特表 2024-523704 カルシウム結晶沈着疾患の治療の手段および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】カルシウム結晶沈着疾患の治療の手段および方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/00 20060101AFI20240621BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20240621BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240621BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240621BHJP

【ＦＩ】

C07K14/00 ZNA

A61P3/00

A61P9/00

A61P19/02

A61P19/00

A61P13/12

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500215

(86)(22)【出願日】2022-06-27

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 EP2022067584

(87)【国際公開番号】W WO2023280615

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】21183609.3

(32)【優先日】2021-07-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515288959

【氏名又は名称】ユニフェルシテイト マーストリヒト

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ

【住所又は居所原語表記】Ｍｉｎｄｅｒｂｒｏｅｄｅｒｓｂｅｒｇ ４－６ Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(71)【出願人】

【識別番号】517079054

【氏名又は名称】アカデミシュ ジーケンハウス マーストリヒト

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＳＣＨ ＺＩＥＫＥＮＨＵＩＳ ＭＡＡＳＴＲＩＣＨＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】ウェルティン、ティム ヨハネス マリア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン デン アッカー、グース ゲイズベルタス ヒュバート

(72)【発明者】

【氏名】シュルガース、レオン ヨハネス

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン ライン、ローデウェイク ウィレム

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA09

4C084BA19

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZC211

4C084ZC212

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA01

4H045BA18

4H045BA30

4H045EA20

4H045FA10

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、薬物治療の分野、特にヒトの治療、より詳細にはカルシウム結晶沈着疾患を持つヒトの治療に関する。一態様では、本発明は、ヒト体内でのカルシウム結晶の沈殿（異所性石灰化としても既知）を防ぐか、または減少させるポリペプチドを提供する。より詳細には、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸がＤ－アミノ酸である環状ポリペプチド、本明細書に記載のポリペプチドを含む医薬組成物、並びに変形性関節症、肩関節周囲炎、異所性骨化、血管石灰化、腎臓結石および石灰沈着症からなる群より選択される疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸がＤ－アミノ酸である環状ポリペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載の環状ポリペプチドと、医薬上許容可能な担体と、を含む医薬組成物。

【請求項3】

変形性関節症、肩関節周囲炎、異所性骨化、血管石灰化、腎臓結石および石灰沈着症からなる群より選択される疾患の治療用の請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載の医薬上許容可能な担体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬物治療の分野、特にヒトの治療、より詳細にはカルシウム結晶沈着疾患を持つヒトの治療に関する。一態様では、本発明は、ヒト体内でのカルシウム含有結晶の沈殿（異所性石灰化としても既知）を防ぐか、または減少させるポリペプチドを提供する。

【背景技術】

【0002】

軟部組織の石灰化としても知られるカルシウム結晶の異常沈着は、アテローム性動脈硬化症（１）、腎不全（２）、変形性関節症（３）など、多くの全身疾患や慢性疾患における大きな問題である。アテローム性動脈硬化症や変形性関節症では、カルシウム沈着の重要性は当初認識されていなかったが（４，５）、腎臓疾患ではよく認識されている（６）。カルシウムを含む結晶は、しばしば微粒子の形で検出が困難であるが、実際に疾患を引き起こしたり、少なくとも疾患を悪化させたりする可能性があることが次第に明らかになってきた（７，８）。病的なカルシウム沈着は、主に塩基性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）とピロリン酸カルシウム二水和物（ＣＰＰ）からなる。

