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特表2024-523436ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体及びその抗原結合断片、その調製方法と使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体及びその抗原結合断片、その調製方法と使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240621BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240621BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240621BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240621BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240621BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240621BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240621BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240621BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240621BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240621BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240621BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C07K19/00
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/86 Z
C12Q1/02
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K39/395 L
A61K45/00
A61K35/17
A61P35/00
C07K14/705
C12N5/0783
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023578686
(86)(22)【出願日】2021-06-16
(85)【翻訳文提出日】2024-02-13
(86)【国際出願番号】 CN2021100263
(87)【国際公開番号】W WO2022261846
(87)【国際公開日】2022-12-22
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523476384
【氏名又は名称】上海▲シン▼湾生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＩＮＯＢＡＹ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ６， Ｎｏ．５１８ Ｈａｏｙｅ Ｒｏａｄ， Ｊｉｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１５０６， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100197642
【弁理士】
【氏名又は名称】南瀬 透
(74)【代理人】
【識別番号】100219483
【弁理士】
【氏名又は名称】宇野 智也
(72)【発明者】
【氏名】徐建青
(72)【発明者】
【氏名】張曉燕
(72)【発明者】
【氏名】丁相卿
(72)【発明者】
【氏名】廖啓彬
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QR48
4B063QR80
4B063QS40
4B063QX10
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C085AA14
4C085AA26
4C085AA27
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA11
4H045BA10
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合断片、調製方法及び使用を提供する。前記ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド、及び前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。本発明によって提供されるＡＸＬを標的とする抗体は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合し、ＡＤＣＣ作用を媒介して腫瘍を殺傷し、又はＣＡＲＴ細胞の標的識別ドメインとして、抗腫瘍作用を発揮し、腫瘍を予防又は治療するために用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）以下の３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなる ＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）以下の３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）以下の３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片であって、 （ａ）以下の３つの相補性決定領域を含む重鎖可変領域、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５及び７のいずれか一つに示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、また、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６及び８のいずれか一つに示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は前記軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を有するＶＬを含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列を有するＶＬを含む、請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列を有するＶＬを含む、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
前記抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列を有するＶＬを含む、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
前記抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有しており、
（ｂ）ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して最多２０個のアミノ酸の保存的置換を有しており、
をさらに含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域であり、より好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、さらに好ましくは、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり、
好ましくは、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項11】
前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2、Ｆｖ、ジスフィルド結合により連結されるＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ及びシングルドメイン抗体から選ばれ、及び／又は、前記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異抗体又は多重特異性抗体であり、より好ましくは、前記抗体は、完全ヒト抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞であって、好ましくは、前記抗体又は抗原結合断片中の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、直列組み合わせ又は並列組み合わせである、キメラ抗原受容体Ｔ細胞。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又はその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする単離された核酸分子。
【請求項14】
請求項１３に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、
より好ましくは、前記ベクターは、ウイルスであり、
さらに好ましくは、前記ウイルスベクターのウイルス骨格は、修飾又はエンジニアリングワクシニアウイルスＴｉａｎ Ｔａｎ株、ワクシニアウイルスニューヨーク株、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株、ワクシニアウイルスカナリア株、ワクシニアウイルスアンカラ株、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、水痘－帯状ヘルペスウイルスベクター、呼吸器合胞体ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＥＢウイルス、巨大細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、天然痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、羊口瘡ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、セネカウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、砂粒ウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ピチンデウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、パラミクソウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、サルウイルス５、麻疹ウイルス、水泡口炎ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、オルトミクソウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型及びヒト免疫不全ウイルス２型、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、サルバブルウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス又はポリオーマウイルスに由来し、
より好ましくは、前記ベクターは、クローニングベクターＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＫａｐｐａ又はクローニングベクターＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＧ１である、ベクター。
【請求項15】
請求項１３に記載の単離された核酸分子又は請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、原核のもの又は真核のものであり、より好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は、抗体又は抗原結合断片、多重特異性抗体を調製するのに適した他の細胞から選ばれ、さらに好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、よりさらに好ましくは、前記宿主細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ又はネコの細胞であり、最も好ましくは、前記宿主細胞は、２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。
【請求項16】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片発現を許容する条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養するステップと、培養された宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の調製方法。
【請求項17】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異又は多重特異性分子であって、好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合し、さらに１つ又は複数の他のターゲットに追加に特異的に結合し、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、第２ターゲットに対する第２結合特異性を有する分子、好ましくは二次抗体を少なくとも１つさらに含み、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質エピトープに特異的に結合する他の抗体又は抗原結合断片をさらに含む、二重特異又は多重特異性分子。
【請求項18】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び前記抗体又はその抗原結合断片に連結された治療剤を含む免疫コンジュゲートであって、好ましくは、前記治療剤は、細胞毒性剤から選ばれ、
好ましくは、前記治療剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、
好ましくは、前記免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲートである、免疫コンジュゲート。
【請求項19】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１７に記載の二重特異又は多重特異性分子又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲート、及び薬学的に許容されるベクター及び／又は賦形剤を含有する医薬組成物であって、好ましくは、医薬組成物は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、抗腫瘍活性を有する医薬であり、より好ましくは、前記薬学活性剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスであり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片、二重特異又は多重特異性分子又は免疫コンジュゲートは、前記追加の薬学活性剤と、単離された成分として、又は同じ組成物の成分として提供される、医薬組成物。
【請求項20】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有するキットであって、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識、放射性核種、蛍光染料、発光物質又はビオチンを有し、より好ましくは、前記検出可能な標識は、酵素であり、さらに好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼであり、より好ましくは、前記発光物質は、化学発光物質であり、
好ましくは、前記キットは、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み、
好ましくは、前記二次抗体は、検出可能な標識、放射性核種、蛍光染料、発光物質又はビオチンをさらに含み、より好ましくは、前記検出可能な標識は、酵素であり、さらに好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼであり、より好ましくは、前記発光物質は、化学発光物質である、キット。
【請求項21】
請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、好ましくは、前記抗原結合ドメインは、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合断片を含み、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、免疫エフェクター細胞によって発現され、
より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である、キメラ抗原受容体。
【請求項22】
請求項２１に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子。
【請求項23】
請求項２２に記載の単離された核酸分子を含み、好ましくは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を調製するために用いられる、ベクター。
【請求項24】
請求項２２に記載の単離された核酸分子又は請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、免疫エフェクター細胞であり、より好ましくは、前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞であり、
好ましくは、前記宿主細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞である、宿主細胞。
【請求項25】
腫瘍細胞増殖を阻害し、及び／又は前記腫瘍細胞を殺傷する方法であって、前記腫瘍細胞を有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１７に記載の二重特異又は多重特異性分子、又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物、又は請求項２１に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項２４に記載の宿主細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項26】
被験者において腫瘍を予防及び／又は治療するための方法であって、前記方法は、それを必要とする被験者に有効量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１７に記載の二重特異又は多重特異性分子、又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物、又は請求項２１に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項２４に記載の宿主細胞を投与することを含み、好ましくは、前記被験者は、ヒトであり、
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、神経膠腫、好ましくは高レベル神経膠腫、母細胞腫、好ましくは神経芽細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、肺がん、好ましくは小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトであり、
好ましくは、前記方法は、抗腫瘍活性を有する追加の医薬を投与することをさらに含み、より好ましくは前記抗腫瘍活性を有する追加の医薬は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスであり、
好ましくは、前記方法は、追加の抗腫瘍療法を投与することをさらに含み、より好ましくは、前記追加の抗腫瘍療法は、手術、化学治療、放射治療、標的化治療、免疫治療、ホルモン治療、遺伝子治療又は姑息的治療である、方法。
【請求項27】
