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▶ ジェローム カナディ リサーチ インスティチュート フォー アドバンスト バイオロジカル アンド テクノロジカル サイエンシズの特許一覧
特表2024-523703ヒストンｍＲＮＡの８－ＯＸＯＧ修飾および分解による乳がん細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】ヒストンｍＲＮＡの８－ＯＸＯＧ修飾および分解による乳がん細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240621BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240621BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240621BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
C12N15/09 Z ZNA
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500212
(86)(22)【出願日】2022-07-05
(85)【翻訳文提出日】2024-03-04
(86)【国際出願番号】 US2022036133
(87)【国際公開番号】W WO2023283194
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】63/218,449
(32)【優先日】2021-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522396089
【氏名又は名称】ジェローム カナディ リサーチ インスティチュート フォー アドバンスト バイオロジカル アンド テクノロジカル サイエンシズ
(74)【代理人】
【識別番号】100091502
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 正威
(72)【発明者】
【氏名】カナディ， ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】マーティー， サラヴァナ
(72)【発明者】
【氏名】チェン， シャオチィエン
(72)【発明者】
【氏名】チュワン， タイセン
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ53
4B063QR48
4B063QR56
4B063QR66
4B063QS32
4B063QS40
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA18
4H045BA70
4H045CA40
4H045EA50
4H045FA33
(57)【要約】
細胞周期の初期Ｓ期過程でのヒストンｍＲＮＡの酸化および分解を通して、サブタイピングにかかわらず、乳がんにおいて細胞死を誘導するための方法。乳がん細胞における酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルをモニタリングするための方法であって、乳がん細胞からヒストンｍＲＮＡを単離するステップと、配列番号１によるペプチドとともにヒストンｍＲＮＡをインキュベートするステップと、蛍光強度を測定することによって酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルを決定するステップとを含む方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳がん細胞において酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルをモニタリングするための方法であって、乳がん細胞からヒストンｍＲＮＡを単離するステップと、
配列番号１によるペプチドとともにヒストンｍＲＮＡをインキュベートするステップと；
蛍光強度を測定することによって酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項2】
蛍光強度は顕微鏡法によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ヒストンｍＲＮＡは８－オキソグアニン修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
乳がん細胞は、ヒストンｍＲＮＡを単離するステップの前に、低温プラズマで処置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
低温プラズマ処置は３５℃未満にての低温プラズマを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
低温プラズマ処置の６、２４または４８時間後に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
単離されたヒストンｍＲＮＡについて差次的発現解析のステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ；ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ；ＨＩＳＴ２Ｈ３ＤおよびＨＩＳＴ４Ｈを含む群から選択されるヒストンの単離されたヒストンｍＲＮＡレベルを決定する、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
以下の配列（Ａｌｅｘａ ４８８）ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＳＥＶＶＶＳＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を有する、固相ペプチド合成によって合成されたペプチド（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、細胞周期の初期Ｓ期過程でのヒストンｍＲＮＡの酸化および分解を通して、サブタイピングにかかわらず、乳がん細胞の細胞死を誘導する方法に関する。
本発明は、細胞周期の初期Ｓ期過程でのヒストンｍＲＮＡの酸化および分解を通して、サブタイピングにかかわらず、乳がん細胞の細胞死を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
関連技術の簡単な説明
乳癌は、臨床的挙動、組織学的特徴に基づいて、および／または生物学的特性によって、さまざまな実体に大別することができ、このことは、新規処置の発見、腫瘍進化の研究、および治療耐性のメカニズムの特定にとって重要である（Ｒｕｓｓｎｅｓ，Ｈ．Ｇ．、Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ，Ｏ．Ｃ．、Ｂｏｒｒｅｓｅｎ－Ｄａｌｅ，Ａ．Ｌ．＆Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｔｏ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１８７、２１５２～２１６２頁（２０１７））。腫瘍細胞のうちの少なくとも１％においてエストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）のいずれかの発現を有する腫瘍が、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）として大別され（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｅ．ら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２８、２７８４～２７９５頁（２０１０））、乳がんの内因性サブタイプは、ルミナルＡ（ＥＲ＋ＰＲ＋／－ＨＥＲ２－）、ルミナルＢ（ＥＲ＋ＰＲ＋／－ＨＥＲ２＋）、基底様（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）、およびＨＥＲ２陽性（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）に分類される（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｄ．Ｌ．＆Ｓｐｅｉｒｓ，Ｖ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３（２０１１）およびＤａｉ，Ｘ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、Ｂａｉ，Ｚ．＆Ｌｉ，Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ８、３１３１～３１４１頁（２０１７））。
乳癌は、臨床的挙動、組織学的特徴に基づいて、および／または生物学的特性によって、さまざまな実体に大別することができ、このことは、新規処置の発見、腫瘍進化の研究、および治療耐性のメカニズムの特定にとって重要である（Ｒｕｓｓｎｅｓ，Ｈ．Ｇ．、Ｌｉｎｇｊａｅｒｄｅ，Ｏ．Ｃ．、Ｂｏｒｒｅｓｅｎ－Ｄａｌｅ，Ａ．Ｌ．＆Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｔｏ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１８７、２１５２～２１６２頁（２０１７））。腫瘍細胞のうちの少なくとも１％においてエストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）のいずれかの発現を有する腫瘍が、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）として大別され（Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｍ．Ｅ．ら Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２８、２７８４～２７９５頁（２０１０））、乳がんの内因性サブタイプは、ルミナルＡ（ＥＲ＋ＰＲ＋／－ＨＥＲ２－）、ルミナルＢ（ＥＲ＋ＰＲ＋／－ＨＥＲ２＋）、基底様（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）、およびＨＥＲ２陽性（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）に分類される（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｄ．Ｌ．＆Ｓｐｅｉｒｓ，Ｖ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３（２０１１）およびＤａｉ，Ｘ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、Ｂａｉ，Ｚ．＆Ｌｉ，Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ８、３１３１～３１４１頁（２０１７））。
【0003】
全身的および局所的処置とは、そのうち症例の７０％がＨＲ＋ＨＥＲ２－である主たる３種の乳がんサブタイプ：ＨＲ＋ＨＥＲ２－、ＨＥＲ２＋およびＴＮＢＣで取り組んでいるものであり（Ｄａｉ，Ｘ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、Ｂａｉ，Ｚ．＆Ｌｉ，Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８、３１３１～３１４１頁、（２０１７））、かつＥＲシグナル伝達をダウンレギュレーションするための内分泌療法剤の使用である。ＨＥＲ２＋乳がんは症例の１５～２０％を占め、ＨＥＲ２標的療法にはトラスツズマブおよびペルツズマブなどの抗ＨＥＲ２抗体、ならびにラパチニブおよびネラチニブなどの小分子チロシンキナーゼ阻害剤が含まれる。基底様（ＴＮＢＣ）は乳がん症例の概１５％を構成するが、その分子病態生理学についてはほとんど理解されていないままである。Ｈｏｗｌａｄｅｒ，Ｎ．ら ＵＳ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｊｏｉｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＨＥＲ２ ｓｔａｔｕｓ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０６（２０１４）。２０１９年３月、食品医薬品局（ＦＤＡ）は、プログラム細胞死１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）陽性発現を有する局所進行性または転移性ＴＮＢＣを伴う初期処置に向けて、化学療法と組み合わせでの免疫療法薬アテゾリズマブの迅速承認を、初の免疫療法に付与した（Ａｄａｍｓ，Ｓ．ら Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ．ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ（２０１９））。
【0004】
種々のがんタイプにわたる新規な抗がん療法としての低温大気圧プラズマ（ＣＡＰ）は、１０年超にわたって調査されており、その著しい抗がん能力については、ｉｎ ｖｉｔｒｏで２０種のがんタイプを超えて実証されてきたが（Ｙａｎ，Ｄ．、Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｈ．＆Ｋｅｉｄａｒ，Ｍ．Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｙ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ８、１５９７７～１５９９５頁（２０１７））、それには乳がんが含まれる（Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｇ．ら Ｆｌｏａｔｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｐｌａｓｍａ ｉｎ Ａｉｒ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｉｎ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｓｋｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ２７、１６３～１７６頁（２００７）、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．ら Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｃａｕｓｅｓ ａ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｆｌｕｘ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ＣＡＰ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ８、１００４８（２０１８）、Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｕｎｉｎｇ ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９、ｅ９８６５２（２０１４）、Ｐｒｉｖａｔ－Ｍａｌｄｏｎａｄｏ、Ａ．，Ｇｏｒｂａｎｅｖ、Ｙ．，Ｄｅｗｉｌｄｅ、Ｓ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｅ．＆Ｂｏｇａｅｒｔｓ，Ａ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｈｏｒｔ－ ａｎｄ Ｌｏｎｇ－Ｌｉｖｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１０（２０１８）、Ｘｕ，Ｄ．ら Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ１９、１３５頁（２０１９）、Ｒｏｗｅ，Ｗ．ら Ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓｃａｌｐｅｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｄｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｐｌａｓｍａ１、１７７～１８８頁（２０１８）、Ｙａｎ，Ｄ．ら Ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ－ｂａｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｄ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ５２（２０１９）、Ｍａ，Ｊ．ら Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｎｒｆ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ｐｌａｓｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ６５８、５４～６５頁（２０１８）、Ｄｕａｎ，Ｊ．、Ｌｕ，Ｘ．＆Ｈｅ，Ｇ．Ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ１２１（２０１７）、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｂ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｎ ＭＣＦ－７ ａｎｄ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０、ｅ０１２９９３１（２０１５）、Ｘｕ，Ｘ．ら Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ１５（２０１８）、Ｗｅｉｓｓ，Ｍ．ら Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ａｎｔｉ－Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅｄｏｘ ａｎｄ Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０、ｅ０１３０３５０（２０１５）、Ｉｓｈａｑ，Ｍ．、Ｈａｎ，Ｚ．Ｊ．、Ｋｕｍａｒ，Ｓ．、Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｄ．Ｍ．＆Ｏｓｔｒｉｋｏｖ，Ｋ．Ｋ．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ－Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｐｌａｓｍａ－ ａｎｄ ＴＲＡＩＬ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ＴＲＡＩＬ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ１２、５７４～５８２頁（２０１５））。ＣＡＰ装置を用いる皮下腫瘍結節または頭蓋内腫瘍結節に対するマウスモデルによるＣＡＰのｉｎ ｖｉｖｏ研究（Ｃｈｅｒｎｅｔｓ，Ｎ．、Ｋｕｒｐａｄ，Ｄ．Ｓ．、Ａｌｅｘｅｅｖ，Ｖ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｄ．Ｂ．＆Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｔ．Ａ．Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ Ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ Ｐｕｌｓｅｄ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｓ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｂ１６ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｐｏｌｙｍ１２、１４００～１４０９頁（２０１５）およびＣｈｅｎ，Ｚ．ら Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｉｃｒｏ Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｂｏｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）９（２０１７））、またはＣＡＰ活性化媒体／水による間接的処置は（Ｕｔｓｕｍｉ，Ｆ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｎｏｎｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｏｎ ａｎｔｉ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｈｅｍｏ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ８、ｅ８１５７６（２０１３）、Ｘｕ，Ｄ．ら Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｗａｔｅｒ．Ｐｌａｓｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０（２０１８）、およびＬｉｕ，Ｊ．－Ｒ．ら Ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａ ｐ５３／ＰＩＧｓ／ｃａｓｐａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｄ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ５２（２０１９））、免疫系の活性化（Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．、Ｙｏｎｅｔａｍａｒｉ，Ｋ．、Ｓｈｉｒａｋａｗａ，Ｙ．、Ａｋｉｙａｍａ，Ｔ．＆Ｏｎｏ，Ｒ．Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｐｕｌｓｅｄ ｓｔｒｅａｍｅｒ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｄ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ５０、１２ＬＴ０１（２０１７）、Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ら Ｐｌａｓｍａ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ．ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ２、３５３～３５９頁（２０１８）、Ｃｈｅｎ，Ｇ．ら Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１７、３６８７～３６９２頁（２０２０）およびＦｒｅｕｎｄ，Ｅ．ら Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｌａｓｍａ－ｔｒｅａｔｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ＣＴ２６ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ９、６３４（２０１９））に加えて、腫瘍成長速度を効果的に減少させ、がん細胞死を誘導する。食品医薬局（ＦＤＡ）によって承認された、がんの処置に向けたＣＡＰを用いる米国で初の治験を、Ｊｅｒｏｍｅ Ｃａｎａｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＪＣＲＩ－ＡＢＴＳ）およびＵＳ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，ＬＬＣ（ＵＳＭＩ）が接受した。ＪＣＲＩ－ＡＢＴＳで開発されたＣａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ（商標）は、低温プラズマと高周波プラズマ電気外科システムを統合し、このシステムと方法が乳癌をはじめとする種々のタイプの固形腫瘍を効果的に除去することを実証した（Ｒｏｗｅ，Ｗ．ら Ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓｃａｌｐｅｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｄｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｐｌａｓｍａ １、１７７～１８８頁、Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｌａｓｍａ１、２１８～２２８頁（２０１８）およびＬｙ，Ｌ．ら Ｃａｎａｄｙ ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０２０））。
