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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】抗ＣＤ４０抗体、その抗原結合断片及び医薬用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240621BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240621BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240621BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240621BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240621BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240621BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240621BHJP
A61K 31/706 20060101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P37/06
A61P37/02
A61P25/00
A61K39/395 N
A61P43/00 121
A61K31/706
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579198
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2023-12-22
(86)【国際出願番号】 CN2022101780
(87)【国際公開番号】W WO2023274201
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】202110722124.0
(32)【優先日】2021-06-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516174219
【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】520392096
【氏名又は名称】上海盛迪医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＨＥＮＧＤＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１２８８ Ｈａｉｋｅ Ｒｏａｄ， Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｔｏｗｎ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】林 源
(72)【発明者】
【氏名】粟 ▲ルゥ▼
(72)【発明者】
【氏名】林 侃
(72)【発明者】
【氏名】廖 成
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB41
4C085BB42
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C085GG06
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA04
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA05
4C086ZA01
4C086ZB07
4C086ZB08
4C086ZC75
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
抗ＣＤ４０抗体、その抗原結合断片と医薬用途、及び抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、並びに疾患を治療・予防する方法、特に自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片であって、ａ－１）前記ＶＨは配列番号６７又は６８の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号６３～６６の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－２）前記ＶＨは配列番号１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－３）前記ＶＨは配列番号３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－４）前記ＶＨは配列番号５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－１）前記ＶＨは配列番号８１又は８２の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号７７～８０の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－２）前記ＶＨは配列番号７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－３）前記ＶＨは配列番号９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号１０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－４）前記ＶＨは配列番号１１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号１２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－５）前記ＶＨは配列番号１３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号１４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－６）前記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号１６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－７）前記ＶＨは配列番号１７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号１８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｃ）前記ＶＨは配列番号１９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号２０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｄ）前記ＶＨは配列番号２１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号２２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ここで、前記ＣＤＲはＫａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムに従って定義され、好ましくはＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義される、
抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
１）それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号７４、７５、７６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、 ２）それぞれ配列番号８８、８９、９０で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号９１、３７、９２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
３）それぞれ配列番号５１、５２、５３で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号５４、５５、５６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、或いは
４）それぞれ配列番号５７、５８、５９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号６０、６１、６２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、を含み、
好ましくは、１）中の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、
１－１）それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２９、３０、７３で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
１－２）それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２６、２７、２８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
１－３）それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号２９、２７、３２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、を含み、
好ましくは、２）中の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、
２－１）それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号８７、５０、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
２－２）それぞれ配列番号３３、３４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３６、３７、３８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
２－３）それぞれ配列番号３９、４０、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４２、３７、４３で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
２－４）それぞれ配列番号３９、４４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号４５、３７、４６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、
２－５）それぞれ配列番号３９、４７、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、それぞれ配列番号３６、３７、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と、を含み、
より好ましくは、１－１）中の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号２９で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、配列番号３０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、配列番号６９～７２の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、を含み、
より好ましくは、２－１）中の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、
それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号８３～８６の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、配列番号５０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、配列番号４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、を含む、
請求項１に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
組換え抗体、ウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片である、請求項１又は２に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記ヒト化抗体又はその抗原結合断片の重鎖フレームワーク領域はＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ４－３０－４＊０２、ＩＧＨＶ４－４＊０８、ＩＧＨＪ１＊０１に由来し、且つ／又は、軽鎖フレームワーク領域はＩＧｋＶ１－１３＊０２、ＩＧｋＶ１－９＊０１、ＩＧｋＶ１－６＊０１、ＩＧＫＪ４＊０１に由来し、好ましくは、重鎖フレームワーク領域のＦＲ１～ＦＲ３はＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ４－３０－４＊０２、ＩＧＨＶ４－４＊０８に由来し、重鎖フレームワーク領域のＦＲ４はＩＧＨＪ１＊０１に由来し、軽鎖フレームワーク領域のＦＲ１～ＦＲ３はＩＧｋＶ１－１３＊０２、ＩＧｋＶ１－９＊０１、ＩＧｋＶ１－６＊０１に由来し、軽鎖フレームワーク領域のＦＲ４はＩＧＫＪ４＊０１に由来する、
請求項３に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項5】
Ａ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、Ａ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－６）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－７）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－８）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｃ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、或いは
Ｄ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する、
請求項１～４の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を更に含み、好ましくは、前記ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体であり、より好ましくは、前記Ｆｃ領域はＮ２９７Ａ変異を含むＩｇＧ１のＦｃ領域であり、又はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅの何れか１つ又は複数の変異を有するＩｇＧ１のＦｃ領域である、前記請求項の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
前記抗原結合断片はｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である、前記請求項の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９３若しくは９７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、或いは重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９５若しくは９８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する、
前記請求項の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
ｉ）１０ ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合することと、ｉｉ）明らかなアゴニスト活性がないことと
の少なくとも一項を有する、
請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離したポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項12】
請求項１０に記載のポリヌクレオチド又は請求項１１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項13】
請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む、ＣＤ４０結合分子。
【請求項14】
請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片と、少なくとも１種の薬用可能な賦形剤、希釈剤又はベクターとを含む、医薬組成物。
【請求項15】
タクロリムスを更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
自己免疫疾患を治療する方法であって、必要とする対象に治療有効量の請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項１４に記載の医薬組成物を投与することを含み、
前記自己免疫疾患は、シェーグレン症候群、多発性硬化症又はエリテマトーデスが好ましく、全身性エリテマトーデスがより好ましい、
方法。
【請求項17】
自己免疫疾患を治療する薬剤の調製に用いられる、請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の用途であって、前記自己免疫疾患は、シェーグレン症候群、多発性硬化症又はエリテマトーデスが好ましく、全身性エリテマトーデスがより好ましい、
用途。
【請求項18】
移植片対宿主病を治療するか又は移植拒絶反応を緩和する方法であって、必要とする対象に治療有効量の請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片、或いは請求項１４～１５中の何れか一項に記載の医薬組成物を投与することを含み、
前記移植は、固形臓器移植が好ましく、肝、腎、心臓、肺の移植がより好ましい、
方法。
【請求項19】
請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をタクロリムスと組み合わせて、移植片対宿主病を治療するか又は移植拒絶反応を緩和する薬剤の調製に用いる用途であって、前記移植は、固形臓器移植が好ましく、肝、腎、心臓、肺の移植がより好ましい、
用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２１年６月２８日に提出された出願番号が２０２１１０７２２１２４．０である中国特許出願の優先権を主張する。
【0002】
本開示は、バイオ医薬分野、特にＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路に関連する疾患を治療又は介入する分野に関する。具体的には、本開示はＣＤ４０抗体、その抗原結合断片及びその医薬組成物、並びに自己免疫疾患を治療するための方法及び関連する製薬用途に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、細胞膜表面に位置するＩ型膜貫通糖タンパク質であり、分子量が約４８ ｋＤａで、免疫系において重要な役割を果たしている。ＣＤ４０は、Ｂ細胞、樹状細胞、単核細胞とマクロファージなどの種々の免疫細胞に発現され、血小板にも発現され、条件によっては、好酸球と実質細胞に発現され得る。ＣＤ４０の天然リガンドはＣＤ１５４又はＣＤ４０Ｌであり、活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、血小板とＢ細胞を含む様々な細胞種類において発現を誘導可能なＩＩ型膜貫通タンパク質である（Ｐｕｃｉｎｏ Ｖ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
【0004】
ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合した後、ＴＲＡＦを動員し、ＮＦ－ｋＢ、ＪＮＫとＭＡＰＫ経路を介して下流シグナル伝達を媒介し、免疫細胞の活性化と増殖、炎症性因子とケモカインの分泌などを含む様々な細胞種類依存的活性化結果を果たすことができる（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ ＲＨ ｅｔ ａｌ．，２００７）。例えば、前記経路を介するシグナル伝達は、適応免疫系の幾つかの重要なエフェクター機能に必要であり、原発性Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ）、Ｂ細胞増殖、胚中心（ＧＣ）形成、免疫グロブリン（Ｉｇ）のアイソタイプの変換、体細胞変異、及び記憶Ｂ細胞とプラズマ細胞の分化が含まれる（Ｆｏｙ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｆｏｙ ＴＭ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。Ｂ細胞に影響を及ぼす以外、ＣＤ４０経路の活性化は、ＤＣの成熟と機能及び単核細胞とマクロファージの生存とサイトカインの分泌に重要なシグナルを提供する（Ｃａｕｘ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
【0005】
ＣＤ４０シグナル伝達経路の機能調節障害は、自己免疫疾患をもたらすことができる（Ｋａｒｎｅｌｌ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌシグナル伝達経路は、炎症組織における実質細胞の機能に関与することが見出された：腎、唾液腺及び皮膚などの部位に由来し、ケモカインを分泌できる活性化した上皮細胞はＣＤ４０に応答することが可能である。更に、ＣＤ４０又はＣＤ４０Ｌは、アテローム性動脈硬化患者及び前臨床アテローム性動脈硬化モデルの病変部位における発現レベルが何れも上昇される。ＣＤ４０は、マトリックス分解酵素の発現を刺激・誘導し、アテローム性動脈硬化の病原性に関連する細胞種類、例えば、内皮細胞、平滑筋細胞とマクロファージなどにおける組織因子の発現を促進することができる（Ｍｉｃｈｅｌ ＮＡ ｅｔ ａｌ．、２０１７）。ＣＤ４０経路は、ＩＬ－１、ＩＬ－６とＩＬ－８などの炎症性因子、及び細胞間接着分子－１（ＩＣＡＭ－１）、Ｅ－セレクチン（Ｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ）と血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）などの接着分子の生成をアップレギュレートする。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用は、更に移植拒絶の予防に使用され、アカゲザルの腎臓同種移植研究にキメラ抗ＣＤ４０拮抗薬ｃｈ５Ｄ１２を使用することにより、ＣＤ４０の拮抗作用は、病状の改善に十分であるとともに、平均生存期間を１００日間以上延長することが明らかになる。ｃｈ５Ｄ１２を抗ＣＤ８６抗体と組み合わせて、同種移植研究の開始時のみに投与し、その後シクロスポリンで延長治療を行う場合、４年を超える平均生存期間が実現され、これにより、この組み合わせは、免疫寛容を潜在的に誘導し得ることが示されている（Ｈａａｎｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。
【0006】
多くの前臨床研究により、Ｔ細胞依存性免疫応答の促進におけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用の重要な役割の証拠が提供されている。従って、ＣＤ４０シグナル伝達の遮断は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群などの疾患にいて病原性自己免疫応答を阻害するために適切且つ必要な治療戦略であると考えられている。現在、そのような疾患を治療するために何れの抗ＣＤ４０抗体も承認されていない。従って、この分野では、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌの相互作用に介入し、ＣＤ４０シグナル伝達を遮断するために使用可能な治療剤が依然として切望されている。本開示は、そのような治療用ヒト化抗ＣＤ４０抗体を提供し、それは、ＣＤ４０に特異的に結合可能であり、ＣＤ４０シグナル伝達経路関連疾患、特に自己免疫疾患への介入又は治療のための優れた抗原結合特異性、親和性、薬学動態と薬力学的特性を有する。また、治療用ヒト化抗ＣＤ４０抗体とタクロリムスを組み合わせて移植片対宿主病の治療又は移植拒絶反応の緩和に用いることを提供する。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、ポリヌクレオチドをコードする抗ＣＤ４０抗体とその抗原結合断片、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、上記抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、それらの自己免疫疾患（移植片対宿主病、移植拒絶を含む）への治療又は介入のための方法及び関連する製薬用途を提供する。
