特表 2024-523647 改変ＤＷＡＲＦ１４遺伝子を含むスイカ植物及び植物部分を選択する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】改変ＤＷＡＲＦ１４遺伝子を含むスイカ植物及び植物部分を選択する方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 6/34 20180101AFI20240621BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20240621BHJP

   C12N 15/29 20060101ALN20240621BHJP

   C12Q 1/6895 20180101ALN20240621BHJP

【ＦＩ】

A01H6/34 ZNA

A01H5/10

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6827 Z

C12N15/29

C12Q1/6895 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580665

(86)(22)【出願日】2022-06-28

(85)【翻訳文提出日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 EP2022067731

(87)【国際公開番号】W WO2023275048

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/217,071

(32)【優先日】2021-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】21194565.4

(32)【優先日】2021-09-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522327245

【氏名又は名称】ヌンヘムス ビー．ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アルヴァダ，ジャヤスリ

(72)【発明者】

【氏名】マザヘリ，モナ

(72)【発明者】

【氏名】キアッパリーノ，エレナ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ04

4B063QQ42

4B063QR32

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

(57)【要約】

本発明は、突然変異された場合、増加した二次分枝表現型を付与する、スイカ、キュウリ又はメロンにおけるＤＷＡＲＦ１４と命名された遺伝子のためのジェノタイピング方法に関する。ＤＷＡＲＦ１４遺伝子における改変を含む植物も本明細書で提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣｌＤ１４（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むスイカ植物であって、前記突然変異アレルは、対応する野生型アレルと比較して低下した遺伝子発現をもたらすか又は遺伝子発現をもたらさない、１つ以上の調節配列における突然変異を含むか、又は前記突然変異アレルは、前記野生型アレルによってコードされるタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入又は置換を含むタンパク質をコードし、ＣｌＤ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらし、前記突然変異アレルは、前記突然変異アレルがホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を発生させる前記植物をもたらし、前記突然変異アレルは、配列番号１のタンパク質をコードする突然変異アレルではなく、前記野生型アレルの前記ＣｌＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、
ｂ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、スイカ植物。

【請求項2】

前記突然変異アレルは、１つ以上のアミノ酸が挿入、置換又は欠失されているタンパク質をコードし、前記タンパク質の機能低下をもたらすが、前記タンパク質の機能喪失をもたらさず、それにより、前記二次分枝の平均数は、前記野生型ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である植物より多いが、非機能性タンパク質をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である植物ほど多くない、請求項１に記載のスイカ植物。

【請求項3】

前記突然変異アレルに対してホモ接合性であり、且つ前記野生型アレルに対してホモ接合性である前記植物と比較して増加した平均数の二次分枝を発生させる、請求項１又は２に記載のスイカ植物。

【請求項4】

種子であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の植物がそれから成長され得る、種子。

【請求項5】

ＣｌＤ１４（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）１つ以上のスイカ植物、種子又は植物部分の１つ以上のゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と、
ｂ）野生型ＣｌＤ１４アレルと前記突然変異ＣｌＤ１４アレルとを区別する、鋳型としてａ）の前記ＤＮＡサンプルを使用するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸増幅に基づき、及び／又は前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションに基づく、工程と、任意選択的に、
ｃ）前記突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択する工程と
を含み、前記突然変異ＣｌＤ１４アレルは、配列番号６の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含み、配列番号２の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異ＣｌＤ１４タンパク質をもたらす、方法。

【請求項6】

前記ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は前記ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６又は配列番号６の相補鎖の少なくとも１０ヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記突然変異アレルは、前記アレルのコード領域に挿入若しくは重複された少なくとも１つのコドン、又は別のコドンに変化された少なくとも１つのコドン、又は欠失されるか若しくは終止コドンに変化された少なくとも１つのコドンを含む、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項8】

前記突然変異アレルは、配列番号５の配列を含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６又は配列番号６の相補配列に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含む、請求項５～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ジェノタイピングアッセイは、ＫＡＳＰアッセイであり、前記ＫＡＳＰアッセイは、前記ＤＮＡサンプル中において、配列番号６の前記野生型アレルを検出する第１のフォワードプライマーと、前記ＤＮＡサンプル中において、配列番号６に対して挿入、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含む前記突然変異アレルを検出する第２のフォワードプライマーと、１つの共通のリバースプライマーとを含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スイカにおける改変（又は突然変異）遺伝子の同定並びにこの遺伝子の改変（若しくは突然変異）アレル又はこの遺伝子の野生型アレルを含む植物及び植物部分を生成及び／又は選択する方法に関する。この遺伝子は、野生型遺伝子がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＡｔＤＷＡＲＦ１４（ＡｔＤ１４）遺伝子のオルソログであると推定されるため、ＤＷＡＲＦ１４、又はＣｌＤＷＡＲＦ１４、又はＣｌＤ１４と呼ばれる。通常のスイカ植物では、野生型ＣｌＤ１４遺伝子は、８番染色体上に見られ、２６７アミノ酸のＣｌＤ１４タンパク質をコードする。この遺伝子の改変アレルは、多分枝性スイカ植物において見られ、これは、８アミノ酸の重複を含み、したがって２７５アミノ酸のタンパク質であった（図１を参照されたい）。ＣｌＤ１４遺伝子のこの改変アレルに対してホモ接合性である植物は、多分枝表現型を有し、二次分枝の平均数は、４５以上の二次分枝である。対照的に、改変アレルに対してヘテロ接合性であるか、又は野生型アレルに対してホモ接合性であるスイカ植物は、通常の分枝表現型を有し、二次分枝の平均数は、４５を大きく下回り、例えば平均して約３０未満の二次分枝、例えば約２０の二次分枝である。

【背景技術】

【0002】

メロン及びキュウリなどの他のウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）も、スイカＣｌＤ１４タンパク質と高い配列同一性を有するＤ１４タンパク質をコードする遺伝子を含有する。これらは、例えば、ＣｍＤ１４（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ））又はＣｓＤ１４（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ））遺伝子及びタンパク質と呼ばれる。スイカ、キュウリ及びメロン遺伝子及びタンパク質は、本明細書では単にＤ１４遺伝子、Ｄ１４アレル又はＤ１４タンパク質とも呼ばれる。

【0003】

８つのアミノ酸重複を含む突然変異アレルは、非機能性ＣｌＤ１４タンパク質を実際にコードすることが意外にもさらに分かった。Ｄ１４タンパク質は、様々な他のタンパク質と相互作用する複雑なタンパク質であり、８つのアミノ酸重複がタンパク質機能を完全になくすことが予想されなかったため、これは、予想外であった。スイカＴＩＬＬＩＮＧ集団をスクリーニングするとき、切断された非機能性タンパク質（２６７アミノ酸のうちの１１３アミノ酸を欠いた）をコードした突然変異アレルは、意外にも、８つのアミノ酸重複を含む突然変異アレルと同じ多分枝表現型をもたらした。両方の突然変異アレルは、野生型植物における二次分枝の平均数（１００％の二次分枝に設定された）と比べて約２４０％である二次分枝の平均数をもたらした。非機能性タンパク質によって引き起こされるこの強い表現型は、本明細書では「強い多分枝」又は「完全な多分枝」と呼ばれる。さらに、この結果は、「完全な多分枝」をもたらさないが、「中間の多分枝」をもたらす突然変異アレルの生成を可能にし、それにより、ＣｌＤ１４タンパク質は、機能低下を有し、機能喪失を有さない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

したがって、一態様では、本発明は、（突然変異アレルがホモ接合体である場合に）非機能性ＣｌＤ１４タンパク質及び完全な多分枝をもたらす、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含むか、又は（突然変異アレルがホモ接合体である場合に）機能低下ＣｌＤ１４タンパク質及び中間の多分枝をもたらす、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含むスイカ植物に関する。配列番号１（ＣｌＤ１４ｉｎｓ）の非機能性タンパク質をコードする突然変異アレルを含むスイカ植物は、一態様では包含されない。

【0005】

本発明は、別の態様では、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）植物、特にスイカ、メロン又はキュウリ植物又は植物部分がＤ１４遺伝子の野生型アレル及び／又はＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含むかどうかを決定する方法に関する。Ｄ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号２のスイカＤ１４タンパク質（又は配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質）、配列番号８のキュウリＤ１４タンパク質（若しくは配列番号８との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質）又は配列番号９のメロンタンパク質（若しくは配列番号９との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質）をコードする。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号８（キュウリ）又は配列番号９（メロン）のアミノ酸９４～１０１の重複をコードするアレルである。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号９（メロン）又は配列番号８（キュウリ）の野生型タンパク質と比較して挿入、重複、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝をもたらす機能低下タンパク質であるか、又はアレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす非機能性タンパク質である。

【0006】

野生型アレル又はＤ１４遺伝子の突然変異アレルを検出する方法も提供され、それにより、プライマー対又はオリゴヌクレオチドプローブのいずれかは、スイカ、メロン又はキュウリのゲノムＤＮＡ中のＤ１４アレルを増幅又は検出するために使用される。オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブは、配列番号５若しくは６（又はこれらのいずれかの相補ＤＮＡ鎖）又は配列番号１５若しくは１６（又はこれらのいずれかの相補ＤＮＡ鎖）の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超える連続したヌクレオチドを含む。特に、ＰＣＲ反応においてゲノムＤ１４アレルの一部にハイブリダイズし、それを増幅する少なくとも１つのフォワードプライマー及び１つのリバースプライマーのプライマーの対が提供される。

【0007】

別の態様では、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）植物、特にスイカ、メロン又はキュウリ植物又は植物部分を生成及び／又は選択する方法は、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号８（キュウリ）又は配列番号９（メロン）のアミノ酸９４～１０１の重複をコードするアレルである。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号９（メロン）又は配列番号８（キュウリ）の野生型タンパク質と比較して挿入、重複、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝をもたらす機能低下タンパク質であるか、又はアレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす非機能性タンパク質である。

【0008】

一態様では、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物及び植物部分も提供される。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号８（キュウリ）又は配列番号９（メロン）のアミノ酸９４～１０１の重複を含むタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号９（メロン）又は配列番号８（キュウリ）の野生型タンパク質と比較して挿入、重複、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝をもたらす機能低下タンパク質であるか、又はアレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす非機能性タンパク質である。

【0009】

一態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルに対してヘテロ接合性であるスイカ植物が提供される。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）のアミノ酸９４～１０１の重複を含むタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号９（メロン）又は配列番号８（キュウリ）の野生型タンパク質と比較して挿入、重複、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝をもたらす機能低下タンパク質であるか、又はアレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす非機能性タンパク質である。

【0010】

米国特許第７３１４９７９Ｂ２号明細書は、ＨＭＢＮアレルと呼ばれる劣性アレルを記載しており、これは、ホモ接合体において二次分枝を増加させ、平均果実重量を０．８７ｋｇに減少させる。

【0011】

国際公開第２００６／０６０４２５号パンフレットも、ＨＭＢＮアレルと呼ばれる劣性アレルを記載している。１５頁［００９０］において、ＨＭＢＮアレルは、「スイカ育種計画から生じた予想外の突然変異アレル」として記載されている。

【0012】

米国特許出願公開第２０２００９３０８６号明細書は、ホモ接合体におけるＨＭＢＮアレル及び２番染色体上の突然変異ｔｓ遺伝子アレルの組合せのため、０．９ｋｇ未満の小さい果実を産生するスイカ植物を記載している。

【0013】

ＨＭＢＮアレルの遺伝子及び遺伝子位置は、これまで知られていない。その結果、遺伝子の機能も知られていない。

【0014】

本明細書では、ＨＭＢＮアレルの遺伝子が同定され、配列番号２（野生型ＣｌＤ１４タンパク質）のアミノ酸９４～１０１の重複を含むＣｌＤ１４タンパク質をコードすることが分かった。この突然変異タンパク質は、配列番号１に示され、本明細書ではＣｌＤ１４ｉｎｓ（「挿入」のため）とも呼ばれる。

【0015】

野生型タンパク質ＣｌＤ１４（配列番号２）は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＷＡＲＦ１４タンパク質のオルソログであると考えられる。ＡｔＤＷＡＲＦ１４は、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるストリゴラクトンシグナル伝達及びストリゴラクトン加水分解において二重機能を有することが示されているタンパク質であり、これは、これらの機能のいずれにも影響を与える突然変異体が作出されたためである。Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０：１９１，Ｓｔｒｉｇｏｌａｃｔｏｎｅ ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＤＷＡＲＦ１４）を参照されたい。この刊行物では、著者は、図５において、ストリゴラクトンシグナル伝達経路及び加水分解におけるシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＤＷＡＲＦ１４（ＡｔＤ１４）タンパク質の関与のモデルを記載している。生物活性ストリゴラクトン分子は、ＡｔＤ１４タンパク質によって知覚され、ＡｔＤ１４タンパク質の構造変化を誘導して、他のシグナル伝達タンパク質（Ｄ５３など）とのタンパク質複合体の形成をもたらす。シグナル伝達は、例えば、分枝形成の阻害をもたらす。シグナル伝達後、ＡｔＤ１４タンパク質は、その元の構造に戻るように変化し、ストリゴラクトン分子を加水分解する。したがって、ＡｔＤ１４は、例えば、分枝形成を阻害するシグナル伝達及び植物におけるストリゴラクトンレベルの恒常性の両方に関与する。ＡｔＤ１４タンパク質は、「触媒三残基」と呼ばれる３つのアミノ酸、すなわちＳ９７（セリン９７）、Ｄ２１８（アスパラギン２１８）及びＨ２４７（ヒスチジン２４７）を含有する。これらは、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｄ１４タンパク質及び改変スイカＣｌＤ１４タンパク質における対応するアミノ酸について図２に示される。

【0016】

多分枝表現型（ＨＭＢＮアレルによって引き起こされる）の根底にあることが特定された配列番号１（ＣｌＤ１４ｉｎｓ）のスイカタンパク質は、８つのアミノ酸の重複を含むことが分かった。重複は、図２に見られるように、触媒三残基のアミノ酸の１つを含み、すなわちＳ９７が重複される。ＡｔＤ１４タンパク質におけるＳ９７は、タンパク質の表面に位置するようであり、リガンド結合に関与するようである。

【0017】

最初に、何らかの理論によって制約されるものではないが、ＣｌＤ１４タンパク質における８つのアミノ酸の重複は、他のタンパク質／リガンドとの相互作用を減少させるか若しくは防止するためにＣｌＤ１４構造を変化させるか、又はストリゴラクトン分子のための結合ポケットが影響され、それによりシグナル伝達を減少させるか若しくは防止するようにＣｌＤ１４構造を変化させることがあり得ることが本出願人によって推測された。

【0018】

しかしながら、さらなる分析により、８つのアミノ酸の重複の影響は、ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質がインビボで非機能的であり、スイカにおいてそのシグナル伝達の役割を果たすことができないことであることが意外にも分かった。したがって、突然変異アレルがホモ接合体である場合に見られる表現型は、最も極端な二次分枝形成であり、本明細書では「完全な多分枝」又は「強い多分枝」と呼ばれる。これは、アミノ酸Ｗ１５５についてのコドンが終止コドン（Ｗ１５５終止又はＷ１５５^＊）に突然変異されて、配列番号２のアミノ酸１～１５４のみを含む切断タンパク質をもたらすＴＩＬＬＩＮＧ突然変異体から結論付けられた。Ｗ１５５^＊タンパク質は、野生型タンパク質の１１３アミノ酸が欠失しているため、非機能的であるはずである。突然変異アレルＷ１５５^＊に対してホモ接合性である植物における（平均）二次分枝形成に対する影響は、ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質をコードする突然変異アレルを含む植物において見られるのと同じであった。実施例を参照されたい。

【0019】

したがって、意外にも、ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質（８つのアミノ酸重複を含む）は、インビボで非機能的であり、すなわち、それは、ストリゴラクトンシグナル伝達経路においてその機能を喪失し、もはやいずれのシグナルも伝達せず、それにより二次分枝形成の阻害が誘導されず、多分枝表現型が最大限に発現されることが分かった。

【0020】

スイカ植物は、雄花の花粉による雌花の授粉後に種あり果実を産生する二倍体（２ｎ）又は別のスイカ植物（授粉種植物と呼ばれる）からの花粉による雌花の授粉後に種なし果実を産生する三倍体（３ｎ）（三倍体植物の花は、稔性花粉を産生しないため）のいずれかの果実産生のために栽培される。

【0021】

ＨＭＢＮアレルは、ホモ接合体においてＨＭＢＮアレルを含有し、多分枝表現型を有する授粉種植物を発生させるためにこれまで使用されきた。これらの授粉種の１つは、Ｓｉｄｅｋｉｃｋ品種である（Ｈａｒｒｉｓ Ｍｏｒａｎ、ワールドワイドウェブのｈｍｃｌａｕｓｅ．ｃｏｍ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１４／１１／ＵＳＡＣＡＮＡＤＡ＿Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ＿Ｓｉｄｅｋｉｃｋ＿Ｔｅｃｈｓｈｅｅｔ＿２０１４＿ＥＮＧ．ｐｄｆを参照されたい）。Ｓｉｄｅｋｉｃｋは、種あり果実がピンク色の果肉を有し、廃棄されるため、収穫不可能な授粉種である。

【0022】

市販の授粉種は、収穫可能又は収穫不可能な授粉種であるとして区別され得る（同様にＭｃＧｒｅｇｏｒ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｓ ２０１４、上掲を参照されたい）。収穫可能な授粉種は、雌花の授粉後に市場性のある種あり果実を産生する二倍体授粉種である。収穫不可能な授粉種は、雌花の授粉後、果肉が白い果実、脆い外皮を有する果実など、農学的に望ましくない果実を産生する二倍体授粉種である。したがって、栽培者は、三倍体、種なし果実及び二倍体、種あり果実を１つの圃場で生産するか、又は三倍体、種なし果実のみを生産し、授粉種の二倍体、種あり果実を廃棄することを選択し得る。明らかに、授粉種は、本来であれば三倍体植物によって占有可能な圃場の多くの空間を占め、この理由から、小型の植物を産生するいくつかの授粉種が開発されている。

【0023】

本発明者らは、Ｓｉｄｅｋｉｃｋ中に存在し、Ｓｉｄｅｋｉｃｋの多分枝表現型の根底にある単一の劣性遺伝子が、配列番号２の野生型タンパク質と比較して８つのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードすることを発見した。改変（又は突然変異）タンパク質は、配列番号１として本明細書に含まれる。野生型タンパク質及び突然変異タンパク質のアラインメントが図１に示されている（「Ｄ１４Ｉｎｓ」は、配列番号１の突然変異タンパク質であり、「ＷＴ」は、配列番号２の野生型タンパク質である）。したがって、突然変異ＣｌＤ１４遺伝子（配列番号５及び配列番号３に示される）のゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ／ｍＲＮＡは、野生型ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ（配列番号６及び配列番号４に示される）と比べて２４ヌクレオチドの重複を含む。

【0024】

本発明者らは、Ｓｉｄｅｋｉｃｋの多分枝表現型が、配列番号２の野生型タンパク質と比較して８つのアミノ酸の重複を含むタンパク質のため、インビボで非機能的であることと、表現型が「完全な多分枝」であり、すなわち二次分枝形成が起こることを阻害するシグナル伝達がないこととをさらに発見した。それにより、本発明者らは、初めて、突然変異アレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす様々な突然変異アレル（Ｓｉｄｅｋｉｃｋ中に存在する突然変異アレルと異なる）を作出することができるだけでなく、インビボで機能を保持するが、野生型タンパク質と比較して低下した機能を有し、突然変異アレルがホモ接合体である場合により穏やかな又は中間の多分枝をもたらす突然変異アレルを作出することもできる。

【0025】

ＢＬＡＳＴ解析により、キュウリ（ＣｓＤ１４）及びメロン（ＣｍＤ１４）の対応するタンパク質が同定された。これらは、以下の表１に示されるように、（Ｅｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅペアワイズアラインメント、デフォルトパラメータを用いて）互いに非常に高い配列同一性を有する。

【0026】

【表1】

【0027】

高いタンパク質配列同一性を考慮すると、スイカ、キュウリ及びメロンＤ１４タンパク質のインビボ機能が同じであることが予想される。

【0028】

したがって、相応して、ＣｌＤ１４（配列番号２）、ＣｓＤ１４（配列番号８）及びＣｍＤ１４（配列番号９）におけるアミノ酸９４～１０１の重複は、ホモ接合体において、野生型タンパク質をコードする野生型アレルに対してホモ接合性である植物よりはるかに多い二次分枝（「完全な多分枝」）を形成させるはずである。同様に、Ｄ１４タンパク質の機能喪失をもたらす他の突然変異アレルは、「完全な多分枝」をもたらすはずであり、Ｄ１４タンパク質の機能低下をもたらす突然変異アレルは、「中間の多分枝」をもたらすはずである。図３は、突然変異スイカＣｌＤ１４タンパク質（配列番号１、図３中のＣｌＤ１４ｉｎｓ）及び野生型キュウリ及びメロンタンパク質の多重配列アラインメントを示す。

【0029】

一態様では、これらの突然変異アレル並びにホモ接合体又はヘテロ接合体におけるこれらの突然変異アレルを含む植物及び植物部分（果実など）が本明細書に包含される。

【0030】

したがって、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子における任意の突然変異アレル及びこのような突然変異アレル、特に１つ以上のアミノ酸が配列番号２（スイカＣｌＤ１４）、配列番号８（キュウリＣｓＤ１４）又は配列番号９（メロンＣｍＤ１４）の野生型タンパク質と比べて、挿入、欠失、重複又は置換される突然変異アレルを含む植物が本明細書に包含される。一態様では、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、重複又は置換により、コードされたタンパク質は、インビボで機能低下Ｄ１４タンパク質又は機能喪失Ｄ１４タンパク質になる。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸９４～１０１の少なくとも１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全てのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードする。一態様では、少なくともＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４の９７位におけるＳｅｒ（Ｓ）が重複される。

【0031】

ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子における突然変異アレルを生成するためのさらなる方法が本明細書に包含される。特に、インビボで機能低下又は機能喪失を有し、突然変異アレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝（インビボで機能喪失型の場合）又は中間の多分枝（インビボで機能低下型の場合）をもたらすタンパク質をコードする突然変異アレルを生成する方法である。

【0032】

一態様では、配列番号２、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸９４～１０１の少なくとも１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全てのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードする突然変異アレルを生成する方法も包含される。一態様では、タンパク質をコードする突然変異アレルを生成する方法であり、少なくとも野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質の９７位におけるＳｅｒ（Ｓ）が重複される。

【0033】

ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレル及び／又は野生型アレルの存在について植物又は植物部分又は種子をスクリーニング（例えば、ジェノタイピング）及び／又は選択する方法も本明細書で提供される。

【0034】

突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、１つ以上のアミノ酸が野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質と比較して挿入、重複、欠失及び／又は置換されているタンパク質をコードするアレルを含み得るか、又は突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、プロモーター又はエンハンサーなど、遺伝子の調節領域における１つ以上の突然変異（１つ以上のヌクレオチドの挿入、重複、欠失及び／又は置換）を含み得、それにより機能低下野生型タンパク質又は機能喪失野生型タンパク質が作出される。

【0035】

一態様では、突然変異アレルは、置換、挿入及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、それにより、タンパク質は、インビボで非機能的であり、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物は、完全な多分枝を示す。したがって、機能性Ｄ１４が植物中に存在しないため、完全な多分枝は、二次分枝形成の阻害を完全に欠いている。スイカにおける完全な多分枝は、例えば、野生型植物（１００％の二次分枝に設定された）と比べて約２４０％の二次分枝の平均数として見られる（実施例を参照されたい）。好ましくは、ホモ接合体における突然変異アレルを含む植物及びホモ接合体における野生型アレルを含む植物の表現型は、同じ遺伝的背景において比較され、それによりバックグラウンドゲノムが酷似し、遺伝子型の相違を最小限に抑える。

【0036】

一態様では、突然変異アレルは、野生型Ｄ１４タンパク質をコードし、突然変異アレルは、例えば、調節領域（プロモーターなど）の突然変異のためにインビボで発現されず、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物は、完全な多分枝を示す。

【0037】

突然変異がインビボでＤ１４タンパク質の機能喪失をもたらす、Ｄ１４のノックアウトアレル又はＤ１４の突然変異アレルは、本明細書の他の箇所で説明されるように、デノボで容易に生成され得る。

【0038】

一態様では、突然変異アレルは、置換、挿入及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、それにより、タンパク質は、インビボで機能低下を有し、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物は、中間の多分枝を示す。したがって、中間の多分枝は、植物における二次分枝形成の阻害を完全に欠いておらず、突然変異Ｄ１４タンパク質は、インビボでいくらかの機能性を保持し、二次分枝形成を部分的に阻害する。スイカにおける中間の多分枝は、例えば、野生型植物（機能性Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である）の平均数と、非機能性Ｄ１４タンパク質又はノックアウトアレルに対してホモ接合性である植物の平均数との間で生じる二次分枝の平均数として見られる。例えば、機能性Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である植物が、１００％に設定された二次分枝の平均数を生成し、非機能性Ｄ１４タンパク質をコードするアレルに対してホモ接合性である（又はノックアウトアレルに対してホモ接合性である）植物が野生型と比べて２４０％の二次分枝を生成する場合、「中間の多分枝」は、１００％（ホモ接合性野生型）と２４０％（ホモ接合性非機能性）との間の二次分枝の平均数を生成し、それにより野生型植物（１００％の二次分枝に設定された）と比べて約少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％又は２００％の二次分枝の平均数であるが、完全な多分枝未満である（実施例を参照されたい）。突然変異がＤ１４タンパク質のインビボでの機能低下をもたらす、Ｄ１４遺伝子における突然変異アレルは、本明細書の他の箇所で説明されるように、デノボで容易に生成され得る。

【0039】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（スイカ）、配列番号８（キュウリ）又は配列番号９（メロン）のアミノ酸２２から開始し、アミノ酸２５９で終了する、ＩＰＲ００００７３ドメインにおいて置換、挿入及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。

【0040】

一態様では、突然変異アレルは、表２又は図６に示されるような突然変異Ｄ１４タンパク質をコードする。

【0041】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（野生型スイカタンパク質）、又は配列番号８（野生型キュウリタンパク質）、又は配列番号９（野生型メロンタンパク質）のアミノ酸９４～１０１の領域において置換、挿入及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。

【0042】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（野生型スイカタンパク質）、又は配列番号８（野生型キュウリタンパク質）、又は配列番号９（野生型メロンタンパク質）のアミノ酸９４～１０１から選択される重複した１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。

【0043】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２（野生型スイカタンパク質ＣｌＤ１４）、又は配列番号８（野生型キュウリタンパク質ＣｓＤ１４）、又は配列番号９（野生型メロンタンパク質ＣｍＤ１４）のアミノ酸９４～１０１から選択される重複した１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全てのアミノ酸を含むタンパク質をコードする。一態様では、突然変異アレルは、少なくとも、配列番号２（野生型スイカタンパク質）、又は配列番号８（野生型キュウリタンパク質）、又は配列番号９（野生型メロンタンパク質）のセリン９７（Ｓ９７）の重複を含むタンパク質をコードする。一態様では、１つ以上の重複したアミノ酸が野生型アミノ酸に隣接する。

【0044】

一態様では、上記の突然変異アレルは、野生型アレル（ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４及びＣｍＤ１４の野生型タンパク質をコードする）に対してホモ接合性である植物と比較して、突然変異アレルがホモ接合体である場合、スイカ、キュウリ又はメロン植物の増加した二次分枝をもたらす。一態様では、突然変異アレルは、ノックアウトアレルであるか、又は突然変異アレルがホモ接合体である場合に完全な多分枝をもたらす非機能性Ｄ１４タンパク質をコードする。一態様では、突然変異アレルは、野生型Ｄ１４タンパク質と比較して低下した機能を有するが、インビボで機能を依然として保持し、突然変異アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝をもたらす突然変異Ｄ１４タンパク質をもたらす。

【0045】

上記の突然変異アレルは、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの技術などの標的化された遺伝子編集技術又は放射線に誘発される突然変異誘発若しくは化学的に誘発される突然変異誘発などの突然変異誘発により、デノボで容易に生成され得る。二次分枝数がホモ接合性突然変異体植物においてより多いかどうかを決定するために、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物は、植物を自殖させ、次に野生型対照（例えば、非突然変異植物）と比較してホモ接合性植物を成長させることによって生成され得る。

【0046】

別の態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｍＤ１４又はＣｓＤ１４アレルは、野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質のＣ末端の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれを超えるアミノ酸が欠失しているか、又は異なるアミノ酸で任意選択的に置換された切断タンパク質をコードして、タンパク質が、低下したインビボ機能を有するか又はインビボ機能を有さないようにする。

【0047】

異なる態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｍＤ１４又はＣｓＤ１４アレルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれを超えるアミノ酸が野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質に挿入されるか、又はそれと重複されるか、又はそれと置換されるか、又はそれから欠失されているタンパク質をコードして、タンパク質が、低下したインビボ機能を有するか又はインビボ機能を有さないようにする。

【0048】

前述されるように、多分枝の程度は、突然変異タンパク質の機能性によって決定され、それにより、非機能性突然変異タンパク質は、最大レベルの多分枝（本明細書では完全な又は強い多分枝と呼ばれる）をもたらす一方、機能低下突然変異タンパク質は、より低い程度の多分枝（本明細書では中間の多分枝と呼ばれる）をもたらす。したがって、Ｄ１４機能性と多分枝の程度との間に直接的な関係がある。当業者は、様々な突然変異アレル及び突然変異アレルを含むホモ接合性植物を容易に生成し、次にこの植物を栽培し、所望の程度の多分枝をもたらす突然変異アレルを選択することができる。

