを示すがん再発スコアを決定することをさらに含んでいてもよい。

【0345】

がん再発スコアが決定される場合、それを、がん再発ステータスを決定するためにさらに使用することができる。がん再発ステータスは、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回る場合、がん再発のリスクがある可能性がある。がん再発ステータスは、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回る場合、がん再発のリスクが低いかまたはより低い可能性がある。特定の実施形態では、所定の閾値と等しいがん再発スコアは、がん再発のリスクがあるか、またはがん再発のリスクが低いかもしくはより低いかのいずれのがん再発ステータスももたらし得る。

【0346】

一部の実施形態では、がん再発スコアを所定のがん再発閾値と比較し、がん再発スコアががん再発閾値を上回る場合、対象は、その後のがん処置の候補であると分類されるか、がん再発スコアががん再発閾値を下まわる場合、療法の候補ではないと分類される。特定の実施形態では、がん再発閾値と等しいがん再発スコアは、その後のがん処置の候補であるかまたは療法の候補ではないかのいずれにも分類されるという結果をもたらし得る。

【0347】

上記で考察されている方法は、対象のがん再発のリスクを決定するためのおよび／または対象をその後のがん処置の候補であると分類するための方法に関するセクションを含む、本明細書の他所に示されている１つまたは複数の任意の適合性のある特徴をさらに含んでもよい。
２．対象におけるがん再発のリスクを決定するための、および／または対象をその後のがん処置の候補であると分類するための方法

【0348】

一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象のがん再発のリスクを決定するための方法である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、対象をその後のがん処置の候補であると分類するための方法である。

【0349】

そのような方法のいずれかは、対象に対する１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で、がんと診断された対象から試料を収集することを含んでいてもよい。対象は、本明細書に記載の対象のいずれであってもよい。試料は、ＤＮＡ、例えばｃｆＤＮＡを含んでいてもよい。ＤＮＡは、組織試料または液体試料から得ることができる。

【0350】

そのような方法のいずれかは、試料またはその部分試料を、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるエピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の標的特異的プローブと接触させることを含んでいてもよい。こうした方法は、対象に由来するＤＮＡから標的領域の複数のセットを捕捉することをさらに含んでいてもよく、複数の標的領域セットは、配列可変標的領域セットを含み、それによりＤＮＡ分子の一緒にされた捕捉セットが生成される。１つまたは複数の捕捉ステップは、本明細書の他所に記載の実施形態のいずれかに従って実施することができる。そのような方法のいずれかは、捕捉ＤＮＡ分子を配列決定することを含んでいてもよく、それにより配列情報のセットが生成される。配列可変標的領域セットの捕捉ＤＮＡ分子は、エピジェネティック標的領域セットの捕捉ＤＮＡ分子よりも深い配列決定深度まで配列決定してもよい。そのような方法のいずれかは、配列情報のセットを使用して、予め選択された時点で、腫瘍細胞を起源とするかまたは由来するＤＮＡの存在または非存在を検出することを含んでいてもよい。腫瘍細胞を起源とするかまたは由来するＤＮＡの存在または非存在の検出は、本明細書の他所に記載のそれらの実施形態のいずれかに従って実施することができる。

【0351】

そのような方法のいずれかでは、以前のがん処置は、手術、治療組成物の投与、および／または化学療法を含んでいてもよい。

【0352】

対象のがん再発のリスクを決定するための方法は、対象の腫瘍細胞を起源とするかまたは由来するタイプ特異的標的領域の存在もしくは非存在または量を示すがん再発スコアを決定することを含んでいてもよい。がん再発スコアは、がん再発ステータスを決定するためにさらに使用することができる。がん再発ステータスは、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回る場合、がん再発のリスクがある可能性がある。がん再発ステータスは、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回る場合、がん再発のリスクが低いかまたはより低い可能性がある。特定の実施形態では、所定の閾値と等しいがん再発スコアは、がん再発のリスクがあるか、またはがん再発のリスクが低いかもしくはより低いかのいずれのがん再発ステータスをもたらす可能性がある。

【0353】

対象をその後のがん処置の候補であると分類するための方法は、対象のがん再発スコアを所定のがん再発閾値と比較し、それにより、がん再発スコアががん再発閾値を上回る場合、対象をその後のがん処置の候補であると分類するか、またはがん再発スコアががん再発閾値を下回る場合、療法の候補ではないと分類することを含んでいてもよい。特定の実施形態では、がん再発閾値と等しいがん再発スコアは、その後のがん処置の候補であるかまたは療法の候補ではないかのいずれにも分類されるという結果をもたらし得る。一部の実施形態では、その後のがん処置は、化学療法または治療組成物の投与を含む。