【0003】

カルシウム結晶の沈着を制御することは、無機リン酸（π）のような高濃度の金属イオンおよび陰イオンが細胞内外の環境に存在する多細胞生物において極めて重要である。コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分は、核形成中心として働くことによって、石灰化を促進することができる（９）。一方で、ミネラル化は骨の発育と恒常性維持に極めて重要である（１０）。そのため、カルシウムイオン濃度は、筋収縮と神経インパルス発生に重要なホルモンであるＰＴＨとカルシトニンによって、血流中の厳しい限度（１．１５～１．３３ｍｍｏｌ／Ｌ）内に維持されている（１１）。総カルシウム濃度は２．２～２．７ｍＭであり、約４５％がイオン性、約４５％がタンパク質結合性、約１０％が複合体性である（１２）。リン酸濃度は食事からの摂取により変動することが知られており（０．８～１．５ｍＭ）、タンパク質結合型はごく一部（約１０～１５％）である（１３）。内因性の石灰化阻害因子としては、無機ピロリン酸（ｐｐｉ）があり、これはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（Ｅｎｐｐ１；（１４））、アンキリン１（Ａｎｋ１；（１５））およびＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー６（Ａｂｃｃ６；（１６））によって刺激されることが、マウスノックアウト動物実験によって証明されている。その他の重要な石灰化阻害因子としては、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、Ｇｌａリッチタンパク質（ＧＲＰ）、クロトー（ＫＬ）、α－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ、フェチュインＡとしても知られる）などがある。

【発明の概要】

【0004】

内因性の石灰化抑制剤がいくつかあるにもかかわらず、カルシウム結晶沈着症の治療や予防に有効な組成物は存在しない。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】配列番号１に示されるペプチドとｂフェチュインの生体外における広い濃度範囲でのカルシウム沈殿抑制効果を示す図である。カルシウム沈殿アッセイ（２時間）におけるペプチドの１０段階希釈系列（合計１０^１５）。ｂフェチュインまたはペプチド１を添加しなくても、１００％の沈殿が得られる（破線）。

【図2】ペプチド（２０μＭ）の非存在下（左パネル）または存在下（右パネル）で２時間後に形成された沈殿物から得られた電子顕微鏡像である。ｂフェチュイン存在下で形成された沈殿を中央のパネルに示す。サンプル処理（透析）前の吸収測定によって、沈殿抑制率～５０％が確認された。走査型電子顕微鏡の倍率は３５，０００倍。バーは５マイクロメートルを示す。中央のパネル：０．５ｍｇ／ｍｌのｂフェチュイン、右パネル：２０μＭペプチド１を添加。

【図3】配列番号１に示されるペプチドによるヒト関節軟骨細胞、血管平滑筋細胞および骨髄間質細胞の細胞石灰化の阻害を示す図である。生体内細胞アッセイの代表的な位相差顕微鏡画像を示す。Ａ）ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣｓ）を１ｍＭのＡＴＰと２０μＭのペプチドの有無で７日間刺激した。結果は、それぞれ３つの生物学的複製を持つ３人の軟骨細胞ドナーから得られた。Ｂ）血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）を、２０μＭのペプチドの存在下または非存在下で、４．５ｍＭのイオン性カルシウムで７日間刺激した。結果は、３人のＶＳＭＣドナーのそれぞれ３つの生物学的複製から得られた。Ｃ）β－グリセロリン酸（ＢＧＰ）を含む骨形成分化培地中で、２．１μＭのペプチドの存在下または非存在下で、ＢＭＳＣを２１日間分化させた。ＢＭＳＣ；１人のドナーの４つの生物学的複製を用いた。左パネル：各実験の最終日に位相差画像を得た。石灰化は黒い点で見ることができる。各条件につき１枚の代表画像を示す。スケールバーは２００μｍを示す。右のパネル：Ｒａｎｄｏｘ社の総カルシウムアッセイで測定したウェルあたりの総カルシウム沈殿量を定量し、総タンパク質で正規化した。各ドナーの陽性コントロールは１００％に正規化した。統計的比較はスチューデントｔ観察者検定（ｔ－ｏｂｓｅｒｖｅｒｔｅｓｔ）を用いて行った。＊＝ｐ値＜０．０５。

