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▶ サイミューン セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】胸腺細胞組成物及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20240621BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240621BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240621BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240621BHJP
C07K 14/71 20060101ALI20240621BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
C12Q1/68
C12Q1/06
C12N5/10
C07K14/705
C07K14/71
C12N9/88
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579537
(86)(22)【出願日】2022-06-22
(85)【翻訳文提出日】2024-02-07
(86)【国際出願番号】 US2022034579
(87)【国際公開番号】W WO2022271862
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/214,176
(32)【優先日】2021-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/256,445
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/296,250
(32)【優先日】2022-01-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/321,142
(32)【優先日】2022-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523483304
【氏名又は名称】サイミューン セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】リム ビング
(72)【発明者】
【氏名】ルメルツ ダ ローシャ エドロアルド
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B065AA90X
4B065BB40
4H045AA10
4H045EA54
4H045FA72
(57)【要約】
本開示はインビトロで胸腺細胞を生成及び維持するための方法を提供する。本開示において、胸腺細胞を含む細胞集団の組成物及びシステムも提供する。一態様において、本開示は、可溶性因子、ミネラル、又はそれらの組み合わせの存在下で細胞集団を培養して、胸腺細胞への前記細胞集団の分化又は成熟を誘導することによって、インビトロで胸腺細胞の集団を生成するための方法を提供し、ここで、前記細胞集団は、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように任意に操作され、かつ前記細胞集団は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞、及び前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞からなる群から選択される１つ又は複数の細胞型を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）胸腺細胞の１つ又は複数の集団を生成する工程、ｂ）胸腺細胞の前記集団の各々からＲＮＡを抽出及び配列決定する工程、
ｃ）胸腺細胞の前記集団の各々について試験胸腺マップを生成するために、ａ）で配列決定されたＲＮＡを分析して胸腺細胞の各集団内の亜集団を同定する工程、
ｄ）前記試験胸腺マップの各々を参照胸腺マップと比較する工程、及び
ｅ）約０．７～１．４の亜集団比（ＳＰＲ）又は相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を有する試験胸腺マップを選択することにより、胸腺細胞産物を同定する工程
によって生成される、胸腺細胞産物。
【請求項2】
胸腺細胞の各集団内の前記亜集団が、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及びタフト／イオノサイト細胞のうちの１つ又は複数を含む、請求項１に記載の胸腺細胞産物。
【請求項3】
前記ＳＰＲが約０．７～１．４である、請求項１から２のいずれか１項に記載の胸腺細胞産物。
【請求項4】
前記ＳＰＲが、ｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、及びタフト／イオノサイトＳＰＲである、請求項３に記載の胸腺細胞産物。
【請求項5】
前記ｉＴＥＣ ＳＰＲ、前記ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、前記ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、前記Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、前記ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、前記角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、前記繊毛ＳＰＲ、前記ミエリンＳＰＲ、前記筋様ＳＰＲ、前記神経内分泌ＳＰＲ、及び前記タフト／イオノサイトＳＰＲが、約０．７～１．４である、請求項１から４のいずれか１項に記載の胸腺細胞産物。
【請求項6】
前記ＳＰＲがｉＴＥＣ ＳＰＲであり、かつ前記ｉＴＥＣが１である、請求項５に記載の胸腺細胞産物。
【請求項7】
前記ＲＣＴＲが約０．７～１．４である、請求項１に記載の胸腺細胞産物。
【請求項8】
前記ＲＣＴＲが１である、請求項７に記載の胸腺細胞産物。
【請求項9】
胸腺細胞の前記１つ又は複数の集団が、幹細胞の分化によって調製される、請求項１に記載の胸腺細胞産物。
【請求項10】
胸腺細胞の前記１つ又は複数の集団が、人工多能性幹細胞の分化によって調製される、請求項９に記載の胸腺細胞産物。
【請求項11】
前記参照胸腺マップが、１つ又は複数のヒト胸腺から作成される、請求項１に記載の胸腺細胞産物。
【請求項12】
前記ヒト胸腺が、胎児ヒト胸腺、生後ヒト胸腺、青年期胸腺、成体ヒト胸腺、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の胸腺細胞産物。
【請求項13】
前記亜集団がｉＴＥＣを含み、かつｉＴＥＣが、ＩＧＫＣ（ＥＮＳＧ０００００２１１５９２）、ＡＮＡＸ２、ＬＩＭＡ１（ＥＮＳＧ００００００５０４０５）、ＥＧＦＲ（ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）、ＡＳＣＬ１（ＥＮＳＧ０００００１３９３５２）、ＨＥＳ１（ＥＮＳＧ０００００１１４３１５）、ＪＵＮＤ（ＥＮＳＧ０００００１３０５２２）、ＦＯＳ（ＥＮＳＧ０００００１７０３４５）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１５０３４７）、ＩＲＦ１（ＥＮＳＧ０００００１２５３４７）、ＭＡＦＢ（ＥＮＳＧ０００００２０４１０３）、ＩＦＩ１６（ＥＮＳＧ０００００１６３５６５） 、ＦＯＸＣ１（ＥＮＳＧ００００００５４５９８）、ＳＴＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１１５４１５）、ＪＵＮＢ（ＥＮＳＧ０００００１７１２２３）、ＥＧＦＲ１、ＺＦＰ３６（ＥＮＳＧ０００００１２８０１６）、ＪＵＮ（ＥＮＳＧ０００００１７７６０６）、ＦＯＳＢ（ＥＮＳＧ０００００１２５７４０）、ＩＥＲ２（ＥＮＳＧ０００００１６０８８８）、ＰＡＸ９（ＥＮＳＧ０００００１９８８０７）、及び／又はＨＩＦ１Ａ（ＥＮＳＧ０００００１００６４４）のうちの１つ又は複数の発現を含む、請求項２に記載の胸腺細胞産物。
【請求項14】
前記亜集団がｃＴＥＣを含み、かつｃＴＥＣが、ＰＳＭＡ３（ＥＮＳＧ０００００１００５６７）、ＦＡＢＰ５（ＥＮＳＧ０００００１６４６８７）、ＡＰＲＴ（ＥＮＳＧ０００００１９８９３１）、ＬＳＭ６（ＥＮＳＧ０００００１６４１６７）、ＣＴＳＶ（ＥＮＳＧ０００００１３６９４３）、ＳＮＲＰＥ（ＥＮＳＧ０００００１８２００４）、ＥＣＨＳ１（ＥＮＳＧ０００００１２７８８４）、ＨＳＰＥ１（ＥＮＳＧ０００００１１５５４１）、ＲＡＮ（ＥＮＳＧ０００００１３２３４１）、ＴＭＡ７（ＥＮＳＧ０００００２３２１１２）、ＴＩＭＭ１３（ＥＮＳＧ００００００９９８００）、ＬＤＨＢ（ＥＮＳＧ０００００１１１７１６）、ＥＣＩ１（ＥＮＳＧ０００００１６７９６９）、ＧＣＳＨ（ＥＮＳＧ０００００１４０９０５）、ＮＯＰ５８（ＥＮＳＧ００００００５５０４４）、ＭＲＰＬ１１（ＥＮＳＧ０００００１７４５４７）、ＳＴＯＭＬ２（ＥＮＳＧ０００００１６５２８３）、ＩＮＧ２（ＥＮＳＧ０００００１６８５５６）、ＴＯＭＭ７（ＥＮＳＧ０００００１９６６８３）、ＭＲＰＳ３４（ＥＮＳＧ００００００７４０７１）、ＭＲＰＬ１４（ＥＮＳＧ０００００１８０９９２）、ＭＲＰＬ５７（ＥＮＳＧ０００００１７３１４１）、ＩＭＰ３（ＥＮＳＧ０００００１７７９７１）、ＭＺＴ２Ａ（ＥＮＳＧ０００００１７３２７２）、及び／又はＸＲＣＣ６（ＥＮＳＧ０００００１９６４１９）のうちの１つ又は複数の発現を含む、請求項２に記載の胸腺細胞産物。
【請求項15】
前記亜集団が角質細胞様ｍＴＥＣを含み、かつ角質細胞様ｍＴＥＣが、ＣＤ２４（ＥＮＳＧ０００００２７２３９８）、ＥＬＦ３（ＥＮＳＧ０００００１６３４３５）、ＣＬＤＮ４（ＥＮＳＧ０００００１８９１４３）、ＭＡＬ２（ＥＮＳＧ０００００１４７６７６）、ＡＳＡＨ１（ＥＮＳＧ０００００１０４７６３）、ＴＭＥＭ１２３（ＥＮＳＧ０００００１５２５５８）、ＴＭＢＩＭ６（ＥＮＳＧ０００００１３９６４４）、ＬＧＡＬＳ３（ＥＮＳＧ０００００１３１９８１－）、ＭＹＬ１２Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１１８６８０）、ＡＣＡＤＶＬ（ＥＮＳＧ００００００７２７７８）、ＫＲＴ１９（ＥＮＳＧ０００００１７１３４５）、ＳＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１３００６６）、ＲＡＢ２５（ＥＮＳＧ０００００１３２６９８）、ＷＦＤＣ２（ＥＮＳＧ０００００１０１４４３）、ＶＡＭＰ８（ＥＮＳＧ０００００１１８６４０）、ＳＰＩＮＴ１（ＥＮＳＧ０００００１６６１４５）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＥＮＳＧ００００００２１３５５）、ＣＤＨ１（ＥＮＳＧ００００００３９０６８）、ＧＳＮ（ＥＮＳＧ０００００１４８１８０）、ＳＤＣ４（ＥＮＳＧ０００００１２４１４５）、ＭＧＳＴ２（ＥＮＳＧ００００００８５８７１）、ＣＡＳＴ（ＥＮＳＧ０００００１５３１１３）、Ｂ４ＧＡＬＴ１（ＥＮＳＧ００００００８６０６２）、ＰＥＲＰ（ＥＮＳＧ０００００１１２３７８）、及び／又はＤＭＫＮ（ＥＮＳＧ０００００１６１２４９）のうちの１つ又は複数の発現を含む、請求項２に記載の胸腺細胞産物。
【請求項16】
インビトロで胸腺細胞の集団を生成するための方法であって、可溶性因子、ミネラル、又はそれらの組み合わせの存在下で細胞集団を培養して、胸腺細胞への前記細胞集団の分化又は成熟を誘導するステップ
を含み、
ここで、前記細胞集団が、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように任意に操作され、かつ
前記細胞集団が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞、及び前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞からなる群から選択される１つ又は複数の細胞型を含む、
前記方法。
【請求項17】
胸腺細胞の前記集団が、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及びタフト／イオノサイト細胞のうちの１つ又は複数の亜集団を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞集団が可溶性因子の存在下で培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記可溶性因子が、増殖因子、サイトカイン、トランスポーター、又はホルモンのうちの１つ又は複数である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記可溶性因子が増殖因子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記増殖因子が上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞集団がサイトカインの存在下で培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項23】
前記サイトカインがマクロファージ阻害因子（ＭＩＦ、ＥＮＳＧ０００００２４０９７２）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞集団がトランスポーターの存在下で培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項25】
前記トランスポーターがラクトトランスフェリン（ＬＴＦ、ＥＮＳＧ００００００１２２２３）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞集団がミネラルの存在下で培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項27】
前記ミネラルが、鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素のうちの１つ又は複数である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ミネラルが鉄である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞集団が、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作される、請求項１６に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞集団が、細胞表面受容体を発現するように操作される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞表面受容体が、ＣＤ７４（ＥＮＳＧ００００００１９５８２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１、ＥＮＳＧ０００００１５００９３）、又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞集団が、細胞内因子を発現するように操作される、請求項２９に記載の方法。
【請求項33】
前記細胞内因子がエノラーゼ１（ＥＮＯ１、ＥＮＳＧ００００００７４８００）である、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
インビトロで胸腺細胞の集団を維持する方法であって、ａ）可溶性因子もしくはミネラルの存在下で胸腺細胞の前記集団を培養するステップ、
ｂ）１つもしくは複数の支持細胞の存在下で胸腺細胞の前記集団を培養するステップ、及び／又は
細胞表面受容体もしくは細胞内因子を発現するように胸腺細胞の前記集団を操作するステップ
のうちの１つ又は複数を含む、前記方法。
【請求項35】
胸腺細胞の前記集団が可溶性因子の存在下で培養される、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記可溶性因子が、増殖因子、サイトカイン、トランスポーター、又はホルモンのうちの１つ又は複数である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記可溶性因子が増殖因子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記増殖因子が上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記細胞集団がサイトカインの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項40】
前記サイトカインがマクロファージ阻害因子（ＭＩＦ、ＥＮＳＧ０００００２４０９７２）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
胸腺細胞の前記集団がトランスポーターの存在下で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項42】
前記トランスポーターがラクトトランスフェリン（ＬＴＦ、ＥＮＳＧ００００００１２２２３）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
胸腺細胞の前記集団がミネラルの存在下で培養される、請求項３４に記載の方法。
【請求項44】
前記ミネラルが、鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素のうちの１つ又は複数である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ミネラルが鉄である、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
胸腺細胞の前記集団が、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作される、請求項３４に記載の方法。
【請求項47】
胸腺細胞の前記集団が、細胞表面受容体を発現するように操作される、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記細胞表面受容体が、ＣＤ７４（ＥＮＳＧ００００００１９５８２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１、ＥＮＳＧ０００００１５００９３）、又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