【0354】

そのような方法はいずれも、がん再発スコアに基づき対象の無病生存（ＤＦＳ）期間を決定することを含んでいてもよく、例えば、ＤＦＳ期間は、１年、２年、３年、４年、５年、または１０年などであってもよい。

【0355】

一部の実施形態では、配列情報のセットは、配列可変標的領域配列を含み、がん再発スコアの決定は、特定の免疫細胞タイプ、配列可変標的領域配列に存在するＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ、および／または融合のレベルを示す少なくとも第１のサブスコアを決定することを含んでいてもよい。

【0356】

一部の実施形態では、１、２、３、４、または５から選択される、配列可変標的領域における突然変異の数は、第１のサブスコアが、がん再発に陽性であると分類されるがん再発スコアをもたらすのに十分である。一部の実施形態では、突然変異の数は、１、２、または３から選択される。

【0357】

一部の実施形態では、配列情報のセットはエピジェネティック標的領域配列を含み、がん再発スコアの決定は、健常対象に由来する対応する試料に見出されるＤＮＡ（例えば、健常対象に由来する血液試料に見出されるｃｆＤＮＡ、または健常対象に由来する組織試料であり、試験対象から得られたものと同じ組織タイプである組織試料に見出されるＤＮＡ）とは異なるエピジェネティック状態を表す分子（エピジェネティック標的領域配列から得られる）の量を示す第２のサブスコアを決定することを含む。こうした異常分子（つまり、健常対象に由来する対応する試料中に見出されるＤＮＡとは異なるエピジェネティック状態を有する分子）は、がんに関連付けられるエピジェネティック変化、例えば、高メチル化可変標的領域のメチル化および／または断片化可変標的領域の破損と一致してもよく、「破損」は、健常対象に由来する対応する試料中に見出されるＤＮＡとは異なることを意味する。

【0358】

一部の実施形態では、高メチル化可変標的領域セットにおける高メチル化および／または断片化可変標的領域セットにおける異常断片化を示す、０．００１％～１０％の範囲の値よりも大きいかまたは等しい、高メチル化可変標的領域セットおよび／または断片化可変標的領域セットに対応する分子の割合は、第２のサブスコアをがん再発陽性であると分類するのに十分である。範囲は、０．００１％～１％、０．００５％～１％、０．０１％～５％、０．０１％～２％、または０．０１％～１％であってもよい。

【0359】

一部の実施形態では、そのような方法のいずれかは、腫瘍細胞を起源とすることを示す１つまたは複数の特徴を示す配列情報のセット中の分子の割合から腫瘍ＤＮＡの割合を決定することを含んでいてもよい。これは、例えば、高メチル化可変標的領域および断片化可変標的領域の一方または両方を含む、エピジェネティック標的領域の一部またはすべてに対応する分子に対して行うことができる（高メチル化可変標的領域の高メチル化および／または断片化可変標的領域の異常断片化は、腫瘍細胞を起源とすることを示すとみなすことができる）。これは、配列可変標的領域に対応する分子、例えば、ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶ、および／または融合などの、がんと一致する変更を含む分子に対して行うことができる。腫瘍ＤＮＡの割合は、エピジェネティック標的領域に対応する分子と配列可変標的領域に対応する分子との組合せに基づいて決定することができる。

【0360】

がん再発スコアの決定は、少なくとも部分的には、腫瘍ＤＮＡの割合に基づいてもよく、１０^－１１～１または１０^－１０～１の範囲の閾値より大きな腫瘍ＤＮＡの割合は、がん再発スコアをがん再発陽性であると分類するのに十分である。一部の実施形態では、１０^－１０～１０^－９、１０^－９～１０^－８、１０^－８～１０^－７、１０^－７～１０^－６、１０^－６～１０^－５、１０^－５～１０^－４、１０^－４～１０^－３、１０^－３～１０^－２、または１０^－２～１０^－１の範囲内の閾値よりも大きいかまたは等しい腫瘍ＤＮＡの割合は、がん再発スコアをがん再発陽性であると分類するのに十分である。一部の実施形態では、少なくとも１０^－７の閾値よりも多くの腫瘍ＤＮＡの割合は、がん再発スコアをがん再発陽性であると分類するのに十分である。腫瘍ＤＮＡの割合が、上述の実施形態のいずれかに対応する閾値などの閾値よりも大きいという決定は、累積確率に基づいてなすことができる。例えば、腫瘍割合が上述の範囲のいずれかの閾値より大きいという累積確率が、少なくとも０．５、０．７５、０．９、０．９５、０．９８、０．９９、０．９９５、または０．９９９の確率閾値を超える場合、試料は陽性であるとみなした。一部の実施形態では、確率閾値は、０．９９など、少なくとも０．９５である。