【0008】
抗ＣＤ４０抗体、その抗原結合断片
一態様によれば、幾つかの実施形態において、本開示は、
配列番号２３で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１と、
配列番号２４で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ２と、
配列番号２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ３と、
ＱＸ１ＳＥＤＩＳＳＮＬＸ２（配列番号７４）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１がＡ又はＳから選ばれ、Ｘ２がＡ又はＳから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ１と、
Ｘ３ＡＳＮＬＡＳ（配列番号７５）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ３がＡ又はＰから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ２と、
ＱＧＸ４ＹＷＸ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８ＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７６）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ４がＡ又はＧから選ばれ、Ｘ５がＳ又はＴから選ばれ、Ｘ６がＳ又はＧから選ばれ、Ｘ７がＴ又はＳから選ばれ、Ｘ８がＮ又はＹから選ばれ、Ｘ９がＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０がＶ又はＧから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体及びその抗原結合断片を提供する。
一態様によれば、幾つかの実施形態において、本開示は、
配列番号２３で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１と、
配列番号２４で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ２と、
配列番号２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ３と、
ＱＸ１ＳＥＤＩＳＳＮＬＸ２（配列番号７４）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１がＡ又はＳから選ばれ、Ｘ２がＡ又はＳから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ１と、
Ｘ３ＡＳＮＬＡＳ（配列番号７５）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ３がＡ又はＰから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ２と、
ＱＧＸ４ＹＷＸ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８ＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７６）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ４がＡ又はＧから選ばれ、Ｘ５がＳ又はＴから選ばれ、Ｘ６がＳ又はＧから選ばれ、Ｘ７がＴ又はＳから選ばれ、Ｘ８がＮ又はＹから選ばれ、Ｘ９がＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０がＶ又はＧから選ばれる、軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体及びその抗原結合断片を提供する。
【0009】
幾つかの具体的な実施形態において、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号２６、２７、２８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、配列番号２９で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、配列番号３０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２、ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７３）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ９がＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号２９、２７、３２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号２６、２７、２８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、配列番号２９で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、配列番号３０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２、ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７３）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ９がＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号２９、２７、３２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0010】
幾つかの具体的な実施形態において、
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号２９で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、配列番号３０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、配列番号６９～７２の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号２３、２４、２５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号２９で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、配列番号３０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、配列番号６９～７２の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0011】
幾つかの具体的な実施形態において、本開示は、上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の何れか１つ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0012】
別の態様によれば、幾つかの実施形態において、本開示は、
ＳＹＧＶＸ１１（配列番号８８）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１１がＳ又はＴから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ１と、
Ｘ１２ＩＸ１３ＳＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＹＹＡＸ１７ＷＡＸ１８Ｓ（配列番号８９）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１２がＡ又はＧから選ばれ、Ｘ１３がＧ又はＡから選ばれ、Ｘ１４がＴ、Ｓ又はＤから選ばれ、Ｘ１５がＴ又はＳから選ばれ、Ｘ１６がＴ又はＡから選ばれ、Ｘ１７がＳ、Ｎから選ばれ、Ｘ１８がＫ又はＲから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ２と、
ＧＧＩＴＸ１９ＹＡＸ２０（配列番号９０）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１９がＡ又はＶから選ばれ、Ｘ２０がＩ又はＭから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ３と、
ＱＡＳＸ２１Ｘ２２ＩＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号９１）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２１がＱ又はＥから選ばれ、Ｘ２２がＳ又はＤから選ばれ、Ｘ２３がＳ又はＴから選ばれ、Ｘ２４がＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ１と、
配列番号３７で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、
ＱＳＹＸ２６Ｘ２７ＳＸ２８Ｘ２９ＴＸ３０（配列番号９２）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２６がＦ又はＹから選ばれ、Ｘ２７がＳ、Ｄ又はＮから選ばれ、Ｘ２８がＳ又はＦから選ばれ、Ｘ２９がＳ、Ｔ又はＹから選ばれ、Ｘ３０がＶ又はＩから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
ＳＹＧＶＸ１１（配列番号８８）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１１がＳ又はＴから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ１と、
Ｘ１２ＩＸ１３ＳＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＹＹＡＸ１７ＷＡＸ１８Ｓ（配列番号８９）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１２がＡ又はＧから選ばれ、Ｘ１３がＧ又はＡから選ばれ、Ｘ１４がＴ、Ｓ又はＤから選ばれ、Ｘ１５がＴ又はＳから選ばれ、Ｘ１６がＴ又はＡから選ばれ、Ｘ１７がＳ、Ｎから選ばれ、Ｘ１８がＫ又はＲから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ２と、
ＧＧＩＴＸ１９ＹＡＸ２０（配列番号９０）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ１９がＡ又はＶから選ばれ、Ｘ２０がＩ又はＭから選ばれる重鎖ＨＣＤＲ３と、
ＱＡＳＸ２１Ｘ２２ＩＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号９１）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２１がＱ又はＥから選ばれ、Ｘ２２がＳ又はＤから選ばれ、Ｘ２３がＳ又はＴから選ばれ、Ｘ２４がＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ１と、
配列番号３７で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２と、
ＱＳＹＸ２６Ｘ２７ＳＸ２８Ｘ２９ＴＸ３０（配列番号９２）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２６がＦ又はＹから選ばれ、Ｘ２７がＳ、Ｄ又はＮから選ばれ、Ｘ２８がＳ又はＦから選ばれ、Ｘ２９がＳ、Ｔ又はＹから選ばれ、Ｘ３０がＶ又はＩから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0013】
幾つかの具体的な実施形態において、
それぞれ配列番号３３、３４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号３６、３７、３８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４０、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号４２、３７、４３で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号４５、３７、４６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４７、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号３６、３７、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、ＱＡＳＱＳＩＳＸ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号８７）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２４がＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ１、配列番号５０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２、配列番号４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号３３、３４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号３６、３７、３８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４０、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号４２、３７、４３で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４４、３５で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号４５、３７、４６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４７、４１で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号３６、３７、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、
それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、ＱＡＳＱＳＩＳＸ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号８７）で示される配列を含み、そのうち、Ｘ２４がＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５がＶ又はＧから選ばれる軽鎖ＬＣＤＲ１、配列番号５０で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２、配列番号４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ３、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0014】
幾つかの具体的な実施形態において、
それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号８３～８６の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、それぞれ配列番号５０、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２及び軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号３９、４７、４９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と、配列番号８３～８６の何れか１つで示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１と、それぞれ配列番号５０、４８で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ２及び軽鎖ＬＣＤＲ３と、
を含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0015】
幾つかの具体的な実施形態において、本開示は、上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の何れか１つ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0016】
別の態様によれば、幾つかの実施形態において、本開示は、それぞれ配列番号５１、５２、５３で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号５４、５５、５６で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、を含む抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0017】
幾つかの実施形態において、本開示は、それぞれ配列番号５７、５８、５９で示される配列を含む重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び／又は、それぞれ配列番号６０、６１、６２で示される配列を含む軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、を含む抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0018】
幾つかの具体的な実施形態において、本開示は、上記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の何れか１つ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0019】
別の態様において、本開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのうち、
ａ－１）上記ＶＨは配列番号１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－２）上記ＶＨは配列番号３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－３）上記ＶＨは配列番号５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－４）上記ＶＨは配列番号６７又は６８の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６３～６６の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－１）上記ＶＨは配列番号７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－２）上記ＶＨは配列番号９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－３）上記ＶＨは配列番号１１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－４）上記ＶＨは配列番号１３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－５）上記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－６）上記ＶＨは配列番号１７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－７）上記ＶＨは配列番号８１又は８２の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号７７～８０の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｃ）上記ＶＨは配列番号１９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号２０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｄ）上記ＶＨは配列番号２１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
そのうち、上記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義される、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義される。
ａ－１）上記ＶＨは配列番号１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－２）上記ＶＨは配列番号３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－３）上記ＶＨは配列番号５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ａ－４）上記ＶＨは配列番号６７又は６８の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号６３～６６の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－１）上記ＶＨは配列番号７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－２）上記ＶＨは配列番号９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－３）上記ＶＨは配列番号１１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－４）上記ＶＨは配列番号１３で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１４で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－５）上記ＶＨは配列番号１５で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１６で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－６）上記ＶＨは配列番号１７で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号１８で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｂ－７）上記ＶＨは配列番号８１又は８２の何れか１つで示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号７７～８０の何れか１つで示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
ｃ）上記ＶＨは配列番号１９で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは配列番号２０で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、或いは
ｄ）上記ＶＨは配列番号２１で示されるＶＨ中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、上記ＶＬは配列番号２２で示されるＶＬ中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含み、
そのうち、上記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義される、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を提供する。幾つかの具体的な実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義される。
【0020】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は組換え抗体である。
【0021】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、ウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体又はその抗原結合断片である。
