特表 2024-523636 細胞の生理活性を調節するキメラポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】細胞の生理活性を調節するキメラポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240621BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240621BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240621BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALI20240621BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/24 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/19 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240621BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

C07K16/30

C07K14/47

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/0781

C12N5/0786

C12N5/0784

C12N5/0783

C12N5/10

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/071

C12N15/867 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N5/0787

C12N15/26

C12N15/24

C12N15/19

A61K48/00

A61K38/16

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/12

A61K35/17

A61K35/15

A61K35/30

A61K35/28

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580614

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2024-01-16

(86)【国際出願番号】 CN2022102395

(87)【国際公開番号】W WO2023274303

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】202110730083.X

(32)【優先日】2021-06-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202210111505.X

(32)【優先日】2022-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202111056553.5

(32)【優先日】2021-09-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515309715

【氏名又は名称】科済生物医薬（上海）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＳＧＥＮ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】王益

(72)【発明者】

【氏名】李宗海

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

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4B065CA27

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4C084AA02

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4C084BA02

4C084NA05

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4C084ZB27

4C087AA01

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4C087BC83

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4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA01

4H045DA30

4H045DA50

4H045DA76

4H045DA83

4H045DA89

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

標的分子に特異的に結合可能な結合ペプチドと、１つ以上の切断部位を含む受容体調節ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラポリペプチドであって、前記受容体調節ドメインが、細胞外領域及び膜貫通領域を含み、前記細胞外領域及び膜貫通領域は同時にＮｏｔｃｈタンパク質に由来するものではなく、前記結合ペプチドと前記標的分子との結合は、前記受容体調節ドメインの切断を誘導することができ、それによって前記細胞内ドメインが放出される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）標的分子に特異的に結合可能な結合ドメインと、
ｂ）１つ以上の切断部位を含む受容体調節ドメインと、
ｃ）細胞内ドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記受容体調節ドメインが、細胞外領域及び膜貫通領域を含み、前記細胞外領域及び前記膜貫通領域が同時にＮｏｔｃｈタンパク質に由来するものではなく、
前記結合ドメインと前記標的分子との結合が、前記受容体調節ドメインの切断を誘導することができ、それによって前記細胞内ドメインが放出される、キメラポリペプチド。

【請求項2】

前記細胞外領域は、Ｊａｇｇｅｄ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＡＰＰ、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈｒｉｎＢ１、成長ホルモン受容体、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＦＮａＲ２、ＩＬ１Ｒ２、Ｌ１、ＬＲＰ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ６、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ネクチン１α、ＮＲＡＤＤ、ｐ７５－ＮＴＲ、Ｐｃｄｈ α４、Ｐｃｄｈ γ－Ｃ３、ＰＴＰκ、ＰＴＰ－ＬＡＲ、ＳｏｒＣＳ１ｂ、ＳｏｒＬＡ、ソルチリン、ＡｐｏＥＲ２、ＰＫＨＤ１、ＥｒｂＢ４、ＩＦＮａＲ２、ＶＥＧＦ－Ｒ１、またはＶＬＤＬＲに由来する細胞外領域もしくはそれらの組み合わせ、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の断片もしくはそれらの組み合わせ、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の変異体もしくはそれらの組み合わせ、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域のトランケート構造もしくはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラポリペプチド。

【請求項3】

前記膜貫通領域がストップトランスファー配列（ＳＴＳ）をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のキメラポリペプチド。

【請求項4】

前記結合ドメインが、標的細胞表面上の標的分子に結合可能な抗原結合ドメインを含むか、または前記結合ドメインが、受容体に結合可能なリガンド部分を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項5】

前記標的細胞が病原体であることを特徴とする、請求項４に記載のキメラポリペプチド。

【請求項6】

前記標的細胞がヒト細胞であることを特徴とする、請求項４に記載のキメラポリペプチド。

【請求項7】

前記ヒト細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項６に記載のキメラポリペプチド。

【請求項8】

前記標的分子が、分化マーカークラスター、細胞表面受容体、接着タンパク質、インテグリン、ムチン、レクチン、及び腫瘍抗原からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項9】

前記標的分子が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項10】

前記抗原結合ドメインが、抗体、受容体、細胞接着分子、非抗体分子足場、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項11】

前記抗体が、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ミニ抗体、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ）_ｖフラグメント、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びその機能性フラグメントまたはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１０に記載のキメラポリペプチド。

【請求項12】

前記抗原結合ドメインは、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＡＬＰＰＬ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２４６、ＣＤ２７２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４６、ＣＤ７１、ＣＤ９７、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＥＣＬ１、ＣＳ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＬＴ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＩＧＬＬ１、ＩＬ １１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ １１７、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ｂ、ＰＲＳＳ２１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＩＲＰａ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＡＬＰＩ、ｃＭｅｔ、及びＡｘｌからなる選択される腫瘍抗原に特異的に結合することを特徴とする、請求項４～１１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項13】

前記受容体調節ドメインの膜貫通領域がγ-セクレターゼ切断部位を含むことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項14】

前記細胞内ドメインが、転写因子、部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、抑制性免疫受容体、活性化免疫受容体、またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載のキメラポリペプチド。

【請求項15】

前記転写因子が、Ｇａｌ４－ＶＰ１６、Ｇａｌ４－ＶＰ６４、ｔｅｔＲ－ＶＰ６４、ＺＦＨＤ１－ＶＰ６４、Ｇａｌ４－ＫＲＡＢ、ＨＡＰ１－ＶＰ１６、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のキメラポリペプチド。

【請求項16】

追加のタンパク質加水分解性切断部位、シグナル配列、検出可能なラベル、腫瘍特異的切断部位、疾患特異的切断部位、及びそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項17】

前記受容体調節ドメインの細胞外領域が、配列番号１、３、５、７、９、及び１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項18】

前記ＳＴＳが、配列番号２２、２３、２４、２５、及び２６のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項19】

前記受容体調節ドメインの膜貫通領域が、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、１０２、 １０３、及び１０４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項20】

前記受容体調節ドメインが、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～１９のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項21】

前記キメラポリペプチドが、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６１、７３、８７、１０５、１０６、１０８または１１０のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～２０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、核酸分子。

【請求項23】

前記核酸分子が発現カセットまたは発現ベクター内に構築されることを特徴とする、請求項２２に記載の核酸分子。

【請求項24】

前記発現ベクターがウイルスベクターまたはトランスポゾンベクターを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の核酸分子。

【請求項25】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであることを特徴とする、請求項２４に記載の核酸分子。

【請求項26】

請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド及び／または請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、操作された細胞。

【請求項27】

前記操作された細胞が、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、内皮細胞または幹細胞であることを特徴とする、請求項２６に記載の操作された細胞。

【請求項28】

前記免疫細胞が、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、その他のＴ細胞、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項２７に記載の操作された細胞。

【請求項29】

前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインに作動可能に連結された外来遺伝子をコードする発現カセットをさらに含み、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインが前記外来遺伝子の発現を調節することを特徴とする、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の操作された細胞。

【請求項30】

前記外来遺伝子が、ＧＡＬ－４、ｔｅｔＲ、ＺＦＨＤ１、ＨＮＦ１Ａ、またはＨＡＰ１によって調節されるプロモーターの調節下で発現されることを特徴とする、請求項２９に記載の操作された細胞。

【請求項31】

前記外因性遺伝子発現産物が、非コードＲＮＡ、サイトカイン、サイトトキシン、ケモカイン、免疫調節因子、アポトーシス促進因子、抗アポトーシス因子、ホルモン、分化因子、脱分化因子、修飾ＴＣＲ、ＣＡＲ、レポーター遺伝子、またはそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項２９または３０に記載の操作された細胞。

【請求項32】

前記キメラポリペプチドの結合ドメインが第１の標的分子に特異的に結合し、前記外因性遺伝子発現産物がＣＡＲであり、前記ＣＡＲが前記第１の標的分子とは異なる第２の標的分子に特異的に結合し、前記第１の標的分子及び前記第２の標的分子がそれぞれ、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＭＯＧ、ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＡＬＰＰＬ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２４６、ＣＤ２７２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４６、ＣＤ７１、ＣＤ９７、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＥＣＬ１、ＣＳ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＦＡＰ、ＦＬＴ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＩＧＬＬ１、ＩＬ １１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ １１７、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ｂ、ＰＲＳＳ２１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＩＲＰａ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＡＬＰＩ、ｃＭｅｔ、及びＡｘｌからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３１に記載の操作された細胞。

【請求項33】

前記第１の標的分子及び前記第２の標的分子がそれぞれ、ＡＳＧＲ１とＧＰＣ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩとＩＬ１３Ｒａ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩとＢ７Ｈ３、メソテリとＣｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２とメソテリ、ＦＡＰとＣｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１とＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１２３とＮＫＧ２Ｄの組み合わせのいずれかから選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の操作された細胞。

【請求項34】

前記キメラポリペプチド及びＣＡＲがそれぞれ、配列番号６１及び６２に示される配列、または配列番号６１及び６４に示される配列、または配列番号６１及び６５に示される配列、または配列番号６１及び６６に示される配列、または配列番号１０５及び６７に示される配列、または配列番号１０６及び６７に示される配列、または配列番号１０８及び１０７に示される配列、または配列番号７３及び１０９に示される配列、または配列番号５０及び１０９に示される配列を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の操作された細胞。

【請求項35】

前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１、または上記のサイトカインの組み合わせであることを特徴とする、請求項３１に記載の操作された細胞。

【請求項36】

前記操作された細胞が、配列番号５９、６３、６８、６９、７０、７１、７２、７４、８８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列またはその翻訳されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の操作された細胞。

【請求項37】

薬学的に許容される担体を含み、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子及び／または請求項２６～３６のいずれか一項に記載の操作された細胞をさらに含む、医薬組成物。

【請求項38】

ａ）請求項２６～３６のいずれか一項に記載の操作された細胞を提供することと、
ｂ）前記操作された細胞を標的分子と接触させることとを含む、前記操作された細胞の活性を調節する方法であって、
前記標的分子と前記操作された細胞上のキメラポリペプチドの結合ドメインとの結合が、前記キメラポリペプチドのタンパク質加水分解切断部位の切断を誘導し、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメイン内の転写因子を放出し、前記操作された細胞の活性を調節することを特徴とする、前記方法。

【請求項39】

前記操作された細胞活性が、細胞増殖、細胞アポトーシス、細胞の非アポトーシス死、細胞分化、細胞脱分化、細胞遊走、細胞接着及び／または細胞溶解活性のいずれかから選択されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記転写因子が外因性遺伝子の発現を調節し、前記外因性遺伝子が、ケモカイン、ケモカイン受容体、キメラ抗原受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、代謝酵素、病原体由来タンパク質、増殖誘導物質、受容体、ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、部位特異的ヌクレアーゼ、Ｔ細胞受容体、毒素、毒素由来タンパク質、転写調節因子、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳調節因子、翻訳活性化因子、翻訳阻害因子、活性化免疫受容体、抗体、アポトーシス阻害因子、アポトーシス誘導因子、修飾Ｔ細胞受容体、免疫活性化因子、免疫抑制剤、及び抑制性免疫受容体からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

放出された前記転写因子が、前記操作された細胞の分化を調節し、前記操作された細胞が、免疫細胞、幹細胞、始原細胞または前駆細胞であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

腫瘍を治療する方法であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項43】

請求項２６～３６のいずれか一項に記載の操作された細胞を標的分子と接触させることを含む、前記操作された細胞を活性化する方法であって、
前記キメラポリペプチドを含む結合ドメインが、第１の標的分子に特異的に結合する抗体を含み、前記接触により前記キメラポリペプチドが前記キメラポリペプチドの細胞内ドメイン内の転写因子を放出してタンパク質を活性化し、前記操作された細胞におけるＣＡＲ及び／または修飾ＴＣＲの発現を調節し、前記ＣＡＲ及び／または修飾ＴＣＲが、第１の標的分子とは異なる第２の標的分子に特異的に結合した後に前記操作された細胞を活性化することを特徴とする、前記方法。

【請求項44】

前記第１の標的分子及び前記第２の標的分子が異なる腫瘍抗原であるか、または前記第１の標的分子が組織特異的分子であり、前記第２の標的分子が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

治療有効量の請求項２６～３６のいずれか一項に記載の操作された細胞を受験者に投与することを含む、前記受験者における標的細胞の活性を阻害する方法であって、前記操作された細胞が、前記受験者における標的細胞の活性を阻害することを特徴とする、前記方法。

【請求項46】

前記標的細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記標的細胞が、急性骨髄腫白血病細胞、未分化リンパ腫細胞、星状細胞腫細胞、Ｂ細胞がん細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、上衣腫細胞、食道癌細胞、神経膠芽腫細胞、神経膠腫細胞、平滑筋肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、非小細胞肺癌細胞、希突起膠腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、末梢Ｔ細胞リンパ腫細胞、腎臓癌細胞、肉腫細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、中皮腫細胞または肉腫細胞であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記標的細胞が低レベルの標的分子を発現し、前記キメラポリペプチドの結合ドメインが前記標的分子に特異的に結合することを特徴とする、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記操作された細胞は、前記キメラポリペプチドが標的分子に結合することによって転写を開始させて活性化されるＣＡＲ、修飾ＴＣＲ、外因性サイトカイン、及び／または治療用モノクローナル抗体をさらに含むことを特徴とする、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

前記標的分子が第１の標的分子及び第２の標的分子を含み、前記キメラポリペプチドが前記第１の標的分子に特異的に結合し、前記ＣＡＲ及び／または修飾ＴＣＲが前記第２の標的分子に特異的に結合し、前記標的細胞内の第１の標的分子及び第２の標的分子が不均一性腫瘍抗原を発現するか、または前記第１の標的分子が組織特異的分子であり、前記第２の標的分子が腫瘍抗原であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記標的細胞における前記第１の標的分子の陽性率が、前記標的細胞における前記第２の標的分子の陽性率よりも低いことを特徴とする、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記操作された細胞の抗腫瘍特異性をさらに高めることができることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。

【請求項53】

ａ）請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド；
ｂ）請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子；
ｃ）請求項２６～３６のいずれか一項に記載の細胞；及び
ｄ）請求項３７に記載の医薬組成物
の１つ以上を含むことを特徴とする、細胞活性を調節し、標的細胞を阻害し、もしくは必要とする受験者の健康状態を治療するためのシステムまたは薬箱またはキット。

【請求項54】

腫瘍の治療における、
ａ）請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド；
ｂ）請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子；
ｃ）請求項２６～３６のいずれか一項に記載の細胞；及び
ｄ）請求項３７に記載の組成物
の１つ以上の使用。

【請求項55】

前記腫瘍が、固形腫瘍、血液腫瘍、軟組織腫瘍、または転移性病変であることを特徴とする、請求項５４に記載の使用。

【請求項56】

健康状態を治療するための医薬品の製造における、請求項１～２１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド；請求項２２～２５のいずれか一項に記載の核酸分子；請求項２６～３６のいずれか一項に記載の細胞；請求項３７に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【優先権情報】

【0001】

本出願は、２０２１年６月２９日に提出された中国特許出願ＣＮ２０２１１０７３００８３．Ｘ、２０２１年９月９日に提出された中国特許出願ＣＮ２０２１１１０５６５５３．５、２０２２年１月２９日に提出された中国特許出願ＣＮ２０２２１０１１１５０５．Ｘの優先権を要求し、それらの全内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【配列表の同時提出】

【0002】

以下のＡＳＣＩＩテキストフォーマットのコンピューター可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：ＦＦ００６１７ＰＣＴ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ－２０２２０６２９－ｙｚｇ．ｔｘｔ、日付：２０２２年０６月２９日、サイズ：２３２ＫＢ）は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

【技術分野】

【0003】

本出願は、細胞の生理活性を調節することができるキメラポリペプチド、及びキメラポリペプチドを発現する細胞に関する。

【背景技術】

【0004】

インビトロで細胞の遺伝子発現や細胞分化などの生理活性を制御する方法は数多くあるが、インビボで細胞の空間特異的な制御をどのように達成するかは依然として技術的に困難である。例えば、一部の免疫細胞は、抗腫瘍分子（ＣＡＲ、サイトカインなど）を外因的に発現すると、細胞を活性化し、強力な抗腫瘍効果を発揮することができる一方、オフターゲット毒性の潜在的なリスクや細胞の長期活性化による機能障害ももたらされる。

【0005】

現在、Ｎｏｔｃｈ受容体の第一世代合成誘導体であるｓｙｎＮｏｔｃｈが存在しており、これはリガンド結合ドメイン、Ｎｏｔｃｈコア調節領域、及び細胞内シグナル伝達領域で構成されている。その原理は、天然型Ｎｏｔｃｈ分子が標的分子（リガンド）に結合した後に細胞外及び細胞内で剪断が発生する特徴を利用して、天然型Ｎｏｔｃｈ分子の細胞内領域を人工シグナル伝達分子（特異的転写因子など）で置き換えることであり、これによって、リガンド依存的な遺伝子発現制御は基本的に実現される。

【0006】

しかし、この技術には依然として多くの問題があり、ｓｙｎＮｏｔｃｈにはバックグラウンド漏洩があり、つまりリガンド活性化がない状態でも弱い遺伝子発現が存在すること；ｓｙｎＮｏｔｃｈ誘導遺伝子発現レベルが低いこと；ｓｙｎＮｏｔｃｈの配列が長く、分子が大きいため、細胞工学による改変が困難である。

【発明の開示】

【0007】

本出願は、以下の態様に係る。

【0008】

ａ）標的分子に特異的に結合可能な結合ペプチドと、
ｂ）１つ以上の切断部位を含む受容体調節ドメインと、
ｃ）細胞内ドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、
前記受容体調節ドメインが、細胞外領域及び膜貫通領域を含み、前記細胞外領域及び前記膜貫通領域が同時にＮｏｔｃｈタンパク質に由来するものではなく、
前記結合ペプチドと前記標的分子との結合が、前記受容体調節ドメインの切断を誘導することができ、それによって前記細胞内ドメインが放出される、キメラポリペプチド。

【0009】

一実施形態では、前記キメラポリペプチドは、前記切断部位が酵素加水分解部位、好ましくはプロテアーゼ加水分解部位であることを特徴とする。

【0010】

一実施形態では、前記キメラポリペプチドは、前記受容体調節ドメインの膜貫通領域に切断部位が含まれており、前記結合ペプチドが前記標的分子に結合すると、細胞内ドメインの切断及び放出が引き起こされることを特徴とする。

【0011】

一実施形態では、キメラポリペプチドは、前記膜貫通領域がＩ－ＣＬｉＰ（膜内切断プロテアーゼ（ｉｎｔｒａｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｌｙ ｃｌｅａｖｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ））酵素切断部位を含むことを特徴とし、好ましくは、前記Ｉ－ＣＬｉＰがγ－セクレターゼ切断部位を含み、より好ましくは、前記γ－セクレターゼ切断部位が、Ｇｌｙ－Ｖａｌジペプチド配列のγ－セクレターゼ切断部位を含む。