【0049】

本発明の一態様では、対応する野生型植物細胞と比較して、ＣｌＤ１４タンパク質、ＣｓＤ１４タンパク質又はＣｍＤ１４タンパク質の低下した活性を有することを特徴とする植物又は植物細胞が提供され、野生型植物細胞のＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号２（スイカＣｌＤ１４）、配列番号８（キュウリＣｓＤ１４）又は配列番号９（メロンＣｍＤ１４）で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列が、配列番号２（スイカＣｌＤ１４）、配列番号８（キュウリＣｓＤ１４）又は配列番号９（メロンＣｍＤ１４）で示されるアミノ酸配列との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号４若しくは配列番号６又は配列番号４若しくは配列番号６との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含む配列の、ＣｌＤ１４タンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）配列番号１７若しくは配列番号１５又は配列番号１７若しくは配列番号１５との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含む配列の、ＣｓＤ１４タンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）配列番号１８若しくは配列番号１６又は配列番号１８若しくは配列番号１６との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含む配列の、ＣｍＤ１４タンパク質をコードする核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる。

【0050】

ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質の低下した活性は、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルによって引き起こされる。

【0051】

低下した活性は、突然変異アレルの発現のノックダウン若しくはノックアウト（例えば、プロモーター若しくは他の調節配列における突然変異によって）又は機能喪失若しくは機能低下ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４若しくはＣｍＤ１４タンパク質をコードする突然変異アレルによって引き起こされ得る。機能喪失タンパク質をコードする突然変異アレル又はノックアウトアレルは、ホモ接合体において強い多分枝表現型を有する植物をもたらす一方、機能低下タンパク質をコードする突然変異アレル又はノックダウンアレルは、ホモ接合体において、野生型アレルに対してホモ接合性である植物と、機能喪失（又はノックアウト）アレルに対してホモ接合性である植物との間の中間の多分枝表現型をもたらすであろう。

【0052】

一態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、野生型タンパク質と比較して機能低下又は機能喪失を有する突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質をコードし、例えば、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して置換、欠失及び／若しくは挿入又は重複された１つ以上のアミノ酸を含む。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９の野生型タンパク質と比べて置換、欠失又は挿入された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、それにより、突然変異タンパク質は、機能喪失を有し、強い多分枝（ホモ接合体である場合）をもたらすか、又は機能低下を有し、中間の多分枝（ホモ接合体である場合）をもたらすかのいずれかである。

【0053】

本明細書でスイカにおいて生成されるＷ１５５^＊突然変異体など、切断Ｄ１４タンパク質をもたらす突然変異アレルは、一般に、機能喪失をもたらすであろう。Ｑ２５５^＊はまた、高度に保存されたＩＰＲ００００７３ドメインの５アミノ酸を含む、タンパク質の最後の１３アミノ酸が欠失しているため、機能喪失又は機能低下をもたらし得る。

【0054】

切断タンパク質或いは別のアミノ酸で置換されるか又は欠失若しくは挿入された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルが容易に生成され、アレルがホモ接合体である場合、多分枝に対する影響を調べるためにインビボで試験され得る。表２及び以下の表Ａに記載される突然変異体もスイカ、メロン若しくはキュウリにおいて容易に生成され得るか、又は他の突然変異体は、ランダム変異誘発、続いて例えばＴＩＬＬＩＮＧ、標的化突然変異誘発方法などの公知の方法を用いて生成され得る。

【0055】

ＳＩＦＴ又はＰＲＯＶＥＡＮ解析などのソフトウェアプログラムも、タンパク質機能に対するアミノ酸挿入、欠失又は置換の影響の予測を行うために使用され得るが、これは、単なる予測であり、依然としてインビボで確認される必要がある。例えば、Ｐ２４５Ｌは、ＳＩＦＴ解析によって「許容されない」と予測され、Ｐｒｏｖｅａｎ解析によって「有害」と予測され、これは、タンパク質の機能が喪失又は低下されることが予測されることを意味する。ＳＩＦＴ解析を用いて「許容される」又はＰｒｏｖｅａｎ解析を用いて「中性」であると予測される変化について、機能は、変化しないと予測される。しかしながら、記載されるように、予測は、真実である必要はなく（それは、統計モデルに基づく）、インビボ分析が必要とされる。さらに、タンパク質機能に対する影響を与えることが予測される突然変異アレルについてのさらなる分析に焦点を合わせるためのツールが有用であり得る。

【0056】

【表2】

【0057】

したがって、本明細書における一態様は、ＣｌＤ１４（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むスイカ植物であって、突然変異アレルは、対応する野生型アレルと比較して低下した遺伝子発現をもたらすか又は遺伝子発現をもたらさない、１つ以上の調節配列における突然変異を含むか、又は突然変異アレルは、野生型アレルによってコードされるタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入又は置換を含むタンパク質をコードし、ＣｌＤ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらし、突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を発生させる前記植物をもたらし、突然変異アレルは、配列番号１のタンパク質をコードする突然変異アレルではなく、野生型アレルのＣｌＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、スイカ植物である。

【0058】

本明細書における別の態様は、ＣｓＤ１４（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むキュウリ植物であって、突然変異アレルは、対応する野生型アレルと比較して低下した遺伝子発現をもたらすか又は遺伝子発現をもたらさない、１つ以上の調節配列における突然変異を含むか、又は突然変異アレルは、野生型アレルによってコードされるタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入又は置換を含むタンパク質をコードし、ＣｓＤ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらし、突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を発生させる前記植物をもたらし、野生型アレルのＣｓＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１５で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、キュウリ植物である。

【0059】

本明細書におけるさらに別の態様は、ＣｍＤ１４（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むメロン植物であって、突然変異アレルは、対応する野生型アレルと比較して低下した遺伝子発現をもたらすか又は遺伝子発現をもたらさない、１つ以上の調節配列における突然変異を含むか、又は突然変異アレルは、野生型アレルによってコードされるタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入又は置換を含むタンパク質をコードし、ＣｍＤ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらし、突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を発生させる前記植物をもたらし、野生型アレルのＣｍＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）配列番号１６で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、メロン植物である。

【0060】

特に、スイカ植物、キュウリ植物又はメロン植物は、１つ以上のアミノ酸が挿入、置換又は欠失されているタンパク質をコードする突然変異アレルを含み、前記突然変異タンパク質は、タンパク質の機能喪失ではなく、機能低下を含み、それにより、二次分枝の平均数は、野生型Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である植物より多いが、非機能性タンパク質をコードする突然変異Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である植物ほど多くない。

【0061】

一態様では、スイカ植物、キュウリ植物又はメロン植物は、１つ以上のアミノ酸が挿入、置換又は欠失されているタンパク質をコードする突然変異アレルも含み、前記突然変異タンパク質は、タンパク質の機能喪失を含む。

【0062】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＶ１４が様々なアミノ酸、特にＩ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0063】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＰ４４が様々なアミノ酸、特にＳ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0064】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＬ７２が様々なアミノ酸、特にＦ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0065】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＨ８９が様々なアミノ酸、特にＹ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0066】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＧ１２１が様々なアミノ酸、特にＳ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0067】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２又は９のＳ１３９が様々なアミノ酸、特にＮ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0068】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＷ１５５が様々なアミノ酸又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0069】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＧ２３５が様々なアミノ酸、特にＶ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0070】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＰ２５４が様々なアミノ酸、特にＬ又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0071】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のＱ２５５が様々なアミノ酸又は終止コドンで置換されているタンパク質をコードする。

【0072】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～アミノ酸１０１から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全てのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードする。一態様では、少なくともＳ９７が重複される。一態様では、アミノ酸９４～１０１が重複される。

【0073】

別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～アミノ酸１０１から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全てのアミノ酸の欠失又は置換を含むタンパク質をコードする。一態様では、少なくともＳ９７が欠失されるか又は別のアミノ酸で置換される。一態様では、アミノ酸９４～１０１が欠失されるか又は他のアミノ酸で置換される。

【0074】

したがって、一態様では、突然変異アレルは、それぞれ配列番号２、８又は９のＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４、ＣｍＤ１４タンパク質をコードし、少なくともＳ９７が重複されるか、又は以下のアミノ酸の少なくとも１、２、３、４、５、６、７つ又は８つ全ての連続したアミノ酸、Ｖ９４（バリン９４）、Ｇ９５（グリシン９５）、Ｈ９６（ヒスチジン９６）、Ｓ９７（セリン９７）、Ｖ９８（バリン９８）、Ｓ９９（セリン９９）、Ａ１００（アラニン１００）、Ｍ１０１（メチオニン１０１）が重複される。一態様では、少なくとも１、２、３、４又はそれを超える連続したアミノ酸がＳ９７を含む。

【0075】

一態様では、少なくとも１、２、３、４又はそれを超えるアミノ酸の重複は、元のアミノ酸に隣接して位置し、すなわち重複したアミノ酸間に他のアミノ酸の間隔を有さない。

【0076】

別の態様では、突然変異アレルは、それぞれ配列番号２、８又は９のＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４、ＣｍＤ１４タンパク質をコードし、少なくとも１つのアミノ酸、例えば配列番号２、８若しくは９のアミノ酸９４～１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸又は配列番号２、８若しくは９のＩＰＲ００００７３ドメインにおける少なくとも１つのアミノ酸或いはヘリカルリッドドメインの少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸又は終止コドンで置換されて、アレルがホモ接合体である場合（野生型アレルが二倍体植物又は植物細胞中に存在しない場合）、機能喪失又は機能低下タンパク質及び表現型変化（増加した二次分枝）をもたらす。ＩＰＲ００００７３ドメインは、配列番号２、８及び９のアミノ酸２２から開始し、配列番号２、８及び９のアミノ酸２５９で終了する。ヘリカルリッドドメインは、配列番号２、８及び９のアミノ酸１３６から開始し、配列番号２、８及び９のアミノ酸１９３で終了する。開始又は終了に言及するとき、言及されるアミノ酸又はヌクレオチドが含まれる。

【0077】

さらに別の態様では、突然変異アレルは、それぞれ配列番号２、８又は９のＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４、ＣｍＤ１４タンパク質をコードし、触媒三残基の少なくとも１つのアミノ酸又は１、２、３、４、５、６、７若しくは８位だけ触媒三残基のアミノ酸の前若しくは後が別のアミノ酸又は終止コドンで置換されて、アレルがホモ接合体である場合（野生型アレルが二倍体植物又は植物細胞中に存在しない場合）、機能喪失又は機能低下タンパク質及び表現型変化（増加した二次分枝）をもたらす。触媒三残基のアミノ酸は、配列番号２、８又は９のＳ９７、Ｄ２１８及びＨ２４７である。

【0078】

別の態様では、１つ以上のアミノ酸は、例えば、未成熟終止コドンを生じる突然変異によって欠失し、アレルがホモ接合体である場合（野生型アレルが二倍体植物又は植物細胞中に存在しない場合）、機能喪失又は機能低下タンパク質及び表現型変化（増加した二次分枝）をもたらす。特に、一態様では、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～１０１から選択される１つ以上のアミノ酸は、例えば、前記アミノ酸をコードするコドンの前の配列中に存在する未成熟終止コドン突然変異によって欠失している。代わりに、ＩＰＲ００００７３ドメインの１つ以上のアミノ酸が欠失するか、又はヘリカルリッドドメインの１つ以上のアミノ酸が欠失するか、又は触媒三残基の１つ以上のアミノ酸及び／又は１、２、３、４、５、６、７若しくは８位だけ触媒三残基のアミノ酸の前若しくは後が、例えば、前記アミノ酸をコードするコドンの前の配列中に存在する未成熟終止コドン突然変異によって欠失している。

【0079】

突然変異アレルが、インビボ表現型を野生型表現型、すなわち野生型アレルがホモ接合体において存在する場合の通常の二次分枝から、突然変異アレルが二倍体植物においてホモ接合体である場合の増加した二次分枝に変化させる場合、タンパク質の機能低下又は機能喪失が存在する。したがって、「増加した二次分枝」又は「増加した平均数の二次分枝」という用語は、機能喪失Ｄ１４タンパク質又はＤ１４アレルの発現のノックアウトによって生じる「完全な多分枝」表現型及び機能低下Ｄ１４タンパク質又は野生型機能性Ｄ１４アレルと比較したＤ１４アレルの低下した発現によって生じる「中間の多分枝」表現型の両方を包含する。二次分枝の絶対平均数は、遺伝子型間でいくらか異なり得るが、相対的影響は、様々な遺伝子型において同じであるはずである。したがって、特定の遺伝的背景又は遺伝子型において、野生型は、二次分枝の特定の平均数を有し、機能喪失タンパク質又はノックアウトアレルは、二次分枝の最大又は「完全な」平均数を有し、機能低下又はノックダウンアレルは、これらの２つの極値の中間である。例えば、野生型における二次分枝の平均数が１００％に設定され、機能喪失が野生型と比べて２４０％である場合、１００％超及び２４０％未満の平均二次分枝は、「中間の多分枝」表現型である。一態様では、「増加した平均二次分枝」は、野生型（１００％である）と比べて少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％である。一態様では、「増加した平均二次分枝」は、「完全な多分枝」未満であり、それは、例えば、「完全な多分枝」（１００％である）の９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下である。

【0080】

一態様では、増加した二次分枝は、平均で約２０本の二次分枝を生成する、配列番号２のタンパク質をコードする野生型アレルに対してホモ接合性であるスイカ植物と比較して、配列番号１のタンパク質をコードするアレル（配列番号２のアミノ酸９４～１０１の重複を含む）に対してホモ接合性であるスイカ植物において見られるように、４５以上の二次分枝の平均数である。実施例も参照されたい。

【0081】

スイカ及び他のウリ科植物において、主茎が成長し、一次側枝を形成する。一次側枝上において、植物は、二次側枝を形成する。これらの二次分枝は、例えば、主茎上の末端／クラウンから９０ｃｍの位置から開始して、末端／クラウンまで計数される。したがって、二次分枝は、一態様では、植物のクラウンの９０ｃｍの距離から開始して植物の末端／クラウンまでの二次分枝の数を計数することによって測定される。これは、ある系統のいくつか（少なくとも４、５、６、７、８、９、１０）の植物について行われ、次に二次分枝の平均数が各系統について計算される。しかしながら、二次分枝は、クラウンからのより短い距離、例えば４０ｃｍから開始する二次分枝の数を計数することによって測定することもできる。

【0082】

概要
スイカにおいてＣｌＤ１４、キュウリにおいてＣｓＤ１４又はメロンにおいてＣｍＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含む栽培スイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物部分が提供され、前記突然変異アレルは、突然変異アレルが二倍体植物においてホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を付与する。

【0083】

一態様では、スイカＣｌＤ１４遺伝子は、スイカゲノムの８番染色体上に位置し、特に、この遺伝子は、チャールストングレイ染色体（ｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ）の８番染色体の塩基２８７９４２８１から開始し、塩基２８７９５１７３で終了する領域に位置する。プロモーター配列は、ゲノムコード配列の上流、例えば塩基２８７９４２８１から上流の１０００又は２０００塩基以内に位置する。

【0084】

一態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、ホモ接合体である場合、コードされた突然変異タンパク質が非機能的であるため又は突然変異アレルが発現されず、すなわちノックアウトアレルであるため、二次分枝の最も多い平均数が形成される完全な多分枝を付与する。

【0085】

別の態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、ホモ接合体である場合、野生型植物と比較して増加した平均数の二次分枝が形成される中間の多分枝を付与するが、枝の最も多い平均数は、完全な多分枝植物において形成可能ではない。中間の多分枝は、コードされた突然変異タンパク質が、野生型タンパク質と比較して低下した機能を有することに起因するか、又は突然変異アレルが野生型アレルより低いレベルで発現され、すなわちノックダウンアレルであることに起因する。

【0086】

一実施形態において、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物又は植物部分又は種子は、スイカ植物又は植物部分又は種子であり、二倍体、四倍体、三倍体又は倍数体である。好ましくは、突然変異アレルは、二倍体植物又は植物部分又は種子において１又は２コピーで存在する。任意選択的に、それは、四倍体植物又は植物部分又は種子において２若しくは４コピーで、又は三倍体植物又は植物部分又は種子において１、２若しくは３コピーで存在し得る。

【0087】

植物、植物部分又は種子は、ＣｌＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカであり得、それにより、野生型遺伝子は、配列番号２の野生型タンパク質（又は配列番号２との少なくとも９５％、９６％、９７％又は９８％の配列同一性を含む野生型タンパク質）をコードするか、又はＣｓＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むキュウリであり得、それにより、野生型遺伝子は、配列番号８の野生型タンパク質（又は配列番号８との少なくとも９５％、９６％、９７％又は９８％の配列同一性を含む野生型タンパク質）をコードするか、又はＣｍＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むメロンであり得、それにより、野生型遺伝子は、配列番号９の野生型タンパク質（又は配列番号９との少なくとも９５％、９６％、９７％又は９８％の配列同一性を含む野生型タンパク質）をコードする。

【0088】

ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物部分は、細胞、花、葉、茎、挿木、花粉、根、台木、接穂、果実、プロトプラスト、胚、葯であり得る。

【0089】

ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の少なくとも１つの突然変異アレルを含むこのような植物部分から繁殖させる、栄養繁殖させたスイカ、キュウリ又はメロン植物も包含される。

【0090】

同様に、種子であって、本発明の植物がそれから成長され得る、種子が提供される。

【0091】

さらに、本発明に係る植物によって産生される雄花又は雌花、子房、葯及び花粉又は小胞子が提供される。

【0092】

スイカ、キュウリ又はメロン果実を産生する方法であって、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む二倍体植物を成長させることを含む方法が提供される。突然変異アレルは、本明細書の他の箇所に記載され、ホモ接合体において、通常の二次分枝（野生型Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である）と比較して増加した二次分枝（突然変異アレルに対してホモ接合性である）を付与するＤ１４アレルである。

【0093】

種なしスイカ果実を産生する方法であって、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルの２コピーを含む、三倍体植物及び二倍体授粉種植物を成長させることと、三倍体植物の花の授粉を可能にすることと、任意選択的に種なし三倍体果実を収穫することとを含む方法が提供される。

【0094】

種なしスイカ果実を産生する方法であって、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルの１、２又は３コピーを含む三倍体植物及び二倍体授粉種植物を成長させることと、三倍体植物の花の授粉を可能にすることと、任意選択的に種なし三倍体果実を収穫することとを含む方法が提供される。

【0095】

スイカ果実を産生するさらなる方法であって、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む二倍体植物を成長させることと、花の授粉を可能にすることと、任意選択的に種あり二倍体果実を収穫することとを含む方法が提供される。

【0096】

スイカ、キュウリ又はメロン植物を成長させる方法であって、特に圃場、又は温室、又はトンネル内において、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む二倍体スイカ、キュウリ又はメロン植物を成長させることを含む方法が提供される。

【0097】

（野生型Ｄ１４遺伝子に対してホモ接合性である植物と比較して）二次分枝の増加した（平均）数を生成する栽培スイカ、キュウリ又はメロン植物の産生の方法であって、
ａ）ランダム又は標的化突然変異を１つ以上のスイカ、キュウリ若しくはメロン植物、植物部分若しくは種子中に導入するか；又は突然変異植物若しくは種子の集団（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ集団）を提供する工程、
ｂ）ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレル、例えば、有意に低下した野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質（例えば、ノックダウン若しくはノックアウトアレル）を生成するか又はそれらを全く生成しない突然変異アレル又は野生型タンパク質と比較して欠失、置換、挿入又は重複された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする突然変異アレルを含む植物を選択する工程、
ｃ）任意選択的に、植物から任意のトランスジェニック構築物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築物）を除去する工程、及び／又は
ｄ）任意選択的に、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物を生成し、野生型アレルに対してホモ接合性である植物と比較して、植物によって生成される二次分枝の平均数を分析する工程
を含む方法が提供される。

【0098】

スイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分を選択又は同定する方法であって、
ａ）植物又は植物部分のゲノムＤＮＡが突然変異アレルを含むかどうか及び／又はそれらのゲノム中にＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４若しくはＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルを含むかどうか分析する工程と、任意選択的に、
ｂ）ゲノム中にＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物又は植物部分を選択する工程と
を含み、ＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし、Ｃｓ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号８のタンパク質をコードし、ＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号９のタンパク質をコードする、方法が提供される。

【0099】

工程ａ）は、様々な方法において、例えばＰＣＲベースの方法、シーケンシングベースの方法、核酸ハイブリダイゼーションベースの方法、遺伝子発現レベルなどを用いて行われ得る。一態様では、例えば、ＫＡＳＰアッセイが使用され得る（例えば、実施例を参照されたい）。

【0100】

スイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分のゲノムＤＮＡをスクリーニング（例えば、ジェノタイピング）する方法であって、
ａ）スイカ、メロン又はキュウリ植物又は複数の植物（例えば、Ｆ２集団、近交系系統、戻し交配集団、育種集団、交配植物など）のゲノムＤＮＡのサンプル（若しくは複数のサンプル）を提供する工程と、
ｂ）ＰＣＲプライマーの対又はオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、プライマー又は（オリゴヌクレオチド）プローブは、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のゲノムＤ１４アレルの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又はそれを超えの連続したヌクレオチドを含み、ＰＣＲアッセイでゲノムアレルにハイブリダイズし、且つ／又はゲノムアレルの一部を増幅することができる、工程と、
ｃ）工程ａ）のサンプルに対して工程ｂ）のプライマー対を使用したＰＣＲアッセイ又はプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイを行う工程と、任意選択的に、
ｄ）ゲノム中にＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のアレル（例えば、野生型アレル及び／又は突然変異アレル）の１又は２コピーを含む植物又は植物部分又は種子を選択する工程と
を含み、ＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし、Ｃｓ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号８のタンパク質をコードし、ＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号９のタンパク質をコードする、方法が提供される。

【0101】

工程ｂ）において、ＰＣＲプライマー対は、Ｄ１４アレルのＤＮＡ鎖に相補的な少なくとも１つのフォワードプライマー及びＤ１４アレルの他方のＤＮＡ鎖に相補的な１つのリバースプライマーであり、このプライマー対は、ＰＣＲ反応において変性したゲノムＤＮＡにハイブリダイズし、Ｄ１４アレルの一部を増幅する。プライマーは、プライマー設計ツールを用いて、野生型又は任意の突然変異Ｄ１４アレルを増幅するように設計され得る。一態様では、一方がＤ１４遺伝子の野生型アレルを増幅するように設計され、一方がＤ１４遺伝子の突然変異アレルを増幅するように設計された２つのフォワードプライマー及び１つの共通のリバースプライマーが使用される。これらの３つのプライマーは、工程ａ）のサンプルをジェノタイピングするためにＫＡＳＰアッセイで使用され得る。したがって、一態様では、工程ｃ）におけるアッセイは、ＫＡＳＰアッセイであるが、ワールドワイドウェブのｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｓｅｃｔｏｒｓ／ａｇｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ／ａｇｒｉｇｅｎｏｍｉｃｓ－ｐｃｒ－ｑｐｃｒ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに記載されるものなどの他のジェノタイピングアッセイも使用され得る。

【0102】

一態様では、アッセイは、Ｄ１４遺伝子の野生型と突然変異アレルとを区別し、例えば配列番号６の野生型ＣｌＤ１４アレルと、配列番号５の突然変異ＣｌＤ１４ｉｎｓアレル又は別の突然変異アレルとを区別する。他の突然変異アレルの例は、表Ａ及び表２に示されるが、任意の他の突然変異アレル、例えば対照植物、例えばホモ接合体において野生型アレルを含む植物を比較して、ホモ接合体において、発生する二次分枝の平均数を有意に増加させる任意の突然変異アレルも包含される。一態様では、突然変異アレルは、ノックアウトアレル又は強い多分枝をもたらす機能喪失タンパク質をコードする突然変異アレルであり、別の態様では、突然変異アレルは、ノックダウンアレル又は中間の多分枝をもたらす機能低下タンパク質をコードする突然変異アレルである。したがって、Ｄ１４遺伝子の任意の野生型及び／又は突然変異アレルがアッセイで検出され得る。

【0103】

ゲノムＤＮＡを分析するために、少なくとも粗ゲノムＤＮＡ抽出が必要であり得る。ゲノムＤＮＡにおける突然変異アレル又は野生型アレルの存在は、直接又は間接的に検出され得る。直接とは、例えば、例えばオリゴヌクレオチドプローブの核酸ハイブリダイゼーションによるものであり得る。間接的とは、例えば、例えばプライマーに結合されたテール配列を含む例えばＰＣＲプライマーを使用した核酸増幅によるものであり得、ＰＣＲ中、アレル特異的プライマーは、鋳型ＤＮＡに結合してそれを伸長させ、それによりテール配列を新たに合成された鎖に結合し、その後のＰＣＲラウンドにおいてＦＲＥＴカセット（蛍光共鳴エネルギー移動カセット）がテールに結合し、蛍光を発する。次に、蛍光シグナルが検出され得る。これは、例えば、ＫＡＳＰアッセイで使用される。

【0104】

突然変異アレルは、様々な点で野生型アレルと異なり得、例えばプロモーター配列若しくはタンパク質コード配列又はイントロン／エクソンスプライス部位が異なり得る。突然変異アレルは、低下した遺伝子発現を有するか又は遺伝子発現を有さなくてもよいか、又はそれは、野生型タンパク質と比較して欠失、置換又は挿入又は重複された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質の産生をもたらし得る。

【0105】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９の機能性タンパク質と比べて置換、挿入又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、それにより、突然変異タンパク質は、インビボで低下した機能を有するか又は機能を有さない。

【0106】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９の機能性タンパク質と比べて、保存されたＩＰＲ０００７３ドメインのアミノ酸のいずれか１つ以上及び／又はヘリカルリッドドメインのいずれか１つ以上のアミノ酸及び／又は触媒三残基アミノ酸のいずれか１つ以上及び／又は触媒三残基アミノ酸の前又は後の８つのアミノ酸のいずれか１つ以上から選択される、置換、挿入又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードするアレルであり、それにより、突然変異タンパク質は、インビボで低下した機能を有するか又は機能を有さない。したがって、本明細書に記載される突然変異アレルの１つ以上を含む植物及び植物部分が本明細書に包含されるだけでなく、本明細書に記載される突然変異アレルの少なくとも１つを含む植物又は植物部分の検出を可能にするアッセイも包含される。したがって、それに由来する任意のスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分又はＤＮＡは、野生型Ｄ１４アレルの存在又は本明細書に記載される突然変異Ｄ１４アレルのいずれかの少なくとも１つの存在について分析され得る。任意の突然変異アレルについて、特異的突然変異アレルのためにプライマー又はプローブを作出する方法が周知であるため、アッセイが容易に開発され得る。例えばＷ１５５^＊アレルについて、アッセイは、スイカ植物に由来するゲノムＤＮＡ中のアレルの存在を検出するように容易に設計され得る。

【0107】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～１０１の１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードするアレルである。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９の少なくともＳｅｒ ９７の重複を含む。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～１０１の全てのアミノ酸の重複を含む。

【0108】

一態様では、植物又は植物部分は、スイカであり、突然変異アレルは、配列番号１（Ｄ１４ｉｎｓ）のタンパク質をコードする。本明細書に記載される８つのアミノ酸重複をコードするこの突然変異アレルは、本明細書に記載されるように検出され得る。

【0109】

別の態様では、植物又は植物部分は、スイカであり、突然変異アレルは、機能低下又は機能喪失をもたらす挿入、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードするが、これは、配列番号１（Ｄ１４ｉｎｓ）のタンパク質ではなく、すなわち、それは、Ｓｉｄｅｋｉｃｋ品種に存在するアレルでない。したがって、植物は、そのゲノム中に配列番号５の配列を含まない。一態様では、植物は、そのゲノム中に配列番号５の配列の１コピーのみを含む。

【0110】

ゲノム中にスイカＣｌＤ１４遺伝子、又はキュウリＣｓＤ１４遺伝子、又はメロンＣｍＤ１４遺伝子の少なくとも１つの突然変異アレルを含む植物又は植物部分を生成及び／又は選択する方法も提供される。

【0111】

一態様では、ゲノム中におけるスイカＣｌＤ１４遺伝子、又はキュウリＣｓＤ１４遺伝子、又はメロンＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレル及び／又は突然変異アレルの存在を検出する方法も提供される。

【0112】

一態様では、スイカ植物又は植物部分又は種子が、配列番号２のタンパク質をコードする野生型アレルの少なくとも１つのコピーを含むかどうか及び／又は例えば配列番号１のタンパク質若しくは配列番号２のタンパク質（他の箇所に記載されるような）と比べて置換、挿入若しくは欠失された１つ以上のアミノ酸を含む任意のタンパク質をコードする突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むかどうかを検出する方法と、任意選択的に、例えば配列番号１のタンパク質又は配列番号２のタンパク質（他の箇所に記載されるような）と比べて置換、挿入又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含む任意のタンパク質をコードする突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含む植物、植物部分又は種子を選択する方法とが提供される。

【0113】

別の態様では、スイカ植物若しくは植物部分又は種子配列番号６を含む野生型アレルの少なくとも１つのコピーを含むかどうか及び／或いは配列番号６に対して挿入、置換又は欠失された１つ以上のヌクレオチドを含む突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むかどうかを検出する方法であり、それにより、コードされたタンパク質は、インビボで機能低下又は機能喪失を有する。

【0114】

一態様では、ＣｌＤ１４（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）１つ以上のスイカ植物、種子又は植物部分の１つ以上のゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と、
ｂ）野生型ＣｌＤ１４アレルと突然変異ＣｌＤ１４アレルとを区別する、鋳型としてａ）のＤＮＡサンプルを使用するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸増幅に基づき、及び／又は前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションに基づく、工程と、任意選択的に、
ｃ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択する工程と
を含み、突然変異ＣｌＤ１４アレルは、配列番号６の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含み、配列番号２の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異ＣｌＤ１４タンパク質をもたらす、方法が提供される。

【0115】

この方法において、一態様では、前記ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は前記ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６又は配列番号６の相補鎖の少なくとも１０ヌクレオチドを含むプライマー又はプローブである。

【0116】

この方法において、一態様では、突然変異アレルは、アレルのコード領域に挿入若しくは重複された少なくとも１つのコドン、又は別のコドンに変化された少なくとも１つのコドン、又は欠失されるか若しくは終止コドンに変化された少なくとも１つのコドンを含む。例えば、突然変異アレルは、本明細書における表Ａ又は表２に記載されるような突然変異アレルである。突然変異アレルは、機能喪失又は機能低下を有する突然変異Ｄ１４タンパク質をコードして、突然変異アレルがホモ接合体である場合、それぞれ強い多分枝又は中間の多分枝をもたらすアレルであり得る。