【0361】

一部の実施形態では、配列情報のセットは、配列可変標的領域配列およびエピジェネティック標的領域配列を含み、がん再発スコアの決定は、配列可変標的領域配列中に存在するＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ、および／または融合物の量を示す第１のサブスコア、およびエピジェネティック標的領域配列中の異常分子の量を示す第２のサブスコアを決定すること、ならびに第１および第２のサブスコアを組み合わせてがん再発スコアを提供することを含む。第１および第２のサブスコアを組み合わせる場合、各サブスコアに閾値を独立して適用することにより（例えば、配列可変標的領域における突然変異の所定の数よりも大きく（例えば、＞１）、およびエピジェネティック標的領域における異常分子（つまり、健常対象に由来する対応する試料に見出されるＤＮＡとは異なるエピジェネティック状態を有する分子、例えば腫瘍）の所定の割合よりも大きい）、または機械学習分類器をトレーニングして複数のポジティブトレーニングおよびネガティブトレーニング試料に基づいてステータスを決定することにより、組み合わせることができる。

【0362】

一部の実施形態では、－４～２または－３～１の範囲の組合せスコアの値は、がん再発スコアをがん再発陽性であると分類するのに十分である。

【0363】

がん再発スコアががん再発に陽性であると分類される任意の実施形態では、対象のがん再発ステータスは、がん再発のリスクがある可能性があり、および／または対象は、その後のがん処置の候補であると分類することができる。

【0364】

一部の実施形態では、がんは、本明細書の他所に記載のタイプのがんのいずれか１つ、例えば、結腸直腸がんである。
３．療法および関連投与

【0365】

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、個別化療法を識別し、患者に施すことに関する。一部の実施形態では、特定の核酸のレベルの決定は、適切な処置の選択を容易にする。一部の実施形態では、患者または対象は、所与の疾患、障害、または状態を有する。本質的にあらゆるがん療法（例えば、外科療法、放射線療法、および／または化学療法など）が、こうした方法の一部として含まれ得る。ある特定の実施形態では、対象に施される療法は、少なくとも１つの化学療法薬を含む。一部の実施形態では、化学療法薬は、アルキル化剤（例えば、これらに限定されないが、クロランブシル、シクロホスファミド、シスプラチン、およびカルボプラチン）、ニトロソウレア（例えば、これらに限定されないが、カルムスチンおよびロムスチン）、代謝拮抗剤（例えば、これらに限定されないが、フルオロウラシル（Fluorauracil）、メトトレキサート、およびフルダラビン）、植物アルカロイドおよび天然産物（例えば、これらに限定されないが、ビンクリスチン、パクリタキセル、およびトポテカン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、これらに限定されないが、ブレオマイシン、ドキソルビシン、およびミトキサントロン）、ホルモン剤（例えば、これらに限定されないが、プレドニゾン、デキサメタゾン、タモキシフェン、およびロイプロリド）、および生物学的応答調節剤（例えば、これらに限定されないが、ハーセプチンおよびアバスチン、アービタックスおよびリツキサン）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、対象に施される化学療法は、ＦＯＬＦＯＸまたはＦＯＬＦＩＲＩを含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＲＰ阻害剤を含む療法を対象に施すことができる。ある特定の実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤としては、なかでも、オラパリブ、タラゾパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ（商品名ＺＥＪＵＬＡ）を挙げることができる。典型的には、療法としては、少なくとも１つの免疫療法（または免疫療法剤）が挙げられる。免疫療法は、一般に、所与のがんタイプに対する免疫応答を増強するための方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強するための方法を指す。

【0366】

一部の実施形態では、療法は、体細胞起源であるかまたは生殖系列起源であるかの核酸変異体のステータスに基づいて個別化される。一部の実施形態では、本質的にあらゆるがん療法（例えば、外科療法、放射線療法、および／または化学療法など）が、こうした方法の一部として含まれ得る。典型的には、個別化療法としては、少なくとも１つの免疫療法（または免疫療法剤）が挙げられる。免疫療法は、一般に、所与のがんタイプに対する免疫応答を増強するための方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強するための方法を指す。