【0022】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、ヒト化抗体である時に、重鎖フレームワーク領域がＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ４－３０－４＊０２、ＩＧＨＶ４－４＊０８、ＩＧＨＪ１＊０１に由来し、且つ／又は、軽鎖フレームワーク領域がＩＧｋＶ１－１３＊０２、ＩＧｋＶ１－９＊０１、ＩＧｋＶ１－６＊０１、ＩＧＫＪ４＊０１に由来する。例えば、重鎖フレームワーク領域のＦＲ１～ＦＲ３はＩＧＨＶ２－２６＊０１、ＩＧＨＶ４－３０－４＊０２、ＩＧＨＶ４－４＊０８、重鎖フレームワーク領域のＦＲ４がＩＧＨＪ１＊０１に由来し、軽鎖フレームワーク領域のＦＲ１～ＦＲ３はＩＧｋＶ１－１３＊０２、ＩＧｋＶ１－９＊０１、ＩＧｋＶ１－６＊０１、軽鎖フレームワーク領域のＦＲ４がＩＧＫＪ４＊０１に由来する。
【0023】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片はＶＨとＶＬを含み、そのうち、
Ａ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－６）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－７）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－８）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｃ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、或いは
Ｄ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する。
Ａ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ａ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６３～６６の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－１）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－２）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－３）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－４）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１３で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－５）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１５で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－６）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－７）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｂ－８）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号８２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号７７～８０の何れか１つで示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、
Ｃ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１９で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２０で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、或いは
Ｄ）ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２１で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２２で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する。
【0024】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合断片であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４抗体又はその抗原結合断片であり、例えばＮ２９７Ａ変異を有するＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片であり、例えばＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴとＴ２５６Ｅのうちの１つ若しくはそれらの任意の組み合わせを有するＩｇＧ１抗体又はその抗原結合断片である。
【0025】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノ抗体、ペプチド抗体ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体及び多重特異性抗体（二重特異性抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙとｔｅｔｒａｂｏｄｙ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）であり、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片である。
【0026】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体の抗原結合断片の重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９３若しくは９７で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９４で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、或いは
重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９５若しくは９８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する。
重鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９５若しくは９８で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、軽鎖全長のアミノ酸配列は配列番号９６で示されるか又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する。
【0027】
上述したような「少なくとも９０％の同一性」は、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を含む。
【0028】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域は、０～１０個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸変化を有し、軽鎖可変領域は０～１０個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のアミノ酸変化を有する。幾つかの具体的な実施形態において、上記アミノ酸変化は、保存的取替、置換若しくは修飾、及び／又は機能に影響を及ぼしない欠失、追加である。
【0029】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片と同じエピトープに結合するか又は競合して結合する抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片を提供する。
【0030】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片のＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０）との結合を遮断する抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片を提供する。
【0031】
幾つかの実施形態において、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０）との結合が上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片によって遮断される抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片を提供する。
【0032】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片は、
（ｉ）１０ ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合することと、
（ｉｉ）明らかなアゴニスト活性がないことと
の少なくとも一項を有する。
（ｉ）１０ ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合することと、
（ｉｉ）明らかなアゴニスト活性がないことと
の少なくとも一項を有する。
【0033】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片は、ＣＤ４０リガンドとＣＤ４０の結合を少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％低減させる。
【0034】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又は抗原結合断片は、１０－７ Ｍ、１０－８ Ｍ、１０－９ Ｍ、１０－１０ Ｍ、１０－１１ Ｍ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合する。
【0035】
幾つかの実施形態において、上記の何れかの抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含むＣＤ４０結合分子を提供する。
【0036】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む複合体を提供する。例えば、上記複合体は、抗体薬物複合体である。
【0037】
ポリヌクレオチド及びベクター
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離したポリヌクレオチドを提供する。上記単離したポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。本開示の幾つかの実施形態によれば、本開示のポリヌクレオチドは単離したポリヌクレオチドである。
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をコードする、単離したポリヌクレオチドを提供する。上記単離したポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。本開示の幾つかの実施形態によれば、本開示のポリヌクレオチドは単離したポリヌクレオチドである。
【0038】
本開示は、上記の本開示の何れかの抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ分子を更に提供する。
【0039】
本開示のポリヌクレオチドは、ベクターの形態であってもよく、ベクター中に存在してもよく、及び／又はベクターの一部であってもよく、当該ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターである。ベクターは、特に発現ベクター、即ち、ＶＥＧＦ結合分子又はその複合体のインビトロ及び／若しくはインビボで（即ち、適切な宿主細胞、宿主生物、及び／若しくは発現系で）の発現を提供可能なベクターであってもよい。当該発現ベクターは通常、少なくとも１つの本開示のポリヌクレオチドを含み、それは、１つ又は複数の適切な発現調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）に操作可能に連結される。特定の宿主における発現に対して上記要素及びその配列を選択することは、当業者の常識である。本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の発現に有用又は必要な調節要素及び他の要素は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、組み込み因子、選択マーカー、リーダー配列、レポーター遺伝子である。
【0040】
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のポリペプチドのアミノ酸配列についての情報に基づき、既知の方法（例えば、自動ＤＮＡ合成及び／又は組換えＤＮＡ技術）により調製若しくは取得されてもよく、及び／又は適切な天然源から単離されてもよい。
【0041】
宿主細胞
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片若しくは複合体、或いは本開示のポリヌクレオチド又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片若しくは複合体、或いは本開示のポリヌクレオチド又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。幾つかの実施形態において、宿主細胞は細菌細胞、真菌細胞又は哺乳動物細胞である。
【0042】
細菌細胞は、例えば、グラム陰性菌株（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）菌株及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株）とグラム陽性菌株（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）菌株及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌株）の細胞を含む。
【0043】
真菌細胞は、例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種の細胞を含み、又はサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、サッカロミセスセレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びピキアメタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ））及びハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）の種の細胞を含む。
【0044】
哺乳動物細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などを含む。
【0045】
しかしながら、本開示は、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞及びこの分野における異種タンパク質を発現するための任意の他の細胞を使用してもよい。
【0046】
一実施形態において、本開示に使用される宿主細胞は、完成した植物又は動物個体に発達することができない。
【0047】
調製方法
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を調製する方法を提供し、それは、
－ 本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で、本開示の宿主細胞を培養することと、
－ 培養物から、宿主細胞によって発現された抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を回収することと、を含み、且つ
－ 任意選択的に、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を更に精製及び／又は修飾することを含む。
本開示は、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を調製する方法を提供し、それは、
－ 本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で、本開示の宿主細胞を培養することと、
－ 培養物から、宿主細胞によって発現された抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を回収することと、を含み、且つ
－ 任意選択的に、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を更に精製及び／又は修飾することを含む。
【0048】
本開示は、薬物を本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片に複合又は修飾することを含む、複合体の調製方法を提供する。
【0049】
本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、上記のような細胞において細胞内方式で（例えば、細胞質において、ペリプラズムにおいて、又は封入体において）産生され、次に宿主細胞から単離され、そして任意選択的に更に精製されてもよく、或いは、細胞外方式で（例えば、宿主細胞を培養する培地において）産生され、次に培地から単離され、そして任意選択的に更に精製されてもよい。例えば、調整された緩衝液を含むＡ又はＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで精製し、非特異的に結合した成分を洗い流し、更にＰＨ勾配法により、結合した抗体を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより検出して収集する。選択的に、通常の方法によりろ過して濃縮する。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに－７０℃などで冷凍し、又は凍結乾燥する。
【0050】
組換えてポリペプチドを産生するための方法及び試薬、例えば、特定の好適な発現ベクター、形質転換又はトランスフェクション方法、選択マーカー、タンパク質発現を誘導する方法、培養条件などは、この分野において既知のものである。同様に、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片若しくは複合体を製造する方法に適用されるタンパク質の単離・精製技術は、当業者に周知のものである。
【0051】
組成物
本開示は、上記の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を提供する。例えば、治療若しくは緩和有効量の上記のような抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片と、少なくとも１種の薬用可能な賦形剤、希釈剤又はベクターとを含む医薬組成物を提供する。
本開示は、上記の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を提供する。例えば、治療若しくは緩和有効量の上記のような抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片と、少なくとも１種の薬用可能な賦形剤、希釈剤又はベクターとを含む医薬組成物を提供する。
【0052】
幾つかの具体的な実施形態において、上記医薬組成物の単位用量には、０．０１～９９ ｗｔ％の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含んでもよく、或いは、医薬組成物の単位用量における抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の含有量は０．１～２０００ ｍｇであり、幾つかの具体的な実施形態では１～１０００ ｍｇである。
【0053】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片と、１種若しくは複数種の別の免疫抑制剤との組み合わせ又は組成物を提供する。上記組成物は、例えば、医薬組成物である。選択的に、上記医薬組成物は、薬学可能な賦形剤、希釈剤又はベクターを更に含んでもよい。
【0054】
本開示の一実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片、タクロリムス、及び薬学可能な賦形剤、希釈剤又はベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0055】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む製品を提供する。選択的に、製品は、容器及びラベルを含む。容器は、例えば、バイアル、注射器及び試験管である。容器は、病状の治療に有効な組成物を収容する。容器における又は容器につながるラベルは、上記組成物が選択された病状の治療に使用されることを示す。組成物には、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片が含まれている。上記製品は、疾患の治療に有効なタクロリムスを収容する第２の容器を更に含んでもよい。
【0056】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片及びタクロリムスを含む製品を提供する。
【0057】
治療方法及び製薬用途
本開示は、疾患若しくは病状の治療・介入・予防・診断に用いられる上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の方法を提供する。
本開示は、疾患若しくは病状の治療・介入・予防・診断に用いられる上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の方法を提供する。
【0058】
具体的に、幾つかの実施形態において、本開示は、自己免疫疾患、移植片対宿主病を治療若しくは緩和するか又は移植拒絶反応を緩和するための薬剤の調製における、本開示によって記載される抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の用途を提供する。
【0059】
更に、幾つかの実施形態において、本開示は、自己免疫疾患、移植片対宿主病を治療若しくは緩和するか又は移植拒絶反応を緩和するための薬剤の調製における、本開示によって記載される抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片と１種若しくは複数種の他の免疫抑制剤との組み合わせの用途を提供する。
【0060】
本開示の実施形態において、本開示によって記載される抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数種の他の免疫抑制剤と個別に、連続的に、又は同時に投与することができる。
【0061】
本開示の実施形態において、本開示によって記載される抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、１種又は複数種の他の免疫抑制剤の前に、後に又は同時に投与することができる。
【0062】
具体的に、本開示は、自己免疫疾患、移植片対宿主病を治療若しくは緩和するか又は移植拒絶反応を緩和するための薬剤の調製における、本開示によって記載される抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片とタクロリムスとの組み合わせの用途を提供する。幾つかの実施形態において、移植片対宿主病、臓器移植拒絶を改善又は治療する方法及び関連する製薬用途を提供し、対象に改善又は治療有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片或いはその医薬組成物を投与することを含む。
【0063】
幾つかの実施形態において、自己免疫性疾患、炎性疾患を改善又は治療する方法及び関連する製薬用途を提供し、対象に改善又は治療有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片或いはその医薬組成物を投与することを含む。
【0064】
幾つかの実施形態において、ＣＤ４０関連障害疾患を治療する方法及び関連する製薬用途を提供し、幾つかの実施形態において、ＣＤ４０関連障害細胞の成長又は分化を阻害する方法及び関連する製薬用途を提供し、幾つかの実施形態において、ヒトＣＤ４０抗原を発現する細胞の成長及び／又は分化を阻害する方法及び関連する製薬用途を提供し、幾つかの実施形態において、対象におけるＢ細胞による抗体の産生を阻害する方法及び関連する製薬用途を提供し、幾つかの実施形態において、免疫障害疾患を治療する方法及び関連する製薬用途を提供する。上記方法は、何れも、対象又は細胞に治療若しくは阻害有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片或いはその医薬組成物を投与することを含む。
【0065】
幾つかの実施形態において、末梢Ｂ細胞の枯渇を誘導する方法及び関連する製薬用途を提供し、対象に誘導有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片或いはその医薬組成物を投与することを含む。