【図4】ペプチドの関節内注射は、ラットの変形性関節症モデルにおいて、軟骨組織病理を改善し、動物の運動能力を改善したことを示す図である。変形性関節症は、内側半月板の外科的断裂と側副靭帯の切断によって誘発された（Ｎ＝４０）。濃度２０μＭのペプチド５０μｌまたはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）５０μｌを隔週で関節内に注射した（各群Ｎ＝２０）。２８日目に剖検を行い、ＯＡＲＳＩスコアリングシステムに従って組織学的解析を行った。Ａ）組織学的外観が最高、平均、最低のもの由来の代表的なトルイジンブルー染色組織切片。軟骨組織は濃い青色で染色されている。Ｂ）ＯＡＲＳＩスコアは、盲検化された２人の観察者によって、１匹あたりの軟骨損傷のグレードとステージを掛け合わせて求めた。統計的比較は両側ｔ検定で行った。＊＝ｐ値＜０．０５。Ｃ）実験２０日目の歩行分析スコア。１匹につき４回の測定を行い、各点はグラフ中の１匹の平均を表す。群間の統計的有意性はマン・ホイットニーのＵ検定で決定した。＊＝ｐ値＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0006】

本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸がＤ－アミノ酸である環状ポリペプチドに関する。また、本発明は、そのようなポリペプチドと、医薬上許容可能な担体とを含む医薬組成物、並びに疾患の治療におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、変形性関節症、肩関節周囲炎、異所性骨化、血管石灰化、腎臓結石および石灰沈着症からなる群より選択される疾患の治療用の本明細書に記載のポリペプチドに関する。

【0007】

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、３０個のＤ－アミノ酸からなる環状ポリペプチドを化学合成した。その配列は、ＬＩＹＲＱＰＮＣＤＤＰＥＴＥＥＡＡＬＶＡＩＤＹＩＡＰＨＧＰＧ（以下ペプチド１、ペプチド、または配列番号１に示されるペプチドとも称す）であり、１位のアミノ酸Ｄ－ロイシン（Ｌ）が３０位のアミノ酸Ｄ－グリシン（Ｇ）に化学的に結合して、環状ポリペプチドを形成する。本明細書において、「ポリペプチド」および「ペプチド」は互換的に使用される。

【0008】

配列番号１に示されるペプチドの阻害能力を評価するために、実施例２に記載されているように、確立された生体外リン酸カルシウム沈殿アッセイ（１７－１９）を使用した。陽性対照として、沈殿を完全に阻害することが見出された１ｍｇ／ｍｌ（２０．６μＭ）の濃度のウシフェチュイン（ｂフェチュイン）を使用した。

【0009】

有効でなくなるまでペプチドを希釈しようと試みた。配列番号１に示されるペプチドは、ペプチドの濃度を増加すると陽性の用量反応効果を示した。ウシフェチュイン（ｂフェチュイン）は、１～１０μｇ／ｍｌ（２０，６～２００，６ｎＭ）でその阻害効果を失ったが、配列番号１に示されるペプチドは、アトモル濃度範囲まで活性のままであった（図１）。

【0010】

２．６ａＭではなく２０．６ａＭでも、対照と比較して統計的に有意に沈殿を抑制できることがわかった（図１）。この２０．６ａＭの濃度は、１００μｌの反応容積中１，２５０ペプチド分子に相当すると見積もられた。

【0011】

要約すると、配列番号１に示されるペプチドは、ｂフェチュインよりも効率的にリン酸カルシウムの生体外沈殿を阻害する。配列番号１に示されるペプチドは、カルシウム結晶沈着疾患の認められた生体外モデルにおいて、カルシウム結晶沈着を防ぐのにｂフェチュインより有効であると結論付けられる。