【0012】

一実施形態では、キメラポリペプチドの受容体調節ドメインの細胞外領域は切断部位を含み、標的分子に特異的に結合する前記ペプチドが前記標的分子に結合すると、前記細胞外領域の切断が引き起こされ、さらに細胞内ドメインの切断及び放出が引き起こされる。

【0013】

一実施形態では、キメラポリペプチドの細胞外領域の切断部位は、シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）プロテアーゼ切断部位であり、好ましくは、前記シェダーゼプロテアーゼは、ＢＡＣＥ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ１－ＭＭＰから選択される。

【0014】

一実施形態では、キメラポリペプチドの細胞外領域は、Ｊａｇｇｅｄ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＡＰＰ、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈｒｉｎＢ１、成長ホルモン受容体、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＦＮａＲ２、ＩＬ１Ｒ２、Ｌ１、ＬＲＰ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ６、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ネクチン１α、ＮＲＡＤＤ、ｐ７５－ＮＴＲ、Ｐｃｄｈ α４、Ｐｃｄｈ γ－Ｃ３、ＰＴＰκ、ＰＴＰ－ＬＡＲ、ＳｏｒＣＳ１ｂ、ＳｏｒＬＡ、ソルチリン、ＡｐｏＥＲ２、ＰＫＨＤ１、ＥｒｂＢ４、ＩＦＮａＲ２、ＶＥＧＦ－Ｒ１、またはＶＬＤＬＲの細胞外ドメイン、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の断片、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の変異体に由来する。

【0015】

一実施形態では、キメラポリペプチドの細胞外領域は、Ｊａｇｇｅｄ２の細胞外領域もしくはＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域を含むか、またはＪａｇｇｅｄ２の細胞外領域の断片もしくはＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域の断片を含む。

【0016】

一実施形態では、キメラポリペプチドの細胞外領域は、配列番号１、３、５、７、９、及び１１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0017】

一実施形態では、キメラポリペプチドの細胞内ドメインは、以下のタンパク質：
転写活性化タンパク質；転写抑制タンパク質；転写補助活性化タンパク質；転写補助抑制タンパク質；ＤＮＡ結合ポリペプチド；ＲＮＡ結合ポリペプチド；翻訳調節ポリペプチド；ホルモン；サイトカイン；毒素；抗体；クロマチン調節因子；自殺タンパク質（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）；オルガネラ特異的ポリペプチド（例えば、核孔調節因子、ミトコンドリア調節因子、小胞体調節因子など）；アポトーシス促進ポリペプチド；抗アポトーシスポリペプチド；他のメカニズムを通じて細胞死を促進するその他のポリペプチド；増殖促進ポリペプチド；抗増殖ポリペプチド；免疫共刺激ポリペプチド；部位特異的ヌクレアーゼ；リコンビナーゼ；抑制性免疫受容体；活性化免疫受容体；Ｃａｓ９及びＲＮＡ標的ヌクレアーゼの変異体；ＤＮＡ認識ポリペプチド；シグナル伝達ポリペプチド；受容体チロシンキナーゼ；非受容体チロシンキナーゼ；分化を促進するポリペプチド
のいずれかから選択されるタンパク質断片を含み、
好ましくは、前記細胞内ドメインは、転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、抑制性免疫受容体、及び活性化免疫受容体からなるタンパク質のいずれかから選択されるタンパク質断片を含む。

【0018】

一実施形態では、転写活性化タンパク質は、ＧＬＡ４－ＶＰ６４またはその断片であり、好ましくは、前記転写活性化タンパク質は、配列番号２７に示される配列を含む。

【0019】

一実施形態では、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインは部位特異的ヌクレアーゼであり、好ましくは、前記部位特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。

【0020】

一実施形態では、前記キメラタンパク質の受容体調節ドメインは、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または８５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0021】

一実施形態では、前記結合ペプチドは、抗体、抗原、リガンド、受容体、細胞接着分子、または非抗体分子足場である。

【0022】

一実施形態では、前記結合ペプチドは抗体であり、前記抗体は、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ミニ抗体である。

【0023】

一実施形態では、前記非抗体分子足場は、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、アビマー、親和体、アンチカリン、またはアフィリンである。

【0024】

一実施形態では、前記標的分子は、ヒト病理学的組織及び／またはヒト正常組織におけるリガンドに存在する。

【0025】

一実施形態では、前記病理学的組織は、腫瘍組織、感染症組織、または遺伝子変異組織である。

【0026】

一実施形態では、前記腫瘍組織は、腫瘍細胞、腫瘍細胞を含む器官、及び腫瘍微小環境を含む。

【0027】

一実施形態では、前記標的分子は、特定のヒト病理学的組織及び／またはヒト正常組織において特異的に発現されるか、または高度に発現される。

【0028】

一実施形態では、前記膜貫通領域は、ｎｏｔｃｈからの膜貫通領域であり、好ましくは、前記膜貫通領域は、配列１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、１０２、１０３、１０４に示されるか、または、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、１０２、１０３、１０４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0029】

一実施形態では、前記受容体調節ドメインは５０～３００個のアミノ酸を有する。

【0030】

一実施形態では、前記受容体調節ドメインと前記認識ドメインとの間に接続ペプチドが含まれる。

【0031】

一実施形態では、前記キメラポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、結合ペプチド、受容体調節ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。

【0032】

本出願はまた、上記のキメラポリペプチドを発現する細胞にも関する。

【0033】

一実施形態では、前記細胞は免疫エフェクター細胞である。

【0034】

一実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、ＣＩＫ細胞、及び幹細胞由来の免疫エフェクター細胞である。

【0035】

一実施形態では、前記細胞は、別のキメラポリペプチドまたはＴ細胞受容体を発現する核酸も含む。

【0036】

一実施形態では、前記別のキメラポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体、またはＴ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）である。

【0037】

一実施形態では、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインが放出された後、別のキメラポリペプチドまたはＴ細胞受容体の発現を活性化することができる。

【0038】

本出願は、本出願の細胞を調製するために使用される核酸、発現ベクター、及びウイルスに関する。

【0039】

一実施形態では、前記核酸は発現ベクター内に構築される。

【0040】

本出願は、細胞を活性化する方法に関し、この方法は、
上述の本出願の細胞を固定化抗原と接触させることを含み、前記キメラポリペプチドを含む前記結合ペプチドが、第１の抗原に特異的な抗体を含み、前記接触により前記キメラポリペプチドに含まれる前記転写活性化タンパク質が放出され、前記細胞における前記ＣＡＲ及び／またはＴＣＲの発現を調節し、前記ＣＡＲ及び／またはＴＣＲが、第２の抗原に結合した後に前記細胞の活性化をもたらす。

【0041】

一実施形態では、前記第１の抗原及び／または第２の抗原には抗原発現の不均一性が存在する。

【0042】

一実施形態では、前記第１の抗原及び／または第２の抗原は腫瘍抗原である。

【0043】

一実施形態では、前記方法は、第１の抗原の不均一な発現を伴う腫瘍を治療するために使用される。

【0044】

本出願は、細胞を活性化する方法に関し、この方法は、
上述の本出願の細胞を前記標的分子と接触させることを含み、前記キメラポリペプチドを含む前記結合ペプチドが、第１の標的分子に特異的な抗体を含み、前記接触により前記キメラポリペプチドに含まれる前記転写活性化タンパク質が放出され、前記細胞における前記ＣＡＲ及び／またはＴＣＲの発現を調節し、前記ＣＡＲ及び／またはＴＣＲが、第２の標的分子に結合した後に前記細胞の活性化をもたらす。

【0045】

一実施形態では、前記第１の標的分子及び／または前記第２の標的分子には発現の不均一性が存在する。

【0046】

一実施形態では、前記第１の標的分子及び／または第２の標的分子は腫瘍抗原である。

【0047】

一実施形態では、前記方法は、前記第１の標的分子の不均一な発現を伴う腫瘍を治療するために使用される。

【0048】

一実施形態では、前記標的分子は不溶性分子である。

【0049】

一実施形態では、前記第１の標的分子は、細胞膜表面抗原を含む。

【0050】

一実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、ＣＩＫ細胞、幹細胞由来の免疫エフェクター細胞、またはそれらの組み合わせを含む。

【0051】

本出願は、サイトカインＩＬ－１２の分泌を調節する方法に関し、この方法は、
一実施形態では、本出願の細胞を固定化抗原と接触させることを含み、前記キメラポリペプチドを含む前記結合ペプチドが、抗原に特異的な抗体を含み、前記接触により前記キメラポリペプチドに含まれる前記転写活性化タンパク質が放出され、前記細胞における前記ＩＬ－１２の発現を調節する。

【0052】

一実施形態では、前記細胞はＴ細胞である。

【0053】

一実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原を含む。

【0054】

本出願は、サイトカインＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＣＣＬ２１またはそれらの組み合わせの分泌を調節する方法に関し、この方法は、
本出願の細胞を前記標的分子と接触させることを含み、前記キメラポリペプチドを含む前記結合ペプチドが、前記標的分子に特異的な抗体を含み、前記接触により前記キメラポリペプチドに含まれる前記転写活性化タンパク質が放出され、前記細胞における前記ＩＬ－１２、ＩＬ－７、ＣＣＬ２１またはそれらの組み合わせの発現を調節する。

【0055】

一実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、ＣＩＫ細胞、幹細胞由来の免疫エフェクター細胞、またはそれらの組み合わせを含む。

【0056】

一実施形態では、前記標的分子は腫瘍抗原を含む。

【0057】

一実施形態では、前記標的分子は不溶性分子である。

【0058】

一実施形態では、前記標的分子は、細胞膜表面抗原を含む。

【0059】

本出願の範囲内で、本出願の上述の技術的特徴及び以下（実施例など）に具体的に説明される技術的特徴を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術案を形成することができることを理解されたい。紙面の都合上、ここでは一々説明しない。

【図面の簡単な説明】

【0060】

【図1】図１Ａ及び１Ｂは、それぞれＧＰＣ３発現肝癌細胞と共インキュベートした後、ＧＰＣ３を標的とするｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）が、ｓｙｎＮｏｔｃｈと同等またはｓｙｎＮｏｔｃｈより有意に高いＢＦＰ発現レベルを誘導することを示す図である。

【図2】ｓｙｎＮｏｔｃｈ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するキメラポリペプチドが、コーティングされた抗原と共インキュベートした後に転写活性を引き起こし得ることを示す図である。

【図3】全長ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域またはその切断体を含む、ＧＰＣ３を標的とするキメラポリペプチドが遺伝子発現を調節することを示す図である。

【図4】抗原濃度が低い場合（０．７８１２５μｇ／ｍＬ以下）、キメラポリペプチドを含む細胞は静止したままであり、高濃度の抗原によって刺激されると（０．３１２５μｇ／ｍＬ以上）、キメラポリペプチドを含む細胞は活性化されることを示す図である。

【図5】ＧＰＣ３発現肝臓癌細胞と共インキュベートした後、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣが、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して同等または増加したＩＬ１２の発現を誘導することを示す図である。

【図6】異なる肝癌細胞のＧＰＣ３発現レベルを示す図である。

【図7】単一ベクター系がｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）をｓｙｎＮｏｔｃｈよりも高いレベルで発現することを示す図である。

【図8】ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣまたはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）が、ＧＰＣ３低発現細胞とのインキュベーション後にｓｙｎＮｏｔｃｈよりも高い転写を誘導することを示す図である。

【図9】ＧＰＣ３低発現細胞とのインキュベーション後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３の誘導発現レベルが低い一方、ＧＰＣ３高発現細胞とのインキュベーション後、その誘導発現レベルがｓｙｎＮｏｔｃｈに相当することを示す図である。

【図10】ＩＬ１２発現を調節するｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣが、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞と相乗的な抗腫瘍効果を発揮することを示す図である。

【図11】それぞれＥＧＦＲｖＩＩＩ発現神経膠腫細胞Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＵ２５１－ＥＧＦＲｖＩＩＩと共インキュベートした後、腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現する細胞が、ｓｙｎＮｏｔｃｈキメラポリペプチドを発現する細胞と同様のレベルでＢＦＰ発現を誘導するが、ｓｙｎＮｏｔｃｈキメラポリペプチドを発現する細胞には、抗原非依存性の活性化があることを示す図である。

【図12】ヒト初代Ｔ細胞を、腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ及びｓｙｎＮｏｔｃｈ－ＣＡＲ Ｔ発現細胞に調製した後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣの陽性率及び発現レベルがｓｙｎＮｏｔｃｈよりも高いことを示す図である。

【図13】抗原刺激の非存在下では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣＡＲを発現せず、自発的ＣＡＲシグナルを有さないことを示す図である。

【図14】抗原刺激の非存在下では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が低活性化及び低分化状態にあることを示す図である。

【図15】抗原刺激の非存在下では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が低枯渇状態にあることを示す図である。

【図16】腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ－Ｔ発現細胞は、ＥＧＦＲｖＩＩＩによって活性化され、ＩＬ１３Ｒａ２陽性神経膠腫細胞を死滅させることができ、ｓｙｎＮｏｔｃｈ－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原発現の不均一性が強い腫瘍を死滅させるときにより効果的であることを示す図である。

【図17】ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ－Ｔのインビボ抗腫瘍効果を示す図である。

【図18】ヒトＢ７Ｈ３のみを認識する３７６．９６－２８Ｚ－Ｔ細胞は有意な抗腫瘍効果を有するが、ヒト及びマウスＢ７Ｈ３を認識するＢ７Ｈ３－２８Ｚ－Ｔ及びＢ７Ｈ３－ＢＢＺ－Ｔの有効性が低いことを示す図である。特異性の低いＢ７Ｈ３－２８ＺをＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣの制御下に置くことで、その特異的な殺傷効果を向上させることができる。

【図19】メソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現する第二世代及び第四世代のＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、抗原によって特異的に活性化され、腫瘍細胞を殺傷することができることを示す図である。

【図20】メソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現する第二世代及び第四世代のＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、抗原によって特異的に活性化され、腫瘍細胞を殺傷することができることを示す図である。

【図21】ＦＡＰ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗腫瘍性であり、マウスの体重が有意に減少しないことを示す図である。

【図22】図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを含むメソテリン－ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原によって特異的に活性化され、腫瘍細胞を殺傷することができることを示す図である。

【図23】図２３Ａは、ＡＭＬ細胞のＣＬＬ１及びＮＫＧ２Ｄの発現レベルを示す図であり、図２３Ｂは、ＣＬＬ１を標的とするキメラポリペプチドの結合によって誘発される転写活性を示す図である。

【図24】ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するＴＨＰ１及びＨＬ－６０細胞を殺傷し、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって誘導されたＣＤ３Ｚ－ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＬＬ１発現が低いＴＨＰ－１細胞に対する殺傷効果が弱く、ＣＬＬ１とＮＫＧ２Ｄリガンドの両方の発現が高いＨＬ－６０細胞のみを殺傷することができることを示す図である。

【図25】ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞がよく増殖したことを示す図である。

【図26】ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞の死亡率がＵＴＤの死亡率と基本的に同じである一方、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の死亡率が有意に増加しており、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞が、培養系におけるＴ細胞の増殖と活性を効果的に確保できることを示す図である。

【発明の詳細】

【0061】

本出願は、新しいタイプのキメラポリペプチドが、標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）への特異的結合によって引き起こされる転写調節活性を有することを発見した。前記キメラポリペプチドの受容体調節ドメインの細胞外領域及び膜貫通領域は同時にＮｏｔｃｈに由来するものではなく、膜貫通領域には１つ以上の切断部位が含まれる。本出願のキメラポリペプチドが有する、標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）への特異的結合によって引き起こされる転写調節活性は、ｓｙｎＮｏｔｃｈが有する標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）への特異的結合によって引き起こされる転写調節活性と同等するか、またはｓｙｎＮｏｔｃｈ活性より高い。本出願は、結合誘発型転写スイッチを有するキメラポリペプチド、キメラポリペプチドをコードする核酸、及び核酸で遺伝的に修飾された宿主細胞を提供する。本出願は、結合誘発型転写調節活性を有するキメラポリペプチドをコードする核酸を含むトランスジェニック生物を提供する。また、結合誘発型転写調節活性を有する１つ以上のキメラポリペプチドを使用して細胞の活性を局所的に調節する方法、及び結合誘発型転写調節活性を有する１つ以上のキメラポリペプチドを使用する局在化細胞活性化システムも提供する。

【0062】

本出願によって提供されるキメラポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：（ａ）標的分子に特異的に結合できる結合ドメイン、（ｂ）１つ以上の切断部位を含む受容体調節ドメイン、及びｃ）細胞内ドメインを含み、前記受容体調節ドメインの細胞外領域及び膜貫通領域がＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドとは異なり、前記結合ドメインと前記標的分子との結合が、前記受容体調節ドメインの切断を誘導することができ、それによって前記細胞内ドメインが放出される。

【0063】

例示的には、本出願は、キメラポリペプチドｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）、及び本出願のキメラポリペプチドをコードする核酸、ならびに核酸で遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。本出願は、キメラポリペプチドｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）をコードする核酸を含むトランスジェニック生物を提供する。

【0064】

本出願で設計されたキメラポリペプチド（例えば、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）など）を発現する操作された細胞は、腫瘍抗原（例えば、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３など）を発現する腫瘍細胞に結合すると、転写調節活性を引き起こすことができる。一例では、転写はＢＦＰ発現、サイトカインＩＬ１２またはＣＡＲの発現を調節する。一例では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）を発現する細胞は、ｓｙｎＮｏｔｃｈキメラポリペプチドを発現する細胞の発現レベルに近い、またはそれよりも有意に高いレベルでＢＦＰ、ＩＬ１２、及びＣＡＲの発現を誘導する。

【0065】

ＩＬ１２などの炎症促進性サイトカインは、Ｔ細胞腫瘍免疫を促進する強力な機能を持つことが証明されているが、有毒な副作用が発生する可能性があるため、臨床応用のリスクが高くなる。本出願で提供されるキメラポリペプチドを使用して腫瘍部位における炎症促進性サイトカインの特異的な発現を調節することにより、副作用の問題を効果的に解決することができる。特定の実施形態では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）を発現する細胞は、ｓｙｎＮｏｔｃｈキメラポリペプチドを発現する細胞のレベルに近い、またはそれよりも有意に高いレベルでＩＬ１２発現を誘導する。特定の実施形態では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣは、低レベルで発現される標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）に対してより感受性が高く、遺伝子発現を誘導する能力がより強い。例示的には、低レベルで発現する腫瘍抗原に特異的に結合した後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣのＩＬ１２発現を誘導する能力は、ｓｙｎＮｏｔｃｈよりも有意に高く、約４～６倍にも達する。例示的には、腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩにより活性化されるｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって誘導されるＢＦＰのレベルはｓｙｎＮｏｔｃｈのレベルに相当するが、ｓｙｎＮｏｔｃｈは腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩのないＵ８７またはＵ２５１細胞との共インキュベーション後にも非特異的に活性化される。これは、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣは、強力な遺伝子誘導能を有するだけでなく、抗原特異性が高く、安全性も高いことを示唆している。

【0066】

本出願で提供されるキメラポリペプチドは、可溶性抗原によって活性化されない。例示的には、可溶性抗原は、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）キメラポリペプチドを発現する細胞を活性化することができない。特定の実施形態では、可溶性抗原とは、細胞外環境に溶解して遊離している抗原を指す。