【0066】
幾つかの実施形態において、疾患又は病状を治療・緩和する方法及び関連する製薬用途を提供し、必要とする対象に有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、上記疾患又は病状はＣＤ４０に関連してもしなくてもよく、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、自己免疫性脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎）、内分泌性眼疾患、ブドウ膜網膜炎、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、グレーブス病、糸球体腎炎、自己免疫性肝疾患、炎症性腸疾患（例えば、クローン病又は潰瘍性結腸炎）、過敏症、アナフィラキシー反応、シェーグレン症候群、１型糖尿病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、線維筋痛症、多発性筋炎、皮膚筋炎、炎症性筋炎、多発性内分泌不全、シュミット症候群（Ｓｃｈｍｉｄｔ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫性ブドウ膜炎、アジソン病、副腎炎、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、ループス肝炎、アテローム性動脈硬化症、亜急性皮膚エリテマトーデス、副甲状腺機能低下症、ドレスラー症候群（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病、溶血性貧血、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ ａｒｃａｔａ）、類天疱瘡、強皮症、全身性進行性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、食道蠕動障害、手指硬化症と毛細血管拡張症）、男性と女性の自己免疫性不妊症、強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇｓｐｏｎｄｏｌｙｔｉｓ）、潰瘍性結腸炎、混合性結合組織病、結節性多発動脈炎、全身性壊死性血管炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性鼻炎、グッドパスチャー症候群（Ｇｏｏｄ ｐａｓｔｕｒｅ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シャーガス病（Ｃｈａｇａｓ’ｄｉｓｅａｓｅ）、サルコイドーシス、リウマチ熱、喘息、反復流産、抗リン脂質症候群、農夫肺、多形性紅斑、心術後症候群、クッシング症候群（Ｃｕｓｈｉｎｇ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫性慢性活動性肝炎、鳥飼育者肺、中毒性表皮壊死症、アルポート症候群（Ａｌｐｏｒｔ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肺胞炎、アレルギー性肺胞炎、線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、輸血反応、高安動脈炎（Ｔａｋａｙａｓｕ’ｓ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、リウマチ性多発筋痛、側頭動脈炎、住血吸虫症、巨細胞動脈炎、回虫症、アスペルギルス症、サムプター症候群（Ｓａｍｐｔｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、湿疹、リンパ腫様肉芽腫症、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、カプラン症候群（Ｃａｐｌａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、デング熱、脳脊髄炎、心内膜炎、心内膜心筋線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シャルマン症候群（Ｓｈｕｌｍａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、フェルティ症候群（Ｆｅｌｔｙ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、糸状虫症、毛様体炎、慢性毛様体炎、異色性毛様体炎、フックス毛様体炎（Ｆｕｃｈ’ｓ ｃｙｃｌｉｔｉｓ）、ＩｇＡ腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ ｐｕｒｐｕｒａ）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、心筋症、イートン・ランバート症候群（Ｅａｔｏｎ－Ｌａｍｂｅｒｔ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、再発性多発性軟骨炎、クリオグロブリン血症、ワルデンストレームマクログロブリン血症、エバンス症候群（Ｅｖａｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、急性呼吸促迫症候群、肺炎症、骨粗鬆症、遅延型過敏反応及び自己免疫性腺機能不全を含む。例えば、シェーグレン症候群、多発性硬化症及び全身性エリテマトーデスである。
【0067】
幾つかの実施形態において、Ｂリンパ球（例えば、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、関節リウマチ及び１型糖尿病）、Ｔｈ１リンパ球（例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本病、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、ウェゲナー肉芽腫症、結核症又は移植片対宿主病）、又はＴｈ２リンパ球（例えば、アトピー性皮膚炎、全身性エリテマトーデス、アトピー性喘息、鼻結膜炎、アレルギー性鼻炎、オーメン症候群（Ｏｍｅｎｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、全身性硬化症又は慢性移植片対宿主病）に関連する疾患を治療する方法及び関連する製薬用途を提供し、必要とする対象に有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。
【0068】
幾つかの実施形態において、腫瘍又は癌を治療する方法及び関連する製薬用途を提供し、必要とする対象に有効量の上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を投与することを含み、上記腫瘍又は癌は、ＣＤ４０の発現に関連してもしなくてもよい。
【0069】
幾つかの実施形態において、移植片対宿主病又は移植拒絶反応を治療又は緩和する方法を提供し、必要とする対象に上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片及びタクロリムスを投与することを含む。
【0070】
幾つかの実施形態において、移植片対宿主病又は移植拒絶反応を治療又は緩和する薬剤の調製における上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片の用途を提供し、それはタクロリムスとの併用を含む。幾つかの実施形態において、タクロリムスの、移植片対宿主病又は移植拒絶反応を治療又は緩和する薬剤の調製に用いられる用途を提供し、それは上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片との併用を含む。
【0071】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片とタクロリムスを組み合わせて移植片対宿主病又は移植拒絶反応の治療又は緩和に用いる方法、及び組み合わせて移植片対宿主病又は移植拒絶反応を治療又は緩和する薬剤の調製に用いる用途を提供する。
【0072】
幾つかの実施形態において、上記移植は、固形臓器移植、例えば、腎臓移植、肝臓移植、心臓移植、肺移植、膵臓移植、小腸移植又は複合組織移植である。
【0073】
幾つかの実施形態において、上記移植は、同種細胞、異種細胞、同種組織、異種組織、同種臓器及び異種臓器からなる群より選ばれる１つを移植することを意味する。
【0074】
幾つかの実施形態において、上記抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、移植レシピエントの組織移植片に基づく拒絶反応を阻害又は逆転し、或いは移植レシピエントに移植した組織の機能を延長又は維持し、或いは移植レシピエント中の損傷移植組織の機能を回復させる。
【0075】
検出
本開示は、ＣＤ４０を検出する組成物を提供し、上記組成物は本開示による抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む。本開示は、インビボ又はインビトロでＣＤ４０を検出する方法、システム又は装置を更に提供し、それは、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片で試料を処理することを含む。
本開示は、ＣＤ４０を検出する組成物を提供し、上記組成物は本開示による抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含む。本開示は、インビボ又はインビトロでＣＤ４０を検出する方法、システム又は装置を更に提供し、それは、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片で試料を処理することを含む。
【0076】
幾つかの実施形態において、インビトロ検出方法、システム又は装置は、例えば、
（１）試料を抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合断片に接触させること、
（２）ＣＤ４０結合抗体若しくはその抗原結合断片と試料との間で形成された複合物を検出すること、及び／又は
（３）参照試料（例えば、対照試料）を抗体に接触させること、及び
（４）参照試料との比較により、複合体の形成程度を確定すること、
を含み得る。例えば、対照試料又は対象におけるものと比べ、試料又は対象における複合物形成の変化（例えば、統計学的に有意な変化）は、試料にＣＤ４０があることを示す。
（１）試料を抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合断片に接触させること、
（２）ＣＤ４０結合抗体若しくはその抗原結合断片と試料との間で形成された複合物を検出すること、及び／又は
（３）参照試料（例えば、対照試料）を抗体に接触させること、及び
（４）参照試料との比較により、複合体の形成程度を確定すること、
を含み得る。例えば、対照試料又は対象におけるものと比べ、試料又は対象における複合物形成の変化（例えば、統計学的に有意な変化）は、試料にＣＤ４０があることを示す。
【0077】
別の幾つかの実施形態において、インビボ検出方法、システム又は装置は、
（１）対象に抗ＣＤ４０の抗体又はその抗原結合断片を投与することと、
（２）抗ＣＤ４０の抗体又はその抗原結合断片と対象との間での複合物の形成を検出することと、
を含んでもよい。
（１）対象に抗ＣＤ４０の抗体又はその抗原結合断片を投与することと、
（２）抗ＣＤ４０の抗体又はその抗原結合断片と対象との間での複合物の形成を検出することと、
を含んでもよい。
【0078】
検出は、複合物を形成する位置又は時間を確定することを含んでもよい。検出可能な物質でＣＤ４０抗体を標識し、上記標識を検出することにより、ＣＤ４０抗体に結合する物質（例えば、ＣＤ４０）への検出が実現される。好適な検出可能な物質は、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質及び放射性物質を含む。ＣＤ４０に結合するか又は結合しない抗体を測定したり、それを可視化したりすることにより、ＣＤ４０結合抗体又はその抗原結合断片とＣＤ４０との間での複合物の形成を検出することができる。通常の検出アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学を使用することができる。検出のために、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその断片は、フルオロフォア発色団で標識されてもよい。
【0079】
幾つかの実施形態において、試薬キットを更に提供し、上記試薬キットは抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含み、診断マニュアルを更に含んでもよい。試薬キットは、少なくとも１つの付加的な試薬、例えば、マーカーや付加的な診断剤を更に含んでもよい。インビボでの使用に対して、抗体は、医薬組成物として調製することができる。
【0080】
用語の定義
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明確に定義しない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
本開示が更に容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で別途明確に定義しない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に通常理解されている意味を持っている。
【0081】
文脈で特に明記のない限り、明細書及び特許請求の範囲の全体において、「含有する」、「有する」、「含む」などの言葉は、排他的又は網羅的な意味ではなく、包括的な意味、即ち、「含むが、これらに限定されない」という意味を持っていると理解すべきである。
【0082】
本開示に使用されるアミノ酸の３文字コードと１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0083】
「ＣＤ４０」及び「ＣＤ４０抗原」は、正常と腫瘍性Ｂ細胞の表面に発現された約４８ ｋＤの糖タンパク質を指し、それは、細胞の増殖と分化に関与するシグナルの受容体として作用する（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８：７８８－７８５）。バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｊｉにより調製されたライブラリーから、ＣＤ４０をコードするｃＤＮＡ分子を単離した（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１４０３）。配列情報は、本開示の表２を参照してよい。ＣＤ４０を内因的に発現する細胞は、表面でのＣＤ４０の発現を特徴とする任意の細胞であり、正常と腫瘍性Ｂ細胞、指状突起細胞、基底上皮細胞、がん細胞、マクロファージ、内皮細胞、濾胞性樹状細胞、へんとう腺細胞及び骨髄由来形質細胞を含むが、これらに限定されない。
【0084】
「抗体」は、所望の抗原結合活性を示せば、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体と抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むが、これらに限定されない。抗体は、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合で連結してなるテトラペプチド鎖構造である免疫グロブリンを指してもよい。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸組成と配列順序が異なるので、その抗原性も異なる。これにより、免疫グロブリンは、５種類、又は、免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分けることができ、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いによって、更に異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は、定常領域によって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、何れもκ鎖又はλ鎖を有してもよい。抗体重鎖及び軽鎖は、Ｎ末端に近い約１１０個のアミノ酸の配列が大きく変化され、可変領域（Ｖ領域）となり、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列が比較的に安定的で、定常領域（Ｃ領域）となる。可変領域は、３つの超可変領域（ＣＤＲ）と、配列が比較的に保存的な４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。それぞれの軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は、３つのＣＤＲ領域と、４つのＦＲ領域とからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。
【0085】
ＣＤＲについての確定又は定義は、抗体の構造を解明し、及び／又は抗体－リガンド複合物の構造を解明することにより、ＣＤＲの確実な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同定を達成することができる。これは、当業者に知られている種々の技術の何れか１つ、例えば、Ｘ線結晶学によって実現することができる。種々の分析方法は、ＣＤＲの同定に使用することができ、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、接触定義、立体配座定義を含むが、これらに限定されない。
【0086】
Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、抗体における残基に番号を付けるための基準であり、一般的にＣＤＲ領域の同定に使用される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４－８を参照）。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムと類似するが、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、ある構造ループ領域の位置を考慮に入れた。（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－１７、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８３を参照）。ＡｂＭ番号付けシステムは、抗体構造をモデリングしたＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ製のコンピュータプログラム統合スイートを使用する（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：９２６８－９２７２、“ＡｂＭＴＭ，Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ＭｏｄｅｌｉｎｇＶａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄを参照）。ＡｂＭ番号付けシステムは、知識データベース及びａｂ ｉｎｉｔｉｏ法の組み合わせを用いて、基本配列から抗体の三次構造をモデル化する（Ｓａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，３：１９４－１９８における「Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ」に記載されたものを参照）。接触定義は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである（例えばＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２－４５を参照）。立体配座の定義において、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる（例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６－１１６６を参照）。なお、他のＣＤＲの境界の定義は、上記方法の１つに厳密に従うとは限らないが、特定の残基又は残基群が抗原結合に顕著に影響しないという予測又は実験結果によって、それらは短縮又は延長可能であるとはいえ、依然としてＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書に使用されるように、ＣＤＲは、この分野における既知の任意の方法（方法の組み合わせを含む）によって定義されるＣＤＲを指すことができる。各番号付けシステムの対応関係は、当業者によく知られているものであり、例示的に、下記の表１に示す通りである。
【0087】
【表1】
【0088】
本開示に係る抗体又は抗原結合断片のＶＬ領域とＶＨ領域のＣＤＲアミノ酸残基は、数量と位置において既知のＫａｂａｔ番号付けシステムに合致する。
「モノクローナル抗体」又は「単クローン抗体」とは、基本的に同質の抗体集団から得られた抗体であり、即ち、少量で天然に存在し得る変異を除き、集団に含まれる各抗体は同じである。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原部位に対するものである。更に、通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、例えば、基本的に同質の抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、何れかの特定の方法により抗体を産生する必要があると解釈されない。
「モノクローナル抗体」又は「単クローン抗体」とは、基本的に同質の抗体集団から得られた抗体であり、即ち、少量で天然に存在し得る変異を除き、集団に含まれる各抗体は同じである。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原部位に対するものである。更に、通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、例えば、基本的に同質の抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、何れかの特定の方法により抗体を産生する必要があると解釈されない。
【0089】
「ウサギ抗体」という用語は、本開示において、この分野での知識と技術により調製されたヒトＣＤ４０又はそのエピトープに対するモノクローナル抗体である。調製時にＣＤ４０抗原を試験ウサギに注射した後、所望の配列又は機能特性を持つ抗体を発現した抗体を単離する。本開示の一具体的な実施形態において、上記ウサギ抗ヒトＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、ウサギκ、λ鎖若しくはその変異体の軽鎖定常領域を更に含み、或いは、ウサギＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域を更に含んでもよい。
【0090】
「完全ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の可変と定常領域を有する抗体を含む。本開示に係る完全ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列でコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム若しくは部位特異的な変異誘発、又はインビボの体細胞変異により導入された変異）を含むことができる。しかし、「完全ヒト抗体」という用語は、別種の哺乳動物種（例えば、ウサギ）の生殖細胞系から誘導されたＣＤＲ配列をヒト骨格配列に移植した抗体（即ち、「ヒト化抗体」）を含まない。
【0091】
「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ－ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、非ヒトＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワークに移植して産生された抗体を指す。キメラ抗体が大量の非ヒトタンパク質成分を持つことにより誘導された強い免疫応答反応を克服することができる。免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記完全ヒト抗体可変領域に対して最も少ない逆変異を行うことにより、活性を維持することができる。
【0092】
「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、第１の種の抗体の可変領域を第２の種の抗体の定常領域と融合してなる抗体であり、第１の種の抗体により誘発される免疫応答反応を低減することができる。一例として、キメラ抗体を作成するには、まず、ウサギ特異的単クローン抗体を分泌するウサギを作成し、上記抗体を単離し、そして必要に応じて完全ヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし、ウサギ可変領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とをキメラ遺伝子になるように連結した後、ヒトベクターに挿入し、最後に真核細胞系又は原核細胞系においてキメラ抗体分子を発現しなければならない。完全ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はその変異体の重鎖定常領域から選ばれてもよく、好ましくはヒトＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、又はアミノ酸変異した後にＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性の細胞仲介性の細胞傷害作用）毒性のないＩｇＧ１を使用する。