【0012】

次に、ｂフェチュインまたは配列番号１に示されるペプチドの存在または非存在下での生体外アッセイで２時間後に形成した沈着物を走査電子顕微鏡で分析した（実施例３）。対照では、比較的大きな粒子（～１μＭ）と小さな粒子（５０～２００ｎＭ）（図２；左パネル）が見られた。より大きい粒子は明確な結晶化したエッジを有しており、ＢＣＰ結晶形成に典型的なものである（２０）。ｂフェチュインと接触させた後に得られた粒子は、これらの鋭いエッジがない全く異なる形態であった（図２；中央のパネル）。また、粒子は幾分小さくなった（約０．５μＭの範囲内）。配列番号１に示されるペプチドで得られた粒子は、さらに小さくコンパクトに見えた。それらは、三角形、四角形、まれに五角形または六角形の形態であった（図２；右のパネル）。ペプチドで処理したサンプルから得られた最も小さい識別可能な粒子の大きさは約６７ｎｍ±７（平均±ＳＤ、ｎ＝４）であり、一次ＣＰＰに似ていた（＜１００ｎＭ）。ペプチドを用いて得られた粒子は、高倍率（＞３５，０００ｘ）で電子線による分解を受けやすかったが、対照サンプルからの粒子ではそのようなことはなかった。ｂフェチュインは、外面を覆うことによってＣＰＰの成長を妨げることが知られている。理論にとらわれることなく、このペプチドがリン酸カルシウム粒子とも相互作用するという仮説を立てた。

【0013】

これを試験するために、ｂフェチュインまたは配列番号１に示されるペプチドの存在下または非存在下（対照）で、粒子を２時間または２４時間形成させ、その後、遠心分離によって回収し、洗浄し、酸に溶解し、続いてペレットおよび上清中の総カルシウム、リン酸塩およびタンパク質を測定した。

【0014】

対照のペレット中のカルシウム量は、２時間と２４時間の反応時間の間で同程度のままであった。

【0015】

ｂフェチュインおよびペプチドを用いて得られたペレットでは、沈殿したカルシウムの量が、２時間のインキュベーションでは１％未満であったが、２４時間のインキュベーションでは２％以上となり、時間の関数として増加した。これは、ペプチドまたはｂフェチュインを添加しない対照（２時間で２６％、２４時間で２８％）よりもまだ有意に低かった。

【0016】

ペレット中のリン酸塩は、２時間から２４時間にかけて、対照ペレットの２％から１４％に増加した。ｂフェチュインまたはペプチドを添加すると、２４時間後のリン酸含量は９％まで有意に減少した。

【0017】

最後に、総タンパク質含量を測定したところ、ｂフェチュインとペプチドの両方がペレットに取り込まれたことが確認された。最大４％のｂフェチュインと２２％のペプチドがペレットに取り込まれた。これらの分析を総合すると、ｂフェチュインと配列番号１に示されるペプチドの両方がリン酸カルシウム粒子に取り込まれ、その形態と組成を変化させることが証明された。

【0018】

このペプチドが生体内でも抗石灰化作用を示すかどうかを調べるために、３つの異なるよく確立された細胞石灰化モデル、すなわちＡＴＰ誘発ヒト関節軟骨細胞石灰化モデル（ＨＡＣ）、カルシウム誘発血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）石灰化モデル、β－グリセロリン酸誘発骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭＳＣ）骨形成分化モデルでその効果を試験した（実施例６、（２１－２３））。

【0019】

軟骨細胞をＡＴＰで７日間刺激した後、石灰化のコントロール（ここではＡＴＰ存在下で得られる最大沈殿量と定義）と比較すると、ペプチドによる石灰化の阻害は２２～３３％であった（図３Ａ）。（図３Ａ）。

【0020】

７日間のＶＳＭＣ石灰化モデルでは、ペプチドによって石灰化が５８～６１％阻害された（図３Ｂ）。

【0021】

最後に、３週間のＢＭＳＣ分化モデルにおいて、ペプチドはカルシウム沈殿の強い阻害（８１％）を示した（図３Ｃ）。ペプチド処理の効果は、位相差顕微鏡画像ではっきりと確認できた（図３Ｃ）。

