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▶ ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-02
(54)【発明の名称】細胞のカプセル化のための超多孔性ゲルマトリックス
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20240625BHJP
A61M 1/34 20060101ALI20240625BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240625BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20240625BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240625BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20240625BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
A61M1/34 100
C12N5/071
C12N5/0735
C12N5/10
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572627
(86)(22)【出願日】2022-05-27
(85)【翻訳文提出日】2024-01-19
(86)【国際出願番号】 US2022031355
(87)【国際公開番号】W WO2022251643
(87)【国際公開日】2022-12-01
(31)【優先権主張番号】63/194,000
(32)【優先日】2021-05-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】506115514
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100203208
【弁理士】
【氏名又は名称】小笠原 洋平
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】バラハ，チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】ロイ，シューボ
(72)【発明者】
【氏名】ムンナンギ，プジタ
(72)【発明者】
【氏名】サンタンドレウ，アナ
(72)【発明者】
【氏名】シャヒーン，レベッカ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C077
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BB15
4B065BC46
4B065CA24
4B065CA44
4C077BB02
4C077KK12
4C077NN03
4C077PP02
4C077PP05
4H045AA10
4H045CA40
4H045EA34
(57)【要約】
ゲルを形成することができる水溶性材料と生体適合性疎水性物質とを含むエマルションから生成される生体適合性ゲルマトリックスが提供される。特定の態様では、本開示の生体適合性ゲルマトリックスは、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルであって、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではない、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルと、複数の細胞であって、細胞は、複数のマイクロチャネルに隣接しており、複数の細胞の大部分は、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つから５０ミクロン以下の距離内にある、複数の細胞とを含み得、複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。マトリックスの使用方法及びマトリックスを作製する方法も提供される。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体適合性ゲルマトリックスであって、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルであって、前記複数のマイクロチャネル及び前記複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではない、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルと、
複数の細胞であって、前記細胞は、前記複数のマイクロチャネルに隣接しており、前記複数の細胞の大部分は、前記複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つから５０ミクロン以下の距離内にある、複数の細胞と、を含み、
前記複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロンの幅を有し、前記複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する、生体適合性ゲルマトリックス。
【請求項2】
前記ゲルマトリックスが、アガロースで構成されている、請求項１に記載のゲルマトリックス。
【請求項3】
前記ゲルマトリックスが、コラーゲン、アルギネート、セルロース、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ゼラチン、又はデキストランで構成されている、請求項１に記載のゲルマトリックス。
【請求項4】
前記マトリックスが、平面スキャフォールド、円筒、球体、又は繊維の形態である、請求項１～３のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項5】
前記マイクロチャネルが、前記複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、前記マトリックス中にカプセル化された前記複数の細胞の少なくとも８０％が、少なくとも１日間生存可能である、請求項１～４のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項6】
前記マイクロチャネルが、前記複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、前記マトリックス中にカプセル化された前記複数の細胞の少なくとも８０％が、最大１ヶ月間生存可能である、請求項１～５のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項7】
前記マイクロチャネルが、前記複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、前記マトリックス中にカプセル化された前記複数の細胞の少なくとも８０％が、少なくとも１日間生存可能かつ機能的である、請求項１～４のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項8】
前記マイクロチャネルが、前記複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、前記マトリックス中にカプセル化された前記複数の細胞の少なくとも８０％が、最大１ヶ月間生存可能かつ機能的である、請求項１～４のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項9】
前記複数の細胞が、インスリン産生細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載のゲルマトリックス。
【請求項10】
前記インスリン産生細胞が、幹細胞の分化に由来する、請求項９に記載のゲルマトリックス。
【請求項11】
前記インスリン産生細胞が、膵島から単離された膵細胞である、請求項９に記載のゲルマトリックス。
【請求項12】
前記インスリン産生細胞が、膵臓から単離された膵島内にあり、前記膵島が、前記マトリックス中にカプセル化されている、請求項９に記載のゲルマトリックス。
【請求項13】
前記膵島が各々、約１０００個の細胞を含む、請求項１２に記載のゲルマトリックス。
【請求項14】
各膵島が、約１００ミクロンの直径を有する、請求項１２又は１３に記載のゲルマトリックス。
【請求項15】
前記インスリン産生細胞が、幹細胞由来の濃縮βクラスター（ｅＢＣ）内にある、請求項９に記載のゲルマトリックス。
【請求項16】
各ｅＢＣが、約１０００個の細胞を含む、請求項１５に記載のゲルマトリックス。
【請求項17】
各ｅＢＣが、約１００ミクロンの直径を有する、請求項１５又は１６に記載のゲルマトリックス。
【請求項18】
生体人工限外ろ過デバイスであって、請求項１～１７のいずれか一項に記載のマトリックスを含む、平面スキャフォールドと、
前記平面スキャフォールドの第１の表面に配置された第１の半透過性限外ろ過膜と、
前記平面スキャフォールドの前記第１の表面に隣接し、かつ前記第１の半透過性限外ろ過膜を介して前記平面スキャフォールドと流体連通し、かつ入口及び出口を含む、第１のコンパートメントと、
前記平面スキャフォールドの第２の表面に隣接し、かつ出口を含む、第２のコンパートメントと、を含み、
前記第１の半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、
前記第１の半透過性限外ろ過膜は、前記第１のコンパートメントから前記マトリックスへの限外ろ過液の輸送を可能にし、前記限外ろ過液は、前記マトリックスを通って前記第２のコンパートメントへと横断する、生体人工限外ろ過デバイス。
【請求項19】
前記デバイスが、前記平面スキャフォールドの前記第２の表面に配置された第２の半透過性限外ろ過膜を更に含み、前記限外ろ過液は、前記複数のマイクロチャネルから前記第２の半透過性限外ろ過膜を横切って前記第２のコンパートメントへと横断する、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項20】
前記第２の半透過性限外ろ過膜が、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項21】
前記第１及び第２の半透過性限外ろ過膜が、０．１ミクロン～２ミクロンの範囲範囲の幅を有する複数の細孔を含む、請求項１９又は２０に記載のデバイス。
【請求項22】
前記第２の半透過性限外ろ過膜が、前記第１の半透過性限外ろ過膜における前記複数の細孔の前記幅よりも大きい幅を有する複数の細孔を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項23】
前記第１のコンパートメントの前記入口が、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、前記血管は、前記対象の動脈である、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項24】
前記第１のコンパートメントの前記出口が、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、前記血管は、前記対象の静脈又は前記対象の動脈である、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項25】
前記第２のコンパートメントの前記出口が、（ｉ）対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、前記限外ろ過液を、前記対象の１つ以上の血管、（ｉｉ）前記対象の１つ以上の静脈、（ｉｉｉ）前記対象の１つ以上の動脈、及び／又は（ｉｖ）分析物分析デバイスに提供する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項26】
前記第１の半透過性膜における前記複数の細孔が、０．２μｍ～０．５μｍ、２０ｎｍ～２ミクロン、又は２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲の幅を有する、請求項１８～２５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項27】
前記第２の半透過性膜における前記複数の細孔が、０．２μｍ～０．５μｍ、２０ｎｍ～２ミクロン、又は２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲の幅を有する、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項28】
前記第１の半透過性限外ろ過膜の厚さが、０．１ミクロン～１００ミクロン、０．５μｍ～１０μｍの範囲内である、請求項１８～２７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項29】
前記第２の半透過性限外ろ過膜の厚さが、０．１ミクロン～１００ミクロン又は０．５μｍ～１０μｍの範囲内である、請求項１９～２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項30】
前記平面スキャフォールドの第１及び／又は第２の表面の表面が、１ｃｍ２～１００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である、請求項１８～２９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項31】
前記第１の半透過性限外ろ過膜の表面積が、１ｃｍ２～１０００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である、請求項１８～３０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項32】
前記第２の半透過性限外ろ過膜の表面積が、１ｃｍ２～１０００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲内である、請求項１９～３１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項33】
前記複数の細孔が、円形の形状をしており、前記幅が、前記細孔の直径を指す、請求項１８～３２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項34】
前記複数の細孔が、スリット形状である、請求項１８～３３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項35】
前記複数の細孔が、スリット形状であり、前記細孔の幅が、５ｎｍ～１００ｎｍである、請求項１８～３４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項36】
前記複数の細孔が、スリット形状であり、前記細孔の長さが、０．１ミクロン～５ミクロンの範囲である、請求項１８～４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項37】
前記複数の細孔がスリット形状であり、前記細孔の長さが１μｍ～３μｍの範囲内である、請求項１８～３６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項38】
前記細胞が、前記デバイスを含む前記対象に対して自家由来である、請求項１８～３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項39】
前記細胞が、前記デバイスを含む前記対象に対して異種由来である、請求項１８～３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項40】
前記細胞が、前記デバイスを含む前記対象に対して同種異系由来である、請求項１８～３７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項41】
生体人工限外ろ過デバイスであって、請求項１～１７のいずれか一項に記載のマトリックスを含む、平面スキャフォールドと、
前記平面スキャフォールドの第１の表面に配置された請求項１８～４０のいずれか１項に記載の第１の半透過性限外ろ過膜と、第２の表面に配置された請求項１９～４０のいずれか１項に記載の第２の半透過性限外ろ過膜と、
第１の入口及び第１の出口を含む第１のコンパートメントであって、前記第１のコンパートメントは前記平面スキャフォールドの前記第１の表面に隣接している、第１のコンパートメントと、
第２の入口及び第２の出口を含む第２のコンパートメントであって、前記第２のコンパートメントは前記平面スキャフォールドの前記第２の表面に隣接している、第２のコンパートメントと、を含み、
前記第１の入口は、対象の動脈に接続するように構成され、前記第１の出口は、前記第２のコンパートメントの前記第２の入口に接続され、
前記第２のコンパートメントの前記第２の出口は、前記対象の静脈に接続するように構成され、