【0367】

一部の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子を標的とする。ある特定の腫瘍は、免疫チェックポイント経路を乗っ取ることにより免疫系を回避することができる。したがって、免疫チェックポイントを標的にすることは、免疫系を回避する腫瘍の能力に対抗し、ある特定のがんに対する抗腫瘍免疫を活性化するための効果的な手法として浮上している。Pardoll, Nature Reviews Cancer, 2012, 12:252-264。

【0368】

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを低減させる阻害性分子である。例えば、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上に発現され、抗原提示細胞上のＣＤ８０（別名Ｂ７．１）またはＣＤ８６（別名Ｂ７．２）に結合することによりＴ細胞活性化を下方制御する役割を果たす。ＰＤ－１は、Ｔ細胞上に発現される別の阻害性チェックポイント分子である。ＰＤ－１は、炎症応答中の末梢組織でのＴ細胞の活性を制限する。加えて、ＰＤ－１のリガンド（ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２）は、多くの異なる腫瘍の表面では一般的に上方制御され、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の下方制御がもたらされる。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＣＴＬＡ４またはＰＤ－１である。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２など、ＰＤ－１のリガンドである。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６など、ＣＴＬＡ４のリガンドである。他の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、またはアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）である。

【0369】

こうした免疫チェックポイント分子を標的とするアンタゴニストを使用すると、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＰＤ－１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子はＰＤ－Ｌ１である。ある特定の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストは抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。ある特定の実施形態では、抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。ある特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗ＰＤ－１抗体である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体および抗ＰＤ－１抗体の組合せである。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））またはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））の１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体はイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、アベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、またはデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））の１つまたは複数である。

【0370】

ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、またはＡ２ａＲに対するアンタゴニスト（例えば、抗体）である。他の実施形態では、アンタゴニストは、阻害性免疫チェックポイント分子の細胞外ドメインおよび抗体のＦｃドメインを含む可溶性融合タンパク質など、阻害性免疫チェックポイント分子の可溶型である。ある特定の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２の細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、またはＡ２ａＲの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ２またはＬＡＧ３の細胞外ドメインを含む。

【0371】

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを増幅する共刺激分子である。例えば、ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体である。Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して抗原に結合すると、ＣＤ２８は、抗原提示細胞上のＣＤ８０（別名Ｂ７．１）またはＣＤ８６（別名Ｂ７．２）に結合して、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を増幅し、Ｔ細胞活性化を促進する。ＣＤ２８は、ＣＴＬＡ４と同じリガンド（ＣＤ８０およびＣＤ８６）に結合するため、ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８により媒介される共刺激シグナル伝達に対抗するかまたはそれを調節することができる。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＣＤ２７から選択される共刺激分子である。他の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、またはＣＤ７０を含む、共刺激分子のリガンドである。

【0372】

こうした共刺激チェックポイント分子を標的とするアゴニストを使用すると、ある特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、ある特定の実施形態では、免疫療法または免疫療法剤は、共刺激チェックポイント分子のアゴニストである。ある特定の実施形態では、共刺激チェックポイント分子のアゴニストは、アゴニスト抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ２８抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、または抗ＣＤ２７抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体またはモノクローナル抗体は、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７ＲＰ１、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、または抗ＣＤ７０抗体である。

【0373】

ある特定の実施形態では、体細胞起源であるかまたは生殖系列起源であるかとしての、対象に由来する試料の核酸変異体のステータスを、参照集団の比較器結果のデータベースと比較して、その対象のために個別化または標的化された療法を識別することができる。典型的には、参照集団は、対象と同じがんもしくは疾患タイプを有する患者、および／または対象と同じ療法を受けているかもしくは受けたことがある患者を含む。個別化または標的化療法（複数可）は、核酸変異体および比較器結果がある特定の分類基準を満たす（例えば、実質的またはほぼ一致する）場合に、識別することができる。

【0374】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の個別化療法は、典型的には非経口的に（例えば、静脈内または皮下）投与される。免疫療法剤を含む医薬組成物は、典型的には静脈内投与される。ある特定の療法剤は経口投与される。しかしながら、個別化療法（例えば、免疫療法剤など）は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、および／または耳内にも投与することができ、投与としては、錠剤、カプセル、顆粒、水性懸濁物、ゲル、スプレー、座薬、膏薬、または軟膏などを挙げることができる。