【0022】

結論として、ペプチドは、３つの異なる細胞モデルにおいて生体内での石灰化を阻害する。

【0023】

また、ラットの変形性関節症モデルにおいて、ペプチドを隔週で関節内に注射した場合の効果を評価した（図４）。変形性関節症は、手術による内側半月板の断裂と側副靭帯の切断で誘発した（Ｎ＝４０）。濃度２０μＭのペプチド５０μｌまたはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）５０μｌを隔週で関節内に注射した（各群Ｎ＝２０）。２８日目に剖検を行い、ＯＡＲＳＩスコアリングシステム（２４）に従って組織学的解析を行った。

【0024】

術後２８日目に、ペプチドで処置したラットの膝関節では、ビヒクルで処置した群と比較して、組織病理学的ＯＡスコアが３８％有意に減少した（図４Ｂ）。最も注目すべきは、ペプチド投与後の歩行スコアの大幅かつ有意な改善で、１６／２０匹が正常な歩行を示したのに対し、ビヒクル対照投与群では５／２０匹しか正常な歩行を示さなかった（図４Ｃ）。

【0025】

要約すると、ラットの変形性関節症モデルにおいて、ペプチドの関節内注射が変形性関節症の病態の程度を改善し、動物の運動能力を向上させることがわかった。

【実施例】

【0026】

実施例１：ペプチド合成
凍結乾燥したペプチドをＰｅｐＳｃａｎ（ＮＬ）で合成した。バッチは９０％以上の純度で生成された。精製はｐＨＰＬＣで行い、質量およびＵＶプロファイルは、ＭＳ－ＵＰＬＣ分析（Ｃ１８ ＲＰ－ＨＰＬＣカラム）で評価した。

【0027】

実施例２：生体外リン酸カルシウム沈殿アッセイ
カルシウム沈殿アッセイは、若干の変更を加えて、基本的に以前と同様に行った（１９）。２．４ｍＭイオン化カルシウム（０．１Ｍストック）を１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内の５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．４）に添加した。ペプチドまたはｂフェチュインを添加し、室温で１５分間インキュベートした。その後、１．６ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍストック）を添加し、混合物を３７℃で１２０分間インキュベートした。タイミングが結果に影響しないことを確認するため、ペプチドまたはｂフェチュインを含まない陽性対照を、一連の開始時と終了時の２回用意した。

【0028】

データは各実験で最初の陽性対照（１００％に正規化）に対して正規化した。沈殿阻害の内部参照として、各実験で１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．２５ｍｇ／ｍｌのウシフェチュイン（ｂフェチュイン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ２３７９）を用いた。２時間後、サンプルをキュベット（１．０ｍｌ反応液）に移し、プレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、Ａ６２０で吸光度を測定した。それぞれの条件は３つの生物学的反復から構成された。

【0029】

実施例３：走査型電子顕微鏡
生体外リン酸カルシウム沈殿の２時間後、サンプルを透析膜に移して反応を停止させた。一晩の透析後、サンプルを凍結乾燥し、スタブにマウントし、ＳＥＭ調査の前にコントラストを高めるために金コーティングした（２５）。画像は１０．０ｋＶ、０．４０ｎＡで得られた。

【0030】

実施例４：カルシウムアッセイ
沈着したカルシウムの定量は、０．１ＭのＨＣｌで沈着ミネラルを加水分解した後、カルシウム定量キット（Ｒａｎｄｏｘ社，イギリス国ロンドン）を用いて、製造元の指示に従って行った。カルシウムの測定値は、ｍｉｃｒｏ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ社，オランダ国ブレイスウェイク）を用いてタンパク質含量に正規化した。タンパク質含量を測定できるようにするため、同量の０．１ＭのＮａＯＨを用いて酸を中和し、０．１％ＳＤＳ（最終濃度）を加えて細胞石灰化アッセイで細胞を溶解した。