前記半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、
前記第１の半透過性限外ろ過膜は、前記第１のコンパートメントから前記スキャフォールドへの限外ろ過液の輸送を可能にし、前記第２の半透過性限外ろ過膜は、前記スキャフォールド内の前記複数のマイクロチャネルから前記第２のコンパートメントへの前記限外ろ過液の輸送を可能にする、生体人工限外ろ過デバイス。
【請求項42】
前記細胞が、前記対象に対して自家由来である、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項43】
前記細胞が、前記対象に対して異種由来である、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項44】
前記細胞が、前記対象に対して同種異系由来である、請求項４１に記載のデバイス。
【請求項45】
前記第２の半透過性限外ろ過膜の前記複数の細孔が、前記第１の半透過性限外ろ過膜の前記複数の細孔の幅よりも大きい幅を有するか、又は前記第２の半透過性限外ろ過膜の前記複数の細孔が、前記第１の半透過性限外ろ過膜の前記複数の細孔の幅よりも小さい幅を有する、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項46】
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法であって、前記方法は、請求項１８～４０のいずれか一項に記載の生体人工限外ろ過デバイスを前記対象に接続すること、を含み、前記接続することは、
前記第１のコンパートメントの前記入口を前記対象の動脈に接続し、前記第１のコンパートメントの前記出口を前記対象の血管に接続することと、
前記第２のコンパートメントの前記出口を前記対象の血管又は体腔に接続するか、又は
前記第２のコンパートメントの前記出口を分析物分析デバイスに接続することと、を含む、方法。
【請求項47】
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法であって、前記方法は、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の生体人工限外ろ過デバイスを前記対象に接続すること、を含み、前記接続することは、
前記第１の入口を対象の動脈に接続することと、
前記第２の出口を前記対象の静脈に接続することと、を含む、方法。
【請求項48】
前記方法が、前記対象にインスリンを提供することを含み、前記細胞が、インスリン産生細胞を含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項49】
前記生体人工デバイスの接続を必要とする前記対象に生体人工デバイスを接続することは、前記スキャフォールド内の細胞の生存率の増加をもたらす、請求項４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記限外ろ過液が、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記限外ろ過液が、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含み、前記インスリン産生細胞が、前記限外ろ過液中のグルコースの存在に応答してインスリンを排出し、前記複数のマイクロチャネルが、前記インスリンを前記第２のコンパートメントに輸送する、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記排出されたインスリンが、前記スキャフォールド内の前記複数のマイクロチャネルに輸送される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記半透過性限外ろ過膜が、前記スキャフォールドへの免疫系成分の通過を防止する、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記半透過性限外ろ過膜が、前記スキャフォールドへの抗体の通過を防止する、請求項４６～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記半透過性限外ろ過膜が、前記スキャフォールドへのサイトカインの通過を防止する、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記半透過性限外ろ過膜が、前記スキャフォールドへのＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／又はＩＬ－１βの通過を防止する、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルを含む、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、アルギネート、デキストラン、又はセルロースを含む、マトリックスを作製する方法であって、前記複数のマイクロチャネル及び前記複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではなく、前記複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロンの幅を有し、前記複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有し、前記方法は、溶解したアガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースを含む水溶液を生成することと、
水不混和性試薬及び界面活性剤を前記水溶液に添加することと、
前記水溶液を、前記溶解したアガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロース、水不混和性試薬及び界面活性剤を含むエマルションを生成するのに十分な条件下で混合することと、
前記エマルションを、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースのゲル化を可能にするのに十分な温度に置くことによって前記マトリックスを生成し、それによってマトリックスを作製することと、を含む、方法。
【請求項58】
前記マトリックスを生成するステップの前に、細胞を前記エマルションに添加することを更に含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記マトリックスを生成することが、平面を含むモールドに前記エマルションをキャストし、それによって平面スキャフォールドを作製することを含む、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項60】
方法が、前記平面スキャフォールドの第１の表面に第１の半透過性限外ろ過膜を配置することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
方法が、前記平面スキャフォールドの第２の表面に第２の半透過性限外ろ過膜を配置することを含む、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記アガロースが、超低ゲル化アガロースである、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記アガロースが、水溶液中に１％～１０％ｗ／ｖ、２％～１０％ｗ／ｖ、２％～８％ｗ／ｖ、又は３％～６％ｗ／ｖの濃度で存在する、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記アガロースを溶解することが、水溶液を約３７℃の温度に加熱し、前記溶液を約３００回転／分（ＲＰＭ）で撹拌することを含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記水不混和性試薬が、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）である、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１９４，０００号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／１９４，０００号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
序論
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、ランゲルハンスの膵島内のインスリン産生β細胞の自己免疫破壊に起因する。レシピエントの肝臓の門脈に死体膵島を直接注入することによる膵島移植は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ ｍｅｌｌｉｔｕｓ １）の患者に非侵襲的な治癒を提供する。しかしながら、ドナーの入手可能性、不十分な生着、及び全般的な免疫抑制からの副作用は、このアプローチのより広範な適用のための障害として残っている。更に、注入された膵島の最大６０％が、外科的な送出後の数日以内に生存不能となり、長期的なインスリン非依存性が５年間の移植までに失われることが多い。自然免疫及び適応免疫の活性化が膵島移植片不全の主な原因のうちの１つである。膵島をカプセル化するというアイデアは、非常に大きな関心を集めている。しかしながら、機能を維持し、患者の免疫系から保護されるカプセル化された膵島を提供するための改良されたデバイス及び方法が必要である。
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、ランゲルハンスの膵島内のインスリン産生β細胞の自己免疫破壊に起因する。レシピエントの肝臓の門脈に死体膵島を直接注入することによる膵島移植は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ ｍｅｌｌｉｔｕｓ １）の患者に非侵襲的な治癒を提供する。しかしながら、ドナーの入手可能性、不十分な生着、及び全般的な免疫抑制からの副作用は、このアプローチのより広範な適用のための障害として残っている。更に、注入された膵島の最大６０％が、外科的な送出後の数日以内に生存不能となり、長期的なインスリン非依存性が５年間の移植までに失われることが多い。自然免疫及び適応免疫の活性化が膵島移植片不全の主な原因のうちの１つである。膵島をカプセル化するというアイデアは、非常に大きな関心を集めている。しかしながら、機能を維持し、患者の免疫系から保護されるカプセル化された膵島を提供するための改良されたデバイス及び方法が必要である。
【発明の概要】
【0003】
ゲルを形成することができる水溶性材料と生体適合性疎水性物質とを含むエマルションから生成される生体適合性ゲルマトリックスが提供される。生体適合性疎水性物質の使用は、細胞に対して無毒であり、かつ細胞への栄養素の流れをサポートすることができるマイクロチャネルを含む生体適合性ゲルマトリックスの生成を可能にする。マトリックスはまた、細胞への栄養素の拡散をサポートするナノチャネルを含む。
【0004】
特定の態様では、本開示の生体適合性ゲルマトリックスは、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルであって、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではない、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルと、複数の細胞であって、細胞は、複数のマイクロチャネルに隣接しており、複数の細胞の大部分は、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つから５０ミクロン以下の距離内にある、複数の細胞とを含み得、複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロン、例えば、５～１００ミクロン又は５～５０ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。
【0005】
特定の態様では、生体適合性ゲルマトリックスを生成するためのエマルションが提供される。エマルションは、ゲルを形成することができる水溶性材料と生体適合性疎水性物質と任意選択で界面活性剤とを含む水中油型エマルションであり得る。エマルションは、生細胞を更に含んでいてもよい。エマルションを冷却すると、マトリックスが形成され、このマトリックスは、本明細書に記載されるようにマイクロチャネル及びナノチャネルを含む。
【0006】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、水溶性材料アガロース、例えば、超低ゲル化アガロースで構成されている。低ゲル化アガロースの例としては、ＩＸ型アガロース、例えば、ＩＸ－Ａ型アガロースが挙げられる。特定の態様では、ゲルマトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、アルギネート、セルロース、ＰＣＬ、又はデキストランなどの水溶性材料で構成されている。
【0007】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、平面スキャフォールド、円筒、球体、又は繊維の形態である。特定の態様では、ゲルマトリックスは、少なくとも１ｃｍ３～約１０，０００ｃｍ３の体積を含む。特定の態様では、ゲルマトリックスは、１ｃｍ２～１０００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲の表面積を含む。
【0008】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、少なくとも１００個の細胞を含む。特定の態様では、細胞は、マトリックス中に均一に分散されてよい。特定の態様では、細胞は、単一細胞又は細胞のクラスターであってもよい。特定の態様では、細胞は、インスリン産生細胞である。特定の態様では、インスリン産生細胞は、幹細胞の分化に由来する。特定の態様では、インスリン産生細胞は、膵島から単離された膵細胞である。特定の態様では、インスリン産生細胞は、膵臓から単離された膵島にあり、膵島は、マトリックス中にカプセル化されている。特定の態様では、膵島は各々、約１０００個の細胞を含む。特定の態様では、各膵島は、約１００ミクロンの直径を有する。特定の態様では、インスリン産生細胞は、幹細胞由来の濃縮βクラスター（ｅＢＣ）内にある。特定の態様では、各ｅＢＣは、約１０００個の細胞を含む。特定の態様では、各ｅＢＣは、約１００ミクロンの直径を有する。
【0009】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％は、少なくとも１日間生存可能である。
【0010】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％は、最大１ヶ月間生存可能である。
【0011】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％は、少なくとも１日間生存可能かつ機能的である。
【0012】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％は、最大１ヶ月間生存可能かつ機能的である。
【0013】
特定の態様では、細胞は、インスリン産生細胞であり、細胞をグルコースに曝露し、インスリン産生を測定することによって、細胞の機能を評価する。特定の態様では、細胞は、マトリックスを通して血液を流すことによってインスリンに曝露される。
【0014】
特定の態様では、本明細書に開示されるような生体適合性ゲルマトリックスを含む平面スキャフォールドを含む生体人工限外ろ過デバイスが提供される。本デバイスは、平面スキャフォールドの第１の表面に配置された第１の半透過性限外ろ過膜と、平面スキャフォールドの第１の表面に隣接し、かつ第１の半透過性限外ろ過膜を介して平面スキャフォールドと流体連通し、かつ入口及び出口を含む、第１のコンパートメントと、平面スキャフォールドの第２の表面に隣接し、かつ出口を含む、第２のコンパートメントと、を含み得、第１の半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、第１の半透過性限外ろ過膜は、第１のコンパートメントからマトリックスへの限外ろ過液の輸送を可能にし、限外ろ過液は、マトリックスを通って第２のコンパートメントへと横断する。
【0015】
特定の態様では、本デバイスは、平面スキャフォールドの第２の表面に配置された第２の半透過性限外ろ過膜を更に含み、限外ろ過液は、複数のマイクロチャネルから第２の半透過性限外ろ過膜を横切って第２へのコンパートメントへと横断する。
【0016】
特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含む。特定の態様では、第１及び第２の半透過性限外ろ過膜は、０．１ミクロン～２ミクロン、０．２ミクロン～０．５ミクロン、２０ｎｍ～２ミクロン、又は２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲範囲の幅を有する複数の細孔を含む。