【0117】

２つのアレル特異的フォワードプライマー、例えば配列番号１０のＦＡＭプライマー及び配列番号１１のＶＩＣプライマー並びに例えば配列番号１２の共通のリバースプライマーを含むＫＡＳＰアッセイ（Ｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｋｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ特異的ＰＣＲ－ジェノタイピングアッセイ）も提供される。実施例も参照されたい。明らかに、他のアレル特異的プライマーは、野生型アレル（配列番号２のタンパク質をコードする）と、２４ヌクレオチドの重複を含み（８つのアミノ酸をコードする）、配列番号１のタンパク質をコードする突然変異アレル又は例えば野生型タンパク質と比べて置換、重複、欠失又は挿入された１つ以上のアミノ酸を含む任意の他の突然変異アレルとを検出及び／又は区別するために開発され得る。例えば、Ｗ１５５のコドンが終止コドンに変化された突然変異アレルを検出するためのＫＡＳＰアッセイ又は表２の突然変異アレルのいずれか及びインビボで機能喪失又は機能低下Ｄ１４タンパク質をもたらす任意の他の突然変異アレルのためのＫＡＳＰアッセイが提供される。

【0118】

同様に、（野生型又は突然変異）ゲノム配列、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列、タンパク質配列の単離された配列又は分枝並びにスイカＣｌＤ１４遺伝子、又はキュウリＣｓＤ１４遺伝子、又はメロンＣｍＤ１４遺伝子の野生型又は突然変異アレルを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブが本明細書に包含される。

【0119】

スイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分のゲノムＤＮＡ（の一部）のＰＣＲ増幅産物及び／又はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション産物を生成する方法であって、
ａ）スイカ、メロン又はキュウリ植物又は複数の植物（例えば、Ｆ２集団、近交系系統、戻し交配集団、育種集団、交配植物など）のゲノムＤＮＡのサンプル（若しくは複数のサンプル）を提供する工程、
ｂ）少なくともＰＣＲプライマーの対又は少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、プライマー又は（オリゴヌクレオチド）プローブは、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のゲノムＤ１４アレルの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又はそれを超える連続したヌクレオチドを含み、ＰＣＲアッセイでゲノムアレルにハイブリダイズし、且つ／又はゲノムアレルの一部を増幅することができる、工程と、
ｃ）工程ａ）のサンプルに対して工程ｂ）のプライマー対を使用したＰＣＲアッセイ又はプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイを行って、ＰＣＲ増幅産物及び／又はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション産物を生成する工程と、任意選択的に、
ｄ）ゲノム中にＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のアレル（例えば、野生型アレル及び／又は突然変異アレル）の１又は２コピーを含む植物又は植物部分又は種子を選択する工程と
を含み、ＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし（又は配列番号６のゲノムＤＮＡを含む）、Ｃｓ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号８のタンパク質をコードし（又は配列番号１５のゲノムＤＮＡを含む）、ＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号９のタンパク質をコードする（又は配列番号１６のゲノムＤＮＡを含む）、方法も提供される。

【0120】

さらに、スイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分のゲノムＤＮＡ（の一部）を増幅及び／又はハイブリダイズする方法であって、
ａ）スイカ、メロン又はキュウリ植物又は複数の植物（例えば、Ｆ２集団、近交系系統、戻し交配集団、育種集団、交配植物など）のゲノムＤＮＡのサンプル（若しくは複数のサンプル）を提供する工程、
ｂ）少なくともＰＣＲプライマーの対又は少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを提供する工程であって、プライマー又は（オリゴヌクレオチド）プローブは、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のゲノムＤ１４アレルの少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又はそれを超える連続したヌクレオチドを含み、ＰＣＲアッセイでゲノムアレルにハイブリダイズし、且つ／又はゲノムアレルの一部を増幅することができる、工程と、
ｃ）工程ａ）のサンプルに対して工程ｂ）のプライマー対を使用したＰＣＲアッセイ又はプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイを行って、ＰＣＲ増幅産物及び／又はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション産物を生成する工程と、任意選択的に、
ｄ）ゲノム中にＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子のアレル（例えば、野生型アレル及び／又は突然変異アレル）の１又は２コピーを含む植物又は植物部分又は種子を選択する工程と
を含み、ＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし（又は配列番号６のゲノムＤＮＡを含む）、Ｃｓ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号８のタンパク質をコードし（又は配列番号１５のゲノムＤＮＡを含む）、ＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルは、配列番号９のタンパク質をコードする（又は配列番号１６のゲノムＤＮＡを含む）、方法が提供される。

【0121】

Ｄ１４遺伝子のゲノムＤＮＡの一部を増幅及び／又はハイブリダイズするプライマー及び／又はプローブ及び反応成分を含むジェノタイピングキットも提供される。

【0122】

プライマー及びプローブは、好ましくは、増幅又はハイブリダイゼーション反応生成物を検出することができるように例えばテール配列又は標識によって標識又は修飾される。

【0123】

一般的な定義
動詞「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味で、この用語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されない項目が除外されるわけではないことを意味するために使用される。さらに、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」によるある要素への言及は、文脈上、その要素が１つある及び１つのみあると明らかに解釈すべき場合を除いて、その要素が２つ以上存在する可能性が除外されるわけではない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、通常、「少なくとも１つ」を意味し、例えば、「植物」は、いくつかの細胞、植物なども指す。同様に、「果実」又は「植物」は、複数の果実及び植物も指す。

【0124】

本明細書で使用される際、「植物」という用語は、全植物又は好ましくは由来する植物と同じ遺伝子構造を有するその任意の部分又は誘導体、例えば植物器官（例えば、収穫された又は収穫されていない果実、葉、花、葯など）、植物細胞、植物プロトプラスト、全植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞集塊、植物移植片、苗木、植物中でインタクトな植物細胞、植物クローン若しくは微細繁殖又は植物の部分、例えば植物挿木、胚、花粉、葯、胚珠、果実（例えば、採取された組織又は器官）、花、葉、種子、クローン繁殖させた植物、根、茎、根端、接木（接穂及び／又は台木）などを含む。苗木、発根前又は発根後の挿木などの任意の発育段階も含まれる。「植物の種子」が言及されるとき、これらは、そこから植物を成長させることができる種子又は自家受精後若しくは他家受精後に植物に生成される種子のいずれかを指す。

【0125】

本明細書で使用される際、「品種」又は「栽培品種」という用語は、所与の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる特性の発現によって定義され得る、最も下位の公知の階級の単一の植物学的分類群内の植物集団を意味する。

【0126】

「アレル」という用語は、特定の遺伝子座、例えばＤ１４遺伝子座（Ｄ１４遺伝子が位置する場所；遺伝子のアレルは、ＣｌＤ１４（スイカにおける）若しくはＣｓＤ１４（キュウリにおける）若しくはＣｍＤ１４（メロンにおける）と表される野生型アレル又は突然変異アレルであり得る）における遺伝子の１つ以上の代替的な形態のいずれかを意味し、これらのアレルは、特定の遺伝子座における１つの形質又は特性（例えば、二次分枝）に関連する。生物の二倍体細胞では、所与の遺伝子のアレルは、染色体上の特定の位置又は遺伝子座（複数の遺伝子座）に位置する。相同染色体の対の各染色体上に１つのアレルが存在する。二倍体植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なるアレルを含み得る。これらは、遺伝子の同一のアレル（ホモ接合性）又は２つの異なるアレル（ヘテロ接合性）、例えば突然変異体の２つの同一のコピー又は突然変異アレルの１つのコピー及び野生型アレルの１つのコピーであり得る。同様に、三倍体植物は、遺伝子の３つの同一のアレル（例えば、突然変異アレルの３つのコピー）を有する場合、その遺伝子に対してホモ接合性であると称され、四倍体植物は、遺伝子の４つの同一のアレル、例えば突然変異アレルの４つのコピーを有する場合、その遺伝子に対してホモ接合性であると称される。

【0127】

「ＣｌＤ１４遺伝子」は、栽培スイカにおいて８番染色体上で同定される単一の劣性遺伝子であり、これは、突然変異させると、野生型、非突然変異ＣｌＤ１４遺伝子に対してホモ接合性である植物と比較して、突然変異アレルがホモ接合体である場合に発生する二次分枝の増加した（平均）数の表現型変化をもたらす。ＣｓＤ１４遺伝子及びＣｍＤ１４遺伝子は、ＣｌＤ１４遺伝子のオルソログであるが、キュウリ及びメロン中にある。

【0128】

「Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３など」は、２つの親植物又は親系統間での交配後の連続した関連する世代を指す。２つの植物又は系統を交配させることによって産生される種子から成長した植物は、Ｆ１世代を呼ばれる。Ｆ１植物を自殖させることにより、Ｆ２世代が生じるなどである。

【0129】

「Ｆ１交配系」植物（又はＦ１交配種子）は、２つの近交系親系統を交配させることから得られる世代である。したがって、Ｆ１交配種子は、それからＦ１交配植物が成長する種子である。Ｆ１交配系は、雑種強勢のため、より勢力が強く、収量が高い。近交系系統は、ゲノム中のほとんどの遺伝子座で本質的にホモ接合性である。

【0130】

「植物系統」又は「育種系統」は、植物及びその後代を指す。本明細書で使用される際、「近交系系統」という用語は、繰り返し自殖されてきた、ほぼホモ接合性である植物系統を指す。したがって、「近交系系統」又は「親系統」は、数世代（例えば、少なくとも４、５、６、７又はそれを超える世代）にわたって同系交配を行って、高い均一性を有する植物系統をもたらす植物を指す。

【0131】

「遺伝子」という用語は、細胞内でメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）及び動可能に連結された調節領域（例えば、プロモーター）を含む（ゲノム）ＤＮＡ配列を意味する。一例は、本発明のＤ１４遺伝子である。したがって、その遺伝子の異なるアレルは、その遺伝子の異なる代替的な形態であり、これは、ゲノムＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列、エクソン配列、イントロン配列などにおける）、ｍＲＮＡ及び／又はコードされたタンパク質のアミノ酸配列の例えば１つ以上のヌクレオチドの相違の形態であり得る。

【0132】

「突然変異ＣｌＤ１４アレル」は、本明細書では、スイカにおいて遺伝子の突然変異アレルであって、突然変異アレルがホモ接合体である場合、二次分枝の増加した（平均）数、例えば４５本以上の二次分枝（「多分枝」とも呼ばれる）をスイカ植物に生じさせる突然変異アレルを指す。同様に、「突然変異ＣｓＤ１４アレル又は突然変異ＣｍＤ１４アレル」は、これらの作物において二次分枝の増加を生じさせる、キュウリ及びメロンにおけるオルソログ遺伝子の突然変異アレルを指す。突然変異アレルにおける突然変異は、欠失、切断、挿入、重複、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異又は非同義突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異及び／又はプロモーター配列若しくはエンハンサー若しくはサイレンサー配列などの１つ以上の調節配列における突然変異を含む、任意の突然変異又は突然変異の組合せであり得る。突然変異ＣｌＤ１４アレルは、「完全な多分枝」又は「強い多分枝」をもたらし得、これは、非機能性タンパク質をコードする突然変異アレル又はノックアウトアレルである突然変異アレルにより、二次分枝形成を抑制するために、植物におけるシグナルを伝達しない突然変異アレルを指す。突然変異ＣｌＤ１４アレルは、「中間の多分枝」をもたらし得、これは、機能低下タンパク質をコードする突然変異アレル又はノックダウンアレルである突然変異アレルにより、野生型植物よりかなり程度は低いが、二次分枝形成をある程度抑制するために、植物における一部のシグナルを伝達する突然変異アレルを指す。したがって、「中間の多分枝」表現型は、野生型、非突然変異アレルに対してホモ接合性である植物の二次分枝の平均数と「完全な多分枝」表現型を有する植物の二次分枝の平均数との中間である。

【0133】

「野生型ＣｌＤ１４、又はＣｓＤ１４、又はＣｍＤ１４アレル」は、本明細書では、通常の数の二次分枝を植物に発生させる遺伝子の機能性アレルを指す。野生型ＣｌＤ１４アレルは、スイカの任意の商業的品種（例えば、Ｎｕｎｈｅｍｓ品種Ｐｒｅｍｉｕｍ Ｆ１、Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｆ１など）に見られる。一態様では、野生型ＣｌＤ１４アレルは、ＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレルであり、それにより、ＣｌＤ１４遺伝子は、配列番号２のタンパク質をコードするか、又は（例えば、Ｎｅｅｄｌｅを用いて、ペアワイズでアラインメントされるとき）配列番号２との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質をコードする遺伝子である。一態様では、野生型ＣｓＤ１４アレルは、ＣｓＤ１４遺伝子の野生型アレルであり、それにより、ＣｓＤ１４遺伝子は、配列番号８のタンパク質をコードするか、又は（例えば、Ｎｅｅｄｌｅを用いて、ペアワイズでアラインメントされるとき）配列番号８との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質をコードする遺伝子である。一態様では、野生型ＣｍＤ１４アレルは、ＣｍＤ１４遺伝子の野生型アレルであり、それにより、ＣｍＤ１４遺伝子は、配列番号９のタンパク質をコードするか、又は（例えば、Ｎｅｅｄｌｅを用いて、ペアワイズでアラインメントされるとき）配列番号９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質をコードする遺伝子である。

【0134】

「遺伝子座」（複数の遺伝子座）という用語は、例えば遺伝子又は遺伝子マーカーが見出される染色体上の１つ又は複数の特定の位置又は部位を意味する。したがって、ＣｌＤ１４遺伝子座は、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレル及び／又は野生型アレルが見出される、スイカのゲノムにおける位置である。ＣｌＤ１４遺伝子座は、栽培スイカ８番染色体上の遺伝子座である（ワールドワイドウェブのｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇにおいて、「スイカ：ゲノム」、「チャールストングレイ」又は「９７１０３ Ｖ１又はＶ２の下で見られる公開されたスイカゲノムの染色体アサインメントを用いて）。

【0135】

「誘発突然変異アレル」は、人間の介入、例えば標的化された遺伝子編集技術（Ｃｒｉｓｐｒベースの技術、ＴＡＬＥＮＳなど）も含めて、物理的若しくは化学的突然変異誘発方法を用いるか又は例えば組織培養（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｌｏｓ ９（５）ｅ９６８７９に記載されるような）を用いる突然変異誘発によって突然変異が誘発されている突然変異アレルである。

【0136】

「二倍体植物」は、本明細書では２ｎと表記される、２組の染色体を有する植物、栄養繁殖植物部分又は二倍体植物を成長させることができる種子を指す。

【0137】

「ＤＨ植物」又は「倍加半数体植物」は、例えばインビトロ技術を用いて、二倍体植物の一倍体ゲノムを二倍にすることによって生成された二倍体植物である。したがって、ＤＨ植物は、全ての遺伝子座においてホモ接合性である。

【0138】

「三倍体植物」は、本明細書では３ｎと表記される、３組の染色体を有する植物、栄養繁殖植物部分又は三倍体植物を成長させることができる種子を指す。

【0139】

「四倍体植物」は、本明細書では４ｎと表記される、４組の染色体を有する植物、栄養繁殖植物部分又は四倍体植物を成長させることができる種子を指す。

【0140】

「倍数体植物」は、二倍体より高い倍数性、すなわち三倍体（３ｎ）、四倍体（４ｎ）、六倍体（６ｎ）、八倍体（８ｎ）などを有する植物を指す。

【0141】

「授粉種植物」又は「授粉種」は、三倍体植物における着果を誘発する授粉種として好適な（近交系又は交配系）二倍体植物又はその部分（例えば、その花粉又は接穂）を指す。したがって、授粉種植物は、適切な日時において且つ適切な期間にわたって適切な量の花粉を生成することにより、正常な三倍体植物の良好な着果（及び良好な三倍体果実収量）をもたらすことができる。

【0142】

「交配系三倍体植物」又は「Ｆ１三倍体」又は「三倍体交配系」は、雄性二倍体親を雌性四倍体親と他家受精させることによって得られる交配系三倍体種子から成長させた三倍体植物である。雄性親は、四倍体雌性親における着果及び種子産生を誘発するために使用されて、Ｆ１交配系三倍体種子を含む果実をもたらす。Ｆ１三倍体種子を産生するために使用される雄性親及び雌性親は両方とも近交系であり、それにより各親系統がほぼホモ接合性であり、安定している。

【0143】

「種なし果実」は、生存能力のある成熟種子を含まない果実である。果実は、１つ以上の小さい食べられる白色の胚珠を含み得る。任意選択的に、果実は、数個の茶色又は黒色の種子を含有し得るが、これらは、生存能力がない。生存能力のある成熟種子は、適切な条件下で土壌において発芽され、植物に成長し得る種子である。

【0144】

「混植すること」は、同じ圃場に播種又は移植された２種類以上の種子及び／又は移植片の組合せ、特に三倍体交配系植物（三倍体植物における種なし果実産生及び授粉種植物における二倍体果実産生の場合）と同じ圃場における授粉種の播種及び／又は移植を指す。例えば、授粉種は、別の列に植えられるか、又は同じ列に（例えば、各列内の盛り上がった場所に）三倍体植物と混植され得る。授粉種は、三倍体の列間にも植えられ得る。授粉種及び三倍体交配系の種子は、播種前にも混合され得、ランダムな播種をもたらし得る。三倍体交配系植物及び／又は授粉種植物の移植は、様々な植物の台木も含み得る。好適な台木は、当技術分野で公知である。様々な台木を有するスイカ植物は、「接木された」と称される。

【0145】

「植栽すること」又は「植栽された」は、苗木（小植物）を圃場に機械又は手で播種（直播き）又は移植することを指す。

【0146】

「栄養繁殖」又は「クローン繁殖」は、栄養組織からの植物の繁殖、例えばインビトロ繁殖又は接木法（接穂及び台木を使用する）による植物の繁殖を指す。インビトロ繁殖は、インビトロ細胞又は組織培養物及びインビトロ培養物からの全植物の再生を含む。接木は、台木に接木することによる元の植物の繁殖を含む。したがって、元の植物のクローン（すなわち遺伝学的に同一の栄養繁殖）は、インビトロ培養又は接木のいずれかによって生成され得る。「細胞培養」又は「組織培養」は、植物の細胞又は組織のインビトロ培養を指す。「再生」は、細胞培養又は組織培養又は栄養繁殖からの植物の発達を指す。「非繁殖細胞」は、全植物に再生させることができない細胞を指す。

【0147】

「劣性」は、優性アレルが二倍体ゲノム中に存在しない場合、すなわちそれが二倍体においてホモ接合性である場合、その表現型（例えば、多分枝）を発現するアレルを指す。突然変異ＣｌＤ１４アレルは、二倍体植物において２コピーで、任意選択的に、四倍体植物において４コピーで、又は三倍体植物において２若しくは３コピーで、又は別の倍数性においてそれぞれの数のコピーで存在する場合、表現型変化（他の箇所に記載される）を有する植物をもたらす。優性アレルは、本明細書では野生型（ＷＴ）アレルとも呼ばれる。

【0148】

「栽培スイカ」又は「キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）」は、本明細書では、キトルルス・ラナトゥス亜種ブルガリス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ ｓｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）又はキトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（Ｔｈｕｎｂ．）Ｍａｔｓｕｍ．＆Ｎａｋａｉ亜種ブルガリス（ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）（Ｓｃｈｒａｄ．）であって、良好な作物栽培学的特性を有し、特に良好な果実品質及び果実均一性を有する市場性のある果実を産生するものを指す。これは、野生スイカを除外する。

【0149】

「野生スイカ」は、キトルルス・ラナトゥス亜種ラナトゥス（（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ ｓｓｐ．ｌａｎａｔｕｓ）及びキトルルス・ラナトゥス亜種ムコソスペルムス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ ｓｓｐ．ｍｕｃｏｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）であって、低い品質及び低い均一性を有する果実を産生するものを指す。

【0150】

「栽培キュウリ」又は「栽培メロン」は、ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）又はククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）であって、良好な作物栽培学的特性を有し、特に良好な果実品質及び果実均一性を有する市場性のある果実を産生するものを指す。これは、低い品質及び低い均一性を有する果実を産生する野生キュウリ又は野生メロンを除外する。

【0151】

「ＳＮＰマーカー」は、例えば、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルと野生型アレルとの間の一塩基変異多型を指す。遺伝子の突然変異アレルと野生型アレルとを区別し得るＳＮＰマーカーアッセイ（すなわちアレル特異的アッセイ）を用いて、突然変異アレル及び／又は野生型アレルの存在について植物、植物部分又はそれに由来するＤＮＡをスクリーニングすることができる。

【0152】

「インデルマーカー」は、例えば突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルと野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルとの間の挿入／欠失多型を指す。例えば、マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２は、配列番号２のタンパク質をコードする野生型ＣｌＤ１４アレルと、配列番号１のタンパク質（８つのアミノ酸の重複を含む）をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルとを区別するインデルマーカーである。遺伝子の突然変異アレルと野生型アレルとを区別し得るインデルマーカーアッセイ（すなわちアレル特異的アッセイ）を用いて、突然変異アレルの存在について植物、植物部分又はそれに由来するＤＮＡをスクリーニングすることができる。

【0153】

「ジェノタイピング」方法は、植物又は植物部分又は種子の遺伝子型又はアレル組成を決定することができる方法である。ＫＡＳＰアッセイなどの両アレルジェノタイピングアッセイは、ある遺伝子座における２つのアレルを区別することができる。

【0154】

「栽培スイカゲノム」及び「栽培スイカゲノム上での物理的位置」及び「８番染色体」は、栽培スイカの物理的ゲノム（参照ゲノムは、ワールドワイドウェブのｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇにおいて「スイカ：ゲノム」、例えば「スイカ（チャールストングレイ）」に見られる）並びに物理的染色体及び染色体上の物理的位置を指す。

【0155】

「突然変異ＣｌＤ１４アレルを含む染色体領域」は、栽培スイカの例えば８番染色体のゲノム領域であって、突然変異ＣｌＤ１４アレルを保有する領域を指す。アレルの存在は、表現型的に且つ／又は異なるｌＤ１４アレルを区別するマーカーの検出若しくはアレル配列自体のゲノム配列（例えば、アレルをシーケンシングすることによって決定される）によって決定され得る。「アレル特異的マーカー」は、特定のアレル（例えば、特異的突然変異アレル）に特異的な、したがって例えば突然変異アレルと野生型アレルとを区別するマーカーである。

【0156】

形質（突然変異Ｄ１４アレルの表現型の特徴など）を付与する遺伝的要素、遺伝子移入断片又は遺伝子若しくはアレルは、それが存在する植物又は種子から、それが存在しない別の植物又は種子（野生型系統又は品種など）に遺伝的要素、遺伝子座、遺伝子移入断片、遺伝子又はアレルによって付与される形質の付加を別として、受容植物の表現型変化を生じさせずに従来の育種技術を用いて、それを転移させることができる場合、植物又は種子又は組織又は細胞「から入手可能である」又は「から入手することができる」又は「から誘導可能である」又は「から誘導することができる」又は「に存在する」又は「に見出されるとおりである」と言われる。これらの用語は同義的に使用され、したがって、遺伝的要素、遺伝子座、遺伝子移入断片、遺伝子又はアレルは、その形質を欠く任意の他の遺伝的背景に転移させることができる。遺伝的要素、遺伝子座、遺伝子移入断片、遺伝子又はアレル（例えば、突然変異ＣｌＤ１４アレル）を含む栽培スイカは、例えば突然変異誘発（例えば、化学的突然変異誘発、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘発など）によってデノボで生成され、次に例えば他の栽培スイカに交配させることができる。同様に、遺伝的要素、遺伝子座、遺伝子移入断片、遺伝子又はアレル（例えば、突然変異ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレル）を含む栽培キュウリ又はメロンがデノボで生成され得る。

【0157】

「平均」又は「中間」は、本明細書では算術平均を指し、両方の用語が同義的に使用される。したがって、「平均」又は「中間」という用語は、いくつかの測定値の算術平均を指す。当業者は、植物系統又は品種の表現型が成長条件にある程度依存し、したがって、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれを超える植物（又は植物部分）の算術平均が、好ましくは、いくつかのレプリケート及び好適な対照植物を同じ実験において同じ条件下で成長させる無作為化実験設計において測定されることを理解する。「統計的に有意な」又は「統計的に有意に」異なる又は「有意に」異なるとは、好適な対照と比較したとき、対照（の平均）とのその特性の統計的に有意な差（例えば、ＡＮＯＶＡを用いて、ｐ値が０．０５未満である、ｐ＜０．０５）を示す植物系統又は品種の特性を指す。例えば、本明細書では、二次分枝の平均数の差に言及するとき、言及される差は、統計的に有意な差であり、例えば、「中間の多分枝」植物遺伝子型は、ホモ接合体において野生型Ｄ１４アレルを含む対照植物遺伝子型より統計的に有意に高い二次分枝の平均数を有することが理解される。

【0158】

「従来の育種技術」という用語は、本明細書では交配、戻し交配、自殖、選択、倍加半数体産生、染色体倍加、胚救出、プロトプラスト融合、マーカー支援選択、突然変異育種などを包含し、これらは、全て育種家に公知であるように、例えば突然変異ＣｌＤ１４アレルを含む８番染色体を入手し、同定し且つ／又は転移させることができる。

【0159】

「戻し交配」は、突然変異ＣｌＤ１４アレルによって付与される表現型変化などの（単一の）形質を１つの（多くの場合、より劣った）遺伝的背景（「供与体」とも呼ばれる）から別の（多くの場合、より優れた）遺伝的背景（「反復親」とも呼ばれる）に転移させることができる育種方法を指す。交配の後代（例えば、例えば供与体を反復親スイカと交配させることによって得られるＦ１植物又はＦ１を自殖させることから得られるＦ２植物若しくはＦ３植物など）は、例えば、より優れた遺伝的背景を有する親に「戻し交配」される。戻し交配を繰り返した後、一方の（多くの場合、より劣った）遺伝的背景の形質は、他方の（多くの場合、より優れた）遺伝的背景に取り込まれていることになる。

【0160】

「マーカー支援選択」又は「ＭＡＳ」は、特定の遺伝子座又は特定の染色体領域若しくはアレル特異的マーカーに遺伝的に及び物理的に連結している分子マーカー（ＳＮＰマーカー又はインデルマーカーなど）の存在を用いて、特定の遺伝子座又は領域又はアレルの存在について植物を選択するプロセスである。例えば、突然変異ＣｌＤ１４アレル又はアレル特異的マーカーに遺伝的に及び物理的に連結している分子マーカーを用いて、例えば突然変異ＣｌＤ１４アレルを含むスイカ植物又は植物部分を検出及び／又は選択することができる。アレル特異的マーカーは、それらがアレルを直接選択するため、好ましいマーカーである。

【0161】

「導入遺伝子」又は「キメラ遺伝子」は、アグロバクテリウム媒介形質転換などの形質転換によって植物のゲノムに導入された、組み換え遺伝子などのＤＮＡ配列を含む遺伝子座を指す。そのゲノムに安定に組み込まれた導入遺伝子を含む植物は、「トランスジェニック植物」と呼ばれる。

【0162】

「単離核酸配列」又は「単離ＤＮＡ」は、もはやそれが単離された天然環境中にない核酸配列、例えば細菌宿主細胞中又は植物核若しくは色素体ゲノム中にある核酸配列を指す。本明細書では、「配列」に言及するとき、このような配列を有する分子、例えば核酸分子が言及されることが理解される。

【0163】

「宿主細胞」又は「組み換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」は、少なくとも１つの核酸分子が前記細胞に導入された結果として生じる新たな個々の細胞（又は生物）を指す用語である。宿主細胞は、好ましくは、植物細胞又は細菌細胞である。宿主細胞は、染色体外（エピソーム）複製分子として核酸を含有し得るか、又は宿主細胞の核若しくは色素体ゲノムに組み込まれた核酸を含むか、又は導入された染色体、例えばミニ染色体として含む。

【0164】

「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又は局所的アラインメントアルゴリズムを用いた２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定され得る。次に、配列は、それらが例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴ又はＥｍｂｏｓｓプログラム「Ｎｅｅｄｌｅ」（デフォルトパラメータを使用する、以下を参照されたい）によって最適にアラインメントされたとき、少なくとも一定の最小パーセンテージの配列同一性（以下にさらに定義されるように）を共有するとき、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と称され得る。これらのプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの全長にわたってマッチ数が最大となり、且つギャップ数が最小となるようにアラインメントする。一般に、ギャップ生成ペナルティ＝１０及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチド及びタンパク質アラインメントの両方について）であるデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドについて、使用されるデフォルトのスコアリング行列は、ＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質について、デフォルトのスコアリング行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，１０９１５－１０９１９）。配列アラインメント及びパーセンテージ配列同一性のスコアは、例えば、ワールドワイドウェブのｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）で利用可能なＥＭＢＯＳＳなどのコンピュータプログラムを用いて決定され得る。代わりに、配列類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのデータベースを検索することによって決定され得るが、配列同一性を比較するために、ヒットが取得され、ペアワイズでアラインメントされるべきである。２つのタンパク質若しくは２つのタンパク質ドメイン又は２つの核酸配列は、パーセンテージ配列同一性が少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える場合（デフォルトパラメータ、すなわちギャップ生成ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５を用いて、核酸についてスコアリング行列ＤＮＡＦＵＬＬ及びタンパク質についてＢｌｏｓｕｍ６２を用いて、Ｅｍｂｏｓｓ「ｎｅｅｄｌｅ」によって決定される際）、「実質的な配列同一性」を有する。

【0165】

参照配列「との実質的な配列同一性」を有するか又は参照配列との少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の核酸配列同一性の配列同一性を有する核酸配列（例えば、ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）が参照されるとき、一実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一と見なされ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて同定され得る。別の実施形態において、核酸配列は、所与のヌクレオチド配列と比較して１つ以上の突然変異を含むが、依然としてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いて同定され得る。