【0031】

実施例５：リン酸塩アッセイ
沈着したリン酸塩の定量は、沈着物を０．１ＭのＨＣＬで可溶化した後、製造元の指示に従い、リン酸塩比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ，ＭＫ０３０）を用いて行った。

【0032】

実施例６：細胞石灰化モデル
ヒト初代平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）は、手術を受けた患者の組織摘出物から得た。組織は±５ｍｍ2の大きさに切り離し、以前の方法で単離した（２６）。簡単に言うと、細胞は２０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を加えたＭ１９９で培養した。単離の成功は、α－平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、平滑筋タンパク質２２α（ＳＭ２２α）、リン酸化ミオシン軽鎖２（ｐＭＬＣ）の陽性発現、およびＳ１００ Ｃカルシウム結合タンパク質４（Ｓ１００Ａ４）の非存在についての免疫蛍光染色によって判定した。実験には５～８継代の細胞を用い、１ｃｍ^２当たり１０，０００個の細胞を播種した。２４時間後、培地を石灰化培地（５．４ｍＭカルシウム入り増殖培地、またはペプチドと５．４ｍＭカルシウム入り増殖培地）に変えた。培地は、７日目に石灰化が目視で確認されるまで、２日ごとまた３日ごとにリフレッシュした。

【0033】

ヒト初代軟骨細胞（ＨＡＣ）は、末期変形性関節症患者の人工膝関節全置換術の関節軟骨から、書面によるインフォームド・コンセントの後、残余材料として分離した（ＭＥＴＣ２０１７－０１８３）。細胞は１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した。３～５継代の細胞を実験に使用し、１ｃｍ^２あたり３０，０００個の細胞を実験用に播種した。２４時間後、培地を石灰化培地（１ｍＭのＡＴＰを添加した増殖培地、または指示濃度のペプチドと１ｍＭのＡＴＰを添加した増殖培地）に変えた。７日目に石灰化が目視で確認されるまで、培地は２日ごとまたは３日ごとにリフレッシュした。

【0034】

骨髄由来間質細胞（ＢＭＳＣｓ）は、若年者の腸骨稜から採取したヒト骨髄吸引液から単離した（ＭＥＴＣ０８－４－０５６）。細胞は、１０％ＦＣＳと１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で培養した。骨分化は、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、デキサメタゾン１００ｎＭ、β－グリセロリン酸１０ｍＭを添加した培地で行った。培地は、２１日目に石灰化が目視で確認されるまで、２日ごとまたは３日ごとにリフレッシュした。

【0035】

実施例７：ラット変形性関節症モデル
ルイスラット（ｎ＝４０）は、右膝関節の内側半月板断裂と側副靭帯切断の手術を受けた（２７）。術後７、１０、１４、１７、２１および２４日目に、５０μｌのビヒクル（０．９％ＮａＣｌ）（ｎ＝２０）または配列番号１に示されるペプチド（２０μＭ；ｎ＝２０）を関節内に注射した。歩行分析は２０日目に行い、剖検は術後２８日目に行った。脱灰してパラフィン包埋した膝関節の組織切片を得、トルイジンブルー（２８）で染色して組織学的スコアリングを行った（２４）。Ｂｏｌｄｅｒ Ｂｉｏｐａｔｈ社（アメリカ合衆国ボールダー）で実験を実施し、組織切片を染色した。
実施例８：統計分析

【0036】

２群の比較には両側スチューデントｔ検定を用いた。沈殿アッセイからのデータは正規分布と仮定した。複数群の比較には、ダネットの後検定またはボンフェローニの後検定を伴う一元配置分散分析を用いた。ラットＯＡモデルについては、正規分布のデータについては両側スチューデントｔ検定（ダゴスティーノ・ピアソン正規性検定）、正規分布でないデータについてはマン・ホイットニーのＵ検定を用いて群間比較を行った。統計解析はＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８で行った。

【0037】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0038】

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024523704000001.app

【国際調査報告】