【0005】
ＣＡＰはがん細胞死を誘導し、低温プラズマカクテルを構成する活性酸素種（ＲＯＳ）および活性窒素種（ＲＮＳ）が、ならびにこれらが細胞培養培地または体液と接触する場合に液体相で生成する種も、重要な役割を果たすという証拠がある。Ｄａｉ，Ｘ．、Ｂａｚａｋａ，Ｋ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｅ．Ｗ．＆Ｏｓｔｒｉｋｏｖ，Ｋ．Ｋ．Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ：Ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１２（２０２０）。こういった種は、細胞および組織においてアポトーシス、細胞周期停止およびＤＮＡ損傷を誘導する可能性がある。最も不可解な問題とは、ＣＡＰがいかようにしてがん細胞において細胞死を選択的に誘導することができ、一方で正常組織をインタクトで維持することができるのか、ということである。先行研究では、結腸直腸がん細胞におけるＳｒｘ－Ｎｒｆ２抗酸化システムを通した酸化ストレスの誘導（Ｉｓｈａｑ，Ｍ．、Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｄ．＆Ｏｓｔｒｉｋｏｖ，Ｋ．Ｋ．Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｇａｓ ｐｌａｓｍａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｎｏｘ２－ＡＳＫ１ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｓ ｍｉｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ Ｓｒｘ－Ｎｒｆ２ ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１８４３、２８２７～２８３７頁（２０１４））、セストリン２媒介性一酸化窒素シンターゼシグナル伝達（Ｘｉａ，Ｊ．ら Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ｓｅｓｔｒｉｎ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ１２、ｅ２０１８０００４６（２０１９））またはＣＡＰ誘導性エピジェネティック変化（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｂ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｎ ＭＣＦ－７ ａｎｄ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０、ｅ０１２９９３１（２０１５））などの、簡明とは言えないいくつかの証拠が強調されてきたが、しかし、ＣＡＰ誘導性細胞死におけるＲＮＡの役割を強調した研究はない。いくつかの研究が示唆してきたことは、ＲＮＡが酸化ストレスに対する細胞応答において重要な役割を果たしている可能性がある、ということである。さらに、ＲＮＡ機能は構造的に一体的な部分としても（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｃａｍｐｏｓ，Ａ．＆Ａｚｏｒｉｎ，Ｆ．ＲＮＡ ｉｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｔｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２、ｅ１１８２（２００７））、クロマチンの調節因子としても（Ｗｕ，Ｓ．Ｋ．、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｔ．、Ｂａｌａｓ，Ｍ．Ｍ．＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｍ．ＲＮＡ ｍａｔｃｈｍａｋｉｎｇ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ４８、２４６７～２４８１頁（２０２０））、機能する。正に荷電したヒストンタンパク質への負に荷電したＤＮＡの会合はクロマチンと総称され、ヒストンタンパク質は、ＤＮＡ複製、転写、ＤＮＡ修復、組換え、染色体分離などの、染色体ＤＮＡが関与するすべての細胞プロセスにおいて極めて重要な役割を果たす（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．＆Ｌｏｒｃｈ，Ｙ．Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｖｅ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ，ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ９８、２８５～２９４頁（１９９９）およびＫｈｏｒａｓａｎｉｚａｄｅｈ，Ｓ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ：ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ１１６、２５９～２７２頁（２００４））。染色体へのそのアセンブリおよびその生合成は、細胞周期のＳ期過程のＤＮＡ合成と密接に調節されており、その調節は転写レベルと転写後レベルの両方で起こり、その結果、Ｓ期過程では数倍の上昇がもたらされる（Ｈｅｉｎｔｚ，Ｎ．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １０８８、３２７～３３９頁（１９９１）、Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．＆Ｄｕｒｏｎｉｏ，Ｒ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１４、６９２～６９９頁（２００２）、Ｏｓｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ６０、８２７～８６１頁（１９９１）、Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．、Ｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｖａｎ Ｗｉｊｎｅｎ，Ａ．Ｊ．＆Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ：ｔｈｅ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｉｓ ａ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇ１／Ｓ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ２０、４１～４９頁（１９９６）およびＧｕｎｊａｎ，Ａ．、Ｐａｉｋ，Ｊ．＆Ｖｅｒｒｅａｕｌｔ，Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ８７、６２５～６３５頁（２００５））が、このようなことは、調節タンパク質が（Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４）などのヒストン遺伝子のプロモーター領域におけるサブタイプ特異的調節エレメント（ＳＳＲＥ）に直接結合する場合にもたらされる（Ｈｅｉｎｔｚ，Ｎ．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ１０８８、３２７～３３９頁（１９９１）、Ｏｓｌｅｙ，Ｍ．Ａ．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ６０、８２７～８６１頁（１９９１）、ＤｅＲａｎ，Ｍ．、Ｐｕｌｖｉｎｏ，Ｍ．、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．、Ｓｕ，Ｃ．＆Ｚｈａｏ，Ｊ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅｓ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＮＰＡＴ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ＴＲＲＡＰ－Ｔｉｐ６０ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｇ１／Ｓ ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２８、４３５～４４７頁（２００８）、Ｍｉｅｌｅ，Ａ．ら ＨｉＮＦ－Ｐ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｌｉｎｋｓ ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｎ Ｅ／ＣＤＫ２／ｐ２２０ＮＰＡＴ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ４ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｇ１／Ｓ ｐｈａｓｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２５、６１４０～６１５３頁（２００５）およびＦｌｅｔｃｈｅｒ，Ｃ．、Ｈｅｉｎｔｚ，Ｎ．＆Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＴＦ－１，ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２ｂ ｇｅｎｅ．Ｃｅｌｌ５１、７７３～７８１頁（１９８７））。Ｓ期以外のコアヒストンの過剰発現は毒性であり、ヒストン遺伝子の調節解除は染色体の喪失につながり、その結果、ＤＮＡ損傷および細胞死がもたらされる（Ｍｅｉ，Ｑ．ら Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ８、９５００５～９５０２２頁（２０１７）、Ｚｈａｏ，Ｊ．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｎｏｒｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ３、６９５～６９７頁（２００４）、Ｙｅ，Ｘ．ら Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃａｕｓｅｓ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ，ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ，ａｎｄ Ｓ ｐｈａｓｅ ａｒｒｅｓｔ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ１１、３４１～３５１頁（２００３）、Ｍｅｅｋｓ－Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．＆Ｈａｒｔｗｅｌｌ，Ｌ．Ｈ．Ｎｏｒｍａｌ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｉｍｅｒ ｓｅｔｓ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ４４、４３～５２頁（１９８６）およびＫｕｒａｔ，Ｃ．Ｆ．ら Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｏ Ｓ ｐｈａｓｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｂｏｕｎｄａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ２５、２４８９～２５０１頁（２０１１））。細胞増殖を制御する遺伝子に突然変異が蓄積すると、最終的にはがん状態にいたる。これらの特徴によって、がんは正常細胞からが区別され、Ｓ期イベントが正常細胞よりも腫瘍でいっそう頻繁に起こるように思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
乳がん細胞株に対するＣＡＰの効果については繰り返し研究されてきたが（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｂ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｎ ＭＣＦ－７ ａｎｄ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０、ｅ０１２９９３１（２０１５）、Ｘｕ，Ｘ．ら Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ａｎｔｉ－ｃａｎｃｅｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ１５（２０１８）、Ｐａｒｋ，Ｓ．ら Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ Ｒｅｓｔｏｒｅｓ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）１１（２０１９）、Ｘｉａｎｇ，Ｌ．、Ｘｕ，Ｘ．、Ｚｈａｎｇ，Ｓ．、Ｃａｉ，Ｄ．＆Ｄａｉ，Ｘ．Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｖｅｙｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｏｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１２４、２０５～２１３頁（２０１８）、Ｌｉｕ，Ｙ．ら Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｏｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ７、７９８０（２０１７）、Ｌｅｅ，Ｓ．ら Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＭＣＦ－７ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１１０、２８０～２９０頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｒｅｅｒａｄｂｉｏｍｅｄ．２０１７．０６．０１７（２０１７）、Ｚｈｕ，Ｗ．ら Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｏｌｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｌｏａｄｅｄ Ｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ６、２１９７４（２０１６）、Ｗａｎｇ，Ｍ．ら Ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｂｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ８、ｅ７３７４１（２０１３）およびＫｉｍ，Ｓ．Ｊ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｔ．Ｈ．、Ｂａｅ，Ｓ．Ｈ．＆Ｌｅｅｍ，Ｓ．Ｈ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｐｕｌｓｅｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｊｅｔ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ９７（２０１０））、このことが示唆するところは乳がんに向けた有望な療法としてのＣＡＰである。しかし、さまざまな分子サブタイプの乳がんに対するＣＡＰのさまざま効果については、本発明者らの先行研究（Ｌｙ，Ｌら Ｃａｎａｄｙ ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０２０））を除いて、まだ報告されていない。異なるマーカー状態を有する乳がん細胞株に対するＣＡＰの効果を理解するために、４種の乳がん細胞株を種々の投与量で低温プラズマを用いて試験した。選択された４種の細胞株、ＭＣＦ－７（ルミナルＡ、ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）、ＢＴ－４７４（ルミナルＢ、ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（基底様、ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）およびＳＫ－ＢＲ－３（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）は文献で広く研究されたものであるが、各サブタイプの代表的な細胞株である（Ｈｏｌｌｉｄａｙ，Ｄ．Ｌ．＆Ｓｐｅｉｒｓ，Ｖ．Ｃｈｏｏｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｏｒ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３（２０１１））。本研究の目的は、正確な療法としての低温プラズマを証明すること、およびすべての乳がんサブタイプに対するＣＡＰの抗がんメカニズムを明らかにすること、である。本研究において、低温プラズマ処置による乳がん細胞株のヒストンＲＮＡの分解が細胞死につながり、このことが乳がん細胞においてアポトーシスを選択的に誘導するためのキーとなる差別化要因であることを報告するのは、本発明者らが初めてである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
乳がんは世界中の女性の間で最も一般的ながんである。その分子受容体マーカーの状態およびその変異性サブタイプが臨床療法を複雑にしている。低温大気圧プラズマ（ＣＡＰ）は、正常組織ではなく、乳がん細胞をはじめとする多くのがんと選択的に闘う補助療法として有望な結果を示してきた。しかし、その根底にあるメカニズムはこれまで研究されないままであった。このメカニズムを調査するために、異なるマーカー状態を有する４種の乳がん細胞株を、種々の出力設定および処置時間で低温プラズマを使用して試験した。細胞生物学的および生化学的方法を使用して、これら細胞株でのアポトーシスの差次的進行をモニタリングした。低温プラズマによって投与量依存様式で細胞死が誘導されたが、この場合、１００％除去を達成するにはサブタイプそれぞれにとってわずかに異なる出力または時間の設定が必要であった。低温プラズマ処置後最長７２時間、共焦点顕微鏡イメージングおよびＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを使用して、細胞をＫｉ６７発現によってモニタリングした場合、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、および細胞周期の停止が観察された。細胞周期解析により実証されたところは、細胞死はＳ期へと完全移行することなくＧ１周期の終わりに生じること、である。ＲＮＡＳｅｑプロファイリングおよびｑＲＴ－ＰＣＲ解析により示されたところは、低温プラズマ処置後に少なくとも１６種のヒストンｍＲＮＡタイプが分解されること、である。さらに、インサイツ蛍光プローブおよび免疫沈降解析により確認されたところは、低温プラズマ処置後１時間以内にヒストン遺伝子転写物が８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）修飾によって分解されること、である。ｑＲＴ－ＰＣＲによるＤＮＡ損傷応答遺伝子の発現は、低温プラズマ処置の１２時間後にアップレギュレーションされたが、このことが指示するところは、ＤＮＡ損傷というよりはむしろ、ヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾および分解が低温プラズマ処置によって誘導される細胞死の主因であること、である。本発明者らの報告が初めて実証するころは、低温プラズマは、ＣＡＰ誘導性細胞死の可能性のある新規な一メカニズムとして、細胞周期の初期Ｓ期過程でのヒストンｍＲＮＡの酸化および分解を通して、サブタイピングにかかわらず、乳がんの細胞死を効果的に誘導したこと、である。
【0008】
好ましい実施形態では、本発明は、乳がん細胞における酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルをモニタリングするための方法である。本方法は、乳がん細胞からヒストンｍＲＮＡを単離するステップと、配列番号１によるペプチドとともにヒストンｍＲＮＡをインキュベートするステップと、蛍光強度を測定することによって酸化ヒストンｍＲＮＡのレベルを決定するステップとを含む。蛍光強度は顕微鏡法によって決定することができる。ヒストンｍＲＮＡは８－オキソグアニン修飾とすることができる。乳がん細胞は、ヒストンｍＲＮＡを単離するステップの前に、低温プラズマで処置されている。低温プラズマ処置は３５℃未満にての低温プラズマを用いる。方法は、低温プラズマ処置の６、２４または４８時間後に実施することができる。方法は、単離されたヒストンｍＲＮＡについて差次的発現解析のステップをさらに含むことができ、ここで、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ；ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ；ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ；ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ；ＨＩＳＴ２Ｈ３ＤおよびＨＩＳＴ４Ｈを含む群から選択されるヒストンの単離されたヒストンｍＲＮＡレベルを決定する。
【0009】
別の実施形態では、本発明は、固相ペプチド合成によって合成されたペプチド（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）であり、以下の配列（Ａｌｅｘａ ４８８）ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＳＥＶＶＶＳＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を有する。
【0010】
さらに別の実施形態では、本発明は、ヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾および分解による乳がん細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の方法である。
【0011】
本発明および本発明の利点のより完全な理解のために、次に、以下の説明および添付の図面を参照する、ここで：
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【図2】ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）細胞株のＫｉ６７染色を示す図である。ＣＡＰ処置の６／２４／４８時間後のＭＣＦ－７細胞の「Ｋｉ６７＋」細胞数の平均化定量プロット（棒の上の＊は、未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を表す。＊ｐ＜０．０５）。
【0014】
【図3】ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞株のＫｉ６７染色を示す図である。ＣＡＰ処置の６／２４／４８時間後のＢＴ－４７４細胞の「Ｋｉ６７＋」細胞数の平均化定量プロット（棒の上の＊は、未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を表す。＊ｐ＜０．０５）。
【0015】
【図4】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮ）細胞株のＫｉ６７染色を示す図である。ＣＡＰ処置の６／２４／４８時間後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の「Ｋｉ６７＋」細胞数の平均化定量プロット（棒の上の＊は、未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を表す。＊ｐ＜０．０５）。
【0016】
【図5】ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）細胞株のＫｉ６７染色を示す図である。ＣＡＰ処置の６／２４／４８時間後のＳＫ－ＢＲ－３細胞の「Ｋｉ６７＋」細胞数の平均化定量プロット（棒の上の＊は、未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を表す。＊ｐ＜０．０５）。
