特表 2024-523424 逆位キメラｓｉＲＮＡ分子およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】逆位キメラｓｉＲＮＡ分子およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240621BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240621BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240621BHJP

   A61K 47/56 20170101ALI20240621BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20240621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 110Z

C12Q1/02

C12Q1/68 100Z

A61K31/713

A61P35/00

C07H21/04 Z CSP

A61K47/68

A61K47/56

A61K9/14

A61P43/00 121

C12N15/115 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023578074

(86)(22)【出願日】2022-06-21

(85)【翻訳文提出日】2024-01-24

(86)【国際出願番号】 US2022034235

(87)【国際公開番号】W WO2022271624

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/212,976

(32)【優先日】2021-06-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501345323

【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＮＯＲＴＨ ＣＡＲＯＬＩＮＡ ＡＴ ＣＨＡＰＥＬ ＨＩＬＬ

(74)【代理人】

【識別番号】100113376

【弁理士】

【氏名又は名称】南条 雅裕

(74)【代理人】

【識別番号】100179394

【弁理士】

【氏名又は名称】瀬田 あや子

(74)【代理人】

【識別番号】100185384

【弁理士】

【氏名又は名称】伊波 興一朗

(74)【代理人】

【識別番号】100137811

【弁理士】

【氏名又は名称】原 秀貢人

(72)【発明者】

【氏名】ピーコット チャド

(72)【発明者】

【氏名】チャレディー ヨギザ

【テーマコード（参考）】

4B063

4C057

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B063QA20

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR35

4B063QS38

4B063QS40

4B063QX10

4C057CC02

4C057MM01

4C057MM09

4C076AA19

4C076AA31

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、および１つまたは複数の標的遺伝子の発現の阻害におけるその使用に関する。本発明は、ＲＮＡ干渉、化学修飾したオリゴヌクレオチド、および／またはキメラｓｉＲＮＡの多価の組合せを使用した、ｃ－Ｍｙｃの発現の阻害、またはｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳの二重阻害にさらに関する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

逆配向の第１および第２のｓｉＲＮＡを含む逆位キメラｓｉＲＮＡ分子であって、
ａ）リンカーによって連結された前記第１のｓｉＲＮＡの第１の鎖および前記第２のｓｉＲＮＡの第１の鎖を含む、第１のＲＮＡ分子と、
ｂ）前記第１のｓｉＲＮＡの前記第１の鎖に実質的に相補的である、第２のＲＮＡ分子と、
ｃ）前記第２のｓｉＲＮＡの前記第１の鎖に実質的に相補的である、第３のＲＮＡ分子と
を含む、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項2】

前記第１のＲＮＡ分子が、前記第１のｓｉＲＮＡのセンス鎖および前記第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項3】

約３０～約６０個のヌクレオチドの長さ、たとえば約３５～約５５個のヌクレオチドの長さ、たとえば約４０～約５０個のヌクレオチドの長さである、請求項１または２に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項4】

それぞれのｓｉＲＮＡが、独立して、約１５～約３０個のヌクレオチド、たとえば約１７～約２５個のヌクレオチド、たとえば約１９～約２３個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項5】

前記リンカーが代謝的に脆弱なリンカーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項6】

前記リンカーが、約２～約１０個のヌクレオチドの長さ、たとえば約３～約８個のヌクレオチドの長さ、たとえば約４～約６個のヌクレオチドの長さである、請求項１から５のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項7】

前記リンカーが、リン酸ジエステルチミン、リン酸ジエステルアデニン、またはリン酸ジエステルＴＣＡを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項8】

少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項9】

完全に化学修飾されている、請求項８に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項10】

前記分子中のそれぞれのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている、請求項９に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項11】

少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項12】

前記第１および第２のｓｉＲＮＡが同じ標的遺伝子と結合する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項13】

前記第１および第２のｓｉＲＮＡが異なる標的遺伝子と結合する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項14】

前記１および第２のｓｉＲＮＡのうちの一方がｃ－Ｍｙｃと結合する、請求項１３に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項15】

前記１および第２のｓｉＲＮＡのうちの一方がｃ－Ｍｙｃと結合し、他方がＫＲＡＳと結合する、請求項１３に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項16】

それぞれリンカーによって隔てられた１つまたは複数の追加のｓｉＲＮＡをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項17】

それぞれの追加のｓｉＲＮＡが、独立して、前記第１および第２のｓｉＲＮＡと同じ標的遺伝子または異なる標的遺伝子と結合する、請求項１６に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子。

【請求項18】

以下の配列の組のうちの１つを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子：
配列番号６３～６５
配列番号６６～６８
配列番号６９～７１
配列番号７１～７４
配列番号７５～７７
配列番号７８～８０
配列番号８１～８３
配列番号８４～８６
配列番号８７～８９
配列番号９０～９２
配列番号９３～９５
配列番号９６～９８
配列番号９９～１０１
配列番号１０２～１０４
またはそれと少なくとも９０％同一である配列。

【請求項19】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子を含む組成物。

【請求項20】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子のうちの２つ以上を任意の組合せで含み、前記２つ以上の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子がそれぞれ異なる配列を含む、組成物。

【請求項21】

ナノ粒子をさらに含む、請求項１９または２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記ナノ粒子がナノリポソームである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

請求項１から１８のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子および／または請求項１９から２２のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項24】

前記逆位キメラｓｉＲＮＡ分子がリガンド、抗体、またはアプタマーとコンジュゲートしている、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

細胞中における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１から１８のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項２３もしくは２４に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞中における前記標的遺伝子の発現を阻害することを含む方法。

【請求項26】

前記対象に、請求項１から１８のいずれか一項に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項２３もしくは２４に記載の医薬組成物を送達し、それによって、前記対象において前記障害を処置することを含む、それを必要としている対象において、標的遺伝子に関連する障害を処置する方法。

【請求項27】

前記対象に、請求項１４または１５に記載の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子を送達し、それによって、前記対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現する癌を処置する方法。

【請求項28】

前記送達が全身性送達である、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ｓｉＲＮＡ分子が少なくとも１つの化学修飾を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子が、以下の配列対：
配列番号１のセンス鎖および配列番号１９のアンチセンス鎖、
配列番号２のセンス鎖および配列番号２０のアンチセンス鎖、
配列番号４のセンス鎖および配列番号２２のアンチセンス鎖、
配列番号６のセンス鎖および配列番号２４のアンチセンス鎖、
配列番号９のセンス鎖および配列番号２７のアンチセンス鎖、
またはそれと少なくとも９０％同一である配列のうちの１つを含む、ヒトｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子。

【請求項30】

完全に化学修飾されている、請求項２９に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項31】

前記ｓｉＲＮＡ分子中のそれぞれのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている、請求項３０に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項32】

前記ｓｉＲＮＡ分子が少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項33】

前記ｓｉＲＮＡ分子が、以下の配列対：
配列番号３７のセンス鎖および配列番号３８のアンチセンス鎖、
配列番号３９のセンス鎖および配列番号４０のアンチセンス鎖、
配列番号４１のセンス鎖および配列番号４２のアンチセンス鎖、
配列番号４３のセンス鎖および配列番号４４のアンチセンス鎖、または
配列番号４５のセンス鎖および配列番号４６のアンチセンス鎖
のうちの１つを含む、請求項３２に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項34】

請求項２９から３３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む組成物。

【請求項35】

請求項２９から３３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡのうちの２つ以上を任意の組合せで含み、前記２つ以上のｓｉＲＮＡがそれぞれ異なる配列を含む、組成物。

【請求項36】

ナノ粒子をさらに含む、請求項３４または３５に記載の組成物。

【請求項37】

前記ナノ粒子がナノリポソームである、請求項３６に記載の組成物。

【請求項38】

請求項２９から３３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡおよび／または請求項６から９のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項39】

前記ｓｉＲＮＡがリガンド、抗体、またはアプタマーとコンジュゲートしている、請求項３８に記載の医薬組成物。

【請求項40】

前記細胞を、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項３８もしくは３９に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞中における前記ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む、細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法。

【請求項41】

前記対象に、請求項２９から３３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項３８もしくは３９に記載の医薬組成物を送達し、それによって、前記対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現する癌を処置する方法。

【請求項42】

前記送達が全身性送達である、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

野生型ＫＲＡＳまたはＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、もしくはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードしている天然に存在するヒトＫＲＡＳを標的とするＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ分子と、ヒトｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とするｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子とを含むｓｉＲＮＡ分子であって、前記ｓｉＲＮＡ分子が少なくとも１つの化学修飾を含み、前記ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子が、以下の配列対：
配列番号１のセンス鎖および配列番号１９のアンチセンス鎖、
配列番号２のセンス鎖および配列番号２０のアンチセンス鎖、
配列番号４のセンス鎖および配列番号２２のアンチセンス鎖、
配列番号６のセンス鎖および配列番号２４のアンチセンス鎖、
配列番号９のセンス鎖および配列番号２７のアンチセンス鎖、
またはそれと少なくとも９０％同一である配列のうちの１つを含む、ｓｉＲＮＡ分子。

【請求項44】

完全に化学修飾されている、請求項４３に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項45】

前記ｓｉＲＮＡ分子中のそれぞれのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている、請求項４４に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項46】

前記ｓｉＲＮＡ分子が少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。

【請求項47】

前記ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子が、以下の配列対：
配列番号３７のセンス鎖および配列番号３８のアンチセンス鎖、
配列番号３９のセンス鎖および配列番号４０のアンチセンス鎖、
配列番号４１のセンス鎖および配列番号４２のアンチセンス鎖、
配列番号４３のセンス鎖および配列番号４４のアンチセンス鎖、または
配列番号４５のセンス鎖および配列番号４６のアンチセンス鎖
のうちの１つを含む、請求項４６に記載のｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子。

【請求項48】

前記ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ分子が、以下の配列対：
配列番号４７のセンス鎖および配列番号４８のアンチセンス鎖、または
配列番号４９のセンス鎖および配列番号５０のアンチセンス鎖
のうちの１つである、請求項４６または４７に記載のＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ分子。

【請求項49】

請求項４３から４８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む組成物。

【請求項50】

野生型ＫＲＡＳまたはＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、もしくはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードしている天然に存在するヒトＫＲＡＳを標的とする少なくとも１つのＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ分子と、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のヒトｃ－Ｍｙｃを標的とする２つ以上のｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子とを、任意の組合せで含み、前記２つ以上のｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡがそれぞれ異なる配列を含む、組成物。

【請求項51】

ナノ粒子をさらに含む、請求項４９または５０に記載の組成物。

【請求項52】

前記ナノ粒子がナノリポソームである、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

請求項４３から４８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡおよび／または請求項４９から５２のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項54】

前記ｓｉＲＮＡがリガンド、抗体、またはアプタマーとコンジュゲートしている、請求項５３に記載の医薬組成物。

【請求項55】

細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項５３もしくは５４に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、前記細胞中における前記ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む方法。

【請求項56】

それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現する癌を処置する方法であって、前記対象に、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項４９から５２のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項５３もしくは５４に記載の医薬組成物を送達し、それによって、前記対象において癌を処置することを含む方法。

【請求項57】

前記送達が全身性送達である、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

野生型ＫＲＡＳまたはＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、もしくはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードしている天然に存在するヒトＫＲＡＳを標的とするＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡと、
ヒトｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とするｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子と、
前記ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡおよび前記ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡを接続するリン酸ジエステルリンカー領域と
を含む、ｓｉＲＮＡ多価キメラ分子。

【請求項59】

１つまたは複数の化学修飾を有する、請求項５８に記載のｓｉＲＮＡ多価キメラ分子。

【請求項60】

前記ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡおよび前記ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡが完全に化学修飾されている、請求項５９に記載のｓｉＲＮＡ多価キメラ分子。

【請求項61】

前記ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡおよび前記ｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ中のそれぞれのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている、請求項６０に記載のｓｉＲＮＡ多価キメラ分子。

【請求項62】

前記ｓｉＲＮＡ分子が少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む、請求項５８から６１のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ多価キメラ分子。

【請求項63】

請求項５８から６２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む組成物。

【請求項64】

ナノ粒子をさらに含む、請求項６３に記載の組成物。

【請求項65】

前記ナノ粒子がナノリポソームである、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

請求項５８から６２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、および／または請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項67】

前記ｓｉＲＮＡがリガンド、抗体、またはアプタマーとコンジュゲートしている、請求項６６に記載の医薬組成物。

【請求項68】

細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項５８から６２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項６６もしくは６７に記載の医薬組成物と接触させて、それによって、前記細胞中における前記ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む方法。

【請求項69】

それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を発現する癌を処置する方法であって、前記対象に、請求項５８から６２のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の組成物、および／または請求項６６もしくは６７に記載の医薬組成物を送達して、それによって、前記対象において癌を処置することを含む方法。

【請求項70】

前記送達が全身性送達である、請求項６９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の記述
本出願は、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている、２０２１年６月２１日に出願の米国仮出願第６３／２１２，９７６号の優先権を主張するものである。

【0002】

本発明は、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、および１つまたは複数の標的遺伝子の発現の阻害（ｉｎｈｂｉｔｉｏｎ）におけるその使用に関する。本発明は、ＲＮＡ干渉、化学修飾したオリゴヌクレオチド、および／またはキメラｓｉＲＮＡの多価の組合せを使用した、ｃ－Ｍｙｃの発現の阻害、またはｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳの二重阻害にさらに関する。

【背景技術】

【0003】

ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、攻撃的な癌種の発癌性駆動因子として十分に特徴づけられているが、その細胞内局在化、遍在性の組織発現、および酵素結合部位の欠如が原因で、概して「新薬開発不可能である」とみなされている。同様に、ＲＡＳ遺伝子は、下流のエフェクタータンパク質に作用して細胞の生存、成長、および増殖を促進する、小さなＧＴＰａｓｅのファミリーをコードする（Ｋｈｏｓｒａｖｉ－Ｆａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．、１３：６７（１９９４））。ＲＡＳタンパク質の正しい機能は、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を介した、その活性のあるＧＴＰと結合した形態への活性化、およびＲＡＳ－ＧＴＰ複合体の膜会合に依存しており、これらはどちらも、ＫＲＡＳ阻害の標的として提案されている。しかし、ＫＲＡＳを直接阻害することにおける、以前に提案された治療剤の低い有効性および標的特異性が原因で、ＫＲＡＳ経路を標的とするための現在の手段は、主に下流のエフェクタータンパク質の阻害に焦点を当てている（Ｃｏｘら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、１３：８２８（２０１４））。それでもなお、遺伝子活性を直接下方制御する小分子の開発における難題にもかかわらず、ＫＲＡＳは、ヒト癌における駆動的突然変異としてのその有病率が理由で、治療上関連性のある標的であり続ける。最近の研究により、ｃ－Ｍｙｃおよび突然変異体ＫＲＡＳが密にカップリングされていることが明らかとなっており（Ｖａｓｅｖａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、３４（５）（２０１８））、これは、両標的を同時にサイレンシングする能力が、相加的および／または相乗的な抗癌効果を有し得ることを示唆している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、ｃ－Ｍｙｃ配列およびｃ－ＭｙｃとＫＲＡＳとの組合せの特異的阻害のためのＲＮＡ干渉を使用した組成物および方法を提供することによって、当技術分野における欠陥に打ち勝つ。さらに、本発明は、２つの化学修飾したｓｉＲＮＡが、代謝的に脆弱なリン酸ジエステルＤＮＡ橋によって連結されて、１つまたは複数の標的遺伝子を同時に、たとえばｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳまたは任意の他の目的の遺伝子を特異的に阻害する、新規キメラｓｉＲＮＡ設計を使用した組成物および方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明は、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子の開発に基づく。これらの構築体は、１つまたは複数の標的遺伝子の遺伝子発現の注目すべき阻害を提供し、単一ｓｉＲＮＡおよび直列キメラｓｉＲＮＡよりも予想外に優れている。したがって、本発明の一態様は、
ａ）リンカーによって連結された第１のｓｉＲＮＡの第１の鎖および第２のｓｉＲＮＡの第１の鎖を含む、第１のＲＮＡと、
ｂ）第１のｓｉＲＮＡの第１の鎖に実質的に相補的である、第２のＲＮＡと、
ｃ）第２のｓｉＲＮＡの第１の鎖に実質的に相補的である、第３のＲＮＡと
を含む、逆配向の第１および第２のｓｉＲＮＡを含む逆位キメラｓｉＲＮＡ分子に関する。

【0006】

本発明の別の態様は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む、組成物、たとえば医薬組成物に関する。

【0007】

本発明のさらなる態様は、細胞を、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、組成物、および／または医薬組成物と接触させ、それによって、細胞中における標的遺伝子の発現を阻害することを含む、細胞中における標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。

【0008】

本発明の追加の態様は、対象に、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、組成物、および／または医薬組成物を送達し、それによって、対象において障害を処置することを含む、それを必要としている対象において、標的遺伝子に関連する障害を処置する方法に関する。

【0009】

本発明の別の態様は、対象に、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子を送達し、それによって、対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現する癌を処置する方法に関する。

【0010】

本発明は、ｃ－Ｍｙｃ配列の発現を阻害するＲＮＡ分子の同定にさらに基づく。したがって、本発明の一態様は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子のヌクレオチド配列の一領域に相補的であり、領域が、約１８～約２５個の連続的なヌクレオチドから本質的になり、二本鎖ＲＮＡ分子が、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する、二本鎖ＲＮＡ分子に関する。最近の研究により、ｃ－Ｍｙｃおよび突然変異体ＫＲＡＳが密にカップリングされていることが明らかとなっており（Ｖａｓｅｖａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、３４（５）（２０１８））、これは、両標的を同時にサイレンシングする能力が、相加的および／または相乗的な抗癌効果を有し得ることを示唆している。一実施形態では、複数のｓｉＲＮＡを使用して、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ遺伝子をどちらも同時に阻害する。

【0011】

本発明の別の態様は、本発明のＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む組成物、たとえば医薬組成物に関する。

【0012】

本発明のさらなる態様は、細胞を、本発明のＲＮＡ分子と接触させ、それによって、細胞中におけるヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法に関する。

【0013】

本発明の追加の態様は、対象に、本発明のＲＮＡ分子を送達し、それによって、対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌を処置する方法に関する。

【0014】

本発明の別の態様は、細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害するため、およびそれを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌を処置するための、本発明のＲＮＡ分子の使用に関する。

