特表 2024-523759 インテインと融合した転写活性化因子様エフェクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-06-28

(54)【発明の名称】インテインと融合した転写活性化因子様エフェクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240621BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240621BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20240621BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240621BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240621BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/63 Z ZNA

C12N9/16 Z

C12N5/10

A01H5/00 A

C12N15/62 Z

C12N15/11 Z

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024524973

(86)(22)【出願日】2022-07-07

(85)【翻訳文提出日】2024-03-07

(86)【国際出願番号】 US2022073508

(87)【国際公開番号】W WO2023283597

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/219,291

(32)【優先日】2021-07-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】511276161

【氏名又は名称】サイバス オイローペ ベスローテン ヴェンノーツハップ

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアムス，ロバート ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】ウィクソン，サラ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA88X

4B065AA88Y

4B065AA89X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA31

4B065CA60

(57)【要約】

本開示の実施形態は、第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする複数のヌクレオチド配列、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列を対象にする。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列；
第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した前記第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列；および
レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列
を含む、複数のヌクレオチド配列。

【請求項2】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記第１のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテインをコードする、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項3】

前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼと融合した前記第２のインテインをコードする、請求項２に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項4】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼの第１の部分および前記第１のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼの前記第１の部分および前記第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテインをコードする、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項5】

前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼの第２の部分と融合した前記第２のインテインをコードし、前記レアカットヌクレアーゼの前記第１の部分および前記第２の部分は、前記レアカットヌクレアーゼを形成する、請求項４に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項6】

各々、別個のベクターを含む、および／または単一発現コンストラクト上にある、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項7】

前記第１のインテインおよび前記第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、それに応じて、前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を形成するように構成されている、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項8】

前記第１のインテインおよび前記第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、それに応じて、前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮを形成するように構成されている、請求項７に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項9】

前記第１のインテインおよび前記第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質を形成するように構成されている、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項10】

その各々はさらに、プロモーターおよびターミネーターをコードする、請求項１に記載の、複数のヌクレオチド配列。

【請求項11】

細胞を、
第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列；
第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した前記第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列；および
レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列
と接触させること；ならびに
前記細胞を接触させることに応じて、
前記第１のＴＡＬＥ、前記第２のＴＡＬＥおよび前記レアカットヌクレアーゼを、前記第１のインテインおよび前記第２のインテインによりスプライシングし、
前記第１のＴＡＬＥおよび前記レアカットヌクレアーゼを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；および
前記第２のＴＡＬＥおよび前記レアカットヌクレアーゼを含む第２の半ＴＡＬＥＮ
を形成すること
を含む、方法。

【請求項12】

さらに、前記第１のヌクレオチド配列、前記第２のヌクレオチド配列、および前記第３のヌクレオチド配列を翻訳して、前記第１のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、前記第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、および前記レアカットヌクレアーゼと融合した前記第２のインテインを形成することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

さらに、前記第１の半ＴＡＬＥＮおよび前記第２の半ＴＡＬＥＮを使用して前記細胞を形質転換することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記第１のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第２のＴＡＬＥのＣ末端と融合した前記Ｎ末端インテインをコードし、前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼのＮ末端と融合したＣ末端インテイン、または前記レアカットヌクレアーゼの部分間に融合した前記Ｃ末端インテインをコードする、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記第１のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第２のＴＡＬＥのＮ末端と融合した前記Ｃ末端インテインをコードし、前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼのＣ末端と融合したＮ末端インテイン、または前記レアカットヌクレアーゼの部分間に融合した前記Ｎ末端インテインをコードする、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

スプライシングが、前記第１のインテインの、前記第２のインテインへの結合を含み、
前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む第１の中間体、ここで前記第１のインテインは前記第１のＴＡＬＥと融合し、前記第２のインテインは前記レアカットヌクレアーゼと融合している；および
前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む第２の中間体、ここで前記第１のインテインは前記第２のＴＡＬＥと融合し、前記第２のインテインは前記レアカットヌクレアーゼと融合している、
を形成する、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

スプライシングが、
前記第１のインテインを前記第２のインテインに結合すること；
前記第１のインテインおよび前記第２のインテインに関連したスプライス部位を切断すること；ならびに
前記第１のＴＡＬＥを前記レアカットヌクレアーゼに結合し、前記第２のＴＡＬＥを前記レアカットヌクレアーゼに結合して、前記第１の半ＴＡＬＥＮおよび前記第２の半ＴＡＬＥＮを形成すること、
を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

前記スプライス部位は、
前記第１のインテインと前記第１のＴＡＬＥとの間；
前記第１のインテインと前記第２のＴＡＬＥとの間；ならびに
前記第２のインテインと前記レアカットヌクレアーゼまたはその一部との間、
にある、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

少なくとも第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列；
少なくとも第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列；および
レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列
を含む、発現コンストラクト。

【請求項20】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記第１のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第２のＴＡＬＥのＣ末端と融合した前記Ｎ末端インテインをコードし、前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼのＮ末端と融合したか、または前記レアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＣ末端インテインをコードする、請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項21】

前記第１のヌクレオチド配列は、前記第１のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、前記第２のＴＡＬＥのＮ末端と融合した前記Ｃ末端インテインをコードし、前記第３のヌクレオチド配列は、前記レアカットヌクレアーゼのＣ末端と融合したか、または前記レアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＮ末端インテインをコードする、請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項22】

細胞による、前記第１のヌクレオチド配列、前記第２のヌクレオチド配列、および前記第３のヌクレオチド配列の翻訳に応じて、前記第１のインテインおよび第２のインテインは、互いに結合し、セルフスプライシングして、
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ；および
前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質
を形成するように構成されている、請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項23】

前記第１のヌクレオチド配列、前記第２のヌクレオチド配列、および前記第３のヌクレオチド配列は、別個のベクターを含むか、または単一発現コンストラクト上にある、請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項24】

前記第１のＴＡＬＥは、共同して標的ＤＮＡ配列中の第１のヌクレオチド配列に結合する第１の複数のＴＡＬＥ反復配列を含む；および
前記第２のＴＡＬＥは、共同して前記標的ＤＮＡ配列中の第２のヌクレオチド配列に結合する第２の複数のＴＡＬＥ反復配列を含む
請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項25】

前記第１のヌクレオチド配列、前記第２のヌクレオチド配列、および前記第３のヌクレオチド配列の各々はさらに、プロモーターおよびターミネーターをコードする、請求項１９に記載の発現コンストラクト。

【請求項26】

第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列；
第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した前記第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列；および
レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列
含む複数のヌクレオチド配列により形質転換させた植物、植物部位または植物細胞であって、
前記第１のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、前記第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、および前記レアカットヌクレアーゼと融合した前記第２のインテインを発現する、植物、植物部位または植物細胞。

【請求項27】

前記第１のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、前記第２のＴＡＬＥと融合した前記第１のインテイン、および前記レアカットヌクレアーゼと融合した前記第２のインテインの、前記発現した第１のインテインおよび第２のインテインは、セルフスプライシングして、
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ；および
前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質
を形成する、請求項２６に記載の植物、植物部位または植物細胞。

【請求項28】

形質転換させた植物、植物部位または植物細胞は、
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；
前記レアカットヌクレアーゼに結合した前記第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ；および
前記第２のインテインに結合した前記第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質
を示す、請求項２６に記載の植物、植物部位または植物細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出されたデータの、参照による組込み
ＡＳＣＩＩテキストファイルのコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれており、サイズ１１５ｋｂで、本明細書と同時に提出されており、「Ｃ１６３３１１２１１１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」と識別され、２０２２年７月７日に作成されたものである。

【背景技術】

【0002】

レアカットヌクレアーゼ、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）、および関連するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）またはＣｐｆ１システムを使用するゲノム編集技術は、基礎生物学研究、バイオテクノロジー、品種改良および遺伝子治療を加速させた。レアカットヌクレアーゼは、欠失、挿入を生成するため、および相同組換えを開始するために使用可能である。ＴＡＬＥＮは、レアカットヌクレアーゼと、特異的配列を標的にして、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中に正確な切断を生成し得るＴＡＬＥとを含む。あるＴＡＬＥＮデザインは、レアカットヌクレアーゼと融合した、第１の結合部位を認識する左ＴＡＬＥを含む左半分ＴＡＬＥＮと、それに続くスペーサー領域、およびレアカットヌクレアーゼと融合した、第２の結合部位を認識する右ＴＡＬＥを含む右半分ＴＡＬＥとを含む。

【発明の概要】

【0003】

本開示は、ＴＡＬＥに関連する前記の課題および必要性の克服を対象にする。

【0004】

様々な態様は、第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列を含む複数のヌクレオチド配列を対象にする。

【0005】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテインをコードする。さらなる一部の態様では、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインをコードする。

【0006】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼの第１の部分および第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼの第１の部分および第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテインをコードする。さらなる一部の態様では、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼの第２の部分と融合した第２のインテインをコードし、ただし、レアカットヌクレアーゼの第１の部分および第２の部分は、レアカットヌクレアーゼを形成する。

【0007】

一部の態様では、複数のヌクレオチド配列は、各々、別個のベクターを含む、および／または単一発現コンストラクト上にある。

【0008】

一部の態様では、第１のインテインおよび第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、それに応じて、レアカットヌクレアーゼに結合した第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を形成するように構成されている。さらなる一部の態様では、第１のインテインおよび第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、それに応じて、レアカットヌクレアーゼに結合した第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮを形成するように構成されている。

【0009】

一部の態様では、第１のインテインおよび第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし、第２のインテインに結合した第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質を形成するように構成されている。

【0010】

一部の態様では、複数のヌクレオチド配列の各々はさらに、プロモーターおよびターミネーターをコードする。

【0011】

一部の態様は、細胞を、第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列と接触させることを含む方法を対象にする。本方法はさらに、細胞を接触させることに応じて、第１のＴＡＬＥ、第２のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼが、第１のインテインおよび第２のインテインによりスプライシングし、第１のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ならびに第２のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼを含む第２の半ＴＡＬＥＮを形成することを含む。

【0012】

一部の態様では、本方法はさらに、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列を翻訳し、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインを形成することを含む。

【0013】

一部の態様では、本方法はさらに、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮを使用して細胞を形質転換することを含む。

【0014】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼのＮ末端と融合したＣ末端インテイン、またはレアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＣ末端インテインをコードする。

【0015】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼのＣ末端と融合したＮ末端インテイン、またはレアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＮ末端インテインをコードする。

【0016】

一部の態様では、スプライシングは、第１のインテインの、第２のインテインへの結合を含み、レアカットヌクレアーゼと融合している第２のインテインに結合した、第１のＴＡＬＥと融合している第１のインテインを含む第１の中間体、およびレアカットヌクレアーゼと融合している第２のインテインに結合した、第２のＴＡＬＥと融合している第１のインテインを含む第２の中間体を形成する。

【0017】

一部の態様では、スプライシングは、第１のインテインを第２のインテインに結合すること、第１のインテインおよび第２のインテインに関連した（associated with）スプライス部位を切断すること、ならびに第１のＴＡＬＥをレアカットヌクレアーゼに結合し、第２のＴＡＬＥをレアカットヌクレアーゼに結合して、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮを形成する。

【0018】

一部の態様では、スプライス部位は、第１のインテインと第１のＴＡＬＥとの間、第１のインテインと第２のＴＡＬＥとの間、および第２のインテインとレアカットヌクレアーゼまたはその一部との間にある。

【0019】

一部の態様は、少なくとも第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列、少なくとも第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトを対象にする。

【0020】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥのＣ末端と融合したＮ末端インテインをコードし、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼのＮ末端と融合したか、またはレアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＣ末端インテインをコードする。

【0021】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥのＮ末端と融合したＣ末端インテインをコードし、第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼのＣ末端と融合したか、またはレアカットヌクレアーゼの部分間に融合したＮ末端インテインをコードする。

【0022】

一部の態様では、細胞による、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列の翻訳に応じて、第１のインテインおよび第２のインテインは、互いに結合し、セルフスプライシングして、レアカットヌクレアーゼに結合した第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、レアカットヌクレアーゼに結合した第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ、および第２のインテインに結合した第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質を形成するように構成されている。

