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特表2024-523570ビーズベースの核酸の組み合わせインデックス付けのための方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】ビーズベースの核酸の組み合わせインデックス付けのための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240621BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240621BHJP
C12Q 1/6855 20180101ALI20240621BHJP
C12Q 1/6874 20180101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6855 Z
C12Q1/6874 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579590
(86)(22)【出願日】2022-06-23
(85)【翻訳文提出日】2023-12-25
(86)【国際出願番号】 US2022034734
(87)【国際公開番号】W WO2022271954
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/214,693
(32)【優先日】2021-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500358711
【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】アンドレア・マンゾ
(72)【発明者】
【氏名】コリン・ブラウン
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン・ノーバーグ
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー・ハリントン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QQ41
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
(57)【要約】
いくつかの実施形態は、組み合わせインデックス付きビーズを調製するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドへの異なるインデックスの逐次付加を含む。いくつかの実施形態では、インデックスは、化学ライゲーション、ポリメラーゼ伸長、部分的二本鎖アダプターのライゲーション、又は短いスプリントライゲーションによって付加される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の組み合わせインデックス付きビーズを調製する方法であって、（ａ）第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドを含む一次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、前記一次インデックス付きビーズの集団が、複数の第１のインデックス付きビーズの亜集団を含み、前記第１のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第１のインデックスを含む、一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、
（ｂ）前記一次インデックス付きビーズの集団を複数の第２のビーズの亜集団に分割することと、
（ｃ）二次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、
（ｉ）前記複数の第２のビーズの亜集団の第１のポリヌクレオチドを、第２のインデックスを含む第２のポリヌクレオチドで伸長して、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、前記第２のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第２のインデックスを含む、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、
（ｉｉ）前記第２のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、前記二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含み、任意選択で、
（ｄ）前記二次インデックス付きビーズの集団を複数の第３のビーズの亜集団に分割することと、
（ｅ）三次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、
（ｉ）前記複数の第３のビーズの亜集団の第２のポリヌクレオチドを、第３のインデックスを含む第３のポリヌクレオチドで伸長して、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、前記第３のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第３のインデックスを含む、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、
（ｉｉ）前記第３のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、前記三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を更に含む、方法。
【請求項2】
（ｃ）が、化学ライゲーションによって前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記第１のポリヌクレオチドが、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’修飾デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含み、前記第２のポリヌクレオチドが、前記３’－官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ｄＮＴＰを含み、
前記３’官能性部分及び前記５’官能性部分が、互いに反応して、修飾バックボーン結合を形成することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドで伸長することにより、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得、前記方法が、前記二次インデックス付きポリヌクレオチドを修飾して、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’修飾デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む修飾ポリヌクレオチドを得ることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記修飾することが、前記二次インデックス付きポリヌクレオチドをテンプレート非依存性ポリメラーゼと接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記テンプレート非依存性ポリメラーゼが、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリＡポリメラーゼ、又はＣＣＡ付加ＲＮＡポリメラーゼから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記テンプレート非依存性ポリメラーゼが、ＴｄＴである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
化学ライゲーション反応によって前記修飾ポリヌクレオチドを前記第３のポリヌクレオチドで伸長することを更に含み、前記第３のポリヌクレオチドが、前記３’官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ｄＮＴＰを含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記３’官能性部分が、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記５’官能性部分が、前記３’官能性部分と異なり、かつそれと適合性があり、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記３’官能性部分及び前記５’官能性部分が、以下の対：（ｉ）３’－アジド／５’－アルキニル、（ｉｉ）３’－アルキニル／５’－アジド、（ｉｉｉ）３’－チオール／５’－アルキニル、（ｉｖ）３’－チオール／５’－アルケニル、（ｖ）３’－アルキニル／５’－チオール、（ｖｉ）３’－アルケニル／５’－チオール、（ｖｉｉ）３’－アジド／５’－シクロオクチニル、（ｖｉｉｉ）３’－シクロオクチニル／５’－アジド、（ｉｘ）３’－ニトロン／５’－シクロオクチニル、及び（ｘ）３’－シクロオクチニル／５’－ニトロンから選択される、請求項３～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記３’官能性部分が、３’－アジドであり、前記５’官能性部分が、５’－アルキニルである、請求項３～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記クリックケミストリー反応が、トリアゾリルを含む修飾バックボーン結合を形成するための銅触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）を含む、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
（ｃ）が、ポリメラーゼ伸長によって前記第１のポリヌクレオチドを伸長することを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、第１のリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
（ｉ）前記第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、前記第２のインデックス又は前記第２のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第１のアダプターを前記第１のリンカーにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドを伸長して、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記第１のアダプターが、非伸長性３’末端を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項17】
前記非伸長性３’末端が、３’２’ジデオキシヌクレオチド又はＣ３リンカーを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記第１のアダプターを前記二次インデックス付きポリヌクレオチドから除去することを更に含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記除去することが、熱若しくは塩基によって前記第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって前記第１のアダプターを分解することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記第１のリンカーが、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記第１のリンカーが、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
（ｅ）が、ポリメラーゼ伸長によって前記第２のポリヌクレオチドを伸長することを含む、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記第１のアダプターが、第２のリンカーの相補体を含み、その結果、前記二次インデックス付きポリヌクレオチドが、前記第２のリンカーを含む、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
（ｉ）前記第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、前記第３のインデックス又は前記第３のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第２のアダプターを前記第２のリンカーにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記二次インデックス付きポリヌクレオチドを伸長して、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記第２のアダプターが、非伸長性３’末端を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記非伸長性３’末端が、３’２’ジデオキシヌクレオチド又はＣ３リンカーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記第２のアダプターを前記三次インデックス付きポリヌクレオチドから除去することを更に含む、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記除去することが、熱若しくは塩基によって前記第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって前記第１のアダプターを分解することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記第２のリンカーが、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記第２のリンカーが、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
（ｃ）が、ライゲーションによって前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項32】
（ｉ）前記第２のポリヌクレオチドと、前記第１のポリヌクレオチドの第１のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第１のアダプターを前記第１のリンカーにハイブリダイズすることと、任意選択で、追加のオリゴヌクレオチドを前記第１のインデックスにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ライゲーションによって前記第２のポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドで伸長することを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
（ｉ）前記第３のポリヌクレオチドと、前記第２のポリヌクレオチドの第２のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第２のアダプターを前記第２のリンカーにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記第２のポリヌクレオチドを前記第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記ライゲーションが、リガーゼの使用を含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記ライゲーションが、化学ライゲーション反応を含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
（ｃ）が、ライゲーションによって前記第１のポリヌクレオチドを伸長することを含み、前記第１のポリヌクレオチドが、第１のリンカーを含み、前記第２のポリヌクレオチドが、第２のリンカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項38】
（ｉ）前記第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、前記第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第１のアダプターを前記第１のリンカーにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドを、前記第２のリンカーにハイブリダイズすることができる前記領域にハイブリダイズすることと、
（ｉｖ）前記第１のポリヌクレオチドを前記第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第１のリンカー及び／又は前記第２のリンカーが、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記第１のリンカー及び／又は前記第２のリンカーが、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記第１のリンカー／又は第２のリンカーが、前記第１のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記第１のリンカー及び／又は前記第２のリンカーが、同じ長さを有する前記オリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記第１のアダプターを前記二次インデックス付きポリヌクレオチドから除去することを更に含む、請求項３７～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記除去することが、熱若しくは塩基によって前記第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって前記第１のアダプターを分解することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
（ｅ）が、ライゲーションによって前記第２のポリヌクレオチドを伸長することを含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、第３のリンカーを含み、その結果、前記二次インデックス付きポリヌクレオチドが、前記第３のリンカーを含み、前記第３のポリヌクレオチドが、第４のリンカーを含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
（ｉ）前記第３のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、前記第４のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）前記第２のアダプターを前記第３のリンカーにハイブリダイズすることと、
（ｉｉｉ）前記第３のポリヌクレオチドを、第４のインデックスにハイブリダイズすることができる前記領域を介して、前記第２のアダプターにハイブリダイズすることと、
（ｉｖ）前記二次インデックス付きポリヌクレオチドを前記第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記第３のリンカー及び／又は前記第４のリンカーが、９個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記第３のリンカー及び／又は前記第４のリンカーが、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記第３のリンカー及び／又は前記第４のリンカーが、前記第２のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記第３のリンカー及び／又は前記第４のリンカーが、同じ長さを有する前記オリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記第２のアダプターを前記三次インデックス付きポリヌクレオチドから除去することを更に含む、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記除去することが、熱若しくは塩基によって前記第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって前記第１のアダプターを分解することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
（ａ）が、（ｉ）前記第１のポリヌクレオチドを複数の第１のビーズの亜集団に付着させて、前記第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、前記第１のポリヌクレオチドが、第１のビーズの亜集団ごとに異なる第１のインデックスを含む、第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、