【0017】
特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも大きい幅を有する複数の細孔を含む。
【0018】
特定の態様では、第１のコンパートメントの入口は、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、血管は、対象の動脈である。特定の態様では、第１のコンパートメントの出口は、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、血管は、対象の静脈又は対象の動脈である。特定の態様では、出口に接続された動脈は、入口に接続された動脈と同じ動脈である。特定の態様では、第２のコンパートメントの出口は、（ｉ）対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、限外ろ過液を、対象の１つ以上の血管、（ｉｉ）対象の１つ以上の静脈、（ｉｉｉ）対象の１つ以上の動脈、及び／又は（ｉｖ）分析物分析デバイスに提供する。
【0019】
特定の態様では、第１の半透過性限外ろ過膜の厚さは、０．１ミクロン～１００ミクロン又は０．５ミクロン～１０ミクロンの範囲である。
【0020】
特定の態様では、平面スキャフォールドの第１及び／又は第２の表面の表面は、１ｃｍ２～１０００ｃｍ２、１ｃｍ２～１００ｃｍ２、１０ｃｍ２～１００ｃｍ２、又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲である。特定の態様では、第１の半透過性限外ろ過膜の表面積は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲である。
【0021】
特定の態様では、複数の細孔は、円形の形状をしており、幅は、細孔の直径を指す。特定の態様では、複数の細孔はスリット形状である。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の幅は、５ｎｍ～５００ｎｍ、例えば、５ｎｍ～３００ｎｍ、５ｎｍ～２００ｎｍ、又は５ｎｍ～１００ｎｍである。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の長さは、０．１ミクロン～５ミクロンの範囲である。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の長さは、１μｍ～３μｍの範囲内であり、細孔の幅は、５ｎｍ～１００ｎｍである。特定の態様では、デバイス内の細胞は、対象に対して自家由来であるか、対象に対して異種由来であるか、又は対象に対して同種他家由来である。
【0022】
特定の態様では、本明細書に開示されるマトリックスを含む平面スキャフォールドを含む生体人工限外ろ過デバイスが提供される。本デバイスは、平面スキャフォールドの第１の表面に配置された本明細書に開示されるような第１の半透過性限外ろ過膜と、第２の表面に配置された本明細書に開示されるような第２の半透過性限外ろ過膜と、第１の入口及び第１の出口を含む第１のコンパートメントであって、第１のコンパートメントは平面スキャフォールドの第１の表面に隣接している、第１のコンパートメントと、第２の入口及び第２の出口を含む第２のコンパートメントであって、第２のコンパートメントは平面スキャフォールドの第２の表面に隣接している、第２のコンパートメントと、を含み、第１の入口は、対象の動脈に接続するように構成され、第１の出口は、第２のコンパートメントの第２の入口に接続され、第２のコンパートメントの第２の出口は、対象の静脈に接続するように構成され、半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、第１の半透過性限外ろ過膜は、第１のコンパートメントからスキャフォールドへの限外ろ過の輸送を可能にし、第２の半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールド内の複数のマイクロチャネルから第２のコンパートメントへの限外ろ過液の輸送を可能にする。特定の態様では、デバイス内の細胞は、対象に対して自家由来であるか、対象に対して異種由来であるか、又は対象に対して同種他家由来である。特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも大きい幅を有するか、又は第２の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも小さい幅を有する。
【0023】
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるような生体人工限外ろ過デバイスを対象に接続することを含み得、接続することは、第１のコンパートメントの入口を対象の動脈に接続し、第１のコンパートメントの出口を対象の血管に接続することと、第２のコンパートメントの出口を対象の血管又は体腔に接続するか、又は第２のコンパートメントの出口を分析物分析デバイスに接続することと、を含む。
【0024】
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるような生体人工限外ろ過デバイスを対象に接続することを含み得、接続することは、第１の入口を対象の動脈に接続することと、第２の出口を対象の静脈に接続することと、を含む。
【0025】
特定の態様では、本方法は、対象にインスリンを提供することを含み、細胞はインスリン産生細胞を含む。特定の態様では、生体人工デバイスの接続を必要とする対象に生体人工デバイスを接続することは、スキャフォールド内の細胞の生存率の増加をもたらす。特定の態様では、限外ろ過液は、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含む。特定の態様では、限外ろ過液は、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含み、インスリン産生細胞は、限外ろ過液中のグルコースの存在に応答してインスリンを排出し、複数のマイクロチャネルは、インスリンを第２のコンパートメントに輸送する。
【0026】
特定の態様では、排出されたインスリンは、スキャフォールド内の複数のマイクロチャネルに輸送される。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへの免疫系成分の通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへの抗体の通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへのサイトカインの通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへのＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／又はＩＬ－１βの通過を防止する。
【0027】
特定の態様では、本明細書に開示される生体適合性ゲルマトリックスを作製する方法が提供される。生体適合性ゲルマトリックスは、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースから生成され得、かつ複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルを含み、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではなく、複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロン、５～１００ミクロン、又は５～５０ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。特定の態様では、本方法は、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースを水溶液に溶解させることと、生体適合性疎水性物質及び界面活性剤を水溶液に添加することと、水溶液を、溶解したアガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロース、生体適合性疎水性物質及び界面活性剤を含むエマルションを生成するのに十分な条件下で混合することと、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースのゲル化を可能にするのに十分な温度にエマルションを置くことによってマトリックスを生成し、それによってマトリックスを作製することと、を含む。特定の態様では、本方法は、マトリックスを生成するステップの前に、細胞をエマルションに添加することを更に含み得る。特定の態様では、マトリックスを生成することは、平面を含むモールドにエマルションをキャストし、それによって平面スキャフォールドを作製することを含む。特定の態様では、本方法は、平面スキャフォールドの第１の表面に第１の半透過性限外ろ過膜を配置することを更に含む。特定の態様では、本方法は、第２の半透過性限外ろ過膜を平面スキャフォールドの第２の表面に配置することを更に含む。特定の態様では、アガロースは、超低ゲル化アガロースである。特定の態様では、アガロースは、水溶液中に１％～１０％ｗ／ｖ、２％～１０％ｗ／ｖ、２％～８％ｗ／ｖ、又は３％～６％ｗ／ｖの濃度で存在する。特定の態様では、アガロースを溶解することは、水溶液を約３７℃の温度に加熱し、溶液を約３００回転／分（ＲＰＭ）で撹拌することを含む。特定の態様では、マトリックスを生成することは、アガロース、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースがゲルを形成する温度までエマルションを冷却することを含む。特定の態様では、水不混和性試薬は、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）である。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】ＳＰＡスキャフォールド及び血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイスアセンブリを示す。図１Ａは、アガロース中の対流孔及び拡散孔を示すＳＰＡスキャフォールドの概略断面図を提示する。図１Ｂは、膵島チャンバハウジング内のＳＰＡスキャフォールドを提示する。図１Ｃは、ｉＢＡＰの構成要素、すなわち流路、シリコンナノポア膜（ＳＮＭ）、細胞チャンバ内の細胞スキャフォールド、及びポリカーボネート（ＰＣ）裏面及び限外ろ過液出口の分解図を示す。図１Ｄは、インビトロ試験に使用されるアセンブルされたｉＢＡＰを示す。
【図1B】ＳＰＡスキャフォールド及び血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイスアセンブリを示す。図１Ａは、アガロース中の対流孔及び拡散孔を示すＳＰＡスキャフォールドの概略断面図を提示する。図１Ｂは、膵島チャンバハウジング内のＳＰＡスキャフォールドを提示する。図１Ｃは、ｉＢＡＰの構成要素、すなわち流路、シリコンナノポア膜（ＳＮＭ）、細胞チャンバ内の細胞スキャフォールド、及びポリカーボネート（ＰＣ）裏面及び限外ろ過液出口の分解図を示す。図１Ｄは、インビトロ試験に使用されるアセンブルされたｉＢＡＰを示す。
【図1C】ＳＰＡスキャフォールド及び血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイスアセンブリを示す。図１Ａは、アガロース中の対流孔及び拡散孔を示すＳＰＡスキャフォールドの概略断面図を提示する。図１Ｂは、膵島チャンバハウジング内のＳＰＡスキャフォールドを提示する。図１Ｃは、ｉＢＡＰの構成要素、すなわち流路、シリコンナノポア膜（ＳＮＭ）、細胞チャンバ内の細胞スキャフォールド、及びポリカーボネート（ＰＣ）裏面及び限外ろ過液出口の分解図を示す。図１Ｄは、インビトロ試験に使用されるアセンブルされたｉＢＡＰを示す。
【図1D】ＳＰＡスキャフォールド及び血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイスアセンブリを示す。図１Ａは、アガロース中の対流孔及び拡散孔を示すＳＰＡスキャフォールドの概略断面図を提示する。図１Ｂは、膵島チャンバハウジング内のＳＰＡスキャフォールドを提示する。図１Ｃは、ｉＢＡＰの構成要素、すなわち流路、シリコンナノポア膜（ＳＮＭ）、細胞チャンバ内の細胞スキャフォールド、及びポリカーボネート（ＰＣ）裏面及び限外ろ過液出口の分解図を示す。図１Ｄは、インビトロ試験に使用されるアセンブルされたｉＢＡＰを示す。
【図2】ｉＢＡＰ、蠕動ポンプ、及び圧力計からなる透水試験デバイスを示す。目盛り付きシリンジ及びタイマーを使用して、限外ろ過測定を決定した。
【図3】ＳＰＡ及び非乳化アガロースで作製されたスキャフォールドの透水値（平均±ＳＤ、＊＊は＜ｐ０．００１を表す）が統計的に有意であることが示され、Ｆ（１，１２）＝６９８６である。
【図4A】ＰＦＤ液滴サイズ分析を示す。図４Ａは、液滴分析に使用した３％ＳＰＡスキャフォールドの代表的なＤＩＣ画像を示す。図４Ｂは、各スキャフォールドについて平均±ＳＤとして表されるＰＦＤ液滴を代表表するＰＦＤ液滴のサイズ分布を示すヒストグラムを示す。図４Ｃは、各ＤＩＣ画像について計算され、次いで平均化されたスキャフォールドの相対的な液滴面積を示す。線は、各スキャフォールドの平均±ＳＤを表し、＊はｐ＜０．０５を表す。
【図4B】ＰＦＤ液滴サイズ分析を示す。図４Ａは、液滴分析に使用した３％ＳＰＡスキャフォールドの代表的なＤＩＣ画像を示す。図４Ｂは、各スキャフォールドについて平均±ＳＤとして表されるＰＦＤ液滴を代表表するＰＦＤ液滴のサイズ分布を示すヒストグラムを示す。図４Ｃは、各ＤＩＣ画像について計算され、次いで平均化されたスキャフォールドの相対的な液滴面積を示す。線は、各スキャフォールドの平均±ＳＤを表し、＊はｐ＜０．０５を表す。
【図4C】ＰＦＤ液滴サイズ分析を示す。図４Ａは、液滴分析に使用した３％ＳＰＡスキャフォールドの代表的なＤＩＣ画像を示す。図４Ｂは、各スキャフォールドについて平均±ＳＤとして表されるＰＦＤ液滴を代表表するＰＦＤ液滴のサイズ分布を示すヒストグラムを示す。図４Ｃは、各ＤＩＣ画像について計算され、次いで平均化されたスキャフォールドの相対的な液滴面積を示す。線は、各スキャフォールドの平均±ＳＤを表し、＊はｐ＜０．０５を表す。
【図5A】３％ＳＰＡスキャフォールドの分解を示す。図５Ａは、２８日間の分解研究で体重の変化を測定し、異なる時点で有意差が見出されなかったことを示す。データは、平均±ＳＤとして示される。図５Ｂは、０、７、２１、及び２８日間の培養におけるスキャフォールドの代表的な画像を示す。
【図5B】３％ＳＰＡスキャフォールドの分解を示す。図５Ａは、２８日間の分解研究で体重の変化を測定し、異なる時点で有意差が見出されなかったことを示す。データは、平均±ＳＤとして示される。図５Ｂは、０、７、２１、及び２８日間の培養におけるスキャフォールドの代表的な画像を示す。
【図6A】３％の従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣの組織学的評価及び生存率を提示する。図６Ａは、従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣのＨ＆Ｅ及び生存率染色からの代表的な画像を示す。図６Ｂは、平均＋ＳＤとして報告される生存率の結果を提示する。
【図6B】３％の従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣの組織学的評価及び生存率を提示する。図６Ａは、従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣのＨ＆Ｅ及び生存率染色からの代表的な画像を示す。図６Ｂは、平均＋ＳＤとして報告される生存率の結果を提示する。
【0029】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本教示の実施又は試験に使用され得るが、いくつかの例示的な方法及び材料が、以下に記載される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本教示の実施又は試験に使用され得るが、いくつかの例示的な方法及び材料が、以下に記載される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「ろ過」という用語は、微粒子を通過させない媒体（例えば、半透過性膜）に流体キャリアを通過させることによって、空気又は液体などの流体から粒子状物質を分離するプロセスを指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「限外ろ過」という用語は、流体をろ過に供することを指し、ろ過される材料は、非常に小さく、典型的には、流体は、コロイド状の、溶解溶質、又は非常に微細な固体材料を含み、フィルタは、微小多孔性又はナノ多孔性である。フィルタは、半透過性膜などの膜であり得る。ろ過される流体は、「供給流体」と称される。特定の実施形態では、供給流体は、動脈血であってもよい。限外ろ過中、供給流体は、フィルタを通してろ過された「透過液」又は「ろ過液」又は「限外ろ過液」と、膜を通してろ過されなかった供給流体の一部である「保持液」とに分離される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、又はげっ歯類を指す。特定の実施形態では、対象又は患者は、ヒトであってもよい。特定の実施形態では、対象又は患者は、糖尿病予備軍であってもよく、又は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）又は２型糖尿病などの糖尿病を有していてもよい。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【0033】