【0023】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列は、別個のベクターを含むか、または単一発現コンストラクト上にある。

【0024】

一部の態様では、第１のＴＡＬＥは、共同して、標的ＤＮＡ配列中の第１のヌクレオチド配列に結合する、第１の複数のＴＡＬＥ反復配列を含み、第２のＴＡＬＥは、共同して、標的ＤＮＡ配列中の第２のヌクレオチド配列に結合する、第２の複数のＴＡＬＥ反復配列を含む。

【0025】

一部の態様では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列の各々はさらに、プロモーターおよびターミネーターをコードする。

【0026】

様々な態様は、第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）の少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第１のヌクレオチド配列、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする第３のヌクレオチド配列を含む複数のヌクレオチド配列により形質転換させた植物、植物部位または植物細胞を対象にする。そして、形質転換させた植物、植物部位または植物細胞は、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインを発現する。

【0027】

一部の態様では、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインの、発現した第１のインテインおよび第２のインテインは、セルフスプライシングして、レアカットヌクレアーゼに結合した第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、レアカットヌクレアーゼに結合した第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ、および第２のインテインに結合した第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質を形成する。

【0028】

一部の態様では、形質転換させた植物、植物部位または植物細胞は、レアカットヌクレアーゼに結合した第１のＴＡＬＥを含む第１の半転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、レアカットヌクレアーゼに結合した第２のＴＡＬＥを含む第２の半ＴＡＬＥＮ、および第２のインテインに結合した第１のインテインを含む、スプライシングされたタンパク質を示す。

【0029】

様々な実施形態は、本明細書に記載される方法、ベクター、発現コンストラクト、ヌクレオチド配列および／もしくはシステムにより形質転換させた宿主細胞ならびに／または生物体を対象にする。

【0030】

様々な実施形態は、本明細書において特許請求されるヌクレオチド配列および／またはシステムのいずれかを形成する方法を対象にする。

【0031】

様々な例の実施形態は、添付図面と関連して以下の詳細な説明を考慮すると、より完全に理解できる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1A-1D】本開示と一致した、例示的ヌクレオチド配列を示す図であり、それらのヌクレオチド配列は、ＴＡＬＥを伴う第１のインテインをコードする、およびレアカットヌクレアーゼを伴う第２のインテインをコードする。

【図2】本開示と一致した、例示的ヌクレオチド配列を使用してＴＡＬＥＮを生成するための例示的方法を示す流れ図である。

【図3A-3B】本開示と一致した、例示的発現コンストラクトを示す図である。

【図4】本開示と一致した、インテインによりスプライシングしてＴＡＬＥＮを形成する例を示す流れ図である。

【図5】本開示と一致した、ヌクレオチド配列を使用する細胞の編集から得られるジェノタイピングを示す画像である。

【図6A-6C】本開示と一致した、ＹＦＰ陰性対照、ＴＡＬＥＮ陽性対照、およびインテインからのゲノム領域を示す全体画像である。

【図7】本開示と一致した、異なるプラスミドベクターを使用する、ダイズ外植体の形質転換の例示的結果を示す図である。

【図8A-8I】本開示と一致した、異なるプラスミドベクターを使用する、アサ外植体の形質転換の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本開示の態様は、様々な方法、ヌクレオチド配列、システム、発現コンストラクト、ならびにヌクレオチド配列を使用して形質転換させた宿主細胞および／または生物体を対象にする。本発明は、必ずしもそのような適用に限定されない一方、本発明の様々な態様は、その関係を使用する様々な実施形態の考察を介して理解され得る。

【0034】

したがって、以下の説明では、本明細書に提示される具体的な実施形態を記載するために、様々な具体的詳細を記載する。しかし、それらの実施形態の１つまたは複数の他の実施例および／または変形形態が、以下に示されるすべての具体的詳細を伴わずに実行可能であることが当業者には明らかである。他の場合、周知の特色は、本明細書での実施形態の説明を不明瞭にさせないように、詳細には記載されていない。例示しやすいように、同じ要素、または同じ要素の追加の実例を指すために、異なる図において同じ参照番号を使用し得る。

【0035】

レアカットヌクレアーゼ、例えばレアカットエンドヌクレアーゼは、特異的遺伝子を標的にするため、または複数遺伝子を標的にするために使用可能である。非限定的な例は、ＴＡＬＥＮ、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲを含む。レアカットヌクレアーゼは、長さが１２～４０塩基対以上の認識部位を有する、標的配列と呼ばれることもあるヌクレオチド配列に対するエンドヌクレアーゼ活性を伴う天然または操作されたタンパク質であり得る。典型的に、レアカットヌクレアーゼは、認識部位の内部での切断を引き起こす。一部の場合、レアカットヌクレアーゼは、切断活性を伴うヌクレアーゼドメインと融合した結合ドメインを含有する融合タンパク質である。結合ドメインは、標的配列に結合するように構成され得る。レアカットエンドヌクレアーゼドメインは、標的位置と関連する標的ゲノム遺伝子座において変異を誘導するように構成され得る。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｆｏｋ１と呼ばれることもあるＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼとの、結合ドメインの融合タンパク質の例である。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインと融合した結合ドメインを介して、標的配列に対する特異性を有するように遺伝子操作され得て、選択された特異的ＤＮＡ配列を標的にするキメラヌクレアーゼをもたらし、標的配列において、またはその近くでのＤＮＡの切断をもたらす。そのようなＤＮＡ切断（二本鎖切断）は、ノックアウトのような変異、あるいは遺伝子機能の変化を、高精度かつ効率的に誘導し得る。

【0036】

本開示に従う実施形態は、ＴＡＬＥおよびヌクレアーゼを含有するヌクレオチド配列中でのインテインの使用を対象にする。一部の実施形態では、半ＴＡＬＥおよびヌクレアーゼは、互いに分離しており、翻訳後、インテインは、それぞれの半ＴＡＬＥをスプライシングしてヌクレアーゼにライゲートすることができる。半ＴＡＬＥおよびヌクレアーゼを含有するヌクレオチド配列に対して相補的インテインを使用することにより、生物体の細胞へと送達するため、および形質転換するために使用されるベクターは、完全半ＴＡＬＥＮを含有するヌクレオチド配列と比べて、より小さいプラスミドサイズ（「カーゴサイズ」と呼ばれることもある）を有し得る。プラスミドサイズの低下は、ヌクレオチド配列の発現頻度を上昇させ得る。さらに、ＴＡＬＥおよびヌクレアーゼを含有するヌクレオチド配列におけるインテインの使用は、細胞への遺伝子編集物質の送達に柔軟性を付加し得る。

【0037】

一部の実施形態では、異なるヌクレオチド配列は、プラスミドのような一般的発現コンストラクト上で送達され得る。一緒に送達されるものの、各ヌクレオチド配列は、異なる分子複合体をコードし、他の分子複合体とは別個に転写および翻訳される。分子複合体は、一緒に転写および翻訳されてタンパク質または融合タンパク質を形成する、化合物または化合物の複合体である。例えば、第１のヌクレオチド配列は、第１のインテインと融合した第１のＴＡＬＥの分子複合体をコードし、そのヌクレオチド配列は、一緒に転写および翻訳されて、融合した第１のＴＡＬＥと第１のインテインとを含む融合タンパク質を形成する。得られる分子複合体は、第１のＴＡＬＥと融合したヌクレアーゼの翻訳および転写と比べて、小さいカーゴサイズを有する。本明細書で使用する融合タンパク質は、単一ポリペプチドを産生する単一ユニットとして一緒に転写および／もしくは翻訳されるように互いに連結もしくは固定されている別個の遺伝子によってコードされる少なくとも２つのドメインを含むタンパク質もしくはタンパク質複合体を含む、ならびに／または指す。

【0038】

前記の実施形態のいずれかでは、分子複合体は、転写および翻訳されてからスプライシングされて、細胞を形質転換するためのＴＡＬＥＮを形成する。細胞の内部に送達される分子複合体のカーゴサイズの低下は、分子複合体の転写型の発現頻度を上昇させ得る。さらに、ＴＡＬＥおよびヌクレアーゼを含有する分子複合体におけるインテインの使用は、細胞への遺伝子編集物質の送達に柔軟性を付加し得る。例えば、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、同じままであって、ＴＡＬＥの可変部分のみが、異なる標的向けに修正されていてもよい（例えば、第１および第２のヌクレオチド配列において）。

【0039】

次に図を見ると、図１Ａ～図１Ｄは、本開示と一致した、例示的ヌクレオチド配列を示す図であり、それらのヌクレオチド配列は、ＴＡＬＥを伴う第１のインテインをコードする、およびレアカットヌクレアーゼを伴う第２のインテインをコードする。

【0040】

図１Ａが示すように、複数のヌクレオチド配列１００は、第１のＴＡＬＥ１０２の少なくとも一部分と融合した第１のインテイン１０４をコードし、レアカットヌクレアーゼ１０８の少なくとも一部分と融合した第２のインテイン１０６をコードする。図１Ｂがさらに示すように、第１のＴＡＬＥ１０２は、ＴＡＬＥ Ｎ末端１０３、第１の複数のＴＡＬＥ反復配列１０５（結合ドメインとして例示）、およびＴＡＬＥ Ｃ末端１０７を含み得る。第１の複数のＴＡＬＥ反復配列１０５は、共同して、標的ＤＮＡ配列中の第１のヌクレオチド配列に結合することができ、結合ドメインと呼ばれ得る。ＴＡＬＥ反復配列は、２つの位置（１２位および１３位）において異なる３３～３５アミノ酸長リピートのアレイであり得て、「反復可変二残基（ＲＶＤ）」と呼ばれることもある。各ＲＶＤは、単一ヌクレオチドを認識するため、複数リピートのアレイは、アレイにおけるリピートの数に対応する長さの、「標的配列」と呼ばれることもあるユニークヌクレオチド配列を同定する。アレイのＲＶＤは共に、標的配列に結合する結合ドメインを形成する。

【0041】

図１Ｂが示すように、他の複数のヌクレオチド配列１０１は、第１のＴＡＬＥ１０２の少なくとも一部分と融合した第１のインテイン１０４、レアカットヌクレアーゼ１０８の少なくとも一部分と融合した第２のインテイン１０６、および第２のＴＡＬＥ１１０の少なくとも一部分と融合した第１のインテイン１１２をコードし得る。第１のインテイン１０４、１１２は、同じインテインをコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、インテイン配列は２回出現する）。第２のＴＡＬＥ１１０は、ＴＡＬＥ Ｎ末端１０９、第２の複数のＴＡＬＥ反復配列１１１（結合ドメインとして例示）、およびＴＡＬＥ Ｃ末端１１３を含み得る。第２の複数のＴＡＬＥ反復配列１１１は、共同して、標的ＤＮＡ配列中の第２のヌクレオチド配列に結合することができ、結合ドメインと呼ばれ得る。

【0042】

図１Ｂが示すように、複数のヌクレオチド配列１０１は、第１のＴＡＬＥ１０２と融合した第１のインテイン１０４をコードする第１のヌクレオチド配列、第２のＴＡＬＥ１１０と融合した第１のインテイン１１２をコードする第２のヌクレオチド配列、およびレアカットヌクレアーゼ１０８と融合した第２のインテイン１０６をコードする第３のヌクレオチド配列を含み得る。しかし、実施例はそのように限定されず、図１Ｃがさらに示すように、第１および／または第２のインテインは、第１のＴＡＬＥ１０２、第２のＴＡＬＥ１１０、および／またはレアカットヌクレアーゼ１０８の部分と融合可能である。

【0043】

一部の実施形態では、複数のヌクレオチド配列１００、１０１は、各々、別個のベクターを形成してもよい。一部の実施形態では、図３Ａ～図３Ｂが示すように、複数のヌクレオチド配列１００、１０１は、単一発現コンストラクト上に形成され得る。