（ｉｉ）前記第１のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、前記一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記第１のポリヌクレオチドが、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーを介してビーズに付着される、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記第１の結合パートナー又は前記第２の結合パートナーが、ビオチン、ストレプトアビジン、ビオチン誘導体、ストレプトアビジン誘導体、抗体、及び抗体の抗原結合断片からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
（ｄ）及び（ｅ）を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付きビーズの亜集団に付加することと、を更に含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記第１のポリヌクレオチドが、Ｐ５配列、Ｐ５’配列、Ｐ７配列、及びＰ７’配列からなる群から選択されるプライマー結合部位を含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
前記第１のインデックス、前記第２のインデックス、及び／又は前記第３のインデックスが、２０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
前記第１のインデックス、前記第２のインデックス、及び／又は前記第３のインデックスが、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
（ｂ）が、前記一次インデックス付きビーズの集団を複数の区画にランダムに分配することを含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
（ｄ）が、前記二次インデックス付きビーズの集団を複数の区画にランダムに分配することを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記複数の区画が、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画を含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項63】
前記複数の組み合わせインデックス付きビーズが、磁気ビーズを含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記複数の組み合わせインデックス付きビーズをアレイ上に分配することを更に含む、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
アレイ上の前記組み合わせインデックス付きビーズを配列決定することを更に含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記組み合わせインデックスに基づいて、アレイ上の前記複数の組み合わせインデックス付きビーズのうちの１つのビーズの位置をデコードすることを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記複数の組み合わせインデックス付きビーズの各ビーズが、捕捉プローブを含む、請求項１～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記第１のポリヌクレオチド、前記第２のポリヌクレオチド、又は前記第３のポリヌクレオチドが、前記捕捉プローブを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
複数の標的核酸を前記捕捉プローブにハイブリダイズすることを更に含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記捕捉プローブを伸長することを更に含む、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国仮特許第６３／２１４，６９３号（２０２１年６月２４日出願）、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬ ＩＮＤＥＸＩＮＧ ＯＦ ＢＥＡＤ－ＢＡＳＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ」に対する優先権を主張し、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
本出願は、米国仮特許第６３／２１４，６９３号（２０２１年６月２４日出願）、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＯＭＢＩＮＡＴＯＲＩＡＬ ＩＮＤＥＸＩＮＧ ＯＦ ＢＥＡＤ－ＢＡＳＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ」に対する優先権を主張し、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
【0002】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、ＩＬＬＩＮＣ６０８ＷＯＳＥＱＬＩＳＴと題され、２０２２年６月１７日に作成されたファイルとして提供され、これは、およそ３．１５キロバイトのサイズである。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットでの配列表とともに出願されている。配列表は、ＩＬＬＩＮＣ６０８ＷＯＳＥＱＬＩＳＴと題され、２０２２年６月１７日に作成されたファイルとして提供され、これは、およそ３．１５キロバイトのサイズである。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
いくつかの実施形態は、組み合わせインデックス付きビーズを調製するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドへの異なるインデックスの逐次付加を含む。いくつかの実施形態では、インデックスは、化学ライゲーション、ポリメラーゼ伸長、部分的二本鎖アダプターのライゲーション、又は短いスプリントライゲーションによって付加される。
【背景技術】
【0004】
生体試料中に存在する特定の核酸配列の検出は、例えば、微生物を識別及び分類する、感染症を診断する、遺伝子異常を検出及び特徴付ける、がんに関連する遺伝的変化を識別する、疾患に対する遺伝的感受性を調べる、並びに様々な種類の治療に対する応答を測定するための方法として使用されてきた。生体試料中の特定の核酸配列を検出するための一般的な技術は、核酸配列決定である。
【0005】
核酸配列決定方法は、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔによって使用された化学的分解法並びにＳａｎｇｅｒによって使用されたストランド伸長法から著しく進化している。現在では、単一チップ上での数千個の核酸の並行処理を可能にするいくつかの配列決定方法が使用されている。いくつかのプラットフォームは、ビーズベース及びマイクロアレイのフォーマットを含み、シリカビーズが、配列決定、遺伝子型決定、遺伝子発現プロファイリングを含む用途でのこのようなフォーマットの適用に応じたプローブで官能化される。
【0006】
現在のビーズベースのアレイ上で異なる試料を遺伝子型決定する方法は、ビーズチップの異なる面積を複数のセクターに物理的に細分割するためのガスケットを必要とする。次いで、個々の試料を、ガスケットによって作成された各別個のセクションにロードする。しかしながら、そのような方法は、比較的少ない試料数の投入で使用されるが、ビーズチップ当たりの試料の密度が、ビーズチップ当たり２４～９６、３８４、１５３６、又はそれ以上の試料に増加すると、困難であり管理不能であることが立証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国仮特許第６３／２１４，６９３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書において提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、複数の組み合わせインデックス付きビーズを調製する方法であって、（ａ）第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドを含む一次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、一次インデックス付きビーズの集団が、複数の第１のインデックス付きビーズの亜集団を含み、第１のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第１のインデックスを含む、一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、（ｂ）一次インデックス付きビーズの集団を複数の第２のビーズの亜集団に分割することと、（ｃ）二次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、（ｉ）複数の第２のビーズの亜集団の第１のポリヌクレオチドを、第２のインデックスを含む第２のポリヌクレオチドで伸長して、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、第２のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第２のインデックスを含む、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第２のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含み、任意選択で、（ｄ）二次インデックス付きビーズの集団を複数の第３のビーズの亜集団に分割することと、（ｅ）三次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、（ｉ）複数の第３のビーズの亜集団の第２のポリヌクレオチドを、第３のインデックスを含む第３のポリヌクレオチドで伸長して、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、第３のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第３のインデックスを含む、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第３のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を更に含む、方法を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、化学ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’修飾デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含み、第２のポリヌクレオチドは、３’－官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ｄＮＴＰを含み、３’官能性部分及び５’官能性部分は、互いに反応して、修飾バックボーン結合を形成することができる。
【0011】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することにより、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得、本方法は、二次インデックス付きポリヌクレオチドを修飾して、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’修飾デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む修飾ポリヌクレオチドを得ることを更に含む。
【0012】
いくつかの実施形態では、修飾することは、二次インデックス付きポリヌクレオチドをテンプレート非依存性ポリメラーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（terminal deoxynucleotidyl transferase、ＴｄＴ）、ポリＡポリメラーゼ、又はＣＣＡ付加ＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、ＴｄＴである。
【0013】
いくつかの実施形態はまた、化学ライゲーション反応によって修飾ポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドで伸長することを含み、第３のポリヌクレオチドは、３’官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ｄＮＴＰを含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、３’官能性部分は、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される。
【0015】
いくつかの実施形態では、５’官能性部分は、３’官能性部分と異なり、かつ３’官能性部分と適合性があり、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される。
【0016】
いくつかの実施形態では、３’官能性部分及び５’官能性部分は、以下の対：（ｉ）３’－アジド／５’－アルキニル、（ｉｉ）３’－アルキニル／５’－アジド、（ｉｉｉ）３’－チオール／５’－アルキニル、（ｉｖ）３’－チオール／５’－アルケニル、（ｖ）３’－アルキニル／５’－チオール、（ｖｉ）３’－アルケニル／５’－チオール、（ｖｉｉ）３’－アジド／５’－シクロオクチニル、（ｖｉｉｉ）３’－シクロオクチニル／５’－アジド、（ｉｘ）３’－ニトロン／５’－シクロオクチニル、及び（ｘ）３’－シクロオクチニル／５’－ニトロンから選択される。いくつかの実施形態では、３’官能性部分は、３’－アジドであり、５’官能性部分は、５’－アルキニルである。
【0017】
いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、トリアゾリルを含む修飾バックボーン結合を形成するための銅触媒アジド－アルキン環化付加（copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition、ＣｕＡＡＣ）を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ポリメラーゼ伸長によって第１のポリヌクレオチドを伸長することを含み、第１のポリヌクレオチドは、第１のリンカーを含む。
【0019】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第２のインデックス又は第２のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドを伸長して、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、非伸長性３’末端を含む。いくつかの実施形態では、非伸長性３’末端は、３’２’ジデオキシヌクレオチド、又はＣ３リンカーを含む。
【0021】
いくつかの実施形態はまた、二次インデックス付きポリヌクレオチドから第１のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ポリメラーゼ伸長によって第２のポリヌクレオチドを伸長することを含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、第２のリンカーの相補体を含み、その結果、二次インデックス付きポリヌクレオチドが、第２のリンカーを含む。
【0025】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第３のインデックス又は第３のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第２のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）二次インデックス付きポリヌクレオチドを伸長して、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、非伸長性３’末端を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、非伸長性３’末端は、３’２’ジデオキシヌクレオチド、又はＣ３リンカーを含む。
【0028】
いくつかの実施形態はまた、三次インデックス付きポリヌクレオチドから第２のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0030】
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む。
【0031】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第２のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドの第１のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0032】
いくつかの実施形態はまた、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドで伸長することを含む。
【0033】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第３のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドの第２のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第２のリンカーにハイブリダイズすることと、任意選択で、追加のオリゴヌクレオチドを第１のインデックスにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第２のポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、ライゲーションは、リガーゼの使用を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ケミカルライゲーション反応を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、（ｃ）は、ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドを伸長することを含み、第１のポリヌクレオチドは、第１のリンカーを含み、第２のポリヌクレオチドは、第２のリンカーを含む。
【0037】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドを、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域にハイブリダイズすることと、（ｉｖ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0039】
いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、第１のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている。
【0040】
いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む。
【0041】
いくつかの実施形態はまた、二次インデックス付きポリヌクレオチドから第１のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、（ｅ）は、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドを伸長することを含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第３のリンカーを含み、その結果、二次インデックス付きポリヌクレオチドが、第３のリンカーを含み、第３のポリヌクレオチドは、第４のリンカーを含む。
【0043】
いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第３のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第４のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第３のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第４のインデックスにハイブリダイズすることができる領域を介して、第３のポリヌクレオチドを第２のアダプターにハイブリダイズすることと、（ｉｖ）二次インデックス付きポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、９個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0045】
いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、第２のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている。
【0046】
いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む。
【0047】
いくつかの実施形態はまた、三次インデックス付きポリヌクレオチドから第２のアダプターを除去することを含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、（ａ）は、（ｉ）第１のポリヌクレオチドを複数の第１のビーズの亜集団に付着させて、第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、第１のポリヌクレオチドが、第１のビーズの亜集団ごとに異なる第１のインデックスを含む、第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第１のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーを介してビーズに付着される。いくつかの実施形態では、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーは、ビオチン、ストレプトアビジン、ビオチン誘導体、ストレプトアビジン誘導体、抗体、及び抗体の抗原結合断片からなる群から選択される。
【0051】
いくつかの実施形態はまた、（ｄ）及び（ｅ）を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付きビーズの亜集団に付加することと、を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、Ｐ５’配列、Ｐ７配列、及びＰ７’配列からなる群から選択されるプライマー結合部位を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、第１のインデックス、第２のインデックス、及び／又は第３のインデックスは、２０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のインデックス、第２のインデックス、及び／又は第３のインデックスは、１０個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0054】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は、一次インデックス付きビーズの集団を複数の区画にランダムに分配することを含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、（ｄ）は、二次インデックス付きビーズの集団を複数の区画にランダムに分配することを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、複数の区画は、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、複数の組み合わせインデックス付きビーズは、磁気ビーズを含む。
【0058】
いくつかの実施形態はまた、複数の組み合わせインデックス付きビーズをアレイ上に分布させることを含む。いくつかの実施形態はまた、アレイ上の組み合わせインデックス付きビーズを配列決定することを含む。
【0059】
いくつかの実施形態はまた、組み合わせインデックスに基づいて、アレイ上の複数の組み合わせインデックス付きビーズのうちの１つのビーズの位置をデコードする。
【0060】
いくつかの実施形態では、複数の組み合わせインデックス付きビーズの各ビーズは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、又は第３のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、複数の標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態はまた、捕捉プローブを伸長することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】プール及び分割戦略を含む組み合わせインデックス付けの例示的な実施形態を示す。
【図2】リンカー－スプリントを用いた逐次的なスプリントされたライゲーション反応によって、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）、第２のインデックス（インデックスＢ）、及び第３のインデックス（インデックスＣ）に接合するスキームの実施形態を示す。
【図3】クリックケミストリーライゲーションによって、第２のインデックス（インデックスＢ）を、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に接合するスキームの一実施形態を示す。
【図4】逐次的ポリメラーゼ伸長反応によって、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。
【図5】二本鎖領域及び一本鎖オーバーハングを含むアダプターを使用して、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。
【図6】短いリンカー－スプリントを用いた逐次的なスプリントされたライゲーション反応によって、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。
【図7A】ポリメラーゼ伸長のための伸長テンプレート（リンク１ａ’－インデックスＢ’－Ｈｙｂ’）とハイブリダイズした捕捉オリゴヌクレオチド（Ｐ５－インデックスＡ－リンク１ａ）を有するビーズ、及び捕捉オリゴヌクレオチドの量を測定するのに有用なプライマーの位置、並びに伸長生成物を有するビーズ、及び全長伸長生成物の量を測定するのに有用なプライマーの位置を含む概略図を示す。
【図7B】捕捉オリゴヌクレオチドの量、及び様々な条件下での捕捉オリゴヌクレオチドのライゲーション伸長又は捕捉オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ伸長からの全長生成物の量についてのグラフを示す。
【図8A】ポリメラーゼ伸長又はライゲーションのいずれかによる捕捉オリゴヌクレオチドの伸長を含む３レベルインデックス付けのための方法において試験される工程及び条件を概説する概略図である。番号付けは、試験した条件に対応する。
【図8B】スプリントライゲーション（splint ligation、ＳＬ）及びポリメラーゼ伸長（polymerase extension、ＰＥ）を比較するための様々な実験条件を要約した表であり、レベル１インデックス付け（Ｌ１）、レベル２インデックス付け（Ｌ２）、及びレベル３インデックス付け（Ｌ３）について図８Ａで番号付けされた様々な条件（condition、ｃｏｎｄ）を含む。
【図9】様々な条件下での捕捉オリゴヌクレオチド（capture oligonucleotide、ＣＯ）、第２のレベルの伸長生成物、及び第３のレベルの伸長生成物の量を示すグラフである。
【図10】定量ＰＣＲによって測定された、ビオチン又は二重デスチオビオチン（dual desthiobiotin、ｄｄｂｉｏｔｉｎ）を介してビーズに付着され、様々な変性条件下で処理された第１の伸長生成物を有する捕捉オリゴヌクレオチドの濃度のグラフである。
【図11A】３レベルインデックス付け生成物、合成生成物に由来するＰＣＲ生成物、及びＰＣＲ生成物に由来する配列決定リードを含む、ビーズ上の合成生成物の配列決定リード方向を示す概略図である。
【図11B】ポリメラーゼ伸長若しくはスプリントライゲーションによって生成された伸長生成物について、完全に正確であるか、又は両方のインデックスが使用可能であるかのいずれかである配列を含む配列決定リードのパーセンテージを示すグラフである。使用可能なインデックスには、インデックスエラー補正履行でデコード補正することができ、３個のヌクレオチドハミング距離で設計されたインデックス内に１つ以下の「ＳＮＰ」を含み、「インデックス」領域全体にわたって挿入欠失を含まないものが含まれ、例えば、３レベルインデックスオリゴヌクレオチドでは、インデックス領域は、３つのインデックスを含む。
【図11C】ポリメラーゼ伸長若しくはスプリントライゲーションによって生成された伸長生成物について、完全に正確であるか、又は両方のインデックスが使用可能であるかのいずれかである配列を含む配列決定リードに関して、エラーが欠失、挿入、又は塩基変化（ＳＮＰ）であるかどうかを含む塩基ごとのエラー率を示すグラフである。使用可能なインデックスには、インデックスエラー補正履行でデコード補正することができ、３ヌクレオチドハミング距離で設計されたインデックス内に１つ以下の「ＳＮＰ」を含み、「インデックス」領域全体にわたって挿入欠失を含まないものが含まれ、例えば、３レベルインデックスオリゴヌクレオチドでは、インデックス領域は、３つのインデックスを含む。
【図12A】標準スプリントライゲーション法（左パネル）及び二本鎖スプリントライゲーション法（右パネル）における工程を示す概略図である。いくつかの実施形態では、二本鎖スプリントライゲーション法は、追加のオリゴヌクレオチド（インデックス１’）を含み得る。
【図12B】標準スプリントライゲーション及び二本鎖スプリントライゲーションのための方法における工程で試験された条件を示す概略図である。
【図12C】標準ライゲーション又は二本鎖ライゲーションのいずれかからの伸長生成物を測定するための順方向プライマー又は逆方向プライマーの位置を示す概略図である。
【図13A】定量ＰＣＲによって測定された、伸長生成物の濃度を示すグラフである。図１２Ｃに示されるように、Ｆ２及びＲ１プライマーを用いて捕捉オリゴヌクレオチドを測定し、Ｆ２及びＲ２又はＦ３及びＲ２プライマーのいずれかを用いて全長生成物を測定した。
【図13B】全長対照に対して正規化された伸長生成物の相対濃度を示すグラフである。
【図13C】捕捉オリゴヌクレオチド濃度に対して正規化された伸長生成物の相対濃度を示すグラフである。
【図13D】様々な量の二本鎖スプリントオリゴの存在下で生成された伸長生成物の濃度を示すグラフである。
【図13F】非伸長性３’ｄｄＣ末端を有するオリゴヌクレオチドの存在下で生成された伸長生成物の濃度を示すグラフである。
【図13G】室温又は７５℃でのライゲーション前の工程で生成された伸長生成物の濃度を示すグラフである。
【図14A】スプリントライゲーション伸長若しくは二本鎖スプリントライゲーションによって生成された伸長生成物について、完全に正確であるか、又は両方のインデックスが使用可能であるかのいずれかである配列を含む配列決定リードのパーセンテージを示すグラフである。使用可能なインデックスには、インデックスエラー補正履行でデコード補正することができ、３ヌクレオチドハミング距離で設計されたインデックス内に１つ以下の「ＳＮＰ」を含み、「インデックス」領域全体にわたって挿入欠失を含まないものが含まれ、例えば、３レベルインデックスオリゴヌクレオチドでは、インデックス領域は、３つのインデックスを含む。
【図14B】スプリントライゲーション伸長又は二本鎖スプリントライゲーションによって生成された伸長生成物の配列決定リードについて、エラーが欠失、挿入、又は塩基変化（ＳＮＰ）のいずれであるかを含む塩基ごとのエラー率を示すグラフである。
【図15A】標準スプリントライゲーション法（左パネル）及び二本鎖スプリントライゲーション法（右パネル）についての３レベルインデックス付けにおける工程を示す概略図である。
【図15B】標準スプリントライゲーション又は二本鎖スプリントライゲーションを用いた３レベルインデックス付けのための方法における工程において試験された条件を示す概略図である。
【図16A】定量ＰＣＲによって測定された、捕捉オリゴヌクレオチドの伸長生成物、第２レベル生成物、及び第３レベル生成物の濃度を示すグラフである。
【図16B】スプリントライゲーション伸長若しくは二本鎖スプリントライゲーションによって生成された伸長生成物について、完全に正確であるか、又は３つ全てのインデックスが使用可能であるかのいずれかである配列を含む配列決定リードのパーセンテージを示すグラフである。使用可能なインデックスには、インデックスエラー補正履行でデコード補正することができ、３ヌクレオチドハミング距離で設計されたインデックス内に１つ以下の「ＳＮＰ」を含み、「インデックス」領域全体にわたって挿入欠失を含まないものが含まれ、例えば、３レベルインデックスオリゴヌクレオチドでは、インデックス領域は、３つのインデックスを含む。
【図16C】スプリントライゲーション伸長又は二本鎖スプリントライゲーションによって生成された伸長生成物の配列決定リードについて、エラーが欠失、挿入、又は塩基変化（ＳＮＰ）のいずれであるかを含む塩基ごとのエラー率を示すグラフである。
【図17】標準スプリントライゲーションによる、又は短縮されたスプリントを使用するスプリントライゲーションによる捕捉オリゴヌクレオチドの伸長を示す概略図である（上パネル）。下のパネルは、伸長生成物を測定するためのプライマーの位置を示す。
【図18B】レベル１インデックスを有する捕捉オリゴヌクレオチド（Ｌ１オリゴ）、スプリントオリゴヌクレオチド（スプリント）、及びレベル２オリゴヌクレオチド（Ｌ２オリゴ）を含む様々な実験条件を示す表である。
【図18C】様々なスプリントオリゴヌクレオチドを用いたスプリントライゲーション伸長によって生成された伸長生成物についての、対照の全長伸長生成物に対する全長伸長生成物のグラフである。
【図19A】リンカー配列「ＫＳ－３’」及び「ＭＳ－３’」を含む二本鎖スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス法の概略図である。
【図19B】二本鎖スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス法のための例示的なワークフローの概要の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0062】
いくつかの実施形態は、組み合わせインデックス付きビーズを調製するための方法及び組成物に関する。いくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドへの異なるインデックスの逐次付加を含む。いくつかの実施形態では、インデックスは、化学的ライゲーション、ポリメラーゼ伸長、部分的二本鎖アダプターのライゲーション、又は短いスプリントライゲーションによって付加される。
【0063】
各ビーズが単一のオリゴヌクレオチド配列で均一にコーティングされているビーズ連結オリゴヌクレオチドのプールは、合成ロングリード配列決定などの配列決定法の構成要素である。そのようなビーズプールの組み合わせアセンブリは、十分なインデックス多様性を達成するために使用され得るが、しかしながら、いくつかの方法は、インデックスの連続的なレベルを接合するために、スプリントされたライゲーション戦略に依存する。スプリントライゲーションは、ビーズコードに不変塩基を導入し、完全なビーズコードを読み取るのに必要な合成による配列決定（sequencing by synthesis、ＳＢＳ）サイクルの数を増加させるという欠点を有する。本明細書で提供される特定の実施形態は、ビーズコード中の不変塩基の数を低減させ、ビーズコード情報密度を増加させ、より効率的なビーズコード配列決定を可能にする、標準スプリントライゲーションビーズコード合成戦略に対するいくつかの代替法を含む。
【0064】
ビーズ連結オリゴヌクレオチドの組み合わせアセンブリは、各ビーズが単一の固有インデックスオリゴヌクレオチドで均一にコーティングされている多数の固有インデックスを含有するビーズプールの生成を可能にする。表面付着ストレプトアビジンなどのオリゴヌクレオチド捕捉のために誘導体化された磁気ビーズの共通プールから開始して、ビーズをマルチウェルプレートの「Ｍ」個のウェルに等分し、各ウェルは、ビオチンなどのビーズ捕捉部分を用いて合成された単一オリゴヌクレオチド配列を含有する。結合後、ビーズを再びプールし、混合し、マルチウェルプレートの「Ｎ」個のウェルに分割して、第２のレベルのインデックスを付着させる。第２のインデックス反応における各ウェルは、第１のレベルのオリゴヌクレオチドの均一な混合物を含有するので、固有インデックスの総数は、第２のインデックスが付着された後に「Ｍ」×「Ｎ」になる。このプロセスを複数回繰り返すことにより、標準的なマルチウェルプレート、例えば、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、又は３８４ウェルプレートに容易に適合し得る個々のインデックスオリゴヌクレオチドの小さなセットから、数百万の固有インデックスを有するビーズプールが得られ得る。プール及び分割戦略を含む組み合わせインデックス付けの例示的な実施形態を図１に示す。
【0065】
直接捕捉された第１のレベルを超えるインデックスについては、一本鎖インデックスオリゴヌクレオチドをビーズに結合したインデックスに共有付着させる方法が必要である。これは、長いスプリントライゲーションアプローチを用いて行うことができる（図２）。直接捕捉された第１のレベルのオリゴヌクレオチドは、その３’末端に８個のヌクレオチドの捕捉配列（Ｌ１Ａ）を有するように設計され、入ってくるインデックスオリゴヌクレオチドは、その５’末端に第２の８個のヌクレオチドの捕捉配列（Ｌ１Ｂ）、並びに５’末端にリン酸を有する。いくつかの実施形態では、ＬＩＡ及び／又はＬＩＢは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個以上のヌクレオチドの長さを有し得る。次いで、これらの２つの片を、３’末端のＬ１Ａ及び５’末端のＬ１Ｂに相補的である１６個のヌクレオチドのスプリントオリゴヌクレオチドとのライゲーション反応において組み立てられ、結合スプリントは、ビーズに結合した捕捉オリゴヌクレオチド及び溶液中インデックスオリゴヌクレオチドの両方とハイブリダイズし、２つの片の３’末端及び５’末端を互いに直接隣接させる。次いで、反応中のリガーゼ酵素が、インデックスオリゴヌクレオチドのリン酸化された５’末端を捕捉オリゴの３’末端に共有結合させる。表１は、特定の方法において、１２、９６、１９２、又は３８４及び７６８マルチウェルプレートを使用して得ることができる固有ビーズコードの数を列挙する。いくつかのそのような方法は、以下を含む：（ａ）ビーズを第１のマルチウェルプレートのウェルに分配することであって、各ウェルが、異なるインデックスＡを含有する、分配することと、インデックスＡをビーズに付着させることと、ビーズをプールすることと、（ｂ）ビーズを第２のマルチウェルプレートのウェル内に再分配することであって、各ウェルが、異なるインデックスＢを含有する、再分配することと、インデックスＢをビーズに付着させることと、（ｃ）ビーズを第３のマルチウェルプレートのウェル内に再分配することであって、各ウェルが、異なるインデックスＣを含有する、再分配することと、インデックスＣをビーズに付着させること。
【0066】
【表1】
【0067】
スプリントされたライゲーションアプローチは、ビーズコード中のインデックスの各レベルについて可変インデックス領域間に１６個のヌクレオチドの不変スプリント配列を必要とする。ビーズコードは、典型的には単一リードで配列決定されるので、これらの不変領域は、ＳＢＳ中の「暗」サイクルなどの化学のみのサイクルで読み取られなければならない。例えば、不変領域中の各塩基は、正しいフェージングを維持するために追加のＳＢＳサイクルを必要とする。これらは、典型的には、「化学のみ」又は「暗」のＳＢＳサイクルであり、重合化学工程が画像化工程なしで使用される。８個のヌクレオチドの個々のサブインデックスを有する３レベルインデックスの場合、これは、情報インデックス配列の２４個のヌクレオチドを配列決定するだけのために、少なくとも３２の合計暗サイクルが必要であることを意味する。この多数のサイクルは、インデックス配列及び任意の後続のインサート配列決定リードの両方について、リード品質の低下をもたらすことが観察されている。
【0068】
本明細書で提供される特定の実施形態は、不変塩基の数を低減するための長いスプリントライゲーション戦略に加えて、ビーズコード合成戦略を含み、その結果、ビーズコードを読み取るのに必要な化学のみのＳＢＳサイクルを含む。いくつかのそのような実施形態は、アジド－アルキンクリックケミストリーを使用する化学ライゲーションによるビーズコード合成、テンプレートポリメラーゼ伸長によるビーズコード合成、二本鎖断片の酵素的ライゲーションによるビーズコード合成、及び非標準ヌクレオチドを含有する短いスプリントでのスプリントされたライゲーションによるビーズコード合成を含む。
【0069】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、アレイ上でのハイスループット遺伝子型決定に関する。いくつかの実施形態は、アレイ内の微小特徴部（マイクロフィーチャ）の位置をデコードすることに関する。いくつかの実施形態では、微小特徴部は、バーコード及びインデックスを有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態は、バーコード及びインデックスを配列決定して、アレイ内のポリヌクレオチドの位置を識別することを含む。本明細書に開示される方法及び組成物に有用であり得る特定の態様は、その全体が参照により組み込まれる国際公開第２０２０／０８６７４６号に開示されている。