医薬調製における、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１７に記載の二重特異又は多重特異性分子、又は請求項１８に記載の免疫コンジュゲート、又は請求項１９に記載の医薬組成物、又は請求項２１に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項２４に記載の宿主細胞の用途であって、前記医薬は、被験者の腫瘍を予防及び／治療するために用いられ、好ましくは、前記被験者は、ヒトであり、
好ましくは、医薬は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、抗腫瘍活性を有する医薬であり、より好ましくは、前記薬学活性剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスであり、
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、神経膠腫、好ましくは高レベル神経膠腫、母細胞腫、好ましくは神経芽細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、肺がん、好ましくは小細胞肺がん及び非小細胞肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである、用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物免疫技術分野に属し、具体的にはＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体及びその抗原結合断片に関し、本発明はさらに前記抗体及びその抗原結合断片の調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＸＬは、１０４－１４０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、哺乳動物受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭサブファミリーに属し、且つ形質転換能力（Ｐａｃｃｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を持つ。ＡＸＬ細胞外ドメインは、２つの膜遠位Ｎ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｉｇ１とＩｇ２ドメイン）と、２つの膜近位フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）繰り返し配列（ＦＮ１とＦＮ２ドメイン）との組み合わせからなる（Ｐａｃｃｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＸＬタンパク質は、遺伝子ＡＸＬ（ＵＦＯ、ＡＲＫ、Ｔｙｒｏ７又はＪＴＫ１１）によってコード発現され、受容体が、チロシンキナーゼのＴｙｒｏ－３ファミリーのメンバーである。ＡＸＬタンパク質は、リガンドＧａｓ６（抗凝固因子タンパク質Ｓと相同であり、７０－ｋＤａ）を結合した後、ＰＩ－３Ｋ／Ａｋｔ、Ｒａｓ／Ｅｒｋ及びβ－カテニン／ＴＣＦなどの経路によってシグナルを伝達し、腫瘍細胞の生存、増殖、移行と接着を調節することに関与する。ＡＸＬは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）において初めて同定された形質転換遺伝子であり、その後の研究によって明らかなように、正常組織に比べて、ＡＸＬは、肺がん、乳がん、前立腺がん、甲状腺がん、子宮内膜がん、卵巣がん及び腎臓がんなどの多くの腫瘍組織において活性発現状態を呈し、特に、高侵襲、高転移の基底様及び／又は三陰性乳がん、転移性肺がん、膵臓がんなどの腫瘍組織において異常な活性化表現を呈し、腫瘍細胞上皮間葉転換、血管新生、アポトーシス及び免疫調節などを調節することに関与し、腫瘍転移、侵襲を促進することで予後不良を引き起こす。一方、非腫瘍の疾患においては、顕著な上昇、例えば、慢性ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患又は非アルコール性脂肪性肝疾患などの慢性肝疾患（ＣＬＤ）患者の血清に可溶性ＡＸＬ（ｓＡｘｌ）の上昇は見られない。しかし、肝細胞がん（ＨＣＣ）、又は肝臓がん高度関連の後期線維化（Ｆ３期）又は肝硬変（Ｆ４期）の患者の血清においてｓＡｘｌ濃度は特異的に増加する。したがって、ＡＸＬもバイオマーカーとして腫瘍の臨床診断に用いることができる。
【0003】
近年の研究によれば、ＡＸＬタンパク質の高発現も腫瘍の薬剤耐性の形成と密接な関係があることが見出された。化学療法及び受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）治療に対し薬剤抵抗性を有する癌細胞、例えばＥＧＦＲ阻害剤難治性肺がん、ＰＩ３Ｋ阻害剤薬剤耐性頭頸部がん、抗ＨＥＲ２抗体薬剤耐性乳がん、スニチニブ薬剤耐性腎臓がんとＡＬＫ阻害剤薬剤耐性神経芽細胞腫などで、ＡＸＬ発現は顕著に向上する。ＡＸＬ発現を阻害することは、細胞毒性医薬及び標的阻害剤に対する薬剤耐性腫瘍細胞の感受性を逆転できる。したがって、ＡＸＬキナーゼ阻害剤は、がん治療の新規ポリシーとなる。また、ＡＸＬの唯一のリガンドであるＧａｓ６も複数の悪性腫瘍において高発現を呈し、ＡＸＬ－Ｇａｓ６の相互作用を特異的に遮断することにより、腫瘍細胞の移行、侵襲及び薬剤耐性を効果的に阻害することができる。臨床研究から分かったように、ＡＶＢ－５００は、ＡＸＬ／Ｇａｓ６シグナル伝達経路を阻害することにより、白金薬剤耐性卵巣がんの進展を効果的に阻害するできる。現在、当該研究は、すでに米国で第Ｉ相臨床試験を完成し、第II相登録臨床研究に入る直前である。
【0004】
他の標的に比べて、ＡＸＬを標的とする抗体は、迅速に大量にインターナリゼーションされることができ、抗原性に関連する腫瘍標的細胞の表面に結合する数が多く、非標的細胞に結合する数が少なく、標的細胞内に入る数が多く、非標的細胞内に入る数が少ないことに寄与する。したがって、ＡＸＬに特異的に結合する抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）の開発が当分野にて注目されている。腫瘍微小環境における解糖の強化、酸素欠損及び組織灌流不足などにより、大量の酸性代謝産物が蓄積され、腫瘍微小環境を酸性にし、通常、ｐＨ値は５．８～７．０の範囲内であり、多くの場合は６．４～６．８の間にある。このような酸性の腫瘍微小環境は、腫瘍の増殖、侵襲移行及び免疫脱出を促進し、腫瘍治療に挑戦をもたらす。したがって、腫瘍の治療効果を向上させるために、より多くの特異性が強く、酸性腫瘍微小環境の条件下で、親和力が高く、免疫原性が低く、安定性に優れたＡＸＬを標的とする抗体を研究開発することが強く求められている。
【0005】
データに示すように、ＡＸＬモノクローナル抗体と小分子細胞毒性医薬とを組み合わせて調製した抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）が腫瘍に作用する標的性を増強し、毒副作用を減少できる。ＡＤＣは、完全又は一部のヒト化抗体又は抗体断片医薬に比べて、腫瘍組織内で高活性の細胞毒性医薬を放出することによって、腫瘍の成長及び転移を効果的に阻害する。臨床研究から明らかなように、従来のＡＸＬ抗体に由来するＡＤＣは、腫瘍抗原を標的とする部位が単一であるため、薬剤耐性が生じやすく、しかもその血液半減期が低いため、毒性が増加する。したがって、ＡＸＬ抗体薬をさらに研究開発及び最適化する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
従来技術の不足に鑑みて、本発明の主な目的は、酸性条件下での親和力がより高く、特異性がより強く、免疫原性がより低く、安定性により優れたＡＸＬタンパク質を標的とする抗体を提供することである。本発明は、前記抗体の調製方法及び用途をさらに提供し、本発明のＡＸＬタンパク質を標的とする抗体は、腫瘍の検出及び／又は治療に用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一態様では、本発明は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0008】
一態様では、本発明は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0009】
一態様では、本発明は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0010】
一態様では、本発明は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、及び
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３、
及び／又は
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、及び
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示される配列、又はそれと比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３、
を含み、
好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか一つに記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＨは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７に示されるＶＨ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８に示されるＶＨ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、また、前記抗体又はその抗原結合断片のＶＬは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０に示されるＶＬ ＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。
【0011】
一態様では、本発明は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ここで、
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５及び７のいずれか一つに示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、また、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６及び８のいずれか一つに示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は前記軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される。
前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １、３、５及び７のいずれか一つに示される重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、また、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、４、６及び８のいずれか一つに示される軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲを含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲ、及び／又は前記軽鎖可変領域に含まれる３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される。
【0012】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を有するＶＬを含む。
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を有するＶＬを含む。
【0013】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列を有するＶＬを含む。
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示される配列を有するＶＬを含む。
【0014】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列を有するＶＬを含む。
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列を有するＶＬを含む。
【0015】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列を有するＶＬを含む。
（ａ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列、
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
及び／又は、
（ｂ）以下から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列、
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載の置換は、保存的置換であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に示される配列を有するＶＨ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に示される配列を有するＶＬを含む。
【0016】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、
（ａ）ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば、最多２０個、最多１５個、最多１０個、又は最多５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有しており、
（ｂ）ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域（ＣＬ）又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して最多２０個のアミノ酸の保存的置換（例えば最多１５個、最多１０個、又は最多５個のアミノ酸の保存的置換、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の保存的置換）を有しており、
をさらに含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり、
好ましくは、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域である。
（ａ）ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加（例えば、最多２０個、最多１５個、最多１０個、又は最多５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有しており、
（ｂ）ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域（ＣＬ）又はその変体と、
前記変体はその由来配列と比較して最多２０個のアミノ酸の保存的置換（例えば最多１５個、最多１０個、又は最多５個のアミノ酸の保存的置換、例えば１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸の保存的置換）を有しており、
をさらに含み、
好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域であり、
好ましくは、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域である。
【0017】
本発明による抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）2、Ｆｖ、ジスフィルド結合によって連結されるＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及びシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）から選ばれ、及び／又は、前記抗体は、マウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異抗体又は多重特異性抗体であり、より好ましくは、前記抗体は、完全ヒト抗体である。
【0018】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体Ｔ細胞を提供し、
好ましくは、前記抗体又は抗原結合断片中の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、直列組み合わせ又は並列組み合わせである。
好ましくは、前記抗体又は抗原結合断片中の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、直列組み合わせ又は並列組み合わせである。
【0019】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、又はその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子を提供する。
【0020】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の単離された核酸分子を含むベクターを提供し、好ましくは、前記ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、より好ましくは、前記ベクターは、ウイルスであり、
さらに好ましくは、前記ウイルスベクターのウイルス骨格は、修飾又は改変されたワクシニアウイルスＴｉａｎ Ｔａｎ株、ワクシニアウイルスニューヨーク株、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株、ワクシニアウイルスカナリア株、ワクシニアウイルスアンカラ株、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、水痘－帯状ヘルペスウイルスベクター、呼吸器合胞体ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＥＢウイルス、巨大細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、天然痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、羊口瘡ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、セネカウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、砂粒ウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ピチンデウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、パラミクソウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、サルウイルス５、麻疹ウイルス、水泡口炎ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、オルトミクソウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型及びヒト免疫不全ウイルス２型、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、サルバブルウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス又はポリオーマウイルスに由来する。