胸腺細胞の前記集団が、細胞内因子を発現するように操作される、請求項４６に記載の方法。
【請求項50】
前記細胞内因子が、エノラーゼ１（ＥＮＯ１、ＥＮＳＧ００００００７４８００）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
胸腺細胞の前記集団が、１つ又は複数の支持細胞の存在下で培養される、請求項３４に記載の方法。
【請求項52】
前記支持細胞が、内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、上皮細胞、線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、又はリンパ管内皮細胞のうちの１つ又は複数である、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記支持細胞が間葉系幹細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記支持細胞が内皮細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項55】
胸腺細胞の前記集団が、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）、髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）、及び皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）からなる群から選択される１つ又は複数の亜集団を含む、請求項３４から５４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づき、２０２１年６月２３日に出願した米国特許仮出願第６３／２１４，１７６号、２０２１年１０月１５日に出願した米国特許仮出願第６３／２５６，４４５号、２０２２年１月４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９６，２５０号、及び２０２２年３月１８日に出願した米国特許仮出願第６３／３２１，１４２号の優先権を主張し、その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）に基づき、２０２１年６月２３日に出願した米国特許仮出願第６３／２１４，１７６号、２０２１年１０月１５日に出願した米国特許仮出願第６３／２５６，４４５号、２０２２年１月４日に出願した米国特許仮出願第６３／２９６，２５０号、及び２０２２年３月１８日に出願した米国特許仮出願第６３／３２１，１４２号の優先権を主張し、その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
背景情報
胸腺は免疫系において中心的な役割を果たす主要なリンパ器官である。胸腺の微小環境はリンパ球（例えばＴ細胞）のようなエフェクター細胞の成熟の発達のためのユニークな訓練場を提供する。当分野において周知のように、胸腺細胞とエフェクター細胞の間の複雑な相互作用はエフェクター細胞の表現型及び機能性を決めることができる。一部の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用は、胸腺細胞により発現された因子の認識によってエフェクター細胞の生存が促進されるように、調整される。それに対して、他の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用はエフェクター細胞の死を引き起こし得る。このような相互作用を制御することで、胸腺は、自己に対する寛容を確立しながら外来侵入者に対して活性化された免疫応答を開始できるエフェクター細胞のレパートリーを確立する上で極めて重要な役割を果たす。
胸腺は免疫系において中心的な役割を果たす主要なリンパ器官である。胸腺の微小環境はリンパ球（例えばＴ細胞）のようなエフェクター細胞の成熟の発達のためのユニークな訓練場を提供する。当分野において周知のように、胸腺細胞とエフェクター細胞の間の複雑な相互作用はエフェクター細胞の表現型及び機能性を決めることができる。一部の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用は、胸腺細胞により発現された因子の認識によってエフェクター細胞の生存が促進されるように、調整される。それに対して、他の胸腺細胞－エフェクター細胞相互作用はエフェクター細胞の死を引き起こし得る。このような相互作用を制御することで、胸腺は、自己に対する寛容を確立しながら外来侵入者に対して活性化された免疫応答を開始できるエフェクター細胞のレパートリーを確立する上で極めて重要な役割を果たす。
【0003】
胸腺細胞と胸腺細胞産物を生成するための改善された方法、及び機能的な胸腺上皮細胞に分化できる機能的な胸腺細胞が豊富な細胞集団はまだ求められている。
【発明の概要】
【0004】
概要
本開示は胸腺細胞産物及びその作製方法を提供する。本開示の胸腺産物は、（ｉ）胸腺細胞の１つ又は複数の集団を生成すること、（ｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々からＲＮＡを抽出及び配列決定すること、（ｉｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々について試験胸腺マップを生成するために、ＲＮＡ配列を分析して胸腺細胞の各集団内の亜集団を同定すること、（ｉｖ）前記試験胸腺マップの各々を参照胸腺マップと比較すること、並びに（ｖ）約０．７から約１．４の亜集団比（ＳＰＲ）又は相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を有する試験胸腺マップを選択することにより胸腺細胞産物を同定すること、によって調製される。いくつかの態様において、前記各胸腺細胞集団内の前記細胞亜集団は、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及び／又はタフト／イオノサイト細胞から選択される。いくつかの態様において、前記ＳＰＲは約０．７～１．４である。いくつかの態様において、前記ＳＰＲは、ｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、及び／又はタフト／イオノサイトＳＰＲである。いくつかの実施形態において、前記ＳＰＲはｉＴＥＣ ＳＰＲである。非限定的な例として、前記ｉＴＥＣ ＳＰＲは１である。
本開示は胸腺細胞産物及びその作製方法を提供する。本開示の胸腺産物は、（ｉ）胸腺細胞の１つ又は複数の集団を生成すること、（ｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々からＲＮＡを抽出及び配列決定すること、（ｉｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々について試験胸腺マップを生成するために、ＲＮＡ配列を分析して胸腺細胞の各集団内の亜集団を同定すること、（ｉｖ）前記試験胸腺マップの各々を参照胸腺マップと比較すること、並びに（ｖ）約０．７から約１．４の亜集団比（ＳＰＲ）又は相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を有する試験胸腺マップを選択することにより胸腺細胞産物を同定すること、によって調製される。いくつかの態様において、前記各胸腺細胞集団内の前記細胞亜集団は、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及び／又はタフト／イオノサイト細胞から選択される。いくつかの態様において、前記ＳＰＲは約０．７～１．４である。いくつかの態様において、前記ＳＰＲは、ｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、及び／又はタフト／イオノサイトＳＰＲである。いくつかの実施形態において、前記ＳＰＲはｉＴＥＣ ＳＰＲである。非限定的な例として、前記ｉＴＥＣ ＳＰＲは１である。
【0005】
いくつかの実施形態において、前記ＲＣＴＲは約０．７～１．１４である。非限定的な例として、前記ＲＣＴＲは１である。
【0006】
前記胸腺細胞産物の調製に用いられる本開示の胸腺細胞集団は幹細胞の分化によって調製される。
【0007】
いくつかの実施形態において、前記参照胸腺マップはヒト胸腺、例えば成体又は胎児胸腺を使用して生成される。
【0008】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団の前記ｉＴＥＣ亜集団は、ＩＧＫＣ（ＥＮＳＧ０００００２１１５９２）、ＡＮＡＸ２、ＬＩＭＡ１（ＥＮＳＧ００００００５０４０５）、ＥＧＦＲ（ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）、ＡＳＣＬ１（ＥＮＳＧ０００００１３９３５２）、ＨＥＳ１（ＥＮＳＧ０００００１１４３１５）、ＪＵＮＤ（ＥＮＳＧ０００００１３０５２２）、ＦＯＳ（ＥＮＳＧ０００００１７０３４５）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１５０３４７）、ＩＲＦ１（ＥＮＳＧ０００００１２５３４７）、ＭＡＦＢ（ＥＮＳＧ０００００２０４１０３）、ＩＦＩ１６（ＥＮＳＧ０００００１６３５６５）、ＦＯＸＣ１（ＥＮＳＧ００００００５４５９８）、ＳＴＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１１５４１５）、ＪＵＮＢ（ＥＮＳＧ０００００１７１２２３）、ＥＧＦＲ１、ＺＦＰ３６（ＥＮＳＧ０００００１２８０１６）、ＪＵＮ（ＥＮＳＧ０００００１７７６０６）、ＦＯＳＢ（ＥＮＳＧ０００００１２５７４０）、ＩＥＲ２（ＥＮＳＧ０００００１６０８８８）、ＰＡＸ９（ＥＮＳＧ０００００１９８８０７）、及び／又はＨＩＦ１Ａ（ＥＮＳＧ０００００１００６４４）のうちの１つ又は複数の発現を含み得る。
【0009】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団の前記ｃＴＥＣ亜集団は、ＰＳＭＡ３（ＥＮＳＧ０００００１００５６７）、ＦＡＢＰ５（ＥＮＳＧ０００００１６４６８７）、ＡＰＲＴ（ＥＮＳＧ０００００１９８９３１）、ＬＳＭ６（ＥＮＳＧ０００００１６４１６７）、ＣＴＳＶ（ＥＮＳＧ０００００１３６９４３）、ＳＮＲＰＥ（ＥＮＳＧ０００００１８２００４）、ＥＣＨＳ１（ＥＮＳＧ０００００１２７８８４）、ＨＳＰＥ１（ＥＮＳＧ０００００１１５５４１）、ＲＡＮ（ＥＮＳＧ０００００１３２３４１）、ＴＭＡ７（ＥＮＳＧ０００００２３２１１２）、ＴＩＭＭ１３（ＥＮＳＧ００００００９９８００）、ＬＤＨＢ（ＥＮＳＧ０００００１１１７１６）、ＥＣＩ１（ＥＮＳＧ０００００１６７９６９）、ＧＣＳＨ（ＥＮＳＧ０００００１４０９０５）、ＮＯＰ５８（ＥＮＳＧ００００００５５０４４）、ＭＲＰＬ１１（ＥＮＳＧ０００００１７４５４７）、ＳＴＯＭＬ２（ＥＮＳＧ０００００１６５２８３）、ＩＮＧ２（ＥＮＳＧ０００００１６８５５６）、ＴＯＭＭ７（ＥＮＳＧ０００００１９６６８３）、ＭＲＰＳ３４（ＥＮＳＧ００００００７４０７１）、ＭＲＰＬ１４（ＥＮＳＧ０００００１８０９９２）、ＭＲＰＬ５７（ＥＮＳＧ０００００１７３１４１）、ＩＭＰ３（ＥＮＳＧ０００００１７７９７１）、ＭＺＴ２Ａ（ＥＮＳＧ０００００１７３２７２）、及びＸＲＣＣ６（ＥＮＳＧ０００００１９６４１９）のうちの１つ又は複数の発現を含み得る。
【0010】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団の前記角質細胞様ｍＴＥＣ亜集団は、ＣＤ２４（ＥＮＳＧ０００００２７２３９８）、ＥＬＦ３（ＥＮＳＧ０００００１６３４３５）、ＣＬＤＮ４（ＥＮＳＧ０００００１８９１４３）、ＭＡＬ２（ＥＮＳＧ０００００１４７６７６）、ＡＳＡＨ１（ＥＮＳＧ０００００１０４７６３）、ＴＭＥＭ１２３（ＥＮＳＧ０００００１５２５５８）、ＴＭＢＩＭ６（ＥＮＳＧ０００００１３９６４４）、ＬＧＡＬＳ３（ＥＮＳＧ０００００１３１９８１－）、ＭＹＬ１２Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１１８６８０）、ＡＣＡＤＶＬ（ＥＮＳＧ００００００７２７７８）、ＫＲＴ１９（ＥＮＳＧ０００００１７１３４５）、ＳＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１３００６６）、ＲＡＢ２５（ＥＮＳＧ０００００１３２６９８）、ＷＦＤＣ２（ＥＮＳＧ０００００１０１４４３）、ＶＡＭＰ８（ＥＮＳＧ０００００１１８６４０）、ＳＰＩＮＴ１（ＥＮＳＧ０００００１６６１４５）、ＳＥＲＰＩＮＢ１（ＥＮＳＧ００００００２１３５５）、ＣＤＨ１（ＥＮＳＧ００００００３９０６８）、ＧＳＮ（ＥＮＳＧ０００００１４８１８０）、ＳＤＣ４（ＥＮＳＧ０００００１２４１４５）、ＭＧＳＴ２（ＥＮＳＧ００００００８５８７１）、ＣＡＳＴ（ＥＮＳＧ０００００１５３１１３）、Ｂ４ＧＡＬＴ１（ＥＮＳＧ００００００８６０６２）、ＰＥＲＰ（ＥＮＳＧ０００００１１２３７８）、及びＤＭＫＮ（ＥＮＳＧ０００００１６１２４９）のうちの１つ又は複数の発現を含み得る。
【0011】
本開示は、インビトロで胸腺細胞を生成するための方法を提供する。これらの方法は、可溶性因子、ミネラル、又はそれらの組み合わせの存在下で細胞集団を培養するステップを含み得る。このような方法は、胸腺細胞への前記細胞集団の分化又は成熟を含み得る。前記細胞集団も、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、前記細胞集団は多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞、前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞であり得る。
【0012】
前記胸腺細胞は、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及びタフト／イオノサイト細胞、又はそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数である。可溶性因子は、増殖因子、サイトカイン、トランスポーター、ホルモン、又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。非限定的な例として、前記可溶性因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８）のような増殖因子である。前記可溶性因子はサイトカイン、例えば、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ、ＥＮＳＧ０００００２４０９７２）である。前記可溶性因子は、トランスポーター、例えば、ラクトトランスフェリン（ＬＴＦ、ＥＮＳＧ００００００１２２２３）であってもよい。
【0013】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞はミネラルの存在下で培養される。前記ミネラルは、鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素である。一態様において、前記ミネラルは鉄である。本開示の細胞は、胸腺細胞を生成又は維持する目的で、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作される。前記細胞表面受容体は、ＣＤ７４（ＥＮＳＧ００００００１９５８２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１、ＥＮＳＧ０００００１５００９３）、及び／又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）である。前記細胞内因子はＥＮＯ１（ＥＮＳＧ００００００７４８００）である。
【0014】
本開示はインビトロで胸腺細胞の集団を維持する方法も提供する。前記方法は、（ｉ）可溶性因子もしくはミネラルの存在下で胸腺細胞の前記集団を培養するステップ、（ｉｉ）１つもしくは複数の支持細胞の存在下で胸腺細胞の前記集団を培養ステップ、及び／又は（ｉｉｉ）細胞表面受容体もしくは細胞内因子を発現するように胸腺細胞の前記集団を操作するステップを含み得る。
【0015】
本開示の細胞は１つ又は複数の支持細胞の存在下で培養される。支持細胞は内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、上皮細胞、線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、又はリンパ管内皮細胞である。いくつかの実施形態において、支持細胞は間葉系幹細胞である。いくつかの態様において、前記支持細胞は内皮細胞である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
詳細な説明
Ｉ．序論
胸腺上皮細胞はＴ細胞分化において重要である。本明細書に記載のように調製された胸腺細胞は、胸腺組織及び胸腺細胞の特性、例えば胸腺関連免疫機能の治療用途への利用を可能にすることができる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下は胸腺細胞の組成物と機能的能力の変化によって引き起こされることが知られている。加えて、アンドロゲン及びエストロゲンを含む性ホルモンの変化により、胸腺自体は萎縮するかまたは老化を示す。胸腺萎縮の発症は思春期の発症と同時に始まる場合がある。従って、胸腺上皮細胞の再生は加齢に伴う免疫機能の低下を軽減する組成物及び方法を提供する可能性がある。
Ｉ．序論
胸腺上皮細胞はＴ細胞分化において重要である。本明細書に記載のように調製された胸腺細胞は、胸腺組織及び胸腺細胞の特性、例えば胸腺関連免疫機能の治療用途への利用を可能にすることができる。例えば、加齢に伴う免疫機能の低下は胸腺細胞の組成物と機能的能力の変化によって引き起こされることが知られている。加えて、アンドロゲン及びエストロゲンを含む性ホルモンの変化により、胸腺自体は萎縮するかまたは老化を示す。胸腺萎縮の発症は思春期の発症と同時に始まる場合がある。従って、胸腺上皮細胞の再生は加齢に伴う免疫機能の低下を軽減する組成物及び方法を提供する可能性がある。
【0017】
ＩＩ．組成物
細胞