【0067】

本出願で提供されるキメラポリペプチド（例えば、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）など）の受容体調節ドメインは、ｓｙｎＮｏｔｃｈの対応するドメインより短い。発現が調節される遺伝子と同じレンチウイルスベクターに組み込まれた場合、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節される遺伝子は、配列長の点でより大きな容量を持つことができる。特定の実施形態では、標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）に特異的に結合する結合ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって最終的に調製されたＴ細胞の感染陽性率は、ｓｙｎＮｏｔｃｈより高く、その約１．５倍であり、工業的な生産と調製の困難さを低下させる。

【0068】

本出願で提供されるキメラポリペプチド（例えば、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ））は、結合によってＣＡＲ発現を誘発して調節することにより、抗原発現に不均一または強い抗原不均一性を有する腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を向上させる。例示的には、本出願のキメラポリペプチド（例えば、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ））を発現する細胞は、第１の標的分子（例示的には、腫瘍抗原ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を発現する標的細胞と接触した後、第２の標的分子（例示的には、ＩＬ１３Ｒａ２）を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の転写調節を誘発することができる。これによって、第１の標的分子が腫瘍微小環境に存在する場合に限り、第２の標的分子を発現する腫瘍細胞の標的殺傷を達成し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍特異性を高める。それだけでなく、第１の標的分子と第２の標的分子を同時に発現する単一の標的細胞は、標的殺傷を開始するための必要な条件ではないため、本出願は、第２の標的分子を発現する標的細胞が第１の標的分子の発現を失うかまたは低下させることによって、標的細胞がエフェクター細胞の殺傷から逃れる現象を軽減することができる。特定の実施形態では、第１の標的分子の陽性率が低い場合、第１の標的分子を標的とするｓｙｎＮｏｔｃｈは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞を効果的に殺傷することができないが、本出願で提供される第１の標的分子を標的とするｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）は依然としてＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷することができる。

【0069】

本出願により提供される、結合によってＣＡＲ発現を誘発して調節するキメラポリペプチド（ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）など）は、標的分子の刺激がない場合にはＣＡＲを発現せず、ＣＡＲリン酸化も生じない。活性化されていない状態では、低レベルのＣＤ２５及びＣＤ６９発現が維持され、低枯渇状態では、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、及びＣＤ３９は低レベルの発現を維持し、分化が不十分な状態では、ほとんどの細胞がＴｓｃｍ細胞である。

【0070】

本出願によって提供される、結合によってＣＡＲ発現を誘発して調節するキメラポリペプチドは、ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞の殺傷の空間特異的調節を達成し、オフターゲット毒性を低減し、細胞の長期活性化によって引き起こされる機能不全を低減し、非特異的標的分子の活性化を低減し、高効率のウイルスパッケージングにより、工業的調製の困難さを軽減することができる。

【0071】

本出願はまた、そのような受容体、それらをコードする核酸、これらの核酸で遺伝的に修飾された宿主細胞を産生するための組成物及び方法、ならびに細胞活性を調節するための及び／または様々な健康状態（例えば疾患（例えば腫瘍））を治療するための方法も提供する。

【0072】

特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、細胞生物学、細胞培養、遺伝子治療、生化学、微生物学、組換えＤＮＡ、免疫学、遺伝学及び分子生物学の分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。これらの技術は文献で詳しく説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．ＡＵＳＵＢＥＬ，２０００，Ｗｉｌｅｙａｎｄ ｓｏｎＩｎｃ，Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ ＆ Ｍ．Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｓ．－ｉｎ－ｃｈｉｅｆ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特にＶｏｌｓ．１５４、１５５（Ｗｕｅｔａｌ．ｅｄｓ．）及びＶｏｌ．１８５，“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ＆ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄ ｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）及びＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照されたい。本明細書に記載のものと類似または同等のすべての方法及び材料は、本出願の実施または試験に使用することができ、適切な方法及び材料が本明細書に記載されている。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本明細書に準ずる。さらに、特に明記しない限り、本出願の材料、方法、及び実施例は例示のみを目的とするものであり、限定することを意図したものではない。本出願の内容から、当業者は、本出願の精神及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更または改変を行うことができ、依然として同じまたは類似の結果を得ることができることを理解するであろう。本出願の範囲は、本明細書に記載される特定の実施形態（これらは単に本出願の態様の例示として意図されている）に限定されず、機能的に同等の方法及びコンポーネントは本出願の範囲内にある。本出願は、本出願の主題を、さまざまな用途及び条件に応じて加える変形及び修正をカバーする。

【0073】

１．定義：
本明細書で使用される場合、「約」は、具体的な状況に応じて当業者に公知または認識可能であるか、または所定値の最大約±１％、±２％、±３％、±４％、±５％、±６％、±７％、±８％、±９％、±１０％、±１１％、±１２％、±１３％、±１４％、±１５％、±１６％、±１７％、±１８％、±１９％、±２０％、±２５％、±３０％の範囲内の変化を表すことができる。すなわち、「約」で表される範囲は、所定値±１％、所定値±２％、所定値±３％、所定値±４％、所定値±５％、所定値±６％、所定値±７％、所定値±８％、所定値±９％、所定値±１０％、所定値±１１％、所定値±１２％、所定値±１３％、所定値±１４％、所定値±１５％、所定値±１６％、所定値±１７％、所定値±１８％、所定値±１９％、所定値±２０％、所定値±２５％、所定値±３０％をカバーする。あるいは、特に生物学的システムまたは方法に関して、この用語は、値の約５倍以内または約２倍以内など、値の一桁内にあることを指してもよい。

【0074】

範囲：範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔にするためのものであり、本出願の範囲に対する不変の制限として解釈されるべきではない。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の値を具体的に開示したように考慮されるべきである。例えば、１から６までの範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲、及び、これらの範囲内の、例えば１、２、３、４、５、６などの特定の数値点を具体的に開示したとみなされるべきである。上記の原則は、記載された値の幅に関係なく同様に適用される。範囲の説明が使用される場合、当該範囲には範囲の端点が含まれる。

【0075】

「受容体」という用語は、細胞膜または細胞内に存在し、標的分子に結合して細胞内の一連の生化学反応を活性化し、細胞が外部の刺激に対して対応する効果を生み出すことができる特殊なタンパク質またはポリペプチドの一種を指す。受容体に結合する標的分子（生理活性物質とも呼ばれる）を総称してリガンド、または標的抗原と呼ぶ。

【0076】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞を含むがこれに限定されない免疫細胞によって発現され得る操作された分子を指す。ＣＡＲはＴ細胞で発現され、キメラ受容体によって決定される特異性でＴ細胞をリダイレクトして標的細胞の死滅を誘導できる。ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナルドメインを含む。細胞内シグナルドメインは、一次シグナルドメイン及び／または共刺激シグナルドメインを含む。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、または完全ヒトモノクローナル抗体に由来し得る。ＣＡＲという用語は、ＣＡＲ分子に特に限定されるものではなく、ＣＡＲ変異体も含む。ＣＡＲ変異体は、ＣＡＲの細胞外部分（例えば、リガンド結合部分）及び細胞内部分（例えば、細胞内シグナル伝達部分）が２つの別個の分子上に存在する分割ＣＡＲを含む。ＣＡＲ変異体はまた、例えば、分割ＣＡＲの２つの部分の条件的なヘテロ二量体化を薬物によって制御する分割ＣＡＲなど、条件的に活性化され得るＣＡＲであるＯＮスイッチＣＡＲ（ＯＮ－ｓｗｉｔｃｈ ＣＡＲ）も含む。ＣＡＲ変異体は、一次ＣＡＲの活性を増幅または阻害できる二次ＣＡＲ結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲも含む。ＣＡＲ変異体は、例えば二重特異性ＣＡＲシステムの成分として使用できる阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）も含み、ここで、二次ＣＡＲ結合ドメインの結合により一次ＣＡＲ活性化が阻害される。

【0077】

「操作される」という用語は、細胞生物学及び分子生物学の原理と方法を応用して、何らかの工学的手段を通じて細胞全体レベルまたは細胞小器官レベルで細胞内の遺伝物質を変更したり、細胞産物を取得したりすることを指す。操作された細胞は、追加、欠失、及び／または変更された遺伝子を含む細胞を指す場合もある。

【0078】

「細胞」または「操作された細胞」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物由来の細胞を指してもよい。

【0079】

「個体」及び「受験者」という用語は置き換えて使用することができ、ヒト、またはヒト、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、類人猿、サルを含むがこれらに限定されない他の種の動物を含む。

【0080】

「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外因性核酸の導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及びバイオリスティックを含む、当技術分野で知られている様々な手段によって達成することができる。

【0081】

「核酸」または「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指し、目的のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。前記核酸分子は、内因性核酸配列との実質的な同一性を維持する必要があるだけであり、内因性核酸配列と１００％相同または同一である必要はない。内因性配列との「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、一般に、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖にハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイゼーション」とは、様々なストリンジェントな条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列またはその一部の間で二本鎖分子の対が形成されることを指す。「相同性」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間の、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。「実質的な同一性」または「実質的な相同性」という用語は、参照アミノ酸配列または核酸配列と少なくとも約５０％の相同性または同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を指す。一例において、そのような配列は、比較としてのアミノ酸配列または核酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の相同性または同一性を有する。配列同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用することによって測定することができる。このようなソフトウェアは、さまざまな置換、欠失、及び／またはその他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって、同一または類似の配列を照合する。保存的置換には一般に、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン、リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンのグループ内の置換が含まれる。同一性の程度を決定する例示的な方法では、ＢＬＡＳＴプログラムを使用することができ、ここで、ｅ－３とｅ－１００の間の確率スコアは密接に関連した配列を示す。

【0082】

「単離された」という用語は、天然の状態から変化または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ものではないが、それと共に自然に存在する物質から部分的または完全に分離されている同じ核酸またはペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することも、宿主細胞などの非天然環境に存在することもある。

【0083】

「作動可能に連結された」という用語は、所望の様式で作動できるようにする２つ以上の配列（例えば、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列）間の物理的または機能的連結を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。通常、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要に応じて、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を結合する。

【0084】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は置き換えて使用でき、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。

【0085】

「免疫細胞の活性化」という用語は、免疫応答の開始につながる、シグナル伝達経路によって引き起こされる細胞内タンパク質発現の変化を指す。一例では、ＣＡＲが抗原に結合した後に形成される免疫シナプスには、結合受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８、ＣＤ３γ／ＣＤδ／ＣＤε／ＣＤζなど）近くの多くの分子の凝集が含まれる。この膜結合シグナル分子の凝集は、ＣＤ３分子に含まれるＩＴＡＭモチーフをリン酸化する。このリン酸化により、Ｔ細胞活性化経路が開始され、最終的にＮＦ－κＢやＡＰ－１などの転写因子が活性化される。これらの転写因子は、ＩＬ－２産生のアップレギュレーション、Ｔ細胞増殖の促進など、Ｔ細胞の全体的な遺伝子発現を誘導し、それによってＴ細胞媒介性免疫応答を開始する。「Ｔ細胞活性化」または「Ｔ細胞が活性化される」ことは、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生、及び／または検出可能なエフェクター機能を誘導するために刺激されたＴ細胞の状態を指す。一例では、前記免疫細胞は、特定の抗原を含む細胞と共インキュベートした後に活性化されるか、または前記免疫細胞はウイルスに感染した後に活性化される。

【0086】

「抗原」という用語は、腫瘍抗原及び病原体抗原を含むがこれらに限定されない、免疫応答を誘発する分子を指す。任意の腫瘍抗原が、本出願に記載される腫瘍関連実施形態において使用され得る（「実施例」及び「実施形態」は、本明細書において互換的に使用できる）。本出願における腫瘍抗原は、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；ＣＤ１７１；ＣＳ－１；Ｃ型レクチン様分子－１；ガングリオシドＧＤ３；Ｔｎ抗原；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ７０；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７Ｈ６；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ（ＩＬ－１３Ｒα）；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒα）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；がん胎児性抗原（ＣＥＡ）；ＮＹ－ＥＳＯ－１；ＨＩＶ－１ Ｇａｇ；ＭＡＲＴ－１；ｇｐ１００；チロシナーゼ；メソテリン；ＥｐＣＡＭ；プロテアーゼセリン２１（ＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）；段階特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＵＣ６；上皮成長因子受容体ファミリー及びその変異体（ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；ＬＭＰ２；ＥｐｈｒｉｎＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ；ＴＧＳ５；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ－アセチルＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体；腫瘍血管内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍血管内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；Ｃｌａｕｄｉｎ６、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．１；ＡＳＧＰＲ１；ＣＤＨ１６；５Ｔ４；８Ｈ９；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；ＣＡ９；カッパ軽鎖；ＣＳＰＧ４；ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０；ＦＡＰ；ＦＡＲ；ＦＢＰ；胎児性ＡｃｈＲ；ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２；ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥ３；ＫＤＲ；ＭＣＳＰ；ＮＫＧ２Ｄリガンド；ＰＳＣ１；ＲＯＲ１；Ｓｐ１７；ＳＵＲＶＩＶＩＮ；ＴＡＧ７２；ＴＥＭ１；フィブロネクチン；テネイシン；腫瘍壊死帯のがん胎児性変異体；Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドのヘキソース部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン作動性受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体遺伝子座Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；ＥＴＳ転座変異遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）；黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）；黒色腫精巣癌抗原２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）；Ｆｏｓ関連抗原１；ｐ５３変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座ブレークポイント；アポトーシスの黒色腫阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼセリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；Ｖ－ｍｙｃ鳥骨髄細胞腫ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ）；Ｔ細胞によって認識される扁平上皮がん抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹＴＥＳ１）；リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）；滑膜肉腫Ｘブレークポイント２（ＳＳＸ２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲ）；白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃタイプレクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン－３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）を含むが、これらに限定されない。病原体抗原は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫の抗原を含むが、これらに限定されない。ウイルス抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、またはインフルエンザウイルス抗原を含むが、これらに限定されない。

【0087】

「抗原結合ドメイン」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫分子の免疫学的に活性な部分を含む、抗原決定基に特異的に結合する分子を指し、すなわち、抗原に特異的に結合する（「免疫反応」）抗原結合部位を含む分子を指す。「抗体」という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗原結合能を保持している抗体分子の断片も含む。「抗体」という用語は、本出願では「免疫グロブリン」及び「抗原ドメイン」という用語と置き換えて使用できる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、天然抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、直鎖状抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖなど）、単一ドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。一例では、抗体は、ジスルフィド結合によって連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。ＣＨは、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＣＬはひとつの構造ドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分できる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の様々な細胞（例えば、免疫細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への結合を媒介する。抗原ドメインは、他の参照抗原（ポリペプチドまたは他の物質を含む）に結合するよりも高い親和性（親和力とも呼ばれる）で抗原に結合する場合、その抗原ドメインは、抗原に「特異的に結合する」、または抗原に対して「免疫反応性がある」。

【0088】

「治療有効量」、「治療有効」、「有効量」、または「有効量で」という用語は、本明細書では互換的に使用可能であり、本明細書に記載の特定の生物学的結果を達成するのに有効な化合物、製剤、物質または組成物、医薬組成物の量、例えば、限定されないが、Ｔ細胞応答を促進するのに十分な量または用量を指す。免疫細胞の有効量とは、抗腫瘍活性を増加、強化、または延長できる免疫細胞の数；抗腫瘍免疫細胞の数または活性化免疫細胞の数の増加；ＩＦＮ－γ分泌、腫瘍退縮、腫瘍縮小、及び腫瘍壊死を促進する免疫細胞の数を指すが、これらに限定されない。

【0089】

本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するために必要な細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。

【0090】

「内因性」という用語は、核酸分子またはポリペプチドなどが生物自体に由来することを指す。

【0091】

「外因性」という用語は、核酸分子またはポリペプチドが細胞内に内因的に存在しない、または発現レベルが過剰発現された場合の機能を達成するには不十分であることを指し、細胞内で発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドをカバーし、例えば、外因性、異種性及び過剰発現された核酸分子及びペプチドをカバーする。

【0092】

「認識」という用語は、標的抗原への選択的結合を指す。本出願における外因性受容体を発現する免疫細胞は、前記外因性受容体が特異的に結合する抗原を発現する細胞を認識することができる。

【0093】

「特異的に結合する」という用語は、サンプル中に存在する結合パートナー（例えば、腫瘍抗原）タンパク質を認識して結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体またはリガンドを指す。

【0094】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない多くのベクターが当技術分野で知られている。したがって、「ベクター」という用語は、自発的に複製するプラスミドまたはウイルスを含み、トランスポゾンベクター、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物も含む。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。

【0095】

「疾患」という用語は、腫瘍（がん）や病原体感染など、細胞、組織、または器官の正常な機能を損傷したり妨害したりするあらゆる状態を指す。難治性がんは、放射線療法に非感受性のがん、放射線療法後の再発のがん、化学療法に非感受性のがん、化学療法後の再発のがん、ＣＡＲ－Ｔ療法に非感受性のがんまたは治療後の再発のがんを含むが、これらに限定されない。

【0096】

「腫瘍」という用語は、細胞または組織の病理学的増殖、及びその後の他の組織または器官へのそれらの転移または浸潤を特徴とする疾患を指す。腫瘍細胞の増殖は通常制御されておらず進行性であり、遊走と接触阻害の喪失を特徴とする。腫瘍は、がんとその前がん病変を含む。腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはそれらの転移性病変を含む。

【0097】

「抗原発現の不均一性または抗原の不均一性」という用語は、細胞集団内の細胞が異なる抗原を発現すること、または同じ抗原が細胞集団の一部の細胞でのみ発現されることを意味する。

【0098】

２．キメラポリペプチド
本願のキメラポリペプチドは、標的分子（リガンド、標的抗原としても知られる）依存的に転写活性を調節する受容体である。本出願のキメラポリペプチドは、結合ドメイン、受容体調節ドメイン及び細胞内ドメインを含む、組換え型の非天然受容体である。

【0099】

一例では、キメラポリペプチドが標的分子に結合した後、前記キメラポリペプチドの加水分解が引き起こされて、細胞内ドメインが放出される。一例において、キメラポリペプチドが標的細胞の表面に提示された標的分子（例えば腫瘍抗原）に結合した後、前記キメラポリペプチドの加水分解が引き起こされて細胞内ドメインが放出される。例示的には、キメラポリペプチドが腫瘍細胞の表面上の腫瘍抗原に結合した後、細胞内のカスタム転写プログラムを調整する転写因子を調節する。

【0100】

本出願のキメラポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで：（ａ）標的分子に特異的に結合できる結合ドメイン、（ｂ）１つ以上の切断部位を含む受容体調節ドメイン、及びｃ）細胞内ドメインを含み、前記受容体調節ドメインの細胞外領域及び膜貫通領域が同時にＮｏｔｃｈに由来するものではなく、前記結合ドメインと前記標的分子との結合が、前記受容体調節ドメインの切断を誘導し、前記細胞内ドメインを放出することができる。標的分子に特異的に結合することができる結合ドメイン及び細胞内ドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに対して異種である。

