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特表2024-523738ニューロンおよびその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-06-28
(54)【発明の名称】ニューロンおよびその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20240621BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20240621BHJP
C12N 5/0797 20100101ALN20240621BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
C12N5/0735
C12N5/0797
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024501921
(86)(22)【出願日】2022-07-13
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 EP2022069565
(87)【国際公開番号】W WO2023285514
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】21185527.5
(32)【優先日】2021-07-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509091848
【氏名又は名称】ノヴォ ノルディスク アー／エス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヨナタン・ニクリス
(72)【発明者】
【氏名】ヨセフィン・ラガルド・クリスチャンセン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065BA21
4B065BA30
4B065CA44
(57)【要約】
本発明は、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、細胞がニューロンに発達する傾向が高いかどうかを示す陽性細胞を選択する工程と、を含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、－ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、
－ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＣＤ８３、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法。
【請求項2】
ニューロン前駆体を含む前記細胞集団が、神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程であって、神経系幹細胞を含む前記細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＳＯＸ２を発現する、工程、および前記ＳＯＸ２の発現が少なくとも５％減少するまで、神経系幹細胞を含む前記細胞集団を培養する工程によって取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記細胞集団が、腹側中脳領域の神経系幹細胞を含み、マーカーＣＤ４７に対して陽性の細胞が除外される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記細胞集団が、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域の神経系幹細胞を含み、マーカーＣＤ９９およびＣＤ４７のうちの一方または両方に対して陽性の細胞が除外される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
細胞を選択および／または除外するときに、前記細胞集団の１０～９０％が、マーカーＳＯＸ２に対して陽性であり、前記細胞集団の５～５０％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性であり、前記細胞集団の５～２０％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
細胞を選択および／または除外するときに、前記細胞集団の１０～９０％が、マーカーＳＯＸ２に対して陽性であり、前記細胞集団の５～５０％が、マーカーＡＳＣＬ１のうちの１つ以上に対して陽性であり、前記細胞集団の５～２０％が、マーカーＩＮＡのうちの１つ以上に対して陽性である、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
ニューロン前駆体を含む前記細胞集団を取得する工程が、ＰＳＣを神経系幹細胞に分化させる工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＳＣが、細胞を選択および／または除外する工程の前に、少なくとも２０日間、神経系幹細胞に分化することができる、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
細胞を選択および／または除外する工程が、ＭＡＣＳを使用して細胞を単離することによって実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって取得される、ニューロンおよび／またはその前駆体のインビトロ細胞集団。
【請求項11】
ニューロンおよび／またはその前駆体のインビトロ細胞集団であって、前記細胞集団の５％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＣＤ８３、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である、細胞集団。
【請求項12】
前記細胞集団の５％未満が、マーカーＣＤ９９に対して陽性である、請求項１１に記載の細胞集団。
【請求項13】
前記細胞集団の５％未満が、マーカーＣＤ４７に対して陽性であり、前記細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＦＯＸＡ２に対して陽性である、請求項１１に記載の細胞集団。
【請求項14】
前記細胞集団の少なくとも８０％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項15】
前記細胞集団の少なくとも８０％が、前脳、後脳、もしくは脊髄ニューロンおよび／またはその前駆体である、請求項１２に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）などの幹細胞の分野に関する。具体的には、細胞集団を幹細胞由来ニューロンおよびその前駆体において富化するための方法が提供される。
【背景技術】
【0002】
ヒト多能性幹細胞は、人体の様々な難治性疾患および障害の治療に変革をもたらす可能性がある。治療には、パーキンソン病などの神経状態の細胞補充療法が含まれる。しかしながら、かかる治療が実行可能になるためには、中枢神経系（ＣＮＳ）にそれらを送達するための幹細胞由来産物を人工的に産生するためのインビトロ方法の開発が必要である。
【0003】
ｈＰＳＣの定義された細胞型への分化は、制御することが困難なプロセスであり、多くの場合、特定のプロトコルから生成された子孫は不均一であり、細胞型の混合物を含む。現在、ｈＰＳＣを神経系幹細胞に、および続いてニューロンに分化させるためのいくつかの方法が説明されている。しかしながら、すべてのプロトコルは、不均一な集団を生成し、すなわち、すべての細胞が必ずしもニューロン前駆細胞であるわけではなく、異なる細胞型に特殊化する可能性があるか、またはインビトロ分化およびインビボ発達の非同調の性質が、同時に存在する異なる細胞段階をもたらす。不均一な培養は、目的の単一／特異的な細胞型における疾患および正常な生物学を調査するために、または細胞補充療法の文脈、および特にニューロンが意図される治療用細胞型である場合など、単一／特異的な細胞型の移植が必要な場合には、最適ではない。細胞の混合集団の移植は、細胞療法の安全性および有効性プロファイルを低減し、望ましくない細胞型からの望ましくない副作用のリスクを増加させる。細胞集団を分離して、より高い純度のニューロンおよびその前駆体を取得するための方法は、特許文献１に記載されている。しかしながら、ニューロンに発達する傾向が増加した神経系細胞を含む富化された細胞集団を取得するためのさらなる方法に対する必要性が、依然として存在する。
【0004】
したがって、本発明の目的は、腹側中脳ニューロンなどのニューロンおよびその前駆体に発達するように決定された細胞型を目指して、神経系細胞を含む細胞集団の均一性を改善することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０２１／０４２０２７号
【発明の概要】
【0006】
上記に概説した目的は、本発明の態様によって達成される。加えて、本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかになるであろうさらなる課題を解決することができる。
【0007】
本発明の第１の態様は、ニューロンおよび／または中間前駆細胞などのその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
【0008】
本発明者らは、特定の細胞を単離することによって、細胞集団において、ニューロンに発達する傾向がある細胞の割合を増加させることが可能であることを発見し、特定の細胞は、ある特定の表面マーカー上で陽性および／または陰性に選択することによって単離される。さらに、本発明者らは、特にニューロンなどの神経系細胞に分化する細胞集団に適用される場合、細胞を選択および／または除外するタイミングが結果を改善し得ることを発見した。具体的には、インビトロ分化プロセスなどにおいてニューロンに発達する細胞は、異なる段階を経て進行し、最初に、細胞は神経系幹細胞になり、その後、中間前駆細胞にさらに分化した後にニューロンに変わる。本発明者らは、神経系幹細胞がニューロン運命を有するかどうかを示す特定の表面マーカーが、神経系幹細胞がさらに発達した後にのみ確実に発現されることを発見した。ニューロン同一性への分化を受けている細胞集団では、個々の細胞は、異なる発達段階にあり、細胞集団は、多能性幹細胞、神経系幹細胞、中間前駆細胞、およびニューロンなどの細胞の亜集団を含み得る。さらに、１つの段階から別の段階へと移行する個々の細胞は、両方の段階を示すマーカーを発現し得る。本発明者らは、細胞の選択および／または除外が、好ましくは細胞集団に適用され、細胞の少なくとも一部が、神経系幹細胞であることからさらに発達していることを発見した。発現マーカーＳＯＸ２は、神経系幹細胞同一性の特徴である。神経系幹細胞がさらに発達するにつれて、細胞は、ある時点でＳＯＸ２をもはや発現しない。これは、ニューロン運命を有する細胞上で発現またはサイレンシングされる特定の表面マーカーと一致する。したがって、細胞集団におけるＳＯＸ２の発現の減少は、神経系幹細胞がさらに発達していることを示し、ニューロンに発達する傾向がある細胞を単離するための絶好の機会を特定するために使用され得る。
【0009】
したがって、本発明の一態様は、細胞集団からニューロンおよび／またはその前駆体を単離するための方法であって、マーカーＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程と、細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が減少するまで、細胞集団をさらに培養する工程と、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
【0010】
あるいは、細胞を選択および／または除外するタイミングは、神経系幹細胞の一部が中間前駆細胞および／またはニューロンにさらに発達したことを示すマーカーに基づいて確立されてもよい。一実施形態では、細胞集団は、最初に、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を神経系幹細胞に分化させることによって取得され、細胞の選択は、培養物が中間前駆細胞などの単能性細胞および／もしくは多分化能性細胞、ならびに／またはニューロンなどの最終分化細胞から成る、分化におけるある特定の段階に進行すると適用され得る。したがって、一実施形態では、細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、中間前駆体同一性のマーカーを発現する。一実施形態では、細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性である。本発明者らは、これらのマーカーの発現を、ニューロン発達の強い傾向がある細胞の陽性および／または陰性選択が、特定された表面マーカーに基づいて実施され得る段階まで、細胞集団が成熟しているという強力な指標として特定した。中間前駆細胞に発達する前の細胞は、細胞の単離が実施されるための特定された表面マーカーを十分に発現またはサイレンシングしない可能性がある。
【0011】
本発明者らは、特定された表面マーカーに基づいて細胞集団におけるニューロンを増加させるために、細胞を選択および／または除外することが、脳のすべての領域に適用され得ることを発見した。具体的には、表面マーカーＣＤ４７を発現する細胞を除外することが、腹側中脳神経系細胞になることに向けられた細胞集団におけるニューロンの割合を増加させることがわかった。さらに、表面マーカーＣＤ９９を発現する細胞を除外することが、前脳、後脳、または脊髄に向けられた細胞集団におけるニューロンの割合を増加させることがわかった。
【0012】
本発明の別の態様では、ニューロンおよび／またはその前駆体の細胞集団が提供され、細胞の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、かつ／または細胞の５０％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である。上記に従った細胞集団は、ニューロンに発達する傾向の増加を特徴とする。
【0013】
別の態様は、本発明に従った細胞集団を含む組成物に関する。さらなる態様では、神経学的状態の治療などにおいて、医薬として使用するための、本発明に従った細胞集団または組成物が開示される。均一な細胞集団の移植は、細胞療法の安全性および有効性プロファイルを高め、望ましくない細胞型からの望ましくない副作用のリスクを減少させる。本発明に従った細胞集団または組成物を用いた治療は、ニューロンおよび／またはその前駆体を有する細胞の比率を増加させ、それによって、かかる細胞の投与を必要とする状態の予防または治療にとって非常に好適なものにする。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】図１は、ｈＰＳＣ（Ａ）から早期ＮＳＣ（Ｂ）、不均一な中間段階培養物（Ｃ）、および最終的に、最終分化細胞型（Ｄ）への分化段階を示す簡略化された概略図を示す。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析を行った時間枠は、ボックス（Ｅ）でマーク付けされている。
【図2B】図２Ｂは、ｈＥＳＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって取得されたｔ－ＳＮＥプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡの発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図3A】図３Ａは、ＤＩＶ１６腹側中脳ＮＳＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって取得されたベン図を示す。この図は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡのうちの１つ以上を発現する細胞の割合を示す。
【図3B】図３Ｂは、ＤＩＶ１６腹側中脳ＮＳＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって取得されたｔ－ＳＮＥプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡの発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図4A】図４Ａは、ＤＩＶ２４腹側中脳神経系細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって取得されたベン図を示す。この図は、ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡのうちの１つ以上を発現する細胞の割合を示す。
【図4B】図４Ｂは、ＤＩＶ２４腹側中脳神経系細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって取得されたｔ－ＳＮＥプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡの発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図5】図５は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＬＭＸ１Ａ、ＳＯＸ２、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡの発現プロファイルを示す。ＬＭＸ１Ａ陰性細胞は、円でマーク付けされている。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図6】図６は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＧＡＰ４３、ＡＤＣＹＡＰ１、Ｃ１ＱＬ１、およびＮＲＸＮ１の発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図7】図７は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＦＺＤ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＤＤＣ、ＧＰＲ８５、およびＬＲＲＣ４Ｃの発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図8】図８は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＰＭ８、ＦＲＥＭ２、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＣＨＲＮＡ５、およびＣＬＤＮ５の発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図9】図９は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＤ３６、およびＣＤ４７の発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図10】図１０は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１の発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図11】図１１は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析のＤＩＶ２２、２４、および２６腹側中脳神経系細胞によって取得された統合型ＵＭＡＰプロットを示す。このプロットは、遺伝子ＣＭＴＭ６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＲＬＦ１、ＩＴＧＢ８、およびＣＤ８３の発現プロファイルを示す。発現レベルは、転写物当たりのＵＭＩ（ＵＴＰ）として表され、発現なし（非常に薄い灰色）から高発現（濃い灰色）までの色のグラデーションを使用して表示される。
【図12】図１２は、ＣＤ４７陽性細胞またはＣＤ９９陰性細胞が富化された集団を取得するための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）戦略を概説する。この図は、第一に、（Ａ）細胞を表す事象を選択し、破片を除外する、第二に、（Ｂ）単一細胞を選択し、ダブレットを除外する、第三に、（Ｃ）生細胞を選択し、死細胞を除外する、最後に、（Ｄ）ＣＤ４７陽性集団またはＣＤ４７陰性集団を選択する、階層的ゲートを示す。
【図15】図１５は、ＦＡＣＳ直後に細胞内フローサイトメトリーによって分析した、ソーティングされたＣＤ４７陽性（Ａ）試料および陰性（Ｂ）試料における、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２を発現する細胞の割合を示す。
【図17】図１７は、ＦＡＣＳ直後に細胞内フローサイトメトリーによって分析した、ソーティングされたＣＤ４７陽性（Ａ）試料および陰性（Ｂ）試料における、中脳底板マーカーＦＯＸＡ２を発現する細胞の割合を示す。
【図19】図１９は、ソーティングされたＣＤ４７陽性細胞（Ａ、Ａｉ）、ＣＤ４７陰性細胞（Ｂ、Ｂｉ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ、Ｃｉ）の、ＦＡＣＳの２４時間後に得られた低倍率（Ａ、Ｂ、Ｃ）および高倍率（Ａｉ、Ｂｉ、Ｃｉ）の位相コントラスト画像における細胞の形態を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図20】図２０は、ソーティングされたＣＤ４７陽性細胞（Ａ、Ａｉ）、ＣＤ４７陰性細胞（Ｂ、Ｂｉ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ、Ｃｉ）の、ＦＡＣＳの５日後に得られた低倍率（Ａ、Ｂ、Ｃ）および高倍率（Ａｉ、Ｂｉ、Ｃｉ）の位相コントラスト画像における細胞の形態を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図21】図２１は、ＦＡＣＳの５日後にＫｉ６７およびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ４７陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４７陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図22】図２２は、ＦＡＣＳの５日後にＦＯＸＡ２およびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ４７陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４７陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図23】図２３は、ＦＡＣＳの５日後にＴＨおよびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ４７陽性細胞（Ａ）、ＣＤ４７陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図24】図２４は、ＣＤ９９陽性細胞またはＣＤ９９陰性細胞が富化された集団を取得するための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）戦略を概説する。この図は、第一に、（Ａ）細胞を表す事象を選択し、破片を除外する、第二に、（Ｂ）単一細胞を選択し、ダブレットを除外する、第三に、（Ｃ）生細胞を選択し、死細胞を除外する、最後に、（Ｄ）ＣＤ９９陽性集団またはＣＤ９９陰性集団を選択する、階層的ゲートを示す。