本開示の細胞は、胸腺細胞、エフェクター細胞、多能性幹細胞、それらの集団及びそれらに由来する細胞を限定することなく含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は人工多能性幹細胞に由来し得る。
細胞
本開示の細胞は、胸腺細胞、エフェクター細胞、多能性幹細胞、それらの集団及びそれらに由来する細胞を限定することなく含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は人工多能性幹細胞に由来し得る。
【0018】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、特定の個体又は対象に関して、自己由来のもの、同種間のもの、同系間のもの、又は異種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、それらの臨床応用から最終的に恩恵を受ける対象に関して、自己由来のもの、同種間のもの、同系間のもの、又は異種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞であり得る。細胞は、初代細胞又は不死化細胞株であり得る。いくつかの態様において、本開示の細胞は同系細胞源から調製又はそれに由来し得る。本明細書に記載の任意の細胞は該当する細胞型のための当分野既知のマーカーによって特徴付けられる。
【0019】
胸腺細胞
本開示の細胞は胸腺細胞の集団を含み得る。胸腺細胞は、胸腺に由来する細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞と関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞である。いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団は多能性幹細胞の分化に由来する。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞はｉＰＳＣである。胸腺細胞は胚、胎児、又は成体の胸腺細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は胸腺細胞の集団であり得る。いくつかの態様において、本開示の組成物は胸腺細胞産物である。
本開示の細胞は胸腺細胞の集団を含み得る。胸腺細胞は、胸腺に由来する細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞と関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞である。いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団は多能性幹細胞の分化に由来する。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞はｉＰＳＣである。胸腺細胞は胚、胎児、又は成体の胸腺細胞である。いくつかの実施形態において、本開示の組成物は胸腺細胞の集団であり得る。いくつかの態様において、本開示の組成物は胸腺細胞産物である。
【0020】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は以下のステップの１つ又は複数によって胸腺幹に分化する多能性幹細胞の分化によって調製される。ＰＳＣは胚体内胚葉（ＤＥ）に似た細胞に分化でき、かつ／又はそれに分化するように誘導できる。胚体内胚葉細胞は第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）に似た細胞に分化でき、かつ／又はそれに分化するように誘導できる。胚体内胚葉及び／又はＰＰＥ細胞は、腹側咽頭内胚葉（ＡＦＥ）に似た細胞に分化でき、かつ／又はそれに分化するように誘導できる。ＡＦＥは第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）に似た細胞に分化でき、かつ／又はそれに分化するように誘導できる。胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）はＰＰＥ細胞から生成できる。ＴＥＣはＴＥＰＣＳに由来することができる。本明細書に記載の細胞型の各々は１つ又は複数のマーカーによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及び／又はＮａｎｏｇに限定されないマーカーの発現増加に関連付けられる。いくつかの実施形態において、胚体内胚葉は、例えばＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、及び／又はＣＥＲ１に限定されないマーカーの発現増加に関連付けられる。いくつかの実施形態において、前方前腸細胞（ＡＦＥ）は、例えばＦＯＸＡ２、ＳＯＸ２、及び／又はＰＡＸ９に限定されないマーカーの発現増加に関連付けられる。いくつかの実施形態において、第３咽頭嚢内胚葉細胞は、例えばＨＯＸＡ３、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９、ＥＹＡ１、ＳＩＸ１、ＰＢＸ１、及び／又はＰＡＸ１に限定されないマーカーの発現増加に関連付けられる。いくつかの実施形態において、胸腺上皮前駆細胞は、例えばＦＯＸＮ１、Ｋ５、Ｋ８、及び／又はＨＯＸＡ３に限定されないマーカーの発現増加に関連付けられる。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＤＥ細胞、第３ＰＰＥ細胞、ＡＦＥ細胞、ＴＥＰＣ、及び／又はＴＥＣ細胞に由来する。
【0021】
本開示の胸腺細胞の集団を調製するために、多能性幹細胞は胚体内胚葉細胞に培養および分化される。胚体内胚葉細胞は更に前方前腸細胞に培養および分化される。いくつかの実施形態において、前方前腸細胞は咽頭内胚葉細胞に培養および分化される。いくつかの実施形態において、咽頭内胚葉細胞は胸腺細胞、例えば、胸腺上皮細胞に培養および分化される。いくつかの実施形態において、分化は約１４日間から約２１日間行われる。
【0022】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＰＳＣから調製される。この点については、本方法は多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させるのに十分な条件下で多能性幹細胞を一定期間培養するステップを含み得る。例えば、本方法は胸腺細胞へのＰＳＣの分化を駆動する因子及び／又は阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養するステップを含み得る。
【0023】
いくつかの実施形態において、ＰＳＣを胸腺細胞に分化させるための方法は当分野で既知の任意の方法である。ＰＳＣを胸腺細胞に分化させるための方法は、当分野で既知の分化用の１つ又は複数のパラメーター又はそれらの組み合わせの使用を含み得る。パラメーターは、（ｉ）分化促進因子、（ｉｉ）分化促進阻害物質、（ｉｉｉ）分化促進の継続時間、（ｉｖ）温度、（ｖ）基質、及び／又は（ｖｉ）分化を促進する支持細胞を含むが、それらに限定されない。以下の参考文献に記載のＰＳＣを胸腺細胞に分化させるための任意の方法又はパラメーターは、本明細書に使用され、Ｐａｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２１９－２９、Ｓｏｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１４ Ｖｏｌ． ２ ｊ ９２５－９３７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２３０－６、Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｐｒｏｇ． ２０１５ Ｖｏｌ １７， Ｎｏ． ５、Ｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ２０１５ ５， ９８８２、Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ２０２０ １０：２２４、国際特許公開ＷＯ２０１９０６０３３６、ＷＯ２０２０２０５８５９、ＷＯ２０２０２２００４０、ＷＯ２０１４１３４２１３、ＷＯ２０１０１４３５２９、ＷＯ２０１１１３９６２８、ＷＯ２０２２０７６７５１、ＷＯ２０１４１３４２１３、ＷＯ２０２１２２２２９７及び中国特許公開ＣＮ２０１１１０１２１２４３を含み、これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0024】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の集団は、１つ又は複数の細胞型の亜集団を含み得る。細胞型はｉＴＥＣ、ｍＴＥＣ、角質細胞様ｍＴＥＣ、ｃＴＥＣ－高、ｃＴＥＣ－低、ｍＴＥＣ－低 細胞である。
【0025】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の集団は胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）を含み得る。胸腺細胞はＴＥＣであるか又はそれに由来し得る。いくつかの実施形態において、前記ＴＥＣはｉＰＳＣの分化に由来する。胚発生中、ＴＥＣはＣＤ４５発現に陰性で上皮マーカーＥｐＣＡＭに陽性である非造血細胞に由来する。ＴＥＣは皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）及び／又は髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）である。ｍＴＥＣはサイトケラチン５（Ｋ５）及びサイトケラチン１４（Ｋ１４）発現を特徴とするが、サイトケラチン８（Ｋ８）発現のレベルが低いのに対して、ｃＴＥＣはＫ８及びＫ１８を発現する。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＫ５及びＫ８（Ｋ５＋Ｋ８＋）の両方とも発現するＴＥＣに由来する。いくつかの態様において、Ｋ５＋Ｋ８＋細胞はｍＴＥＣ及び／又はｃＴＥＣの前駆細胞である。ｍＴＥＣは、Ｌｙ５１（例えば、ＵＥＡ－１＋Ｌｙ５１－）ではなく、細胞表面のハリエニシダ凝集素－１（Ｕｌｅｘ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－１）（ＵＥＡ－１）の発現にも陽性であり得るが、ｃＴＥＣはＵＥＡ－１－Ｌｙ５１＋である。いくつかの実施形態において、胸腺細胞はｍＴＥＣであるか又はそれに由来し得る。
【0026】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の前記集団は髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ｍＴＥＣはｉＰＳＣの分化に由来する。いくつかの実施形態において、ｍＴＥＣは、例えばサイトケラチン５、サイトケラチン１４、ＵＥＡ－１、ＣＤ８０、カテプシンＬ、及び／又はカテプシンＳに限定されないマーカーの高発現を有し得る。
【0027】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞の集団は皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ｃＴＥＣはｉＰＳＣの分化に由来する。いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばサイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｌｙ５１、ＣＤ２０５、カテプシンＬ、及び／又は胸腺特異的セリンプロテアーゼに限定されないマーカーの高発現を有するｃＴＥＣであるか又はそれに由来し得る。非限定的な例として、胸腺細胞は、例えばＣＣＬ２５、及び／又はＫＲＴ５のようなマーカーを発現するｃＴＥＣであるか又はそれに由来し得る。ｍＴＥＣは、例えばＣＣＬ１９、ＫＲＴ８、及び／又はＡＩＲＥのようなマーカーを発現し得る。
【0028】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は、例えばＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＰＡＸ１、ＤＬＩＡ、ＩＳＬ１、ＥＹＡ１、ＳＩＸ１、ＩＬ７、Ｋ５、Ｋ８、及びＡＩＲＥのような１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣであるか又はそれに由来し得る。
【0029】
胸腺細胞は、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ３６７， Ｉｓｓｕｅ ６４８０（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の任意の細胞型であるか又はそれに由来し得る。例えば、胸腺細胞は、例えばＭＹＯＤ１及びＭＹＯＧ発現筋様細胞（本明細書ではＴＥＣ（ｍｙｏ）という）のような筋様細胞、及び／又はＮＥＵＲＯＤ１、ＳＹＰ、ＣＨＧＡ－発現ＴＥＣＳ（本明細書ではＴＥＣ（ｎｅｕｒｏ）という）に由来する。
【0030】
胸腺細胞は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６に記載の細胞型に由来する。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の前記集団は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｃＴＥＣ低」細胞を含み得、より低いレベルの機能遺伝子（ＨＬＡクラスＩＩ）及びより多くのＫＩ６７＋－増殖細胞の含有を特徴とする。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｍＴＥＣ低」細胞に由来し、ＣＬＤＮ４の発現、より低いレベルのＨＬＡクラスＩＩ、ＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５の発現、及び高レベルのケモカインＣＣＬ２１を特徴とする。
【0031】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「ｍＴＥＣ高」細胞を含み得、ＳＰＩＢ、ＡＩＲＥ、ＦＥＺＦ２、より高いレベルのＨＬＡクラスＩＩの発現を特徴とする。胸腺細胞は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の角質細胞様ｍＴＥＣであるか又はそれに由来し得、ＫＲＴ１、及び／又はＩＶＬの発現を特徴とする。
【0032】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、標準的なＴＥＣアイデンティティ遺伝子、例えば、ＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＳＩＸ１を発現する、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の未成熟ＴＥＣ（ｉＴＥＣ）を含み得る。
【0033】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、例えばＫＲＴ５、ＫＲＴ８、ＡＩＲＥ、ＰＳＭＢ１１、及び／又はＰＲＳＳ１６に限定されない１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣを含み得る。
【0034】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、例えばＡＩＲＥ、ＣＫ５、ＣＫ８、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２５、ＤＬＬ４、及び／又はＨＬＡ－ＤＲに限定されない１つ又は複数のマーカーを発現するＴＥＣを含み得る。
【0035】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、例えばＣＴＳＶ、ＳＬＣ４６Ａ２、ＨＬＡ－ＤＭＡ、ＣＸＣＬ１２、ＴＨＹ１、ＥＮＯ１、ＣＡＬＲ、ＡＬＣＡＭ、ＡＴＰＩＦ１、及び／又はＨＳＰＡ５に限定されない細胞表面マーカーの発現を特徴とするｃＴＥＣｈｉ（又はｃＴＥＣ高）細胞を含み得る。
【0036】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、例えばＬＴＦ、ＨＬＡ－ＤＲＡ＜ＣＤ７４、ＨＬＡ ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＩＬ２ＲＧ、及び／又はＦＣＥＲ２に限定されない１つ又は複数のマーカーの発現を特徴とするＡＩＲＥ＋ｍＴＥＣ高 細胞を含み得る。
【0037】
いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣの分化に由来する胸腺細胞の集団は、角質細胞様ｍＴＥＣを含み得る。該細胞は、皮膚の角質細胞（最終分化ケラチノサイト）でも発現するケラチン細胞骨格１（ＫＲＴ１）、ＫＲＴ１０、ＳＰＩＮＫＳのような遺伝子を発現するため、角質細胞様と呼ばれる。角質細胞様細胞は、ＡＩＲＥのような、ｍＴＥＣと重複する転写物をも発現する。そのため、それらは角質細胞様ｍＴＥＣと呼ばれる。それらは、ヒト胸腺内のユニークな細胞であるハッサル小体を生じさせる前駆体である可能性が高い。これらの細胞はｍＴＥＣ前駆細胞に由来するとも考えられる（Ｎｏａｍ Ｋａｄｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２０ ｖ２０：２３９。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0038】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来する。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は多能性幹細胞に由来する。
【0039】
多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉といった３つの胚葉のいずれかを生じさせる能力を有する。多能性幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、核移植由来胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のような幹細胞を含み得る。多能性幹細胞は、（ｉ）自己複製の能力と（ｉｉ）多能性とを含む幹細胞表現型を有し得る。多能性関連遺伝子は、Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＧＤＦ３、ＲＥＸＩ、ＦＧＦ４、ＥＳＧＩ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ｈＴＥＲＴ及びＳＳＥＡＩを含み得るが、それらに限定されない。