【0044】

第１のインテイン１０４、１１２および第２のインテイン１０６は、接触するとセルフスプライシングするように構成され得る。セルフスプライシングに応じて、レアカットヌクレアーゼ１０８に結合した第１のＴＡＬＥ１０２を含む第１の半ＴＡＬＥＮが形成され得る。さらに、レアカットヌクレアーゼ１０８に結合した第２のＴＡＬＥ１１０を含む第２の半ＴＡＬＥＮが形成され得る。さらに、第２のインテイン１０６に結合した第１のインテイン１０４、１１２を含む、スプライシングされたタンパク質が形成され得る。一部の実施例では、スプライシングされたタンパク質は、トランススプライシングされたタンパク質である。一部の実施例では、スプライシングされたタンパク質は、シススプライシングされたタンパク質である。

【0045】

本明細書で使用するインテインは、インテインが結合している他のタンパク質から自己切除する（self-excise）内部タンパク質断片または要素であり、インテインは、エクステインと呼ばれることもある隣接成分の、ペプチド結合によるライゲーションを触媒する。インテイン切除は、補助的な酵素または補因子を必要としないこともある翻訳後プロセスである。この自己切除プロセスは、ＲＮＡイントロンの、プレｍＲＮＡからのスプライシングとの類似により「タンパク質スプライシング」と呼ばれる（Ｐｅｒｌｅｒ Ｆら、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５－１１２７（１９９４））。第１のインテイン１０４、１１２および第２のインテイン１０６はそれぞれ、互いに親和性を有するＮ末端インテインおよびＣ末端インテインを含み、接触すると互いに結合する。第１のインテイン１０４、１１２および第２のインテイン１０６は、トランススプライシングインテインと呼ばれ得る。トランススプライシングに関して、一方のインテインは、Ｎ－エクステインに結合しているＮ末端インテイン（例えば断片）であり、他方のインテインは、Ｃ－エクステインに結合しているＣ末端インテインである。Ｎ末端インテインとＣ末端インテインとは互いに結合し、セルフスプライシングして、Ｎ－エクステインとＣ－エクステインとのライゲーションを触媒する。一部の実施例では、インテイン配列は、中でも、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ（シアノバクテリア）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（超好熱古細菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ（超好熱菌）、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、およびＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅに由来する。例示的インテインは、中でも、Ｔｆｕ ｐｏｌ－１インテイン、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｎａＥ）インテイン（例えば、Ｓｓｐ ＤｎａＥ、Ｎｐｕ ＤｎａＥ）、Ｇｐ４１－１、Ｍｘｅ ＧｙｒＡ、Ｍｒｕ ＲｅｃＡ、ＭＴＵ ＲｅｃＡ、Ｔｌｉ Ｐｏｌ－２、Ｓｃｅ ＶＭＡ、およびＳｓｐ ＤＮＡヘリカーゼ（ＤｎａＢ）を含む。

【0046】

一部の実施形態では、第１および第２のインテイン１０４、１１２、１０６は、直交性インテインであり得る。例えば、ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓからのＮ末端インテインは、ＮｏｓｔｏｃからのＣ末端インテインに結合可能であり、および／または２つの異なるＮ末端インテインは、同じＣ末端インテインに結合可能である。

【0047】

本明細書中で、例えば、図１Ｄがさらに示すように、複数のヌクレオチド配列１００、１０１は各々さらに、追加要素、例えば、プロモーターおよび／またはターミネーターをコードし得る。

【0048】

図１Ｃは、レアカットヌクレアーゼおよびＴＡＬＥの部分と融合したインテインをコードする複数のヌクレオチド配列１１５の一例を示す。例えば、第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥ１０２と融合したレアカットヌクレアーゼの第１の部分１０８－１と融合した第１のインテイン１０４をコードする。第２のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼの第２の部分１０８－２と融合した第２のインテイン１０６をコードする。示すように、レアカットヌクレアーゼの第１の部分１０８－１は、第１のＴＡＬＥ１０２と第１のインテイン１０４との間に融合している。複数のヌクレオチド配列１００、１０１と同様に、第１のインテイン１０４および第２のインテイン１０６は、接触するとセルフスプライシングするように構成され得る。スプライシングに応じて、レアカットヌクレアーゼの第１および第２の部分１０８－１、１０８－２は、互いに結合し得て、第１のＴＡＬＥ１０２を伴う第１の半ＴＡＬＥＮを形成する。図１Ｃは例示しないものの、一部の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥと融合した、レアカットヌクレアーゼの第１の部分１０８－１と融合した第１のインテイン１０４をコードし得て、スプライシングに応じて、レアカットヌクレアーゼの第１および第２の部分１０８－１、１０８－２は、互いに結合し得て、第２のＴＡＬＥを伴う第２の半ＴＡＬＥＮを形成する。

【0049】

図１Ｄは、その各々がさらにプロモーターおよびターミネーターを含む、複数のヌクレオチド配列１１７の一例を示す。例えば、第１のヌクレオチド配列は、第１のプロモーター１１６、第１のＴＡＬＥ１０２、第１のインテイン１０４、第１のターミネーター１１８、および場合によりレアカットヌクレアーゼの一部１０８－２をコードする。第２のヌクレオチド配列は、第２のプロモーター１２４、第２のＴＡＬＥ１１０、第１のインテイン１１２、第２のターミネーター１２６、および場合によりレアカットヌクレアーゼの一部１０８－３をコードする。第３のヌクレオチド配列は、第３のプロモーター１２０、第２のインテイン１０６、レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分１０８－２、および第３のターミネーター１２２をコードする。一部の実施形態では、第２のインテイン１０６は、レアカットヌクレアーゼの第２の部分１０８－２と融合しており、第１のインテイン１０４、１１２はそれぞれ、レアカットヌクレアーゼの第１の部分１０８－１、１０８－３、および第１のＴＡＬＥ１０２または第２のＴＡＬＥ１１０と融合している。

【0050】

しかし、実施形態はそのように限定されず、様々な実施形態では、第１のインテイン１０４、１１２は、第１のＴＡＬＥ１０２の第１の部分および／もしくは第２のＴＡＬＥ１１０の第１の部分と融合可能であり、ならびに／または第２のインテイン１０６は、単一ヌクレオチド配列としてのレアカットヌクレアーゼと融合した、第１のＴＡＬＥ１０２の第２の部分および／もしくは第２のＴＡＬＥ１１０の第２の部分と融合している。他の実施形態では、第２のインテイン１０６が、単一ヌクレオチド配列としてのレアカットヌクレアーゼと融合している。

【0051】

非限定的な例として、プロモーターは、中でも、ノパリンシンターゼプロモーター（ＮｏｓＰｒｏ）またはＴ７プロモーターを含み得る。他の例示的プロモーターは、中でも、Ｓｐ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ＡＤＨＩプロモーターおよびＡＤＨ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｔ７ｌａｃプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーターを含み得る。

【0052】

非限定的な例として、ターミネーターは、中でも、Ｎｏｓターミネーター（ＮｏｓＴｅｒｍ）、ＣａＭＶターミネーター、ｔ７Ｓ、ｔＥ９、ｔｍａｓ、ｔｏｃｓ、ｔＴｒ９、ｔｐｉｎＩＩＩ、ｔＯＲＦ２５、ｔｔｍｌを含み得る。

【0053】

図２は、本開示と一致した、例示的ヌクレオチド配列を使用してＴＡＬＥＮを生成するための例示的方法を示す流れ図である。本方法２３０で使用されるヌクレオチド配列は、図１Ａ～図１Ｄのいずれかのヌクレオチド配列１００、１０１、１１５、１１７を含み得る。

【0054】

２３２において、本方法２３０は、細胞を、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列と接触させることを含む。第１のヌクレオチド配列は、第１のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする。第２のヌクレオチド配列は、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテインをコードする。第３のヌクレオチド配列は、レアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする。

【0055】

２３４では、細胞を接触させることに応じて、本方法２３０は、第１のＴＡＬＥ、第２のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼが、第１のインテインおよび第２のインテインによりスプライシングし、第１のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼを含む第１の半ＴＡＬＥＮならびに第２のＴＡＬＥおよびレアカットヌクレアーゼを含む第２の半ＴＡＬＥＮを形成することを含む。第１および第２の半ＴＡＬＥＮは、左半分および右半分ＴＡＬＥＮを含み得る。

【0056】

例えば、および細胞をヌクレオチド配列と接触させることに応じて、本方法２３０は、細胞が、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列を転写および／または翻訳することを含み得る。転写および／または翻訳に応じて、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインが、形成または発現可能である。様々な実施形態では、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列の各々の複数のコピーが、転写および／または翻訳され得て、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインの各々の複数のコピーをもたらす。

【0057】

第１のインテインおよび第２のインテインは、接触するとセルフスプライシングし得る。スプライシングプロセスは、第１および第２の半ＴＡＬＥＮの形成に先立って形成される中間体をもたらし得る。例えば、図４がさらに示すように、第１のインテインおよび第２のインテインは、結合して、第１の中間体および第２の中間体を形成することができる。第１の中間体は、第２のインテインに結合した第１のインテインを含み得て、ただし、第１のインテインは、第１のＴＡＬＥと融合し、第２のインテインは、レアカットヌクレアーゼと融合している。第２の中間体は、第２のインテインに結合した第１のインテインを含み得て、ただし、第１のインテインは、第２のＴＡＬＥと融合し、第２のインテインは、レアカットヌクレアーゼと融合している。

【0058】

前記のように、スプライシングは、インテイン間での結合、スプライス部位での切断、および構成要素間での結合を含む。例えば、スプライシングは、第１のインテインの、第２のインテインへの結合、第１のインテインおよび第２のインテインに関連したスプライス部位での切断、ならびに第１のＴＡＬＥの、レアカットヌクレアーゼへの結合および第２のＴＡＬＥの、レアカットヌクレアーゼへの結合を含み、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮを形成する。一部の実施例では、スプライシングは、レアカットヌクレアーゼの第１の部分および第２の部分の互いの結合を含み得て、完全レアカットヌクレアーゼを形成する。

【0059】

スプライス部位は、複数のヌクレオチド配列の構成要素間にあり得る。例えば、スプライス部位は、第１のインテインと第１のＴＡＬＥとの間、第１のインテインと第２のＴＡＬＥとの間、および第２のインテインとレアカットヌクレアーゼまたはその一部との間、にあり得る。一部の実施形態では、スプライス部位は、第２のインテインとレアカットヌクレアーゼの第１の部分および第２の部分の各々との間にあり得る。

【0060】

一部の実施形態では、本方法２３０はさらに、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮを使用して細胞を形質転換することを含み得る。例えば、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮは、結合ドメインを介して標的ＤＮＡ配列に結合し得て、それに応じて、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮのエンドヌクレアーゼは、標的配列においてか、またはその近くでの二本鎖切断をもたらし得る。

【0061】

様々な実施形態は、複数のヌクレオチド配列を含むシステムを対象にする。一部の実施形態では、単一発現コンストラクトは、複数のヌクレオチド配列の各々を含み得る。他の実施形態では、および／または付加的に、各々のヌクレオチド配列は、個々のベクターを形成してもよい。

【0062】

図３Ａ～図３Ｂは、本開示と一致した、図１Ａ～図１Ｄが示すヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトのような、例示的発現コンストラクトを示す図である。図３Ａ～図３Ｂは、単一発現コンストラクト３４０、３６０を示すものの、実施形態は、そのように限定されず、それぞれのヌクレオチド配列が、システムを形成する別個のベクター上に存在してもよい。

【0063】

システムまたは発現コンストラクト３４０、３６０は、前記の第１のヌクレオチド配列３４１－Ａ、３４１－Ｂ、第２のヌクレオチド配列３４３－Ａ、３４３－Ｂ、および第３のヌクレオチド配列３４５－Ａ、３４５－Ｂを含む。第１のヌクレオチド配列３４１－Ａ、３４１－Ｂは、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７の少なくとも一部分と融合した第１のインテイン３０４、３６２をコードする。第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７は、ＴＡＬＥ Ｎ末端３０３、第１の複数のＴＡＬＥ反復配列、例えば、第１の結合ドメイン（ＢＤ１）３０５、およびＴＡＬＥ Ｃ末端３０７を含み得る。第１の複数のＴＡＬＥ反復配列は、標的ＤＮＡ配列中の第１のヌクレオチド配列に結合する。第１のヌクレオチド配列３４１－Ａ、３４１－Ｂはさらに、第１のプロモーター３４２および第１のターミネーター３４４を含む。第１のプロモーター３４２は、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７および第１のインテイン３０４、３６２の上流にあり得て、第１のターミネーター３４４は、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７および第１のインテイン３０４、３６２の下流にあり得る。