本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「処理すること」という用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／あるいは疾患及び／若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点では治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、対象、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因であり得るが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、例えば、疾患の退縮を引き起こすこと、例えば、疾患の症候を完全に又は部分的に取り除くことを含む。
【0034】
本明細書で使用される場合、本開示のデバイスの文脈で使用される「層」、「フィルム」、又は「膜」という用語、及びそれらの複数形は、シリコン膜、窒化ケイ素、シリカ、原子的に薄い膜、例えば、グラフェン、シリコン、シリセン、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）など、若しくはそれらの組み合わせ、又はポリマーから形成され得るデバイスの個々の層を指す。本開示の多孔性層を製造するために使用される「層」、「フィルム」、又は「膜」は、典型的には多孔性であり、ナノ多孔性又は微小多孔性であり得る。「ナノ多孔性層」、「ナノポア層」、「ナノ多孔性膜」、「ナノポア膜」、「ナノ多孔性フィルム」、及び「ナノポアフィルム」という語句は、互換的に使用され、全てナノポアが作製されたポリマー層を指す。ナノ多孔性層は、層を支持するためのフレームを含み得る。「微小多孔性層」、「マイクロポア層」、「微小多孔性膜」、「マイクロポア膜」、「微小多孔性フィルム」、及び「マイクロポアフィルム」という語句は、互換的に使用され、全てマイクロポアが作製されたポリマー層を指す。微小多孔性層は、層を支持するためのフレームを含み得る。
【0035】
本明細書で使用される場合、本明細書で説明されるようなマトリックス中に配置された細胞の文脈で使用される「カプセル化された」という用語は、マトリックス中のマイクロチャネル内に存在するのではなく、マトリックスによって取り囲まれている細胞を指す。カプセル化された細胞は、マトリックス中で大きく移動しないようにマトリックス中に固定化される。カプセル化された細胞は、細胞を取り囲むマトリックス中のマイクロチャネル内の溶液の流れを介して栄養素を受け取る。カプセル化された細胞は、細胞を取り囲むマトリックス中のナノチャネル内の栄養素の拡散を介して栄養素を受け取る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「生体適合性」という用語は、細胞、例えば、哺乳動物細胞に対して大きな毒性を示さない材料、マトリックス、又はデバイスを指す。
【0037】
本発明を更に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、それ自体は勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することが意図されるものではないことも理解されるべきである。
【0038】
値の範囲が提供される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値、及びこの記載の範囲内の任意の他の記載される値又は中間値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の特異的に除外された制限に従って、本発明内に包含されてもよい。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。
【0039】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料が、以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【0040】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「チャネル」への言及は、複数のそのようなチャネルを含み、「アガロース細胞領域」への言及は、１つ以上のアガロース細胞領域及び当業者に知られているその等価物への言及などを含む。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的要素を除外するように起草され得ることに更に留意されたい。したがって、この記述は、特許請求要素の列挙に関連した「もっぱら（ｓｏｌｅｌｙ）」及び「のみ（ｏｎｌｙ）」などの排他的用語の使用のための、又は「消極的な」限定の使用のための先行詞として機能することが意図される。
【0041】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明される本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態では組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせが本発明によって具体的に包含され、各々及び全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、そのような可変部を説明する実施形態に列挙されている全てのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、各々及び全てのそのようなサブコンビネーションが本明細書に個別にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。
【0042】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のために、そのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。更に、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認される必要がある場合がある。
【発明を実施するための形態】
【0043】
上記に要約されるように、ゲルを形成することができる水溶性材料と生体適合性疎水性物質とを含むエマルションから生成される生体適合性ゲルマトリックスが提供される。生体適合性疎水性物質の使用は、細胞に対して無毒であり、かつ細胞への栄養素の流れをサポートすることができるマイクロチャネルを含む生体適合性ゲルマトリックスの生成を可能にする。マトリックスはまた、細胞への栄養素の拡散をサポートするナノチャネルを含む。エマルションを生成するために疎水性物質の使用がない場合、ゲルを形成することができる水溶性材料から形成される生体適合性ゲルマトリックスは、マイクロチャネルを含まない。マイクロチャネルがないと、マトリックスの透水性を著しく低下させ、生細胞を支持するために使用したり、様々な用途のために細胞を提供するためのデバイスとして使用したりすることに適さない。生体適合性疎水性物質の使用は、マトリックス中の生細胞のカプセル化を可能にする。
【0044】
特定の態様では、本開示の生体適合性ゲルマトリックスは、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルであって、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではない、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルと、複数の細胞であって、細胞は、複数のマイクロチャネルに隣接しており、複数の細胞の大部分は、複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つから５０ミクロン以下の距離内にある、複数の細胞とを含み得、複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロン、例えば、５～１００ミクロン又は５～５０ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有するマイクロチャネルを形成するプロセスの結果として、マイクロチャネルは、パターニングから得られたものなどの直線チャネル及び／又は均一に配置されたチャネルではない。
【0045】
特定の態様では、本開示の生体適合性ゲルマトリックスは、マトリックスに貫通チャネルを含めるために、中空チューブの周りにマトリックスを固化させることによって導入されるレーザーカットボイド又はボイドを含まない。
【0046】
特定の態様では、複数のセルの大部分は、４０ミクロン以下、３０ミクロン以下、２０ミクロン以下、１０ミクロン以下、５ミクロン以下、１ミクロン以下の距離内にあるか、又は複数のマイクロチャネルのうちの少なくとも１つに直接隣接している。特定の態様では、複数の細胞の大部分は、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、又は８５％以上である。
【0047】
特定の態様では、複数のマイクロチャネルは、５～５００ミクロン、５～１００ミクロン、又は５～５０ミクロンの幅を有する。特定の態様では、複数のマイクロチャネルは円形であり、幅はマイクロチャネルの平均直径を指す。したがって、例えば、マイクロチャネルの直径は、５～１００ミクロンの範囲であってもよい。特定の態様では、複数のマイクロチャネルは、５～３０ミクロン、５～２０ミクロン、１０～３０ミクロン、又は２０～３０ミクロンの幅を有する。
【0048】
特定の態様では、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。特定の態様では、複数のナノチャネルは円形であり、幅はナノチャネルの平均直径を指す。したがって、例えば、ナノチャネルの直径は、１ｎｍ～５００ｎｍ、１ｎｍ～２５０ｎｍ、１ｎｍ～２００ｎｍ、１ｎｍ～１００ｎｍ、１０ｎｍ～１００ｎｍ、又は１ｎｍ～５０ｎｍの範囲であってもよい。
【0049】
複数のマイクロチャネル及びナノチャネルは、ＰＣＬ又は炭化ケイ素などからチャネルを生成するために使用されるものなどのパターニング技術を使用することによってパターン化されず、製造されない。
【0050】
特定の態様では、生体適合性ゲルマトリックスを生成するためのエマルションが提供される。エマルションは、ゲルを形成することができる水溶性材料と生体適合性疎水性物質と任意選択で界面活性剤とを含む水中油型エマルションであり得る。エマルションは、生細胞を更に含んでいてもよい。エマルションを冷却すると、マトリックスが形成され、このマトリックスは、本明細書に記載されるようにマイクロチャネル及びナノチャネルを含む。
【0051】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、水溶性材料、例えばアガロース、例えば、超低ゲル化アガロースで構成されている。特定の態様では、ゲルマトリックスは、コラーゲン、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、アルギネート、セルロース、又はデキストランなどの水溶性材料で構成されている。
【0052】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、平面スキャフォールド、円筒、球体、又は繊維の形状である。例えば、エマルションは、任意の所望の形状のモールドに移され、冷却され、モールドから除去され得る。特定の態様では、モールドは、半透過性限外ろ過膜から形成され得る。特定の態様では、平面スキャフォールドは、直方体形状を有する形状を指す。
【0053】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、少なくとも１ｃｍ３～約１０，０００ｃｍ３の体積を含む。例えば、ゲルマトリックスは、１ｃｍ３～１０００ｃｍ３、１０ｃｍ３～約１０，０００ｃｍ３、又は１０ｃｍ３～約１０００ｃｍ３の体積を有し得る。特定の態様では、ゲルマトリックスは、１ｃｍ２～１０００ｃｍ２、例えば、１ｃｍ２～５０ｃｍ２、１０ｃｍ２～１００ｃｍ２、１０ｃｍ２～５０ｃｍ２、又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲の表面積を含む。
【0054】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、少なくとも１００個の細胞、例えば、１０００個の細胞、１０，０００個の細胞、１００，０００個の細胞、１０６個の細胞、１０８個の細胞、１０１０個の細胞、１０１２個の細胞、１０１４個の細胞、又はそれ以上を含む。特定の態様では、細胞は、マトリックス中に均一に分散されていてもよい。特定の態様では、細胞は、単一細胞又は細胞のクラスターであってもよい。特定の態様では、細胞は、インスリン産生細胞である。特定の態様では、インスリン産生細胞は、幹細胞の分化に由来する。特定の態様では、インスリン産生細胞は、膵島から単離された膵細胞である。特定の態様では、インスリン産生細胞は、膵臓から単離された膵島にあり、膵島は、マトリックス中にカプセル化されている。特定の態様では、膵島は各々、約１０００個の細胞、例えば、５００～５０００個の細胞又は８００～１５００個の細胞を含む。特定の態様では、各膵島は、約１００ミクロン、例えば、５０～２００ｍｍ、５０～１５０ｍｍ、８０～２００ｍｍ、８０～１５０ｍｍ、又は９０～１２５ｍｍの直径を有する。特定の態様では、インスリン産生細胞は、幹細胞由来の濃縮βクラスター（ｅＢＣ）中にある。特定の態様では、各ｅＢＣは、約１０００個の細胞、例えば、５００～５０００個の細胞又は８００～１５００個の細胞を含む。特定の態様では、各ｅＢＣは、約１００ミクロン、例えば、５０～２００ｍｍ、５０～１５０ｍｍ、８０～２００ｍｍ、８０～１５０ｍｍ、又は９０～１２５ｍｍの直径を有する。
【0055】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％が、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも３０日間、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、又はそれ以上生存可能である。
【0056】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％が、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、又は最大６ヶ月間生存可能である。
【0057】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％が、少なくとも１日間、少なくとも１０日間、少なくとも３０日間、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、又はそれ以上生存可能かつ機能的である。
【0058】
特定の態様では、マイクロチャネルは、複数の細胞への栄養素の流れを可能にし、マトリックス中にカプセル化された複数の細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％が、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、又は最大６ヶ月間生存可能かつ機能的である。
【0059】
特定の態様では、細胞は、インスリン産生細胞であり、細胞をグルコースに曝露し、インスリン産生を測定することによって、細胞の機能を評価する。特定の態様では、細胞は、マトリックスを通して血液を流すことによってインスリンに曝露される。
【0060】
特定の態様では、生体適合性ゲルマトリックスは、最初にエマルションを形成することなく形成された生体適合性ゲルマトリックスが有意な数のマイクロチャネルを含まないため、エマルションを形成することなく形成された生体適合性ゲルマトリックスよりも高い透水性を有する。実施例の項で説明されるように、マイクロチャネルは、疎水性物質の使用によって形成された気泡から形成され、この気泡はマトリックスの形成中にエマルションの冷却中に合体する。
【0061】