【0040】
本明細書に記載の細胞は胚性幹細胞に由来し得る。ＥＳ細胞は、（ａ）自己複製し、（ｂ）生物内の全ての細胞型を産生するように分化し、かつ／又は（ｃ）発生中の生物に由来する、細胞を含み得る。ＥＳ細胞は、発生中の生物の胞胚の内部細胞塊に由来し得る。ＥＳ細胞は、発生中の生物の８細胞期から単一割球の除去を含む単一割球生検（ＳＢＢ）によって生成された割球にも由来し得る。ＥＳ細胞は、例えばＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、及び／又はアルカリホスファターゼに限定されないマーカーの発現を特徴とする。ＥＳ細胞を生成及び特徴決定する方法は当分野で既知であり、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６に見出すことができる（これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0041】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は本開示の細胞の生成にも使用され得る。ｉＰＳＣは、例えば（ａ）自己複製、（ｂ）生物内の細胞の全てのタイプを産生するように分化する能力、及び／又は（ｃ）体細胞由来、に限定されない１つ又は複数の特性を有する細胞を含み得る。ｉＰＳＣは、例えばＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＳＯＸ２、ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１８、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、Ｚｐｆ４２に限定されないマーカーを発現し得る。ｉＰＳ細胞を生成及び特徴決定する方法は、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、及びＵＳ２００９０３０４６４６に見出される（これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞もしくは非Ｔ細胞、Ｂ細胞、あるいは末梢血単核細胞、造血前駆細胞、又は任意の他の体細胞型からの任意の他の細胞に由来する。
【0042】
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は成体幹細胞に由来する。成体幹細胞は、対象、例えば対象の内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、及び／又は血液から得られる。ＰＳＣは、胎盤又は臍帯由来の胚性幹細胞と、前駆細胞（例えば、内耳、骨髄、間葉、皮膚、脂肪、肝臓、筋肉、及び／又は血液に由来する前駆細胞）も含み得る。
【0043】
支持細胞
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、胸腺細胞の生成及び／又は培養下での胸腺細胞の維持を助ける支持細胞を含み得るか又は該支持細胞で培養される。支持細胞の非限定的な例としては、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような造血非Ｔ細胞前駆細胞、上皮細胞及び線維芽細胞のような非造血細胞、骨格組織の前駆細胞のような間質細胞、骨、軟骨、造血支持間質、及び脂肪細胞のような構成要素を含む。いくつかの実施形態において、支持細胞は、胸腺細胞の増殖、生存、成熟、又は機能を促進する。いくつかの実施形態において、支持細胞は間葉系由来である。１つの実施形態において、間葉系細胞は間葉系幹細胞である。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、胸腺細胞の生成及び／又は培養下での胸腺細胞の維持を助ける支持細胞を含み得るか又は該支持細胞で培養される。支持細胞の非限定的な例としては、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような造血非Ｔ細胞前駆細胞、上皮細胞及び線維芽細胞のような非造血細胞、骨格組織の前駆細胞のような間質細胞、骨、軟骨、造血支持間質、及び脂肪細胞のような構成要素を含む。いくつかの実施形態において、支持細胞は、胸腺細胞の増殖、生存、成熟、又は機能を促進する。いくつかの実施形態において、支持細胞は間葉系由来である。１つの実施形態において、間葉系細胞は間葉系幹細胞である。
【0044】
支持細胞は胸腺微小環境に存在し得る非免疫細胞である。例えば、支持細胞は線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、内皮細胞、及び／又はリンパ管内皮細胞である。
【0045】
いくつかの実施形態において、支持細胞は、その全ての内容が参照によって本明細書に組み込まれるＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）に記載の神経内分泌細胞（ＢＥＸ１、ＮＥＵＲＯＤ１を発現）、筋肉様筋様細胞（ＭＹＯＤ１、ＤＥＳを発現）、及びミエリン陽性上皮細胞（ＳＯＸ１０、ＭＰＺを発現）である。いくつかの実施形態において、間葉系細胞は、例えばＬＡＭＡ２、ＬＡＭＡ４、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＬＵＭ、ＣＳＰＧ４、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＩＧＦ１、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１０、ＦＳＴ、ＢＭＰ４、ＳＦＲＰ２、ＷＮＴ５Ａに限定されないマーカーに関連付けられる。間葉系細胞は、これらのマーカーの１つ又は複数に対して陽性又は陰性である。いくつかの実施形態において、間葉系細胞は本明細書に記載のいくつかのマーカーに陽性であるが、他のマーカーに陰性である。
【0046】
いくつかの実施形態において、内皮細胞は、例えばＶＥＧＦＣ、ＰＥＣＡＭ１、ＡＰＬＮＲ、ＰＲＯＸＩ、ＬＹＶＥ１、ＡＣＫＲ１、ＳＥＬＥ、ＳＥＬＰ、ＦＮ１、及び／又はＴＧＦＢ１に限定されない１つ又は複数のマーカーに関連付けられる。内皮細胞はこれらのマーカーの１つ又は複数に対して陽性又は陰性である。いくつかの実施形態において、内皮細胞は本明細書に記載のいくつかのマーカーに陽性であるが、他のマーカーに陰性である。
【0047】
胸腺細胞産物
いくつかの実施形態において、本開示は胸腺細胞産物を提供する。胸腺細胞産物は本明細書に記載の方法によって調製される。本明細書で使用されるように、「胸腺細胞産物」とは、表現型的にもしくは能的にヒト胸腺もしくはその亜集団との類似点を有し、かつ／又は治療、診断、もしくは研究用途に適する、胸腺細胞の集団を指す。本開示の胸腺産物は、（ｉ）胸腺細胞の１つ又は複数の集団を生成すること、（ｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々からＲＮＡを抽出及び配列決定すること、（ｉｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々について試験胸腺マップを生成するために、ＲＮＡ配列を分析して胸腺細胞の各集団内の前記亜集団を同定すること、（ｉｖ）前記試験胸腺マップの各々を参照胸腺マップと比較すること、並びに（ｖ）約０．７から約１．４の亜集団比（ＳＰＲ）又は相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を有する試験胸腺マップを選択することにより胸腺細胞産物を同定すること、によって、調製される。本明細書で使用されるように、ＳＰＲとは、参照胸腺マップ中の細胞の亜集団の割合に対する試験胸腺マップ中の亜集団（本明細書では「細胞型」ともいう）の割合の比を指す。本明細書で使用されるように、ｃＴＥＣ比とは、特定の胸腺マップ内のｃＴＥＣ低 細胞に対するｃＴＥＣ高 細胞の割合の比を指す。
いくつかの実施形態において、本開示は胸腺細胞産物を提供する。胸腺細胞産物は本明細書に記載の方法によって調製される。本明細書で使用されるように、「胸腺細胞産物」とは、表現型的にもしくは能的にヒト胸腺もしくはその亜集団との類似点を有し、かつ／又は治療、診断、もしくは研究用途に適する、胸腺細胞の集団を指す。本開示の胸腺産物は、（ｉ）胸腺細胞の１つ又は複数の集団を生成すること、（ｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々からＲＮＡを抽出及び配列決定すること、（ｉｉｉ）胸腺細胞の前記集団の各々について試験胸腺マップを生成するために、ＲＮＡ配列を分析して胸腺細胞の各集団内の前記亜集団を同定すること、（ｉｖ）前記試験胸腺マップの各々を参照胸腺マップと比較すること、並びに（ｖ）約０．７から約１．４の亜集団比（ＳＰＲ）又は相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を有する試験胸腺マップを選択することにより胸腺細胞産物を同定すること、によって、調製される。本明細書で使用されるように、ＳＰＲとは、参照胸腺マップ中の細胞の亜集団の割合に対する試験胸腺マップ中の亜集団（本明細書では「細胞型」ともいう）の割合の比を指す。本明細書で使用されるように、ｃＴＥＣ比とは、特定の胸腺マップ内のｃＴＥＣ低 細胞に対するｃＴＥＣ高 細胞の割合の比を指す。
【0048】
胸腺細胞産物は胸腺マップを分析することによって調製される。本明細書で使用されるように、「胸腺マップ」とは、胸腺細胞又は胸腺組織の集団の分子プロファイルを指す。分子プロファイルは、胸腺細胞又は胸腺組織の集団の全転写プロファイル、前記胸腺細胞又は胸腺組織内の細胞の亜集団、及び／又は同定された亜集団の転写プロファイルを含み得る。いくつかの実施形態において、胸腺マップは、本明細書で使用されるように、胸腺組織及び前記胸腺組織内の既知の細胞型の転写プロファイルによって生成されるヒト胸腺の代表的なマップを指す参照胸腺マップである。１つの実施形態において、参照胸腺マップはＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の転写プロファイリングデータを使用して生成され得る。本明細書で使用されるように、試験胸腺マップとは、分子プロファイルが参照胸腺マップと比較される胸腺細胞の集団の特徴を指す。
【0049】
１つの実施形態において、ＳＰＲは０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．０６、０．９７、０．９８、０．９９、１．０、１．１、１．２、１．３、及び／又は１．４であり得る。非限定的な例として、ＳＰＲは１である。
【0050】
ＲＣＴＲはｃＴＥＣ比を計算することによって作成される。本明細書で使用されるように、ｃＴＥＣ比とは、特定の胸腺マップ（参照又は試験胸腺マップ）内のｃＴＥＣ低 細胞に対するｃＴＥＣ高 細胞の割合の比を指す。ｃＴＥＣ比は胸腺マップ間で異なる場合があり、ＲＣＴＲは０．７０、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．０６、０．９７、０．９８、０．９９、１．０、１．１、１．２、１．３、及び／又は１．４であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＣＴＲは約０．７から約１．１４であり得る。非限定的な例として、ＲＣＴＲは１であり得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞集団の各々内の細胞亜集団は、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、ｃＴＥＣ－高 細胞、ｃＴＥＣ－低 細胞、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 細胞、ｍＴＥＣ－低 細胞、角質細胞様ｍＴＥＣ細胞、繊毛細胞、ミエリン細胞、筋様細胞、神経内分泌細胞、及び／又はタフト／イオノサイト細胞であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰＲは約０．７から約１．４であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰＲは、ｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、及び／又はタフト／イオノサイトＳＰＲであり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰＲはｉＴＥＣ ＳＰＲであり得る。非限定的な例として、ｉＴＥＣ ＳＰＲは１であり得る。
【0051】
ＩＩＩ．方法
本開示は胸腺細胞、胸腺細胞を作製する方法及び／又は培養下で胸腺細胞を維持する方法を提供する。
本開示は胸腺細胞、胸腺細胞を作製する方法及び／又は培養下で胸腺細胞を維持する方法を提供する。
【0052】
本開示はインビトロで胸腺細胞を生成するための方法を提供する。これらの方法は、可溶性因子、ミネラル、又はそれらの組み合わせの存在下で細胞集団を培養するステップを含み得る。このような方法は、胸腺細胞への細胞集団の分化又は成熟を含み得る。細胞集団は細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞集団は多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚体内胚葉（ＤＥ）細胞、第３咽頭嚢内胚葉（ＰＰＥ）細胞、前方前腸内胚葉（ＡＦＥ）細胞、胸腺上皮前駆細胞（ＴＥＰＣ）、未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）、胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）、髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣ）、皮質胸腺上皮細胞（ｃＴＥＣ）、又はそれらの組み合わせであり得る。
【0053】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞は未成熟胸腺上皮細胞（ｉＴＥＣ）であり得る。いくつかの態様において、ｉＴＥＣは少なくとも１つの細胞表面受容体を発現し得、ここで、前記少なくとも１つの細胞表面受容体は、ＩＧＫＣ（ＥＮＳＧ０００００２１１５９２）、ＡＮＡＸ２、ＬＩＭＡ１（ＥＮＳＧ００００００５０４０５）、又はＥＧＦＲ（ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）であり得る。いくつかの実施形態において、ｉＴＥＣは少なくとも１つの細胞内因子を発現し得、ここで、前記少なくとも１つの細胞内因子は、ＡＳＣＬ１（ＥＮＳＧ０００００１３９３５２）、ＨＥＳ１（ＥＮＳＧ０００００１１４３１５）、ＪＵＮＤ（ＥＮＳＧ０００００１３０５２２）、ＦＯＳ（ＥＮＳＧ０００００１７０３４５）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１５０３４７）、ＩＲＦ１（ＥＮＳＧ０００００１２５３４７）、ＭＡＦＢ（ＥＮＳＧ０００００２０４１０３）、ＩＦＩ１６（ＥＮＳＧ０００００１６３５６５） 、ＦＯＸＣ１（ＥＮＳＧ００００００５４５９８）、ＳＴＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１１５４１５）、ＪＵＮＢ（ＥＮＳＧ０００００１７１２２３）、ＥＧＦＲ１、ＺＦＰ３６（ＥＮＳＧ０００００１２８０１６）、ＪＵＮ（ＥＮＳＧ０００００１７７６０６）、ＦＯＳＢ（ＥＮＳＧ０００００１２５７４０）、ＩＥＲ２（ＥＮＳＧ０００００１６０８８８）、ＰＡＸ９（ＥＮＳＧ０００００１９８８０７）、又はＨＩＦ１Ａ（ＥＮＳＧ０００００１００６４４）であり得る。
【0054】
可溶性因子は、増殖因子、サイトカイン、トランスポーター、ホルモン、又はそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。
【0055】
非限定的な例として、可溶性因子は上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８）のような増殖因子であり得る。
【0056】
可溶性因子はサイトカイン、例えば、マクロファージ阻害因子（ＭＩＦ、ＥＮＳＧ０００００２４０９７２）であり得る。
【0057】
可溶性因子はトランスポーター、例えば、ラクトトランスフェリン（ＬＴＦ、ＥＮＳＧ００００００１２２２３）であってもよい。
【0058】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、ミネラルの存在下で培養され得る。ミネラルは鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素であり得る。一態様において、ミネラルは鉄であり得る。
【0059】
本開示の細胞は胸腺細胞を生成又は維持する目的で、細胞表面受容体又は細胞内因子を発現するように操作され得る。細胞表面受容体は、ＣＤ７４（ＥＮＳＧ００００００１９５８２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１、ＥＮＳＧ０００００１５００９３）、及び／又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）であり得る。
【0060】
細胞内因子はＥＮＯ１（ＥＮＳＧ００００００７４８００）であり得る。
【0061】
本開示はインビトロで胸腺細胞の集団を維持するための方法も提供する。前記方法は、（ｉ）可溶性因子もしくはミネラルの存在下で胸腺細胞の前記集団を培養するステップ、（ｉｉ）１つもしくは複数の支持細胞の存在下で胸腺細胞の前記集団を培養するステップ、及び／又は（ｉｉｉ）細胞表面受容体もしくは細胞内因子を発現するように胸腺細胞の前記集団を操作するステップを含み得る。
【0062】
本開示の細胞は１つ又は複数の支持細胞の存在下で培養され得る。支持細胞は内皮細胞、間葉系細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、上皮細胞、線維芽細胞、間質細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、又はリンパ管内皮細胞であり得る。いくつかの実施形態において、支持細胞は間葉系細胞であり得る。いくつかの態様において、支持細胞は内皮細胞であり得る。