【0064】

第２のヌクレオチド配列３４３－Ａ、３４３－Ｂは、第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３の少なくとも一部分と融合した第１のインテイン３１２、３６４をコードする。第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３は、ＴＡＬＥ Ｎ末端３０９、第２の複数のＴＡＬＥ反復配列、例えば、第２の結合ドメイン（ＢＤ２）３１１、およびＴＡＬＥ Ｃ末端３１３を含み得る。第２の複数のＴＡＬＥ反復配列は、標的ＤＮＡ配列中の第２のヌクレオチド配列に結合する。第２のヌクレオチド配列３４３－Ａ、３４３－Ｂはさらに、第２のプロモーター３４６および第２のターミネーター３４８を含む。第２のプロモーター３４６は、第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３および第１のインテイン３１２、３６４の上流にあり得て、第２のターミネーター３４８は、第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３および第１のインテイン３１２、３６４の下流にあり得る。

【0065】

第３のヌクレオチド配列３４５－Ａ、３４５－Ｂは、レアカットヌクレアーゼ３０８の少なくとも一部分と融合した第２のインテイン３０６、３６６をコードする。第３のヌクレオチド配列３４５－Ａ、３４５－Ｂはさらに、第３のプロモーター３５０および第３のターミネーター３５２を含む。第３のプロモーター３５０は、レアカットヌクレアーゼ３０８および第２のインテイン３０６、３６６の上流にあり得て、第３のターミネーター３５２は、レアカットヌクレアーゼ３０８および第２のインテイン３０６、３６６の下流にあり得る。

【0066】

図３Ａの発現コンストラクト３４０が示すように、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列３４１－Ａは、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７のＣ末端３０７と融合したＮ末端インテイン３０４をコードする。第２のヌクレオチド配列３４３－Ａは、第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３のＣ末端３１３と融合したＮ末端インテイン３１２をコードする。そして、第３のヌクレオチド配列３４５－Ａは、レアカットヌクレアーゼ３０８のＮ末端と融合したか、またはレアカットヌクレアーゼ３０８の部分間に融合したＣ末端インテイン３０６をコードする。そのような実施形態では、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７および第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３は、それぞれ、第１のインテイン３０４、３１２の上流にある。第２のインテイン３０６は、レアカットヌクレアーゼ３０８の少なくとも一部分の上流にある。

【0067】

図３Ｂの発現コンストラクト３６０が示すように、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列３４１－Ｂは、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７のＮ末端３０３と融合したＣ末端インテイン３６２をコードする。第２のヌクレオチド配列３４３－Ｂは、第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３のＮ末端３０９と融合したＣ末端インテイン３６４をコードする。そして、第３のヌクレオチド配列３４５－Ｂは、レアカットヌクレアーゼ３０８のＣ末端と融合したか、またはレアカットヌクレアーゼ３０８の部分間に融合したＮ末端インテイン３６６をコードする。そのような実施形態では、第１のＴＡＬＥ３０３、３０５、３０７および第２のＴＡＬＥ３０９、３１１、３１３は、それぞれ、第１のインテイン３６２、３６４の下流にある。第２のインテイン３６６は、レアカットヌクレアーゼ３０８の少なくとも一部分の下流にある。

【0068】

本明細書で使用する発現コンストラクトは、ゲノム編集試薬（genome editing reagent）を運ぶ１つもしくは複数のベクターもしくはバイナリーベクターを含むヌクレオチド配列（例えば、核酸配列もしくはＤＮＡ配列）を含む、および／または指す。ゲノム編集試薬は、ヌクレアーゼおよび／もしくはＴＡＬＥを含み得るか、またはコードし得る。一部の実施形態では、発現コンストラクトは、細胞内でのゲノム編集試薬の輸送を促進するように選択および配置された様々なヌクレオチド配列を含み得る。例えば、発現コンストラクトは、前記の第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列および第３のヌクレオチド配列を含み得る。レアカットヌクレアーゼは、数あるヌクレアーゼの中でもＦｏｋＩタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、発現コンストラクトおよび／またはベクターは、他の構成要素、例えば、検出可能標識、プロモーターおよびターミネーターを含み得る。検出可能標識は、数ある種類の標識の中でも、蛍光タンパク質、フルオロフォア、またはフルオロフォアに結合したヌクレオチドを含み得る。

【0069】

ベクターまたはバイナリーベクターは、「インサート」と呼ばれることもある１つもしくは複数の導入遺伝子と骨格とを含む核酸配列を含むか、または指す。バイナリーベクターは、形質転換した細胞が発現する導入遺伝子と調節配列とを含む発現カセットを含み得る。

【0070】

本明細書で使用するドメインは、三次元構造を形成し得る、タンパク質配列の保存された部分およびそのタンパク質の三次構造を含む、ならびに／または指す。ドメインは、発現カセットによりコードされ得る。

【0071】

本明細書中でさらに示すように、それぞれ、第１のヌクレオチド配列３４１－Ａ、３４１－Ｂ、第２のヌクレオチド配列３４３－Ａ、３４３－Ｂ、および第３のヌクレオチド配列３４５－Ａ、３４５－Ｂを含む発現コンストラクト３４０、３６０の転写および／または翻訳に応じて、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインの各々の複数のコピーが形成され得る。さらに、それぞれのインテイン３０４、３１２、３０６、３６２、３６４、３６６は、互いに結合し、セルフスプライシングすることができ、第１の半ＴＡＬＥＮおよび第２の半ＴＡＬＥＮを形成する。

【0072】

一部の実施形態では、第１のプロモーター３４２、第２のプロモーター３４６および第３のプロモーター３５０は、同じプロモーターを含み得る。他の実施形態では、第１のプロモーター３４２、第２のプロモーター３４６および第３のプロモーター３５０は、各々、異なるプロモーターを含み得る。さらなる実施形態では、第１のプロモーター３４２および第２のプロモーター３４６は、同じプロモーターであり得て、第３のプロモーター３５０は、第１のプロモーター３４２および第２のプロモーター３４６と異なってもよい。例えば、第３のプロモーター３５０は、転写および／または翻訳後、第１のＴＡＬＥと融合した第１のインテイン、および第２のＴＡＬＥと融合した第１のインテインのコピーの数と比べて、レアカットヌクレアーゼと融合した第２のインテインの追加のコピーが形成されるように、第１のプロモーター３４２および第２のプロモーター３４６よりも強力なプロモーターであり得る。

【0073】

図４は、本開示と一致した、インテインによりスプライシングしてＴＡＬＥＮを形成するプロセスの一例を示す流れ図である。

【0074】

細胞の集団を、複数のヌクレオチド配列と接触させた後、複数のヌクレオチド配列が、細胞により転写および／または翻訳され、第１のＴＡＬＥ４７４と融合した第１のインテイン４７８－Ａ、第２のＴＡＬＥ４８２と融合した第１のインテイン４７８－Ｂ、およびレアカットヌクレアーゼ４８３と融合した第２のインテイン４８１を含む、構成要素４７１、４７３および４７５が形成される。図４は、構成要素４７１、４７３および４７５の単一コピーを示すものの、構成要素４７１、４７３および４７５の各々の複数のコピーが形成され得る。

【0075】

構成要素４７１、４７３および４７５は、互いに接触し得て、それに応じて、第１のインテイン４７８－Ａ、４７８－Ｂがそれぞれ、第２のインテイン４８１のコピーに結合する。結合に応じて、第１の中間体４７７および第２の中間体４７９が形成される。第１の中間体４７７は、第２のインテイン４８１に結合した第１のインテイン４７８－Ａを含み、ただし、第１のインテイン４７８－Ａは、第１のＴＡＬＥ４７４と融合し、第２のインテイン４８１は、レアカットヌクレアーゼ４８３と融合している。第２の中間体４７９は、第２のインテイン４８１に結合した第１のインテイン４７８－Ｂを含み、ただし、第１のインテイン４７８－Ｂは、第２のＴＡＬＥ４８２と融合し、第２のインテイン４８１は、レアカットヌクレアーゼ４８３と融合している。

【0076】

第１のインテイン４７８－Ａ、４７８－Ｂがそれぞれ、第２のインテイン４８１のコピーに結合した後、インテイン４７８－Ａ、４７８－Ｂ、４８１は、セルフスプライシングして、第１の半ＴＡＬＥＮ４８５、第２の半ＴＡＬＥＮ４８９、およびスプライシングされたタンパク質４８７が形成される。例えば、インテイン４７８－Ａ、４７８－Ｂ、４８１は、第１のインテイン４７８－Ａ、４７８－Ｂ、および第２のインテイン４８１に関連したスプライス部位において切断することができ、第１のＴＡＬＥ４７４をレアカットヌクレアーゼ４８３に結合し、第２のＴＡＬＥ４８２をレアカットヌクレアーゼ４８３に結合する。第１の半ＴＡＬＥＮ４８５は、第１のＴＡＬＥ４７４のＣ末端の近位で、レアカットヌクレアーゼ４８３に結合した第１のＴＡＬＥ４７４を含み得る。第２の半ＴＡＬＥＮ４８９は、第２のＴＡＬＥ４８２のＣ末端の近位で、レアカットヌクレアーゼ４８３に結合した第２のＴＡＬＥ４８２を含み得る。スプライシングされたタンパク質４８７は、第２のインテイン４８１に結合した第１のインテイン４７８（例えば、４７８－Ａまたは４７８－Ｂ）を含み得る。本明細書で使用するスプライシングされたタンパク質は、別個に転写および／もしくは翻訳される、かつ共にスプライシングして、単一ユニット、例えば単一ポリペプチドを形成する別個の遺伝子によってコードされる少なくとも２つのドメインを含むタンパク質もしくはタンパク質複合体を含む、ならびに／または指す。

【0077】

前述のように、第１の半ＴＡＬＥＮ４８５および第２の半ＴＡＬＥＮ４８９は、細胞を形質転換することができる。例えば、様々な実施形態は、本明細書に記載される方法、ベクター、発現コンストラクト、ヌクレオチド配列および／もしくはシステムにより形質転換させた宿主細胞ならびに／または生物体を対象にする。一部の実施形態では、その全体がその教示に関して本明細書に組み込まれている、２０１３年５月１４日に発行された「ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ」なる名称の米国特許第８４４０４３１号明細書に記載されるように、細胞は形質転換可能であり、および／または生物体は形質転換もしくは再生可能である。

【0078】

本明細書で使用する、細胞の集団を複数のヌクレオチド配列と接触させることは、発現コンストラクトを、細胞の集団へと送達することを含み得る。発現コンストラクトは、例えば、ＰＥＧ媒介性形質転換、アグロバクテリウム感染、エレクトロポレーション、粒子衝突またはマイクロインジェクション仲介のプロトプラスト形質転換、ならびにそれらの組合せを含むがそれらに限定されない、様々なアプローチを介して細胞内へと送達可能である。

【0079】

様々な実施形態では、細胞の集団を、複数のヌクレオチド配列、例えば、複数のヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトと接触させる前に。複数のヌクレオチド配列は、標準的な分子技術を使用して生成され得る。

【0080】

一部の実施例では、複数のヌクレオチド配列および／または発現コンストラクトにより遺伝的に形質転換された標的細胞を同定するために、細胞の集団をスクリーニングすることができる。本明細書で使用する標的細胞は、複数のヌクレオチド配列を発現する、および／もしくは他のやり方で遺伝子組換えを示すもしくは発現する細胞を含む、ならびに／または指す。標的細胞は、意図される変異を、標的ゲノム遺伝子座において含み得る。一部の実施形態では、細胞の集団はスクリーニング可能であり、標的細胞は、発現コンストラクトの発現に関して、検出可能標識を介して選択され得る。検出可能標識に関する、細胞の集団のスクリーニングは、検出可能標識を有する標的細胞を、細胞の集団の残部から単離することを含み得る。様々な実施形態は、形質転換された細胞の、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）ベースの選択を含む。