【図27】図２７は、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ、Ａｉ）、ＣＤ９９陰性細胞（Ｂ、Ｂｉ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ、Ｃｉ）の、ＦＡＣＳの２４時間後に得られた低倍率（Ａ、Ｂ、Ｃ）および高倍率（Ａｉ、Ｂｉ、Ｃｉ）の位相コントラスト画像における細胞の形態を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図28】図２８は、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ、Ａｉ）、ＣＤ９９陰性細胞（Ｂ、Ｂｉ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ、Ｃｉ）の、ＦＡＣＳの４８時間後に得られた低倍率（Ａ、Ｂ、Ｃ）および高倍率（Ａｉ、Ｂｉ、Ｃｉ）の位相コントラスト画像における細胞の形態を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図29】図２９は、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ、Ａｉ）およびＣＤ９９陰性細胞（Ｂ、Ｂｉ）のＦＡＣＳの５日後に得られた低倍率（Ａ、Ｂ）および高倍率（Ａｉ、Ｂｉ）の位相コントラスト画像における細胞の形態を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図30】図３０は、ＦＡＣＳの４８時間後にＫｉ６７およびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ）、ＣＤ９９陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図31】図３１は、ＦＡＣＳの１２日後にＫｉ６７およびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ）およびＣＤ９９陰性細胞（Ｂ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図32】図３２は、ＦＡＣＳの４８時間後にＦＯＸＡ２およびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ）、ＣＤ９９陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図33】図３３は、ＦＡＣＳの４８時間後にＴＨおよびＤＡＰＩについて染色した、ソーティングされたＣＤ９９陽性細胞（Ａ）、ＣＤ９９陰性細胞（Ｂ）、および「パススルー」対照細胞（Ｃ）の代表的な免疫蛍光画像を示す。スケールバー：５０μｍ。
【図35】図３５は、ＦＡＣＳ後の免疫蛍光法によるＫｉ６７＋細胞の定量化を示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７陰性およびＣＤ４７陽性のソーティングされた試料におけるＤＡＰＩによって特定された、全細胞のうちのＫｉ６７＋細胞の割合を示す。
【図36】図３６は、ＦＡＣＳ後の免疫蛍光法によるＳＯＸ２＋細胞の定量化を示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７陰性およびＣＤ４７陽性のソーティングされた試料におけるＤＡＰＩによって特定された、全細胞のうちのＳＯＸ２＋細胞の割合を示す。
【図37】図３７は、ＦＡＣＳ直後に行われた細胞内フローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７（ＣＤ４７－およびＣＤ４７＋）に基づいてソーティングされた試料、およびＣＤ９９と組み合わせたＣＤ４７（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋およびＣＤ４７－ＣＤ９９－）に基づいてソーティングされた試料中の総生細胞のうちのＣＤ４７＋細胞の割合を示す。
【図38】図３８は、ＦＡＣＳ直後に行われた細胞内フローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７（ＣＤ４７－およびＣＤ４７＋）に基づいてソーティングされた試料、およびＣＤ９９と組み合わせたＣＤ４７（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋およびＣＤ４７－ＣＤ９９－）に基づいてソーティングされた試料中の総生細胞のうちのＣＤ９９＋細胞の割合を示す。
【図39】図３９は、ＦＡＣＳ直後に行われた細胞内フローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７（ＣＤ４７－およびＣＤ４７＋）に基づいてソーティングされた試料、およびＣＤ９９と組み合わせたＣＤ４７（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋およびＣＤ４７－ＣＤ９９－）に基づいてソーティングされた試料中の総生細胞のうちのＳＯＸ２＋細胞の割合を示す。
【図40】図４０は、ＦＡＣＳ直後に行われた細胞内フローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７（ＣＤ４７－およびＣＤ４７＋）に基づいてソーティングされた試料、およびＣＤ９９と組み合わせたＣＤ４７（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋およびＣＤ４７－ＣＤ９９－）に基づいてソーティングされた試料中の総生細胞のうちのＫｉ６７＋細胞の割合を示す。
【図41】図４１は、ＦＡＣＳ直後に行われた細胞内フローサイトメトリー分析からの結果の棒グラフを示す。このグラフは、ソーティングされていない試料、ならびにＣＤ４７（ＣＤ４７－およびＣＤ４７＋）に基づいてソーティングされた試料、およびＣＤ９９と組み合わせたＣＤ４７（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋およびＣＤ４７－ＣＤ９９－）に基づいてソーティングされた試料中の総生細胞のうちのＩＮＡ＋細胞の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践は、別段の指示がない限り、当業者に公知の化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。
【0016】
すべての見出しおよび小見出しが、本明細書では便宜上使用されているだけであり、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことに留意されたい。
【0017】
本明細書で提示する任意およびすべての例または例示的な語句（例えば「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に本発明をより明瞭にするという意図しかなく、別段の請求がない限り、本発明の範囲を制限するものではない。
【0018】
以下、本発明による方法は、非限定的な実施形態および実施例によってより詳細に記載される。
【0019】
定義
一般的な定義
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。
一般的な定義
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書に別段示されない限り、単数形で提示される用語は、複数の状況も含む。
【0020】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する記載された項目のうちの１つ以上のうちのいずれかおよびすべての可能な組み合わせ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、かつそれらを包含する。さらに、本発明はまた、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。
【0021】
幹細胞
「幹細胞」は、分化能および増殖能（特に自己複製能力）を有するが、分化能を維持する未分化細胞として理解されるべきである。幹細胞は、分化能に従って、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、単能性幹細胞およびこれらに類するものなどの分類を含む。
「幹細胞」は、分化能および増殖能（特に自己複製能力）を有するが、分化能を維持する未分化細胞として理解されるべきである。幹細胞は、分化能に従って、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、単能性幹細胞およびこれらに類するものなどの分類を含む。
【0022】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）とは、インビトロで培養することができ、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する任意の細胞系統に分化する効力を有する幹細胞を指す。
【0023】
多能性幹細胞は、受精卵、体細胞核移植胚、生殖幹細胞、組織中の幹細胞、体細胞、およびこれらに類するものから誘導または単離され得る。多能性幹細胞（ＰＳＣ）の例としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性胚細胞（ＥＧ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、およびこれらに類するものが含まれる。
【0024】
本明細書で使用される場合、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知）という用語は、ＰＳＣではなく、かつ核を有する細胞から直接生成され得る１つのタイプの多能性幹細胞を意味する。多能性関連遺伝子の特定のセットの産物の導入によって、非多能性細胞は、多能性幹細胞に変換され得る。
【0025】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞を意味する。多能性胚性幹細胞はまた、例えば、国際公開第２００３／０４６１４１号に記載されるような単為生殖生物に由来してもよい。胚性幹細胞は、単一の割球から、または胚を破壊することなく取得された内部細胞塊を培養することによって産生され得る。胚性幹細胞は、所与の組織から入手可能であり、市販されている。好ましくは、本発明の方法および産物は、ヒトＰＳＣ、すなわち、ヒト誘導多能性幹細胞、または単為生殖生物を含むヒト胚性幹細胞のいずれかに由来する幹細胞に基づく。
【0026】
本明細書で使用される場合、「多分化能性幹細胞」という用語は、すべての種類ではないが、複数のタイプの組織または細胞に分化する効力を有する幹細胞を意味し、典型的には１つの胚葉に限定されない。神経系幹細胞は、神経系統に限定される多分化能性幹細胞の一例である。
【0027】
本明細書で使用される場合、「単能性幹細胞」という用語は、１つの特定の細胞型のみに分化する効力を有する幹細胞を意味する。
【0028】
本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、細胞が、フラスコ、マルチウェル、またはペトリ皿のような容器などにおいて、ヒトまたは動物の体外で提供および維持されることを意味する。したがって、細胞は、細胞培養培地中で培養されるということになる。
【0029】
本明細書で使用される場合、「非天然」という用語は、多能性幹細胞に由来するが、ヒト起源であり得る細胞が、自然界には存在しない人工構築物であることを意味する。一般に、幹細胞療法の分野では、ヒト身体の細胞にできるだけ似た細胞を提供することが目的である。しかしながら、多能性幹細胞が胚性および胎児段階に受ける発達を、成熟細胞がヒト身体の天然細胞と区別できない程度まで模倣することは、可能とならないかもしれない。本質的に、本発明の一実施形態では、細胞は人工的である。
【0030】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「人工」という用語は、自然界で自然発生であるが、自然発生ではない構築物に改変された材料を含み得る。これは、人体の細胞を模倣する非自然発生の細胞に分化する、ヒト幹細胞を含む。
【0031】
細胞集団のある特定の割合、例えば、細胞集団のＸ％が、ある特定のマーカーを発現することを指す場合、その細胞集団における細胞の割合、すなわち、その細胞集団における細胞のＸ％を意味する。
【0032】
プロトコル
本出願全体を通して、細胞を培養するまたは分化させるためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。
本出願全体を通して、細胞を培養するまたは分化させるためのプロセスを指す場合の「方法」および「プロトコル」という用語は、互換的に使用され得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、プロトコルに関する「日」および同様にインビトロでの日数（ＤＩＶ）という用語は、分化手順中のある特定の工程を実施するための特定の時間を指す。
【0034】
一般的に、かつ別段の定めのない限り、「０日目」は、プロトコルの開始を指し、これは例えば、幹細胞をプレーティングすること、または幹細胞をインキュベーターに移すこと、または幹細胞の移植前に、現在の細胞培養培地中の幹細胞を化合物と接触することによるが、これらに限定されない。典型的には、プロトコルの開始は、未分化幹細胞を別の細胞培養培地および／または容器に移すことにより、例えば、限定されないが、プレーティングもしくはインキュベートすることにより、および／または未分化幹細胞を、分化プロセスが開始されるような方法で未分化幹細胞に影響を及ぼす化合物（複数可）と最初に接触させることによって行われる。
【0035】
方法における「細胞」を指す場合、細胞型に関係なく、細胞集団のすべての細胞を意味する。
【0036】
１日目、２日目などの「Ｘ日目」に言及する場合、これは、０日目のプロトコル開始に関連するものである。当業者は、別段の指定がない限り、工程を実施するための正確な日時が変動し得ることを認識するであろう。したがって、「Ｘ日目」は、±１０時間、±８時間、±６時間、±４時間、±２時間、または±１時間などの時間範囲を包含することを意味する。
【0037】
幹細胞の培養
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、連続的手順を指し、これは、細胞の様々な段階での生存率を維持するために、方法全体を通して用いられる。目的の細胞が、例えば、限定されないが、生体組織または胚から単離された後、それらは続いて、注意深く制御された条件下で維持される。これらの条件は、各細胞型によって異なるが、一般に、必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、増殖因子、ホルモン、および気体（ＣＯ２、Ｏ２）を供給し、物理化学的環境（ｐＨ緩衝液、浸透圧、温度）を調節する基質および／または培地を備えた適切な容器から成る。
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、連続的手順を指し、これは、細胞の様々な段階での生存率を維持するために、方法全体を通して用いられる。目的の細胞が、例えば、限定されないが、生体組織または胚から単離された後、それらは続いて、注意深く制御された条件下で維持される。これらの条件は、各細胞型によって異なるが、一般に、必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、増殖因子、ホルモン、および気体（ＣＯ２、Ｏ２）を供給し、物理化学的環境（ｐＨ緩衝液、浸透圧、温度）を調節する基質および／または培地を備えた適切な容器から成る。
【0038】
本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」という用語は、細胞の増殖を支持するように設計された液体またはゲルを指す。細胞培養培地は概して、細胞周期を調節する適切なエネルギー源および化合物を含む。
【0039】
本明細書で使用される場合、「インキュベーター」という用語は、細胞培養を支持し得る任意の好適なインキュベーターを指す。非限定的な例としては、培養皿、ペトリ皿、およびプレート（６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、９６００ウェルおよびこれらに類するもののマイクロタイタープレート、マイクロプレート、ディープウェルプレートなど）、フラスコ、チャンバースライド、チューブ、Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙシステム、ローラーボトル、スピナーフラスコ、中空繊維、マイクロキャリア、またはビーズが挙げられる。
【0040】
本明細書で使用される場合、プロトコルにおいて言及される場合「幹細胞を提供する」という用語は、上述のような方法によって細胞のバッチを取得すること、および任意選択で、細胞を新しい基質上に播種することなどによって、異なる環境に移動させることを意味する。当業者は、幹細胞がそのような移動に対して脆弱であり、手順が注意を必要とすること、および幹細胞を元の細胞培養培地中で維持することが、細胞培養培地をさらなる分化プロセスにより適した別の細胞培養培地で置き換える前に、細胞のより持続可能な移動を促進し得ることを容易に認識するであろう。
【0041】
幹細胞の分化
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連して「発現する」という用語は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、ＲＮＡシークエンシング、およびこれに類するものなどのアッセイを使用して検出され得るＲＮＡ分子、ならびに／または例えば、フローサイトメトリー、免疫細胞化学／免疫蛍光法、およびこれに類するものなどの抗体ベースのアッセイを使用して検出され得るタンパク質の存在を指す。アッセイの感度および特異性に応じて、遺伝子またはタンパク質は、ＲＮＡシークエンシングなどにおいて最低１つの分子が検出されたときに発現されるとみなされてもよく、またはバックグラウンド／ノイズレベルを超える検出限界が、フローサイトメトリーなどの対照試料に関連して定義されてもよい。細胞または細胞集団におけるマーカーの発現は、実施例９に記載される方法によって決定され得る。
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連して「発現する」という用語は、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、ＲＮＡシークエンシング、およびこれに類するものなどのアッセイを使用して検出され得るＲＮＡ分子、ならびに／または例えば、フローサイトメトリー、免疫細胞化学／免疫蛍光法、およびこれに類するものなどの抗体ベースのアッセイを使用して検出され得るタンパク質の存在を指す。アッセイの感度および特異性に応じて、遺伝子またはタンパク質は、ＲＮＡシークエンシングなどにおいて最低１つの分子が検出されたときに発現されるとみなされてもよく、またはバックグラウンド／ノイズレベルを超える検出限界が、フローサイトメトリーなどの対照試料に関連して定義されてもよい。細胞または細胞集団におけるマーカーの発現は、実施例９に記載される方法によって決定され得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「マーカー」という用語は、細胞によって作製された自然発生の特定可能な発現を指し、これは、細胞のある特定の特性と相互に関連付けられ得る。好ましい実施形態では、マーカーは、検出することができ、細胞の同一性と相互に関連付けることができる、遺伝子発現またはプロテオミクス発現である。マーカーは、遺伝子と呼ばれる場合がある。これは、対応するｍＲＮＡおよびタンパク質の発現に容易に翻訳され得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、本明細書に開示される表面タンパク質または転写因子などの任意のマーカーに関して使用される「陰性」または「－」という用語は、細胞または細胞集団において発現されていないマーカーを指し、一方で、「弱い」または「低い」という用語は、細胞集団におけるマーカーの平均発現と比較して、または参照試料と比較して、細胞において低減されたレベルで発現されているマーカーを指す。
【0044】
本明細書で使用される場合、本明細書に開示される表面タンパク質または転写因子などの任意のマーカーに関して使用される「陽性」または「＋」という用語は、細胞または細胞集団で発現されているマーカーを指し、一方で、「高い」または「強い」という用語は、細胞集団におけるマーカーの平均発現と比較して、または参照試料と比較して、細胞において増加したレベルで発現されるマーカーを指す。
【0045】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、例えば、未成熟状態から低い未成熟状態へ、または未成熟状態から成熟状態へ、細胞が未分化状態または意図された分化状態とは異なる状態から特定の分化状態に進行するプロセスを広く指し、これは、方法の実施中に継続的に生じ得る。多能性幹細胞に関する「分化」という用語は、細胞が未分化状態から特定の分化状態へ、すなわち、未成熟状態から低い未成熟状態または最終状態へと進行するプロセスを指す。細胞相互作用および成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを喪失するまたは分化細胞のマーカーを獲得するときに生じる。単一マーカーの喪失または獲得は、細胞が「完全に分化」または「最終分化」されたことを示し得る。「最終分化」細胞は、発達系統の最終段階であり、さらに分化することができない。
【0046】
本明細書で使用される場合、細胞を培養するまたは分化させることに関する「接触」という用語は、特定の化合物を、それが細胞に触れて「接触した」細胞を産生することを可能にする場所に配置することによって、細胞を、例えば、特定の化合物に曝露することを意味する。接触は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。接触の非限定的な例は、化合物を細胞の細胞培養培地に添加することによる。細胞の接触は、細胞および特定の化合物が近接している限り、例えば、化合物が細胞培養培地中に好適な濃度で存在する限り、起こるものと想定される。
【0047】
本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、細胞分化を促進することができるシグナル伝達経路などのプロセスを低減または抑制または下方制御する化合物を指す。
【0048】
本明細書で使用される場合、「活性剤」という用語は、細胞分化を促進することができるシグナル伝達経路などのプロセスを誘導または刺激または上方制御する化合物を指す。
【0049】
本明細書で使用される場合、プロトコルの工程を説明するとき、細胞は、「細胞」、「分化細胞」、または場合によってはＰＳＣもしくは「ＰＳＣ由来細胞」と呼ばれてもよい。当業者であれば、ＰＳＣを特殊化細胞に分化させるためのプロトコルの間、ある時点で細胞が多能性を喪失することを認識するであろう。したがって、例えば、細胞を化合物と接触させる工程において「細胞」または「ＰＳＣ」に言及する場合、最初に多能性幹細胞であった細胞を意味する。
【0050】
幹細胞産物
本明細書で使用される場合、「分化細胞」という用語は、未分化状態から低い未成熟状態へと進行した多能性幹細胞などの細胞を指す。分化細胞は、例えば、前駆細胞などの低い未成熟状態の特殊化細胞であってもよく、または特殊化／最終細胞型に完全に成熟していてもよい。
本明細書で使用される場合、「分化細胞」という用語は、未分化状態から低い未成熟状態へと進行した多能性幹細胞などの細胞を指す。分化細胞は、例えば、前駆細胞などの低い未成熟状態の特殊化細胞であってもよく、または特殊化／最終細胞型に完全に成熟していてもよい。