さらに好ましくは、前記ウイルスベクターのウイルス骨格は、修飾又は改変されたワクシニアウイルスＴｉａｎ Ｔａｎ株、ワクシニアウイルスニューヨーク株、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株、ワクシニアウイルスカナリア株、ワクシニアウイルスアンカラ株、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、水痘－帯状ヘルペスウイルスベクター、呼吸器合胞体ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＥＢウイルス、巨大細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、天然痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、羊口瘡ウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、エンテロウイルス、セネカウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、砂粒ウイルス、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ピチンデウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、パラミクソウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、耳下腺炎ウイルス、サルウイルス５、麻疹ウイルス、水泡口炎ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、オルトミクソウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型及びヒト免疫不全ウイルス２型、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、サルバブルウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス又はポリオーマウイルスに由来する。
【0021】
より好ましくは、前記ベクターは、クローニングベクターＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＫａｐｐａ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＦＪ４７５０５６．１）又はクローニングベクターＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ： ＦＪ４７５０５５．１）である。
【0022】
別の態様では、本発明は、本発明に記載の単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を提供し、
好ましくは、前記宿主細胞は、原核のもの又は真核のものであり、より好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は抗体又は抗原結合断片、多重特異性抗体を調製するのに適した他の細胞から選ばれ、さらに好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、よりさらに好ましくは、前記宿主細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ又はネコの細胞であり、最も好ましくは、前記宿主細胞は、２９３細胞又はＣＨＯ細胞である。
好ましくは、前記宿主細胞は、原核のもの又は真核のものであり、より好ましくは、前記宿主細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞又は抗体又は抗原結合断片、多重特異性抗体を調製するのに適した他の細胞から選ばれ、さらに好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、よりさらに好ましくは、前記宿主細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ又はネコの細胞であり、最も好ましくは、前記宿主細胞は、２９３細胞又はＣＨＯ細胞である。
【0023】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片発現を許容する条件下で、前記宿主細胞を培養するステップと、培養された宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を回収するステップと、を含む、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片の調製方法を提供する。
【0024】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異又は多重特異性分子を提供し、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合し、さらに１つ又は複数の他のターゲットに追加に特異的に結合し、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、第２ターゲットに対する第２結合特異性を有する分子（例えば二次抗体）を少なくとも１つさらに含み、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質エピトープに特異的に結合する他の抗体又は抗原結合断片をさらに含む。
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質に特異的に結合し、さらに１つ又は複数の他のターゲットに追加に特異的に結合し、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、第２ターゲットに対する第２結合特異性を有する分子（例えば二次抗体）を少なくとも１つさらに含み、
好ましくは、前記二重特異又は多重特異性分子は、ＡＸＬタンパク質エピトープに特異的に結合する他の抗体又は抗原結合断片をさらに含む。
【0025】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、及び前記抗体又はその抗原結合断片に連結された治療剤を含む免疫コンジュゲートを提供し、
好ましくは、前記治療剤は、細胞毒性剤から選ばれ、
好ましくは、前記治療剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、
好ましくは、前記免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
好ましくは、前記治療剤は、細胞毒性剤から選ばれ、
好ましくは、前記治療剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、
好ましくは、前記免疫コンジュゲートは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
【0026】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、二重特異又は多重特異性分子又は免疫コンジュゲート、及び薬学的に許容されるベクター及び／又は賦形剤を含有する医薬組成物を提供し、
好ましくは、医薬組成物は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスなどの抗腫瘍活性を有する医薬であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片、二重特異又は多重特異性分子又は免疫コンジュゲートは、前記追加の薬学活性剤と、単離された成分として、又は同じ組成物の成分として提供される。
好ましくは、医薬組成物は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスなどの抗腫瘍活性を有する医薬であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片、二重特異又は多重特異性分子又は免疫コンジュゲートは、前記追加の薬学活性剤と、単離された成分として、又は同じ組成物の成分として提供される。
【0027】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を含有するキットを提供し、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識、例えば酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光染料、発光物質（例えば化学発光物質）又はビオチンを有し、
好ましくは、前記キットは、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み、
好ましくは、前記二次抗体は、検出可能な標識、例えば酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光染料、発光物質（例えば化学発光物質）又はビオチンをさらに含む。
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識、例えば酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光染料、発光物質（例えば化学発光物質）又はビオチンを有し、
好ましくは、前記キットは、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み、
好ましくは、前記二次抗体は、検出可能な標識、例えば酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光染料、発光物質（例えば化学発光物質）又はビオチンをさらに含む。
【0028】
更なる一態様では、本発明は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供し、
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、本発明に記載の抗体の抗原結合断片を含み、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）によって発現される。
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
好ましくは、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、本発明に記載の抗体の抗原結合断片を含み、
好ましくは、前記抗原結合受容体は、免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）によって発現される。
【0029】
更なる一態様では、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。
【0030】
更なる一態様では、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子を含み、好ましくはキメラ抗原受容体Ｔ細胞を調製するために用いられるベクターを提供する。
【0031】
更なる一態様では、本発明は、前記キメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞を提供し、
好ましくは、前記宿主細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）であり、
好ましくは、前記宿主細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）である。
好ましくは、前記宿主細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）であり、
好ましくは、前記宿主細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）である。
【0032】
本発明、腫瘍細胞成長を阻害し、及び／又は前記腫瘍細胞を殺傷する方法であって、前記腫瘍細胞を有効量の本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は二重特異又は多重特異性分子、又は免疫コンジュゲート、又は医薬組成物、又はキメラ抗原受容体、又は宿主細胞と接触させることを含む、方法をさらに提供する。
【0033】
本発明は、被験者（例えばヒト）において腫瘍を予防及び／又は治療するための方法をさらに提供し、前記方法は、それを必要とする被験者に有効量の本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は二重特異又は多重特異性分子、又は免疫コンジュゲート、又は医薬組成物、又はキメラ抗原受容体、又は宿主細胞を投与することを含み、
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、高レベル神経膠腫などの神経膠腫、神経芽細胞腫などの母細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんなどの肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物、例えばヒトであり、
好ましくは、前記方法は、抗腫瘍活性を有する追加の医薬、例えばアルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスを投与することをさらに含み、
好ましくは、前記方法は、追加の抗腫瘍療法、例えば手術、化学治療、放射治療、標的化治療、免疫治療、ホルモン治療、遺伝子治療又は姑息的治療を投与することをさらに含む。
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、高レベル神経膠腫などの神経膠腫、神経芽細胞腫などの母細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんなどの肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物、例えばヒトであり、
好ましくは、前記方法は、抗腫瘍活性を有する追加の医薬、例えばアルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスを投与することをさらに含み、
好ましくは、前記方法は、追加の抗腫瘍療法、例えば手術、化学治療、放射治療、標的化治療、免疫治療、ホルモン治療、遺伝子治療又は姑息的治療を投与することをさらに含む。
【0034】
本発明は、医薬調製における、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、又は二重特異又は多重特異性分子、又は免疫コンジュゲート、又は医薬組成物、又はキメラ抗原受容体、又は宿主細胞の用途をさらに提供し、前記医薬は、被験者（例えばヒト）の腫瘍を予防及び／治療するために用いられ、
好ましくは、医薬は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、抗腫瘍活性を有する医薬、例えばアルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスであり、
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、高レベル神経膠腫などの神経膠腫、神経芽細胞腫などの母細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんなどの肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物、例えばヒトである。
好ましくは、医薬は、追加の薬学活性剤をさらに含み、
好ましくは、前記追加の薬学活性剤は、抗腫瘍活性を有する医薬、例えばアルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害薬、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、分子標的薬、免疫チェックポイント阻害剤又は腫瘍溶解ウイルスであり、
好ましくは、前記腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、高レベル神経膠腫などの神経膠腫、神経芽細胞腫などの母細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんなどの肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれ、
好ましくは、前記被験者は、哺乳動物、例えばヒトである。
【0035】
具体的には、本発明によって提供されるＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合の調製方法は、
１）天然ファージ抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合を発現できるハイブリドーマ株を得るステップと、
２）ステップ１）で得られたハイブリドーマ株において、ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合を発現する遺伝子をクローニングするステップと、
３）ステップ２）でクローニングして得られた遺伝子及び前記遺伝子に操作的に関連する発現調節配列を含む発現ベクターを提供するステップと、
４）ステップ３）に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
５）ステップ４）で得られた宿主細胞を培養するステップと、
６）単離精製してモノクローナル抗体を得るステップと、を含む。
１）天然ファージ抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合を発現できるハイブリドーマ株を得るステップと、
２）ステップ１）で得られたハイブリドーマ株において、ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合を発現する遺伝子をクローニングするステップと、
３）ステップ２）でクローニングして得られた遺伝子及び前記遺伝子に操作的に関連する発現調節配列を含む発現ベクターを提供するステップと、
４）ステップ３）に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
５）ステップ４）で得られた宿主細胞を培養するステップと、
６）単離精製してモノクローナル抗体を得るステップと、を含む。
【0036】
別の態様では、本発明は、上記調製方法に用いられるハイブリドーマ株を提供する。
【0037】
本発明は、天然ファージ抗体ライブラリーを用いてスクリーニングすることで、ＡＸＬを標的とする抗体７１株を得て、いずれもヒトＡＸＬに結合する全ヒト抗体を認識することができ、そのうち４株の標的ＡＸＬ抗体（Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４）は、ヒトＡＸＬの細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）タンパク質を特異的に認識し、ＡＸＬ－Ｇａｓ６相互作用を遮断する潜在能力を有する。上記ＡＸＬ抗体は、酸性条件下での親和力がより強く、より正確かつ有効な腫瘍殺傷作用を発揮するとともに、正常組織毒性に対する殺傷を減少させ、抗体医薬の臨床使用の安全性を増加させることができることが期待される。本発明に記載のＡＸＬに対する抗体は、ＡＤＣＣ作用を媒介することができ、単独で抗体を薬剤として投与することができ、ＣＡＲＴ細胞を調製し、抗腫瘍作用を発揮することもできる。
【0038】
本発明は、ＡＸＬタンパク質を特異的に標的とする抗体を分泌するヒト－マウスハイブリドーマを調製し、分子生物学的技術を用いて当該抗体の重鎖及び軽鎖配列（全数ヒトの遺伝子）をクローニングし、抗ＡＸＬタンパク質ヒトモノクローナル抗体を構築し、ＣＨＯ細胞により抗体を発現し、産生する。これらの抗体は、医薬として従来の抗体と比較して、より強い結合能と特異性を有する。実験結果から示されるように、本発明の特異性抗体は、良好な生物学的効果を有し、ヒトＡＸＬタンパク質を認識でき、かつ親和力が２．９２×１０-9Ｍと１．４０×１０-9Ｍであり、本発明の抗体は、比較的強い酸性環境の走化性を有し、ＡＸＬ高発現疾患を標的とするためのＣＡＲＴ又はモノクローナル抗体などの治療薬を調製することができ、非常に有望である。
【0039】
当業者であれば、本明細書に記載された発明は、具体的に説明されたものに加えて、変更及び修正が容易であることを理解するであろう。本発明は、これらの変形及び修正の全てを含む。本発明は、明細書における単独又は共通の言及又は指摘された全てのステップ及び特徴、及びステップ又は特徴の任意と全ての組み合わせも含む。
【0040】
本発明のその他の特徴及び態様は、以下の詳細な記述と添付図面を考慮して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0041】
以下、図面と結び付けて本発明の実施形態を詳細に説明し、ここで、
【図1】ＥＬＩＳＡスクリーニングによるクローン上澄みと抗原ｈＡＸＬ－ＥＣＤの結合を表すグラフを示す。図１Ａ～図１Ｇは、それぞれ本出願の７１個のクローンがｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合することができることを示し、そのうち５番、７番、１１番及び１４番のクローンの親和力が最も高く、５番、７番、１１番及び１４番のクローンを選択して実験を行い、Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４と命名した。
【図2】本発明で使用される抗体に構築された表現ベクターマップＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＫａｐｐａ及びＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＧ１ ＷＴを示す。