【0081】

したがって、いくつかの実施形態は、ＤＮＡを介する、細胞の遺伝子編集を、ＦＡＣＳおよび蛍光タンパク質または２つのＴＡＬＥＮのフルオロフォア標識を使用した、両方ともの半ＴＡＬＥＮを受け取る標的細胞の選択と合わせた組合せを対象にする。ＦＡＣＳ選択した細胞から再生した生物体は、意図される遺伝子編集に関して濃縮され得るため、一過性遺伝子発現では典型的に必要とされるスクリーニングの労力を軽減させる。

【0082】

本開示の様々な実施形態は、図２が記載する方法２３０により、および／もしくは図１Ａ～図１Ｄ、図３Ａ～図３Ｂ、および図４が示す複数のヌクレオチド配列もしくは構成要素を使用して生成された非天然型の宿主細胞ならびに／または生物体を対象にする。例えば、方法２３０はさらに、複数のヌクレオチド配列で形質転換された、同定された標的細胞を培養すること、および培養した標的細胞から生物体を再生することを含み得て、ただし、再生された生物体は、標的修飾を発現する。複数のヌクレオチド配列および／または得られる構成要素（例えば、半ＴＡＬＥＮおよびスプライシングされたタンパク質）は、再生された生物体から除去され得る（例えば、交配による除去（crossed away））。

【0083】

一部の実施形態では、方法２３０と一致して、非天然型生物体が、複数のヌクレオチド配列の使用を含むゲノム編集技術により生成され得る。複数のヌクレオチド配列は、別個のベクターであってもよく、および／または単一発現コンストラクト上に形成されてもよい。ゲノム編集技術は、細胞の集団を、複数のヌクレオチド配列と接触させること、複数のヌクレオチド配列で形質転換された標的細胞を同定するために、細胞の集団をスクリーニングすること、および場合により、同定された標的細胞から非天然型生物体を再生することを含み得る。

【0084】

本明細書で使用する細胞および／または細胞集団は、様々な異なる種類の生物体からであり得る。例示的細胞は、中でも、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、甲殻類、クモ類、棘皮動物、蠕虫、軟体類、海綿動物、植物、菌類、藻類、細菌であり得る。

【0085】

本明細書で使用する上流は、参照配列と比べて、ヌクレオチド配列の５’末端に近位および／またはより近い位置を含み得る。逆に、下流は、参照配列と比べて、ヌクレオチド配列の３’末端に近位および／またはより近い位置を含み得る。本明細書で使用する、列挙した形容詞を前に伴う配列、例えば、レアカットヌクレアーゼ配列、インテイン配列もしくはＴＡＬＥ配列は、その形容詞をコードするか、もしくはその形容詞である（例えば、ヌクレアーゼをコードするか、もしくはヌクレアーゼである）ヌクレオチド配列を含むか、または指す。

【0086】

意図される遺伝子編集に関して細胞を濃縮および／またはスクリーニングするための異なる例示的アプローチを記載する。細胞の濃縮および／またはスクリーニングは、意図されるゲノム編集を含有する可能性の高い細胞の提示（representation）を高め得る。

【0087】

複数のヌクレオチド配列は、様々な公知の方法、例えば、ＰＥＧ媒介性形質転換、エレクトロポレーション、衝突またはマイクロインジェクション仲介の形質転換を使用して、細胞または他の組織内へと送達され得る。胚のような、細胞壁を伴うより大きい組織には、ＤＮＡでコートされた金粒子による衝突（または遺伝子銃）が、送達方法として使用可能である。ヌクレオチド配列の送達に続いて、蛍光色の陽性細胞を選択するために、ＦＡＣＳを使用することができる。

【0088】

粒子衝突形質転換には、発現コンストラクトを、金粒子のような粒子上にコートし得る。金粒子上に核酸をコートするためには、異なる体積の核酸溶液を、一定量の金懸濁液とピペッティングにより混合する。

【0089】

実施形態は、そのように限定されず、様々な粒子衝突形質転換プロトコルが使用可能である。

【0090】

便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において利用される特定の用語を、ここで提供する。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の実施形態の記載を助けるために提供されるものであり、特許請求の範囲に記載された発明を限定することは意図しない。

【0091】

特許請求の範囲および明細書における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明示されるか、または代替物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するのに使用されるものの、本開示は代替物のみならびに「および／または」を指す定義を支持する。

【0092】

明らかに文脈が異なる要求をしない限り、明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、閉鎖的、排他的または網羅的な意味とは反対に、オープンかつ包括的な意味で解釈されるべきである。例えば、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むが、限定されないこと」を示すと読むことができる。単数または複数を使用する単語は、それぞれ、複数および単数も含む。単語「ａ」および「ａｎ」は、特許請求の範囲および明細書中で単語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と合わせて使用する場合、特に断りのない限り、１つまたは複数を示す。

【0093】

本明細書で使用する用語「ポリペプチド」もしくは「タンパク質」は、そのモノマーが、アミド結合を介して互いに連結されているアミノ酸残基であるポリマーを含む、および／または指す。アミノ酸がアルファアミノ酸である場合、Ｌ－光学異性体またはＤ－光学異性体のいずれかを使用することができ、Ｌ異性体が典型的である。本明細書で使用する用語、ポリペプチドまたはタンパク質は、いずれかのアミノ酸配列を含み、糖タンパク質のような、修飾された配列を含む。用語ポリペプチドは、特に断りのない限り、天然型タンパク質、ならびに組換えまたは合成により産生されたタンパク質を網羅することが明確に意図される。

【0094】

用語「ヌクレオチド配列」は、鎖もしくは配列中の複数のヌクレオチドを含む、および／または指す。ヌクレオチドは、リン酸基に連結したヌクレオシド（例えば、炭糖（carbon sugar）を含む核酸塩基）を含む化合物を含む、および／または指す。ヌクレオチド配列は、核酸と呼ばれることもあり得て、配列のヌクレオチドが、核酸の基本単位を形成する。用語「核酸」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ核酸、および一本鎖もしくは二本鎖型のいずれかの核酸の配列を含む、ならびに／または指し、特に限定されない限り、天然型ヌクレオチドと同様に核酸にハイブリダイズする、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。特に指示がない限り、特定のヌクレオチド配列または核酸配列は、それらの相補性配列を含む。

【0095】

開示される方法および組成物向けに使用可能である、それと関連して使用可能である、その調製において使用可能である材料、組成物ならびに構成要素、または開示される方法および組成物の生成物が開示される。それらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、それらの化合物の、１つ１つの組合せおよび入替えへの具体的な言及は明確に開示されない場合があるとはいえ、様々な個別および集団的な組合せの各々が具体的に意図されると理解される。この概念は、本開示のすべての態様に適用され、開示される方法のステップを含むがそれに限定されない。前記のいずれかの実施形態の具体的な要素は、他の実施形態における要素のために組み合わせても置換してもよい。例えば、行われ得る様々な追加ステップがある場合、それらの追加ステップの各々は、開示された方法のいずれかの具体的な方法ステップまたは方法ステップの組合せと共に行うことが可能であり、各々の、そのような組合せまたは組合せのサブセットが、具体的に意図され開示される。さらに、本明細書に記載される実施形態は、本明細書の他の場所で記載されるものか、または当技術分野で公知のいずれかの適切な材料を使用して、実施され得ると理解される。

【0096】

様々な実施形態は、それに対して、利益が主張され、参照により本明細書に完全に組み込まれている、基礎となる仮出願である、２０２１年７月７日に出願した「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ Ｆｕｓｅｄ ｔｏ Ｉｎｔｅｉｎｓ」なる名称の米国仮出願第６３／２１９，２９１号明細書に従って実施される。例えば、本明細書および／または仮出願における実施形態は、様々な程度で組み合わされ得る（全面的を含む）。仮出願で考察される実施形態は、特に断りのない限り、全体的な技術的開示に対する、または請求される発明のいずれかの部分に対する限定であるとは決して意図されない。

【0097】

例示的実施形態が、例示および記載された一方、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更がその中で行われ得ると理解される。

【0098】

実験的実施形態
様々な実験的実施形態は、本明細書中では言及しやすいようにベクターと呼ばれることもあり、かつ前述の発現コンストラクトまたはその一部分、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡコンストラクトを含み得る、異なる核酸ベクターのデザインを対象にした。ベクターは、第１のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテイン、第２のＴＡＬＥの少なくとも一部分と融合した第１のインテイン、およびレアカットヌクレアーゼの少なくとも一部分と融合した第２のインテインをコードする。前記のベクターによる遺伝子編集を示すために、具体的な実験をデザインした。行ったいくつかの実験を、本明細書に記載する。

【0099】

様々な実験的実施形態では、いくつかのベクターをデザインして構築した。ベクターは、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合したＴＡＬエフェクター、およびＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列と融合したエンドヌクレアーゼを含んだ。Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎとｉｎｔ－Ｃペプチド配列とは、共に、ここではインテインと呼ばれるトランスインテインを構成する。それらのインテインベクターの統合活性による遺伝子編集を示すために、具体的な実験を行った。実験的実施形態で使用した例示的コンストラクトおよび配列は、配列番号１～１５９に記載されるヌクレオチド配列を含む。配列番号１～１６４は、各々の合成ＤＮＡである。

【0100】

異なるベクターを、以下の表１に示す。表１中の核酸ベクターは、ＤＮＡコンストラクトを含む。

【0101】

【表1】

【0102】

表１中のコンストラクトは、以下に詳細に記載する実験的実施形態において生成した。プラスミドベクター１および９は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した遺伝子ＢｎＦＡＤ２を標的にするＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１（配列番号１）は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、遺伝子ＢｎＦＡＤ２を標的にするＴＡＬエフェクター、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列、ターミネーターＮｏｓＴｅｒｍ、および左半分ＴＡＬＥＮ（ＨＴ）骨格をコードする。プラスミドベクター９（配列番号９）は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、遺伝子ＢｎＦＡＤ２を標的にするＴＡＬエフェクター、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列、ターミネーターＮｏｓＴｅｒｍ、および右ＨＴ骨格をコードする。プラスミドベクター１７（配列番号１７）は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと融合したＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列をコードする。プラスミドベクター１７は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ、およびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍをコードする。実験的実施形態では、プラスミドベクター１、９および１７を共同で使用して、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集活性を実証した。

【0103】

プラスミドベクター１の配列は、配列番号１に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号２）、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号３）、ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３－Ｌ）結合ドメイン（配列番号４）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号５）、リンカー（配列番号６）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ（配列番号７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号８）をコードする。プラスミドベクター９の配列は、配列番号９に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号２）、右ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号１０）、ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３－Ｒ）結合ドメイン（配列番号１１）、右ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号１２）、リンカー（配列番号６）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ（配列番号７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号８）をコードする。プラスミドベクター１７の配列は、配列番号１７に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号２）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃ（配列番号１８）、リンカー（ＡＧＣＣＧＴＴＣＣ）、Ｆｏｋｌ（配列番号１９）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号８）をコードする。

【0104】

プラスミドベクター１、９および１７の遺伝子編集活性を、プラスミドベクター対照１および対照２に対して比較した。プラスミドベクター対照１は、左ＨＴ骨格中の、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３－Ｌ）を標的にするＴＡＬＥＮおよびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍからなる。プラスミドベクター対照２は、右ＨＴ骨格中の、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３－Ｒ）を標的にするＴＡＬＥＮおよびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍからなる。

【0105】

プロモーターＮｏｓＰｒｏおよびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓからの配列に基づき、ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ配列に基づき、ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３）は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ中に見出される配列を標的にし、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ配列に基づき、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃおよびｉｎｔ－Ｎペプチド配列は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ６８０３からである。