【0017】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】７２時間にわたるＣＡＰ処置の有り無し両方での、乳がん細胞株のカスパーゼ３／７活性を示す図である。Ａ）ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）。Ｂ）ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）。Ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮ）。Ｄ）ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）。
【0018】
【図7A】
【図7B】ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）細胞株のアポトーシス解析を示す図である。Ａ）ＣＡＰ処置の２４時間後の一実験からの、アネキシンＶ 対 ＰＩによって染色されたＭＣＦ－７細胞の代表的な散布図。Ｂ）ＣＡＰ処置の４８時間後の同じ実験からのアネキシンＶ 対 ＰＩによって染色されたＭＣＦ－７細胞の代表的な散布図。Ｃ）ＣＡＰ処置の２４時間後のＭＣＦ－７細胞の「生」、「初期アポトーシス」、および「後期アポトーシス／死」の各集団の平均化定量プロット。Ｄ）ＣＡＰ処置の４８時間後のＭＣＦ－７細胞の「生」、「初期アポトーシス」、および「後期アポトーシス／死」の各集団の平均化定量プロット（棒の上の＊は、対応する未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を示す。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0019】
【図8A】
【図8B】ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞株のアポトーシス解析を示す図である。Ａ）ＣＡＰ処置の２４時間後の一実験からの、アネキシンＶ 対 ＰＩによって染色されたＢＴ－４７４細胞の代表的な散布図。Ｂ）ＣＡＰ処置の４８時間後の同じ実験からのアネキシンＶ 対 ＰＩによって染色されたＢＴ－４７４細胞の代表的な散布図。Ｃ）ＣＡＰ処置の２４時間後のＢＴ－４７４細胞の「生」、「初期アポトーシス」、および「後期アポトーシス／死」の各集団の平均化定量プロット。Ｄ）ＣＡＰ処置の４８時間後のＢＴ－４７４細胞の「生」、「初期アポトーシス」、および「後期アポトーシス／死」の各集団の平均化定量プロット（棒の上の＊は、対応する未処置群と比較したＣＡＰ処置群の統計学的有意性を表す。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0020】
【図9A】
【0021】
【図10A】
【0022】
【図11】ＣＡＰ処置後７２時間にわたる、Ｇ１期、Ｇ１－Ｓ期、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期、およびＭ－Ｇ１期におけるＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）細胞の定量化を示す図である。Ａ～Ｅ）細胞は未処置であるか、または種々の投与量のＣＡＰによって処置した。
【0023】
【図12】ＣＡＰ処置後７２時間にわたる、Ｇ１期、Ｇ１－Ｓ期、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期、およびＭ－Ｇ１期におけるＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞の定量化を示す図である。Ａ～Ｅ）細胞は未処置であるか、または種々の投与量のＣＡＰによって処置した。
【0024】
【図13】ＣＡＰ処置後７２時間にわたる、Ｇ１期、Ｇ１－Ｓ期、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期、およびＭ－Ｇ１期におけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）細胞の定量化を示す図である。Ａ～Ｅ）細胞は未処置であるか、または種々の投与量のＣＡＰによって処置した。
【0025】
【図14】ＣＡＰ処置ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（６０２）とモック対照（６０５）の間で差次的に発現した上位３０の遺伝子のクラスタリングを示すヒートマップの図である。遺伝子発現レベルを対数（絶対値）スケールで表示する。ヒストン遺伝子をヒートマップでひときわ目立たせて表示する。
【0026】
【図15】ＣＡＰ処置６時間の後のヒストンおよびヒストン関連遺伝子の倍率変化（ｌｏｇ２スケール）における次世代シークエンシング（ＮＧＳ）全トランスクリプトーム解析を示す棒グラフの図である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２０ｐで５分間ＣＡＰ処置し、６時間インキュベートした。リボソームＲＮＡを総ＲＮＡから除去し、ＲＮＡシーケンシングライブラリを調製した。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）全トランスクリプトームシークエンシングを、ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２×１５０ｂｐシークエンシングを用いて実施し、ＲＮＡ－Ｓｅｑデータを用いる下流解析をＤＥＳｅｑ２を使用することによって実施し、機能エンリッチメント解析をＷｅｂＧｅｓｔａｌｔを使用して実施した。ヒストンおよびヒストン関連遺伝子のほとんどが、ＣＡＰ処置後に有意にダウンレギュレーションされた。
【0027】
【図16A】
【図16B】ＣＡＰ処置後のヒストンＲＮＡ分解を示す図である：（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のモック対照試料と比較した、ＣＡＰ処置以降０時間、１時間、２時間および３時間後のヒストンＲＮＡの倍率変化を示す棒グラフ。（Ｂ）反復測定ＡＮＯＶＡを使用しこれに続くボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を適宜使用するｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を使用して統計学的解析を実施した。＊Ｐ＜０．００５。
【0028】
【図17】ＣＡＰ処置または未処置のＭＤＡ－ＭＢ－２３１生細胞上で、蛍光タグ付き８－ｏｘｏＧ結合ペプチドプローブを用いてインサイツでプローブしたＲＮＡ酸化の蛍光強度を示す棒グラフの図である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２０ｐで５分ＣＡＰ処置し、１時間のインキュベーション後、蛍光タグ付き８－ｏｘｏＧ結合ペプチドプローブを一晩結合させ、翌日培地を除去し、ＰＢＳと交換した。インサイツ８－ｏｘｏＧ結合プローブの蛍光強度を波長４８５ｎｍで読み取った。相対蛍光強度を、モック対照と比較したパーセントとして報告する。少なくとも１００倍高い８－ｏｘｏＧ結合が、単独で処置したＴａｔ－Ｓ３ペプチドと比較して、ＣＡＰ処置－Ｔａｔ－Ｓ３ペプチドプローブのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において見いだされる。比率の平均ＳＥＭをプロットする。反復測定ＡＮＯＶＡを使用しこれに続くボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を適宜使用するｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を使用して統計学的解析を実施した。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0029】
【図18A】
【図18B】８－ｏｘｏＧヒストンＲＮＡのプルダウンを示す図である：（Ａ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の、免疫沈降８－ｏｘｏＧモック対照試料と比較した、ＣＡＰ処置以降０時間および１時間後の免疫沈降８－ｏｘｏＧヒストンＲＮＡの倍率変化を示す棒グラフ。（Ｂ）反復測定ＡＮＯＶＡこれに続くボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を適宜使用するｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を使用して統計学的解析を実施した。＊Ｐ＜０．００５。
【0030】
【図19A】
【図19B】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中でのＣＡＰ処置した後の０時間および１時間のインキュベーションにての、ＣＡＰ－８－ｏｘｏＧ免疫沈降群とインプット群との間のヒストン遺伝子における８－ｏｘｏＧ修飾のパーセンテージ変化を示す棒グラフの図である。
【0031】
【図20】異なるインキュベーション時点（３、６、１２および２４時間）にてのＣＡＰ処置後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞における、モック対照と比較したＤＮＡ損傷応答遺伝子ＡＴＦ３、ＣＣＮＥ１、ＥＧＲ１、ＩＤ２およびＰＴＧＳ２の各遺伝子の倍率変化を示す棒グラフの図である。統計学的解析を、スチューデントｔ検定を使用して実施した。＊Ｐ＜０．００５；＊＊Ｐ＜０．００１。
【0032】
【図21】本発明による、低温プラズマ誘導アポトーシスのメカニズムを例示するダイアグラムである。
【0033】
【図22】未処置であるかまたは８０ｐもしくは１２０ｐで３分間もしくは５分間ＣＡＰにより処置された、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて作成されたＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）安定細胞株の細胞周期の図である。処置の０～４８時間後の細胞のコンフルエンス。
【0034】
【図23】未処置であるかまたは８０ｐもしくは１２０ｐで３分間もしくは５分間ＣＡＰにより処置された、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて作成されたＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）安定細胞株の細胞周期の図である。処置の０～４８時間後の細胞のコンフルエンス。
【0035】
【図24】未処置であるかまたは８０ｐもしくは１２０ｐで３分間もしくは５分間ＣＡＰにより処置された、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて作成された、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）安定細胞株の細胞周期に関する、処置の０～４８時間後の細胞のコンフルエンスのグラフの図である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
本発明を、図面を参照して説明する。
【0037】
低温プラズマ処置後の乳がん細胞の生存率および増殖の減少
先行研究は、ＣＡＰが種々の細胞株において抗がん効果を有することを示唆してきた。広範囲の低温プラズマ発生装置が世界中で使用されているにもかかわらず、新たに得られつつある証拠により、細胞タイプ特異的耐性が腫瘍細胞において観察される場合があることが示されてきた（Ｃｏｎｗａｙ，Ｇ．Ｅ．ら Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｉｎｄｕｃｅｓ ＲＯＳ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｕ３７３ＭＧ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ１１４、４３５～４４３頁（２０１６））。乳がん細胞株に対するＣＡＰ処置に関する先行研究において本発明者らは、低温プラズマが受容体の状態に基づいて乳がん細胞の生存率を最大９２～９９％減少させることができることを報告してきた（Ｌｙ，Ｌ．ら Ｃａｎａｄｙ ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０２０））。本発明を開発する上で、異なる受容体状態を有する４種の乳がん細胞株の感受性を比較し、それらのアポトーシスおよび細胞周期の進行を観察した。すべての実験は、米国、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｔａｋｏｍａ ＰａｒｋのＪｅｒｏｍｅ Ｃａｎａｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓで実施したものである。
先行研究は、ＣＡＰが種々の細胞株において抗がん効果を有することを示唆してきた。広範囲の低温プラズマ発生装置が世界中で使用されているにもかかわらず、新たに得られつつある証拠により、細胞タイプ特異的耐性が腫瘍細胞において観察される場合があることが示されてきた（Ｃｏｎｗａｙ，Ｇ．Ｅ．ら Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｌａｓｍａ ｉｎｄｕｃｅｓ ＲＯＳ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ｕ３７３ＭＧ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ１１４、４３５～４４３頁（２０１６））。乳がん細胞株に対するＣＡＰ処置に関する先行研究において本発明者らは、低温プラズマが受容体の状態に基づいて乳がん細胞の生存率を最大９２～９９％減少させることができることを報告してきた（Ｌｙ，Ｌ．ら Ｃａｎａｄｙ ｃｏｌｄ ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０２０））。本発明を開発する上で、異なる受容体状態を有する４種の乳がん細胞株の感受性を比較し、それらのアポトーシスおよび細胞周期の進行を観察した。すべての実験は、米国、Ｍａｒｙｌａｎｄ、Ｔａｋｏｍａ ＰａｒｋのＪｅｒｏｍｅ Ｃａｎａｄｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓで実施したものである。
【0038】
４種の乳がん細胞株の細胞生存能および増殖速度の出力依存性の減少および時間依存性の減少を図１Ａ～１Ｅに示した。低温プラズマ処置細胞の生存能を、低温プラズマ処置の４８時間後の未処置細胞に対して正規化した。処置時間を長くし処置出力を上げると、４種の細胞株すべてにわたって細胞生存能がより低い結果となり、それらのうちで、ＳＫ－ＢＲ－３（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）が低温プラズマ処置に対して最も感受性が高く、ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）は最も強力な投与量が必要である。ここで確立された生存能によって、さまざまな設定下での低温プラズマ処置に対する乳がんサブタイプそれぞれの反応の概要が提供される。以下の実験では、ヘリウム流量設定３ＬＰＭの条件で、３つの処置期間（３、５、および６分）について２つの出力設定（８０ｐおよび１２０ｐ）の条件で４種の乳がん細胞株を試験した。
【0039】
低温プラズマにより処置した細胞を７２時間インキュベートし、次いで、増殖速度の指標として細胞のコンフルエンスを解析し、ＩｎｃｕＣｙｔｅによってプロットし、このコンフルエンスを図１Ｂ～１Ｅに示した。スチューデントｔ検定を、ＮＴと比較して、各処置投与量に関しておよび低温プラズマ処置後の１時間ごとに実施したが、＊は、処置後４８時間～７２時間の過程でｐ＜０．０５の場合に統計学的有意性を表す。低温プラズマ処置により、未処置（ＮＴ）と比較して、細胞のタイプおよび投与量に基づいて、すべての細胞株の増殖がさまざまな程度に減少した。ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞（図１Ｃ）の場合、最高投与量（１２０ｐ ５分にてのより高い出力および時間の条件の低温プラズマ処置）を用いる場合のみ、細胞は、ＮＴと比較して、処置以降２６時間後にコンフルエンスの統計学的に有意な低下を示すことを始めた。ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）、およびＳＫ－ＢＲ－３（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）の各細胞の場合（図１Ｂ、１Ｄおよび１Ｅ）、増殖速度は低温プラズマの出力依存様式でおよび時間依存様式で低下した：低温プラズマ処置はＭＣＦ－７細胞の増殖を有意に遅らせたが細胞を完全に排除するわけではなく、細胞は処置の４８時間後に回復する傾向があった；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＢＴ－４７４およびＭＣＦ－７と比較して、低用量の低温プラズマ処置にいっそう応答しており、最高投与量（１２０ｐ ５分）で細胞を完全に根絶することができた；ＳＫ－ＢＲ－３（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）細胞の場合（図１Ｅ）、すべての処置投与量が細胞増殖を効果的に停止させた。
【0040】
細胞増殖を減少させる乳がん細胞に対する低温プラズマの細胞傷害性を、細胞増殖マーカーＫｉ－６７によって視覚化した。Ｋｉ－６７差次的発現は、重要な治療上の意義をもたらすことができる（Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｎ．Ａ．＆Ｙｕｓｓｉｆ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉ－６７ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１３、４９６～５０４頁、ｄｏｉ：１０．２０８９２／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３９４１．２０１６．００６６（２０１６）およびＩｎｗａｌｄ，Ｅ．Ｃ．ら Ｋｉ－６７ ｉｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ｃｏｈｏｒｔ ｏｆ ａ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ１３９、５３９～５５２頁、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０５４９－０１３－２５６０－８（２０１３））。乳がん細胞を所望の低温プラズマ投与量で処置し、Ｋｉ－６７／ＤＡＰＩ共染色を低温プラズマ処置の６、２４、または４８時間後に実施した。
【0041】
定量化の場合、Ｋｉ－６７陽性（Ｋｉ－６７＋）細胞数をＫｉ－６７＋細胞パーセンテージの代わりに使用したが、これは、染色プロセス過程で後期アポトーシス細胞または死細胞が洗い流されて偽総細胞数がもたらされたからである。明瞭に焦点が合った核の輪郭を描き、Ｋｉ－６７チャネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。Ｋｉ－６７ ＭＦＩの平均値を、未処置およびアイソタイプ対照を含めて各処置群（５つの画像）について算出した。Ｋｉ－６７＋細胞とは、そのＫｉ－６７ ＭＦＩが各細胞株のアイソタイプ対照以外のすべての群のＭＦＩの最低平均値よりも大きい場合と定義した。
【0042】
作成した画像では、Ｋｉ－６７染色は、より高い投与量で処置した細胞よりも、未処置の細胞においてまたはより低い投与量の低温プラズマによる細胞において、著しく明るかった。ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）未処置試料では、Ｋｉ－６７が核質全体に見られ、ほとんどの場合、核小体と共局在性であった。低用量または短時間のインキュベーション（６時間 １２０ｐ ３分、６時間 １２０ｐ ５分、２４時間 １２０ｐ ３分、および４８時間 １２０ｐ ３分）にて、核小体はインタクトであり、Ｋｉ－６７発現は依然としてしかし少数の細胞で観察された；高用量（２４時間 １２０ｐ ５分および４８時間 １２０ｐ ５分）にて、Ｋｉ－６７染色は低減するかまたは破壊された核小体を有する核全体に提示されるか、いずれかであった。同じパターンが、わずかに異なる処置条件をもってして、４種の乳がん細胞株すべてで見られた。ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）、ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮ）の場合、１２０ｐ ５分にての低温プラズマ処置により、２４時間のインキュベーション後に核に目に見える損傷が生じた。ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）の場合、８０ｐ ３分のより低い処置用量にての低温プラズマ処置の早くも６時間後に目に見える核損傷が観察された。
【0043】
Ｋｉ－６７＋細胞の数は、出力依存性の様式および時間依存性の様式で、４種の乳がん細胞株すべてにおいて、低温プラズマ処置によって減少した。低温プラズマ処置後の６、２４、および４８時間の各インキュベーションにわたって、Ｋｉ－６７＋細胞数は徐々に低下した。Ｋｉ－６７＋細胞数の減少に加えて、核の形状およびサイズが低温プラズマ処置後に変化した。最高投与量の低温プラズマで処置したすべての細胞において収縮および断片化が見られた。細胞数の減少は、生存率および密集度で観察される増殖の阻害と相関する。
【0044】
低温プラズマ処置後の乳がん細胞のアポトーシス
次の問題は、低温プラズマが単に細胞増殖を減少させるのかそれとも細胞死を誘導するのかということであった。下流のアポトーシス経路の重要なステップとして、各細胞株についてアポトーシス活性のタイムラインを理解するためにカスパーゼ３／７活性を測定した。低温プラズマ処置後、細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓで染色し、即座にインキュベーターに戻し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ １０×レンズで３日間スキャンした（低温プラズマ後０～７２時間）。位相コントラスト画像を１時間ごとに撮影して、アポトーシスの進行をモニタリングした。低温プラズマ処置後０から７２時間までの画像毎の総集団のうちのカスパーゼ３／７活性細胞のパーセンテージをＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアにより解析し、図２に示した。
次の問題は、低温プラズマが単に細胞増殖を減少させるのかそれとも細胞死を誘導するのかということであった。下流のアポトーシス経路の重要なステップとして、各細胞株についてアポトーシス活性のタイムラインを理解するためにカスパーゼ３／７活性を測定した。低温プラズマ処置後、細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓで染色し、即座にインキュベーターに戻し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ １０×レンズで３日間スキャンした（低温プラズマ後０～７２時間）。位相コントラスト画像を１時間ごとに撮影して、アポトーシスの進行をモニタリングした。低温プラズマ処置後０から７２時間までの画像毎の総集団のうちのカスパーゼ３／７活性細胞のパーセンテージをＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアにより解析し、図２に示した。
【0045】
４種の乳がん細胞株すべてについて、アポトーシス（低温プラズマによって誘導された場合）は、処置後４時間以内に開始し、処置以降４８時間後後にプラトーに達した。各細胞株について、アポトーシス活性の動態を表すカスパーゼ３／７曲線の傾きは用量依存性であり、これは、低温プラズマ用量が高いほど（出力が高いほどまたは期間が長いほど）、アポトーシスがより早くかつより速く生じたことを示唆する。
【0046】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングの大きな利点とは、アポトーシス進行を０時間目から継続的にモニタリングすることおよび可視化することである。しかし、ＩｎｃｕＣｙｔｅの限界とは、すべての２次元イメージング解析と同様に、剥離細胞が焦点面に存在しないすなわち解析中に存在しなかったことである。アポトーシス集団をより十分に定量化し、アポトーシスのパーセンテージを算出するために、細胞をアネキシンＶ 対 ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で染色し、低温プラズマ処置の２４時間および４８時間後にての細胞アポトーシスをフローサイトメトリーにより確認した。乳がん細胞株それぞれについて、「生」細胞、「初期アポトーシス」細胞、および「後期アポトーシス／死」細胞の代表的な散布図および定量化プロットを図７Ａ～１０Ｂに示した。
【0047】
４種の細胞株すべてについて、未処置試料において、細胞のうちの大部分の細胞（およそ８０～９０％）が生存していた（「生」、アネキシンＶ－／ＰＩ－）。対照的に、８０ｐまたは１２０ｐで３、５または６分間低温プラズマ処置に曝露すると、２４時間および４８時間のインキュベーション時間にわたって種々の程度にアポトーシスが誘導された。
【0048】