【図3】本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の親和力をフローデータで示すグラフであり、そのうち図３Ａは、異なるｐＨにおいて、陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、図３Ｂ～３Ｅは、異なるｐＨにおいて、抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、本発明の抗体は、陽性対照に対してより高い親和力を有し、且つ酸性条件下で、中性条件よりも高い結合能力を有することが明らかである。
【図4】本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－１１と陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体を用いてそれぞれ調製したＣＡＲＴ細胞、及び異なる条件下でのインビトロ活性試験を示し、図４から一義的に明らかなように、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－１１は、インビトロの酸性条件下で活性化がより強い。
【図5】陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体で調製したＣＡＲＴ細胞に比べ、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－１１を用いて調製したＣＡＲＴ細胞がインビトロで高い殺傷活性を媒介することができることを示す。
【図6】陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体に比べて、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４を用いてインビトロでより広抗腫瘍活性を媒介することができることを示す。
【図7】抗体可変領域の配列方式を示す。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本出願の以下の説明は、本出願の複数の実施形態を説明するためのものに過ぎない。したがって、ここで論じられる具体的な修正方式は、出願の範囲を限定するものと理解すべきではない。当業者であれば、本出願の範囲から逸脱することなく、複数の同等の形態、変形及び修正を容易に導き出すことができ、このような同等の実施形態は本発明の範囲に含まれることが理解されるべきである。本出願において引用された全ての文献は、開示出版物、特許、及び特許出願を含めて、その全文を引用により本発明に組み込む。
【0043】
定義
本発明における「抗体」は、ある特定の抗原に結合可能な任意な免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体又は二重特異（２価）抗体を含む。１つの天然の無傷抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む。各重鎖は、１つの可変領域と第１、第２、第３の定常領域からなり、各軽鎖は、１つの可変領域と１つの定常領域からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ及びμに分類することができ、哺乳動物の軽鎖は、λ又はκに分類することができる。抗体は、「Ｙ」型を呈し、Ｙ字型構造のネックは、２本の重鎖の第２と第３の定常領域からなり、それらはジスフィルド結合によって結合される。「Ｙ」型構造の各アームは、そのうちの１本の重鎖の可変領域と第１の定常領域を含み、１本の軽鎖の可変領域及び定常領域と結合する。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は、いずれも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域を含む。軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含む。本発明で開示される抗体と抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ命名法によって命名又は認識されることができる。（ＡＩ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４）：９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ． ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。ここで、３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、ステント支持超可変ループを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる側部連続部によって分離されている。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を有する。抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいていくつかの種類に分けることができる。α、δ、ε、γ及びμ重鎖を含有するか否かによって、抗体は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの主な分類又は異性体に分けることができる。いくつかの主要な抗体の分類は、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）又はＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分類されることができる。
本発明における「抗体」は、ある特定の抗原に結合可能な任意な免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体又は二重特異（２価）抗体を含む。１つの天然の無傷抗体は、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む。各重鎖は、１つの可変領域と第１、第２、第３の定常領域からなり、各軽鎖は、１つの可変領域と１つの定常領域からなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ及びμに分類することができ、哺乳動物の軽鎖は、λ又はκに分類することができる。抗体は、「Ｙ」型を呈し、Ｙ字型構造のネックは、２本の重鎖の第２と第３の定常領域からなり、それらはジスフィルド結合によって結合される。「Ｙ」型構造の各アームは、そのうちの１本の重鎖の可変領域と第１の定常領域を含み、１本の軽鎖の可変領域及び定常領域と結合する。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗原の結合を決定する。各鎖の可変領域は、いずれも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域を含む。軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３を含む。本発明で開示される抗体と抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ命名法によって命名又は認識されることができる。（ＡＩ－Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．，Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３（４）：９２７（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８６（３）：６５１－６３（１９８５）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ． ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２（６２５２）：８７７－８３（１９８９）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。ここで、３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存され、ステント支持超可変ループを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる側部連続部によって分離されている。重鎖及び軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を有する。抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいていくつかの種類に分けることができる。α、δ、ε、γ及びμ重鎖を含有するか否かによって、抗体は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５つの主な分類又は異性体に分けることができる。いくつかの主要な抗体の分類は、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）又はＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分類されることができる。
【0044】
本出願における「抗原結合断片」は、１つ又は複数のＣＤＲを含む抗体部分、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を有さない任意の他の抗体断片によって形成された抗体断片を意味する。抗原結合断片の例としては、二重機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスフィルド結合が安定しているＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスフィルド結合が安定している二重機能性抗体（ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（２価の二重機能性抗体）、２価一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）、多重特異性抗体、ラクダ化シングルドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ナノ抗体、ドメイン抗体及び２価ドメイン抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合断片は、母体抗体と同じ抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、特定のヒト抗体からの１つ又は複数のＣＤＲを含み、１つ又は複数の異なるヒト抗体からのフレームワーク領域に転送することができる。
【0045】
抗体の「Ｆａｂ」断片は、１本の軽鎖（可変領域及び定常領域を含む）と１本の重鎖の可変領域及び定常領域の一部がジスフィルド結合によって結合した抗体分子の部分を意味する。
【0046】
「Ｆａｂ’」断片は、ヒンジ領域の一部を含むＦａｂ断片を意味する。
【0047】
「Ｆ（ａｂ’）２」は、Ｆａｂの二量体を意味する。
【0048】
抗体のＦｃ領域は、様々な異なるエフェクター機能、例えばＡＤＣＣ及びＣＤＣを担当するが、抗原の結合に関与しない。
【0049】
抗体の「Ｆｖ」領域は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片を指し、１本の軽鎖の可変領域と１本の重鎖の可変領域からなる。
【0050】
「一本鎖Ｆｖ抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とが直接又は１つのペプチド鎖を介して連結されたエンジニアリング抗体（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８５：５８７９（１９８８））を意味する。
【0051】
「一本鎖抗体Ｆｖ－Ｆｃ」又は「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」は、ある抗体Ｆｃ領域に連結されたｓｃＦｖからなるエンジニアリング抗体を意味する。
【0052】
「ラクダ化シングルドメイン抗体（Ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ（Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨＣＡｂ）」は、いずれも、２つのＶＨドメインを含むが、軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１－２）：２５－３８（１９９９）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７－３０２（２００１）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，００５，０７９）。重鎖抗体は、最初にラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ及びアルパカ）より誘導されて得る。軽鎖の欠失にもかかわらず、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）は、抗原結合の全機能を確証された（Ｈａｍｅｒｓ Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）：４４６－８（１９９３）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら，「Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５４（１）：３９－４７（２００２）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１０９（１）：９３－１０１（２００３））。重鎖抗体の可変領域（ＶＨドメイン）は、既知の最小の獲得免疫による抗原結合単位Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２１（１３）：３４９０－８．Ｅｐｕｂ（２００７））である。
【0053】
「ナノ抗体」は、重鎖抗体由来の１つのＶＨドメインと２つの定常領域ＣＨ２及びＣＨ３からなる抗体断片を意味する。
【0054】
「二重機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、同一のポリペプチド鎖に連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む２つの抗原結合部位を含有する小さな抗体断片を含む（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０（１４）：６４４４－８（１９９３）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１参照）。２つのドメイン間のアダプターは非常に短く、同じ鎖上の２つのドメインを互いにペアにすることができないため、２つのドメインを別の鎖の相補ドメインとペアにさせられ、２つの抗体結合部位を形成する。これらの２つの抗体結合部位は、同一又は異なる抗原（又は抗原エピトープ）を標的として結合することができる。
【0055】
「ドメイン抗体」は、１本の重鎖可変領域又は１本の軽鎖可変領域のみを含む抗体断片を意味する。場合によっては、２つ又は複数のＶＨドメインは、１つのポリペプチドアダプターにより共有結合されて２価ドメイン抗体を形成する。２価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同一又は異なる抗原を標的として作用することができる。
【0056】
いくつかの実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、２つのＶＨ遺伝子の間が１本のポリペプチドアダプターによって連結され、ジスフィルド結合によって２つのＶＬ基と結合する３本のペプチド鎖を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、「二重特異ｄｓ二重機能性抗体」は、ＶＬ１－ＶＨ２（１つのポリペプチドアダプターによって連結される）及びＶＨ１－ＶＬ２（１つのポリペプチドアダプターによって連結される）を含有し、両者は、ＶＨ１とＶＬｌとの間でジスフィルド結合によって結合される。
【0058】
「二重特異性ｄｓＦｖ」又は「ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ」は、ＶＨ１－ＶＨ２基では、両方の重鎖がポリペプチドアダプター（例えば、長い弾性アダプター）によって連結され、そしてジスフィルド結合によってそれぞれＶＬ１及びＶＬ２基と結合され、ジスフィルド結合によってペアする各重鎖軽鎖が異なる抗原特異性を有する３つのポリペプチド鎖を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、量化された２つのＶＨ－ＶＬ（ポリペプチドアダプターによって連結される）基を含む２価の二重機能性抗体又は２価の一本鎖抗体（ＢｓＦｖ）であり、ここで、２つの基のＶＨは、他方の基のＶＬと協働して、同じ抗原（又は抗原エピトープ）又は異なる抗原（又は抗原エピトープ）を標的として結合することができる２つの結合部位を形成する。別のいくつかの実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、互いに連結されたＶL1－ＶH2（ポリペプチドアダプターによって連結される）及びＶH1－ＶL2（ポリペプチドアダプターによって連結される）を含む二重特異性二重機能性抗体であり、ここで、ＶH1とＶL1とが協働して、ＶH2とＶL2とが協働し、且つ各協働ペアが異なる抗原特異性を有する。
【0060】
抗体又は抗原結合断片に用いられる場合、本出願で使用される用語「完全ヒト」は、前記抗体又は抗原結合断片が、あるアミノ酸配列があるか、又は前記アミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列が、ヒト又はヒト免疫細胞から生産されるか、又は例えばヒト抗体ライブラリーを利用するトランスジェニック非ヒト動物などの非ヒト由来の抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体をコードする他の配列に対応することを意味する。いくつかの実施形態では、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体由来のアミノ酸残基（特に抗原結合残基）を含まない。
【0061】
抗体又は抗原結合断片に用いられる場合、本出願で使用される用語「ヒト化」は、非ヒト動物由来のＣＤＲ、ヒト由来のＦＲ領域、及びヒト由来の定常領域（適用する場合）を含む抗体又は抗原結合断片を意味する。ヒト化抗体又は抗原結合断片は、低下した免疫原性を有するため、特定の実施形態においてヒトの治療剤として利用可能である。いくつかの実施形態では、前記非ヒト動物は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、又はハムスターである。いくつかの実施形態では、前記ヒト化抗体又は抗原結合断片は、ＣＤＲ配列が非ヒト由来であることを除き、基本的に全てヒト由来の配列からなる。いくつかの実施形態では、前記ヒト由来のＦＲ領域は、それが由来するヒト抗体と同じアミノ酸配列を含んでもよく、又はいくつかのアミノ酸の変化、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個以下のアミノ酸の変化を含んでもよい。いくつかの実施形態では、当該アミノ酸変更は、重鎖ＦＲ領域にのみ存在してもよく、軽鎖ＦＲ領域にのみ存在してもよく、又は２つの鎖中に同時に存在してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、前記ヒト化抗体は、ヒトＦＲｌ－３、ヒトＪＨ及びＪＫを含む。
【0062】
本出願で使用される用語「キメラ」は、１つの種に由来する重鎖及び／又は軽鎖の一部を有し、前記重鎖及び／又は軽鎖の残部が異なる種に由来する抗体又は抗原結合断片を意味する。例示的な例において、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域と、非ヒト動物、例えばマウス由来の可変領域とを含んでもよい。
【0063】
本出願における「特異的に結合する」又は「特異的な結合」は、両分子間の非ランダム結合反応、例えば抗体と抗原との間の反応を意味する。特定の実施形態では、本出願の抗体又はその抗原結合断片は、ヒト及び／又はサルＡＸＬタンパク質に特異的に結合し、かつその結合親和力（ＫD）が≦１０-6Ｍである。本出願におけるＫDは、解離速度と結合速度との比（ｋoff／ｋon）を意味し、表面プラズモン共鳴の方法によって測定することができ、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅのような器具を使用する。