【0106】

表１の残りの例示的コンストラクトを、以下に記載する。プラスミドベクター１３（配列番号１３に記載）およびプラスミドベクター１５（配列番号１５に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合したＴＡＬエフェクターをコードするエントリーベクターである。プラスミドベクター１３は、左ＨＴ骨格中の、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、ＴＡＬエフェクター、ゴールデンゲートクローニング用のＢｓａＩ部位が隣接するｌａｃＺカセット、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ配列、およびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍをコードする。プラスミドベクター１５は、右ＨＴ骨格中の、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、ＴＡＬエフェクター、ゴールデンゲートクローニング用のＢｓａＩ部位が隣接するｌａｃＺカセット、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ配列、およびターミネーターＮｏｓＴｅｒｍをコードする。

【0107】

プラスミドベクター１３の配列は、配列番号１３に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号２）、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号３）、ＬａｃＺカセット（配列番号１４）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号５）、リンカー（配列番号６）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ（配列番号７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号８）をコードする。プラスミドベクター１５の配列は、配列番号１５に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号２）、右ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号１０）、ＬａｃＺカセット（配列番号１６）、右ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号１２）、リンカー（配列番号６）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎ（配列番号７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号８）をコードする。

【0108】

表２に示すように、表１のベクターによる細胞の形質転換を示すためのさらなる実験を行った。より具体的には、表１中に示すベクターを使用して、カノーラプロトプラストを形質転換した。それらのベクターは、前述のベクターである配列番号１、配列番号９、配列番号１７、プラスミドベクター対照１、およびプラスミドベクター対照２を含む。すべての試料を、各々２００，０００個のプロトプラストを形質転換するために使用し、すべての試料を、生物学的レプリケートとして試験した。試料ＡおよびＤは、各々３０ｕｇのプロセスコントロールプラスミドを含み、データ解析時の陰性対照として機能した。試料ＢおよびＥは、各々３０ｕｇの、標的ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３）の遺伝子編集用の対照ベクターであるプラスミドベクター対照１およびプラスミドベクター対照を含んだ。試料ＣおよびＦは、３０ｕｇの、３つのインテインプラスミドである配列番号１、配列番号９および配列番号１７を含んだ。インテイン試料ＣおよびＦを、陽性対照試料ＢおよびＥと比較して、遺伝子編集効率を評価した。全試料は、解析用の同じイルミナ配列を使用して調製した。ベクターを使用してカノーラプロトプラストを形質転換し、インテインＴＡＬＥＮベクターの遺伝子編集効率を、インテイン配列を伴わないＴＡＬＥＮベクターに対して比較した。表２は、行った実験を示す。

【0109】

【表2】

【0110】

カノーラの形質転換を行うために、実験の３０～６０日前に、１０個のカノーラ種子を１．５ｍＬの７０％エタノールで洗浄してから、１．８ｍＬの滅菌水で洗浄した。種子を滅菌するために、１．５ｍＬの１％次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用して種子を洗浄し、次いで、種子を、１．８ｍＬの滅菌水でさらに５回洗浄した。水に浸した後、再び滅菌した種子のうちの６つを、ＰｌａｎｔＣｏｎ中の８Ｐ－ＭＳ－Ｇ培地上に植えた。種子を、２５℃、１６／８ｈｒの明暗比においてインキュベートした。

【0111】

３０～６０日のインキュベーション後、発芽したカノーラ小植物体を消化した。滅菌ハサミを使用して４～６枚のカノーラ若葉を切除し、５０～１００ｕｌのＣＰＤＳを含有するペトリ皿中に置いた。滅菌ストレートエッジカミソリを使用して、葉を０．５～１ｍｍ片に切った。さらなる４ｍＬのＣＰＤＳをプレートに添加して、そのプレートを、より大きい１００ｍｍのペトリ皿の内部に置いて無菌状態を確保した。プレートを真空チャンバーへと移し、３０ｉｎＨｇにおいて１０分間、真空化した。１０分後、プレートを、２５℃の暗所中、２５ｒｐｍにおいて１６時間インキュベートした。

【0112】

１６時間後、プロトプラスト消化を、４ｍＬのＷ－５ ｐｌｕｓ Ｃａｒｂ１００溶液で洗浄し、プロトプラスト溶液を優しくピペッティングしてＦａｌｃｏｎ ４０ｕｍセルストレーナーを通して、５０ｍＬチューブに入れる。このステップをもう一度繰り返した。次いで、チューブを、１００ｘｇにおいて５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを４ｍＬのＷ－５洗浄バッファーで再懸濁し、もう一度遠心分離し、残りの上清を捨てた。次いで、洗浄したペレットを、２ｍＬのＷ－５洗浄バッファーで再懸濁し、２０ｕｌの懸濁液を、細胞計数用の血球計数盤上にロードした。血球計数盤の４つのグリッドの中の細胞数を使用して、グリッド当たりのプロトプラスの平均数を得た。試料中のプロトプラストの総数は、次のように計算した：

【0113】

【数1】

であり、ただし、

【0114】

【数2】

は、前もってカウントした４つのグリッド｛ａ，ｂ，ｃ，ｄ｝の平均である。形質転換を行うために、２ｍＬのＷ－５バッファーおよびプロトプラスト懸濁液を含有する５０ｍＬチューブを、１００ｘｇにおいて５分間遠心分離した。試料Ａ～Ｃに関しては、上清を除去し、１ｘ１０^６個のプロトプラスト当たり１ｍＬの室温１ＸＭＭＧを添加し、２００，０００個のプロトプラストに相当する体積を、各形質転換用の指定量のベクターを含有する１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに添加した。試料Ｄ～Ｆに関しては、１ｘ１０^６個のプロトプラスト当たり５００ｕｌの室温２ＸＭＭＧを、指定量のＤＮＡベクターと共に、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ中の２００，０００個のプロトプラストに添加した。全試料に関して、液体を上下にゆっくりとピペッティングすることにより、プロトプラスト懸濁液をベクターと混合した。プロトプラストおよびプラスミドベクターを室温で５分間インキュベートした。５分後、１Ｘ体積の室温ＰＥＧを、各マイクロ遠心チューブに添加し、完全に混ざるまで上下にピペッティングした。次いで、チューブを室温で２０分間インキュベートした。２０分後、１．５ｍＬのＷ－５洗浄バッファーを添加して、プロトプラストを再懸濁した。チューブを、２００ｘｇにおいて５分間遠心分離し、上清を除去し、さらなる８００ｕｌのＷ－５洗浄バッファーを添加して、細胞を再懸濁した。０．５～２ｍＬの洗浄したプロトプラストを、６～２４ウェルプレートに移し、２４～４８時間インキュベートした。

【0115】

遺伝子編集活性を評価するために、プロトプラストを１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに移すことにより、プロトプラストを回収した。懸濁液を２００ｘｇにおいて５分間遠心分離し、上清を捨てて、チューブを液体窒素中に２分間置いた。次いで、プロトプラストＤＮＡを抽出してイルミナにより解析するまでは、チューブを－８０℃で保管した。

【0116】

表３は、表１に記載したベクターで形質転換したプロトプラストから検出された欠失を示す。遺伝子編集効率は、ここでは事象百分率として示され、試料Ａ～Ｆにわたって比較した。試料ＡおよびＤは、ＹＦＰを発現するベクターで形質転換したカノーラプロトプラストを含み、陰性対照として利用され、編集は予期されなかった。試料ＢおよびＥは、遺伝子ＢｎＦＡＤ２を標的にするＴＡＬＥＮで形質転換したカノーラプロトプラストを含んだ。試料ＣおよびＦは、各々がＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎまたはｉｎｔ－Ｃ配列と融合しており、同じくＢｎＦＡＤ２を標的にするＴＡＬエフェクターおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼで形質転換したカノーラプロトプラストを含んだ。

【0117】

表３は、前記のベクターで形質転換されたプロトプラスト細胞の集団における、欠失または事象の数を検出するＮＨＥＪ変異アッセイの結果を示す。このアッセイは、標的ＢｎＦＡＤ２を含有する３つのゲノム領域を増幅し、表３中では、イルミナ１、２および３として表される。示すように、ＴＡＬＥＮインテイン試料は、ＹＦＰ陰性対照よりも著しく多い数の欠失を産生したが、欠失を、ＴＡＬＥＮ対照ベクターと同じ頻度では産生しなかった。

【0118】

【表3】

【0119】

実験は、ＴＡＬＥＮベクターのプラスミドカーゴサイズを低下させ、かつ細胞への遺伝子編集物質の送達時に柔軟性をさらに加える方法としてのトランススプライシングインテインの使用を試験した。前述のように、実験は、カノーラ（Ｂｎ－Ｗｅｓｔａｒ）プロトプラストにおいて行った。ＴＡＬＥＮによる標的である、公知の３つのコピーを有するＦＡＤ２遺伝子中のＴ０３．０１。３つのＦＡＤ２遺伝子コピー中での編集を検出するアンプリコン配列を使用してプロトプラストの遺伝子型を同定した。以下の表４は、得られる配列包括度の要約を提示する。

【0120】

この実験では、各インテイン試料に関して、全３つの遺伝子コピーにわたり、良好な包括度が存在した（例えば、２４，０００から４１，０００リードの間の範囲を有する、２８，０００リード超の平均）。実験１および２は、形質転換入力（transformation input）の異なる濃度を試験するために行った。具体的には、実験２（「Ｍｏｄ」法）は、高体積のＤＮＡを低濃度で使用した。

【0121】

以下の表４および表５は、実験１および２の編集百分率を提示する。両方ともの実験において、インテイン試料は、陰性対照よりも高いものの陽性対照よりは低い、ある程度のレベルの編集を一貫して示した。実験２（Ｍｏｄ法、より少量のＤＮＡ）は、陽性対照では高い編集百分率を有するが、インテイン試料では低い編集百分率を有する。理解され得るように、編集百分率＝（編集を伴うリードの数／解析されたリードの総数）^＊１００。

【0122】

【表4】

【0123】

【表5】

【0124】

図５は、本開示と一致した、ヌクレオチド配列を使用する細胞の編集から得られるジェノタイピングを示す画像を示す。特に、図５は、陰性対照５９０、陽性対照５９１、およびインテイン５９２のゲノム領域の整列させた画像を示す。

【0125】

図６Ａ～図６Ｃは、本開示と一致した、ＹＦＰ陰性対照、ＴＡＬＥＮ陽性対照、およびインテインからのゲノム領域の全体画像を示す。例えば、図６Ａは、試料Ａ ＹＦＰ陰性対照のゲノム領域の画像を示す。図６Ｂは、試料Ｂ（＋）ＢｎＦＡＤ２（Ｔ０３）ＴＡＬＥＮ陽性対照のゲノム領域の画像を示す。図６Ｃは、試料Ｃ（＋）インテインのゲノム領域の画像を示す。

【0126】

植物細胞、例えば、カノーラ、アサおよび／またはダイズ植物細胞を形質転換するためのさらなるプラスミドベクターを使用して、様々な実験を行った。実施例は特定の植物細胞を記載するものの、実施形態は、そのように限定されず、任意の種類の植物および／または植物以外の細胞、例えば、哺乳類細胞を含み得る。Ｓｓｐ ＤＮＡＥおよびＧｐ４１－１を含む異なる種類のインテイン、天然および非天然エクステイン、ならびに異なる標的に対して特異的な結合ドメインを有するＴＡＬＥを使用した。実験はさらに、ＴＡＬＥＮを含む陽性対照、およびＴＡＬＥを含まない陰性対照を含んだ。

【0127】

一部の実験は、ダイズ植物細胞を形質転換するためのさらなるプラスミドベクターを使用して、異なる遺伝子、例えば、シンターゼ（ＡＬＳ）導入遺伝子、脂肪酸不飽和化酵素３（ＦＡＤ３）導入遺伝子、および成長調節因子（ＧＲＦ）導入遺伝子と関連するＴＡＬＥを使用して行った。実験的実施形態に関して使用した例示的コンストラクトおよび配列は、配列番号９２～１５９に記載されるヌクレオチド配列を含む。以下の表６～８は、異なるプラスミドベクターを示す。