「生」細胞の集団は、未処置と比較して、処置出力を高くし時間を延長することに伴って有意に低下した（ｐ値は＜０．０５から＜０．００１の範囲にある）。ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）の「生」集団は、低温プラズマ処置後に８０．０４％から２．３７％まで低下した（図７Ａおよび７Ｂ）；ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）の「生」集団は、低温プラズマ処置後に９２．１１％から２．７８％まで低下した（図８Ａおよび８Ｂ）；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮ）の「生」集団は、低温プラズマ処置後８８．１６％から２．６２％まで低下した（図９Ａおよび９Ｂ）；ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）の「生」集団は、低温プラズマ処置後、８２．０６％から１．１４％まで低下した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。処置出力を高くし時間を延長することに伴って、初期アポトーシスを起こしている細胞の増大が４種の細胞株すべてにおいて見られた。
【0049】
加えて、４種の細胞株の中で、ＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）細胞が低温プラズマ処置に対して最も感受性が高く、ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞が最も耐性があった。強力で統計学的に有意な異なる（＊＊＊ｐ＜０．００１）「生」集団が、最低の処置投与量（８０ｐ ３分）の条件でＳＫ－ＢＲ－３（ＨＥＲ２＋）において低温プラズマ処置の２４時間後に観察された（図１０Ａ）。ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）は、８０ｐにて６分間の低温プラズマ処置の条件で２４時間まで（＊ｐ＜０．０５、図８Ａ）、または８０ｐにて５分間の低温プラズマ処置の条件で４８時間まで（＊ｐ＜０．０５、図８Ｂ）、有意な低下を示さなかった。この発見は、上記の生存率および増殖阻害と一致する。
【0050】
低温プラズマ処置の４８時間後の集団（図７Ａ、８Ａ、９Ａ、および１０Ａ）を２４時間後の集団（それぞれ、図７Ｂ、８Ｂ、９Ｂおよび１０Ｂ）と比較すると、低温プラズマ誘導アポトーシスには、最大４８時間を要した可能性がある。例えば、８０ｐにて３分間および６分間で、ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）は、低温プラズマ処置の２４時間後に３２．１７％から６０．８９％まで；および低温プラズマ処置後の４８時間で３６．９５％から８７．３０％まで、アポトーシス細胞集団の増大を示したが、このことが指示するところは、２４時間から４８時間の間にいっそうの細胞がアポトーシス手順に入ったこと、である。このような現象は、すべての低温プラズマ処置条件について４種の細胞株すべてで観察することができる。
【0051】
細胞周期の時間的進行
乳がん細胞株の安定な細胞集団を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて生成し、所望の投与量の低温プラズマで処置した。ＨＥＲ２＋サブタイプＳＫ－ＢＲ－３の安定な細胞集団を生成する場合に技術的な困難があった。別のＨＥＲ２＋細胞株ＡＵ－５６５を用いて試みがなされたが、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いても安定な細胞株を作製することは同様にできなかった。したがって、ＨＥＲ２＋サブタイプに対しては細胞周期解析を実施しなかった。
乳がん細胞株の安定な細胞集団を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて生成し、所望の投与量の低温プラズマで処置した。ＨＥＲ２＋サブタイプＳＫ－ＢＲ－３の安定な細胞集団を生成する場合に技術的な困難があった。別のＨＥＲ２＋細胞株ＡＵ－５６５を用いて試みがなされたが、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを用いても安定な細胞株を作製することは同様にできなかった。したがって、ＨＥＲ２＋サブタイプに対しては細胞周期解析を実施しなかった。
【0052】
低温プラズマ処置後、細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）で３日間モニタリングした。Ｇ１（赤色）相、Ｓ／Ｇ２／Ｍ（緑色）相またはＳからＧ１への移行（Ｓ－Ｇ１、黄色）相にある細胞の定量化データおよび位相コントラスト画像を、図１１～図１３および図２２～２４に示す。
【0053】
トランスフェクトされていない細胞株のコンフルエンス（図１Ｂ～１Ｄ）と一致した、図２２～図２４に示した低温プラズマ処置後の安定な細胞株のコンフルエンスによって、細胞機能がレンチウイルスによって変更されていないことが確認された。
【0054】
低用量の低温プラズマ処置（８０ｐ ３分および５分、ならびに１２０ｐ ３分、図１１）で処置したＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）細胞の場合、処置後の最初の８時間の過程で、Ｇ１期の細胞数はクラッシュしたが、一方、Ｇ１－Ｓ移行期およびＳ／Ｇ２／Ｍ期の細胞数には有意な変化はなかった。最高用量の低温プラズマ（１２０ｐ ５分）で処置した場合、すべての相の細胞数が低下し、大部分の細胞が９時間以内に死滅し（図２２）、したがって、定量化については９時間のみについてプロットした（図１１）。
【0055】
低用量の低温プラズマ処置（８０ｐ ３分および５分、ならびに１２０ｐ ３分）は、ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）の細胞周期に有意な変化をもたらさなかったが、このことは、カスパーゼ３／７活性と一致している（図６）。アポトーシスが観察された１２０ｐ ５分にての最高低温プラズマ用量の場合では（図６）、Ｇ１およびＳ／Ｇ２／Ｍの細胞数が劇的に低下したのに対し、一方、Ｇ１－Ｓ移行期によってわずかに増加したが、このことが示唆するところは、細胞周期がＧ１期からＳ／Ｇ２／Ｍ期へと完全に進行しなかったこと、である。
【0056】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮＢＣ）の場合、低用量の低温プラズマ（８０ｐ ３分および５分、１２０ｐ ３分）によって、８時間以内にＧ１期で細胞数が直ちに低下したが、限定数の細胞がＳ／Ｇ２／Ｍ期に向かって進行した（黄色と緑色）。高用量の低温プラズマ（１２０ｐ ５分）によってアポトーシスが即座に誘導され、したがってすべての期の細胞数が低下した。
【0057】
ヒストン遺伝子の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）全トランスクリプトーム解析
ＲＮＡシーケンシング技術は、近年、ハイスループットのトランスクリプトーム解析に向けて注目を集めてきたが（Ｗａｎｇ，Ｚ．、Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ：ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ１０、５７～６３頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ２４８４（２００９））、乳がんＲＮＡトランスクリプトミクスの多くの研究が、予後マーカーならびに新規治療標的を有する（Ｅｓｗａｒａｎ，Ｊ．ら Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ２、２６４、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００２６４（２０１２）、Ｈｏｒｖａｔｈ，Ａ．ら Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ３、２２５６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０２２５６（２０１３）およびＣｈｅｎ，Ｆ．ら ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ３４、１２９～１３８頁、ｄｏｉ：１０．７５５５／ＪＢＲ．３４．２０１９０１１１（２０２０））。しかし、ＣＡＰ処置後の乳がんＲＮＡトランスクリプトミクスは調査されていなかった。ＣＡＰ誘導性細胞死に関与する潜在的な遺伝子およびメカニズムを明らかにするために、本発明者らは、低温プラズマ処置の乳がん細胞株のトランスクリプトームを調べかつ比較する手段として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑを用いるＮＧＳアプローチを使用した。ここで、ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２０ｐで５分間処置し、処置の６時間後に総ＲＮＡ分離向けに細胞を回収し、これに続いて、材料および方法のセクションに記載の、ＤＮＡクリーンアップ、ｒＲＮＡ除去によるＲＮＡ－Ｓｅｑ－ライブラリの調製、ＨｉＳｅｑシーケンシングおよびデータ解析を行った。それぞれモック対照細胞および標的化試料細胞について、合計４５，０３７，５５９および３７，６８３，５１０のリードを配列決定した。モック（対照）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の遺伝子発現を、低温プラズマ処置細胞における発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション向けのベースラインとして使用した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃｖ．０．３６を使用した低品質リードは、ＳＴＡＲアライナーｖ．２．５．２ｂを使用してＥＮＳＥＭＢＬで利用可能なホモ・サピエンス参照ゲノムにマッピングされる。合計９７．８％および９８．２％のリードを、モック試料細胞および処置試料細胞に対してそれぞれマッピングした。エクソン領域内に入るユニークなリードのみをカウントした。ＤＥＳｅｑ２を使用して、試料の群間の差次的発現解析を実施し、調整済みｐ値＜０．０５および絶対ｌｏｇ２倍率変化＞１を有する遺伝子を、各比較について差次的発現遺伝子と呼んだ。合計２５，６７１のｍＲＮＡ遺伝子から、７５がモック対照試料と低温プラズマ処置試料の間で差次的に発現された（４４がアップレギュレーションされ、３５がダウンレギュレーションされた）。少数の遺伝子のみが差次的に発現したので、本発明者ら次に、新たな何らかのパターンが出現したかどうか判定するために、それらの差次的発現レベルに基づいて遺伝子を大別する手作業の方法を探索した。ヒストン遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質、長鎖非コードＲＮＡおよびキナーゼなどのさまざまなクラスの遺伝子のうちでひときわ際立っていた（図１４）。２４のヒストンおよびヒストン関連遺伝子が、モックと比較して低温プラズマ処置試料において差次的に発現された（図１５）。
ＲＮＡシーケンシング技術は、近年、ハイスループットのトランスクリプトーム解析に向けて注目を集めてきたが（Ｗａｎｇ，Ｚ．、Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ：ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ１０、５７～６３頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ２４８４（２００９））、乳がんＲＮＡトランスクリプトミクスの多くの研究が、予後マーカーならびに新規治療標的を有する（Ｅｓｗａｒａｎ，Ｊ．ら Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ２、２６４、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００２６４（２０１２）、Ｈｏｒｖａｔｈ，Ａ．ら Ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ３、２２５６、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０２２５６（２０１３）およびＣｈｅｎ，Ｆ．ら ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｈｏｒｍｏｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ３４、１２９～１３８頁、ｄｏｉ：１０．７５５５／ＪＢＲ．３４．２０１９０１１１（２０２０））。しかし、ＣＡＰ処置後の乳がんＲＮＡトランスクリプトミクスは調査されていなかった。ＣＡＰ誘導性細胞死に関与する潜在的な遺伝子およびメカニズムを明らかにするために、本発明者らは、低温プラズマ処置の乳がん細胞株のトランスクリプトームを調べかつ比較する手段として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑを用いるＮＧＳアプローチを使用した。ここで、ＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２０ｐで５分間処置し、処置の６時間後に総ＲＮＡ分離向けに細胞を回収し、これに続いて、材料および方法のセクションに記載の、ＤＮＡクリーンアップ、ｒＲＮＡ除去によるＲＮＡ－Ｓｅｑ－ライブラリの調製、ＨｉＳｅｑシーケンシングおよびデータ解析を行った。それぞれモック対照細胞および標的化試料細胞について、合計４５，０３７，５５９および３７，６８３，５１０のリードを配列決定した。モック（対照）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の遺伝子発現を、低温プラズマ処置細胞における発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション向けのベースラインとして使用した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃｖ．０．３６を使用した低品質リードは、ＳＴＡＲアライナーｖ．２．５．２ｂを使用してＥＮＳＥＭＢＬで利用可能なホモ・サピエンス参照ゲノムにマッピングされる。合計９７．８％および９８．２％のリードを、モック試料細胞および処置試料細胞に対してそれぞれマッピングした。エクソン領域内に入るユニークなリードのみをカウントした。ＤＥＳｅｑ２を使用して、試料の群間の差次的発現解析を実施し、調整済みｐ値＜０．０５および絶対ｌｏｇ２倍率変化＞１を有する遺伝子を、各比較について差次的発現遺伝子と呼んだ。合計２５，６７１のｍＲＮＡ遺伝子から、７５がモック対照試料と低温プラズマ処置試料の間で差次的に発現された（４４がアップレギュレーションされ、３５がダウンレギュレーションされた）。少数の遺伝子のみが差次的に発現したので、本発明者ら次に、新たな何らかのパターンが出現したかどうか判定するために、それらの差次的発現レベルに基づいて遺伝子を大別する手作業の方法を探索した。ヒストン遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質、長鎖非コードＲＮＡおよびキナーゼなどのさまざまなクラスの遺伝子のうちでひときわ際立っていた（図１４）。２４のヒストンおよびヒストン関連遺伝子が、モックと比較して低温プラズマ処置試料において差次的に発現された（図１５）。
【0058】
低温プラズマ処置群およびモック群におけるヒストン遺伝子の差次的発現をさらに解析するために、本発明者らは、１５のヒストン遺伝子を選択し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用してＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、低温プラズマ処置の０、１、２および３時間後にてのそれらのｍＲＮＡレベルを比較した。これら４つの時点を、低温プラズマ処置後のヒストン遺伝子の初期発現を評価するために任意に選択した。細胞培養実験からの３回反復を、ＮＧＳに使用したものとはまったく異なる別々の３日に分けて調製した。図１６Ａに、ｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した、選択した遺伝子のｍＲＮＡレベルを示す。ｑＲＴ－ＰＣＲが示したところは、ヒストンｍＲＮＡのダウンレギュレーションは低温プラズマ処置後のインキュベーションの最初の１時間ですぐに開始されること、である（図１６Ａ）。１５のヒストンｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、ＮＧＳによって観察された倍率変化よりも数分の一低かった。ダウンレギュレーションされた遺伝子とは、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｃ（０、１、２、および３時間の各群のＡＮＯＶＡ：Ｆ［６，１４］＝４４２．７６、Ｐ＜０．００３Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ（Ｆ［６，１４］＝４８５．５９、Ｐ＜０．００５Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ（Ｆ［６，１４］＝４２５．４１、Ｐ＜０．００５Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＧ（Ｆ［６，１４］＝４６６．４６、Ｐ＜０．００２Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩ（Ｆ［６，１４］＝４０１．４５、Ｐ＜０．００７Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ（Ｆ［６，１４］＝５３０．２１、Ｐ＜０．００１Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ（Ｆ［６，１４］＝１０７５．２、Ｐ＜０．００８Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ（Ｆ［６，１４］＝３７７．５、Ｐ＜０．００１Ｅ－８）、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ（Ｆ［６，１４］＝３６４．２１、Ｐ＜０．００１Ｅ－９）、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ａ（Ｆ［６，１４］＝２１０．２６、Ｐ＜０．００６Ｅ－７）、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ（Ｆ［６，１４］＝３３３．９１、Ｐ＜０．００２Ｅ－８）、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ（Ｆ［６，１４］＝３８２．３４、Ｐ＜０．００１Ｅ－８）、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｈ（Ｆ［６，１４］＝３４５．５２、Ｐ＜０．００２Ｅ－８）、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂ（Ｆ［６，１４］＝３４５．５２、Ｐ＜０．００２Ｅ－８）、ＨＩＳＴ２Ｈ３Ｄ（Ｆ［６，１４］＝１１７．６、Ｐ＜０．００３Ｅ－６）、ＨＩＳＴ４Ｈ４（Ｆ［６，１４］＝４３４．５８、Ｐ＜０．００３４Ｅ－９）。モック対照と比較した、異なる時点にての統計学的解析によるダウンレギュレーションの有意性を図１６Ｂに示した。対照と比較して統計学的有意性を示さなかった唯一のヒストンｍＲＮＡはＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃであるが、一般的な傾向は他のヒストンｍＲＮＡと同様であった。これらのｍＲＮＡを有するものは、０時間群とは違って、１時間群から３時間群の間で統計学的有意性を示さなかった（ｐ＜０．０１）。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＩの各ｍＲＮＡを除いて、他のすべてのヒストンｍＲＮＡは、対照と比較して、インキュベーション０時間時点で全体としてはアップレギュレーションされ、ＨＩＳＴ４Ｈ４（ｐ＜０．０１）およびＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＪ（ｐ＜０．０１）は有意性を示した。興味深いことに、すべてのヒストンｍＲＮＡが１時間のインキュベーション後に低温プラズマ処置群において高度にダウンレギュレーションされており、このことによって、低温プラズマによって誘導されるヒストン関連細胞死の出現に関する明確なメカニズムが示唆される。したがって、ヒストンｍＲＮＡダウンレギュレーションのｑＰＣＲ検証により、本発明者らは、低温プラズマ誘導性細胞死のメカニズムをさらに探索するように促されたのである。
【0059】
低温プラズマ処置によるＲＮＡのインサイツ８－ｏｘｏＧ修飾
最近の研究において、ＣＡＰ生成の活性酸素種および活性窒素種（ＲＯＮＳ）によって、核酸において８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）形成を誘導することが示されている（Ｋｕｒｉｔａ，Ｈ．、Ｈａｒｕｔａ，Ｎ．、Ｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｙ．、Ｓｅｔｏ，Ｔ．＆Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．Ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１５、ｅ０２３２７２４、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２３２７２４（２０２０））。低温プラズマ処置後のＲＮＡ上でのインサイツ８－ｏｘｏＧ修飾を調査するために、本発明者らは、ＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ部位に緊密に結合する、以前に設計した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．Ｃ．ら ＲＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ－ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ１０、１６５４５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－７３３７６－７（２０２０））ヒトリボソームタンパク質Ｓ３（ｈＲｐＳ３）ペプチドプローブ（ＴａＴ－Ｓ３－ペプチド）を、方法のセクションに記載されているように、修飾しかつ生成した。蛍光シグナルを、ＴａＴ－Ｓ３ペプチドでプローブしたまたはプローブしなかったＣＡＰ処置細胞と未処置細胞の間で比較した（ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３、モックＴａＴ－Ｓ３、ＣＡＰ、およびモックの各群のＡＮＯＶＡ：Ｆ［３，４０］）＝５８７．７８、Ｐ＜４．３Ｅ－３３）。ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３群およびモックＴａＴ－Ｓ３群の平均蛍光シグナルは、プローブされていないＣＡＰ群またはモック群と比較して、それぞれ２０４１０％および１７３８％であった（ｔ検定Ｐ＜１．９６Ｅ－１１）。低温プラズマによって細胞死が誘導されたために、モックＴａＴ－Ｓ３対照群と比較してウェル中には低温プラズマ処置細胞がおよそ５０％しか存在しなかったのであるが、ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３群は、モックＴａＴ－Ｓ３群よりも１１７４％高かった（ｔ検定Ｐ＜１．３６Ｅ－１１）。本結果が実証するところは、低温プラズマ処置のＴＮＢＣ細胞の核酸では８－ｏｘｏＧ形成が高頻度で起こったこと、ならびに、ＲＮＡＳｅｑデータおよびｑＲＴ－ＰＣＲ解析で観察されたダウンレギュレーションはヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾に起因すると思われること、である。