特定の態様では、ゲルマトリックスは、冷却時にゲルを形成することができる水溶性物質を含む。そのような物質の例としては、アガロース及びコラーゲンが挙げられる。特定の態様では、ゲルマトリックスは、アルギネート、アルギネート誘導体、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、マトリゲル、天然多糖類、合成多糖類、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファジン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アルキレンオキシド）、変性スチレンポリマー、プルロニックポリオール、ポリオキサマー、ポリ（ウロン酸）、又はポリ（ビニルピロリドン）ポリマーポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡポリマー、ポリエステル、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＭ）、ポリ（アクリレート）、ポリエチレングリコール、フィブリン、ＰＣＬ、及びポリ（メチルメタクリレート）及び上記のいずれかのコポリマー又はグラフトコポリマーを含まない。
【0062】
本明細書で使用される場合、ゲルという用語は、水と、水溶性物質とを含むマトリックスを指し、水溶液に溶解した後、特定の温度未満で冷却すると、ゲル又はマトリックスを形成するものである。水溶性物質は、親水性で膨潤性であり、架橋を形成してゲルを作製する。ゲルは、形成後、水溶性物質が硬化してゲルを形成する温度よりも高い温度にゲルを曝露することによって、溶解することができる。
【0063】
本明細書に記載されるマトリックス、スキャフォールド、及びデバイスに含まれ得る細胞には、骨髄細胞；間葉系幹細胞、間質細胞、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞若しくは胚性幹細胞）、血管細胞、脂肪組織に由来する前駆細胞、骨髄由来の前駆細胞、腸細胞、膵島、セルトリ細胞、β細胞、膵島の前駆細胞、β細胞の前駆細胞、末梢血前駆細胞、成体組織から単離された幹細胞、網膜前駆細胞、心筋前駆細胞、骨前駆細胞、神経前駆細胞、及び遺伝的に形質転換された細胞、又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。細胞の集団は、対象由来（自家細胞）、別のドナー由来（同種他家細胞）、又は他の種由来（異種細胞）であり得る。細胞をマトリックスに導入することができ、マトリックスを即座に（１日以内に）対象に移植してもよいか、又は細胞を、移植前に細胞増殖を可能にするために、より長い期間、例えば１日を超えて培養してもよい。
【0064】
特定の実施形態では、マトリックス中の細胞の集団は、幹細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞の集団は、膵臓前駆細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞の集団は、膵島から単離された膵細胞である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞の集団は、膵臓から単離された膵島である。特定の実施形態では、マトリックス中の細胞集団は、ランゲルハンス島などの組織片の形態であり得、これは、デバイスを受ける対象又は別の対象から単離されたものであってもよい。
【0065】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるデバイスは、１型糖尿病などの糖尿病を有する人を処置するために使用されてもよい。デバイスは、膵島細胞を含んでもよく、又はインスリン産生膵細胞に分化することができる幹細胞を含んでもよい。特定の実施形態では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、デバイス内でインスリン産生膵細胞に分化されてもよく、次いで、分化したインスリン産生膵細胞を含む生体人工デバイスは、対象に（例えば、腹膜に、膵臓若しくは肝臓に隣接して、腎臓、肺、若しくは心臓に隣接して、又は皮下、例えば、腕若しくは腹部に）据え付けられる。場合によっては、デバイスは、ＰＳＣを含み得、デバイスは、対象の膵臓又は肝臓に隣接して移植され得る。
【0066】
特定の態様では、本明細書に開示される生体適合性ゲルマトリックスを含む平面スキャフォールドを含む生体人工限外ろ過デバイスが提供される。デバイスは、平面スキャフォールドの第１の表面に配置された第１の半透過性限外ろ過膜と、平面スキャフォールドの第１の表面に隣接し、かつ第１の半透過性限外ろ過膜を介して平面スキャフォールドと流体連通し、かつ入口及び出口を含む、第１のコンパートメントと、平面スキャフォールドの第２の表面に隣接し、かつ出口を含む、第２のコンパートメントと、を含み、第１の半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、第１の半透過性限外ろ過膜は、第１のコンパートメントからマトリックスへの限外ろ過液の輸送を可能にし、限外ろ過液は、マトリックスを通って第２のコンパートメントへと横断する。
【0067】
特定の態様では、本デバイスは、平面スキャフォールドの第２の表面に配置された第２の半透過性限外ろ過膜を更に含み、限外ろ過液は、第２の半透過性限外ろ過膜を横切って複数のマイクロチャネルから第２のコンパートメントに横断する。
【0068】
特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含む。特定の態様では、第１及び第２の半透過性限外ろ過膜は、０．１ミクロン～２ミクロン、０．２ミクロン～０．５ミクロン、２０ｎｍ～２ミクロン、又は２０ｎｍ～５０ｎｍの範囲範囲の幅を有する複数の細孔を含む。
【0069】
特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも大きい幅を有する複数の細孔を備える。
【0070】
特定の態様では、第１のコンパートメントの入口は、任意選択で、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、血管は、対象の動脈である。特定の態様では、第１のコンパートメントの出口は、任意選択で、対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、血管は、対象の静脈又は対象の動脈である。特定の態様では、出口に接続された動脈は、入口に接続された動脈と同じ動脈である。特定の態様では、第２のコンパートメントの出口は、（ｉ）対象の血管に接続するためのチューブに取り付け可能であり、任意選択で、限外ろ過液を、対象の１つ以上の血管、（ｉｉ）対象の１つ以上の静脈、（ｉｉｉ）対象の１つ以上の動脈、及び／又は（ｉｖ）分析物分析デバイスに提供する。
【0071】
特定の態様では、第１の半透過性限外ろ過膜の厚さは、０．１ミクロン～１００ミクロン又は０．５ミクロン～１０ミクロンの範囲である。
【0072】
特定の態様では、平面スキャフォールドの第１及び／又は第２の表面の表面は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲である。特定の態様では、第１の半透過性限外ろ過膜における表面積は、１ｃｍ２～１００ｃｍ２又は１５ｃｍ２～３０ｃｍ２の範囲である。
【0073】
特定の態様では、複数の細孔は、円形の形状をしており、ここで、幅は、細孔の直径を指す。特定の態様では、複数の細孔はスリット形状である。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の幅は、５ｎｍ～５００ｎｍ、５ｎｍ～４００ｎｍ、５ｎｍ～３００ｎｍ、５ｎｍ～２００ｎｍ、５ｎｍ～１００ｎｍ、又は５ｎｍ～５０ｎｍである。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の長さは、０．１ミクロン～５ミクロンの範囲である。特定の態様では、複数の細孔は、スリット形状であり、細孔の長さは、１μｍ～３μｍの範囲内であり、細孔の幅は、５ｎｍ～１００ｎｍである。特定の態様では、デバイス内の細胞は、対象に対して自家由来であるか、対象に対して異種由来であるか、又は対象に対して同種異系由来である。
【0074】
特定の態様では、本明細書に開示されるマトリックスを含む平面スキャフォールドを含む生体人工限外ろ過デバイスが提供される。本デバイスは、平面スキャフォールドの第１の表面に配置された本明細書に開示されるような第１の半透過性限外ろ過膜と、第２の表面に配置された本明細書に開示されるような第２の半透過性限外ろ過膜と、第１の入口及び第１の出口を含む第１のコンパートメントであって、第１のコンパートメントは平面スキャフォールドの第１の表面に隣接している、第１のコンパートメントと、第２の入口及び第２の出口を含む第２のコンパートメントであって、第２のコンパートメントは平面スキャフォールドの第２の表面に隣接している、第２のコンパートメントと、を含み、第１の入口は、対象の動脈に接続するように構成され、第１の出口は、第２のコンパートメントの第２の入口に接続され、第２のコンパートメントの第２の出口は、対象の静脈に接続するように構成され、半透過性限外ろ過膜は、５ｎｍ～５ミクロンの範囲の幅を有する複数の細孔を含み、第１の半透過性限外ろ過膜は、第１のコンパートメントからスキャフォールドへの限外ろ過の輸送を可能にし、第２の半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールド内の複数のマイクロチャネルから第２のコンパートメントへの限外ろ過液の輸送を可能にする。特定の態様では、デバイス内の細胞は、対象に対して自家由来であるか、対象に対して異種由来であるか、又は対象に対して同種異系由来である。特定の態様では、第２の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも大きい幅を有するか、又は第２の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔は、第１の半透過性限外ろ過膜における複数の細孔の幅よりも小さい幅を有する。
【0075】
場合によっては、血液がデバイスに導入される第１のコンパートメントは、血液の限外ろ過を容易にするのに適した寸法を有し得る。例えば、第１のコンパートメントは、１００ミクロン～６ｍｍ、例えば、５００ミクロン～４ｍｍ、１ｍｍ～３ｍｍ、又は２ｍｍ～３ｍｍの高さを有し得る。
【0076】
特定の実施形態では、生体人工デバイスは、対象の体腔に適合するように寸法決めされる。デバイスは、矩形又は円筒の形状であってもよい。特定の場合では、本デバイスは、５０ｃｍ２以下、例えば１０～３０ｃｍ２、１０～２５ｃｍ２、１５～２５ｃｍ２、２０～２５ｃｍ２、１５～３０ｃｍ２の表面積を有し得る。特定の場合では、本デバイスは、矩形であり得、３ｃｍ～１０ｃｍの長さ、１ｃｍ～６ｃｍの幅、及び０．３ｃｍ～２ｃｍの高さ、例えば３ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ～６ｃｍ×４ｃｍ×１ｃｍの寸法（長さ×幅×高さ）、例えば、３ｃｍ×１ｃｍ×０．５ｃｍ、５ｃｍ×２ｃｍ×１ｃｍ、又は６ｃｍ×４ｃｍ×１ｃｍの寸法を有する。
【0077】
本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるデバイスは、移植された細胞を、機能的かつ生存可能な状態で、少なくとも１ヶ月間かつ最大で少なくとも２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、３年、５年、１０年、又は最大５０年、又はそれ以上、例えば１ヶ月～５０年、１年～２５年、５年～５０年、５年～２５年、１０年～５０年、又は１５年～２５年の期間にわたって維持し得る。
【0078】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるデバイスは、対象に据え付けられときに分解又は腐敗しない不活性材料から作られたハウジングにカプセル化され得る。対象に配置される医療用具として承認された任意の材料を利用することができ、医療グレードのプラスチック、不活性金属、例えばチタン、ステンレス鋼などが含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
特定の実施形態では、生体人工デバイスは、２つ以上の半透過性限外ろ過膜を含む。特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜は、平面スキャフォールドの第１の表面及び第２の表面に配置される。スキャフォールドの第１の表面に配置された半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドの第２の表面に配置された半透過性限外ろ過膜と同じであってもよいし、異なっていてもよい。例えば、動脈血を含むコンパートメントに隣接する半透過性限外ろ過膜は、マトリックス中のチャネルを通って流れる限外ろ過液を含むコンパートメントに隣接する半透過性限外ろ過膜よりも小さい細孔を有し得る。場合によっては、動脈血を含むコンパートメントに隣接する半透過性限外ろ過膜は、マトリックス中のチャネルを通って流れる限外ろ過液を含むコンパートメントに隣接する半透過性限外ろ過膜よりも大きな細孔を有し得る。特定の実施形態では、半透過性膜は、動脈血を含むコンパートメントからの限外ろ過液のろ過を可能にし、限外ろ過液は、スキャフォールド内の複数のマイクロチャネルに輸送される。複数のマイクロチャネルは細胞に隣接しており、これにより、マイクロチャネル内の限外ろ過液中の分子と、細胞によって放出された分子との効率的な交換を提供する。これらの分子は、マイクロチャネルの管腔と細胞を取り囲むマトリックスとの間で濃度依存的に拡散する。例えば、酸素、グルコース、脂質、ビタミン、及びミネラルなどの分子は、チャネルの内腔からマトリックスに拡散し、尿素、二酸化炭素、インスリンなどの細胞によって分泌される分子は、マイクロチャネルの内腔に輸送される。いくつかの実施形態では、限外ろ過液中の分子の拡散及び交換は、例えば、限外ろ過液がマイクロチャネルに入らず、例えばナノチャネルを介してマトリックスを透過するなど、マイクロチャネルの外側で起こり得ることが理解される。
【0080】
特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜は、生体液のろ過のために構成される。特定の実施形態では、膜は、複数のナノポアを含み、細孔の形状及びサイズが制御される。特定の実施形態では、膜は、複数の細孔を含む。特定の実施形態では、複数の細孔は、マイクロポアであってもよく、０．１μｍ～５μｍ、例えば、０．１μｍ～３μｍ、０．１μｍ～０．５μｍ、０．５μｍ～１μｍ、１μｍ～１．５μｍ、１．５μｍ～２μｍ、０．１μｍ～１μｍ、０．１μｍ～０．８μｍ、０．２μｍ～０．７μｍ、０．２μｍ～０．６μｍ、０．２μｍ～０．５μｍの範囲の幅を有し得る。特定の実施形態では、複数の細孔は、ナノポアであってもよく、１ｎｍ～５００ｎｍ、例えば、１ｎｍ～９０ｎｍ、２ｎｍ～５０ｎｍ、３ｎｍ～４０ｎｍ、４ｎｍ～５０ｎｍ、４ｎｍ～４０ｎｍ、５ｎｍ～５０ｎｍ、５ｎｍ～２０ｎｍ、４ｎｍ～２０ｎｍ、７ｎｍ～１００ｎｍ、１２ｎｍ～２０ｎｍ、又は５ｎｍ～１０ｎｍの幅を有し得る。特定の実施形態では、複数の細孔は、スリット形状であり、本明細書に列挙される幅を有し、１μｍ～１０μｍ、例えば、２μｍ～３μｍ、３μｍ～４μｍ、４μｍ～５μｍ、５μｍ～６μｍ、６μｍ～７μｍ、７μｍ～８μｍ、８μｍ～９μｍ、又は９μｍ～１０μｍの範囲の長さを有する。特定の場合では、長方形の細孔は、１００～１０００ｎｍの深さ、３ｎｍ～５０ｎｍの幅、及び１ミクロン～５ミクロンの長さ、例えば、５ｎｍ～５０ｎｍ×１ミクロン～２ミクロン×２００ｎｍ～５００ｎｍの幅×長さ×深さを有する。
【0081】
特定の実施形態では、本開示のデバイスは、６ｍｍ×６ｍｍ、５ｍｍ×５ｍｍ、７ｍｍ×７ｍｍ、８ｍｍ×８ｍｍ、９ｍｍ×９ｍｍ、１０ｍｍ×１０ｍｍ、１０ｃｍ×１０ｃｍ、例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍ～１０ｃｍ×１０ｃｍの寸法（長さ×幅）を有する半透過性限外ろ過膜を含む。いくつかの実施形態では、半透過性限外ろ過膜は、矩形であり得る。特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜は、０．５～１００ｃｍ２、例えば、３０～１００ｃｍ２、１０～３０ｃｍ２、１５～３０ｃｍ２、１５～２０ｃｍ２、２０～２５ｃｍ２、２５～３０ｃｍ２、０．５～１０ｃｍ２、０．７５～５ｃｍ２、０．７５～３ｃｍ２、又は０．７５～２ｃｍ２の範囲の表面積を有する。
【0082】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるデバイスは、実質的に平面であってもよく、２０～１００ｃｍ２（各平面側）の範囲の表面積及び１ｃｍ～３ｃｍの厚さを有するように寸法決定されてもよい。特定の実施形態では、本明細書に開示されるデバイスは、最大５００ｃｍ３、例えば５０～５００ｃｍ３、１００～５００ｃｍ３、１００～３００ｃｍ３、１００～１５０ｃｍ３の体積を有し得る。特定の場合では、本デバイスは、５～７５ｃｍ２、例えば、５～５０ｃｍ２、１０～３０ｃｍ２、又は１５～３０ｃｍ２の表面を有する半透過性膜を含み得る。膜における細孔のサイズは、１０ｎｍ～１００ｎｍ、例えば１０ｎｍ～２０ｎｍの幅であり得る。