【0166】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定するために使用され得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なるであろう。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨ下における）である。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０２モル濃度であり、温度が少なくとも６０℃であるように選択されるであろう。塩濃度を低下させ、且つ／又は温度を上昇させると、ストリンジェンシーが増加する。ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを用いたノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えばｔ６３℃の０．２×ＳＳＣで２０分間の少なくとも１回の洗浄又は同等の条件を含むものである。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを用いたサザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば少なくとも５０℃、通常、約５５℃の温度の０．２×ＳＳＣで２０分間の少なくとも１回の洗浄（通常２回）又は同等の条件を含むものである。

【0167】

本発明との関連における「Ｍ１世代」又は「Ｍ１植物」は、突然変異誘発処理から直接生成される第１世代を指すものとする。例えば、突然変異原で処理された種子から成長した植物は、Ｍ１世代の代表例である。

【0168】

「Ｍ２世代」又は「Ｍ２植物」は、本明細書では、Ｍ１世代の自家授粉から得られる世代を指すものとする。自家受粉したＭ１植物から得られる種子から成長した植物は、Ｍ２植物である。Ｍ３、Ｍ４などは、自家授粉後に得られるそれより後の世代を指す。

【0169】

「ｍＲＮＡコード配列」は、本明細書では一般的な意味を有するものとする。ｍＲＮＡコード配列は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されることは別として、遺伝子／アレルのそれぞれのＤＮＡコード（ｃＤＮＡ）配列に対応する。

【0170】

核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の「突然変異」は、例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入による、対応する野生型配列と比較した１つ以上のヌクレオチドの変化である。このような突然変異の例は、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異又は調節配列における突然変異である。

【0171】

「核酸分子」は、当技術分野における一般的な理解を有するものとする。それは、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）のいずれかを含むヌクレオチドから構成される。

【0172】

「点突然変異」は、一塩基の置換又は一塩基の挿入若しくは欠失である。

【0173】

「ナンセンス突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列の（点）突然変異であり、それにより核酸分子中のコドンが終止コドンに変化される。これにより、未成熟終止コドンがｍＲＮＡ中に存在することになり、切断タンパク質の翻訳をもたらす。切断タンパク質は、機能低下又は機能喪失を有し得る。

【0174】

「ミスセンス又は非同義突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列の（点）突然変異であり、それにより、コドンは、異なるアミノ酸をコードするように変化される。得られたタンパク質は、機能低下又は機能喪失を有し得る。

【0175】

「スプライス部位突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列における突然変異であり、それによりプレｍＲＮＡのＲＮＡスプライシングが変化されて、野生型と異なるヌクレオチド配列を有するｍＲＮＡ及び異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をもたらす。得られたタンパク質は、機能低下又は機能喪失を有し得る。

【0176】

「フレームシフト突然変異」は、タンパク質をコードする核酸配列における突然変異であり、それにより、ｍＲＮＡのリーディングフレームが変化されて、異なるアミノ酸配列をもたらす。得られたタンパク質は、機能低下又は機能喪失を有し得る。

【0177】

本発明との関連における「欠失」は、所与の核酸配列中のいずれの箇所でも、少なくとも１つのヌクレオチドが、対応する野生型配列の核酸配列と比較して欠失しているか、又は所与のアミノ酸配列のいずれの箇所でも、少なくとも１つのアミノ酸が、対応する（野生型）配列のアミノ酸配列と比較して欠失していることを意味するものとする。

【0178】

「切断」は、ヌクレオチド配列の３’末端又は５’末端のいずれかの少なくとも１つのヌクレオチドが、対応する野生型配列の核酸配列と比較して欠失していること又はタンパク質のＮ末端又はＣ末端のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸、ただし好ましくは少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるアミノ酸が、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較して欠失していることを意味すると理解されるものとする。５’末端は、対応する野生型核酸配列の翻訳において開始コドンとして使用されるＡＴＧコドンによって決定される。

【0179】

「置換」は、核酸配列中の少なくとも１つのヌクレオチド又はタンパク質配列中の少なくとも１つのアミノ酸が、それぞれのタンパク質のコード配列中のヌクレオチドの交換のため、それぞれ対応する野生型核酸配列又は対応する野生型アミノ酸配列と比較して異なることを意味するものとする。

【0180】

「挿入」は、タンパク質の核酸配列又はアミノ酸配列が、それぞれ対応する野生型核酸配列又は対応する野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのさらなるヌクレオチド又はアミノ酸を含むことを意味するものとする。

【0181】

「重複」は、１つ以上の（連続した）ヌクレオチド又は１つ以上の（連続した）アミノ酸が、野生型配列における１回の代わりに、ヌクレオチド又はアミノ酸配列において少なくとも２回存在することを意味するものとする。したがって、重複は、野生型配列において１回既に存在していた１つ以上の連続したヌクレオチド又は１つ以上の連続したアミノ酸の挿入である。挿入は、元の配列に隣接し得るか、又はそれは、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸によって隔てられ得、すなわち、それは、元の配列からさらに離れて重複され得る。

【0182】

本発明との関連における「未成熟終止コドン」は、終止コドンが、対応する野生型コード配列の終止コドンと比較して、５’末端の開始コドンにより近いコード配列（ｃｄｓ）中に存在することを意味する。

【0183】

例えば、遺伝子のプロモーター又はエンハンサーでの「調節配列における突然変異」は、例えば作出される遺伝子のｍＲＮＡ転写物が減少するか又は作出されないことにつながる、例えば１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は挿入による、野生型配列と比較した１つ以上のヌクレオチドの変化である。

【0184】

「タンパク質の突然変異」は、例えば１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、切断又は挿入又は重複による、野生型配列と比較した１つ以上のアミノ酸残基の変化である。

【0185】

「突然変異タンパク質」は、本明細書では、タンパク質をコードする核酸配列に１つ以上の突然変異を含むタンパク質であり、それにより、突然変異は、例えば、突然変異アレルによって付与される表現型により例えばインビボで測定可能であるように、「機能低下」又は「機能喪失」タンパク質（をコードする突然変異核酸分子）をもたらす。

【0186】

「野生型３次元構造」又は「野生型タンパク質折り畳み」は、インビボでその正常な機能を実行するための野生型タンパク質のインビボでの折り畳みを指す。「修飾された３次元構造又は修飾されたタンパク質折り畳み」は、インビボでの正常な機能又は活性を低下又は消失させる、野生型タンパク質と異なる折り畳みを有する突然変異タンパク質を指し、すなわち、タンパク質は、機能低下又は機能喪失を有する。タンパク質切断も、修飾された３次元構造につながる。３－Ｄ構造は、例えばＲａｐｔｏｒＸなどのプログラムを用いて、予測された野生型タンパク質構造を予測されたタンパク質構造と比較して、修飾されると予測され得る。

【0187】

本発明に関連して、タンパク質の「活性の低下」は、対応する野生型植物細胞又は対応する野生型植物と比較したとき、Ｄ１４タンパク質の活性の低下を意味するものとする。低下は、一態様では、遺伝子発現の完全なノックアウト若しくはノックダウン又は機能喪失若しくは機能低下Ｄ１４タンパク質の産生を含むものとし、例えば突然変異Ｄ１４タンパク質は、野生型の機能性Ｄ１４タンパク質と比較して機能喪失又は機能低下を有し得る。活性の低下は、Ｄ１４タンパク質をコードする遺伝子の発現の低下（ノックダウンとも呼ばれる）、又はＤ１４タンパク質をコードする遺伝子の発現のノックアウト及び／若しくは細胞内のＤ１４タンパク質の量の減少、又は細胞内のＤ１４タンパク質の活性の機能低下若しくは機能喪失であり得る。Ｄ１４タンパク質機能が二次分枝の程度を直接反映する（引き起こす）ことが分かったように、機能喪失タンパク質（若しくはノックアウトアレル）又は機能低下タンパク質（若しくはノックダウンアレル）は、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物において、表現型的に決定され得、「完全な多分枝」表現型又は「中間の多分枝」表現型のいずれかにおいて見られるであろう。

【0188】

本発明に関連して、「野生型植物細胞」又は「野生型植物」という用語は、それらが野生型Ｄ１４アレルを含み、突然変異Ｄ１４アレルを含まないことを意味する。したがって、野生型植物又は野生型植物細胞は、完全に機能性のＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質（野生型Ｄ１４タンパク質とも呼ばれる）をコードする、完全に機能性のＤ１４遺伝子を含む植物又は植物細胞であり、例えばスイカ植物又は植物細胞に関して、そのゲノム中に配列番号６を含み、且つ／又は配列番号２のタンパク質（又は配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質）を産生し、通常の分枝表現型を有する二倍体スイカ植物である。

【0189】

「ノックアウト」又は「完全なノックアウト」は、それぞれの遺伝子の発現がもはや検出可能でないことと理解されるものとする。

【0190】

「機能喪失」、又は「機能低下」、又は「機能減少」は、本発明に関連して、タンパク質が、対応する野生型タンパク質と等しい又は同様の量でおそらく存在するが、その正常な効果をもはや引き起こさないことを意味するものとし、すなわち、二倍体植物にホモ接合体において存在する場合、このようなタンパク質をコードする突然変異アレルについて、植物は、本明細書の他の箇所に記載される表現型変化を生じる。記載されるように、Ｄ１４タンパク質機能が二次分枝の程度を直接反映する（引き起こす）ことが分かり、機能喪失タンパク質又は機能低下タンパク質は、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物において、表現型的に決定され得、「完全な多分枝」表現型又は「中間の多分枝」表現型のいずれかにおいて見られるであろう。

【0191】

「触媒三残基」は、配列番号２（ＣｌＤ１４）、配列番号８（ＣｓＤ１４）及び配列番号９（ＣｍＤ１４）の野生型ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４及びＣｍＤ１４タンパク質、Ｓ９７、Ｄ２１８及びＨ２４７における３つの保存されたアミノ酸を指す。「標的化遺伝子編集」は、内因性標的遺伝子を修飾することができる、例えば１つ以上のヌクレオチドを、例えばプロモーター又はコード配列において挿入、置換及び／又は欠失させることができる技術を指す。例えば、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９遺伝子編集、Ｃｒｉｓｐｒ－ＣｐｆＩ遺伝子編集又は「塩基編集」若しくは「プライマー編集」と呼ばれるより最近の技術などのＣＲＩＳＰＲベースの技術は、スイカにおける内因性野生型ＣｌＤ１４遺伝子（配列番号２のタンパク質又は配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を含む野生型タンパク質をコードする）、キュウリにおける内因性野生型ＣｓＤ１４遺伝子（配列番号８のタンパク質又は配列番号８との少なくとも９５％の配列同一性を含む野生型タンパク質をコードする）及びメロンにおける内因性野生型ＣｍＤ１４遺伝子（配列番号９のタンパク質又は配列番号９との少なくとも９５％の配列同一性を含む野生型タンパク質をコードする）などの内因性標的遺伝子を修飾するために使用され得る。

【0192】

「オリゴヌクレオチド」又は「オリゴ」又は「オリゴヌクレオチドプライマー又はプローブ」は、例えば少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又はそれを超えるヌクレオチド長の、核酸の短い一本鎖ポリマーである。オリゴは、非修飾であり得るか、又はそれらの意図される使用に応じた様々な化学的反応、例えば、それぞれライゲーション又はブロック伸長を可能にする５’又は３’リン酸基の付加、プローブとして使用するための放射性核種又はフルオロフォア及び／又は消光剤による標識、酵素などの機能性分子の共有結合を可能にするチオール、アミノ又は他の反応性部分の取込み並びに多様な機能性の他のリンカー及びスペーサーによる拡張で修飾され得る。ＤＮＡオリゴが最も一般的に使用されるが、ＲＮＡオリゴも利用可能である。オリゴの長さは、通常、接尾語－ｍｅｒ（－量体）を加えることによって表記される。例えば、１９ヌクレオチド（塩基）を有するオリゴヌクレオチドは、１９量体と呼ばれる。ほとんどの使用では、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡの鎖と塩基対合するように設計される。オリゴヌクレオチドの最も一般的な使用は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のプライマーとしての使用である。プライマーは、増幅の標的とされる配列に相補的なそれらの配列の少なくとも一部で設計される。相補配列のための最適なプライマー長さは、例えば１８～２２ヌクレオチドである。ＰＣＲのための最適なプライマー配列は、通常、プライマー設計ソフトウェアによって決定される。

【0193】

「ＤＮＡマイクロアレイ」は、固体担体に結合された、ＤＮＡ、通常、オリゴヌクレオチドの多くの顕微鏡的スポットを有するアレイである。アッセイ標的は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡであり得る。システムに応じて、特異的スポットへの標的のハイブリダイゼーションは、蛍光、化学発光又はコロイド銀若しくは金によって検出される。マイクロアレイは、ゲノムワイドな遺伝子発現解析を可能にする、多数の遺伝子の発現の同時測定並びに例えば一塩基多型（ＳＮＰ）又はインデル解析を用いたジェノタイピング研究などの複数の用途に使用される。

【0194】

「相補鎖」は、２本の相補配列鎖を指し、二本鎖ＤＮＡについて、センス（又はプラス）及びアンチセンス（又はマイナス）鎖と呼ばれることがある。センス／プラス鎖は、一般に、ＤＮＡの転写される配列（又は転写で生成されたｍＲＮＡ）である一方、アンチセンス／マイナス鎖は、センス配列に相補的な鎖である。本明細書で提供される配列のいずれについても、配列の一方の鎖のみが示されるが、示される鎖の相補鎖も本明細書に包含される。ＤＮＡの相補ヌクレオチドは、Ｔに相補的なＡ及びＣに相補的なＧである。ＲＮＡの相補ヌクレオチドは、Ｕに相補的なＡ及びＣに相補的なＧである。

【図面の簡単な説明】

【0195】

【図1】配列番号２の野生型（ＷＴ）ＣｌＤ１４タンパク質と、配列番号１の突然変異ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質との間のペアワイズアミノ酸配列アラインメント。８つの重複したアミノ酸が太字で強調される。

【図2】シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡｔＤ１４タンパク質（配列番号７）と、配列番号１のＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質との間のペアワイズアミノ酸配列アラインメント。触媒三残基のアミノ酸が太字で強調される。

【図3】配列番号１のスイカＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質、及び野生型キュウリＣｓＤ１４タンパク質（配列番号８）、及び野生型メロンＣｍＤ１４タンパク質（配列番号９）の多重配列アラインメント。

【図4-1】配列番号２の野生型スイカＣｌＤ１４タンパク質をコードする野生型ゲノム配列（配列番号６）及び２４の重複／挿入されたヌクレオチドを含み、配列番号１の突然変異タンパク質（触媒三残基、Ｓ９７のアミノ酸の１つを含む、８つのアミノ酸の重複を含む）をコードする突然変異ゲノム配列（配列番号５）のペアワイズアラインメント。イントロン配列が太字で示される。

【図4-2】図４－１の続き。

【図5】Ｆａｍアレル（突然変異挿入アレル）がＸ軸上にあり、ＶＩＣアレル（野生型／欠失アレル）がＹ軸上にある、インデルマーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２についてのアレル識別プロット。

【図6】野生型ＣｌＤ１４タンパク質において同定されるＴＩＬＬＩＮＧ突然変異体が、以下に示されるアミノ酸置換とともに太字で及び下線付きで示される。四角に囲まれたアミノ酸は、触媒三残基のアミノ酸である。薄い灰色のバーは、アミノ酸１３６～１９３のヘリカルリッドドメインを示す（Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０：１９１に記載される）。２つの黒色の三角（矢印付き）は、保存されたドメインＩＰＲ０００７３（アミノ酸２２～２５９）の開始及び終了を示し、これは、「α／βヒドロラーゼ折り目－１」又は「ＡＢ＿ヒドロラーゼ＿１」ドメインとして記載されるＩｎｔｅｒＰｒｏドメインである。このドメインは、以下のように説明される。α／βヒドロラーゼ折り目は、多様な系統発生的起源及び触媒機能のいくつかの加水分解酵素に共通である。各酵素のコアは、らせんによって結合された８つの鎖を含むα／β－シートである（バレルではなく）。酵素は、共通の祖先から分岐して、触媒残基の配置を保存するものと考えられる。全ては、触媒三残基を有し、その要素は、折り目の最も保存された構造的特徴であるループ上にある。触媒三残基は、ループ上に示される。これらの１つは、求核剤エルボーであり、折り目の最も保存された特徴である。

【図7】Ｗ１５５終止ＴＩＬＬＩＮＧ突然変異体（Ｗ１５５終止アレルに対してホモ接合性である）の右側の写真は、多分枝表現型を示す。左側の写真は、単一器官植物（野生型アレルに対してホモ接合性である）であり、機能性ＣｌＤ１４タンパク質がストリゴラクトンに結合し、二次分枝を抑制する。

【発明を実施するための形態】

【0196】

本発明の第１の実施形態は、（ホモ接合体である場合に）遺伝子の機能性野生型アレルに対してホモ接合性である植物と比較して発生する二次分枝の平均数の変化を付与する、本明細書でＤ１４遺伝子（ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４）と呼ばれる遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含む、栽培スイカ、キュウリ又はメロン植物に関する。

【0197】

ＣｌＤ１４遺伝子は、栽培スイカの内因性遺伝子であり、突然変異されるとき且つホモ接合体において、植物によって生成される二次分枝の有意な増加をもたらす。

【0198】

多分枝性スイカでは、ＣｌＤ１４遺伝子の内因性アレルの両方のコピーは、コード配列中の２４ヌクレオチドの重複を含み、これは、したがって、８つのアミノ酸の重複につながることが分かった。タンパク質は、本明細書ではＣｌＤ１４ｉｎｓと呼ばれ、配列番号１に示される。重複は、触媒三残基（Ｓ９７）のアミノ酸の１つを含んでいた。当初、この重複は、機能を低下させるか、又はインビボでの触媒三残基の適切な機能をなくし得ることが本発明者らによって推測されていた。

【0199】

Ｄ１４は、ストリゴラクトン結合、加水分解、様々な他のタンパク質及びリガンドとの相互作用、構造変化及びシグナル伝達を含む、植物及びタンパク質中のいくつかの機能性ドメインにおけるいくつかの機能を有する複雑なタンパク質である。

【0200】

したがって、切断された非機能性Ｄ１４タンパク質（Ｗ１５５^＊タンパク質と呼ばれる）を生成したＴＩＬＬＩＮＧ突然変異体が、８つのアミノ酸重複を含むタンパク質と同じ表現型を有していたことは、非常に意外であった。これは、実際に８つのアミノ酸重複（触媒三残基アミノ酸Ｓ９７を含む）を含むタンパク質が機能喪失タンパク質であったことと、見られる表現型が最も強い二次分枝（本明細書では「完全な多分枝」又は「強い多分枝」と呼ばれる）であったこととを意味していた。完全な機能喪失を有さない突然変異タンパク質が生成され得、これは、「中間の多分枝」表現型、すなわち二次分枝の部分的な抑制のみが存在するように二次分枝形成が抑制され、機能低下Ｄ１４タンパク質によって依然として誘発され、伝達されるシグナル伝達経路を生じさせることも意味する。

【0201】

したがって、一態様では、ＣｌＤ１４（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むスイカ植物であって、突然変異アレルは、対応する野生型アレルと比較して低下した遺伝子発現をもたらすか又は遺伝子発現をもたらさない、１つ以上の調節配列における突然変異を含むか、又は突然変異アレルは、野生型アレルによってコードされるタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入又は置換を含むタンパク質をコードし、ＣｌＤ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらし、突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、増加した平均数の二次分枝を発生させる前記植物をもたらし、突然変異アレルは、配列番号１のタンパク質（ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質）をコードする突然変異アレルではなく、野生型アレルのＣｌＤ１４タンパク質は、
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子、
ｂ）配列番号６で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によってコードされる、スイカ植物が提供される。

【0202】

一態様では、突然変異アレルは、１つ以上のアミノ酸が挿入、置換又は欠失されているタンパク質をコードし、タンパク質の機能喪失をもたらし、それにより、二次分枝の平均数は、その最も高いレベル（完全な多分枝）、例えば、ホモ接合体において野生型アレルを含む野生型対照植物の少なくとも２００％、２１０％、２１５％、２２０％又はそれを超え、例えば、それは、非機能性タンパク質ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質又はＷ１５５^＊タンパク質をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である植物と同程度に多いが、突然変異アレルは、配列番号１のＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質をコードするアレルでない。したがって、植物のゲノムは、８番染色体上に配列番号５を含まず、これは、ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質をコードするゲノム配列である。

【0203】

機能喪失Ｄ１４タンパク質をコードするＣｌＤ１４アレルは、デノボで容易に生成され得る。例えばランダム又は標的化突然変異誘発による。２つの特異的突然変異アレルは、実施例において生成されるＷ１５５^＊突然変異体及びＱ２５５^＊突然変異体である。しかしながら、ＣｌＤ１４タンパク質機能の損失をもたらす任意の他の突然変異アレルが包含され、容易に生成され得、その表現型が試験される。

【0204】

別の態様では、突然変異アレルは、１つ以上のアミノ酸が挿入、置換又は欠失されているタンパク質をコードし、タンパク質の機能低下をもたらすが、タンパク質の機能喪失をもたらさず、それにより、二次分枝の平均数は、野生型ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である植物より多いが、例えばＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質又はＷ１５５^＊タンパク質などの非機能性タンパク質をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である植物ほど多くない。

【0205】

スイカ植物は、一態様では、突然変異アレルに対してホモ接合性であり、且つ野生型アレルに対してホモ接合性である植物と比較して増加した平均数の二次分枝（完全な多分枝又は中間の多分枝）を発生させる。増加した平均二次分枝（完全な多分枝又は中間の多分枝）を有する植物を成長させることができる種子も包含される。

【0206】

元の多分枝突然変異体（本明細書でＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質と呼ばれる８つのアミノ酸重複を含む）について、突然変異アレルにおけるインデルマーカー（挿入／欠失）、すなわち突然変異／修飾アレルにおける２４のさらなるヌクレオチドの挿入及び野生型アレルにおけるこれらの２４のヌクレオチドの「欠失」（非存在）に基づくハイスループットジェノタイピングアッセイは、インデルについて植物、種子又は植物部分の集団のゲノムＤＮＡをスクリーニングするために開発された。図４は、ＣｌＤ１４野生型アレル（配列番号６；「２４ヌクレオチドの欠失」）及び突然変異／修飾アレル（配列番号５、「２４ヌクレオチドの挿入」）のゲノム配列を示す。

【0207】

２つのフォワード及び１つのリバースＰＣＲプライマーを設計するように使用された、インデルを含む２つの配列が配列番号１３（「欠失」配列、すなわち野生型アレル）及び配列番号１４（「挿入配列」、すなわち突然変異アレル）に示される。これらは、アレルの逆鎖（－鎖）の配列である。順鎖（プラス鎖）は、配列番号６（野生型ゲノム配列）及び配列番号５（挿入を有する突然変異ゲノム配列）及びさらに図４に示される。

【0208】

しかしながら、Ｄ１４遺伝子の任意の突然変異アレル、例えば、表Ａ若しくは表２に示される任意の突然変異体又はＣｌＤ１４遺伝子の他の突然変異アレルのための同様のジェノタイピングアッセイが開発され得る（本明細書に包含される）。

【0209】

したがって、一態様では、スイカ植物、種子、植物部分、細胞又は組織をジェノタイピングするためのジェノタイピングアッセイであって、
ａ）１つ以上のスイカ植物又は植物の集団のゲノムＤＮＡを提供する工程と、
ｂ）配列番号６（又はその相補鎖）の野生型アレルの存在及び／又は突然変異アレルの存在を検出するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、突然変異アレルは、配列番号６に対して挿入、欠失、置換又は重複された１つ以上のヌクレオチドを含む、工程と、任意選択的に、
ｃ）野生型アレルの２コピー、又は野生型アレルの１コピー及び突然変異アレルの１コピー、又は突然変異アレルの２コピーのいずれかを含む植物、種子、植物部分、細胞又は組織を選択する工程と
を含むジェノタイピングアッセイが提供される。

【0210】

工程ｂ）において、突然変異アレルの突然変異は、好ましくは、野生型タンパク質と比べて１つ以上のアミノ酸を挿入、欠失又は置換させる。

【0211】

一態様では、スイカ植物、植物部分、細胞又は組織をジェノタイピングするジェノタイピングアッセイであって、
ａ）１つ以上のスイカ植物又は植物の集団（例えば、育種集団、Ｆ２集団、戻し交配集団など）のゲノムＤＮＡを提供する工程と、
ｂ）配列番号２のタンパク質をコードする野生型アレルの存在及び／又は突然変異アレルの存在を検出するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、突然変異アレルは、配列番号２と比べて挿入、欠失、置換又は重複された１つ以上のアミノ酸を含む、工程と、任意選択的に、
ｃ）野生型アレルの２コピー、又は野生型アレルの１コピー及び突然変異アレルの１コピー、又は突然変異アレルの２コピーのいずれかを含む植物、種子、植物部分、細胞又は組織を選択する工程と
を含むジェノタイピングアッセイが提供される。

【0212】

工程ａ）は、ジェノタイピングアッセイで分析される植物、種子、植物部分、細胞又は組織からのゲノムＤＮＡの単離を含み得る。多くの場合、当技術分野で公知であるように、粗ＤＮＡ抽出方法が使用され得る。

【0213】

工程ｂ）は、好ましくは、アレル特異的プライマー及び／又はアレル特異的プローブを利用する両アレルジェノタイピングアッセイを含む。

【0214】

工程ａ）の植物は、例えば、化学的若しくは放射線突然変異原又は遺伝子編集技術を用いて突然変異誘発され得る。したがって、工程ａ）前に、植物、種子若しくは植物部分を突然変異誘発剤で処理する工程又はＣｌＤ１４アレルにおける標的化突然変異を誘発する工程があり得る。

【0215】

インデル及びＳＮＰを検出することができ、ゲノムＤＮＡ（８番染色体上のＣｌＤ１４遺伝子座における）中に存在する配列番号６の野生型アレル又はゲノムＤＮＡ中に存在するＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルを区別することができる限り、様々なジェノタイピングアッセイが使用され得る。ジェノタイピングアッセイは、一般に、ＰＣＲ又は熱サイクル処理反応（ポリメラーゼ連鎖反応）において野生型又は突然変異アレルのいずれかを増幅し、増幅産物を検出するために使用されるアレル特異的プライマーに基づくか、又は野生型アレル若しくは突然変異アレルのいずれか又は両方にハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブに基づく。例えば、ＢＨＱｐｌｕｓプローブによるジェノタイピングは、２つのアレル特異的プローブ及び多型の領域に隣接する２つのプライマーを使用し、熱サイクル処理中、ポリメラーゼは、ＤＮＡに結合したアレル特異的プローブに遭遇し、蛍光シグナルを放出する。アレルの区別は、２つのアレル特異的ＢＨＱＰｌｕｓプローブの競合的結合を含む（ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍも参照されたい）。

【0216】

ジェノタイピングアッセイの例には、競合的アレル特異的ＰＣＲ及びエンドポイント蛍光検出をベースとするＫＡＳＰアッセイ（ＬＧＣによる、ｗｗｗ．ＬＧＣｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ及びさらにｗｗｗ．ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｃｒ－ｋｉｔｓ－ａｎｄ－ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ａｓｓａｙｓ／ｋａｓｐ－ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを参照されたい）、同様にＰＣＲベースであるＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｓｔｅｍｓ）、ＨＲＭアッセイ（高分解能融解アッセイ）（ここで、アレル特異的プローブは、リアルタイムＰＣＲを用いて検出される）又はＲｎａｓｅ Ｈ２依存的ＰＣＲをベースとするｒｈＡｍｐアッセイ、ＢＨＱｐｌｕｓジェノタイピング、ＢＨＱｐｌｅｘ ＣｏＰｒｉｍｅｒジェノタイピング及びその他多くのものがある。

【0217】

ＫＡＳＰアッセイは、Ｈｅ Ｃ，Ｈｏｌｍｅ Ｊ，Ａｎｔｈｏｎｙ Ｊ．‘ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ：ｔｈｅ ＫＡＳＰ ａｓｓａｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１４５：７５－８６’及び欧州特許第１７２６６６４Ｂ１号明細書又は米国特許第７６１５６２０ Ｂ２号明細書（参照により援用される）にも記載されている。ＫＡＳＰジェノタイピングアッセイは、ヌクレオチドレベルで起こっている遺伝的変異の同定及び測定のための新規な均一な蛍光ベースのレポーターシステムと組み合わせて独自の形態の競合的アレル特異的ＰＣＲを利用して、一塩基変異多型（ＳＮＰ）又は挿入及び欠失（インデル）を検出する。ＫＡＳＰ技術は、様々な機器プラットフォームで使用するのに好適であり、分析することが可能なＳＮＰの数及びサンプルの数の点で柔軟性を提供する。ＫＡＳＰ化学は、９６ウェル、３８４ウェル及び１，５３６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいても同様に良好に機能し、ヒト、動物及び植物遺伝学の分野にわたり、使用者によって大規模及び小規模の実験室で長年にわたって利用されている。

【0218】

ＴａｑＭａｎジェノタイピングアッセイは、Ｗｏｏｄｗａｒｄ Ｊ．‘Ｂｉ－ａｌｌｅｌｉｃ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＴａｑＭａｎ（登録商標）ａｓｓａｙ．’ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１４；１１４５：６７－７４、米国特許第５２１００１５号明細書及び米国特許第５４８７９７２号明細書（参照により本明細書に援用される）にも記載されている。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術では、アレル特異的プローブは、公知の多型部位の迅速且つ高信頼性のジェノタイピングに用いられる。ＴａｑＭａｎアッセイは、一塩基変異多型、挿入／欠失及び変異体の有無を含む複数の変異型のジェノタイピングにおいてロバストである。単一の両アレル多型を問い合わせるために、異なるフルオロフォアで標識された２つのＴａｑＭａｎプローブは、周囲の標的領域のＰＣＲベースの増幅中に異なるアレルにハイブリダイズするように設計される。ＰＣＲのプライマー伸長段階中、Ｔａｑポリメラーゼの５’－３’エキソヌクレアーゼ活性により、結合プローブからフルオロフォアが切断され、放出される。ＰＣＲの終了時に、各フルオロフォアの発光強度が測定され、問い合わされた部位におけるアレルの決定が行われ得る。