最近の研究において、ＣＡＰ生成の活性酸素種および活性窒素種（ＲＯＮＳ）によって、核酸において８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）形成を誘導することが示されている（Ｋｕｒｉｔａ，Ｈ．、Ｈａｒｕｔａ，Ｎ．、Ｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｙ．、Ｓｅｔｏ，Ｔ．＆Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．Ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１５、ｅ０２３２７２４、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２３２７２４（２０２０））。低温プラズマ処置後のＲＮＡ上でのインサイツ８－ｏｘｏＧ修飾を調査するために、本発明者らは、ＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ部位に緊密に結合する、以前に設計した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｒｉｖｅｒａ，Ｊ．Ｃ．ら ＲＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ－ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ１０、１６５４５、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２０－７３３７６－７（２０２０））ヒトリボソームタンパク質Ｓ３（ｈＲｐＳ３）ペプチドプローブ（ＴａＴ－Ｓ３－ペプチド）を、方法のセクションに記載されているように、修飾しかつ生成した。蛍光シグナルを、ＴａＴ－Ｓ３ペプチドでプローブしたまたはプローブしなかったＣＡＰ処置細胞と未処置細胞の間で比較した（ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３、モックＴａＴ－Ｓ３、ＣＡＰ、およびモックの各群のＡＮＯＶＡ：Ｆ［３，４０］）＝５８７．７８、Ｐ＜４．３Ｅ－３３）。ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３群およびモックＴａＴ－Ｓ３群の平均蛍光シグナルは、プローブされていないＣＡＰ群またはモック群と比較して、それぞれ２０４１０％および１７３８％であった（ｔ検定Ｐ＜１．９６Ｅ－１１）。低温プラズマによって細胞死が誘導されたために、モックＴａＴ－Ｓ３対照群と比較してウェル中には低温プラズマ処置細胞がおよそ５０％しか存在しなかったのであるが、ＣＡＰ－ＴａＴ－Ｓ３群は、モックＴａＴ－Ｓ３群よりも１１７４％高かった（ｔ検定Ｐ＜１．３６Ｅ－１１）。本結果が実証するところは、低温プラズマ処置のＴＮＢＣ細胞の核酸では８－ｏｘｏＧ形成が高頻度で起こったこと、ならびに、ＲＮＡＳｅｑデータおよびｑＲＴ－ＰＣＲ解析で観察されたダウンレギュレーションはヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾に起因すると思われること、である。
【0060】
低温プラズマ処置後にヒストンＲＮＡが８－ｏｘｏＧ修飾される
本発明者らが核酸の８－ｏｘｏＧ修飾が高い割合で形成されることを発見した後、ＣＡＰ誘導後のヒストンＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ形成を調査することが賢明であった。Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺ）、ｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１）、ＣＡＰ Ｚｅｒｏ（ＣＰ０）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１）の各群からの総ＲＮＡの一部をインプット（それぞれＭＺＩＮ、Ｍ１ＩＮ、ＣＰ０ＩＮ、およびＣＰ１ＩＮ）として使用し、その総ＲＮＡの第２の部分を使用して、抗８－ｏｘｏＧ抗体を用いた免疫沈降を介して８－ｏｘｏＧ含有転写産物（それぞれＭＺＩＰ、Ｍ１ＩＰ、ＣＰ０ＩＰ、およびＣＰ１ＩＰ）を単離した。これらの試料を、１６のヒストン遺伝子の第１の鎖合成およびｑＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した（図１８Ａ）。ＣＰ０ＩＰ群およびＣＰ１ＩＰ群の試料は、ＭＺＩＰ群およびＭ１ＩＰ群と比較して、１６のヒストン遺伝子すべてに関して有意により高い量を有した。本発明者らは、群間の有意性を見つけるために、適宜ボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を実施した（図１８Ｂ）。ｑＲＴ－ＰＣＲによって解析されたすべてのヒストン遺伝子のうちで、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＰ、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＰ、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＮ、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＮおよびＣＰ０ＩＰ 対 ＣＰ１ＩＰの各群間に、有意な（Ｐ＜０．０１）ｍＲＮＡ増幅の差異があった、ただし、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＰ間のＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ（Ｐ＜０．０１４）、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＮ間のＨＩＳＴ４Ｈ４（Ｐ＜０．０１２）、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＮ間のＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ（それぞれＰ＜０．０６５；０．０８；０．０９）を除くが、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯについては他のヒストンと違ってＣＰ０ＩＰ 対 ＣＰ１ＩＰの間では有意であったのだが（それぞれＰ＜０．０００９；０．００３；０．００５）、しかし、そのような遺伝子の傾向は、有意である他の遺伝子と同様であった。本発明者らは、ＣＰ０ＩＮ群およびＣＰ１ＩＮ群と比較した、ＣＰ０ＩＰおよびＣＰ１ＩＰにおけるヒストンＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ修飾のパーセンテージを定量化した（図１９）。８－ｏｘｏＧ修飾イベントは、解析したすべてのヒストン遺伝子において、ＣＰ０ＩＮ群およびＣＰ１ＩＮ群と比較して、ＣＰ０ＩＰおよびＣＰ１ＩＰにおいて有意により高かった（Ｐ＜０．００１）。まとめると、本発明者らのデータは、低温プラズマ処置のＴＮＢＣ細胞におけるこれら１６のヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ酸化修飾の証拠を提供する。重要なことに、ヒストンｍＲＮＡの負の倍率変化（図１６）は、転写レベルにての調節というよりはむしろヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾および分解に起因するものである。
本発明者らが核酸の８－ｏｘｏＧ修飾が高い割合で形成されることを発見した後、ＣＡＰ誘導後のヒストンＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ形成を調査することが賢明であった。Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺ）、ｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１）、ＣＡＰ Ｚｅｒｏ（ＣＰ０）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１）の各群からの総ＲＮＡの一部をインプット（それぞれＭＺＩＮ、Ｍ１ＩＮ、ＣＰ０ＩＮ、およびＣＰ１ＩＮ）として使用し、その総ＲＮＡの第２の部分を使用して、抗８－ｏｘｏＧ抗体を用いた免疫沈降を介して８－ｏｘｏＧ含有転写産物（それぞれＭＺＩＰ、Ｍ１ＩＰ、ＣＰ０ＩＰ、およびＣＰ１ＩＰ）を単離した。これらの試料を、１６のヒストン遺伝子の第１の鎖合成およびｑＲＴ－ＰＣＲ解析に使用した（図１８Ａ）。ＣＰ０ＩＰ群およびＣＰ１ＩＰ群の試料は、ＭＺＩＰ群およびＭ１ＩＰ群と比較して、１６のヒストン遺伝子すべてに関して有意により高い量を有した。本発明者らは、群間の有意性を見つけるために、適宜ボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を実施した（図１８Ｂ）。ｑＲＴ－ＰＣＲによって解析されたすべてのヒストン遺伝子のうちで、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＰ、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＰ、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＮ、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＮおよびＣＰ０ＩＰ 対 ＣＰ１ＩＰの各群間に、有意な（Ｐ＜０．０１）ｍＲＮＡ増幅の差異があった、ただし、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＰ間のＨＩＳＴ１Ｈ３Ｃ（Ｐ＜０．０１４）、ＣＰ０ＩＰ 対 ＭＺＩＮ間のＨＩＳＴ４Ｈ４（Ｐ＜０．０１２）、ＣＰ１ＩＰ 対 Ｍ１ＩＮ間のＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯ（それぞれＰ＜０．０６５；０．０８；０．０９）を除くが、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯについては他のヒストンと違ってＣＰ０ＩＰ 対 ＣＰ１ＩＰの間では有意であったのだが（それぞれＰ＜０．０００９；０．００３；０．００５）、しかし、そのような遺伝子の傾向は、有意である他の遺伝子と同様であった。本発明者らは、ＣＰ０ＩＮ群およびＣＰ１ＩＮ群と比較した、ＣＰ０ＩＰおよびＣＰ１ＩＰにおけるヒストンＲＮＡ上の８－ｏｘｏＧ修飾のパーセンテージを定量化した（図１９）。８－ｏｘｏＧ修飾イベントは、解析したすべてのヒストン遺伝子において、ＣＰ０ＩＮ群およびＣＰ１ＩＮ群と比較して、ＣＰ０ＩＰおよびＣＰ１ＩＰにおいて有意により高かった（Ｐ＜０．００１）。まとめると、本発明者らのデータは、低温プラズマ処置のＴＮＢＣ細胞におけるこれら１６のヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ酸化修飾の証拠を提供する。重要なことに、ヒストンｍＲＮＡの負の倍率変化（図１６）は、転写レベルにての調節というよりはむしろヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ修飾および分解に起因するものである。
【0061】
低温プラズマによって誘導されるＤＮＡ損傷はＲＮＡの酸化の後に起こる
ＣＡＰ処置によって誘導される細胞死への主たる寄与体のメカニズムを理解するために、ＴＮＢＣ細胞を前述の条件で処置し、３、６、１２および２４時間インキュベートし、これ続いて総ＲＮＡを分離し、第１の鎖を合成した。以下のＤＮＡ損傷応答遺伝子の発現をモック群と比較してｑＲＴ－ＰＣＲにより定量化した（図２０）：活性化転写因子３（ＡＴＦ３）遺伝子（Ｙａｎ，Ｃ．、Ｌｕ，Ｄ．、Ｈａｉ，Ｔ．＆Ｂｏｙｄ，Ｄ．Ｄ．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３，ａ ｓｔｒｅｓｓ ｓｅｎｓｏｒ，ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐ５３ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｉｔｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ２４、２４２５～２４３５頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７１２（２００５））、サイクリンＥ１遺伝子（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｌｌｏｂｅｔ，Ｓ．ら Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．ＮＰＪ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ６、４０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５２３－０２０－００１８１－ｗ（２０２０））、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）遺伝子（Ｋｒｏｎｅｓ－Ｈｅｒｚｉｇ，Ａ．ら Ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５、５１３３～５１４３頁、ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０４－３７４２（２００５））、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ２（ＩＤ２）遺伝子およびプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）遺伝子。これらはＤＮＡ損傷の初期レスポンダであり、本発明者らは、１２時間のインキュベーション後になって初めて２倍超の増加で、ＡＴＦ３、ＥＧＲ１およびＩＤ２の各遺伝子転写産物が有意にアップレギュレーションされること（Ｐ＜０．０５）、を見いだした。ＣＣＮＥ１およびＰＴＧＳ２は、モック対照と比較して、いずれの時点でも有意なアップレギュレーションを示さなかった。本結果が示すところは、ＤＮＡ損傷がＴＮＢＣ細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の主因ではないこと、である。
ＣＡＰ処置によって誘導される細胞死への主たる寄与体のメカニズムを理解するために、ＴＮＢＣ細胞を前述の条件で処置し、３、６、１２および２４時間インキュベートし、これ続いて総ＲＮＡを分離し、第１の鎖を合成した。以下のＤＮＡ損傷応答遺伝子の発現をモック群と比較してｑＲＴ－ＰＣＲにより定量化した（図２０）：活性化転写因子３（ＡＴＦ３）遺伝子（Ｙａｎ，Ｃ．、Ｌｕ，Ｄ．、Ｈａｉ，Ｔ．＆Ｂｏｙｄ，Ｄ．Ｄ．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３，ａ ｓｔｒｅｓｓ ｓｅｎｓｏｒ，ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐ５３ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｉｔｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ２４、２４２５～２４３５頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００７１２（２００５））、サイクリンＥ１遺伝子（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ Ｌｌｏｂｅｔ，Ｓ．ら Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．ＮＰＪ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ６、４０、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５２３－０２０－００１８１－ｗ（２０２０））、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）遺伝子（Ｋｒｏｎｅｓ－Ｈｅｒｚｉｇ，Ａ．ら Ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ １ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｖｉａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ６５、５１３３～５１４３頁、ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０４－３７４２（２００５））、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ２（ＩＤ２）遺伝子およびプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（ＰＴＧＳ２）遺伝子。これらはＤＮＡ損傷の初期レスポンダであり、本発明者らは、１２時間のインキュベーション後になって初めて２倍超の増加で、ＡＴＦ３、ＥＧＲ１およびＩＤ２の各遺伝子転写産物が有意にアップレギュレーションされること（Ｐ＜０．０５）、を見いだした。ＣＣＮＥ１およびＰＴＧＳ２は、モック対照と比較して、いずれの時点でも有意なアップレギュレーションを示さなかった。本結果が示すところは、ＤＮＡ損傷がＴＮＢＣ細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の主因ではないこと、である。
【0062】
考察
過去数十年において、さまざまなＣＡＰ装置を使用して多様な腫瘍細胞タイプに関する研究が公開されてきた。ＣＣＰＣＳは、ＴＮＢＣを始めとするいくつかのがんに対する有望な抗がんの処置法としてこれまでに実証されてきた（Ｒｏｗｅ，Ｗ．ら Ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓｃａｌｐｅｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｄｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｐｌａｓｍａ１、１７７～１８８頁、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｌａｓｍａ１０１００１６（２０１８）およびＣｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｌａｓｍａ１、２１８～２２８頁、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｌａｓｍａ１０１００１９（２０１８））。各種の乳腺腫瘍細胞株の分子的特徴および対応する腫瘍サブタイプは、同じサブタイプの腫瘍のモデルとして実施可能である（Ｄａｉ，Ｘ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、Ｂａｉ，Ｚ．＆Ｌｉ，Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ８、３１３１～３１４１頁、ｄｏｉ：１０．７１５０／ｊｃａ．１８４５７（２０１７））。Ｋｉ－６７発現、アポトーシスの進行、および細胞周期をモニタリングすることを介して低温プラズマを使用して、分子サブタイプに基づいて乳がん細胞株に対するＣＡＰの投与量依存性のアポトーシス効果を解析するのは、本発明者らが初めてである。Ｋｉ－６７発現は、乳がん患者における乳がんの分子サブタイプに応じた独立した予後パラメータである（Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｎ．Ａ．＆Ｙｕｓｓｉｆ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉ－６７ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１３、４９６～５０４頁、ｄｏｉ：１０．２０８９２／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３９４１．２０１６．００６６（２０１６））。Ｓｏｌｉｍａｎらは、Ｋｉ－６７発現が１５％よりも高い患者は転移および再発に関しより高い発生率を呈すること（ｐ＝０．０００）（Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｎ．Ａ．＆Ｙｕｓｓｉｆ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉ－６７ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１３、４９６～５０４頁、ｄｏｉ：１０．２０８９２／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３９４１．２０１６．００６６（２０１６））およびＫｉ６７の低下により、無病生存期間と全生存期間が有意に改善されること、を報告した。分子レベルで、Ｋｉ－６７の発現、局在および翻訳後修飾が細胞周期によって調節され（Ｅｎｄｌ，Ｅ．＆Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉ－６７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｉｎｃｉｄｅ Ｗｉｔｈ Ｔｗｏ Ｍａｊｏｒ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１８２、３７１～３８０頁（２０００））、初期Ｇ１期過程で、Ｋｉ－６７抗原は、Ｓ期およびＧ２期の核小体の位置とは異なり核質中に位置し７４、非がん性細胞とがん性細胞では異なって調節され（Ｃｈｉｅｒｉｃｏ，Ｌ．ら Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ Ｋｉ－６７ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１２、ｅ０１７１８１５（２０１７））、このことにより、がん細胞に対するＣＡＰ選択性のメカニズムに関する洞察がもたらされる。４種の乳がんサブタイプについてＫｉ－６７発現に関する本発明者らのデータが指示するところは、投与量がわずかに異なるという条件での低温プラズマによるＫｉ－６７のダウンレギュレーション、である。
過去数十年において、さまざまなＣＡＰ装置を使用して多様な腫瘍細胞タイプに関する研究が公開されてきた。ＣＣＰＣＳは、ＴＮＢＣを始めとするいくつかのがんに対する有望な抗がんの処置法としてこれまでに実証されてきた（Ｒｏｗｅ，Ｗ．ら Ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｓｃａｌｐｅｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ Ｄｏｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｐｌａｓｍａ１、１７７～１８８頁、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｌａｓｍａ１０１００１６（２０１８）およびＣｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｌａｓｍａ１、２１８～２２８頁、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｌａｓｍａ１０１００１９（２０１８））。各種の乳腺腫瘍細胞株の分子的特徴および対応する腫瘍サブタイプは、同じサブタイプの腫瘍のモデルとして実施可能である（Ｄａｉ，Ｘ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．、Ｂａｉ，Ｚ．＆Ｌｉ，Ｊ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ８、３１３１～３１４１頁、ｄｏｉ：１０．７１５０／ｊｃａ．１８４５７（２０１７））。Ｋｉ－６７発現、アポトーシスの進行、および細胞周期をモニタリングすることを介して低温プラズマを使用して、分子サブタイプに基づいて乳がん細胞株に対するＣＡＰの投与量依存性のアポトーシス効果を解析するのは、本発明者らが初めてである。Ｋｉ－６７発現は、乳がん患者における乳がんの分子サブタイプに応じた独立した予後パラメータである（Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｎ．Ａ．＆Ｙｕｓｓｉｆ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉ－６７ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１３、４９６～５０４頁、ｄｏｉ：１０．２０８９２／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３９４１．２０１６．００６６（２０１６））。Ｓｏｌｉｍａｎらは、Ｋｉ－６７発現が１５％よりも高い患者は転移および再発に関しより高い発生率を呈すること（ｐ＝０．０００）（Ｓｏｌｉｍａｎ，Ｎ．Ａ．＆Ｙｕｓｓｉｆ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉ－６７ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ１３、４９６～５０４頁、ｄｏｉ：１０．２０８９２／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－３９４１．２０１６．００６６（２０１６））およびＫｉ６７の低下により、無病生存期間と全生存期間が有意に改善されること、を報告した。分子レベルで、Ｋｉ－６７の発現、局在および翻訳後修飾が細胞周期によって調節され（Ｅｎｄｌ，Ｅ．＆Ｇｅｒｄｅｓ，Ｊ．Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｉ－６７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｉｎｃｉｄｅ Ｗｉｔｈ Ｔｗｏ Ｍａｊｏｒ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｍｉｔｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１８２、３７１～３８０頁（２０００））、初期Ｇ１期過程で、Ｋｉ－６７抗原は、Ｓ期およびＧ２期の核小体の位置とは異なり核質中に位置し７４、非がん性細胞とがん性細胞では異なって調節され（Ｃｈｉｅｒｉｃｏ，Ｌ．ら Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｔｈｗａｙ ｏｎ Ｋｉ－６７ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎ－ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１２、ｅ０１７１８１５（２０１７））、このことにより、がん細胞に対するＣＡＰ選択性のメカニズムに関する洞察がもたらされる。４種の乳がんサブタイプについてＫｉ－６７発現に関する本発明者らのデータが指示するところは、投与量がわずかに異なるという条件での低温プラズマによるＫｉ－６７のダウンレギュレーション、である。