【0083】
本開示の半透過性限外ろ過膜は、生体液のろ過に使用するのに適した任意の膜材料を含み、膜は、構造的に細孔の形成を支持することができる。適切な膜材料の例は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【0084】
特定の実施形態では、膜材料は、合成、生物学的、及び／又は生体適合性である（例えば、体外又は体内で使用するため）。材料には、生体適合性のあるシリコン、コーティングされたシリコン材料、ポリシリコン、炭化ケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）、二酸化ケイ素、ＰＭＭＡ、ＳＵ－８、及びＰＴＦＥが含まれるが、これらに限定されない。他の可能な材料には、金属（例えば、チタン）、セラミック（例えば、シリカ又は窒化シリコン）、及びポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、及びシリコーン）が含まれる。膜用の材料は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３１８５８号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0085】
本開示の半透過性限外ろ過膜は、複数の細孔を含み、細孔の形状は、線形、正方形、長方形（スリット形）、円形、卵形、楕円形、又は他の形状を含む。本明細書で使用される場合、細孔の幅とは、細孔が円形、卵形、又は楕円形である場合の直径を指す。特定の実施形態では、膜は、単一の形状又は形状の任意の組み合わせを含む細孔を含む。特定の実施形態では、細孔のサイズは高度に均一である。特定の実施形態では、細孔は、スリット形状の細孔の寸法間に２０％未満のサイズ変動、１０％未満のサイズ変動、又は５％未満のサイズ変動が存在するように微細加工される。特定の実施形態では、適切な細孔のサイズ及び形状を決定する要因には、透水性と溶質透過選択性との間のバランスが含まれる。特定の実施形態では、複数の細孔は、膜を横切る分子の効率的な輸送を可能にする最適なフラックス効率を提供するスリット形状の細孔である。特定の実施形態では、膜は、スリット形状のナノポアを含む。特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜は、例えば、１ｃｍ２、０．５ｃｍ２、又は０．４ｃｍ２の膜表面積上に、約１０３～１０８個の長方形のスリット形状のナノポア（例えば、１０４～１０８個、又は１０５～１０７個）を有する。特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜上のスリット形状のナノポアの数は、膜が毛細血管灌流圧で生理学的に十分な限外ろ過体積を生成することを可能にするのに十分である。特定の実施形態では、半透過性限外ろ過膜の空隙率は、約１％～５０％、例えば、１０％～５０％、２０％～５０％、又は２０％～７５％などである）。
【0086】
使用する方法
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるような生体人工限外ろ過デバイスを対象に接続することを含み得、接続することは、第１のコンパートメントの入口を対象の動脈に接続し、第１のコンパートメントの出口を対象の血管に接続することと、第２のコンパートメントの出口を対象の血管又は体腔に接続するか、又は第２のコンパートメントの出口を分析物分析デバイスに接続することと、を含む。
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるような生体人工限外ろ過デバイスを対象に接続することを含み得、接続することは、第１のコンパートメントの入口を対象の動脈に接続し、第１のコンパートメントの出口を対象の血管に接続することと、第２のコンパートメントの出口を対象の血管又は体腔に接続するか、又は第２のコンパートメントの出口を分析物分析デバイスに接続することと、を含む。
【0087】
細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスの提供を必要とする対象に、細胞を含む生体人工限外ろ過デバイスを提供する方法が開示される。本方法は、本明細書に開示されるような生体人工限外ろ過デバイスを対象に接続することを含み得、接続することは、第１の入口を対象の動脈に接続することと、第２の出口を対象の静脈に接続することと、を含む。
【0088】
特定の態様では、本方法は、対象にインスリンを提供することを含み、細胞はインスリン産生細胞を含む。特定の態様では、生体人工デバイスの接続を必要とする対象に生体人工デバイスを接続することは、スキャフォールド内の細胞の生存率の増加をもたらす。特定の態様では、限外ろ過液は、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含む。特定の態様では、限外ろ過液は、グルコース及び酸素のうちの１つ以上を含み、インスリン産生細胞は、限外ろ過液中のグルコースの存在に応答してインスリンを排出し、複数のマイクロチャネルは、インスリンを第２のコンパートメントに輸送する。
【0089】
特定の態様では、排出されたインスリンは、スキャフォールド内の複数のマイクロチャネルに輸送される。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへの免疫系成分の通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへの抗体の通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへのサイトカインの通過を防止する。特定の態様では、半透過性限外ろ過膜は、スキャフォールドへのＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／又はＩＬ－１βの通過を防止する。特定の実施形態では、本開示の生体人工デバイスは、対象の血液からデバイス内の細胞への栄養素の輸送を可能にしながら、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／又はＩＬ－１βの通過を減少させることができる。特定の実施形態では、本開示の生体人工デバイスは、免疫系の構成要素（例えば、免疫細胞、抗体、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、及び／又はＩＬ－１β）の通過を少なくとも５０％（例えば、６０％～８０％）減少させることができる。特定の実施形態では、本開示の生体人工デバイスは、ナノポアを有する半透過性限外ろ過膜を有する（例えば、本開示の生体人工デバイスは、処置を必要とする対象の処置のために、生体人工デバイス内の細胞の有効数を収容するようなサイズである。例えば、対象は、機能細胞の欠如によって引き起こされる症状、例えば、機能細胞によって通常分泌される分子が分泌されないか、又は症状をもたらすレベルで分泌される症状に罹患していてもよい。本開示の生体人工デバイス内に機能細胞を提供することで、症状を緩和することができる。例示的な症状としては、１型糖尿病、パーキンソン病、筋ジストロフィーなどが挙げられる。
【0090】
本デバイスは、皮下、腹腔内、又は脳、脊髄、膵臓、肝臓、子宮、皮膚、膀胱、腎臓、筋肉などの体内の任意の適切な場所に移植され得る。移植部位は、処置を必要とする疾患／損傷組織に基づいて選択することができる。糖尿病（ＤＭ）などの疾患の処置のために、本デバイスは、皮下腔又は腹膜などの臨床的に好都合な部位に据え付けられてもよい。デバイスは、本明細書に記載されるように対象の血管系に接続され得る。場合によっては、本デバイスは、血管移植片にインラインで接続され得る。場合によっては、本デバイスは、対象に接続されて、限外ろ過液を、対象の動脈、静脈、体腔（例えば、腹腔）、又はそれらの組み合わせに供給し得る。場合によっては、本デバイスは、カテーテルに接続されて、カテーテルが接続された静脈に限外ろ過液を供給する。
【0091】
本明細書に開示される方法及びデバイスは、ヒト臨床及び獣医学的用途の両方に使用することができる。したがって、生体人工デバイスが投与される対象又は患者は、ヒトであってもよく、又は獣医学的用途の場合には、実験動物、農業動物、家畜、若しくは野生動物であってもよい。主題のデバイス及び方法は、ヒト、サル及びチンパンジーなどの実験動物、イヌ及びネコなどの家畜、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの農業動物、並びにクマ、パンダ、ライオン、トラ、ヒョウ、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、及びクジラなどの飼育下の野生動物を含むが、これらに限定されない動物に適用することができる。
【0092】
動作中、血液は、患者の血管系（すなわち、動脈）から生体人工デバイスの第１のコンパートメントの入口に送られる。血液は、生体人工デバイスの第１のコンパートメントを通って流れ、血液からの栄養素及び小分子は、半透過性限外ろ過膜を通過し、一方、血液内の免疫グロブリン及びサイトカインなどの大分子は、デバイス内の細胞との接触が妨げられる。栄養素及び小分子には、グルコース、酸素、及びインスリンが含まれるが、これらに限定されない。半透過性限外ろ過膜を通過する小分子及び栄養素をろ過して、細胞の集団を含むデバイスのマトリックスに接触する限外ろ過液を形成する。特定の実施形態では、細胞集団がインスリンを限外ろ過液に放出する。次いで、限外ろ過液は、マトリックスの限外ろ過チャネルを通過し、マトリックスは、次いで、第２の半透過性限外ろ過膜を通過する。任意選択で、第２のコンパートメントの出口は、カテーテルに接続するように構成され得る。特定の実施形態では、カテーテルは第２の静脈に接続する。
【0093】
本開示のデバイスは、血流の生理学的速度で１～１５ｍｌ／分の速度で限外ろ過液を生じさせる高い限外ろ過速度を提供する。
【0094】
作製方法
特定の態様では、本明細書に開示される生体適合性ゲルマトリックスを作製する方法が提供される。生体適合性ゲルマトリックスは、アガロース、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースなどの水溶性ゲル形成材料から生成され得、かつ複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルを含み、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではなく、複数のマイクロチャネルは、５～１００ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。
特定の態様では、本明細書に開示される生体適合性ゲルマトリックスを作製する方法が提供される。生体適合性ゲルマトリックスは、アガロース、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースなどの水溶性ゲル形成材料から生成され得、かつ複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルを含み、複数のマイクロチャネル及び複数のナノチャネルは、パターン化されたマイクロチャネル及びナノチャネルではなく、複数のマイクロチャネルは、５～１００ミクロンの幅を有し、複数のナノチャネルは、１ｎｍ～５００ｎｍの幅を有する。
【0095】
特定の態様では、本方法は、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースを水溶液に溶解させることと、生体適合性疎水性物質及び界面活性剤を水溶液に添加することと、水溶液を、溶解したアガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロース、生体適合性疎水性物質及び界面活性剤を含むエマルションを生成するのに十分な条件下で混合することと、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースのゲル化を可能にするのに十分な温度にエマルションを置くことによってマトリックスを生成し、それによってマトリックスを作製することと、を含む。特定の態様では、本方法は、マトリックスを生成するステップの前に、細胞をエマルションに添加することを更に含み得る。
【0096】
特定の態様では、水溶性ゲル形成材料を水溶液に溶解することは、水溶性ゲル形成材料と緩衝液又は平衡塩溶液との溶液を混合、例えば撹拌することを含み得る。特定の態様では、溶解はまた、混合ステップの前、間、及び／又は後に溶液に熱を加えることを含み得る。
【0097】
特定の態様では、生体適合性疎水性物質及び界面活性剤を水溶液に添加し、混合することは、水溶性ゲル形成材料の溶液と生体適合性疎水性物質との溶液を混合し、その溶液を３７℃の温度に加熱し、約３００ＲＰＭ（例えば、１００～５００ＲＰＭ）で撹拌し、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ２０）を添加し、一定期間撹拌するステップを含み得る。溶液を、より高い速度、例えば、５００ＲＰＭよりも高い速度（例えば、６００～１０００ＲＰＭよりも高い速度）で撹拌して、エマルションを作製してもよい。
【0098】
アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースのゲル化を可能にするのに十分な温度にエマルションを置くことによってマトリックスを生成するステップは、水溶性ゲル形成材料のゲル化に十分な期間、室温（例えば、２５℃）及び／又は４℃にエマルションを置くことを含み得る。
【0099】
特定の態様では、マトリックスを生成することは、平面を含むモールドにエマルションをキャストし、それによって平面スキャフォールドを作製することを含む。特定の態様では、本方法は、平面スキャフォールドの第１の表面に第１の半透過性限外ろ過膜を配置することを更に含む。特定の態様では、本方法は、第２の半透過性限外ろ過膜を平面スキャフォールドの第２の表面に配置することを更に含む。
【0100】
特定の態様では、アガロースは、超低ゲル化アガロースである。特定の態様では、アガロースは、水溶液中に１％～１０％ｗ／ｖ、２％～１０％ｗ／ｖ、２％～８％ｗ／ｖ、又は３％～６％ｗ／ｖの濃度で存在する。特定の態様では、アガロースを溶解することは、水溶液を約３７℃の温度に加熱し、溶液を約３００回転／分（ＲＰＭ）で撹拌することを含む。特定の態様では、エマルションを作製することは、溶液を約５００～１０００ＲＰＭで撹拌することを含む。特定の態様では、マトリックスを生成することは、アガロース、ゼラチン、ポリエチレングリコール、ＰＣＬ、コラーゲン、アルギネート、デキストラン、又はセルロースがゲルを形成する温度までエマルションを冷却することを含む。
【0101】
特定の態様では、生体適合性疎水性物質は、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）などの水不混和性試薬である。特定の態様では、アガロース溶液、ＰＦＤ溶液、及び界面活性剤溶液は、約６３％～６５％（ｖ／ｖ）のアガロース溶液、約３２％～３３％（ｖ／ｖ）のＰＦＤ、及び約５％～２％（ｖ／ｖ）の界面活性剤で組み合わされる。
【0102】
特定の態様では、マトリックスは、水不混和性試薬を溶解して水不混和性試薬を除去する溶媒で洗浄され得る。特定の態様では、マトリックスは、界面活性剤を除去するために水溶液で洗浄され得る。特定の態様では、マトリックスは、水不混和性試薬及び界面活性剤を除去するために、疎水性材料と水溶液との混合物で洗浄され得る。
【0103】
実験
上記で提供される開示から理解され得るように、本開示は、多種多様な用途を有する。したがって、以下の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。当業者であれば、本質的に同様の結果を得るために変更又は修正可能な様々な非重要なパラメータを容易に認識するであろう。したがって、以下の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提出されるものであり、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、寸法など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、若干の実験誤差及び逸脱は考慮されるべきである。
上記で提供される開示から理解され得るように、本開示は、多種多様な用途を有する。したがって、以下の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。当業者であれば、本質的に同様の結果を得るために変更又は修正可能な様々な非重要なパラメータを容易に認識するであろう。したがって、以下の実施例は、本発明の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提出されるものであり、本発明者が本発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、寸法など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、若干の実験誤差及び逸脱は考慮されるべきである。