【0051】
本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、同じ培養物中の複数の細胞を指す。細胞集団は、例えば、異なるタイプの細胞、または同一もしくは類似の特殊化した特徴に向かって様々な成熟段階にある細胞などの様々な発達段階にある細胞の混合物であってもよく、あるいは共通マーカーを有する細胞のより均一な組成物であってもよい。本明細書で使用される場合、「細胞集団のＸ％」および「細胞のＸ％」など、細胞集団または細胞の割合への言及は、互換的に使用され得る。
【0052】
本明細書で使用される場合、「神経系細胞集団」という用語は、神経系細胞を含む細胞集団を指す。
【0053】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「遺伝子改変された」という用語は、遺伝子編集に供され、もはや自然発生の細胞とはみなすことができない細胞を指す。遺伝子改変された幹細胞の場合、幹細胞が特殊化細胞にさらに分化するときでさえも、遺伝子編集から生じる形質は持続し、したがって、特殊化細胞を遺伝子改変され、人工的な状態、すなわち、非自然発生の状態にする。遺伝子改変された幹細胞の一例は、ＨＬＡ欠失幹細胞であり、これはユニバーサルドナー細胞とも呼ばれ、移植片拒絶の問題を克服することを意図する。ＨＬＡ欠失幹細胞を取得するための方法は、国際公開第２０２０／２６０５６３号に開示されている。
【0054】
神経外胚葉細胞
本明細書で使用される場合、「神経系（ｎｅｕｒａｌ）」という用語は、神経系（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）を指す。
本明細書で使用される場合、「神経系（ｎｅｕｒａｌ）」という用語は、神経系（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）を指す。
【0055】
本明細書で使用される場合、「神経系細胞」という用語は、非天然細胞を指し、天然の対応部分は、天然に外胚葉の胚葉、より具体的には神経外胚葉の一部を形成し、神経系幹細胞からニューロンおよび他の最終分化細胞型（例えば、グリア細胞）に至るまで、すなわち、神経系幹細胞段階および神経芽細胞段階などの細胞段階など、この胚葉内の任意の発達段階の細胞を包含することを意味する。したがって、ニューロンおよびその前駆体は、特定のタイプの神経系細胞とみなされる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「ニューロン」および「神経細胞」という用語は、有糸分裂後であり、最終的に特殊化細胞に分化した神経系細胞を指すために互換的に使用され得る。ニューロン同一性は、マーカーＩＮＡ、ＳＴＭＮ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上の発現を特徴とする。
【0057】
本明細書で使用される場合、「神経芽細胞」という用語は、典型的には多分化能性または単に単能性であり、限られた程度までのみ自己再生することができる、中間前駆細胞を指す。神経芽細胞は、最終的に、ニューロンまたは星状細胞などの最終分化細胞型を生じさせる。「神経芽細胞」および「中間前駆細胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」および「中間前駆細胞（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」という用語は、互換的に使用され得る。中間前駆細胞同一性は、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上の発現を特徴とする。
【0058】
本明細書で使用される場合、「ニューロン前駆体（ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」、「ニューロンの前駆体」、および「ニューロン前駆体（ｎｅｕｒｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」という用語は、互換的に使用され得、ニューロンにさらに特殊化する可能性または傾向を有する神経系細胞を指す。「ニューロン前駆体」および「非天然ニューロン前駆体」という用語は、互換的に使用され得る。
【0059】
本発明に従った神経系細胞は、前脳、中脳、後脳、脊髄などに特異的な細胞などの特定の局所的同一性を有し得る。
【0060】
本明細書で使用される場合、「前脳」という用語は、大脳皮質および線条体を含む構造を生じさせる神経系管およびＣＮＳの吻側領域を指す。
【0061】
本明細書で使用される場合、「中脳」という用語は、黒質を含む構造を生じさせる（吻側尾側軸上の）神経系管およびＣＮＳの内側領域を指す。
【0062】
本明細書で使用される場合、「後脳」および「脊髄」という用語は、峡部オーガナイザーに対して尾側である神経系管の尾側領域を指す。
【0063】
本明細書で使用される場合、「ドーパミン作動性（ＤＡ）細胞」または「ドーパミン作動性ニューロン」または「ドーパミンニューロン」という用語は、神経伝達物質ドーパミンを合成することができる細胞を指す。
【0064】
細胞集団をニューロンおよび／またはその前駆体において富化するための方法
本発明の一態様は、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
本発明の一態様は、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
【0065】
本発明の別の態様は、細胞集団をニューロンおよび／またはその前駆体において富化するための方法であって、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、１つ以上の陽性マーカーに対して陽性の細胞を選択する工程、および／または１つ以上の陰性マーカーに対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
【0066】
本明細書で使用される場合、細胞集団に関する「～において富化する」という用語は、細胞集団における所望の細胞型の割合を増加させることを意味する。具体的には、本明細書で使用される場合、「細胞集団をニューロンおよび／またはその前駆体において富化する」という用語は、細胞集団中のニューロンおよび／またはその前駆体の割合を増加させることを意味する。したがって、「～が富化された」細胞集団とは、その細胞集団が、所望の細胞型において富化する方法に供されていない参照細胞集団と比較して、当該所望の細胞型の増加した割合を有することを意味するということになる。好ましい実施形態では、細胞集団は、所望の細胞型を単離することによって富化される。本明細書で使用される場合、細胞集団に関する「単離」という用語は、細胞集団から望ましくない細胞を除去すること、または細胞集団から所望の細胞型を回収することのいずれかによって、望ましくない細胞から所望の細胞型を分離することを意味する。したがって、細胞集団をニューロンおよび／またはその前駆体において富化するための方法は、代替的に、細胞集団からニューロンおよび／またはその前駆体を単離するための方法として表されてもよく、本明細書に記載される実施形態は、両方に等しく適用される。
【0067】
したがって、本発明は、細胞集団からニューロンおよび／またはその前駆体を単離するための方法であって、神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程と、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法に関する。
【0068】
一実施形態では、神経系幹細胞は、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域のものである。一実施形態では、神経系幹細胞は、腹側中脳神経系幹細胞である。
【0069】
本明細書で使用される場合、神経系幹細胞および／またはニューロン前駆体を含む細胞集団に関する「取得」という用語は、ＰＳＣなどの細胞の分化を誘導するための任意の方法に従って取得可能な細胞のバッチを得ることを意味し、細胞は、神経系幹細胞および／またはニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化する。
【0070】
本明細書で使用される場合、ある特定のマーカーを発現する細胞を含む細胞集団に関する「選択」という用語は、工程を実施する前の初期細胞集団と比較して、マーカーを発現しない細胞の画分と比較して、マーカーを発現する細胞の画分が増加した細胞集団をもたらすことが意図される工程を実施することを意味する。マーカーを発現する細胞を単離すること、または細胞を分離することなど、ある特定のマーカーを発現する細胞を選択するための任意の好適な方法が使用され得る。
【0071】
本明細書で使用される場合、ある特定のマーカーを発現する細胞に関する「除外」という用語は、工程を実施する前の初期細胞集団と比較して、マーカーを発現しない細胞の画分と比較して、マーカーを発現する細胞の画分が減少した細胞集団をもたらすことが意図される工程を実施することを意味する。マーカーを発現する細胞を激減させること、または細胞を分離することなど、ある特定のマーカーを発現する細胞を除外するための任意の好適な方法が使用され得る。ある特定のマーカーを発現する細胞を選択および／または除外するための方法の非限定的な例は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、またはイムノパニングなどの抗体媒介ソーティングである。したがって、好ましい実施形態では、陽性および陰性マーカーは、表面マーカーであるということになる。
【0072】
本明細書で使用される場合、「陽性マーカー」という用語は、細胞を選択するために使用され得るマーカーを指し、マーカーＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５を含む。
【0073】
本明細書で使用される場合、「陰性マーカー」という用語は、細胞を除外するために使用され得るマーカーを指し、マーカーＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１を含む。
【0074】
一実施形態では、方法は、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得することを含む。ニューロン前駆体を含む細胞集団は、マーカーＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を最初に取得することによって得られてもよく、細胞集団は、細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が減少するまでさらに培養され、それによって、神経系幹細胞が中間前駆細胞にさらに分化し、そのうちの一部がニューロン前駆体であることを示す。この段階では、方法に従った表面マーカーは、ニューロン運命を有する細胞を単離するための細胞の選択および／または除外に適している。したがって、一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団は、マーカーＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程、および神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が減少するまで、神経系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程によって取得される。一実施形態では、神経系幹細胞を含む取得された細胞集団の少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％、好ましくは少なくとも９５％が、ＳＯＸ２を発現する。一実施形態では、神経系幹細胞を含む細胞集団は、細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が、少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％、好ましくは少なくとも２０％減少するまで培養される。一実施形態では、神経系幹細胞を含む取得された細胞集団の少なくとも９０％が、ＳＯＸ２を発現し、細胞は、少なくとも９０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、好ましくは８０％未満がＳＯＸ２を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、さらに培養される。
【0075】
一実施形態では、工程ｃ）での選択および／または除外は、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される。
【0076】
別の実施形態では、細胞を選択および／または除外するためのタイミングは、ＳＯＸ２の代わりにＣＤ９９の発現に基づいて決定される。したがって、一実施形態では、工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＣＤ９９を発現する。一実施形態では、細胞集団は、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ９９の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまで、工程ｂ）でさらに培養される。一実施形態では、工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも９０％が、ＣＤ９９を発現し、細胞は、少なくとも９０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、好ましくは８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、工程ｂ）でさらに培養される。一実施形態では、工程ｃ）の選択および／または除外は、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される。
【0077】
好ましい実施形態では、陽性マーカーおよび陰性マーカーに基づいて細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団は、中間前駆細胞および／またはニューロンを含む。一実施形態では、細胞を選択および／または除外する工程を実施するときに、細胞集団の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％が、中間前駆体同一性またはニューロン同一性を発現する。一実施形態では、細胞集団は、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上の発現が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％になるまで培養される。一実施形態では、細胞集団は、マーカーＩＮＡ、ＳＴＭＮ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上の発現が、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％になるまで培養される。
【0078】
一実施形態では、細胞を選択および／または除外する工程を実施するときに、細胞集団の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＨＬＨ１、ＩＮＡ、ＳＴＭＮ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である。
【0079】
一実施形態では、細胞を選択および／または除外する時点で、細胞集団の１０～９０％、例えば、１０～８０％、１０～７０％、１０～６０％、または１０～５０％が、ＳＯＸ２に対して陽性であり、細胞集団の５～５０％、例えば、５～４０％、５～３０％、５～２０％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性であり、細胞集団の５～２０％、例えば、５～１５％、または５～１０％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である。
【0080】
一実施形態では、神経系細胞は、腹側中脳同一性のものであり、細胞集団の少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％が、細胞を選択および／または除外する工程を実施するときに、マーカーＡＳＣＬ１およびＩＮＡのうちの一方または両方に対して陽性である。
【0081】
一実施形態では、マーカーＣＤ４７に対して陽性の細胞は、除外される。一実施形態では、マーカーＣＤ９９に対して陽性の細胞は、除外される。
【0082】
一実施形態では、方法は、選択および／または除外の工程の後にニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程を含む。
【0083】
一実施形態では、方法は、選択および／または除外の工程の後に、ならびに任意選択でニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程の後に、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された神経系細胞集団を回収するさらなる工程を含む。
【0084】
一実施形態では、回収された細胞は、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陰性である。
【0085】
一実施形態では、細胞集団は、神経系細胞集団である。一実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が、神経系細胞である。
【0086】
一実施形態では、富化された細胞集団は、ニューロンに発達する傾向が増加している。本明細書で使用される場合、細胞特殊化に関する「傾向」という用語は、細胞がある特定の細胞型に発達する可能性を指す。したがって、ある特定の細胞型に発達する細胞集団の傾向を増加させることは、その細胞型に発達する可能性が高い細胞の割合を増加させることを意味する。
【0087】
一実施形態では、ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、腹側中脳、腹側脊髄、背側前脳、または腹側前脳領域のものである。
【0088】
特定の実施形態では、ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％が、腹側中脳領域のものである。
【0089】
ある特定の実施形態では、腹側中脳領域の細胞集団、およびマーカーＣＤ４７に対して陽性の細胞は、細胞集団の少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％が、マーカーＡＳＣＬ１およびＩＮＡのうちの１つを発現する時点で除外される。さらなる実施形態では、マーカーＣＤ４７およびＣＤ９９のいずれかに対して陽性の細胞は、除外される。
【0090】
別の実施形態では、腹側脊髄、背側前脳、または腹側前脳の細胞集団、およびマーカーＣＤ９９に対して陽性の細胞は、除外される。
【0091】
ある特定の実施形態では、細胞の選択および／または除外は、抗体媒介セルソーティングによって実施される。さらなる実施形態では、細胞の選択および／または除外は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、もしくはイムノパニングを使用して、または参照試料と比較して実施され、好ましくは、選択および／または除外は、ＭＡＣＳを使用して実施される。
【0092】
一実施形態では、神経系細胞集団は、インビトロ細胞培養物である。一実施形態では、神経系細胞集団の細胞は、非天然である。
【0093】
当業者は、細胞段階を示すある特定のマーカーの発現が細胞において内部で発現され得、例えば、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑによって分析され得るが、他のマーカーは、細胞表面上に発現され、ＦＡＣＳなどの抗体媒介分析が使用され得ることを認識するであろう。表面マーカーに基づく細胞の選択および／または除外のタイミングは、例えば、ＳＯＸ２の発現について試料を分析することによって確立され得る。典型的には、例えば、神経系幹細胞を取得するためのプロトコルの設計中に、プロトコル中の細胞発現が分析され、その結果、プロトコルにおける選択および／または除外のタイミングは、産生設定中のマーカーの発現をさらにモニタリングする必要なく決定され得る。
【0094】
ニューロン前駆体を含む神経系細胞を取得するための方法
一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団は、ＰＳＣ、好ましくはｈＰＳＣに由来する。ある特定の実施形態では、ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞である。
一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団は、ＰＳＣ、好ましくはｈＰＳＣに由来する。ある特定の実施形態では、ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞またはヒト誘導多能性幹細胞である。
【0095】
方法の一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程は、ＰＳＣがニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む。ある特定の実施形態では、ＰＳＣは、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤と接触する。
【0096】
本明細書で使用される場合、「ＳＭＡＤシグナル伝達経路」という用語は、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）タンパク質シグナル伝達経路を指す。一実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、およびＬＤＮ－１９３１８９から選択される。一実施形態では、ＰＳＣは、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の２つ以上の阻害剤と接触する。当業者は、ＰＳＣをＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤と接触させることが、細胞を神経系統に分化させるための堅牢な技法であることを認識するであろう。
【0097】
一実施形態では、ＰＳＣは、０日目にＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤と接触する。さらなる実施形態では、ＰＳＣは、少なくとも５日間、例えば、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、または少なくとも１０日間、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤と接触する。
【0098】
方法の一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得することは、ＰＳＣが前脳、中脳、後脳、または脊髄領域の神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む。細胞が中脳、後脳、または脊髄領域に分化する一実施形態では、細胞は、ＷＮＴ経路の少なくとも１つの活性剤と接触する。一実施形態では、細胞は、０日目～５日目、好ましくは０日目に、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つの活性剤と接触する。一実施形態では、細胞は、少なくとも５日間、例えば、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つの活性剤と接触する。一実施形態では、細胞は、細胞をＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤と接触させることと同時に、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つの活性剤と接触する。