【0015】

本発明の別の態様は、少なくとも１つの化学修飾を含み、以下の配列対：
配列番号３７のセンス鎖および配列番号３８のアンチセンス鎖、
配列番号３９のセンス鎖および配列番号４０のアンチセンス鎖、
配列番号４１のセンス鎖および配列番号４２のアンチセンス鎖、
配列番号４３のセンス鎖および配列番号４４のアンチセンス鎖、もしくは
配列番号４５のセンス鎖および配列番号４６のアンチセンス鎖、
またはそれと少なくとも９０％同一である配列
のうちの１つを含む、天然に存在するヒトｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子に関する。

【0016】

本発明の別の態様は、本発明のｓｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む組成物、たとえば医薬組成物に関する。

【0017】

本発明のさらなる態様は、細胞を、本発明のｓｉＲＮＡ分子と接触させ、それによって、細胞中におけるヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む、細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法に関する。

【0018】

本発明の追加の態様は、対象に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子を送達し、それによって、対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌を処置する方法に関する。

【0019】

本発明の別の態様は、細胞中においてヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害するため、およびそれを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌を処置するための、本発明のｓｉＲＮＡ分子の使用に関する。

【0020】

本発明の別の態様は、二本鎖ＲＮＡ分子であって、第１のＲＮＡ分子が、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子を標的とするアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、第２のＲＮＡ分子が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードすることができる天然に存在するＫＲＡＳ配列を標的とするアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、第１のＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子のヌクレオチド配列の一領域に相補的なアンチセンス鎖を有し、領域が、約１８～約２５個の連続的なヌクレオチドから本質的になり、二本鎖ＲＮＡ分子が、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害し、第２のＲＮＡ分子のヌクレオチド配列が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、またはＧ１３Ｄから選択される突然変異をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列のヌクレオチド配列の一領域に相補的なアンチセンス鎖を有し、領域が、約１８～約２５個の連続的なヌクレオチドから本質的になり、二本鎖ＲＮＡ分子が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、またはＫＲＡＳ野生型配列をコードしている天然に存在するＫＲＡＳ配列の発現を阻害する、二本鎖ＲＮＡ分子に関する。

【0021】

本発明の別の態様は、ｓｉＲＮＡ分子であって、第１のｓｉＲＮＡ分子が、天然に存在するヒトｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とし、少なくとも１つの化学修飾を含み、以下の配列対：
配列番号３７のセンス鎖および配列番号３８のアンチセンス鎖、
配列番号３９のセンス鎖および配列番号４０のアンチセンス鎖、
配列番号４１のセンス鎖および配列番号４２のアンチセンス鎖、
配列番号４３のセンス鎖および配列番号４４のアンチセンス鎖、もしくは
配列番号４５のセンス鎖および配列番号４６のアンチセンス鎖、
またはそれと少なくとも９０％同一である配列
のうちの１つを含み、第２のｓｉＲＮＡ分子が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列を標的とし、少なくとも１つの化学修飾を含む、ｓｉＲＮＡ分子に関する。一部の実施形態（ｅｍｂｏｉｄｍｅｎｔ）では、ｓｉＲＮＡ分子は、以下の配列対：
配列番号４７のセンス鎖および配列番号４８のアンチセンス鎖、
配列番号４９のセンス鎖および配列番号５０のアンチセンス鎖、
またはそれと少なくとも９０％同一である配列
のうちの１つを含む。

【0022】

本発明の別の態様は、本発明のｓｉＲＮＡ分子のうちの１つまたは複数を含む組成物、たとえば医薬組成物に関する。

【0023】

本発明のさらなる態様は、細胞を、本発明のｓｉＲＮＡ分子と接触させ、それによって、細胞中における、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子、および、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列の発現を阻害することを含む、細胞中において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子、および、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列の発現を阻害する方法に関する。

【0024】

本発明の追加の態様は、対象に、本発明のｓｉＲＮＡ分子を送達し、それによって、対象において癌を処置することを含む、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子、および、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列の過剰発現を含む癌を処置する方法に関する。

【0025】

本発明の別の態様は、細胞中において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子、および、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列の発現を阻害するため、ならびに、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ、およびＧ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄから選択される突然変異、または野生型配列をコードすることができる、天然に存在するＫＲＡＳ配列の過剰発現を含む癌を処置するための、本発明のｓｉＲＮＡ分子の使用に関する。

【0026】

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明中により詳細に記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A-1C】ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において、合成ｓｉＲＮＡ（「ｓｉＲ」）が、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の発現を減少させることができることを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、ｓｎｏｒｄ９０を標的とする対照ｓｉＲＮＡおよび８つのｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４および４８時間処理した。Ｂ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、ｓｎｏｒｄ９０を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ、以前に公開されている論文からの陽性対照ｓｉＲＮＡ、および８つのｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した。Ｃ）パネルＢからのｃ－Ｍｙｃバンド強度の定量。

【図2A-2B】合成の化学修飾したｓｉＲＮＡが、ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ転写物を実質的に低下させることができることを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび５つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４、４８、および７２時間処理した。Ｂ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび５つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４および７２時間処理した。

【図3A-3D】合成の化学修飾したｓｉＲＮＡが、ｃ－Ｍｙｃタンパク質発現を減少させることができることを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２およびＡ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで４８（Ａ４２７）および７２（ＭＩＡ－ＰａＣａ２）時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した。Ｂ）パネルＡからのｃ－Ｍｙｃバンド強度の定量。Ｃ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに化学修飾した（Ｈｉ２ＦおよびＨｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで４８時間処理した。Ｄ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに化学修飾した（Ｈｉ２ＦおよびＨｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで７２時間処理した。

【図4A-4B】合成の化学修飾したｓｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ球状体形成を減少させることを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２およびＡ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび２つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した。Ｂ）パネルＡ中の画像からの球状体平均面積の定量。^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＝０．０００２。

【図5A-5D】ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において、化学修飾したｓｉＲＮＡを用いたｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳの二重標的化が、球状体の面積および数の減少をもたらすことを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（Ｈｉ２Ｆ）およびＫＲＡＳ（Ｈｉ２ＯＭｅ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した。Ｂ）Ｏｒｇａｎｏｓｅｇを使用した、共焦点画像からの球状体の面積および数の定量。^＊ｐ＝０．００２７、^＊＊ｐ＝０．０１４７、^＊＊＊ｐ＝０．００２２、^＊＊＊＊ｐ＝０．０１１３。Ｃ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（Ｈｉ２Ｆ）およびＫＲＡＳ（Ｈｉ２ＯＭｅ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで２４時間処理し、その後、９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いて５日間イメージングした。Ｄ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いたイメージング後、細胞をＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ ３Ｄと混合し、蛍光をプレートリーダーで測定して、代謝活性を決定した。^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１。

【図6A-6F】Ａ４２７細胞中において、化学修飾したｓｉＲＮＡを用いたｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳの二重標的化が、球状体の面積および数の減少をもたらすことを示す図である。Ａ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（Ｈｉ２Ｆ）およびＫＲＡＳ（Ｈｉ２ＯＭｅ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した。Ｂ）Ｏｒｇａｎｏｓｅｇを使用した、共焦点画像からの球状体の面積および数の定量。^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１。Ｃ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（Ｈｉ２Ｆ）およびＫＲＡＳ（Ｈｉ２ＯＭｅ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いて５日間イメージングした。Ｄ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いたイメージング後、細胞をＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ ３Ｄと混合し、蛍光をプレートリーダーで測定して、代謝活性を決定した。Ｅ、Ｆ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（Ｈｉ２Ｆ）およびＫＲＡＳ（Ｈｉ２ＯＭｅ）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、ＣｅｌｌＴｏｘ Ｇｒｅｅｎを用いて９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いて５日間イメージングした。グラフは８４時間までのデータを示す。^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１。

【図7】ＫＲＡＳおよびｃＭｙｃを標的とするｓｉＲを２つの配向（「逆位キメラ」および「直列キメラ」）で合わせる、リン酸ジエステル連結された化学修飾したｓｉＲＮＡを示す模式図である。

【図8】ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において、ＫＲＡＳおよびｃＭｙｃを標的とするｓｉＲ（「逆位キメラ」）を合わせる、リン酸ジエステル連結された化学修飾したｓｉＲが、生物活性があり、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物を減少させることができることを示す図である。ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、および１個化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ（単独でまたは組み合わせてのいずれか）、ならびに１つの「逆位キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭ、１０ｎＭ、および２０ｎＭで４８および７２時間処理した。

【図9】Ａ４２７細胞中において、逆位キメラが、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物を減少させることにおいて、直列キメラよりも強力であることを示す図である。Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで４８および７２時間処理した。

【図10A-10C】ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において、逆位キメラが、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物を減少させることにおいて、直列キメラよりも強力であることを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで４８および７２時間処理した。Ｂ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、２つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、２つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで７２時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した。Ｃ）Ｂからのｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳのバンド強度の定量。

【図11】逆位キメラが５０％血清中で直列キメラよりも安定であることを示す図である。１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを、１０ｕＭで、５０％のＦＢＳ中、３７℃で、０、６、および２４時間インキュベートした。反応を０．５ＭのＥＤＴＡで停止させた。ｓｉＲバンド強度の定量を右側に示す。

【図12】どちらのキメラもサイトゾル条件中で安定であることを示す図である。１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを、緩衝ラット肝臓サイトゾル中、３７℃で０、６、および２４時間インキュベートした。反応を０．５ＭのＥＤＴＡで停止させた。ｓｉＲバンド強度の定量を右側に示す。

【図13】どちらのキメラもエンドソーム条件中で解離し始めたことを示す図である。１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを、酸性化したラット肝臓トリトソーム（ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）中、３７℃で０、６、および２４時間インキュベートした。反応を０．５ＭのＥＤＴＡで停止させた。ｓｉＲバンド強度の定量を右側に示す。

【図14A-14C】ダイサーが逆位または直列キメラをどちらも切断しないことを示す図である。Ａ）１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを、緩衝組換えダイサーと共に、３７℃で０、６、および２４時間インキュベートした。反応を０．５ＭのＥＤＴＡで停止させた。ｓｉＲバンド強度の定量を右側に示す。ＨＥＫ２９３Ｔ親（Ｂ）およびＮｏＤｉｃｅ（Ｃ）細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで４８時間処理した。

【図15】逆位キメラが、直列キメラよりも増加した、ＫＲＡＳ－ルシフェラーゼタンパク質に対する効力をもたらすことを示す図である。内在性ＫＲＡＳをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって除去し、ＫＲＡＳ－ホタルルシフェラーゼおよび非標識のウミシイタケルシフェラーゼを安定に組み込むＡ４３１同質遺伝子細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、９６時間、３９～０．００２ｎＭの範囲の用量で処理した。ウミシイタケルシフェラーゼを用いてホタルルシフェラーゼのデータを正規化した。

【図16A-16B】逆位キメラのＶ２が、Ｖ１と等価な、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡに対する効力をもたらすことを示す図である。ＭＩＡ－ＰａＣａ２（Ａ）およびＡ４２７（Ｂ）細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン１ ｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、７２時間、４ｎＭおよび１０ｎＭで処理した。

【図17A-17B】Ａ４２７細胞中において、逆位キメラのＶ２が、単一ｓｉＲよりも増加した、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳタンパク質の低下をもたらすことを示す図である。Ａ）Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで７２時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した。Ｂ）パネルＡからのｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、ｐＥＲＫ（１／２）／ｔＥＲＫ（１／２）、およびｐＳ６のバンド強度の定量。すべての条件は、ビンキュリンのバンド強度を用いて正規化した。

【図18A-18B】ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において、逆位キメラのＶ２が、単一ｓｉＲよりも増加した、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳタンパク質の低下をもたらすことを示す図である。Ａ）ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで７２時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した。Ｂ）Ａからのｃ－Ｍｙｃ、ＫＲＡＳ、およびｐＥＲＫ（１／２）／ｔＥＲＫ（１／２）のバンド強度の定量。すべての条件は、ビンキュリンのバンド強度を用いて正規化した。

【図19】逆位キメラのＶ２が、ＫＲＡＳ－ルシフェラーゼタンパク質に対して高い効力をもたらすことを示す図である。ＫＲＡＳ－ホタルルシフェラーゼおよび非標識のウミシイタケルシフェラーゼを安定に組み込ませたＡ４３１ ＫＲＡＳノックアウト細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、９６時間、２１～０．００１ｎＭの範囲の用量で処理した。ウミシイタケルシフェラーゼを用いてホタルルシフェラーゼのデータを正規化した。

【図20A-20B】複数の細胞系中において、逆位キメラＶ２が細胞生存度を相乗的に減少させることを示す図である。ＭＩＡ－ＰａＣａ２（Ａ）およびＡ４２７（Ｂ）細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、１２０時間、４０ｎＭ～０．０１９ｎＭの範囲の用量で処理した。

【図21A-21D】複数の細胞系中において、逆位キメラＶ２が球状体生存度を減少させることを示す図である。Ａ４２７（Ａ）およびＭＩＡ－ＰａＣａ２（Ｂ）細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」バージョン２ ｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した。Ｃ）Ｏｒｇａｎｏｓｅｇを使用した共焦点画像からの、Ａ４２７中における球状体の面積および数の定量。^＊＊＊ｐ＝０．００４、^＊＊ｐ＝０．００８４、^＊＊＊＊ｐ＝＜０．００１。Ｄ）Ａ４２７中における球状体の面積および数の定量。^＊ｐ＝０．０４３５、^＊＊ｐ＝０．０１８２、^＊＊＊ｐ＝０．０４２、^＊＊＊＊ｐ＝０．００１２。

【図22】ＫＲＡＳ ＷＴまたはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖレポーターを発現する同質遺伝子細胞系を使用した、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）ｓｉＲＮＡの開発および妥当性確認を示す図である。Ａ４３１細胞は、内在性ＫＲＡＳ ＷＴ対立遺伝子がＣＲＩＳＰＲを用いて欠失されていた。その後、安定ＫＲＡＳ ＷＴまたはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ発現ベクターを発現させた。ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡレベルでは、形質移入（２０ｎＭ）の４８時間後、ＥＦＴＸ－３Ｇ１２Ｖ４（またはＥＦＴＸ－Ｇ１２Ｖ ＦＭ４）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの強力なサイレンシングをもたらしたが、ＫＲＡＳ ＷＴの標的化を完全に容赦したことが見出された。パン－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡと比較して、ルシフェラーゼ読取りを使用して、ＥＦＴＸ－Ｇ１２Ｖ－ＦＭ４がＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを強力に標的とするが、ＫＲＡＳ ＷＴの標的化を完全に容赦することが見出された。

【図23】ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するＳＫＣＯ１（結腸）およびＨ７２７（肺）細胞系を使用した、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）ｓｉＲＮＡの開発および妥当性確認を示す図である。ＳＫＣＯ１およびＨ７２７細胞系（Ｇ１２Ｖ突然変異を有する）を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＥＦＴＸ－Ｇ１２Ｖ ｓｉＲＮＡ（Ｈｉ２ＯＭｅ）Ｇ１２Ｖ突然変異体に特異的なＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、約１週間、４０ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の用量で処理した。

【図24】Ｈ４４１中において、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）およびｃ－Ｍｙｃを標的とする逆位キメラが、細胞生存度を相乗的に減少させることを示す図である。Ｈ４４１（Ｇ１２Ｖ突然変異を有する）細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）Ｇ１２Ｖ突然変異体に特異的なＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２逆位キメラバージョン２ ｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｇ１２Ｖに特異的な逆位キメラを用いて、１４４時間、４０ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の用量で処理した。

【図25】ＳＫＣＯ１中において、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）およびｃ－Ｍｙｃを標的とする逆位キメラが、細胞生存度を相乗的に減少させることを示す図である。ＳＫＣＯ１（Ｇ１２Ｖ突然変異を有する）細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）Ｇ１２Ｖ突然変異体に特異的なＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２逆位キメラバージョン２ ｓｉＲＮＡ、または１つのＭ２／Ｇ１２Ｖに特異的な逆位キメラを用いて、２１６時間、４０ｎＭ～０．０１ｎＭの範囲の用量で処理した。

【図26】ＲＰＭＩ－８２２６骨髄腫細胞系中において、ＩＲＦ４およびｃ－Ｍｙｃを標的とする逆位キメラが、細胞生存度を相乗的に減少させることを示す図である。ＲＰＭＩ－８２２６細胞を、ＲＮＡｉＭａｘと複合体形成させた様々な用量のＨｉＯＭｅ ｓｉＲＮＡを用いて、９６ウェルプレート形式で５日間処理し、２ＯＭｅを陰性対照として用いた。形質移入後の５日目に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ２．０を加え、ルミネセンスを決定した。

【図27A-27B】同じ遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）を標的とする逆位キメラが、個々のｓｉＲを用いて遺伝子を標的化することよりも、ｍＲＮＡの低下においてより有効であることを示す図である。Ａ４２７（Ａ）およびＭＩＡ－ＰａＣａ２（Ｂ）細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、２つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｍ３逆位キメラｓｉＲＮＡ、または１つのＭ３／Ｍ２逆位キメラｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで７２時間処理した。

【図28】同じ遺伝子（ＫＲＡＳ）を標的とする逆位キメラが、個々のｓｉＲを用いて遺伝子を標的化することよりも、ＫＲＡＳ－ルシフェラーゼタンパク質の低下ついてより有効であることを示す図である。ＫＲＡＳ－ホタルルシフェラーゼおよび非標識のウミシイタケルシフェラーゼを安定に組み込ませたＡ４３１ ＫＲＡＳノックアウト細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、または１つのＫ３／Ｋ２逆位キメラｓｉＲＮＡを用いて、９６時間、３９～０．００２ｎＭの範囲の用量で処理した。ウミシイタケルシフェラーゼを用いてホタルルシフェラーゼのデータを正規化した。

【図29】直列および逆位キメラの両方における、リンカーおよび標的化部分の潜在的なコンジュゲーション部位（黒い矢印）を示す図である。

【図30】合わせた逆位キメラおよび直列キメラ設計を使用した、３個までのユニークなｓｉＲＮＡを合わせる、リン酸ジエステル連結された化学修飾したｓｉＲを示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明の好ましい実施形態を示す添付の図面を参照して、本発明を以下により詳細に記述する。しかし、本発明は様々な形態で具体化してよく、本明細書中に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全となるように提供し、したがって、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるであろう。