【0104】
材料及び方法
ＳＰＡスキャフォールドの作製
超多孔性化アガロース（ＳＰＡ）スキャフォールドを、超低ゲル化アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ａ２５７６）を５ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＡＪ００２）に溶解し、ビーカーに３％又は６％ｗ／ｖ溶液を作ることによって構築した。溶液を、マイクロ波で加熱し、各サイクル間で穏やかに混合する５つの短いサイクルで更に溶解した。次いで、アガロース溶液をホットプレート上で３７℃に加熱し、毎分３００回転（ＲＰＭ）で撹拌した。次いで、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｐ９９００）及びＴｗｅｅｎ（商標）８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｐ４７８０）をアガロース溶液に添加して、アガロース（６４％、ｖ／ｖ）、ＰＦＤ（３３％、ｖ／ｖ）、及びＴｗｅｅｎ（商標）８０（３％、ｖ／ｖ）からなるエマルションを作製した。ＰＦＤは、その生体適合性及び類似の環状構造を持つことから、水不混和性溶媒としてシクロヘキサンの代わりに選択した［１］。次いで、ビーカーをパラフィルム（Ｂｅｍｉｓ Ｃｏ．，Ｉｎｃ）で密封し、７５０ｒｐｍで約１０分間撹拌して完全に混合し、その濁った色によって示されるように乳化した。
ＳＰＡスキャフォールドの作製
超多孔性化アガロース（ＳＰＡ）スキャフォールドを、超低ゲル化アガロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ａ２５７６）を５ｍＬのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＡＪ００２）に溶解し、ビーカーに３％又は６％ｗ／ｖ溶液を作ることによって構築した。溶液を、マイクロ波で加熱し、各サイクル間で穏やかに混合する５つの短いサイクルで更に溶解した。次いで、アガロース溶液をホットプレート上で３７℃に加熱し、毎分３００回転（ＲＰＭ）で撹拌した。次いで、ペルフルオロデカリン（ＰＦＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｐ９９００）及びＴｗｅｅｎ（商標）８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ｐ４７８０）をアガロース溶液に添加して、アガロース（６４％、ｖ／ｖ）、ＰＦＤ（３３％、ｖ／ｖ）、及びＴｗｅｅｎ（商標）８０（３％、ｖ／ｖ）からなるエマルションを作製した。ＰＦＤは、その生体適合性及び類似の環状構造を持つことから、水不混和性溶媒としてシクロヘキサンの代わりに選択した［１］。次いで、ビーカーをパラフィルム（Ｂｅｍｉｓ Ｃｏ．，Ｉｎｃ）で密封し、７５０ｒｐｍで約１０分間撹拌して完全に混合し、その濁った色によって示されるように乳化した。
【0105】
次いで、完全に混合された超多孔性アガロースエマルションを、３１６Ｌステンレス鋼製細胞スキャフォールドハウジングにキャストした。実験が細胞を含む場合、３６ｕＬのエマルションを、細胞スキャフォールドハウジングにキャストする前に、所望の数の細胞と混合した。ゲル化を達成するために、スキャフォールドを室温（２５℃）で２０分間置き、その後に４℃で１０分間冷却した。ゲル化されたスキャフォールドは、ＰＦＤ液滴によって作り出された対流孔と、アガロースの本来の微細構造内に既に存在する拡散孔とから構成される（図１Ａ）。次いで、スキャフォールド（図１Ｂ）を血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイス（図１Ｃ）に挿入した。全てのインビトロ試験では、我々のグループによって以前に開発された対流性物質輸送下での膵島カプセル化用のｉＢＡＰデバイスプロトタイプを使用した（図１Ｄ）［２］。
【0106】
図１Ａ～１Ｄは、ＳＰＡスキャフォールド及び血管内生体人工膵臓（ｉＢＡＰ）デバイスアセンブリを示す。図１Ａは、アガロース中の対流孔及び拡散孔を示すＳＰＡスキャフォールドの概略断面図を提示する。図１Ｂは、膵島チャンバハウジング内のＳＰＡスキャフォールドを提示する。図１Ｃは、ｉＢＡＰの構成要素である流路、シリコンナノポア膜（ＳＮＭ）、細胞チャンバ内の細胞スキャフォールド、及びポリカーボネート（ＰＣ）裏面及び限外ろ過液出口の分解図を示す。図１Ｄは、インビトロ試験に使用されるアセンブルされたｉＢＡＰを示す。
【0107】
透水性測定
ＳＰＡ細胞スキャフォールドの透水性のみを試験するために、ｉＢＡＰプロトタイプをＳＮＭなしでアセンブルし、カスタムフロー回路に接続した（図２）。Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ２５チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を、デバイスの入口及び出口の両方に接続した。蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）がデバイス内のクロスフロー速度を制御した。圧力計（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）をチューブと直列に配置して、スキャフォールドを横断する膜貫通圧力（ＴＭＰ）を評価した。限外ろ過液出口をＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ１４チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）に接続した。限外ろ過速度は、スキャフォールド当たり３回測定した、１ｍＬの限外ろ過液を生成するのに必要な時間によって決定した。ＴＭＰ、限外ろ過速度（ＵＦ）、及び表面積（ＳＡ）を使用して、ダルシーの法則（式１）から導かれる式を使用して、透水率（Ｌｐ）を計算した。
ＳＰＡ細胞スキャフォールドの透水性のみを試験するために、ｉＢＡＰプロトタイプをＳＮＭなしでアセンブルし、カスタムフロー回路に接続した（図２）。Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ２５チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を、デバイスの入口及び出口の両方に接続した。蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）がデバイス内のクロスフロー速度を制御した。圧力計（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）をチューブと直列に配置して、スキャフォールドを横断する膜貫通圧力（ＴＭＰ）を評価した。限外ろ過液出口をＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ１４チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）に接続した。限外ろ過速度は、スキャフォールド当たり３回測定した、１ｍＬの限外ろ過液を生成するのに必要な時間によって決定した。ＴＭＰ、限外ろ過速度（ＵＦ）、及び表面積（ＳＡ）を使用して、ダルシーの法則（式１）から導かれる式を使用して、透水率（Ｌｐ）を計算した。
【数1】
【0108】
図２は、ｉＢＡＰ、蠕動ポンプ、及び圧力計からなる透水試験セットアップを示す。目盛り付きシリンジ及びタイマーを使用して、限外ろ過測定を決定した。
【0109】
液滴画像の取得及び分析
イメージングに使用したＳＰＡスキャフォールドは、前述と同じ方法で３％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を用いて調製した。ゲル化後、（ｎ＝３）スキャフォールドを、細菌の成長を防ぐために１０％ホルマリンに固定し、ガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ：Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ）に置いた。タイムラプス広域顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）２０倍レンズでスキャフォールドをイメージングした。Ｚスタック画像を、スキャフォールド上の３つの異なる位置で撮影し、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを使用して分析した。Ｈｏｕｇｈ Ｃｉｒｃｌｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍプラグイン（ＵＣＢ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１スタック当たり３スライス（スキャフォールド当たりｎ＝９画像）上で使用して、スキャフォールド内のＰＦＤ液滴サイズを決定した。次いで、液滴サイズの結果を使用して、液滴の面積を決定し、次いで画像の総面積で除算することによって、相対的な液滴面積を計算した。ＳＰＡバッチ間のばらつきを可視化するために、スキャフォールド当たりの液滴サイズ及び相対液滴面積（％）の結果を平均した。
イメージングに使用したＳＰＡスキャフォールドは、前述と同じ方法で３％（ｗ／ｖ）アガロース溶液を用いて調製した。ゲル化後、（ｎ＝３）スキャフォールドを、細菌の成長を防ぐために１０％ホルマリンに固定し、ガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ：Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ）に置いた。タイムラプス広域顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）２０倍レンズでスキャフォールドをイメージングした。Ｚスタック画像を、スキャフォールド上の３つの異なる位置で撮影し、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを使用して分析した。Ｈｏｕｇｈ Ｃｉｒｃｌｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍプラグイン（ＵＣＢ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１スタック当たり３スライス（スキャフォールド当たりｎ＝９画像）上で使用して、スキャフォールド内のＰＦＤ液滴サイズを決定した。次いで、液滴サイズの結果を使用して、液滴の面積を決定し、次いで画像の総面積で除算することによって、相対的な液滴面積を計算した。ＳＰＡバッチ間のばらつきを可視化するために、スキャフォールド当たりの液滴サイズ及び相対液滴面積（％）の結果を平均した。
【0110】
分解試験
３％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液で作製したＳＰＡ（ｎ＝１５）スキャフォールドを使用して、２８日間静置条件下で分解試験を行った。スキャフォールドを、１０％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００４）を補充した１ｍＬのＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ：３５０１１ＣＶ）を入れた１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌディッシュ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ：ＰＩＸＰ０１２５０）に入れた。実験期間中、スキャフォールドを５％ＣＯ２及び３７℃に維持し、ＦＢＳはウェル内で３～４日ごとに交換した。７日ごとに培養皿から３つのスキャフォールドを取り出し、水和した状態で重量を測定した。
３％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液で作製したＳＰＡ（ｎ＝１５）スキャフォールドを使用して、２８日間静置条件下で分解試験を行った。スキャフォールドを、１０％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＵＣＳＦ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ：ＣＣＦＧＫ００４）を補充した１ｍＬのＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ：３５０１１ＣＶ）を入れた１２ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌディッシュ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ：ＰＩＸＰ０１２５０）に入れた。実験期間中、スキャフォールドを５％ＣＯ２及び３７℃に維持し、ＦＢＳはウェル内で３～４日ごとに交換した。７日ごとに培養皿から３つのスキャフォールドを取り出し、水和した状態で重量を測定した。
【0111】
細胞調達、培養、カプセル化
成人ヒト膵島は、ＵＣＳＦ膵島及び細胞産生施設（Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）及びＰｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）の両方から得た。ＵＣＳＦから単離された膵島を、単離の２４時間以内にＣＭＲＬ１０６６培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ：１５１１０ＣＶ）で輸送した。Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｓからの膵島を洗浄し、ＰＩＭ培地（Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）でインキュベートした。濃縮されたβクラスター（ｅＢＣ）を、前述のように産生した［３］。簡潔に述べると、ＭＥＬ－１ ＩＮＳＧＦＰ／ｗ ｈＰＳＣを、分化誘導因子とともに、２０日間にわたる６つのステージからなる膵臓発生を段階的に再現する方法で培養した。次いで、細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別し、未成熟のβ様細胞を再結合し、更に培養してｅＢＣを形成した。ｅＢＣは、２８日目までに機能的及び生理学的研究の準備ができていた。ｅＢＣをＧＮ９培地（１％のペニシリン－ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ、１：１００ｇｌｕｔａｍａｘ、１：１００ＮＥＡＡ、１０μＭのＡｌｋｉ ＩＩ、０．５ｍＭのＶｉｔＣ、１μＭのＴ３、１ｍＭのシステイン、１０μＭの亜鉛、及び１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充したＣＭＲＬ培地）で輸送した。全ての供給源からの細胞を、カプセル化の前に、５％ＣＯ２及び３７℃で非処理のＴ７５フラスコ内で一晩維持した。３６μＬのＳＰＡに５００個のＩＥＱ又は５００個のｅＢＣ（平均直径１００μｍのクラスター当たり約１０００個の細胞）のいずれかの細胞を、混合ステップの後、３％ＳＰＡエマルションに添加し、前述のようにゲル化させた。
成人ヒト膵島は、ＵＣＳＦ膵島及び細胞産生施設（Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）及びＰｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）の両方から得た。ＵＣＳＦから単離された膵島を、単離の２４時間以内にＣＭＲＬ１０６６培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ：１５１１０ＣＶ）で輸送した。Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｓからの膵島を洗浄し、ＰＩＭ培地（Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）でインキュベートした。濃縮されたβクラスター（ｅＢＣ）を、前述のように産生した［３］。簡潔に述べると、ＭＥＬ－１ ＩＮＳＧＦＰ／ｗ ｈＰＳＣを、分化誘導因子とともに、２０日間にわたる６つのステージからなる膵臓発生を段階的に再現する方法で培養した。次いで、細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって選別し、未成熟のβ様細胞を再結合し、更に培養してｅＢＣを形成した。ｅＢＣは、２８日目までに機能的及び生理学的研究の準備ができていた。ｅＢＣをＧＮ９培地（１％のペニシリン－ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ、１：１００ｇｌｕｔａｍａｘ、１：１００ＮＥＡＡ、１０μＭのＡｌｋｉ ＩＩ、０．５ｍＭのＶｉｔＣ、１μＭのＴ３、１ｍＭのシステイン、１０μＭの亜鉛、及び１０μｇ／ｍｌのヘパリンを補充したＣＭＲＬ培地）で輸送した。全ての供給源からの細胞を、カプセル化の前に、５％ＣＯ２及び３７℃で非処理のＴ７５フラスコ内で一晩維持した。３６μＬのＳＰＡに５００個のＩＥＱ又は５００個のｅＢＣ（平均直径１００μｍのクラスター当たり約１０００個の細胞）のいずれかの細胞を、混合ステップの後、３％ＳＰＡエマルションに添加し、前述のようにゲル化させた。