【0375】

がん以外の、特定の遺伝子に基づく疾患、障害、または状態を処置するための治療選択肢は、一般に、当業者であれば周知であり、検討されている特定の疾患、障害、または状態を考慮すれば明らかであろう。

【0376】

一部の実施形態では、例えば、遺伝子変異体が検出される場合、療法は、体細胞起源であるかまたは生殖系列起源であるかとしての核酸変異体のステータスに基づき個別化される。一部の実施形態では、本質的にあらゆるがん療法（例えば、外科療法、放射線療法、および／または化学療法など）が、こうした方法の一部として含まれ得る。典型的には、個別化療法としては、少なくとも１つの免疫療法（または免疫療法剤）が挙げられる。免疫療法は、一般に、所与のがんタイプに対する免疫応答を増強するための方法を指す。ある特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍またはがんに対するＴ細胞応答を増強するための方法を指す。

【0377】

ある特定の実施形態では、体細胞起源であるかまたは生殖系列起源であるとしての、対象に由来する試料の核酸変異体のステータスを、参照集団の比較器結果のデータベースと比較して、その対象のための個別化または標的化療法を識別することができる。典型的には、参照集団は、対象と同じがんもしくは疾患タイプを有する患者、および／または対象と同じ療法を受けているかもしくは受けたことがある患者を含む。個別化または標的化療法（複数可）は、核酸変異体および比較器結果がある特定の分類基準を満たす（例えば、実質的またはほぼ一致する）場合に、識別することができる。

【0378】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の個別化療法は、典型的には非経口的に（例えば、静脈内または皮下に）投与される。免疫療法剤を含む医薬組成物は、典型的には静脈内投与される。ある特定の療法剤は経口投与される。しかしながら、個別化療法（例えば、免疫療法剤など）は、例えば、頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、および／または耳内などの方法によっても投与することもでき、投与としては、錠剤、カプセル、顆粒、水性懸濁物、ゲル、スプレー、座薬、膏薬、または軟膏などを挙げることができる。
ＩＶ．キット

【0379】

本明細書に記載の組成物を含むキットも提供される。キットは、本明細書に記載の方法を実施する際に使用することができる。一部の実施形態では、キットは、複数の標的特異的プローブを含む。一部の実施形態では、複数の標的特異的プローブは、タイプ特異的エピジェネティック変異およびコピー数変異を有する標的領域にハイブリダイズする捕捉部分を含むプローブを含むかまたはそれからなる。一部の実施形態では、キットは、捕捉部分の結合パートナーに連結された固体支持体を含む。一部の実施形態では、キットはアダプターを含む。一部の実施形態では、キットは、アダプターにアニーリングするＰＣＲプライマーを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書の他所の追加要素を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法を実施するための使用説明書を含む。

【0380】

一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡ中のメチルシトシンを認識する作用剤をさらに含む。一部のそのような実施形態では、作用剤は、抗体またはメチル結合タンパク質もしくはメチル結合ドメインである。一部の実施形態では、キットは、配列可変標的領域セットに特異的に結合する標的特異的プローブを含む。一部のそのような実施形態では、標的特異的プローブは捕捉部分を含む。

【0381】

キットは、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢＩ、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬｌ、ＡＫＴｌ、ＡＴＭ、ＣＤＨｌ、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＮＮＢｌ、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲｌ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、およびＮＴＲＫｌからなる群から選択される少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個の、またはすべての遺伝子に選択的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んでもよい。オリゴヌクレオチドプローブが選択的にハイブリダイズすることができる遺伝子の数はさまざまであり得る。例えば、遺伝子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、または５４を含んでいてもよい。キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための複数のオリゴヌクレオチドプローブおよび使用説明書を含む容器を含んでいてもよい。