【0219】

したがって、配列番号２のタンパク質をコードするＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレル又はＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルの存在を区別し得る様々なジェノタイピングアッセイが使用され得る。ＣｌＤ１４遺伝子の様々な突然変異アレルが検出され得る。したがって、配列番号１のタンパク質（２４ヌクレオチドの重複のため、８つのさらなるアミノ酸を含む）をコードする突然変異アレルのみならず、このアッセイは、例えば表Ａ又は表２などに記載されるような任意の突然変異アレルなどのＣｌＤ１４遺伝子の任意の他の突然変異アレルを検出するように設計され得る。

【0220】

記載されるように、好ましくは、両アレルジェノタイピングアッセイ、例えば、ＫＡＳＰアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＢＨＱｐｌｕｓアッセイ、ＰＡＣＥジェノタイピング（ワールドワイドウェブのｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｑｐｃｒ－ａｎｄ－ｐｃｒ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ／ｐａｃｅ－ｓｎｐ－ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ａｓｓａｙｓを参照されたい）又は任意の他の両アレルジェノタイピングアッセイが使用され得る。

【0221】

一態様では、上記の方法の工程ｂ）におけるジェノタイピングアッセイは、ＫＡＳＰアッセイである。したがって、工程ｂ）において、競合的ＰＣＲは、２つのフォワードプライマー及び１つの共通のリバースプライマーを用いて行われる。２つのフォワードプライマーは、配列番号６（又はその相補鎖）に相補的な少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。さらに、２つのフォワードプライマーは、アレルの野生型配列を突然変異配列と区別するＳＮＰ又はインデルに対する特異性を提供する１、２、３又はそれを超えるヌクレオチドを（好ましくはプライマーの３’末端に）含む。２つのフォワードプライマーは、それにより、野生型アレル又は突然変異アレルのいずれかに対する異なる結合特異性（又は優先度）を有する。例えばＦａｍ－プライマーは、野生型配列の１７ヌクレオチド及び挿入アレルに特異的な１ヌクレオチドを含み、実施例におけるＶＩＣ－プライマーは、野生型アレルの１８ヌクレオチド及び「欠失」アレルに特異的な１ヌクレオチドを含む。ＫＡＳＰアッセイは、配列番号６の野生型アレルと、挿入、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドが野生型アレルと異なるＣｌＤ１４遺伝子の任意の突然変異アレルとを区別するように容易に設計され得、したがって、例えば、このアッセイは、２つのアレルを区別する任意のＳＮＰ又はインデル用に設計され得る。

【0222】

例えば、実施例に記載されるＫＡＳＰアッセイなどのジェノタイピングアッセイは、二倍体スイカ植物及び植物部分について記載されるのと同じように、三倍体又は四倍体スイカ植物及び植物部分における突然変異及び／又は野生型ＣｌＤ１４アレルを検出するためにも実施され得ることが注記される。

【0223】

一態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、配列番号２の野生型タンパク質と比べて挿入、重複、置換又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする。

【0224】

一態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、配列番号２のタンパク質と比較して切断されたタンパク質をコードし、例えば少なくとも８、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれを超えるアミノ酸がＣ末端又は任意選択的にＮ末端において欠失している。

【0225】

一態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、配列番号２のタンパク質と比較して欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超えるアミノ酸が欠失されるか又は１つ以上の異なるアミノ酸で置換される。

【0226】

別の態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、配列番号２のタンパク質と比較して挿入又は重複された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードし、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超えるアミノ酸が挿入又は重複される。一態様では、配列番号２のアミノ酸９４～アミノ酸１０１の少なくとも１つ以上のアミノ酸が重複され、好ましくは、少なくともＳ９７が重複される。一態様では、配列番号２のアミノ酸９４～１０１の少なくとも２、３、４、５、６、７又は８つの連続したアミノ酸が重複され、好ましくは、連続したアミノ酸は、Ｓ９７を含む。

【0227】

したがって、一実施形態において、ＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型アレル及び／又は突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）スイカ植物又は複数の植物（例えば、育種集団、Ｆ２、戻し交配など）のゲノムＤＮＡを提供することと、
ｂ）核酸増幅（例えば、アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む）及び／又は核酸ハイブリダイゼーション（例えば、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブの使用を含む）に基づいて、ａ）のゲノムＤＮＡ中のアレルの存在を区別する又は区別し得るアッセイ（例えば、両アレルジェノタイピングアッセイ）を実施して、遺伝子の野生型アレル及び／又は遺伝子の突然変異アレルの存在を検出することであって、野生型アレルは、配列番号６の配列を含み（又は野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし）、突然変異アレルは、配列番号６の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含む（又は突然変異アレルは、配列番号２の野生型タンパク質と比べて挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする）、検出することと、任意選択的に、
ｃ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択することと
を含む方法が提供される。

【0228】

工程ｂ）において、ジェノタイピングアッセイは、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びＰＣＲプライマー、好ましくはアレル特異的プライマーなど、オリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸（特にＤＮＡ）増幅反応及び／又はオリゴヌクレオチドプローブ、好ましくはアレル特異的プローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションに基づいて野生型及び突然変異アレルを区別する。

【0229】

プライマー又はプローブは、好ましくは、標識、例えば蛍光標識を含むか又はテール配列又は他の修飾を含むように修飾される。

【0230】

一態様では、上記の方法のいずれかにおいて、アッセイは、１つ以上のＣｌＤ１４アレル特異的プライマー又は１つ以上のＣｌＤ１４アレル特異的プローブを使用する。記載されるように、配列番号６のゲノム配列又は配列番号２のタンパク質をコードする他の（例えば、縮重）ゲノム配列又は例えば配列番号２と比較して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする突然変異アレルのゲノム配列に基づいて、ＰＣＲプライマー及び核酸プローブは、オリゴヌクレオチド設計のための公知の方法又はソフトウェアプログラムを用いて設計され得る。プライマー及びプローブは、例えば少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又はそれを超えるヌクレオチド（塩基）長であり得、鋳型ＤＮＡ配列にアニールし（又はそれにハイブリダイズし）、すなわち、それらは、好ましくは、標的配列との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。野生型アレル又は突然変異アレルに対するプライマー又はプローブ特異性は、プライマー又はプローブの少なくとも１、２、３又はそれを超えるヌクレオチドがいずれかのアレルに特異的であることに起因する。したがって、プライマー又はプローブは、標的遺伝子の２つのアレル間の多型（例えば、ＳＮＰ又はインデル）として設計され、そのため、それらはこれらを区別する。一態様では、アッセイは、例えば、ＫＡＳＰアッセイ、ＴａｑＭａｎアッセイ、ＢＨＱｐｌｕｓプローブアッセイ又は任意の他の両アレルジェノタイピングアッセイから選択される両アレルジェノタイピングアッセイである。

【0231】

一態様では、突然変異アレルは、アレルのコード領域に挿入若しくは重複された少なくとも１つのコドン、又は（例えば、一塩基変化によって）別のコドンに変化された少なくとも１つのコドン、又は欠失されるか若しくは終止コドンに変化された少なくとも１つのコドンを含む。

【0232】

上記の方法のいずれかにおいて、一態様では、突然変異アレルは、配列番号５の配列を含み、すなわち２４ヌクレオチドの挿入／重複を含み、タンパク質中の８つのアミノ酸の重複をもたらす。したがって、一態様では、本方法は、配列番号２のタンパク質をコードする野生型ＣｌＤ１４アレルの２コピー、配列番号１のタンパク質をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルの２コピー又は各アレル（ヘテロ接合）の１コピーを含む植物、種子又は植物部分を区別するために使用され得る。任意選択的に、これらの遺伝子型のいずれかを含む植物、植物部分又は種子は、例えば、さらなる育種のため又はスイカ産生に使用するために選択され得る。

【0233】

上記の方法のいずれかにおいて、別の態様では、突然変異アレルは、本明細書、例えば表Ａ又は表２に記載される突然変異タンパク質をコードする。したがって、一態様では、本方法は、配列番号２のタンパク質をコードする野生型ＣｌＤ１４アレルの２コピー、本明細書、例えば表Ａ又は表２に記載される突然変異タンパク質をコードする突然変異ＣｌＤ１４アレルの２コピー又は各アレル（ヘテロ接合）の１コピーを含む植物、種子又は植物部分を区別するために使用され得る。任意選択的に、これらの遺伝子型のいずれかを含む植物、植物部分又は種子は、例えば、さらなる育種のため又はスイカ産生に使用するために選択され得る。

【0234】

したがって、一態様では、上記の方法のいずれかにおいて、突然変異アレルは、記載されるように、機能喪失タンパク質又は機能低下タンパク質をコードする。

【0235】

ＰＣＲベース（ＰＣＲプライマーを使用する）であれ、且つ／又はハイブリダイゼーションベース（プローブを使用する）であれ、任意のＤＮＡジェノタイピングアッセイが上記の方法で使用され得るが、一態様では、ＫＡＳＰアッセイが野生型及び突然変異アレルを区別するために使用される。このアッセイは、ハイスループット方式で例えば９６ウェルプレート又はそれを超えるウェルプレート（例えば、３８４ウェルプレート）において使用され得る。

【0236】

野生型及び突然変異ＣｌＤ１４アレル間のＳＮＰ又はインデルに応じて、様々なアレル特異的プライマー及びプローブがアッセイで使用するために設計され得る。

【0237】

一態様では、２つのフォワードプライマー（１つが野生型アレル用及び１つが突然変異アレル用）及び１つの共通のリバースプライマー（野生型及び突然変異アレルの両方用）がＫＡＳＰアッセイで使用される。一態様では、２つのフォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号６又は配列番号６の相補配列の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又はそれを超えるヌクレオチドを含む。フォワードプライマーは、野生型アレルの増幅又は突然変異アレルの増幅のいずれかに対する特異性（又は優先度）を付与する少なくとも１、２又は３ヌクレオチドを（好ましくはプライマーの３’末端に）さらに含む。各フォワードプライマーは、共通のリバースプライマーとプライマー対を形成して、熱サイクル処理中、プライマー対間の標的アレルのＤＮＡ配列を増幅する。熱サイクル処理のための標準的な構成要素が使用され、ＫＡＳＰアッセイのための標準的な構成要素が使用される。

【0238】

一態様では、ＫＡＳＰアッセイは、ＣｌＤ１４アレルに見られるインデルを区別し、すなわち、ＫＡＳＰアッセイは、スイカゲノムにおいて、ホモ接合体において配列番号６（ＣｌＤ１４野生型、通常の分枝性アレル）ののゲノムＤＮＡの存在、ホモ接合体において配列番号５（挿入を有するＣｌＤ１４アレル、多分枝アレル）の存在並びに配列番号６及び配列番号５の両方の存在を区別し得る。異なるフォワード及びリバースプライマーは、アッセイでアレルの区別を達成するように設計され得る。

【0239】

一態様では、フォワードプライマーは、配列番号１０及び／若しくは配列番号１１の配列又はこれらのいずれかの相補配列を含む。一態様では、共通のプライマーは、任意選択的に、配列番号１２の配列又はその相補配列を含む。

【0240】

一態様では、プライマーは、配列番号１０（フォワードプライマー）、配列番号１１（フォワードプライマー）及び配列番号１２（共通のプライマー）又は配列番号１０、配列番号１１若しくは配列番号１２或いはこれらの配列のいずれか１つの相補配列との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を含む配列の１つ以上を含む。

【0241】

別の実施形態において、ＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型アレル及び／又は突然変異アレルのハイブリダイゼーション産物又は増幅産物を産生する方法であって、
ａ）スイカ植物又は複数の植物（例えば、育種集団、Ｆ２、戻し交配など）のゲノムＤＮＡを提供することと、
ｂ）ａ）のゲノムＤＮＡ中のアレルの存在を区別する又は区別し得るアッセイ（例えば、両アレルジェノタイピングアッセイ）を実施することであって、アッセイにより、核酸増幅産物が生成され（例えば、この産物を生成するためにアレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって）、且つ／又はアッセイにより、核酸ハイブリダイゼーション産物が生成され（例えば、ハイブリダイゼーション産物を生成するためにアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、それにより、増幅産物又はハイブリダイゼーション産物は、ＤＮＡ中の遺伝子の野生型アレル及び／又は遺伝子の突然変異アレルの存在を示し、野生型アレルは、配列番号６の配列を含み（又は野生型アレルは、配列番号２のタンパク質をコードし）、突然変異アレルは、配列番号６の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含む（又は突然変異アレルは、配列番号２の野生型タンパク質と比べて挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質をコードする）、実施することと、任意選択的に、
ｃ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択することと
を含む方法が提供される。

【0242】

スイカ植物、植物部分又は種子に由来するゲノムＤＮＡサンプルからの突然変異及び／又は野生型ＣｌＤ１４アレルの全て又は一部を増幅する方法であって、ゲノムＤＮＡを、サンプル中の突然変異ＣｌＤ１４又は野生型ＣｌＤ１４アレルの全て又は一部を増幅するプライマー対と接触させることと、増幅産物を検出することとを含む方法も提供される。

【0243】

スイカ植物、植物部分又は種子に由来するゲノムＤＮＡサンプル中の突然変異及び／又は野生型ＣｌＤ１４アレルにプローブをハイブリダイズする方法であって、サンプル中の突然変異ＣｌＤ１４又は野生型ＣｌＤ１４アレルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡを接触させることと、ハイブリダイゼーション産物を検出することとを含む方法も提供される。

【0244】

上記及び本明細書の他の箇所に記載される全ての実施形態も、これらの実施形態に適用される。したがって、増幅産物は、ＤＮＡサンプル中の突然変異アレル及び／又は野生型アレルを検出するために、例えばＫＡＳＰアッセイ又は他のアッセイで生成されたＰＣＲ増幅産物、例えば競合的ＰＣＲ増幅産物であり得る。したがって、ハイブリダイゼーション産物は、ＤＮＡサンプル中の核酸にハイブリダイズして、ＤＮＡサンプル中の突然変異アレル及び／又は野生型アレルを検出するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション産物であり得る。プライマー対又はプローブは、好ましくは、アレル特異的であり、したがって、これらの産物は、野生型アレルの２コピー、突然変異アレルの２コピー又は各々の１コピーのいずれかがスイカ植物、植物部分又は種子のゲノムＤＮＡ中に存在するものとして区別可能である。

【0245】

プライマー又はプローブは、好ましくは、それらが増幅する又はハイブリダイズする野生型配列と比べて、テール配列若しくは蛍光標識によって修飾され、例えば標識されているか又は他の方法で修飾されている。

【0246】

記載される方法は、植物、植物部分又は種子のゲノムＤＮＡ中の突然変異アレル及び／又は野生型アレルの検出を必要とするため、ゲノムＤＮＡは、検出に利用可能である必要があり、例えば、それは、ＤＮＡ抽出方法を用いて植物細胞から抽出され得るか、又は少なくとも損傷した細胞から溶液（例えば、緩衝液）中に溶出され得る。

【0247】

他のウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）のオルソログ遺伝子が本明細書で提供されるため、上記の方法は、他のＤ１４遺伝子及び他の種、特にキュウリ及びメロンにおけるアレルにも適用され得る。

【0248】

したがって、一態様では、スイカ、キュウリ又はメロン植物、種子、植物部分、細胞又は組織をジェノタイピングするためのジェノタイピングアッセイであって、
ａ）１つ以上のスイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物の集団（例えば、育種集団、Ｆ２集団、戻し交配集団など）のゲノムＤＮＡを提供する工程と、
ｂ）配列番号６の若しくはそれと少なくとも９５％の同一性を含む（スイカ遺伝子）、又は配列番号１５の若しくはそれと少なくとも９５％の同一性を含む（キュウリ遺伝子）、又は配列番号１６の若しくはそれと少なくとも９５％の同一性を含む（メロン遺伝子）野生型アレルの存在及び／又は突然変異アレルの存在を検出することができるか又は検出するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、突然変異アレルは、配列番号６（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）、配列番号１５（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）又は配列番号１６（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）と比べて挿入、欠失、置換又は重複された１つ以上のヌクレオチドを含む、工程と、任意選択的に、
ｃ）野生型アレルの２コピー、又は野生型アレルの１コピー及び突然変異アレルの１コピー、又は突然変異アレルの２コピーのいずれかを含む植物、種子、植物部分、細胞又は組織を選択する工程と
を含むジェノタイピングアッセイが提供される。

【0249】

一態様では、スイカ、メロン又はキュウリ植物、種子、植物部分、細胞又は組織をジェノタイピングするジェノタイピングアッセイであって、
ａ）１つ以上のスイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物の集団（例えば、育種集団、Ｆ２集団、戻し交配集団など）のゲノムＤＮＡを提供する工程と、
ｂ）配列番号２のタンパク質若しくはそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（スイカ野生型ＣｌＤ１４タンパク質）、又は配列番号８若しくはそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（キュウリ野生型ＣｌＤ１４タンパク質）、又は配列番号９若しくはそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（メロン野生型ＣｌＤ１４タンパク質）をコードする野生型アレルの存在及び／又は突然変異アレルの存在を検出することができる（又は検出する）ジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、突然変異アレルは、配列番号２（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）、又は配列番号８（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）、又は配列番号９（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）と比べて挿入、欠失、置換又は重複された１つ以上のアミノ酸を含む、工程と、任意選択的に、
ｃ）野生型アレルの２コピー、又は野生型アレルの１コピー及び突然変異アレルの１コピー、又は突然変異アレルの２コピーのいずれかを含む植物、種子、植物部分、細胞又は組織を選択する工程と
を含むジェノタイピングアッセイが提供される。

【0250】

したがって、ＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）、ＣｓＤ１４（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）又はＣｍＤ１４（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型アレル及び／又は突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）核酸増幅及び／又は核酸ハイブリダイゼーションに基づいて、Ｄ１４アレルを検出又は区別する少なくとも１つの植物から得られるゲノムＤＮＡサンプルに対するアッセイを実施して、遺伝子の野生型アレル及び／又は遺伝子の突然変異アレルの存在を検出することであって、野生型アレルは、配列番号２のタンパク質又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（スイカにおける）、配列番号８又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（キュウリにおける）及び配列番号９又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（メロンにおける）をコードし、突然変異アレルは、配列番号２（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）、配列番号８（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）又は配列番号９（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）と比べて挿入、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む、検出することと、任意選択的に、
ｂ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択することと
を含む方法が提供される。

【0251】

さらに、Ｄ１４遺伝子の遺伝子型を決定し、且つ任意選択的に特定の遺伝子型、例えばＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）、ＣｓＤ１４（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）又はＣｍＤ１４（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型アレル及び／又は突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分を選択する方法であって、
ａ）１つ以上の植物から得られた１つ以上のゲノムＤＮＡサンプルに対して両アレルジェノタイピングアッセイを実施することであって、前記ジェノタイピングアッセイは、アレル特異的プライマー又はアレル特異的プローブが遺伝子の野生型アレル又は遺伝子の突然変異アレルの存在を検出するＤ１４アレル特異的プライマー及び／又はＤ１４アレル特異的プローブに基づいて、Ｄ１４アレルを検出又は区別し、野生型アレルは、配列番号２のタンパク質又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（スイカにおける）、配列番号８又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（キュウリにおける）及び配列番号９又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質（メロンにおける）をコードし、突然変異アレルは、配列番号２（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）、配列番号８（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）又は配列番号９（又はそれと少なくとも９５％の同一性を含む野生型配列と比べて）と比べて挿入、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む、実施することと、任意選択的に、
ｂ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む１つ以上の植物、種子又は植物部分を選択することと
を含む方法が提供される。

【0252】

このようなアッセイは、例えば、Ｄ１４遺伝子の野生型アレル（通常の二次分枝を有する）に対してホモ接合性である、Ｄ１４アレル突然変異アレルに対してホモ接合性又はヘテロ接合性である、特定の遺伝子型を含む植物を選択するために、例えば育種プログラムにおける植物のマーカー支援選択（ＭＡＳ）に使用され得る。

【0253】

したがって、スイカ、キュウリ又はメロン植物を育種する方法も本明細書で提供され、前記方法は、ゲノム中のＤ１４遺伝子座におけるアレル組成について１つ以上の植物をジェノタイピングすることと、任意選択的にＤ１４遺伝子座に特定の遺伝子型を有する１つ以上の植物を選択することとを含む。一態様では、ジェノタイピングバイシーケンシングもＤ１４遺伝子について行われ得る。

【0254】

記載されるように、任意選択的に、突然変異Ｄ１４アレルの２コピーを含む植物又は種子は、成長され、二次分枝表現型についてフェノタイピングされ得る。突然変異アレルは、一態様では、ホモ接合体において、多分枝／増加した二次分枝を付与する突然変異アレルである。一態様では、突然変異アレルは、ホモ接合体である場合、「完全な多分枝」を付与する。別の態様では、突然変異アレルは、ホモ接合体である場合、「中間の多分枝」を付与する。したがって、突然変異アレルは、置換、挿入又は欠失された１つ以上のヌクレオチドを含み得、それにより、コードされたタンパク質は、機能喪失を有するか、又はアレルは、植物において発現されず、突然変異アレルがホモ接合体である場合、「完全な多分枝」をもたらすか、又は突然変異アレルは、置換、挿入又は欠失された１つ以上のヌクレオチドを含み得、それにより、コードされたタンパク質は、機能低下を有するか、又はアレルは、植物において低下した発現を有し、突然変異アレルがホモ接合体である場合、「中間の多分枝」をもたらす。

【0255】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９のＩＰＲ００００７３ドメインの少なくとも１つのアミノ酸（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）を含むタンパク質が欠失されるか、又は異なるアミノ酸若しくは終止コドンで置換されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、少なくとも１つのアミノ酸を含むタンパク質が配列番号２、配列番号８及び配列番号９のＩＰＲ００００７３ドメイン（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）において挿入又は重複されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。

【0256】

異なる態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９のヘリカルリッドドメインの少なくとも１つのアミノ酸（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）を含むタンパク質が欠失されるか、又は異なるアミノ酸若しくは終止コドンで置換されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、少なくとも１つのアミノ酸を含むタンパク質が配列番号２、配列番号８及び配列番号９のドメインのヘリカルリッドドメイン（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）において挿入又は重複されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。

【0257】

別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９の触媒三残基の少なくとも１つのアミノ酸（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）又は触媒三残基アミノ酸の前若しくは後の１、２、３、４、５、６、７若しくは８つのアミノ酸を含むタンパク質が欠失されるか、又は異なるアミノ酸若しくは終止コドンで置換されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９の触媒三残基の少なくとも１つのアミノ酸（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）を含むタンパク質が重複されているため、又は触媒三残基アミノ酸の前若しくは後の１、２、３、４、５、６、７若しくは８つのアミノ酸の少なくとも１つが重複されているため、又は少なくとも１つのアミノ酸が触媒三残基アミノ酸の前又は後の８つのアミノ酸のストレッチに挿入されているため、インビボでの機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。

【0258】

さらに別の態様では、突然変異アレルは、表Ａ又は表２のタンパク質をコードする。

【0259】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９のアミノ酸９４～１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）の重複を含むタンパク質をコードする。

【0260】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９の少なくともセリン９７（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）の重複を含むタンパク質をコードする。

【0261】

さらに他の態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸９４～１０１（又はこれらのいずれかとの少なくとも９５％の同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸）の重複を含むタンパク質をコードする。

【0262】

スイカＣｌＤ１４野生型及び／又は突然変異アレルを検出するためのアッセイについて上記にさらに記載される態様は、キュウリＣｓＤ１４野生型及び／又は突然変異アレル又はメロンＣｍＤ１４野生型及び／又は突然変異アレルを検出するためのアッセイにも適用される。

【0263】

異なる態様では、スイカにおけるＣｌＤ１４と命名された遺伝子、キュウリにおけるＣｓＤ１４及びメロンにおけるＣｍＤ１４の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分が提供され、前記突然変異アレルは、
ａ）調節要素に１つ以上の突然変異を含み、野生型アレルと比較してアレルの発現を生じないか又は低下した発現を生じ、及び／又は
ｂ）野生型タンパク質と比較して置換、挿入、重複又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードするかのいずれかであり、
ａ）又はｂ）の前記突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、（ホモ接合体において野生型アレルを含む植物と比較して）発生する増加した平均数の二次分枝を付与し、野生型スイカＣｌＤ１４アレルは、配列番号２のタンパク質又は配列番号２との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を含むタンパク質をコードし、野生型キュウリＣｓＤ１４アレルは、配列番号８のタンパク質又は配列番号８との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を含むタンパク質をコードし、野生型メロンＣｍＤ１４アレルは、配列番号９のタンパク質又は配列番号９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える配列同一性を含むタンパク質をコードする。

【0264】

スイカの野生型機能性Ｄ１４タンパク質は、配列番号２で示され、キュウリのものは配列番号８で示され、メロンのものは配列番号９で示される。しかしながら、スイカ、キュウリ及びメロン中にいくらかのアミノ酸配列変異が存在することがあり、機能性Ｄ１４タンパク質は、例えば、本明細書で提供される配列番号２、配列番号８又は配列番号９と異なる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超えるアミノ酸を含み得るか、又はタンパク質は、配列番号２、８又は９のタンパク質との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．３％、９９．４％、９９．５％又は９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ－Ｎｅｅｄｌｅを用いてはペアワイズでアラインメントされるとき）を含む。配列番号２、８又は９のＤ１４タンパク質のこのような機能性変異体は、他の系統又は品種で存在し得る。したがって、これらのアレルは、配列が変化し得るが、植物の表現型は、野生型表現型に等しい。このような機能性変異体アレル（対立遺伝子多型）は、例えば、通常の二次分枝パターンを有する多くの異なるスイカ、キュウリ又はメロン系統又は品種のＤ１４遺伝子をシーケンシングすることによって判明され得る。

【0265】

したがって、一態様では、配列番号２、８又は９のタンパク質の機能性変異体は、（例えば、デフォルトパラメータを用いたＮｅｅｄｌｅを用いて）ペアワイズでアラインメントされるとき、配列番号２、８又は９のタンパク質との少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．３％、９９．４％、９９．５％又は９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の配列同一性を含むタンパク質である。

【0266】

一態様では、Ｄ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分が提供され、前記突然変異アレルは、
ａ）配列番号２、８若しくは９のアミノ酸９４から開始し、アミノ酸１０１で終了する領域又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の配列同一性を含む変異体Ｄ１４タンパク質中の同等のアミノ酸、
ｂ）配列番号２、８若しくは９のアミノ酸２２から開始し、アミノ酸２５９で終了するＩＰＲ００００７３ドメインの領域又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の配列同一性を含む変異体Ｄ１４タンパク質中の同等のアミノ酸、
ｃ）配列番号２、８若しくは９のアミノ酸１３６から開始し、アミノ酸１９３で終了するヘリカルリッドドメインドメインの領域又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の配列同一性を含む変異体Ｄ１４タンパク質中の同等のアミノ酸、
ｄ）触媒三残基アミノ酸又は配列番号２、８若しくは９の触媒三残基アミノ酸Ｓ９７、Ｄ２１８及びＨ２４７の前若しくは後の１、２、３、４、５、６、７若しくは８つのアミノ酸又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の配列同一性を含む変異体Ｄ１４タンパク質中の同等のアミノ酸
から選択されるタンパク質の領域において、挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードし、
前記突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、発生する二次分枝の（有意に）増加した平均数を付与し、好ましくは突然変異アレルがホモ接合体である場合に中間の多分枝又は完全な多分枝表現型を付与する。

【0267】

「から開始する」及び「で終了する」又は「から」及び「への」という用語は、記載される最初及び最後のアミノ酸を含む。

【0268】

ａ）において、配列番号２、８又は９のアミノ酸９４から開始し、アミノ酸１０１で終了する、タンパク質の領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失及び／又は置換は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸、好ましくは、少なくともＳ９７の挿入、重複、欠失及び／又は置換であり得る。

【0269】

一態様では、アミノ酸９４～１０１の少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８つの連続したアミノ酸は、好ましくは、少なくともＳ９７の重複、欠失又は置換を含めて重複、欠失又は置換される。一態様では、突然変異アレルは、Ｈ９６（ヒスチジン９６）及びＳ９７（セリン９７）；又はＳ９７（セリン９７）及びＶ９８（バリン９８）；又はＨ９６（ヒスチジン９６）、Ｓ９７（セリン９７）及びＶ９８（バリン９８）；又はＧ９５（グリシン９５）、Ｈ９６（ヒスチジン９６）、Ｓ９７（セリン９７）、Ｖ９８（バリン９８）及びＳ９９（セリン９９）；又はＶ９４（バリン９４）、Ｇ９５（グリシン９５）、Ｈ９６（ヒスチジン９６）、Ｓ９７（セリン９７）、Ｖ９８（バリン９８）、Ｓ９９（セリン９９）及びＡ１００（アラニン１００）；又はＶ９４（バリン９４）、Ｇ９５（グリシン９５）、Ｈ９６（ヒスチジン９６）、Ｓ９７（セリン９７）、Ｖ９８（バリン９８）、Ｓ９９（セリン９９）、Ａ１００（アラニン１００）及びＭ１０１（メチオニン１０１）の重複又は欠失又は置換を含む。

【0270】

別の態様では、Ｄ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分が提供され、前記突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸１９７から開始し、アミノ酸２４９で終了するタンパク質の領域又は配列番号２、８又は９との少なくとも９５％の配列同一性を含む変異体Ｄ１４タンパク質中の同等のアミノ酸における挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードし、前記突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、発生する増加した平均数の二次分枝を付与する。したがって、一態様は、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸１９７から開始し、アミノ酸２４９で終了するタンパク質の領域における１つ以上のアミノ酸の挿入、重複、欠失及び／又は置換であり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸、好ましくは、少なくともＤ２１８又はＨ２４７の挿入、重複、欠失及び／又は置換であり得る。