【0064】
特に明記しない限り、本発明に記載の抗体の重軽鎖定常領域は、それぞれヒトＩｇＧ１及びκ鎖である。
【0065】
本出願において、アミノ酸配列に用いられる場合、「保存的置換」は、１つのアミノ酸残基を類似する物理化学的性質を持つ側鎖を有する別の１つのアミノ酸残基に置き換えることを意味する。例えば、疎水性側鎖アミノ酸残基間（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、ＶａＬ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ）、中性親水性側鎖残基間（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎ）、酸性側鎖残基間（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性側鎖アミノ酸間（例えばＨｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ）又は芳香族側鎖残基間（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＰｈｅ）に保存的置換を行うことができる。当分野では、保存的置換は、通常、タンパク質配座構造の著しい変化を引き起こさないから、タンパク質の生物活性を保留することができることが既知である。
【0066】
アミノ酸配列（又は核酸配列）に用いられる場合、「パーセント配列同一性」は、配列アラインメントを行い、且つ必要に応じて同一のアミノ酸（又は核酸）の数が最大になるように間隔を導入した後、候補配列において、参照配列と同じアミノ酸（又は核酸）残基が前記候補配列のアミノ酸（又は核酸）残基に占める百分率を意味する。前記アミノ酸残基の保存的置換は、同じ残基と考えられてもよいし、考えられなくてもよい。当分野で開示されたツールによって配列アラインメントすることで、アミノ酸（又は核酸）配列のパーセント配列同一性を決定することができる。当業者であれば、例えば適切なアルゴリズムを選択することによって、前記ツールのデフォルトパラメータを使用してもよいし、アラインメントの必要に応じてパラメータを適切に調整してもよい。
【0067】
本出願で使用される「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞及び抑制性Ｔ細胞を含む。
【0068】
本出願で使用される「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域が、そのエフェクター、例えばＣ１複合体とＦｃ受容体と結合する生物活性を意味する。例示的なエフェクター機能としては、抗体とＣ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域とエフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び貪食を含む。
【0069】
本出願における「がん」又は「がん症状」は、腫瘍又は悪性細胞の成長、増殖又は転移によって媒介され、固形腫瘍と非固形腫瘍、例えば白血病を引き起こす任意の医学的状態を意味する。本発明における「腫瘍」は、腫瘍及び／又は悪性細胞の実体物質を意味する。
【0070】
ある状態に対する「治療」又は「療法」は、ある状態を予防又は軽減すること、ある状態が発症は進行する速度を低下させること、ある状態に進行するリスクを減少させること、ある状態に関連する症状の進行を予防又は遅延させること、ある状態に関連する症状を減少又は終息させること、ある状況の完全又は部分的な逆転を産生させること、ある状態を治癒させること、又は以上の組み合わせを含む。がんにとって、「治療」又は「療法」は、腫瘍又は悪性細胞の成長、増殖又は転移、又は上記のいくつかの組み合わせを阻害又は遅延させることを意味してもよい。腫瘍にとって、「治療」又は「療法」は、腫瘍の全部又は一部を除去すること、腫瘍の成長及び転移を阻害又は遅延させること、腫瘍の進行を予防又は遅延させること、又は上記のいくつかの組み合わせを含む。
【0071】
「単離された」物質は、人工的に自然状態から変化している。自然界においてある「単離された」物質又は成分が出現した場合、それはすでに変更されているか、又はその元の状態から離脱されているか、又はその両方が発生している。例えば、ある生体動物の体内に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されていないが、これらのポリヌクレオチド又はポリペプチドが、天然の状態でそれと共存する物質と十分に単離し、十分に純粋な状態で存在していれば、「単離された」と考えることができる。特定の実施形態では、抗体及び抗原結合断片の純度は、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であり、電気泳動方法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される。
【0072】
本発明における「ベクター」は、あるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをその中に操作的に挿入して、このタンパク質を発現させることができる輸送媒体を意味する。ベクターは、自身の携帯する遺伝物質要素が宿主細胞内にて発現されるように、宿主細胞を形質転換、形質導入又はトランスフェククトするために使用することができる。例えば、ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、ファージ例えばλファージ又はＭ１３ファージ、及び動物ウイルスなどが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの種類は、レトロウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）を含む）がある。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント及びレポーター遺伝子のような複数の発現制御エレメントを含有してもよい。また、ベクターは、複製開始部位をさらに含有してもよい。ベクターはまた、これらに限定されないが、ウイルス粒子、リポソーム、またはタンパク質外殻のような細胞へのアクセスを助ける成分を含んでもいい。
【0073】
本発明における「宿主細胞」は、外来ポリヌクレオチド及び／又はベクターが導入された細胞である。
【0074】
本発明におけるＡＸＬタンパク質を標的とする抗体について、いくつかの実施形態では、本出願は、ＡＸＬタンパク質を標的とする例示的な抗体Ｈｕ００１－５抗体、Ｈｕ００１－７抗体、Ｈｕ００１－１１抗体、Ｈｕ００１－１４抗体を提供する。
【0075】
前記ＣＤＲ配列を１つ又は複数のアミノ酸の置換を含むように修飾することにより、向上した生物学的活性、例えば向上したＡＸＬタンパク質との結合親和性を得ることができることは当業者であれば理解するできる。例えば、ファージディスプレイ技術を利用して抗体変異体ライブラリー（例えばＦａｂ又はＦｃＦｖ変体）を産生して発現させ、その後ＡＸＬタンパク質との親和性のある抗体をスクリーニングすることができる。別の例では、ＡＸＬタンパク質への前記抗体との結合をコンピュータソフトウェアでシミュレートし、抗体に結合界面を形成するアミノ酸残基を同定することができる。これらの残基の置換を回避して結合親和性の低下を防止したり、これらの残基を標的として置換してより強い結合を形成したりしてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ配列の少なくとも１つ（又は全部）の置換は、保存的置換である。
【0076】
いくつかの実施形態では、前記抗体又は抗原結合断片は、１つ又は複数のＣＤＲ配列を含み、これらの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９－３２の配列と少なくとも８０％（例えば少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するとともに、その親抗体と類似又はそれより高いＡＸＬタンパク質との結合親和性を保持している。前記親抗体は、基本的に同じ配列を有するが、その相応するＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９－３２に記載の配列と１００％の配列同一性を有する。
【0077】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体又は抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴法により測定することで、≦１０-7Ｍの結合親和性（ＫD）でＡＸＬタンパク質に特異的に結合することができる。結合親和性値は、抗原と抗原結合分子との結合がバランスに達したときの解離速度と結合速度との比（ｋoff／ｋon）により算出されるＫD値で表すことができる。前記抗原結合親和性（例えばＫD）は、例えばＢｉａｃｏｒｅなどの器具を用いたプラズモン共鳴結合法を含む当分野で従来既知の適切な方法によって適切に決定することができる。
【0078】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体又は抗原結合断片は、１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０（即ち、半数結合濃度）でＡＸＬタンパク質に結合する。抗体又は抗原結合断片とＡＸＬタンパク質との結合は、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチ法、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、ＦＡＣＳ又はその他の結合試験などの従来既知の方法により測定することができる。例示的な例において、被測定抗体（即ち、一次抗体）を、固定化されたＡＸＬタンパク質又はＡＸＬタンパク質を発現する細胞に結合させた後、未結合抗体を洗い流し、標識された二次抗体を導入することで、それは一次抗体と結合することができるため、結合した二次抗体を検出することができる。固定化されたＡＸＬタンパク質を用いる場合には、マイクロプレートにて前記検出を行うことができ、又はＡＸＬタンパク質を発現する細胞を用いる場合には、ＦＡＣＳ分析を用いて前記検出を行うことができる。
【0079】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体又は抗原結合断片は、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ（ＦＡＣＳ分析を用いて測定した）のＥＣ５０（即ち５０％の有効濃度）でＡＸＬタンパク質に結合する。
【0080】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体の利点は、腫瘍細胞、精製された腫瘍抗原、及び免疫刺激因子によってトランスフェクトされた細胞、腫瘍ワクチンなどの免疫原性を有する物質と併用できることである。また、前記ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体及びその抗原結合断片は、標準化学療法及び放射線療法、標的に基づく小分子療法、その他の新興免疫チェックポイント調節剤療法を含む併用治療に含んでもよい。いくつかの実施形態では、前記抗体及びその抗原結合断片は、抗体-薬物コンジュゲート、二重特異又は多価抗体のベース分子として使用することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体及びその抗原結合断片は、ラクダ化シングルドメイン抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二重機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓ二重機能性抗体（ｄｓ ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノ抗体、ドメイン抗体又は２価ドメイン抗体である。
【0082】
いくつかの実施形態では、本出願に記載の抗体は、免疫グロブリン定常領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。前記重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１－ＣＨ２又はＣＨ１－ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、所望の特性を得るために、１つ又は複数の修飾をさらに含んでもよい。例えば、前記定常領域を修飾して、ＦｃＲｎ受容体が１つ又は複数のシステイン残基に結合するか又はそれを導入するように、１つ又は複数のエフェクター機能を低減又は除去することができる。
【0083】
いくつかの実施形態では、前記抗体及びその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。本発明における抗体又はその抗原結合断片は、様々なコンジュゲートに連結することができると考えられる（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｍ．Ｃｒｕｓｅ ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ．（ｅｄｓ．）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）参照）。これらのコンジュゲートは、共有結合、親和結合、インターカレーション、配位結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）、錯化、結合、混合又は添加などの他の方式で前記抗体又は抗原抱合体と連結することができる。いくつかの実施形態では、本発明で開示される抗体及び抗原結合断片に、工学的方法によって、エピトープ結合部分以外の特定部位を含有させることができ、これらの部位は、１つ又は複数のコンジュゲートを結合するために用いることができる。例えば、このような部位は、システイン残基及びヒスチジン残基などの１つ又は複数の反応性アミノ酸残基を含んでもよく、抱合体との共有結合を補助するために用いられる。いくつかの実施形態では、抗体は、コンジュゲートに間接的に連結されてもよく、又は別のコンジュゲートを介して連結されてもよい。例えば、前記抗体又はその抗原結合断片は、ビオチンに結合して、２番目のコンジュゲートに間接的に結合され、アビジンに連結することができる。前記コンジュゲートは、検出可能な標識、医薬動態修飾部分、精製部分又は細胞傷害活性部分であってもよい。検出可能な標識の例としては、蛍光標識（例えばフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリスリン又はテキサスレッド）、酵素基質標識物質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、炭水化物オキシダーゼ又はβ－Ｄガラクトシダーゼ）、安定同位体又は放射性同位体、発色団部分、ジゴキシン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子又は金を含み、検出を行う。いくつかの実施形態では、前記コンジュゲートは、抗体の半減期の延長に寄与するＰＥＧなどの医薬動態修飾部分であってもよい。その他の好適なポリマーとしては、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体などが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記コンジュゲートは、精製部分、例えば磁気ビーズであってもよい。「細胞傷害活性部分」は、細胞に対して有害であるか、又は細胞を壊死又は死滅させる可能性のある任意の試薬であってもよい。細胞傷害活性部分としては、例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチル、エリスリン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン及びその類似体、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－メルカプトグアニン、シタラビン、５フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン塩酸塩、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）とロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣとシス－ジクロロジアミンプラチナ（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン系抗生物質（例えばダウノルビシン（旧ダウノマイシン）とアドリアマイシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンとアントラマイシン（ＡＭＣ））及び抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンとビンブラスチン）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0084】
ポリヌクレオチド及び組換え方法
当分野で公知の遺伝子工学技術を用いて、本出願に記載の抗体及びその抗原結合断片のアミノ酸配列を対応するＤＮＡコード配列に変換することができる。遺伝暗号の縮退性により、変換して得られたＤＮＡ配列は、完全に一致することができるが、コードされたタンパク質配列は不変のままである。
当分野で公知の遺伝子工学技術を用いて、本出願に記載の抗体及びその抗原結合断片のアミノ酸配列を対応するＤＮＡコード配列に変換することができる。遺伝暗号の縮退性により、変換して得られたＤＮＡ配列は、完全に一致することができるが、コードされたタンパク質配列は不変のままである。
【0085】
当分野で公知の組換え技術を用いて、前記抗体及びその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入してクローン化（ＤＮＡ増幅）又は遺伝子発現に用いることができる。別の実施形態では、前記抗体及びその抗原結合断片は、当分野で公知の相同組換えの方法によって調製することができる。様々なベクターは、選択可能である。ベクター成分は、通常、シグナル配列、複製開始点、１つ又は複数の標識遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１ａ）及び転写終結配列の2種類以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
いくつかの実施形態では、前記ベクター系は、哺乳動物、細菌、酵母系などを含み、また、プラスミド、例えばｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＬｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＬｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２などのその他のラボから入手可能な、又は市販のベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。好適なベクターは、プラスミド又はウイルスベクター（例えば複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含んでもよい。
【0087】
前記抗体及びその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入してクローン又は遺伝子発現に用いることができる。本発明において、前記ベクターにおけるＤＮＡをクローン又は発現するのに適用する宿主細胞は、原核細胞、酵母又は上記高次真核細胞である。本発明の使用に適用される原核細胞は、真菌を含み、例えば腸内細菌科（例えば大腸菌）、腸内細菌属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、マウスチフス菌などのサルモネラ属、マルセッセンスなどのセラチア属、及び赤痢菌属、バチルス・サブティリス並びバキルスリケニホルミスなどの桿菌属、緑膿菌などのシュードモナス、及びストレプトミケスなどのグラム陰性菌又はグラム陽性菌などが挙げられる。
【0088】