【0070】
ハイブリダイゼーションによるデコードは、捕捉プローブのランダムに分配されたアレイ内の捕捉プローブの位置を識別することを含む。この方法は、典型的には、標識されたハイブリダイゼーションプローブを捕捉プローブの１つ又はそれ以上の部分にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションイベントを撮像し、ハイブリダイゼーションプローブを除去する、数回の連続的なサイクルを伴う。ハイブリダイゼーションによるデコードは、特殊な試薬、特殊な流体デバイス、及び特殊な検出器を必要とする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションによるデコードは、７～８回の連続的なサイクルとともに最大８時間かかり得る。
【0071】
本明細書で提供される実施形態は、プライマー結合部位及びバーコードを含むポリヌクレオチドのランダムに分配されたアレイを含む。いくつかの実施形態では、バーコードは、ハイスループット配列決定システムを使用してアレイをデコードするために、容易に配列決定することができる。いくつかの実施形態は、追加の試薬、ハイブリダイゼーションプローブ、又は特殊なデコーディング機器なしで、アレイをデコードするためにかかる時間を大幅に短縮することができる。
【0072】
いくつかの実施形態は、次世代配列決定（next generation sequencing、ＮＧＳ）技術及びビーズベースのマイクロアレイの使用を含む。いくつかのこのような実施形態は、基質及び試薬に対するわずかな改変とともに一般的なＮＧＳ配列決定プラットフォーム上で実行することができる、高性能、低コスト、かつハイスループットの遺伝子型決定アッセイをもたらす。
【0073】
いくつかの実施形態は、「Ｓ」個のウェルを含有するマルチウェルプレートにＳ個のビーズプールがロードされている遺伝子型決定アッセイを行うことを含み、各ビーズプールは、固有の試料インデックスを有し、各ウェルは、「Ｎ」個の固有のビーズタイプを含有する。ランダムプライマー増幅、その後の酵素的断片化、及びクリーンアップを含む工程で核酸試料を処理するなど、試料からの核酸ライブラリ生成後、各試料ライブラリは、インデックス付きウェルに付加され、捕捉プローブにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションが完了した後、蛍光ヌクレオチド及び適切なポリメラーゼを含むインコーポレーションミックスを添加することにより、対象となるＳＮＰをプローブするための一塩基伸長アッセイが実行される。この取り込みの最後に、プレート内の全てのビーズ捕捉試料がプールされ、フローセルにロードされる。フローセルは、そのままにすることも、パターン化することもでき、表面は、ビーズの固定化を所望の密度で支持するように適切に修正することができる。いくつかの実施形態では、ビーズ固定化時に、ＳＮＰ部位での蛍光インコーポレーション由来のシグナルを読み取るための１回のスキャンサイクルを含むＳＮＰリードアウトが実施される。このサイクルは、器具上でのＳＢＳサイクルを含んでもよい。また、フローセル内の特定のビーズの捕捉プローブ及び位置を識別するために、ビーズプールの複雑さに応じて、１２～２０回のＳＢＳサイクルを含むバーコードリードアウトも実施される。いくつかの実施形態では、この工程は、識別されたＳＮＰを通り越して配列決定する追加のサイクルによって置き換えることができる。また、試料インデックスを読み取るための６～１２回のＳＢＳサイクルを含む試料インデックスリードアウトも実施される。いくつかの実施形態では、フローセル上のアッセイ全体は、約３０回未満のＳＢＳサイクルを含むことができ、４時間未満で実行することができる。
【0074】
定義
本明細書で使用される場合、「核酸」は、当技術分野におけるその使用と一致することを意図し、天然に存在する核酸又はその機能的類似体を含む。特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、又は特定のヌクレオチド配列を複製するためのテンプレートとして使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するバックボーンを有する。アナログ構造は、当技術分野において既知の様々なもののいずれかを含む、代替的バックボーン結合を有することができる。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）に見られる）又はリボース糖（例えば、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）に見られる）を有する。核酸は、当技術分野において既知のこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを含有することができる。核酸は、天然又は非天然塩基を含み得る。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野において既知である。非天然の塩基の例としては、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）及び架橋核酸（bridged nucleic acid、ＢＮＡ）が挙げられる。ＬＮＡ及びＢＮＡ塩基をＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込んで、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度及び特異性を高めることができる。ＬＮＡ及びＢＮＡ塩基、並びにそのような塩基の使用は、当業者に既知であり、日常的である。
本明細書で使用される場合、「核酸」は、当技術分野におけるその使用と一致することを意図し、天然に存在する核酸又はその機能的類似体を含む。特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、又は特定のヌクレオチド配列を複製するためのテンプレートとして使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有するバックボーンを有する。アナログ構造は、当技術分野において既知の様々なもののいずれかを含む、代替的バックボーン結合を有することができる。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）に見られる）又はリボース糖（例えば、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）に見られる）を有する。核酸は、当技術分野において既知のこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを含有することができる。核酸は、天然又は非天然塩基を含み得る。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、又はグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸に含まれ得る有用な非天然塩基は、当技術分野において既知である。非天然の塩基の例としては、ロックド核酸（locked nucleic acid、ＬＮＡ）及び架橋核酸（bridged nucleic acid、ＢＮＡ）が挙げられる。ＬＮＡ及びＢＮＡ塩基をＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込んで、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度及び特異性を高めることができる。ＬＮＡ及びＢＮＡ塩基、並びにそのような塩基の使用は、当業者に既知であり、日常的である。
【0075】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド類似体」という用語は、修飾ヌクレオチド塩基部分、修飾ペントース部分、及び／又は修飾リン酸部分、並びにポリヌクレオチドの場合、修飾ヌクレオチド間結合を有する合成類似体を指す。修飾ヌクレオチド間結合としては、リン酸類似体、アキラル及び非荷電サブユニット間結合を有する類似体、並びにアキラルサブユニット間結合を有する非荷電モルホリノベースのポリマーが挙げられる。一部のヌクレオチド間結合類似体は、モルホリデート、アセタール、及びポリアミド結合複素環を含む。リン酸類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート、ボラノホスフェートが含まれ、そのような対イオンが存在する場合、関連する対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋を含むが、それらに限定されない。修飾されたヌクレオチド塩基部分の例は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）；Ｃ－５プロピニル－Ｃ及びＣ－５プロピニル－Ｕを含むがそれらに限定されないＣ－５－プロピニル類似体；２，６－ジアミノプリン（２－アミノアデニン又は２－アミノ－ｄＡとしても知られる）；ヒポキサンチン、シュードウリジン、２－チオピリミジン、イソシトシン（ｉｓｏＣ）、５－メチルｉｓｏＣ、及びイソグアニン（ｉｓｏＧ）を含むがこれらに限定されない。修飾ペントース部分の例としては、Ｂｚ－Ａ－ＬＮＡ、５－Ｍｅ－Ｂｚ－Ｃ－ＬＮＡ、ｄｍｆ－Ｇ－ＬＮＡ、及びＴ－ＬＮＡを含むロックド核酸（ＬＮＡ）類似体、並びに２’位又は３’位が水素、ヒドロキシ、アルコキシ（例えば、メトキシ、メトキシ－エチル、－Ｏ－メチル、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、及びフェノキシ）、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、又はブロモである２’修飾又は３’修飾が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、２－アミノプリン；５－ブロモデュ、デオキシウリジン、デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、５－ヒドロキシブチン－２’－デオキシウリジン、及び８－アザ－７－デアザグアノシンが挙げられる。
【0076】
本明細書で使用される場合、「ターゲット」は、核酸に関して使用する場合、本明細書に記載の方法又は組成物の文脈における核酸の意味的識別子として意図され、別途明示的に示されるもの以外の核酸の構造又は機能を必ずしも限定するものではない。標的核酸は、本質的に既知又は未知の配列の任意の核酸であってもよい。それは、例えば、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの断片であってもよい。配列決定は、標的分子の全体又は一部の配列の決定をもたらし得る。標的は、核又は無細胞の試料などの一次核酸試料に由来し得る。一実施形態では、標的は、各標的断片の末端にユニバーサル配列を配置することによって増幅に好適なテンプレートに処理することができる。標的はまた、ｃＤＮＡへの逆転写によって一次ＲＮＡ試料から得ることもできる。
【0077】
本明細書で使用される場合、「ユニバーサル」は、ヌクレオチド配列を記述するために使用する場合、２つ以上の核酸分子に共通する配列の領域を指し、分子はまた、互いに異なる配列の領域を有する。分子の集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル捕捉核酸の集団、例えば、ユニバーサル配列の一部に相補的な捕捉オリゴヌクレオチド、例えば、ユニバーサル捕捉配列を使用して、複数の異なる核酸を捕捉することができる。ユニバーサル捕捉配列の非限定的な例としては、Ｐ５及びＰ７プライマーと同一又は相補的な配列が挙げられる。同様に、分子の集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列は、ユニバーサル配列の一部に相補的なユニバーサルプライマーの集団、例えば、ユニバーサルアンカー配列を使用して、複数の異なる核酸を増幅又は複製（例えば、配列決定）することができる。したがって、捕捉オリゴヌクレオチド又はユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含む。ハイブリダイズする２つのユニバーサル配列は、ユニバーサル結合対と称される。例えば、ハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチド及びユニバーサル捕捉配列は、ユニバーサル結合対である。
【0078】
本明細書で使用される場合、「Ｐ５」及び「Ｐ７」は、プライマー配列又はプライマー結合部位を指す場合に使用され得る。「Ｐ５’」（Ｐ５プライム）及び「Ｐ７’」（Ｐ７プライム）という用語は、それぞれＰ５及びＰ７の相補体を指す。本明細書に提示される方法において、任意の好適な増幅プライマーを使用することができ、Ｐ５及びＰ７の使用は、例示的な実施形態のみであることが理解されるであろう。フローセル上でのＰ５及びＰ７などの増幅プライマーの使用は、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０１０２５１号、同第２００６／０６４１９９号、同第２００５／０６５８１４号、同第２０１５／１０６９４１号、同第１９９８／０４４１５１号及び同第２０００／０１８９５７号の開示によって例示されるように、技術分野において既知である。例えば、任意の好適な順方向増幅プライマーは、固定化されているか又は溶液中にあるかに関わらず、相補的配列及び配列の増幅のために本明細書に提示される方法において有用であり得る。同様に、任意の好適な逆増幅プライマーは、固定化されているか又は溶液中にあるかに関わらず、相補的配列及び配列の増幅のために本明細書に提示される方法において有用であり得る。当業者であれば、本明細書に提示される核酸の捕捉及び／又は増幅に好適なプライマー配列の設計及び使用方法を理解するであろう。
【0079】
本明細書で使用される場合、「区画」は、何かを他の物から分離又は単離する面積又は容積を意味することを意図する。例示的な区画としては、バイアル、チューブ、ウェル、液滴、ボーラス、ビーズ、容器、表面特色、又は流体流、磁性、電流などの物理的な力によって分離された面積又は容積が挙げられる。一実施形態では、区画は、９６又は３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェルである。
【0080】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語及びその派生語は、一般に、対象とするターゲット配列にハイブリダイズすることができる任意の核酸を指す。典型的には、プライマーは、基質として機能し、その上に、ヌクレオチドは、ポリメラーゼによって重合され得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、合成された核酸鎖に組み込まれ、別のプライマーがハイブリダイズして、合成された核酸分子に相補的な新たな鎖合成をプライムすることができる部位を提供することができる。プライマーは、ヌクレオチド又はその類似体の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、一本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために本明細書において交換可能に使用され、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、これらの類似体、又はこれらの混合物を含み得る。これらの用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの類似体を含み、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドに適用可能であることを理解されたい。本明細書で使用するこの用語はまた、例えば逆転写酵素の作用によって、ＲＮＡテンプレートから生成される相補的又はコピーＤＮＡであるｃＤＮＡも包含する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、並びに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。
【0081】
本明細書で使用される場合、「アダプター（adaptor）」又は「アダプター（adapter）」及びその派生語、例えば、ユニバーサルアダプターは、一般に、核酸分子にライゲーションされ得るか、又はライゲーション反応においてスプリントを形成することができる任意の線状オリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、アダプター又はアダプターの一部は、標的核酸のリンカー領域などの標的配列の３’末端又は５’末端に実質的に相補的又は相補的である。一般に、アダプターは、ヌクレオチド及び／又は核酸の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの態様では、アダプターは、１つ以上の位置に１つ以上の切断可能な基を含み得る。別の態様では、アダプターは、プライマー、例えばユニバーサルプライマーの少なくとも一部と実質的に同一であるか、又は実質的に相補的である配列を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、下流エラー補正、同定、又は配列決定を支援するために、バーコード又はタグを含み得る。「アダプター（adaptor）」及び「アダプター（adapter）」という用語は、交換可能に使用される。
【0082】
本明細書で使用される場合、「アレイ」は、相対的な位置に従って互いに区別することができる部位の集団を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイ内の部位の位置に従って互いに区別することができる。アレイの個々の部位は、特定の種類の１つ以上の分子を含み得る。例えば、部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含むことができ、又は部位は、同じ配列（及び／又はその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含むことができる。アレイの部位は、同じ基質上に位置する異なる特徴とすることができる。例示的な特徴としては、基質中のウェル、基質中又は基質上のビーズ（又は他の粒子）、基質からの突出部、基質上の隆起部、又は基質内のチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。アレイの部位は、それぞれ異なる分子を有する別個の基質とすることができる。別個の基質に付着した異なる分子は、基質が会合する表面上の基質の位置に従って、又は液体若しくはゲル内の基質の位置に従って特定することができる。別個の基質が表面上に位置する例示的なアレイとしては、ウェル内にビーズを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、アレイは、フローセル上に位置することができる。
【0083】
組み合わせインデックス付け
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着した第１のポリヌクレオチドがインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドなどの第１のポリヌクレオチドは、化学ライゲーションによって、ポリメラーゼ伸長によって、第２のポリヌクレオチド及び一本鎖オーバーハングを含む二本鎖アダプターのライゲーションによって、又はスプリントライゲーションによってなどを含む様々な方法によって、インデックスを含む一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドなどの第２のポリヌクレオチドで伸長される。
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着した第１のポリヌクレオチドがインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドなどの第１のポリヌクレオチドは、化学ライゲーションによって、ポリメラーゼ伸長によって、第２のポリヌクレオチド及び一本鎖オーバーハングを含む二本鎖アダプターのライゲーションによって、又はスプリントライゲーションによってなどを含む様々な方法によって、インデックスを含む一本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドなどの第２のポリヌクレオチドで伸長される。
【0084】
