特表 2024-523655 核酸分析のための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】核酸分析のための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20240621BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240621BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z

C12Q1/6851 Z

C12Q1/6827 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580755

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2024-02-21

(86)【国際出願番号】 US2022035468

(87)【国際公開番号】W WO2023278537

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/216,961

(32)【優先日】2021-06-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523436964

【氏名又は名称】フルーエント バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゴッドフリー， トニー

(72)【発明者】

【氏名】クーグラー， キャサリン

(72)【発明者】

【氏名】メルツァー， ロバート

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、配列決定することなく、無細胞核酸（ｃｆＤＮＡ）から患者特異的変異を検出するための超高感度方法および組成物を提供する。本発明の方法は、ｃｆＤＮＡの多重増幅のための流体仕切りを利用し、それによって、均一に増幅されたアンプリコンのライブラリーを作製する。上記均一に増幅されたアンプリコンは、ｃｆＤＮＡに存在する変異の一重検出のために任意の数の異なる検出反応へと（検出感度を維持しながら）分割され得る。これらの方法は、実質的に改善されたシグナル対ノイズ比および存在量が低い変異のより容易な識別を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

変異を検出するための方法であって、前記方法は、
標的核酸およびＰＣＲプライマーを含む水性溶液を調製する工程；
混合物を作製するために、前記水性溶液と油とを合わせる、工程；
複数の仕切りを形成するために、前記混合物を剪断する工程であって、ここで前記仕切りのうちの少なくとも一部は、単一の標的核酸、およびＰＣＲプライマーを含む工程；
アンプリコンのライブラリーを生成するために、前記標的核酸を前記仕切りの内部で、前記ＰＣＲプライマーで増幅する工程；
アンプリコンの前記ライブラリーを複数の異なる反応容器へと分割する工程；ならびに
前記反応容器のうちの１つの中のアンプリコンから、ＰＣＲによって変異を検出する工程、
を包含する方法。

【請求項2】

前記変異を検出する工程は、ｑＰＣＲで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

増幅の間に、行われるＰＣＲサイクルの回数は、前記仕切りのうちの一部の内部で消費されるＰＣＲプライマーの対の数より大きい、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

仕切りのうちの前記一部の内部の非使用ＰＣＲプライマーの数は、最終ＰＣＲサイクルが開始される前にゼロに達する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

仕切りのうちの前記一部の内部で前記標的核酸を増幅する工程は、増幅事象ゼロを含む少なくとも１つのＰＣＲサイクルを伴う、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記標的核酸は、増幅の間に均一に増幅される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記標的核酸は、デジタルＰＣＲによって増幅される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記混合物を剪断する工程は、テンプレート粒子を使用して、実質的に均一な数のＰＣＲプライマーを含む均一なサイズにした仕切りの形成をテンプレート化することを包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記標的核酸は、無細胞核酸である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記無細胞核酸は、反復的に保護されたゲノム領域として予め特定される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記無細胞核酸は、尿サンプル、血液サンプル、または喀痰サンプルから単離される、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記標的核酸は、およそ６０～９０塩基対の長さである、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

増幅が完了する前に実質的な数のＰＣＲプライマーが消費され尽されるように、前記水性溶液に添加されるべきＰＣＲプライマーの濃度を計算する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

ｑＰＣＲは、改変されたプライマーで行われ、前記改変されたプライマーは、ロック核酸プライマー、２－テール付加プライマー、または発光プライマーのうちの１またはこれより多くのものを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項15】

前記ＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つは、発蛍光性である、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ＰＣＲプライマーのうちの異なるものは、標的核酸のうちの異なる分子に相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記複数の異なる反応容器は、１またはこれより多くのがん変異を検出するための試薬を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記複数の異なる反応容器のうちの１つは、第１のがん変異を検出するための第１の試薬を含み、前記複数の異なる反応容器のうちの第２の１つは、第２のがん変異を検出するための第２の反応を含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記試薬は、ｑＰＣＲのプライマーを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

がん変異の存在下では、前記プライマーはアンプリコンとハイブリダイズできず、それによって、変異の存在を示す、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、無細胞ＤＮＡを分析するための方法および組成物を提供する。

【背景技術】

【0002】

背景
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、ネクローシスの結果としてがん細胞によって放出される。ｃｆＤＮＡは体液（例えば、血液または尿）中に存在し、疾患状態を知らせ得ることから、ｃｆＤＮＡを分析する方法は、臨床上非常に重要である。ｃｆＤＮＡから有用な洞察を得るために、上記ｃｆＤＮＡの特異的領域が、正常な野生型細胞に存在しない変異を特定するために検出および分析されなければならない。上記変異は一般に、ＤＮＡ配列決定技術を使用して検出される。不運なことに、ＤＮＡ配列決定における急激な進歩にもかかわらず、ｃｆＤＮＡにおいてがん変異を特定するには、いくつかの難題が残っている。

【0003】

例えば、がん細胞に由来する変異ｃｆＤＮＡは、正常なＤＮＡのバックグラウンドと比較して極めて希である。よって、超高感度検出モダリティー（例えば、０．１％未満）が必要とされる。不運なことに、標準的な配列決定技術は、０．５～１．０％ 塩基呼び出しエラーによって制限されており、よって、洗練されたライブラリー調製法およびバイオインフォマティクス分析が、変異検出のために必要とされる。これは、ｃｆＤＮＡ配列決定ライブラリーの調製を複雑で、時間を浪費し、かつ高価なものにする。さらに、ｃｆＤＮＡは体液から抽出されなければならないことから、上記ｃｆＤＮＡは、代表的には、非常に短いフラグメント長へと分解されており、これはしばしば、ＤＮＡ配列決定のために必要とされる検出限界を下回っている。

【0004】

よって、早期がん検出および／またはモニタリングにおけるｃｆＤＮＡ適用の潜在的可能性が広範にわたって認識されているにもかかわらず、臨床上関連する情報をｃｆＤＮＡから得る成功裡のストラテジーは、欠いたままである。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
本発明は、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から変異を検出するための超高感度方法および組成物を提供する。本発明は、診断標的ががん変異に関して評価される前に、それら標的の多重予備増幅のための予めテンプレート化した即席の仕切りを利用する。上記予めテンプレート化した即席の仕切りは標的ｃｆＤＮＡの非常に均一な多重増幅を提供することから、本発明の方法は、診断標的の総数および変異検出のために使用される技術的複製物を実質的に増大させるために有用である。よって、上記増幅された標的は、特定のがん変異の検出のための検出反応の任意の数にわたって分けられ得る。これは、患者特異的がん変異が、それらの多重化能力において概して制限される超高感度のＰＣＲベースのモダリティーによって検出されることを可能にする。よって、本発明は、高価な配列決定なしに、迅速なサンプル－回答形式（ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ａｎｓｗｅｒ ｆｏｒｍａｔ）において患者特異的がん変異を検出するための頑健かつ安価なワークフローを提供する。

【0006】

具体的には、本発明の方法および組成物は、予めテンプレート化した即席の仕切りを利用して、均一なサイズにした反応チャンバ（そこからｃｆＤＮＡの標的が増幅される）を生成する。好ましくは、１またはこれより多くの異なるｃｆＤＮＡ分子にわたる複数の標的が増幅され、それによって、がん検出のための多重増幅によって別個の標的の総数を増大させる。ｃｆＤＮＡの多重化された標的は、増幅バイアスなしに仕切りの内部で均一に富化される。上記富化された標的アンプリコンは、変異検出のために任意の数の異なる反応容器へと分割され得る。これは、サンプル分割に起因する検出感度低減（これは、現行の技術の一般的問題である）のいかなる懸念もなしに、標準的実験装置、例えば、ｄＰＣＲ機器類で、多数の高感度の一重検出反応が並行して行われることを可能にする。

【0007】

よって、本発明は、疾患を検出する、再発をモニタリングする、または疾患治療の有効性を評価するために、個別化医療を一変させる潜在的可能性とともに、単純化された費用効果的ワークフローを提供する。