【0029】

別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中において本発明の説明に使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみが目的であり、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で引用するすべての出版物、特許出願、特許、特許公開、および他の参考文献は、参照を提示する文および／または段落に関連する教示について、その全体で参考として組み込まれている。

【0030】

ヌクレオチド配列は、そうでないと具体的に示さない限りは、本明細書中では、単一鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に提示する。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書中では、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨された様式で、または（アミノ酸では）、どちらも米国特許法施行規則第１．８２２条および確立された慣習法に従った一文字のコードもしくは三文字のコードのどちらによって、表す。

【0031】

そうでないと示さない限りは、当業者に知られている標準方法を、遺伝子をクローニングするため、核酸を増幅および検出するためなどに使用し得る。そのような技法は当業者に知られている。たとえば、Ｇｒｅｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２０１２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0032】

内容によりそうでないと示されない限りは、本明細書中に記載の本発明の様々な特長を任意の組合せで使用できることが、具体的に意図される。

【0033】

さらに、本発明はまた、本発明の一部の実施形態では、本明細書中に記載の任意の特長または特長の組合せを排除または省略できることも企図する。

【0034】

例示すると、明細書が、複合体が構成要素Ａ、Ｂ、およびＣを含むと記述する場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣのうちの任意のもの、またはその組合せを、単独でまたは任意の組合せで省略および拒否できることが、具体的に意図される。

【0035】

定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと示されない限りは、複数形も含むことを意図する。

【0036】

また、本明細書中で使用する「および／または」とは、関連する列挙した項目のうちの１つまたは複数の任意かつすべての可能な組合せ、ならびに代替（「または」）で解釈した場合は組合せの欠如をいい、またそれを包含する。

【0037】

ポリペプチドの量、用量、時間、温度、酵素活性、または他の生物活性などの測定可能な値に言及する場合に、本明細書中で使用する用語「約」とは、指定した量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。

【0038】

本明細書中で使用する移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法的な変形）とは、列挙した材料またはステップ、ならびに特許請求した発明の基本的および新規の特徴に大いに影響を与えないものを包含すると解釈される。したがって、本明細書中で使用する用語「から本質的になる」は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価であると解釈されるべきでない。

【0039】

本発明のポリヌクレオチド配列に適用される用語「から本質的になる」（および文法的な変形）とは、列挙した配列（たとえば配列番号）、ならびにポリヌクレオチドの機能が大いに変更されないような、列挙した配列の５’および／または３’末端上における合計１０個以下（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の追加のヌクレオチドの両方からなる、ポリヌクレオチドを意味する。合計１０個以下の追加のヌクレオチドは、亮末端の追加のヌクレオチドの合計数を合算したものを含む。本発明のポリヌクレオチドに適用する用語「大いに変更された」とは、列挙した配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、標的ｍＲＮＡの発現を阻害する能力の、少なくとも約５０％以上の増加または減少をいう。

【0040】

用語「増強する」または「増加させる」とは、指摘したパラメータの少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、またはさらには１５倍の増加をいう。

【0041】

本明細書中で使用する用語「阻害する」もしくは「低下させる」またはその文法的変形とは、指摘したレベルまたは活性の、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多くの減少または減弱をいう。特定の実施形態では、阻害または低下は、検出可能な活性がわずかまたは本質的にないことをもたらす（最大でも重要でない量、たとえば約１０％未満またはさらには５％）。

【0042】

本明細書中で使用する「治療上有効な」量とは、対象にある程度の改善または利点をもたらす量である。別の言い方をすれば、「治療上有効な」量とは、対象における少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、軽減、または減少（たとえば、癌の場合、腫瘍量の低下、さらなる腫瘍成長の防止、転移の防止、または生存時間の増加）を提供する量である。当業者は、治療効果は、ある程度の利点が対象に提供される限りは、完全または治癒的である必要はないことを理解されよう。

【0043】

用語「処理する」、「処置すること」、または「～の処置」とは、対象の状態の重篤度が低下または少なくとも部分的に改善または改変されており、少なくとも１つの臨床症状のある程度の緩和、軽減、または減少が達成されることを意図する。

【0044】

「防止する」または「防止すること」または「防止」とは、本発明の方法の非存在下で発生するであろう重篤度と比較した、対象における障害の発症の防止もしくは遅延および／または障害の重篤度の減少をいう。防止は、完全、たとえば対象における癌の完全な非存在であることができる。防止はまた、対象における癌の発生率または重篤度が、本発明なしで起こったであろうものよりも低いような、部分的であることもできる。

【0045】

本明細書中で使用する「核酸」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」は、互換性があるように使用され、ＲＮＡおよびＤＮＡをどちらも包含し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成（たとえば化学合成）ＤＮＡまたはＲＮＡ、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラが挙げられる。用語、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、または核酸とは、鎖の長さにかかわらず、ヌクレオチドの鎖をいう。核酸は二本鎖または一本鎖であることができる。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であることができる。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体を使用して合成することができる（たとえばイノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、たとえば、変更された塩基対合能力または増加したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製することができる。本発明は、本発明の核酸、ヌクレオチド配列、またはポリヌクレオチドの補体（完全補体または部分的補体のどちらであることもできる）である核酸をさらに提供する。ｄｓＲＮＡを合成によって生成する場合、より一般的でない塩基、たとえば、イノシン、５－メチルシトシン、６－メチルアデニン、ヒポキサンチン、および他のものも、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイム対合に使用することができる。たとえば、ウリジンおよびシチジンのＣ－５プロピン類似体を含有するポリヌクレオチドは、高い親和性でＲＮＡと結合すること、および遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されている。リン酸ジエステル主鎖への修飾、またはＲＮＡのリボース糖基中の２’－ヒドロキシなどの、他の修飾も行うことができる。

【0046】

「単離したポリヌクレオチド」とは、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中において、それが直接隣接しているヌクレオチド配列（５’末端に１つおよび３’末端に１つ）と、直接隣接していない、ヌクレオチド配列（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。したがって、一実施形態では、単離した核酸は、コード配列と直接隣接している５’非コード（たとえばプロモーター）配列の一部または全部を含む。したがって、この用語は、他の配列とは独立して、たとえば、ベクター内、自律複製するプラスミドもしくはウイルス内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に取り込まれる、あるいは、別個の分子（たとえば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理によって生成されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する、組換えＤＮＡを含む。これはまた、追加のポリペプチドまたはペプチド配列をコードしているハイブリッド核酸の一部である組換えＤＮＡも含む。遺伝子を含む単離したポリヌクレオチドは、そのような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、遺伝子に関連するコード領域および調節領域を含むが、染色体上に天然に見つかる追加の遺伝子は含まない。

【0047】

用語「単離した」とは、細胞物質、ウイルス材料、および／もしくは培養培地（組換えＤＮＡ技法によって生成した場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学薬品（化学合成した場合）を実質的に含まない、核酸、ヌクレオチド配列、またはポリペプチドをいうことができる。さらに、「単離した断片」は、断片として天然に存在せず、天然状態では見つからないであろう、核酸、ヌクレオチド配列、またはポリペプチドの断片である。「単離した」とは、調製物が技術的に純粋（均一）であることを意味しないが、これは、ポリペプチドまたは核酸を意図する目的のために使用することができる形態で提供するために、十分に純粋である。

【0048】

「単離した細胞」とは、天然状態においてそれが通常会合している他の構成要素から分離されている細胞をいう。たとえば、単離した細胞は、培養培地中の細胞および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であることができる。したがって、単離した細胞は、対象に送達するおよび／または対象内に導入することができる。一部の実施形態では、単離した細胞は、対象から取り出し、本明細書中に記載のようにｅｘ ｖｉｖｏで操作し、その後、対象に戻す、細胞であることができる。

【0049】

ポリヌクレオチドに適用する用語「断片」とは、参照核酸またはヌクレオチド配列と比較して短縮された長さであり、参照核酸またはヌクレオチド配列と同一またはほぼ同一（たとえば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）である隣接したヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、ヌクレオチド配列を意味すると理解されたい。そのような本発明による核酸断片は、適切な場合は、それが構成要素であるより大きなポリヌクレオチド中に含まれ得る。一部の実施形態では、そのような断片は、本発明による核酸またはヌクレオチド配列の少なくとも約８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個、またはそれより多くの連続的なヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、それから本質的になる、および／または、それからなることができる。

【0050】

ポリペプチドに適用する用語「断片」とは、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と比較して短縮された長さであり、参照ポリペプチドまたはアミノ酸配列と同一またはほぼ同一（たとえば、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％同一）である隣接したアミノ酸のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる、アミノ酸配列を意味すると理解されたい。そのような本発明によるポリペプチド断片は、適切な場合は、それが構成要素であるより大きなポリペプチド中に含まれ得る。一部の実施形態では、そのような断片は、本発明によるポリペプチドまたはアミノ酸配列の少なくとも約４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００個、またはそれより多くの連続的なアミノ酸の長さを有するペプチドを含む、それから本質的になる、および／または、それからなることができる。

【0051】

「ベクター」とは、核酸の細胞内へのクローニングおよび／または移行のための、任意の核酸分子である。ベクターは、別のヌクレオチド配列を付着させて、付着させたヌクレオチド配列複製を可能にし得る、レプリコンであり得る。「レプリコン」は、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自身の制御下で複製することができる、任意の遺伝因子（たとえば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスゲノム）であることができる。用語「ベクター」は、核酸を細胞内にｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで挿入するための、ウイルスおよび非ウイルス（たとえばプラスミド）の核酸分子をどちらも含む。当技術分野で知られている多数のベクターを使用して、核酸を操作すること、応答要素およびプロモーターを遺伝子内に取り込ませること等を行い得る。たとえば、応答要素およびプロモーターに対応する核酸断片の、適切なベクター内への挿入は、適切な核酸断片を、相補的な粘着性末端を有する選択されたベクター内にライゲーションすることによって、達成することができる。あるいは、核酸分子の末端を酵素的に修飾し得る、または、ヌクレオチド配列（リンカー）を核酸末端にライゲーションさせることによって任意の部位を生成し得る。そのようなベクターは、ベクターを含有するおよび／またはベクターの核酸を細胞ゲノム内に取り込んだ細胞の選択を提供する選択マーカーをコードしている配列を含有するように、操作し得る。そのようなマーカーは、マーカーによってコードされているタンパク質を取り込み、それを発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。「組換え」ベクターとは、１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列（すなわち導入遺伝子）、たとえば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの異種ヌクレオチド配列を含むウイルスまたは非ウイルスベクターをいう。

【0052】

ウイルスベクターは、細胞および生きた動物対象における多種多様な遺伝子送達の応用において使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、それだけには限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、および／またはアデノウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、それだけには限定されないが、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、核酸－タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。目的の核酸に加えて、ベクターはまた、核酸移行結果（特定組織への送達、発現の持続期間など）の選択、測定、およびモニタリングに有用な１つもしくは複数の調節領域および／または選択マーカーも含み得る。

【0053】

ベクターは、当技術分野で知られている方法、たとえば、形質移入、電気穿孔、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、または核酸ベクター輸送体によって、所望の細胞内に導入し得る（たとえば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：９６３（１９９２）、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１４６２１（１９８８）、およびＨａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照）。

【0054】

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、リポフェクションによって、細胞にｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。リポソーム媒介性形質移入で遭遇する困難および危険を制限するように設計された合成カチオン性脂質を使用して、本発明のヌクレオチド配列のｉｎ ｖｉｖｏ形質移入のためのリポソームを調製することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３（１９８７）、Ｍａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８０２７（１９８８）、およびＵｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５（１９９３））。カチオン性脂質の使用は、負荷電核酸のカプセル封入を促進し、また、負荷電の細胞膜との融合も促進する場合がある（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：３８７（１９８９））。核酸の移行のために特に有用な脂質化合物および組成物は、国際公開公報ＷＯ９５／１８８６３号およびＷＯ９６／１７８２３号、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号中に記載されている。外因性ヌクレオチド配列を特定臓器内にｉｎ ｖｉｖｏで導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実用的な利点を有する。リポソームの特定細胞への分子標的化は、利点の１つの領域を表す。形質移入を特定の細胞種に向けることが、細胞の不均一性を有する組織、たとえば膵臓、肝臓、腎臓、および脳において特に好ましいであろうことは、明確である。脂質は、標的化の目的のために他の分子と化学的にカップリングさせ得る（Ｍａｃｋｅｙら、１９８８、上記）。標的化ペプチド、たとえば、ホルモンもしくは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子を、リポソームと化学的にカップリングさせることができる。

【0055】

様々な実施形態では、他の分子、たとえば、陽イオン性オリゴペプチド（たとえばＷＯ９５／２１９３１号）、核酸結合タンパク質に由来するペプチド（たとえばＷＯ９６／２５５０８号）、および／または陽イオン性ポリマー（たとえばＷＯ９５／２１９３１号）を、核酸のｉｎ ｖｉｖｏでの送達を容易にするために使用することができる。

【0056】

また、ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで裸核酸として導入することも可能である（米国特許第５，６９３，６２２号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号を参照）。受容体媒介性核酸送達手法も使用することができる（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１４７（１９９２）、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：４４２９（１９８７））。

【0057】

本明細書中で使用する用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換性があるように使用され、別段に指摘しない限りはペプチドおよびタンパク質をどちらも包含する。

【0058】

「融合タンパク質」とは、自然では一緒に融合されて見つからない２つ（以上）の異なるポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列またはその断片が、正しい翻訳リーディングフレームで一緒に融合されている場合に生じる、ポリペプチドである。例示的な融合ポリペプチドとしては、本発明のポリペプチド（またはその断片）と、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、マルトース－結合タンパク質、もしくはレポータータンパク質（たとえば、緑色蛍光タンパク質、β－グルクロニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなど）、赤血球凝集素、ｃ－Ｍｙｃ、ＦＬＡＧエピトープ等の全部または一部分との融合物が挙げられる。

【0059】

用語、ポリヌクレオチドコード配列の「発現する」または「発現」とは、配列が転写され、任意選択で翻訳されることを意味する。典型的には、本発明によれば、本発明のコード配列の発現は、本発明のポリペプチドの生成をもたらす。発現されたポリペプチド全体または断片も、精製なしでインタクトな細胞中で機能することができる。

【0060】

本明細書中で使用する用語「過剰発現」または「過剰発現すること」とは、野生型細胞と比較して増加したレベルの生成されるポリペプチド、および／または増加した発現時間（たとえば構成的発現）をいう。

【0061】

本明細書中で使用する用語「遺伝子」とは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを生成するために使用されることができる核酸分子をいう。遺伝子は、機能的タンパク質を生成するために使用されることができても、できなくてもよい。遺伝子は、コードおよび非コード領域をどちらも含むことができる（たとえば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサー、終止配列、ならびに５’および３’非翻訳領域）。遺伝子は「単離」されていてよく、これは、その天然状態で核酸と通常は会合して見つかる構成要素を実質的にまたは本質的に含まない核酸を意味する。そのような構成要素としては、他の細胞物質、組換え産生からの培養培地、および／または核酸の化学合成において使用した様々な化学薬品が挙げられる。

【0062】

本明細書中で使用する「相補的」ポリヌクレオチドとは、標準のワトソン－クリック相補性規則に従って塩基対合が可能なものである。具体的には、プリンがピリミジンと塩基対合して、グアニンとシトシンの対（Ｇ：Ｃ）、およびＤＮＡの場合はアデニンとチミン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合はアデニンとウラシルの対（Ａ：Ｕ）のどちらかの組合せを形成する。たとえば、配列「Ａ－Ｇ－Ｔ」は相補的配列「Ｔ－Ｃ－Ａ」と結合する。２つのポリヌクレオチドは、それぞれが、他方に実質的に相補的である少なくとも１つの領域を有する限りは、互いに完全に相補的でない場合でも互いにハイブリダイズし得ることが理解されよう。

【0063】

本明細書中で使用する用語「相補的」または「相補性」とは、許容的な塩および温度条件下、塩基対合による、ポリヌクレオチドの自然な結合をいう。２つの一本鎖分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」であり得る、または、一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全であり得る。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に対して顕著な影響を有する。

【0064】

本明細書中で使用する用語「実質的に相補的」または「部分的に相補的」とは、２つの核酸配列が、そのヌクレオチドの少なくとも約６０％、７０％、８０％、または９０％が相補的であることを意味する。一部の実施形態では、２つの核酸配列は、そのヌクレオチドのうちの少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くで、相補的であることができる。用語「実質的に相補的」および「部分的に相補的」はまた、２つの核酸配列が高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできることも意味し、そのような条件は当技術分野で周知である。

【0065】

本明細書中で使用する「異種」とは、別の種に由来する核酸配列、または、同じ種もしくは生物からのものであるが、その元の形態もしくは細胞中で主に発現される形態のどちらかから修飾されている核酸配列のいずれかをいう。したがって、ヌクレオチド配列を導入する細胞のものとは異なる生物または種に由来するヌクレオチド配列は、その細胞および細胞の子孫に対して異種である。さらに、異種ヌクレオチド配列は、同じ天然の元の細胞種に由来し、それ内に挿入されているが、非天然状態、たとえば、異なるコピー数、および／または自然で見つかるものとは異なる調節配列の制御下で存在する、ヌクレオチド配列を含む。

【0066】

本明細書中で使用する用語「接触させること」、「導入すること」、および「投与すること」は、互換性があるように使用され、標的遺伝子の発現を阻害または変更または改変するために、本発明のｄｓＲＮＡまたは本発明のｄｓＲＮＡをコードしている核酸分子を細胞に送達するプロセスをいう。ｄｓＲＮＡは、それだけには限定されないが、細胞内への直接導入（すなわち細胞内）および／または腔、間質腔、もしくは生物の循環内への細胞外導入を含めた、いくつかの方法で投与し得る。

【0067】

細胞または生物のコンテキストにおける「導入すること」とは、核酸分子が細胞の内部に接近するような様式で、核酸分子を生物および／または細胞に提示することを意味する。複数の核酸分子を導入する場合、これらの核酸分子は、単一ポリヌクレオチドもしくは核酸構築体の一部として、または別個のポリヌクレオチドもしくは核酸構築体としてアセンブルすることができ、同じまたは異なる核酸構築体上に位置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換事象または別個の形質転換事象で細胞内に導入することができる。したがって、本明細書中で使用する用語「形質転換」とは、異種核酸の細胞内への導入をいう。細胞の形質転換は安定または一過性であり得る。