いくつかの実施形態は、分割及びプールインデックス付けを含む。例えば、第１のビーズの集団は、第１の複数の亜集団に分割され、第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドをビーズに付着させることによって、異なる第１のインデックスが各亜集団に付加され、亜集団が組み合わされて、第２のビーズの集団が得られる。第２のビーズの集団は、第２の複数の亜集団に分割され、付着した第１のポリヌクレオチドを、第２のインデックスを含むポリヌクレオチドで伸長することによって、異なる第２のインデックスが各亜集団に付加され、亜集団が組み合わされて、第３のビーズの集団が得られる。第３のビーズ集団は、第３の複数の亜集団に分割され、第２のポリヌクレオチドを、第３のインデックスを含むポリヌクレオチドで伸長することによって、異なる第３のインデックスが各亜集団に付加され、亜集団が組み合わされて、第４のビーズの集団が得られる。集団を亜集団に分割し、各亜集団に異なるインデックスを付加することを繰り返して、更により多様な組み合わせインデックスを生成することができる。
【0085】
複数の組み合わせインデックス付きビーズを調製するためのいくつかの実施形態は、（ａ）第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドを含む一次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、一次インデックス付きビーズの集団が、複数の第１のインデックス付きビーズの亜集団を含み、第１のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第１のインデックスを含む、一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、（ｂ）一次インデックス付きビーズの集団を複数の第２のビーズの亜集団に分割することと、（ｃ）二次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、（ｉ）複数の第２のビーズの亜集団の第１のポリヌクレオチドを、第２のインデックスを含む第２のポリヌクレオチドで伸長して、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、インデックス付きビーズの第２の亜集団が、互いに異なる第２のインデックスを含む、第２のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第２のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、二次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む。
【0086】
いくつかの実施形態はまた、（ｄ）二次インデックス付きビーズの集団を複数の第３のビーズの亜集団に分割することと、（ｅ）三次インデックス付きビーズの集団を得ることであって、（ｉ）複数の第３のビーズの亜集団の第２のポリヌクレオチドを、第３のインデックスを含む第３のポリヌクレオチドで伸長して、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、第３のインデックス付きビーズの亜集団が、互いに異なる第３のインデックスを含む、第３のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第３のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む、三次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む。いくつかの実施形態はまた、（ｄ）及び（ｅ）を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付きビーズの亜集団に付加して、更により多様な組み合わせインデックスを生成することと、を含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドを含む一次インデックス付きビーズの集団を得ることは、（ｉ）第１のポリヌクレオチドを複数の第１のビーズの亜集団に付着させて、第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることであって、第１のポリヌクレオチドが、第１のビーズの亜集団ごとに異なる第１のインデックスを含む、第１のインデックス付きビーズの亜集団を得ることと、（ｉｉ）第１のインデックス付きビーズの亜集団を組み合わせて、一次インデックス付きビーズの集団を得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１の結合パートナー及び第２の結合パートナーを介して、複数の第１のビーズの亜集団のうちの１つのビーズに付着される。いくつかの実施形態では、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーは、ビオチン、ストレプトアビジン、ビオチン誘導体、ストレプトアビジン誘導体、抗体、及び抗体の抗原結合断片からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、共有付着によって、例えば化学反応を介してビーズに付着される。
【0088】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、プライマー結合部位を含む。プライマー結合部位の例としては、Ｐ５配列、Ｐ５’配列、Ｐ７配列、及びＰ７’配列を挙げることができる。Ｐ５プライマー：ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＡ（配列番号０１）、及びＰ７プライマー：ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧＡ ＧＡＴ（配列番号０２）。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ユニバーサル配列を含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、第１のインデックス、第２のインデックス、及び／又は第３のインデックスは、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２個の連続するヌクレオチドを超える、それ未満の、若しくはそれに等しい長さ、又は前述の数のいずれか２つの範囲内の長さを有する。いくつかの実施形態では、インデックス又はインデックスの組み合わせを使用して、付着した核酸などの要素、又はビーズをタグ付けすることができる。本明細書で提供される実施形態により有用な特定の方法及び組成物は、各々その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／００２３１１９号及び同第２０１８／０３５５３４８号に開示されている。
【0090】
いくつかの実施形態では、一次インデックス付きビーズの集団又は二次インデックス付きビーズの集団などのインデックス付きビーズの集団を分割することは、インデックス付きビーズの集団を複数の区画にランダムに分配することを含み得る。いくつかの実施形態では、複数の区画は、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画を含む。いくつかの実施形態では、複数の区画は、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、又は３８４ウェルプレートを含む。いくつかの実施形態では、フローセルは、複数の区画を含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、複数のビーズは、磁気ビーズを含む。
【0092】
いくつかの実施形態はまた、複数の組み合わせインデックス付きビーズをアレイ上に分布させることを含む。いくつかの実施形態では、複数の組み合わせインデックス付きビーズは、アレイ上にランダムに分布している。
【0093】
いくつかの実施形態はまた、組み合わせインデックス付きビーズを配列決定することを含む。例えば、ビーズの組み合わせインデックス又はその相補体を配列決定することができる。いくつかの実施形態では、組み合わせインデックス又はその相補体は、アレイ上で配列決定することができる。いくつかの実施形態では、配列決定は、合成による配列決定（ＳＢＳ）を含み得る。本明細書で提供される方法及び組成物との使用に容易に適合させ得る例示的なＳＢＳ手順、流体システム、及び検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３－５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号に記載されており、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態はまた、ビーズの組み合わせインデックスに基づいて、アレイ上の複数の組み合わせインデックス付きビーズのうちの１つのビーズの位置をデコードすることを含む。
【0094】
いくつかの実施形態では、複数の組み合わせインデックス付きビーズのうちの１つのビーズは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、又は第３のポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態はまた、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態はまた、捕捉プローブを伸長することを含む。
【0095】
化学ライゲーションを含む組み合わせインデックス付け
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、化学ライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。本明細書で提供される実施形態により有用な特定の方法及び組成物は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１２７８１６号に開示されている。
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、化学ライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。本明細書で提供される実施形態により有用な特定の方法及び組成物は、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／０１２７８１６号に開示されている。
【0096】
いくつかの実施形態では、化学ライゲーションによるインデックスの逐次付加は、インデックスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの連続レベルを共有結合させるための銅触媒アジド－アルキン環化付加「クリック」反応（ＣｕＡＡＣ）を含む（図３）。クリックケミストリーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドと適合性があり、環状トリアゾール生成物は、ＤＮＡに存在するホスホジエステル結合と同様の寸法を有する。ＤＮＡ中に存在するホスホジエステル結合と同様の寸法の環状トリアゾール生成物は、トリアゾール結合を、多くのＤＮＡポリメラーゼにとって実行可能なテンプレートにし、トリアゾール含有ＤＮＡ鎖は、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）を含む方法によって増幅することができる。化学ライゲーションの利点としては、異なる一本鎖ポリヌクレオチドの末端が、過剰のインデックスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを使用し、最終的なビーズコード又は組み合わせインデックス内の全ての又はほんの一握りの不変塩基位置を排除することによって、スプリントオリゴヌクレオチド又はスプリントアダプターの非存在下で接合され得る方法が挙げられる。加えて、ＣｕＡＡＣ反応は、代替の溶媒中及び非標準温度で行うことができるので、酵素的ライゲーション工程の不在は、反応条件の柔軟性を増加させる。
【0097】
いくつかの実施形態では、ビーズコード又は組み合わせインデックス合成のための化学ライゲーションは、２段階合成戦略を含む。ビーズコードの第１のレベルに関して、第１のインデックスを含む第１のポリヌクレオチドなどの最初の捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端にＣｕＡＡＣハンドル（アジド又はアルキン）を伴って生成され、このオリゴヌクレオチドは、５’－ビオチン／ストレプトアビジンなどの結合パートナーを介して磁気ビーズに結合される。ビーズコードの第２のレベルについては、３’－アジド／５’アルキン又は３’－アルキン／５’－アジドなどの同族ＣｕＡＡＣハンドルを有する、第２のインデックスを含む第２のポリヌクレオチドなどの過剰なインデックスオリゴヌクレオチドが、銅触媒とともに、ビーズに結合した第１のポリヌクレオチドに付加される。いくつかの実施形態では、第２のインデックスを含むポリヌクレオチドは、５’末端上のクリックハンドルのみを有するであろう。反応が完了したら、ビーズはペレット化され、残りのＣｕＡＡＣ試薬は、洗い流される。これは、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの間などのインデックスレベル間に本質的に「瘢痕のない」接合部をもたらし、レベルを分離する不変塩基はない。
【0098】
いくつかの実施形態では、第３のインデックスを含む第３のポリヌクレオチドを付着させることは、５’末端及び３’末端の両方に相補的クリックハンドルを有するように合成された第２のポリヌクレオチドの使用を含み得るが、しかしながら、これは、長いコンカテマーの形成をもたらし得る。コンカテマーの形成を回避しながら追加のインデックスレベルを付加するために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）などの酵素を使用して、デオキシリボースの３’ＯＨ位にクリックハンドルを含有する単一塩基を、組み立てられた２レベルビーズコードの３’末端に挿入する。ＴｄＴは、ヌクレオチド三リン酸を一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端にほとんど特異性を有さずに付着させるが、クリックハンドルが３’ＯＨをブロックするので、単一塩基のみが各オリゴに付着される。ＴｄＴを洗い流した後、同一の手順を使用して、最初の２つのオリゴヌクレオチドの結合に追加のインデックスレベルが付加される。クリック反応は、１００％の効率を有さない場合があるので、更なるライゲーションをブロックして、「スキップされた」レベルを有する組み合わせインデックスを回避することができる。これは、相補的クリックハンドルを含有する小分子を付加して、任意の未反応の３’基をブロックすることによって達成される。
【0099】
いくつかの実施形態では、化学ライゲーションは、反応に必要なオリゴヌクレオチドの量を低減させるために、スプリントされたライゲーション戦略において使用され得る。化学ライゲーションは、非標準ヌクレオチドの使用に適合する。より高いハイブリダイゼーション特異性を有する特定の非標準ヌクレオチドの使用は、より短いスプリントオリゴヌクレオチドを可能にする。例えば、ペプチド核酸（peptide nucleic acid、ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又は２’－ＯＭｅ塩基などの修飾ヌクレオチドは、長さを付加することなくオリゴヌクレオチドの融解温度を上昇させることができる。
【0100】
図３は、クリックケミストリーライゲーションによって、第２のインデックス（インデックスＢ）を、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に接合するスキームの一実施形態を示す。図３に示されるように、Ｐ５配列及びインデックスＡを含む第１のポリヌクレオチドは、ビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合される。例えば、ビーズは、ビオチンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンに連結された５’末端を含み、又はビーズは、ストレプトアビジンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、プロパルギル部分を有する３’末端を含む。第２のポリヌクレオチドは、インデックスＢ及びアジド部分を有する５’末端を含む。銅触媒クリック反応は、第１及び第２のポリヌクレオチドの接合をもたらす。最初にビーズ連結ポリヌクレオチドをＴｄＴで処理して、プロパルギル部分を含む単一ヌクレオチドを付加することによって、追加のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加される。アジド部分を有する５’末端を含む追加のポリヌクレオチドを使用して、追加のクリック反応を介してビーズ連結ポリヌクレオチドを更に伸長することができる。
【0101】
いくつかの実施形態は、化学ライゲーション反応によって、ビーズ連結された第１のポリヌクレオチドなどの第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’－修飾デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）を含む。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、３’官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、３’官能性部分及び５’官能性部分は、互いに反応して、修飾バックボーン結合を形成することができる。
【0102】
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することにより、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得、本方法は、二次インデックス付きポリヌクレオチドを修飾して、クリックケミストリー反応に関与することができる３’官能性部分を含む末端３’修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチドを得ることを更に含む。いくつかの実施形態では、修飾することは、二次インデックス付きポリヌクレオチドをテンプレート非依存性ポリメラーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリＡポリメラーゼ、又はＣＣＡ付加ＲＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施形態では、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、ＴｄＴである。
【0103】
いくつかの実施形態はまた、化学ライゲーション反応によって、修飾ポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドで伸長することを含み、第３のポリヌクレオチドは、３’官能性部分とのクリックケミストリー反応に関与することができる適合性５’官能性部分を含む末端５’修飾ヌクレオチドを含む。
【0104】
いくつかの実施形態では、３’官能性部分は、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５’官能性部分は、３’官能性部分とは異なり、かつ３’官能性部分と適合性があり、アジド、アルキニル、アルケニル、チオール、及びニトロンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、３’官能性部分及び５’官能性部分は、以下の対：（ｉ）３’－アジド／５’－アルキニル、（ｉｉ）３’－アルキニル／５’－アジド、（ｉｉｉ）３’－チオール／５’－アルキニル、（ｉｖ）３’－チオール／５’－アルケニル、（ｖ）３’－アルキニル／５’－チオール、（ｖｉ）３’－アルケニル／５’－チオール、（ｖｉｉ）３’－アジド／５’－シクロオクチニル、（ｖｉｉｉ）３’－シクロオクチニル／５’－アジド、（ｉｘ）３’－ニトロン／５’－シクロオクチニル、及び（ｘ）３’－シクロオクチニル／５’－ニトロンから選択される。いくつかの実施形態では、３’官能性部分は、３’－アジドであり、５’官能性部分は、５’－アルキニルである。いくつかの実施形態では、直交クリック反応がＬ１／Ｌ２インデックスとＬ２／Ｌ３インデックスとの間で使用される場合、ＴｄＴ工程は、回避され得る。
【0105】
いくつかの実施形態では、クリックケミストリー反応は、トリアゾリルを含む修飾バックボーン結合を形成するための銅触媒アジド－アルキン環化付加を含む。
【0106】
ポリメラーゼ伸長を含む組み合わせインデックス付け