【0008】

本発明は、予めテンプレート化した即席の仕切りでｃｆＤＮＡの標的の多重増幅を伴う方法および組成物を提供する。上記標的は、体液サンプル（例えば、血液、尿または喀痰）内に極めて低頻度（０．０１％未満）において存在する単一塩基変異であり得る。上記標的は、疾患再発を示す患者特異的変異であり得る。標的増幅の後に、本発明の方法は、迅速で、信頼性があり、かつ費用効果的であるＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）に基づく超高感度検出ストラテジーを含む。よって、本発明の組成物および方法は、疾患を追跡するおよび／またはがん再発をモニタリングするために特に十分に適している。

【0009】

例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、疾患の長期的モニタリングを伴う。

【0010】

長期的モニタリングは、概して、経時的ながん変異の反復された患者内評価を伴う。反復測定は、患者の疾患が安定であるか否かを決定するために、患者が処置にどの程度応答しているかを示すために、または処置の効果を明らかにするために、使用され得る。ｃｆＤＮＡは、例えば、尿または血液から、非侵襲的に得られ得、本発明の方法が希な腫瘍変異を迅速に検出するために有用であることから、本発明は、経時的に反復測定を行うために十分に適している。よって、本開示の組成物および方法は、疾患を検出するためのみならず、治療を受けている患者の長期的な患者モニタリングのためのツールをも提供する。特に、本発明は、疾患の迅速かつ安価な定性化および被験体の治療への応答の迅速な決定を可能にする。

【0011】

１つの局面において、本発明は、核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ）から変異を検出するための方法を提供する。上記方法は、反応容器（例えば、１．５ミリリットルチューブの内部で標的核酸およびＰＣＲプライマーの水性溶液を調製する工程を伴う。上記ＰＣＲプライマーは、上記標的核酸の１またはこれより多くの領域に相補的な配列を含むべきである。例えば、上記ＰＣＲプライマーは、ｃｆＤＮＡの異なるフラグメントの１またはこれより多くの領域に相補的な配列を有し得る。油を上記容器に添加して、混合物を作製する。上記方法は、上記混合物を剪断して、複数の油中水型仕切りを形成し、その結果、上記仕切りのうちの少なくとも一部が、単一の標的核酸および上記ＰＣＲプライマーを含む工程をさらに包含する。上記方法は、上記標的核酸を上記仕切りの内部で、上記ＰＣＲプライマーで増幅して、アンプリコンのライブラリーを生成する工程をさらに包含する。上記アンプリコンは、複数の異なる反応容器へと分割される。好ましくは、上記反応容器のうちの１またはこれより多くのものは、ＰＣＲによって変異の存在を検出するために有用な試薬（例えば、プライマー）を含む。例えば、上記容器は、がん変異に感受性の配列を有するプライマーを含み得る。上記方法は、ＰＣＲによって上記アンプリコンを検出および／または定量して、疾患を評価する工程を伴う。好ましい実施形態において、がん変異の高価で時間を浪費する検出を回避するために、アンプリコンの検出は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって行われる。好ましくは、検出は、がん変異に感受性のプライマーで行われる。

【0012】

定量的分析を促進するために、本発明は、ｃｆＤＮＡ標的の均一な予備増幅を確実にする実験条件を含む。本発明の方法は、反応内の（上記プライマーに相補的な核酸を含む液滴の内部の）増幅可能な種に関する実質的に全てのプライマーがＰＣＲ増幅サイクルの特定の回数内で消費されることを保証するために予め計算された濃度でＰＣＲプライマー対を添加する工程を包含する。これは、いくつかの標的の増幅効率が等しくないにもかかわらず、ｃｆＤＮＡ標的の均一な増幅を保護するために有用である。例えば、多重化ＰＣＲ反応では、ｃｆＤＮＡのいくつかの標的は、効率的に増幅し得るのに対して、ｃｆＤＮＡのいくつかの標的は、非効率的に増幅し得る。バルク増幅において、ｃｆＤＮＡの効率的標的は、上記非効率的種を凌駕し得、効率的種と非効率的種との間の増幅均一性において広い変動をもたらし、正確な定量を妨げる。

【0013】

本発明の方法は、少なくとも２つの独立した機序によって、ｃｆＤＮＡの均一な増幅を確実にし得る。第１に、ｃｆＤＮＡのサンプルが仕切られる場合、平均して、１またはゼロの増幅可能なフラグメントが、各仕切りに存在する。このことは、増幅される生成物（アンプリコン）の間での競合の機会の低減を提供する。次に、好ましい実施形態において、標的特異的ＰＣＲプライマーは、濃度において制限され、その結果、実質的に全ての上記ＰＣＲプライマーは、上記プライマーに相補的なｃｆＤＮＡを有するそれら仕切りの内部で、ＰＣＲの間に消費される。ＰＣＲ増幅プロトコールは、全てのプライマーが非効率的標的に関してすら消費されるように特定される。予めテンプレート化した即席の仕切りは、均一な仕切り容積の仕切りを生成することから、各仕切りの中のアンプリコンの得られる濃度は、従って、正規化され得る。従って、いくつかの実施形態において、効率的かつ均一な増幅を確実にするための条件が確立される。１つの局面において、サンプルは、平均して１未満の増幅可能な標的が各仕切りに存在するように仕切られ、従って、上記仕切りの中で増幅された生成物の間での競合を低減する。さらに、１つの局面において、本発明は、プライマーが反復されるＰＣＲサイクルを終えて実質的に消費されるように、標的特異的プライマーの濃度の制限を提供する。均一な仕切り容積の場合、アンプリコンの得られる濃度は、正規化される。これは、いくつかの多重ＰＣＲ反応において、ある標的が効率的に、あるものは比較的非効率的に増幅されるという懸念を軽減する。効率的増幅は、非効率的増幅をおそらく凌駕し、アンプリコンの不均一な集団をもたらす。

【0014】

よって、本発明のいくつかの実施形態において、相補的ｃｆＤＮＡを含む個々の仕切りのかなりの数の内部で消費されるＰＣＲプライマーの数は、増幅の間に行われるＰＣＲサイクルの回数より小さい。代わりに、または加えて、それらの個々の仕切りの内部の非使用ＰＣＲプライマーの数は、最終ＰＣＲサイクルが開始される前にゼロに達する。よって、予めテンプレート化した即席の仕切りを含むｃｆＤＮＡ標的の増幅は、実質的に増幅事象ゼロを有する少なくとも１回のＰＣＲサイクルを伴い得る。よって、本発明の好ましい方法において、上記標的核酸は、増幅工程の間に均一に増幅される。

【0015】

本発明の方法は、ｃｆＤＮＡ標的の正確な増幅のために、予めテンプレート化した即席の仕切りを使用する。上記予めテンプレート化した即席の仕切りは一般に、容器の内部での仕切りの形成をテンプレート化するテンプレート粒子を使用して形成され、それによって、規定された流体容積、および従って、規定された試薬濃度の内部でｃｆＤＮＡを被包する仕切りを作製する。よって、いくつかの実施形態において、混合物を剪断する前に、上記方法は、テンプレート粒子を上記水性溶液に添加する工程をさらに包含する。上記テンプレート粒子は、実質的に均一な濃度でＰＣＲプライマーを含む実質的に均一な仕切りの形成をテンプレート化する。

【0016】

がん由来のｃｆＤＮＡは、尿から特定され得る。不運なことに、上記ｃｆＤＮＡは、概して高度にフラグメント化され、これは、従来の分析方法（例えば、配列決定）によるゲノム変化の標的化分析を制限する。しかし、驚くべきことに、ｃｆＤＮＡのフラグメントサイズには一貫した分布が存在し、形式上のサイズは８０～８１塩基対である。これは、非ランダムフラグメント化を示唆する。この非ランダムフラグメント化パターンは、クロマチンアクセシビリティーおよび／または寄与しているがん細胞からの遺伝子発現の結果であり得る。