【0093】
「抗原結合断片」という用語は、単鎖抗体（即ち、全長重鎖と軽鎖）、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されたＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、２価又は３価又は４価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ及び上記の何れか１つのエピトープ結合断片を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６、Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９－２１７を参照）。これらの抗体断片を産生・調製する方法は、この分野において公知のものである（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照）。Ｆａｂ－Ｆｖ形態は、ＷＯ２００９／０４０５６２に初めて開示され、そのジスルフィド結合の安定化形態であるＦａｂ－ｄｓＦｖが、ＷＯ２０１０／０３５０１２に初めて開示された。本開示に係る抗原結合断片は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０とＷＯ２００５／００３１７１に記載されたＦａｂ及びＦａｂ’断片を更に含む。多価抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性のものを含んでもよく、又は単一特異性のものであってもよく（例えば、ＷＯ９２／２２５８３とＷＯ０５／１１３６０５を参照）、後者の一例としては、ＷＯ９２／２２５８３に記載されたＴｒｉ－Ｆａｂ（又はＴＦＭ）である。
【0094】
「ＣＤ４０に結合する」という用語は、ＣＤ４０又はそのエピトープと相互作用できることを意味し、上記ＣＤ４０又はそのエピトープは、ヒト由来のものであってもよい。本開示の「抗原結合部位」という用語は、抗原において連続しておらず、本開示の抗体又は抗原結合断片により認識される３次元空間部位を指す。
【0095】
「抗原」という用語は、免疫適格性脊椎動物を免疫化して、抗原を認識する抗体を産生し、又は発現ライブラリー（例えば、特にファージ、サッカロミセス又はリボソームディスプレイライブラリー）をスクリーニングするための分子を指す。本開示において、抗原はより広義に定義されており、抗体により特異的に認識される標的分子を含み、且つ抗体を産生するための免疫化プロセス又は抗体を選択するためのライブラリーの選別に使用される分子の一部又は模倣体を含む。本開示のヒトＣＤ４０結合抗体に対して、ヒトＣＤ４０の単量体と多量体（例えば、二量体、三量体など）、及びヒトＣＤ４０の欠失変異体と他の変異体は、何れも抗原と称される。
【0096】
「エピトープ」という用語は、抗原における免疫グロブリン又は抗体に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸から、又はタンパク質の三次折畳により並列して隣接しないアミノ酸から形成されてもよい。隣接するアミノ酸により形成されたエピトープは、通常、変性溶媒に暴露された後に保持されるが、三次折畳により形成されたエピトープは通常、変性溶媒で処理された後に無くなる。エピトープは、通常、独特の空間配座で、少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。何のエピトープが所定の抗体により結合されるかを決定する方法は、この分野でよく知られているもので、ウエスタンブロット法と免疫沈降検出分析などを含む。エピトープの空間配座を決定する方法は、この分野における技術と本開示に記載される技術、例えば、Ｘ線結晶分析法と２次元核磁気共鳴などを含む。
【0097】
「特異的結合」、「選択的結合」という用語は、抗体の所定の抗原におけるエピトープとの結合を指す。通常、ヒトＣＤ４０又はそのエピトープを分析物として使用するとともに、抗体をリガンドとして使用し、機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定する場合、抗体は、約１０－７ Ｍ未満若しくはそれよりも小さい平衡解離定数（ＫＤ）で所定の抗原又はそのエピトープに結合し、且つ所定の抗原又はそのエピトープに対する結合親和性が、所定の抗原（又はそのエピトープ）又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）に対する結合親和性の少なくとも２倍である。「抗原を識別する抗体」という用語は、本開示において「特異的に結合する抗体」という用語と互いに交換して使用されてもよい。
【0098】
「結合親和性」又は「親和性」は、本開示において、２つの分子（例えば、抗体又はその一部と抗原）間の非共有相互作用の強度の目安として使用される。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（ＫＤ）を決定することにより定量化することができる。ＫＤは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）で複合物の形成と解離の動態を測定することにより決定することができる。一価複合物の結合と解離に対応する速度定数は、それぞれ結合速度定数ｋａ（又はｋｏｎ）と解離速度定数ｋｄ（又はｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａという方程式によってｋａ及びｋｄに関連する。解離定数の値は、周知の方法により直接決定することができ、且つ、例えばＣａｃｅｃｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４，Ｂｙｔｅ ９：３４０－３６２）に記載されたような方法により、複雑な混合物に対しても算出することができる。ＫＤは、例えばＷｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５４２８－５４３２）に開示されたような二重ろ過ニトロセルロースフィルター結合アッセイにより決定することができる。標的抗原に対する抗体の結合能力を評価する他の標準的なアッセイは、この分野で既知のものであり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ及びフローサイトメトリー分析、及び本開示の他所で挙げられた他のアッセイを含む。抗体の結合動態と結合親和性は、この分野で知られている標準的なアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、例えばＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム又はＫｉｎＥｘＡにより評価されてもよい。各抗体／抗原複合物のＫＤ値を比較することにより、異なる分子との相互作用に関連する結合親和性を比較し、例えば、異なる抗体による所定の抗原への結合親和性を比較することができる。同様に、相互作用の特異性は、目的相互作用（例えば、抗体と抗原の間の特異的相互作用）のＫＤ値と非目的相互作用（例えば、ＣＤ４０に結合しない既知の対照抗体）のＫＤ値を決定して比較することで評価することができる。
【0099】
「保存（的）置換」という用語は、元のアミノ酸残基と類似の特性を有する別のアミノ酸残基に置換されることを指す。例えば、リジン、アルギニンとヒスチジンは、塩基性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有し、また、アスパラギン酸とグルタミン酸は、酸性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。更に、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインとトリプトファンは、電荷をもたない極性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有し、また、アラニン、バリン、ロイシン、トレオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニンとメチオニンは、非極性側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。更に、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンとヒスチジンは、芳香族側鎖を持つことにおいて類似の特性を有する。従って、上記のような類似の特性を示す群におけるアミノ酸残基が置換される場合にも、それは特性の特定の変化を示さないことが当業者に明らかである。
【0100】
「阻害」又は「遮断」は交換して使用されてもよく、部分的と完全な阻害／遮断の両方をカバーする。ＣＤ４０に対する阻害／遮断は、阻害や遮断のない場合にＣＤ４０の結合が発生される時に活性が現れる正常なレベル又は種類を低減又は変更することが好ましい。阻害と遮断は、抗ＣＤ４０抗体と接触した場合、抗ＣＤ４０抗体と接触していないＣＤ４０に比べて、何れの測定可能なＣＤ４０結合親和性も低下することを含むことも意図する。
【0101】
「成長の阻害」（例えば、細胞について）は、細胞成長の任意の測定可能な低下も含むことを意図する。
【0102】
「アゴニスト活性」、「アゴニスト活性」又は「アゴニスト性」は、アゴニストとしての機能を指す。アゴニストと細胞受容体の結合により、当該受容体の天然リガンドによるものと類似若しくは同様の反応又は活性が引き起こされる。例えば、ＣＤ４０アゴニストは、細胞の増殖及び／又は分化、例えば、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、ＶＣＡＭなどの分子による細胞間の接着のアップレギュレート、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインの分泌、ＣＤ４０受容体を介するＴＲＡＦ（例えば、ＴＲＡＦ２及び／又はＴＲＡＦ３）、ＭＡＰキナーゼ、例えばＮＩＫ（ＮＦ－κＢ誘導キナーゼ）、１－κＢキナーゼ（ＩＫＫα／β）、転写因子ＮＦ－κＢ、ＲａｓとＭＥＫ／ＥＲＫ経路、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路、Ｐ３８ ＭＡＰＫ経路などの経路によるシグナルの伝達、ＸＩＡＰ、Ｍｃｌ－１、ＢＣＬｘなどの分子による抗－アポトーシスシグナルの伝達、Ｂ及び／又はＴ細胞記憶の産生、Ｂ細胞抗体の産生、Ｂ細胞のアイソタイプの変換、クラスＩＩ ＭＨＣとＣＤ８０／８６の細胞表面発現のアップレギュレートなどの応答の何れか又は全てを誘導することができる。「拮抗活性」、「拮抗薬活性」又は「拮抗性」は、拮抗薬となり得る物質の機能を指す。例えば、ＣＤ４０の拮抗薬は、ＣＤ４０受容体とアゴニスト性リガンド、具体的にＣＤ４０Ｌとの結合によって誘導される任意の応答を防止又は低減することができる。拮抗薬は、アゴニスト結合によって誘導される１種又は複数種の応答を５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、８５％、且つ最も好ましくは９０％、９５％、９９％又は１００％低下させることができる。抗ＣＤ４０抗体のＣＤ４０リガンドへの結合特異性及び拮抗活性を検出する方法は、当業者に知られているものであり、標準的な競合結合アッセイ、Ｂ細胞による免疫グロブリンの分泌をモニターするアッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイ、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ様Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産生のＴ細胞補助アッセイ、Ｂ細胞増殖の共刺激アッセイ、及びＢ細胞活性化マーカーをアップレギュレートするアッセイを含むが、これらに限定されない。
【0103】
抗体及び抗原結合断片を産生・精製する方法は、従来技術でよく知られており、且つ、例えば冷泉港の抗体実験技術マニュアル（５～８章及び１５章）で見出すことができる。例えば、ヒトＣＤ４０又はその断片をマウスに免疫することができ、得られた抗体は復元、精製されることができるとともに、通常の方法によりアミノ酸シークエンシングを行うことができる。抗原結合断片は、同じく通常の方法により調製することができる。本開示に記載される抗体又は抗原結合断片は、遺伝子工学的方法により、非ヒト由来のＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒト由来のＦＲ領域が加えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトから入手可能である。
【0104】
当業者に知られている通常の技術により、同じエピトープに対する結合で抗体を競合的にスクリーニングすることができる。例えば、競合及び交差競合研究を行うことにより、互いに競合したり、交差競合したりして抗原に結合する抗体を得ることができる。それらの交差競合によって同じエピトープと結合する抗体を得るハイスループット方法は、国際特許公開ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。従って、当業者に知られている通常の技術により、本開示にかかる抗体分子と競合してＣＤ４０における同じエピトープに結合する抗体及びその抗原結合断片を得ることができる。
【0105】
「障害」という用語は、本開示のヒト化抗ＣＤ４０抗体を用いた治療から利益が得られる任意の病状である。それは、慢性及び急性の障害又は疾患を含む。本開示の治療すべき障害の非限定的な例としては、がん、血液悪性腫瘍、良性と悪性腫瘍、白血病及びリンパ性悪性腫瘍、並びに炎症性障害、血管新生障害、自己免疫障害と免疫学的障害が含まれる。
【0106】
「ＣＤ４０関連障害」又は「ＣＤ４０関連疾患」という用語は、ＣＤ４０を発現する細胞の修飾又は除去を示す病状を指す。これらの細胞は、異常増殖を示すＣＤ４０発現細胞、又は癌性若しくは悪性増殖に関連するＣＤ４０発現細胞を含む。ＣＤ４０抗原の発現異常を示す癌のより具体的な例としては、Ｂリンパ芽球性腫瘍、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、骨肉腫、表皮と内皮腫瘍、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、皮膚癌（黒色腫）、膀胱癌及び腎臓癌が含まれる。このような障害は、白血病、リンパ腫（Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、多発性骨髄腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、例えば骨肉腫、ユーイング肉腫のような肉腫、悪性黒色腫、腺癌（卵巣腺癌を含む）、カポジ肉腫／カポジ腫瘍及び扁平上皮癌を含む固形腫瘍を含むが、これらに限定されない。「ＣＤ４０関連障害」は、免疫系の疾患及び障害、例えば、自己免疫障害及び炎症性障害を更に含む。このような病状は、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性結腸炎及びクローン病）、肺炎症、喘息、及び特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含むが、これらに限定されない。
【0107】
「…の成長を妨げる」又は「成長阻害」という用語は、細胞、特にＣＤ４０抗原を発現する腫瘍性細胞種類の成長又は増殖を阻害することを指す。従って、成長阻害は、例えば、Ｓ期の腫瘍性細胞の百分率を顕著に低減する。
【0108】
「与える」、「投与」及び「処理」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器や生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器や生物流体との接触を意味する。「与える」、「投与」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究と実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、ここで、上記流体は細胞と接触する。「与える」、「投与」及び「処理」は、また、試薬、診断、結合組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究と診断的応用を意味する。
【0109】
「治療」は、対象に内用又は外用の治療剤、例えば、本開示の何れか１つの抗体又はその抗原結合断片或いはそれを含む組成物を投与することを意味し、上記対象は、１つ若しくは複数の疾患又はその症状を患っており、患っている恐れがあり、又は患う傾向があるが、上記治療剤は、これらの症状に対して治療作用を有することが知られている。通常、このような症状の退行を誘導することによるにせよ、臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこのような症状を阻害することによるにせよ、治療される対象又は集団に、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与える。何れかの具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、対象の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の対象に必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度や進行状況の評価に医者や他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又は製品）は、ある対象における目標疾患症状の緩和に無効であり得るが、例えばＳｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定とＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のようなこの分野で知られている任意の統計学的検定方法により、統計学的に有意な数の対象において目標疾患症状を軽減するはずであることが確認された。
【0110】
「有効量」は、医学障害の症状又は病状を改善又は予防するために十分な量を含む。有効量は、更に、診断の許容又は促進に十分な量を指す。特定の対象又は獣医学的対象に使用される有効量は、例えば、治療すべき病状、対象の全体的健康状態、投与の方法や経路と用量、及び副作用の重症度といった要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与計画であってもよい。
【0111】
「相同性」又は「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列の類似性を指す。２つの比較される配列における位置が何れも同じヌクレオチド又はアミノ酸モノマーサブユニットに占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置が同じヌクレオチドに占められると、上記分子は当該位置で相同である。２つの配列間の相同性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００％をかける関数である。例えば、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチングするか又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般的には、２つの配列をアラインメントして最大の相同性百分率が得られる場合に比較する。
【0112】
「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養物」は、互いに交換して使用されてもよく、このような名称は何れもその子孫を含む。また、意図するかしないかの変異のために、あらゆる子孫は、ＤＮＡ含有量において精確に同じであり得ないと理解すべきである。最初の形質転換細胞からスクリーニングされたものと同様の機能又は生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。
【0113】
「任意選択的」又は「任意選択的に」とは、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。
【0114】
本開示の「ＣＤ４０結合分子」は、最大限に解釈すると、本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片を含み、ＣＤ４０への結合を実現可能なタンパク質であれば、何れも当該用語の範囲にある。例えば、ＣＤ４０結合タンパク質は、例えば複合で、１つ又は複数のエフェクター分子を含んでもよい。上記「エフェクター分子」は、単独で治療活性を有する（例えば、抗腫瘍活性又は免疫活性化若しくは阻害活性を有する）か又は検出機能を有することができ、例えば、生理活性タンパク質（例えば、酵素）、他の抗体若しくは抗体断片、合成若しくは天然に存在するポリマー、ポリヌクレオチドとその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡとその断片、放射性核種（特に、放射性ヨウ化物）、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基（例えば、蛍光化合物）、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光分析によって検出可能な化合物などの任意の形態であってもよい。エフェクター分子と本開示の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片との複合方式は、通常の方法により達成することができる。
【0115】
「抗体薬物複合体」は、薬物（例えば、抗腫瘍剤、毒素）を抗体に連結してなる複合体を指し、上記複合体は、通常の方法によって、例えば、切断可能又は切断不可能なリンカーによって連結することができる。
【図面の簡単な説明】
【0116】
【図1A-B】ＣＤ４０拮抗型抗体のレポーター遺伝子システムにおける活性結果であり、図１Ａと図１Ｂはそれぞれ９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２に関連する結果であり、図１Ａと図１Ｂは両方ともヒトＩｇＧ１アイソタイプを陰性対照、ＣＦＺ５３３を陽性対照として使用している。
【図2A-B】ＣＤ４０拮抗型抗体のＢ細胞活性化実験系における阻害活性結果であり、図２Ａは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＣＤ１９＋ＣＤ６９＋の細胞百分率阻害結果であり、図２Ｂは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＣＤ１９＋ＣＤ６９＋の細胞ＭＦＩ阻害結果であり、図２Ａ～図２Ｂは両方ともヒトＩｇＧ１アイソタイプを陰性対照として、ＣＦＺ５３３を陽性対照として使用している。
【図3A-D】ＣＤ４０拮抗型抗体のＤＣ細胞活性化実験系における阻害活性結果であり、図３Ａは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ８０＋の細胞ＭＦＩ阻害結果であり、図３Ｂは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ８６＋の細胞ＭＦＩ阻害結果であり、図３Ｃは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＩＬ－１２／２３ ｐ４０を阻害する結果であり、図３Ｄは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２と２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＴＮＦαを阻害する結果であり、図３Ａ～３Ｄは何れもヒトＩｇＧ１アイソタイプを陰性対照として、ＣＦＺ５３３を陽性対照として使用している。
【図4】ＣＤ４０拮抗型抗体９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のＢ細胞活性化実験系における内因性アゴニスト活性結果であり、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＣＦＺ５３３、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳを対照として使用している。
【図7】マウス皮膚移植拒絶モデルにおけるＣＤ４０拮抗型抗体とタクロリムス（ＦＫ５０６）との併用の活性結果であり、図７のＡは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２（１０ ｍｐｋ）及びそれとタクロリムス（ＦＫ５０６）との併用の皮膚移植片生存率（％）の結果であり、図７のＢは２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２（１０ ｍｐｋ）及びそれとタクロリムス（ＦＫ５０６）との併用の皮膚移植片生存率（％）の結果であり、図７のＣは９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２（１０ ｍｐｋ）及びそれとタクロリムス（ＦＫ５０６）との併用の皮膚移植片採点結果であり、図７のＤは２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２（１０ ｍｐｋ）及びそれとタクロリムス（ＦＫ５０６）との併用の皮膚移植片採点結果である。