【0068】

ポリヌクレオチドのコンテキストにおける「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドが細胞内に導入され、細胞のゲノム内に組み込まれないことを意味する。

【0069】

細胞内に導入されたポリヌクレオチドのコンテキストにおける「安定に導入すること」または「安定に導入した」とは、導入したポリヌクレオチドが安定に細胞のゲノム内に安定に取り込まれ、したがって、細胞がポリヌクレオチドで安定に形質転換されていることを意図する。

【0070】

本明細書中で使用する「安定形質転換」または「安定に形質転換させた」とは、細胞内に導入され、細胞のゲノム内に組み込まれることを意味する。したがって、組み込まれた核酸分子は、その子孫、より詳細には複数の逐次的な世代の子孫によって受け継がれることができる。本明細書中で使用する「ゲノム」は核およびミトコンドリアのゲノムを含み、したがって、核酸の、たとえばミトコンドリアゲノム内での組込みを含む。本明細書中で使用する安定形質転換はまた、染色体外（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍａｓｏｍａｌｌｙ）に、たとえばミニ染色体として維持される導入遺伝子もいうことができる。

【0071】

一過性形質転換は、たとえば、生物内に導入された１つまたは複数の導入遺伝子によってコードされているペプチドまたはポリペプチドの存在を検出することができる、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウエスタンブロットによって検出し得る。細胞の安定形質転換は、たとえば、生物内に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定形質転換は、たとえば、生物内に導入された導入遺伝子のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする核酸配列を用いた、細胞のＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイによって検出することができる。細胞の安定形質転換はまた、たとえば、標準の方法に従って検出することができる、導入遺伝子の標的配列（複数可）とハイブリダイズして導入遺伝子配列の増幅をもたらす特異的プライマー配列を用いた、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅反応によっても検出することができる。形質転換はまた、当技術分野で周知の直接シーケンシングおよび／またはハイブリダイゼーションプロトコルによっても検出することができる。

【0072】

本発明の実施形態は、本発明の核酸を発現するように設計された発現カセットに向けられている。本明細書中で使用する「発現カセット」とは、少なくとも目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結させた制御配列を有する核酸分子を意味する。このようにして、たとえば、本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列と作動可能な相互作用にあるプロモーターを、生物または細胞における発現のための発現カセット中に提供する。

【0073】

本明細書中で使用する用語「プロモーター」とは、コード配列の効率的な発現のための必要なシグナルを取り込むヌクレオチド配列の一領域をいう。これは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する配列を含んでよいが、そのような配列に限定されず、他の調節タンパク質が、タンパク質翻訳の制御に関与する領域と一緒に結合する領域を含むことができ、また、コード配列も含むことができる。

【0074】

さらに、本発明の「プロモーター」は、生物の細胞中において転写を開始させることができるプロモーターである。そのようなプロモーターとしては、ヌクレオチド配列の発現を構成的に駆動するもの、誘導された際に発現を駆動するもの、および組織または発生に特異的な様式で発現を駆動するものが挙げられ、これらの様々な種類のプロモーターは当技術分野で知られている。

【0075】

本発明の目的のために、調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域、および翻訳停止領域）は、生物もしくは細胞に対してネイティブ／類似であることができる、ならびに／または、調節領域は、他の調節領域に対してネイティブ／類似であることができる。あるいは、調節領域は、生物もしくは細胞および／または互いに（すなわち調節領域）に対して異種であり得る。したがって、たとえば、プロモーターは、ポリヌクレオチドが由来する種とは異なる種からのポリヌクレオチドと作動可能に連結された場合に、異種であることができる。あるいは、プロモーターは、プロモーターが、ポリヌクレオチドが由来する種と同じ／類似の種からのものであるが、一方または両方（すなわちプロモーターおよびポリヌクレオチド）がその元の形態および／もしくはゲノム座位から実質的に改変されている、またはプロモーターが作動可能に連結させたポリヌクレオチドのネイティブプロモーターではない場合にも、選択されたヌクレオチド配列に対して異種であることができる。

【0076】

使用するプロモーターの選択肢は、それだけには限定されないが、細胞または組織に特異的な発現、所望の発現レベル、効率、誘導性、および選択性を含めたいくつかの要因に依存する。たとえば、特異的な組織または臓器中での発現が所望される場合は、組織特異的プロモーターを使用することができる。対照的に、刺激に対する応答における発現が所望される場合は、誘導性プロモーターを使用することができる。生物の細胞全体にわたって連続的な発現が所望される場合は、構成的プロモーターを使用することができる。プロモーターおよび他の調節領域をその配列に対して適切に選択および配置することによって、ヌクレオチド配列の発現を変調することは、当業者にはルーチン的な事柄である。

【0077】

上述のプロモーターに加えて、発現カセットは他の調節配列も含むことができる。本明細書中で使用する「調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響を与える、ヌクレオチド配列を意味する。調節配列としては、それだけには限定されないが、エンハンサー、イントロン、翻訳リーダー配列、およびポリアデニル化シグナル配列が挙げられる。

【0078】

発現カセットはまた、生物において機能的な転写および／または翻訳停止領域（すなわち停止領域）も任意選択で含むことができる。様々な転写ターミネーターが、発現カセット中で使用するために利用可能であり、導入遺伝子より先の転写の停止および正しいｍＲＮＡポリアデニル化を司っている。停止領域は、転写開始領域に対してネイティブであり得る、作動可能に連結させた目的のヌクレオチド配列に対してネイティブであり得る、宿主に対してネイティブであり得る、または別の供給源に由来し得る（すなわち、プロモーター、目的のヌクレオチド配列、宿主、もしくはその任意の組合せに対して外来もしくは異種であり得る）。

【0079】

シグナル配列は、本発明の核酸と作動可能に連結させて、ヌクレオチド配列を細胞区画内に向けることができる。このようにして、発現カセットは、シグナル配列の核酸配列と作動可能に連結させたｓｉＲＮＡをコードしているヌクレオチド配列を含む。シグナル配列は、ｓｉＲＮＡのＮまたはＣ末端で作動可能に連結させ得る。

【0080】

使用する調節配列（複数可）の種類にかかわらず、これらのｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列と作動可能に連結させることができる。本明細書中で使用する「作動可能に連結させた」とは、発現カセットなどの核酸構築体の要素が、その通常の機能を行うように構成されていることを意味する。したがって、目的のヌクレオチド配列と作動可能に連結させた調節または制御配列（たとえばプロモーター）は、目的のヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる。制御配列は、目的のヌクレオチド配列の発現を指示するように機能する限りは、それと隣接している必要はない。したがって、たとえば、介在性の非翻訳であるが転写された配列がプロモーターとコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列はそれでも、コード配列に「作動可能に連結させた」とみなすことができる。本発明のヌクレオチド配列（すなわちｓｉＲＮＡ）を調節配列と作動可能に連結させることができ、それによって、細胞および／または対象中における発現が可能となる。

【0081】

発現カセットはまた、形質転換させた生物または細胞を選択するために使用することができる選択マーカーのヌクレオチド配列も含むことができる。本明細書中で使用する「選択マーカー」とは、発現された際に、マーカーを発現する生物または細胞に明確な表現型を与え、したがって、そのような形質転換させた生物または細胞を、マーカーを有さないものから識別することを可能にする、核酸を意味する。そのような核酸は、マーカーが、選択剤（たとえば抗生物質など）を使用することによってなどの化学的手段によって選択することができる特質を与えるかどうか、または、マーカーが、単純に、スクリーニング（によってなどの観察もしくは試験を通じて同定することができる特質であるかどうかに応じて、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーのどちらかをコードし得る。もちろん、適切な選択マーカーの多くの例が当技術分野で知られており、本明細書中に記載の発現カセットにおいて使用することができる。

【0082】

本発明の一部の実施形態では、発現カセットは、ｄｓＲＮＡの一方または両方の鎖の鋳型であるヌクレオチド配列と作動可能に連結させた発現制御配列を含むことができる。さらなる実施形態では、プロモーターは、鋳型ヌクレオチド配列のいずれの末端とも隣接することができ、プロモーターがそれぞれの個々のＤＮＡ鎖の発現を駆動し、それによって、ハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する２つの相補的（または実質的に相補的）なＲＮＡが生成される。代替実施形態では、ヌクレオチド配列は、１つの転写単位上でｄｓＲＮＡの両方の鎖へと転写され、ここで、センス鎖は転写単位の５’末端から転写され、アンチセンス鎖は３’末端から転写され、２本の鎖は約３～約５００塩基対によって隔てられており、転写後、ＲＮＡ転写物は、それ自身上に折り畳まれて短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を形成する。

【0083】

本明細書中で使用する「配列同一性」とは、２つの最適にアラインメントしたポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、構成要素、たとえばヌクレオチドまたはアミノ酸のアラインメントウィンドウの全体にわたって不変である程度をいう。「同一性」は、既知の方法によって容易に計算することができ、それだけには限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）中に記載のものが挙げられる。

【0084】

本明細書中で使用する用語「実質的に同一」または「～に対応する」とは、２つの核酸配列が少なくとも６０％、７０％、８０％、または９０％の配列同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、２つの核酸配列は、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有することができる。

【0085】

試験配列および参照配列のアラインメントしたセグメントの「同一性割合」とは、２つのアラインメントした配列によって共有される同一構成要素の数を、参照配列セグメント中の構成要素の合計数、すなわち、参照配列全体または参照配列のより小さな定義された部分によって除算したものである。

【0086】

本明細書中で使用する用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」とは、２つの配列を、（比較ウィンドウにわたって合計で参照配列の２０パーセント未満の適切なヌクレオチドの挿入、欠失、またはギャップを用いて）最適にアラインメントした場合の、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）ポリヌクレオチド分子（またはその相補鎖）の直鎖状ポリヌクレオチド配列中の同一ヌクレオチドの百分率をいう。一部の実施形態では、「パーセント同一性」とは、アミノ酸配列中の同一アミノ酸の百分率をいうことができる。

【0087】

比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適アラインメントは当業者に周知であり、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似度検索方法、ならびに任意選択でこれらのアルゴリズムコンピュータによる実行、たとえば、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡなどのツールによって実施し得る。パーセント配列同一性は、同一性割合を１００を乗算したものとして表される。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列もしくはその一部分、またはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであり得る。本発明の目的のために、「パーセント同一性」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列ではＢＬＡＳＴＸバージョン２．０、およびポリヌクレオチド配列ではＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用しても決定し得る。

【0088】

配列同一性のパーセントは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（バージョン１０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」または「Ｇａｐ」プログラムを使用して決定することができる。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８：４４３～４５３頁、１９７０）を利用して、一致の数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする、２つの配列のアラインメントを見つける。「ＢｅｓｔＦｉｔ」は、２つの配列間の最良の類似度セグメントの最適アラインメントを行い、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、２：４８２～４８９頁、１９８１、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１１：２２０５～２２２０頁、１９８３）を使用して、一致の数を最大限にするためにギャップを挿入する。

【0089】

配列同一性を決定するために有用な方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４））およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ、４８：１０７３（１９８８））中にも開示されている。より詳細には、配列同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、それだけには限定されないが、国立医学図書館、国立衛生研究所、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、２０８９４の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｈｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラム（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ、ＮＬＭ、ＮＩＨ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０頁（１９９０））を参照）が挙げられ、ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以上は、ギャップ（欠失および挿入）をアラインメント内に導入することを可能にし、ペプチド配列には、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性を決定することができ、ポリヌクレオチド配列には、ＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性を決定することができる。

【0090】

本明細書中で使用する「ＲＮＡｉ」または「ＲＮＡ干渉」とは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスをいう。本明細書中で使用する「ｄｓＲＮＡ」とは、部分的または完全に二本鎖であるＲＮＡをいう。二本鎖ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などとも呼ばれる。ＲＮＡｉプロセスにおいて、標的遺伝子の一部分と相補的な第１の（アンチセンス）鎖と第１のアンチセンス鎖と完全または部分的に相補的な第２の（センス）鎖とを含むｄｓＲＮＡを、生物内に導入する。生物内への導入後、標的遺伝子に特異的なｄｓＲＮＡは比較的小さな断片（ｓｉＲＮＡ）へとプロセッシングされ、続いて、生物全体にわたって分配されることができ、一世代の期間にわたって、標的遺伝子の完全または部分的な欠失から生じる表現型に酷使するようになり得る表現型をもたらす。

【0091】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、一般に約１８～約２５個のヌクレオチドの長さの非タンパク質コードＲＮＡである。これらのｍｉＲＮＡは、標的転写物のトランスでの切断を指示し、様々な調節および発達経路に関与する遺伝子の発現を負に調節する（Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、１１６：２８１～２９７頁（２００４）、Ｚｈａｎｇら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２８９：３～１６頁（２００６））。したがって、ｍｉＲＮＡは、成長および発達の様々な側面、ならびにシグナル伝達およびタンパク質分解に関与していることが示されている。最初のｍｉＲＮＡが植物中で発見されて以来（Ｒｅｉｎｈａｒｔら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６：１６１６～１６２６頁（２００２）、Ｐａｒｋら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、１２：１４８４～１４９５頁（２００２））、数百種類が同定されている。多数のマイクロＲＮＡ遺伝子（ＭＩＲ遺伝子）が同定されており、データベースで公的に利用可能となっている（ｍｉＲＢａｓｅ、ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）。ｍｉＲＮＡはまた、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２００５／０１２０４１５号および第２００５／１４４６６９Ａ１号中にも記載されている。

【0092】

ｍｉＲＮＡをコードしている遺伝子は、不完全なステム－ループ構造を形成することができる７０～３００ｂｐの長さの一次ｍｉＲＮＡ（「ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ」と呼ばれる）を生じる。単一のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは１個から数個のｍｉＲＮＡ前駆体を含有し得る。動物では、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素Ｄｒｏｓｈａおよびその補因子ＤＧＣＲ８／Ｐａｓｈａによって、核内で約６５ｎｔのより短いヘアピンＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）へとプロセッシングされる。その後、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは細胞質へと輸出され、ここで別のＲＮａｓｅＩＩＩ酵素ダイサーによってさらにプロセッシングされて、約２２ｎｔの大きさのｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖を放出する。マイクロＲＮＡの生物発生および機能に関する多数の総説が利用可能であり、たとえば、Ｂａｒｔｅｌ、Ｃｅｌｌ、１１６：２８１～２９７頁（２００４）、Ｍｕｒｃｈｉｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１６：２２３～２２９頁（２００４）、Ｄｕｇａｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．、７：５１２～５２０頁（２００４）、およびＫｉｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、６：３７６～３８５頁（２００５）を参照されたい。

【0093】

ＲＮＡ分子
本発明は、多価逆位キメラ二本鎖ＲＮＡまたは化学修飾したｓｉＲＮＡ分子であるＲＮＡ分子に関する。逆位キメラは、遺伝子発現の阻害において驚くべきほど有効であり、直列様式で配置した個々のｓｉＲＮＡまたはキメラｓｉＲＮＡと比較して、両方の標的遺伝子に対して予想外にはるかにより強力である。逆位キメラ分子はｓｉＲＮＡ送達プロセスを有利に単純化し、両方の遺伝子転写物の等価なモル標的化を確実にする。キメラ分子設計はまた、エンドソーム内で切断可能であることが実証されているリンカーが短いヌクレオチド橋であるため、２つのｓｉＲＮＡの合成を単純化させる。

【0094】

本明細書中で使用する逆位キメラとは、２つのｓｉＲＮＡを、互いにタンデムであるが、センスおよびアンチセンス配向に関して逆位に含む分子である（すなわち、第１の鎖は、５’から３’配向のセンス（パッセンジャー）鎖であり、リンカー（たとえばリン酸ジエステルＤＮＡ橋）が続き、第２の鎖は、やはり５’から３’配向のアンチセンス（ガイド）鎖である）。直列キメラもタンデムであるが、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を同じ５’から３’配向で有する。キメラは３つのＲＮＡ分子から構成される。第１のＲＮＡ分子は、それぞれのｓｉＲＮＡの第１の鎖を、任意選択でリンカーによって接続されて含む。逆位キメラでは、第１のＲＮＡ分子は、一方のｓｉＲＮＡのセンス鎖および第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。直列キメラでは、第１のＲＮＡ分子は、一方のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖および第２のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。第２のＲＮＡ分子は第１のｓｉＲＮＡの第１の鎖と実質的に相補的であり、第３のＲＮＡ分子は第２のｓｉＲＮＡの第１の鎖と実質的に相補的である。たとえば図７を参照されたい。

【0095】

逆位キメラ分子はまた、約３０～６０個のヌクレオチド、たとえば、約３５～５５個のヌクレオチド、たとえば、約４０～５０個のヌクレオチドの全体的な長さを有し得る。逆位キメラ分子内のｓｉＲＮＡのそれぞれは、約１５～３０個のヌクレオチド、たとえば、約１７～２５個のヌクレオチド、たとえば、約１９～２３個のヌクレオチドの長さを有し得る。

【0096】

２つのｓｉＲＮＡは、リンカー、たとえば代謝的に脆弱なリンカー（すなわち、逆位キメラ分子を細胞に送達または対象に投与した際に切断されるリンカー）、たとえばポリヌクレオチドリンカーによって接続され得る。リンカーは、約２～１０個のヌクレオチドの長さ、たとえば約３～８個のヌクレオチド、たとえば４～６個のヌクレオチドであり得る。リンカー中のヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、たとえば、リン酸ジエステルチミン、リン酸ジエステルアデニン、リン酸ジエステルチミン／シトシン／アデニン（ＴＣＡ）リンカーなどであり得る。

【0097】

本発明の一態様は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子に関し、分子は少なくとも１つの化学修飾を含む。一部の実施形態では、分子は完全に化学修飾されている。用語「完全に化学修飾した」とは、分子中のすべてのヌクレオチドが化学修飾を含有することを意味する。一部の実施形態では、分子中のそれぞれのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている。

【0098】

ある特定の実施形態では、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子中のヌクレオチド連結のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個が化学修飾されている。一部の実施形態では、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子は少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ホスホロチオエート連結は、分子のそれぞれの鎖の最後の２個のヌクレオチドの間に配置される。一部の実施形態では、分子はすべてホスホロチオエート連結を含む。