【0099】
本明細書で使用される場合、「ＷＮＴ経路」という用語は、ＷＮＴシグナル伝達経路を指す。一実施形態では、ＷＮＴ経路の少なくとも１つの活性剤は、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３阻害剤である。したがって、一実施形態では、ＰＳＣは、ＣＨＩＲ９９０２１と接触する。
【0100】
方法の一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得することは、ＰＳＣが神経系管の腹側領域の神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む。かかる実施形態では、細胞は、ＳＨＨシグナル伝達経路の活性剤と接触してもよい。本明細書で使用される場合、「ＳＨＨ」という用語は、ソニックヘッジホッグを指す。一実施形態では、細胞は、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃ２４ＩＩ、プルモルファミン、およびＳＡＧ（平滑化作動薬）から選択される化合物と接触する。一実施形態では、細胞は、少なくとも７日目、例えば、少なくとも６日目、少なくとも５日目、少なくとも４日目、少なくとも３日目、少なくとも２日目、少なくとも１日目、または０日目から、ＳＨＨシグナル伝達経路の活性剤と接触する。好ましい実施形態では、細胞は、細胞をＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤と接触させることと同時に、ＳＨＨシグナル伝達経路の活性剤と接触する。
【0101】
方法の一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得することは、ＰＳＣが中脳または後脳領域の神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む。かかる実施形態では、細胞は、ＦＧＦ８、好ましくはＦＧＦ８ｂと接触してもよい。本明細書で使用される場合、「ＦＧＦ」という用語は、線維芽細胞増殖因子を指す。一実施形態では、細胞は、５日目～１５日目、好ましくは８日目～１０日目、例えば、９日目にＦＧＦ８と接触する。一実施形態では、細胞は、少なくとも２日間、例えば、少なくとも５日間または６日間、ＦＧＦ８と接触する。一実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤への細胞の曝露を終了するときに、ＦＧＦ８と接触する。
【0102】
方法の一実施形態では、ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得することは、ＰＳＣが腹側中脳領域の神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む。
【0103】
神経系細胞を腹側中脳領域に分化させるための一実施形態では、細胞は、Ｌ－アスコルビン酸などのアスコルビン酸と接触する。一実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤への細胞の曝露を終了するときに、アスコルビン酸と接触する。一実施形態では、細胞は、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、または１３日目から、好ましくは１１日目からアスコルビン酸と接触する。好ましい実施形態では、細胞は、神経系細胞を回収する工程までアスコルビン酸と接触する。
【0104】
神経系細胞を腹側中脳領域に分化させるための一実施形態では、細胞は、ＢＤＮＦと接触する。本明細書で使用される場合、「ＢＤＮＦ」という用語は、脳由来の神経栄養因子を指す。一実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤への細胞の曝露を終了するときに、ＢＤＮＦと接触する。一実施形態では、細胞は、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、または１３日目から、好ましくは１１日目からＢＤＮＦと接触する。好ましい実施形態では、細胞は、神経系細胞を回収する工程までＢＤＮＦと接触する。一実施形態では、細胞は、アスコルビン酸およびＢＤＮＦと同時に接触する。
【0105】
神経系細胞を腹側中脳領域に分化させるための一実施形態では、細胞は、ＧＤＮＦと接触する。本明細書で使用される場合、「ＧＤＮＦ」という用語は、グリア由来の神経栄養因子を指す。一実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤への細胞の曝露を終了するときに、ＧＤＮＦと接触する。一実施形態では、細胞は、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、または１８日目から、好ましくは１６日目からＧＤＮＦと接触する。好ましい実施形態では、細胞は、神経系細胞を回収する工程までＧＤＮＦと接触する。
【0106】
神経系細胞を腹側中脳領域に分化させるための一実施形態では、細胞は、ＤＡＰＴまたはＮｏｔｃｈ経路の他の阻害剤と接触する。本明細書で使用される場合、「ＤＡＰＴ」という用語は、（２Ｓ）－Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニン－２－フェニル］グリシン１，１－ジメチルエチルエステルを指す。一実施形態では、細胞は、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤への細胞の曝露を終了するときに、ＤＡＰＴと接触する。一実施形態では、細胞は、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、または１８日目から、好ましくは１６日目からＤＡＰＴと接触する。好ましい実施形態では、細胞は、神経系細胞を回収する工程までＤＡＰＴと接触する。一実施形態では、細胞は、ＧＤＮＦおよびＤＡＰＴと同時に接触する。
【0107】
一実施形態では、ＰＳＣは、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｄ－リシン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ラミニン、フィブロネクチン、ｉＭａｔｒｉｘおよび／もしくはコラーゲン、ならびに／またはそれらの断片などの細胞外マトリックスを含む基質上で培養され、分化する。一実施形態では、基質は、ラミニンまたはその断片、例えば、ラミニン－１１１、ラミニン－５２１、および／またはラミニン－５１１を含む。
【0108】
一実施形態では、ＰＳＣは、細胞を選択および／または除外する工程の前に、少なくとも１０日間、例えば、少なくとも１５日間、少なくとも１８日間、少なくとも２０日間、少なくとも２２日間、少なくとも２５日間、または少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも２０日間、ニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化することができる。
【0109】
一実施形態では、ＰＳＣは、細胞を選択および／または除外する工程の前に、１５日間～５０日間、好ましくは１８日間～４０日間、より好ましくは２０日間～４０日間、より好ましくは２０日間～３０日間、ニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化することができる。一実施形態では、残りのニューロンおよび／またはその前駆体は、細胞を選択および／または除外する工程の後に、さらに分化／成熟することができる。
【0110】
一実施形態では、細胞を選択および／または除外する工程は、ニューロン前駆体を含む神経系細胞へのＰＳＣの分化の開始から１５日目～４０日目に実施される。
【0111】
一実施形態では、神経系細胞は、腹側中脳神経系細胞に分化し、細胞を選択および／または除外する工程は、２２日目～２５日目に実施される。
【0112】
ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団
本発明の別の態様は、ニューロンおよびその前駆体の細胞集団に関し、細胞の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、かつ／または細胞の５０％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である。
本発明の別の態様は、ニューロンおよびその前駆体の細胞集団に関し、細胞の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、かつ／または細胞の５０％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である。
【0113】
一実施形態では、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％の細胞が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である。
【0114】
一実施形態では、細胞の５０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、またはさらにより好ましくは１％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である。
【0115】
一実施形態では、細胞の５０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、またはさらにより好ましくは１％未満が、マーカーＣＤ４７に対して陽性である。
【0116】
一実施形態では、細胞の５０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、またはさらにより好ましくは１％未満が、マーカーＣＤ９９に対して陽性である。
【0117】
一実施形態では、細胞の５０％未満、好ましくは４５％未満、より好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、またはさらにより好ましくは１％未満が、マーカーＣＤ４７およびＣＤ９９に対して陽性である。
【0118】
一実施形態では、細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体、腹側脊髄ニューロンおよび／またはその前駆体、背側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体、ならびに腹側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体から選択される。
【0119】
一実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％が、マーカーＦＯＸＡ２に対して陽性である。
【0120】
一実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体である。
【0121】
ある特定の実施形態では、細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％が、神経芽細胞および／またはニューロンである。
【0122】
一実施形態では、細胞集団の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またはさらにより好ましくは少なくとも９９％が、マーカーＡＳＣＬ１およびＩＮＡのうちの一方または両方に対して陽性である。
【0123】
一実施形態では、細胞集団は、ニューロンに発達する傾向が増加している。
【0124】
一実施形態では、細胞集団は、インビトロである。
【0125】
一実施形態では、細胞集団は、神経系細胞集団である。
【0126】
一実施形態では、細胞集団は、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化される。
【0127】
一実施形態では、細胞集団の細胞は、インビトロ分化細胞である。
【0128】
一実施形態では、細胞集団の細胞は、非天然細胞である。
【0129】
一実施形態では、細胞集団の細胞は、ｈＰＳＣに由来する。
【0130】
一実施形態では、細胞集団の細胞は、遺伝子改変されている。さらなる実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＨＬＡ欠失である。
【0131】
一実施形態では、細胞集団は、少なくとも１，０００個の細胞、例えば、少なくとも１００，０００個の細胞、少なくとも１，０００，０００個の細胞、または少なくとも１０，０００，０００個の細胞を含む。
【0132】
一実施形態では、細胞集団は、上述の方法のいずれかによって取得される。
【0133】
医薬組成物および医薬としての使用
本発明の一態様は、本明細書に記載される富化された細胞集団を含む組成物に関する。組成物は、凍結保護剤および／または生体材料、例えば、細胞外マトリックスなど、薬理学的に許容可能である任意の好適な添加剤を含んでもよい。
本発明の一態様は、本明細書に記載される富化された細胞集団を含む組成物に関する。組成物は、凍結保護剤および／または生体材料、例えば、細胞外マトリックスなど、薬理学的に許容可能である任意の好適な添加剤を含んでもよい。
【0134】
別の態様は、医薬として使用するための本発明に従った組成物または細胞集団に関する。したがって、一実施形態では、組成物または細胞集団は、ニューロンおよび／またはその前駆体の投与を必要とする状態の予防または治療のためのものである。
【0135】
一実施形態では、組成物または細胞集団は、パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、てんかん、失明、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態などの神経学的状態の治療で使用するためのものである。
【0136】
特定の実施形態では、細胞集団は、パーキンソン病の治療のための腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体を含む。
【0137】
特定の実施形態では、細胞集団は、脳卒中による損傷の治療のための皮質ニューロンおよび／またはその前駆体を含む。
【0138】
別の態様では、本発明に従った有効量の細胞集団または組成物の患者への投与を含む、神経学的状態の治療または予防方法が提供される。
【0139】
特定の実施形態
本発明の態様を、これより、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載する。
１．細胞集団からニューロンおよび／またはその前駆体を単離するための方法であって、
ａ）ＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程と、
ｂ）神経系幹細胞を含む細胞集団をさらに培養する工程と、
ｃ）ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法。
２．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＳＯＸ２を発現する、実施形態１に記載の方法。
３．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１または２に記載の方法。
４．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも９０％が、ＳＯＸ２を発現し、細胞集団が、少なくとも９０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、好ましくは８０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．工程ｃ）での選択および／または除外が、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＣＤ９９を発現する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ９９の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも９０％が、ＣＤ９９を発現し、細胞集団が、少なくとも９０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、好ましくは８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．工程ｃ）での選択および／または除外が、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．細胞集団が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上の発現が、少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、または２０％になるまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．細胞集団が、マーカーＩＮＡ、ＳＴＭＮ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上の発現が少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、または２０％になるまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．工程ｃ）で細胞を選択および／または除外する時点で、細胞集団の１０～９０％が、ＳＯＸ２に対して陽性であり、細胞集団の５～５０％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性であり、細胞集団の５～２０％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．工程ａ）の神経系幹細胞を含む細胞集団が、少なくとも１４日間、ＰＳＣの神経誘導によって取得される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．神経系幹細胞が、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域のものである、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．神経系幹細胞が、腹側中脳神経系幹細胞である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、
－ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、
－ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／または
－ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法。
１８．ニューロン前駆体を含む細胞集団が、マーカーＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程、および神経系幹細胞を含む細胞集団におけるマーカーＳＯＸ２の発現が減少するまで、神経系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程によって取得される、実施形態１７に記載の方法。
１９．取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＳＯＸ２を発現する、実施形態１８に記載の方法。
２０．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまでさらに培養される、実施形態１９に記載の方法。
２１．神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＳＯＸ２に対して陽性であり、神経系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＯＸ２の発現が８０％未満になるまで培養される、実施形態１８または１９に記載の方法。
２２．マーカーＣＤ４７に対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．マーカーＣＤ９９に対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．マーカーＣＤ９９およびＣＤ４７のいずれかに対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．細胞集団の少なくとも８０％が、神経系細胞である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、中間前駆体同一性またはニューロン同一性を発現する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．細胞集団が、ＰＳＣ、好ましくはｈＰＳＣに由来する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．細胞集団を取得することが、ＰＳＣがニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．ＰＳＣが、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域の神経系細胞に分化する、実施形態３０に記載の方法。
３２．ＰＳＣが、１５日間～５０日間、神経系細胞に分化することができる、実施形態３０または３１に記載の方法。
３３．ＰＳＣが、少なくとも２０日間、神経系細胞に分化することができる、実施形態３０または３１に記載の方法。
３４．ＰＳＣが、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤と接触する、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．細胞が、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つの活性剤と接触する、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．細胞が、ＳＨＨシグナル伝達経路の活性剤と接触する、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．細胞が、ＦＧＦ８と接触する、実施形態３０～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．細胞が、ラミニンまたはその断片、好ましくはラミニン－５２１および／またはラミニン－５１１および／またはラミニン－１１１でコーティングされた基質上で培養される、実施形態３０～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．細胞が、アスコルビン酸と接触する、実施形態３０～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．細胞が、ＢＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦと接触する、実施形態３０～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．細胞が、ＤＡＰＴと接触する、実施形態３０～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．選択および／または除外の工程の後に、ニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程を含む、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．選択および／または除外の工程の後に、ならびに任意選択でニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程の後に、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を回収する工程を含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された回収された細胞集団が凍結保存される、実施形態４３に記載の方法。