【図8】ＣＤ４０拮抗型抗体９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスにおけるＰＫ検出結果であり、ＣＦＺ５３３を対照として使用している。
【発明を実施するための形態】
【0117】
以下、実施例に合わせて本開示を更に説明するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限するものではない。
【0118】
本開示の実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹが参照される。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
【0119】
実施例１． ＣＤ４０免疫抗原、抗原をスクリーニングする配列及び調製
ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ５２２８）、マウスＦｃタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｍＦｃ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ５２５ａ）、ｈｉｓタグとビオチンタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０－ｈｉｓ－ａｖｉ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ８２Ｅ８）及びｈｉｓタグ付きのカニクイザルＣＤ４０（ｃｙｎｏ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｃ５２Ｈ６）は、何れもＡｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入された精製市販タンパク質試薬であり、それぞれの配列の由来は表２に示されている。上記タンパク質試薬は、次の各実施例の実験に使用することができる。
ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ５２２８）、マウスＦｃタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈ－ＣＤ４０－ｍＦｃ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ５２５ａ）、ｈｉｓタグとビオチンタグ付きのヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０－ｈｉｓ－ａｖｉ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｈ８２Ｅ８）及びｈｉｓタグ付きのカニクイザルＣＤ４０（ｃｙｎｏ－ＣＤ４０－ｈｉｓ）組換えタンパク質（製品番号ＣＤ０－Ｃ５２Ｈ６）は、何れもＡｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入された精製市販タンパク質試薬であり、それぞれの配列の由来は表２に示されている。上記タンパク質試薬は、次の各実施例の実験に使用することができる。
【0120】
【表2】
【0121】
実施例２． 抗ＣＤ４０ウサギモノクローナル抗体のスクリーニング及びヒト－ウサギキメラ抗体の調製
抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体は、２匹のニュージーランドホワイトラビットを免疫することにより産生された。免疫抗原は、Ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４０組換えタンパク質である（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓで、リン酸塩緩衝液により１ μｇ／μＬに調製した）。フロイントアジュバントによる乳化：最初は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、残りの追加免疫化は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。各回の免疫は、抗原４００ μｇの多点皮下注射を採用した。免疫注射時間は０、７、２０、４１日目である。２７と４８日目に採血して血液検出を行い、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ方法によりウサギ血清における抗体価を検出した。血清中の抗体価が高くて安定する傾向があるウサギを選択した：６３日目に追加免疫を行い、４００ μｇ／匹でリン酸緩衝液から調製された抗原溶液を静脈内注射し、６７日目に当該ウサギの脾臓を収集し、ビオチンラグ付きのＣＤ４０抗原を加え、標識されたモノクローナルＢ細胞をフローサイトメーターにより選別して９６ウェルプレートに入れた。１４日間培養後に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの方法により、ヒトＣＤ４０、カニクイザルＣＤ４０及びＲａｊｉ細胞（ヒトＣＤ４０を発現した腫瘍細胞株）に結合可能なクローンをスクリーニングし、合計２８株のＢ細胞モノクローンを得た。これらのモノクローナル細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写し、ＰＣＲ増幅した後、シークエンシングのためにシークエンシング会社へ送付し、最終的にウサギ抗体２８株の配列を取得し、親和性・活性同定実験（方法は実施例２～３を参照）でスクリーニングして１１株の単クローン抗体を得て、重鎖及び軽鎖可変領域の配列は表３に、ＣＤＲの配列は表４に示されている。
抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体は、２匹のニュージーランドホワイトラビットを免疫することにより産生された。免疫抗原は、Ｈｉｓタグ付きのヒトＣＤ４０組換えタンパク質である（ｈ－ＣＤ４０－ｈｉｓで、リン酸塩緩衝液により１ μｇ／μＬに調製した）。フロイントアジュバントによる乳化：最初は完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、残りの追加免疫化は、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。各回の免疫は、抗原４００ μｇの多点皮下注射を採用した。免疫注射時間は０、７、２０、４１日目である。２７と４８日目に採血して血液検出を行い、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ方法によりウサギ血清における抗体価を検出した。血清中の抗体価が高くて安定する傾向があるウサギを選択した：６３日目に追加免疫を行い、４００ μｇ／匹でリン酸緩衝液から調製された抗原溶液を静脈内注射し、６７日目に当該ウサギの脾臓を収集し、ビオチンラグ付きのＣＤ４０抗原を加え、標識されたモノクローナルＢ細胞をフローサイトメーターにより選別して９６ウェルプレートに入れた。１４日間培養後に、上清を収集し、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの方法により、ヒトＣＤ４０、カニクイザルＣＤ４０及びＲａｊｉ細胞（ヒトＣＤ４０を発現した腫瘍細胞株）に結合可能なクローンをスクリーニングし、合計２８株のＢ細胞モノクローンを得た。これらのモノクローナル細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写し、ＰＣＲ増幅した後、シークエンシングのためにシークエンシング会社へ送付し、最終的にウサギ抗体２８株の配列を取得し、親和性・活性同定実験（方法は実施例２～３を参照）でスクリーニングして１１株の単クローン抗体を得て、重鎖及び軽鎖可変領域の配列は表３に、ＣＤＲの配列は表４に示されている。
【0122】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【0123】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【0124】
得られた可変領域配列をそれぞれヒトの抗体ＩｇＧ１定常領域（Ｎ２９７Ａ変異付き、Ｅｕ番号付けシステム）配列とヒトｋａｐｐａ鎖定常領域配列に連結してヒト－ウサギのキメラ抗体配列を取得し、分子クローニング技術により、キメラ抗体の配列を発現ベクターに挿入し、ＨＥＫ２９３細胞発現系を利用すれば、ヒト－ウサギキメラ抗体を得ることができる。
【0125】
実施例３． ヒト－ウサギキメラ抗ＣＤ４０抗体Ｒａｊｉ細胞結合実験
Ｒａｊｉ細胞は、ヒトＣＤ４０を過剰発現する腫瘍細胞株である。２Ｅ５個のＲａｊｉ細胞を９６ウェルプレートに接種した。１００ μＬの測定待ちの抗体を加え、最高終濃度が１００ ｎＭで、５倍希釈し、合計８個の濃度にして、４℃で１時間インキュベートした。洗浄液で１回洗浄し、１：５００の希釈度で、ＡＦ６４７に複合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ、製品番号２０５－６０９－０８８）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で１回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を読み取った。ＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合ＥＣ５０値を算出した。抗ＣＤ４０拮抗型抗体ＣＦＺ５３３（即ち、Ｉｓｃａｌｉｍａｂ、Ｎｏｖａ）を陽性対照として使用し、重鎖と軽鎖可変領域の配列は、それぞれＵＳ８２７７８１０Ｂの配列５と配列２に由来した。
Ｒａｊｉ細胞は、ヒトＣＤ４０を過剰発現する腫瘍細胞株である。２Ｅ５個のＲａｊｉ細胞を９６ウェルプレートに接種した。１００ μＬの測定待ちの抗体を加え、最高終濃度が１００ ｎＭで、５倍希釈し、合計８個の濃度にして、４℃で１時間インキュベートした。洗浄液で１回洗浄し、１：５００の希釈度で、ＡＦ６４７に複合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｏｔｏｒｉｅｓ、製品番号２０５－６０９－０８８）を加え、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で１回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を読み取った。ＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の結合ＥＣ５０値を算出した。抗ＣＤ４０拮抗型抗体ＣＦＺ５３３（即ち、Ｉｓｃａｌｉｍａｂ、Ｎｏｖａ）を陽性対照として使用し、重鎖と軽鎖可変領域の配列は、それぞれＵＳ８２７７８１０Ｂの配列５と配列２に由来した。
【0126】
表５の結果から、２Ｆ１２、３Ｆ６、４Ｆ６、５Ａ９、５Ｂ８、９Ｅ６、１０Ａ４は、何れもＣＦＺ５３３より強い結合ＥＣ５０を有するが、８Ｅ１（配列が示されていない）を例とする他の抗体はＣＦＺ５３３よりもＥＣ５０が弱いことが示されている。
【0127】
【表5】
【0128】
実施例４ ヒト－ウサギキメラ抗ＣＤ４０抗体のレポーター遺伝子細胞活性実験
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入され、当該細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子及びＮＦ－ｋＢ仲介性のＳＥＡＰゲノムを安定トランスフェクションしたもので、ＳＥＡＰ基質であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅにより上清において分泌されたＳＥＡＰを検出することでＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルを表現することができる。この実験は、ＣＤ４０Ｌによる細胞ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌの活性化を検出することにより、ＩＣ５０の大きさに基づいて抗ＣＤ４０抗体のインビトロ拮抗薬活性を評価した。細胞ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌを１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと３０ μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含むＤＭＥＭ培地に培養し、１：５又は１：１０の継代比率で１週間に２～３回継代した。継代時に、培地を吸引除去し、０．２５％のトリプシン５ ｍＬで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェル細胞培養プレートに１００ μＬの細胞懸濁液を加え、密度が５×１０＾５細胞／ｍＬで、培地が１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと３０ μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含むＤＭＥＭであり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬの滅菌水のみを加えた。培養プレートをインキュベーターにおいて２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。細胞が壁に付着した後、各ウェルに１００ μＬの勾配希釈した測定待ちの抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。２５ ｎｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ、製品番号２７０６－ＣＬ）と２ μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ、製品番号ＭＡＢ０５０）を加え、培養プレートをインキュベーターで２０～２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。各ウェルから２０ μＬの細胞上清を取って新しい９６ウェルフラットプレートに入れ、１８０ μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ基質溶液を加え、培養プレートをインキュベーターにて暗所で１～３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＭｕｌｔｉＳｋａｎＦｃ）により６３０ ｎｍでの吸光度を測定し、ＩＣ５０値を算出して抗ＣＤ４０抗体のインビトロ細胞活性を評価した。表６を参照すると、その結果から、２Ｆ１２、３Ｆ６、４Ｄ４、４Ｆ６、５Ａ９、５Ｂ８、８Ｃ１２、８Ｇ１０、９Ｅ６、９Ｆ１０、１０Ａ４は、何れもＣＦＺ５３３に相当するか又はそれよりやや強いレポーター遺伝子細胞阻害活性ＩＣ５０を有するが、２Ｆ１（配列が示されていない）を例とする他の抗体は、ＣＦＺ５３３よりもＩＣ５０が弱いことが示されている。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入され、当該細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子及びＮＦ－ｋＢ仲介性のＳＥＡＰゲノムを安定トランスフェクションしたもので、ＳＥＡＰ基質であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅにより上清において分泌されたＳＥＡＰを検出することでＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルを表現することができる。この実験は、ＣＤ４０Ｌによる細胞ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌの活性化を検出することにより、ＩＣ５０の大きさに基づいて抗ＣＤ４０抗体のインビトロ拮抗薬活性を評価した。細胞ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌを１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと３０ μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含むＤＭＥＭ培地に培養し、１：５又は１：１０の継代比率で１週間に２～３回継代した。継代時に、培地を吸引除去し、０．２５％のトリプシン５ ｍＬで細胞層をすすいだ後、トリプシンを吸引除去し、細胞をインキュベーターに入れて３～５分間消化し、新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁した。９６ウェル細胞培養プレートに１００ μＬの細胞懸濁液を加え、密度が５×１０＾５細胞／ｍＬで、培地が１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと３０ μｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含むＤＭＥＭであり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬの滅菌水のみを加えた。培養プレートをインキュベーターにおいて２４時間培養した（３７℃、５％のＣＯ２）。細胞が壁に付着した後、各ウェルに１００ μＬの勾配希釈した測定待ちの抗体を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。２５ ｎｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌ（Ｒ＆Ｄ、製品番号２７０６－ＣＬ）と２ μｇ／ｍＬのａｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ、製品番号ＭＡＢ０５０）を加え、培養プレートをインキュベーターで２０～２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。各ウェルから２０ μＬの細胞上清を取って新しい９６ウェルフラットプレートに入れ、１８０ μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ基質溶液を加え、培養プレートをインキュベーターにて暗所で１～３時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ ＭｕｌｔｉＳｋａｎＦｃ）により６３０ ｎｍでの吸光度を測定し、ＩＣ５０値を算出して抗ＣＤ４０抗体のインビトロ細胞活性を評価した。表６を参照すると、その結果から、２Ｆ１２、３Ｆ６、４Ｄ４、４Ｆ６、５Ａ９、５Ｂ８、８Ｃ１２、８Ｇ１０、９Ｅ６、９Ｆ１０、１０Ａ４は、何れもＣＦＺ５３３に相当するか又はそれよりやや強いレポーター遺伝子細胞阻害活性ＩＣ５０を有するが、２Ｆ１（配列が示されていない）を例とする他の抗体は、ＣＦＺ５３３よりもＩＣ５０が弱いことが示されている。
【0129】
【表6】
【0130】
実施例５． 抗ＣＤ４０抗体のヒト化
ウサギ抗体２Ｆ１２、３Ｆ６、９Ｅ６及び１０Ａ４の重・軽鎖可変領域の配列を抗体ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースと比較して、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。最終抗体をヒト化するヒト生殖細胞系列テンプレートの情報は表７を参照する。
ウサギ抗体２Ｆ１２、３Ｆ６、９Ｅ６及び１０Ａ４の重・軽鎖可変領域の配列を抗体ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースと比較して、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。最終抗体をヒト化するヒト生殖細胞系列テンプレートの情報は表７を参照する。
【0131】
【表7】
【0132】
ウサギ抗体のＣＤＲ領域を、選択されたヒト生殖細胞系列テンプレートに移植して、ヒト生殖細胞系列可変領域を置き換え、対応するヒトＩｇＧ定常領域（好ましくは、重鎖はＮ２９７Ａ変異付きのＩｇＧ１で、軽鎖はκである）と組換えを行った。その後、ウサギ抗体の３次元構造に基づき、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、及びＶＬとＶＨの立体配座に重要な影響を与える残基を復帰変異させるとともに、潜在的な翻訳後修飾リスク部位を変異させて、最終的なヒト化分子を得た。例示的に、２Ｆ１２及び９Ｅ６に対応するヒト化軽・重鎖可変領域の配列が示されており（表８、表９参照）、ここで、Ｌは軽鎖、Ｈは重鎖を表し、Ｌ及びＨに続く数字は、異なる復帰変異を含む異なるバージョンのヒト化配列を表す。
【0133】
【表8】
【0134】
９Ｅ６は、ヒト化の過程において、以下のＬＣＤＲ３を得た：
＞９Ｅ６－Ｌ１のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＮＶ （配列番号６９）
＞９Ｅ６－Ｌ２のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＳＧ （配列番号７０）
＞９Ｅ６－Ｌ３のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＴＧ （配列番号７１）
＞９Ｅ６－Ｌ４のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＱＧ （配列番号７２）
＞９Ｅ６－ＬのＬＣＤＲ３一般式
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７３）で、そのうち、Ｘ９はＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選らばれ、Ｘ１０はＶ又はＧから選らばれる。
＞９Ｅ６－Ｌ１のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＮＶ （配列番号６９）
＞９Ｅ６－Ｌ２のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＳＧ （配列番号７０）
＞９Ｅ６－Ｌ３のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＴＧ （配列番号７１）
＞９Ｅ６－Ｌ４のＬＣＤＲ３
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＱＧ （配列番号７２）
＞９Ｅ６－ＬのＬＣＤＲ３一般式
ＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７３）で、そのうち、Ｘ９はＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選らばれ、Ｘ１０はＶ又はＧから選らばれる。
【0135】
５Ａ９、９Ｅ６、９Ｆ１０は、次のような一般式の構造を有する：
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、それぞれＳＹＤＭＳ（配列番号２３）、ＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号２４）、ＧＷＴＲＬＤＬ（配列番号２５）で示され、
ＬＣＤＲ１は、ＱＸ１ＳＥＤＩＳＳＮＬＸ２（配列番号７４）で示され、そのうち、Ｘ１はＡ又はＳから選ばれ、Ｘ２はＡ又はＳから選ばれ、
ＬＣＤＲ２は、Ｘ３ＡＳＮＬＡＳ（配列番号７５）で示され、そのうち、Ｘ３はＡ又はＰから選ばれ、
ＬＣＤＲ３は、ＱＧＸ４ＹＷＸ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８ＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７６）で示され、そのうち、Ｘ４はＡ又はＧから選ばれ、Ｘ５はＳ又はＴから選ばれ、Ｘ６はＳ又はＧから選ばれ、Ｘ７はＴ又はＳから選ばれ、Ｘ８はＮ又はＹから選ばれ、Ｘ９はＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０はＶ又はＧから選ばれる。
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３は、それぞれＳＹＤＭＳ（配列番号２３）、ＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳ（配列番号２４）、ＧＷＴＲＬＤＬ（配列番号２５）で示され、
ＬＣＤＲ１は、ＱＸ１ＳＥＤＩＳＳＮＬＸ２（配列番号７４）で示され、そのうち、Ｘ１はＡ又はＳから選ばれ、Ｘ２はＡ又はＳから選ばれ、
ＬＣＤＲ２は、Ｘ３ＡＳＮＬＡＳ（配列番号７５）で示され、そのうち、Ｘ３はＡ又はＰから選ばれ、
ＬＣＤＲ３は、ＱＧＸ４ＹＷＸ５Ｘ６Ｘ７ＳＸ８ＦＧＸ９Ｘ１０（配列番号７６）で示され、そのうち、Ｘ４はＡ又はＧから選ばれ、Ｘ５はＳ又はＴから選ばれ、Ｘ６はＳ又はＧから選ばれ、Ｘ７はＴ又はＳから選ばれ、Ｘ８はＮ又はＹから選ばれ、Ｘ９はＮ、Ｓ、Ｔ又はＱから選ばれ、Ｘ１０はＶ又はＧから選ばれる。
【0136】
【表9】
【0137】
２Ｆ１２は、ヒト化の過程において、以下のＬＣＤＲ１を得た：
＞２Ｆ１２－Ｌ１のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＮＶＬＡ （配列番号８３）