【0101】

本願のキメラポリペプチドは、既存のＳｙｎＮｏｔｃｈ受容体よりも優れた転写調節活性を有し、操作化のためによりモジュール化されたプラットフォームを提供する。既存のＳｙｎＮｏｔｃｈ受容体は、リガンド結合ドメイン（一本鎖抗体やナノボディなど）を使って操作できるが、ＳｙｎＮｏｔｃｈ受容体上の受容体／リガンドの天然の細胞外ドメインを使用することは困難である。本出願のキメラポリペプチドは、他のタイプのリガンド結合ドメインと一緒に使用することに適しており、それによって疾患及び組織を標的とする可能性が広がる。

【0102】

２．１ 受容体調節ドメイン
キメラポリペプチドの受容体調節ドメインは、細胞外領域及び膜貫通領域（膜貫通ドメインとしても知られる）を含む。受容体調節ドメインは、Ｉ－ＣＬｉＰ（膜内切断プロテアーゼ）酵素切断部位またはシェダーゼプロテアーゼ切断部位から選択される１つ以上のリガンド誘導性タンパク質加水分解切断部位を含む。Ｉ－ＣＬｉＰｓは、膜貫通タンパク質の膜貫通領域上の特定の部位の加水分解を触媒できる膜貫通切断プロテアーゼである。一例では、前記Ｉ－ＣＬｉＰはγ－セクレターゼ切断部位を含む。一例では、前記γ－セクレターゼ切断部位は、Ｇｌｙ－Ｖａｌジペプチド配列のγ－セクレターゼ切断部位を含む。一例では、前記シェダーゼプロテアーゼは、ＢＡＣＥ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１７、ＭＴ１－ＭＭＰ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0103】

一例において、受容体調節ドメインは、膜貫通領域に位置する１つ以上のリガンド誘導性タンパク質加水分解切断部位を含み、前記切断部位は、Ｉ－ＣＬｉＰ酵素切断部位から選択される。一例において、細胞外領域は、１つ以上のリガンド誘導性シェダーゼタンパク質加水分解切断部位を含み、膜貫通領域は、Ｉ－ＣＬｉＰｓ酵素切断部位を含む。一例では、細胞外領域の切断部位はシェダーゼプロテアーゼ切断部位である。一例では、膜貫通領域はＩ－ＣＬｉＰｓ酵素切断部位を含む。

【0104】

一例において、細胞外領域は１つ以上の切断部位を含む。一例では、膜貫通領域は１つ以上の切断部位を含む。一例において、細胞外領域は１つ以上の切断部位を含み、膜貫通領域は１つ以上の切断部位を含む。一例では、細胞外領域は切断部位を含まない。一例では、膜貫通領域は１つ以上の切断部位を含む。一例では、細胞外領域は切断部位を含まず、膜貫通領域は１つ以上の切断部位を含む。

【0105】

２．１．１ 膜貫通領域
一例において、膜貫通領域は、少なくとも１つのγ－セクレターゼ切断部位を含む単回膜貫通受容体膜貫通領域である。一例では、膜貫通領域は、ＣＬＳＴＮ１、ＣＬＳＴＮ２、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＬＲＰ８、ＡＰＰ、ＢＴＣ、ＴＧＢＲ３、ＳＰＮ、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＤＣＣ、ＤＬＬ１、ＤＳＧ２、ＤＡＧ１、ＣＤＨ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ４、ＥＰＨＢ２、ＥＦＮＢ１、ＥＦＮＢ２、ＥｒｂＢ４、ＧＨＲ、ＨＬＡ－Ａ及びＩＦＮＡＲ２の膜貫通領域を含むが、これらに限定されず、ここで、膜貫通領域は少なくとも１つのγ－セクレターゼ切断部位を含む。一例では、膜貫通領域は、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＮＳＲ、ＥＲＮ１、ＥＲＮ２、ＪＡＧ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３、ＫＣＮＥ４、ＫＬ、ＣＨＬ１、ＰＴＰＲＦ、ＳＣＮ１Ｂ、ＳＣＮ３Ｂ、ＮＰＲ３、ＮＧＦＲ、ＰＬＸＤＣ２、ＰＡＭ、ＡＧＲ、ＲＯＢＯ１、ＳＯＲＣＳ３、ＳＯＲＣＳ１、ＳＯＲＬ１、ＳＤＣ１、ＳＤＣ２、ＳＰＮ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＶＡＳＮ、ＦＬＴ１、ＣＤＨ５、ＰＫＨＤ１、ＮＥＣＴＩＮ１、ＰＣＤＨＧＣ３、ＮＲＧ１、ＬＲＰ１Ｂ、ＣＤＨ２、ＮＲＧ２、ＰＴＰＲＫ、ＳＣＮ２Ｂ、Ｎｒａｄｄ、及びＰＴＰＲＭ膜貫通領域を含むが、これらに限定されない。

【0106】

一例では、膜貫通領域は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、アフリカツメガエル、またはガルス）からのＮｏｔｃｈ１膜貫通領域、Ｎｏｔｃｈ２膜貫通領域、Ｎｏｔｃｈ３膜貫通領域、またはＮｏｔｃｈ４膜貫通領域を含む。一例では、膜貫通領域は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１０２、１０３または１０４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性または同一性の断片、及び／または任意選択で、異なるアミノ酸残基で置換される最大１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。一例では、配列番号１３、１４、１５、１７、１８、１９、１０２、１０３または１０４における「ＧＶ」以外のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基に置換される。

【0107】

一例では、膜貫通領域は、ヒトまたは非ヒト動物に由来するＡＰＬＰ１膜貫通領域またはＡＰＬＰ２膜貫通領域を含む。一例において、膜貫通領域は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性または同一性の断片、及び／または任意選択で、異なるアミノ酸残基で置換される最大１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。

【0108】

一例において、膜貫通領域のカルボキシル末端は、移送停止配列（ストップトランスファー配列、ｓｔｏｐ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＴＳ）を含む。ＳＴＳはキメラポリペプチドの細胞内ドメインを連結し、小胞体の内腔への侵入を防ぐ。一例において、ＳＴＳは、約４～１０個の残基、例えば、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基を含む。一例では、ＳＴＳは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＣＬＳＴＮ１、ＣＬＳＴＮ２、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＤＡＧ１、ＧＨＲ、ＰＴＰＲＦ、ＡＧＲ、ＫＬ、ＮＲＧ１、ＬＲＰ１Ｂ、Ｊａｇ２、ＥＰＣＡＭ、ＫＣＮＥ３、ＣＤＨ２、ＮＲＧ２、ＰＴＰＲＫ、ＢＴＣ、ＥＰＨＡ３、ＩＬ１Ｒ２、またはＰＴＰＲＭのＳＴＳ配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。一例では、ＳＴＳは、最初の４残基におけるＬｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）のみを含む配列を含む。一例では、ＳＴＳは、配列番号２２、２３、２４、２５または２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性または同一性の断片、及び／または任意選択で、異なるアミノ酸残基で置換される最大１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。

【0109】

２．１．２ 細胞外ドメイン
一例では、細胞外領域は、Ｊａｇｇｅｄ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＡＰＬＰ１、ＡＰＬＰ２、ＡＰＰ、ＣＤ４４、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、Ｄｅｌｔａ１、Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈｒｉｎＢ１、成長ホルモン受容体、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＦＮａＲ２、ＩＬ１Ｒ２、Ｌ１、ＬＲＰ、ＬＲＰ２、ＬＲＰ６、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、ネクチン１α、ＮＲＡＤＤ、ｐ７５－ＮＴＲ、Ｐｃｄｈ α４、Ｐｃｄｈ γ－Ｃ３、ＰＴＰκ、ＰＴＰ－ＬＡＲ、ＳｏｒＣＳ１ｂ、ＳｏｒＬＡ、ソルチリン、ＡｐｏＥＲ２、ＰＫＨＤ１、ＥｒｂＢ４、ＩＦＮａＲ２、ＶＥＧＦ－Ｒ１、またはＶＬＤＬＲの細胞外の完全長、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の断片もしくはその切断型もしくは切断された構造、または上記タンパク質のいずれかの細胞外領域の変異体を含む。一例において、上記タンパク質の細胞外領域は全長である。一例において、キメラポリペプチドの受容体調節ドメインの細胞外領域は、それぞれ、上述のＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣまたはＪａｇｇｅｄ２細胞外領域の全長を含み、前記キメラポリペプチドは、標的分子に特異的に結合した後にキメラポリペプチドの切断を誘発し、細胞内ドメインを放出することができる。

【0110】

本出願に係るタンパク質細胞外領域の断片とは、完全な細胞外領域を含まれず、タンパク質細胞外領域の一部のみを含むものである。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域断片を含むキメラポリペプチドは、標的分子に特異的に結合した後、前記キメラポリペプチドの切断を引き起こし、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインを放出する。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域フラグメントは、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２３及びＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３など、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域内の潜在的なＡＤＡＭ１０切断部位を除去した後のフラグメントを含む。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域フラグメントは、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ１などのＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域のＮ末端付近を除去したフラグメントを含む。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域フラグメントは、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３などのＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域のＣ末端付近を除去したフラグメントを含む。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域フラグメントは、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２などのＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域の中間配列を除去したフラグメントを含む。一例において、上記のＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３、またはＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２３からなる受容体調節ドメインの細胞外領域をそれぞれ含むキメラポリペプチドはいずれも、標的分子に特異的に結合した後、前記キメラポリペプチドの切断を引き起こし、細胞内ドメインを放出することができる。

【0111】

本出願に係るタンパク質の細胞外領域の変異体とは、タンパク質の細胞外領域の全アミノ酸のアミノ酸配列の一部に変異、欠失又は付加が含まれるものを意味する。一例において、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域の変異体から構成される受容体調節ドメインの細胞外領域を含むキメラポリペプチドは、標的分子に特異的に結合した後、前記キメラポリペプチドの切断を引き起こし、細胞内ドメインを放出する。一例において、Ｊａｇｇｅｄ２の細胞外領域の変異体から構成される受容体調節ドメインの細胞外領域を含むキメラポリペプチドは、標的分子に特異的に結合した後、前記キメラポリペプチドの切断を引き起こし、細胞内ドメインを放出する。

【0112】

本出願に係るタンパク質の細胞外領域のトランケート構造または切断型とは、タンパク質の細胞外領域のすべてのアミノ酸断片から一部のアミノ酸断片を切断したものをいう。一例では、切断型ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ１、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３、またはＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２３から構成される受容体調節ドメインの細胞外領域をそれぞれ含むキメラポリペプチドはいずれも、標的分子に特異的に結合した後、前記ポリペプチドの切断を引き起こし、細胞内ドメインを放出することができる。

【0113】

本出願では、タンパク質細胞外領域の断片、変異体、またはトランケート構造（切断型または切断体としても知られる）は、互換的に使用される場合があり、タンパク質細胞外領域の断片、変異体、またはトランケート構造（切断型または切断体とも呼ばれる）は、タンパク質細胞外領域の配列と比較して、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する。一例において、前記トランケート構造のアミノ酸配列は、配列番号５、７、９、及び１１に示される。

【0114】

本出願の特定の実施形態では、タンパク質の細胞外領域の断片、変異体またはトランケート構造（切断型にも呼ばれる）は、ＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域が除去または変異された、ＡＤＡＭ１０により切断した潜在的な部位である。

【0115】

一例では、細胞外領域は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、シロホオテナガザル、ボノボ、スマトラオランウータン、チンパンジー、ゴリラ、ウサギ、ペルーナイトザル、マーモセット、カンムリキツネザル、小耳グレーターガラゴ、マウス、ラット、ウシ、アフリカツメガエル）のＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域の全長またはその切断型を含む。一例では、細胞外領域は、Ｊａｇｇｅｄ２の細胞外領域の全長またはその切断型を含む。一例では、細胞外領域は、切断部位を含むＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域を含む。一例では、細胞外領域は、切断部位を含まないＥｐｈｒｉｎＢ２の細胞外領域を含む。一例において、細胞外領域は、配列番号１、３、５、７、９または１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性もしくは同一性の断片、及び／または任意選択で、異なるアミノ酸残基で置換される最大１、２、３、４、５またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。

【0116】

一例では、受容体調節ドメインは、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ３膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ３膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外ドメイン／Ｎｏｔｃｈ３膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ３膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ４膜貫通領域膜領域（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（ＡＰＬＰ２ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域／Ｎｏｔｃｈ１膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（ＡＰＬＰ２ＳＴＳ）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域／ＡＰＬＰ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）を含む。本明細書では、膜貫通領域がＮｏｔｃｈ１膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）であることは、この膜貫通領域にはＮｏｔｃｈ１膜貫通領域とＮｏｔｃｈ１のＳＴＳ部分が含まれることを意味し、膜貫通領域がＮｏｔｃｈ１膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）であることは、この膜貫通領域にはＮｏｔｃｈ１膜貫通領域が含まれているが、ＳＴＳ部分はＮｏｔｃｈ２ＳＴＳを使用していることを意味し、膜貫通領域がＮｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）であることは、膜貫通領域にはＮｏｔｃｈ４膜貫通領域とＮｏｔｃｈ１ＳＴＳが含まれることを意味し、残りの説明は類推される。

【0117】

例示的には、キメラポリペプチドｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣは、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域フラグメント（配列番号１）及びＮｏｔｃｈ１膜貫通領域（配列番号１３）から構成される受容体調節ドメインを含む。一例では、キメラポリペプチドｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣの受容体調節ドメインは、配列番号２８に示される配列を含む。

【0118】

例示的に、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣは、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ１膜貫通領域（配列番号１３）から構成される受容体調節ドメイン、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号３、４）及びＮｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）（配列番号１０２）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）（配列番号１０３）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）（配列番号１０４）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（配列番号１４）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ３膜貫通ドメイン（配列番号１５）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びＮｏｔｃｈ４膜貫通ドメイン（配列番号１６）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びヒトＮｏｔｃｈ１膜貫通ドメイン（配列番号１７）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びヒトＮｏｔｃｈ２膜貫通ドメイン（配列番号１８）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びヒトＮｏｔｃｈ３膜貫通ドメイン（配列番号１９）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びヒトＮｏｔｃｈ４膜貫通ドメイン（配列番号２０）、またはＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号１、３、５、７、９または１１）及びヒトＡＰＬＰ２膜貫通ドメイン（配列番号２１）構成される受容体調節ドメインを含む。一例では、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣの受容体調節ドメインは、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３７、３８、３９、４０、４１または８５に示される配列を含む。

【0119】

キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）は、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域フラグメント（配列番号３）及びＡＰＬＰ２膜貫通領域（配列番号２１）から構成される受容体調節ドメインを含む。一例において、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）の受容体調節ドメインは、配列番号３６に示される配列を含む。

【0120】

一例では、キメラポリペプチドに含まれる受容体調節ドメインは、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または８５に示される配列のいずれか１つと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を有する。

【0121】

キメラポリペプチドの受容体調節ドメインは短いため、ウイルスのパッケージングと発現に有益であり、工業的な生産と調製の困難さが軽減される。キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）のコード配列の全長は、ｓｙｎＮｏｔｃｈコード配列の全長より短く、完全なキメラポリペプチドを含む最終的に調製されたベクターは、細胞への形質導入効率が高く、工業的生産及び調製の困難さを軽減する。

【0122】

一例において、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）は、それらが結合して調節を引き起こす遺伝子とは同じベクターに配置されず、すなわちデュアルベクターシステムとなる。一例では、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）及びそれらが結合して調節を引き起こす遺伝子は、同じベクターに配置され、すなわち単一ベクターシステムとなる。一例において、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）単一ベクターシステムの感染効率は、ｓｙｎＮｏｔｃｈの感染効率よりも高く、工業的生産及び調製の困難さを軽減する。一例では、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ単一ベクターシステムの感染効率はｓｙｎＮｏｔｃｈの感染効率よりも約１．５倍高く、これにより工業的な生産及び調製の困難さが軽減される。

【0123】

ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して、キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌに誘導された転写調節の漏洩発現のレベルが有意に低くなる。キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｉｎＢ２ＥＣ－Ｄｅｌ３は、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して、誘導発現のストリンジェンシーと強い誘導能力を併せ持つ。キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｉｎＢ２ＥＣ－Ｄｅｌ３は、同じ標的分子の異なる発現レベルをよりよく区別でき、正常組織では発現が低いが腫瘍組織では発現が高い標的分子を同定するのに適しており、正常組織でのオフターゲットを引き起こしにくい。キメラポリペプチドｓｙｎＥｐｈｉｎＢ２ＥＣ－Ｄｅｌ３は、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して遺伝子発現をより厳密に調節し、低発現の標的分子に対する感受性が低く、腫瘍で高発現し、正常組織で低発現の標的分子を標的とする場合、ｓｙｎＥｐｈｉｎＢ２ＥＣ－Ｄｅｌ３は腫瘍組織に対する選択性がより高く、より安全である。

【0124】

２．２ 細胞内ドメイン
本出願のキメラポリペプチドは、キメラポリペプチドが標的分子に結合した後に加水分解によって放出される細胞内ドメインを含む。

【0125】

本願のキメラポリペプチドの細胞内ドメインは、以下のタンパク質：
転写因子（転写活性化タンパク質及び転写抑制タンパク質を含む）、転写補助活性化タンパク質、転写補助抑制タンパク質、ＤＮＡ結合ポリペプチド、ＲＮＡ結合ポリペプチド、翻訳調節ポリペプチド、ホルモン、サイトカイン、毒素、抗体、クロマチン調節因子、自殺タンパク質（ｓｕｉｃｉｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、オルガネラ特異的ポリペプチド（例えば、核孔調節因子、ミトコンドリア調節因子、小胞体調節因子など）、アポトーシス促進ポリペプチド、抗アポトーシスポリペプチド、他のメカニズムを通じて細胞死を促進するその他のポリペプチド、増殖促進ポリペプチド、抗増殖ポリペプチド、免疫共刺激ポリペプチド、部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、抑制性免疫受容体、活性化免疫受容体、Ｃａｓ９及びＲＮＡ標的ヌクレアーゼの変異体、ＤＮＡ認識ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、分化を促進するポリペプチドのいずれかから選択されるタンパク質断片またはそれらの組み合わせを含む。

【0126】

本出願のキメラポリペプチドの細胞内ドメインは、プロモーター駆動型ＤＮＡ配列の転写を促進または阻害する転写活性化タンパク質を含む。一例では、転写因子は細胞分化を直接調節する。一例では、転写因子は、第２の転写因子の発現を調節することによって細胞分化を間接的に調節する。転写因子は転写活性化タンパク質または転写抑制タンパク質である。一例では、転写因子は転写抑制タンパク質である。一例では、転写因子は転写活性化タンパク質である。一例では、転写因子は核局在化シグナルも含む。一例では、転写因子は、Ｇａｌ４－ＶＰ１６、Ｇａｌ４－ＶＰ６４、ｔｅｔＲ－ＶＰ６４、ＺＦＨＤ１－ＶＰ６４、Ｇａｌ４－ＫＲＡＢ、及びＨＡＰ１－ＶＰ１６から選択される。一例では、転写因子はＧａｌ４である。一例では、転写因子はＧａｌ４－ＶＰ６４である。