【0099】

逆位キメラ分子中のそれぞれのｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡと結合し、その遺伝子の発現を阻害することができる。一部の実施形態では、逆位キメラ分子中のそれぞれのｓｉＲＮＡは、同じ標的遺伝子、たとえば遺伝子の異なる部分と結合する。他の実施形態では、逆位キメラ分子中のそれぞれのｓｉＲＮＡは、たとえば２つの遺伝子の発現を同時に効率的に阻害するために、異なる標的遺伝子と結合する。

【0100】

標的遺伝子は、発現の阻害が所望される任意の目的の遺伝子であり得る。一部の実施形態では、標的遺伝子は、研究目的のために研究されているものである。他の実施形態では、標的遺伝子は、病状において過剰発現されるまたは他の様式で症状に関連するものであり、発現の阻害は治療または予防目的のためである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、病原体、たとえば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物、たとえばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスによって発現されるものである。一部の実施形態では、標的遺伝子は、癌において過剰発現されるまたはそれに関連するものである。特定の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡはｃ－Ｍｙｃを標的とする。一実施形態では、１つのｓｉＲＮＡがｃ－Ｍｙｃを標的とし、１つのｓｉＲＮＡがＫＲＡＳを標的とする。

【0101】

逆位キメラ分子中のそれぞれのｓｉＲＮＡは、既知のｓｉＲＮＡまたは後に開発されるものであり得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡのうちの少なくとも１つは、本明細書中に開示するｓｉＲＮＡである。

【0102】

一部の実施形態では、逆位キメラ分子は、それに付着した追加の直列ｓｉＲＮＡ、たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよい多くと二重鎖形成していてよい。たとえば、合計３つの可能なユニークなｓｉＲＮＡ配列をもたらす、直列キメラと二重鎖形成した逆位キメラ設計を実証する、図３０を参照されたい。それぞれのｓｉＲＮＡは、上述のようにリンカーによって隔てられていてよい。逆位キメラ分子中のそれぞれのｓｉＲＮＡは、独立して、同じ標的遺伝子または異なる標的遺伝子と結合してそれを阻害し得る。それぞれの追加のｓｉＲＮＡは、逆位キメラ分子中のｓｉＲＮＡに対して直列または逆位の配向であってよい。追加のｓｉＲＮＡのそれぞれの対は、逆位キメラ形式、たとえば逆位キメラ分子の鎖中であってよい。

【0103】

一部の実施形態では、逆位キメラ分子は、別の分子、たとえば、リンカー（たとえば担体と結合するため）またはリガンド（たとえば分子を特異的な細胞もしくは結合部位に標的化するため）と、共有的または非共有的に結合していてよい。コンジュゲーションのための適切な部位を図２９に示す。

【0104】

一部の実施形態では、キメラ分子は、
配列番号６３～６５
配列番号６６～６８
配列番号６９～７１
配列番号７１～７４
配列番号７５～７７
配列番号７８～８０
配列番号８１～８３
配列番号８４～８６
配列番号８７～８９
配列番号９０～９２
配列番号９３～９５
配列番号９６～９８
配列番号９９～１０１
配列番号１０２～１０４
のうちの１つと少なくとも９０％同一である、たとえば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列の組を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0105】

本発明の第２の態様は、ｃ－Ｍｙｃを転写レベルで標的化することによる代替治療手法を表す。本発明は、ｃ－ＭｙｃメッセンジャーＲＮＡと相補的に結合し、癌遺伝子の転写を阻害して、癌細胞において遺伝子ノックダウンおよび続くアポトーシスを誘導することができる、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる。従来、ｓｉＲＮＡは、その組織特異的の欠如、身体内での迅速な分解、および免疫活性化が原因で、臨床的制限に直面していた。しかし、本明細書における合成ｓｉＲＮＡは、これらをｉｎ ｖｉｖｏ分解から保護し、ナノ担体または他の送達系の必要性を追放する、薬物様特性を与える新規化学修飾を含有する。

【0106】

したがって、本発明の一態様は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子に関し、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列はｃ－Ｍｙｃ遺伝子のヌクレオチド配列の一領域と相補的であり、領域は約１８～約２５個の連続的なヌクレオチドから本質的になり、二本鎖ＲＮＡ分子はｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子を有さない細胞（たとえば対照細胞または非形質転換細胞）と比較して減少した、細胞中におけるｃ－Ｍｙｃの発現をもたらす。一部の実施形態では、ｃ－Ｍｙｃの発現は、少なくとも約５０％、たとえば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれより多く阻害される。

【0107】

二本鎖ＲＮＡ分子は、約１８～約２５個（たとえば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５個、またはそれ中の任意の範囲）のヌクレオチドを含む、それから本質的になる、またはそれからなることができる。ＲＮＡ分子の操作を容易にするが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）における二本鎖ＲＮＡ分子の基本的な特徴または機能に大いに影響を与えないために、追加のヌクレオチドを３’末端、５’末端、または３’および５’末端の両方に付加することができる。さらに、ＲＮＡｉにおける二本鎖ＲＮＡ分子の基本的な特徴または機能に大いに影響を与えない１または２個のヌクレオチドを、本明細書中に開示した配列のうちの任意のものの一方または両方の末端から欠失させることができる。用語本明細書中で使用する「大いに影響を与える」とは、ｍＲＮＡによってコードされているタンパク質の発現を阻害する能力の、約５０％以下、たとえば、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％以下、またはそれより少ない変化をいう。当業者に知られているように、そのような追加のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の相補性を標的配列に沿って延長するヌクレオチドであることができる、および／または、そのようなヌクレオチドは、ＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子をコードしている核酸分子の操作を容易にするヌクレオチドであることができる。たとえば、ｓｉＲＮＡ二重鎖を安定化させるために使用し、ｓｉＲＮＡの特異性に影響を与えない、３’末端のＴＴオーバーハングが存在し得る。

【0108】

本発明のｄｓＲＮＡは、一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを任意選択で含み得る。二本鎖構造は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖（すなわちヘアピンループを形成する）または２本の相補的なＲＮＡ鎖によって形成され得る。ＲＮＡ二重鎖形成は、細胞の内部または外部のいずれでも開始され得る。本発明のｄｓＲＮＡがヘアピンループを形成する場合、これは、細胞中のヘアピン配列を安定化させるための相補的ＲＮＡ鎖間のヌクレオチドのストレッチである、イントロンおよび／またはヌクレオチドスペーサーを任意選択で含み得る。ＲＮＡは、細胞１個あたり少なくとも１つのコピーの送達を可能にする量で導入し得る。より高い用量の二本鎖材料がより有効な阻害をもたらし得る。

【0109】

特定の実施形態では、本発明は、阻害する標的遺伝子の一領域と完全に相補的なヌクレオチド配列を含有する二本鎖ＲＮＡを提供する。しかし、本発明を実施するために、二本鎖ＲＮＡ分子のアンチセンス鎖と標的配列との間の１００％の相補性は必要ないことが理解されよう。したがって、遺伝子の突然変異、株の多型性、または進化の多様性が原因で予想され得る配列の変動を寛容することができる。標的配列と比較して挿入、欠失、および単一点突然変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であり得る。

【0110】

一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、たとえば、配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１～９のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
配列番号１ ＧＡＧＧＡＵＡＵＣＵＧＧＡＡＧＡＡＡＵ
配列番号２ ＧＡＧＡＡＣＡＧＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＡ
配列番号３ ＡＡＣＡＣＡＡＡＣＵＵＧＡＡＣＡＧＣＵ
配列番号４ ＡＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＵ
配列番号５ ＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＵＧＧＵＣＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号６ ＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＧＵＣ
配列番号７ ＣＡＧＡＵＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧ
配列番号８ ＧＡＧＡＣＣＵＵＣＡＵＣＡＡＡＡＡＣＡＵＣＡＵＣＡ
配列番号９ ＧＡＧＣＵＡＡＡＡＣＧＧＡＧＣＵＵＵＵ

【0111】

一部の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、たとえば、配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１９～２７のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
配列番号１９ ＡＵＵＵＣＵＵＣＣＡＧＡＵＡＵＣＣＵＣ
配列番号２０ ＵＵＧＵＧＵＵＵＣＡＡＣＵＧＵＵＣＵＣ
配列番号２１ ＡＧＣＵＧＵＵＣＡＡＧＵＵＵＧＵＧＵＵ
配列番号２２ ＡＵＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵ
配列番号２３ ＵＣＵＵＧＡＧＧＡＣＣＡＧＵＧＧＧＣＵＧＵＧ
配列番号２４ ＧＡＣＧＵＵＧＵＧＵＧＵＵＣＧＣＣＵＣＵＵ
配列番号２５ ＣＧＧＵＵＧＵＵＧＣＵＧＡＵＣＵＧ
配列番号２６ ＵＧＡＵＧＡＵＧＵＵＵＵＵＧＡＵＧＡＡＧＧＵＣＵＣ
配列番号２７ ＡＡＡＡＧＣＵＣＣＧＵＵＵＵＡＧＣＵＣ

【0112】

一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの一方または両方は、３’末端にＴＴオーバーハングを含む。したがって、一部の実施形態では、センス鎖は、配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、たとえば、配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号１０～１８のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
配列番号１０ ＧＡＧＧＡＵＡＵＣＵＧＧＡＡＧＡＡＡＵｄＴｄＴ
配列番号１１ ＧＡＧＡＡＣＡＧＵＵＧＡＡＡＣＡＣＡＡｄＴｄＴ
配列番号１２ ＡＡＣＡＣＡＡＡＣＵＵＧＡＡＣＡＧＣＵｄＴｄＴ
配列番号１３ ＡＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＵｄＴｄＴ
配列番号１４ ＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＵＧＧＵＣＣＵＣＡＡＧＡｄＴｄＴ
配列番号１５ ＡＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＧＵＣｄＴｄＴ
配列番号１６ ＣＡＧＡＵＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧｄＴｄＴ
配列番号１７ ＧＡＧＡＣＣＵＵＣＡＵＣＡＡＡＡＡＣＡＵＣＡＵＣＡｄＴｄＴ
配列番号１８ ＧＡＧＣＵＡＡＡＡＣＧＧＡＧＣＵＵＵＵｄＴｄＴ

【0113】

一部の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、たとえば、配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号２８～３６のうちのいずれかのヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
配列番号２８ ＡＵＵＵＣＵＵＣＣＡＧＡＵＡＵＣＣＵＣｄＴｄＴ
配列番号２９ ＵＵＧＵＧＵＵＵＣＡＡＣＵＧＵＵＣＵＣｄＴｄＴ
配列番号３０ ＡＧＣＵＧＵＵＣＡＡＧＵＵＵＧＵＧＵＵｄＴｄＴ
配列番号３１ ＡＵＵＵＣＵＵＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＵｄＴｄＴ
配列番号３２ ＵＣＵＵＧＡＧＧＡＣＣＡＧＵＧＧＧＣＵＧＵＧｄＴｄＴ
配列番号３３ ＧＡＣＧＵＵＧＵＧＵＧＵＵＣＧＣＣＵＣＵＵｄＴｄＴ
配列番号３４ ＣＧＧＵＵＧＵＵＧＣＵＧＡＵＣＵＧｄＴｄＴ
配列番号３５ ＵＧＡＵＧＡＵＧＵＵＵＵＵＧＡＵＧＡＡＧＧＵＣＵＣｄＴｄＴ
配列番号３６ ＡＡＡＡＧＣＵＣＣＧＵＵＵＵＡＧＣＵＣｄＴｄＴ

【0114】

本発明の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖は、アンチセンス鎖と完全に相補的であることができる、または、センス鎖は、アンチセンス鎖と実質的に相補的または部分的に相補的であることができる。実質的または部分的に相補的とは、センス鎖およびアンチセンス鎖が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のヌクレオチド対合でミスマッチであることができることを意味する。そのようなミスマッチは、センス鎖配列内、たとえば３’末端付近に導入して、当業者に知られているように、ダイサーによる二本鎖ＲＮＡ分子のプロセッシングを増強すること、本発明のキメラ核酸分子または人工マイクロＲＮＡ前駆体分子内に挿入されたｓｉＲＮＡ分子中のミスマッチのパターンを複製することなどを行うことができる。そのような修飾は、二重鎖の一端で塩基対合を弱めて鎖の不斉性を生じ、したがって、センス鎖ではなくアンチセンス鎖がプロセッシングされ、意図する遺伝子がサイレンシングされる可能性を増強させる（ＧｅｎｇおよびＤｉｎｇ、「Ｄｏｕｂｌｅ－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｓｉＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ＡＬＳ－ｃａｕｓｉｎｇ Ａｌｌｅｌｅ１」、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．、２９：２１１～２１６頁（２００８）、Ｓｃｈｗａｒｚら、「Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡｉ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｃｅｌｌ、１１５：１９９～２０８頁（２００３））。

【0115】

本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、当技術分野で知られている任意の種類のＲＮＡ干渉分子の形態であり得る。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ分子は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。他の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ分子は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。他の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ分子はマイクロＲＮＡ前駆体分子の一部である。

【0116】

化学修飾したｓｉＲＮＡ
本発明の一態様は、本発明のｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子に関し、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つの化学修飾を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は完全に化学修飾されている。用語「完全に化学修飾した」とは、ｓｉＲＮＡ中のすべてのヌクレオチドが化学修飾を含有することを意味する。一部の実施形態では、前記ｓｉＲＮＡ分子中のそれぞれのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル基または２’－フルオロ基で修飾されている。

【0117】

ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ中のヌクレオチド連結のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個が化学修飾されている。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡはすべてホスホロチオエート連結を含む。

【0118】

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの化学修飾を含むｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡ分子は、以下の配列対のうちの１つを含む：
配列番号１のセンス鎖および配列番号１９のアンチセンス鎖、
配列番号２のセンス鎖および配列番号２０のアンチセンス鎖、
配列番号３のセンス鎖および配列番号２１のアンチセンス鎖、
配列番号４のセンス鎖および配列番号２２のアンチセンス鎖、
配列番号５のセンス鎖および配列番号２３のアンチセンス鎖、
配列番号６のセンス鎖および配列番号２４のアンチセンス鎖、
配列番号７のセンス鎖および配列番号２５のアンチセンス鎖、
配列番号８のセンス鎖および配列番号２６のアンチセンス鎖、または
配列番号９のセンス鎖および配列番号２７のアンチセンス鎖。

【0119】

一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号１～９および１９～２７のうちの１つと少なくとも９０％同一である、たとえば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0120】

【0121】

ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は完全に化学修飾されており、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡ分子は、以下の配列対のうちの１つを含む：
配列番号３７のセンス鎖および配列番号３８のアンチセンス鎖、
配列番号３９のセンス鎖および配列番号４０のアンチセンス鎖、
配列番号４１のセンス鎖および配列番号４２のアンチセンス鎖、
配列番号４３のセンス鎖および配列番号４４のアンチセンス鎖、または
配列番号４５のセンス鎖および配列番号４６のアンチセンス鎖。

【0122】

一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号３７～４６のうちの１つと少なくとも９０％同一である、たとえば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0123】

一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、ヒトＫＲＡＳ ｍＲＮＡを標的とする第２のｓｉＲＮＡ分子（たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許公開第２０２０／０２４８１８５号中に開示されているｓｉＲＮＡ分子）とタンデムで（たとえば、共有的または非共有的に連結させることによって一緒に投与することで）合わせることができる。一部の実施形態では、ヒトＫＲＡＳ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は完全に化学修飾されており、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ｓｉＲＮＡ分子は、以下の配列対のうちの１つを含む：
配列番号４７のセンス鎖および配列番号４８のアンチセンス鎖、
配列番号４９のセンス鎖および配列番号５０のアンチセンス鎖。

【0124】

ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ中のヌクレオチド連結のうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個が化学修飾されている。一部の実施形態では、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡは少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個のホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡはすべてホスホロチオエート連結を含む。

【0125】

一部の実施形態では、ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡは、配列番号４７～５０のうちの１つと少なくとも９０％同一である、たとえば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。

【0126】

逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して、当技術分野で知られている手順によって構築し得る。たとえば、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは、分子の生物学的安定性を増加させる、または逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、もしくは化学修飾したｓｉＲＮＡ分子と標的ヌクレオチド配列との間に形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された、様々な修飾ヌクレオチドを使用して化学合成してよく、たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子を生成するために使用することができる、修飾ヌクレオチドの例としては、それだけには限定されないが、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、二本鎖ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡをコードしている核酸がそれ内にクローニングされた発現ベクターを使用して生成することができる。

【0127】

逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチド間架橋リン酸残基のうちの少なくとも１つまたはすべてが修飾リン酸基、たとえば、ホスホン酸メチル、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、およびホスホロアミデートである、ヌクレオチド配列をさらに含むことができる。たとえば、ヌクレオチド間架橋リン酸残基のすべてまたは１つおきを、記載のように修飾することができる。別の非限定的な例では、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、ヌクレオチドのうちの少なくとも１つまたはすべてが２’低級アルキル部分（たとえば、Ｃ_１～Ｃ_４、直鎖状または分枝状、飽和または不飽和のアルキル、たとえば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１－プロペニル、２－プロペニル、およびイソプロピル）を含有する、ヌクレオチド配列である。別の例では、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、２’－フルオロヌクレオチド、２－Ｏ－メチルヌクレオチド、またはロックド核酸ヌクレオチドであり得る。たとえば、ヌクレオチドのすべてまたは１つおきを、記載のように修飾することができる。修飾ヌクレオチド塩基を含有するものを含めた、そのポリヌクレオチド分子作製方法の教示についてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、Ｆｕｒｄｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：９１９３（１９８９）、Ａｇｒａｗａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１４０１（１９９０）、Ｂａｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：３５３７（１９９０）、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：３３７３（１９８９）、ＷａｌｄｅｒおよびＷａｌｄｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５０１１（１９８８）も参照されたい）。

【0128】

本発明は、本発明のＲＮＡ分子を含む核酸構築体にさらに関する。本発明は、本発明のＲＮＡ分子をコードしている核酸構築体およびＲＮＡ分子をコードしている核酸分子を含む核酸構築体にさらに関する。これらの実施形態のそれぞれにおいて、核酸構築体は、ベクターまたはプラスミド、たとえば発現ベクターであり得る。