原核細胞以外に、糸状真菌又は酵母などの真核微生物も、宿主細胞として抗体をコードするベクターをクローニング又は発現することができる。サッカロミセス・セルビシエ、又はパン酵母は、最もよく使用される低等真核宿主微生物である。しかしながら、多くの他の属、種及び株は、いずれも比較的よく使用されており、且つ本発明において適用され、例えば、シゾサッカロマイセス・ポンベ、クルイベロマイセス属乳酵母、クルイベロマイセス・フラジリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロマイセス・ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロマイセス・ウィッカーラミ（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロマイセス・ワルティ（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロマイセス・ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロマイセス・サーモトレランスとクルイベロマイセス・マルシアヌス：ヤロウイア・リポリティカ（ＥＰ４０２２２６）などのクルイベロマイセス属宿主、ピキア・パストリス（ＥＰ１８３０７０）、カンジダ：トリコデルマ・レセイ（ＥＰ２４４２３４）、アカパンカビ、シュワンニオミセス・オキシデンタリスなどのシュワンニオミセス・オキシデンタリス、及びニューロスポラ、ペニシリウム、クルブラリア、及びなどのアスペルギルス（アスペルギルス・ニデュランス及びアスペルギルス・ニジェールなど）などの糸状真菌がある。
【0089】
本発明によって提供される糖化抗体又はその抗原結合断片を発現するのに適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎細胞としては、植物、昆虫細胞が挙げられる。複数種のバキュロウイルス株（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｓｔｒａｉｎｓ）及びその変体並びに対応する許可性昆虫宿主細胞（ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｓｅｃｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ）は、例えば、ツマジロクサヨトウ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）及びカイコなどの宿主に多く見られるの。トランスフェクション用の様々なウイルス株は、例えば、アウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルスと、カイコ核多角体病ウイルスのＢｍ－５変異体などの公的に入手可能であるものであり、、これらのウイルスはいずれも本発明で使用することができ、特にツマジロクサヨトウ細胞をトランスフェクションするために用いることができる。綿花、トウモロコシ、ジヤガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養も宿主として用いることができる。
【0090】
しかしながら、最も興味深いのは、脊椎細胞であり、脊椎細胞の培養（組織培養）は通常の操作となっている。使用可能な哺乳動物宿主細胞としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎細胞ＣＶ１系（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎芽腎細胞株（２９３又は懸濁培養した２９３細胞サブクローン、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，］．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、赤ん坊ハムスター腎細胞（Ｂ血、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａ ｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞及びヒト肝臓がん細胞系ＨｅｐＧ２）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、前記宿主細胞は、２９３Ｆ細胞である。
【0091】
前記抗体及びその抗原結合断片を産生する発現又はクローニングベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、修飾された後、プロモーターの誘導、形質転換細胞の選択又は標的配列をコードする遺伝子を増幅するのに適した通常の栄養培地で培養する。
【0092】
本発明では、前記抗体及びその抗原結合断片を産生するための宿主細胞は、当分野で公知の様々な培地で培養することができる。前記培地は、当分野で公知の適切な濃度の任意の他の必要な添加剤をさらに含有してもよい。前記培地の条件、例えば温度、ｐＨ値などの類似条件は、発現に用いる宿主細胞を選択することに従来使用された条件であり、当業者によく知られている。
【0093】
組換え技術を用いる場合、前記抗体は、細胞内、壁膜空間にて生成されるか、又は培地に直接分泌されることができる。前記抗体が細胞内にて生成されたる場合、例えば、遠心分離又は超音波の方法により、宿主細胞又は分解断片の粒子の残骸をまず除去することができる。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）には、大腸菌壁膜空間に分泌された抗体を単離する方法が記載されている。簡単に説明すると、酢酸ウラン（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）が存在する条件下でセルペースト（ｃｅｌｌ ｐａｓｔｅ）を約３０分間以上溶ける。遠心分離により細胞破片を除去する。前記抗体が培地に分泌された場合、一般的に、まず市販のタンパク濃度フィルター、例えば、ｌＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを用いて、当該発現系の上澄み液を濃縮する。いずれかの上記ステップにおいても、タンパク質分解を抑制するためのＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤、偶発的な汚染物質の成長を防止するための抗生物質を添加することができる。
【0094】
前記細胞から得られた抗体は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィーカラム、硫酸アンモニウム沈殿、塩析及びアフィニティークロマトグラフィーなどの精製方法を用いて精製することができ、そのうち、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。前記抗体の種類及び前記抗体における任意の免疫グロブリンが存在するＦｃドメインは、タンパク質Ａが親和リガンドとして適切であるか否かを決定する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウス由来の異性体及びヒトγ３に適用する（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７ １５７５（１９８６））。アガロースは、最もよく使用される親和リガンド付着基質であるが、他の基質を選んでもよい。アガロースに比べて、機械的な力が安定する基質、例えば多孔質ガラス又はポリ（スチレン）ベンゼンは、より速い流速及びより短い処理時間を実現できる。当該抗体がＣＨ３ドメインを含有する場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ．ＴＭ樹脂を用いて精製することができる（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）。他のタンパク質精製の技術、例えばイオン交換カラムにおける分留、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂に基づくヘパリンアガロースゲルクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトグラフィーフォーカス、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、所望により得られた抗体から決定することができる。
【0095】
任意の予備精製ステップ後、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法により、興味のある抗体及び不純物を含有する混合物を処理し、ｐＨ約２．５～４．５の溶出緩衝液で、好ましくは低塩濃度で行うことができる（例えば、約０～０．２５Ｍ塩濃度）。
【0096】
キット
本出願は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、生体サンプルにおけるＡＸＬタンパク質の存在状況又はレベルを検出するために用いられる。前記生体サンプルは、細胞又は組織を含んでもよい。
本出願は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、生体サンプルにおけるＡＸＬタンパク質の存在状況又はレベルを検出するために用いられる。前記生体サンプルは、細胞又は組織を含んでもよい。
【0097】
いくつかの実施形態では、前記キットは、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、未標識の抗体を含み、未標識の抗体に結合可能な標識の二次抗体をさらに含む。前記キットは、取扱説明及びキットにおいて各コンポーネントを分離させたパッケージをさらに含むことができる。
【0098】
いくつの実施形態では、前記抗体は、サンドイッチ測定、例えばＥＬＩＳＡ又はイムノクロマトグラフィー測定のために基質又は器具に接続される。適用される基質又は器具は、例えば、マイクロプレート及び試験紙であってもよい。
【0099】
医薬組成物及び治療方法
本出願は、前記抗体を含む医薬組成物及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体をさらに提供する。
本出願は、前記抗体を含む医薬組成物及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体をさらに提供する。
【0100】
本出願で開示される医薬組成物に使用される医薬的に許容される担体は、例えば、医薬的に許容される液体、ゲル剤又は固体担体、水相媒体、非水相媒体、抗微生物物質、等張物質、緩衝液、酸化防止剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、整合剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤又は非毒性補助物質、他の当分野で公知の成分又は上記の複数の組み合わせを含んでもよい。
【0101】
適用できる成分は、例えば、酸化防止剤、充填剤、粘着剤、崩壊剤、緩衝液、防腐剤、潤滑剤、矯味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤又は糖及びシクロデキストリンなどの安定剤を含んでもよい。適用できる酸化防止剤は、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン及び／又は没食子酸プロピルを含んでもよい。本発明で開示される抗体を含む組成物において、１つ又は複数のメチオニンなどの酸化防止剤を含むと、前記抗体の酸化を低下させることができる。酸化作用の減少により、結合親和力の低下を防止又は減少させることによって、抗体の安定性を向上させ、保存可能期限を延長することができる。
【0102】
更に言えば、医薬的に許容される担体は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液注射液、等張ブドウ糖注射液、無菌水注射液、又はグルコースと乳酸リンガー注射液などの水相媒体と、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ごま油、又はピーナッツ油などの非水相媒体、細菌抑制又は真菌抑制濃度での抗菌物質、塩化ナトリウム又はグルコースなどの等張剤、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液などの緩衝液、硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルピロリドンなどの懸濁剤と分散剤、ポリソルベート８０（ポリソルベート－８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸）、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸又は乳酸などの統合試薬を含むことができる。担体としての抗菌剤は、フェノール類又はクレゾール、水銀製剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、クロルフェノキシアンモニウム及びクロルフェネチルアンモニウムを含む複数回用量容器中の医薬組成物に添加することができる。適用できる賦形剤は、例えば、水、塩、グルコース、グリセロール又はエタノールを含むことができる。適用できる非毒性補助物質は、例えば、乳化剤、ｐＨ値緩衝剤、安定剤、可溶化剤、又は酢酸ナトリウム、ソルビタンラウレート、トリエタノールアミンオレート、又はシクロデキストリンのような物質を含むことができる。
【0103】
前記医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、乳剤、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤又は粉末であってもよい。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。
【0104】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、注射可能な組成物に製剤化される。注射可能な医薬組成物は、任意の従来の形態、例えば、液体溶媒、懸濁剤、乳化剤、又は液体溶媒、懸濁剤又は乳化剤を生成するのに適した固体形態で調製することができる。注射製剤は、すぐに使用できる無菌及び／又はパイロジェンフリー溶液、凍結乾燥粉末などの使用前に溶媒と結合した無菌乾燥の可溶物、皮下錠、注射すれば使用できる無菌懸濁剤、使用前に媒体と結合した無菌乾燥不溶製品、及び無菌及び／又はパイロジェンフリーの乳剤を含むことができる。溶媒は、水相又は非水相であってもよい。
【0105】
いくつかの実施形態では、単位投与量の注射製剤は、アンプル、チューブ、又は針を有するシリンジ内に収容される。当分野では、全ての注射投与製剤は、無菌でパイロジェンフリーであることが知られている。
【0106】
いくつかの実施形態では、本出願で開示される抗体又はその抗原結合断片を、ある適切な溶媒に溶解させることによって、滅菌凍結乾燥粉末を調製することができる。前記溶媒は、粉末又は粉末から調製された組換え溶液の安定性を向上させ、又は粉末又は組換え溶液の他の薬理成分を改善することができる。適用できる賦形剤は、水、グルコース、ソルビトール、フルクトース、トウモロコシシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、黒糖又はその他の適用できる物質が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、緩衝液、例えばクエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム緩衝液又は他の当業者がよく知られている緩衝液を含んでもよく、一実施形態では、緩衝液のｐＨは、中性である。当分野で公知の標準条件で、前記溶液に対して次のろ過除菌を行い、その後、凍結乾燥して所望の製剤を調製する。一実施形態では、得られた溶媒をバイアルに分注して凍結乾燥させる。各バイアルは、単回投与量又は複数回投与量の前記ＡＸＬタンパク質を標的とする抗体又はその抗原結合断片又はその組成物を収容することができる。各バイアルにおける収容量は、毎回の投与量に必要な量、又は複数回の投与量に必要な量（例えば１０％過剰）よりも僅かに高くすることができ、それによってサンプリングの正確性及び投与の精度を保証する。凍結乾燥粉末は、適切な条件で、例えば約４℃から室温の範囲内で貯蔵することができる。
【0107】
凍結乾燥粉末を注射用水で再溶解して注射投与用製剤を得る。一実施形態では、凍結乾燥粉末を無菌パイロジェンフリー水又は他の適用できる液体担体に添加して再溶解させることができる。精確な量は、選択された療法によって決定され、経験値に基づいて決定してもよい。
【0108】
治療有効量の本出願に記載の抗体を、それを必要とする被験者に投与することを含む、治療方法をさらに提供する。
【0109】
本出願にて提供される抗体の治療有効投与量は、当分野で公知の様々な要因、例えば、体重、年齢、既往歴、現治療、対象者の健康状態及び交差感染の可能性、アレルギー、超過敏及び副作用、並びに投与経路と腫瘍進行の程度に依存する。当業者（例えば医師又は獣医）は、これら又は他の条件又は要求に応じて投与量を比例的に低減又は上昇させることができる。
【0110】
いくつかの実施形態では、本発明によって提供される抗体は、治療有効投与量約０．０ｌｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇの間で投与することができる。いくつかの実施形態では、前記抗体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与され、いくつかの実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、又は０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。ある特定の投与量は、複数の間隔で投与することができ、例えば、毎日１回、毎日２回又はそれ以上、毎月２回又はそれ以上、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、毎月１回又は２ヶ月又はそれ以上に１回である。いくつかの実施形態では、投与量は、治療プロセスに従って変化し得る。例えば、いくつかの実施形態では、初期投与量は、後続投与量よりも高くてもよい。いくつかの実施形態では、投与量は、治療プロセスにおいて投与対象者の反応に応じて調整される。
【0111】
投与レジメンは、最適な反応（例えば治療反応）に達するように調整されることができる。例えば、単一投与量投与又は一定期間に複数回の分割された投与量投与を行うことができる。
【0112】
本発明で開示される抗体は、当分野で公知の投与手段、例えば注射投与（例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内点滴、筋肉内注射又は皮内注射を含む静脈注射）又は非注射投与（例えば、経口投与、鼻腔投与、舌下投与、直腸投与又は外用投与）によって投与することができる。
【0113】
いくつかの実施形態では、前記抗体は、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、前立腺がん、腎細胞がん、肉腫、高レベル神経膠腫などの神経膠腫、神経芽細胞腫などの母細胞腫、骨肉腫、形質細胞腫、組織球肉腫、膵臓がん、乳がん、小細胞肺がん及び非小細胞肺がんなどの肺がん、胃がん、肝臓がん、結腸がん、直腸がん、食道がん、大腸がん、造血系がん、睾丸がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、扁平上皮がん、腺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頚部扁平上皮がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は血液がん疾患から選ばれる腫瘍及びがんを含むその分子機構に関連する症状を治療するために用いることができる。
【0114】
使用方法
本出願は、前記抗体を使用する方法をさらに提供する。
本出願は、前記抗体を使用する方法をさらに提供する。
【0115】
いくつかの実施形態では、本出願は、本出願に記載の抗体の治療有効量を投与することを含む、個体において前記抗体メカニズムに関連する状況又は症状を治療する方法を提供する。
【0116】
本発明で開示される抗体は、単独投与又は１つ又は複数の他の治療手段又は物質と併用投与することができる。例えば、本発明で開示される抗体は、化学療法、放射線療法、がん治療手術（例えば、腫瘍切除術）、抗ウイルス薬、１つ又は複数の抗嘔吐薬又は他の化学療法による合併症に対する療法、又は任意の他のがん又はウイルスに用いられる治療物質と併用することができる。いくつかのこのような実施形態では、本発明で開示される抗体は、１つ又は複数の治療物質と併用される場合、前記１つ又は複数の治療物質と同時に投与してもよく、いくつかのこのような実施形態では、前記抗体は、同一の医薬組成物の一部として同時に投与してもいい。しかし、他の治療物質と「併用する」抗体は、同時投与又は当該治療物質と同じ組成物において投与する必要がない。本発明における「併用」の意味は、前記抗体と第２種の物質とが異なる投与方式によって投与される場合であっても、他の治療物質の前又は後に投与された抗体も当該治療物質と「併用される」と考えられることをさらに含む。可能な場合には、本発明で開示される抗体と併用される他の治療物質は、当該他の治療物質の製品説明書における方法、又は外科医師用のデスクリファレンス２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ Ｅｄ；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月））、又は他の当分野での公知の方法を参照して、投与してもいい。