【0382】

キットは、異なる分子バーコードおよび同一の試料バーコードを有する少なくとも４、５、６、７、または８つの異なるライブラリーアダプターを含んでいてもよい。ライブラリーアダプタは、配列決定アダプターでなくてもよい。例えば、ライブラリーアダプターは、フローセル配列も、配列決定用のヘアピンループの形成を可能にする配列も含まない。分子バーコードおよび試料バーコードの様々な変化型および組合せが全文にわたって説明されており、キットに応用可能である。さらに、一部の場合では、アダプターは配列アダプターではない。加えて、キットに付属のアダプターは、配列決定アダプターをさらに含んでいてもよい。配列決定アダプターは、１つまたは複数の配列決定プライマーにハイブリダイズする配列を含んでいてもよい。配列決定アダプターは、固体支持体にハイブリダイズする配列、例えばフローセル配列をさらに含んでいてもよい。例えば、配列決定アダプターは、フローセルアダプターであってもよい。配列決定アダプターは、ポリヌクレオチド断片の一方または両方の末端に付着させることができる。一部の場合では、キットは、異なる分子バーコードおよび同一の試料バーコードを有する少なくとも８つの異なるライブラリーアダプターを含んでいてもよい。ライブラリーアダプターは、配列決定アダプターでなくてもよい。キットは、ライブラリーアダプターに選択的にハイブリダイズする第１の配列、およびフローセル配列に選択的にハイブリダイズする第２の配列を有する配列決定アダプターをさらに含んでいてもよい。別の例では、配列決定アダプターはヘアピン形状であってもよい。例えば、ヘアピン形状のアダプターは、相補的二本鎖部分およびループ部分を含んでいてもよく、二本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに付着（例えば、ライゲーション）することができる。ヘアピン形状の配列決定アダプターをポリヌクレオチド断片の両末端に付着させて環状分子を生成し、それを複数回配列決定してもよい。配列決定アダプターは、１つまたは複数のバーコードを含んでいてもよい。例えば、配列決定アダプターは、試料バーコードを含んでいてもよい。試料バーコードは、所定の配列を含んでいてもよい。試料バーコードは、ポリヌクレオチドの供給源を識別するために使用することができる。試料バーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはそれよりも多く（または全文に記載の任意の長さ）の核酸塩基、例えば少なくとも８塩基であってもよい。上記に記載のように、バーコードは、連続配列であってもよくまたは不連続配列であってもよい。

【0383】

ライブラリーアダプターは平滑末端およびＹ字形であってもよく、４０核酸塩基長未満であってもよく、またはそれと等しくてもよい。ライブラリーアダプターの他の変化型は、全文に見出すことができ、キットに応用可能である。

【0384】

本発明の好ましい実施形態を本明細書において示し説明してきたが、当業者であれば、そのような実施形態は単なる例として提供されていることが明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の例により限定されることが意図されていない。本発明は上述の明細書を参照して説明されているが、本明細書における実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。当業者であれば、今や、本発明から逸脱することなく、数多くの変化型、変更、および置換を思いつくだろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に示されている特定の図示、構成、または相対的割合に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載の開示の実施形態に対する種々の代替を本発明の実施に使用することができることが理解されるべきである。したがって、本開示は、あらゆるそのような代替、改変、変形型、または均等物も網羅することが企図される。本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により規定され、そうした特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれにより網羅されることが意図されている。上述の開示は、明瞭性および理解を目的として、例示および例によりある程度詳細に説明されているが、当業者であれば、本開示を読むと、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に種々の変更をなすことができ、添付の特許請求の範囲内で実施することができることは明らかであろう。例えば、方法、システム、コンピュータ可読媒体、および／または成分特徴、ステップ、要素、またはそれらの他の態様はすべて、種々の組合せで使用することができる。

【0385】

本明細書で引用される特許、特許出願、ウェブサイト、他の刊行物または文書、および受託番号などはすべて、個々の項目があたかも具体的におよび個々に参照により組み込まれていることを示すかのごとく、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時点で受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効出願日における受託番号に関連付けられているバージョンが意図されている。有効出願日とは、実際の出願日または該当する場合は受託番号を参照する優先権出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、刊行物またはウェブサイトなどの異なる版が異なる時期に刊行されている場合、別様の指示がない限り、本出願の有効出願日において最新の刊行された版が意図されている。

【実施例】

【0386】

（実施例１）
対象の早期結腸直腸がんに関連付けられるＣＮＶでもあるタイプ特異的ＤＭＲを検出するためのｃｆＤＮＡの分析
健常対象および早期結腸直腸がんを有する対象に由来する試料を、血液ベースアッセイで分析して、異常に高いコピー数を有する可能性のある結腸組織に関連付けられる高メチル化領域を検出し、そのようなシグナルが、結腸直腸がんまたは結腸直腸前がんを予測するか否かを試験する。こうした対象の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、次いでビーズに付着したＭＢＤに対する結合に基づいて分配する。漸増塩濃度でビーズを洗浄する。未結合ＤＮＡおよびこうした洗浄でのＤＮＡは、漸増的にメチル化されたｃｆＤＮＡの３つの分配画分（低メチル化、残留メチル化、および高メチル化分配画分）をもたらす。分配画分中のｃｆＤＮＡ分子を浄化して塩を除去し、ライブラリー調製の酵素ステップに備えて濃縮する。