【0271】

さらに別の態様では、Ｄ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分が提供され、前記突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９又は変異体Ｄ１４タンパク質又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質における挿入、重複、欠失及び／又は置換された少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれを超えるアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードし、前記突然変異アレルは、突然変異アレルがホモ接合体である場合、記載される修飾された表現型を付与する。したがって、突然変異Ｄ１４タンパク質は、例えば、Ｎ末端又はＣ末端において切断されて、Ｎ末端又はＣ末端において前記少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０ ７０、８０、９０、１００、１５０、２００又はそれを超えるアミノ酸を欠き得るか、又は野生型機能性Ｄ１４タンパク質と比較して、任意の他の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸が欠失、置換又は挿入又は重複され得る。一態様では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）が欠失、重複又は置換され、それにより、欠失、重複又は置換は、配列番号２、８若しくは９のＳ９７、Ｄ２１８及びＨ２４７から選択される触媒三残基のアミノ酸又はこれらのいずれかの変異配列における同等のアミノ酸を含む。

【0272】

突然変異アレルは、ランダム突然変異誘発又は標的化遺伝子編集などの様々な技術によって生成され得、次に、突然変異アレルの表現型は、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物において分析され得る。ランダム又は標的化突然変異誘発技術を用いて、任意の突然変異が生成又は再現され得、例えば、本明細書に記載される突然変異体は、デノボで容易に作出され得る。ＴＩＬＬＩＮＧプライマーは、例えばアレルにおける特異的突然変異のために設計され得、例えば本明細書に記載される突然変異体を含むＭ２植物のデノボでの同定を可能にする。品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋ Ｆ１中に存在する突然変異アレルも、デノボで作出され得る。遺伝子配列が開示されている場合、種子の寄託は、実施可能要件でない。同様に、標的化遺伝子編集は、アレルにおける任意の所望の突然変異を生成するために使用され得る。

【0273】

ＴＩＬＬＩＮＧは、例えば、ＭｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ ａｌ．（Ｊｕｎ ２０００）．“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ ｇｅｎｏｍｅｓ（ＴＩＬＬＩＮＧ）ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ”．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３（２）：４３９－４２に記載されている。

【0274】

一態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋ Ｆ１中に存在する突然変異アレルではなく、異なる突然変異アレルであり、例えば１つ以上のヌクレオチドが異なり得るが、例えば遺伝子コードの縮退のため、コードされた突然変異タンパク質は、依然として同じであり得るか（すなわち配列番号１のタンパク質）、又は１つ以上のアミノ酸が配列番号１と比較して異なり得る（すなわち突然変異タンパク質のペアワイズアラインメントが配列番号１との１００％の配列同一性を生じない）。例えば、８つのアミノ酸の重複の代わりに、５、６若しくは７つのみのアミノ酸が重複され得るか；又は９、１０若しくは１１のアミノ酸が重複され得る。別の態様では、ＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレルは、品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋ Ｆ１中の突然変異アレルと同一であるが、ＣＲＩＳＰＲベースの技術などの突然変異誘発技術によってデノボで誘発される。

【0275】

野生型機能性タンパク質の１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換をもたらすＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子における任意の突然変異アレルは、低下した機能を有するか又は機能を有さない突然変異タンパク質をもたらし得、したがって突然変異アレルがホモ接合体である場合、発生するはるかに多い二次分枝の表現型をもたらし得る。このような突然変異アレルを含む植物及び植物部分は、本明細書における一実施形態である。

【0276】

「同等のアミノ酸」は、例えばＥｍｂｏｓｓ Ｎｅｅｄｌｅ（デフォルトパラメータ）を用いて、ペアワイズアミノ酸配列アラインメントによって容易に決定され得る。

【0277】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸番号Ｓ９７、Ｄ２１８若しくはＨ２４７又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸のコドンの重複又は挿入を含むタンパク質をコードする。

【0278】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸番号９４～１０１又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸の１つ以上のコドンの重複又は挿入を含むタンパク質をコードする。

【0279】

コドンの突然変異は、例えば異なるアミノ酸をコードする例えば異なるリーディングフレーム又は異なるコドン又は終止コドンをもたらす、コドンにおける（少なくとも１つの）ヌクレオチド挿入、欠失又は置換であり得る。コドン全体も欠失されるか又は異なるコドン（又は任意選択的に終止コドン）で置換されて、コードされたアミノ酸の欠失又はその置換のいずれかをもたらし得る。

【0280】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸番号Ｓ９７、Ｄ２１８若しくはＨ２４７又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸のアミノ酸置換（置き換え）又は欠失又は終止コドンを含むタンパク質をコードする。

【0281】

一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、８若しくは９のタンパク質のＣ末端又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質のＣ末端の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１１３、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００アミノ酸の切断を含む突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４タンパク質をコードする。一態様では、配列番号２、８若しくは９のアミノ酸９４、９５、９６又は９７から開始する（及びそれを含む）か、又はアミノ酸２１８から開始する（及びそれを含む）か、又はアミノ酸２４７から開始する（及びそれを含む）全てのアミノ酸又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を含むタンパク質中の同等のアミノ酸が欠失されるか又は１つ以上の異なるアミノ酸で置換される。

【0282】

記載されるように、スイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物部分は、突然変異Ｄ１４アレルを含み得、突然変異アレルは、ランダム突然変異誘発又は標的化突然変異誘発、例えばＣＲＩＳＰＲベースの方法によって生成される。ランダム突然変異誘発は、例えば化学物質誘発（例えば、ＥＭＳ処理）又は放射線誘発突然変異誘発又は他の方法であり得、それにより、突然変異がゲノムにおいてランダムに誘発され、次に内因性Ｄ１４遺伝子における突然変異を含む植物又は植物部分がスクリーニングされ、同定され得る。標的化突然変異誘発は、例えば、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９若しくはＣｒｉｓｐｒ－ＣｐｆＩ又は他の公知の方法を用いて、Ｄ１４遺伝子などの標的遺伝子に突然変異を特異的に導入する方法である。

【0283】

一態様では、突然変異アレルを含む植物は、本質的に生物学的なプロセスのみによって産生されるわけではなく、これは、突然変異アレルがある時点で人間の介入によって生成されたことを意味する。このような人間が生成した突然変異アレルが交配及び選択によってある植物から別の植物に転移される場合、植物自体が交配及び選択のみによって生成されたとしても、本特許は、突然変異アレルを含む植物を包含する。

【0284】

一態様では、スイカ、キュウリ又はメロン植物は、二倍体であり、上述されるように突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含み、すなわち、植物は、ヘテロ接合性である。この表現型は、突然変異アレルがホモ接合体である場合にのみ見られるため、これらの植物は、通常の二次分枝を有する。このようなヘテロ接合性植物を自殖させることにより、ホモ接合性であり、突然変異アレルの２コピーを含む植物を生成するであろう。一態様では、スイカ植物は、二倍体であり、上述されるように突然変異Ｄ１４アレルの２コピーを含み、すなわち、植物は、ホモ接合性である。したがって、植物は、本明細書に記載される修飾された表現型も有する。

【0285】

突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含む植物及び植物部分は、好ましくは、栽培植物、野生でない植物である。したがって、好ましくは、栽培スイカ（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ））、キュウリ又はメロン。植物は、近交系系統、Ｆ１交配系又は育種系統であり得る。

【0286】

一態様では、植物は、スイカ植物であり、スイカ植物は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含む、二倍体、三倍体又は四倍体である。二倍体植物又は植物部分は、一態様では、２コピーを含み、三倍体植物又は植物部分は、１、２又は３コピーを含み、四倍体植物又は植物部分は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの２又は４コピーを含む。二倍体植物、種子及び植物部分について本明細書に記載されるジェノタイピング方法又はアッセイは、三倍体又は四倍体植物、種子又は組織／植物部分に同様に当てはまることが注記される。突然変異ＣｌＤ１４アレル又は野生型アレルの１、２又は３コピーを含む三倍体植物、種子又は部分を選択することができ、突然変異ＣｌＤ１４アレル又は野生型アレルの１、２、３又は４コピーを含む四倍体植物を選択することができる。ＫＡＳＰアッセイは、例えば、存在するＣｌＤ１４アレル及びそれらのコピー数について三倍体及び四倍体ゲノムＤＮＡを分析するために使用され得る。

【0287】

上記の植物又は植物部分を成長させることができる種子も本明細書に包含される。

【0288】

突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含む植物部分は、細胞、花、葉、茎、挿木、胚珠、花粉、根、台木、接穂、果実、プロトプラスト、胚、葯であり得る。

【0289】

さらに、植物部分から繁殖され、そのゲノム中に突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含む栄養繁殖させた植物が提供される。

【0290】

一態様では、二倍体、種ありスイカ果実を産生する方法も提供され、前記方法は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの１又は２つのコピーを含む二倍体スイカ植物を成長させることと、花の授粉を可能にすることと、任意選択的に、植物において発生する二倍体、種あり果実を収穫することとを含み、それにより、果実組織は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの１又は２つのコピーも含む。

【0291】

一態様では、種なしスイカ果実を産生する方法も提供され、前記方法は、三倍体スイカ植物に近い突然変異ＣｌＤ１４アレルの２コピーを含む二倍体スイカ植物を成長させることと、二倍体植物の花粉により、三倍体植物の花の授粉を可能にすることと、任意選択的に三倍体植物において発生する種なし果実及び／又は二倍体植物の自家授粉後、二倍体植物において発生する種あり果実を収穫することとを含む。

【0292】

「近く成長する」に言及するとき、これは、二倍体授粉種植物が、授粉種植物に訪れ得る昆虫が花粉を授粉種植物の雄花から三倍体植物に移すことを可能にするほど十分に三倍体植物に近いことを意味する。授粉種は、三倍体植物と同じ圃場において、条を成して若しくは条間に又はランダムに混植され得る。授粉種は、三倍体植物と同じ台木に接木されて、二段接木植物も生成し得る。その後、このような二段接木植物は、花粉をそれらの植物に提供するために、三倍体植物に近く成長され得る。

【0293】

一態様では、突然変異ＣｌＤ１４アレルは、国際公開第２０２１／１６５０９１号パンフレットに記載されるように、２番染色体上のＴｓ遺伝子（トマト種子サイズ遺伝子）などの異なる遺伝子と組み合わされ得る。本明細書に記載される突然変異ＣｌＤ１４アレル及びＴｓ遺伝子欠失又は例えば機能低下又は機能喪失Ｔｓタンパク質をコードする突然変異アレルを組み合わせることにより、本明細書に記載されるような「強い多分枝」又は「中間の多分枝」表現型を有する植物は、小さい種子を有する果実を産生し得る。種子サイズは、２番染色体及び６番染色体遺伝子座によって決定されるため（国際公開第２０２１／１６５０９１号パンフレットに記載されるように）、本明細書に記載される植物の果実は、実際に、大型から中間ないし極小型まで、任意の種子サイズを有し得る。

【0294】

しかしながら、本明細書に記載されるＣｌＤ１４アレルは、単為結果性又は偽単為結果性を付与する遺伝子とも組み合わされ得、それにより、種なし果実は、本明細書に記載されるように、「強い多分枝」又は「中間の多分枝」表現型を有する植物において産生され得る。全て参照により本明細書に援用される、国際公開第２０２２／０９６４５１号パンフレット、国際公開第２０２２／０７８７９２号パンフレット、国際公開第２０１９２３８８３２号パンフレット、国際公開第２０１８０６０４４４号パンフレット又は国際公開第２０１７２０２７１５号パンフレットを参照されたい。

【0295】

植物、植物部分又はそれに由来するＤＮＡを、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４若しくはＣｍＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルの存在についてスクリーニングするため、又はＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４若しくはＣｍＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルを含む植物又は植物部分を選択するため、又はＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４若しくはＣｍＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルを含む植物又は植物部分を生成する方法も提供され、前記突然変異アレルは、
ａ）調節要素に１つ以上の突然変異を含み、野生型アレルと比較してアレルの発現を生じないか又は低下した発現を生じ、及び／又は
ｂ）野生型タンパク質と比較して置換、挿入、重複及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードするかのいずれかであり、
野生型スイカアレルは、配列番号２のタンパク質又は配列番号２との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質をコードし、野生型キュウリアレルは、配列番号８のタンパク質又は配列番号８との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質をコードし、野生型メロンアレルは、配列番号９のタンパク質又は配列番号９との少なくとも９５％の配列同一性を含むタンパク質をコードする。

【0296】

前述されるように、本明細書における方法は、好ましくは、本明細書に記載される突然変異アレルに関し、これは、ホモ接合体である場合、植物の「完全な多分枝」又は「中間の多分枝」表現型をもたらす。

【0297】

植物、植物部分又はそれに由来するＤＮＡをスクリーニングする方法は、ゲノムＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの配列情報を提供すること、ゲノムＤＮＡ中のＤ１４遺伝子配列を決定し、遺伝子配列を野生型遺伝子配列と比較すること、又はＤ１４遺伝子座におけるアレルについてゲノムＤＮＡをジェノタイピングすること、例えば、例えばＰＣＲプライマーを用いて、遺伝子配列若しくはｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）の全て若しくは一部を増幅すること、又はゲノム領域をシーケンシングし（例えば、ジェノタイピングバイーケンシング）、Ｄ１４アレル配列を野生型配列と比較することを含む。

【0298】

突然変異体を生成する方法であって、（例えば、放射線又は化学的突然変異誘発剤を用いて）例えばスイカ、キュウリ又はメロンの１つ以上の種子、植物又は植物部分の突然変異を誘発するか又は突然変異誘発された植物の集団を提供することと、存在する突然変異Ｄ１４アレルについてＭ１若しくはＭ２又はさらなる世代をスクリーニングすることとを含む。次に、突然変異アレルを含む植物は、表現型を分析するために、突然変異アレルに対してホモ接合性にされ得る。

【0299】

一態様では、突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、ゲノムＤＮＡにおける突然変異を含み、本明細書の他の箇所に記載されるように、挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸、例えば配列番号２、８若しくは９のアミノ酸９４～１０１（又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％の同一性を含む配列中の同等のアミノ酸）の重複を含む突然変異Ｄ１４タンパク質の発現をもたらす。

【0300】

したがって、ホモ接合体である場合、発生する二次分枝の少なくとも（有意に）高い平均数を生じさせる、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子の任意の突然変異アレルは、本発明の実施形態である。このような突然変異ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４アレルは、過度の負担なしに当業者によって生成され得る。当業者は、例えば、ＣｌＤ１４、ＣｓＤ１４又はＣｍＤ１４遺伝子における突然変異体を生成し、それらが、例えば、野生型アレルに対してホモ接合性である二倍体植物と比較して、二倍体植物において、ホモ接合体である場合に少なくとも二次分枝のより多い平均数をもたらすかどうかを決定することができる。当業者は、植物が例えば比較として用いられ得る、非機能性タンパク質をコードする突然変異体を生成することもできる。それにより、新たな突然変異体は、突然変異アレルの影響が例えば「中間の多分枝」又は「完全な多分枝」であるかどうかを決定するために、野生型分枝表現型及び「完全な多分枝」表現型と比較され得る。同じ遺伝的背景系統における、したがって、例えば、非突然変異誘発系統（対照、野生型）及び好ましくはまた同じ背景系統における完全な多分枝表現型を有する突然変異系統における突然変異アレルの表現型を比較することが好ましい。最も少ない分枝及び最も強い分枝の表現型が同じ背景にある方式並びに任意の新たな突然変異体が比較され、最も広い範囲に配置され得る。

【0301】

遺伝子のヌクレオチド配列を同定して、当業者は、様々な方法、例えば突然変異誘発、ＴＩＬＬＩＮＧ又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又は当技術分野で公知の他の方法により、Ｄ１４遺伝子中に突然変異体を含むスイカ、キュウリ又はメロン植物を生成することができる。特に、Ｃｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮＳ及びその他などの標的化遺伝子組み換え技術を用いて、標的化突然変異が当業者によって行われ得る。次に、当業者は、突然変異Ｄ１４アレルに対してホモ接合性である、すなわちより多い平均数の二次分枝を発生させる植物の表現型を確認することができる。したがって、当業者は、本明細書に開示される特定のＤ１４突然変異体に限定されず、当業者は、スイカ、キュウリ又はメロンのＤ１４アレルの他の突然変異を同様に生成し、それによりホモ接合体である場合に多分枝をもたらす他の突然変異体を生成することができる。様々な突然変異が生成され、得られる表現型について試験され得、例えば、調節要素は、アレルの発現を低下させるか（ノックダウン）又は発現をなくし（ノックアウト）、したがって細胞又は植物中に存在する野生型Ｄ１４タンパク質の量を減少させるか又はなくすように突然変異され得る。代わりに、Ｄ１４タンパク質の機能低下又は機能喪失をもたらす突然変異、すなわち置換、挿入、重複及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸をもたらす突然変異（ミスセンス突然変異又はフレームシフト突然変異など）又はそれによりタンパク質がコード配列における未成熟終止コドンの導入によって切断される突然変異（ナンセンス突然変異）が生成され得る。

【0302】

Ｄ１４タンパク質は、触媒三残基の保存されたアミノ酸を含むため、一態様では、触媒三残基の１つ以上のアミノ酸又は触媒三残基のアミノ酸を含むものが置換、欠失、重複及び／又は挿入されることが包含され、したがって、突然変異は、機能喪失をもたらす可能性が高い。

【0303】

次に、Ｄ１４アレルの任意の突然変異が、予測される表現型をもたらすかどうかは、突然変異に対してホモ接合性である植物を生成し、野生型植物系統に近く植物系統を成長させ、両方の系統の表現型、例えば多分枝表現型を分析することによって試験され得る。

【0304】

代わりに、当業者は、二次分枝のより多い平均数（多分枝）を生成することが可能な栽培スイカ、キュウリ若しくはメロン植物の産生の方法及び／又は突然変異Ｄ１４アレルを含むスイカ、キュウリ若しくはメロン植物を生成する方法であって、
ａ）スイカ、キュウリ又はメロン植物、植物部分若しくは種子、特に栽培植物の集団に突然変異を導入するか、又は突然変異された植物若しくはその後代の集団を提供する工程と；
ｂ）成長されると、より多い平均数の二次分枝を発生させる植物を選択する工程と；
ｃ）任意選択的に、ｂ）で選択された植物がＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含むかどうかを決定する工程と；
ｄ）任意選択的に、ｃ）で得られた植物を成長させる工程と
を含む方法を実施することができる。

【0305】

工程ｂ）及びｃ）は、工程ｂ）が、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物を選択する工程であり、工程ｃ）が、任意選択的に、植物（又はその後代）がより多い平均二次分枝／多分枝表現型を生成するかどうかを決定する工程であるように入れ替えることもできる。

【0306】

工程ａ）は、例えば、化学的突然変異原、例えばＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）などの突然変異誘発剤による処理又は紫外線、Ｘ線若しくはγ線などによる照射により、例えばスイカ、キュウリ又はメロンの１つ以上の系統又は品種の種子の突然変異を誘発することによって行われ得る。集団は、例えばＴＩＬＬＩＮＧ集団であり得る。好ましくは、突然変異誘発された植物集団は、工程ｂ）を実施する前に（例えば、Ｍ２世代又はＭ３、Ｍ４などを生成するために）少なくとも１回自殖される。

【0307】

工程ｂ）のフェノタイピングは、例えば、二次分枝を計数することにより、容易に視覚的に行われ得る。

【0308】

このような植物又はその後代は、表現型分析（例えば、二次分枝）により、且つ／又はＤ１４遺伝子及びコードされたタンパク質における突然変異若しくはＤ１４遺伝子の発現について植物をジェノタイピングすること、シーケンシングすること及び当業者に公知の他の方法により、突然変異Ｄ１４遺伝子の存在について試験され得る。したがって、表現型的に選択された植物がＤ１４遺伝子の突然変異アレルを含むかどうかを確認するための様々な方法又は方法の組合せがある。

【0309】

工程ｂ）が、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物の選択である場合、当業者は、突然変異Ｄ１４アレルを含む植物を同定するために、Ｄ１４遺伝子のＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出するための様々な方法を使用することもできる。機能性ＣｌＤ１４タンパク質（配列番号２）をコードする野生型スイカＣｌＤ１４遺伝子のゲノムＤＮＡは、配列番号６のＤＮＡであり、配列番号２のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）は、配列番号４で示される。プロモーターは、この配列の上流にあり、例えばシーケンシングによって又はスイカゲノムデータベースから回収され得る。例えば、ＡＴＧ開始の上流の少なくとも１０００又は少なくとも２０００塩基は、プロモーター配列を含む。

【0310】

機能性ＣｓＤ１４タンパク質（配列番号８）をコードする野生型キュウリＣｓＤ１４遺伝子のゲノムＤＮＡは、配列番号１５のＤＮＡであり、配列番号８のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）は、配列番号１７で示される。プロモーターは、この配列の上流にあり、例えばシーケンシングによって又はキュウリゲノムデータベースから回収され得る。例えば、ＡＴＧ開始の上流の少なくとも１０００又は少なくとも２０００塩基は、プロモーター配列を含む。

【0311】

機能性ＣｍＤ１４タンパク質（配列番号９）をコードする野生型メロンＣｍＤ１４遺伝子のゲノムＤＮＡは、配列番号１６のＤＮＡであり、配列番号９のタンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｍＲＮＡ）は、配列番号１８で示される。プロモーターは、この配列の上流にあり、例えばシーケンシングによって又はキュウリゲノムデータベースから回収され得る。例えば、ＡＴＧ開始の上流の少なくとも１０００又は少なくとも２０００塩基は、プロモーター配列を含む。

【0312】

一態様では、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルは、Ｄ１４遺伝子の低下した発現を生じるか若しくは発現を生じない突然変異アレルであるか、又は野生型Ｄ１４タンパク質と比較して置換、挿入、重複又は欠失されたコードされたＤ１４タンパク質の１つ以上のアミノ酸をもたらす突然変異アレルである。

【0313】

一態様では、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルは、標的化又はランダムのいずれかの突然変異を、遺伝子（プロモーター又は他の調節要素、スプライス部位、コード領域など）中で誘発し、突然変異Ｄ１４アレルを含む植物を例えば後代から選択することによって得ることができる。一態様では、コドンの突然変異を含むか、又は１つ以上のコドン、例えば配列番号２、８又は９のアミノ酸９４～１０１をコードするコドンの１つ以上の挿入、欠失又は重複を含むアレルが選択される。一態様では、突然変異アレルは、コードされたスイカ、キュウリ又はメロンＤ１４タンパク質の切断を引き起こす。

【0314】

一態様では、インデルマーカー（マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２）は、スイカ植物若しくは植物部分又はそれに由来するＤＮＡのゲノム中で検出される。このインデルマーカーは、実施例に記載され、スイカにおける挿入アレル（挿入／重複された２４ヌクレオチドを含み、８つのアミノ酸の重複をもたらす）及び／又は野生型アレルを検出する。

【0315】

インデルマーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２への言及は、本明細書で提供される特定のフォワード及びリバースＰＣＲプライマーに限定されず、配列番号６の野生型ＣｌＤ１４アレル及び配列番号５の突然変異ＣｌＤ１４アレル（重複／挿入された２４ヌクレオチドを含む）を区別し得る任意の両アレルマーカーに関連することが注記される。当業者は、他のアレル特異的プライマー又はアレル特異的プローブを、これらの２つのＣｌＤ１４アレルについて遺伝子型を検出するための両アレルマーカーとして容易に使用させることができる。

【0316】

一態様では、インデルマーカー（マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２）は、スイカ植物若しくは植物部分又はそれに由来するゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡのゲノム中で検出される。したがって、２４ヌクレオチドの挿入の存在を検出する方法が本明細書で提供される。したがって、スイカのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ／ｍＲＮＡは、野生型ＣｌＤ１４アレル及び／又は挿入アレルの存在についてスクリーニングされ得、任意選択的に選択され得る。

【0317】

別の態様では、表Ａ又は表２に示されるように、別のアミノ酸又は終止コドンによって単一のアミノ酸置換を付与するＳＮＰは、スイカ植物若しくは植物部分又はそれに由来するＤＮＡのゲノム中で検出される。したがって、それらのＳＮＰのいずれかの存在を検出する方法が本明細書で提供される。したがって、スイカのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ／ｍＲＮＡは、表Ａ又は表２の野生型ＣｌＤ１４アレル及び／又は突然変異アレルの存在についてスクリーニングされ得、任意選択的に選択され得る。

【0318】

スイカ、キュウリ又はメロンの他の突然変異Ｄ１４アレルについて、インデル又はＳＮＰマーカー（又は他のマーカー）及びインデル又はＳＮＰジェノタイピング（又は他のジェノタイピング）アッセイが容易に設計され得る。したがって、特に、スイカ、キュウリ又はメロンのＤ１４タンパク質のアミノ酸挿入、重複、欠失又は置換をもたらす任意の突然変異アレルのためのアレル特異的マーカー及び検出方法が本明細書に包含される。

【0319】

特に、一態様では、インデルマーカー（例えば、マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２）の遺伝子型が決定され、配列番号６の野生型アレル及び／又は配列番号５の突然変異ＣｌＤ１４アレルを含む植物又は後代植物を選択するために使用され得る。

【0320】

突然変異ＣｌＤ１４アレルに対してヘテロ接合性である二倍体植物は、ゲノム中に配列番号５及び配列番号６の両方を含むであろう。突然変異ＣｌＤ１４アレルに対してホモ接合性である二倍体植物は、８番染色体上の遺伝子座において配列番号５のみを含むであろう。野生型アレルに対してホモ接合性である二倍体植物はまた、ゲノム中に配列番号６のみを含むであろう。

【0321】

記載されるように、例えばコドンにおける、根底にあるゲノム変化が、例えば本明細書に開示されるアミノ酸変化根底にあるゲノム変化又は野生型Ｄ１４アレルと比較した、突然変異Ｄ１４アレルにおける他のゲノム変化を検出するようにマーカーアッセイを設計するために使用され得るため、突然変異アレル特異的マーカー及びマーカーアッセイは、同様に、任意の突然変異Ｄ１４アレルのために容易に開発され得る。

【0322】

特異的突然変異Ｄ１４アレルを検出するこのようなアレル特異的マーカーを用いて、ジェノタイピングは、植物及び植物材料（又はそれに由来するＤＮＡ）におけるアレルの存在及びコピー数を検出するために実施され得る。

【0323】

本発明の実施形態に関して、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルの突然変異は、欠失、切断、挿入、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス又は非同義突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異及び／又は調節配列における突然変異を含む任意の突然変異であり得る。一態様では、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルの突然変異は、点突然変異である。突然変異は、Ｄ１４遺伝子のコード配列を含むＤＮＡ配列又はＤ１４タンパク質をコードするＲＮＡ配列中で発生し得るか、又はそれは、Ｄ１４タンパク質のアミノ酸中で発生し得る。Ｄ１４タンパク質コード遺伝子のＤＮＡ配列に関して、突然変異は、コード配列中で発生し得るか、又はそれは、Ｄ１４遺伝子の５’－及び３’－非翻訳領域、プロモーター、エンハンサーなどのような非コード配列中で発生し得る。Ｄ１４タンパク質をコードするＲＮＡに関して、突然変異は、プレ－ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ中で発生し得る。一態様では、突然変異アレルは、１つ以上のアミノ酸が置換、挿入、重複及び／又は欠失されているため機能喪失又は機能低下を有するタンパク質をもたらし、例えば、タンパク質のＣ末端、ＩＰＲ００００７３ドメイン、ヘリカルリッドドメインにおいて置換、挿入、重複及び／又は欠失された１つ以上のアミノ酸をもたらすか、又は触媒三残基のアミノ酸の１つを含む。

【0324】

したがって、本発明の一実施形態は、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む本発明に係る植物細胞又は植物であって、突然変異アレルは、
ａ）ゲノム配列中の欠失、切断、挿入、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス又は非同義突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異；
ｂ）１つ以上の調節配列における突然変異；
ｃ）コード配列中の欠失、切断、挿入、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス又は非同義突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異；
ｄ）プレ－ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ中の欠失、切断、挿入、点突然変異、ナンセンス突然変異、ミスセンス又は非同義突然変異、スプライス部位突然変異、フレームシフト突然変異；及び／又は
ｅ）Ｄ１４タンパク質中の１つ以上のアミノ酸の欠失、切断、挿入、重複又は置換
からなる群から選択される突然変異の１つ以上を含むか又はもたらすことを特徴とする、植物細胞又は植物に関する。

【0325】

一態様では、突然変異アレルは、Ｄ１４遺伝子の低下した発現を生じるか若しくは発現を生じないか、又は突然変異アレルは、機能低下又は機能喪失を有するタンパク質をコードする。特に、突然変異アレルのホモ接合体は、野生型アレルに対してホモ接合性である対照植物と比較して、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物における二次分枝の平均数の有意な増加をもたらす。平均二次分枝の有意な増加は、アレルがノックアウトアレルであるか若しくは非機能性タンパク質を産生する場合、「完全な多分枝」であるか、又はアレルがノックダウンアレルであるか若しくは機能低下タンパク質を産生する場合、「中間の多分枝であるかのいずれかである。

【0326】

低下した発現（ノックダウンアレル）又は無発現（ノックアウトアレル）は、プロモーターなど、Ｄ１４遺伝子の調節領域の突然変異があることを意味し、それにより、野生型Ｄ１４アレルを含む植物及び植物部分と比較して、Ｄ１４アレルの低下したｍＲＮＡ転写物が作出されるか又はｍＲＮＡ転写物が作出されない。発現の低下は、例えば、例えばノーザンブロット分析又はＲＴ－ＰＣＲを用いて、Ｄ１４タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物の量を測定することによって決定され得る。本明細書では、減少は、好ましくは、野生型Ｄ１４遺伝子を含む植物又は植物部分と比較して少なくとも５０％、特に少なくとも７０％、任意選択的に少なくとも８５％若しくは少なくとも９５％又は１００％（無発現）の、ＲＮＡ転写物の量の減少を意味する。発現は、例えば、花組織又は葉組織において分析され得る。

【0327】

一態様では、１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質は、野生型タンパク質と比較して、置換、挿入、重複又は欠失されている。したがって、スイカ、キュウリ又はメロンについて、１つ以上のアミノ酸は、配列番号２、８若しくは９の野生型Ｄ１４タンパク質又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、又は９８％、又は９９％の配列同一性を含む野生型Ｄ１４タンパク質と比較して挿入、欠失又は置換され；それにより、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質と比較して機能低下又は機能喪失を有し、したがって突然変異アレルが二倍体植物にホモ接合体において存在する場合に（中間の又は強い）多分枝をもたらす。