【0117】
いくつかの実施形態では、前記治療物質は、がんに対する免疫反応を誘導又は増強することができる。例えば、腫瘍ワクチンは、一部の腫瘍又はがんに対する免疫応答を誘導するために用いることができる。サイトカイン療法は、腫瘍抗原の免疫系への提示を向上させるために用いることができる。サイトカイン療法の例としては、インターフェロンα、β及びγなどのインターフェロン、マクロファージＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦ及び顆粒球ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、１Ｌ－Ｌ、１Ｌ－１ａ、１Ｌ－２、１Ｌ－３、１Ｌ－４、１Ｌ－５、１Ｌ－６、１Ｌ－７、１Ｌ－８、１Ｌ－９、１Ｌ－１０、１Ｌ－ｌｌ及び１Ｌ－１２などのインターロイキン、ＴＮＦ－α及びＴＮＦ－βなどの腫瘍壊死因子が挙げられるが、これらに限定されない。また、ＰＤ－１抗体、ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤及びＦａｓリガンド阻害剤などの免疫阻害対象を不活化する試薬を用いることができる。もう一組の試薬は、腫瘍又はがん細胞に対する免疫応答を活性化するもの、例えば、Ｔ細胞活性化を向上させるもの（例えば、Ｔ細胞共通刺激シグナル伝達経路、例えばＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどの経路）、樹状細胞機能及び抗原提示を向上させるものを含む。
【0118】
以下の実施例は、本発明をより良く説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものと理解すべきではない。以下に示す特定の組成物、材料及び方法の全ては、その全体又は一部が本発明の範囲内にある。これら特定の組成物、材料及び方法は、本発明を制限するためのものではなく、単に本発明の範囲内にある特定の実施形態を説明するためのものである。当業者であれば、進歩性を付加することなく、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料及び方法を開発することができる。本発明の方法に対してなされた複数の変更は、依然として本発明の範囲内に含まれ得ることを理解されたい。発明者は、このような変動を本発明の範囲に含むことを意図している。
【0119】
実施例１：天然のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーの構築及びスクリーニング
ＡＸＬ抗原調製：ヒト組換えＡＸＬタンパク質は、ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎから購入し、製品番号：Ｃ０２Ｂであった。
ＡＸＬ全ヒト抗体スクリーニングは、三優生物医薬（上海）有限公司に依頼して完了させた。合計四回スクリーニングを行い、四回目で得たクローンを選択してＥＬＩＳＡの陽性クローンのＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。最終的に、２３０４個のクローンから全部でｈＡＸＬ－ＥＣＤタンパク質に結合できる７１個の陽性クローンをスクリーニングした。シーケンス解析、ＥＬＩＳＡ結合後、最終的に４つのクローンの配列を選択して全長抗体を構築して、さらなる実験を行った。具体的な実施方法は、以下のとおりである。
１．１ 陽性クローンシーケンシング及び解析
初歩的なスクリーニング完了後、７１個のｈＡＸＬ－ＥＣＤタンパク質に結合できる陽性クローンに番号を付け、２μＬの菌液を２ｍＬの２ＹＴ培地に吸い取り、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、プラスミドを抽出して二代シーケンシングを行った。シーケンシング結果は、ＳｅｑＭａｎによって元のＡＢ１ファイルを統合し、比較し、非抗体遺伝子配列を除去し、抗体遺伝子整合版のｆａｓｔａファイルを生成した。その後、ＤＮＡ配列をＭＥＧＡ６によりアミノ酸配列に翻訳し、アミノ酸配列によりターミネーター、非通常配列などを含むアミノ酸配列を見つけ、アミノ酸配列のｆａｓｔａファイルを導出し、陽性抗体クローンの抗体軽鎖と重鎖配列を得、解析比較を経て、配列が新規な抗体配列であった。
１．２ ＥＬＩＳＡスクリーニングによるクローン上澄みと抗原ｈＡＸＬ－ＥＣＤとの結合親和力
まず、３回目でスクリーニングしたクローンを、３００μＬの２－ＹＴ培地を含有する９６ウェルの深ウェルプレートに選別し、３７℃で一晩培養し、上澄みには、発現されたＦａｂを含有し、上澄みを取り、勾配希釈した後、２μｇ／ｍＬ ｈＡＸＬ－ＥＣＤがコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加え、その後、ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＦａｂを二次抗体（ヤギ抗ヒト－ＨＲＰ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３１４８２，１：６０００希釈）として検出し、シグナル値が高いほど、親和力が強いことを示す。結果は、図１Ａ－Ｇに示すとおりであり、図１Ａ～図１Ｇは、それぞれ本出願の７１個のクローンがｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合することができることを示し、ここで、５番、７番、１１番及び１４番のクローンの親和力が最も高く、５番、７番、１１番及び１４番のクローンを選択して実験を行い、Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４と命名した。ＥＬＩＳＡ測定法において、４つの抗体（Ｈｕ００１－５抗体、Ｈｕ００１－７抗体、Ｈｕ００１－１１抗体、Ｈｕ００１－１４抗体）のＦａｂは、いずれも良好な親和活性を示した。
シークエンシングにより、その分泌抗体に対応する重鎖可変領域ｃＤＮＡ配列及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡ配列が得られた。対応する抗体ＣＤＲ配列を下記表１に示した。
ＡＸＬ抗原調製：ヒト組換えＡＸＬタンパク質は、ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎから購入し、製品番号：Ｃ０２Ｂであった。
ＡＸＬ全ヒト抗体スクリーニングは、三優生物医薬（上海）有限公司に依頼して完了させた。合計四回スクリーニングを行い、四回目で得たクローンを選択してＥＬＩＳＡの陽性クローンのＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。最終的に、２３０４個のクローンから全部でｈＡＸＬ－ＥＣＤタンパク質に結合できる７１個の陽性クローンをスクリーニングした。シーケンス解析、ＥＬＩＳＡ結合後、最終的に４つのクローンの配列を選択して全長抗体を構築して、さらなる実験を行った。具体的な実施方法は、以下のとおりである。
１．１ 陽性クローンシーケンシング及び解析
初歩的なスクリーニング完了後、７１個のｈＡＸＬ－ＥＣＤタンパク質に結合できる陽性クローンに番号を付け、２μＬの菌液を２ｍＬの２ＹＴ培地に吸い取り、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養し、プラスミドを抽出して二代シーケンシングを行った。シーケンシング結果は、ＳｅｑＭａｎによって元のＡＢ１ファイルを統合し、比較し、非抗体遺伝子配列を除去し、抗体遺伝子整合版のｆａｓｔａファイルを生成した。その後、ＤＮＡ配列をＭＥＧＡ６によりアミノ酸配列に翻訳し、アミノ酸配列によりターミネーター、非通常配列などを含むアミノ酸配列を見つけ、アミノ酸配列のｆａｓｔａファイルを導出し、陽性抗体クローンの抗体軽鎖と重鎖配列を得、解析比較を経て、配列が新規な抗体配列であった。
１．２ ＥＬＩＳＡスクリーニングによるクローン上澄みと抗原ｈＡＸＬ－ＥＣＤとの結合親和力
まず、３回目でスクリーニングしたクローンを、３００μＬの２－ＹＴ培地を含有する９６ウェルの深ウェルプレートに選別し、３７℃で一晩培養し、上澄みには、発現されたＦａｂを含有し、上澄みを取り、勾配希釈した後、２μｇ／ｍＬ ｈＡＸＬ－ＥＣＤがコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加え、その後、ＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＦａｂを二次抗体（ヤギ抗ヒト－ＨＲＰ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，３１４８２，１：６０００希釈）として検出し、シグナル値が高いほど、親和力が強いことを示す。結果は、図１Ａ－Ｇに示すとおりであり、図１Ａ～図１Ｇは、それぞれ本出願の７１個のクローンがｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合することができることを示し、ここで、５番、７番、１１番及び１４番のクローンの親和力が最も高く、５番、７番、１１番及び１４番のクローンを選択して実験を行い、Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４と命名した。ＥＬＩＳＡ測定法において、４つの抗体（Ｈｕ００１－５抗体、Ｈｕ００１－７抗体、Ｈｕ００１－１１抗体、Ｈｕ００１－１４抗体）のＦａｂは、いずれも良好な親和活性を示した。
シークエンシングにより、その分泌抗体に対応する重鎖可変領域ｃＤＮＡ配列及び軽鎖可変領域ｃＤＮＡ配列が得られた。対応する抗体ＣＤＲ配列を下記表１に示した。
【表1】
【0120】
実施例２ 全長抗体の構築、発現及び精製
本実施例では、実施例１で得られたｈＡＸＬ－ＥＣＤ結合に対するブロッキング活性の良い２つのＦａｂ抗体をヒトＩｇＧ１サブタイプとして構築し、そのうち、軽鎖は、いずれもκ型であり、抗体型は、全ヒト抗体である。
２．１プラスミド構築
スクリーニングによって得られた抗体を含有する菌株から、ＰＣＲ増幅により抗体の軽、重鎖可変領域断片を取得し、相同組換え方法により、それぞれ軽鎖、重鎖定常領域断片を含有する真核発現ベクタープラスミドＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＫａｐｐａ又はＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＧ１ ＷＴ（図２）に構築し、完全抗体の軽、重鎖の全長遺伝子に組み合わせ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１－８に示される抗体重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードした。
構築した抗体の軽重鎖全長遺伝子を含むベクターを、それぞれ大腸菌ＴＯＰ１０（一意にＤＬ１０１０Ｓ）に形質転換して、３７℃で一晩培養し、エンドトキシンフリープラスミド抽出キット（ＯＭＥＧＡ、Ｄ６９５０－０１）を用いて、抗体軽重鎖プラスミドを抽出して真核発現に供した。
２．２抗体の発現精製
Ｅｘｐｉ２９３トランジェント発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、製品番号Ａ１４３５１０１）を通じて、候補抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－１１、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１４及び対照抗体ＣＣＴ３０１－３８（ＵＳ１００６６２３８参照）を発現させ、具体的な方法は下記の通りである。Ｅｘｐｉ２９３細胞を２５０ｍＬ培養フラスコにて培養し、トランスフェクションした当日、細胞密度が７×１０6個の生細胞／ｍＬ程度であり、細胞生存率＞９８％であることを確認し、３７℃で予熱したのＥｘｐｉ２９３発現培地を用いて細胞を６×１０6個細胞／ｍＬ（最終体積７５ｍＬ）の最終濃度に調整した。４℃で予冷した１ｍＬのＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を取って、標的のプラスミド（５０μｇ）を希釈するとともに、１ｍＬのＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を用いてトランスフェクション試薬７５μＬ ＦｅｃｔｏＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社、製品番号ＰＴ－１１６－００１）を希釈し、さらに両者を１ｍＬ等体積で混合して軽く均一に混合してＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地／プラスミドＤＮＡ混合液に調製し、室温で１５ｍｉｎインキュベートし、用意した細胞懸濁液にゆっくり加え、細胞培養シェイカーに置き、３７℃、５％ＣＯ2条件で培養した。トランスフェクション後２４ｈに、（最終濃度が０．６μＬ／ｍＬとなるように）培養系内にＦｅｃｔｏＰＲＯ ｂｏｏｓｔｅｒを添加し、引き続き３７℃、シェイカーと５％ＣＯ2条件下で培養した。トランスフェクションした後の５日目に、同じ体積のＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を培養系内にゆっくり添加し、１０日間トランスフェクションした後、細胞培養上澄みを収集し、４０００ｇで１０分間遠心した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアガロースカラム（ＧＥ社、製品番号２８９０３１３４）を用いて親和精製を行い、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で目的とするタンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで中和した後、３０ｋＤの限外濾過濃縮管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、製品番号ＵＦＣ９０１０９６）を通じて得られたタンパク質をＰＢＳ緩衝液に移入した。
４つの候補抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１、Ｈｕ００１－１４及び対照抗体ＣＣＴ３０１－３８は相対分子量が１５０ｋＤであり、純度がいずれも９０％以上であった。精製抗体のタンパク濃度を超微量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、製品番号ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ Ｃ）で測定し、測定したＡ２８０数値を抗体理論吸光係数で割った数値を抗体濃度値とし、分注して－８０℃に保管した。
本実施例では、実施例１で得られたｈＡＸＬ－ＥＣＤ結合に対するブロッキング活性の良い２つのＦａｂ抗体をヒトＩｇＧ１サブタイプとして構築し、そのうち、軽鎖は、いずれもκ型であり、抗体型は、全ヒト抗体である。
２．１プラスミド構築
スクリーニングによって得られた抗体を含有する菌株から、ＰＣＲ増幅により抗体の軽、重鎖可変領域断片を取得し、相同組換え方法により、それぞれ軽鎖、重鎖定常領域断片を含有する真核発現ベクタープラスミドＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＫａｐｐａ又はＡｂＶｅｃ－ｈＩｇＧ１ ＷＴ（図２）に構築し、完全抗体の軽、重鎖の全長遺伝子に組み合わせ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１－８に示される抗体重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードした。
構築した抗体の軽重鎖全長遺伝子を含むベクターを、それぞれ大腸菌ＴＯＰ１０（一意にＤＬ１０１０Ｓ）に形質転換して、３７℃で一晩培養し、エンドトキシンフリープラスミド抽出キット（ＯＭＥＧＡ、Ｄ６９５０－０１）を用いて、抗体軽重鎖プラスミドを抽出して真核発現に供した。
２．２抗体の発現精製
Ｅｘｐｉ２９３トランジェント発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、製品番号Ａ１４３５１０１）を通じて、候補抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－１１、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１４及び対照抗体ＣＣＴ３０１－３８（ＵＳ１００６６２３８参照）を発現させ、具体的な方法は下記の通りである。Ｅｘｐｉ２９３細胞を２５０ｍＬ培養フラスコにて培養し、トランスフェクションした当日、細胞密度が７×１０6個の生細胞／ｍＬ程度であり、細胞生存率＞９８％であることを確認し、３７℃で予熱したのＥｘｐｉ２９３発現培地を用いて細胞を６×１０6個細胞／ｍＬ（最終体積７５ｍＬ）の最終濃度に調整した。４℃で予冷した１ｍＬのＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を取って、標的のプラスミド（５０μｇ）を希釈するとともに、１ｍＬのＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を用いてトランスフェクション試薬７５μＬ ＦｅｃｔｏＰｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社、製品番号ＰＴ－１１６－００１）を希釈し、さらに両者を１ｍＬ等体積で混合して軽く均一に混合してＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地／プラスミドＤＮＡ混合液に調製し、室温で１５ｍｉｎインキュベートし、用意した細胞懸濁液にゆっくり加え、細胞培養シェイカーに置き、３７℃、５％ＣＯ2条件で培養した。トランスフェクション後２４ｈに、（最終濃度が０．６μＬ／ｍＬとなるように）培養系内にＦｅｃｔｏＰＲＯ ｂｏｏｓｔｅｒを添加し、引き続き３７℃、シェイカーと５％ＣＯ2条件下で培養した。トランスフェクションした後の５日目に、同じ体積のＥｘｐｉ２９３(TM)発現培地を培養系内にゆっくり添加し、１０日間トランスフェクションした後、細胞培養上澄みを収集し、４０００ｇで１０分間遠心した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアガロースカラム（ＧＥ社、製品番号２８９０３１３４）を用いて親和精製を行い、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で目的とするタンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで中和した後、３０ｋＤの限外濾過濃縮管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、製品番号ＵＦＣ９０１０９６）を通じて得られたタンパク質をＰＢＳ緩衝液に移入した。
４つの候補抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１、Ｈｕ００１－１４及び対照抗体ＣＣＴ３０１－３８は相対分子量が１５０ｋＤであり、純度がいずれも９０％以上であった。精製抗体のタンパク濃度を超微量分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社、製品番号ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ Ｃ）で測定し、測定したＡ２８０数値を抗体理論吸光係数で割った数値を抗体濃度値とし、分注して－８０℃に保管した。
【0121】
実施例３ ｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合する候補抗体の親和力試験
ｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合する候補抗体の親和力は、フローサイトメトリーにより検出された。Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の計４つのクローンを、それぞれ酸性（ＰＨ＝６．０）及び中性（ＰＨ＝７．４）の２種類の条件で検出した。