【0129】

本発明の別の態様は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ、分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体と、別の構成要素、たとえば適切な担体とを含む組成物に関する。一部の実施形態では、組成物幅は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ、分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体のうちの２つ以上を含み、２つ以上の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、それぞれ異なるアンチセンス鎖を含む。ある特定の実施形態では、２つ以上のＲＮＡ分子は、同じ核酸構築体上、異なる核酸構築体上、またはその任意の組合せで存在する。一部の実施形態では、組成物は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。

【0130】

本発明の組成物は、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、および核酸構築体のうちの任意のものを、任意の組合せかつ互いと比較して任意の比で含む、それから本質的になる、またはそれからなることができることを理解されよう。さらに、「２つ以上」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、および核酸構築体の合計数までを意味する。

【0131】

本発明の一部の態様では、組成物または医薬組成物は、たとえば、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体の安定性を増強させるための、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体の対象への送達を増強させる、追加の構成要素をさらに含む。一部の実施形態では、追加の構成要素は、粒子、たとえば微粒子またはナノ粒子であり得る。一部の実施形態では、粒子は、脂質粒子、たとえばリポソーム、たとえばマイクロリポソームまたはナノリポソームである。リポソーム、マイクロリポソーム、またはナノリポソームは、リポソームの調製に適切であることが当技術分野で知られている任意の構成要素を含有し得る。一部の実施形態では、リポソームは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む。リポソームは、当技術分野で知られている方法によって、たとえば、その全体で本明細書中に参考として組み込まれているＰｅｃｏｔら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、１３：２８７６（２０１４）に記載のように調製し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ分子は、たとえばＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ （ペンシルベニア州Ｄｏｙｌｅｓｔｏｗｎ）によって提供されるものなどの粒子を使用して、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）へと形成する。ある特定の実施形態では、脂質粒子は、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ－ｃＤＭＡまたはＰＥＧ－ｃＤＳＡ、および１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ，Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる（Ｊｕｄｇｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１１９：６６１（２００９）を参照）。一部の実施形態では、脂質粒子は、本発明の逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子のうちの２つ以上を含む。一部の実施形態では、追加の構成要素は、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体が共有的または非共有的にコンジュゲートされている標的化された送達部分、たとえば、リガンド、アプタマー、またはモノクローナル抗体である。

【0132】

本発明は、本発明のＲＮＡ分子および／または核酸構築体を含む細胞を包含する。したがって、一部の実施形態では、本発明は、本発明のＲＮＡ分子および／または核酸構築体および／または組成物を含む形質転換細胞を提供し、形質転換細胞は、対照細胞と比較してｃ－Ｍｙｃの発現が低下している。

【0133】

方法
本発明の核酸分子、核酸構築体、および／または組成物を用いた、様々な方法が本明細書中に提供される。したがって、一態様では、本発明は、細胞中における標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、本発明のＲＮＡ分子、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、核酸構築体、組成物、および／または医薬組成物と接触させ、それによって、細胞中における標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。

【0134】

本発明の別の態様は、それを必要としている対象において、標的遺伝子に関連する障害を処置する方法であって、対象に、本発明のＲＮＡ分子、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、核酸構築体、組成物、および／または医薬組成物を送達し、それによって、対象において障害を処置することを含む方法に関する。標的遺伝子に関連する障害は、標的遺伝子の発現または過剰発現が、障害を引き起こす、または障害の１つもしくは複数の症状を引き起こす、または障害を引き起こしている生物によって発現されている、障害である。

【0135】

本発明は、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、本発明のＲＮＡ分子、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、核酸構築体、組成物、および／または医薬組成物と接触させ、それによって、細胞中におけるヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の発現を阻害することを含む方法を、さらに提供する。

【0136】

また、それを必要としている対象において、ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌を処置する方法であって、対象に、本発明のＲＮＡ分子、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、核酸構築体、組成物、および／または医薬組成物を送達し、それによって、対象において癌を処置することを含む方法も、本明細書中に提供する。ヒトｃ－Ｍｙｃ遺伝子の過剰発現を含む癌は、１つまたは複数の細胞がｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現する癌、たとえば腫瘍である。

【0137】

これらの態様のそれぞれの一実施形態では、対象は、障害、たとえば癌を診断された者であり得る。別の実施形態では、対象は、障害、たとえば癌を発生するリスクにある（たとえば、遺伝性要因、喫煙、ウイルス感染、化学薬品への曝露などが原因でかかりやすい）者であり得る。さらなる実施形態では、対象は、病原体に感染した者であり得る。さらなる実施形態では、対象は、標的遺伝子、たとえばｃ－Ｍｙｃ遺伝子を過剰発現するとして同定され、障害、たとえば癌を診断されたまたはされていない者であり得る。

【0138】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で知られている任意の方法によって、たとえば形質移入または微量注入によって、たとえば脂質粒子を含む組成物の一部として、細胞内に直接送達することができる。他の実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドの形態で対象に送達して、対象の細胞内で二本鎖ＲＮＡの発現を生じさせることができる。当業者は、本発明のＲＮＡをコードしている単離したポリヌクレオチドが、典型的には、適切な発現制御配列、たとえば転写／翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルと会合しているであろうことを理解するであろう。

【0139】

所望するレベルおよび組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサー要素を使用できることが、さらに理解されよう。プロモーターは、所望する発現パターンに応じて、構成的または誘導性であることができる。プロモーターはネイティブまたは外来であることができ、天然または合成配列であることができる。外来とは、転写開始領域が、転写開始領域を導入する野生型宿主中で見つからないことを意図する。プロモーターは、目的の標的細胞（複数可）中で機能するように選択される。

【0140】

例示すると、ＲＮＡコード配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター、アルブミンプロモーター、伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター、またはラウス肉腫ウイルスプロモーターと作動可能に会合させることができる。

【0141】

誘導性プロモーター／エンハンサー要素としては、ホルモン誘導性および金属誘導性要素、ならびに外因的供給される化合物によって調節される他のプロモーターが挙げられ、それだけには限定されないが、亜鉛誘導性メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８号を参照）、エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６（１９９６））、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７（１９９２））、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６（１９９５）、Ｈａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２（１９９８）も参照）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９（１９９７）、Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２（１９９７））、およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５（１９９７））が挙げられる。

【0142】

他の組織特異的プロモーターまたは調節プロモーターとしては、それだけには限定されないが、典型的にはニューロンにおいて組織特異性を与えるプロモーターが挙げられる。これらとしては、それだけには限定されないが、シナプシン１、チューブリンα１、血小板由来成長因子Ｂ鎖、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ、および神経細線維のプロモーターが挙げられる。骨格筋細胞プロモーターとしては、それだけには限定されないが、β－アクチン、Ｐｉｔｘ３、クレアチンキナーゼ、およびミオシン軽鎖のプロモーターが挙げられる。心筋細胞プロモーターとしては、それだけには限定されないが、心臓アクチン、心臓トロポニンＴ、トロポニンＣ、ミオシン軽鎖－２、およびα－ミオシン重鎖のプロモーターが挙げられる。島（ベータ）細胞プロモーターとしては、それだけには限定されないが、グルコキナーゼ、ガストリン、インスリン、および膵島アミロイドポリペプチドが挙げられる。

【0143】

さらに、特異的開始シグナルが、挿入されたＲＮＡコード配列の効率的な翻訳に一般に必要である。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことできるこれらの翻訳制御配列は、天然および合成の両方の様々な起源のものであることができる。

【0144】

二本鎖ＲＮＡをコードしている単離した核酸は、発現ベクター内に取り込ませることができる。様々な宿主細胞と適合性のある発現ベクターは当技術分野で周知であり、核酸の転写および翻訳に適切な要素を含有する。典型的には、発現ベクターは「発現カセット」を含有し、これは、５’から３’の方向で、プロモーター、プロモーターと作動可能に会合させた、二本鎖ＲＮＡをコードしているコード配列、ならびに任意選択でＲＮＡポリメラーゼ用の停止シグナルおよびポリアデニラーゼ用のポリアデニル化シグナルを含む終止配列を含む。

【0145】

当技術分野で知られている動物および哺乳動物プロモーターの非限定的な例としては、それだけには限定されないが、ＳＶ４０初期（ＳＶ４０ｅ）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の３’末端反復配列（ＬＴＲ）中に含有されるプロモーター、アデノウイルス（Ａｄ）のＥ１Ａまたは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｌプロモーターおよび転写制御領域の調節配列、遍在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、α－アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、神経細線維、ケラチン、ＧＦＡＰなど）のプロモーター、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ、または第ＶＩＩＩ型因子のものなど）のプロモーター、ならびに病因および／または疾患関連プロモーターが挙げられる。さらに、本発明のこれらの発現配列のうちの任意のものを、エンハンサーおよび／または調節配列などの付加によって修飾することができる。

【0146】

本発明の実施形態において使用し得るエンハンサーとしては、それだけには限定されないが、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、伸長因子Ｉ（ＥＦ１）エンハンサー、酵母エンハンサー、ウイルス遺伝子エンハンサーなどが挙げられる。

【0147】

停止制御領域、すなわちターミネーターまたはポリアデニル化配列は、好ましい宿主に対してネイティブな様々な遺伝子に由来し得る。本発明の一部の実施形態では、停止制御領域は、合成配列、合成ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ウイルスターミネーター配列などを含み得る、またはそれに由来し得る。

【0148】

当業者には、任意の適切なベクターを使用して、ポリヌクレオチドを細胞または対象に送達できることが明白であろう。ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達することができる。他の実施形態では、ベクターは、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に送達することができ、その後、ベクターを含有する細胞を対象に送達する。送達ベクターの選択は、標的宿主の年齢および種、ｉｎ ｖｉｔｒｏ対ｉｎ ｖｉｖｏ送達、所望する発現のレベルおよび持続、意図する目的（たとえば治療またはスクリーニング用）、標的細胞または臓器、送達経路、単離したポリヌクレオチドの大きさ、安全性の懸念などを含む、当技術分野で知られているいくつかの要因に基づいて行うことができる。

【0149】

適切なベクターとしては、それだけには限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター（たとえば、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび他のパルボウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、または単純ヘルペスウイルス）、脂質ベクター、ポリリシンベクター、合成ポリアミノポリマーベクターなどが挙げられる。

【0150】

当技術分野で知られている任意のウイルスベクターを本発明において使用することができる。組換えウイルスベクターを生成するためおよびウイルスベクターを核酸送達に使用するためのプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および他の標準的な実験室の手引き（たとえばＶｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９７）中に見つけることができる。

【0151】

非ウイルス移行方法も用いることができる。核酸移行のための多くの非ウイルス方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送について、哺乳動物細胞によって使用される通常の機構に依存する。特定の実施形態では、非ウイルス核酸送達系は、標的細胞による核酸分子の取り込みについて、エンドサイトーシス経路に依存する。この種類の例示的な核酸送達系としては、リポソームに由来する系、ポリリシンコンジュゲート、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。

【0152】

特定の実施形態では、プラスミドベクターを本発明の実施において使用する。たとえば、組織内への注射によって、プラスミドを筋肉細胞内に導入することができる。発現は数カ月間に及ぶことができるが、陽性細胞の数は典型的には低い（Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：２４７（１９８９））。カチオン性脂質は、一部の培養細胞内への核酸の導入を助けることが実証されている（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：３８７（１９８９））。カチオン性脂質プラスミドＤＮＡ複合体をマウスの循環内に注射することは、肺におけるＤＮＡの発現をもたらすことが示されている（Ｂｒｉｇｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２９８：２７８（１９８９））。プラスミドＤＮＡの１つの利点は、非複製細胞内に導入できることである。

【0153】

代表的な実施形態では、核酸分子（たとえばプラスミド）を、その表面上に正電荷を保有する脂質粒子中に捕捉させ、任意選択で、標的組織の細胞表面抗原に対する抗体を用いてタグ付けすることができる（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ、２０：５４７（１９９２）、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９号、日本特許出願第１０４７３８１号、および欧州特許公開ＥＰ－Ａ－４３０７５号）。

【0154】

両親媒性陽イオン性分子からなるリポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの核酸送達のための非ウイルスベクターとして有用である（Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４０４（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２：２９１（１９９５）、Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：３８２（１９９４）、Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：６４７（１９９４）、およびＧａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７１０（１９９５）中に総説）。正荷電リポソームは、静電相互作用を介して負荷電核酸と複合体形成して、脂質：核酸複合体を形成すると考えられている。脂質：核酸複合体は、核酸移行ベクターとしていくつかの利点を有する。ウイルスベクターとは異なり、脂質：核酸複合体を使用して、本質的に無制限の大きさの発現カセットを移行させることができる。複合体はタンパク質を欠くため、これらが誘起する可能性がある免疫原性および炎症反応はより少ない。さらに、これらは複製または組換えられて感染性因子を形成することができず、また、低い組込み頻度を有する。いくつかの出版物が、両親媒性カチオン性脂質がｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸送達を媒介できることを実証している（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３（１９８７）、Ｌｏｅｆｆｌｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７：５９９（１９９３）、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２５５０（１９９４））。

【0155】

いくつかのグループが、動物およびヒトの両方におけるｉｎ ｖｉｖｏ形質移入について、両親媒性カチオン性脂質：核酸複合体の使用を報告している（Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２：７１０（１９９５）、Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：２０９（１９９３）、およびＴｈｉｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：９７４２（１９９５）中に総説）。米国特許第６，４１０，０４９号は、長い貯蔵寿命を有するカチオン性脂質：核酸複合体を調製する方法を記載している。

【0156】

また、核移行シグナルを使用して、二本鎖ＲＮＡまたは発現ベクターの、核の近く内への標的化、および／または核内へのその侵入を増強させることができる。そのような核移行シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳまたはヌクレオプラスミンＮＬＳなどのタンパク質またはペプチドであることができる。これらの核移行シグナルは、ＮＬＳ受容体（カリオフェリンアルファ）などの様々な核輸送因子と相互作用し、その後、これがカリオフェリンベータと相互作用する。

【0157】

発現ベクターは、原核または真核細胞中における二本鎖ＲＮＡの発現用に設計することができる。たとえば、二本鎖ＲＮＡは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（たとえばバキュロウイルス発現系）、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞中で発現させることができる。一部の適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、（１９９０）中にさらに記述されている。細菌ベクターの例としては、それだけには限定されないが、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：２２９（１９８７））、ｐＭＦａ （ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、３０：９３３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｇｅｎｅ、５４：１１３（１９８７））、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）が挙げられる。培養昆虫細胞（たとえばＳｆ９細胞）中でタンパク質を生成させるために核酸の発現に利用可能な、バキュロウイルスベクターの非限定的な例としては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：２１５６（１９８３））およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：３１（１９８９））が挙げられる。

【0158】

哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ＰＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ＰＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ、３２９：８４０（１９８７））、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：１８７（１９８７））が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用する場合、発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス調節要素によって提供される。たとえば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。

【0159】

ウイルスベクターは、細胞および生きた動物対象における多種多様な遺伝子送達の応用において使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、それだけには限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バーウイルス、アデノウイルス、ジェミニウイルス、およびカリモウイルスのベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの非限定的な例としては、プラスミド、リポソーム、帯電脂質（サイトフェクチン）、核酸－タンパク質複合体、およびバイオポリマーが挙げられる。目的の核酸に加えて、ベクターはまた、核酸移行結果（特定組織への送達、発現の持続期間など）の選択、測定、およびモニタリングに有用な１つもしくは複数の調節領域および／または選択マーカーも含み得る。

【0160】

上述の調節制御配列に加えて、組換え発現ベクターは追加のヌクレオチド配列を含有することができる。たとえば、組換え発現ベクターは、ベクターを取り込んだ宿主細胞を同定するための選択マーカー遺伝子をコードすることができる。

【0161】

ベクターＤＮＡは、慣用の形質転換または形質移入技法を介して原核または真核細胞内に導入することができる。本明細書中で使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、外来核酸（たとえばＤＮＡおよびＲＮＡ）を宿主細胞内に導入するための、当分野で認識されている様々な技法をいい、それだけには限定されないが、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポフェクション、電気穿孔、微量注入、ＤＮＡをロードしたリポソーム、リポフェクタミン－ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速微粒子を使用した遺伝子照射、およびウイルス媒介性形質移入が挙げられる。宿主細胞を形質転換させるまたは形質移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）および他の実験室の手引き中に見つけることができる。

【0162】

安定組込みが所望される場合、しばしば、小画分の細胞（具体的には哺乳動物細胞）のみが、外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込む。組み込み体を同定および選択するために、選択マーカー（たとえば抗生物質に対する耐性）をコードする核酸を、目的の核酸と共に宿主細胞内に導入することができる。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与えるものが挙げられる。選択マーカーをコードしている核酸は、目的の核酸を含むものと同じベクター上で宿主細胞内に導入することができるか、または別個のベクター上で導入することができる。導入核酸で安定に形質移入した細胞は、薬物選択によって同定することができる（たとえば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存する一方で、他の細胞は死滅する）。

【0163】

一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子を対象に直接投与する。一般に、本発明の化合物を薬学的に許容される担体（たとえば生理食塩水）中に懸濁させ、経口、外用、もしくは静脈内注入によって投与する、または皮下、筋肉内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、または肺内で注射する。これらは、好ましくは、疾患または障害の部位、たとえば肺、腸管、または膵臓に直接送達する。必要な投与量は、投与経路の選択肢、配合物の性質、患者の病気の性質、対象の大きさ、体重、表面積、年齢、および性別、投与する他の薬物、ならびに担当医の判断に依存する。適切な投与量は０．０１～１００．０μｇ／ｋｇの範囲内である。様々な投与経路の異なる効率に鑑みて、必要投与量の幅広い変動を予想するべきである。たとえば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い投与量（たとえば、２、３、４、６、８、１０、２０、５０、１００、１５０、またはそれより高い倍数）を要することが予想される。これらの投与量レベルの変動は、当技術分野において十分に理解されているように、最適化のための標準の経験的ルーチンを使用して調節することができる。投与は単回または複数回であることができる。適切な送達ビヒクル（たとえばポリマー微粒子または埋め込み型装置）における阻害剤のカプセル封入は、特に経口送達のために、送達の効率を増加させ得る。