【0017】

よって、本発明のいくつかの実施形態において、上記標的核酸は、およそ６０～９０塩基対の長さであり、例えば、およそ８０または８１塩基対の長さである。上記ＰＣＲプライマーは、反復的に保護されたゲノム領域と相関するｃｆＤＮＡの領域を増幅するように設計され得る。上記反復的に保護されたゲノム領域は、がん細胞において高度に発現されるＤＮＡの配列または高いクロマチンアクセシビリティーと関連する領域を伴い得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、がんを有する被験体の全ゲノムＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）配列決定によって得られるがん配列情報と、がんのない被験体の全ゲノムＤＮＡ配列決定によって得られる相当する野生型配列とを比較して、ある特定のがんと関連する反復的に保護されたゲノム領域を特定する工程を包含し得る。よって、反復的に保護されたゲノム領域（例えば、反復的に保護されたゲノム領域の上位５％または１％）に相補的であるＰＣＲプライマーが設計され得る。

【0018】

本発明の方法は、配列決定することなしに、患者特異的変異の検出を可能にする。よって、本発明の方法は、疾患をモニタリングするための費用効果的なワークフローを提供する。例えば、好ましい実施形態は、ｑＰＣＲによって標的アンプリコンを検出することを伴う。検出は、変異に感受性のプライマーで行われ得る。例えば、場合によっては、ｑＰＣＲプライマーは、変異した配列を有する標的アンプリコンへのハイブリダイゼーションを防止する配列を含む。よって、変異した配列を含む標的アンプリコンは、増幅に失敗する場合がある。ｑＰＣＲの間の１またはこれより多くの標的アンプリコンの増幅の失敗は、本発明の実施形態に従って検出され得、患者の健康状態を評価するために定量され得る。他の場合には、ｑＰＣＲプライマーは、ある特定の変異（例えば、単一の塩基対置換）を含む標的核酸に対して高度に特異的である配列で設計される。

【0019】

いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲは、改変されたプライマーで行われる。上記改変されたプライマーは、１またはこれより多くの腫瘍変異に対するプライマー特異性を増強する改変を含み得る。例えば、上記改変されたプライマーは、ロック核酸プライマー、２－テールプライマー、または発蛍光性プライマーのうちの１つを含み得る。場合によっては、上記プライマーは、テンプレート粒子、およびｑＰＣＲの前に予めテンプレート化した即席の仕切りの内部で多重増幅を行うための試薬を含むキットの一部として提供される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、変異を検出する方法を示す。

【図2】図２は、希な核酸を検出するための方法を図式化する。

【図3】図３は、仕切りの内部でｄＰＣＲ増幅されたｃｆＤＮＡの蛍光画像を示す。

【図4】図４は、予備増幅アッセイからのデータを示す。

【図5】図５は、予備増幅した標的 対 非増幅標的の増幅効率を比較するｑＰＣＲデータを示す。

【図6】図６は、本発明の方法が変異核酸と野生型核酸との間を識別する能力を明らかに示すｑＰＣＲデータを提供する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

詳細な説明
本発明は、配列決定することなしに、ハイスループットで無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から超稀少変異を検出するために有用な方法を提供する。よって、本発明は、疾患を検出する、疾患再発をモニタリングする、または治療の有効性を評価するために有用な、単純、安価、かつ迅速なサンプル－結果ワークフロー（ｓａｍｐｌｅ－ｔｏ－ｒｅｓｕｌｔ ｗｏｒｋｆｌｏｗ）を提供する。

【0022】

本発明は、体液からのｃｆＤＮＡ調製時に概して予測される、正常ＤＮＡのバックグラウンドからの希な変異の患者特異的検出のために予めテンプレート化した即席の仕切りを使用するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、予めテンプレート化した即席の仕切りの内部でのｃｆＤＮＡの均一な、高信頼性多重化標的予備増幅（すなわち、検出前の標的の多重増幅）とｑＰＣＲベースの一重検出とを組み合わせる。上記予めテンプレート化した即席の仕切りは、例えば、数千から数百万もの仕切りの形成を、同時に、単一のチューブ中でテンプレート化し、かつｑＰＣＲ分析の前に増幅のためにそれら仕切りの内部でｃｆＤＮＡのフラグメントを分離するヒドロゲルテンプレート粒子を利用する。

【0023】

上記予めテンプレート化した即席の仕切りは、正確な流体制御で標的ｃｆＤＮＡの均一な予備増幅を可能にし、よって、患者特異的変異を検出する安価なアプローチに関する現行のＰＣＲの限界を克服する。上記予めテンプレート化した仕切りは、一貫した形状およびサイズのテンプレート化した粒子の周りに形成され得ることから、ｃｆＤＮＡの１または０個のフラグメントを含むその得られる仕切りはまた、十分に規定されたサンプル容積を含む。仕切りの数は、反応容器サイズおよび試薬の量、例えば、テンプレート粒子によってのみ規定される。よって、本発明の方法はまた、大規模に大きさを変更できる。

【0024】

仕切りの内部で個々の増幅可能なｃｆＤＮＡフラグメントを単離することによって、本発明は、増幅バイアスを排除または実質的に低減し得、それによって、標的核酸の微量の増幅（例えば、０．０１％未満）を可能にし得る。例えば、並行した個々の仕切りの内部でのｃｆＤＮＡの増幅は、不要なアンプリコンとアンプリコンとの相互作用を排除し得、従って、多重化された標的にわたる均一な増幅を可能にし得る。

【0025】

均一な標的ｃｆＤＮＡ増幅は、富化されたアンプリコンの得られた混合物が、任意の数の検出用の反応容器（例えば、ＰＩＰｓ）、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１０００個、またはより多くの異なる反応容器へと分割されることを可能にする。上記反応容器は、マルチウェルディッシュの個々のウェルを含み得る。

【0026】

好ましくは、上記ウェルの実質的な数が、少なくとも１つのがん変異を検出するための試薬を含み得る。例えば、１またはこれより多くのウェルは、第１のがん変異を検出するための試薬（例えば、プライマー）を含み得る一方で、上記ウェルのうちの異なるものが、異なるがん変異を検出するための異なる試薬を含み得る。これは、多数の一重検出反応が標準的な実験装置（例えば、ｑＰＣＲ機器類）で並行して行われることを可能にし、競合技術に共通するサンプル分割に起因する検出感度低減という懸念を排除する。

【0027】

予めテンプレート化した即席の仕切り形成とＰＣＲベースの検出モダリティーとを組み合わせることによって、本発明は、臨床上重要なｃｆＤＮＡの選択された領域を均一に富化し、いかなる感度の喪失もなしに超高感度変異検出のためのサンプル分割を可能にするために有用である。さらに、いくつかの実施形態は、デジタル予備増幅を伴う。デジタル予備増幅は、絶対標的コピー数を（サンプル分割後ですら）増大させ得、そうでなければ、低存在量（＜１０コピー）改変体のいくつかのＰＣＲベースの検出ストラテジーと関連するある種の感度問題を克服し得る。最終的には、予備増幅（仕切りの内部で起こる増幅事象）での目的の標的の富化は、非標的ゲノムバックグラウンドを抑制し、特異性の改善を生じる。

【0028】

図１は、変異を検出する方法１０１を示す。方法１０１は、標的核酸およびＰＣＲプライマーを含む水性溶液を調製する工程１０３を伴う。上記ＰＣＲプライマーは、上記標的核酸に相補的な配列を含む。上記方法１０１は、上記水性溶液と油とを合わせて１０５、混合物を作製する工程をさらに含む。次に、上記混合物は、複数の油中水型仕切りへと剪断され１０７、ここで上記油中水型仕切りのうちの少なくとも一部は、単一の標的核酸およびＰＣＲプライマーを含む。剪断１０７の後、上記方法は、上記ＰＣＲプライマーを有する仕切りの内部で標的核酸を増幅して１０９、アンプリコンのライブラリーを生成する工程を伴う。上記方法は、複数の異なる反応容器へとアンプリコンのうちの一部を置くことによって、アンプリコンのライブラリーを分割する工程１１１をさらに包含する。次に、上記方法は、上記複数の反応容器からのアンプリコンを検出１１３および／または定量して、それによって、上記核酸を分析する工程を伴う。