【0063】
胸腺細胞の調製及び維持
いくつかの実施形態において、本開示は本明細書に記載の１つ又は複数の細胞又は細胞型を調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は胸腺細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、本開示は本明細書に記載の１つ又は複数の細胞又は細胞型を調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は胸腺細胞であり得る。
【0064】
公共データベースに蓄積されている一連のデータは初代ヒト及びマウス胸腺の単一細胞トランスクリプトームを提供する（Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６、Ｋｅｒｎｆｅｌｄ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１８ Ｊｕｎ １９；４８（６）：１２５８－１２７０．ｅ６、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１９ Ｎｏｖ １９；５１（５）：９３０－９４８．ｅ６を参照。これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。これは本開示の細胞の胸腺細胞への分化及び／又は成熟を促進する因子を同定するための豊富な材料源を提供する。ｓｃＲＮＡ配列決定データの分析により、本開示は胸腺細胞表現型を促進及び／又は維持し得る潜在的な因子及び／又は支持細胞を同定する。
【0065】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞は生物から単離され得る。いくつかの実施形態において、生物は哺乳動物であり得る。哺乳動物細胞はヒト、齧歯動物、ブタ及び／又はウシの供給源のから単離され得る。本開示の細胞のヒト供給源は自己由来又は同種間のものであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞を含有する組織は本明細書に記載の用途にそのまま採取及び使用され得る。本開示の細胞は胚、胎児、成体生物から得られ得る。いくつかの態様において、生物は生きているものであってもよいか、又は死体生物であってもよい。
【0066】
本明細書に記載の細胞は他の細胞型に由来し得る。非限定的な例として、本開示の細胞は多能性幹細胞（ＰＳＣ）に由来し得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は前駆細胞に由来し得る。いくつかの実施形態において、本開示の細胞はＰＳＣ及び／又は前駆細胞の分化に由来し得る。
【0067】
いくつかの実施形態において、胸腺細胞はＰＳＣから調製され得る。この点については、本方法は多能性幹細胞を胸腺細胞に分化させるのに十分な条件下で多能性幹細胞を一定期間培養するステップを含み得る。例えば、本方法はＰＳＣの胸腺細胞への分化を駆動する因子及び／又は阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養するステップを含み得る。ＰＳＣを胸腺細胞に分化させるための方法は当分野で既知である。ＰＳＣを胸腺細胞に分化させるための方法は当分野で既知の分化用の１つ又は複数のパラメーター又はそれらの組み合わせの使用を含み得る。パラメーターは、（ｉ）分化促進因子、（ｉｉ）分化促進阻害物質、（ｉｉｉ）分化促進の継続時間、（ｉｖ）温度、（ｖ）基質、及び／又は（ｖｉ）分化を促進する支持細胞を含むが、それらに限定されない。以下の参考文献に記載のＰＳＣを胸腺細胞に分化させる任意の方法又はパラメーターは本明細書で使用され得、Ｐａｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２１９－２９、Ｓｏｈ ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． ２０１４ Ｖｏｌ． ２ ｊ ９２５－９３７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２０１３ Ａｕｇ １；１３（２）：２３０－６、Ｏｋａｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｐｒｏｇ． ２０１５ Ｖｏｌ １７， Ｎｏ． ５、Ｓｕ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ．Ｒｅｐ． ２０１５ ５， ９８８２、Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０２０ １０：２２４、国際特許公開ＷＯ２０１９０６０３３６、ＷＯ２０２０２０５８５９、ＷＯ２０２０２２００４０、ＷＯ２０１４１３４２１３、ＷＯ２０１０１４３５２９、ＷＯ２０１１１３９６２８、及び中国特許公開ＣＮ２０１１１０１２１２４３を含み、これらそれぞれの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0068】
可溶性因子
本明細書に記載の因子は、本開示の細胞の成熟、運命の特異化を誘導するために、及び／又は特定の細胞状態の維持を助けるために使用され得る。可溶性因子は細胞表面分子に結合できるか又は細胞に取り込むことができるタンパク質又はペプチドを含み得る。細胞による可溶性因子の取り込みは受動拡散、トランスポーター、及び／又はエンドサイトーシスによって行われ得る。可溶性因子は増殖因子、ホルモン、トランスポーター、及びサイトカインを含み得る。細胞に提供される時、可溶性因子は細胞にシグナルを生成し得る。シグナルは生存、増殖及び分化等の１つ又は複数の細胞作用を引き起こし得る。
本明細書に記載の因子は、本開示の細胞の成熟、運命の特異化を誘導するために、及び／又は特定の細胞状態の維持を助けるために使用され得る。可溶性因子は細胞表面分子に結合できるか又は細胞に取り込むことができるタンパク質又はペプチドを含み得る。細胞による可溶性因子の取り込みは受動拡散、トランスポーター、及び／又はエンドサイトーシスによって行われ得る。可溶性因子は増殖因子、ホルモン、トランスポーター、及びサイトカインを含み得る。細胞に提供される時、可溶性因子は細胞にシグナルを生成し得る。シグナルは生存、増殖及び分化等の１つ又は複数の細胞作用を引き起こし得る。
【0069】
いくつかの実施形態において、可溶性因子はリガンドであり得る。
【0070】
いくつかの実施形態において、可溶性因子は増殖因子であり得る。増殖因子は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、増殖刺激因子（ＭＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ＧＤＦ、ニューロトロフィン、肉腫増殖因子（ＳＧＦ）、及び／又は増殖／分化因子（ＧＤＦ）であり得る。
【0071】
非限定的な例として、増殖因子は上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＥＮＳＧ０００００１３８７９８）であり得る。
【0072】
いくつかの実施形態において、可溶性因子はサイトカインであり得る。当分野で既知のいかなるサイトカインも用いられ得る。非限定的な例として、サイトカインはインビボで胸腺細胞又はエフェクター細胞によって産生され得る。Ｙａｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ１６： ７１７５－７１８４， ２０１７は、本開示に有用であり得る、Ｔ細胞又は胸腺細胞によって生成されるサイトカインを提供する（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、サイトカインはマクロファージ阻害因子（ＭＩＦ、ＥＮＳＧ０００００２４０９７２）であり得る。
【0073】
いくつかの実施形態において、可溶性因子はトランスポータータンパク質であり得、第２コンパニオンタンパク質又はミネラルに結合し１つの場所から別の場所へのその転移を容易にすることができる。転移は、細胞外環境から細胞内へ、又は生物体内の１つの場所から別の場所へと発生し得る。いくつかの実施形態において、トランスポータータンパク質はミネラルトランスポータータンパク質であり得る。非限定的な例として、トランスポータータンパク質はラクトトランスフェリン（ＬＴＦ、ＥＮＳＧ００００００１２２２３）であり得る。
【0074】
ミネラル
いくつかの実施形態において、本開示の細胞はミネラルの存在下で調製又は培養され得る。ミネラルは鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素であり得る。いくつかの実施形態において、ミネラルは鉄、又はその塩もしくは誘導体であり得る。
いくつかの実施形態において、本開示の細胞はミネラルの存在下で調製又は培養され得る。ミネラルは鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、ナトリウム、硫黄、亜鉛、塩化物、クロム、銅、フッ化物、又はヨウ素であり得る。いくつかの実施形態において、ミネラルは鉄、又はその塩もしくは誘導体であり得る。
【0075】
細胞表面受容体
可溶性因子又はリガンドはリガンドに特異的な対応物受容体と相互作用し、共にメッセージ又はシグナルを細胞に伝達して特定の機能又は表現型を持たせることができる。いくつかの実施形態において、細胞は胸腺細胞であり得る。細胞表面受容体はＧタンパク質共役受容体、酵素共役受容体、及びイオンチャネル結合受容体受容体であり得る。
可溶性因子又はリガンドはリガンドに特異的な対応物受容体と相互作用し、共にメッセージ又はシグナルを細胞に伝達して特定の機能又は表現型を持たせることができる。いくつかの実施形態において、細胞は胸腺細胞であり得る。細胞表面受容体はＧタンパク質共役受容体、酵素共役受容体、及びイオンチャネル結合受容体受容体であり得る。
【0076】
細胞表面受容体の非限定的な例は、ＣＤ７４（ＥＮＳＧ００００００１９５８２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１、ＥＮＳＧ０００００１５００９３）、及び／又は上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）を含む。一態様において、細胞表面受容体はＣＤ７４であり得る。ＣＤ７４は、ＮＦカッパＢを活性化することで胸腺細胞の細胞性及び成熟を調節することが証明されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ＦＡＳＥＢ Ｊ． ２０２１ Ｍａｙ；３５（５）：ｅ２１５３５。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0077】
細胞内因子
本開示の方法は本明細書に記載の細胞集団を１つ又は複数の細胞内因子とともに培養するステップを含み得る。細胞内因子は細胞質又は核に存在するあらゆるタンパク質又はペプチドであり得る。
本開示の方法は本明細書に記載の細胞集団を１つ又は複数の細胞内因子とともに培養するステップを含み得る。細胞内因子は細胞質又は核に存在するあらゆるタンパク質又はペプチドであり得る。
【0078】
いくつかの実施形態において、細胞内因子は細胞質細胞内因子である。非限定的な例として、細胞内因子はエノラーゼ１（ＥＮＯ１、ＥＮＳＧ００００００７４８００）であり得る。他の態様において、細胞内因子は核に存在する因子であり得る。例えば、因子は転写因子又は転写関連因子であり得る。細胞内核因子の非限定的な例は、ＮＦＫＢ１、ＰＡＸ１、ＰＲＤＸ１５、ＰＳＩＰ１、ＡＩＲＥ、ＤＬＸ５、ＦＥＺＦ２、ＬＴＦ、ＳＰＩＢを含み得る。
【0079】
胸腺細胞集団の分析
幹細胞の分化に由来する胸腺細胞集団は、本明細書に記載の１つ又は複数の方法によって分析され得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞集団は、例えばｃＴＥＣ－高、ｃＴＥＣ－低、未成熟ＴＥＣ、ｍＴＥＣ－低、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ高、ケラチノサイト様ｍＴＥＣ、神経内分泌細胞、筋様細胞、ミエリン細胞に限定されない細胞型の１つ又は複数を含み得る。胸腺細胞型の各々は１つ又は複数のマーカーに関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｃＴＥＣ－高 細胞は、例えばＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、及びＣＣＬ２５に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｃＴＥＣ－低 細胞は、例えばＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５（ＨＬＡクラスＩＩ、ＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５のレベルが低く、ＫＩ６７＋増殖細胞が増加）に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、未成熟ＴＥＣ細胞は、ｃＴＥＣ／ｍＴＥＣ機能遺伝子を欠く、例えばＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＳＩＸ１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｍＴＥＣ－低 細胞は、例えば、ＣＬＤＮ４、低レベルのＨＬＡクラスＩＩ、高レベルのケモカインＣＣＬ２１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ高 細胞は、例えばＳＰＩＢ、ＡＩＲＥ、ＦＥＺＦ２、高レベルのＨＬＡクラスＩＩに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ケラチノサイト様ｍＴＥＣ細胞は、例えばＫＲＴ１、ＩＶＬに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、神経内分泌細胞は、例えばＢＥＸ１、ＮＥＵＲＯＤ１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、筋様細胞は、例えばＭＹＯＤ１、ＤＥＳに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ミエリン細胞は、例えばＭＰＺの発現に関連付けられ得る。この説明全体を通じて使用されるように、細胞亜集団内のマーカー遺伝子発現の「低い」又は「より低い」レベルへの言及は、細胞集団全体にわたるマーカー遺伝子の平均発現レベルよりも約１．５倍低い、約２倍低い、約２．５倍低い、約３倍低い、約３．５倍低い、約４倍低い、約４．５倍低い、又は約５倍低い、又は５倍以下低いことを意味する。同様に、この説明全体を通じて、細胞亜集団内のマーカー遺伝子発現の「高い」又は「より高い」レベルへの言及は、細胞集団全体にわたるマーカー遺伝子の平均発現レベルよりも約１．５倍高い、約２倍高い、約２．５倍高い、約３倍高い、約３．５倍高い、約４倍高い、約４．５倍高い、又は約５倍高い、又は５倍以上高いことを意味する。
幹細胞の分化に由来する胸腺細胞集団は、本明細書に記載の１つ又は複数の方法によって分析され得る。いくつかの実施形態において、胸腺細胞集団は、例えばｃＴＥＣ－高、ｃＴＥＣ－低、未成熟ＴＥＣ、ｍＴＥＣ－低、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ高、ケラチノサイト様ｍＴＥＣ、神経内分泌細胞、筋様細胞、ミエリン細胞に限定されない細胞型の１つ又は複数を含み得る。胸腺細胞型の各々は１つ又は複数のマーカーに関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｃＴＥＣ－高 細胞は、例えばＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、及びＣＣＬ２５に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｃＴＥＣ－低 細胞は、例えばＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５（ＨＬＡクラスＩＩ、ＰＳＭＢ１１、ＰＲＳＳ１６、ＣＣＬ２５のレベルが低く、ＫＩ６７＋増殖細胞が増加）に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、未成熟ＴＥＣ細胞は、ｃＴＥＣ／ｍＴＥＣ機能遺伝子を欠く、例えばＦＯＸＮ１、ＰＡＸ９、ＳＩＸ１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ｍＴＥＣ－低 細胞は、例えば、ＣＬＤＮ４、低レベルのＨＬＡクラスＩＩ、高レベルのケモカインＣＣＬ２１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ高 細胞は、例えばＳＰＩＢ、ＡＩＲＥ、ＦＥＺＦ２、高レベルのＨＬＡクラスＩＩに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ケラチノサイト様ｍＴＥＣ細胞は、例えばＫＲＴ１、ＩＶＬに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、神経内分泌細胞は、例えばＢＥＸ１、ＮＥＵＲＯＤ１に限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、筋様細胞は、例えばＭＹＯＤ１、ＤＥＳに限定されないマーカーの発現に関連付けられ得る。いくつかの実施形態において、ミエリン細胞は、例えばＭＰＺの発現に関連付けられ得る。この説明全体を通じて使用されるように、細胞亜集団内のマーカー遺伝子発現の「低い」又は「より低い」レベルへの言及は、細胞集団全体にわたるマーカー遺伝子の平均発現レベルよりも約１．５倍低い、約２倍低い、約２．５倍低い、約３倍低い、約３．５倍低い、約４倍低い、約４．５倍低い、又は約５倍低い、又は５倍以下低いことを意味する。同様に、この説明全体を通じて、細胞亜集団内のマーカー遺伝子発現の「高い」又は「より高い」レベルへの言及は、細胞集団全体にわたるマーカー遺伝子の平均発現レベルよりも約１．５倍高い、約２倍高い、約２．５倍高い、約３倍高い、約３．５倍高い、約４倍高い、約４．５倍高い、又は約５倍高い、又は５倍以上高いことを意味する。