【0328】

上記の野生型アレルの突然変異アレルは、一態様では、低下した発現を有するか若しくは発現を有さない（例えば、プロモーター又はエンハンサー要素の突然変異によって）又は野生型タンパク質と比較して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質を産生する突然変異アレルであり、それにより、突然変異アレルが植物においてホモ接合体である場合及び野生型アレルに対してホモ接合性である植物と比較して、突然変異アレルに対してホモ接合性である植物の表現型を分析することによって決定され得るように、突然変異タンパク質は、インビボで低下した機能を有するか又は機能を有さない。同じ表現型分析は、低下した遺伝子発現を有するか又は遺伝子発現を有さない突然変異アレルについて行われ得る。したがって、任意の突然変異アレルは、植物においてホモ接合性にされ得、表現型は、元の非突然変異アレルを含む対照植物及び／又は非機能性タンパク質をコードする突然変異アレル（例えば、ＣｌＤ１４ｉｎｓ又はＷ１５５^＊など、又はキュウリ若しくはメロンＤ１４タンパク質における同じ突然変異体）を含む対照植物と比較され得る。

【0329】

あるアミノ酸から別のアミノ酸へのアミノ酸が本明細書で言及される場合、これは、言及される開始／最初の及び終了／最後のアミノ酸を含む。

【0330】

アミノ酸が「欠失される」と言及される場合、これは、コドンが終止コドンに変化されるか、又はコドンが欠失される突然変異若しくはコードされないアミノ酸をもたらすフレームシフトがある突然変異を含む。同様に、アミノ酸が「置換される」と言及される場合、これは、コドンが異なるアミノ酸をコードするか若しくはコドンが挿入される突然変異又はコードされる異なるアミノ酸をもたらすフレームシフトがある突然変異を含む。

【0331】

スイカは、任意のタイプのスイカであり得る。一態様では、突然変異ＣｌＤ１４アレル、例えば、配列番号１のタンパク質をコードする突然変異アレル又は異なる突然変異アレルの１又は２つのコピーを含むスイカ植物は、授粉種植物ではなく、すなわち、それは、例えば、開花期が三倍体開花と同期しておらず、且つ／又は花粉産生が花粉発生源として好適であるほど十分に多くないため、三倍体果実産生のための授粉種として好適でない。一態様では、それは、果実産生自体に使用され、花粉産生に使用されない。したがって、それは、三倍体植物と混植されない（混植に好適でない）が、自家授粉によって果実産生のためにそれ自体で成長される。自家授粉後に産生される果実はまた、ピンク色又は白色の果肉及び低いブリックスを有して「収穫不可能」ではなく、収穫及び消費のために十分に適している（すなわち高いブリックス、赤色の果肉を有するなど）。

【0332】

突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ植物及びその部分は、二倍体、四倍体又は三倍体であり得る。二倍体植物は、突然変異アレルに対してヘテロ接合性であるか、又は突然変異アレル、例えば配列番号１のタンパク質をコードする突然変異アレル若しくは記載される任意の他の突然変異アレルに対してホモ接合性であり得る。一態様では、ホモ接合体において突然変異Ｄ１４アレルを含む二倍体植物は、倍加単数体植物（ＤＨ）、例えば倍加単数体スイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物細胞又は植物部分である。

【0333】

三倍体スイカ植物は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの１、２又は３コピーを有し得る。突然変異アレルの１コピーを有する三倍体植物は、野生型雌四倍体（４つの野生型コピーを有する）を、突然変異アレルに対してホモ接合性である二倍体雄と交配させることによって作出され得る。２つの突然変異アレルを有する三倍体植物は、突然変異アレルの４つのコピーを含む雌四倍体を、野生型アレルに対してホモ接合性である二倍体雄と交配させることによって作出され得る。

【0334】

四倍体スイカ植物は、突然変異ＣｌＤ１４アレルの１、２、３又は４つのコピーを有し得る。突然変異アレルの２コピーを含む遺伝子型は、突然変異アレルに対してヘテロ接合性である二倍体の染色体を倍加することによって作出され得る。突然変異アレルの４コピーを含む遺伝子型は、突然変異アレルに対してホモ接合性である二倍体の染色体を倍加することによって作出され得る。

【0335】

本明細書に包含されるスイカ、キュウリ又はメロン植物はまた、栄養（クローン）繁殖され得、このような栄養繁殖させた植物又は「栄養繁殖」は、本発明の一実施形態である。それらは、突然変異Ｄ１４アレルの存在によって且つ／又は表現型的に（任意選択的に自殖後）他の植物と容易に区別され得る。１つ以上の突然変異Ｄ１４アレルの存在は、本明細書の他の箇所に記載されるように決定され得る。

【0336】

栄養繁殖は、様々な方法によって作出され得る。例えば、本発明の植物の１つ以上の接穂は、異なる台木、例えば生物的ストレス又は非生物的ストレス耐性台木に接木され得る。

【0337】

他の方法は、インビトロ細胞又は組織培養方法及びこのような培養からの栄養繁殖の生殖を含む。このような細胞又は組織培養物は、本発明の植物の様々な細胞又は組織を含むか又はそれからなる。一態様では、このような細胞又は組織培養物は、本発明の植物の栄養細胞又は栄養組織を含むか又はそれからなる。

【0338】

別の態様では、細胞又は組織培養物は、本発明の植物の葯、花粉、小胞子又は胚珠などの生殖細胞又は組織を含むか又はそれからなる。このような培養物は、染色体倍加剤で処理されて、例えば倍加単数体植物を作出し得るか、又はそれらは、代わりに、単数体植物を作出するために（例えば、四倍体から二倍体を作出するため又は二倍体から単数体を作出するために）使用され得る。

【0339】

インビトロ細胞又は組織培養物は、したがって、果実、胚、分裂組織、子葉、花粉、小胞子、胚珠、葉、葯、根、根端、雌しべ、花、種子、茎からなる群から選択される植物部分からの細胞又はプロトプラスト又は植物組織を含むか又はそれからなり得る。例えば種皮（母体組織）のみなど、これらのいずれかの部分も含まれる。

【0340】

したがって、本発明の一態様では、突然変異Ｄ１４アレルの１又は２つのコピーを含む植物の細胞の細胞培養物又は組織培養物（全て上述されるとおりである）が提供される。記載されるように、細胞培養物又は組織培養物は、突然変異Ｄ１４アレルを含む植物の植物部分からの細胞又はプロトプラスト又は植物組織を含み、胚、分裂組織、子葉、花粉、小胞子、葉、葯、根、根端、雌しべ、花、種子、茎；又はこれらのいずれかの部分からなる群から選択される細胞又は組織を含むか又はそれからなり得る。

【0341】

このような細胞培養物又は組織培養物から再生されたスイカ、キュウリ又はメロン植物も提供され、再生された植物（又は例えば再生植物を交配若しくは自殖させた後に得られるその後代）は、突然変異Ｄ１４アレルを含む。したがって、一態様では、１つ以上のコピーにおける突然変異Ｄ１４アレルを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物は、栄養繁殖させた植物である。

【0342】

異なる態様では、１つ以上のコピーにおける突然変異Ｄ１４アレルを含む、本発明の細胞及び組織（及び任意選択的に、さらに細胞又は組織培養物）は、非繁殖細胞又は組織である。

【0343】

さらなる方法
増加した平均数の二次分枝を生成することが可能なスイカ、キュウリ若しくはメロン植物の産生の方法又はＤ１４遺伝子の突然変異アレルを生成する方法であって、
ａ）スイカ、キュウリ又はメロン植物の集団に突然変異を導入するか若しくはスイカ、キュウリ又はメロン植物突然変異集団を提供する工程；又はＤ１４標的遺伝子におけるランダムに誘発される突然変異又は標的化誘発突然変異を含むスイカ、キュウリ又はメロン植物を提供する工程、
ｂ）Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物を選択する工程；
ｃ）任意選択的に、ｂ）で選択される植物が、突然変異Ｄ１４アレルがホモ接合体である場合、Ｄ１４遺伝子の野生型アレルを含む対照植物と比較して増加した平均数の二次分枝を生成するかどうかを確認する工程
を含む方法も提供される。

【0344】

完全な多分枝表現型を生成することが可能なスイカ、キュウリ若しくはメロン植物の産生の方法又はホモ接合体である場合に完全な多分枝表現型を付与するＤ１４遺伝子の突然変異アレルを生成する方法であって、
ａ）スイカ、キュウリ又はメロン植物の集団に突然変異を導入するか若しくはスイカ、キュウリ又はメロン植物突然変異集団を提供する工程；又はＤ１４標的遺伝子におけるランダムに誘発される突然変異又は標的化誘発突然変異を含むスイカ、キュウリ又はメロン植物を提供する工程、
ｂ）Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物を選択する工程であって、突然変異Ｄ１４アレルは、ノックアウトアレル又は機能喪失Ｄ１４タンパク質をコードするアレルである、工程；
ｃ）任意選択的に、ｂ）で選択される植物が、突然変異Ｄ１４アレルがホモ接合体である場合、Ｄ１４遺伝子の野生型アレルを含む対照植物と比較して増加した平均数の二次分枝を生成するかどうかを確認する工程
を含む方法も提供される。

【0345】

中間の多分枝表現型を生成することが可能なスイカ、キュウリ若しくはメロン植物の産生の方法又はホモ接合体である場合に中間の多分枝表現型を付与するＤ１４遺伝子の突然変異アレルを生成する方法であって、
ａ）スイカ、キュウリ又はメロン植物の集団に突然変異を導入するか若しくはスイカ、キュウリ又はメロン植物突然変異集団を提供する工程；又はＤ１４標的遺伝子におけるランダムに誘発される突然変異又は標的化誘発突然変異を含むスイカ、キュウリ又はメロン植物を提供する工程、
ｂ）Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物を選択する工程であって、突然変異Ｄ１４アレルは、ノックダウンアレル又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードするアレルである、工程；
ｃ）任意選択的に、ｂ）で選択される植物が、突然変異Ｄ１４アレルがホモ接合体である場合、Ｄ１４遺伝子の野生型アレルを含む対照植物と比較して増加した平均数の二次分枝を生成するかどうかを確認する工程
を含む方法がさらに提供される。

【0346】

上記の方法によって生成される突然変異Ｄ１４アレル及び／又は上記の方法によって誘発及び同定される突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、メロン又はキュウリ植物が包含される。一態様では、上記の方法によって産生され、ホモ接合体において完全な多分枝を付与する突然変異アレルを含むスイカ植物は、配列番号５の突然変異アレルを含まない。別の態様では、上記の方法によって産生され、ホモ接合体において完全な多分枝を付与する突然変異アレルを含むスイカ植物は、品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋと異なるスイカバックグラウンドにあり、それが、授粉種Ｓｉｄｅｋｉｃｋによってコードされるのと同じタンパク質（配列番号１に示されるタンパク質ＣｌＤ１４ｉｎｓ）をコードする場合、品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋと１つ以上の特性が異なる。それは、例えば、授粉種として好適でなく、且つ／若しくは赤色の果肉を有し、且つ／若しくはより高い平均果実重量を有するか、又はその植物をＳｉｄｅｋｉｃｋと区別する他の特性を有する果実を産生する点でＳｉｄｅｋｉｃｋと異なり得る。

【0347】

ａ）でのスイカ、キュウリ又はメロン植物の集団は、好ましくは、突然変異誘発剤で処理される／処理された（又はそれに曝された）栽培スイカ、キュウリ又はメロン育種系統若しくは品種の単一の遺伝子型或いは例えばＭ２、Ｍ３又はさらなる世代の植物を産生する集団の個体を自殖した後に得られるこのような集団の後代である。これは、例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ集団であり得る。それは、例えば、Ｃｒｉｓｐｒベースの方法を用いて標的化遺伝子組み換えを行われたスイカ、キュウリ又はメロン系統でもあり得る。

【0348】

工程ｂ）において、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルを含む植物の選択は、表現型的に且つ／又はＤ１４遺伝子の突然変異アレル、すなわち野生型Ｄ１４アレルの低下した発現を有するか（ノックダウンアレルの場合）若しくは発現を有さない（ノックアウトアレルの場合）かのいずれかであるアレル又は突然変異Ｄ１４タンパク質をコードするアレルの存在について植物（又は植物部分又はそれに由来するＤＮＡ）をスクリーニングすることによって行われ得る。

【0349】

表現型についてのスクリーニングに関して、これらは、突然変異Ｄ１４アレルがホモ接合体である場合及び突然変異アレルが低下した発現を有するか若しくは発現を有さないか又は機能低下若しくは機能喪失タンパク質をコードする場合にのみ選択され得、それにより表現型が分かることが理解される。表現型又は表現型の組合せについてのスクリーニングは、記載されるように行うことができ、例えば、ホモ接合体における野生型Ｄ１４アレルを含む対照系統又は品種と同じ成長条件下において、ホモ接合体における突然変異Ｄ１４アレルを含む系統を成長させ、次に二次分枝を分析する。

【0350】

Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルの存在についての植物のスクリーニング又は選択に関して、これは、例えば、植物がゲノムＤＮＡの突然変異を含むかどうかを決定するために、コード領域の一部又はコード領域の全てを増幅して、ゲノムＤＮＡを増幅するＰＣＲプライマーを例えば設計すること又は他の方法により、Ｄ１４ ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質を検出する様々な方法によって行われ得る。

【0351】

したがって、突然変異Ｄ１４アレルの存在を決定するため又は存在する突然変異Ｄ１４アレルを含む植物を選択するために様々な方法が使用され得る。例えば、Ｄ１４遺伝子座を含むアレル又は染色体領域のマーカー解析又は配列解析が実施され得るか、又はＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲがＤ１４アレル（若しくはその一部）又はｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅するために使用され得るか、又はシーケンシングが行われ得る。劣性遺伝を決定するための遺伝子解析も実施され得る。したがって、アレルは、例えばシーケンシングされて（例えば、そのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ）、どのような突然変異が存在するかを決定することができる。工程ｂ）において、Ｐｒｏｖｅａｎ及び／又はＳＩＦＴ解析も、Ｄ１４タンパク質機能を低下させるか又はなくすことが予測される突然変異アレルを有する植物を選択するために使用され得る。実施例を参照されたい。

【0352】

遺伝子編集方法が使用された場合、内因性アレルの突然変異を誘発するために植物に導入されたベクター／構築物は、好ましくは、突然変異Ｄ１４アレルを含む植物系統から除去され、それにより、植物系統は、このようなベクター又は構築物を含まない。

【0353】

一態様では、植物は、形質転換によってゲノムに挿入された遺伝子構築物を含まない。

【0354】

一態様では、突然変異アレルは、特に、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９又はＣｒｉｓｐｒ／ＣｐｆＩ又は他のヌクレアーゼ）を用いて、突然変異誘発（例えば、化学的若しくは放射線突然変異誘発）によって又は標的化突然変異誘発によって生成される。一態様では、突然変異Ｄ１４アレルを含む栽培植物は、トランスジェニック植物ではなく、すなわち例えばＣＲＩＳＰＲ構築物を含まない非トランスジェニック後代が選択される。

【0355】

一態様では、Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルは、人為的な突然変異、すなわち化学的突然変異誘発若しくは放射線突然変異誘発などの突然変異誘発技術又はＣｒｉｓｐｒベースの技術などの標的化突然変異誘発技術によって導入される突然変異を含む。

【0356】

ＣＲＩＳＰＲベースの方法（例えば、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９若しくはＣｒｉｓｐｒ／ＣｐｆＩ）、ＴＡＬＥＮＳ、亜鉛フィンガー又は他の方法などの任意の標的化遺伝子組み換え方法を用いた、スイカ、キュウリ又はメロンにおける内因性Ｄ１４遺伝子の標的化突然変異誘発の方法が本明細書で提供される。

【0357】

一態様では、単離された突然変異Ｄ１４タンパク質及び単離された野生型Ｄ１４タンパク質又は突然変異Ｄ１４タンパク質若しくは野生型Ｄ１４タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。突然変異又は野生型Ｄ１４タンパク質に結合することが可能な抗体も本明細書に包含される。単離された突然変異タンパク質は、一態様では、８つのアミノ酸の重複を含む配列番号１のタンパク質であるが、本明細書に記載される任意の他の突然変異Ｄ１４アレルの単離されたタンパク質でもあり得る。一態様では、単離された突然変異タンパク質は、表Ａ又は表２に記載されるタンパク質である。一態様では、単離された核酸は、表Ａ又は表２に記載される突然変異タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0358】

さらなる態様では、本明細書で提供されるヌクレオチド配列又は核酸分子（及び／又は配列又は分子の相補鎖）の断片は、これらがＤＮＡ又はＲＮＡサンプル中の配列を検出するためにＰＣＲプライマー又はプローブとして使用され得るため、包含される。断片は、例えば、配列番号５若しくは６、配列番号１３若しくは１４、配列番号１５若しくは１６、配列番号１０、１１若しくは１２のゲノム配列、又はこれらのいずれか相補鎖若しくは逆相補鎖、又はｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ配列、又は配列番号３若しくは４、又は配列番号１７若しくは１８、又はこれらのいずれかの相補鎖若しくは逆相補鎖の分子の、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５又はそれを超えるヌクレオチドのストレッチを含む。表Ａ又は表２に記載される突然変異タンパク質をコードする単離された核酸分子又は配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の断片も包含される。

【0359】

検出方法
一態様では、種子、植物又は植物部分又はＤＮＡを、Ｄ１４タンパク質コード遺伝子の突然変異アレル及び／又は野生型アレルをゲノム中に含むこのような種子、植物又は植物部分から同定及び／又は選択するためのスクリーニング方法が提供される。

【0360】

本方法は、突然変異アレル及び／又は野生型アレルの存在を検出するために、公知の方法を用いて、ＤＮＡ（特に、ゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（若しくはｃＤＮＡ）又はタンパク質レベルでスクリーニングすることを含む。遺伝子の突然変異アレル及び／又は野生型アレルの存在を検出するための多くの方法がある。

【0361】

したがって、突然変異Ｄ１４アレル及び／又は野生型Ｄ１４アレルの存在について、植物又は植物材料若しくは植物部分或いはそれに由来するＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はタンパク質をスクリーニング及び／又は選択する方法であって、以下の工程：
ａ）内因性Ｄ１４遺伝子の遺伝子発現を、例えば、それが低下又は消失したかどうかを検出するために決定する工程；
ｂ）野生型Ｄ１４タンパク質の量を、例えば、それが低下又は消失したかどうかを検出するために決定する工程；
ｃ）突然変異又は野生型Ｄ１４タンパク質をコードする突然変異及び／又は野生型ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡが存在するかどうかを決定する工程；
ｄ）突然変異及び／又は野生型Ｄ１４タンパク質が存在するかどうかを決定する工程；
ｅ）植物又はその後代が突然変異表現型（記載されるように、例えば強い多分枝又は中間の多分枝）又は野生型表現型（通常の分枝）を示すかどうかを決定する工程
の１つ以上を含む方法が提供される。

【0362】

ＲＴ－ＰＣＲ、ＰＣＲ、抗体ベースのアッセイ、シーケンシング、ジェノタイピングアッセイ（例えば、アレル特異的ジェノタイピング）、ジェノタイピングバイシーケンシング、フェノタイピングなどの常法が使用され得る。

【0363】

植物又は植物材料又は植物部分は、葉、葉部分、細胞、果実、果実部分、子房、茎、胚軸、種子、種子の部分、種皮、胚など、スイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物材料又は植物部分であり得る。

【0364】

例えば、野生型アレルと突然変異アレルとの間に一塩基の相違（一塩基変異多型、ＳＮＰ又は挿入欠失多型、インデル）がある場合、ＳＮＰ又はインデルジェノタイピングアッセイは、植物又は植物部分又は細胞がそのゲノム中に野生型ヌクレオチド（若しくは複数のヌクレオチド）又は突然変異ヌクレオチド（若しくは複数のヌクレオチド）を含むかどうかを検出するために使用され得る。例えば、ＳＮＰ又はインデルは、ＫＡＳＰアッセイ（ワールドワイドウェブのｋｐｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏ．ｕｋを参照されたい）又は他のジェノタイピングアッセイ、特に両アレルジェノタイピングアッセイを用いて容易に検出され得る。ＫＡＳＰアッセイを開発するために、例えば、ＳＮＰ又はインデルの上流の約７０塩基対及び下流の約７０塩基対が選択され得、２つのアレル特異的フォワードプライマー及び１つのリバースプライマーが設計され得る。例えばＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ．９，１０８６－１０９９、特にＫＡＳＰアッセイ方法については、ｐ０９７－１０９８を参照されたい。

【0365】

同様に、他のジェノタイピングアッセイが使用され得る。例えば、ＴａｑＭａｎ ＳＮＰジェノタイピングアッセイ、高分解能融解（ＨＲＭ）アッセイ、ＳＮＰ－ジェノタイピングアレイ例えばマイクロアレイ（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａなど）又はＤＮＡシーケンシング（例えば、シーケンシングにとるジェノタイピング）が同様に使用され得る。

【0366】

したがって、野生型アレル及び突然変異アレルのゲノム配列の相違に基づいて、当業者は、特定のアレルを検出するために使用され得るマーカー又はアッセイを容易に開発することができる。

【0367】

突然変異Ｄ１４アレルを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物（若しくは植物部分）を同定する方法も本明細書で提供され、この方法は、植物（若しくは植物部分）において突然変異Ｄ１４アレルの存在を検出することを含み、この存在は、Ｄ１４アレル中で少なくとも１つのマーカー（例えば、ＳＮＰマーカー若しくはインデルマーカー）又はＤ１４アレルによってコードされたタンパク質を検出することによって検出される。突然変異Ｄ１４アレルを検出する方法は、ＰＣＲ増幅、核酸シーケンシング、核酸ハイブリダイゼーション及びアレルによってコードされたＤ１４タンパク質を検出するための抗体ベースのアッセイ（例えば、免疫測定法）を含む方法からなる群から選択される。

【0368】

調節要素の突然変異を含む突然変異Ｄ１４アレルを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物（若しくは植物部分）を同定する方法も本明細書で提供され、この方法は、植物（若しくは植物部分）において突然変異Ｄ１４アレルの低下した遺伝子発現又は遺伝子発現の非存在を検出することを含み、この存在は、野生型Ｄ１４アレルのｍＲＮＡレベル（ｃＤＮＡ）又は野生型Ｄ１４タンパク質のタンパク質レベルを検出することによって検出される。突然変異Ｄ１４アレルを検出する方法は、ＰＣＲ増幅（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）、核酸シーケンシング、ウエスタンブロット法及びアレルによってコードされたＤ１４タンパク質を検出するための抗体ベースのアッセイ（例えば、免疫測定法）からなる群から選択される。

【0369】

スイカ、キュウリ又はメロン植物又は植物部分の細胞又はが、配列番号２、８若しくは９のタンパク質又は配列番号２、８若しくは９との少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を含むタンパク質をコードするＤ１４と命名された遺伝子の突然変異アレルを含むかどうかを決定、又は検出、又はアッセイする方法も提供され、本明細書で提供される。一態様では、本方法は、アレルの発現を決定し、且つ／又はアレルのコード配列を決定し、且つ／又はアレルのコード配列の一部（例えば、アレルのＳＮＰ又はインデル遺伝子型）を決定し、且つ／又は産生されたタンパク質のアミノ酸配列及び／若しくは産生されたタンパク質の量を決定することを含む。

【0370】

植物又はその部分が本発明の突然変異Ｄ１４アレルを含むかどうかを決定するために様々な方法が使用され得る。記載されるように、野生型アレルのｍＲＮＡ（若しくはｃＤＮＡ）レベルが決定され得るか、又は野生型タンパク質レベルが、野生型アレルの低下した発現又は無発現があるかどうかを調べるために決定され得る。コード配列又はその一部は、例えば、いずれの突然変異アレルが存在し得るかを既に認識している場合にも分析され得、アッセイは、突然変異を検出するために開発され得、例えばＳＮＰ又はインデルジェノタイピングアッセイ、例えばマーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２についてのジェノタイピング（実施例を参照されたい）又は表Ａ若しくは表２の突然変異アレル或いは他の突然変異アレルのいずれかについてのジェノタイピングは、例えば、突然変異アレル及び野生型アレルの存在を区別することができる。

【0371】

植物の選択の方法であって、
ａ）Ｄ１４タンパク質コード遺伝子をコードするアレルの突然変異を有する植物を同定する工程であって、遺伝子の野生型アレルは、配列番号２、８又は９の群から選択されるタンパク質のいずれか１つとの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含むＤ１４タンパク質をコードする、工程と、任意選択的に、
ｂ）植物又は後代植物が多分枝表現型を生成するかどうかを決定する工程と、任意選択的に、
ｃ）工程ａ）の突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含む植物を選択する工程と
を含む方法。

【0372】

植物の産生の方法であって、
ａ）植物の集団に突然変異を導入する工程又は突然変異された植物の集団（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ集団）を提供する工程と、
ｂ）多分枝表現型を生成する及び／又は突然変異Ｄ１４アレルを含む植物を選択する工程と、
ｃ）任意選択的に、ｂ）で選択された植物が、Ｄ１４タンパク質コード遺伝子をコードするアレルの突然変異を有するかどうかを確認し、且つこのような突然変異を含む植物を選択する工程と、任意選択的に、
ｄ）ｃ）で得られた植物を成長させる／栽培する工程と
を含み、遺伝子の野生型アレルは、配列番号２、８又は９のタンパク質との少なくとも９５％の配列同一性を含むＤ１４タンパク質をコードする、方法。

【0373】

強い多分枝表現型又は中間の多分枝表現型を含む植物の選択の方法であって、
ａ）Ｄ１４遺伝子の突然変異アレルの存在について植物（又はそれに由来するＤＮＡ）をスクリーニングする工程であって、遺伝子の野生型アレルは、配列番号２、８又は９の群から選択されるタンパク質のいずれか１つとの少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含むＤ１４タンパク質をコードする、工程と、
ｂ）ｉ）がノックアウトアレルであるか又は非機能性Ｄ１４タンパク質をコードする突然変異アレル（このアレルは、ホモ接合体において強い多分枝表現型を生成する）、又はｉｉ）がノックダウンアレルであるか又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードする突然変異アレル（このアレルは、ホモ接合体において中間の多分枝表現型を生成する）のいずれかを含む植物を選択する工程と、任意選択的に、
ｃ）ホモ接合体における突然変異アレルを含む植物又は後代植物がｉ）の前記強い多分枝表現型又はｉｉの前記中間の多分枝表現型を生成することを確認する工程と
を含む方法。

【0374】

一態様では、工程ｂ）は、例えば、タンパク質機能に対するアミノ酸変化の影響のＳＩＦＴ又はＰｒｏｖｅａｎ解析を実施することにより、突然変異アレルが、機能低下又は機能喪失を有するＤ１４タンパク質をコードするかどうかを予測することを含む。Ｐｒｏｖｅａｎ解析において「有害」である及び／又はＳＩＦＴ解析において「許容されない」と予測されるアレルを含む１つ又は複数の植物が工程ｂ）で選択される。

【0375】

強い多分枝表現型又は中間の多分枝表現型を含む植物の産生又は選択の方法であって、
ａ）植物の集団に突然変異を導入するか、又は突然変異植物の集団（例えば、ＴＩＬＬＩＮＧ集団）を提供する工程、
ｂ）ｉ）がノックアウトアレルであるか又は非機能性Ｄ１４タンパク質をコードする突然変異Ｄ１４アレル（このアレルは、ホモ接合体において強い多分枝表現型を生成する）、又はｉｉ）がノックダウンアレルであるか又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードする突然変異Ｄ１４アレル（このアレルは、ホモ接合体において中間の多分枝表現型を生成する）のいずれかを含む植物を選択する工程、
ｃ）ｉ）若しくはｉｉ）の突然変異アレルを含む植物を選択する工程
を含み、遺伝子の野生型アレルは、配列番号２、８又は９のタンパク質との少なくとも９５％の配列同一性を含むＤ１４タンパク質をコードする、方法。

【0376】

選択された植物は、ホモ接合体における突然変異アレルを含む植物を産生するように自殖され得、ホモ接合性植物は、表現型を決定するために成長され得る。

【0377】

植物の産生の方法であって、
ａ）植物への外来核酸分子の導入の工程であって、外来核酸分子は、
ｉ）Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の低下をもたらす少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子；
ｉｉ）共抑制効果により、Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の低下をもたらすＤＮＡ分子；
ｉｉｉ）Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の特異的転写物を分割する少なくとも１つのリボザイムをコードするＤＮＡ分子；
ｉｖ）少なくとも１つのアンチセンスＲＮＡ及び少なくとも１つのセンスＲＮＡを同時にコードするＤＮＡ分子であって、前記アンチセンスＲＮＡ及び前記センスＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子を形成し、これは、Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の低下をもたらす（ＲＮＡｉ技術）、ＤＮＡ分子；
ｖ）Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は異種配列の挿入をもたらすインビボでの突然変異誘発によって導入される核酸分子であって、突然変異又は挿入は、Ｄ１４タンパク質をコードする遺伝子の発現の低下をもたらすか、又は機能喪失又は機能低下Ｄ１４タンパク質の合成をもたらす、核酸分子；
ｖｉ）抗体をコードする核酸分子であって、抗体は、内因性Ｄ１４タンパク質への抗体の結合によりＤ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の活性の低下をもたらす、核酸分子；
ｖｉｉ）トランスポゾンを含むＤＮＡ分子であって、これらのトランスポゾンの組み込みは、Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子における突然変異又は挿入をもたらし、これは、Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の低下をもたらすか、又は不活性タンパク質の合成をもたらす、ＤＮＡ分子；
ｖｉｉｉ）Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の挿入により、Ｄ１４タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の低下をもたらすか、又は機能喪失又は機能低下Ｄ１４タンパク質の合成をもたらす、Ｔ－ＤＮＡ分子；
ｉｘ）レア切断エンドヌクレアーゼ又は特注のレア切断エンドヌクレアーゼ、好ましくは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸分子
からなる群から選択される、工程、
ｂ）植物又は植物の後代を選択する工程であって、植物又は植物の後代は、より高いパーセンテージの融合した花弁及び／若しくは葉を有する雄花及び／又は花を生成する、工程、任意選択的に、
ｃ）ｂ）で選択された植物又は後代が、例えば外来核酸分子がゲノムに組み込まれていない野生型植物と比較して、Ｄ１４タンパク質の低下した活性を有するかどうかを確認する工程、任意選択的に、
ｄ）ｃ）で得られた植物を成長させる／栽培する工程
を含む方法。