４５．回収された細胞が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陰性である、実施形態４３または４４に記載の方法。
４６．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団が、ニューロンに発達する傾向が増加している、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域のものである、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、腹側中脳領域のものである、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、前脳領域のものであり、選択および／または除外する工程が、３０～７０日目、好ましくは３０～４０日目に実施される、実施形態３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
５０．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、脊髄領域のものであり、選択および／または除外する工程が、２０～４０日目、好ましくは２０～３０日目に実施される、実施形態３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
５１．細胞の選択および／または除外が、抗体媒介セルソーティングによって実施される、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．細胞の選択および／または除外が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、またはイムノパニングを使用して実施される、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．マーカーが、表面マーカーである、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．細胞集団が、インビトロである、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．細胞集団の細胞が、非天然である、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法によって取得される細胞集団。
５８．ニューロンおよび／またはその前駆体の細胞集団であって、細胞集団の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、かつ／または細胞の５０％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である、細胞集団。
５９．細胞集団の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陰性である、実施形態５８に記載の細胞集団。
６０．細胞集団の少なくとも５０％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体、腹側脊髄ニューロンおよび／またはその前駆体、背側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体、ならびに腹側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体から選択される、実施形態５８または５９に記載の細胞集団。
６１．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ４７に対して陰性である、実施形態５８～６０のいずれか１つに記載の細胞集団。
６２．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ９９に対して陰性である、実施形態５８～６１のいずれか１つに記載の細胞集団。
６３．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ４７およびＣＤ９９に対して陰性である、実施形態５８～６２のいずれか１つに記載の細胞集団。
６４．細胞集団の少なくとも６０％が、マーカーＦＯＸＡ２に対して陽性である、実施形態５８～６３のいずれか１つに記載の細胞集団。
６５．細胞集団の少なくとも５０％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体である、実施形態５８～６４のいずれか１つに記載の細胞集団。
６６．細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＡＳＣＬ１およびＩＮＡのうちの一方または両方に対して陽性である、実施形態５８～６５のいずれか１つに記載の細胞集団。
６７．細胞集団が、ニューロンに発達する傾向が増加している、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載の細胞集団。
６８．細胞集団の細胞が、インビトロ分化細胞である、実施形態５８～６７のいずれか１つに記載の細胞集団。
６９．細胞集団が、インビトロである、実施形態５８～６８のいずれか１つに記載の細胞集団。
７０．細胞集団の細胞が、非天然細胞である、実施形態５８～６９のいずれか１つに記載の細胞集団。
７１．細胞集団の細胞が、ｈＰＳＣに由来する、実施形態５８～７０のいずれか１つに記載の細胞集団。
７２．細胞集団の細胞が、遺伝子改変されている、実施形態５８～７１のいずれか１つに記載の細胞集団。
７３．遺伝子改変細胞が、ＨＬＡ欠失である、実施形態７２に記載の細胞集団。
７４．細胞集団が、少なくとも１，０００個の細胞を含む、実施形態５８～７３のいずれか１つに記載の細胞集団。
７５．細胞集団が、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化される、実施形態５８～７４のいずれか１つに記載の細胞集団。
７６．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態５８～７５のいずれか１つに記載の細胞集団。
７７．実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法によって取得される、実施形態５８～７６のいずれか１つに記載の細胞集団。
７８．実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団を含む組成物。
７９．医薬として使用するための、実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団または実施形態７８に記載の組成物。
８０．ニューロンおよび／またはその前駆体の投与を必要とする状態の予防または治療のための、実施形態７９に記載の細胞集団または組成物。
８１．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、てんかん、失明、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態から選択される神経学的状態の治療で使用するための、実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団または実施形態７８に記載の組成物。
８２．有効量の実施形態７９に記載の細胞集団または組成物の患者への投与を含む、神経学的状態の治療または予防方法。
本発明の態様を、これより、以下の非限定的な実施形態によってさらに記載する。
１．細胞集団からニューロンおよび／またはその前駆体を単離するための方法であって、
ａ）ＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程と、
ｂ）神経系幹細胞を含む細胞集団をさらに培養する工程と、
ｃ）ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／またはＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法。
２．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＳＯＸ２を発現する、実施形態１に記載の方法。
３．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１または２に記載の方法。
４．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも９０％が、ＳＯＸ２を発現し、細胞集団が、少なくとも９０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、好ましくは８０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．工程ｃ）での選択および／または除外が、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＳＯＸ２を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＣＤ９９を発現する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＣＤ９９の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．工程ａ）で取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも９０％が、ＣＤ９９を発現し、細胞集団が、少なくとも９０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、好ましくは８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、より好ましくは７０％未満がマーカーＣＤ９９を発現するまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．工程ｃ）での選択および／または除外が、神経系幹細胞を含む細胞集団の８０％未満がマーカーＣＤ９９を発現した後５日以内、例えば、４日、３日、または２日以内に実施される、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．細胞集団が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上の発現が、少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、または２０％になるまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．細胞集団が、マーカーＩＮＡ、ＳＴＭＮ２、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上の発現が少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、または２０％になるまで、工程ｂ）でさらに培養される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．工程ｃ）で細胞を選択および／または除外する時点で、細胞集団の１０～９０％が、ＳＯＸ２に対して陽性であり、細胞集団の５～５０％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性であり、細胞集団の５～２０％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．工程ａ）の神経系幹細胞を含む細胞集団が、少なくとも１４日間、ＰＳＣの神経誘導によって取得される、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．神経系幹細胞が、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域のものである、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．神経系幹細胞が、腹側中脳神経系幹細胞である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を提供するための方法であって、
－ニューロン前駆体を含む細胞集団を取得する工程と、
－ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を選択する工程、ならびに／または
－ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性の細胞を除外する工程と、を含む、方法。
１８．ニューロン前駆体を含む細胞集団が、マーカーＳＯＸ２を発現する神経系幹細胞を含む細胞集団を取得する工程、および神経系幹細胞を含む細胞集団におけるマーカーＳＯＸ２の発現が減少するまで、神経系幹細胞を含む細胞集団を培養する工程によって取得される、実施形態１７に記載の方法。
１９．取得された神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＳＯＸ２を発現する、実施形態１８に記載の方法。
２０．細胞集団が、少なくとも、神経系幹細胞を含む細胞集団におけるＳＯＸ２の発現が、５％、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％減少するまでさらに培養される、実施形態１９に記載の方法。
２１．神経系幹細胞を含む細胞集団の少なくとも８０％が、ＳＯＸ２に対して陽性であり、神経系幹細胞を含む細胞集団が、ＳＯＸ２の発現が８０％未満になるまで培養される、実施形態１８または１９に記載の方法。
２２．マーカーＣＤ４７に対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．マーカーＣＤ９９に対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．マーカーＣＤ９９およびＣＤ４７のいずれかに対して陽性の細胞が除外される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．細胞集団の少なくとも８０％が、神経系細胞である、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、中間前駆体同一性またはニューロン同一性を発現する、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、マーカーＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２、ＮＥＵＲＯＤ４、ＮＥＵＲＯＤ６、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＥＯＭＥＳ、ＣＨＸ１０、ＩＳＬ１、ＳＯＸ４、ＳＯＸ１１、ＮＫＸ２．１、ＮＦＥ２Ｌ２、およびＮＨＬＨ１のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．細胞を選択および／または除外するときに、細胞集団の少なくとも５％が、マーカーＩＮＡ、ＴＵＢＢ３、ＳＴＭＮ２、ＭＡＰ２、およびＲＢＦＯＸ３のうちの１つ以上に対して陽性である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．細胞集団が、ＰＳＣ、好ましくはｈＰＳＣに由来する、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．細胞集団を取得することが、ＰＳＣがニューロン前駆体を含む神経系細胞に分化することを可能にする工程を含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．ＰＳＣが、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域の神経系細胞に分化する、実施形態３０に記載の方法。
３２．ＰＳＣが、１５日間～５０日間、神経系細胞に分化することができる、実施形態３０または３１に記載の方法。
３３．ＰＳＣが、少なくとも２０日間、神経系細胞に分化することができる、実施形態３０または３１に記載の方法。
３４．ＰＳＣが、ＳＭＡＤシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤と接触する、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．細胞が、ＷＮＴシグナル伝達経路の少なくとも１つの活性剤と接触する、実施形態３０～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．細胞が、ＳＨＨシグナル伝達経路の活性剤と接触する、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．細胞が、ＦＧＦ８と接触する、実施形態３０～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．細胞が、ラミニンまたはその断片、好ましくはラミニン－５２１および／またはラミニン－５１１および／またはラミニン－１１１でコーティングされた基質上で培養される、実施形態３０～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．細胞が、アスコルビン酸と接触する、実施形態３０～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．細胞が、ＢＤＮＦおよび／またはＧＤＮＦと接触する、実施形態３０～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．細胞が、ＤＡＰＴと接触する、実施形態３０～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．選択および／または除外の工程の後に、ニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程を含む、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．選択および／または除外の工程の後に、ならびに任意選択でニューロンおよび／またはその前駆体を成熟させるさらなる工程の後に、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団を回収する工程を含む、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された回収された細胞集団が凍結保存される、実施形態４３に記載の方法。
４５．回収された細胞が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陰性である、実施形態４３または４４に記載の方法。
４６．ニューロンおよび／またはその前駆体が富化された細胞集団が、ニューロンに発達する傾向が増加している、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、前脳、中脳、後脳、または脊髄領域のものである、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、腹側中脳領域のものである、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、前脳領域のものであり、選択および／または除外する工程が、３０～７０日目、好ましくは３０～４０日目に実施される、実施形態３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
５０．ニューロンおよび／またはその前駆体の少なくとも５０％が、脊髄領域のものであり、選択および／または除外する工程が、２０～４０日目、好ましくは２０～３０日目に実施される、実施形態３１～４７のいずれか１つに記載の方法。
５１．細胞の選択および／または除外が、抗体媒介セルソーティングによって実施される、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．細胞の選択および／または除外が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、またはイムノパニングを使用して実施される、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．マーカーが、表面マーカーである、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．細胞集団が、インビトロである、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．細胞集団の細胞が、非天然である、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法によって取得される細胞集団。
５８．ニューロンおよび／またはその前駆体の細胞集団であって、細胞集団の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、かつ／または細胞の５０％未満が、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性である、細胞集団。
５９．細胞集団の少なくとも５０％が、ＰＴＰＲＯ、ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＨＢ２、ＤＣＣ、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＡＤＣＹＡＰ１、ＧＰＭ６Ａ、ＧＡＰ４３、Ｃ１ＱＬ１、ＮＲＸＮ１、ＬＲＲＣ４Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＦＺＤ１、ＦＲＥＭ２、ＴＲＰＭ８、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＣＬＤＮ５、ＣＨＲＮＡ５、およびＧＰＲ８５から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陽性であり、ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ６、ＣＭＴＭ８、ＣＭＴＭ７、ＣＲＬＦ１、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ８３、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＣＤ１２０ａ、ＴＮＦＲＳＦ１２ａ／ＣＤ２６６、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＩＴＧＢ８、ＨＬＡ－Ａ、およびＲＡＭＰ１から選択されるマーカーのうちの１つ以上に対して陰性である、実施形態５８に記載の細胞集団。