＞２Ｆ１２－Ｌ２のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＱＧＬＡ （配列番号８４）
＞２Ｆ１２－Ｌ３のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＳＧＬＡ （配列番号８５）
＞２Ｆ１２－Ｌ４のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＴＧＬＡ （配列番号８６）
＞２Ｆ１２－Ｌ的ＬＣＤＲ１一般式
ＱＡＳＱＳＩＳＸ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号８７）で、そのうち、Ｘ２４はＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５はＶ又はＧから選ばれる。
＞２Ｆ１２－Ｌ１のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＮＶＬＡ （配列番号８３）
＞２Ｆ１２－Ｌ２のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＱＧＬＡ （配列番号８４）
＞２Ｆ１２－Ｌ３のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＳＧＬＡ （配列番号８５）
＞２Ｆ１２－Ｌ４のＬＣＤＲ１
ＱＡＳＱＳＩＳＴＧＬＡ （配列番号８６）
＞２Ｆ１２－Ｌ的ＬＣＤＲ１一般式
ＱＡＳＱＳＩＳＸ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号８７）で、そのうち、Ｘ２４はＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５はＶ又はＧから選ばれる。
【0138】
４Ｆ６、５Ｂ８、８Ｇ１０、８Ｃ１２、４Ｄ４、２Ｆ１２は、次のような一般式の構造を有する：
ＨＣＤＲ１はＳＹＧＶＸ１１（配列番号８８）で示され、そのうち、Ｘ１１はＳ又はＴから選ばれ、
ＨＣＤＲ２はＸ１２ＩＸ１３ＳＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＹＹＡＸ１７ＷＡＸ１８Ｓ（配列番号８９）で示され、そのうち、Ｘ１２はＡ又はＧから選ばれ、Ｘ１３はＧ又はＡから選ばれ、Ｘ１４はＴ、Ｓ又はＤから選ばれ、Ｘ１５はＴ、Ｓから選ばれ、Ｘ１６はＴ、Ａから選ばれ、Ｘ１７はＳ、Ｎから選ばれ、Ｘ１８はＫ又はＲから選ばれ、
ＨＣＤＲ３はＧＧＩＴＸ１９ＹＡＸ２０（配列番号９０）で示され、そのうち、Ｘ１９はＡ又はＶから選ばれ、Ｘ２０はＩ又はＭから選ばれ、
ＬＣＤＲ１はＱＡＳＸ２１Ｘ２２ＩＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号９１）で示され、そのうち、Ｘ２１はＱ又はＥから選ばれ、Ｘ２２はＳ又はＤから選ばれ、Ｘ２３はＳ又はＴから選ばれ、Ｘ２４はＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５はＶ又はＧから選ばれる。
ＨＣＤＲ１はＳＹＧＶＸ１１（配列番号８８）で示され、そのうち、Ｘ１１はＳ又はＴから選ばれ、
ＨＣＤＲ２はＸ１２ＩＸ１３ＳＸ１４ＧＸ１５Ｘ１６ＹＹＡＸ１７ＷＡＸ１８Ｓ（配列番号８９）で示され、そのうち、Ｘ１２はＡ又はＧから選ばれ、Ｘ１３はＧ又はＡから選ばれ、Ｘ１４はＴ、Ｓ又はＤから選ばれ、Ｘ１５はＴ、Ｓから選ばれ、Ｘ１６はＴ、Ａから選ばれ、Ｘ１７はＳ、Ｎから選ばれ、Ｘ１８はＫ又はＲから選ばれ、
ＨＣＤＲ３はＧＧＩＴＸ１９ＹＡＸ２０（配列番号９０）で示され、そのうち、Ｘ１９はＡ又はＶから選ばれ、Ｘ２０はＩ又はＭから選ばれ、
ＬＣＤＲ１はＱＡＳＸ２１Ｘ２２ＩＸ２３Ｘ２４Ｘ２５ＬＡ（配列番号９１）で示され、そのうち、Ｘ２１はＱ又はＥから選ばれ、Ｘ２２はＳ又はＤから選ばれ、Ｘ２３はＳ又はＴから選ばれ、Ｘ２４はＮ、Ｑ、Ｓ又はＴから選ばれ、Ｘ２５はＶ又はＧから選ばれる。
【0139】
ＬＣＤＲ２はＧＡＳＮＬＡＳ（配列番号３７）で示され、
ＬＣＤＲ３はＱＳＹＸ２６Ｘ２７ＳＸ２８Ｘ２９ＴＸ３０（配列番号９２）で示され、そのうち、Ｘ２６はＦ又はＹから選ばれ、Ｘ２７はＳ、Ｄ又はＮから選ばれ、Ｘ２８はＳ又はＦから選ばれ、Ｘ２９はＳ、Ｔ又はＹから選ばれ、Ｘ３０はＶ又はＩから選ばれる。
ＬＣＤＲ３はＱＳＹＸ２６Ｘ２７ＳＸ２８Ｘ２９ＴＸ３０（配列番号９２）で示され、そのうち、Ｘ２６はＦ又はＹから選ばれ、Ｘ２７はＳ、Ｄ又はＮから選ばれ、Ｘ２８はＳ又はＦから選ばれ、Ｘ２９はＳ、Ｔ又はＹから選ばれ、Ｘ３０はＶ又はＩから選ばれる。
【0140】
各ウサギ抗体のヒト化の各バージョンの軽重鎖同士を２つずつ組み合わせ、発現・精製した。命名規則は、重鎖と軽鎖可変領域番号の組み合わせであり、例えば、「２Ｆ１２－Ｌ１Ｈ１」とは、ＶＨとして配列番号６３、ＶＬとして配列番号６７が選ばれた抗体である。軽・重鎖定常領域は、それぞれヒトＩｇＧ１定常領域（Ｎ２９７Ａ変異付き、Ｅｕ番号付けシステム）配列とヒトｋａｐｐａ鎖定常領域の配列が採用された。
【0141】
例示的なヒト化分子２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２（２Ｆ１２－Ｌ４軽鎖と２Ｆ１２－Ｈ２重鎖を使用した）及び９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２（９Ｅ６－Ｌ４軽鎖と９Ｅ６－Ｈ２重鎖を使用した）の配列は次の通りであり、その軽・重鎖定常領域はそれぞれヒトＩｇＧ１定常領域（Ｎ２９７Ａ変異付き、Ｅｕ番号付けシステム）配列とヒトｋａｐｐａ鎖定常領域の配列が採用された。
【0142】
＞９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２ ＨＣ：
ＱＶＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＬＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＴＲＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９３
＞９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２ ＬＣ：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＤＩＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＬＬＩＦＰＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＱＧＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９４
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２ ＨＣ：
ＥＶＴＶＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＧＩＧＳＤＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＮＬＫＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＧＧＩＴＶＹＡＭＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９５
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２ ＬＣ：
ＡＦＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＴＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＬＬＩＶＧＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＳＹＦＳＳＳＳＴＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９６
ＱＶＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＬＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＴＲＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９３
＞９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２ ＬＣ：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＤＩＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＬＬＩＦＰＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＧＧＹＷＴＳＴＳＮＦＧＱＧＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９４
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２ ＨＣ：
ＥＶＴＶＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＧＩＧＳＤＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＮＬＫＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＧＧＩＴＶＹＡＭＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９５
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２ ＬＣ：
ＡＦＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＴＧＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＰＰＫＬＬＩＶＧＡＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＳＹＦＳＳＳＳＴＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号９６
【0143】
上記抗体の重鎖定常領域を改変し、抗体には、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴとＴ２５６Ｅ（Ｅｕ番号付けシステム）という５つの部位変異を有するヒトＩｇＧ１定常領域が採用され、軽鎖定常領域及び軽・重鎖可変領域が変更されなかった。新たに産生された抗体は、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ及び９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥであり、その完全な重鎖配列は以下の通りである：
＞９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ ＨＣ：
ＱＶＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＬＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＴＲＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９７
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ ＨＣ：
ＥＶＴＶＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＧＩＧＳＤＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＮＬＫＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＧＧＩＴＶＹＡＭＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９８
上記の下線領域は、重鎖又は軽鎖定常領域である。
＞９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ ＨＣ：
ＱＶＱＶＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＤＭＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＡＩＧＧＡＧＧＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＩＳＶＤＴＳＬＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＷＴＲＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９７
＞２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ ＨＣ：
ＥＶＴＶＫＥＳＧＰＶＬＶＫＰＴＥＴＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＧＧＩＧＳＤＧＳＡＹＹＡＳＷＡＫＳＲＬＴＩＳＲＤＴＮＬＫＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＲＧＧＩＴＶＹＡＭＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９８
上記の下線領域は、重鎖又は軽鎖定常領域である。
【0144】
例示的なＩｇＧ Ｆｃは以下の通りである：
＞ ＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｎ２９７Ａ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９９
＞ ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＡＡＹＴＥ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１００
＞ ＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｎ２９７Ａ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号９９
＞ ＩｇＧ１－Ｆｃ（ＡＡＹＴＥ）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１００
【0145】
実施例６． ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＲａｊｉ細胞結合実験
Ｒａｊｉ細胞の表面でのヒトＣＤ４０の高発現は、細胞表面のヒトＣＤ４０に対するＣＤ４０拮抗型抗体の結合特性の検出に使用することができる。
Ｒａｊｉ細胞の表面でのヒトＣＤ４０の高発現は、細胞表面のヒトＣＤ４０に対するＣＤ４０拮抗型抗体の結合特性の検出に使用することができる。
【0146】
Ｒａｊｉを１．５Ｅ５／ウェルでプレートに播き、様々な濃度のＣＤ４０拮抗型抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄した後、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８に複合した抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体）を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により細胞表面の蛍光強度を検出した。
【0147】
その結果、表１０に示すように、そのうち２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２とＣＦＺ５３３とは、Ｒａｊｉ表面のヒトＣＤ４０に対して類似の結合能力を有する。
【0148】
【表10】
【0149】
実施例７． ヒトＣＤ４０及びカニクイザルＣＤ４０に対する抗ＣＤ４０抗体の親和性アッセイ
測定待ちの抗体を抗ヒトＦｃのチップへアフィニティー捕捉した後、一連の濃度勾配でのＨｉｓタグ付きのヒト又はカニクイザルＣＤ４０抗原をチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合・解離曲線を得た。実験に使用された緩衝液は、Ｄ．Ｉ．Ｗａｔｅｒで１×（ｐＨ７．４）に希釈されたＨＢＳ－ＥＰ＋１０×緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）である。実験から得られたデータを（１：１）Ｂｉｎｄｉｎｇモデルでフィッティングし、表１１に示すように、親和性の値を得た。
測定待ちの抗体を抗ヒトＦｃのチップへアフィニティー捕捉した後、一連の濃度勾配でのＨｉｓタグ付きのヒト又はカニクイザルＣＤ４０抗原をチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合・解離曲線を得た。実験に使用された緩衝液は、Ｄ．Ｉ．Ｗａｔｅｒで１×（ｐＨ７．４）に希釈されたＨＢＳ－ＥＰ＋１０×緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）である。実験から得られたデータを（１：１）Ｂｉｎｄｉｎｇモデルでフィッティングし、表１１に示すように、親和性の値を得た。
【0150】
９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２はＣＦＺ５３３に比べてヒトＣＤ４０に対して類似の結合定数を有するが、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２のカニクイザルＣＤ４０への結合親和性が比較的強く、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２のカニクイザルＣＤ４０への結合親和性がやや弱い。
【0151】
【表11】
【0152】
実施例８． 抗ＣＤ４０抗体のレポーター遺伝子細胞活性実験
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入され、当該細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子及びＮＦ－ｋＢ仲介性のＳＥＡＰゲノムを安定トランスフェクションしたもので、ＳＥＡＰ基質であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅにより上清において分泌されたＳＥＡＰの含有量を検出することでＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルを表現することができる。この実験は、ＣＤ４０Ｌ誘導性のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞の活性化に対するＣＤ４０拮抗型抗体の阻害作用を検出することにより、ＩＣ５０の大きさに基づいてＣＤ４０拮抗型抗体のインビトロ細胞活性を評価した。
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｃａｔ＃ｈｋｂ－ｃｄ４０）から購入され、当該細胞は、ヒトＣＤ４０遺伝子及びＮＦ－ｋＢ仲介性のＳＥＡＰゲノムを安定トランスフェクションしたもので、ＳＥＡＰ基質であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅにより上清において分泌されたＳＥＡＰの含有量を検出することでＣＤ４０シグナル伝達経路の活性化レベルを表現することができる。この実験は、ＣＤ４０Ｌ誘導性のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞の活性化に対するＣＤ４０拮抗型抗体の阻害作用を検出することにより、ＩＣ５０の大きさに基づいてＣＤ４０拮抗型抗体のインビトロ細胞活性を評価した。
【0153】
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞を１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎ、１００ μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎと３０ ｐｇ／ｍＬのＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎを含むＤＭＥＭ培地において培養し、１週間に２～３回継代した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＣＤ４０Ｌ細胞を５Ｅ４／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに播き（培地はＤＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１００ μｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎである）、一晩培養した。細胞が壁に付着した後、各ウェルに１００ μＬの勾配希釈した測定待ちの抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ＣＤ４０Ｌ－ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ、２７０６－ＣＬ－０２５）及び抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ０５０－５００）を加え、一晩培養した。細胞を遠心分離し、２０ μＬの細胞上清を新しい９６ウェルホワイトプレートに移し、１８０ μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ基質溶液を加え、暗所で１５分間インキュベートし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーにより６２０ ｎｍでの吸光度を測定し、ＩＣ５０値を算出してＣＤ４０拮抗型抗体のインビトロ細胞活性を評価した。
【0154】
その結果、表１２及び図１Ａ～１Ｂに示すように、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２とＣＦＺ５３３とはレポーター遺伝子システムに対して類似の阻害活性を有するが、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２はＣＦＺ５３３よりも阻害活性が優れている。
【0155】
【表12】
【0156】
実施例９． 抗ＣＤ４０抗体のＢ細胞活性化実験系における阻害活性
ＣＤ４０はＢ細胞に高く発現され、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合すると、Ｂ細胞の活性化を誘導し、一連の活性化マーカーの発現をアップレギュレートすることができる。ＣＤ４０拮抗型抗体は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合を遮断することにより、Ｂ細胞の免疫活性化過程を解除する。
ＣＤ４０はＢ細胞に高く発現され、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合すると、Ｂ細胞の活性化を誘導し、一連の活性化マーカーの発現をアップレギュレートすることができる。ＣＤ４０拮抗型抗体は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合を遮断することにより、Ｂ細胞の免疫活性化過程を解除する。
【0157】
ヒトＰＢＭＣを２Ｅ５／ウェル、５０ μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに播いた（培地はＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシンである）。各ウェルに勾配希釈した測定待ちの抗体５０ μＬを加え、３７℃、５％のＣＯ２の条件で０．５時間共インキュベートした。各ウェルにＣＤ４０Ｌ－ｈｉｓ及び抗Ｈｉｓ抗体を加え、一晩刺激した。翌日、遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ μＬの１：１０００で希釈したＦｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ＥＦ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６５０８６５１４）を加えて室温で１５分間染色した。細胞を２回洗浄した後、１００ μＬの１：２００で希釈したヒトＦｃブロッキング剤（Ｆｃ ｂｌｏｃｋｅｒ、ＢＤ、５６４２２０）を加えて室温で１０分間ブロッキングした。細胞を遠心分離した後、１：２００で希釈したフロー抗体（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２２３０）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ６９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１０９１０））を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、２００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により細胞表面の蛍光強度を検出した。
【0158】