【0127】

場合によっては、本出願のキメラポリペプチドの細胞内ドメインによって誘導される抗体は、疾患（免疫疾患、腫瘍を含む）を治療するために使用される治療用抗体である。

【0128】

一例では、前記細胞内ドメインは、以下のタンパク質：転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、抑制性免疫受容体、活性化免疫受容体のいずれかから選択されるタンパク質断片またはそれらの組み合わせを含む。一例では、前記転写活性化タンパク質は、ＧＬＡ４、ＧＬＡ４－ＶＰ６４、またはそれらの断片を含む。一例では、前記転写活性化タンパク質は、配列番号２７に示されるものと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0129】

一例では、部位特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ポリペプチドである。一例では、細胞内ドメインはリコンビナーゼである。一例では、細胞内ドメインは抑制性免疫受容体である。一例では、細胞内ドメインは活性化免疫受容体である。

【0130】

一例では、キメラポリペプチドは、配列番号２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１または８５がそれぞれ配列番号２７と順に連結したアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0131】

２．３ 結合ドメイン（結合ペプチドとも呼ばれる）
キメラポリペプチドは、標的分子に特異的に結合する結合ドメインを含む。一例において、本明細書に開示されるキメラ受容体の結合ドメインは、１つ以上の標的分子に特異的に結合する。一例において、キメラポリペプチドは、結合ドメインと受容体構造調節ドメインとの間に介在するリンカーを含む。前記結合ドメインは、抗体、抗原、リガンド、受容体、標的（例えば、タグＦＬＡＧ）、Ｆｃ受容体、細胞外マトリックス成分、細胞接着分子、非抗体分子足場、またはそれらの組み合わせを含む。

【0132】

一例では、キメラポリペプチドの結合ドメインは抗原結合ドメインを含む。一例において、抗原結合ドメインは、抗体、受容体、細胞接着分子、非抗体分子足場、またはそれらの組み合わせから選択される。一例では、抗原結合ドメインは、抗体に基づく認識足場を含む。一例では、抗原結合ドメインは抗体を含む。一例において、抗原結合ドメインに含まれる抗体は、腫瘍抗原、疾患関連抗原、または細胞外マトリックス成分に特異的に結合する。一例において、抗原結合ドメインに含まれる抗体は、細胞表面抗原、可溶性抗原、または不溶性基質上に固定化された抗原に特異的に結合する。一例では、抗原結合ドメインは単鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。一例において、抗原結合ドメインに含まれる抗体は、複数の抗原に特異的に結合できる。一例において、抗原結合ドメインは、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ミニ抗体、またはそれらの組み合わせを含む。一例において、抗原結合ドメインは、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン、アビマー、親和体、アンチカリン、またはアフィリンなどの非抗体ベースの認識足場である。一例では、抗体は、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ミニ抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）ｖフラグメント、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及びその機能的フラグメントまたはそれらの組み合わせである。

【0133】

一例において、結合ドメインは、内因性抗原及び外因性抗原などの抗原を含む。一例では、結合ドメインは受容体のリガンドを含む。一例では、結合ドメインは受容体を含む。一例では、結合ドメインは細胞接着分子（例えば、細胞接着分子の細胞外ドメインの全部または一部）を含む。一例では、結合ドメインは重合ドメインの一部を含む。

【0134】

一例において、結合ドメインは、１．定義の用語「抗原」に記載される腫瘍抗原及び／または病原体抗原に特異的に結合する。一例において、結合ドメインは、１．定義の用語「抗原」に記載される腫瘍抗原及び／または病原体抗原に特異的に結合する抗体を含む。一例では、結合ドメインに含まれる抗体は、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する。一例では、結合ドメインは、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する抗体ＶＨもしくはＶＬまたはｓｃＦＶを含む。一例では、前記結合ドメインは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１０１に示されるものと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0135】

一例では、キメラポリペプチドは、配列番号５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、６１、７３、８７、１０５、１０６、１０８または１１０に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。

【0136】

２．４ 標的分子
本出願のキメラポリペプチドに結合する標的分子は、リガンドまたは標的抗原とも呼ばれる。

【0137】

標的分子は膜結合していてもよい。標的分子は細胞表面に存在することができる。標的分子は、不溶性基材（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ポリカーボネート、ニトロセルロースなど）上に固定化することができる。標的分子は可溶性であってもよい。標的分子は、細胞外環境（例えば、細胞外マトリックス）に存在し得る。標的分子は人工マトリックス中に存在し得る。標的分子は非細胞環境に存在し得る。標的分子は、例えばプレート、組織培養用ディッシュ、カラムなどのさまざまな形で不溶性支持体上に存在することができる。標的分子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に存在し得る（例えば、抗原はＥＣＭ成分である）。標的分子は人工マトリックス中に存在し得る。標的分子は非細胞環境に存在し得る。標的分子は、ポリペプチド、核酸、糖タンパク質、小分子、炭水化物、脂質、糖脂質、リポタンパク質、及びリポ多糖を含む。一例では、標的分子は、分化マーカークラスター、細胞表面受容体、接着タンパク質、インテグリン、ムチン、レクチン、及び腫瘍抗原から選択される。

【0138】

一例では、標的分子は分化（ＣＤ）マーカークラスターである。いくつかの実施形態では、ＣＤマーカーは、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５９、ＣＤ６６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ１３４、ＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲ４）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５８、ＣＤ１７８、ＣＤ１８１（ＣＸＣＲ１）、ＣＤ１８２（ＣＸＣＲ２）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ２１０、ＣＤ２４６、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ＣＤ２７９、ＣＤ２９５、ＣＤ３３９（ＪＡＧ１）、ＣＤ３４０（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ２、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、ＭＡＧＥ、アルカリホスファターゼ、胎盤様２（ＡＬＰＰＬ２）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）からなる群から選択される。

【0139】

一例では、標的分子は抗原である。一例では、標的分子は、腫瘍抗原及び／または病原体抗原を含む。一例では、腫瘍抗原は、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３、ＡＬＰＰＬ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２４６、ＣＤ２７２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４６、ＣＤ７１、ＣＤ９７、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＥＣＬ１、ＣＳ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＬＴ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＩＧＬＬ１、ＩＬ １１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ １１７、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ｂ、ＰＲＳＳ２１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＩＲＰａ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＡＬＰＩ、ｃＭｅｔ、及びＡｘｌから選択される。

【0140】

一例では、キメラポリペプチドとその転写によって発現を調節するＣＡＲは、それぞれ異なる腫瘍抗原を認識する。

【0141】

抗原不均一性を伴う腫瘍の治療では、第１の標的分子（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の陽性細胞の割合（つまり、陽性率）が低く、第２の標的分子（例えば、ＩＬ１３Ｒａ２）の陽性率が高い。そのような腫瘍細胞は、第１の標的分子を標的とする治療を回避し、それによって治療有効性が低下する。第２の標的分子の広範な発現により、第２の標的分子を標的とする治療はオフターゲット毒性を引き起こす可能性がある。一例において、本出願は、第１の標的分子に結合して転写調節を引き起こし、第２の標的分子の外因性受容体の発現を認識するキメラポリペプチドを構築し、第２の標的分子を発現し、第１の標的分子を部分的に発現する腫瘍細胞の特異的かつ広範な殺傷を実現する。一例では、第２の標的分子を標的とするＣＡＲの殺傷効果は、第１の標的分子に結合するキメラポリペプチドの転写調節活性の誘発に依存する。すなわち、殺傷効果には、環境中に第１の標的分子と第２の標的分子の存在が必要である。第１の標的分子に結合するキメラポリペプチド（ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ））を使用して第２の標的分子を標的とする外因性受容体（ＣＡＲなど）の発現を誘発及び調節することは、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して、前記キメラポリペプチドによって転写・調節されるＣＡＲ－Ｔ細胞の、第１の標的分子の不均一な発現を伴う腫瘍に対する抗腫瘍効果を有意に改善することができる。

【0142】

標的分子の不均一性を伴う腫瘍の治療では、第１の標的分子（例えば、メソテリン）が高度に発現するが、正常組織でも発現し、第２の標的分子（例えば、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２）が高度に発現するが、他の正常組織でも発現するため、第１の標的分子または第２の標的分子を単独で標的にすると、オフターゲット毒性が生じる。一例では、第１の標的分子に特異的に結合するキメラポリペプチド（ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ））を使用して第２の標的分子を標的とする外因性受容体の発現の転写調節を誘発することは、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して、前記キメラポリペプチドの結合によって転写・調節されるＣＡＲ－Ｔ細胞の、第１及び第２の標的分子の不均一な発現を伴う腫瘍に対する抗腫瘍効果を有意に改善することができる。一例では、第２の標的分子に特異的に結合するキメラポリペプチド（ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ））を使用して第１の標的分子を標的とする外因性受容体の発現を誘発して調節することは、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して、前記キメラポリペプチドの結合によって誘発調節されるＣＡＲ－Ｔ細胞の、第１及び第２の標的分子の不均一な発現を伴う腫瘍に対する抗腫瘍効果を有意に改善することができる。

【0143】

一例では、治療に使用される細胞は、ＣＡＲによって標的化される第２の標的分子を発現し、その後、第２の標的分子を標的とする治療により、培養プロセス中に細胞が互いに殺し合い、前記細胞の活性及び生産に影響を与える。一例では、第１の標的分子に特異的に結合するキメラポリペプチドは、第２の標的分子を標的とするＣＡＲの発現の転写調節を引き起こすために使用され、前記細胞は腫瘍細胞上の第１の標的分子に特異的に結合した後、前記細胞内の第２の標的分子を標的とする外因性受容体の発現の転写調節を誘発し、第２の標的分子を発現する腫瘍細胞を殺傷し、及び／または第２の標的分子を発現する宿主免疫細胞を攻撃して、前記細胞の生存と増殖を増加させ、抗腫瘍活性をさらに向上させる。一例では、前記第２の標的分子は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣなどのＮＫＧ２受容体ファミリー；ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、１５ ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２／Ｓ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１などのキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリー；ＮＫＰ３０、ＮＫＰ４４、ＮＫＰ４６、ＮＫｐ８０などの天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）；及び、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ９４、ＣＤ１５８、ＣＤ５６、ＬＩＲ／ＩＬＴ２、ＣＤ２４４、ＣＤ２２６、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ１６１、ＴＩＧＩＴ、ＣＳ１などのその他のＮＫ細胞特異的発現抗原から選択されるＮＫ細胞マーカーを含む。一例では、白血病細胞（例えば、ＣＬＬ１、ＣＤ１２３）の第１の標的分子に特異的に結合するキメラポリペプチドを使用して、ＮＫＧ２Ｄを標的とする外因性受容体の発現の転写調節を誘発し、それによって腫瘍細胞を殺傷する。

【0144】

一例において、標的分子は、炎症性疾患関連分子であり、これには、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ミオスタチン、ＯＸ－４０、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－α、及びＶＥＧＦ－Ａが含まれるが、これらに限定されない。

【0145】

２．５． キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子
キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化または阻害される転写制御エレメントに作動可能に連結される。一例において、調節される遺伝子は、ＧＡＬ－４、ｔｅｔＲ、ＺＦＨＤ１、ＨＮＦ１Ａ、またはＨＡＰ１によって調節されるプロモーターの制御下で発現される。一例では、調節される遺伝子発現産物は、非コードＲＮＡ、サイトカイン、サイトトキシン、ケモカイン、免疫調節因子、アポトーシス促進因子、抗アポトーシス因子、ホルモン、分化因子、脱分化因子、修飾ＴＣＲ、ＣＡＲ、レポーター遺伝子またはそれらの組み合わせから選択される。

【0146】

一例において、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子は、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、サイトカイン受容体、分化因子、成長因子、成長因子受容体、ホルモン、代謝酵素、増殖誘導物質、受容体、小分子セカンドメッセンジャー合成酵素、Ｔ細胞受容体、転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、翻訳調節因子、翻訳活性化タンパク質、翻訳抑制タンパク質、活性化免疫受容体、アポトーシス阻害剤、アポトーシス誘導因子、免疫活性化因子、免疫抑制剤及び抑制性免疫受容体を含むが、これらに限定されない。

【0147】

一例では、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子は、転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、ＣＡＲ、第２のキメラポリペプチド、翻訳調節因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、または抗体分子を含むがこれらに限定されない。一例において、前記転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、外因性受容体、第２のキメラポリペプチド、翻訳調節因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、抗体分子をコードする核酸配列またはそれらの組み合わせは、転写制御エレメントに作動可能に連結されており、この転写制御エレメントは、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化または阻害される。一例では、前記転写制御エレメントはＵＡＳ（上流活性化配列、ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み、その配列は配列番号４８に示される。一例では、キメラポリペプチドの細胞内ドメインはＧＡＬ４－ＶＰ６４を含み、その配列は配列番号２７に示され、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子の核酸配列はＵＡＳに作動可能に連結され、その配列は配列番号４８に示される。一例において、キメラポリペプチドの細胞内ドメインはＧＡＬ４－ＶＰ６４を含み、その配列は配列番号２７に示され、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子の核酸配列はＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、その配列は配列番号４９に示される。

【0148】

一例において、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子は、外因性サイトカインまたはＣＡＲを含む。一例において、前記外因性サイトカイン核酸配列は、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化または阻害される転写制御エレメントに作動可能に連結される。一例では、細胞内のキメラポリペプチドが標的分子に結合した後に受容体の加水分解を引き起こし、受容体が切断されて細胞内ドメインが放出され、細胞が、インターフェロン（α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン）、インターロイキン（ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２；ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２４）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β、ＴＲＡＩＬ、ＭＩＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＭＣＰ－１、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＲ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１６、ＭＣＳＦが含まれるサイトカインまたはケモカインの発現を誘導させる。一例では、前記サイトカインには、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＣＣＬ２１、またはそれらの組み合わせが含まれる。

【0149】

一例において、サイトカインＩＬ１２核酸配列は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化される転写制御エレメントに作動可能に連結される。ＩＬ１２サブユニットＰ３５のＧＥＮＥ ＩＤ：３５９２、サブユニットＰ４０のＧＥＮＥ ＩＤ：３５９３である。一例において、ＩＬ１２は、配列番号５８に示される配列を含む。

【0150】

一例では、細胞内の前記キメラポリペプチドは、標的分子に結合した後に受容体の加水分解を引き起こし、受容体が切断され、細胞内ドメインを放出させ、細胞によるＣＡＲまたは修飾ＴＣＲの発現を誘導する。前記ＣＡＲまたは修飾ＴＣＲの核酸配列は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化または阻害される転写制御エレメントに作動可能に連結される。一例では、ＣＡＲまたは修飾ＴＣＲは、腫瘍抗原、がん細胞関連抗原、血液悪性腫瘍抗原、固形腫瘍抗原、細胞表面抗原、細胞内抗原などを特異的に認識する。

【0151】

一例では、第１の標的分子と第２の標的分子は異なり、それぞれ：１）血液腫瘍抗原：ＣＤ１９（Ｂ細胞で発現）、ＣＤ２０（Ｂ細胞で発現）、ＣＤ２２（Ｂ細胞で発現）、ＣＤ３０（Ｂ細胞で発現）、ＣＤ３３（骨髄細胞で発現）、ＣＤ７０（Ｂ細胞／Ｔ細胞で発現）、ＣＤ１２３（骨髄細胞で発現）、κ（Ｂ細胞で発現）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（骨髄細胞で発現）、ＮＫＧ２Ｄリガンド（骨髄細胞で発現）、ＲＯＲ１（Ｂ細胞で発現）、ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１（骨髄腫細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞及びほとんどのＢ細胞で発現）、ＣＤ１３８（多発性骨髄腫の悪性形質細胞で発現）、ＣＤ５６（骨髄腫細胞、神経細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、及び小柱骨芽細胞で発現）、ＣＤ３８（Ｂ細胞／Ｔ細胞で発現）、及びＣＤ１６０（ＮＫ細胞／Ｔ細胞で発現）など；２）固形腫瘍抗原：Ｂ７Ｈ３（悪性腫瘍及び神経膠腫で発現）、ＣＡＩＸ（腎臓で発現）、ＣＤ４４ｖ６／ｖ７（子宮頸部で発現）、ＣＤ１７１（神経芽腫で発現）、ＣＥＡ（結腸で発現）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（神経膠腫で発現）、ＥＧＰ２（がんで発現）、ＥＧＰ４０（結腸で発現）、ＥｐｈＡ２（神経膠腫、肺で発現）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）（乳房、肺、前立腺、神経膠腫で発現）、ＥｒｂＢ受容体ファミリー（乳房、肺、前立腺、神経膠腫で発現）、ＥｒｂＢ３／４（乳房、卵巣で発現）、ＨＬＡ－Ａ１／ＭＡＧＥ１（黒色腫で発現）、ＨＬＡ－Ａ２／ＮＹ－ＥＳＯ－１（悪性腫瘍、黒色腫で発現）、ＦＲ－ａ（卵巣で発現）、ＦＡＲ（横紋筋肉腫で発現）、ＧＤ２（神経芽腫、悪性腫瘍、黒色腫で発現）、ＧＤ３（黒色腫、肺癌で発現）、ＨＭＷ－ＭＡＡ（黒色腫で発現）、ＩＬ１１Ｒａ（骨肉腫で発現）、ＩＬ１３Ｒａ２（神経膠腫で発現）、Ｌｅｗｉｓ Ｙ（乳房／卵巣／膵臓で発現）、メソテリン（中皮腫、乳房、膵臓で発現）、Ｍｕｃ１（卵巣、乳房、前立腺で発現）、ＮＣＡＭ（神経芽腫、直腸結腸で発現）、ＮＫＧ２Ｄリガンド（卵巣、悪性腫瘍で発現）、ＰＳＣＡ（前立腺、膵臓で発現）、ＰＳＭＡ（前立腺で発現）、ＴＡＧ７２（結腸で発現）、ＶＥＧＦＲ－２（腫瘍血管系で発現）、Ａｘｌ（肺癌で発現）、Ｍｅｔ（肺癌で発現）、α５β３（腫瘍血管系で発現）、α５β１（腫瘍血管系で発現）、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１／ＴＲＡＩＬ－Ｒ２（固形腫瘍（結腸、肺、膵臓）及び血液悪性腫瘍で発現）、ＲＡＮＫＬ（前立腺癌及び骨転移で発現）、テネイシン（神経膠腫、上皮腫瘍（乳房、前立腺）で発現）、ＥｐＣＡＭ（上皮腫瘍（乳房、結腸、肺）で発現）、ＣＥＡ（上皮腫瘍（乳房、結腸、肺）で発現）、ｇｐＡ３３（結腸直腸癌で発現）、ムチン（上皮腫瘍（乳房、結腸、肺、卵巣）で発現））、ＴＡＧ－７２（上皮腫瘍（乳房、結腸、肺）で発現）、ＥｐｈＡ３（肺、腎臓、黒色腫、神経膠腫、血液悪性腫瘍で発現）、及びＩＧＦ１Ｒ（肺、乳房、頭頸部、前立腺、甲状腺、神経膠腫で発現）から選択される。表面抗原及び細胞内抗原の例としては、例えば、Ｈｅｒ２（ＥＲＢＢ２）、ＭＡＧＥ－Ａ１（ＭＡＧＥＡ１）、ＭＡＲＴ－１（ＭＬＡＮＡ）、ＮＹ－ＥＳＯ（ＣＴＡＧ１）、ＷＴ１、ＭＵＣ１７、及びＭＵＣ１３が挙げられる。一例では、第１及び第２の標的分子はそれぞれ、ＢＣＭＡ、Ｂ７Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＥＡ、ＣＳ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、Ｅｒｂファミリーメンバー（ＥＲＢＢ１、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４）、ＦＡＰ、胎児性アセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）、葉酸受容体β（ＦＯＬＲ２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＩＬ－１３Ｒａ２（ＩＬ１３ＲＡ２）、κ軽鎖（ＩＧＫ）、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、メソセリン（ＭＳＬＮ）、ムチン－１（ＭＵＣ１）、ムチン－１６（ＭＵＣ１６）、ＮＫＧ２Ｄリガンド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、及び未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ（ＡＬＫ）から選択される。