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドがポリメラーゼ伸長によるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドがポリメラーゼ伸長によるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、アダプターは、第１のインデックスを含むビーズに結合した第１のポリヌクレオチドの３’リンカー（Ｌ１Ａ）領域に相補的な３’領域、及び第２のインデックス配列の逆相補体の両方を含有するオリゴヌクレオチドを含む（図４）。アダプターオリゴヌクレオチドは、ビーズに結合した第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰは、第１のポリヌクレオチドを伸長し、その結果、その３’末端にアダプターの相補体を含有する共有結合した、ビーズに結合したオリゴヌクレオチドがもたらされる。アダプターは、第１のポリヌクレオチドに直接ハイブリダイズするので、現在のスプリントライゲーションワークフローでは、８個の塩基対１６個の塩基など、半数の塩基が、同様の結合特異性を達成するのに十分である。重合が完了すると、例えば、アダプターがチミンの代わりにデオキシウラシル残基を含む場合、アダプターは、熱、塩基（ＮａＯＨ）、又はＵＳＥＲ酵素による処理を用いた変性によって除去され得る。第３のインデックスを含む第２のアダプターを、伸長された第１のポリヌクレオチドの３’末端にハイブリダイズし、伸長された第１のポリヌクレオチドを、重合反応及びハイブリダイズされた第２のアダプターで更に伸長することによって、追加のインデックスレベルを付加することができる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼがアダプターの３’末端をプライマーとして使用し、望ましくない生成物を生成することを防止するために、アダプターの３’末端を、例えば、３’２’ジデオキシヌクレオチド、Ｃ３リンカー、又は他の標準的なブロッキング化学によりブロックすることができる。
【0108】
図４は、逐次的ポリメラーゼ伸長反応によって、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。図４に示されるように、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び第１のリンカー（リンク１ａ）を含む第１のポリヌクレオチドは、ビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合される。例えば、ビーズは、ビオチンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンに連結された５’末端を含み、又はビーズは、ストレプトアビジンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域、インデックスＢ’、及びリンカー２ａ’を含む第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズし、第１のポリヌクレオチドをポリメラーゼの存在下で伸長して、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のアダプターは、除去される。リンカー２ａにハイブリダイズすることができる領域、インデックスＣ’、及び捕捉プローブ’（Ｈｙｂ’）を含む第２のアダプターを、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドのリンカー２ａ領域にハイブリダイズし、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドを、ポリメラーゼの存在において更に伸長して、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並び捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。
【0109】
いくつかの実施形態は、ポリメラーゼ伸長によって第１のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、第１のリンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第２のインデックス又は第２のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドを伸長して、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、非伸長性３’末端を含む。いくつかの実施形態では、非伸長性３’末端は、３’２’ジデオキシヌクレオチド、又は３炭素スペーサーアームなどのＣ３リンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、二次インデックス付きポリヌクレオチドから第１のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。
【0110】
いくつかの実施形態では、三次インデックス付きビーズの集団を得ることは、ポリメラーゼ伸長によって第２のポリヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、第２のリンカーの相補体を含み、その結果、二次インデックス付きポリヌクレオチドが、第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第３のインデックス又は第３のインデックスの相補体を含む領域と、を含む、第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第２のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）二次インデックス付きポリヌクレオチドを伸長して、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、第２のアダプターは、非伸長性３’末端を含む。いくつかの実施形態では、非伸長性３’末端は、３’２’ジデオキシヌクレオチド、又はＣ３リンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、三次インデックス付きポリヌクレオチドから第２のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、５個未満の連続ヌクレオチドの長さを有する。
【0111】
二本鎖断片のライゲーションを含む組み合わせインデックス付け
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド及び二本鎖領域を含むアダプターのライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。いくつかの実施形態では、部分的二本鎖アダプターの使用は、単一のリンカー配列を使用して、追加のインデックスをビーズ連結オリゴヌクレオチドにライゲーションすることができ、それによって、いくつかの他の方法と比較して、組み合わせインデックス付きオリゴヌクレオチド中のリンカー配列の長さを低減させることを意味する。例えば、図１５Ａ（左パネル）は、スプリントが、ビーズ連結オリゴヌクレオチド中の「ＫＳ－３’」配列に、及びインデックス２を含有するアダプター配列中の「ＫＳ－５’」配列にそれぞれアニーリングする２つのリンカー配列「ＫＳ－３」及び「ＫＳ－５」を含有する、標準スプリントライゲーションについての例示的な実施形態を示す。対照的に、図１５Ａ（右パネル）に示される二本鎖スプリントライゲーションの例示的な実施形態は、インデックスを含有するアダプター配列をビーズ連結オリゴヌクレオチドにライゲーションするのに十分な単一リンカー配列「ＫＳ－３」を含有する二本鎖スプリントを示す。
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド及び二本鎖領域を含むアダプターのライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含む。いくつかの実施形態では、部分的二本鎖アダプターの使用は、単一のリンカー配列を使用して、追加のインデックスをビーズ連結オリゴヌクレオチドにライゲーションすることができ、それによって、いくつかの他の方法と比較して、組み合わせインデックス付きオリゴヌクレオチド中のリンカー配列の長さを低減させることを意味する。例えば、図１５Ａ（左パネル）は、スプリントが、ビーズ連結オリゴヌクレオチド中の「ＫＳ－３’」配列に、及びインデックス２を含有するアダプター配列中の「ＫＳ－５’」配列にそれぞれアニーリングする２つのリンカー配列「ＫＳ－３」及び「ＫＳ－５」を含有する、標準スプリントライゲーションについての例示的な実施形態を示す。対照的に、図１５Ａ（右パネル）に示される二本鎖スプリントライゲーションの例示的な実施形態は、インデックスを含有するアダプター配列をビーズ連結オリゴヌクレオチドにライゲーションするのに十分な単一リンカー配列「ＫＳ－３」を含有する二本鎖スプリントを示す。
【0112】
いくつかの実施形態は、二本鎖の両方の鎖の３’末端から伸長する相補的オーバーハングを有するインデックスオリゴヌクレオチドを含む二本鎖アダプターの使用を含む（例えば、図５、図１５Ａ、及び図１９Ａを参照されたい）。いくつかのそのような実施形態は、相補的塩基の単一領域のみがアセンブリに十分であるため、ビーズコード中の不変塩基の数を最大５０％低減させる。第１のインデックスを含むビーズに結合した第１のポリヌクレオチドから始めて、第１のポリヌクレオチドの３’末端に相補的な３’オーバーハングを有する二本鎖断片を含むアダプターをビーズに付加し、ハイブリダイズする。次いで、インデックス配列、及び次のインデックスレベルのための３’ハイブリダイゼーション配列を含有する「上部」断片を、酵素的又は化学ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドに連結する。ライゲーションが完了したら、アダプターの二本鎖インデックス部分の下部の鎖は、変性によって除去することができ、同じ手順によって追加のインデックスレベルが付加され得る。いくつかの実施形態では、ライゲーション中に追加の一本鎖オリゴヌクレオチドが存在してもよい（例えば、図１２、右パネル「インデックス１’オリゴ」を参照されたい）。追加のオリゴヌクレオチドは、ビーズに結合したポリヌクレオチドのインデックス配列にハイブリダイズすることができる。いくつかのそのような実施形態では、追加のオリゴヌクレオチドは、ライゲーション複合体を更に安定化させ、ライゲーションを促進することができる。
【0113】
図５は、二本鎖領域及び一本鎖オーバーハングを含むアダプターを使用して、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。図５に示されるように、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び第１のリンカー（リンク１ａ）を含む第１のポリヌクレオチドは、ビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合される。例えば、ビーズは、ビオチンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンに連結された５’末端を含み、又はビーズは、ストレプトアビジンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域を含む一本鎖５’オーバーハング、インデックスＢを含む二本鎖領域、及び第２のリンカー（リンク２ａ）を含む領域を含む第１のアダプターは、第１のリンカーにハイブリダイズされる。第１のアダプターは、第１のポリヌクレオチド及びアダプターのリンカー１ａ及びインデックスＢ領域を介して、それぞれリガーゼによるライゲーションによって、又は化学ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドに共有接合されて、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のポリヌクレオチドに共有接合されていない第１のアダプターの鎖は、除去される。第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域を含む一本鎖５’オーバーハング、インデックスＣを含む二本鎖領域、及び捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む第２のアダプターは、第２のリンカーにハイブリダイズされる。第２のアダプターは、第１のポリヌクレオチド及びアダプターのリンカー１ａ及びインデックスＢ領域を介して、それぞれリガーゼによるライゲーションによって、又は化学ライゲーションによって伸長された第１のポリヌクレオチドに共有接合されて、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドに共有接合していない第２のアダプターの鎖は、除去される。
【0114】
図１９Ａは、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、第２のポリヌクレオチド及び二本鎖領域を含むアダプターのライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けの追加の例示的な実施形態を示す。図１９Ａに示されるように、Ｐ５配列、インデックス１、及びＫＳ－３’配列を含むオリゴヌクレオチドは、ビオチン（biotin、Ｂ）及びストレプトアビジン（streptavidin、ＳＡ）を介してビーズに連結される。一方の鎖がＫＳ－３配列、インデックス２’、及びＭＳ－３配列を含み、他方の鎖がインデックス２配列及びＭＳ－３’配列を含む部分的二本鎖アダプターを、ＫＳ－３及びＫＳ－３’配列を介してビーズ連結オリゴヌクレオチドにアニーリングする。アダプター配列をビーズ連結配列にライゲーションして、アダプターの鎖にハイブリダイズされた、伸長されたビーズ連結オリゴヌクレオチドを形成する。アダプターの鎖は、変性によって除去される。２回目のインデックス付けが実施される。
【0115】
いくつかの実施形態は、ライゲーションによって、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドで伸長することを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第２のポリヌクレオチドと、第１のポリヌクレオチドの第１のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態はまた、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドで伸長することを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第３のポリヌクレオチドと、第２のポリヌクレオチドの第２のリンカーにハイブリダイズすることができる３’一本鎖オーバーハングと、を含む、二本鎖の第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第２のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第２のポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、リガーゼの使用を含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、本明細書に開示されるクリックケミストリー反応などの化学ライゲーション反応を含む。
【0116】
スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス付け
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、スプリントライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含み、スプリントは、増加したハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、相補的配列とのより強い結合を有するヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド配列に対するＴｍの増加をもたらすヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、１つ以上の修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、１つ以上のイノシンヌクレオチドを含む。
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ビーズに付着したポリヌクレオチドが、スプリントライゲーションによるインデックスの逐次付加によって伸長される、組み合わせインデックス付けによるインデックス付きビーズの調製を含み、スプリントは、増加したハイブリダイゼーション特異性を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、相補的配列とのより強い結合を有するヌクレオチド、例えば、ヌクレオチド配列に対するＴｍの増加をもたらすヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、１つ以上の修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、スプリントは、１つ以上のイノシンヌクレオチドを含む。
【0117】
いくつかの実施形態は、スプリントとインデックス／捕捉オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの強度を増加させる化学修飾塩基を含むスプリント中の低減された数の塩基と、インデックスの連続的なレベルを連結するためのスプリントされたライゲーションの使用を含む（図６）。それらの現在の形態において、スプリント配列は、室温（約２５℃）に近い変性中点（Ｔｍ）を有する８個のヌクレオチド長である。これは、スプリントが室温ライゲーション反応中に捕捉オリゴヌクレオチド及びインデックスオリゴヌクレオチドの両方に結合することができることを確実にする。
【0118】
図６は、短いリンカー－スプリントを用いた逐次的なスプリントされたライゲーション反応によって、基質に付着した第１のインデックス（インデックスＡ）に、第２のインデックス（インデックスＢ）及び第３のインデックス（インデックスＣ）を付加するスキームの実施形態を示す。図６に示されるように、Ｐ５配列、インデックスＡ及び第１のリンカー（リンク１ａ）を含む第１のポリヌクレオチドは、ビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合される。例えば、ビーズは、ビオチンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ストレプトアビジンに連結された５’末端を含み、又はビーズは、ストレプトアビジンでコーティングされており、第１のポリヌクレオチドは、ビオチンに連結された５’末端を含む。第２のポリヌクレオチドは、第２のリンカー（リンク１ｂ）、インデックスＢ、及び第３のリンカー（リンク２ａ）を含む。第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域及び第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域を含むスプリントなどの一本鎖の第１のアダプターは、第１のポリヌクレオチドの第１のリンカー及び第２のポリヌクレオチドの第２のリンカーの両方にハイブリダイズされる。第１のポリヌクレオチドは、リガーゼの使用によるなど、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドに共有接合されて、インデックスＡ及びＢ並びに第３のリンカー（リンク２ａ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のアダプターは、除去される。第３のポリヌクレオチドは、第４のリンカー（リンク２ｂ）、インデックスＣ、及び捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む。第３のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第４のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含むスプリントなどの一本鎖の第２のアダプターは、伸長されたポリヌクレオチドの第３のリンカー及び第３のポリヌクレオチドの第４のリンカーの両方にハイブリダイズされる。第３のポリヌクレオチドは、リガーゼの使用によるなど、ライゲーションによって、伸長されたポリヌクレオチドに共有接合されて、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第２のアダプターは、除去される。
【0119】