【0029】

より詳細には、上記方法１０１の第１の工程は、水性溶液を調製する工程１０３を伴う。上記水性溶液を調製する１０３ために、任意の適切な順序が使用され得るが、テンプレート粒子を含むチューブを先ず提供することは、有用であり得る。上記テンプレート粒子は、水性媒体（例えば、塩類溶液、栄養ブロス、水）中で提供され得るか、または乾燥されて、使用時に再水和され得る。上記標的核酸（例えば、ｃｆＤＮＡ）を含むサンプルは、上記チューブへと、例えば、被験体からのサンプル収集の際、またはエタノール精製のようなある種の最小限のサンプル調製工程後に、直接添加され得る。好ましくは、上記サンプルは、体液サンプル、例えば、血液サンプルまたは尿サンプルである。よって、上記サンプルは、非侵襲的方法（例えば、採血または採尿）によって被験体から収集され得る。

【0030】

上記標的核酸は、好ましくは、ｃｆＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、一般に、血漿へと放出される分解されたＤＮＡフラグメント（５０～２００ｂｐ）である。ｃｆＤＮＡは、血流の中を自由に循環するＤＮＡの種々の形態を含み、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ），無細胞ミトコンドリアＤＮＡ（ｃｆ ｍｔＤＮＡ）、および無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）が挙げられる。

【0031】

ｃｆＤＮＡのレベルの上昇は、がんにおいて、特に、その進行した状態において観察される。ｃｆＤＮＡは、発病年齢とともに循環中にますます頻繁に存在するようになるという証拠がある。ｃｆＤＮＡは、がんおよび胎児医療以外に、多くの病気に関する有用な生体マーカーであることが示されている。これには、外傷、敗血症、無菌性炎症（ａｓｅｐｔｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、心筋梗塞、脳卒中、移植、糖尿病、鎌状赤血球症が挙げられるが、これらに限定されない。よって、本発明の方法は、がんのみならず、外傷、敗血症、無菌性炎症、心筋梗塞、脳卒中、移植、糖尿病、鎌状赤血球症の検出のためにも有用である。ｃｆＤＮＡは、大部分は、小さなフラグメント（５０～２００ｂｐ）およびより大きなフラグメント（２１ｋｂ）からなるＤＮＡの２本鎖細胞外分子であり、前立腺がんおよび乳がんの診断のための正確なマーカーとして認識されている。

【0032】

血流へのｃｆＤＮＡの放出は、原発性腫瘍、末梢血中を循環する腫瘍細胞、遠隔部位に存在する転移性の沈着物、ならびに造血細胞および間質細胞のような正常細胞タイプを含む異なる機序によって現れる。腫瘍細胞およびｃｆＤＮＡは、がんを有する患者の血流の中を循環する。腫瘍発生の間の血液中のその急速に増大した蓄積は、アポトーシス細胞および壊死細胞による過度のＤＮＡ放出によって引き起こされ得る。ｃｆＤＮＡは、主にヌクレオソーム（これは、ヒストンおよびＤＮＡの核複合体である）として循環し得る。それらは、がんにおいて頻繁に非特異的に上昇するが、細胞毒性がん治療（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ）をモニタリングするために，主に、治療有効性の早期予測のためにより特異的であり得る。

【0033】

水性溶液を調製する工程１０３は、ＤＮＡ増幅試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応緩衝液、マグネシウム、およびＰＣＲプライマー）を添加することを包含する。上記ＰＣＲプライマーは一般に、化学合成されたオリゴヌクレオチド、通常はＤＮＡの合成プライマーであり、これらは、テンプレートＤＮＡ上の特異的部位にアニールするように特注され得る。ＰＣＲプライマーのうちの１またはこれより多くのものは、発蛍光性であり得る。溶液中では、上記プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長の前に、ワトソン－クリック塩基対合を介して上記テンプレートと自発的にハイブリダイズする。上記ＰＣＲプライマーは、代表的には、１８～２４塩基の間の長さであり、増幅されている標的核酸配列の特定の上流および下流の部位をコードする。上記プライマーは、第三者から（例えば、社名Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの下で経営されている会社から）設計および発注され得る。プライマーを設計するための方法は、以下で考察される。

【0034】

定量的分析を促進するために、上記ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲプライマーの実質的な数がＰＣＲ増幅サイクルの特定の回数内で消費されることを確実にするために、予め計算された規定の濃度で溶液へと添加される。特に、ＰＣＲプライマーの各種の濃度は、仕切りの内部での相補的な標的核酸の増幅の間に上記ＰＣＲプライマーが消費されるように計算されたある特定の濃度で上記水性溶液に添加される。これは、いくつかの標的の増幅効率が等しくないにもかかわらず、ｃｆＤＮＡ標的の均一な増幅を確実にするために有用である。

【0035】

例えば、多重化ＰＣＲ反応において、いくつかの標的は、効率的に増幅し得るのに対して、いくつかの標的は、非効率的に増幅し得る。バルク増幅では、上記効率的標的は、上記非効率的標的を凌駕し得、効率的種と非効率的種との間の増幅均一性において広い変動をもたらし、正確な定量を妨げ得る。よって、標的特異的ＰＣＲプライマーは、濃度において制限され、その結果、実質的に全ての上記ＰＣＲプライマーは、標的核酸を有するそれら仕切りの内部で、ＰＣＲの間に消費される。ＰＣＲ増幅プロトコールは、全てのプライマーが非効率的標的に関してすら消費されるように特定される。予めテンプレート化した即席の仕切りは、均一な仕切り容積の仕切りを生成することから、各仕切りの中のアンプリコンの得られる濃度は、従って、正規化され得る。上記水性溶液に添加するべきＰＣＲプライマーの濃度の計算は、予めテンプレート化した即席の仕切りあたりの利用可能なプライマー分子の適切な数を計算するために単純な算数を使用して達成され得る。予めテンプレート化した即席の仕切りあたりの利用可能なプライマー分子の数は、反応容積、テンプレート粒子のサイズ、サンプル投入量、多重性のスケール、およびバルクプライマー濃度の関数として計算され得る。

【0036】

よって、本発明のいくつかの実施形態において、個々の仕切りのかなりの数の内部で消費されるＰＣＲプライマーの数（例えば、相補的な標的核酸を含むもの）は、増幅の間に行われるＰＣＲサイクルの回数より少ない。代わりに、またはさらに、それらの個々の仕切りの内部の非使用ＰＣＲプライマーの数は、最終ＰＣＲサイクルが行われる前にゼロに達する。よって、予めテンプレート化した即席の仕切りを含む標的核酸を増幅する工程は、実質的に増幅事象ゼロを有する少なくとも１回のＰＣＲサイクルを伴い得る。よって、本発明の好ましい方法において、上記標的核酸は、増幅工程の間に均一に増幅される。

【0037】

上記ＰＣＲプライマーは、標的核酸に相補的な配列を含む。好ましくは、上記標的核酸は、尿から単離されたｃｆＤＮＡである。尿からのｃｆＤＮＡは、非侵襲的診断のための有望な分析物である。しかし、尿ｃｆＤＮＡは、高度にフラグメント化されている。これらのフラグメントの特徴が根底にあるゲノム構造を反映するか否かは、未知である。全ゲノム配列決定によるｃｆＤＮＡフラグメントの特徴付けは、４０～１２０塩基対（ｂｐ）の間で、８１ｂｐの形式上のサイズおよび鋭い１０ｂｐの周期性を有する多数の強いピークを明らかにした。これは、Ｍａｒｋｕｓ， ２０２１， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｕｒｉｎｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １３（５８１）（参考として援用される）で考察されるように、完全な分解からの一過性の保護を示唆する。よって、いくつかの実施形態において、上記標的は、ＤＮＡの反復的に保護されたゲノム領域として予め特定される。上記反復的に保護されたゲノム領域は、がんに罹患した患者から採取したｃｆＤＮＡ配列のゲノム全域にわたる差異を比較し、正常で健常な患者（すなわち、がんを有しない）のｃｆＤＮＡ配列を有するそれらの配列を比較することによって、予め特定され得る。よって、上記方法１０１のいくつかの実施形態において、上記標的核酸は、およそ６０～９０塩基対の長さ、例えば、およそ７５～８５塩基対の長さ、および好ましくは、約８０～８１塩基対の長さである。