【0080】
いくつかの実施形態において、ｄａ Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１８ Ｍａｒ １；９（１）：８９２（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒを使用して（細胞周期及びストレス細胞の潜在的な交絡効果を明らかにするために）品質管理、細胞周期、及びミトコンドリア含有量の回帰を行い、その後、可変遺伝子の同定、次元削減（ＵＭＡＰ＝一様多様体近似と投影）及びクラスタリングを行い得る。ＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒは胸腺細胞集団内の転写クラスターを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、単一細胞及びクラスターはＵＭＡＰ空間内で視覚化され得る。いくつかの系統の標準的なマーカー遺伝子は各転写クラスターに細胞型同一性を割り当てるために使用され得る。
【0081】
いくつかの実施形態において、インビトロで生物に由来する又はインビボで生物から得られる胸腺細胞のｓｃＲＮＡ配列データは比較され得る。様々な技術を使用する大規模な単一細胞トランスクリプトームデータセットは、データ統合に課題をもたらすバッチ固有の系統的変動を含む。バッチ修正の方法は回帰ベースのバッチ修正（ｄａ Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１８ Ｍａｒ １；９（１）：８９２ （その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）及び調和ベースのバッチ修正（Ｋｏｒｓｕｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ； １６， ｐａｇｅｓ １２８９－１２９６ （２０１９））を含み得る。
【0082】
いくつかの実施形態において、バッチ修正はＳｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｎｅｔ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｋａｎｇ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， ５８９０ （２０２１）。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）及びＬａｂｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（パッケージＳｅｕｒａｔ（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｃｅｌｌ １７７， １８８８－１９０２。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）で実施されるように）を使用して行うことができる。
【0083】
ＩＶ．定義
発現：本明細書で使用されるように、「発現」及びその文法上の等価物は、マーカーの文脈において、マーカーの産生並びにマーカーのレベル又は量を指す。例えば、細胞におけるマーカーの発現又はマーカーの存在又は細胞がマーカーに対して陽性であるとは、陽性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陽性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を有することが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。同様に、マーカーの発現がない、又は細胞がマーカーに対して陰性であるとは、陰性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陰性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を持たないことが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。そのため、マーカーが存在しないということは、マーカーの発現が検出不可のレベルであることを単に意味するものではなく、特定の場合において、細胞がマーカーを発現している可能性があるが、その発現が陽性対照と比較して低いか、又は陰性対照のそれに類似したレベルであり得る。
発現：本明細書で使用されるように、「発現」及びその文法上の等価物は、マーカーの文脈において、マーカーの産生並びにマーカーのレベル又は量を指す。例えば、細胞におけるマーカーの発現又はマーカーの存在又は細胞がマーカーに対して陽性であるとは、陽性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陽性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を有することが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。同様に、マーカーの発現がない、又は細胞がマーカーに対して陰性であるとは、陰性対照レベルと同様のレベルでのマーカーの発現を指す。陰性対照レベルは、マーカーと関連する細胞運命を持たないことが知られている細胞によって発現されるマーカーのレベルによって決定され得る。そのため、マーカーが存在しないということは、マーカーの発現が検出不可のレベルであることを単に意味するものではなく、特定の場合において、細胞がマーカーを発現している可能性があるが、その発現が陽性対照と比較して低いか、又は陰性対照のそれに類似したレベルであり得る。
【0084】
エフェクター細胞：本明細書で使用されるように、「エフェクター細胞」は、胸腺細胞に接触又は近接すると、シグナル又は細胞細胞死トリガーを実行、開始又は伝播する能力を獲得する任意の細胞又は細胞型を指す。「接触又は近接」とは、細胞内在性又は細胞外来性（例えば、細胞間）シグナル伝達又は他のコミュニケーション又は相互作用を可能にするのに十分な時空間的接近を指す。
【0085】
リンパ球：本明細書で使用されるように、「リンパ球」は、当業者がこの用語を理解するであろう意味及び使用を包含し、更に、リンパ組織又は血液中に存在する、骨髄に由来する１つの種類の免疫細胞を指す。いくつかの実施形態において、リンパ球は胸腺内で成熟する。
【0086】
陰性：本明細書で使用されるように、用語「陰性」（「－」と略す場合がある）は、示された細胞マーカーの発現に関して本明細書で使用される場合、細胞が示された細胞マーカーを検出可能なレベルで発現しないことを意味する。
【0087】
陽性：本明細書で使用されるように、用語「陽性」（「＋」と略す場合がある）は、示された細胞マーカーの発現に関して本明細書で使用される場合、細胞が示された細胞マーカーを検出可能なレベルで発現することを意味し、例えば、低い（ただし検出可能）レベルでの発現及び高い（高）レベルでの発現を含み得る。
【0088】
プレＴ細胞：本明細書で使用されるように、「プレＴ細胞」とは、Ｔ細胞に成熟又は分化できるリンパ球を指す。
【0089】
可溶性因子：本明細書で使用されるように、「可溶性因子」とは細胞表面分子に結合できる又は細胞に取り込むことができる任意のタンパク質又はペプチドを指す。細胞による取り込みは受動拡散、トランスポーター、及び／又はエンドサイトーシスによって行われ得る。
【0090】
亜集団比（ＳＰＲ）：本明細書で使用されるように、ＳＰＲとは参照胸腺マップ中の胸腺細胞亜集団の割合に対する試験胸腺マップ中の胸腺細胞亜集団（本明細書では「細胞型」ともいう）の割合の比を指す。いくつかの実施形態において、ＳＰＲはｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、又はタフト／イオノサイトＳＰＲであり得る。
【0091】
ｃＴＥＣ比及び相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）：本明細書で使用されるように、ｃＴＥＣ比とは、特定の胸腺マップ（参照又は試験胸腺マップ）内のｃＴＥＣ低 細胞に対するｃＴＥＣ高 細胞の割合の比を指す。ＲＣＴＲとは、参照胸腺マップ中のｃＴＥＣ比に対する試験胸腺マップ中のｃＴＥＣ比の比を指す。
【0092】
胸腺細胞又は起源又は系統：本明細書で使用されるように、「胸腺細胞又は胸腺起源又は胸腺系統」とは、胸腺由来の細胞又は胸腺の細胞になる予定の細胞に関連付けられた１つ又は複数の表現型又は遺伝子型マーカーを有する細胞を指す。本明細書で使用されるように、胸腺は胚、胎児又は成体胸腺であり得る。
【0093】
胸腺細胞産物：本明細書で使用されるように、「胸腺細胞産物」とは、表現型的にもしくは機能的にヒト胸腺もしくはその亜集団との類似点を有し、かつ／又は治療、診断、もしくは研究用途に適する、胸腺細胞の集団を指す。
【0094】
胸腺マップ：本明細書で使用されるように、「胸腺マップ」とは、胸腺細胞又は胸腺組織の集団の分子プロファイルを指す。分子プロファイルは、胸腺細胞又は胸腺組織の集団の全転写プロファイル、胸腺細胞又は胸腺組織内の細胞の亜集団、及び／又は同定された亜集団の転写プロファイルを含み得る。いくつかの実施形態において、胸腺マップは、本明細書で使用されるように、胸腺組織及び胸腺組織内の既知の細胞型の転写プロファイルによって生成されるヒト胸腺の代表的なマップを指す参照胸腺マップであり得る。１つの実施形態において、参照胸腺マップはＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の転写プロファイリングデータを使用して生成され得る。本明細書で使用されるように、試験胸腺マップとは、分子プロファイルが参照胸腺マップと比較される胸腺細胞の集団の特徴を指す。
【0095】
変異体：生体分子（例えば、訓練因子又は最終因子）に関して使用される用語「変異体」とは、親分子に関連する又は親分子に由来する生体分子を指す。変異体は、例えば、親分子の修飾型、切断型、突然変異型、相同型、又は他の改変型であってもよい。用語変異体はポリヌクレオチド又はポリペプチドのいずれかを説明するために使用できる。
【0096】
本開示の１つ又は複数の実施形態の詳細は以下の添付の説明に記載される。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の材料及び方法は本開示の実施又は試験に用いることができるが、好ましい材料及び方法をここに記載する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本説明から明らかになろう。本説明において、単数形は、文脈が特に示さない限り、複数形も含む。他に定義されない限り、本説明で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本説明が統制する。
【0097】
本開示を以下の非限定的な例によって更に説明する。
【実施例】
【0098】
実施例１．胸腺細胞の単一細胞ＲＮＡ配列決定分析
Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．に発表された生後１９日の胎児及び２５歳の成体の胸腺のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの分析を行った（ヒト胸腺間質の単一細胞転写プロファイリングにより、胸腺髄質における新規な細胞不均一性が明らかになる。Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．に発表された生後１９日の胎児及び２５歳の成体の胸腺のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータの分析を行った（ヒト胸腺間質の単一細胞転写プロファイリングにより、胸腺髄質における新規な細胞不均一性が明らかになる。Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0099】
ｄａ Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１８ Ｍａｒ １；９（１）：８９２（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒを使用して（細胞周期及びストレス細胞の潜在的な交絡効果を明らかにするために）品質管理、細胞周期、及びミトコンドリア含有量の回帰を行い、その後、可変遺伝子の同定、次元削減（ＵＭＡＰ）及びクラスタリングを行った。ＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒは２４個の転写クラスターを同定した。単一細胞及びクラスターをＵＭＡＰ空間内で視覚化した。各転写クラスターに細胞型同一性を割り当てるためにいくつかの系統の標準的なマーカー遺伝子を使用した。各クラスター内の各遺伝子の平均発現を示すヒートマップを生成した。
【0100】
５つの間葉系細胞（ＭＣ）状態が同定された（ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、及びＭＣ５と呼ばれる）。更なる細胞間コミュニケーション不偏分析により、間葉－上皮相互作用、例えばＭＣ２とｍＴＥＣの間の相互作用が同定された。
【0101】
細胞間コミュニケーション／相互作用をヒートマップとして視覚化して、異なる細胞間の相互作用の程度を分析した。細胞間コミュニケーション不偏分析により、間葉－上皮相互作用、特にＭＣ２とｍＴＥＣの間の相互作用が同定された。Ｅｎｄｏ１及びＥｎｄｏ３と命名された細胞は特定のＴＥＣサブセットと相互作用すると考えられた。このような相互作用の同定は相互作用遺伝子候補及び調節遺伝子候補の同定を容易にする可能性がある。
【0102】
内皮細胞はＴＥＣ細胞、特に、ｍＴＥＣと強く相互作用し、リガンドを潜在的に発現する胸腺上皮細胞及び細胞型の発生に重要であると報告されているシグナル伝達経路につながるリガンド－受容体相互作用を優先していることが見出された。そのような例の１つはｃＴＥＣ及びｍＴＥＣにおけるＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）経路である。これらのデータは、胸腺細胞培養におけるＥＧＦの使用の潜在的な有用性を強調する。細胞型発現リガンドを、細胞型発現受容体と対にし、かつ分析した。内皮細胞とＴＥＣ細胞（特にｍＴＥＣ）の間の強い相互作用が同定された。ＥＧＦＲ、ＩＴＧＢ１のような受容体が分析において同定された。
【0103】
リガンド－受容体相互作用の更なる優先順位付けにより、胸腺上皮細胞（例えば、ＭＩＦ及びＣＤ７４）及び潜在的なエフェクター（例えばＣＤ７４からＬＴＦ）の発達に重要である可能性があるシグナル伝達分子及びネットワークが同定された。活性スコアを使用して遺伝子調節ネットワーク分析に基づいて報告されている転写調節因子によって制御されると予測される遺伝子セットにおける細胞型特異的遺伝子サインの濃縮を研究した。
【0104】
受容体及び下流エフェクターのマッチングにより、受容体の活性を媒介する推定上のシグナル伝達分子及びネットワークが同定された。ＴＥＣの発生に重要である可能性がある特定の細胞表面受容体に応答する転写調節因子も同定された。例えば、ＣＤ７４に応答するＬＴＦ及びＥＮＯ－１が同定された。Ｅｎｏ－１（エノラーゼ）はＴ細胞の代謝に重要であると知られている。ＬＴＦ（ラクトフェリン）は鉄の輸送に関与する。これらの発見はインビトロで培養されたＴＥＣにおける鉄補給の有用性を示唆する。ＭＩＦ（マクロファージ阻害因子）はＣＤ７４の既知のリガンドであるため、この発見は１つ又は複数の細胞型の胸腺細胞への分化誘導及び／又は胸腺細胞維持におけるＭＩＦの添加の有用性を示す。
【0105】
実施例２．胎児胸腺と成体胸腺の比較
若い（又は本明細書で胎児という）（１９週）対年長（２５歳）の胸腺（ｔｈｙｍｕｓｅｓ）（又は胸腺（ｔｈｙｍｉ））の転写プロファイルの比較は、著しく異なるプロファイルを示した。若い胸腺の転写プロファイルは、ｍＴＥＣ高、ｃＴＥＣ高、ｍＴＥＣ低、ｃＴＥＣ低、ｉＴＥＣ、神経内分泌、内皮細胞（Ｅｎｄｏ１、Ｅｎｄｏ２、Ｅｎｄｏ３、Ｅｎｄｏ４、Ｅｎｄｏ５）、間葉系細胞（ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５）、及び周皮細胞（周皮細胞－１、周皮細胞－２、周皮細胞－３）を含む複数の亜集団を示した。対照的に、年長の胸腺の転写プロファイルは、内皮、上皮、周皮細胞、及び間葉系細胞の亜集団を示した。上皮細胞の存在量は胎児胸腺（１９週齢）と比較して、成体胸腺（２５歳）において大幅に減少した。上皮細胞にも未成熟ＴＥＣがあると考えられる。内皮細胞サブセット、及び一部の周皮細胞サブセットは、１９週齢と２５歳の間の胸腺に保存されると考えられたが、間葉系細胞サブセットは年齢間で異なると考えられた。これらのデータは、胸腺欠損が２５歳でも発生することを示す。
若い（又は本明細書で胎児という）（１９週）対年長（２５歳）の胸腺（ｔｈｙｍｕｓｅｓ）（又は胸腺（ｔｈｙｍｉ））の転写プロファイルの比較は、著しく異なるプロファイルを示した。若い胸腺の転写プロファイルは、ｍＴＥＣ高、ｃＴＥＣ高、ｍＴＥＣ低、ｃＴＥＣ低、ｉＴＥＣ、神経内分泌、内皮細胞（Ｅｎｄｏ１、Ｅｎｄｏ２、Ｅｎｄｏ３、Ｅｎｄｏ４、Ｅｎｄｏ５）、間葉系細胞（ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４、ＭＣ５）、及び周皮細胞（周皮細胞－１、周皮細胞－２、周皮細胞－３）を含む複数の亜集団を示した。対照的に、年長の胸腺の転写プロファイルは、内皮、上皮、周皮細胞、及び間葉系細胞の亜集団を示した。上皮細胞の存在量は胎児胸腺（１９週齢）と比較して、成体胸腺（２５歳）において大幅に減少した。上皮細胞にも未成熟ＴＥＣがあると考えられる。内皮細胞サブセット、及び一部の周皮細胞サブセットは、１９週齢と２５歳の間の胸腺に保存されると考えられたが、間葉系細胞サブセットは年齢間で異なると考えられた。これらのデータは、胸腺欠損が２５歳でも発生することを示す。
【0106】
実施例３．転写調節因子
細胞分化の軌跡を追跡するためのアルゴリズムを使用したところ、初期ｉＴＥＣからのｍＴＥＣ対ｃＴＥＣの発生の異なる動態が示された。軌跡の各々は、ｍＴＥＣ又はｃＴＥＣのいずれかへの分化に寄与し得る特定の顕著な遺伝子ネットワーク、シグナル伝達分子及び調節因子を強調した。優先順位付けされた転写調節因子の動態パターンは、ｉＴＥＣからｍＴＥＣと比較して異なるｉＴＥＣからｃＴＥＣの分化パターンを示した。