【0128】

【表6】

【0129】

【表7】

【0130】

【表8】

【0131】

様々な実験では、さらなるプラスミドベクターに加えて、前記のプラスミドベクターを使用して、その全体がその教示に関して本明細書に組み込まれている、Ｘｉｏｎｇ， Ｌ．ら「Ａ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＧｍＣＲＹ１ ｐｈｏｔｏｂｏｄｙ－ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１９、６２（８）、１０７０－１０７７に記載されるプロトコルに従って、ダイズプロトプラストを形質転換した。一部の実施例では、１２ｘバイオレプリケーション（bio-replication）当たり２００，０００細胞用に、レプリケートチューブ中で２４０万細胞をまとめた。スクエア当たり平均１８０が同定されたが、これは、４ｍＬの体積として使用したため、３６０万細胞と同等である。次いで、プロトコルの残部に関しては、記載のように続けた。

【0132】

試料は以下のとおり：
各々の２つのバイオレプリケーション（例えば、試料１に関しては、各々、２００Ｋ細胞を含む１Ａおよび１Ｂ）；ならびに
各試料番号１～６は、各プラスミドを３００ｎｇ／ｕＬの最終濃度で有する。表９は、試験された異なる試料を提示する：

【0133】

【表9】

【0134】

各試料は、ピペッティングエラーを補償するために、ストック濃度および下記に列挙する体積から２２０ｕＬの最終体積にした。例えば、以下は、１０プレート上での試料１～５のプロトプラスト調製物を記載する（例えば、試料当たり２つ）。プロトプラストは、１ｕＬの溶液ｘ１０００ｍＬｘ４ｍＬ（総体積）を含むように加算された。表１０は、各試料調製物の合計を提示する。

【0135】

【表10】

【0136】

前記は、合計３１１９細胞（ｕＬ当たり）ｘ１０００（ｍＬへの変換）ｘ４（各々の総体積４ｍｌ）＝１２５０万細胞をもたらした。細胞を、各々２００，０００（３２０ｕＬ）に分割して、チューブに入れた。

【0137】

例えば、細胞を、以下の設定当たり２つで、２００，０００バイオレプリケートチューブに分割した。洗浄および定量に続いて、細胞をペレットにし、Ｗ５を除去してから、２ｘＭＭＧ（１００ｕｌ＋以下に指定のＤＮＡの１００ｕＬ）を使用した。次いで、プロトコルの残部に関しては、記載のように続けた（ＰＥＧ添加後の最終スピンは依然として、２００ｇではなく１００ｇを５分間使用した）。形質転換および洗浄に続いて、１ｍＬのＷ５溶液中で２４ウェルプレートへと移し、暗所に置いた。試料は以下のとおり：
ａ．各々の２つのバイオレプリケート（例えば、試料１に関しては、各々、２００Ｋ細胞を含む１Ａおよび１Ｂ）；ならびに
ｂ．各試料番号１～６は、各プラスミドを３００ｎｇ／ｕＬの最終濃度で有する。

【0138】

以下の表１１は、異なるブロック上で、異なる試料に関して提供されるさらなるプラスミドベクターを提示する。各試料は、ブロック１試料１に関して１．１と列挙され、ＡおよびＢは、個々のバイオレプリケーションを示す。

【0139】

【表11】

前記で、表１１中のブロック３は、表９に相当する。

【0140】

図７は、本開示と一致した、異なるプラスミドベクターを使用する、ダイズ外植体の形質転換の例示的結果を示す。特に、第１のインテインと融合した左ＴＡＬＥ、第１のインテインと融合した右ＴＡＬＥ、および第２のインテインと融合したヌクレアーゼをコードする共送達されるベクターを使用して、ダイズプロトプラストを形質転換した。ＴＡＬＥは、ＡＬＳ、ＦＡＤ３およびＧＲＦの遺伝子に関連された結合ドメインを含んだ。

【0141】

異なるプラスミドベクターは、ＡＬＳ遺伝子を標的にした第１のセット（例えば、ＡＬＳ－Ｔ０４およびＡＬＳ－Ｔ０７、ならびにプラスミドベクター１５４、１５５、１４９、１５０、１４７、１４８、１２２、１２３、１５６、１５７、１３８、１４６、１３５、１４２、１２４および１２５を含む）、ＦＡＤ３遺伝子を標的にした第２のセット（例えば、ＦＡＤ３－Ｔ０８、ならびにプラスミドベクター１１０、１５２、１３７、１４５、１３４、１４１および１２６を含む）、ならびにＧＲＦ遺伝子を標的にした第３のセット（例えば、ＧＲＦ－Ｔ０３およびＧＲＦ－Ｔ０４、ならびにプラスミドベクター１５３、１５１、１３６、１４３、９２、１４０、１２０、１１９、１５８、１５９、１０２、１４４、１３３、１３９、１２１および１２３を含む）を含んだ。第１、第２および第３のセットの各々の範囲内では、それぞれのベクターが、インテインなし（（プラスミドベクター１２２およびプラスミドベクター１２３）、（プラスミドベクター１２４およびプラスミドベクター１２５）、（プラスミドベクター対照およびプラスミドベクター１２６）、（プラスミドベクター１２０およびプラスミドベクター１１９）ならびに（プラスミドベクター１２１およびプラスミドベクター１２３）のプラスミドベクター群）、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび非天然エクステイン（（プラスミドベクター１５４、プラスミドベクター１５５およびプラスミドベクター１２７）、（プラスミドベクター１５６、プラスミドベクター１５７、プラスミドベクター１２７）、（プラスミドベクター１１０、プラスミドベクター１５２、プラスミドベクター１２７）ならびに（プラスミドベクター１５３、プラスミドベクター１５１、プラスミドベクター１２７）のプラスミドベクター群）、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび天然エクステイン（（プラスミドベクター１５４、プラスミドベクター１５５およびプラスミドベクター１３２）、（プラスミドベクター１５６、プラスミドベクター１５７およびプラスミドベクター１３２）、（プラスミドベクター１５８、プラスミドベクター１５９およびプラスミドベクター１３２）、（プラスミドベクター１１０、プラスミドベクター１５２、プラスミドベクター１３２）ならびに（プラスミドベクター１５３、プラスミドベクター１５１、プラスミドベクター１３２）のプラスミドベクター群）、ＧＰ４１－１のインテインおよび非天然エクステイン（（プラスミドベクター１４９、プラスミドベクター１５０およびプラスミドベクター１３１）、（プラスミドベクター１３８、プラスミドベクター１４６およびプラスミドベクター１３１）、（プラスミドベクター１３７、プラスミドベクター１４５およびプラスミドベクター１３１）、（プラスミドベクター１０２、プラスミドベクター１４４およびプラスミドベクター１３１）ならびに（プラスミドベクター１３６、プラスミドベクター１４３およびプラスミドベクター１３１）のプラスミドベクター群）、ならびにＧＰ４１－１のインテインおよび天然エクステイン（（プラスミドベクター１４７、プラスミドベクター１４８およびプラスミドベクター１３０）、（プラスミドベクター１３５、プラスミドベクター１４２およびプラスミドベクター１３０）、（プラスミドベクター１３４、プラスミドベクター１４１およびプラスミドベクター１３０）、（プラスミドベクター９２、プラスミドベクター１４０およびプラスミドベクター１３０）ならびに（プラスミドベクター１４４、プラスミドベクター１３９およびプラスミドベクター１３０）のプラスミドベクター群）を含んだ。例示的陰性対照プラスミドベクターは、プラスミドベクター１２８（配列番号１２８に記載される）およびプラスミドベクター１２９（配列番号１２９に記載される）を含む。

【0142】

前記のように、３つのプラスミドベクターは、ＴＡＬＥＮ遺伝子活性を共同で実証するために各々の実験において使用することができ、３つのプラスミドベクターのうちの２つは、インテイン（例えば、ｉｎｔ－Ｎまたはｉｎｔ－Ｃ）と融合した、ある遺伝子を標的にするＴＡＬエフェクター（例えば、左および右半分ＴＡＬエフェクター）を含み、第３のプラスミドベクターは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと融合したインテイン（例えば、ｉｎｔ－Ｃまたはｉｎｔ－Ｎ）を含む。異なるベクターは、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎまたはｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３、ＦＡＤ３またはＡＬＳを標的にするＴＡＬエフェクターを含み得る。プラスミドベクター９２（配列番号９２）は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、遺伝子ＧＲＦ３を標的にするＴＡＬエフェクター、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列、ターミネーターＮｏｓＴｅｒｍ、および左ＨＴ骨格をコードする。プラスミドベクター１０２（配列番号１０２）は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、遺伝子ＧＲＦ３を標的にするＴＡＬエフェクター、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列、ターミネーターＮｏｓＴｅｒｍ、および左ＨＴ骨格をコードする。プラスミドベクター１１０（配列番号１１０）は、プロモーターＮｏｓＰｒｏ、遺伝子ＧＲＦ３を標的にするＴＡＬエフェクター、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列、ターミネーターＮｏｓＴｅｒｍ、および左ＨＴ骨格をコードする。

【0143】

プラスミドベクター９２の配列は、配列番号９２に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号９４）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号９５）およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）を含む左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号９３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号９５）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号９６）、ＧｍＧＲＦ３（Ｔ０３－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号９７）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号９８）、リンカー（配列番号９９）、天然スプライス部位ｉｎｔ－Ｎ（配列番号１００）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号１０１）をコードする。

【0144】

プラスミドベクター１０２の配列は、配列番号１０２に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号９４）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号１０４）およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）を含む左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号１０３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号１０４）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号１０５）、ＧｍＧＲＦ３（Ｔ０３－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号１０６）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号１０７）、リンカー（配列番号１０８）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号１０９）をコードする。

【0145】

プラスミドベクター１１０の配列は、配列番号１１０に記載され、その配列は、Ｎｏｓプロモーター（配列番号９４）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号１１２）およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）を含む左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号１１１）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号１１２）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号１１３）、ＧｍＧＲＦ３（Ｔ０３－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号１１４）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号１１５）、リンカー（配列番号１１６）、およびＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号１１７）をコードする。

【0146】

残りの例示的コンストラクトを、以下に記載する。プラスミドベクター１１８（配列番号１１８に記載）は、ＧｍＧＲＦ（Ｔ０４）を標的にした右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターであり、プラスミドベクター１１９（配列番号１１９に記載）は、ＧｍＧＲＦ（Ｔ０３）を標的にした右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。プラスミドベクター１２０（配列番号１２０に記載）は、ＧｍＧＲＦ（Ｔ０３）を標的にした左半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターであり、プラスミドベクター１２１（配列番号１２１に記載）は、ＧｍＧＲＦ（Ｔ０４）を標的にした左半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。プラスミドベクター１２２（配列番号１２２に記載）は、ＧｍＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にした左半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターであり、プラスミドベクター１２３（配列番号１２３に記載）は、ＧｍＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にした右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。プラスミドベクター１２４（配列番号１２４に記載）は、ＧｍＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にした左半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターであり、プラスミドベクター１２５（配列番号１２５に記載）は、ＧｍＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にした右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。プラスミドベクター１２６（配列番号１２６に記載）は、ＧｍＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にした右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。

【0147】

プラスミドベクター１２７（配列番号１２７に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列を、非天然エクステインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと共にコードする。前述のように、プラスミドベクター１２８および１２９（配列番号１２８～１２９に記載）は、ＹＦＰを伴うＴＡＬＥＮ対照であり、プラスミドベクター１２８は、左半分ＴＡＬＥＮを含み、プラスミドベクター１２９は、右半分ＴＡＬＥＮベクターを含む。プラスミドベクター１３０（配列番号１３０に記載）は、ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列を、天然エクステインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと共にコードする。プラスミドベクター１３１（配列番号１３１に記載）は、ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列を、非天然エクステインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと共にコードする。プラスミドベクター１３２（配列番号１３２に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列を、天然エクステインおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼと共にコードする。

【0148】

プラスミドベクター１３３（配列番号１３３に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１３４（配列番号１３４に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１３５（配列番号１３５に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0149】