【0152】

一例では、キメラポリペプチドの結合ドメインは第１の標的分子に特異的に結合し、前記ＣＡＲは第１の標的分子とは異なる第２の標的分子に特異的に結合し、それぞれメソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、ＭＯＧ、ＣＤ１９、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）、ＡＬＰＰＬ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２１３Ａ２、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２４６、ＣＤ２７２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４６、ＣＤ７１、ＣＤ９７、ＣＥＡ、ＣＬＤＮ６、ＣＬＥＣＬ１、ＣＳ－１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＦＡＰ、ＦＬＴ３、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ）、ＩＧＬＬ１、ＩＬ １１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＤ１１７、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ－ｂ、ＰＲＳＳ２１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＩＲＰａ、ＳＳＥＡ－４、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＡＬＰＩ、シトルリンビメンチン、ｃＭｅｔ、及びＡｘｌから選択される。

【0153】

一実施形態では、第１の標的分子に応答してキメラポリペプチドによって誘発される転写因子は、第２の標的分子に応答してＣＡＲの発現を駆動するため、ＣＡＲは、第１及び第２の標的分子の存在下でのみ活性を有し、Ｔ細胞を活性化する。一例において、第１の標的分子及び第２の標的分子は、それぞれ、ＡＳＧＲ１及びＧＰＣ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＩＬ１３Ｒａ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ及びＢ７Ｈ３、メソテリン及びＣｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びメソテリン、ＦＡＰ及びＣｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１及びＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１２３及びＮＫＧ２Ｄである。一例では、前記キメラポリペプチド及びＣＡＲはそれぞれ、配列番号６１及び６２に示される配列、または配列番号６１及び６４に示される配列、または配列番号６１及び６５に示される配列、または配列番号６１及び６６に示される配列、または配列番号１０５及び６７に示される配列、または配列番号１０６及び６７に示される配列、または配列番号１０８及び１０７に示される配列、または配列番号７３及び１０９に示される配列、または配列番号５０及び１０９に示される配列を含む。

【0154】

Ｕ８７及びＵ２５１細胞は内因性ＩＬ１３Ｒａ２を発現するが、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しない。ＣＡＲ発現を調節するキメラポリペプチドを含むＴ細胞による、異なる陽性率で少なくとも２つ以上の標的分子を発現する細胞の死滅を検出する。一例では、自然条件下でＩＬ１３Ｒａ２陽性で部分的にのみＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性の神経膠腫をシミュレートするために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞とＥＧＦＲｖＩＩＩ陰性細胞を異なる割合で混合する。胃癌細胞ＨＧＣ－２７は内因性メソテリンを発現するが、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現しない。ＨＧＣ－２７－Ａ２は、ヒトＣｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現するＨＧＣ－２７細胞である。

【0155】

一例では、ＣＡＲをコードする核酸配列は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって調節される転写制御エレメントに作動可能に連結される。一例では、ＣＡＲをコードする核酸配列はＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されており、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインにはＧＬＡ４－ＶＰ６４が含まれる。一例では、ＣＡＲの細胞外抗原結合領域には、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１２３、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、またはそれらの組み合わせを認識する抗体が含まれる。一例では、ＣＡＲの細胞外抗原結合領域には、メソテリン、ＦＡＰ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＣＬＬ１、ＣＤ１９、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ７、ＣＤ１２３、ＮＫＧ２Ｄ－リガンド、またはそれらの組み合わせを認識する抗体ｓｃＦＶが含まれる。一例では、ＣＡＲの細胞外抗原結合領域は、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１０１に示されるものと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性または相同性を有するアミノ酸配列を含む。一例において、キメラポリペプチドによって発現が調節されるＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ、メソテリン－ＣＡＲ、またはＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲは、転写制御エレメントに作動可能に連結されており、前記転写制御エレメントは、前記キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって調節される。一例では、キメラポリペプチドによって発現が調節されるＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ、Ｂ７Ｈ３－ＣＡＲ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ、メソテリン－ＣＡＲ、またはＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲは、ＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの下流に挿入され、前記キメラポリペプチドの細胞内領域はＧａｌ４－ＶＰ６４を含む。本出願の実施例に記載される「Ｘ－キメラポリペプチドＹを発現するＺ－ＣＡＲ－Ｔ」または「Ｘ－キメラポリペプチドＹ－Ｚ－ＣＡＲ－Ｔ」は、抗原Ｚを認識するＣＡＲの発現を調節する抗原Ｘを標的とするキメラポリペプチドＹを含むＴ細胞を説明するために使用され、前記Ｚ－ＣＡＲはＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの下流に挿入され、前記キメラポリペプチドＹの細胞内領域はＧａｌ４－ＶＰ６４を含む。上文において、記号ＸとＺは異なる腫瘍抗原を表す。つまり、キメラポリペプチドＹは抗原Ｘを標的にすることができ、示されるＣＡＲは抗原Ｚを認識することができ、キメラポリペプチドＹとＣＡＲを組み合わせてＴ細胞に使用すると、前記ＣＡＲの発現はキ前記メラポリペプチドＹの細胞内ドメインによって調節される。

【0156】

胃癌はメソテリンとＣｌａｕｄｉｎ１８．２の両方を高度に発現しており、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞がＣｌａｕｄｉｎ１８．２を発現する正常組織を殺傷するのを防ぐため、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果は腫瘍領域に限定されている。一例では、メソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣのＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞を発現する。

【0157】

一例では、ＣＡＲ細胞外抗原結合領域は膜貫通領域に直接連結されるか、またはヒンジを介して連結される。一例において、前記ヒンジは、ＣＤ８ヒンジ、例えば、配列番号７５と９５～１００％同一性を有する配列を含む。一例では、ＣＡＲをコードする核酸分子の上流に、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８シグナルペプチド、例えば、配列番号８１と９５～１００％同一性を有する配列を含む。

【0158】

本出願のＣＡＲ分子の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８膜貫通ドメインを含む。一例では、ＣＡＲは、ＣＤ８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号７６と９５～１００％同一性を有する配列を含む。一例では、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号７７と９５～１００％同一性を有する配列を含む。

【0159】

一例では、ＣＡＲは、細胞内シグナルドメイン、すなわち一次シグナルドメイン及び／または共刺激シグナルドメインを含む。一例では、一次シグナルドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン、例えば、配列番号８０と９５～１００％同一性を有する配列を含む。一例では、共刺激シグナルドメインは、ＣＤ２８または４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。

【0160】

一例において、ＣＡＲは、４－１ＢＢ細胞内ドメイン、例えば、配列番号７９と９５～１００％同一性を有する配列を含む。一例では、ＣＡＲは、ＣＤ２８細胞内ドメイン、例えば、配列番号７８と９５～１００％同一性を有する配列を含む。

【0161】

一例では、ＣＡＲの細胞内シグナルドメインは、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。一例において、ＣＡＲの細胞内シグナルドメインは、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメイン及びＣＤ２８細胞内ドメインを含む。一例では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメイン及び４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。一例では、ＣＡＲの細胞内シグナルドメインは、ＣＤ３ζ細胞内ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、及び４－１ＢＢ細胞内ドメインを含む。一例では、前記細胞はＣＡＲ及びサイトカインを発現する。

【0162】

例示的に、本出願のキメラポリペプチドによって発現を転写調節するＣＡＲは、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１０１に示される配列がそれぞれ配列番号８２、８３または８４に順次に連結された配列、を含む。

【0163】

一例において、キメラポリペプチド結合によって誘発調節される遺伝子は、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、中外製薬株式会社から入手可能）；ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）；インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））；リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．から入手可能）；アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ））を含むが、これらに限定されない。一例では、上記の治療用抗体は、Ｇａｌ４－ＶＰ６４によって調節されるＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの後ろに挿入される。

【0164】

２．６ その他の配列
一例では、本出願のキメラポリペプチドは、シグナルペプチド、エピトープタグ、親和性ドメイン、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、及び検出可能なシグナルを生成するポリペプチドを含む、１つ以上の他の構造ドメインも含む。

【0165】

３． 核酸とベクター
本出願は、本出願のキメラポリペプチドをコードする及び／またはキメラポリペプチドの結合によって転写調節を誘発する遺伝子を含む核酸ならびに発現ベクターを提供する。

【0166】

一例において、本出願のキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）に作動可能に連結される。一例では、転写制御エレメントは誘導性である。一例では、転写制御エレメントは構成的である。一例では、プロモーターは真核細胞内で機能する。一例では、プロモーターは細胞型特異的プロモーターである。一例では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。

【0167】

一例では、発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。一例では、レトロウイルスベクター（γ―レトロウイルスまたはレンチウイルス）を使用して、核酸分子を細胞に導入する。非ウイルスベクターも使用することができる。形質導入には、任意の適切なウイルスベクターまたは非ウイルス送達システムを使用できる。本出願の特定の実施形態では、キメラポリペプチドを発現するようにｐＲＲＬＳＩＮベクターが構築される。キメラポリペプチドまたはＣＡＲは、単一のポリシストロン性発現カセット、単一ベクター内の複数の発現カセット、または複数のベクター内のアクセサリー分子（例えば、サイトカイン）を用いて構築することができる。ポリシストロン性発現カセットを生成するエレメントの例には、様々なウイルス及び非ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ、例えば、ＦＧＦ－１ ＩＲＥＳ、ＦＧＦ－２ ＩＲＥＳ、ＶＥＧＦ ＩＲＥＳ、ＩＧＦ－ＩＩ ＩＲＥＳ、ＮＦ－κＢ ＩＲＥＳ、ＲＵＮＸ１ ＩＲＥＳ、ｐ５３ＩＲＥＳ、Ａ型肝炎ＩＲＥＳ、Ｃ型肝炎ＩＲＥＳ、ペスチウイルスＩＲＥＳ、非バキュロウイルスＩＲＥＳ、ピコルナウイルスＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、及び脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ）及び切断可能なリンカー（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａペプチドなどの２Ａペプチド））が含まれるが、これらに限定されない。

【0168】

使用され得る他のウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルスなどのヘルペスウイルスが挙げられる。

【0169】

非ウイルス法は、免疫細胞の遺伝子修飾にも使用できる。例えば、核酸分子は、リポフェクション、アシアロムコイド－ポリリシン結合、または外科的条件下でのマイクロインジェクションによって免疫細胞に導入することができる。他の非ウイルス遺伝子導入法には、トランスポゾン、リポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合を使用したインビトロトランスフェクションが含まれる。核酸分子は、最初にインビトロで培養できる細胞型（例えば、自体または同種初代細胞またはそれらの子孫）に導入し、その後、前記核酸分子によって修飾された細胞（またはその子孫）を受験者の標的組織または全身に注射してもよい。

【0170】

４． 操作された細胞
本出願は、本出願の核酸で遺伝子修飾された操作された細胞、本出願のキメラポリペプチドをコードする核酸で遺伝子修飾された操作された細胞、または本出願のキメラポリペプチド、キメラポリペプチド結合によって転写調節を誘発される遺伝子及び核酸で遺伝子修飾された操作された細胞を提供する。本出願は、本出願のキメラポリペプチドを発現する細胞の活性を調節する方法を提供する。この方法は一般に、操作された細胞を標的分子と接触させてキメラポリペプチドの切断を誘導し、それによって細胞内ドメインを放出し、細胞内ドメインの放出により細胞の活性を調節することを含む。

【0171】

一例において、操作された細胞は、本出願のキメラポリペプチドを発現するように遺伝子修飾され、ＣＡＲを発現するようにさらに遺伝子修飾される。例えば、操作された細胞は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子修飾され、キメラポリペプチドの細胞内ドメインは転写活性化タンパク質であり、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインによって活性化される転写制御エレメントに作動可能に連結される。多くのＣＡＲポリペプチドが当技術分野で記載されており、それらのいずれも本明細書での使用に適している。

【0172】

一例では、操作された細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、内皮細胞、または幹細胞である。幹細胞には、ヒト多能性幹細胞（ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びヒト胚性幹細胞を含む）が含まれる。一例では、前記細胞は免疫細胞を含む。一例では、前記細胞は初代細胞である。一例では、免疫細胞は、Ｂ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好酸球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、他のＴ細胞、またはそれらの組み合わせである。一例では、操作された細胞は、配列番号５９、６３、６８、６９、７０、７１、７２、７４、８８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列相同性を有する核酸配列、またはその翻訳されたアミノ酸配列を含む。

【0173】

本出願の免疫細胞は、リンパ系細胞であってもよい。Ｂ、Ｔ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系は、抗体産生、細胞免疫系の制御、血液中の外因性試薬の検出、宿主外因性細胞の検出などを提供する。リンパ系の免疫細胞の非限定的な例としては、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（例えば、リンパ様細胞に分化する幹細胞または多能性幹細胞）を含めて、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びそれらの前駆体が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺内で成熟し、主に細胞性免疫を担うリンパ球であってもよい。Ｔ細胞は適応免疫システムに参加する。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）及び２つのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞など）を含む）、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞とも呼ばれる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞、γδＴ細胞、またはαβＴ細胞を含むが、これらに限定されない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬまたはキラーＴ細胞）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導できるＴリンパ球である。受験者自身のＴ細胞は、本出願のキメラポリペプチドを発現し、転写活性を引き起こすＣＡＲに結合するように操作することができる。一例において、本出願の細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、ＣＩＫ細胞、及び幹細胞由来免疫細胞、またはそれらの組み合わせから選択される。一例では、免疫細胞はＴ細胞である。一例において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。一例では、免疫細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞である。一例において、本出願の組成物中の細胞は、ＣＤ３磁気ビーズによる刺激後にＰＢＭＣ細胞から収集された細胞集団を含む。

【0174】

本願の細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己、非自己（例えば、同種異系）、または操作された前駆細胞もしくは幹細胞からインビトロで誘導されたものであり得る。これは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍などの多くの供給源から入手できる。

【0175】

本出願の特定の態様では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）単離技術などの当業者に知られている任意の数の技術を使用して、受験者から採取された血液サンプルから得ることができる。好ましい態様では、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス製品には通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球、赤血球、血小板などのリンパ球が含まれている。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿部分を除去し、細胞をその後の処理ステップのために適切な緩衝液または培地に入れることができる。本出願のコンテキストでは、複数ラウンドの選択も使用できる。いくつかの態様では、選択手順を実行し、活性化及び拡張中に「選択されていない」細胞を使用することが必要な場合がある。「選択されていない」細胞は、他のラウンドの選択を受けることもできる。

【0176】

本出願の細胞は、腫瘍微小環境を調節することができる。

【0177】

未精製ＣＴＬの供給源は、骨髄、胎児、新生児もしくは成人、または胎児肝臓、末梢血もしくは臍帯血などの他の造血細胞供給源などの当技術分野で公知の任意の供給源であり得る。細胞を単離するには、さまざまな技術を使用できる。例えば、ネガティブ選択では、最初に非ＣＴＬを削除できる。ｍＡｂは、特定の細胞系統及び／またはポジティブ選択とネガティブ選択の分化段階に関連するマーカーを同定するのに特に役立つ。

【0178】

最終分化細胞のほとんどは、最初は比較的大まかな単離によって除去できる。例えば、磁気ビーズ分離を最初に使用して、多数の無関係な細胞を除去できる。特定の実施形態では、全造血細胞の少なくとも約８０％、典型的には少なくとも約７０％が、細胞を単離する前に除去される。

【0179】

単離手順は、密度勾配遠心分離；再沈殿（ｒｅｓｅｔｔｉｎｇ）；細胞密度を変化させる粒子へのカップリング；抗体でコーティングされた磁気ビーズによる磁気分離；アフィニティークロマトグラフィー；補体及び細胞毒素を含むがこれらに限定されない、ｍＡｂと組み合わされる、またはｍＡｂと組み合わせて使用される細胞傷害性薬剤；また、固体マトリックス（例えば、プレート、チップ、水簸）に付着した抗体パニングまたは他の任意の便利な技術を含むが、これらに限定されない。

【0180】

分離及び分析の技術は、フローサイトメトリーを含むが、これらに限定されず、複数のカラーチャネル、低角及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなど、さまざまの複雑さを持つことができる。

【0181】

ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの死細胞に関連する色素を使用して、死細胞に対して細胞を選択できる。特定の実施形態では、細胞は、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）もしくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地、または他の適切な滅菌等張培地中などに収集される。

【0182】

５． 遺伝子組み換え生物
本出願は、本出願のキメラポリペプチドをコードする核酸を含む非ヒトトランスジェニック生物を提供する。本出願のトランスジェニック非ヒト生物は、本出願のキメラポリペプチドをコードする核酸を含むように遺伝子修飾されたゲノムを含む。

【0183】

６．方法
本出願は、本出願のキメラポリペプチドを発現する操作された細胞の活性を調節する方法を提供し、この方法は、本出願のキメラポリペプチドを含む操作された細胞を標的分子と接触させることを含み、前記標的分子とキメラポリペプチドのドメインが結合した後、前記キメラポリペプチドの受容体調節ドメインのプロテアーゼ切断部位の切断を誘導して細胞内ドメインを放出し、細胞内ドメインの放出が操作された細胞の活性を調節する。一例において、前記接触は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで行われる。一例において、標的分子は、標的細胞の表面上に存在するか、不溶性基材上に固定化されているか、細胞外マトリックス中に存在するか、人工マトリックス中に存在するか、または可溶性である。一例では、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞の増殖を調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞におけるアポトーシスを調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、アポトーシス以外の機構によって細胞死を誘導する。一例では、細胞内ドメインの放出は、転写調節、クロマチン調節、翻訳、輸送、または翻訳後プロセシングを通じて、操作された細胞における遺伝子発現を調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞の分化を調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞の遊走を調節する。一例において、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞からの分子の発現及び分泌を調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、標的細胞または細胞外マトリックスへの操作された細胞の接着を調節する。一例では、細胞内ドメインの放出は、操作された細胞における遺伝子産物の再発現を誘導する。細胞内ドメインの放出は、操作された細胞における遺伝子産物の再発現を誘導する。一例では、遺伝子産物は、転写活性化タンパク質、転写抑制タンパク質、キメラ抗原受容体、翻訳調節因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、または抗体である。一例では、放出された転写因子は、免疫細胞、幹細胞、始原細胞または前駆細胞である操作された細胞の分化を調節する。一例では、この方法は腫瘍を治療するために使用される。