【0038】

次に、上記方法１０１は、油を上記水性溶液に添加する工程１０５を伴う。上記油は、チューブに添加される（代表的には、最初に上記水性混合物の上を覆う）。いくつかの実施形態において、１またはこれより多くの界面活性剤（以下に記載される）がまた、仕切りを安定化するために上記混合物に添加され得る。

【0039】

次いで、上記方法１０１は、上記混合物を剪断して１０７、仕切り形成を引き起こす上記流体を剪断する工程を包含する。ボルテックスする間に：上記混合物は、約５～約５０秒以内に、例えば、約３０秒以内に、水性液滴へと仕切り形成することが見出され得る。上記混合物を剪断する工程１０７は、好ましくは、ボルテックスすることによって行われる。ボルテックスする工程は、均一なサイズ分布の仕切りを信頼性高く生成するその能力のために好ましい。仕切りの均一性は、各「反応チャンバ」が実質的に等しい容積および従って、実質的に等しい試薬とともに提供されることを確実にするために役立つ。ボルテックスする工程はまた、容易に制御され（例えば、時間およびボルテックスする速度を制御することによって）、従って、より容易に再現性のあるデータを生成する。ボルテックスする工程は、共有に係る米国特許出願第１７／１４６，７６８号（これは参考として援用される）に記載されるように、標準的なベンチトップ型ボルテックス装置またはボルテックスデバイスで行われ得る。

【0040】

次に、上記方法は、上記仕切りの内部で上記標的核酸を増幅して１０９、標的アンプリコンのライブラリーを生成する工程を伴う。標的増幅は、ＰＣＲによって行われ、これは、サーモサイクラーを使用して行われ得る。

【0041】

好ましくは、ＰＣＲサイクルの回数は、 － 標的核酸を有するそれら仕切りの内部で － 上記ＰＣＲプライマーがＤＮＡ増幅の最終サイクルの前に消費し尽くされるように選択される。例えば、Ｆｅｎｒｉｃｈ ａｎｄ Ｆｌｙｎｎ， Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｏｗ ｉｔ Ｃａｎ Ｂｅ Ｕｓｅｄ ｔｏ Ｍａｘｉｍｉｚｅ ｑＰＣＲ Ｄａｔａ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｓａｍｐｌｅｓ， ２０１８， ＢｉｏＲａｄ（これは参考として援用される）において考察されるとおり。これは、上記標的核酸の均一な増幅を達成するために有用である。増幅する工程１０９は、デジタルＰＣＲを伴い得る。よって、増幅する工程１０９は、発蛍光団の存在下で行われ得る。発蛍光団は、光による励起の際に再発光し得る蛍光化学物質である。蛍光色素は、プローブ（例えば、加水分解プローブ）の一部であり得る。ある特定の局面において、上記発蛍光団は、アンプリコンへと（例えば、挿入色素として）組み込まれ、それは、上記プライマーに結合した標的核酸をＤＮＡポリメラーゼでコピーすることによって作製される。上記発蛍光団の存在は、上記アンプリコンが検出されることを可能にする。上記ＰＣＲプライマーは、上記発蛍光団を含み得る（例えば、上記発蛍光団と連結され得る）。

【0042】

次いで、標的アンプリコンのライブラリーは、ＰＣＲベースのストラテジーでのがん変異の検出１１３のために、異なる反応容器へと分けられる（ｓｐｌｉｔ）１１１（分割される（ｄｉｖｉｄｅｄ））。例えば、アンプリコンのライブラリーは、溶液中で希釈され得（例えば、１００×）、上記アンプリコンを含む溶液をマルチウェルプレートのウェル（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル）へとピペットで移すことによって、分割される１１１。好ましくは、上記ウェルは、少なくとも１つのがん変異を検出するための試薬を含み得る。上記ウェルは、変異を特定するために標識され得る（相当する試薬が検出されることが意図される）。例えば、１つのウェルは、第１のがん変異を検出するための試薬を含み得る一方で、マルチウェルプレートの第２のウェルは、第２のがん変異を検出するための異なる試薬を含み得る。上記試薬は、好ましくは、配列変異に感受性のプライマーである。これは、多数の一重検出反応が標準的な実験装置（例えば、ｑＰＣＲ機器類）で並行して行われることを可能にし、競合技術に共通するサンプル分割に起因する検出感度低減の懸念を排除する。引き続いて、上記アンプリコンは、ＰＣＲ（例えば、ｑＰＣＲ）によって定量される１１３。

【0043】

検出１１３は、検出されたがん変異の定量をさらに伴い得る。例えば、上記がん変異は、検出された変異のうちの各１つの総数を計数することによって定量され得る。各変異の総数は、異なる変異のうちの１またはこれより多くのものの頻度を計算するために使用され得る。すなわち、一方の変異が上記検出された変異のうちのもう一方の変異に対して出現する相対的頻度を決定するために、各変異の合計が１またはこれより多くの異なる変異の総数（例えば、検出された変異の総数）で除算され得る。ある特定の変異が出現する頻度は、がん進行を追跡するために有用な情報を提供し得る。例えば、変異が出現する頻度は、腫瘍クローン進化を追跡するために有用であり得る。

【0044】

いくつかの実施形態において、検出１１３は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）ベースのストラテジーを使用して行われる。ｑＰＣＲは、従来のＰＣＲのように、その最後ではなく、ＰＣＲの間に（すなわち、リアルタイムで）標的ＤＮＡ分子の増幅をモニターする。ｑＰＣＲは、定量的および半定量的に使用され得る。ｑＰＣＲによるＰＣＲ生成物の検出のための２つの一般的方法は、（１）任意の２本鎖ＤＮＡに挿入する非特異的蛍光色素、および（２）蛍光レポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブ（これは、上記プローブがその相補的な配列とハイブリダイズした後にのみ検出可能になる）である。

【0045】

好ましくは、ｑＰＣＲは、核酸における変異に高度に感受性のプライマーを使用して行われる。例えば、上記プライマーは、単一の塩基対置換に感受性の改変されたプライマーであり得る。よって、いくつかの好ましい実施形態において、異なる反応容器は、異なる変異に感受性の異なるプライマーを含む。例えば、場合によっては、プライマーは、上記核酸が変異（例えば、単一の塩基対置換）を含む場合、上記反応容器の内部の核酸にハイブリダイズしない配列を用いて設計される。他の場合には、上記プライマーは、アンプリコンが特異的がん変異（例えば、単一の塩基対変異）を含む場合、プライマーが上記反応容器の内部で核酸にハイブリダイズするのみであるように設計される。

【0046】

ｑＰＣＲは、少なくとも１つの特定された波長の光線で各サンプルを照射し、アンプリコンを反射する励起された発蛍光団によって発せられる蛍光を検出する能力を有するサーマルサイクラーで行われる。上記サーマルサイクラーはまた、サンプルを迅速に加熱および冷却することができ、それによって、核酸およびＤＮＡポリメラーゼの物理化学的特性を利用する。ｑＰＣＲプロセスは概して、反復される（例えば、１５～２５回）一連の温度変化からなる。これらのサイクルは通常、３つの段階からなる：第１は、およそ９５℃で、増幅される標的核酸の２本鎖の分離を可能にする；第２は、およそ５０～６０℃の温度で、上記プライマーと上記ＤＮＡテンプレートとの結合を可能にする；第３は、６８～７２℃の間で、ＤＮＡポリメラーゼによって行われる重合を促進する。フラグメントのサイズが小さいことに起因して、最後の工程は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、アラインメント段階～変性段階の間での変化中に、上記アンプリコンを複製することができる場合もあることから省略され得る。さらに、４工程ＰＣＲでは、蛍光は、非特異的色素が使用される場合にプライマーダイマーの存在によって引き起こされるシグナルを低減するために、各サイクルで数秒間のみ、例えば、８０℃の温度で持続する短い温度相の間に測定される。各サイクルに関して使用される温度およびタイミングは、以下のような広く種々のパラメーターに依存する。例えば：ＤＮＡを合成するために使用される酵素、反応における二価イオンおよびデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）の濃度、ならびにプライマーの結合温度。