いくつかの実施形態は、ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドを伸長することを含み、第１のポリヌクレオチドは、第１のリンカーを含み、第２のポリヌクレオチドは、第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、第１のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドを、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域にハイブリダイズすることと、（ｉｖ）第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドにライゲーションして、二次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、第１のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている。いくつかの実施形態では、第１のリンカー及び／又は第２のリンカーは、同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態はまた、二次インデックス付きポリヌクレオチドから第１のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、三次インデックス付きビーズの集団を得ることは、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドを伸長することを含み、第２のオリゴヌクレオチドは、第３のリンカーを含み、その結果、二次インデックス付きポリヌクレオチドが、第３のリンカーを含み、第３のポリヌクレオチドは、第４のリンカーを含む。いくつかの実施形態はまた、（ｉ）第３のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第４のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む第２のアダプターを得ることと、（ｉｉ）第２のアダプターを第３のリンカーにハイブリダイズすることと、（ｉｉｉ）第４のインデックスにハイブリダイズすることができる領域を介して、第３のポリヌクレオチドを第２のアダプターにハイブリダイズすることと、（ｉｖ）二次インデックス付きポリヌクレオチドを第３のポリヌクレオチドにライゲーションして、三次インデックス付きポリヌクレオチドを得ることと、を含む。いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、９、８、７、６、５、４、３、又は２個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、５個未満の連続するヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、第２のアダプターと同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＴｍを有するように修飾されている。いくつかの実施形態では、第３のリンカー及び／又は第４のリンカーは、同じ長さを有するオリゴヌクレオチドと比較して増加したＧ／Ｃ含量を含むか、又は修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態はまた、三次インデックス付きポリヌクレオチドから第２のアダプターを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去することは、熱若しくは塩基によって第１のアダプターを変性させること、又は酵素分解によって第１のアダプターを分解することを含む。
【0121】
標的核酸の配列決定及び分析
いくつかの実施形態は、標的核酸の配列決定及び／又は分析を含む。本明細書で提供される実施形態により有用な特定の方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０２１／００８７６１３号に開示されており、その全体は、参照により組み込まれる。いくつかの実施形態は、本明細書で提供される方法に従って、アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードすることと、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることと、捕捉プローブを伸長することと、アレイ上の位置で標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸をポリヌクレオチドにハイブリダイズする前にデコードすることができる。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出した後にデコードすることができる。いくつかのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、共通の要素を介して捕捉プローブと関連付けられることができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブはそれぞれ、ビーズなどの同じ微小特徴部に結合されることができる。より多くのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含むことができる。
いくつかの実施形態は、標的核酸の配列決定及び／又は分析を含む。本明細書で提供される実施形態により有用な特定の方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０２１／００８７６１３号に開示されており、その全体は、参照により組み込まれる。いくつかの実施形態は、本明細書で提供される方法に従って、アレイ内のポリヌクレオチドの位置をデコードすることと、標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズすることと、捕捉プローブを伸長することと、アレイ上の位置で標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸をポリヌクレオチドにハイブリダイズする前にデコードすることができる。いくつかの実施形態では、アレイ上のポリヌクレオチドの位置は、標的核酸にハイブリダイズされた捕捉プローブの伸長を検出した後にデコードすることができる。いくつかのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、共通の要素を介して捕捉プローブと関連付けられることができる。例えば、ポリヌクレオチド及び捕捉プローブはそれぞれ、ビーズなどの同じ微小特徴部に結合されることができる。より多くのそのような実施形態では、各ポリヌクレオチドは、捕捉プローブを含むことができる。
【0122】
いくつかの実施形態は、捕捉プローブの一塩基伸長（single base extension、ＳＢＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＢＥは、標的核酸中の対立遺伝子、変異、又は他の特徴部の検出に使用することができる。簡潔に述べると、ＳＢＥは、検出位置に近位の又は隣接した位置で標的ゲノム断片にハイブリダイズする捕捉プローブを利用し、検出位置は特定の遺伝子座を示す。捕捉プローブの３’末端を、検出標識で標識されたヌクレオチド類似体で伸長するために、ポリメラーゼを使用することができる。酵素の忠実度に基づいて、ヌクレオチドは、標的核酸中の検出位置に相補的である場合にのみ、捕捉プローブに取り込まれる。所望により、ヌクレオチドは、ブロッキング基（可逆的なブロッキング基を含む）を使用して、更なる伸長が起こることができないように誘導体化することができ、したがって、単一のヌクレオチドのみが付加される。伸長された捕捉プローブ中の標識されたヌクレオチドの存在は、例えば、アレイ内の特定の位置で、検出することができ、付加されたヌクレオチドは、遺伝子座又は対立遺伝子の同一性を決定するために識別することができる。ＳＢＥは、各々その全体が参照により組み込まれる米国特許第９，４４１，２６７号及び同第９，０４５，７９６号に記載される条件などの既知の条件下で行うことができる。
【0123】
いくつかの実施形態は、対立遺伝子特異的プライマー伸長（allele specific primer extension、ＡＳＰＥ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＥは、３’末端でのヌクレオチド組成が異なる捕捉プローブの伸長を含み得る。ＡＳＰＥ法は、切断可能なリンカーを含有するヌクレオシド又はヌクレオチドを使用して実施することができ、その結果、標識は、プローブが検出された後に除去することができる。これは、プローブの更なる使用、又は検出されたシグナルが、たった今除去された標識によるものであったことの検証を可能にする。簡潔に述べると、ＡＳＰＥは、検出位置に相補的である３’配列部分と、検出位置に隣接する配列に相補的である５’部分と、を有する捕捉プローブに標的核酸をハイブリダイズすることによって実施することができる。例えば、ポリメラーゼによる標識されたヌクレオチドの付加による、捕捉プローブの３’部分のテンプレート指向修飾は、標識された伸長生成物を産生するが、これは、テンプレートが標的配列を含む場合のみである。次いで、このような標識されたプライマー伸長生成物の存在は、例えば、特定の対立遺伝子の存在を示すために、アレイ内でのその位置に基づいて検出することができる。いくつかの実施形態では、ＡＳＰＥは、標的核酸中の同じ検出位置に隣接してアニーリングするように同様の５’末端を有するが、検出位置を補完する３’末端を有する捕捉プローブのみがポリメラーゼによって修飾されるように、異なる３’末端を有する、複数の捕捉プローブを用いて実施することができる。特定の検出位置に相補的である３’末端塩基を有する捕捉プローブは、位置に対する完全一致（perfect match、ＰＭ）プローブと称されるが、一方で、３’末端不一致塩基を有し、ＡＳＰＥ反応で伸長されることができない捕捉プローブは、位置に対する不一致（mismatch、ＭＭ）プローブである。ＰＭプローブ中の標識されたヌクレオチドの存在は、検出することができ、捕捉プローブの３’配列は、検出位置において特定の対立遺伝子を識別するために決定することができる。
【0124】
キット及びシステム
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、キット及びシステムを含む。いくつかのそのような実施形態は、ビーズ、マルチウェルプレート、リガーゼ及びポリメラーゼなどの酵素、ポリヌクレオチド、ビオチン及びストレプトアビジン又はそれらの誘導体などの結合対、並びにクリックケミストリー試薬を含む、本明細書で提供される特定の方法を実施するための試薬を含み得る。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、キット及びシステムを含む。いくつかのそのような実施形態は、ビーズ、マルチウェルプレート、リガーゼ及びポリメラーゼなどの酵素、ポリヌクレオチド、ビオチン及びストレプトアビジン又はそれらの誘導体などの結合対、並びにクリックケミストリー試薬を含む、本明細書で提供される特定の方法を実施するための試薬を含み得る。
【実施例】
【0125】
実施例１－クリックケミストリーライゲーションによるビーズコード合成
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及びプロパルギル部分を有する３’末端を含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及びプロパルギル部分を有する３’末端を含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0126】
第２のポリヌクレオチドを第２の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第２のポリヌクレオチドは、インデックスＢ、及びアジド部分を有する５’末端を含む。インデックスＢは、ウェルごとに異なる。銅触媒クリック反応を各ウェルで実施し、第１及び第２のポリヌクレオチドの接合をもたらす。ビーズ連結ポリヌクレオチドをＴｄＴで処理して、プロパルギル部分を含む単一ヌクレオチドを付加する。ビーズをプールし、第３の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0127】
追加のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドの３’末端に付加する。アジド部分を有する５’末端及びインデックスＣを含む第３のポリヌクレオチドを使用して、追加のクリック反応を介してビーズ連結ポリヌクレオチドを更に伸長することができる。インデックスＣは、ウェルごとに異なる。
【0128】
実施例２－ポリメラーゼ伸長を含む組み合わせインデックス付け
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び８個のヌクレオチドの第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び８個のヌクレオチドの第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0129】
第１のアダプターを第２の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第１のアダプターは、第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域、インデックスＢ’配列、及びリンカー２ａ’を含む。インデックスＢ’配列は、ウェルごとに異なる。第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズし、第１のポリヌクレオチドをポリメラーゼの存在下で伸長して、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のアダプターをビーズから除去する。ビーズをプールし、第３の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0130】
第２のアダプターを第３の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第２のアダプターは、リンカー２ａにハイブリダイズすることができる領域、インデックスＣ’、及び捕捉プローブ’（Ｈｙｂ’）を含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ユニバーサルトランスポソームがビーズ連結オリゴの３’末端に付着している特定の用途に有用であり、インデックス付けに無関係であり得る（すなわち、これは用途に応じて任意の配列であり得る）。インデックスＣ’配列は、ウェルごとに異なる。第２のアダプターを、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドのリンカー２ａ領域にハイブリダイズし、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドをポリメラーゼの存在下で更に伸長して、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第２のアダプターをビーズから除去する。
【0131】
実施例３－二本鎖断片のライゲーションを含む組み合わせインデックス付け
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び８個のヌクレオチドの第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び８個のヌクレオチドの第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0132】
第１のアダプターを第２の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第１のアダプターは、第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域を含む一本鎖５’オーバーハングと、インデックスＢを含む二本鎖領域と、第２のリンカー（リンク２ａ）を含む領域と、を含む。インデックスＢは、ウェルごとに異なる。第１のアダプターを第１のリンカーにハイブリダイズする。第１のアダプターを、第１のポリヌクレオチド及びアダプターのリンカー１ａ及びインデックスＢ領域を介して、それぞれリガーゼによるライゲーションによって、又は化学ライゲーションによって第１のポリヌクレオチドに共有接合させて、インデックスＡ及びＢを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のポリヌクレオチドに共有接合されていない第１のアダプターの鎖を除去する。ビーズをプールし、第３の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0133】
第２のアダプターを第３の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第２のアダプターは、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域を含む一本鎖５’オーバーハングと、インデックスＣを含む二本鎖領域と、捕捉プローブ（Ｈｙｂ）と、含む。第２のアダプターを第２のリンカーにハイブリダイズする。第２のアダプターを、第１のポリヌクレオチド及びアダプターのリンカー１ａ及びインデックスＢ領域を介して、それぞれリガーゼによるライゲーションによって、又は化学ライゲーションによって伸長された第１のポリヌクレオチドに共有接合させて、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む伸長されたポリヌクレオチドに共有接合していない第２のアダプターの鎖を、ビーズから除去する。
【0134】
実施例４－スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス付け
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
複数のビーズをストレプトアビジンでコーティングし、第１の９６ウェルプレートのウェルに分配する。異なる第１のポリヌクレオチドを各ウェルに分配する。各第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドがビオチン／ストレプトアビジン結合対を介してビーズに接合されるように、ビオチンに連結された５’末端を含む。第１のポリヌクレオチドは、Ｐ５配列、インデックスＡ、及び第１のリンカーを含む。各ウェル中の第１のポリヌクレオチドは、異なるウェル中の第１のポリヌクレオチドとは異なるインデックスＡを有する。ビーズをプールし、第２の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0135】
第２のポリヌクレオチドを第２の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第２のポリヌクレオチドは、第２のリンカー（リンク１ｂ）、インデックスＢ、及び第３のリンカー（リンク２ａ）を含む。インデックスＢは、ウェルごとに異なる。第１のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第２のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、スプリントなどの一本鎖の第１のアダプターを各ウェルに添加する。第１のアダプターを、第１のポリヌクレオチドの第１のリンカー及び第２のポリヌクレオチドの第２のリンカーの両方にハイブリダイズする。第１のポリヌクレオチドを、リガーゼの使用によるなど、ライゲーションによって第２のポリヌクレオチドに共有接合させて、インデックスＡ及びＢ並びに第３のリンカー（リンク２ａ）を含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第１のアダプターを除去する。ビーズをプールし、第３の９６ウェルプレートのウェルに分配する。
【0136】
第３のポリヌクレオチドを第３の９６ウェルプレートの各ウェルに添加する。第３のポリヌクレオチドは、第４のリンカー（リンク２ｂ）、インデックスＣ、及び捕捉プローブ（Ｈｙｂ）を含む。インデックスＢは、ウェルごとに異なる。第３のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、第４のリンカーにハイブリダイズすることができる領域と、を含む、スプリントなどの一本鎖の第２のアダプターを各ウェルに添加する。第２のアダプターは、伸長されたポリヌクレオチドの第３のリンカー及び第３のポリヌクレオチドの第４のリンカーの両方にハイブリダイズされる。第３のポリヌクレオチドは、リガーゼの使用によるなど、ライゲーションによって、伸長されたポリヌクレオチドに共有接合させて、インデックスＡ、Ｂ、及びＣ、並びに捕捉プローブを含む伸長されたポリヌクレオチドを得る。第２のアダプターをビーズから除去する。
【0137】
実施例５－ポリメラーゼ伸長を含む組み合わせインデックス付け
ポリメラーゼ伸長を含む組み合わせインデックス付け（例えば、図４を参照されたい）を、スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス付け（例えば、図２を参照されたい）と比較した。捕捉オリゴヌクレオチド（Ｐ５－インデックスＡ－リンク１ａ）及び伸長テンプレート（リンク１ａ’－インデックスＢ’－Ｈｙｂ’）を有するビーズを使用して、ポリメラーゼ伸長による２レベルインデックス付けプロトコルを実施した。ポリメラーゼ伸長を、異なる量のテンプレート、並びにエキソヌクレアーゼ活性を有するＴ４ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有さないＴ４ポリメラーゼを用いて行った。捕捉プローブの数及び全長生成物の数を、図７Ａに示される位置のプライマーを用いる定量ＰＣＲ（quantitative PCR、ｑＰＣＲ）を使用して測定した。図７Ｂに示されるように、（１）Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ＋）は、捕捉プローブ及び伸長テンプレートを分解し、（２）Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ－）は、捕捉オリゴヌクレオチドの分解の低減を示し、（３）捕捉オリゴに対して５０×過剰の伸長テンプレート（３３０ｆｍｏｌ／ｕｇ）は、Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ－）を用いた全長伸長に十分であった。