６０．細胞集団の少なくとも５０％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体、腹側脊髄ニューロンおよび／またはその前駆体、背側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体、ならびに腹側前脳ニューロンおよび／またはその前駆体から選択される、実施形態５８または５９に記載の細胞集団。
６１．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ４７に対して陰性である、実施形態５８～６０のいずれか１つに記載の細胞集団。
６２．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ９９に対して陰性である、実施形態５８～６１のいずれか１つに記載の細胞集団。
６３．細胞集団の８０％超が、マーカーＣＤ４７およびＣＤ９９に対して陰性である、実施形態５８～６２のいずれか１つに記載の細胞集団。
６４．細胞集団の少なくとも６０％が、マーカーＦＯＸＡ２に対して陽性である、実施形態５８～６３のいずれか１つに記載の細胞集団。
６５．細胞集団の少なくとも５０％が、腹側中脳ニューロンおよび／またはその前駆体である、実施形態５８～６４のいずれか１つに記載の細胞集団。
６６．細胞集団の少なくとも８０％が、マーカーＡＳＣＬ１およびＩＮＡのうちの一方または両方に対して陽性である、実施形態５８～６５のいずれか１つに記載の細胞集団。
６７．細胞集団が、ニューロンに発達する傾向が増加している、実施形態５８～６６のいずれか１つに記載の細胞集団。
６８．細胞集団の細胞が、インビトロ分化細胞である、実施形態５８～６７のいずれか１つに記載の細胞集団。
６９．細胞集団が、インビトロである、実施形態５８～６８のいずれか１つに記載の細胞集団。
７０．細胞集団の細胞が、非天然細胞である、実施形態５８～６９のいずれか１つに記載の細胞集団。
７１．細胞集団の細胞が、ｈＰＳＣに由来する、実施形態５８～７０のいずれか１つに記載の細胞集団。
７２．細胞集団の細胞が、遺伝子改変されている、実施形態５８～７１のいずれか１つに記載の細胞集団。
７３．遺伝子改変細胞が、ＨＬＡ欠失である、実施形態７２に記載の細胞集団。
７４．細胞集団が、少なくとも１，０００個の細胞を含む、実施形態５８～７３のいずれか１つに記載の細胞集団。
７５．細胞集団が、ニューロンおよび／またはその前駆体が富化される、実施形態５８～７４のいずれか１つに記載の細胞集団。
７６．細胞集団が、神経系細胞集団である、実施形態５８～７５のいずれか１つに記載の細胞集団。
７７．実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法によって取得される、実施形態５８～７６のいずれか１つに記載の細胞集団。
７８．実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団を含む組成物。
７９．医薬として使用するための、実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団または実施形態７８に記載の組成物。
８０．ニューロンおよび／またはその前駆体の投与を必要とする状態の予防または治療のための、実施形態７９に記載の細胞集団または組成物。
８１．パーキンソン病、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、ハンチントン病、認知症、てんかん、失明、アルツハイマー病、およびニューロンが失われるまたは機能不全となる他の神経学的状態から選択される神経学的状態の治療で使用するための、実施形態５７～７７のいずれか１つに記載の細胞集団または実施形態７８に記載の組成物。
８２．有効量の実施形態７９に記載の細胞集団または組成物の患者への投与を含む、神経学的状態の治療または予防方法。
【実施例】
【0140】
以下は、本発明を実施するための非限定的な実施例である。
【0141】
実施例１：ヒト多能性幹細胞のニューロンへの分化
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＲＣ１７（Ｒｏｓｌｉｎ ＣＴ）および３０５３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を、ヒトラミニン－５２１マトリックス（０．７～１．２μｇ／ｃｍ２、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングされた培養器具上で６０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したｉＰＳ Ｂｒｅｗ ＸＦ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で培養した。培地は毎日交換し、細胞は４～６日毎にＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で継代した。培養物を３７℃、湿度９５％、および５％ ＣＯ２レベルで維持した。
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株ＲＣ１７（Ｒｏｓｌｉｎ ＣＴ）および３０５３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）を、ヒトラミニン－５２１マトリックス（０．７～１．２μｇ／ｃｍ２、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）でコーティングされた培養器具上で６０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したｉＰＳ Ｂｒｅｗ ＸＦ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で培養した。培地は毎日交換し、細胞は４～６日毎にＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で継代した。培養物を３７℃、湿度９５％、および５％ ＣＯ２レベルで維持した。
【0142】
ｈＥＳＣを、確立されたプロトコル（Ｎｏｌｂｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７）に従って、腹側中脳ニューロンに分化させた。簡潔に述べると、ｈＥＳＣを７０～９０％のコンフルエンシーまで増殖させ、次いで０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離した。細胞を、ヒトラミニン－１１１（１．２μｇ／ｃｍ２、ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした細胞培養フラスコまたはプレートに１０４個の細胞／ｃｍ２で播種し、直ちに分化培地と接触させた。細胞を、インビトロでの日数（ＤＩＶ）０～８に、Ｎ２系培地；ＳＭＡＤ阻害剤ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、神経誘導のためのＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、腹側運命のためＳｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｃ２４ＩＩ（ＳＨＨ、５００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、尾状化を促進するためＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、０．５～０．６μＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ｎ２サプリメントＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２％ Ｐ－Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に曝露した。Ｎ２系培地に、ＤＩＶ９～１１の線維芽細胞増殖因子８ｂ（ＦＧＦ８ｂ、１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した。ＤＩＶ１１に、細胞をアキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解離し、１０μＭのＹ－２７６３２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＤＩＶ１１～１６培地（ＦＧＦ８ｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（ＡＡ、２００μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ヒト脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、２０ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ、２％ Ｂ２７サプリメント、ビタミンＡなしＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、０．２％ Ｐ－Ｓ）においてヒトラミニン－１１１（１．２μｇ／ｃｍ２）でコーティングした細胞培養フラスコまたはプレートに、０．８×１０６個の細胞／ｍ２で播種した。インビトロ日数（ＤＩＶ）１６に、細胞をアキュターゼで解離し、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした細胞培養フラスコ／プレート中で凍結保存または再播種して、インビトロ培養を延長し、腹側中脳神経系幹細胞のニューロンへのさらなる分化および成熟を可能にした。
【0143】
参考資料：
●Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ，Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１７ Ｓｅｐ；１２（９）：１９６２－１９７９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１７．０７８．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ａｕｇ ３１．ＰＭＩＤ：２８８５８２９０．
●Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．ＰＭＩＤ：２８０９４０１７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５２２２７２２．
●Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ，Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｐｕｒｉｔｙ ｈｕｍａｎ ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１７ Ｓｅｐ；１２（９）：１９６２－１９７９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１７．０７８．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ａｕｇ ３１．ＰＭＩＤ：２８８５８２９０．
●Ｋｉｒｋｅｂｙ Ａ，Ｎｏｌｂｒａｎｔ Ｓ，Ｔｉｋｌｏｖａ Ｋ，Ｈｅｕｅｒ Ａ，Ｋｅｅ Ｎ，Ｃａｒｄｏｓｏ Ｔ，Ｏｔｔｏｓｓｏｎ ＤＲ，Ｌｅｌｏｓ ＭＪ，Ｒｉｆｅｓ Ｐ，Ｄｕｎｎｅｔｔ ＳＢ，Ｇｒｅａｌｉｓｈ Ｓ，Ｐｅｒｌｍａｎｎ Ｔ，Ｐａｒｍａｒ Ｍ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｇｒａｆｔ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈＥＳＣ－Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ ５；２０（１）：１３５－１４８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１６．０９．００４．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ｏｃｔ ２７．ＰＭＩＤ：２８０９４０１７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ５２２２７２２．
【0144】
実施例２：新規の選択候補および技術的方法を特定するためのｓｃＲＮＡシークエンシング実験設計
単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を行うために、細胞培養物をアキュターゼで単一細胞懸濁液に解離し、３０００～１００００個の細胞を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して処理し、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０でシークエンシングした。データをキュレートして、アポトーシスおよびストレス、ならびにマルチプレットを除去した。
単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を行うために、細胞培養物をアキュターゼで単一細胞懸濁液に解離し、３０００～１００００個の細胞を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して処理し、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０でシークエンシングした。データをキュレートして、アポトーシスおよびストレス、ならびにマルチプレットを除去した。
【0145】
確立されたプロトコルに従って、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を腹側中脳ドーパミンニューロンに分化させることは、細胞に、いくつかの基本的な細胞発達段階を移行させる。最初に、ｈＰＳＣは、神経系幹細胞（ＮＳＣ）（図１Ａ～Ｂ）に移行し、その後、中間前駆細胞（ＩＰ）（図１Ｃ）に移行し、最終的に、最終分化細胞型（図１Ｄ）に移行する。しかしながら、このプロセスは正確ではなく、ＮＳＣ段階後、培養物はその均一性を失い、典型的には、様々な細胞型に分化し始め、混合細胞培養物を形成する（図１Ｃ）。この混合培養組成物は、分化が完了し、細胞が最終的な運命を得るまで持続する（図１Ｄ）。遺伝子の異なる発現の組み合わせ（典型的には、細胞運命指示転写因子タンパク質）が、これらの様々な細胞型を特定するために使用され、図１Ａ～Ｄに示される。
【0146】
単一細胞ＲＮＡ－シークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を、分化に沿ったいくつかの時点で適用し、均一な培養物から不均一な混合培養物への移行の観察およびモニタリングを可能にした。分化に使用されるｈＰＳＣおよびそれが形成するＮＳＣは、そのトランスクリプトームプロファイルによって見られるように、非常に均一である。ｈＰＳＣは、高レベルでその多能性同一性のマーカーを発現し、分析されたｈＰＳＣの９９．５％が、多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１および多能性／ＮＳＣマーカーＳＯＸ２を発現し、これらの遺伝子は、高レベルで発現される（図２Ａ、２Ｂ）。さらに、ｈＰＳＣは、中間前駆体（ＩＰ）マーカーＡＳＣＬ１またはニューロンマーカーＩＮＡなどの、分化細胞の運命を示す最低レベルまたは低レベルの他の遺伝子を発現する（図２Ａ、２Ｂ）。同様に、ＮＳＣは、非常に均一であり、ＮＳＣマーカーＳＯＸ２を発現するが、多能性マーカーＰＯＵ５Ｆ１を発現せず、ＩＰマーカーＡＳＣＬ１およびニューロンマーカーＩＮＡの最低かつ低い発現を有する（図３Ａ、３Ｂ）。
【0147】
ＮＳＣ段階後に培養物に現れる不均一性は、転写レベルで明らかであり、ＤＩＶ２４のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ分析の一例として示される（図４Ａ、４Ｂ）。この時点で、細胞集団は、様々な細胞型および段階のマーカー、例えば、２０．４％のＮＳＣ（ＰＯＵ５Ｆ１－／ＳＯＸ２＋／ＡＳＣＬ１－／ＩＮＡ－細胞、図４Ａ）、ならびに４８．２％の中間前駆細胞（ＰＯＵ５Ｆ１－／ＳＯＸ２＋または－／ＡＳＣＬ１＋／ＩＮＡ＋または－、図４Ａ）、および１６．３％のニューロン（ＰＯＵ５Ｆ１－／ＳＯＸ２－／ＡＳＣＬ１＋または－／ＩＮＡ＋または－、図４Ａ）を発現する。多能性幹細胞は、ＮＳＣ、ＩＰ、およびニューロンへのその分化により、この段階では存在しない（ＰＯＵ５Ｆ１＋／ＳＯＸ２＋／ＡＳＣＬ１－／ＩＮＡ－、図４Ａ、４Ｂ）。
【0148】
実施例３：混合培養段階のｓｃＲＮＡシークエンシング、ならびに細胞集団および精製候補の特定
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ時間経過研究を、細胞が均一である時点（ＤＩＶ１６ ＮＳＣ）から混合培養物（ＤＩＶ２６混合培養物、図１Ｅ）に発達した時点まで、４８時間毎に試料採取して行った。この枠（ＤＩＶ１６、１８、２２、２４、２６）内で４８時間毎に試料採取することにより、異なる細胞段階および細胞型への細胞分化および多様化の軌道が観察され、これらの集団に限定される表面抗原で目的または非目的の集団を分離するのに役立ち得るマーカーについて検索されることを可能にするために、一連のデータが取得されたことを確実にした。
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ時間経過研究を、細胞が均一である時点（ＤＩＶ１６ ＮＳＣ）から混合培養物（ＤＩＶ２６混合培養物、図１Ｅ）に発達した時点まで、４８時間毎に試料採取して行った。この枠（ＤＩＶ１６、１８、２２、２４、２６）内で４８時間毎に試料採取することにより、異なる細胞段階および細胞型への細胞分化および多様化の軌道が観察され、これらの集団に限定される表面抗原で目的または非目的の集団を分離するのに役立ち得るマーカーについて検索されることを可能にするために、一連のデータが取得されたことを確実にした。
【0149】
ＤＩＶ２２～２６の間の混合培養を特定し、これらのデータセットをアライメントして、サブタイプ限定表面抗原を検索した（図５）。ここで、すべての細胞（単一のドットによって表される）は、ｔ－ＳＮＥプロット（ＳＯＸ２＋、図５）の下半分に主に存在していたＮＳＣおよびオフターゲット、ｔ－ＳＮＥプロットの中央に位置するＩＰ（ＡＳＣＬ１＋、図５）、ならびにｔ－ＳＮＥプロットの上部に位置するニューロン（ＩＮＡ＋、図５）など、異なる細胞段階に対応する遺伝子を発現することがわかる。これらの培養物の不均一性をさらに示すと、胚の腹側中脳底板領域に対応するマーカー（ＬＭＸ１Ａ）は、すべての細胞で発現されず、かつｔ－ＳＮＥプロットの下部にある２つのクラスターにおいて選択的に不在であった（図５、丸で囲まれている）。これらの異なる細胞型および段階に対応するクラスターを比較することによって、それらの発現がこれらの同一性に限定される遺伝子を特定することができた。
【0150】
実施例４：ＮＳＣ、ＩＰ、およびニューロン単離のための候補遺伝子の発現プロファイル
ニューロンクラスターにおける最もスコアが高い差次的に発現された表面マーカー遺伝子は、ニューロンマーカーＩＮＡと類似したｔ－ＳＮＥプロット全体にわたる分布を有することが確認され（図６～７）、これらの遺伝子は、混合培養物からのニューロンの単離に適しているとみなされる。これには、遺伝子ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＦＨＢ２、ＧＡＰ４３、ＡＤＣＹＡＰ１、Ｃ１ＱＬ１、およびＮＲＸＮ１（図６）、ならびにＦＺＤ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＤＣＣ、ＧＰＲ８５、およびＬＲＲＣ４Ｃが含まれる。
ニューロンクラスターにおける最もスコアが高い差次的に発現された表面マーカー遺伝子は、ニューロンマーカーＩＮＡと類似したｔ－ＳＮＥプロット全体にわたる分布を有することが確認され（図６～７）、これらの遺伝子は、混合培養物からのニューロンの単離に適しているとみなされる。これには、遺伝子ＡＤＧＲＧ１、ＥＰＦＨＢ２、ＧＡＰ４３、ＡＤＣＹＡＰ１、Ｃ１ＱＬ１、およびＮＲＸＮ１（図６）、ならびにＦＺＤ１、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１、ＤＣＣ、ＧＰＲ８５、およびＬＲＲＣ４Ｃが含まれる。
【0151】
ＩＰ細胞クラスターにおける最もスコアが高い差次的に発現された表面マーカー遺伝子は、ドーパミンニューロン系統ＡＳＣＬ１のＩＰ細胞マーカーと類似したｔ－ＳＮＥプロット全体にわたる分布を有することが確認され（図８）、これらの遺伝子は、混合培養物からのニューロンの単離に適しているとみなされる。これには、遺伝子ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＰＭ８、ＦＲＥＭ２、ＤＬＬ３、ＤＬＬ１、ＣＨＲＮＡ５、およびＣＬＤＮ５が含まれる。
【0152】
ＮＳＣ／オフターゲットクラスターにおける最もスコアが高い差次的に発現された表面マーカー遺伝子は、ＮＳＣ／オフターゲットマーカーＳＯＸ２と類似したｔ－ＳＮＥプロット全体にわたる分布を有することが確認され（図９～１１）、これらの遺伝子は、混合培養物からのＮＳＣ／オフターゲット細胞の単離に適しているとみなされる。これには、遺伝子ＳＬＩＴ２、ＮＴＮ１、ＣＭＴＭ７、ＣＭＴＭ８、ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ９９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＭＥＭ１２３、ＬＲＰ１０、ＨＬＡ－Ａ、ＲＡＭＰ１、ＣＭＴＭ６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＣＲＬＦ１、ＩＴＧＢ８、およびＣＤ８３が含まれる。
【0153】
実施例５：ＣＤ４７およびＣＤ９９に対する抗体を使用した中脳神経系細胞の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