【0063】
ＨＲ＋、ＴＮＢＣ、およびＨＥＲ２＋を始めとする３種の乳癌サブタイプにわたる転移の分子経路については、プロテオミクスアプローチを使用して研究されてきたが（Ｎｅｇｒｏ，Ｇ．ら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ．Ｒａｄｉｏｌ Ｏｎｃｏｌ５４、１０３～１１８頁（２０２０））、このことが示唆するところは、ＨＲ＋乳がんはＴＮＢＣ細胞と類似点を共有したが、一方、ＨＥＲ２＋細胞によりこの分子表現型が特異的に変化され、転移能が最も高いという結果となったこと、である。低温プラズマ処置によるアポトーシス誘導は用量依存性であり、このことについて乳がん細胞株の各分子サブタイプごとにフローサイトメトリーによっておよびＩｎｃｕＣｙｔｅによって定量的かつ視覚的にアッセイした。アポトーシスは、低温プラズマのより高い処置出力および時間で処置した細胞においてより早期に見られた。先に、Ｐａｒｋらは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＴＮ）は、低温プラズマ処置を行うと、ＭＣＦ－７（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－）細胞よりもアポトーシスが高率で起こり、増殖速度の低下が起こることを報告したが（Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｂ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ ｏｎ ＭＣＦ－７ ａｎｄ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ１０、ｅ０１２９９３１（２０１５））、このことは、本発明者らの発見と一致する。加えて、低温プラズマ処置に対して、ＨＥＲ２＋細胞株はより敏感な応答を示したが、一方、ＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）は最も耐性であった。細胞周期データの時間的進行が実証するところは、Ｇ１期の細胞数が低温プラズマ処置後の最初の８時間以内に急速に低下したこと、しかし、この期間過程のＧ１－Ｓ移行期またはＳ／Ｇ２／Ｍ期の増大は、存在する場合、はるかにより小さかったことであり、以上のことによって、Ｇ１期からＳ／Ｇ２／Ｍ期への移行が低温プラズマによって妨害されたこと、が示唆される。
【0064】
低温大気圧プラズマおよびその抗がん効果については、過去２０年間にわたって繰り返し報告されてきた。しかし、正常細胞よりもむしろ悪性細胞において細胞死を誘導するＣＡＰのメカニズムについてはまだ確立されていなかった。いくつかの研究によって、さまざまながんタイプに対するＣＡＰ処置によるＨ２ＡＸのリン酸化が報告されてきたが、その結果、プラズマ発生のＲＯＳがＤＮＡ損傷を誘導すると結論された（Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ－ｄａｍａｇｅ－ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｓｕｂ－Ｇ（１） ａｒｒｅｓｔ ｖｉａ ｔｈｅ ＡＴＭ／ｐ５３ ｐａｔｈｗａｙ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ５４５、１３３～１４０頁（２０１４）、Ｋａｕｓｈｉｋ，Ｎ．ら Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＭＥＭ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＯＳ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５、８５８７（２０１５）、Ｊｕｄｅｅ，Ｆ．ら Ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｐｌａｓｍａ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｍｅｄｉａ ｏｎ ３Ｄ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ６、２１４２１（２０１６）およびＳａｇｗａｌ，Ｓ．Ｋ．、Ｐａｓｑｕａｌ－Ｍｅｌｏ，Ｇ．、Ｂｏｄｎａｒ，Ｙ．、Ｇａｎｄｈｉｒａｊａｎ，Ｒ．Ｋ．＆Ｂｅｋｅｓｃｈｕｓ，Ｓ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｌａｓｍａ ｅｌｉｃｉｔｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｖｉａ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＬＣ２２Ａ１６．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ９、１１７９（２０１８））。近年、ＤＮＡ損傷はＣＡＰ誘導性細胞死の原因というよりはむしろ帰結であることが、Ｂｅｋｅｓｃｈｕｓらによって論じられた（Ｂｅｋｅｓｃｈｕｓ，Ｓ．ら Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｈ２ＡＸ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｋＩＮＰｅｎ Ｐｌａｓｍａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｉｓ Ｎｏｔ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＲＯＳ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ｂｕｔ Ｉｓ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ２０１９、８５３５１６３、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１９／８５３５１６３（２０１９））。本発明者らのデータは、対照群と比較したＣＡＰ処置細胞におけるヒストンＲＮＡ転写物の酸化濃縮を実証することにより、その発見と一致する。ＲＮＡの酸化により多くの転写物の発現レベルが変更するが、このようなことはクロマチン修飾およびＤＮＡ損傷応答に関与する転写物に対して特に顕著であった。本発明者らのデータが示したところは、ＤＮＡ損傷の初期応答遺伝子ＡＴＦ３（Ｚｈａｏ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｇｕｏ，Ｍ．、Ｙｕ，Ｊ．＆Ｙａｎ，Ｃ．Ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＡＴＦ３ ｂｉｎｄｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｉｔｅｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｗｉｔｈ ｐ３００ ａｎｄ Ｈ３Ｋ２７ａｃ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１７、３３５（２０１６））、ＥＧＲ１（Ｓｔｕａｒｔ，Ｊ．Ｒ．、Ｋａｗａｉ，Ｈ．、Ｔｓａｉ，Ｋ．Ｋ．、Ｃｈｕａｎｇ，Ｅ．Ｙ．＆Ｙｕａｎ，Ｚ．Ｍ．ｃ－Ａｂｌ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＥＧＲ１） ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２４、８０８５～８０９２頁（２００５））、およびＩＤ２（Ｆａｎ，Ｙ．ら ＩＤ２ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｄａｍａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐ－ＥＲＫ１／２／ＩＤ２／ＮＲＦ２．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ６５０、１～１３頁（２０１８））の転写活性化が、ＤＮＡ損傷の応答遺伝子の後期応答である、ＣＡＰ処置の１２時間後にて初めて起こること、である。これらの観察された変更は、アポトーシスおよび壊死の帰結というよりはむしろ細胞応答を示すものと考えられた。
【0065】
さらに、アポトーシス活性が誘導された場合、低温プラズマ処置後の細胞周期解析によって、強力な低温プラズマ投与量では、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期にある細胞の数はより高い状況で、Ｇ１にての細胞数が有意に低下することが明らかとなったが、このことが暗示して実証するところは、細胞周期のＳ期が進行するのに必要な機構および成分が損なわれているかまたは利用できないことである（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．ら Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｓ ｐｈａｓｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ／ｃｄｋ２ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ２２、７４５９～７４７２頁（２００２））。低温プラズマ処置がＲＮＡ分子に特異的な８－ｏｘｏＧ修飾を誘導する能力、および次いでこれらの修飾ヒストン転写産物とその関連経路の安定性を損なう能力は、低温プラズマ処置の有害効果およびアポトーシス効果に関する新規なメカニズムである可能性を意味する。ＲＮＡの酸化がクロマチンの不安定化および細胞死に関与する可能性があることを示唆する証左が増えつつある（Ｌｉ，Ｚ．ら Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲＮＡ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ７、１８４（２０２０）およびＬｉｕ，Ｔ．ら Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ ５３、９１０～９２１頁（２０１９））。主として、研究は、ＲＮＡの酸化および酸化ストレス、ならびに神経障害への変性に焦点を当ててきたが（Ｌｉｇｕｏｒｉ，Ｉ．ら Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ，ａｇｉｎｇ，ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ａｇｉｎｇ １３、７５７～７７２（２０１８）およびＮｕｎｏｍｕｒａ，Ａ．、Ｌｅｅ，Ｈ．Ｇ．、Ｚｈｕ，Ｘ．＆Ｐｅｒｒｙ，Ｇ．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＲＮＡ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｒａｔｅ ａｎｄ ｆｉｄｅｌｉｔｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ４５、１０５３～１０６６頁（２０１７））、本発明者らは、初めて、ＲＮＡ酸化ががん細胞における低温プラズマ誘導性細胞死の主因であることを報告するものである。研究では、８－ｏｘｏＧはアデノシンと塩基対を形成する可能性があること、したがって、ｍＲＮＡの酸化によりアミノ酸の点突然変異を導入することができること、が示されてきたが（Ｓｉｍｍｓ，Ｃ．Ｌ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｂ．Ｈ．、Ｍｏｓｉｏｒ，Ｊ．Ｗ．、Ｒａｎｇｗａｌａ，Ａ．Ｓ．＆Ｚａｈｅｒ，Ｈ．Ｓ．Ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｔｅ ｏｆ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｍＲＮＡ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ９、１２５６～１２６４頁（２０１４）およびＴａｎａｋａ，Ｍ．、Ｃｈｏｃｋ，Ｐ．Ｂ．＆Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｒｒｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４、６６～７１頁（２００７））、このことによって、翻訳のエラーおよびタンパク質の不安定化がもたらされる。文献では、８－ｏｘｏＧ ＲＮＡの酸化およびＲＮＡの安定性についても論じられた（Ｂｏｏ，Ｓ．Ｈ．＆Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ． Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ５２、４００～４０８頁（２０２０））。ＲＮＡＳｅｑデータでは、ヒストンｍＲＮＡが主に差次的に発現されることが示され（図１４および１５）、ｑＲＴ－ＰＣＲ定量化（図１６～１９）では、ヒストンｍＲＮＡの８－ｏｘｏＧ ＲＮＡ修飾はまたその分解をもたらすことが示唆される。ヒストンＨ２ＡおよびＨ２Ｂは、ＤＮＡをヌクレオソームにパッケージングする際のキーとなるタンパク質であり（Ｗｙｒｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．＆Ｐａｒｒａ，Ｍ．Ａ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ａｎｄ Ｈ２Ｂ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９、３７～４４頁（２００９））、ヒストンＨ２ＡおよびＨ２Ｂは、複製依存性および細胞周期調節性であり、その結果、ＤＮＡ複製過程でＳ期において１５～３５倍増加する（Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ｅ．ら Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｔｗｏ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｔｅｐｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ１１、２４１６～２４２４頁、ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍｃｂ．１１．５．２４１６（１９９１）およびＨｅｉｎｔｚ，Ｎ．、Ｓｉｖｅ，Ｈ．Ｌ．＆Ｒｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｌｆ－ｌｉｖｅｓ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ＨｅＬａ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ３、５３９～５５０頁（１９８３））。ヒストン遺伝子の転写が細胞周期のＳ期過程で厳密に調節されていることを考慮すると、ＲＮＡ分解または不安定なタンパク質によるヒストンの任意の変更はクロマチンの安定性および細胞生存に有害であると思われる。この現象は、正常細胞というよりはむしろ急速に増殖しているがん細胞に対する低温プラズマ処置の選択性において重要な役割を果たす。
【0066】
さらに、このような側面があるので、１００％除去を達成するには乳がん細胞株サブタイプにとってわずかに異なる出力または時間の設定が必要であった。例えば、急速に増殖するＴＮＢＣ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、比較的遅いペースのＢＴ－４７４（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２＋）細胞と比較して、より短時間の低温プラズマ処置を必要とする。さらに、ヒストンＨ２ＡおよびＨ２Ｂのバリアントの発現レベルは、乳がん細胞株のサブタイプのうちで変動することが示されてきた。この発現レベルは、薬剤耐性のメディエーターであったが（Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．ら Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ａｎｄ Ｈ２Ｂ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１８、１６（２０１６））、ヒストンｍＲＮＡにおけるこの変動はまた、セットアップのためには低温プラズマの出力および処置時間がさまざまであることにつながるとも思える。本発明者らは以下のように考える：低温プラズマ誘導性８－ｏｘｏＧ ＲＮＡ修飾は転写物に対してまったく選択性ではないが、ヒストンＲＮＡの細胞周期依存性の厳密な転写調節によって、低温プラズマ処置が、正常細胞というよりはむしろ急速に増殖しているがん細胞に対して特異的致死性なものとなるが、正常細胞においては、他の遺伝子ＲＮＡ転写物は、細胞周期依存性ではなくかつ遅滞することなく補充することが可能であることから、低温プラズマ侵襲を無事に切り抜けることが可能である。さらに、正常な分裂細胞では、ヒストンｍＲＮＡの半減期およびその分解は、Ｓ期の終了時にまたはＤＮＡ複製が阻害される場合に密接に調節される（Ｍａｒｚｌｕｆｆ，Ｗ．Ｆ．＆Ｋｏｒｅｓｋｉ，Ｋ．Ｐ．Ｂｉｒｔｈ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｎｅ ｍＲＮＡｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ３３、７４５～７５９頁（２０１７））。低温プラズマ処置がゲノムＤＮＡにおいて８－ｏｘｏＧ ＲＮＡ修飾および鎖切断を誘導することを考慮すると（Ｋｕｒｉｔａ，Ｈ．、Ｈａｒｕｔａ，Ｎ．、Ｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｙ．、Ｓｅｔｏ，Ｔ．＆Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．Ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｌｄ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｐｌａｓｍａ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １５、ｅ０２３２７２４（２０２０）およびＢｅｋｅｓｃｈｕｓ，Ｓら Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｈ２ＡＸ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｋＩＮＰｅｎ Ｐｌａｓｍａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｉｓ Ｎｏｔ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＲＯＳ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ｂｕｔ Ｉｓ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｏｘｉｄ Ｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｌｏｎｇｅｖ ２０１９、８５３５１６３（２０１９））、ＤＮＡ複製の停止が起こり、これによってヒストンｍＲＮＡの分解がさらに顕著となる可能性がある。
【0067】
本研究で本発明者らが解析したヒストンｍＲＮＡ（ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ（Ｚｈｏｎｇ，Ｂ．Ｌ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ２０、６６４～６７２頁（２０１６）））は、ヒストンｍＲＮＡがクロマチン構造内に有意に濃縮されていた乳がん組織においておよび結腸直腸がん（ＣＲＣ）においてアップレギュレーションされることが示されてきた（Ｓａｌｅｈ，Ｒ．ら Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｖｅｒｓｕｓ ｅａｒｌｙ－ｓｔａｇｅ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ ８、ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｉｔｃ－２０２０－００１２９４（２０２０））。ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＣ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦおよびＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＯは、乳がん細胞で過剰発現され、この細胞の増殖を高めるためにヌクレオソーム構造の安定性に寄与し（Ｐａｒｓｓｉｎｅｎ，Ｊ．ら Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｆｔｅｒ ＰＰＭ１Ｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ２５９、６１～７０頁（２００８））、かつ、ＢＣＬ２発現のアップレギュレーションを媒介して細胞増殖も刺激すること（Ｓｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｔｚｅｎｇ，Ｔ．Ｙ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．＆Ｈｓｕ，Ｍ．Ｔ．Ａｎ Ｈ２Ａ ｈｉｓｔｏｎｅ ｉｓｏｔｙｐｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ｍｅｄｉａｔｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｐｒｏｍｏｔｅｒ－３’－ＵＴＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ４２、３０７３～３０８８頁（２０１４））、が示されている。研究では、ヒトＴＮＢＣ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の化学療法耐性がヒストン調節、特にＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫのアップレギュレーション（Ｈａｎ，Ｊ．ら Ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．Ｊ Ｏｎｃｏｌ２０１９、１３４５０２６、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１９／１３４５０２６（２０１９））、ＨＩＳＴ１Ｈ３ＣおよびＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢのアップレギュレーション（Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｚ．ら ＰＰＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｍａｙ ｂｅ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ７０、６３７～６４４頁（２０１２））によるものであったこと、も示されてきた。本研究で本発明者らが解析したすべてのヒストンＲＮＡは、がんの発生および進行の一因となるバリアントを有することが示されてきた（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｆ．Ｌ．ら Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｏｆ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ５、３４２８～３４４３頁、ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２００７（２０１４））。がん細胞の高い増殖速度には首尾一貫したヒストン調節が必要であり、どんな欠陥でもクロマチンの不安定性および細胞死をもたらすことになるであろう。まとめると、本発明者らのデータによって、低温プラズマ誘導性細胞死の主因としてヒストンｍＲＮＡにおける酸化的修飾に関する証拠が提供される。