【0047】

ｑＰＣＲを実行するいくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合色素は、ＰＣＲ反応において全ての２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合し、上記色素の蛍光量子収率を増大させる。従って、ＰＣＲの間のＤＮＡ生成物の増大は、各サイクルにおいて測定される蛍光強度の増大をもたらす。標的核酸の定量を可能にする。

【0048】

ｄｓＤＮＡ色素を用いるリアルタイムＰＣＲでは、反応は、通常どおり、蛍光ｄｓＤＮＡ色素を添加した状態で準備される。次いで、その反応は、リアルタイムＰＣＲ機器で実行され、各サイクル後に、蛍光の強度は、検出器で測定される；上記色素は、ｄｓＤＮＡ（すなわち、ＰＣＲ生成物）に結合した場合にのみ蛍光を発する。この方法は、増幅を行うために１対のプライマーを必要とするに過ぎないという利点を有し、これは、コストを下げる；多数の標的配列が、異なるタイプの色素を使用することによってチューブ中でモニターされ得る。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態は、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）増幅、続いて、ｑＰＣＲを伴う。ｄＰＣＲは、希釈サンプルが多くの別個の反応へと分割される増幅反応である。例えば、Ｂｒｏｗｎら（米国特許第６，１４３，４９６号および同第６，３９１，５５９号）、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら（米国特許第６，４４０，７０６号、同第６，７５３，１４７号、および同第７，８２４，８８９号）、ならびにＬａｒｓｏｎら（米国特許出願第１３／０２６，１２０号）、Ｌｉｎｋら（米国特許出願第１１／８０３，１０１号、同第１１／８０３，１０４号、および同第１２／０８７，７１３号）、およびＡｎｄｅｒｓｏｎら（米国特許第７，０４１，４８１号（これは、ＲＥ４１，７８０として再発行）を参照のこと（これらの各々の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）。ｄＰＣＲは、非常に高い感度を有するが、概してその多重化能力に制限がある。サンプルは、多数のｄＰＣＲ反応へと分割され得るが、それは、従来どおり、臨床ｃｆＤＮＡサンプルにおけるように、確率的に制限された標的を有するサンプルにおけるアッセイ感度の低減を余儀なくさせる。有利なことには、本発明の方法は、予めテンプレート化した即席の仕切りの内部で標的核酸の予備増幅によってこの制限に対処する。

【0050】

図２は、希な核酸を検出するための方法２０１を図式化する。上記方法２０１は、標的核酸（ｃｆＤＮＡ）のデジタル予備増幅、続いて、ｑＰＣＲを伴う。ｃｆＤＮＡのデジタル予備増幅は、標的の比例（すなわち、１つの遺伝子における野生型および変異型の現れ）を維持しながら、利用可能な標的分子の拡大を可能にする。これは、サンプルが、設計および最適化が比較的単純な多数の一重ｑＰＣＲアッセイへと分割されることを可能にする。

【0051】

好ましくは、上記方法２０１は、ｃｆＤＮＡの少量（約９個の変異した「ＭＵＴ」フラグメントを含む３０ナノグラムのＤＮＡ総量）を、ｄＰＣＲ増幅のための個々の液滴または仕切りへと分離するためにエマルジョンを使用する。ｃｆＤＮＡの個々の増幅可能なフラグメントは、予めテンプレート化した即席の仕切りの中でＰＣＲ増幅プライマーの所定の混合物とともに単離される。上記仕切りは、ＰＣＲ増幅均一性を増強しながら、ｄＰＣＲによる標的ｃｆＤＮＡの多重増幅を可能にする。例えば、上記仕切りは、多数の増幅された生成物の競合を低減する。

【0052】

上記ｃｆＤＮＡ標的は、例えば、１５サイクルのｄＰＣＲによって増幅される。その結果は、標的にわたって正規化された増幅収量（変異したフラグメントの約３００，０００コピー）である。これは、標的化配列決定適用において本発明者らによって明らかに示されている。ｄＰＣＲ増幅は、振盪されるエマルジョンの中で行われ得る。しかし、好ましくは、増幅は、テンプレート化したエマルジョン、すなわち、テンプレート粒子を使用して形成されたエマルジョンの中で行われる。予めテンプレート化したエマルジョンにおける増幅均一性は好ましい。なぜなら上記テンプレート粒子は、個々の反応容積のために一貫した容積を確立するからである。

【0053】

上記標的ｃｆＤＮＡのデジタル予備増幅は、アンプリコンといわれる増幅生成物のライブラリーを生成する。デジタル予備増幅の後に、上記方法２０１は、ｑＰＣＲによってアンプリコンを検出および／または増幅する工程を伴う。これは、各ＭＵＴのおよそ１７５コピーが溶液１マイクロリットルあたりで存在するように、アンプリコンのライブラリーを１００×希釈する工程を伴い得る。その希釈した溶液は、一重検出のためにマルチウェルプレート２１５の別個の反応容器へとアリコートに分けられ得る。上記反応容器は、特異的がん変異の検出のための試薬とともに予め調製され得る。よって、１つのウェルは、第１の変異の検出に有用な試薬（例えば、プライマー）を含み得る一方で、上記マルチウェルプレートの第２のウェルは、第２の変異を検出するための異なる試薬とともに調製されるなど。上記ウェルは、検出される変異を特定するために標識されるべきである。ｑＰＣＲは、定量的または半定量的であり得る。

【0054】

ｑＰＣＲは、改変されたプライマーで行われ得る。上記プライマーは、好ましくは、変異に感受性である。すなわち、上記プライマーは、好ましくは、標的アンプリコンが変異している（野生型の正常ＤＮＡ配列に見出されないヌクレオチドの配列を含む）場合に、上記プライマーが上記標的アンプリコンにハイブリダイズせず、よって、増幅が起こらないように設計される。増幅事象の欠如は、変異の存在を示し得る。

【0055】

例えば、上記ｑＰＣＲプライマーのうちの１またはこれより多くのものは、ロック核酸（ＬＮＡ）プライマーであり得る。ＬＮＡプライマーは、２’－Ｏ，４’－Ｃメチレン架橋を含む新規な核酸アナログを含む。この架橋 －３’－エンドコンホメーションのロック－ は、リボフラノース環の可撓性を制限し、その構造を剛性の二環式の形成へとロックする。これは、高められたｑＰＣＲアッセイ性能を付与する。例えば、ＬＮＡプライマーは、増大した熱安定性およびハイブリダイゼーション特異性、より正確な遺伝子定量およびアレル識別、ならびに問題のある標的配列のためのより容易かつより融通の利く設計を提供し得る。例えば、Ｂａｌｌａｎｔｙｎｅ， ２００８， Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｉｎ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ９１（３）：３０１－５（これは参考として援用される）に記載されるとおり。いくつかの実施形態において、上記方法は、２－テールプライマーを使用して、非常に短い変異検出プローブ（６～８塩基）で非常に高い特性を達成し得る。その親和性は、上記標的配列のうちのさらなる一部に結合する、共有結合しているが、遠位のプライマー部分を含めることによって増強される。

【0056】

いくつかの実施形態において、上記プライマーのうちの１またはこれより多くのものは、単一ヌクレオチド置換の検出のために最適化される。例えば、上記プライマーのうちの１またはこれより多くのものは、上記標的にハイブリダイズする５’アンカー部分、続いて、標的アレルに相当する非相補的「ブリッジ」および「フット」部分からなる超選択的プライマーを含み得る。上記フット配列は、末端の３’ヌクレオチドにおける単一のミスマッチがプライマー結合を不安定化し、伸長を防止し、異なるアレルの識別を可能にするように、短くてもよい。例えば、Ｔｏｕｒｏｕｔｉｎｅ ａｎｄ Ｔａｎｉｓ， ２０２０， Ａ ｒａｐｉｄ， ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２１６（２）： ３４３－３５２において、およびＶａｒｇａｓ， ２０１６， Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｒｅａｌ－ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ａｓｓａｙｓ ｔｈａｔ Ｍｅａｓｕｒｅ ｔｈｅ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ Ｒａｒｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａｎｃｅｒ， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， １１（５）（これらは、参考として援用される）においても記載されるとおり。いくつかの実施形態において、上記プライマーのうちの１またはこれより多くのものは、発蛍光性プライマー（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒによって商品名ＬＵＸの下で販売される発光プライマーのような）であり得る。