【0164】

特定の実施形態によれば、二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで特異的細胞または組織に標的化することができる。リポソームおよびウイルスベクター系を含めた標的化送達ビヒクルは当技術分野で知られている。たとえば、リポソームは、リポソームに取り込まれた抗体、可溶性受容体、またはリガンドなどの標的化剤を使用することによって特定の標的細胞または組織に向けて、標的化分子が結合することができる特定の細胞または組織を標的とすることができる。標的化リポソームは、たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参考として組み込まれている）、Ｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５：５５００（１９８６）、Ｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１３９７９（１９８７）、Ｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１３９７３（１９８７）、およびＨｕａｎｇらの米国特許第４，９５７，７３５号中に記載されている。エンベロープウイルスベクターは、ウイルスが特異的細胞種に感染するようにエンベロープタンパク質を修飾または置換することによって、核酸分子を標的細胞に送達するように改変することができる。アデノウイルスベクターでは、付着線維をコードしている遺伝子を、細胞特異的受容体と結合するタンパク質ドメインをコードするように改変することができる。ヘルペスウイルスベクターは、中枢および末梢神経系の細胞を天然で標的とする。あるいは、投与経路を使用して、特定的細胞または組織を標的とすることができる。たとえば、アデノウイルスベクターの冠内投与は、遺伝子の心筋細胞への送達に有効であることが示されている（Ｍａｕｒｉｃｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４：２１（１９９９））。コレステロール含有陽イオン性リポソームの静脈内送達は、肺の組織を優先的に標的とすること（Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：１６７（１９９７））、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子の移行および発現を有効に媒介することが示されている。核酸分子の標的化ｉｎ ｖｉｖｏ送達の成功の他の例は、当技術分野で知られている。最後に、組換え核酸分子は、標的細胞中で選択的に誘導され、非標的細胞中で実質的に不活性に保たれる、転写制御配列および好ましくはプロモーターを選択することによって、標的細胞中で選択的に（すなわち、優先的に、実質的に排他的に）発現させることができる。

【0165】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、任意選択で他の治療剤と併せて送達することができる。追加の治療剤は、本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子と同時発生的に送達することができる。本明細書中で使用する言葉「同時発生的に」とは、合わせた効果を生じるために十分に近い時間を意味する（すなわち、同時発生的は、同時であることができる、または、互いの前後の短期間内に起こる２つ以上の事象であることができる）。一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、１）ビンカアルカロイド（たとえば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、２）エピポドフィロトキシン（たとえばエトポシドおよびテニポシド）、３）抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））、４）酵素（たとえばＬ－アスパラギナーゼ）、５）生物学的応答調節物質（たとえばインターフェロン－アルファ）、６）白金配位複合体（たとえばシスプラチンおよびカルボプラチン）、７）アントラセネジオン（たとえばミトキサントロン）、８）置換尿素（たとえばヒドロキシ尿素）、９）メチルヒドラジン誘導体（たとえばプロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン、ＭＩＨ））、１０）副腎皮質抑制剤（たとえば、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）、１１）副腎皮質ステロイド（たとえばプレドニゾン）、１２）プロゲスチン（たとえば、カプロン酸ヒドロプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、１３）エストロゲン（たとえばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、１４）抗エストロゲン剤（たとえばタモキシフェン）、１５）アンドロゲン（たとえばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン）、１６）抗アンドロゲン剤（たとえばフルタミド）、ならびに１７）ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（たとえばロイプロリド）などの、癌を処置するために有用な薬剤と併せて投与する。別の実施形態では、本発明の化合物は、抗血管形成剤、たとえば、ＶＥＧＦに対する抗体（たとえば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管形成の他の促進因子（たとえば、ｂＦＧＦ、アンジオポエチン－１）に対する抗体、アルファ－ｖ／ベータ－３血管インテグリンに対する抗体（たとえばＶＩＴＡＸＩＮ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ－５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦアルファコンジュゲート、シクロホスファミド、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、ジメチルキサンテノン酢酸、ドセタキセル、レナミドマイド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子配合物（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ダイズイソフラボン（ゲニステイン）、タモキシフェンクエン酸塩、サリドマイド、ＡＤＨ－１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ－０１３７３６、ＡＭＧ－７０６、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブトシル酸塩、ＢＭＳ－５８２６６４、ＣＨＩＲ－２６５、パゾパニブ、ＰＩ－８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、スニチニブリンゴ酸塩、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ－１６１、シレニグチド（ｃｉｌｅｎｉｇｔｉｄｅ）、ならびにセレコキシブ、またはその任意の組合せと併せて投与する。

【0166】

本明細書中で使用する用語「癌」とは、任意の良性または悪性の細胞異常成長をいう。例としては、それだけには限定されないが、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵癌、結腸癌、黒色腫、悪性黒色腫、卵巣癌、脳癌、原発性脳癌腫、頭部頸部癌、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部癌腫、乳癌、子宮癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵癌、胃癌腫、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器系癌腫、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌腫、悪性膵臓膵島細胞腫、悪性カルチノイド癌腫、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、頸部過形成、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、有毛細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本能性血小板増加症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、ならびに網膜芽細胞腫が挙げられる。一部の実施形態では、癌は腫瘍形成癌の群から選択される。

【0167】

医薬組成物
さらなる態様として、本発明は、上述の治療効果のうちの任意のもの（たとえば癌の処置）を達成するための、医薬配合物およびそれを投与する方法を提供する。医薬配合物は、上述の試薬のうちの任意のものを薬学的に許容される担体中に含み得る。

【0168】

「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたは他の様式で望ましくないものではない材料、すなわち、材料を、毒性などのいかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与できることを意味する。

【0169】

本発明の配合物は、医薬、製薬、担体、アジュバント、分散剤、希釈剤などを任意選択で含むことができる。

【0170】

本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、化学修飾したｓｉＲＮＡ分子、または核酸構築体は、既知の技法に従って、製薬的担体中での投与のために配合することができる。たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第９版、１９９５）を参照されたい。本発明による医薬配合物の製造において、二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子（生理的に許容されるその塩を含む）を、典型的には、とりわけ許容される担体と混合する。担体は、固体もしくは液体、または両方であることができ、好ましくは、二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子を用いて、０．０１または０．５％～９５％または９９重量％の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子を含有することができる単位用量配合物、たとえば錠剤として配合することができる。１つまたは複数の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子は、本発明の配合物中に取り込ませることができ、これは、周知の製薬技法のうちの任意のものによって調製することができる。

【0171】

本発明のさらなる態様は、対象をｉｎ ｖｉｖｏで処置する方法であって、本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子を薬学的に許容される担体中に含む医薬組成物を、対象に投与することを含み、医薬組成物を治療上有効な量で投与する、方法である。本発明の二本鎖ＲＮＡ、逆位キメラｓｉＲＮＡ分子、または化学修飾したｓｉＲＮＡ分子の、それを必要としているヒト対象または動物への投与は、化合物を投与するための当技術分野で知られている任意の手段によることができる。

【0172】

本発明の配合物の非限定的な例としては、経口、直腸、頬側（たとえば舌下）、経膣、非経口（たとえば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜筋、および平滑筋を含めた筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内）、外用（すなわち、気道表面を含めた皮膚および粘膜の表面の両方）、鼻腔内、経皮、関節内、頭蓋内、くも膜下腔内、吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接臓器注射（たとえば、肝臓内、肢ない、中枢神経系への送達のために脳もしくは脊髄内、膵臓内、または腫瘍もしくは腫瘍周辺組織内）に適したものが挙げられる。任意の所定の事例における最も適切な経路は、処置する状態の性質および重篤度ならびに使用する特定の化合物の性質に依存する。一部の実施形態では、全身投与に関連するすべての副作用を回避するために、配合物を局所的に送達することが望ましい場合がある。たとえば、局所投与は、所望の処置部位での直接注射によって、所望の処置部位付近の部位（たとえば処置部位に供給する血管内）での静脈内での導入によって、達成することができる。一部の実施形態では、配合物は、虚血性組織に局所的に送達することができる。ある特定の実施形態では、配合物は、徐放性配合物、たとえば徐放性デポーの形態であることができる。

【0173】

注射には、担体は、典型的には、無菌的な発熱物質を含まない水、発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水、静菌水、またはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）などの液体である。他の投与方法には、担体は、固体または液体のどちらかであることができる。

【0174】

経口投与には、化合物は、カプセル、錠剤、および粉末などの固形剤形、またはエリキシル、シロップ、および懸濁液などの液体剤形で投与することができる。化合物は、不活性成分、およびグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルカム、炭酸マグネシウムなどの粉末にした担体と共に、ゼラチンカプセル中にカプセル封入することができる。望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散、または他の既知の望ましい特長を提供するために添加することができる追加の不活性成分の例は、弁柄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白インクなどである。同様の希釈剤を使用して、圧縮錠剤を作製することができる。錠剤およびカプセルはどちらも、持続放出生成物として製造して、一定期間にわたる医薬品の連続的な放出を提供することができる。圧縮錠剤は、すべての不快な味をマスキングし、大気から保護するために、糖でコーティングもしくはフィルムでコーティングすることができる、または胃腸管中での選択的崩壊のために腸溶コーティングすることができる。経口投与のための液体剤形は、患者の受け入れを増すために着色料および香味料を含有することができる。

【0175】

頬側（舌下）投与に適した配合物としては、化合物を香味基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に含むロゼンジ、ならびに、化合物を不活性基剤、たとえばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に含むパステル錠が挙げられる。

【0176】

非経口投与に適した本発明の配合物は、化合物の無菌的な水性および非水性の注射溶液を含み、調製物は、好ましくは意図するレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、配合物を意図するレシピエントの血液と等張にする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質を含有することができる。水性および非水性の無菌的な懸濁液としては懸濁剤および増粘剤を挙げることができる。配合物は、単位用量または複数用量容器、たとえば密封したアンプルおよびバイアル中で提示することができ、使用の直前に無菌的な液体担体、たとえば生理食塩水または注射用水の添加のみを必要とする、凍結乾燥条件下保管することができる。

【0177】

即時の注射溶液および懸濁液は、既に記載した種類の無菌的な粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。たとえば、本発明の一態様では、本発明の化合物を単位剤形で、密封容器中で含む、注射用の安定な無菌的な組成物を提供する。化合物または塩は、適切な薬学的に許容される担体で再構成されて、対象内へのその注射に適した液体組成物を形成することができる、凍結乾燥物の形態で提供される。単位剤形は、典型的には約１０ｍｇ～約１０グラムの化合物または塩を含む。化合物または塩が実質的に非水溶性である場合、十分な量の薬学的に許容される乳化剤を、化合物または塩を水性担体中で乳化させるために十分な量で用いることができる。そのような有用な乳化剤の１つはホスファチジルコリンである。

【0178】

直腸投与に適した配合物は、好ましくは単位用量の坐薬として提示する。これらは、化合物を１つまたは複数の慣用の固形担体、たとえばカカオ脂と混合し、その後、生じる混合物を成形することによって、調製することができる。

【0179】

皮膚への外用塗布に適した配合物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、またはオイルの形状をとる。使用することができる担体としては、石油、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、およびその２つ以上の組合せが挙げられる。

【0180】

経皮投与に適した配合物は、長期間の間レシピエントの表皮と密接して保たれるように適応させた、別個のパッチとして提示することができる。経皮投与に適した配合物はまた、イオン泳動によって送達することもでき（たとえばＴｙｌｅ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、３：３１８（１９８６）を参照）、典型的には、化合物の任意選択の緩衝水溶液の形態をとる。適切な配合物は、０．１～０．２Ｍの化合物を含有するクエン酸もしくはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含む。

【0181】

あるいは、化合物は、経鼻投与用に配合することができる、または、任意の適切な手段によって他の様式で対象の肺に投与する、たとえば、対象が吸入する、化合物を含む呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液によって投与する。呼吸用粒子は液体または固体であることができる。用語「エアロゾル」とは、細気管支または鼻道内に吸入されることができる、任意のガス媒介性懸濁相を含む。具体的には、エアロゾルは、定量吸入器もしくは噴霧器、またはミスト霧吹き中で生成することができる、液滴のガス媒介性懸濁液を含む。エアロゾルはまた、吸入器装置からのガス注入によって送達することができる、空気または他の担体ガス中に懸濁させた乾燥粉末組成物も含み、たとえば、ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＪｏｎｅｓ、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ、Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）、Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、６：２７３～３１３頁、およびＲａｅｂｕｒｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２７：１４３（１９９２）を参照されたい。化合物を含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に知られているように、圧力駆動のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器などの任意の適切な手段によって生成することができる。たとえば米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。同様に、化合物を含む固形粒子のエアロゾルは、任意の固形粒子状医薬品のエアロゾル生成器を用いて、製薬分野において知られている技術によって生成することができる。

【0182】

あるいは、全身性ではなく局所的な様式で、たとえばデポーまたは持続放出配合物中で、化合物を投与することができる。

【0183】

さらに、本発明は、本明細書中に開示する化合物およびその塩のリポソーム配合物を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は当技術分野で周知である。化合物またはその塩が水溶性の塩である場合、慣用のリポソーム技術を使用して、それを脂質小胞内に取り込ませることができる。そのような例では、化合物または塩の水溶性が原因で、化合物または塩は、リポソームの親水性中心または核内に実質的に同伴される。用いる脂質層は、任意の慣用組成物のものであることができ、コレステロールを含有することができるか、またはコレステロールを含まないことができるかのどちらかである。目的の化合物または塩が非水溶性である場合、ここでも慣用のリポソーム形成技術を用いて、塩を、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層内に実質的に同伴させることができる。どちらの場合でも、生成されるリポソームは、標準の超音波処理およびホモジナイゼーション技法の使用などを通じて、大きさを小さくすることができる。

【0184】

本明細書中に開示する化合物またはその塩を含有するリポソーム配合物は、凍結乾燥させて、水などの薬学的に許容される担体を用いて再構成してリポソーム懸濁液を再生することができる、凍結乾燥物を生成することができる。

【0185】

非水溶性化合物の場合、たとえば水性ベースの乳濁液中などの、非水溶性化合物を含有する医薬組成物を調製することができる。そのような例では、組成物は、所望の量の化合物を乳化させるために十分な量の薬学的に許容される乳化剤を含有する。特に有用な乳化剤としてはホスファチジルコリンおよびレシチンが挙げられる。

【0186】

特定の実施形態では、化合物を、上記定義したような治療上有効な量で、対象に投与する。薬学的活性のある化合物の投与量は、当技術分野で知られている方法によって決定することができ、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。任意の具体的な化合物の治療上有効な投与量は化合物間および患者間でいくらか変動し、患者の状態および送達の経路に依存する。一般命題として、約０．００１～約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が治療上の有効性を有し、塩を用いる場合も含めて、すべての重量は化合物の重量に基づいて計算する。より高いレベルでの毒性の懸念は、静脈内投与量を約１０ｍｇ／ｋｇまでなどのより低いレベルに制限する場合があり、塩を用いる場合も含めて、すべての重量は化合物の重量に基づいて計算する。約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を経口投与のために用いることができる。典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの投与量を筋肉内注射のために用いることができる。具体的な投与量は、静脈内または経口投与のそれぞれについて、約１μｍｏｌ／ｋｇから５０μｍｏｌ／ｋｇまで、より具体的には、約２２μｍｏｌ／ｋｇまでおよび３３μｍｏｌ／ｋｇまでの化合物である。

【0187】

本発明の特定の実施形態では、複数回の投与（たとえば、２、３、４回、またはそれより多くの投与）を、様々な時間間隔（たとえば、毎時、毎日、毎週、毎月など）にわたって用いて、治療効果を達成することができる。

【0188】

本発明は、獣医学的および医学的な応用において用途が見つかる。適切な対象としてはトリおよび哺乳動物がどちらも挙げられ、哺乳動物が好ましい。本明細書中で使用する用語「トリ」としては、それだけには限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、およびキジが挙げられる。本明細書中で使用する用語「哺乳動物」としては、それだけには限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ科動物、ネコ科動物、イヌ科動物、ウサギ目動物などが挙げられる。ヒト対象としては、新生児、乳児、青少年、および成人が挙げられる。他の実施形態では、対象は癌の動物モデルである。ある特定の実施形態では、対象は癌のリスクを有するまたは癌のリスクにある。

【0189】

以下の実施例は、特許請求の範囲の範囲を本発明に限定することを意図せず、むしろ、特定の実施形態の例示的なものであることを意図する。当業者が思いつく、例示した方法への任意の変動は、本発明の範囲内にあることを意図する。当業者には理解されるように、特許請求した発明のそれぞれの態様についていくつかの実施形態および要素が存在し、様々な要素のすべての組合せがこれによって予測されるため、本明細書中に例示する具体的な組合せは、特許請求した本発明の範囲の限定として解釈されるべきでない。特定の要素を、組合せ中で利用可能な要素群から除去するまたはそれに加えた場合、要素群は、そのような変化を組み入れたと解釈されるべきである。

【実施例1】

【0190】

合成ｓｉＲＮＡはｃ－ＭＹＣ ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質の発現の減少を示す
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、ｓｎｏｒｄ９０を標的とする対照ｓｉＲＮＡおよび８つのｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４および４８時間処理した（図１Ａ）。ｓｎｏｒｄ９０を標的とする対照ｓｉＲＮＡおよび８つのｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを表１に示す。その後、ｃ－Ｍｙｃバンド強度の相対的定量を行った（図１Ｃ）。ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、ｓｎｏｒｄ９０を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ（ＮＣ）、以前に公開された論文からの陽性対照ｓｉＲＮＡ（ＰＣ）、および８つのｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４時間処理し、その後、免疫ブロットした。ビンキュリンを内部対照として使用した（図１Ｂ）。陽性対照は、ｃ－Ｍｙｃ発現を抑制することが以前に示されている（Ｖａｓｅｖａら、ＫＲＡＳ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＹＣ Ｉｓ Ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｄ ｂｙ ａ ＭＥＫ５－ＥＲＫ５ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ、３４（５）、８０７～８２２頁．ｅ７、２０１８）。ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の阻害によって証明されたように、いくつかの非常に強力なｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡが同定された。