腹側中脳ドーパミン作動性（ｖｍＤＡ）前駆細胞を、実施例１に記載されるように、２Ｄインビトロ培養物においてｈＥＳＣから生成した。分化開始の２５日後、細胞培養物を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、Ｎ２培地（１％ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメントを補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に収集した。死細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを使用して標識した。次いで、細胞を、Ｂ２７培地（１％ Ｂ－２７（商標）サプリメント、ビタミンＡなし、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、６０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に再懸濁し、１：２５００の濃度でＣＤ４７に対するＡＰＣコンジュゲート抗体を使用して染色した。ＣＤ４７陽性細胞および陰性細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ機器を使用した蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製した（図１２）。全生細胞集団をソーティングすることによって、「パススルー」対照試料を取得した（図１２Ｃ）。ＦＡＣＳ後、純度が、ＣＤ４７陽性細胞画分および陰性細胞画分について、それぞれ８７％超および９１％超であることを確認した（図１３）。ＦＡＣＳの直後に、ソーティングされた細胞を、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした９６ウェルプレート中で、４５０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。２４時間後（図１９）および５日後（図２０）に得られた位相コントラスト画像は、ソーティングされた細胞の高い生存率、およびＣＤ４７陽性細胞と陰性細胞との間の形態の明らかな差を示した。ＣＤ４７陽性細胞は、突起がほとんどまたは全くない、大きく、低コントラストの細胞体を有すると見られる一方で（図１９Ａ～Ａｉ、２０Ａ～Ａｉ）、ＣＤ４７陰性細胞は、明確に画定された突起を有する、小さく、高コントラストの円形／楕円形細胞体を特徴とする典型的なニューロン形態を示し、これらは、５日間の培養期間にわたって数および長さが増加することがわかる（図１９Ｂ～Ｂｉ、２０Ｂ～Ｂｉ）。予想通り、「パススルー」対照試料は、これら２つの別個の形態を有する細胞の混合物を含有する（図１９Ｃ～Ｃｉ、２０Ｃ～Ｃｉ）。さらに、セルソーティングの直後に、ソーティングされた細胞の試料を、ＢＤ転写因子緩衝液セットを使用した細胞内フローサイトメトリーのために処理し、ＳＯＸ２（１：３０）、Ｋｉ－６７（１：１００）、およびＦＯＸＡ２（１：３２０）に対する抗体で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）フローサイトメーターを使用して記録し、ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２ソフトウェアを使用して分析した。最初に、ソーティングされた試料の純度が、９１％超であることを確認した（図１４、１８）。ＣＤ４７陽性のソーティングされた画分が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２（７１．１％、図１５Ａ、１８）ならびに増殖マーカーＫｉ－６７（２６．３％、図１６Ａ、１８）を発現する細胞について富化されることがわかった一方で、ＣＤ４７陰性のソーティングされた画分は、ＳＯＸ２（１６．２％、図１５Ｂ、１８）およびＫｉ－６７（２．６７％、図１６Ｂ、１８）の両方の顕著により低いレベルを示し、それぞれ７７．２％および８９．８％のＳＯＸ２およびＫｉ６７を発現する細胞の割合の差に対応する。これらの結果は、ＣＤ４７抗体ベースの選択が、発達している底板のマーカーであるＦＯＸＡ２を発現する細胞の割合によってわかるように、ニューロンの富化、ならびに目的の系統の枯渇なしの増殖性神経系幹細胞およびその誘導体の枯渇に使用され得るという仮説を裏付ける（図１７、１８）。これらの結果は、インビトロで再播種された細胞の免疫蛍光（ＩＦ）染色によって裏付けられた。ソーティングの５日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｋｉ－６７（１：２５０）、ＦＯＸＡ２（１：１００）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、１：５００）に対する一次抗体で染色し、続いて、蛍光標識された二次抗体で染色した。ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡で画像を得た。ＩＦ染色は、ＣＤ４７陰性細胞の富化が、ＦＯＸＡ２およびドーパミンニューロン特異的マーカーＴＨ（図２２、２３）によってわかるように、目的の細胞を枯渇させることなく、Ｋｉ６７＋増殖性細胞（図２１、図３５）およびＳＯＸ２＋細胞（図３６）の数を低減することを示すフローサイトメトリーの結果を確認した。
腹側中脳ドーパミン作動性（ｖｍＤＡ）前駆細胞を、実施例１に記載されるように、２Ｄインビトロ培養物においてｈＥＳＣから生成した。分化開始の２５日後、細胞培養物を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、Ｎ２培地（１％ＣＴＳ（商標）Ｎ－２サプリメントを補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に収集した。死細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを使用して標識した。次いで、細胞を、Ｂ２７培地（１％ Ｂ－２７（商標）サプリメント、ビタミンＡなし、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、６０Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に再懸濁し、１：２５００の濃度でＣＤ４７に対するＡＰＣコンジュゲート抗体を使用して染色した。ＣＤ４７陽性細胞および陰性細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ機器を使用した蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製した（図１２）。全生細胞集団をソーティングすることによって、「パススルー」対照試料を取得した（図１２Ｃ）。ＦＡＣＳ後、純度が、ＣＤ４７陽性細胞画分および陰性細胞画分について、それぞれ８７％超および９１％超であることを確認した（図１３）。ＦＡＣＳの直後に、ソーティングされた細胞を、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした９６ウェルプレート中で、４５０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。２４時間後（図１９）および５日後（図２０）に得られた位相コントラスト画像は、ソーティングされた細胞の高い生存率、およびＣＤ４７陽性細胞と陰性細胞との間の形態の明らかな差を示した。ＣＤ４７陽性細胞は、突起がほとんどまたは全くない、大きく、低コントラストの細胞体を有すると見られる一方で（図１９Ａ～Ａｉ、２０Ａ～Ａｉ）、ＣＤ４７陰性細胞は、明確に画定された突起を有する、小さく、高コントラストの円形／楕円形細胞体を特徴とする典型的なニューロン形態を示し、これらは、５日間の培養期間にわたって数および長さが増加することがわかる（図１９Ｂ～Ｂｉ、２０Ｂ～Ｂｉ）。予想通り、「パススルー」対照試料は、これら２つの別個の形態を有する細胞の混合物を含有する（図１９Ｃ～Ｃｉ、２０Ｃ～Ｃｉ）。さらに、セルソーティングの直後に、ソーティングされた細胞の試料を、ＢＤ転写因子緩衝液セットを使用した細胞内フローサイトメトリーのために処理し、ＳＯＸ２（１：３０）、Ｋｉ－６７（１：１００）、およびＦＯＸＡ２（１：３２０）に対する抗体で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）フローサイトメーターを使用して記録し、ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２ソフトウェアを使用して分析した。最初に、ソーティングされた試料の純度が、９１％超であることを確認した（図１４、１８）。ＣＤ４７陽性のソーティングされた画分が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２（７１．１％、図１５Ａ、１８）ならびに増殖マーカーＫｉ－６７（２６．３％、図１６Ａ、１８）を発現する細胞について富化されることがわかった一方で、ＣＤ４７陰性のソーティングされた画分は、ＳＯＸ２（１６．２％、図１５Ｂ、１８）およびＫｉ－６７（２．６７％、図１６Ｂ、１８）の両方の顕著により低いレベルを示し、それぞれ７７．２％および８９．８％のＳＯＸ２およびＫｉ６７を発現する細胞の割合の差に対応する。これらの結果は、ＣＤ４７抗体ベースの選択が、発達している底板のマーカーであるＦＯＸＡ２を発現する細胞の割合によってわかるように、ニューロンの富化、ならびに目的の系統の枯渇なしの増殖性神経系幹細胞およびその誘導体の枯渇に使用され得るという仮説を裏付ける（図１７、１８）。これらの結果は、インビトロで再播種された細胞の免疫蛍光（ＩＦ）染色によって裏付けられた。ソーティングの５日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、Ｋｉ－６７（１：２５０）、ＦＯＸＡ２（１：１００）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、１：５００）に対する一次抗体で染色し、続いて、蛍光標識された二次抗体で染色した。ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１顕微鏡で画像を得た。ＩＦ染色は、ＣＤ４７陰性細胞の富化が、ＦＯＸＡ２およびドーパミンニューロン特異的マーカーＴＨ（図２２、２３）によってわかるように、目的の細胞を枯渇させることなく、Ｋｉ６７＋増殖性細胞（図２１、図３５）およびＳＯＸ２＋細胞（図３６）の数を低減することを示すフローサイトメトリーの結果を確認した。
【0154】
類似の実験では、２５日目のｖｍＤＡ培養物を単一細胞懸濁液に解離し、１：５００の濃度のＣＤ９９に対するＰＥコンジュゲート抗体を使用して染色した。ＣＤ９９陽性細胞および陰性細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ機器を使用した蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製した（図２４）。全生細胞集団をソーティングすることによって、「パススルー」対照試料を取得した（図２４Ｃ）。ＦＡＣＳ後、純度が、ＣＤ９９陽性細胞画分および陰性細胞画分について、それぞれ７９％および１００％であることを確認し（図２５）、すべてのソーティングされた画分で高い生存率（８５％超）が観察された（図２６）。ソーティングされた細胞を、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした９６ウェルプレート中で、４５０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。２４時間後（図２７）、４８時間後（図２８）、および５日後（図２９）に得られた位相コントラスト画像は、ソーティングされた細胞の良好な回収、およびＣＤ９９陽性細胞と陰性細胞との間の形態の明らかな差を示し、ＣＤ９９陰性画分は、大きく、低コントラストの細胞体、および突起がほとんどまたは全くないことを特徴とする非ニューロン細胞を含有することが見出された（図２７Ａ～Ａｉ、２８Ａ～Ａｉ、２９Ａ～Ａｉ）。これらの非ニューロン細胞は、ＣＤ９９陰性のソーティングされた画分において不在であり、その代わりに細胞は、明確に画定された突起を有する小さく、高コントラストの円形／楕円形の細胞体を特徴とする典型的なニューロン形態を示し、これらは、５日間の培養期間にわたって数および長さが増加することがわかる（図２７Ｂ～Ｂｉ、２８Ｂ～Ｂｉ、２９Ｂ～Ｂｉ）。予想通り、「パススルー」対照試料は、これら２つの別個の形態を有する細胞の混合物を含有する（図２７Ｃ～Ｃｉ、２８Ｃ～Ｃｉ）。
【0155】
ソーティングの４８時間後および１２日後、細胞を、Ｋｉ－６７、ＦＯＸＡ２、およびＴＨに対する抗体を用いてＩＦによって定性的に評価した。ＩＦ染色は、ＣＤ９９陰性のソーティングされた画分が、ＣＤ９９陽性および「パススルー」対照細胞と比較して、Ｋｉ－６７を発現する細胞の低減された数を含有したが（図３０、３１）、ドーパミンニューロン系統特異的マーカーＦＯＸＡ２およびＴＨを発現する大量の細胞をなおも示している（図３２、３３）ことを示した。まとめると、これらの結果は、ＣＤ９９抗体ベースの選択がニューロンの富化、ならびに増殖性神経系幹細胞およびその非ニューロン誘導体の枯渇に使用され得るという仮説を裏付ける。
【0156】
ＣＤ４７陰性細胞またはＣＤ９９陰性細胞のＦＡＣＳ富化は、ニューロン細胞の富化、および増殖性ＮＳＣ／非ニューロン細胞型の数の実質的な低減を可能にしたが、ＣＤ４７もＣＤ９９も単独では、これらの望ましくない増殖性細胞型の完全な枯渇を可能にしなかった。興味深いことに、インビトロ日数（ＤＩＶ）２５ ｖｍＤＡ培養物のフローサイトメトリー分析により、細胞の大部分（３４．５％）が、この段階でＣＤ４７およびＣＤ９９の両方を発現したが（図３４ Ｑ２）、ＣＤ４７（８．２８％、図３４ Ｑ３）またはＣＤ９９（６．４２％、図３４ Ｑ１）のみを発現する細胞集団も存在したことが明らかになり、富化のためのこれらのマーカーの組み合わせが、それ自体で使用される場合よりもさらに純粋なニューロン集団をもたらすことを示唆している。一実験では、２５日目のｖｍＤＡ培養物を単一細胞懸濁液に解離し、ＣＤ４７に対する抗体を単独で、またはＣＤ９９に対する抗体と組み合わせて用いて染色し、陽性（ＣＤ４７＋）および陰性（ＣＤ４７－）または二重陽性（ＣＤ４７＋ＣＤ９９＋）および二重陰性（ＣＤ４７－ＣＤ９９－）細胞集団をそれぞれ、ＦＡＣＳによって精製し、前述のように細胞内フローサイトメトリーによって分析した。第一に、単離された画分中のＣＤ４７および／またはＣＤ９９を発現する細胞の割合を決定した。ソーティングされていない対照試料は、細胞の約６０％においてＣＤ４７およびＣＤ９９の発現を示した（図３７、３８）。予想通り、ＣＤ４７を発現する細胞の割合は、ＣＤ４７＋試料およびＣＤ４７＋ＣＤ９９＋試料で増加し（９４％超、図３７）、ＣＤ４７－試料およびＣＤ４７－ＣＤ９９－試料でほぼ完全に枯渇し（２．５％未満、図３７）、集団の分離の成功を確認した。同様に、ＣＤ９９を発現する細胞の割合は、ＣＤ４７＋試料およびＣＤ４７＋ＣＤ９９＋試料の両方において増加し（８３％超、図３８）、ＣＤ４７－試料およびＣＤ４７－ＣＤ９９－試料でほぼ完全に枯渇し（３．５％未満、図３８）、ＣＤ４７抗体ベースのＦＡＣＳによるＣＤ４７－細胞の富化が、ＣＤ９９＋細胞の枯渇をもたらすことを示している。ＣＤ４７－画分およびＣＤ４７－ＣＤ９９－画分の両方が、ＳＯＸ２（図３９）およびＫｉ６７（図４０）を発現する細胞の割合の著しい低減、ならびにＩＮＡ（図４１）によってマーク付けされるニューロンのレベルの増加を示す。
【表1】
【0157】
実施例６：ＣＤ４７に対する磁気ソーティング抗体を使用した中脳神経系細胞の磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）
腹側中脳ドーパミン作動性（ｖｍＤＡ）前駆細胞を、実施例１に記載されるように、２Ｄインビトロ培養物においてｈＥＳＣから生成した。分化開始の２４日後、細胞培養物を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、Ｂ２７培地（ビタミンＡなしの１％ Ｂ－２７（商標）サプリメント、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、６０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に収集した。次いで、細胞を、０．５％ ＢＳＡを含むハンクス平衡塩溶液中に再懸濁し、１：５０の濃度のＣＤ４７に対するＡＰＣコンジュゲート抗体を使用して染色し、その後、抗ＡＰＣマイクロビーズで標識した。ＣＤ４７陽性細胞および陰性細胞を、ＬＳ ＭＡＣＳカラムを使用した磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によって精製した。標識されていない細胞を含有する通過した画分を収集した。磁気的に保持された細胞を溶出し、陽性に選択された画分として収集した。ＭＡＣＳ後、ＣＤ４７陰性細胞画分および陽性細胞画分の両方について、生存率が９０％超であることを確認した。ＭＡＣＳの直後に、ソーティングされた細胞を、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした９６ウェルプレート中で、２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。ソーティングされていない細胞を対照として使用した。４８時間後に得られた位相コントラスト画像（図４２）は、ソーティングされた細胞の高い生存率、およびソーティングされていない細胞とＣＤ４７陰性細胞との間の形態の明らかな差を示した。ＣＤ４７陰性細胞が、明確に画定された突起を有する小さく、高コントラストの円形／楕円形の細胞体を特徴とする典型的なニューロン形態を示した一方で（図４２Ａ）、ソーティングされていない細胞は、ニューロン細胞、および突起がほとんどまたは全くない、大きく、低コントラストの細胞体を有する細胞との混合物を有すると見られる（図４２Ｂ）。さらに、セルソーティングの直後に、ソーティングされた細胞の試料を、ＢＤ転写因子緩衝液セットを使用した細胞内フローサイトメトリーのために処理し、ＳＯＸ２（１：１３０）、Ｋｉ－６７（１：２５００）、ＦＯＸＡ２（１：３２０）、ＬＭＸ１Ａ（１：２５００）、ＡＳＣＬ１（１：２５００）、およびＩＮＡ（１：３０００）に対する抗体で染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（商標）フローサイトメーターを使用して記録し、ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２ソフトウェアを使用して分析した。最初に、ソーティングされた試料の純度が、６８％超であることを確認した（図４３）。ＣＤ４７陰性画分が、より低いレベルの神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２（５２．７％、図４４）ならびに増殖マーカーＫｉ－６７（７．９％、図４４）を発現することがわかった一方で、ソーティングされていない対照は、ＳＯＸ２（７８．６％、図４４）およびＫｉ－６７（２３．１％、図４４）の両方のより高いレベルを示し、それぞれ３３％および６５．８％のＳＯＸ２およびＫｉ６７を発現する細胞の割合の差に対応する。さらに、ＣＤ４７陰性画分は、ソーティングされていない対照と比較して、発達している底板のマーカーであるＦＯＸＡ２を発現する細胞の同等の数を維持することがわかった（７６％、図４４）。ＣＤ４７陰性画分がまた、早期腹側中脳マーカーＬＭＸ１Ａ（７８％、図４４）、中間前駆体マーカーＡＳＣＬ１（５１．２％、図４４）、およびニューロンマーカーＩＮＡ（５９．８％、図４４）を発現する細胞が富化されていることがわかった一方で、ソーティングされていない対照は、３つすべてのマーカーのより低いレベルを示し（ＬＭＸ１Ａ ６１％、ＡＳＣＬ１ ２８，８％、ＩＮＡ ２３．３％、図４４）、それぞれ２１．８％、４３．８％、および６１％のＬＭＸ１Ａ、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡを発現する細胞の割合の差に対応する。これらの結果は、ＣＤ４７抗体ベースの選択が、ニューロンの富化、ならびに増殖性神経系幹細胞およびその誘導体の枯渇に使用され得ることを示す。これらの結果は、インビトロで再播種された細胞の免疫蛍光（ＩＦ）染色によって裏付けられた。ソーティングの１０日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ドーパミン作動性ニューロンマーカーチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、１：５００）に対する一次抗体で染色し、続いて、蛍光標識された二次抗体で染色した。ＺＥＮ ３．２ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で画像を得た。ＩＦ染色は、ＣＤ４７陰性細胞の富化が、ドーパミン作動性ニューロンが富化された細胞集団をもたらすことを確認した（図５３）。
腹側中脳ドーパミン作動性（ｖｍＤＡ）前駆細胞を、実施例１に記載されるように、２Ｄインビトロ培養物においてｈＥＳＣから生成した。分化開始の２４日後、細胞培養物を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、Ｂ２７培地（ビタミンＡなしの１％ Ｂ－２７（商標）サプリメント、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、６０Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシン、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を補充したＣＴＳ（商標）Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地）中に収集した。次いで、細胞を、０．５％ ＢＳＡを含むハンクス平衡塩溶液中に再懸濁し、１：５０の濃度のＣＤ４７に対するＡＰＣコンジュゲート抗体を使用して染色し、その後、抗ＡＰＣマイクロビーズで標識した。ＣＤ４７陽性細胞および陰性細胞を、ＬＳ ＭＡＣＳカラムを使用した磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によって精製した。標識されていない細胞を含有する通過した画分を収集した。磁気的に保持された細胞を溶出し、陽性に選択された画分として収集した。ＭＡＣＳ後、ＣＤ４７陰性細胞画分および陽性細胞画分の両方について、生存率が９０％超であることを確認した。ＭＡＣＳの直後に、ソーティングされた細胞を、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ－アスコルビン酸（２００μＭ）、ｄｃＡＭＰ（５００μＭ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびＹ－２７６３２（１０μＭ）を補充したＢ２７培地中のポリ－Ｌ－オルニチン（０．００２％）およびラミニン－５２１（１．５μｇ／ｃｍ２）でコーティングした９６ウェルプレート中で、２００，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。ソーティングされていない細胞を対照として使用した。４８時間後に得られた位相コントラスト画像（図４２）は、ソーティングされた細胞の高い生存率、およびソーティングされていない細胞とＣＤ４７陰性細胞との間の形態の明らかな差を示した。ＣＤ４７陰性細胞が、明確に画定された突起を有する小さく、高コントラストの円形／楕円形の細胞体を特徴とする典型的なニューロン形態を示した一方で（図４２Ａ）、ソーティングされていない細胞は、ニューロン細胞、および突起がほとんどまたは全くない、大きく、低コントラストの細胞体を有する細胞との混合物を有すると見られる（図４２Ｂ）。さらに、セルソーティングの直後に、ソーティングされた細胞の試料を、ＢＤ転写因子緩衝液セットを使用した細胞内フローサイトメトリーのために処理し、ＳＯＸ２（１：１３０）、Ｋｉ－６７（１：２５００）、ＦＯＸＡ２（１：３２０）、ＬＭＸ１Ａ（１：２５００）、ＡＳＣＬ１（１：２５００）、およびＩＮＡ（１：３０００）に対する抗体で染色し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ（商標）フローサイトメーターを使用して記録し、ＦｌｏｗＪｏ １０．７．２ソフトウェアを使用して分析した。最初に、ソーティングされた試料の純度が、６８％超であることを確認した（図４３）。ＣＤ４７陰性画分が、より低いレベルの神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２（５２．７％、図４４）ならびに増殖マーカーＫｉ－６７（７．９％、図４４）を発現することがわかった一方で、ソーティングされていない対照は、ＳＯＸ２（７８．６％、図４４）およびＫｉ－６７（２３．１％、図４４）の両方のより高いレベルを示し、それぞれ３３％および６５．８％のＳＯＸ２およびＫｉ６７を発現する細胞の割合の差に対応する。さらに、ＣＤ４７陰性画分は、ソーティングされていない対照と比較して、発達している底板のマーカーであるＦＯＸＡ２を発現する細胞の同等の数を維持することがわかった（７６％、図４４）。ＣＤ４７陰性画分がまた、早期腹側中脳マーカーＬＭＸ１Ａ（７８％、図４４）、中間前駆体マーカーＡＳＣＬ１（５１．２％、図４４）、およびニューロンマーカーＩＮＡ（５９．８％、図４４）を発現する細胞が富化されていることがわかった一方で、ソーティングされていない対照は、３つすべてのマーカーのより低いレベルを示し（ＬＭＸ１Ａ ６１％、ＡＳＣＬ１ ２８，８％、ＩＮＡ ２３．３％、図４４）、それぞれ２１．８％、４３．８％、および６１％のＬＭＸ１Ａ、ＡＳＣＬ１、およびＩＮＡを発現する細胞の割合の差に対応する。これらの結果は、ＣＤ４７抗体ベースの選択が、ニューロンの富化、ならびに増殖性神経系幹細胞およびその誘導体の枯渇に使用され得ることを示す。これらの結果は、インビトロで再播種された細胞の免疫蛍光（ＩＦ）染色によって裏付けられた。ソーティングの１０日後、細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ドーパミン作動性ニューロンマーカーチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ、１：５００）に対する一次抗体で染色し、続いて、蛍光標識された二次抗体で染色した。ＺＥＮ ３．２ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡で画像を得た。ＩＦ染色は、ＣＤ４７陰性細胞の富化が、ドーパミン作動性ニューロンが富化された細胞集団をもたらすことを確認した（図５３）。