【0057】

図３は、予めテンプレート化した仕切りの内部でｄＰＣＲ増幅されたｃｆＤＮＡの蛍光画像を示す。濃い方の（異なる陰影／元のものでは照射されている）液滴３０５は、蛍光レポーターに由来するシグナルを発するもの（すなわち、引き続く分析のためのｃｆＤＮＡのアンプリコンを含むもの）である。

【0058】

いくつかの実施形態において、上記液滴は、引き続く分析（例えば、ｑＰＣＲ）の前に、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってソートされ得る。ＦＡＣＳは、標識された分析物（仕切り）のサンプル混合物が、２またはこれより多くの容器へとそれらの光散乱および蛍光特徴に従ってソートされるプロセスである。ＦＡＣＳを使用することによって、本発明の方法は、非標的物質の処理と関連する費用を低減するために、標的アンプリコンを含む仕切りを富化し得る。

【0059】

本明細書に記載されるある特定の方法の特徴は、サンプル中のある特定のオリゴヌクレオチドおよび／または目的の遺伝子の存在を検出するための、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースのアッセイの使用である。例示的な標的核酸としては、被験体における遺伝的変異または疾患と関連するものが挙げられる。他の標的核酸としては、例えば、ウイルスまたは細菌感染と関連するものが挙げられる。

【0060】

本発明のシステムおよび方法は、標的核酸フラグメントの予備増幅のために予めテンプレート化した即席の仕切りを使用すること、および引き続いて、がん変異に関してＰＣＲによってそれらの増幅された標的を評価することを含む。がん変異の検出は、任意の数の種々のＰＣＲベースのアプローチ（例えば、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ），定量的蛍光ＰＣＲ（ＱＦ－ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ－ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ／リアルタイムＰＣＲ－ＲＦＬＰ、ホットスタートＰＣＲ、ネスト化ＰＣＲ、インサイチュポロニーＰＣＲ、インサイチュローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲ）によって行われ得る。

【0061】

このようなアッセイにおいて、１またはこれより多くのプライマーは、がん変異に感受性であり得る。例えば、上記プライマーは、変異していない標的核酸が存在する場合に、これらプライマーがハイブリダイズし、ＰＣＲを開始するのみであるように、特定の変異していない標的に特異的な配列を含み得る。目的の標的が存在し、上記プライマーがマッチするものである場合、ＰＣＲ増幅を使用して上記標的の多くのコピーが作製され得る。標的コピーの存在は、標的核酸が変異を有しないことを示し得る。特定の標的アンプリコンが変異検出のための反応容器に存在するか否かを決定するために、予備増幅された標的アンプリコンは、アッセイを通じて検出され得る。例えば、場合によっては、標的アンプリコンは、蛍光に関して上記仕切りの液体をプローブすることによって検出され得る。例えば、標的核酸の予備増幅は、標的アンプリコンが特定の波長による励起の際に蛍光を発生させる１またはこれより多くの発蛍光団の存在下でドロップレットＰＣＲによって起こり得る。よって、変異検出のための反応容器の内部の標的アンプリコンの存在は、蛍光シグナルの存在によって確認され得る。

【0062】

ＰＣＲベースのおよびリアルタイムＰＣＲベースの検出方法論は、スループットおよび定量性の両方の観点から、核酸の分析を大きく改善した。旧来のＰＣＲベースの検出アッセイは一般に、アガロースゲル電気泳動を介して、増幅されたＤＮＡ標的のエンドポイントのおよびときおり半定量的な分析に依拠する；リアルタイムＰＣＲ（またはｑＰＣＲ）法は、反応が進むにつれて指数関数的増幅を定量するために最も頻繁に使用される。定量的ＰＣＲ反応は、種々の高度に配列特異的な蛍光プローブ技術を使用するか、または非特異的ＤＮＡ挿入発蛍光性色素を使用するかのいずれかによってモニターされる。

【0063】

本発明のいくつかの好ましいシステムおよび方法は、ｄＰＣＲを含む。デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、希釈サンプルからの標的核酸がＰＩＰ被包化を使用して個々に単離された液滴である代替の定量法である。その単離された標的核酸は、各液滴の中で別個の反応で増幅される。反応間の標的ＤＮＡ分子のバックグラウンドからの分布は、標的ＤＮＡの最終希釈および／または限界希釈においてポワソン統計に従う。概して、最終希釈において、液滴のほとんどの部分は、１個またはゼロ個いずれかの標的ＤＮＡ分子を含む。理想的には、最終希釈において、ＰＣＲ陽性反応（ＰＣＲ（＋））の数は、もともと存在するテンプレート分子の数に等しい。限界希釈では、仕切りは、ポワソン分布に従って、ゼロ、１個、およびしばしば１個より多くの標的核酸を含む。限界希釈では、ポワソン統計は、サンプル中に元々存在した標的ＤＮＡの根本的な量を明らかにするために使用される。

【0064】

本発明の方法およびシステムは、種々の供給源から得られた標的核酸を検出および定量するために使用され得る。例えば、標的核酸は、固体組織サンプルまたは流体サンプル（例えば、血液または血漿）から得られ得る。好ましくは、上記サンプルは、流体サンプルである。適切なサンプルとしては、全血または血液の一部、血漿、脳脊髄液、唾液、喀痰、組織吸引物、微生物培養物、培養されていない微生物、スワブ、または任意の他の適切サンプルが挙げられ得る。例えば、いくつかの実施形態において、血液サンプルは、臨床状況において（例えば、瀉血によって）得られる。全血が使用されてもよいし、血液は、標的核酸を単離するために遠心分離されてもよい。

【0065】

好ましくは、上記サンプルは、血液サンプルである。上記サンプルを得る工程は、採血を行って血液を得るか、または血液を臨床施設から受容する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、サンプルを得る工程は、瀉血手順を伴い、血液を血液収集チューブ（例えば、ＢＤ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）によって商標ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲの下で販売される血液収集チューブ）または無細胞ＤＮＡ血液収集チューブ（例えば、Ｓｔｒｅｃｋ， Ｉｎｃ．（Ｌａ Ｖｉｓｔａ， ＮＥ）によって商標ＣＥＬＬ－ＦＲＥＥ ＤＮＡ ＢＣＴの下で販売されるもの）へと収集する。任意の適切な収集技術または容積が、使用され得る。病原性微生物に感染した患者に由来する血液の１０ｍｌ サンプルが、わずか約１ｎｇの微生物核酸を含み得る。

【0066】

標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはその混合物であり得る。ある特定の局面において、本発明の方法は、逆転写酵素反応を行って、標的ＲＮＡのｃＤＮＡを生成する工程を包含する。逆転写酵素反応は、単分散液滴中で行われ得る。得られるｃＤＮＡは、本明細書で記載されるように増幅および検出され得る。好ましい局面において、上記標的核酸は、無細胞核酸であり、これは、非侵襲的手順を介して血液または血漿から採取され得ることから好ましい。

【0067】

ある特定の局面において、本発明の方法は、がん変異の検出前に、ｄＰＣＲを使用してｃｆＤＮＡのサンプル中の１またはこれより多くの標的核酸の存在を特定する工程を包含する。ｄＰＣＲ反応は、サンプルが上記標的核酸に関して陽性であるか否かを決定するために使用され得る。標的核酸に関して陰性のサンプルは、処理される必要がない。よって、本発明の方法は、さらなる分析のために標的核酸を有するサンプルを迅速に特定するために有用である。これは、処理が行われるサンプルの量を低減し、それによって本質的費用を低減する。