【0191】

【実施例2】

【0192】

合成の化学修飾したｓｉＲＮＡがｃ－Ｍｙｃ遺伝子転写物を実質的に低下させる
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび５つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３７と３８、配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号４３と４４、または配列番号４５と４６）を用いて、２０ｎＭで２４、４８、および７２時間処理した（図２Ａ）。Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび５つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを用いて、２０ｎＭで２４および７２時間処理した（図２Ｂ）。これらのｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解および免疫刺激を最小限にするために完全修飾した（ＦＭ）。これらの種類の修飾は、しばしばｓｉＲＮＡのサイレンシング活性を減弱させるが、本発明者らは、未修飾のｓｉＲＮＡと比較してそのサイレンシング活性のすべてまたはほぼすべてを保持する、いくつかの完全修飾したｓｉＲＮＡ配列を開発した。表２は、調製した完全修飾したｓｉＲＮＡ配列を列挙する。Ｈｉ２Ｆパターンは、２’－フルオロ（２’Ｆ）および２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）リボース修飾の約５０／５０の混合物からなる。Ｈｉ２Ｏｍｅパターンは、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性を改善させ、ヌクレアーゼ分解を回避するために、大多数の２’ＯＭｅリボース修飾および最小限の２’Ｆ修飾からなる。これらのＲＴ－ｑＰＣＲデータは、完全修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡが、いくつかの癌細胞系においてその強力なサイレンシング活性を維持することを実証している。

【0193】

【実施例3】

【0194】

合成の化学修飾したｓｉＲＮＡがｃ－ＭＹＣタンパク質発現を減少させる
ＭＩＡ－ＰａＣａ２およびＡ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに化学修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３７と３８、配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号４３と４４、または配列番号４５と４６）を用いて、２０ｎＭで４８時間処理し、免疫ブロットし、ビンキュリンを内部対照として使用した（図３Ａ）。その後、図３Ｂにｃ－Ｍｙｃバンド強度の相対的定量をプロットした。２つの異なる化学修飾パターンを有するｓｉＲＮＡ（Ｈｉ２ＦおよびＨｉ２Ｏｍｅ（配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４））を、Ａ４２７およびＭＩＡ－ＰａＣＡ２細胞中において試験し、実質的に等価に有効であることが示された（図３Ｃおよび３Ｄ）。これらのタンパク質発現データは、完全修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡが、いくつかの癌細胞系においてその強力なサイレンシング活性を維持することを実証している。

【実施例4】

【0195】

合成の化学修飾したｓｉＲＮＡがｉｎ ｖｉｔｒｏ球状体形成を減少させる
ＭＩＡ－ＰａＣａ２およびＡ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡおよび２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）を用いて、２０ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した（図４Ａ）。図４Ａの画像からの球状体平均面積の相対的定量を図４Ｂに示す。相対的定量の統計学は以下であった：^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＝０．０００２。これらのデータは、完全修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡが、いくつかの癌細胞系において強力な腫瘍成長阻害効果を有することを実証している。

【実施例5】

【0196】

化学修飾したｓｉＲＮＡを用いたｃ－ＭＹＣおよびＫＲＡＳの二重標的化が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中において球状体の面積および数の減少をもたらす
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）およびＫＲＡＳ（配列番号４７と４８または配列番号４９と５０のどちらか）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した（図５Ａ）。共焦点画像からの球状体の面積および数の相対的定量を、Ｏｒｇａｎｏｓｅｇソフトウェアを使用して実施し、図５Ｂに示す。相対的定量の統計学は以下であった：^＊＊ｐ＝０．００２２～０．００２７、^＊ｐ＝０．０１１３～０．０１４７。

【0197】

ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）およびＫＲＡＳ（配列番号４７と４８または配列番号４９と５０のどちらか）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、５ｎＭで２４時間処理し、その後、９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて５日間イメージングした（図５Ｃ）。次に、イメージング後処理を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ ３Ｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合したＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｃｅｌｌｓを用いて実施し、蛍光をプレートリーダーで測定して、代謝活性を決定した（図５Ｄ）。これらのデータは、完全修飾したｓｉＲＮＡによって突然変異体ＫＲＡＳまたはｃ－Ｍｙｃを個々に標的化することが抗腫瘍成長効果を有する一方で、ＫＲＡＳおよびｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子の組合せはさらにより有効であることを実証している。これらのデータは、球状体の形成および球状体内での増殖を阻害することに基づいて、癌における突然変異体ＫＲＡＳおよびｃ－Ｍｙｃの二重標的化を支持する。

【実施例6】

【0198】

化学修飾したｓｉＲＮＡを用いたｃ－ＭＹＣおよびＫＲＡＳの二重標的化が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中のＡ４２７細胞中において球状体の面積および数の減少をもたらす
Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）およびＫＲＡＳ（配列番号４７と４８または配列番号４９と５０のどちらか）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で５日間成長させた。共焦点顕微鏡を用いて、５×対物レンズを使用して代表的な位相差画像を撮影した（図６Ａ）。共焦点画像からの球状体の面積および数の相対的定量を、Ｏｒｇａｎｏｓｅｇソフトウェアを使用して実施した（図６Ｂ）。相対的定量の統計学は以下であった：^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１。

【0199】

Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）およびＫＲＡＳ（配列番号４７と４８または配列番号４９と５０のどちらか）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて５日間イメージングした（図６Ｃ）。次に、イメージング後処理を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ ３Ｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合したＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｃｅｌｌｓを用いて実施し、蛍光をプレートリーダーで測定して、代謝活性を決定した（図６Ｄ）。

【0200】

化学修飾したｓｉＲＮＡを用いたｃ－ＭＹＣおよびＫＲＡＳの二重標的化は、Ａ４２７細胞中においてアポトーシスをもたらした。Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡならびに２つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃ（配列番号３９と４０または配列番号４１と４２のどちらか）およびＫＲＡＳ（配列番号４７と４８または配列番号４９と５０のどちらか）を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、１０ｎＭで２４時間処理し、その後、ＣｅｌｌＴｏｘ Ｇｒｅｅｎを用いて９６ウェルの丸底プレート中に播種し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて５日間イメージングした。グラフは８４時間までのデータを示す（図６Ｅおよび６Ｆ）。統計学は以下であった：^＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１、^＊＊＊ｐ＝０．０００３。これらのデータは、完全修飾したｓｉＲＮＡによって突然変異体ＫＲＡＳまたはｃ－Ｍｙｃを個々に標的化することが抗腫瘍成長効果を有する一方で、ＫＲＡＳおよびｃ－Ｍｙｃ ｓｉＲＮＡ分子の組合せはさらにより有効であることを実証している。これらのデータは、球状体内でのアポトーシスの誘導に基づいて、癌における突然変異体ＫＲＡＳおよびｃ－Ｍｙｃの二重標的化を支持する。

【実施例7】

【0201】

ＫＲＡＳおよびｃＭｙｃを標的とするｓｉＲＮＡを合わせた、リン酸ジエステル連結された化学修飾したｓｉＲＮＡ（「キメラ」）は生物学的に活性が高く、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞中においてｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡ転写物を減少させる
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ（配列番号６１と６２）、１つの化学修飾したｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３９と４０）、および１つの化学修飾したＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号４７と４８）を用いて、単独でまたは組み合わせてのいずれかで処理し、１つの「キメラ」ｓｉＲＮＡ（配列番号６３～６５）を用いて、５ｎＭ、１０ｎＭ、および２０ｎＭで４８または７２時間処理した（図８）。ＫＲＡＳおよびｃＭｙｃを標的とするｓｉＲを合わせる、リン酸ジエステル連結された化学修飾したｓｉＲ（「キメラ」）を示す模式図を図７に示し、これは、一方のｓｉＲＮＡのセンス鎖を、リン酸ジエステルヌクレオチド橋、その後に別のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を含むように隣接して合成する概念的設計を明らかにする。その後、それぞれの対応するｓｉＲＮＡに対する相補鎖を二重鎖形成させて、多価キメラｓｉＲＮＡを形成する。キメラは、複数の個々のｓｉＲＮＡまたは複数の標的を標的とするｓｉＲＮＡのいずれの送達プロセスも簡易化することができ、また、両方の遺伝子転写物の等モル濃度標的化も確実にする。このデータは、多価キメラｓｉＲＮＡが細胞内でそれぞれ機能的であり、複数の異なる遺伝子を一度に強力に標的とすることができることを実証している。

【0202】

【実施例8】

【0203】

Ａ４２７細胞中において、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡの転写物およびタンパク質のレベルを減少させることにおいて、逆位キメラが直列キメラよりも強力である
Ａ４２７細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ（配列番号６１と６２）、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３９と４０）、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号４７と４８）、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」（配列番号６３～６５）、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡ（配列番号６６～６８）を用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで４８および７２時間処理した（図９）。

【0204】

ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ（配列番号６１と６２）、１つもしくは２つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号３９と４０、配列番号４１と４２、配列番号５１と５２、配列番号５３と５４）、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ（配列番号４７と４８）、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」（配列番号６３～６５）、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡ（配列番号６６～６８）を用いて、５ｎＭおよび２０ｎＭで４８および７２時間処理した（図１０Ａ～１０Ｃ）。一緒にすると、これらのデータは、ユニークなＫＲＡＳ突然変異を有する２つの異なる癌種（Ａ４２７＝肺腺癌、ＭＩＡ－ＰａＣａ２＝膵腺癌）において、逆位キメラが予想外に直列キメラ設計よりも強力であり、逆位設計の効力が個々のｓｉＲＮＡ（たとえばＫＲＡＳ＝ＫＳｅｑ２またはＭｙｃ＝ＭＳｅｑ２）のそれを上回ることを実証している。これらのデータは、逆位設計の効力が転写物（ＲＴ－ｑＰＣＲ）およびタンパク質（ウエスタンブロット）のレベルで当てはまることを実証している。

【実施例9】

【0205】

逆位および直列キメラの安定性
血清中における逆位および直列キメラの安定性を試験した（図１１）。逆位キメラがより安定であることが示された。対照的に、逆位および直列キメラは、サイトゾル条件下でどちらも安定であった（図１２）。エンドソーム条件下で試験した場合、逆位および直列キメラはどちらも時間と共に解離し始めた（図１３）。逆位および直列キメラはどちらも、ダイサーによる切断に対して耐性であることが実証された（図１４Ａ～１４Ｃ）。これらのデータは、逆位および直列キメラの代謝はエンドソーム区画内で優勢的に起こり、血清条件下では非常にわずかな分解が起こることを実証している。さらに、キメラはサイトゾル中で非常に安定しており、ダイサーによる切断の基質ではない。この情報に基づいて、これらのキメラ分子は循環中に安定となるが、受容体媒介性エンドサイトーシスの際に、これらはＤＮＡ橋で切断されることが予想される。データは、キメラのおよそ半分が、侵入のおよそ２４時間後までにエンドソーム区画中で切断されることを示している。

【実施例10】

【0206】

逆位キメラの効力の増加
内在性ＫＲＡＳをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって除去し、ＫＲＡＳ－ホタルルシフェラーゼおよび非標識のウミシイタケルシフェラーゼを安定に組み込むＡ４３１同質遺伝子細胞系を、２’Ｏｍｅ修飾を有する対照ｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２Ｆ）ｃ－Ｍｙｃを標的とするｓｉＲＮＡ、１つの化学修飾した（Ｈｉ２ＯＭｅ）ＫＲＡＳを標的とするｓｉＲＮＡ、１つのＭ２／Ｋ２「逆位キメラ」、または１つのＭ２／Ｋ２「直列キメラ」ｓｉＲＮＡを用いて、９６時間、３９～０．００２ｎＭの範囲の用量で処理した。ウミシイタケルシフェラーゼを用いてホタルルシフェラーゼのデータを正規化した（図１５）。データは、逆位キメラが予想外に直列キメラおよび個々のＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡ（ＫＳｅｑ２ Ｈｉ２ＯＭｅ）よりもはるかに強力であったことを示す。

【0207】

ｃ－Ｍｙｃ／ＫＲＡＳ逆位キメラの２つの異なるバージョン（Ｖ１（配列番号６３～６５）およびＶ２（配列番号６９～７１））は、ＭＩＡ－ＰａＣＡ２およびＡ４２７細胞に対して同等に強力であった（図１６Ａ～１６Ｂ）。これらのＨｉ２ＯＭｅ（Ｖ２）で設計したキメラは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加が原因で、ｉｎ ｖｉｖｏでより安定であることが予想される。これらのデータは、逆位キメラのＶ２バージョンが、Ａ４２７細胞（図１７Ａ～１７Ｂ）およびＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞（図１８Ａ～１８Ｂ）中において、ｃ－ＭｙｃおよびＫＲＡＳタンパク質を低下させることにおいて単一ｓｉＲＮＡよりも有効であることを実証している。これらのデータは、下流ＭＡＰキナーゼシグナル伝達およびＭＹＣタンパク質発現が逆位キメラ設計によって実質的に弱毒化されており、個々のｓｉＲＮＡ構成要素によって見られる個々の寄与よりもはるかに優れていることを実証している。さらに、Ｖ２逆位キメラは、単一ｓｉＲＮＡと比較して、ＫＲＡＳ－ルシフェラーゼタンパク質に対して予想外に高い効力を示し（図１９）、効力の実質的な左寄りのシフトをもたらした。さらに、Ｖ２逆位キメラは、ＭＩＡ－ＰａＣＡ２およびＡ４２７細胞のどちらにおいても細胞生存度を相乗的に減少させ（図２０Ａ～２０Ｂ）、個々のｓｉＲＮＡと比較して効力の約１０倍の改善を実証した。Ｖ２逆位キメラは、ＭＩＡ－ＰａＣＡ２およびＡ４２７細胞のどちらにおいても球状体生存度（ｖｉａｉｂｌｉｔｙ）を減少させることができた（図２１Ａ～２１Ｄ）。これらのデータは、より最適化された（Ｖ２）設計が、２つのユニークな標的を一度に同時標的化することにおいて非常に有効であり、驚くべきことに、キメラ設計の個々のｓｉＲＮＡ構成要素よりも有効であり、また、直列キメラ設計の効力を一貫してしのぐことを実証している。効力および２つの異なる遺伝子を同時に標的する能力の改善は、阻害活性の著しい改善、時には個々のｓｉＲＮＡと比較して効力の１０倍を超える改善をもたらす。

【実施例11】

【0208】

ＫＲＡＳ ＷＴまたはＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖレポーターを発現する同質遺伝子細胞系を使用した、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）ｓｉＲＮＡの開発および妥当性確認
ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡの特異性を試験するために、ｓｉＲＮＡを、野生型ＫＲＡＳまたはＧ１２Ｖ ＫＲＡＳを発現するＡ４３１同質遺伝子細胞に対して試験した（図２２）。ＲＴ－ｑＰＣＲに基づいて、Ｖ１－Ｇ１２Ｖ Ｈｉ２ＦまたはＶ４－Ｇ１２Ｖ Ｈｉ２ＯＭｅ ｓｉＲＮＡは、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖの強力なサイレンシングをもたらしたが、ＫＲＡＳ ＷＴの標的化を部分的に（Ｖ１－Ｇ１２Ｖ）または完全に（Ｖ４－Ｇ１２Ｖ）のどちらかで容赦した。パン－ＫＲＡＳ ｓｉＲＮＡと比較して、ルシフェラーゼ読取りを使用して、タンパク質レベルで、Ｖ４－Ｇ１２Ｖ Ｈｉ２ＯＭｅがＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを強力に標的とするが、ＫＲＡＳ ＷＴの標的化を完全に容赦することが見出された。同様に、生存度アッセイを使用して、強力な抗増殖効果がＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異を有するＳＫＣＯ１（結腸）およびＨ７２７（肺）細胞系で診られた（図２３）。これらのデータは、Ｖ１－Ｇ１２ＶおよびＶ４－Ｇ１２Ｖがどちらも、ＫＲＡＳ ＷＴを容赦することができる一方で、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖを強力に標的化することを実証している。その結果、データは、これらの組成物がどちらも、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異体癌細胞系に対して強力な抗増殖効果を有することを実証している。

【実施例12】

【0209】

逆位キメラの効力
Ｈ４４１細胞（図２４）およびＳＫＣＯ１細胞（図２５）中において、特異的ＫＲＡＳ突然変異（Ｇ１２Ｖ）およびｃ－Ｍｙｃ（配列番号７５～７７））を標的とする逆位キメラ（Ｍ２／Ｖ４－Ｇ１２Ｖ）は、単一ｓｉＲＮＡと比較して細胞生存度を相乗的に減少させた。これらのデータは、突然変異に特異的なｓｉＲＮＡ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｖ突然変異に対するＶ４－Ｇ１２Ｖ）も逆位キメラ設計において予想外に強力であり、それぞれの標的に対して構成要素よりも強力であることを実証している。

【0210】

ＲＰＭＩ－８２２６骨髄腫細胞系中において、ＩＲＦ４およびｃ－Ｍｙｃ（配列番号９０～９２））を標的とする逆位キメラは、いずれかの個々のｓｉＲＮＡよりも＞５倍の効力の改善に基づいて、単一ｓｉＲＮＡと比較して細胞生存度を相乗的に減少させた。これらのデータは、逆位キメラの優れた有効性が標的遺伝子または疾患の種類に依存せず（図２６）、これらの設計を任意の２つの目的の標的かつ様々な病態生理学的状態にわたって適用できることを示している。

【0211】

注記すべきことに、同じ遺伝子（ｃ－Ｍｙｃ）を標的とする２つのｓｉＲＮＡ（配列番号８４～８６、配列番号８７～８９））を含む逆位キメラは、ｍＲＮＡを低下させることにおいて、同じｃ－Ｍｙｃ標的に対する個々のｓｉＲＮＡを用いて遺伝子を標的化するよりも有効であった（図２７Ａ～２７Ｂ）。

【0212】

同様に、同じ遺伝子（ＫＲＡＳ）を標的とする逆位キメラは、ＫＲＡＳ－ルシフェラーゼタンパク質を低下させることにおいて、個々のｓｉＲＮＡを用いて遺伝子を標的化するよりも有効であった（図２８）。一緒にすると、これらのデータは、ｍＲＮＡ転写物およびタンパク質のレベルで、ユニークな位置でサイレンシングするｓｉＲＮＡを使用することによって、逆位キメラを使用して、同じ標的遺伝子をより強力にサイレンシングすることもできるを実証している。

【0213】

すべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許、または特許出願が、参考として組み込まれているとして具体的かつ個々に示されている場合と同じ程度に、本明細書中に参考として組み込まれている。

【0214】

前述の発明を、理解を明確にする目的で例示および実施例によってある程度詳細に記載したが、特定の変更および改変を、前述の実施形態および添付の特許請求の範囲のリストの範囲内で実施し得ることは明らかであろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図21A-21B】

【図21C】

【図21D】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27A-27B】

【図28】

【図29】

【図30】

【配列表】

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【国際調査報告】