【0378】

上記の方法のいずれかによって得られる植物が本明細書に包含される。

【0379】

一態様では、例えば内因性Ｄ１４遺伝子のサイレンシングにより、内因性Ｄ１４遺伝子の低下した発現を有するか又は発現を有さない遺伝子組み換え植物及び植物部分が提供される。このような植物は、任意の植物であり得、一態様では、それは、スイカ、キュウリ又はメロンである。

【0380】

別の態様では、内因性Ｄ１４遺伝子の突然変異、例えば標的化突然変異誘発によって生成された例えば誘発された突然変異を含む、スイカ、キュウリ又はメロン植物及び植物部分が提供され、それにより、遺伝子発現は、低下されるか若しくはなくされるか、又は発現された遺伝子は、野生型タンパク質と比較して機能低下又は機能喪失Ｄ１４タンパク質をコードするかのいずれかである。

【0381】

別の態様では、ＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型アレル及び／又は突然変異アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）１つ以上のスイカ植物、種子又は植物部分の１つ以上のゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と、
ｂ）野生型ＣｌＤ１４アレルと突然変異ＣｌＤ１４アレルとを区別する、鋳型としてａ）のＤＮＡサンプルを使用するジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸増幅に基づき、及び／又は前記ジェノタイピングアッセイは、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションに基づく、工程と、任意選択的に、
ｃ）突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択する工程と
を含み、野生型ＣｌＤ１４アレルは、配列番号６の配列を含み、突然変異ＣｌＤ１４アレルは、配列番号６の配列に対して挿入、重複、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含む、方法が提供される。

【0382】

上記の方法において、配列番号６又は配列番号６の相補鎖の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超えるヌクレオチドを含む、ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は前記ＣｌＤ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用され得る。

【0383】

上記の方法における一態様では、突然変異アレルは、アレルのコード領域に挿入若しくは重複された少なくとも１つのコドン、又は別のコドンに変化された少なくとも１つのコドン、又は欠失されるか若しくは終止コドンに変化された少なくとも１つのコドンを含む。

【0384】

上記の方法の一態様では、突然変異アレルは、配列番号５の配列を含む。

【0385】

上記の方法の別の態様では、突然変異アレルは、表Ａ又は表２に記載されるタンパク質をコードするアレルである。

【0386】

上記の方法の別の態様では、突然変異アレルは、本明細書の他の箇所に記載されるように、機能喪失Ｄ１４タンパク質又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードするアレルである。

【0387】

上記の方法における一態様では、オリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６又は配列番号６の相補配列に相補的な、少なくとも１５、１６、１７又はそれを超えるヌクレオチドを含む。

【0388】

好ましくは、上記の方法において使用されるジェノタイピングアッセイは、ＫＡＳＰアッセイであり、前記ＫＡＳＰアッセイは、ＤＮＡサンプル中において、配列番号６の野生型アレルを検出する第１のフォワードプライマーと、ＤＮＡサンプル中において、配列番号６に対して挿入、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含む突然変異アレルを検出する第２のフォワードプライマーと、１つの共通のリバースプライマーとを含む。

【0389】

一態様では、第２のフォワードプライマーは、ＤＮＡサンプル中の配列番号５の突然変異アレルを検出する。

【0390】

別の態様では、第２のフォワードプライマーは、表Ａ又は表２に記載されるタンパク質をコードするアレルである突然変異アレルを検出する。

【0391】

別の態様では、第２のフォワードプライマーは、本明細書の他の箇所に記載されるように、機能喪失Ｄ１４タンパク質又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードするアレルである突然変異アレルを検出する。

【0392】

ＫＡＳＰアッセイの一態様では、第１のフォワードプライマーは、配列番号１１又はその相補配列を含み、及び／又は第２のフォワードプライマーは、配列番号１０又はその相補配列を含む。

【0393】

合成された又は合成核酸プライマー又はプローブも本明細書に包含され、前記プライマー又はプローブは、例えば、配列番号５（若しくは別の突然変異アレル）若しくは配列番号６又はこれらのいずれかの相補配列の少なくとも１５ヌクレオチドを含む。このようなオリゴは、オリゴ合成のための一般的な方法を用いて合成され得る。プライマー又はプローブは、好ましくは、ＤＮＡオリゴであり、例えばジェノタイピングアッセイで使用されるように例えば緩衝液中で提供される。

【0394】

ＣｌＤ１４と命名された遺伝子（キトルルス・ラナトゥス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）、ＣｓＤ１４（ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）Ｄｗａｒｆ１４）又はＣｍＤ１４（ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）Ｄｗａｒｆ１４）の野生型Ｄ１４アレル及び／又は突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを含むスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分を検出及び任意選択的に選択する方法であって、
ａ）１つ以上のスイカ、キュウリ又はメロン植物、種子又は植物部分の１つ以上のゲノムＤＮＡサンプルを提供する工程と、
ｂ）鋳型としてａ）のＤＮＡサンプルを用いて、ジェノタイピングアッセイを実施する工程であって、前記ジェノタイピングアッセイは、Ｄ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマーを利用する核酸増幅に基づき、及び／又は前記ジェノタイピングアッセイは、Ｄ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを利用する核酸ハイブリダイゼーションに基づく、工程と、任意選択的に、
ｃ）前記突然変異アレルの１又は２つのコピーを含む植物、種子又は植物部分を選択する工程と
を含み、野生型Ｄ１４アレルは、配列番号２（スイカにおける）、配列番号８（キュウリにおける）及び配列番号９（メロンにおける）のタンパク質をコードし、突然変異Ｄ１４アレルは、配列番号２、配列番号８又は配列番号９と比べて挿入、欠失又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む、方法がさらに提供される。

【0395】

一態様では、突然変異Ｄ１４アレルは、本明細書の他の箇所に記載されるように、機能喪失Ｄ１４タンパク質又は機能低下Ｄ１４タンパク質をコードするアレルである。

【0396】

本方法の一態様では、前記Ｄ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプライマー又は前記Ｄ１４アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号６、若しくは配列番号１５、若しくは配列番号１６又はこれらのいずれかの相補鎖の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれを超えるヌクレオチドを含む。

【0397】

上記の方法のさらなる態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９のアミノ酸９４～１０１から選択される少なくとも１つのアミノ酸の重複を含むタンパク質をコードする。一態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８及び配列番号９の少なくともセリン９７の重複を含むタンパク質をコードする。別の態様では、突然変異アレルは、配列番号２、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸９４～１０１の重複を含むタンパク質をコードする。

【0398】

さらに、スイカ系統を選択するためにインデルマーカーを用いたマーカー支援選択（ＭＡＳ）を含む、スイカのための育種方法であって、前記インデルマーカーは、１つ又は複数のゲノムＤＮＡサンプル中において配列番号６の配列（欠失アレル又はその相補配列）及び／又は配列番号５の配列（挿入アレル又はその相補配列）を検出する、方法が提供される。

【0399】

スイカ系統を選択するためにインデルマーカー又はＳＮＰマーカーを用いたマーカー支援選択（ＭＡＳ）を含む、スイカのための育種方法であって、前記インデルマーカー又はＳＮＰマーカーは、１つ又は複数のゲノムＤＮＡサンプル中において、配列番号２の野生型タンパク質をコードするアレル及び／又は配列番号６の野生型タンパク質と比べて、欠失、挿入、重複又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードするアレルを検出する、方法も提供される。一態様では、突然変異タンパク質は、本明細書の他の箇所に記載されるように、機能喪失Ｄ１４タンパク質又は機能低下Ｄ１４タンパク質である。一態様では、突然変異タンパク質は、表Ａ又は表２のタンパク質である。

【0400】

一態様では、突然変異タンパク質は、配列番号２の配列番号９４～１０１の１つ以上のアミノ酸の重複を含む。一態様では、突然変異タンパク質は、配列番号１の配列を含む。

【0401】

一態様では、インデルマーカーは、マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２である。

【0402】

キュウリ又はメロン系統を選択するためにインデルマーカー又はＳＮＰマーカーを用いたマーカー支援選択（ＭＡＳ）を含む、キュウリ又はメロンのための育種方法であって、前記インデルマーカー又はＳＮＰマーカーは、１つ又は複数のゲノムＤＮＡサンプル中において、配列番号８若しくは９の野生型タンパク質をコードするアレル及び／又は配列番号８若しくは９の野生型タンパク質と比べて、欠失、挿入、重複又は置換された１つ以上のアミノ酸を含む突然変異タンパク質をコードするアレルを検出する、方法も提供される。一態様では、突然変異タンパク質は、配列番号８又は９の配列番号９４～１０１の１つ以上のアミノ酸の重複を含む。

【0403】

上記のこれらの方法は、本明細書の他の箇所に記載される突然変異Ｄ１４アレルのいずれかを用いて、選択又は検出又は育種するために使用され得る。

【0404】

異なる態様では、植物、特にスイカ植物、キュウリ植物又はメロン植物を産生する方法であって、
－ 野生型Ｄ１４アレルの２コピーを有する第１の近交系植物を提供すること、
－ 突然変異Ｄ１４アレル、例えばスイカについて配列番号５の突然変異アレル又は本明細書に記載される任意の他の突然変異アレルの２コピーを有する第２の近交系植物を提供すること、
－ 第１の植物を第２の植物と交配させて、Ｆ１交配系の種子を産生すること、
－ 任意選択的に、Ｆ１交配種子を採取すること
を含む方法が提供される。

【0405】

異なる態様では、植物、特にスイカ植物、キュウリ植物又はメロン植物を産生する方法であって、
－ 突然変異Ｄ１４アレルの２コピーを有する第１の近交系植物を提供すること、
－ 突然変異Ｄ１４アレル、例えばスイカについて配列番号５の突然変異アレル又は本明細書に記載される任意の他の突然変異アレルの２コピーを有する第２の近交系植物を提供すること、
－ 第１の植物を第２の植物と交配させて、Ｆ１交配系の種子を産生すること、
－ 任意選択的に、Ｆ１交配種子を採取すること
を含む方法が提供される。

【0406】

異なる態様では、植物、特にスイカ植物、キュウリ植物又はメロン植物を産生する方法であって、
－ 野生型Ｄ１４アレルの２コピーを有する第１の植物を提供すること、
－ 突然変異Ｄ１４アレル、例えばスイカについて配列番号５の突然変異アレル又は本明細書に記載される任意の他の突然変異アレルの１又は２つのコピーを有する第２の植物を提供すること、
－ 第１の植物を第２の植物と交配させて、Ｆ１植物の種子を産生すること、
－ Ｆ１植物を自殖させて、Ｆ２植物を産生すること又はＦ１植物を別の植物と交配させて、後代植物を産生すること、
－ 任意選択的に、Ｆ２植物をさらに自殖させるか又は前の工程のＦ２植物又は後代植物をさらに（戻し）交配させて、さらなる自殖又は戻し交配植物を産生すること、
－ 任意選択的に、突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピーを有する植物を選択すること
を含む方法が提供される。

【0407】

さらなる実施形態において、スイカ、キュウリ又はメロンのある育種系統又は品種に突然変異Ｄ１４アレルを遺伝子移入する方法であって、突然変異Ｄ１４アレルを含む植物を、突然変異Ｄ１４アレルを欠く植物と交配させること、Ｆ１、Ｆ２又はさらなる世代の後代を反復親に戻し交配させること、最終的に、突然変異Ｄ１４アレルを含む反復親を選択することを含む方法。

【0408】

任意選択的に、ＭＡＳは、第１若しくは第２の植物又はＦ２、Ｆ３などの任意のさらなる世代若しくは戻し交配世代における突然変異及び／又は野生型Ｄ１４アレルを選択するために使用され得る。

【0409】

上記のこれらの方法は、本明細書の他の箇所に記載される突然変異Ｄ１４アレルのいずれかを用いて、選択又は検出又は育種するために使用され得る。

【0410】

上記の方法のいずれかによって産生され、突然変異Ｄ１４アレルの少なくとも１つのコピー、任意選択的に２コピーを含む種子及び／又は植物が本明細書に包含される。

【0411】

配列の説明
配列番号１：挿入を含む、スイカの突然変異Ｄ１４タンパク質（ＣｌＤ１４ｉｎｓ）
配列番号２：スイカの野生型Ｄ１４タンパク質（ＣｌＤ１４）
配列番号３：配列番号１の突然変異ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質をコードするｃＤＮＡ
配列番号４：配列番号２の野生型Ｄ１４タンパク質をコードするｃＤＮＡ
配列番号５：挿入／重複された２４ヌクレオチドを含む、配列番号１の突然変異ＣｌＤ１４ｉｎｓタンパク質をコードするゲノムＤＮＡ
配列番号６：野生型ＣｌＤ１４タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ、ヌクレオチド３７５～４６３のイントロン
配列番号７：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）Ｄ１４タンパク質
配列番号８：キュウリ、ククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）の野生型Ｄ１４タンパク質、ＣｓＤ１４タンパク質
配列番号９：メロン、ククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）の野生型Ｄ１４タンパク質、ＣｍＤ１４タンパク質
配列番号１０：マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２のためのＫＡＳＰアッセイのＦＡＭプライマー
配列番号１１：マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２のためのＫＡＳＰアッセイのＶＩＣプライマー
配列番号１２：マーカーｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２のためのＫＡＳＰアッセイの共通のリバースプライマー
配列番号１３：ＫＡＳＰプライマーを設計するために使用される、ＣｌＤ１４野生型アレルのマイナス鎖
配列番号１４：ＫＡＳＰプライマーを設計するために使用される、ＣｌＤ１４ｉｎｓ突然変異アレル（挿入／重複された２４ヌクレオチドを含む）のマイナス鎖
配列番号１５：キュウリ野生型ＣｓＤ１４遺伝子のゲノムＤＮＡ
配列番号１６：メロン野生型ＣｍＤ１４遺伝子のゲノムＤＮＡ
配列番号１７：キュウリ野生型ＣｓＤ１４遺伝子のｃＤＮＡ
配列番号１８：メロン野生型ＣｍＤ１４遺伝子のｃＤＮＡ

【0412】

以下の非限定的な例が提供される。

【実施例】

【0413】

実施例１
二次分枝（「多分枝」とも呼ばれる）についてのＱＴＬマッピングを、多分枝品種Ｓｉｄｅｋｉｃｋ Ｆ１を、専有の通常の分枝性スイカ植物と交配させることによって開発されたＦ２集団に対して行った。

【0414】

フェノタイピングを、クラウンから９０ｃｍにおける主茎から開始して茎の末端までの二次分枝の数を計数することによって行った。計数を、系統／遺伝子型当たり５～７つの植物に対して行い、平均二次分枝を計算した。

【0415】

８番染色体上の遺伝子がＳｉｄｅｋｉｃｋ Ｆ１における多分枝表現型を生じさせたことが分かった。この遺伝子は、通常分枝の親において存在する野生型遺伝子と比較して、８つのさらなるアミノ酸をコードした２４ヌクレオチドの重複を含有していた。この遺伝子は、本明細書ではＣｌＤ１４と呼ばれる。多分枝表現型は、遺伝子の突然変異アレル（２４－ヌクレオチド重複を含む）がホモ接合体において存在する場合にのみ見られた。

【0416】

配列番号６に示される遺伝子の野生型アレルと、配列番号５に示される、２４のさらなるヌクレオチド（挿入は、野生型配列の２４ヌクレオチドの重複である）を含む遺伝子の突然変異アレルとを区別するための、ｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２と呼ばれるＫＡＳＰマーカーが開発された。図４を参照されたい（イントロン配列が太字で示される）。

【0417】

Ｆ３集団を、ｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２及び二次分枝の平均数について分析し、結果は、以下のとおりであった。

【0418】

【表3】

【0419】

したがって、遺伝子の突然変異アレル（配列番号５；ＣｌＤ１４ｉｎｓ、２４ヌクレオチドの挿入を含む）は、ホモ接合体における突然変異アレルを含むスイカ植物の平均分枝パターンを、４５以上の二次分枝が形成される分枝パターンに変化させることに関与していた。

【0420】

ＫＡＳＰアッセイｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２を、２つのフォワードプライマー及び共通の／リバースプライマーを用いて実施した：
配列番号１０（Ｆａｍプライマー、５’ＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＡＣＣ３’）、及び
配列番号１１（ＶＩＣプライマー、５’ＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＡＣＡ３’）、
配列番号１２（共通のプライマー５’ＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴ３’）。

【0421】

Ｆａｍ及びＶｉｃプライマーは、ＫＡＳＰアッセイについて記載されるように、５’末端にテール配列も含んでいた。

【0422】

ＫＡＳＰアッセイのためのＤＮＡ配列が逆ＤＮＡ鎖（マイナス鎖）上で設計されたが、アレルのプラス鎖に基づいて同様に設計され得ることが注記される。プラス及びマイナス鎖は、二本鎖ＤＮＡの相補鎖である。ヌクレオチドＧは、相補鎖中のＣであり、ヌクレオチドＡは、相補鎖中のＴである。

【0423】

ＫＡＳＰアッセイプライマー設計、ｍＷＭ２３３４９０１５＿ｋ２のために使用されるＤＮＡ配列（ＦＡＭ及びＶＩＣプライマーは、陰影付きの灰色である）。

【0424】

【表4】

【0425】

ＫＡＳＰのパンフレットに従って、ＬＧＣ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）からのＫＡＳＰ（商標）ジェノタイピング技術は、広範なゲノムＤＮＡサンプルにわたって特定の遺伝子座におけるＳＮＰ（一塩基変異多型）及びインデル（挿入／欠失）の高度に正確な両アレルスコアリングを可能にする競合的アレル特異的ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の独自の形態を用いる。両アレルの区別は、２つのユニバーサルプローブの１つと一致する独自のテール配列をそれぞれ有する２つのアレル特異的フォワードプライマーの競合的結合によって達成され；一方はＦＡＭ（商標）色素で標識され、他方はＨＥＸ（商標）色素で標識される。

【0426】

上述されるようなＤＮＡ鋳型（Ｓｉｄｅｋｉｃｋとの交配から得られる様々なスイカ系統又は集団のゲノムＤＮＡ）及びＰＣＲ－プライマーの他に、標準的な構成要素（例えば、ＫＡＳＰアッセイミックス、ＫＡＳＰ－マスターミックスなど）及びアッセイプロトコルは、ＬＧＣ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）のワールドワイドウェブのｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｃｒ－ｋｉｔｓ－ａｎｄ－ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ａｓｓａｙｓ／ｋａｓｐ－ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によって記載されるようにアッセイで使用された。

【0427】

アレル識別プロット（図５）は、ホモ接合性野生型、ヘテロ接合性及びＣｌＤ１４ｉｎｓアレルに対してホモ接合性であるサンプルを区別した。ＣｌＤ１４ｉｎｓアレルにおける反復配列／重複の存在により、サンプル（ＣｌＤ１４ｉｎｓ／ＣｌＤ１４又はＣｌＤ１４ｉｎｓ／ＣｌＤ１４ｉｎｓ）を含有するＣｌＤ１４ｉｎｓアレルは、野生型サンプル（ＣｌＤ１４／ＣｌＤ１４）と比較してより多いシグナルを生成し、それにより、シグナルの分布は、アレル識別プロットにおける古典的な分布から逸脱するが、遺伝子型は、異なるクラスターにおいて明らかに区別されることが注記される。図５中の左上のクラスターは、野生型アレルに対してホモ接合性である植物を表し、右上のクラスターは、挿入／重複を含む突然変異アレルに対してホモ接合性である植物を表し、中央のクラスターは、ヘテロ接合性植物を表す。

【0428】

図４において、２つのゲノム配列（プラス鎖）のアラインメントが示され、配列番号６は、野生型ゲノム配列（挿入を欠く）であり、配列番号５は、２４ヌクレオチドの挿入を含み、したがってＣｌＤ１４ｉｎｓとも呼ばれる、ＣｌＤ１４タンパク質中の８つのアミノ酸の挿入（重複）をもたらす突然変異ＣｌＤ１４配列である（図１及び３を参照されたい）。

【0429】

したがって、上記のＫＡＳＰアッセイは、配列番号６の野生型ＣｌＤ１４アレル（２４ヌクレオチドの挿入／重複を欠く）又はゲノム配列中に２４ヌクレオチドの挿入（重複）を含む配列番号５の突然変異ＣｌＤ１４アレル、すなわち配列番号５中にヌクレオチド２８０～３０３が挿入された（図４を参照されたい）（これは、実際には、配列番号６の野生型配列のヌクレオチド２８１～３０４の重複である）（図４に斜体で示される）突然変異ＣｌＤ１４アレルを検出するために使用され得る。

【0430】

このＫＡＳＰアッセイ又は他のアッセイは、配列番号６のＣｌＤ１４遺伝子の野生型アレル及び／又は野生型アレルと比べて挿入、欠失又は置換された１つ以上のヌクレオチドを含むＣｌＤ１４遺伝子の突然変異アレル、例えば配列番号５の突然変異アレルを検出するために使用され得る。

【0431】

Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－プロットに対するＣｌＤ１４タンパク質のＢＬＡＳＴ解析を、他の種におけるＣｌＤ１４遺伝子のオルソログを同定するために実施し、２つのオルソログ、配列番号８のタンパク質をコードするククミス・サティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）ＣｓＤ１４遺伝子及び配列番号９のタンパク質をコードするククミス・メロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）ＣｍＤ１４遺伝子が同定された。

【0432】

実施例２
スイカＴＩＬＬＩＮＧ集団をスクリーニングし、アミノ酸置換又は終止コドンをもたらすいくつかの突然変異体がＣｌＤ１４遺伝子中に見出された。突然変異体は、以下の表２に列挙され、図６中にも示される。

【0433】

【表5】

【0434】

Ｗ１５５終止突然変異体は、突然変異がホモ接合体である場合、多分枝表現型を有する（Ｗ１５５^＊／Ｗ１５５^＊）。表現型は、８つのアミノ酸の重複を含む元の突然変異体（ＣｌＤ１４ｉｎｓ／ＣｌＤ１４ｉｎｓ）の表現型のように見える。二次分枝の平均数を、クラウンから４０ｃｍの地点で決定し、以下の表３に示す。

【0435】

【表6】

【0436】

表現型が同一であり、及びＷ１５５^＊タンパク質が非機能性でなければならないため（それは、切断され、Ｃ末端の１１３アミノ酸を欠く）、ＣｌＤ１４ｉｎｓ突然変異アレルも、二次分枝を抑制するためのシグナルを伝達しない非機能性タンパク質をコードしていなければならないと意外にも結論付けられ得る。したがって、ＣｌＤ１４遺伝子のノックアウト又は非機能性ＣｌＤ１４タンパク質をもたらす突然変異体がもはやいずれのシグナルも伝達せず、したがってもはや二次分枝の阻害がないと結論付けられる。これは、「完全な多分枝」又は「強い多分枝」と呼ばれることもある。

【0437】

ここで、これは、多分枝表現型が通常の野生型分枝と、ＣｌＤ１４ｉｎｓ／ＣｌＤ１４ｉｎｓ及びＷ１５５^＊／Ｗ１５５^＊植物に見られる強い多分枝表現型との中間であり、野生型植物と比べて約２４０％の二次分枝の平均数をもたらすように、多分枝表現型がより弱く、二次分枝のいくらかの阻害が依然として活性である他の突然変異体が生成され得ることも明らかにする。

【0438】

ほぼ全タンパク質が保存されたドメイン（ＩＰＲ０００７３、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｅｎｔｒｙ／ＩｎｔｅｒＰｒｏ／ＩＰＲ００００７３／を参照されたい）であるように、タンパク質が高度に保存されるため、単一のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入は、例えば、ＩＰＲ０００７３ドメイン中に生成され得、これは、タンパク質ポケットへのいくらかのストリゴラクトンの結合及びストリゴラクトンシグナル伝達経路におけるシグナルのいくらかの伝達を依然として可能にする。例えば、上記の表２中のＴＩＬＬＩＮＧ突然変異体のいずれかは、ホモ接合体において、機能低下ＣｌＤ１４タンパク質及び「中間の多分枝」、例えば野生型植物と比べて少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％の二次分枝をもたらし得るが、ＣｌＤ１４タンパク質がその機能を喪失し、二次分枝をもはや抑制しない植物に見られるような「完全な多分枝」をもたらし得ない。

【0439】

強い多分枝植物では、葉の下の湿度が高くなり、真菌などの病害が発生しやすいため、このようなより「穏やかな多分枝」又は「中間の多分枝」が望ましい。

【0440】

したがって、既存のＣｌＤ１４ｉｎｓ突然変異体（配列番号１に示される、８つのアミノ酸重複を含む）以外のＣｌＤ１４遺伝子における任意の新たに誘発された突然変異体（及びヘテロ接合体又はホモ接合体におけるこれらを含む植物）、特にＣｌＤ１４ｉｎｓ突然変異体又はＷ１５５^＊突然変異体より強くない多分枝（「中間の多分枝」）をもたらす突然変異体が本明細書に包含される。

【0441】

しかしながら、既存のＣｌＤ１４ｉｎｓ突然変異体（配列番号１に示される、８つのアミノ酸重複を含む）以外の、任意のノックアウト突然変異体又は非機能性ＣｌＤ１４タンパク質をもたらす突然変異アレルも、ヘテロ接合体又はホモ接合体におけるこのような突然変異体を含む植物と同様に、本明細書に包含される。

【0442】

実施例３－標的化突然変異誘発
操作されたヌクレアーゼを用いた標的特異的ゲノム編集は、様々な分野で広く使用されるようになった。スイカにおいて、Ｃｒｉｓｐｒは、標的遺伝子を改変するために問題なく使用されている。例えば、Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｇｕｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＣｌＢＧ１ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｅｄ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ．Ｈｏｒｔｉｃ Ｒｅｓ ８，７０（２０２１）．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４３８－０２１－００５０６－１が参照され、この方法及びベクターは、Ｄ１４遺伝子の突然変異を生成するためにも使用され得る。

【0443】

１つ以上のヌクレオチドの一塩基置換又は欠失は、相同的組み換え（ＨＲ）によって実施され得る。

【0444】

バイナリＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターは、例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上掲）に記載されるように使用され得る。Ｄ１４に標的化された特定のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／）を用いた評価に従って選択され得る。標的配列は、ベクターにクローニングされ、次にスイカ栽培品種を形質転換するために使用される。

【0445】

スイカ外植片は、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ３０：３５９－３７１）の修正された方法に従って形質転換され得る。簡潔に述べると、表面滅菌されたスイカ種子を、３日間にわたって３％のＳｕｃが補充されたムラシゲ・スクーグ基礎固体培地に播種した。次に、胚を含まない子葉を、２×２ｍｍの小片に切断した。ベクターを保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＥＨＡ１０５が形質転換に使用され得る。子葉外植片を４日間にわたって暗所で共培養し、次に１．５ｍｇ／Ｌの６ ＢＡ、２ｍｇ／ＬのＢａｓｔａを含有する選択的誘導培地に移す。再生された不定芽を切除し、０．１ｍｇ／Ｌの６ ＢＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２ｍｇ／ＬのＢａｓｔａを含有する選択的伸長培地に移す。

【0446】

プラスミドベクターは、ＣＡＳ９及び２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するカセット並びに相同組み換え修復（ＨＤＲ）のための鋳型としての供与体断片を保有する。Ｃａｓ９遺伝子及びｇＲＮＡの発現は、ユビキチンプロモーターなどの強力なプロモーターによって駆動される。ｇＲＮＡは、２つの標的部位の逆鎖において設計される。

【0447】

供与体断片は、標的Ｄ１４遺伝子（突然変異を除く）の配列に対応する断片の中央に所望の突然変異を含む。任意選択的に、供与体断片中のアミノ酸残基を変化させないさらなる同義突然変異は、ＨＤＲが問題なく達成された後、Ｃａｓ９が供与体断片を再度切断することを防ぐであろう。断片は、それぞれＰＡＭモチーフを含む２つのｇＲＮＡ標的配列と隣接され、供与体ＤＮＡがプラスミドベクターからＣａｓ９／ｇＲＮＡによって放出され得るようになっており；例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ ９，６２８－６３１ ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｐ．２０１６．０１．００１を参照されたい。

【0448】

ＨＤＲを増加させるために、さらなる遊離ＤＮＡ供与体断片が外植片に共導入され得る。形質転換後、例えばプラスミドベクターでコードされた抗生物質耐性に基づいて選択された再生された芽が成長され、突然変異の存在について分析される。これは、ＰＣＲによってＤＮＡからの標的遺伝子配列を増幅するために、プライマーによって行われ得る。プライマーは、それらがプラスミドから断片を増幅できないように設計される。増幅された産物は、突然変異の存在を確認するためにシーケンシングされ得る。

【0449】

植物は、標準的な方法を用いて、所望の突然変異を含む形質変換された植物材料から再生され得る。

【0450】

例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上掲）によって記載されるように、ゲノムＤＮＡは、Ｔ０－Ｔ４トランスジェニック植物の幼葉から抽出され得、次にこれを、２つの標的化部位に隣接するプライマーを用いて、標的遺伝子における特定の断片を増幅するために、鋳型を生成するために使用した。ＰＣＲは、以下の条件下で行われ得る：９４℃／５分；９４℃／３０秒、５６℃／３０秒及び７２℃／１分（３５サイクル）；及び最後の伸長として７２℃／１０分。ＰＣＲ産物は、標準的な方法を用いて直接シーケンシングされ得る。

【0451】

トランスジェニック植物は、Ｃａｓ９に特異的なプライマーを用いて、Ｃａｓ９を含まないことも確認され得る。ＰＣＲは、以下の条件下で行われ得る：９４℃／５分；９４℃／３０秒、６０℃／３０秒及び７２℃／１分（２９サイクル）；及び最後の伸長として７２℃／１０分。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2024523647000001.app

【国際調査報告】