【0184】

本出願は、Ｔ細胞を活性化する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載のＴ細胞（ここで、Ｔ細胞は、ｉ）本出願に係るキメラポリペプチド；及びｉｉ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸で遺伝子修飾されている）を固定化抗原と接触させることを含み、ここで、キメラポリペプチドのドメインが第１の標的分子に特異的な抗体を含み、前記接触によりキメラポリペプチドの細胞内ドメイン（例えば、転写活性化タンパク質）の放出及びＴ細胞におけるＣＡＲポリペプチドの発現が引き起こされ、ＣＡＲポリペプチドは、第２の標的分子の結合後にＴ細胞の活性化をもたらす。一例では、前記第１の標的分子と第２の標的分子は異なる腫瘍抗原であるか、または第１の標的分子は組織特異的分子であり、第２の標的分子は腫瘍抗原である。

【0185】

本開示は、操作された細胞の活性を調節する方法を提供し、この方法は、操作された細胞を表面に固定化された抗原と接触させることを含み、操作された細胞による本開示のキメラポリペプチドの発現により、細胞内ドメインの放出及び操作された細胞活性をもたらすことができる。場合によっては、細胞内ドメインは細胞分化を調節する転写因子である。

【0186】

本開示は、操作された細胞の活性を局所的に調節する方法を提供し、この方法は、本出願を含むキメラポリペプチドを細胞内で発現させること；操作された細胞が標的分子と接触した後、細胞内ドメインを放出して操作された細胞の活性（細胞の遺伝子産物の発現、細胞の増殖、細胞のアポトーシス、細胞の非アポトーシス死、細胞の分化、細胞の脱分化、細胞の遊走、細胞からの分子の分泌、及び細胞の細胞接着）を調節することを含む。

【0187】

一例において、本出願は、腫瘍に罹患している受験者における腫瘍を治療する方法を提供し、この方法は、ｉ）本出願のキメラポリペプチド、またはキメラポリペプチド及びその結合によって転写活性が誘発されるＣＡＲをコードするものを含むベクターを使用して、個体から得られたＴリンパ球またはＮＫＴ細胞を遺伝子修飾すること（ここで、キメラポリペプチドが受験者の腫瘍細胞上の抗原に特異的である）；ｉｉ）遺伝子修飾されたＴリンパ球またはＮＫＴ細胞を受験者に導入することを含み、遺伝子修飾されたＴリンパ球またはＮＫＴは腫瘍細胞を認識して殺し、それによって腫瘍を治療する。

【0188】

一例において、本出願は、受験者における標的細胞の活性を阻害する方法を提供し、この方法は、本出願のキメラポリペプチドを発現する治療有効量の操作された細胞を受験者に投与することを含み、操作された細胞は、受験者における標的細胞の活性を阻害する。一例では、前記標的細胞は腫瘍細胞である。一例では、前記標的細胞は、急性骨髄腫白血病細胞、未分化リンパ腫細胞、星状細胞腫細胞、Ｂ細胞がん細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、上衣腫細胞、食道癌細胞、神経膠芽腫細胞、神経膠腫細胞、平滑筋肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、肝癌細胞、肺癌細胞、マントル細胞リンパ腫細胞、黒色腫細胞、神経芽腫細胞、非小細胞肺癌細胞、希突起膠腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、末梢性Ｔ細胞リンパ腫細胞、腎臓癌細胞、肉腫細胞、胃癌細胞、肝臓癌細胞、中皮腫細胞または肉腫細胞である。一例では、前記標的細胞は低レベルの標的分子を発現する。一例において、前記操作された細胞は、前記キメラポリペプチドが標的分子に結合することによって転写を開始させて活性化されるＣＡＲ、修飾ＴＣＲ、外因性サイトカイン、及び／または治療用モノクローナル抗体をさらに含む。一例では、前記キメラポリペプチドは第１の標的分子に特異的に結合し、前記ＣＡＲ及び／または修飾ＴＣＲは第２の標的分子に特異的に結合し、前記標的細胞内の第１の標的分子及び第２の標的分子が不均一性腫瘍抗原を発現するか、または第１の標的分子は組織特異的分子であり、且つ第２の標的分子は腫瘍抗原である。一例では、第１の標的分子は腫瘍抗原ではないが組織特異的発現を有し、第２の標的分子は腫瘍抗原である。一例では、第１の標的分子の陽性率は、第２の標的分子の陽性率よりも低い。一例では、この方法は、操作された細胞の抗腫瘍特異性を改善することができる。

【0189】

７． 投薬
本出願のキメラポリペプチドを含む組成物は、抗原に対する免疫応答を誘導及び／または増強するため、及び／または腫瘍、病原性感染症もしくは感染症を治療及び／または予防するために、全身的または直接的に受験者に提供することができる。一例において、本出願の組成物を、対象となる器官（例えば、腫瘍の影響を受けた器官）に直接注射する。あるいは、本出願の組成物を、循環系（例えば、静脈、腫瘍血管系）への投与などによって、対象となる器官に間接的に提供してもよい。増殖及び分化剤は、インビトロまたはインビボでＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させるために、組成物の投与前、投与と同時、または投与後に提供され得る。

【0190】

本出願の組成物中の免疫細胞は、精製された細胞集団を含み得る。当業者は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団における本出願の免疫細胞のパーセンテージを容易に決定することができる。本出願の免疫細胞を含む集団において、純度の適切な範囲は、約５０％～約５５％、約５％～約６０％、及び約６５％～約７０％である。特定の実施形態では、純度は約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、または約８０％～約８５％である。特定の実施形態では、純度は約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、及び約９５％～約１００％である。投与量は、当業者によって容易に調整することができる（例えば、純度が低下すると、投与量を増加する必要があるかもしれない）。細胞は注射やカテーテルなどによって導入できる。

【0191】

本出願の組成物は、本出願の免疫細胞または前駆細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。投与は自己由来であっても同種異系であってもよい。例えば、免疫細胞または前駆細胞は、ある受験者から得られ、同じ受験者または異なる適合する受験者に投与できる。末梢血由来免疫細胞またはその子孫（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ源由来）は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射によって投与することができる。本出願の組成物を投与する場合、それらは単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、乳濁液など）で製剤化され得る。

【0192】

８． 剤形
本願のキメラポリペプチドを含む組成物は、選択されたｐＨに緩衝され得る、等張水溶液、懸濁液、乳剤、分散液または粘性組成物などの滅菌液体製剤の形態で都合よく提供され得る。液体製剤は一般に、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与がある程度より便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織との接触時間をより長くするために、適切な粘度範囲内で配合することができる。液体または粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい担体を含んでもよい。

【0193】

無菌注射用溶液は、本出願の組成物の免疫細胞を所望の量の適切な溶媒に組み込み、必要に応じて様々な量の他の成分を組み込むことによって調製することができる。このような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤または賦形剤と混合することができる。組成物は凍結乾燥することもできる。前記組成物は、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化剤または増粘剤、保存剤、矯味剤、顔料などの補助物質を含んでもよく、これは、投与経路及び必要な製剤によって決められる。

【0194】

組成物の安定性及び無菌性を高めるために、抗菌保存剤、酸化防止剤、キレート剤及び緩衝剤を含む様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用からの保護は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などのさまざまな抗菌剤及び抗真菌剤によって確保できる。注射可能な薬剤形態の持続的な吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収を遅らせる薬剤の使用によってもたらすことができる。ただし、使用するいずれのビヒクル、希釈剤、または添加剤は、遺伝子修飾された免疫細胞またはその前駆細胞と適合する必要がある。

【0195】

組成物は等張性であってもよく、すなわち、それらは血液及び／または涙と同じ浸透圧を有していてもよい。組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、またはグルコース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールもしくは他の無機もしくは有機溶質などの他の薬学的に許容される薬剤を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含む緩衝液に特に適している。

【0196】

必要に応じて、薬学的に許容される増粘剤を使用して、組成物の粘度を選択されたレベルに維持することができる。例えば、メチルセルロースは容易かつ経済的に入手でき、使いやすいである。他の適切な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択した試薬によるものである。選択した粘度を達成する量を使用することが重要である。明らかに、適切な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形の性質、例えば液体剤形（例えば、組成物を溶液、懸濁液、ゲル、または時限放出形態もしくは液体充填形態などの他の液体として配合するかどうか）に依存する。

【0197】

投与される組成物中の細胞の数は、治療される受験者に応じて変化するであろう。より効果的な細胞をより少ない数で投与できる。有効量の正確な決定は、対象の体格、年齢、性別、体重、及び対象の状態を含む各受験者の個別の要因に基づいて決定することができる。用量は、当業者であれば、本出願及び当技術分野の知識から容易に決定することができる。

【0198】

当業者は、組成物中の、及び方法で投与される細胞及び任意の添加剤、ビヒクル及び／または担体の量を容易に決定することができる。通常、任意の添加剤（１つ以上の活性細胞及び／または１つ以上の試薬以外）は、リン酸緩衝生理食塩水中に溶液の０．００１重量％～５０重量％の量で存在し、有効成分はマイクログラムからミリグラムで存在し、例えば、約０．０００１重量％～約５重量％、約０．０００１重量％～約１重量％、約０．０００１重量％～約０．０５重量％または約０．００１重量％～約２０重量％、約０．０１重量％～約１０重量％または約０．０５重量％～約５重量％の順序で存在する。動物またはヒトに投与される任意の組成物について、以下の結果を決定することができる：例えば、マウスなどのげっ歯類などの適切な動物モデルにおける致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０を決定することによる毒性；組成物の用量、ここで、成分の濃度及び組成物の投与時間は、適切な反応を引き起こす。

【0199】

９． 治療方法
本出願は、本出願の組成物を必要とする受験者において免疫応答を誘導及び／または増加させる方法を提供する。本出願のキメラポリペプチドを含む組成物は、受験者象における腫瘍を治療及び／または予防するために使用することができる。本出願の組成物は、腫瘍に罹患している受験者の生存を延長するために使用することができる。本出願の組成物は、免疫不全のヒト受験者などにおける病原性感染症または他の感染症を治療及び／または予防するために使用することもできる。このような方法は、既存の状態の緩和または再発の予防のいずれであっても、所望の効果を達成するために有効量の本出願の組成物を投与することを含む。治療の場合、投与される量は、所望の効果を生み出すのに有効な量である。有効量は、１回以上の投与で提供され得る。有効量は、ボーラス投与または持続注入によって提供され得る。

【0200】

一例では、本出願の組成物は、疾患の再発などにより表面抗原発現レベルが低い腫瘍細胞を有する受験者を治療するために使用することができ、ここで、受験者は腫瘍細胞が残ることをもたらす治療を受けたことがある。特定の実施形態では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面上に低密度の標的分子を有する。

【0201】

一例において、本出願の組成物は、ＣＡＲ単独の投与を含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を投与された、疾患再発を患う受験者を治療するために使用することができる。一例では、腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面上に低密度の腫瘍特異的抗原を有する。このような方法は、所望の効果を達成し、既存の状態を緩和するか、または再発を予防するために有効量の本出願の組成物を投与することを含む。

【0202】

「有効量」（または「治療有効量」）は、治療後に有益なまたは所望の臨床結果を生み出すのに十分な量である。有効量は、１回以上の用量で受験者に投与され得る。治療目的の場合、有効量とは、疾患の進行を緩和、改善、安定化、逆転、もしくは遅らせる、または疾患の病理学的結果をその他の方法で軽減するのに十分な量である。有効量は一般に、医師によってケースバイケースで決定され、当業者の能力の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する場合、通常、いくつかの要因が考慮される。これらの要因には、受験者の年齢、性別及び体重、治療される疾患、疾患の重症度、投与される本出願の組成物の形態及び有効濃度が含まれる。

【0203】

抗原特異的Ｔ細胞を使用する養子免疫療法では、通常、約１０^６～１０^１０の範囲の細胞量が注入される。本出願の免疫細胞を宿主に投与し、続いて分化した後、特定の抗原に特異的なＴ細胞を誘導する。本出願の組成物は、静脈内、皮下、節内、腫瘍内、くも膜下腔内、胸腔内、腹腔内、及び胸腺への直接投与を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の方法によって投与することができる。

【0204】

本出願は、対象における腫瘍を治療及び／または予防する方法を提供する。この方法は、有効量の本出願の組成物を腫瘍に罹患している受験者に投与することを含み得る。

【0205】

腫瘍の非限定的な例としては、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、膠芽腫、喉頭癌、黒色腫、神経芽腫、腺癌、神経膠腫、軟部肉腫、及びさまざまながん（前立腺癌及び小細胞肺癌を含む）が挙げられる。腫瘍の非限定的な例には、星状細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、希突起膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、軟骨肉腫、骨肉腫、膵管腺癌、小細胞肺腺癌及び大細胞肺腺癌、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、上皮腺癌及びその肝臓転移巣、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、肝癌、胆管癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、基底細胞癌、汗腺癌、乳頭癌、脂腺癌、腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症及び重度連鎖疾患、乳管及び小葉腺癌などの乳房腫瘍、子宮頸部の扁平上皮癌及び腺癌、子宮及び卵巣の上皮癌、前立腺の腺癌、膀胱の移行性扁平上皮癌、Ｂ細胞及びＴ細胞リンパ腫（結節性及びびまん性）形質細胞腫、急性及び慢性白血病、悪性黒色腫、軟部組織肉腫及び平滑筋肉腫が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、腫瘍は、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、及び骨髄腫）、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、結腸癌、腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、神経膠芽腫、及び喉頭癌から選択される。一例において、本願の組成物は、肝臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、甲状腺癌、胃癌、結腸直腸癌などの従来の治療手段に適さないまたは再発して難治性の固形腫瘍を治療及び／または予防するために使用することができる。一例では、腫瘍は血液腫瘍である。

【0206】

本出願の組成物の治療目標は、疾患進行の緩和もしくは逆転及び／または副作用の緩和を含み得、あるいは治療目標は再発のリスクの低減もしくは遅延を含み得る。

【0207】

本出願は、例えば免疫不全受験者における病原性感染症（例えばウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、または原虫感染）を治療及び／または予防する方法を提供する。この方法は、病原性感染症に罹患している受験者に有効量の本出願の組成物を投与することを含んでもよい。治療しやすいウイルス感染症の例には、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、及びインフルエンザウイルス感染症が含まれるが、これらに限定されない。

【0208】

「増強」という用語は、受験者または腫瘍細胞が本明細書に開示される治療に応答する能力を改善できることを指す。例えば、応答の増強は、応答性の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％以上の増加を含むことができる。本明細書で使用される場合、「増強」とは、免疫細胞療法などの治療に応答する受験者の数を増加させることを指す場合もある。例えば、応答の増強は、治療に応答する受験者の合計パーセンテージを指す場合があり、ここで、パーセンテージは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％以上である。

【0209】

１０．キット
本出願は、受験者における免疫応答を誘導及び／または増強し、及び／または腫瘍もしくは病原体感染を治療及び／または予防するためのキットを提供する。一例において、キットは、有効量の本出願のキメラポリペプチドの組成物及び医薬組成物を含む。一例では、キットは滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、小袋、ブリスターパック、または当技術分野で公知の他の適切な容器の形態であってもよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または薬物を入れるのに適した他の材料で作ることができる。一例において、キットは、発現可能な形態で目的の抗原を認識する本出願のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、１つ以上のベクターに含められていてもよい。

【0210】

一例において、本願の組成物及び／または核酸分子は、腫瘍、病原体、もしくは免疫疾患に罹患している、または腫瘍、病原体、もしくは免疫疾患を発症するリスクのある受験者に組成物または核酸分子を投与するための説明書(プロトコール)とともに提供される。説明書は通常、腫瘍または病原性感染症を治療及び／または予防するための組成物の使用に関する情報を含む。一例では、説明書は、治療薬の説明；腫瘍、病原性感染症、もしくは免疫疾患、またはそれらの症状の治療または予防のための投与スケジュール及び投与；注意事項；警告；適応症；不適応症；医薬品情報；副作用；動物薬理学；臨床研究；及び／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。これらの説明書は、容器に直接印刷することも、容器に貼り付けるラベルとして印刷することも、容器内または容器とともに別個のシート、小冊子、カード、またはフォルダーとして提供することもできる。

【0211】

１１．治療用途または薬剤調製用途
本出願において、本出願に記載される方法は、治療用途として解釈することもできる。すなわち、本出願に記載される方法は、本出願の組成物、核酸分子または操作された細胞の治療用途、または治療用途に対応する薬剤調製用途とみなすことができる。一例において、本出願は、操作された細胞の活性を調節するための上記操作された細胞もしくは核酸分子の使用、または操作された細胞の活性を調節するための薬剤を調製するための上記操作された細胞の使用に関する。本出願は、操作された細胞を活性化するための上記操作された細胞もしくは核酸分子の使用、または操作された細胞を活性化するための薬剤を調製するための上記操作された細胞の使用に関する。本出願は、受験者における標的細胞の活性を阻害するための、または受験者における標的細胞の活性を阻害する薬剤を調製するための、上記操作された細胞もしくは核酸分子の使用に関する。本出願は、必要とする受験者の健康状態を改善もしくは治療するための、または必要とする受験者の健康状態を改善もしくは治療するための薬剤を調製するための、上記操作された細胞もしくは核酸分子の使用に関する。本出願で上述したものはすべて、治療用途または薬剤調製用途にも適用され得る。

【0212】

本出願は、例えば、中国特許出願公開番号ＣＮ１０７０５８３５４Ａ、ＣＮ１０７４６０２０１Ａ、ＣＮ１０５１９４６６１Ａ、ＣＮ１０５３１５３７５Ａ、ＣＮ１０５７１３８８１Ａ、ＣＮ１０６１４６６６６Ａ、ＣＮ１０６５１９０３７Ａ、ＣＮ１０６５５４４１４Ａ、ＣＮ１０５３３１５８５Ａ、ＣＮ１０６３９７５９３Ａ、ＣＮ１０６４６７５７３Ａ、ＣＮ１０４１４０９７４Ａ、ＣＮ１０８８８４４５９Ａ、ＣＮ１０７８９３０５２Ａ、ＣＮ１０８８６６００３Ａ、ＣＮ１０８８５３１４４Ａ、ＣＮ１０９３８５４０３Ａ、ＣＮ１０９３８５４００Ａ、ＣＮ１０９４６８２７９Ａ、ＣＮ１０９５０３７１５Ａ、ＣＮ１０９９０８１７６Ａ、ＣＮ１０９８８０８０３Ａ、ＣＮ１１００５５２７５Ａ、ＣＮ１１０１２３８３７Ａ、ＣＮ１１０４３８０８２Ａ、ＣＮ１１０４６８１０５Ａ、及び例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７１８６１２１Ａ１、ＷＯ２０１８００６８８２Ａ１、ＷＯ２０１５１７２３３９Ａ８、ＷＯ２０１８／０１８９５８Ａ１、ＷＯ２０１４１８０３０６Ａ１、ＷＯ２０１５１９７０１６Ａ１、ＷＯ２０１６００８４０５Ａ１、ＷＯ２０１６０８６８１３Ａ１、ＷＯ２０１６１５０４００Ａ１、ＷＯ２０１７０３２２９３Ａ１、ＷＯ２０１７０８０３７７Ａ１、ＷＯ２０１７１８６１２１Ａ１、ＷＯ２０１８０４５８１１Ａ１、ＷＯ２０１８１０８１０６Ａ１、ＷＯ２０１８／２１９２９９、ＷＯ２０１８／２１０２７９、ＷＯ２０１９／０２４９３３、ＷＯ２０１９／１１４７５１、ＷＯ２０１９／１１４７６２、ＷＯ２０１９／１４１２７０、ＷＯ２０１９／１４９２７９、ＷＯ２０１９／１７０１４７Ａ１、ＷＯ２０１９／２１０８６３、ＷＯ２０１９／２１９０２９に開示されているＣＡＲ－Ｔ細胞及びそれらの調製方法、抗体を含む。