【0387】

分配画分中のｃｆＤＮＡを濃縮した後、分子バーコードを含むアダプターをｃｆＤＮＡに付加する。こうした分子バーコードは非一意的であり、各分配画分を、他の分配画分に使用されているアダプターのバーコードと区別可能な非一意的分子バーコードを有するアダプターとライゲートさせる。ライゲーション後、必要に応じて、高メチル化分配画分をメチル化感受性制限酵素で処理して、誤って分配された非メチル化ＤＮＡを分解する。分配画分を一緒にプールし、ＰＣＲにより増幅する。

【0388】

ＰＣＲの後、増幅したＤＮＡを洗浄し、富化する前に濃縮する。濃縮したら、ＤＮＡを、塩緩衝液、および血液細胞（つまり、試料中に存在する他の主要な細胞タイプ）と比べて結腸組織において高メチル化されており、高メチル化領域で予想される野生型コピー数と比べて異常に高いコピー数を有するＤＭＲに特異的に結合するビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブと一緒にする。この混合物を一晩インキュベートする。

【0389】

ＤＮＡにハイブリダイズしたビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブを、ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズで捕捉し、一連の塩ベース洗浄により捕捉されない増幅ＤＮＡから分離し、それにより試料を富化する。富化後、アンプリコンに試料インデックスを付加するプライマーを使用してさらなる増幅を実施する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑシーケンサーを使用して、富化試料のアリコートを配列決定する。次いで、シーケンサーにより生成された配列リードを、バイオインフォマティクスツール／アルゴリズムを使用して分析する。分子バーコードを使用して一意的な分子を識別し、ならびに差次的に分配された分子へと試料をデコンボリューションする。高メチル化標的領域配列を分析して、結腸組織に関連付けられる領域におけるメチル化ｃｆＤＮＡ分子を検出する。相対的メチル化頻度を、入力ｃｆＤＮＡにより正規化されたメチル化割合（高＋残留）の合計数として決定する。異常に高いＣＮＶを有する結腸特異的高メチル化ＤＭＲは、対象のがんステータスに関連付けられる情報の非常に高感度な検出（例えば、野生型コピー数で存在する結腸特異的高メチル化ＤＭＲの分析から得られることになるものよりも高感度な検出）を提供することができる。
（実施例２）
対象の早期結腸直腸がんに関連付けられるＣＮＶでもあるタイプ特異的ＤＭＲを検出するためのｃｆＤＮＡの分析

【0390】

健常対象および早期結腸直腸がんを有する対象に由来する試料を、血液ベースアッセイで分析して、異常に高いコピー数を有する可能性のある結腸組織に関連付けられる高メチル化領域を検出し、そのようなシグナルが、結腸直腸がんまたは結腸直腸前がんを予測するか否かを試験する。こうした対象の血漿からｃｆＤＮＡを抽出し、次いでメチルシトシンに特異的な抗体と一緒にする。プロテインＧとコンジュゲートさせた磁気ビーズを使用して、抗体およびそれに結合したＤＮＡを免疫沈降させ、したがって高メチル化ＤＮＡと低メチル化ＤＮＡとを分配する。まず、メチル化されていないかまたはメチル化の程度が低いあらゆるＤＮＡを、漸増濃度の塩を含む緩衝液を用いてビーズから溶出させる。最後に、高塩緩衝液を使用して、高度にメチル化されたＤＮＡを、メチルシトシンに特異的な抗体から洗い流す。未結合ＤＮＡおよびこうした洗浄でのＤＮＡは、漸増的にメチル化されたｃｆＤＮＡの３つの分配画分（低メチル化、残留メチル化、および高メチル化分配画分）をもたらす。分配画分中のｃｆＤＮＡ分子を浄化して塩を除去し、ライブラリー調製の酵素ステップに備えて濃縮する。

【0391】

分配画分中のｃｆＤＮＡを濃縮した後、第１のアダプターを、その３’末端へのライゲーションによりｃｆＤＮＡに付加する。アダプターを、ユニバーサルプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼを使用した第二鎖合成のプライミング部位として使用する。第１のアダプターはビオチンを含み、第１のアダプターにライゲートした核酸は、ストレプトアビジンを含むビーズに結合する。次いで、第２のアダプターを、今や二本鎖である分子の第二鎖の３’末端にライゲートさせる。こうしたアダプターは非一意的分子バーコードを含み、各分配画分を、他の分配画分に使用されているアダプターのバーコードと区別可能な非一意的分子バーコードを有するアダプターとライゲートさせる。ライゲーション後、高メチル化分配画分をメチル化感受性制限酵素で処理して、誤って分配された非メチル化ＤＮＡを分解する。分配画分を一緒にプールし、ＰＣＲにより増幅する。