【0068】

方法は、下流の分析（例えば、配列決定）を準備するために、アンプリコンにアダプターを結合する工程および／または標的フラグメントにバーコード付加する工程を包含し得る。任意の適切な方法が、標的フラグメントにバーコード付加するために使用され得る。上記フラグメントは、液滴の内部でバーコード付加され得る。標的フラグメントにバーコードを結合する適切なアプローチとしては、以下が挙げられる：（ｉ）フラグメント化およびアダプターライゲーション（ここでアダプターがバーコードを含む）；（ｉｉ）タグメンテーション（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．によって商標ＮＥＸＴＥＲＡの下で販売されるそれらタグメンテーション試薬キットのような、キット中で販売されるものを含むトランスポザーゼ酵素またはトランスポソソームを使用する）；ならびに（ｉｉｉ）ゲノム中の目的の既知のまたは疑われる標的に相補的なハイブリダイゼーション部分およびＰＣＲ反応によってアンプリコンへとコピーされる少なくとも１つのバーコード部分を有するプライマーを使用する、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅。これらのアプローチのうちのいずれかに関して、上記バーコード（例えば、増幅プライマーまたはライゲーション可能なアダプター内の）は、本明細書で記載されるように、溶液中で遊離してまたはテンプレート粒子に結合させて、提供され得る。いくつかの実施形態において、上記バーコードは、セット（例えば、数千コピーものバーコードを含む）として提供され、ここで各バーコードは、テンプレート粒子に共有結合されている。

【0069】

本明細書で使用される場合、バーコードとは、一般に、セットに特有な１つのバーコードのコピーを有するそのセットとしてバーコード付加された標的核酸に由来する配列リードを特定するために使用され得る識別子配列を含むオリゴヌクレオチドに言及する。バーコードは一般に、約２～約数十個またはこれより多くの識別子配列において既知の数のヌクレオチドを含む。上記バーコードを含むオリゴヌクレオチドは、プライマーセグメント（例えば、遺伝物質中の目的の標的にハイブリダイズするように設計される）、ユニバーサルプライマー結合部位、制限部位、配列決定アダプター、配列決定機器インデックス配列など、またはこれらの組み合わせを含む有用な多くの配列の任意の他のものを含み得る。上記バーコードは、特有の分子識別子を含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のバーコードは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）機器（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｉｎｃ．によって商標ＨＩＳＥＱの下で販売されるＮＧＳ機器）での使用のために設計されたアダプターのセット内のように、配列決定アダプター内に提供される。ＮＧＳアダプター内には、上記バーコードは、バーコード配列がインデックスリードまたは配列リード中に見出されるように、上記インデックス部分または上記標的配列に隣接していてもよい。

【0070】

方法は、標的核酸の増幅のためにＰＣＲプライマーを設計する工程を伴い得る。数個の基準が、一対のＰＣＲプライマーを設計する場合に考えられ得る。プライマー対は、類似の融解温度を有するべきである。なぜならＰＣＲの間のアニーリングは、両鎖について同時に起こり、この共有された融解温度は、好ましくは、反応のアニーリング温度より大き過ぎもしなければ小さ過ぎもしないからである。反応のアニーリング温度より高すぎるＴｍ（融解温度）を有するプライマーは、ＤＮＡ配列に沿って不正確な位置で、誤ってハイブリダイズし、伸長することがある。次いで、上記アニーリング温度より顕著に低いＴｍは、全くアニールおよび伸長させないことがある。

【0071】

さらに、プライマー配列は、ＤＮＡの領域（例えば、既知のがん変異を含む領域）を特有に選択し、近くにある類似の配列へのハイブリダイゼーションの可能性を回避するために選択される必要があり得る。プライマー部位を選択するために一般に使用される方法は、ＢＬＡＳＴ検索である。これによって、プライマーが結合し得る全ての考えられる領域が、見られ得る。ヌクレオチド配列およびプライマー自体はともに、ＢＬＡＳＴ検索され得る。無料のＮＣＢＩツールであるＰｒｉｍｅｒ－ＢＬＡＳＴは、ｅＰｒｉｍｅおよびＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒのような市販のソフトウェア製品で行われるように、プライマー設計およびＢＬＡＳＴ検索を１つのアプリケーションに統合している。理論的ＰＣＲ結果（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＰＣＲ）のコンピューターシミュレーションは、融解温度およびアニーリング温度などを与えることによって、プライマー設計を補助するために行われ得る。

【0072】

プライマー結合のためにＤＮＡの特異的な領域を選択することは、いくつかのさらなる考慮事項を要する。モノヌクレオチドおよびジヌクレオチド反復が多い領域は、回避されるべきである。なぜならループ形成が起こる可能性があり、誤ったハイブリダイゼーションに寄与する可能性があるからである。プライマーは、好ましくは、混合物中の他のプライマーと容易にアニールしない；この現象は、最終溶液を汚染する「プライマーダイマー」生成物の生成をもたらし得る。プライマーはまた、それら自体に強くアニールするべきではない。なぜなら内部ヘアピンおよびループは、テンプレートＤＮＡとのアニールを妨げ得るからである。

【実施例】

【0073】

実施例１ － 予めテンプレート化した即席の仕切りを用いた制御されたプライマー濃度による均一なＰＣＲ増幅
十重予備増幅アッセイを、バルクにおいて（４０５）および予めテンプレート化した即席の仕切り「ＰＩＰｓ」４０７において行った。増幅を、全ての標的に関するプライマー濃度の範囲（０ｎＭ、１．５ｎＭ、３．１ｎＭ、６．３ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ）で行った。得られた予備増幅生成物を、水で１：１０００希釈し、各標的に関する一重検出アッセイを、ｑＰＣＲによって行った。

【0074】

図４は、予備増幅アッセイからのデータを示す。上記データは、十重予備増幅アッセイからのものであり、全ての標的にわたって平均の正規化Ｃｔ値としてプロットされる。エラーバーは、全ての標的にわたる標準偏差である。

【0075】

ＰＩＰｓ仕切り形成は、全てのプライマー濃度において全ての標的にわたって顕著に改善された増幅均一性を生じる。１２．５ｎＭ未満のプライマー濃度では、バルク増幅は、添加されたプライマーがない予備増幅陰性コントロール（下側の四角）から区別できない。ＰＩＰｓ仕切りでは、低プライマー濃度を有するサンプルは、プライマーなしの予備増幅コントロールから十分に分離されている。ＰＩＰｓ予備増幅では、本発明者らは、ＰＣＲ生成物を利用可能なプライマー濃度に制限することによって、使用されるプライマー希釈系列における増幅された生成物の２倍の工程が生じると予測される。この推測は、デジタル予備増幅４０７において確認されるが、バルク増幅４０５の結果では確認されない。

【0076】

実施例２ デジタル予備増幅およびｑＰＣＲ検出
図５は、予備増幅した標的５０５および予備増幅されない（「コントロール」＿ 標的５０７の増幅効率を比較するｑＰＣＲデータを示す。データを、５’ ＶＡＦ’ｓ （１％、０．５％、０．２５％、０．１３％、および０．０６％）および野生型において標的の二十三重、１５サイクル予備増幅によって生成した。予備増幅した生成物を、アレル特異的ｑＰＣＲによる検出の前に２００×希釈した。

【0077】

予備増幅した標的のアレル特異的ｑＰＣＲは、ｑＰＣＲによる標的の効率的検出のために１５０ｎｇのＤＮＡを必要とするのみであった。これは、多量の標的核酸を生成するための予備増幅の顕著な能力を明らかに示す。逆に、予備増幅がない場合、１．３５マイクログラムの全ＤＮＡが、アレル特異的ｑＰＣＲによる標的核酸の検出可能なレベルを提供するために各反応に必要とされた。

【0078】

図６は、本発明の方法が変異核酸と野生型核酸との間を識別する能力を明らかに示すｑＰＣＲデータを提供する。変異ＤＮＡを、ｄＰＣＲによって上記のように予備増幅した。１％ 変異投入量を含む３０ナノグラムの核酸を、ｑＰＣＲアッセイにおいて使用した。ｑＰＣＲを、ＳＳＰプライマーで行った。

【0079】

援用の表示
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）への参照および引用を、本開示全体を通じて行った。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される。

【0080】

均等物
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書で示されかつ記載されるものに加えて、本明細書で引用される科学文献および特許文献への言及を含め、本文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合されうる重要な情報、例示およびガイダンスを含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】