ポリメラーゼ伸長を含む組み合わせインデックス付け（例えば、図４を参照されたい）を、スプリントライゲーションを含む組み合わせインデックス付け（例えば、図２を参照されたい）と比較した。捕捉オリゴヌクレオチド（Ｐ５－インデックスＡ－リンク１ａ）及び伸長テンプレート（リンク１ａ’－インデックスＢ’－Ｈｙｂ’）を有するビーズを使用して、ポリメラーゼ伸長による２レベルインデックス付けプロトコルを実施した。ポリメラーゼ伸長を、異なる量のテンプレート、並びにエキソヌクレアーゼ活性を有するＴ４ポリメラーゼ及びエキソヌクレアーゼ活性を有さないＴ４ポリメラーゼを用いて行った。捕捉プローブの数及び全長生成物の数を、図７Ａに示される位置のプライマーを用いる定量ＰＣＲ（quantitative PCR、ｑＰＣＲ）を使用して測定した。図７Ｂに示されるように、（１）Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ＋）は、捕捉プローブ及び伸長テンプレートを分解し、（２）Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ－）は、捕捉オリゴヌクレオチドの分解の低減を示し、（３）捕捉オリゴに対して５０×過剰の伸長テンプレート（３３０ｆｍｏｌ／ｕｇ）は、Ｔ４ポリメラーゼ（エキソ－）を用いた全長伸長に十分であった。
【0138】
図８Ａ及び図８Ｂは、３レベルインデックス付けプロトコルにおいて試験された様々な条件を要約する。容量は、２連で２５μｌ／条件であった。ポリメラーゼ伸長を２０℃（回転なし）で１５分間、ＮａＯＨ伸長オリゴ変性を用いて実施した。スプリントライゲーションを一晩及び４時間（回転なし）、６０℃のスプリント変性で行った。読み出しは、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ、及び直接ビーズコード配列決定を含んだ。ｑＰＣＲについて、化学合成された全長対照オリゴ（対応する３レベルＰＥ又はＳＬオリゴと同一の配列）を使用して、定量化のための標準曲線を作成した。スプリントライゲーション（ＳＬ）の第２のレベル及び第３のレベルのアンプリコンの濃度を、サイズ差について調整した。
【0139】
図９は、ｑＰＣＲ結果を要約したものであり、ＰＥ（８）がＳＬ（１２）よりも少ない全長オリゴを与えることを示す。合成の効率は、ＳＬに対してＰＥでより低く、例えば、ＰＥでは２０％のオリゴが全長であり、ＳＬでは４０％のオリゴが全長であり、これは、１回目のライゲーションよりもはるかに効率が低い２回目のライゲーション（１２）に、及び／又は回転を伴わない２０℃のインキュベーションに起因した可能性がある。ＰＥを受けた試料は、全長（full length、ＦＬ）ＰＥ（１）及びＳＬ（１０～１２）と比較して、より低い捕捉オリゴ（capture oligo、ＣＯ）分子／ビーズ（３～８）を示した。各伸長は、ＣＯ分子／ビーズを低減させた（３～５対６～８）。いくらかの損失は、ＮａＯＨ洗浄によるビーズからのＢｉｏ－オリゴのストリッピングによるものであった。（６）対（７及び８）、及び（３）対（５）におけるように、いくらかの損失は、Ｔ４ポリメラーゼがオリゴを噛み戻すことに起因した可能性があるが、これは（３）対（４）においては観察されなかった。
【0140】
変性工程における０．２Ｎ ＮａＯＨの効果を試験した。５’ビオチン又は５’ｄｄビオチンのいずれかを介してビーズに結合した６．６ｆｍｏｌの第１のレベルのオリゴ（Ｂ１インデックス）を有するビーズを、５つの異なる変性処理及び対照において伸長／連結なしで使用した：なし（－対照）；変性なし、洗浄工程のみ（１つのレベル当たり２回の洗浄、合計４回）；２×６０℃での熱変性＋洗浄；２×８０℃での熱変性＋洗浄；１×０．２Ｎ ＮａＯＨ変性＋洗浄；及び２×０．２Ｎ ＮａＯＨ変性＋洗浄。残りのオリゴを、第１のレベルのプライマーを用いてｑＰＣＲによって測定した。結果を図１０に要約するが、これは、０．２Ｎ ＮａＯＨ変性がビオチン特異的ＣＯ損失を引き起こしたことを示す。
【0141】
直接ビーズコード配列決定分析を、３レベルインデックス付けについて実施した。簡単に述べると、このアッセイは、Ｈｙｂ領域を標的とするＰ５フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、ＰＣＲによってビーズから合成ビーズコードオリゴを増幅することを含む。リバースプライマーは、試料インデックス、ＭＥ＿Ｖ２＿Ｂ１５配列決定プライマーのための結合領域、及びクラスタリングを可能にするＰ７’配列を導入する。図１１Ａは、分析のためのリード方向を概説する。分析は、配列中の塩基変化エラーを示す、欠失及び推定「ＳＮＰ」の同定を含むエラーコールを用いた、予想される配列に対する各リードのトリミング及びペアワイズアライメントを含む。完全に正確なインデックスは、例えば、３レベルインデックス、インデックス１、インデックス２、及びインデックス３において、インデックス領域にわたってエラー（ＳＮＰ、挿入欠失）を含まなかった。全ての使用可能なインデックスは、インデックスエラー補正履行により正しくデコードされ得るそれらのインデックスを含んでいた。図１１Ｂ及び図１１Ｃは、完全に正確な配列のレベル、使用可能なインデックス、及び塩基ごとのエラー率を示す。スプリントライゲーションは、ポリメラーゼ伸長よりも効率的であったが、両方とも同様のレベルのエラーを有した。
【0142】
前述の研究から、３レベルポリメラーゼ伸長は、スプリントライゲーションよりも少ない全長分子を生成した。０．２Ｎ ＮａＯＨ変性及びＴ４ポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性の付加は、総捕捉オリゴの低減に寄与した可能性が高い。ポリメラーゼ伸長は、この実験においてスプリントライゲーションよりも効率が低いようであった。０．２Ｎ ＮａＯＨ変性は、ビーズからのビオチン化オリゴの損失をもたらしたが、これは、単一の５’ビオチンを５’二重デスチオビオチンで置き換えることによって軽減することができる。合成されたポリメラーゼ伸長オリゴは、スプリントライゲーション法と比較して同様のレベルのエラーを有した。
【0143】
実施例６－二本鎖スプリントライゲーションによる２レベルインデックス付け
二本鎖スプリントライゲーションを含む２レベルインデックス付けを、スプリントライゲーション（標準）を含む２レベルインデックス付けと比較した。スプリントライゲーション及び二本鎖スプリントライゲーションによる標準的な組み合わせインデックス付けの概要を図１２Ａに示す。標準スプリントライゲーションと比較して、二本鎖法では、スプリントの５’半分が第２のレベルのインデックスに相補的であり得、インデックス間の共通配列長を半分に低減させる。試験したプロトコル及び条件の概要を図１２Ｂに示す。
二本鎖スプリントライゲーションを含む２レベルインデックス付けを、スプリントライゲーション（標準）を含む２レベルインデックス付けと比較した。スプリントライゲーション及び二本鎖スプリントライゲーションによる標準的な組み合わせインデックス付けの概要を図１２Ａに示す。標準スプリントライゲーションと比較して、二本鎖法では、スプリントの５’半分が第２のレベルのインデックスに相補的であり得、インデックス間の共通配列長を半分に低減させる。試験したプロトコル及び条件の概要を図１２Ｂに示す。
【0144】
ｑＰＣＲアッセイを実施し、全長スプリントライゲーション及び二本鎖ライゲーションオリゴを使用して、標準曲線を作成した。スプリントライゲーション（標準）を含む組み合わせインデックス付け、及び二本鎖スプリントライゲーション（ｄｓインデックスライゲーション）を含む組み合わせインデックス付けについて、プライマー位置を図１２Ｃに示し、生成物は、Ｆ２及びＲ２又はＦ３及びＲ２を含むプライマーの組み合わせを使用して決定した。濃度は、各試料について適切な標準曲線を使用して決定した。図１３Ａは、ｑＰＣＲの結果を示し、図１３Ｂ及び図１３Ｃは、正規化ｑＰＣＲの結果を示し、合成されたｄｓインデックスライゲーションオリゴがスプリントライゲーションオリゴと同様であった。ＳＬ全長対照オリゴとＤＳ全長対照オリゴとの間の差次的増幅について正規化した後、ＤＳライゲーション及びスプリントライゲーションオリゴは、同様の性能を示した。
【0145】
二本鎖スプリントライゲーションを、漸増量のｄｓインデックスオリゴを用いて実施し、生成物をｑＰＣＲで測定した。図１３Ｄに示されるように、生成物の量の実質的な増加はなかった。二本鎖スプリントライゲーションをインデックス１に相補的なオリゴの存在下で実施し、生成物をｑＰＣＲで測定した。図１３Ｅに示されるように、二本鎖スプリントライゲーションをインデックス１に相補的なオリゴの存在下で実施した場合、生成物の量の実質的な増加はなかった。３’ｄｄＣを有するオリゴを用いて二本鎖スプリントライゲーションを実施し、生成物をｑＰＣＲで測定した。図１３Ｆに示されるように、３’ｄｄＣを有するオリゴを用いて二本鎖スプリントライゲーションを実施した場合、生成物の量は実質的に増加しなかった。室温又は７５℃のいずれかでのライゲーション前インキュベーションを含む二本鎖スプリントライゲーションを実施し、生成物をｑＰＣＲで測定した。図１３Ｇに示されるように、室温又は７５℃のいずれかでのライゲーション前インキュベーションを用いて二本鎖スプリントライゲーションを実施した場合、生成物の量の実質的な増加はなかった。
【0146】
【0147】
前述の２レベル実験から、二本鎖インデックスライゲーションは、ｑＰＣＲによって測定されるスプリントライゲーションと同様の結果を与えた。３３ｆｍｏｌ／μｇビーズを超える二本鎖インデックス量については、単一ライゲーションによる全長生成物の実質的な増加、又はビーズコード内のエラーの増加はなかった。以下の操作は、ほとんど効果がなかった：（１）インデックス１に相補的なオリゴの付加、（２）３’ｄｄＣ修飾の除去、又は（３）７５℃でのライゲーション前インキュベーションの室温インキュベーションへの置き換え。加えて、ビーズコード配列決定は、スプリントライゲーションと比較して、二本鎖ライゲーションでより少ないエラーを示した。
【0148】
実施例７－二本鎖スプリントライゲーションによる３レベルインデックス付け
二本鎖スプリントライゲーションを含む３レベルインデックス付けを、スプリントライゲーション（標準）を含む３レベルインデックス付けと比較した。実験計画の概要を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。
二本鎖スプリントライゲーションを含む３レベルインデックス付けを、スプリントライゲーション（標準）を含む３レベルインデックス付けと比較した。実験計画の概要を図１５Ａ及び図１５Ｂに示す。
【0149】
ｑＰＣＲを、二本鎖スプリントライゲーション又はスプリントライゲーションのいずれかを使用して３レベルインデックス付き生成物に対して実施した。全長二本鎖ライゲーションインデックス対照を標準曲線（より高い純度）として使用し、スプリントライゲーションアンプリコンの濃度をサイズ調整した。結果を図１６Ａに要約する。スプリントライゲーションについて、８０℃での変性は、オリゴの総数を低減させ（２対３）、５０℃でのアニーリングは、オリゴの総数をわずかに増加させた（３対４）。スプリントライゲーション対ｄｓライゲーションに関して、５０℃でのアニーリング及び８０Ｃでの変性は、スプリント及びｄｓライゲーション法と同等の数の全長オリゴを与え（４対７）、オリゴは、全長であり（第３レベル対バイオオリゴ）、ｄｓライゲーションは、より少ない数の第２レベルオリゴを示した。全長対照については、おそらく純度の問題により、分子の総数がより少なかった。
【0150】
【0151】
前述の二本鎖スプリントライゲーション研究から、スプリントライゲーション及びｄｓライゲーションは、同等の数の全長オリゴを与え、８０℃での変性は、いくつかの捕捉オリゴヌクレオチド（ＣＯ）の損失をもたらしたが、５０℃でのアニーリングは、ＣＯの数をわずかに増加させた。ｄｓライゲーションによって合成されたＣＯは、スプリントライゲーションによって合成されたＣＯよりもエラーが少なかった。
【0152】
実施例８－ＬＮＡ含有スプリントオリゴ
ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）を含有する短縮された第１のスプリント（カンガルースプリント）を設計する。カンガルースプリントは、配列：ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＴ／３ｄｄＣ（配列番号０３）に基づき、「３ｄｄＣ」は、３’ジデオキシシチジンである。生成されたスプリントには、５’末端及び３’末端の両方から短縮されたスプリントであって、全てが最後の塩基をジデオキシシチジン（dideoxy-cytidine、ｄｄＣ）に保つスプリント、及び全ての可能なＬＮＡ置換を含有するスプリントが含まれる。生成されたオリゴを、ＩＤＴのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）で分析する。ＬＮＡオリゴについてのＱｉａｇｅｎの設計ガイドラインに従う生成されたオリゴを選択し、ガイドラインには、３０～６０％のＧＣ含量、連続して４個未満のＬＮＡ塩基、連続して３個未満のＧ又はＣが含まれる。元のスプリントと同様のＴｍを有し、ライゲーション部位に相補的な塩基位置にいかなるＬＮＡも有さない生成されたオリゴを選択する。室温で二次構造又は自己ハイブリダイゼーションを有さず、Ｐ５又はＨｙｂ配列に相補的でない生成されたオリゴが選択される。表２は、３つの例示的なオリゴを列挙する。
ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）を含有する短縮された第１のスプリント（カンガルースプリント）を設計する。カンガルースプリントは、配列：ＡＴＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＡＧＴ／３ｄｄＣ（配列番号０３）に基づき、「３ｄｄＣ」は、３’ジデオキシシチジンである。生成されたスプリントには、５’末端及び３’末端の両方から短縮されたスプリントであって、全てが最後の塩基をジデオキシシチジン（dideoxy-cytidine、ｄｄＣ）に保つスプリント、及び全ての可能なＬＮＡ置換を含有するスプリントが含まれる。生成されたオリゴを、ＩＤＴのＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）で分析する。ＬＮＡオリゴについてのＱｉａｇｅｎの設計ガイドラインに従う生成されたオリゴを選択し、ガイドラインには、３０～６０％のＧＣ含量、連続して４個未満のＬＮＡ塩基、連続して３個未満のＧ又はＣが含まれる。元のスプリントと同様のＴｍを有し、ライゲーション部位に相補的な塩基位置にいかなるＬＮＡも有さない生成されたオリゴを選択する。室温で二次構造又は自己ハイブリダイゼーションを有さず、Ｐ５又はＨｙｂ配列に相補的でない生成されたオリゴが選択される。表２は、３つの例示的なオリゴを列挙する。
【0153】
【表2】
【0154】
５’及び３’ＴＭは、以下の設定（ライゲーション反応に基づく）を用いてＩＤＴのオリゴアナライザーを使用して計算する：１．９８μＭのオリゴ、１００ｍＭのＮａ＋、７．９ｍＭのＭｇ＋＋。全長ＴＭは、以下の設定（スプリント変性に基づく）を用いてＩＤＴのオリゴアナライザーを使用して計算する：０．０５μＭのオリゴ、１００ｍＭのＮａ＋。実験の概要を図１７に示す。
【0155】
実施例９－リンカー配列長を低減させるための修飾スプリントオリゴヌクレオチド
ホス－オリゴスプリントハイブリダイゼーション配列が６個のヌクレオチドに減少し、Ｇ／Ｃ含量が増加した更なるスプリントを設計した。新しいホス－オリゴに対して複数のスプリントを設計した。設計されたスプリントの概要を図１８Ａに示し、これは、表３に列挙された配列を示し、Ｘは、イノシンである。
ホス－オリゴスプリントハイブリダイゼーション配列が６個のヌクレオチドに減少し、Ｇ／Ｃ含量が増加した更なるスプリントを設計した。新しいホス－オリゴに対して複数のスプリントを設計した。設計されたスプリントの概要を図１８Ａに示し、これは、表３に列挙された配列を示し、Ｘは、イノシンである。
【0156】
【表3】
【0157】
実験条件の概要を図１８Ｂに示す。試験した条件は、２０℃対１２℃のスプリントライゲーションを含み、これは、サーモサイクラー（回転なし）中で一晩実施した。ＤＳオリゴアニーリングを、急速冷却プロトコル（７５℃でのインキュベーション、直ちに氷に移す）又は低速アニーリング（試料をサーモサイクラー中７５℃でインキュベートし、次いで温度を１℃／３０秒の低下速度で低下させた）のいずれかを使用して実施した。ｑＰＣＲにより捕捉及び全長オリゴを測定した。結果を図１８Ｃに要約するが、これは、再設計された６個のヌクレオチドｐ－オリゴ／スプリントとのライゲーションが約１０～２０％少なかったことを示す。再設計された４個のヌクレオチドスプリントとのライゲーションは約４０～５０％少なかった。試験したスプリントのうちスプリントの最も短い３’部分を有する、図１８Ａに示される「６ｂｐ＿Ｎｅｗ＿６ｂｐ－Ｋスプリント」を用いた結果から、スプリントの３’半分をわずか６個のヌクレオチドに低減させると、ライゲーション効率が約９０％低減したことが推測された。低速アニーリングは、全長オリゴの数にほとんど影響を及ぼさなかった。イノシン塩基の付加は、ライゲーション効率を改善しない可能性がある。イノシンとの塩基の置換は、ライゲーション効率を低減させた可能性がある。要約すると、スプリント配列の再設計、並びにスプリントの５’末端の６個のヌクレオチド及び４個のヌクレオチドへの短縮は、連結がスプリントＴｍより下で行われた場合であっても、ライゲーション効率を低減させた。イノシンをスプリントの５’末端に付加することは、ライゲーション効率を改善しなかった。スプリントの５’末端の塩基をイノシンで置換することは、ライゲーション効率を低減させた。低速アニーリングは、ライゲーション効率にほとんど影響を及ぼさないことが見出された。短縮されたリンカー配列を有するビーズ連結インデックス付きオリゴヌクレオチドを調製する際のライゲーション効率の低減は、低減された長さを有するリンカー配列の使用を含む配列決定ワークフローの効率の増加よりも勝る可能性が高いはずである。
【0158】
実施例１０－二本鎖スプリントライゲーションによるインデックス付けのためのワークフロー
二本鎖スプリントライゲーションによるインデックス付けの概要を図１９Ａに示し、例示的なワークフローを図１９Ｂに示す。図１９Ａに示されるスキームでは、アニーリングは、６０℃で３分間、氷に移すことを含み、ライゲーションは、１回目のライゲーション：Ｏ／Ｎ、２回目のライゲーション：５時間を含み、変性は、８０℃で２分間、緩衝液を直ちに除去することを含む。以下に、二本鎖スプリントライゲーションによってインデックス付きビーズプールを調製するための工程を要約する。
二本鎖スプリントライゲーションによるインデックス付けの概要を図１９Ａに示し、例示的なワークフローを図１９Ｂに示す。図１９Ａに示されるスキームでは、アニーリングは、６０℃で３分間、氷に移すことを含み、ライゲーションは、１回目のライゲーション：Ｏ／Ｎ、２回目のライゲーション：５時間を含み、変性は、８０℃で２分間、緩衝液を直ちに除去することを含む。以下に、二本鎖スプリントライゲーションによってインデックス付きビーズプールを調製するための工程を要約する。
【0159】
【表4】
【0160】
【表5】
【0161】
【表6】
【0162】
【表7】
【0163】
【表8】
【0164】
【表9】
【0165】
【表10】
【0166】
【表11】
【0167】
【表12】
【0168】
【表13】
【0169】
【表14】
【0170】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
【0171】
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するものである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。そのような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明のその開示又は実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び代替を網羅することを意図する。
【0172】
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び／又はより上位にあることを意図する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【図13G】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19A】
【図19B】
【配列表】
【国際調査報告】