【0068】
結論
本研究では、本発明者らが報告するところは、低温プラズマがすべての乳がんサブタイプ向けの効果的な処置法であり、必要な投与量は受容体の状態に基づいて最適化することができる。低温プラズマ誘導性細胞死が、細胞周期のＳ期初期における、ヒストンＲＮＡの８－ｏｘｏＧ ＲＮＡ酸化、これに続く分解およびクロマチン不安定化によるものであることを示すのは、本発明者らが初めてである。本メカニズムは、正常組織に損傷を与えることなくがん細胞の細胞死を選択的に誘導する低温プラズマ療法におけるキーとなる差別化要因である。本発明者らの研究に基づき、乳がんおよびその他のがん向けの治療用の発明を進歩させることに向かって、本メカニズムをより正確に標的とするように条件および基準を改善することができる可能性がある。
本研究では、本発明者らが報告するところは、低温プラズマがすべての乳がんサブタイプ向けの効果的な処置法であり、必要な投与量は受容体の状態に基づいて最適化することができる。低温プラズマ誘導性細胞死が、細胞周期のＳ期初期における、ヒストンＲＮＡの８－ｏｘｏＧ ＲＮＡ酸化、これに続く分解およびクロマチン不安定化によるものであることを示すのは、本発明者らが初めてである。本メカニズムは、正常組織に損傷を与えることなくがん細胞の細胞死を選択的に誘導する低温プラズマ療法におけるキーとなる差別化要因である。本発明者らの研究に基づき、乳がんおよびその他のがん向けの治療用の発明を進歩させることに向かって、本メカニズムをより正確に標的とするように条件および基準を改善することができる可能性がある。
【0069】
方法および材料
低温プラズマ装置
ＣＡＰは、Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ（商標）によって発生させたが、これは、本発明者らの以前の刊行物（Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｌａｓｍａ１、２１８～２２８頁（２０１８））で報告したものである。ＣＣＰＣＳパラメータは以下のように設定した：３Ｌ／分にてのヘリウム流量；８０ｐ（１５．７Ｗ）、１００ｐ（２２．３Ｗ）、および１２０ｐ（２８．７Ｗ）にての出力設定。
低温プラズマ装置
ＣＡＰは、Ｃａｎａｄｙ Ｈｅｌｉｏｓ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ（商標）によって発生させたが、これは、本発明者らの以前の刊行物（Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ら Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｙ Ｃｏｌｄ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｐｌａｓｍａ１、２１８～２２８頁（２０１８））で報告したものである。ＣＣＰＣＳパラメータは以下のように設定した：３Ｌ／分にてのヘリウム流量；８０ｐ（１５．７Ｗ）、１００ｐ（２２．３Ｗ）、および１２０ｐ（２８．７Ｗ）にての出力設定。
【0070】
細胞培養および生存率アッセイ
細胞培養。ヒト乳管癌ＢＴ－４７４および乳腺癌ＳＫ－ＢＲ－３はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）から購入し、提供されたプロトコールに従って培養した。ヒト腺癌細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、Ｈｏｗａｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫａｎａａｎ教授の研究室により好意で寄贈されたものである。ＳＫ－ＢＲ－３をマッコイ５Ａで培養し、ＢＴ－４７４、ＭＣＦ－７、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）および１％Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｃａｔ．＃１５１４０１６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。すべての細胞株は、３７℃および５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）で培養した。概８０％コンフルエンスに達した場合、すべてのアッセイ毎に１ウェルあたり培養培地１ｍを用いて、細胞を１２ウェルプレート（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｃａｌａ、ＦＬ、米国）に１０５個の細胞／ウェルの濃度で播種した。
細胞培養。ヒト乳管癌ＢＴ－４７４および乳腺癌ＳＫ－ＢＲ－３はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）から購入し、提供されたプロトコールに従って培養した。ヒト腺癌細胞株ＭＣＦ－７およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、Ｈｏｗａｒｄ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＫａｎａａｎ教授の研究室により好意で寄贈されたものである。ＳＫ－ＢＲ－３をマッコイ５Ａで培養し、ＢＴ－４７４、ＭＣＦ－７、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）および１％Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ（Ｃａｔ．＃１５１４０１６３、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で培養した。すべての細胞株は、３７℃および５％ＣＯ２加湿インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）で培養した。概８０％コンフルエンスに達した場合、すべてのアッセイ毎に１ウェルあたり培養培地１ｍを用いて、細胞を１２ウェルプレート（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｏｃａｌａ、ＦＬ、米国）に１０５個の細胞／ウェルの濃度で播種した。
【0071】
細胞生存率アッセイ。チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）はＡｂｃａｍ（Ｃａｔ．＃ａｂ１４６３４５）から購入し、製造元のプロトコールに従って４８時間のＣＡＰ処置後に生存率アッセイを実施した。手短に説明すると、細胞培養培地をＭＴＴ溶液に置き換え、３７℃および５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で３時間インキュベートした。次いで、ＭＴＴ溶液をＭＴＴ溶媒に置き換え、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、米国）マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度で読み取った。
【0072】
カスパーゼ活性および細胞周期のためのＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージング
カスパーゼ３／７活性。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｃａｔ．＃４４４０、ＩｎｃｕＣｙｔｅ）は、活性化カスパーゼ３／７認識モチーフ（ＤＥＶＤ）をＤＮＡ挿入色素に結合させ、カスパーゼ－３／７媒介性アポトーシスを起こしている細胞のｍｉｘ－ａｎｄ－ｒｅａｄ、リアル－タイム定量化に理想的に適合しているものである。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅを正常な健全な細胞に添加しても、細胞の増殖および形態にとって非撹乱性である。組織培養培地に添加された場合、不活性な非蛍光基質は、細胞膜を通過し、細胞膜で活性化カスパーゼ－３／７によって切断され、その結果、ＤＮＡ色素が放出され、核ＤＮＡの蛍光染色がもたらされる。
カスパーゼ３／７活性。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｃａｔ．＃４４４０、ＩｎｃｕＣｙｔｅ）は、活性化カスパーゼ３／７認識モチーフ（ＤＥＶＤ）をＤＮＡ挿入色素に結合させ、カスパーゼ－３／７媒介性アポトーシスを起こしている細胞のｍｉｘ－ａｎｄ－ｒｅａｄ、リアル－タイム定量化に理想的に適合しているものである。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅを正常な健全な細胞に添加しても、細胞の増殖および形態にとって非撹乱性である。組織培養培地に添加された場合、不活性な非蛍光基質は、細胞膜を通過し、細胞膜で活性化カスパーゼ－３／７によって切断され、その結果、ＤＮＡ色素が放出され、核ＤＮＡの蛍光染色がもたらされる。
【0073】
乳がん細胞を１０５個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種し、ＣＡＰで処置または未処置とし、これに続いてＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｃａｓｐａｓｅ ３／７色素で染色した。次いで、細胞をＩｎｃｕＣｙｔｅに置き、位相差および緑色チャンネルを用いて倍率１０×で１時間間隔で３日間スキャンした。スキャン後、バックグラウンド除去を備えるＩｎｃｕＣｙｔｅ統合解析ソフトウェアを使用して蛍光対象物を定量化した。
【0074】
細胞周期トラッキング。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｇｒｅｅｎ／Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ．＃４７７９、ＩｎｃｕＣｙｔｅ）とは、細胞機能を変更すること無く、Ｇ１細胞周期期の細胞とＳ／Ｇ２／Ｍ細胞周期期の細胞を区別するためのＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）とｍＫａｔｅ２（赤色蛍光タンパク質）の両方を発現する蛍光シングルカセットインジケーターである。ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４、およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１の各細胞株の安定な細胞集団を、ピューロマイシン選択を使用して生成した。安定な細胞を１２ウェルプレートに１０５個の細胞／ウェルの密度で播種し、ＣＡＰで処置または未処置とし、３日スキャン向けにＩｎｃｕＣｙｔｅに置いた。ＭＣＦ－７細胞およびＭＤＡ－ＭＢＡ－２３１細胞の場合、Ｃｅｌｌ Ｂｙ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｕｌｅを用いて倍率１０×で位相差、緑色、および赤色のチャネルで細胞を１時間毎にスキャンした。クラスターで増殖する傾向があるＢＴ－４７４細胞の場合、Ｃｅｌｌ Ｂｙ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｕｌｅでは各細胞間の境界を適当に検出することできなかったので、ベーシックスキャンおよび解析を使用した。
【0075】
フローサイトメトリー
アポトーシスアッセイを、フローサイトメトリーにより、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｃａｔ．＃５５６４１９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．＃Ｐ３５６６）を用いて、４種の乳がん細胞株すべてに対して実施した。細胞を１２ウェルプレートに播種し、種々の投与量のＣＡＰで処置した。所望の期間でインキュベートした後、細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｔ４０４９）２５０μｌで剥離した。培養培地、洗浄用のＰＢＳ、ならびにトリプシン－ＥＤＴＡはすべてを採取し、アポトーシスの染色および解析用に遠沈したことに留意されたい。データのプロットおよび結果の解析は、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ７（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。
アポトーシスアッセイを、フローサイトメトリーにより、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｃａｔ．＃５５６４１９、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．＃Ｐ３５６６）を用いて、４種の乳がん細胞株すべてに対して実施した。細胞を１２ウェルプレートに播種し、種々の投与量のＣＡＰで処置した。所望の期間でインキュベートした後、細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｔ４０４９）２５０μｌで剥離した。培養培地、洗浄用のＰＢＳ、ならびにトリプシン－ＥＤＴＡはすべてを採取し、アポトーシスの染色および解析用に遠沈したことに留意されたい。データのプロットおよび結果の解析は、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ７（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。
【0076】
共焦点顕微鏡法
免疫蛍光染色およびイメージング。円形カバーガラス（直径１２ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．＃５０－１９２－８９５２）を１２ウェルプレートに置き、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｆ１１４１）およびコラーゲンＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．＃Ａ１０６４４０１）で細胞播種の前に少なくとも１時間コーティングした。チャンバースライドの代わりに１２ウェルプレート中のカバースライドに細胞を播種することで、ウェルサイズと細胞数がＭＴＴによる生存率アッセイおよびフローサイトメトリーによるアポトーシスアッセイと同じままであったので、種々の投与量で一貫したＣＡＰ処置効果をもたらすことができる。ＣＡＰ処置および所望のインキュベーション期間の後、製造元のプロトコールに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合Ｋｉ－６７ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．＃１１８８２）で細胞を染色した。手短に説明すると、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷無水メタノール（－８０℃フリーザーで予冷）を用いて室温で１０分間固定した。メタノールを吸引した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキングバッファ中で６０分間ブロックした。次いで、Ｋｉ－６７およびアイソタイプ対照（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．＃４３４０）抗体を抗体希釈バッファを用いて１：２００で希釈し、そのうちの４００μｌを指定のウェルに添加した。遮光した４℃の冷蔵庫で一晩細胞をインキュベートした。細胞を含む円形カバースライドを、２回洗浄し、その後に、１”（２．５４ｃｍ）×３”（７．６２ｃｍ）×１ｍｍの顕微鏡スライド上へと注意深く移した。細胞をＡｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ．＃Ｈ－１５００）滴下でまずカバーし、次いで２４×５０ｍｍのカバーガラス（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｔ．＃ＧＣ２４５０－ＡＣＳ）でカバーし、４℃の冷蔵庫で最長２晩の間硬化させた。
免疫蛍光染色およびイメージング。円形カバーガラス（直径１２ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ．＃５０－１９２－８９５２）を１２ウェルプレートに置き、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ．＃Ｆ１１４１）およびコラーゲンＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．＃Ａ１０６４４０１）で細胞播種の前に少なくとも１時間コーティングした。チャンバースライドの代わりに１２ウェルプレート中のカバースライドに細胞を播種することで、ウェルサイズと細胞数がＭＴＴによる生存率アッセイおよびフローサイトメトリーによるアポトーシスアッセイと同じままであったので、種々の投与量で一貫したＣＡＰ処置効果をもたらすことができる。ＣＡＰ処置および所望のインキュベーション期間の後、製造元のプロトコールに従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合Ｋｉ－６７ウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．＃１１８８２）で細胞を染色した。手短に説明すると、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷無水メタノール（－８０℃フリーザーで予冷）を用いて室温で１０分間固定した。メタノールを吸引した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキングバッファ中で６０分間ブロックした。次いで、Ｋｉ－６７およびアイソタイプ対照（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ．＃４３４０）抗体を抗体希釈バッファを用いて１：２００で希釈し、そのうちの４００μｌを指定のウェルに添加した。遮光した４℃の冷蔵庫で一晩細胞をインキュベートした。細胞を含む円形カバースライドを、２回洗浄し、その後に、１”（２．５４ｃｍ）×３”（７．６２ｃｍ）×１ｍｍの顕微鏡スライド上へと注意深く移した。細胞をＡｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ．＃Ｈ－１５００）滴下でまずカバーし、次いで２４×５０ｍｍのカバーガラス（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｃａｔ．＃ＧＣ２４５０－ＡＣＳ）でカバーし、４℃の冷蔵庫で最長２晩の間硬化させた。
【0077】
細胞を、４０５および４８８ｎｍのレーザー帯域でＣｏｎｆｏｃａｌ ＬＳＭ ５１０ （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）の６３×レンズを用いて、画像化した。
【0078】
強度の定量化。Ｋｉ－６７発現の強度を、Ｚｅｉｓｓ製Ｚｅｎ Ｌｉｔｅ ３．１を使用して定量化した。各画像においてＳｐｌｉｎｅ Ｃｏｎｔｏｕｒツールを用いて核の輪郭を描いた（画像サイズ：１０８．３６μｍ×１０８．３６μｍ、スケールバー５０μｍ）。輪郭内の各核のＫｉ－６７染色の平均強度をＺｅｎ Ｌｉｔｅ ３．１により測定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにエクスポートしプロットした。各条件について５つの画像を解析し、ＣＡＰ処置後に細胞がまったく残っていない場合に細胞数を０として記録した。
【0079】
ＲＮＡ－Ｓｅｑ－ライブラリの調製
【0080】
ｒＲＮＡ除去およびＨｉＳｅｑシーケンシング。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を上述の方法に従って１２０ｐ（２８．７Ｗ）で５分間ＣＡＰ処置し、６時間インキュベートした。総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従い、二重ＤＮａｓｅ消化を用いるグアニジニウム－フェノール（ＴＲＩｚｏｌ）ベースのキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ）によって分離した。ＲＮＡ試料をＱｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を使用して定量化し、ＲＮＡの完全性を４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）を用いてチェックした。
【0081】
ｒＲＮＡ除去を、Ｒｉｂｏｚｅｒｏ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して実施した。ＲＮＡシーケンシングライブラリの調製には、製造元の推奨に従ってＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａを使用した（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、米国）。手短に説明すると、濃縮ＲＮＡを９４℃で１５分間断片化した。続いて、第１の鎖および第２の鎖のｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ断片を末端修復し、３’末端でアデニル化し、ユニバーサルアダプターをｃＤＮＡ断片にライゲートし、これに続いてインデックスの付加とリミテッドサイクルＰＣＲでのライブラリ濃縮を行った。シーケンシングライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）を使用して検証し、Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用することによってならびに定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）によって定量化した。
【0082】
シーケンシングライブラリをフローセルの１レーン上で多重化およびクラスター化し、製造業者の取扱説明書に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ装置にロードした。試料を２×１５０ペアエンド（ＰＥ）コンフィギュレーションを使用して配列決定した。画像解析とベースコールをＨｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＨＣＳ）によって実行した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑから生成された生の配列データ（．ｂｃｌファイル）を、ＦＡＳＴＱファイルに変換し、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２．１７ソフトウェアを使用して逆多重化した。インデックス配列の特定には１ミスマッチを許容した。ｒＲＮＡ除去を、Ｒｉｂｏｚｅｒｏ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して実施した。ＲＮＡシーケンシングライブラリの調製には、製造元の推奨に従うことによってＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、米国）を使用した。手短に説明すると、濃縮ＲＮＡを９４℃で１５分間断片化した。続いて、第１の鎖および第２の鎖のｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ断片を末端修復し、３’末端でアデニル化し、ユニバーサルアダプターをｃＤＮＡ断片にライゲートし、これに続いてインデックスの付加とリミテッドサイクルＰＣＲでのライブラリ濃縮を行った。シーケンシングライブラリを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ ４２００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）を使用して検証し、Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用することによってならびに定量的ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）によって定量化した。
【0083】