細胞培養フラスコにてＣＨＯ－ＡＸＬ細胞（上海▲シン▼湾生物科技有限公司によって構築されたもの）培地をＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）として培養し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて４８時間培養した後、上澄みを捨て、０．２５％トリプシンで細胞を消化収集した後、細胞を８００ｇの条件で３分間遠心した。上清を捨て、２％ＦＢＳ洗浄緩衝液細胞を再懸濁した（１０6／ｍＬ）。緩衝液のｐＨを調整して細胞をｐＨ６．０及びｐＨ７．４群に分け、各群にそれぞれ一次抗体（Ｈｕ００１－５抗体、Ｈｕ００１－７抗体、Ｈｕ００１－１１抗体、Ｈｕ００１－１４抗体及び陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８）を加え、室温で１５分間インキュベートした。上澄みを捨て、さらに蛍光標識二次抗体ＩｇＧ－Ｆｃ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、製品番号４０９３０４）を加え、引き続き室温で１５分間遮光インキュベートした後、機械的に検出した。シグナル値が高いほど、親和力が強いことを示した。
結果は、図３に示すとおりであり、それは、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の親和力をフローデータで示すグラフであり、ここで、図３Ａは、異なるｐＨにおいて、陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、図３Ｂ～３Ｅは、異なるｐＨにおいて、抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、本発明の抗体は、陽性対照に対してより高い親和力を有し、且つ酸性条件下では中性条件よりも高い結合能力を有することが明らかである。図から分かるように、Ｈｕ００１－５抗体実験群とＨｕ００１－１１抗体実験群の平均蛍光強度は、酸性条件下と中性条件下でともに陽性対照群の約４倍である。酸性条件下でのＨｕ００１－５抗体実験群とＨｕ００１－１１抗体実験群の平均蛍光強度は、いずれも中性条件下での強度値より高く、後者の約１．５倍である。これにより、Ｈｕ００１－５及びＨｕ００１－１１は、陽性対照に比べてＡＸＬに対してより高い親和力を有し、且つ酸性条件において中性条件よりも高い結合能力を有することが分かった。
ｈＡＸＬ－ＥＣＤに特異的に結合する候補抗体の親和力は、フローサイトメトリーにより検出された。Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の計４つのクローンを、それぞれ酸性（ＰＨ＝６．０）及び中性（ＰＨ＝７．４）の２種類の条件で検出した。
細胞培養フラスコにてＣＨＯ－ＡＸＬ細胞（上海▲シン▼湾生物科技有限公司によって構築されたもの）培地をＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）として培養し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて４８時間培養した後、上澄みを捨て、０．２５％トリプシンで細胞を消化収集した後、細胞を８００ｇの条件で３分間遠心した。上清を捨て、２％ＦＢＳ洗浄緩衝液細胞を再懸濁した（１０6／ｍＬ）。緩衝液のｐＨを調整して細胞をｐＨ６．０及びｐＨ７．４群に分け、各群にそれぞれ一次抗体（Ｈｕ００１－５抗体、Ｈｕ００１－７抗体、Ｈｕ００１－１１抗体、Ｈｕ００１－１４抗体及び陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８）を加え、室温で１５分間インキュベートした。上澄みを捨て、さらに蛍光標識二次抗体ＩｇＧ－Ｆｃ－ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、製品番号４０９３０４）を加え、引き続き室温で１５分間遮光インキュベートした後、機械的に検出した。シグナル値が高いほど、親和力が強いことを示した。
結果は、図３に示すとおりであり、それは、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の親和力をフローデータで示すグラフであり、ここで、図３Ａは、異なるｐＨにおいて、陽性対照ＣＣＴ３０１－３８抗体の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、図３Ｂ～３Ｅは、異なるｐＨにおいて、抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４の濃度による親和力の変化を示す模式図であり、本発明の抗体は、陽性対照に対してより高い親和力を有し、且つ酸性条件下では中性条件よりも高い結合能力を有することが明らかである。図から分かるように、Ｈｕ００１－５抗体実験群とＨｕ００１－１１抗体実験群の平均蛍光強度は、酸性条件下と中性条件下でともに陽性対照群の約４倍である。酸性条件下でのＨｕ００１－５抗体実験群とＨｕ００１－１１抗体実験群の平均蛍光強度は、いずれも中性条件下での強度値より高く、後者の約１．５倍である。これにより、Ｈｕ００１－５及びＨｕ００１－１１は、陽性対照に比べてＡＸＬに対してより高い親和力を有し、且つ酸性条件において中性条件よりも高い結合能力を有することが分かった。
【0122】
実施例４ 酸敏感抗体Ｈｕ００１－１１で調製したＣＡＲＴ細胞のインビトロ活性試験
Ｈｕ００１－１１と陽性対照のＣＡＲ細胞キメラ抗原受容体の構造は、図４Ａに示すとおりである。
Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞と陽性対照ＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞は、いずれも上海▲シン▼湾生物有限公司によって調製された。フローサイトメトリーにより、そのＣＡＲ発現陽性率と平均蛍光強度を測定した。図４Ｂに示すように、対照抗体ＣＣＴ３０１－３８は陽性率が３７．４％、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が７３５０であった。Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲは細胞陽性率が４６．９％、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が１９５７１であり、Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞のインビトロ形質導入効率は対照ＣＡＲＴ細胞よりはるかに高い。
９６ウェルプレートにＣＨＯ－ＡＸＬ細胞を標的細胞として加え（１０4細胞／ウェル）、調製したＨｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞をエフェクター細胞とし、標的細胞の数は、エフェクター細胞対標的細胞の比が２：１であるようにした。対照エフェクター細胞は、形質導入されていないＴ細胞（陰性対照）及びＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞（陽性対照）を含む。細胞培養は、ｐＨ６．８群とｐＨ７．４群に分けられた。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで２４時間共培養した後、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ－２、ＩＦＮ－γの含有量を検出し、ＣＡＲＴ細胞のインビトロ活性化の程度を決定した。
Ｅｌｉｓａを用いて培養細胞上澄みにおけるＩＬ－２（Ａｂｃｌｏｎａｌ社、製品番号ＲＫ００００２）及びＩＦＮ－γ（Ａｂｃｌｏｎａｌ社、製品番号ＲＫ０００１５）のタンパク質濃度を検出した。その結果は、図４Ｃ及びＤに示すとおりであり、ＣＨＯ－ＡＸＬのインビトロで共培養した状態で、Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞のＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌レベルは、陽性対照ＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞よりも高く、且つ酸性条件での分泌レベルがより高い。Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞は、インビトロ酸性条件下でより強く活性化され、良好な酸性環境走化性を有することが示唆された。
Ｈｕ００１－１１と陽性対照のＣＡＲ細胞キメラ抗原受容体の構造は、図４Ａに示すとおりである。
Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞と陽性対照ＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞は、いずれも上海▲シン▼湾生物有限公司によって調製された。フローサイトメトリーにより、そのＣＡＲ発現陽性率と平均蛍光強度を測定した。図４Ｂに示すように、対照抗体ＣＣＴ３０１－３８は陽性率が３７．４％、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が７３５０であった。Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲは細胞陽性率が４６．９％、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が１９５７１であり、Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞のインビトロ形質導入効率は対照ＣＡＲＴ細胞よりはるかに高い。
９６ウェルプレートにＣＨＯ－ＡＸＬ細胞を標的細胞として加え（１０4細胞／ウェル）、調製したＨｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞をエフェクター細胞とし、標的細胞の数は、エフェクター細胞対標的細胞の比が２：１であるようにした。対照エフェクター細胞は、形質導入されていないＴ細胞（陰性対照）及びＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞（陽性対照）を含む。細胞培養は、ｐＨ６．８群とｐＨ７．４群に分けられた。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターで２４時間共培養した後、ＥＬＩＳＡ法によりＩＬ－２、ＩＦＮ－γの含有量を検出し、ＣＡＲＴ細胞のインビトロ活性化の程度を決定した。
Ｅｌｉｓａを用いて培養細胞上澄みにおけるＩＬ－２（Ａｂｃｌｏｎａｌ社、製品番号ＲＫ００００２）及びＩＦＮ－γ（Ａｂｃｌｏｎａｌ社、製品番号ＲＫ０００１５）のタンパク質濃度を検出した。その結果は、図４Ｃ及びＤに示すとおりであり、ＣＨＯ－ＡＸＬのインビトロで共培養した状態で、Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞のＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌レベルは、陽性対照ＣＣＴ３０１－３８－ＣＡＲＴ細胞よりも高く、且つ酸性条件での分泌レベルがより高い。Ｈｕ００１－１１－ＣＡＲＴ細胞は、インビトロ酸性条件下でより強く活性化され、良好な酸性環境走化性を有することが示唆された。
【0123】
実施例５ Ｈｕ００１－１１抗体で媒介されたインビトロ神経膠腫細胞殺傷実験
本実験において、標的細胞は、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１細胞であった。エフェクター細胞は、ＣＤ１６－ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１６－Ｔ細胞、上海▲シン▼湾科技有限公司製）であった。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにてＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）でＵ２５１細胞系を培養し、１０5／ｍＬの細胞濃度で細胞を８ウェル培養チャンバーに置いた。１２時間後、それぞれＨｕ００１－１１抗体及びＣＤ１６－Ｔ細胞を加え、エフェクター細胞対標的細胞比はいずれも２：１であった。また、それぞれ形質導入されていないＴ細胞を加えて陰性対照とし、ＣＣＴ３０１－３８抗体及びＣＤ１６－Ｔ細胞を陽性対照とした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓ１６機器を用いて生細胞数と正の相関を有する細胞指数（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）をリアルタイムに検出した。この数値が高いほど、殺傷活性が低いことを示した。逆に、殺傷活性が高いことを示した。
結果は、図５に示すとおりであり、Ｈｕ００１－１１及びＣＤ１６－Ｔの組合せ群は、１２時間に、Ｕ２５１細胞に対する顕著な殺傷が現れ、２０時間にわたって、標的細胞をほぼ完全に殺傷した。陽性抗体対照群は、２４時間で完全な殺傷効果を示した。Ｈｕ００１－１１は神経膠腫Ｕ２５１細胞に対するより良好な殺傷活性を媒介したことが示唆された。
本実験において、標的細胞は、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１細胞であった。エフェクター細胞は、ＣＤ１６－ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ１６－Ｔ細胞、上海▲シン▼湾科技有限公司製）であった。３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにてＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）でＵ２５１細胞系を培養し、１０5／ｍＬの細胞濃度で細胞を８ウェル培養チャンバーに置いた。１２時間後、それぞれＨｕ００１－１１抗体及びＣＤ１６－Ｔ細胞を加え、エフェクター細胞対標的細胞比はいずれも２：１であった。また、それぞれ形質導入されていないＴ細胞を加えて陰性対照とし、ＣＣＴ３０１－３８抗体及びＣＤ１６－Ｔ細胞を陽性対照とした。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ Ｓ１６機器を用いて生細胞数と正の相関を有する細胞指数（ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘ）をリアルタイムに検出した。この数値が高いほど、殺傷活性が低いことを示した。逆に、殺傷活性が高いことを示した。
結果は、図５に示すとおりであり、Ｈｕ００１－１１及びＣＤ１６－Ｔの組合せ群は、１２時間に、Ｕ２５１細胞に対する顕著な殺傷が現れ、２０時間にわたって、標的細胞をほぼ完全に殺傷した。陽性抗体対照群は、２４時間で完全な殺傷効果を示した。Ｈｕ００１－１１は神経膠腫Ｕ２５１細胞に対するより良好な殺傷活性を媒介したことが示唆された。
【0124】
実施例６ 本発明の抗体で媒介されたインビトロ広スペクトル抗腫瘍活性実験
本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４によって媒介されたＣＤ１６－Ｔ細胞のインビトロでの他の固形腫瘍細胞（ヒト卵巣腺腫細胞ＳＫ－ＯＶ３及びヒト肺がん細胞ＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍、いずれもルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を有する）に対する殺傷実験も検証した。
使用された試薬及び器具は、特記しない限り、いずれもＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。具体的には、腫瘍細胞を９６ウェルプレート（１０4／ウェル）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した後、培地を除去して本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４を加え、細胞を１０群に分けた。即ち、陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８群、Ｈｕ００１－５抗体群、Ｈｕ００１－７抗体群、Ｈｕ００１－１１抗体群、Ｈｕ００１－１４抗体群、Ｈｕ００１－５抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－７抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－１１抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－１４抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、ＣＣＴ３０１－３８とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群であった。ＣＤ１６－Ｔ細胞と標的細胞との比率は２：１であった。引き続き３７℃で２４時間培養した後に、上澄みを除去し、各ウェルに５０μＬの１ｘ 細胞溶解液（製品番号Ｅ１５３１）を加えて室温で３０分間振とうしながらインキュベーションした後、各ウェルに３０μＬルシフェラーゼ分析基質（製品番号Ｅ１５１Ａ）を添加して３０秒間発色させ、蛍光値（ＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｎａｖｉｇａｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を機械的に検出した。
結果は、図６に示されるとおりであり、これら２種類の腫瘍細胞系に対して、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４を用いて、インビトロで殺傷を媒介する効率は、いずれも陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８の１．５倍以上であり、明らかな殺傷向上作用があり、本発明の抗ＡＸＬ抗体は、インビトロでより広いスペクトルの抗腫瘍活性を媒介することができることが示された。
図７は、抗体可変領域の配列方式を示す。
本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４によって媒介されたＣＤ１６－Ｔ細胞のインビトロでの他の固形腫瘍細胞（ヒト卵巣腺腫細胞ＳＫ－ＯＶ３及びヒト肺がん細胞ＮＣＩ－Ｈ２９２腫瘍、いずれもルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を有する）に対する殺傷実験も検証した。
使用された試薬及び器具は、特記しない限り、いずれもＰｒｏｍｅｇａ社から購入した。具体的には、腫瘍細胞を９６ウェルプレート（１０4／ウェル）に播種し、３７℃、５％ＣＯ2で２４時間培養した後、培地を除去して本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４を加え、細胞を１０群に分けた。即ち、陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８群、Ｈｕ００１－５抗体群、Ｈｕ００１－７抗体群、Ｈｕ００１－１１抗体群、Ｈｕ００１－１４抗体群、Ｈｕ００１－５抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－７抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－１１抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、Ｈｕ００１－１４抗体とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群、ＣＣＴ３０１－３８とＣＤ１６－Ｔ細胞との組合せ群であった。ＣＤ１６－Ｔ細胞と標的細胞との比率は２：１であった。引き続き３７℃で２４時間培養した後に、上澄みを除去し、各ウェルに５０μＬの１ｘ 細胞溶解液（製品番号Ｅ１５３１）を加えて室温で３０分間振とうしながらインキュベーションした後、各ウェルに３０μＬルシフェラーゼ分析基質（製品番号Ｅ１５１Ａ）を添加して３０秒間発色させ、蛍光値（ＧｌｏＭａｘ（登録商標） Ｎａｖｉｇａｔｏｒ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を機械的に検出した。
結果は、図６に示されるとおりであり、これら２種類の腫瘍細胞系に対して、本発明の抗ＡＸＬ抗体Ｈｕ００１－５、Ｈｕ００１－７、Ｈｕ００１－１１及びＨｕ００１－１４を用いて、インビトロで殺傷を媒介する効率は、いずれも陽性対照抗体ＣＣＴ３０１－３８の１．５倍以上であり、明らかな殺傷向上作用があり、本発明の抗ＡＸＬ抗体は、インビトロでより広いスペクトルの抗腫瘍活性を媒介することができることが示された。
図７は、抗体可変領域の配列方式を示す。
【0125】
以上、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明及び記述したが、本発明は上記特定の実施形態に限定されるものではないと理解すべきである。本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、本発明に対して様々な改良、修飾及び変更を行うことができ、これらの改良、修飾及び変更はいずれも本発明の範囲内に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】