その結果、表１３及び図２Ａ～２Ｂに示すように、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２はＣＦＺ５３３に比べて類似のＢ細胞活性化阻害活性を有する。２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２は、Ｂ細胞阻害活性がＣＦＺ５３３よりも強い。
【0159】
【表13】
【0160】
抗体を加えた後、ＣＤ１９＋ＣＤ６９＋シグナルはバックグラウンド値を下回ったが、これはおそらくＢ細胞のバックグラウンド活性化がある程度阻害されたためであろう（ＣＤ４０Ｌ誘導性のシグナルの阻害以外）。
【0161】
実施例１０． 抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化実験系における阻害活性
ＣＤ４０は樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ、ＤＣ）に高く発現され、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合すると、ＤＣ活性化を誘導し、ＤＣ細胞表面での複数の活性化マーカーの発現をアップレギュレートするとともに、複数種の炎症性因子が分泌されるようにＤＣを促進し、免疫反応を更に拡大することができる。ＣＤ４０拮抗型抗体は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合を遮断することにより、ＤＣ細胞の免疫活性化過程を解除する。
ＣＤ４０は樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ、ＤＣ）に高く発現され、ＣＤ４０ＬはＣＤ４０に結合すると、ＤＣ活性化を誘導し、ＤＣ細胞表面での複数の活性化マーカーの発現をアップレギュレートするとともに、複数種の炎症性因子が分泌されるようにＤＣを促進し、免疫反応を更に拡大することができる。ＣＤ４０拮抗型抗体は、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の結合を遮断することにより、ＤＣ細胞の免疫活性化過程を解除する。
【0162】
ＥｓａｙＳｅｐＴＭヒトＣＤ１４選別試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１９３５９）により新鮮な初代ヒト末梢血ＰＢＭＣから単核細胞を選別して富化し、ＲＰＭＩ－１６４０培地（１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシン）、５０ ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００－０４）及び５０ ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、３００－０３）により６日間分化した。７日目に、分化済みのＤＣ細胞を、１Ｅ５／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに播いた。各ウェルに勾配希釈した測定待ちの抗体を加え、３７℃、５％のＣＯ２の条件で０．５時間共インキュベートした。各ウェルに最終濃度であるＣＤ４０Ｌ－ｈｉｓと抗Ｈｉｓ抗体を更に加えた。４８時間培養した後、ＤＣ細胞の活性化レベルをフローサイトメトリーで検出した：遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）で２回洗浄し、１００ μＬの１：１０００で希釈したＦｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ＥＦ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６５０８６５１４）を加えて室温で１５分間染色した。細胞を２回洗浄した後、１００ μＬの１：２００で希釈したヒトＦｃブロッキング剤（ＢＤ、５６４２２０）を加えて室温で１０分間ブロッキングした。細胞を遠心分離した後、１：２００で希釈したフロー抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７００ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３７２２０）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１商標 ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５２２１）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５４１２））を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、２００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により細胞表面の蛍光強度を検出した。
【0163】
更に、それぞれ２４時間（ＴＮＦα、Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＨＴＮＦＡＰＥＧ）と４８時間（ＩＬ－１２／２３ ｐ４０、Ｎｏｖｕｓ、ＶＡＬ１２１）培養した後、上清におけるサイトカインの分泌レベルを検出した。
【0164】
実験の結果は表１４及び図３Ａ～３Ｄに示すように、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２及び２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２が対照抗体ＣＦＺ５３３と類似のＤＣ細胞阻害活性を有する。
【0165】
【表14】
【0166】
実施例１１． ヒト化抗ＣＤ４０抗体のＢ細胞活性化実験系におけるアゴニスト活性
ＣＤ４０はＴＮＦスーパーファミリー受容体に属し、リガンドＣＤ４０Ｌに結合するか又は抗体により架橋されると、下流シグナル伝達経路の特異的と非特異的活性化を媒介することができるので、ＣＤ４０Ｌを加えない条件でＣＤ４０拮抗型抗体のＢ細胞へのバックグラウンドアゴニスト活性を検出することができる。
ＣＤ４０はＴＮＦスーパーファミリー受容体に属し、リガンドＣＤ４０Ｌに結合するか又は抗体により架橋されると、下流シグナル伝達経路の特異的と非特異的活性化を媒介することができるので、ＣＤ４０Ｌを加えない条件でＣＤ４０拮抗型抗体のＢ細胞へのバックグラウンドアゴニスト活性を検出することができる。
【0167】
ヒトＰＢＭＣを２Ｅ５／ウェル、１００ μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに播いた（培地はＲＰＭＩ－１６４０、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン－ストレプトマイシンである）。各ウェルに１００ μＬの勾配希釈した測定待ちの抗体を加え、３７℃、５％のＣＯ２で一晩培養した。翌日、遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００ μＬの１：１０００で希釈したＦｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ＥＦ７８０を加えて室温で１５分間染色した。細胞を２回洗浄した後、１００ μＬの１：２００で希釈したヒトＦｃブロッキング剤を加えて室温で１０分間ブロッキングした。細胞を遠心分離した後、１：２００で希釈したフロー抗体（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２２３０）、ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ６９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１０９１０））を加え、４℃で０．５時間インキュベートした。遠心分離して上清を除去し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、２００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ）により細胞表面の蛍光強度を検出した。
【0168】
その結果、図４に示すように、ＣＤ４０アゴニスト抗体９Ｅ５－ＳＥＬＦＮＳ（ＷＯ２０２０１０８６１１Ａ１）はＢ細胞を用量依存的に活性化しているが、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２及び２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２は２．５ ｎＭでも明らかなＢ細胞アゴニスト活性を示していない。
【0169】
実施例１２． マウスＴ細胞依存性の体液性免疫応答（ＴＤＡＲ）モデル
雌のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスは、６～７週齢で、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ ＪｉａｎｇＳｕ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、生産ライセンス：ＳＣＸＫ（蘇）－２０１６－０００４、ヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスの合格証明書番号：３２０７２６２００１００１６７７７３。動物が到着した後、７日間適応的に飼育し、ランダムに群分けした。実験の０日目に、各群のマウスから１匹を取って採血した後、腹腔内注射で投与した。１日目にマウスに５０ μｇのＫＬＨ（ＫＬＨ：完全フロイントアジュバントＣＦＡ＝１：１乳化免疫複合物）／匹で腹腔内注射して免疫した。実験の１５日目に、５０ μｇのＫＬＨ（ＫＬＨ：不完全フロイントアジュバントＩＦＡ＝１：１乳化免疫複合物）／匹で腹腔内注射して二次免疫した。各群の薬剤を週２回腹腔内注射し、それぞれ７、１４、２１と２８日目に眼窩静脈叢から～１５０ μＬ採血した。全血を室温で１～４時間静置し、７０００ ｒｐｍの速度で４℃で１０分間遠心分離して血清を分離し、－８０℃で保存して使用に備えた。具体的な実験プロセスは図５に示されている。
雌のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスは、６～７週齢で、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ ＪｉａｎｇＳｕ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、生産ライセンス：ＳＣＸＫ（蘇）－２０１６－０００４、ヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスの合格証明書番号：３２０７２６２００１００１６７７７３。動物が到着した後、７日間適応的に飼育し、ランダムに群分けした。実験の０日目に、各群のマウスから１匹を取って採血した後、腹腔内注射で投与した。１日目にマウスに５０ μｇのＫＬＨ（ＫＬＨ：完全フロイントアジュバントＣＦＡ＝１：１乳化免疫複合物）／匹で腹腔内注射して免疫した。実験の１５日目に、５０ μｇのＫＬＨ（ＫＬＨ：不完全フロイントアジュバントＩＦＡ＝１：１乳化免疫複合物）／匹で腹腔内注射して二次免疫した。各群の薬剤を週２回腹腔内注射し、それぞれ７、１４、２１と２８日目に眼窩静脈叢から～１５０ μＬ採血した。全血を室温で１～４時間静置し、７０００ ｒｐｍの速度で４℃で１０分間遠心分離して血清を分離し、－８０℃で保存して使用に備えた。具体的な実験プロセスは図５に示されている。
【0170】
具体的な投与計画は表１５に示すように、マウス血清を週ごとに分離して抗ＫＬＨの特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより検出した。
【0171】
【表15】
【0172】
その結果、図５Ｂ及び表１６に示すように、１ ｍｇ／ｋｇのＣＤ４０拮抗型抗体は、２回免疫後の抗ＫＬＨの特異的ＩｇＧの産生を顕著に阻害している。低用量である０．３ ｍｇ／ｋｇの９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２及び２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２は、同用量ＣＦＺ５３３に比べて、２回免疫後の抗ＫＬＨのＩｇＧの産生に対してより優れた阻害作用を有する。
【0173】
【表16】
【0174】
実施例１３． マウス皮膚移植拒絶モデル
６週齢で雄のｂａｌｂ／ｃマウスは、上海市計画生育科学研究所実験動物経営部から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、合格証番号：２０１８０００６０２３３９３。
６週齢で雄のｂａｌｂ／ｃマウスは、上海市計画生育科学研究所実験動物経営部から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、合格証番号：２０１８０００６０２３３９３。
【0175】
雌のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスは、６～７週齢で、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ ＪｉａｎｇＳｕ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、合格証明書番号：３２０７２６２００１００１７９７７８。
【0176】
動物が到着した後、７日間適応的に飼育し、ランダムに群分けした。実験の２日前に、マウスにタクロリムスＦＫ５０６又はＣＤ４０拮抗型抗体を腹腔内注射した。実験の０日目に、４％の抱水クロラールでドナーＢａｌｂ／Ｃマウス及びＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスを麻酔し、ドナーのマウスの尾を取り除き、全周の長さが１ ｃｍの尾部皮膚を分離した。レシピエントマウスの背部を除毛し、皮膚層に沿って切開し、背部の脂肪及び結合組織を保持しながら等面積の皮膚を除去し、ドナー皮膚をレシピエントマウスの切開部に置き、接着剤で辺縁皮膚を縫合し、ケージに入れて回復させた。具体的な実験プロセスは図６Ａに示されている。
【0177】
表１７の投与計画によってマウスに投与し、マウスを７日間回復させた後、毎日マウスの皮膚の生存状態を観察し、拒絶採点に従って拒絶スコアを記録した。採点システムは以下の通りである：３：皮膚は赤みが認められず、滑らかであること、２：皮膚の一部は赤みが出て、光沢が失われ、乾燥していること、１：皮膚の殆どは赤くなり、縞模様がなく、縮んでいること、０：移植拒絶により皮膚の８０％が壊死したこと。
【0178】
【表17-1】
【表17-2】
【0179】
その結果、図６Ｂ及び表１８～２０に示すように、ＣＤ４０拮抗型抗体は、モデル群に比べて何れもマウス皮膚移植片の採点を顕著に改善し、皮膚移植片の生存期間を延長することができる。皮膚移植片を採点する過程では、それまでに相違が見られなかったため、８日目から採点した。９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２及び２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２は、対照抗体ＣＦＺ５３３よりも優れた抗移植拒絶活性を示している。
【0180】
【表18】
【0181】
【表19】
【0182】
【表20】
【0183】
また、図７と表２１～表２３に示すように、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２及び２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２はタクロリムスと併用した後、抗マウス皮膚移植拒絶に対する効果が更に向上している。
【0184】
【表21】
【0185】
【表22】
【0186】
【表23】
【0187】
実施例１４． ヒト化抗ＣＤ４０抗体のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスにおけるＰＫ検出
雌のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスは、６～７週齢で、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ ＪｉａｎｇＳｕ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、生産ライセンス：ＳＣＸＫ（蘇）－２０１６－０００４、ヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスの合格証明書番号：３２０７２６２００１００１５４６３２。動物が到着した後、７日間適応的に飼育し、ランダムに群分けした。実験の０日目に、各群のマウスに１０ ｍｇ／ｋｇで抗ＣＤ４０抗体を腹腔内注射し、投与後の１５分間、４時間、８時間、１日間、２日間、４日間、７日間、１０日間と１４日間に、それぞれ１００～１５０ μＬ採血し、１０ μＬのＥＤＴＡ－Ｋ２（０．１ Ｍ）により抗凝固し、氷上で保存した。ＥＬＩＳＡにより異なる時点でのマウス血漿中の抗体濃度を検出した。具体的な検出方法は以下の通りである：ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｃａｔ＃６０９－１０１－０１７）をＰＢＳで２．５ μｇ／ｍＬに希釈し、５０ μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した後、各ウェルに５０ μＬのブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。マウス血漿と検出待ちの抗体の検量線を加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、５０ μＬ／ウェルで抗ｈｌｇＧ Ｆａｂ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ａ０２９３、１：１００００）を加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。各ウェルに１００ μＬのＴＭＢを加え、暗所で５分間反応させた。各ウェルに１００ μＬの０．１６ Ｍの硫酸を加えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーにより４５０ ｎｍのＯＤ値を読み取り、ＣＤ４０拮抗型抗体の濃度を算出した。
雌のヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスは、６～７週齢で、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ ＪｉａｎｇＳｕ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入された。飼育環境：ＳＰＦ、生産ライセンス：ＳＣＸＫ（蘇）－２０１６－０００４、ヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスの合格証明書番号：３２０７２６２００１００１５４６３２。動物が到着した後、７日間適応的に飼育し、ランダムに群分けした。実験の０日目に、各群のマウスに１０ ｍｇ／ｋｇで抗ＣＤ４０抗体を腹腔内注射し、投与後の１５分間、４時間、８時間、１日間、２日間、４日間、７日間、１０日間と１４日間に、それぞれ１００～１５０ μＬ採血し、１０ μＬのＥＤＴＡ－Ｋ２（０．１ Ｍ）により抗凝固し、氷上で保存した。ＥＬＩＳＡにより異なる時点でのマウス血漿中の抗体濃度を検出した。具体的な検出方法は以下の通りである：ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｃａｔ＃６０９－１０１－０１７）をＰＢＳで２．５ μｇ／ｍＬに希釈し、５０ μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した後、各ウェルに５０ μＬのブロッキング溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。マウス血漿と検出待ちの抗体の検量線を加え、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、５０ μＬ／ウェルで抗ｈｌｇＧ Ｆａｂ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ａ０２９３、１：１００００）を加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄した。各ウェルに１００ μＬのＴＭＢを加え、暗所で５分間反応させた。各ウェルに１００ μＬの０．１６ Ｍの硫酸を加えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーにより４５０ ｎｍのＯＤ値を読み取り、ＣＤ４０拮抗型抗体の濃度を算出した。
【0188】
その結果、表２４及び図８に示すように、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２、２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２と対照分子ＣＦＺ５３３とは、ヒトＣＤ４０トランスジェニックマウスにおいて類似のＰＫ特性を有する。
【0189】
【表24】
【0190】
実施例１５． ヒト化抗ＣＤ４０抗体のヒトＦｃＲｎへの親和性測定
測定待ちの抗体を抗ヒトＦａｂのチップへアフィニティー捕捉した後、一連の濃度勾配でのヒトＦｃＲｎ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍから購入）をチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、反応が定常状態になった時のシグナルをリアルタイムで検出した。実験に使用された緩衝液は、Ｄ．Ｉ．Ｗａｔｅｒで１×（ｐＨ７．４）に希釈されたＨＢＳ－ＥＰ＋１０×緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）である。実験から得られたデータを定常状態結合（Ｓｔｅａｄｙ Ｓｔａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ）モデルでフィッティングし、表２５に示すように、親和性の値を得た。親抗体に比べて、ＡＡＹＴＥ変異を持つ抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＦｃＲｎとの結合親和性がより高い。
測定待ちの抗体を抗ヒトＦａｂのチップへアフィニティー捕捉した後、一連の濃度勾配でのヒトＦｃＲｎ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍから購入）をチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ機器により、反応が定常状態になった時のシグナルをリアルタイムで検出した。実験に使用された緩衝液は、Ｄ．Ｉ．Ｗａｔｅｒで１×（ｐＨ７．４）に希釈されたＨＢＳ－ＥＰ＋１０×緩衝溶液（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）である。実験から得られたデータを定常状態結合（Ｓｔｅａｄｙ Ｓｔａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ）モデルでフィッティングし、表２５に示すように、親和性の値を得た。親抗体に比べて、ＡＡＹＴＥ変異を持つ抗ＣＤ４０抗体は、ヒトＦｃＲｎとの結合親和性がより高い。
【0191】
【表25】
【0192】
実施例１６． ＦｃにＡＡＹＴＥ変異が持たれた抗ＣＤ４０抗体のＢ細胞活性化実験系における阻害活性
実施例１０中の方法を参照して、ＦｃにＡＡＹＴＥ変異が持たれた抗ＣＤ４０抗体２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥのＢ細胞活性化実験系における阻害活性を検出した。その結果、図９Ａ～図９Ｂに示すように、Ｆｃ変異した抗ＣＤ４０抗体は、親抗ＣＤ４０抗体と類似のＢ細胞阻害活性を有する。
実施例１０中の方法を参照して、ＦｃにＡＡＹＴＥ変異が持たれた抗ＣＤ４０抗体２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥのＢ細胞活性化実験系における阻害活性を検出した。その結果、図９Ａ～図９Ｂに示すように、Ｆｃ変異した抗ＣＤ４０抗体は、親抗ＣＤ４０抗体と類似のＢ細胞阻害活性を有する。
【0193】
実施例１７． ＦｃにＡＡＹＴＥ変異がもたれた抗ＣＤ４０抗体のＤＣ細胞活性化実験系における阻害活性
実施例１１中の方法を参照して、ＦｃにＡＡＹＴＥ変異がもたれた抗ＣＤ４０抗体２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥのＤＣ細胞活性化実験系における阻害活性を検出した。その結果、図１０Ａ～図１０Ｄに示すように、Ｆｃ変異した抗ＣＤ４０抗体は、親抗ＣＤ４０抗体と類似のＤＣ細胞阻害活性を有する。
実施例１１中の方法を参照して、ＦｃにＡＡＹＴＥ変異がもたれた抗ＣＤ４０抗体２Ｆ１２－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥ、９Ｅ６－Ｌ４Ｈ２－ＡＡＹＴＥのＤＣ細胞活性化実験系における阻害活性を検出した。その結果、図１０Ａ～図１０Ｄに示すように、Ｆｃ変異した抗ＣＤ４０抗体は、親抗ＣＤ４０抗体と類似のＤＣ細胞阻害活性を有する。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【配列表】
【国際調査報告】