【実施例】

【0213】

実施例１：キメラポリペプチドｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）の構築
本実施例は、本出願で使用されるキメラポリペプチドの様々な例示的なキメラポリペプチドの組成を構築した（表１）。

【0214】

例えば、上記表１の断片配列は以下の通りである：ａｎｔｉＧＰＣ３－ｓｃＦｖ（配列番号４２）、ａｎｔｉＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｃＦｖ（配列番号４３）、ａｎｔｉＭｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｓｃＦｖ（配列番号４４）、ａｎｔｉＦＡＰ－ｓｃＦｖ（配列番号４５）、ａｎｔｉＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ｓｃＦｖ（配列番号４６）、ａｎｔｉＣＬＬ１－ｓｃＦｖ（配列番号４７）、Ｊａｇｇｅｄ２細胞外領域（配列番号１、２）、ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域（配列番号号３、４）、ＥｐｈｒｉｎＢ２－ｄｅｌ１細胞外領域（配列番号５、６）、ＥｐｈｒｉｎＢ２－ｄｅｌ２細胞外領域（配列番号７、８）、ＥｐｈｒｉｎＢ２－ｄｅｌ３細胞外領域（配列番号９、１０）、ＥｐｈｒｉｎＢ２－ｄｅｌ２３細胞外領域（配列番号１１、１２）、マウスＮｏｔｃｈ１（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）膜貫通領域（配列番号１３）、マウスＮｏｔｃｈ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）（配列番号１４）、マウスＮｏｔｃｈ３膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）（配列番号１５）、マウスＮｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）（配列番号１６）、ヒトＮｏｔｃｈ１膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ）（配列番号１７）、ヒトＮｏｔｃｈ２膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ）（配列番号１８）、ヒトＮｏｔｃｈ３膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ）（配列番号１９）、ヒトＮｏｔｃｈ４膜貫通領域（Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ）（配列番号２０）、ＡＰＬＰ２膜貫通領域（ＡＰＬＰ２ＳＴＳ）（配列番号２１）、Ｎｏｔｃｈ１ＳＴＳ（配列番号２２）、Ｎｏｔｃｈ２ＳＴＳ（配列番号２３）、Ｎｏｔｃｈ３ＳＴＳ（配列番号２４）、Ｎｏｔｃｈ４ＳＴＳ（配列番号２５）、ＡＰＬＰ２のＳＴＳ（配列番号２６）、ＧＡＬ４－ＶＰ６４（配列番号２７）、ここで、マウスＮｏｔｃｈは英語記号Ｎｏｔｃｈで表され、ヒトＮｏｔｃｈは英語記号ｈｕＮｏｔｃｈで表される。

【0215】

上記キメラポリペプチドをそれぞれＪｕｒｋａｔ細胞（中国科学院細胞バンクから購入）に導入した後、ビオチン標識抗原ポリペプチド＋ＰＥ標識ストレプトアビジンを用いてフローサイトメトリーにより発現を検出した。その結果、上記のポリペプチドはいずれも細胞膜上で安定して発現されていることが示された。

【0216】

本実施例では、表１のＧａｌ４－ＶＰ６４制御ＵＡＳ－ＣＭＶプロモーター（配列番号４９）にＢＦＰ（ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＱＪＲ９７８１５．１）を挿入してキメラポリペプチドにより活性化されるレポーター遺伝子とした。本実施例では、ｐＧＫプロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃７９１２０，７７２１－８２２０ ｂｐ）によって調節される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、陽性伝達マーカーとしてＢＦＰの下流に挿入した。ＧＦＰタンパク質配列は、ｇｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＵＤＹ８０６６９．１に示す。本実施例では、ＵＡＳ－ＣＭＶ、ＢＦＰ、ｐＧＫ、ＧＦＰの核酸配列がこの順に連続してなるＵＡＳ－ＢＦＰ－ＰＧＫ－ＧＦＰ断片をＪｕｒｋａｔ細胞に導入し、Ｊｕｒｋａｔ応答性細胞を構築した。

【0217】

実施例２：ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）は遺伝子発現を調節する
ＧＰＣ３を標的とするキメラペプチドをそれぞれ導入したＪｕｒｋａｔ応答細胞を肝癌細胞と１：１の比率で混合し（ＳＫ－Ｈｅｐ１はＧＰＣ３陰性、ＳＫ－Ｈｅｐ１－ＧＰＣ３は外因的に過剰発現されたＧＰＣ３タンパク質、ＨｕＨ７及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５はＧＰＣ３陽性である）、２４時間共インキュベートし、ＢＦＰをフローサイトメトリーで検出した。図１Ａ及び１Ｂ（数値はＢＦＰ陽性細胞の割合を表す）は、標的細胞との共インキュベーション後、ｓｙｎＮｏｔｃｈ（プラスミドＡｄｄｇｅｎｅ＃７９１２５から改変され、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ配列を抗ＧＰＣ３－ｓｃＦｖ配列に置き換えたもの）と比較して、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ（配列番号５１）、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ（配列番号５２）、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）（配列番号５３）は、同等または有意に増加したＢＦＰ発現レベルを誘導することを示す。

【0218】

実施例３：抗原共インキュベーション実験
コーティング群：ＧＰＣ３抗原（５μｇ／ｍＬ、４℃で一晩）を９６ウェルプレートにプレコーティングし、ＧＰＣ３を標的とするキメラポリペプチドを発現するＪｕｒｋａｔ応答細胞を各ウェルに５０，０００個プレーティングした。溶解群：ＧＰＣ３を標的とするキメラペプチドを発現するＪｕｒｋａｔ応答細胞を各ウェルに５０，０００個プレーティングし、ＧＰＣ３抗原（５μｇ／ｍＬ）を培地に直接添加した。ＢＦＰを、抗原と細胞を共インキュベートしてから０、４、８、２４、及び３２時間後にフローサイトメトリーによって検出した。図２は、コーティングされた抗原と共インキュベートした後、各群の細胞におけるＢＦＰの発現が同等であったことを示している。ＢＦＰは、溶解抗原とともにインキュベートされた細胞ではほとんど検出されなかった。

【0219】

実施例４．ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域の切断（トランケート）型を含むＳｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌは遺伝子発現を調節する
実施例１及び２を参照して、ＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ１（配列番号５４）、ＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２（配列番号５５）、ＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３（配列番号５６）、ＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２３（配列番号５７）を発現するＪｕｒｋａｔ応答細胞を構築し、ＧＰＣ３刺激後のＢＦＰ発現を検出した。図３は、全長ＥｐｈｒｉｎＢ２細胞外領域またはその切断型を含む、ＧＰＣ３を標的とするキメラポリペプチドが何れも遺伝子発現を調節することを示している。発現がｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３またはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ２３によって誘導された場合、漏出は有意に減少した。

【0220】

実施例５．異なる濃度での抗原刺激に対するｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）の応答
ビオチン標識ＧＰＣ３抗原ポリペプチドをＰＢＳ緩衝液（１０μｇ／ｍＬ）に溶解し、０．０１９５３１μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで２倍に希釈し、各濃度で５０μＬをストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ １５５００）に添加し、ＧＰＣ３抗原コーティングのために室温で２時間インキュベートした。

【0221】

ＧＰＣ３を標的とするキメラペプチドを発現するＪｕｒｋａｔ応答細胞４０，０００個を、さまざまな濃度のＧＰＣ３抗原でコーティングしたウェルにそれぞれ添加し、３７℃で２４時間培養し、フローサイトメトリーでＢＦＰを検出した（図４）。

【0222】

実施例６：ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣはＩＬ１２発現を調節する
ＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの下流にＩＬ１２を挿入し、ＩＬ１２の下流にｐＧＫプロモーターによって制御されるＧＦＰを連結し、得られたフラグメントＵＡＳ－ＩＬ１２－ＰＧＫ－ＧＦＰを、ＧＰＣ３を標的とするキメラポリペプチドと同時にまたは連続してＴ細胞に導入し、次いで、肝臓癌細胞と１：１の比率で別々に混合し、２４時間共インキュベートし、培養上清中のＩＬ１２をＥＬＩＳＡによって検出した。図５は、標的細胞と共インキュベートした後、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣがｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して同等または増加したＩＬ１２発現を誘導したことを示している。図６と組み合わせると、ＧＰＣ３低発現細胞とインキュベートした後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣにより誘導された転写が向上したことがわかる。

【0223】

実施例７．ＩＬ１２発現を調節するｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）の単一ベクター系
実施例６では、キメラポリペプチド及び調節される発現遺伝子を２つの異なるベクターに配置し、キメラポリペプチドによる標的遺伝子の調節を実現するには二重ウイルス感染が必要である。操作を簡略化し、形質導入効率を向上させるために、ＩＬ１２をＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの下流に挿入し、キメラポリペプチド発現ベクターに組み込んでＴ細胞に形質導入した。図７は、単一ベクター系がｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ及びｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）をｓｙｎＮｏｔｃｈよりも高いレベルで発現することを示している。図８を図６と組み合わせると、ＧＰＣ３低発現細胞とインキュベートした後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣまたはｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）がｓｙｎＮｏｔｃｈよりも高い転写を誘導したことが示される。図９は、ＧＰＣ３低発現細胞とのインキュベーション後、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３の誘導発現レベルが低い一方、ＧＰＣ３高発現細胞とのインキュベーション後、その誘導発現レベルがｓｙｎＮｏｔｃｈに相当することを示しており、これは、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ｄｅｌ３が抗原の低発現と高発現をより効果的に区別できることを示している。

【0224】

実施例８．ＩＬ１２発現を調節するＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣはＣＡＲ－Ｔ細胞と相乗して腫瘍を治療する
実施例７で調製したＩＬ１２発現を調節するＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣのＴ細胞及びＧＰＣ３－ＣＡＲ（配列番号６０）を発現するＴ細胞を用いたインビボ抗腫瘍実験である。

【0225】

ＮＰＧマウスの皮下にＰＬＣ／ＰＲＦ／５肝癌細胞を接種し、腫瘍形成後、図に従って群に分け、対応する数の細胞を投与し、腫瘍体積と体重を測定した。図１０は、ＩＬ１２発現を調節するｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣが、ＧＰＣ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞と相乗的な抗腫瘍効果を発揮することを示す。

【0226】

実施例９：ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣは遺伝子発現を調節する
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするキメラポリペプチド（配列番号６１）を含むＪｕｒｋａｔ応答細胞を、神経膠腫細胞と１：１の比率で２４時間共インキュベートし、フローサイトメトリーによってＢＦＰを検出した（図１１）。

【0227】

実施例１０．ＣＡＲ発現を調節するｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを含むＣＡＲ－Ｔ細胞
ＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ（配列番号６２）をＵＡＳ－ＣＭＶプロモーターの下流に挿入し、キメラポリペプチド発現ベクターに組み込んでＴ細胞に形質導入し、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするキメラポリペプチドでＩＬ１３Ｒａ－ＣＡＲの発現を調節するＴ細胞を作製し（図１２）、インビトロで１４日間培養した。ＣＡＲ発現及びリン酸化レベルをウェスタンブロットによって検出した（図１３）；細胞をそれぞれＣＤ２５、ＣＤ６９、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３及びＣＤ３９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ抗体で標識し、フローサイトメトリーにより検出した（図１４、１５）。

【0228】

実施例１１．ＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ発現を調節するＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを含むＴ細胞のインビボ及びインビトロ殺傷
標的細胞：Ｕ８７、Ｕ８７－１０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ（９０％Ｕ８７＋１０％Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｕ８７－５０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ（５０％Ｕ８７＋５０％Ｕ８７－ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｕ２５１、Ｕ２５１－１０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ（９０％Ｕ２５１＋１０％Ｕ２５１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、Ｕ２５１－５０％ＥＧＦＲｖＩＩＩ（５０％Ｕ２５１＋５０％Ｕ２５１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ）。

【0229】

エフェクター対標的比３：１、１：１、１：３で共培養し、上清ＬＤＨまたはｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡを検出して標的細胞の死滅をリアルタイムでモニタリングした。図１６は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原の不均一性を有する腫瘍を死滅させることができ、また、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性率が低い腫瘍細胞集団に対しても死滅効果を有することを示す。

【0230】

Ｕ２５１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞をＮＰＧマウスの皮下に接種し、腫瘍形成後、図に従って群に分け、対応する数のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、腫瘍体積と体重を測定した。図１７は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＩＬ１３Ｒａ２－ＣＡＲ－Ｔのインビボ抗腫瘍効果を示す。

【0231】

実施例１２．ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣキメラポリペプチドを発現するＢ７Ｈ３－ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ死滅
Ｂ７Ｈ３－２８Ｚ（配列番号６４）、Ｂ７Ｈ３－ＢＢＺ（配列番号６５）、及び３７６．９６－２８Ｚ（配列番号６６）を発現するＴ細胞をそれぞれ構築した。Ｂ７Ｈ３－２８Ｚを調節するＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを含むＴ細胞を、実施例１０を参照して構築した。

【0232】

Ｕ２５１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞をＮＰＧマウスの皮下に接種し、腫瘍形成後、図に従って群に分け、対応する数の細胞を投与し、腫瘍体積と体重を測定した。図１８は、ヒトＢ７Ｈ３のみを認識する３７６．９６－２８Ｚ－Ｔ細胞が有意な抗腫瘍効果を有するが、ヒト及びマウスＢ７Ｈ３を認識するＢ７Ｈ３－２８Ｚ ＣＡＲ－Ｔ及びＢ７Ｈ３－ＢＢＺ ＣＡＲ－Ｔの治療有効性が低いことを示す。特異性の低いＢ７Ｈ３－２８ＺをＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣの制御下に置くことで、その特異的な殺傷効果を向上させることができる。

【0233】

実施例１３．メソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ死滅
Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ（配列番号６７）の発現を調節するためにメソテリンを標的とするキメラポリペプチド（配列番号１０５）を発現するＴ細胞、またはＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲとＩＬ７及びＣＣＬ２１との共発現を調節するＴ細胞を、実施例１及び１０を参照して調製した。ここで、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ（配列番号６８）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲとＩＬ７（配列番号６９）、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲとＩＬ７及びＣＣＬ２１（配列番号７０）の発現を調節するメソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣの陽性率はそれぞれ４０．１％、３１．１％、３３．８％であった。異なるエフェクター対標的比に従って共培養し、上清中のＬＤＨを検出した。図１９及び２０は、メソテリン－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現する第二世代及び第四世代のＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方が、抗原によって特異的に活性化され、腫瘍細胞を殺傷することができることを示す。

【0234】

実施例１４．ＦＡＰ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボ殺傷
Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ（配列番号６７）を調節するＦＡＰ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ（配列番号１０６）を含むＴ細胞を、実施例１及び１０を参照して構築した。膵臓癌ＰＤＸモデルは、腫瘍形成後、図に従って群分けし、対応する数のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与し、腫瘍体積と体重を測定した。図２１は、ＦＡＰ－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗腫瘍性であり、マウスの体重が有意に減少しないことを示す。

【0235】

実施例１５．Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するメソテリン－ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷
メソテリン－ＣＡＲ（配列番号１０７）を調節するためのＣｌａｕｄｉｎ１８．２－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ（配列番号１０８）を含むＴ細胞を、実施例１及び１０を参照して構築した。エフェクター対標的比３：１、１：１、１：３でそれぞれ共培養し、上清のＬＤＨを検出した。図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを含むメソテリン－ＣＡＲ－Ｔ細胞が抗原によって特異的に活性化され、腫瘍細胞を殺傷することができることを示す。

【0236】

実施例１６．ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣは遺伝子発現を調節する
実施例１及び２を参照して、ＣＬＬ１を標的とするキメラポリペプチド（配列番号７３、１１０）を含むＪｕｒｋａｔ応答細胞を構築し、それぞれ１：１でＡＭＬ細胞株（図２３Ａ）と２４時間共インキュベートし、フローサイトメトリーによってＢＦＰを検出した（図２３Ｂ）。

【0237】

実施例１７．ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣを発現するＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷
実施例１０を参照して、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ（配列番号１０９）を調節するＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ（配列番号７３）を含むＴ細胞を構築した。異なるエフェクター対標的比に従って共培養し、上清中のＬＤＨを検出した。その結果、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞はＮＫＧ２Ｄリガンドを発現するＴＨＰ１及びＨＬ－６０細胞を殺傷し、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって誘導されたＣＤ３Ｚ－ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＬＬ１発現が低いＴＨＰ－１細胞に対する殺傷効果が弱く、ＣＬＬ１とＮＫＧ２Ｄリガンドの両方の発現が高いＨＬ－６０細胞のみを殺傷することができることが示されている（図２３Ａ及び２４）。この結果は、ＢＦＰ誘導性発現の実験と一致しており、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣがＡＭＬ細胞を標的とするＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性をさらに高めることを示している。

【0238】

実施例１８．インビトロで培養したＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖及び活性
インビトロで培養したＣＡＲ－Ｔ細胞を細胞計数と生存率測定のために収集した。図２５は、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞がよく増殖したことを示す。

【0239】

インビトロで培養したＣＡＲ－Ｔ細胞を収集し、抗体で標識し、７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーで検出した。図２６は、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞の死亡率がＵＴＤの死亡率と基本的に同じである一方、ＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の死亡率が有意に増加しており、ＣＬＬ１－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣによって調節されたＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲを含むＴ細胞が、培養系におけるＴ細胞の増殖と活性を効果的に確保できることを示す。

【0240】

実施例１９．他のＡＭＬ治療標的を標的とするキメラポリペプチドはＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ発現を誘導する
実施例１６～１８を参照して、ＣＤ１２３を例として、ＣＤ１２３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣキメラポリペプチド（配列番号５０）によってＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ（配列番号１０９）が調節されたＴ細胞を構築した。これは、ＡＭＬ細胞を標的とするＮＫＧ２Ｄ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性を強化し、培養系におけるＴ細胞の増殖と活性を効果的に確保することができる。

【0241】

実施例２０．キメラポリペプチドは治療用モノクローナル抗体の発現を誘導する
本出願のキメラポリペプチドＧＰＣ３－ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、及びＧＰＣ３－ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）によって発現が調節される遺伝子は、トラスツズマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、及びアダリムマブのコード配列で置き換えられ、ＧＰＣ３陽性腫瘍細胞と共インキュベートした場合、ｓｙｎＪａｇｇｅｄ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ、ｓｙｎＥｐｈｒｉｎＢ２ＥＣ－ＡＰＬＰ２（ＴＭ）は、ｓｙｎＮｏｔｃｈと比較して誘導されたトラスツズマブ、ベバシズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、及びアダリムマブの発現レベルが同等または有意に増加した。

【0242】

本明細書に記載される実施形態は、この実施形態を任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせて含む。さらに、本出願の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本出願にさまざまな変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内に含まれることを理解されたい。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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【国際調査報告】