プラスミドベクター１３６（配列番号１３６に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１３７（配列番号１３７に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１３８（配列番号１３８に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0150】

プラスミドベクター１３９（配列番号１３９に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４０（配列番号１４０に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０３）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４１（配列番号１４１に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４２（配列番号１４２に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0151】

プラスミドベクター１４３（配列番号１４３に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４４（配列番号１４４に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０３）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４５（配列番号１４５に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４６（配列番号１４６に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0152】

プラスミドベクター１４７（配列番号１４７に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１４８（配列番号１４８に記載）は、天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0153】

プラスミドベクター１４９（配列番号１４９に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５０（配列番号１５０に記載）は、非天然Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0154】

プラスミドベクター１５１（配列番号１５１に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５２（配列番号１５２に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０３）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５３（配列番号１５３に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＧＲＦ３（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0155】

プラスミドベクター１５４（配列番号１５４に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５５（配列番号１５５に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０４）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５６（配列番号１５６に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５７（配列番号１５７に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＡＬＳ（Ｔ０７）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0156】

プラスミドベクター１５８（配列番号１５８に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする左半分ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクター１５９（配列番号１５９に記載）は、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列と融合した、遺伝子ＦＡＤ３（Ｔ０８）を標的にする右半分ＴＡＬエフェクターをコードする。

【0157】

例えば、図７は、９２～１５９の異なるプラスミドベクターの編集効率を比較するグラフであり、インテインなし、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび非天然エクステイン、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび天然エクステイン、ＧＰ４１－１のインテインおよび非天然エクステイン、ならびにＧＰ４１－１のインテインおよび天然エクステインの編集効率を示す。

【0158】

様々な実験は、アサ植物細胞を形質転換するためのさらなるプラスミドベクターを使用して、異なる遺伝子、例えば、フィトエン不飽和化酵素（ＰＤＳ）導入遺伝子およびテトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ（ＴＨＣＡＳ）導入遺伝子と関連するＴＡＬＥを使用して行った。

【0159】

アサ胚軸（ＥＡ）組織の、アグロバクテリウムによる形質転換を介して、アサ植物細胞を形質転換した。簡単に言うと、過酸化水素洗浄を使用してアサ種子を滅菌した。滅菌後、種子を、液体抗生物質溶液中に一晩浸した。一晩浸した後、アサ胚を種皮から取り出し、子葉および初生葉を除去することによりＥＡ組織を回収した。

【0160】

次いで、目的のバイナリーベクターを運ぶアグロバクテリウムを加えた培地からなる液体感染溶液を含有するペトリ皿内に、アサＥＡ組織を０．２のＯＤで置いた。アグロバクテリウム溶液中のＥＡを含有する感染ペトリ皿を密封して、４０秒間、超音波処理した。超音波処理後、ＥＡを、感染培地中に１時間置いた。１時間後、ＥＡを、感染培地から取り出し、濡れたろ紙を含有する新たな共培養ペトリ皿上に置いた。プレートを密封し、２３℃、１６／８時間明期のインキュベーター中に４日間置いた。共培養後、ＥＡを、再生培地を含有するペトリ皿上に置いた。ＥＡを含有する再生プレートを密封し、２３℃、１６／８時間明期のインキュベーター中に７日間置いた。ＥＡは、当技術分野で周知のいずれかの技術を使用して形質転換可能である。

【0161】

再生培地上での７日後、ＥＡを培地から取り出し、周知のいずれかの技術を使用するＤＮＡ抽出用に－８０℃で凍結した。例えば、ＤＮＡ抽出は、その全体がその教示に関して本明細書に組み込まれている、２０２１年９月９日に公開された「Ｃａｎｏｌａ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ」なる名称の米国特許公開第２０２１／０２７７４１１号明細書に記載されるように実施され得る。

【0162】

様々な実験では、アサ植物細胞を、配列番号２０～９１に記載されるプラスミドベクターで形質転換した。アサＥＡは、前記のアサ科形質転換プロトコルを使用して、かつそれぞれのバイナリーベクターを含有する細菌を使用して形質転換した。様々な実施形態では、異なるプラスミドベクター間で編集効率を比較した。異なるプラスミドベクターは、ＰＤＳ遺伝子を標的にした第１のセット（例えば、プラスミドベクター９１、２０、４６および８７）ならびにＴＨＣＡＳ遺伝子を標的にした第２のセット（例えば、プラスミドベクター９０、８８、８９および６５）を含んだ。第１のセットおよび第２のセットの各々の範囲内では、それぞれのベクターが、インテインなし（例えば、プラスミドベクター９０および９１）、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター２０および８７）、ＧＰ４１－１のインテインおよび非天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター４６および８８）、ならびにＧＰ４１－１のインテインおよび天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター８９および６５）を含んだ。

【0163】

プラスミドベクター２０の配列は、配列番号２０に記載され、その配列は、ＹＦＰカセット（配列番号２１）、左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号２５）、右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号３４）、およびＦｏｋＩカセット（配列番号４１）をコードする。ＹＦＰカセットは、ＦＭＶプロモーター（配列番号２２）、ＹＦＰタンパク質（配列番号２３）、およびＲｂｃｓターミネーター（配列番号２４）をコードする。左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号２５）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号２７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号２７）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号２８）、ＣｓＰＤＳ（Ｔ０２－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号２９）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号３０）、リンカー（配列番号３１）、およびＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号３２）をコードする。右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号３４）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号３５）、およびＮｏｓターミネーター（ＮＯ番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号３５）は、右ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号３６）、ＣｓＰＤＳ（Ｔ０２－Ｒ１）結合ドメイン（配列番号３７）、右ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号３８）、リンカー（配列番号３９）、およびＳｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号４０）をコードする。ＦｏｋＩカセット（配列番号４１）は、ＭｔＥＦ１ａプロモーター（配列番号４２）、インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号４３）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）をコードする。インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号４３）は、核局在化シグナル（配列番号４４）、Ｓｓｐ ＤｎａＥ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列（配列番号４５）、ＣＦＮ（ＴＧＣＴＴＣＡＡＣ）、リンカー（ＡＧＣＣＧＴＴＣＣ）、およびＦｏｋＩ（配列番号１９）をコードする。

【0164】

プラスミドベクター４６の配列は、配列番号４６に記載され、その配列は、ＹＦＰカセット（配列番号２１）、左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号４７）、右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号５４）、およびＦｏｋＩカセット（配列番号６１）をコードする。ＹＦＰカセットは、ＦＭＶプロモーター（配列番号２２）、ＹＦＰタンパク質（配列番号２３）、およびＲｂｃｓターミネーター（配列番号２４）をコードする。左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号４７）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号４８）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号４８）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号４９）、ＣｓＰＤＳ（Ｔ０２－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号５０）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号５１）、リンカー（配列番号５２）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号５３）をコードする。右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号５４）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号５５）、およびＮｏｓターミネーター（ＮＯ番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号５５）は、右ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号５６）、ＣｓＰＤＳ（Ｔ０２－Ｒ１）結合ドメイン（配列番号５７）、右ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号５８）、リンカー（配列番号５９）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号６０）をコードする。ＦｏｋＩカセット（配列番号６１）は、ＭｔＥＦ１ａプロモーター（配列番号４２）、インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号６２）、およびＮｏｓターミネーター（ＮＯ番号３３）をコードする。インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号６２）は、核局在化シグナル（配列番号６３）、Ｇｐ４１－１ｉｎｔ－Ｃペプチド配列（配列番号６４）、リンカー（ＡＧＣＣＧＴＴＣＣ）、およびＦｏｋＩ（配列番号１９）をコードする。

【0165】

プラスミドベクター６５の配列は、配列番号６５に記載され、その配列は、ＹＦＰカセット（配列番号２１）、左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号６６）、右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号７４）、およびＦｏｋＩカセット（配列番号８２）をコードする。ＹＦＰカセットは、ＦＭＶプロモーター（配列番号２２）、ＹＦＰタンパク質（配列番号２３）、およびＲｂｃｓターミネーター（配列番号２４）をコードする。左半分ＴＡＬＥカセット（配列番号６６）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号６７）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号６７）は、左ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号６８）、ＣｓＴＨＣＡＳ（Ｔ２２－Ｌ１）結合ドメイン（配列番号６９）、左ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号７０）、リンカー（配列番号７１）、天然スプライス部位ｉｎｔ－Ｎ（配列番号７２）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号７３）をコードする。右半分ＴＡＬＥカセット（配列番号７４）は、ＶａＵｂｉ３プロモーター（配列番号２６）、インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号７５）、およびＮｏｓターミネーター（ＮＯ番号３３）をコードする。インテインＴＡＬエフェクター融合物（配列番号７５）は、右ＴＡＬＥ Ｎ末端（配列番号７６）、ＣｓＴＨＣＡＳ（Ｔ２２－Ｒ１）結合ドメイン（配列番号７７）、右ＴＡＬＥ Ｃ末端（配列番号７８）、リンカー（配列番号７９）、天然スプライス部位ｉｎｔ－Ｎ（配列番号８０）、およびＧｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｎペプチド配列（配列番号８１）をコードする。ＦｏｋＩカセット（配列番号８２）は、ＭｔＥＦ１ａプロモーター（配列番号４２）、インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号８３）、およびＮｏｓターミネーター（配列番号３３）をコードする。インテインＦｏｋＩ融合物（配列番号８３）は、核局在化シグナル（配列番号８４）、Ｇｐ４１－１ ｉｎｔ－Ｃペプチド配列（配列番号８５）、天然スプライス部位ｉｎｔ－Ｃ（配列番号８６）、リンカー（ＡＧＣＣＧＴＴＣＣ）、およびＦｏｋＩ（配列番号１９）をコードする。

【0166】

残りの例示的コンストラクトを、以下に記載する。プラスミドベクター８７（配列番号８７に記載）は、ＴＨＣＡＳを標的にする左および右ＴＡＬＥエフェクターを、ＦｏｋＩカセット共にコードし、その各々は、天然Ｓｓｐ ＤｎａＥインテインを含む。プラスミドベクター８８（配列番号８８に記載）は、ＴＨＣＡＳを標的にする左および右ＴＡＬＥエフェクターを、ＦｏｋＩカセット共にコードし、その各々は、非天然Ｇｐ４１－１インテインを含む。プラスミドベクター８９（配列番号８９に記載）は、ＴＨＣＡＳを標的にする左および右ＴＡＬＥエフェクターを、ＦｏｋＩカセット共にコードし、その各々は、天然Ｇｐ４１－１インテインを含む。プラスミドベクター９０（配列番号９０に記載）は、ＴＨＣＡＳ遺伝子を標的にした左および右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。プラスミドベクター９１（配列番号９１に記載）は、ＰＤＳ遺伝子を標的にした左および右半分ＴＡＬＥＮをコードする対照ＴＡＬＥＮベクターである。

【0167】

図８Ａ～図８Ｉは、本開示と一致した、異なるプラスミドベクターを使用する、アサ外植体の形質転換の結果を示す。図８Ａは、第１のセットおよび第２のセットの、異なるプラスミドベクターの編集効率を比較するグラフであり、インテインなし（例えば、プラスミドベクター９０および９１）、ＳＳＰ ＤｎａＥのインテインおよび天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター２０および８７）、ＧＰ４１－１のインテインおよび非天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター４６および８８）、ならびにＧＰ４１－１のインテインおよび天然エクステイン（例えば、プラスミドベクター８９および６５）の編集効率を示す。

【0168】

図８Ｂ～図８Ｃは、図８Ａが示すように、第１のセットおよび第２のセットの、異なるプラスミドベクターの編集事象百分率を比較するグラフである。図８Ｄ～図８Ｉは、本開示と一致した、プラスミドベクター２０（図８Ｄ）、プラスミドベクター４６（図８Ｅ）、プラスミドベクター８９（図８Ｆ）、プラスミドベクター８７（図８Ｇ）、プラスミドベクター８８（図８Ｈ）およびプラスミドベクター６５（図８Ｉ）の異なるプラスミドベクターによる、外植体の形質転換を評価する実験からの外植体の画像である。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【配列表】

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【国際調査報告】