【0392】

ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを洗浄し、富化する前に濃縮する。濃縮したら、増幅されたＤＮＡを、塩緩衝液、および血液細胞（つまり、試料中に存在する他の主要な細胞タイプ）と比べて結腸組織において高メチル化されており、高メチル化領域で予想される野生型コピー数と比べて異常に高いコピー数を有するＤＭＲに特異的に結合するビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブと一緒にする。この混合物を一晩インキュベートする。

【0393】

ＤＮＡにハイブリダイズしたビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブを、ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズで捕捉し、一連の塩ベースの洗浄により捕捉されない増幅されたＤＮＡから分離し、それにより試料を富化する。富化後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑシーケンサーを使用して、富化試料のアリコートを配列決定する。次いで、シーケンサーにより生成された配列リードを、バイオインフォマティクスツール／アルゴリズムを使用して分析する。分子バーコードを使用して一意的分子を識別し、ならびに差次的に分配された分子へと試料をデコンボリューションする。高メチル化標的領域配列を分析して、結腸組織に関連付けられる領域におけるメチル化ｃｆＤＮＡ分子を検出する。相対的メチル化頻度を、入力ｃｆＤＮＡにより正規化されたメチル化割合（高＋残留）の合計数として決定する。異常に高いＣＮＶを有する結腸特異的高メチル化ＤＭＲは、対象のがんステータスに関連付けられる情報の非常に高感度な検出（例えば、野生型コピー数で存在する結腸特異的高メチル化ＤＭＲの分析から得られることになるものよりも高感度な検出）を提供することができる。
（実施例２）
対象の早期結腸直腸がんに関連付けられるＣＮＶでもあるタイプ特異的断片を検出するためのｃｆＤＮＡの分析

【0394】

健常対象および早期結腸直腸がんを有する対象に由来するｃｆＤＮＡの試料を得、分配ステップを省略してもよく、異なるビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブを使用することを除き、実施例１に記載のように分析する。標的特異的プローブは、血液細胞（つまり、ｃｆＤＮＡ試料に寄与する主要な細胞タイプ）と比べて結腸組織において異なる断片化パターンを示すことが公知であり、野生型のコピー数と比べて結腸直腸がんにおいて異常に高いコピー数を示す可能性があるＤＮＡ領域に特異的に結合する。プローブおよびプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを、実施例１に記載のように捕捉し、配列決定する。標的領域断片を分析して、結腸組織に関連付けられるｃｆＤＮＡ分子を検出する。異常に高いＣＮＶを有する結腸特異的断片は、対象のがんステータスに関連付けられる情報の非常に高感度な検出を提供することができる。
（実施例３）
対象におけるがんの存在または非存在を検出するためのｃｆＤＮＡのエピジェネティックおよび配列可変分析

【0395】

エピジェネティック標的領域セットまたは標的特異的プローブ（つまり、結腸特異的ＤＭＲまたは結腸特異的断片化パターン断片に結合するプローブ）に加えて、標的特異的プローブの配列可変標的領域セットも使用されることを除いて、実施例１または２に記載のように、健常対象および早期結腸直腸がんを有する対象に由来するｃｆＤＮＡの試料を得、調製し、捕捉し、配列決定し、分析する。詳細には、ビオチン化ＲＮＡ標的特異的プローブは、結腸がんにおいて突然変異することが公知である配列を含む配列可変標的領域セットに対するプローブを含む。配列可変領域セットに対するプローブは、約５０ｋｂのフットプリントを有する。

【0396】

実際の腫瘍変異体を技術的エラー（例えば、ＰＣＲエラー、配列決定エラー）と区別するのに十分な確度をもってコールすることができる、ＳＮＶ、挿入、欠失、および融合物などのゲノム変更を検出することにより、配列可変標的領域配列を分析する。エピジェネティック標的領域配列を独立して分析して、結腸組織に由来する高メチル化ｃｆＤＮＡ分子を検出する。最後に、両分析の結果を組み合わせて、試料が得られた対象におけるがんまたは前がんの可能性の最終決定を生成する。

【図1】

【国際調査報告】