データ解析。生データの品質を調査した後、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ．０．３６を使用して配列リードをトリミングし、その結果、可能性のあるアダプター配列および低品質のヌクレオチドを除去した。トリミングリードを、ＳＴＡＲアライナーｖ．２．５．２ｂを使用して、ＥＮＳＥＭＢＬで利用可能なホモ・サピエンス参照ゲノムにマッピングした。ＳＴＡＲアライナーとは、スプライスジャンクションを検出するとともにそれらを組み込んでリード配列全体のアラインメントをとる一助となるスプライスアライナーである。この手順の結果として、ＢＡＭファイルを生成した。ユニークな遺伝子ヒット数を、Ｓｕｂｒｅａｄパッケージｖ．１．５．２からの機能カウントを使用することによって算出した。エクソン領域内に入るユニークなリードのみをカウントした。遺伝子ヒット数の抽出の後、遺伝子ヒット数テーブルを下流の差次的発現解析に使用した。ＤＥＳｅｑ２を使用して、試料の群間の遺伝子発現の比較を実施した。Ｗａｌｄ検定を使用して、ｐ値およびＬｏｇ２倍率変化を生成した。調整済みｐ値＜０．０５および絶対ｌｏｇ２倍率変化＞１を有する遺伝子を、各比較について差次的発現遺伝子と呼んだ。遺伝子オントロジー解析を、ソフトウェアＧｅｎｅＳＣＦを実装することにより、統計学的に有意な遺伝子セットに対して実施した。ｇｏａ＿ヒトＧＯリストを使用して、遺伝子の生物学的プロセスに基づいて遺伝子セットをクラスター化し、それらの統計学的有意性を決定した。ＰＣＡ解析を、ＤＥＳｅｑ２ Ｒパッケージ内の「ｐｌｏｔＰＣＡ」機能を使用して実施した。プロットは、最初の２つの主成分により張られる２Ｄ平面内の試料を示す。最も高い行分散によって選択された上位５００の遺伝子を使用してプロットを作成した。
【0084】
リアルタイムｑＰＣＲ検証
リアルタイムｑＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、ＮＧＳ結果から選択された差次的に発現されたヒストンＲＮＡをさらに検証した。第１の鎖の合成を、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＶ １ＳＴ ＳＴＲＮＤ ＳＹＳＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を用いるランダムヘキサマープライマー（ｍＲＮＡおよびＩｎｃＲＮＡ用）を使用して、ＣＡＰ処理のおよびモック対照のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来の総ＲＮＡ １ｕｇを用いて実施し、これに続いて、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を使用して、ＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＦＸ９６ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、米国）中でｃＤＮＡ（５０ｎｇ）のリアルタイム定量的ＰＣＲ増幅を実施したが、各試料について３回反復で解析した。内部対照ハウスキーピング遺伝子１８ｓ ｒＲＮＡを、以前に記載のように選択するとともに（ｄｅ Ｋｏｋ，Ｊ．Ｂ．ら Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ １３ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ８５、１５４～１５９頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．３７００２０８（２００５））、全試料の正規化のために使用し、続いて、２－ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．＆Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５、４０２～４０８頁、ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｅｔｈ．２００１．１２６２（２００１））を使用して倍率変化を算出した。ＤＮＡ汚染を検出するために、第１の鎖合成無しの希釈ＲＮＡ試料を上記のｑＰＣＲに直接使用した。反復測定ＡＮＯＶＡこれに続くボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を適宜使用するｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を使用して統計学的解析を実施した。ｐ＜０．００５を統計学的に有意とみなした。
リアルタイムｑＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施して、ＮＧＳ結果から選択された差次的に発現されたヒストンＲＮＡをさらに検証した。第１の鎖の合成を、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＶ １ＳＴ ＳＴＲＮＤ ＳＹＳＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を用いるランダムヘキサマープライマー（ｍＲＮＡおよびＩｎｃＲＮＡ用）を使用して、ＣＡＰ処理のおよびモック対照のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞由来の総ＲＮＡ １ｕｇを用いて実施し、これに続いて、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を使用して、ＢＩＯ－ＲＡＤ ＣＦＸ９６ ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ、米国）中でｃＤＮＡ（５０ｎｇ）のリアルタイム定量的ＰＣＲ増幅を実施したが、各試料について３回反復で解析した。内部対照ハウスキーピング遺伝子１８ｓ ｒＲＮＡを、以前に記載のように選択するとともに（ｄｅ Ｋｏｋ，Ｊ．Ｂ．ら Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅｓ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ １３ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ８５、１５４～１５９頁、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．３７００２０８（２００５））、全試料の正規化のために使用し、続いて、２－ΔΔＣＴ法（Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．＆Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，Ｔ．Ｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５、４０２～４０８頁、ｄｏｉ：１０．１００６／ｍｅｔｈ．２００１．１２６２（２００１））を使用して倍率変化を算出した。ＤＮＡ汚染を検出するために、第１の鎖合成無しの希釈ＲＮＡ試料を上記のｑＰＣＲに直接使用した。反復測定ＡＮＯＶＡこれに続くボンフェローニ補正のスチューデントｔ検定を適宜使用するｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を使用して統計学的解析を実施した。ｐ＜０．００５を統計学的に有意とみなした。
【0085】
ＲＮＡの８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）修飾
ペプチド合成。（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）ペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 米国、で固相ペプチド合成によって合成したが、以下の配列（Ａｌｅｘａ ４８８）ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＳＥＶＶＶＳＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を有する。Ａｌｅｘａ ４８８色素を、マレイミド化学を使用してＮ末端でシステインに付加した。本ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、切断後に凍結乾燥させた。ペプチド（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）は、細胞透過能を備える蛍光標識プローブを使用した、８－オキソグアニンおよび脱プリン／脱ピリミジン部位の検出に言及しているＫａｎｇ，Ｄ．Ｍ．らによって以前に記載されているように（ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０、５４、ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８６０－０１９－０２３６－ｘ（２０１９））、細胞透過能を備える蛍光標識プローブを使用した８－オキソグアニンの検出用に設計する。ペプチド中のアミノ酸配列ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＣＥＶＶＶＳＧ（配列番号２）は、８－ｏｘｏＧ部位に密接に結合するヒトリボソームタンパク質Ｓ３（ｈＲｐＳ３）から得られる。ペプチド配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）ＴＡＴタンパク質のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）ドメインに由来し、このドメインは、細胞内へとタンパク質を効果的に送達することができるが、融合タンパク質のサイズによって制限されないようである。「ＧＧ」アミノ酸は、ＴＡＴペプチドをＳ３ペプチドに結合するためのＧＧリンカーである。
ペプチド合成。（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）ペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 米国、で固相ペプチド合成によって合成したが、以下の配列（Ａｌｅｘａ ４８８）ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＳＥＶＶＶＳＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）を有する。Ａｌｅｘａ ４８８色素を、マレイミド化学を使用してＮ末端でシステインに付加した。本ペプチドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、切断後に凍結乾燥させた。ペプチド（Ａｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３）は、細胞透過能を備える蛍光標識プローブを使用した、８－オキソグアニンおよび脱プリン／脱ピリミジン部位の検出に言及しているＫａｎｇ，Ｄ．Ｍ．らによって以前に記載されているように（ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０、５４、ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８６０－０１９－０２３６－ｘ（２０１９））、細胞透過能を備える蛍光標識プローブを使用した８－オキソグアニンの検出用に設計する。ペプチド中のアミノ酸配列ＧＶＬＲＦＩＭＥＳＧＡＫＧＣＥＶＶＶＳＧ（配列番号２）は、８－ｏｘｏＧ部位に密接に結合するヒトリボソームタンパク質Ｓ３（ｈＲｐＳ３）から得られる。ペプチド配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３）は、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）ＴＡＴタンパク質のトランスアクチベーター（ＴＡＴ）ドメインに由来し、このドメインは、細胞内へとタンパク質を効果的に送達することができるが、融合タンパク質のサイズによって制限されないようである。「ＧＧ」アミノ酸は、ＴＡＴペプチドをＳ３ペプチドに結合するためのＧＧリンカーである。
【0086】
８－ｏｘｏＧ ＲＮＡのインサイツ検出。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに１０５個／ウェルで播種し、前記のように標準条件で２４時間培養した。最終濃度１．０μＭにてのＡｌｅｘａ ４８８－ＴａＴ－Ｓ３ペプチドを細胞に添加し、２時間インキュベートした。１２０ｐ（２８．７Ｗ）にて５分間のＣＡＰ処置を実施し、細胞を２４時間インキュベートし、これに続いて、ＰＢＳで洗浄した。蛍光シグナルを、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、米国）マイクロプレートリーダーを用いて４８５ｎｍで読み取った。
【0087】
ペプチド合成。ペプチドを、Ｗａｎｇ樹脂（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を使用して固相ペプチド合成によって合成した。ペプチドをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で５モル当量の色素（ＦＰＲ－５５２；ＢｉｏＡｃｔｓ、Ｉｎｃｈｅｏｎ、韓国）を用いてＮ末端グリシンのアミンで標識したが、一方、ペプチド合成後、樹脂および保護基は未変化のままであった。
【0088】
プルダウン
ＲＮＡの調製。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を上述の方法に従って１２０ｐ（２８．７Ｗ）で５分間ＣＡＰ処置し、一方の細胞セットを即座に（０時間）処理し、他方のセットを１時間インキュベートした。総ＲＮＡを、製造元の取扱説明書に従って三重ＤＮａｓｅ Ｉ消化（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いるグアニジニウム－フェノール（ＴＲＩｚｏｌ）ベースのキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ）によって、で分離した。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＲｉｂｏ－ＺｅｒｏＧｏｌｄ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して除去した。８－ｏｘｏＧ含有ＲＮＡ転写物の免疫沈降を、ＣＡＰ処置Ｚｅｒｏ（ＣＰ０）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１）、Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺ）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１）の各条件について、生物学的３回反復で以前に記載されているように実施した。６９手短に説明すると、各試料を複数の部分に分割し、インプットＲＮＡの一部を、免疫沈降（ＩＰ）バッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ、および２００単位／ｍｌのＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ ＲＮＡ阻害剤［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）中で８－オキソ－７，８－ジヒドログアノシン（８－ｏｘｏＧ）モノクローナル抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１０μｇとともに、１ｍｌの反応体積で、回転させて４℃で４時間インキュベートした。８－ｏｘｏＧ抗体は、ＲＮＡ結合タンパク質を通して、媒体無しで８－ｏｘｏＧ含有転写産物に直接特異的に結合する。ＳｕｒｅＢｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ磁気ビーズ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造元のプロトコールに従って洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＩＰバッファ中で室温で２時間ブロックした。ビーズをＩＰバッファで２回洗浄した後、ビーズをＩＰバッファに再懸濁し、ＲＮＡ抗体反応物と混合し、回転させて４℃で２時間インキュベートした。次に、ビーズをＩＰバッファでさらに３回洗浄し、その後に、２ラウンドの競合溶出を実施した。各溶出を、ＩＰバッファ中の８－ｏｘｏ－ｄＧ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）１００μｇとともに回転させて４℃で１時間、ビーズをインキュベートすることから構成した。次いで、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して溶出体積をクリーンアップして、Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺＩＰ）、ｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１ＩＰ）、ＣＡＰ Ｚｅｒｏ（ＣＰ０ＩＰ）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１ＩＰ）の各ＲＮＡを単離した。８－ｏｘｏＧ免疫沈降ＲＮＡおよびインプットＲＮＡについて第１の鎖合成を実施し、これに続いてヒストンＲＮＡについてリアルタイムｑＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。
ＲＮＡの調製。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を上述の方法に従って１２０ｐ（２８．７Ｗ）で５分間ＣＡＰ処置し、一方の細胞セットを即座に（０時間）処理し、他方のセットを１時間インキュベートした。総ＲＮＡを、製造元の取扱説明書に従って三重ＤＮａｓｅ Ｉ消化（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いるグアニジニウム－フェノール（ＴＲＩｚｏｌ）ベースのキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ）によって、で分離した。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＲｉｂｏ－ＺｅｒｏＧｏｌｄ ｒＲＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して除去した。８－ｏｘｏＧ含有ＲＮＡ転写物の免疫沈降を、ＣＡＰ処置Ｚｅｒｏ（ＣＰ０）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１）、Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺ）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１）の各条件について、生物学的３回反復で以前に記載されているように実施した。６９手短に説明すると、各試料を複数の部分に分割し、インプットＲＮＡの一部を、免疫沈降（ＩＰ）バッファ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＩＧＥＰＡＬ、および２００単位／ｍｌのＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ ＲＮＡ阻害剤［Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）中で８－オキソ－７，８－ジヒドログアノシン（８－ｏｘｏＧ）モノクローナル抗体（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）１０μｇとともに、１ｍｌの反応体積で、回転させて４℃で４時間インキュベートした。８－ｏｘｏＧ抗体は、ＲＮＡ結合タンパク質を通して、媒体無しで８－ｏｘｏＧ含有転写産物に直接特異的に結合する。ＳｕｒｅＢｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ磁気ビーズ（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造元のプロトコールに従って洗浄し、０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＩＰバッファ中で室温で２時間ブロックした。ビーズをＩＰバッファで２回洗浄した後、ビーズをＩＰバッファに再懸濁し、ＲＮＡ抗体反応物と混合し、回転させて４℃で２時間インキュベートした。次に、ビーズをＩＰバッファでさらに３回洗浄し、その後に、２ラウンドの競合溶出を実施した。各溶出を、ＩＰバッファ中の８－ｏｘｏ－ｄＧ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ）１００μｇとともに回転させて４℃で１時間、ビーズをインキュベートすることから構成した。次いで、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を使用して溶出体積をクリーンアップして、Ｍｏｃｋ Ｚｅｒｏ（ＭＺＩＰ）、ｏｎｅ ｈｏｕｒ（Ｍ１ＩＰ）、ＣＡＰ Ｚｅｒｏ（ＣＰ０ＩＰ）およびｏｎｅ ｈｏｕｒ（ＣＰ１ＩＰ）の各ＲＮＡを単離した。８－ｏｘｏＧ免疫沈降ＲＮＡおよびインプットＲＮＡについて第１の鎖合成を実施し、これに続いてヒストンＲＮＡについてリアルタイムｑＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を実施した。
【0089】
統計学
すべてのアッセイを少なくとも３回繰り返し、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６により平均値±平均値の標準誤差としてプロットした。データはＡＮＯＶＡによって解析し、ｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を、適宜ボンフェローニ補正のスチューデントのｔ検定を使用して実施した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。差異は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１の場合、統計学的に有意とみなした。
すべてのアッセイを少なくとも３回繰り返し、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１６により平均値±平均値の標準誤差としてプロットした。データはＡＮＯＶＡによって解析し、ｐｏｓｔ－ｈｏｃ比較を、適宜ボンフェローニ補正のスチューデントのｔ検定を使用して実施した。ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。差異は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１の場合、統計学的に有意とみなした。
【0090】
本発明の好ましい実施形態に関する前述の説明は、例示および説明の目的で提示してきたものである。網羅的であること、または本発明を開示された正確な形態に限定することを意図するものではなく、修正および変形が上記の教示に照らして可能でありあるいは本発明の実践から得ることができる。当業者が、企図される特定の用途に適合されるような様々な実施形態で本発明を利用することができるように、本発明およびその実用的用途の原理を説明するために、本発明の実施形態を選択しかつ説明したのである。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲およびその均等物によって定義されることが意図されている。上述の文書それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0072】
カスパーゼ活性および細胞周期のためのＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージング
カスパーゼ３／７活性。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｃａｔ．＃４４４０、ＩｎｃｕＣｙｔｅ）は、活性化カスパーゼ３／７認識モチーフ（ＤＥＶＤ（配列番号４））をＤＮＡ挿入色素に結合させ、カスパーゼ－３／７媒介性アポトーシスを起こしている細胞のｍｉｘ－ａｎｄ－ｒｅａｄ、リアル－タイム定量化に理想的に適合しているものである。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅを正常な健全な細胞に添加しても、細胞の増殖および形態にとって非撹乱性である。組織培養培地に添加された場合、不活性な非蛍光基質は、細胞膜を通過し、細胞膜で活性化カスパーゼ－３／７によって切断され、その結果、ＤＮＡ色素が放出され、核ＤＮＡの蛍光染色がもたらされる。
カスパーゼ３／７活性。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Ｃａｔ．＃４４４０、ＩｎｃｕＣｙｔｅ）は、活性化カスパーゼ３／７認識モチーフ（ＤＥＶＤ（配列番号４））をＤＮＡ挿入色素に結合させ、カスパーゼ－３／７媒介性アポトーシスを起こしている細胞のｍｉｘ－ａｎｄ－ｒｅａｄ、リアル－タイム定量化に理想的に適合しているものである。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｄｙｅを正常な健全な細胞に添加しても、細胞の増殖および形態にとって非撹乱性である。組織培養培地に添加された場合、不活性な非蛍光基質は、細胞膜を通過し、細胞膜で活性化カスパーゼ－３／７によって切断され、その結果、ＤＮＡ色素が放出され、核ＤＮＡの蛍光染色がもたらされる。
【国際調査報告】