細胞分化の軌跡を追跡するためのアルゴリズムを使用したところ、初期ｉＴＥＣからのｍＴＥＣ対ｃＴＥＣの発生の異なる動態が示された。軌跡の各々は、ｍＴＥＣ又はｃＴＥＣのいずれかへの分化に寄与し得る特定の顕著な遺伝子ネットワーク、シグナル伝達分子及び調節因子を強調した。優先順位付けされた転写調節因子の動態パターンは、ｉＴＥＣからｍＴＥＣと比較して異なるｉＴＥＣからｃＴＥＣの分化パターンを示した。
【0107】
実施例４．胸腺組織とｉＰＳＣ由来胸腺細胞のｓｃＲＮＡ配列データセットの比較
Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）からの胸腺組織のｓｃＲＮＡ配列データをＰａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ３６７， Ｉｓｓｕｅ ６４８０からの胸腺組織のｓｃＲＮＡ配列データを比較した（それらの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。様々な技術を使用する大規模な単一細胞トランスクリプトームデータセットは、データ統合に課題をもたらすバッチ固有の系統的変動を含む。バッチ変動から生じる差異を考慮せず、データを細胞型ではなく胸腺組織（胎児対成体）の年齢でクラスター化した。バッチ修正の２つの方法、即ち回帰ベースのバッチ修正（ｄａ Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１８ Ｍａｒ １；９（１）：８９２（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる））及び調和ベースのバッチ修正（Ｋｏｒｓｕｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ； １６， ｐａｇｅｓ １２８９－１２９６ （２０１９））を実行した。これらのデータは、回帰ベースのバッチ修正と比較して、調和ベースのバッチ修正が２つの研究間のデータのクラスター化により効果的であることを示した。
Ｂａｕｔｉｓｔａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， １０９６ （２０２１）からの胸腺組織のｓｃＲＮＡ配列データをＰａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ． ３６７， Ｉｓｓｕｅ ６４８０からの胸腺組織のｓｃＲＮＡ配列データを比較した（それらの全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。様々な技術を使用する大規模な単一細胞トランスクリプトームデータセットは、データ統合に課題をもたらすバッチ固有の系統的変動を含む。バッチ変動から生じる差異を考慮せず、データを細胞型ではなく胸腺組織（胎児対成体）の年齢でクラスター化した。バッチ修正の２つの方法、即ち回帰ベースのバッチ修正（ｄａ Ｒｏｃｈａ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ． ２０１８ Ｍａｒ １；９（１）：８９２（その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる））及び調和ベースのバッチ修正（Ｋｏｒｓｕｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ； １６， ｐａｇｅｓ １２８９－１２９６ （２０１９））を実行した。これらのデータは、回帰ベースのバッチ修正と比較して、調和ベースのバッチ修正が２つの研究間のデータのクラスター化により効果的であることを示した。
【0108】
Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．におけるｓｃＲＮＡ ｓｅｑデータにおいて同定された胎児及び成体胸腺中の異なる集団での細胞類似性を定量化するために、平均分類スコア（ＭＣＳ）を採用した。
【0109】
Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌからの細胞型を使用すること（本明細書では「Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ研究」という）で、単一細胞遺伝子発現プロファイル及びＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔアルゴリズムを使用して細胞型を同定するように機械学習モデルを訓練した（Ｔａｎ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ． ２０１９ Ａｕｇ ２８；９（２）：２０７－２１３．ｅ２。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。そのため、これらのモデルはトランスクリプトームが与えられた細胞型の同一性を表す。次に、これらのモデルをクエリして（ｑｕｅｒｙ）、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．に含まれるデータセット（本明細書では「親」データセットという）内の細胞型間でどのようなトランスクリプトーム類似性が存在するか（存在する場合）を識別した。視覚化を容易にするために、スコアの平均分類を計算した。親データセットからの各単一細胞亜集団はスコアを有し、ヒートマップは親のデータからの以前に注釈付けられた細胞型の平均スコアを示す。分類スコアの範囲は０～１であり、０は類似性なしを示し、１は高類似性を示す。Ｔｅｉｃｈｍａｎｎデータセットに記載の亜集団を親データセットにおける高ＭＣＳで同定した。バッチ修正後に同定された両方の研究間で観察された細胞型の保存は、公開されている胸腺組織のｓｃＲＮＡ配列データセットの調和において重要なステップを表す。そして、これらのデータセットから得られた洞察は、多能性幹細胞の分化に由来する胸腺集団の特徴決定に使用される。
【0110】
多能性幹細胞から分化した胸腺細胞に対してｓｃＲＮＡ配列決定を行った。これらのＴＥＰ由来物から７つの細胞亜集団が同定された。インビトロ由来の胸腺細胞由来物からのｓｃＲＮＡ配列データをＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．におけるｓｃＲＮＡ配列データセットと比較し、平均分類スコアを計算した。この比較は、インビトロ由来物内に存在する細胞集団、及びインビボで胸腺組織に存在する細胞型とのそれらの相関性についての洞察を提供する。平均分類スコアに基づくヒートマップは、ＴＥＰ由来物中の集団が神経内分泌細胞（集団５、３、及び４）と高い類似性を持ち、且つ角質細胞－ｍＴＥＣ様細胞（集団１、及び２及び集団６、７）との類似性がより低いｃＴＥＣ－低、イオノサイト及びミエリン細胞と高い類似性を持つことを明らかにした。集団中の神経内分泌細胞の濃縮は４５％胚体内胚葉細胞のみの存在に起因する可能性が高く、神経内分泌細胞への分化は胚体内胚葉の前方前腸への分化中にＳＭＡＤ阻害によって促進され得る。神経内分泌細胞は、神経内分泌表現型を発生する神経細胞であってもよい。由来物中の角質細胞様ｍＴＥＣの存在は望ましい。ＴＥＰ誘導条件は調整してもよく、ｓｃＲＮＡｓｅｑデータの比較によって決定されたｉＴＥＣの濃縮をサポートする培養条件は望ましい場合がある。
【0111】
ｍＴＥＣに類似する角質細胞様細胞（集団１、２）について、この集団はＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ ２０２１で同定され、本明細書の分析に基づくと、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０２０に記載のｍＴＥＣ ＩＩＩと同等であり得る。該細胞は、皮膚角質細胞（最終分化ケラチノサイト）でも発現されるケラチン細胞骨格１（ＫＲＴ１）、ＫＲＴ１０、ＳＰＩＮＫＳ等の遺伝子を発現するため、角質細胞と呼ばれる。角質細胞様細胞は、ＡＩＲＥのようなｍＴＥＣと重複する転写物も発現する。そのため、それらは角質細胞様ｍＴＥＣと呼ばれる。それらはヒト胸腺におけるユニークな細胞であるハッサル小体を生じさせる前駆体である可能性が高い。これらの細胞はｍＴＥＣ前駆細胞に由来するとも考えられる（（Ｎｏａｍ Ｋａｄｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２０ ｖ２０：２３９。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。角質細胞に似た集団１及び２もタフト／イオノサイト細胞といくつかの類似点を有すると考えられる（Ｍｉｌｌｅｒ Ｃ ｅｔ ａｌ ２０１８ Ｎａｔｕｒｅ ５５９：６２７。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。胸腺タフト細胞は角質細胞様に隣接して局在することが示された（Ｋａｄｏｕｒｉ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０２０ Ａｐｒ；２０（４）：２３９－２５３。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【0112】
実施例５．胸腺細胞表面受容体及び転写調節因子
ｓｃＲＮＡ配列の比較分析の目的の１つは、インビトロでの多能性幹細胞の分化中に最終的にＴＥＰ細胞を生じさせる細胞の前駆細胞又は前駆体を同定することである。ｍＴＥＣとｃＴＥＣ集団の両方を生じさせるｉＴＥＣ細胞とも呼ばれる「二能性」前駆細胞の存在は当分野で推測されているが、決定的に同定されていない。本明細書で行われる細胞結合性のコンピューターによる追跡は、ｉＴＥＣ集団が、更に「ｃＴＥＣ高」及び「ｍＴＥＣ高」細胞に発達する「ｃＴＥＣ低」及び「ｍＴＥＣ低」細胞を生じさせる可能性があると示唆する。胸腺細胞の亜集団の認識を助けるために、様々な亜集団において優先的に発現される表面マーカー及び転写因子を同定していた。特に、前記分析により、２グループのｉＴＥＣ細胞の表面マーカー及び転写因子が同定された。細胞表面マーカーは、ｉＴＥＣ－１についてＩＧＫＣ（ＥＮＳＧ０００００２１１５９２）を、ｉＴＥＣ－２についてＡＮＡＸ２、ＬＩＭＡ１（ＥＮＳＧ００００００５０４０５）、ＥＧＦＲ（ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）を含む。転写調節因子は、ｉＴＥＣ－１についてＡＳＣＬ１（ＥＮＳＧ０００００１３９３５２）、ＨＥＳ１（ＥＮＳＧ０００００１１４３１５）、ＪＵＮＤ（ＥＮＳＧ０００００１３０５２２）、ＦＯＳ（ＥＮＳＧ０００００１７０３４５）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１５０３４７）、ＩＲＦ１（ＥＮＳＧ０００００１２５３４７）、ＭＡＦＢ（ＥＮＳＧ０００００２０４１０３）、ＩＦＩ１６（ＥＮＳＧ０００００１６３５６５）、ＦＯＸＣＩ（ＥＮＳＧ００００００５４５９８）、ＳＴＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１１５４１５）を、ｉＴＥＣ－２についてＪＵＮＢ（ＥＮＳＧ０００００１７１２２３）、ＥＧＦＲ１、ＺＦＰ３６（ＥＮＳＧ０００００１２８０１６）、ＪＵＮ（ＥＮＳＧ０００００１７７６０６）、ＦＯＳＢ（ＥＮＳＧ０００００１２５７４０）、ＩＥＲ２（ＥＮＳＧ０００００１６０８８８）、ＰＡＸ９（ＥＮＳＧ０００００１９８８０７）、ＨＩＦ１Ａ（ＥＮＳＧ０００００１００６４４）を含む。
ｓｃＲＮＡ配列の比較分析の目的の１つは、インビトロでの多能性幹細胞の分化中に最終的にＴＥＰ細胞を生じさせる細胞の前駆細胞又は前駆体を同定することである。ｍＴＥＣとｃＴＥＣ集団の両方を生じさせるｉＴＥＣ細胞とも呼ばれる「二能性」前駆細胞の存在は当分野で推測されているが、決定的に同定されていない。本明細書で行われる細胞結合性のコンピューターによる追跡は、ｉＴＥＣ集団が、更に「ｃＴＥＣ高」及び「ｍＴＥＣ高」細胞に発達する「ｃＴＥＣ低」及び「ｍＴＥＣ低」細胞を生じさせる可能性があると示唆する。胸腺細胞の亜集団の認識を助けるために、様々な亜集団において優先的に発現される表面マーカー及び転写因子を同定していた。特に、前記分析により、２グループのｉＴＥＣ細胞の表面マーカー及び転写因子が同定された。細胞表面マーカーは、ｉＴＥＣ－１についてＩＧＫＣ（ＥＮＳＧ０００００２１１５９２）を、ｉＴＥＣ－２についてＡＮＡＸ２、ＬＩＭＡ１（ＥＮＳＧ００００００５０４０５）、ＥＧＦＲ（ＥＮＳＧ０００００１４６６４８）を含む。転写調節因子は、ｉＴＥＣ－１についてＡＳＣＬ１（ＥＮＳＧ０００００１３９３５２）、ＨＥＳ１（ＥＮＳＧ０００００１１４３１５）、ＪＵＮＤ（ＥＮＳＧ０００００１３０５２２）、ＦＯＳ（ＥＮＳＧ０００００１７０３４５）、ＡＲＩＤ５Ｂ（ＥＮＳＧ０００００１５０３４７）、ＩＲＦ１（ＥＮＳＧ０００００１２５３４７）、ＭＡＦＢ（ＥＮＳＧ０００００２０４１０３）、ＩＦＩ１６（ＥＮＳＧ０００００１６３５６５）、ＦＯＸＣＩ（ＥＮＳＧ００００００５４５９８）、ＳＴＡＴ１（ＥＮＳＧ０００００１１５４１５）を、ｉＴＥＣ－２についてＪＵＮＢ（ＥＮＳＧ０００００１７１２２３）、ＥＧＦＲ１、ＺＦＰ３６（ＥＮＳＧ０００００１２８０１６）、ＪＵＮ（ＥＮＳＧ０００００１７７６０６）、ＦＯＳＢ（ＥＮＳＧ０００００１２５７４０）、ＩＥＲ２（ＥＮＳＧ０００００１６０８８８）、ＰＡＸ９（ＥＮＳＧ０００００１９８８０７）、ＨＩＦ１Ａ（ＥＮＳＧ０００００１００６４４）を含む。
【0113】
実施例６．細胞同一性分析のワークフロー
この研究の目的は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０に発表された参照細胞アトラスに対するｉＰＳＣ由来胸腺細胞の分子類似性を決定するためのアルゴリズムを使用するワークフローを開発することであった。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞の分析は、標的細胞型へのｉＰＳＣの指向性分化中の実質的な不均一性と非同期的な細胞挙動により、多くの場合困難である。前記アルゴリズムは異なる仮定に基づいて構築され、データの一部の側面を捕捉しながらその他の側面を見逃す方が好ましい場合があるため、インビトロｉＰＳＣ由来胸腺細胞のインビボ対応物に対するその分子類似性を決定するには、直交的且つ相補的なアプローチを採用することが重要である。前記ワークフローはＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｋａｎｇ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， ５８９０ （２０２１）。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）及びＬａｂｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（パッケージＳｅｕｒａｔ（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｃｅｌｌ １７７， １８８８－１９０２。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）で実施されるように）を用いた。前記アルゴリズムはｉＰＳＣ由来胸腺細胞から細胞を分類し（ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ。ｉＰＳＣ由来細胞を参照ＵＭＡＰにマッピングし、訓練データセットに由来するクラスラベルに基づいて細胞を分類する（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ））、訓練データセットから学習したラベルをクエリデータセット内の個々の細胞に転送するために用いられた。
この研究の目的は、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１及びＰａｒｋ ｅｔ ａｌ． ２０２０に発表された参照細胞アトラスに対するｉＰＳＣ由来胸腺細胞の分子類似性を決定するためのアルゴリズムを使用するワークフローを開発することであった。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞の分析は、標的細胞型へのｉＰＳＣの指向性分化中の実質的な不均一性と非同期的な細胞挙動により、多くの場合困難である。前記アルゴリズムは異なる仮定に基づいて構築され、データの一部の側面を捕捉しながらその他の側面を見逃す方が好ましい場合があるため、インビトロｉＰＳＣ由来胸腺細胞のインビボ対応物に対するその分子類似性を決定するには、直交的且つ相補的なアプローチを採用することが重要である。前記ワークフローはＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Ｋａｎｇ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １２， ５８９０ （２０２１）。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）及びＬａｂｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（パッケージＳｅｕｒａｔ（Ｓｔｕａｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９， Ｃｅｌｌ １７７， １８８８－１９０２。その全ての内容は参照によって本明細書に組み込まれる）で実施されるように）を用いた。前記アルゴリズムはｉＰＳＣ由来胸腺細胞から細胞を分類し（ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ。ｉＰＳＣ由来細胞を参照ＵＭＡＰにマッピングし、訓練データセットに由来するクラスラベルに基づいて細胞を分類する（Ｓｙｍｐｈｏｎｙ））、訓練データセットから学習したラベルをクエリデータセット内の個々の細胞に転送するために用いられた。
【0114】