【表2】
【0158】
実施例７：ヒト多能性幹細胞の前脳神経系細胞への分化、ならびにこれらの細胞におけるＣＤ４７およびＣＤ９９発現の測定
ｈＥＳＣを、確立されたプロトコル（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２（ａ）、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２（ｂ））に従って分化させた。ｈＥＳＣを播種し、ラミニン－５２１（１．２μｇ／ｃｍ２、ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした培養器具で培養し、９５～１００％コンフルエントな単層を形成すると、分化培地に曝露した。ＤＩＶ０－１０から、細胞を、Ｎ２／Ｂ２７系培地：神経誘導のためのＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ Ｂ２７サプリメント、ビタミンＡありＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２サプリメントＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０，０８９％ β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＤＩＶ１１に、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、１：２比率で継代した。Ｎ２／Ｂ２７系培地を、ＤＩＶ１１～１８の線維芽細胞増殖因子ｂ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）で補充した。ＤＩＶ１８で、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、凍結保存または１：２比率で継代した。ＤＩＶ２０以降、細胞を、サプリメントなしでＮ２／Ｂ２７ベースの培地中で培養し、ＤＩＶ３２に継代した。ＤＩＶ３５に、前脳神経系細胞を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、ＣＤ４７およびＣＤ９９に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、実施例５に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した。分化のこの段階では、細胞のおよそ５０％が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２を発現した一方で（図４６）、およそ２０％が、増殖マーカーＫｉ６７を発現し（図４６Ａ）、これらの細胞が依然として有糸分裂の神経系幹細胞であることを示し、およそ６０％が、ニューロンマーカーＩＮＡを発現し（図４６Ｂ）、これらが分化しているか、またはニューロンに分化する過程にあることを示している。分析は、細胞の６３％がＣＤ９９を発現し（図４５Ａ）、７８％がＣＤ４７を発現した（図４５Ｂ）ことを示した。さらに、ＣＤ９９およびＣＤ４７を発現する細胞の大部分が、ＳＯＸ２（図４７）およびＫｉ６７（図４８）の両方を共発現したことがわかった。これらの結果は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって、ＣＤ９９およびＣＤ４７が、前脳ニューロンの富化および増殖性細胞の枯渇のための抗体標的として使用され得るという仮説を強く裏付ける。
ｈＥＳＣを、確立されたプロトコル（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２（ａ）、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２（ｂ））に従って分化させた。ｈＥＳＣを播種し、ラミニン－５２１（１．２μｇ／ｃｍ２、ＢｉｏＬａｍｉｎａ）でコーティングした培養器具で培養し、９５～１００％コンフルエントな単層を形成すると、分化培地に曝露した。ＤＩＶ０－１０から、細胞を、Ｎ２／Ｂ２７系培地：神経誘導のためのＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）５０％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、２％ Ｂ２７サプリメント、ビタミンＡありＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２サプリメントＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、０．２％ペニシリンストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、０，０８９％ β－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＤＩＶ１１に、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、１：２比率で継代した。Ｎ２／Ｂ２７系培地を、ＤＩＶ１１～１８の線維芽細胞増殖因子ｂ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）で補充した。ＤＩＶ１８で、細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡで解離し、凍結保存または１：２比率で継代した。ＤＩＶ２０以降、細胞を、サプリメントなしでＮ２／Ｂ２７ベースの培地中で培養し、ＤＩＶ３２に継代した。ＤＩＶ３５に、前脳神経系細胞を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、ＣＤ４７およびＣＤ９９に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、実施例５に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した。分化のこの段階では、細胞のおよそ５０％が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２を発現した一方で（図４６）、およそ２０％が、増殖マーカーＫｉ６７を発現し（図４６Ａ）、これらの細胞が依然として有糸分裂の神経系幹細胞であることを示し、およそ６０％が、ニューロンマーカーＩＮＡを発現し（図４６Ｂ）、これらが分化しているか、またはニューロンに分化する過程にあることを示している。分析は、細胞の６３％がＣＤ９９を発現し（図４５Ａ）、７８％がＣＤ４７を発現した（図４５Ｂ）ことを示した。さらに、ＣＤ９９およびＣＤ４７を発現する細胞の大部分が、ＳＯＸ２（図４７）およびＫｉ６７（図４８）の両方を共発現したことがわかった。これらの結果は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって、ＣＤ９９およびＣＤ４７が、前脳ニューロンの富化および増殖性細胞の枯渇のための抗体標的として使用され得るという仮説を強く裏付ける。
【0159】
参考資料：
●Ｓｈｉ Ｙ，Ｋｉｒｗａｎ Ｐ，Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｏｃｔ；７（１０）：１８３６－４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１１６．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ １３．ＰＭＩＤ：２２９７６３５５．（ａ）
●Ｓｈｉ Ｙ，Ｋｉｒｗａｎ Ｐ，Ｓｍｉｔｈ Ｊ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＨＰ，Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｆｅｂ ５；１５（３）：４７７－８６，Ｓ１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．３０４１．ＰＭＩＤ：２２３０６６０６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８８２５９０．（ｂ）
●Ｓｈｉ Ｙ，Ｋｉｒｗａｎ Ｐ，Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｏｃｔ；７（１０）：１８３６－４６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１１６．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｓｅｐ １３．ＰＭＩＤ：２２９７６３５５．（ａ）
●Ｓｈｉ Ｙ，Ｋｉｒｗａｎ Ｐ，Ｓｍｉｔｈ Ｊ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＨＰ，Ｌｉｖｅｓｅｙ ＦＪ．Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｒｏｍ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙ ｓｙｎａｐｓｅｓ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｆｅｂ ５；１５（３）：４７７－８６，Ｓ１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎ．３０４１．ＰＭＩＤ：２２３０６６０６；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３８８２５９０．（ｂ）
【0160】
実施例８：ヒト多能性幹細胞の後脳／脊髄神経系細胞への分化、ならびにこれらの細胞におけるＣＤ４７およびＣＤ９９発現の測定
８０～９０％コンフルエンスでの未分化ｈＥＳＣを、室温で５～７分間、ＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて解離して、再播種のためにフラスコから分離した。ｈＥＳＣの凝集体を、ラミニン－５２１（１．２μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングされた２４ウェルプレートまたはＴ２５フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）上に播種し、均等に分配した。最初の２４時間、細胞をｉＰＳ Ｂｒｅｗ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で維持し、１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充して、細胞生存を促進した。培地を２４時間毎に交換し、細胞を９０～１００％コンフルエンスまで増殖させ、この時点で分化が開始された。分化の最初の６日間、細胞を、神経誘導のためのＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、４５％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、４５％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、５％ Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、０，５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から成る汎ニューロン基本培地中で維持した。尾状化のために３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加し、培地を毎日交換した。６日目に、細胞を、アキュターゼを使用して解離し、１：６の比率で継代した。ＤＩＶ６～１２に、細胞を、ＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ならびに１μＭのＣＨＩＲ、１００ｎＭのプルモルファミン（ＰＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、および５００ｎＭのレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）を補充した汎ニューロン基本培地中で増殖させた。１２日目～１８日目に、細胞を、１００ｎＭのＰＭおよび５００ｎＭのＲＡを補充した汎ニューロン基本培地（ビタミンＡなし）中で増殖させた。ＤＩＶ１５に、細胞を、アキュターゼを使用して解離し、１：６の比率で継代した。ＤＩＶ１８以降、成熟、およびニューロン形成の促進のために、汎ニューロン基本培地（－ＶｉｔＡ）中で培養物を維持した。培地を毎日交換し、培地交換の前に細胞をＤＰＢＳ－／－で洗浄して、細胞死を除去した。ＤＩＶ２４に、後脳／脊髄神経系細胞を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、ＣＤ４７およびＣＤ９９に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、実施例５に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した。分化のこの段階では、細胞のおよそ３７％が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２を発現した一方で（図５０）、およそ１５％が、増殖マーカーＫｉ６７を発現し（図５０Ａ）、これらの細胞が依然として有糸分裂の神経系幹細胞であることを示し、およそ６０％が、ニューロンマーカーＩＮＡを発現し（図５０Ｂ）、これらが分化しているか、またはニューロンに分化する過程にあることを示している。分析は、細胞の３９％がＣＤ９９を発現し（図４９Ａ）、９２％がＣＤ４７を発現した（図４９Ｂ）ことを示した。さらに、ＣＤ９９およびＣＤ４７を発現する細胞の大部分が、ＳＯＸ２（図５１）およびＫｉ６７（図５２）の両方を共発現したことがわかった。これらの結果は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって、ＣＤ９９およびＣＤ４７が、後脳／脊髄ニューロンの富化および増殖性細胞の枯渇のための抗体標的として使用され得るという仮説を強く裏付ける。
８０～９０％コンフルエンスでの未分化ｈＥＳＣを、室温で５～７分間、ＥＤＴＡ ０．５ｍＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて解離して、再播種のためにフラスコから分離した。ｈＥＳＣの凝集体を、ラミニン－５２１（１．２μｇ／ｃｍ２）で予めコーティングされた２４ウェルプレートまたはＴ２５フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）上に播種し、均等に分配した。最初の２４時間、細胞をｉＰＳ Ｂｒｅｗ ＸＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）中で維持し、１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫｉ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充して、細胞生存を促進した。培地を２４時間毎に交換し、細胞を９０～１００％コンフルエンスまで増殖させ、この時点で分化が開始された。分化の最初の６日間、細胞を、神経誘導のためのＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を補充した、４５％ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ）、４５％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、５％ Ｂ２７サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ Ｎ２サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１％ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｇｉｂｃｏ）、０，５％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、０．２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から成る汎ニューロン基本培地中で維持した。尾状化のために３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を添加し、培地を毎日交換した。６日目に、細胞を、アキュターゼを使用して解離し、１：６の比率で継代した。ＤＩＶ６～１２に、細胞を、ＢＭＰ経路阻害剤ＬＤＮ－１９３１８９（１００ｎＭ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）およびＮｏｇｇｉｎ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ならびに１μＭのＣＨＩＲ、１００ｎＭのプルモルファミン（ＰＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、および５００ｎＭのレチノイン酸（ＲＡ、Ｓｉｇｍａ）を補充した汎ニューロン基本培地中で増殖させた。１２日目～１８日目に、細胞を、１００ｎＭのＰＭおよび５００ｎＭのＲＡを補充した汎ニューロン基本培地（ビタミンＡなし）中で増殖させた。ＤＩＶ１５に、細胞を、アキュターゼを使用して解離し、１：６の比率で継代した。ＤＩＶ１８以降、成熟、およびニューロン形成の促進のために、汎ニューロン基本培地（－ＶｉｔＡ）中で培養物を維持した。培地を毎日交換し、培地交換の前に細胞をＤＰＢＳ－／－で洗浄して、細胞死を除去した。ＤＩＶ２４に、後脳／脊髄神経系細胞を、アキュターゼを使用して単一細胞懸濁液に解離し、ＣＤ４７およびＣＤ９９に対するフルオロフォアコンジュゲート抗体で染色し、実施例５に記載されるようにフローサイトメトリーによって分析した。分化のこの段階では、細胞のおよそ３７％が、神経系幹細胞マーカーＳＯＸ２を発現した一方で（図５０）、およそ１５％が、増殖マーカーＫｉ６７を発現し（図５０Ａ）、これらの細胞が依然として有糸分裂の神経系幹細胞であることを示し、およそ６０％が、ニューロンマーカーＩＮＡを発現し（図５０Ｂ）、これらが分化しているか、またはニューロンに分化する過程にあることを示している。分析は、細胞の３９％がＣＤ９９を発現し（図４９Ａ）、９２％がＣＤ４７を発現した（図４９Ｂ）ことを示した。さらに、ＣＤ９９およびＣＤ４７を発現する細胞の大部分が、ＳＯＸ２（図５１）およびＫｉ６７（図５２）の両方を共発現したことがわかった。これらの結果は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳによって、ＣＤ９９およびＣＤ４７が、後脳／脊髄ニューロンの富化および増殖性細胞の枯渇のための抗体標的として使用され得るという仮説を強く裏付ける。
【0161】
実施例９：富化または枯渇のマーカーを特定するためのＲＮＡシークエンシング方法および実験設計
所望の細胞集団（すなわち、ＡＳＣＬ１によってマーク付けされる腹側中脳中間前駆体／神経芽細胞）および望ましくない集団（すなわち、非腹側中脳底板同一性細胞、非ニューロン前駆体、非神経系細胞型）に固有であるか、または上方制御された遺伝子を、偏りのない様式で特定する目的で、不均一なｈＰＳＣ由来の腹側中脳細胞培養物のトランスクリプトームシグネチャを調査するために、ｈＰＳＣ由来の腹側中脳神経系細胞のインビトロ時系列を、単一細胞ＲＮＡシークエンシングを用いて試料採取した（図１および実施例２）。
所望の細胞集団（すなわち、ＡＳＣＬ１によってマーク付けされる腹側中脳中間前駆体／神経芽細胞）および望ましくない集団（すなわち、非腹側中脳底板同一性細胞、非ニューロン前駆体、非神経系細胞型）に固有であるか、または上方制御された遺伝子を、偏りのない様式で特定する目的で、不均一なｈＰＳＣ由来の腹側中脳細胞培養物のトランスクリプトームシグネチャを調査するために、ｈＰＳＣ由来の腹側中脳神経系細胞のインビトロ時系列を、単一細胞ＲＮＡシークエンシングを用いて試料採取した（図１および実施例２）。
【0162】
所望の集団および望ましくない集団（または単一細胞ＲＮＡシークエンシングおよびトランスクリプトミクスの分野で説明されるクラスター）を、公知の遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づいて、シークエンシングデータセット（すなわち、図５に示されるｔＳＮＥプロット）において特定した。これらのクラスター間の比較を行って、所望の集団または望ましくない集団の新規の遺伝子／マーカーを特定した。
【0163】
単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を行うために、未分化ＰＳＣの細胞クラスターならびに分化細胞の細胞クラスターを、アキュターゼ、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ、または他のそのような試薬で単一細胞懸濁液に解離し、３０００～１００００個の細胞を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して処理し、ＮｅｘｔＳｅｑ５５０でシークエンシングした。データを、１０Ｘ ＣｅｌｌｒａｎｇｅｒおよびＳｅｕｒａｔ分析パッケージを使用して、Ｒプログラム言語で処理した。試料を分析し、低品質細胞またはマルチプレット細胞についてフィルタリングし、各個別の実験について別個に分析した後、選択した選択された分化細胞系統ならびにｈＰＳＣの細胞を１つのデータセットに組み合わせ、次いでこれを、Ｓｅｕｒａｔバージョン３について概説されるような標準的なＳｅｕｒａｔワークフローを使用して、すなわち、ＳＣＴｒａｎｓｆｏｒｍを使用した正規化、および最終的に、統合ｔＳＮＥプロットの最初の２９個の主要成分（図５に示されるものなど）を使用して分析した。
【0164】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証および記載されているが、ここで、多くの修正、代用、変更、および均等物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が本発明の真の趣旨の範囲内に含まれるすべての修正および変更を包含するよう意図されていることを理解されたい。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【国際調査報告】