前記ワークフローはｉＰＳＣ細胞から分化した胸腺細胞集団（本明細書では「ｉＰＳ由来胸腺細胞」ともいう）に適用した。２つのｉＰＳＣ由来胸腺細胞集団サンプル、即ち２－１７９及びＥｘｐ２１ ｉＰＳ－ＴＥＰを使用した。まず、クエリ及び訓練細胞がＵＭＡＰ空間（ＵＭＡＰ＝一様多様体近似と投影）内の同様な位置に配置されるように、Ｓｙｍｐｈｏｎｙアルゴリズムをクエリ細胞（サンプル２－１７９）の投影及びＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１で生成された参照ＵＭＡＰ細胞アトラスに適用した。細胞同一性も特定の基準に基づいてこのアプローチを使用して決定した。ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ分析と一致して、Ｓｙｍｐｈｏｎｙもクエリ細胞を神経内分泌状態に割り当てた。しかし、サンプル２－１７９からのｉＰＳＣ由来細胞の大部分がｃＴＥＣ－低かｃＴＥＣ－高かを決定する角質細胞様の類似性は、Ｓｙｍｐｈｏｎｙでは捕捉されなかった。Ｌａｂｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒアプローチ（ソフトウェアパッケージＳｅｕｒａｔで使用可能）も用い、このアプローチでは、訓練データセット、例えば、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１から学習したクラスラベル（細胞型）がクエリ細胞、例えば、サンプル２－１７９及び４－１９１に転送された。ｉＰＳＣサンプル２－１７９（クエリ）のＵＭＡＰ分析後、ラベルが参照からクエリ細胞に転送された。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ及びＳｅｕｒａｔ分析は、神経内分泌細胞集団とｃＴＥＣ－低又はｃＴＥＣ－高 細胞集団の割り当てに関して良好な一致を示した。
【0115】
次に、Ｓｙｍｐｈｏｎｙを使用して、またＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔからの以前の結果も示して、サンプルＥｘｐ２１ ｉＰＳ－ＴＥＰを分析して比較を確立した。Ｓｙｍｐｈｏｎｙ分析は、サンプル２－１７９の同じ分析との比較において神経内分泌細胞の数が増加するが（ＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ結果と一致）、ｃＴＥＣ－低 細胞の数がより多いことを示した。これらの予測によれば、このサンプルにおいてｃＴＥＣ－高 細胞の数はより少ないが、ミエリン及び筋様細胞は実質的により多く、これはＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＮｅｔ分析と部分的に一致する。加えて、Ｓｙｍｐｈｏｎｙを使用してＥｘｐ２１ ｉＰＳ－ＴＥＰを分析することでｉ－ＴＥＣ集団が検出された。
【0116】
胸腺細胞由来物（実験２１）とクエリ間の異なる細胞型の百分率頻度を、Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１で初代ヒト胸腺において同定された細胞型、即ち参照の頻度と比較した。この比較は、神経内分泌細胞の百分率が参照に比べてクエリにおいてより高いことを明らかにした。Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣは参照においてのみ存在し、クエリでは存在しなかった。それに対して、クエリにおけるｉＴＥＣ及びｃＴＥＣ高集団の頻度は参照におけるｉＴＥＣの頻度に非常に似ていた。従って、ｉＰＳ細胞に由来するＴＥＰにおいて同定された細胞型の頻度は初代ヒト胸腺組織において同定された細胞型と同等であった。クエリ及び参照における各細胞型の細胞の数を表１に示す。
【0117】
（表１）クエリ及び参照における細胞数
【0118】
実施例７．ｉＰＳＣ由来胸腺細胞における胸腺多様性の再現
アルゴリズムＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒ及びＳｙｍｐｈｏｎｙを使用してヒト胸腺からの上皮細胞の参照単一細胞アトラス（本明細書ではＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「参照胸腺マップ」ともいう）を生成した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞を前記参照単一細胞アトラス上にマッピングし、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞をヒト胸腺におけるそれらのインビボ対応物に対する分子類似性に基づいて分類して試験胸腺マップを生成した。本明細書で使用されるように、「分子類似性」は、分類子と呼ばれる教師あり機械学習アルゴリズムによって計算される分類スコアと定義されてもよく、０に近いスコアは所与の細胞が特定の細胞型に類似する確率が低いことを意味し、１に近いスコアは所与の細胞がヒト胸腺におけるそれらのインビボ対応物に類似する確率が高いことを意味する。
アルゴリズムＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒ及びＳｙｍｐｈｏｎｙを使用してヒト胸腺からの上皮細胞の参照単一細胞アトラス（本明細書ではＢａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載の「参照胸腺マップ」ともいう）を生成した。ｉＰＳＣ由来胸腺細胞を前記参照単一細胞アトラス上にマッピングし、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞をヒト胸腺におけるそれらのインビボ対応物に対する分子類似性に基づいて分類して試験胸腺マップを生成した。本明細書で使用されるように、「分子類似性」は、分類子と呼ばれる教師あり機械学習アルゴリズムによって計算される分類スコアと定義されてもよく、０に近いスコアは所与の細胞が特定の細胞型に類似する確率が低いことを意味し、１に近いスコアは所与の細胞がヒト胸腺におけるそれらのインビボ対応物に類似する確率が高いことを意味する。
【0119】
このアプローチは、ｉＰＳＣから胸腺上皮細胞を分化させるインビトロプロトコール（例えば、実験２１及び実験２３）が、ヒト胸腺の細胞型多様性の再現により優れていることを示した（データは示さず）。サンプル全体にわたってｉＰＳＣ細胞由来の細胞型の割合を調査することで、実験２１及び２３は、ｃＴＥＣ（ｃＴＥＣ－高、ｃＴＥＣ－低を含む）、ｍＴＥＣのサブセット、未成熟ＴＥＣ、及び他の細胞型（下記表２参照）等、胸腺における重要な細胞型に転写的に類似する細胞を含むことを明らかにした。
【0120】
（表２）ｉＰＳＣ細胞に由来する異なる細胞型の割合
【0121】
表２におけるサンプルについて亜集団比（ＳＰＲ）を計算し、結果を表３に示す。本明細書で使用されるように、ＳＰＲとは、参照胸腺マップ中の細胞亜集団の割合に対する試験胸腺マップ中の亜集団（本明細書では「細胞型」ともいう）の割合の比を指す。いくつかの実施形態において、ＳＰＲはｉＴＥＣ ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｃＴＥＣ－低 ＳＰＲ、Ａｉｒｅ＋ｍＴＥＣ－高 ＳＰＲ、ｍＴＥＣ－低 ＳＰＲ、角質細胞様ｍＴＥＣ ＳＰＲ、繊毛ＳＰＲ、ミエリンＳＰＲ、筋様ＳＰＲ、神経内分泌ＳＰＲ、又はタフト／イオノサイトＳＰＲであり得る。実験２１／２２におけるｉＴＥＣ ＳＰＲの値は１に近く、この実験におけるｉＴＥＣの割合がヒト胸腺（参照胸腺マップ）におけるｉＴＥＣの割合に類似することを示唆した。
【0122】
表２に記載のサンプルについてｃＴＥＣ比及び相対ｃＴＥＣ比（ＲＣＴＲ）を計算し、結果を表４に示す。本明細書で使用されるように、ｃＴＥＣ比とは、特定の胸腺マップ中のｃＴＥＣ低 細胞に対するｃＴＥＣ高 細胞の割合の比を指す。ＲＣＴＲとは、参照胸腺マップに対する試験胸腺マップのｃＴＥＣ比の比を指す。実験２３におけるＲＣＴＲの値は１に近く、この実験におけるｃＴＥＣ比がヒト胸腺（参照胸腺マップ）におけるｃＴＥＣ比に類似することを示唆した。
【0123】
（表３）胸腺細胞由来物のＳＰＲ
【0124】
（表４）胸腺細胞由来物のＲＣＴＲ
【0125】
特に実験２３について、分析は、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞が、転写の観点から、主にｃＴＥＣ、ｉＴＥＣ、角質細胞様ｍＴＥＣ及び神経内分泌細胞に類似することを示した。
【0126】
ｉＰＳＣ由来胸腺細胞のＵＭＡＰ及びクラスタリング分析を行った。この分析は、１６個の不偏転写クラスターの存在を明らかにした。ヒト胸腺のｓｃＲＮＡ ｓｅｑ分析に由来する遺伝子発現サインとのこれらのサインの重複を同定したアルゴリズムＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒを使用してクラスター特異的遺伝子サインを計算した（Ｂａｕｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ． ２０２１に記載）。ヒートマップは、このような濃縮の統計的有意性を示す。クラスター１６特異的遺伝子はヒト胸腺からの神経内分泌遺伝子サインに著しく濃縮されたが、クラスター１１は角質細胞様ｍＴＥＣとの重複遺伝子プログラムを有し、そしてクラスター１、４及び５はｃＴＥＣとの顕著なサインの重複を示した。まとめると、これらの結果は、ｉＰＳＣクラスターとヒト胸腺におけるインビボ細胞型の間で転写プログラムが共有されることを示した。各転写クラスターで表される推定上の細胞型を同定するために、クラスタリング及びＳｙｍｐｈｏｎｙ分析を統合した。この分析はＳｙｍｐｈｏｎｙ予測細胞型がどのように転写クラスター全体に分布するかを調査した（表５）。
【0127】
（表５）異なるクラスターにおける異なる細胞型の割合
【0128】
クラスター１６内の細胞の大部分はＳｙｍｐｈｏｎｙによって神経内分泌細胞として分類され、クラスター１、３、４、５、及び１４はｃＴＥＣとして分類された細胞を高割合で含み、クラスター６はｃＴＥＣ－低として分類された細胞を主に含む。これらのデータは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ予測が転写クラスターからの細胞型の同定をガイドするために使用できることを示し、それは探索的なデータ分析においてよく採用されるステップである。
【0129】
神経内分泌細胞に関連付けられたマーカーを同定するために、クラスター１６内で発現された細胞マーカーを分析した。ＣｅｌｌＲｏｕｔｅｒを使用して、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞においてクラスター１６によって特異的に発現された細胞表面マーカーを分析した。神経内分泌細胞のための細胞表面マーカーは、ＰＤＰＮ（ＥＮＳＧ０００００１６２４９３）、ＣＮＴＮ２（ＥＮＳＧ０００００１８４１４４）、ＮＣＡＭ１（ＥＮＳＧ０００００１４９２９４）、ＣＸＣＲ４（ＥＮＳＧ０００００１２１９６６）、ＮＧＦＲ（ＥＮＳＧ００００００６４３００）、Ｌ１ＣＡＭ（ＥＮＳＧ０００００１９８９１０）、ＣＮＴＮＡＰ２（ＥＮＳＧ０００００１７４４６９）、ＡＮＫ３（ＥＮＳＧ０００００１５１１５０）、ＮＴＲＫ１（ＥＮＳＧ０００００１９８４００）、及び／又はＳＬＣ１Ａ２（ＥＮＳＧ０００００１１０４３６）を含んだ。これらの細胞表面マーカーを使用することで、神経内分泌細胞をｉＰＳＣ由来胸腺細胞集団から除去して他の胸腺細胞型が豊富な細胞集団、例えばｃＴＥＣ、及び／又はｉＴＥＣに限定さらない細胞集団を生成することができる。
【0130】
実施例８：ｉＰＳＣ由来胸腺細胞とヒト胸腺の間の重複する遺伝子発現パターン
ｉＰＳＣ細胞とヒト胸腺における細胞型の分子類似性の潜在的な原因である遺伝子発現プログラムを調査した。ヒートマップから、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞クラスターとヒト胸腺における細胞型の間の重複遺伝子セットを抽出し、それらの平均発現レベルをヒト胸腺の発現レベル上にプロットした。この分析は、ヒト胸腺においてｉＰＳＣクラスター１及びｃＴＥＣ－高で発現される遺伝子が、他の全ての細胞型と比較して実際にこの細胞型でより高度に発現されることを示した（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表６を参照）。また、クラスター１１と角質細胞様ｍＴＥＣ集団の間で共有される遺伝子発現プログラムはヒト胸腺からの角質細胞様ＴＥＣで実際により高度に発現される（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表７を参照）。同様に、クラスター１６と神経内分泌細胞の間で共有される遺伝子プログラムは明らかであり、この場合、標準的な神経内分泌マーカーがｉＰＳＣ細胞、例えばＮＥＵＲＯＤ１で同定され、これは本アプローチの妥当性を裏付けている（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表８を参照）。まとめると、この分析は、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰとそれらのインビボ対応物の間の分子類似性を示した。
ｉＰＳＣ細胞とヒト胸腺における細胞型の分子類似性の潜在的な原因である遺伝子発現プログラムを調査した。ヒートマップから、ｉＰＳＣ由来胸腺細胞クラスターとヒト胸腺における細胞型の間の重複遺伝子セットを抽出し、それらの平均発現レベルをヒト胸腺の発現レベル上にプロットした。この分析は、ヒト胸腺においてｉＰＳＣクラスター１及びｃＴＥＣ－高で発現される遺伝子が、他の全ての細胞型と比較して実際にこの細胞型でより高度に発現されることを示した（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表６を参照）。また、クラスター１１と角質細胞様ｍＴＥＣ集団の間で共有される遺伝子発現プログラムはヒト胸腺からの角質細胞様ＴＥＣで実際により高度に発現される（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表７を参照）。同様に、クラスター１６と神経内分泌細胞の間で共有される遺伝子プログラムは明らかであり、この場合、標準的な神経内分泌マーカーがｉＰＳＣ細胞、例えばＮＥＵＲＯＤ１で同定され、これは本アプローチの妥当性を裏付けている（遺伝子及び関連ＥＮＳＥＭＢＬ遺伝子識別子のリストについては表８を参照）。まとめると、この分析は、ｉＰＳＣ由来ＴＥＰとそれらのインビボ対応物の間の分子類似性を示した。
【0131】
（表６）ヒト胸腺におけるｉＰＳＣ－胸腺細胞クラスター１とｃＴＥＣ－高群の重複部分において発現される遺伝子
【0132】
（表７）ヒト胸腺におけるｉＰＳＣ－胸腺細胞クラスター１１と角質細胞様ｍＴＥＣ群の間の重複部分において発現される遺伝子
【0133】
（表８）ヒト胸腺におけるｉＰＳＣ－胸腺細胞クラスター１６と神経内分泌細胞群の間の重複部分において発現される遺伝子
【0134】
同等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多くの同等物を、通常の実験のみを使用して認識するか、又は確認することができる。本開示の範囲は、上記の明細書に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
当業者は、本明細書に記載された本開示による具体的な実施形態に対する多くの同等物を、通常の実験のみを使用して認識するか、又は確認することができる。本開示の範囲は、上記の明細書に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されている通りである。
【0135】
特許請求の範囲において、「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」等の冠詞は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ又は１つ超を意味する場合がある。グループの１つ以上のメンバー間の「又は」を含む特許請求の範囲又は明細書は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、グループメンバーの１つ、２つ以上、又は全てが所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられているか、又はそうでなければ関連する場合に満たされると考えられる。本開示は、正確にグループの１つのメンバーが所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられるか、又はそうでなければ関連する実施形態を含む。本開示は、複数の、又はグループメンバー全体が、所与の産物又はプロセスに存在するか、用いられるか、又はそうでなければ関連する実施形態を含む。
【0136】
「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素又はステップを許容するが含める必要はないことにも留意されたい。従って、「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「からなる」という用語も包含され、開示される。
【0137】
範囲が指定されている場合は、エンドポイントが含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明らかにそうでないとする場合を除いて、本開示の異なる実施形態において記載された範囲内の任意の特定の値又は下位範囲を範囲の下限の単位の１０分の１まで想定することができることを理解されたい。
【0138】
更に、従来技術の範囲内にある本開示の任意の特定の実施形態は、任意の１つ以上の特許請求の範囲から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。そのような実施形態は、当業者に知られているとみなされるので、除外が本明細書に明示的に記載されていなくても、それらは除外され得る。本開示の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療又は活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法など）は、理由の如何を問わず、従来技術の存在に関連するか否かにかかわらず、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。
【0139】
使用されている用語は、限定ではなく説明の用語であり、添付の特許請求の範囲内で、より広い側面における本開示の真の範囲及び意図から逸脱することなく変更を加えることができることを理解されたい。
【0140】
本開示は、いくつかの記載された実施形態に関して、いくらか詳細に、またある程度詳細に説明されてきたが、本開示は、そのような詳細又は実施形態、又は特定の実施形態に限定されるべきではなく、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の可能な限り広い解釈を提供し、従って本開示の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲に対して解釈されるべきである。
【国際調査報告】