【0112】
生存率及び組織学
細胞生存を、カプセル化直後に評価した。ゲル化後、共焦点イメージングのために、スキャフォールドをガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ：Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ）に入れた。スキャフォールドを、蛍光スピニングディスク共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でイメージングする前に、生細胞／死細胞染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｌ３２２４）を用いて室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。生存率は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを使用して、全細胞面積から死細胞の面積を差し引き、次いで全細胞面積で除算することによって定量化した［４］。生存率を、ＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島（ｎ＝１１）及びｅＢＣ （ｎ＝７）について平均し、ここで、ｎは、分析されたクラスターの数を指す。非乳化３％アガロースを使用して、ヒト膵島（ｎ＝９）及びｅＢＣ（ｎ＝５）の両方を比較した。
細胞生存を、カプセル化直後に評価した。ゲル化後、共焦点イメージングのために、スキャフォールドをガラス底マイクロウェルディッシュ（ＭａｔＴｅｋ：Ｐ３５Ｇ－１．５－１４－Ｃ）に入れた。スキャフォールドを、蛍光スピニングディスク共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でイメージングする前に、生細胞／死細胞染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｌ３２２４）を用いて室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。生存率は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウェアを使用して、全細胞面積から死細胞の面積を差し引き、次いで全細胞面積で除算することによって定量化した［４］。生存率を、ＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島（ｎ＝１１）及びｅＢＣ （ｎ＝７）について平均し、ここで、ｎは、分析されたクラスターの数を指す。非乳化３％アガロースを使用して、ヒト膵島（ｎ＝９）及びｅＢＣ（ｎ＝５）の両方を比較した。
【0113】
スキャフォールドを４％のパラホルムアルデヒドで固定し、グラッドストーン研究所（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）で処理した。スキャフォールドを切片にする前にパラフィンに包埋した。５ミクロン厚の切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。画像は、光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）により２０倍の倍率で撮影した。膵島及びスキャフォールド材料の画像は、ガンマ線を１．３に増加させ、ＦＩＪＩの細孔領域を輪郭強調した。
【0114】
インビトロでのグルコース刺激インスリン分泌アッセイ
動的グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイでは、３７℃５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、ヒト膵島用のＣＭＲＬ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ｖ／ｖを補充）又はｅＢＣ用のＧＮ９培地のいずれかを含有する閉鎖型モックループ回路を使用した。Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ１４及び２５チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を、それぞれ、限外ろ過液出口と、ｉＢＡＰデバイスの入口及び出口の両方とに接続した。蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）でｉＢＡＰデバイス内のスキャフォールドを通して一定の流れを維持し、５０μＬ／分の限外ろ過速度をもたらした。ＧＳＩＳ試験を実施する前に、細胞を低グルコース（５ｍＭ）培地中で１２０分間安定化させた。限外ろ過液試料を、第１の低グルコース（５ｍＭ）段階中に１６分間にわたって収集した。次いで、グルコース濃度を、培地にグルコースを加えることによって増加させ（２８ｍＭ）、限外ろ過液収集を３０分間継続した。グルコース刺激のための２８ｍＭの選択は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）からのプロトコル（ＳＯＰ文書：３１０４、Ａ０３）に基づく［５］。その後、グルコース濃度を基礎濃度に下げ、試料を４４分間収集した。限外ろ過液試料を、それらがインスリン濃度について分析され得るまで、－２０℃で保持した。ＧＳＩＳ実験からの限外ろ過液試料中の分泌インスリン濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０－１１１３－０１）を使用して決定した。インスリン濃度（ｐｇ／Ｌ）と限外ろ過速度（ｍＬ／分）との積を、膵島又はｅＢＣの数で正規化して、インスリン産生（ｐｇ／分／ＩＥＱ）を算出するために使用した。刺激指数（ＳＩ）は、第１相インスリン産生を平均化された基礎インスリン産生で除算することによって算出した。
動的グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイでは、３７℃５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で、ヒト膵島用のＣＭＲＬ培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ｖ／ｖを補充）又はｅＢＣ用のＧＮ９培地のいずれかを含有する閉鎖型モックループ回路を使用した。Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ Ｌ／Ｓ１４及び２５チューブ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を、それぞれ、限外ろ過液出口と、ｉＢＡＰデバイスの入口及び出口の両方とに接続した。蠕動ポンプ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）でｉＢＡＰデバイス内のスキャフォールドを通して一定の流れを維持し、５０μＬ／分の限外ろ過速度をもたらした。ＧＳＩＳ試験を実施する前に、細胞を低グルコース（５ｍＭ）培地中で１２０分間安定化させた。限外ろ過液試料を、第１の低グルコース（５ｍＭ）段階中に１６分間にわたって収集した。次いで、グルコース濃度を、培地にグルコースを加えることによって増加させ（２８ｍＭ）、限外ろ過液収集を３０分間継続した。グルコース刺激のための２８ｍＭの選択は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）からのプロトコル（ＳＯＰ文書：３１０４、Ａ０３）に基づく［５］。その後、グルコース濃度を基礎濃度に下げ、試料を４４分間収集した。限外ろ過液試料を、それらがインスリン濃度について分析され得るまで、－２０℃で保持した。ＧＳＩＳ実験からの限外ろ過液試料中の分泌インスリン濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ：１０－１１１３－０１）を使用して決定した。インスリン濃度（ｐｇ／Ｌ）と限外ろ過速度（ｍＬ／分）との積を、膵島又はｅＢＣの数で正規化して、インスリン産生（ｐｇ／分／ＩＥＱ）を算出するために使用した。刺激指数（ＳＩ）は、第１相インスリン産生を平均化された基礎インスリン産生で除算することによって算出した。
【0115】
統計方法
データは、透水性、相対液滴面積、分解及び生存率実験の平均±ＳＤで表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．２を使用して、異なる試験で平均値の統計的評価を評価した。透水及び生存率データを、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、相対液滴面積及び分解を一元配置分散分析で評価した。事後比較は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して実施した。ｐ値＜０．０５が、全ての分析について統計的に有意であると認められた。
データは、透水性、相対液滴面積、分解及び生存率実験の平均±ＳＤで表した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．２を使用して、異なる試験で平均値の統計的評価を評価した。透水及び生存率データを、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、相対液滴面積及び分解を一元配置分散分析で評価した。事後比較は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を使用して実施した。ｐ値＜０．０５が、全ての分析について統計的に有意であると認められた。
【0116】
結果
透水性
最適化実験では、３％（ｗ／ｖ）及び６％（ｗ／ｖ）のアガロース濃度で作製したＳＰＡスキャフォールド及び非乳化アガロースの透水性（Ｌｐ）を比較した（図３）。二元配置分散分析は、アガロース濃度（３％及び６％）の効果と、スキャフォールドがＳＰＡで作製されたか、又は非乳化アガロースで作製されたかの間の透水性に及ぼす有意な相互作用が見出された（Ｆ（１，１２）＝８１．６、ｐ＜０．００１）。ＳＰＡは、両方のアガロース濃度について、非乳化アガロース（Ｆ（１，１２）＝６９８６、ｐ＜０．００１）よりも高い透水性を有した。更に、３％ＳＰＡ及び３％アガロースは、それらの６％対応物と比較して高い透水性を有した（Ｆ（１，１２）＝８６．１、ｐ＜０．００１）。多重比較検定は、３％及び６％の非乳化アガロース（それぞれ０．００２５及び０．０００８ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）で作製されたスキャフォールドを除いて、全ての群間で有意差を示した（ｐ＜０．００１）。３％ＳＰＡスキャフォールド（ｎ＝４）は、最高の透水性を有し、６％ＳＰＡスキャフォールド（ｎ＝４）（それぞれ０．６６ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ、０．５３ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）と有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。
透水性
最適化実験では、３％（ｗ／ｖ）及び６％（ｗ／ｖ）のアガロース濃度で作製したＳＰＡスキャフォールド及び非乳化アガロースの透水性（Ｌｐ）を比較した（図３）。二元配置分散分析は、アガロース濃度（３％及び６％）の効果と、スキャフォールドがＳＰＡで作製されたか、又は非乳化アガロースで作製されたかの間の透水性に及ぼす有意な相互作用が見出された（Ｆ（１，１２）＝８１．６、ｐ＜０．００１）。ＳＰＡは、両方のアガロース濃度について、非乳化アガロース（Ｆ（１，１２）＝６９８６、ｐ＜０．００１）よりも高い透水性を有した。更に、３％ＳＰＡ及び３％アガロースは、それらの６％対応物と比較して高い透水性を有した（Ｆ（１，１２）＝８６．１、ｐ＜０．００１）。多重比較検定は、３％及び６％の非乳化アガロース（それぞれ０．００２５及び０．０００８ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）で作製されたスキャフォールドを除いて、全ての群間で有意差を示した（ｐ＜０．００１）。３％ＳＰＡスキャフォールド（ｎ＝４）は、最高の透水性を有し、６％ＳＰＡスキャフォールド（ｎ＝４）（それぞれ０．６６ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ、０．５３ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）と有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。
【0117】
図３は、ＳＰＡ及び非乳化アガロースで作製されたスキャフォールドの透水値（平均±ＳＤ、＊＊はｐ＜０．００１を表す）が統計的に有意であったことを示しており、Ｆ（１，１２）＝６９８６である。また、アガロース濃度（３％対６％）の有意な効果Ｆ（１，１２）＝８６．１４もあった。事後検定では、３％及び６％の非乳化アガロースで作製したスキャフォールドを除く全ての群間で有意な差を示した（ｐ＝０．９９８）。透水性は、３％（ｗ／ｖ）のＳＰＡで作製されたスキャフォールドでは、他の３つのスキャフォールドとは有意に異なっていた。
【0118】
ＰＦＤ液滴分析
３つの３％ＳＰＡスキャフォールドをＰＦＤ液滴サイズについて分析して、ＳＰＡバッチ間のばらつきを比較した（図４Ａ）。各スキャフォールドについて、ｚスタック画像を３つの位置及び３つの異なる高さで得て、スキャフォールドごとに合計９つのＤＩＣ画像を得た（ｎ＝９）。ＰＦＤ液滴は十分に分散され、スキャフォールド内の配置に目に見える傾向は示されなかった。各スキャフォールドのＰＦＤ液滴サイズの分布は、直径がより小さい直径に方に著しく偏っていた（図４Ｂ）。ＰＦＤ液滴の中央値直径は、３つのスキャフォールドについて、それぞれ１８．２、１３、及び１４．３μｍであった。スキャフォールドの相対液滴面積を各ＤＩＣ画像について計算し、次いで平均化した（図４Ｃ）。異なるスキャフォールドバッチにおける平均液滴面積（それぞれ１７．６±５．０、１９．７±６．９、及び１３．２±２．７％）を比較するために一元配置分散分析を実施し、平均間に有意差を見出した（Ｆ（２，２４）＝３．８、ｐ＝０．０３７）。多重比較検定では、スキャフォールド２と３との間にのみ有意差が見出され（ｐ＜０．０５）、スキャフォールド間にある程度のばらつきがあることが示された。
３つの３％ＳＰＡスキャフォールドをＰＦＤ液滴サイズについて分析して、ＳＰＡバッチ間のばらつきを比較した（図４Ａ）。各スキャフォールドについて、ｚスタック画像を３つの位置及び３つの異なる高さで得て、スキャフォールドごとに合計９つのＤＩＣ画像を得た（ｎ＝９）。ＰＦＤ液滴は十分に分散され、スキャフォールド内の配置に目に見える傾向は示されなかった。各スキャフォールドのＰＦＤ液滴サイズの分布は、直径がより小さい直径に方に著しく偏っていた（図４Ｂ）。ＰＦＤ液滴の中央値直径は、３つのスキャフォールドについて、それぞれ１８．２、１３、及び１４．３μｍであった。スキャフォールドの相対液滴面積を各ＤＩＣ画像について計算し、次いで平均化した（図４Ｃ）。異なるスキャフォールドバッチにおける平均液滴面積（それぞれ１７．６±５．０、１９．７±６．９、及び１３．２±２．７％）を比較するために一元配置分散分析を実施し、平均間に有意差を見出した（Ｆ（２，２４）＝３．８、ｐ＝０．０３７）。多重比較検定では、スキャフォールド２と３との間にのみ有意差が見出され（ｐ＜０．０５）、スキャフォールド間にある程度のばらつきがあることが示された。
【0119】
図４Ａ～４Ｂは、ＰＦＤ液滴サイズ分析を示す。図４Ａは、液滴分析に使用した３％ＳＰＡスキャフォールドの代表的なＤＩＣ画像を示す。図４Ｂは、各スキャフォールドについて平均±ＳＤとして表されるＰＦＤ液滴を表すＰＦＤ液滴のサイズ分布を示すヒストグラムを示す。図４Ｃは、各ＤＩＣ画像について計算され、次いで平均化されたスキャフォールドの相対的な液滴面積を示す。線は、各スキャフォールドの平均±ＳＤを表し、＊はｐ＜０．０５を表す。
【0120】
スキャフォールド分解研究
水和したスキャフォールド重量の変化を、静置培養条件で２８日間にわたって評価した。０日目のスキャフォールドの平均重量は４５．８±９．７８ｍｇであったが、２８日目のスキャフォールドの平均重量は４２．７±４．８１ｍｇであった（図５Ａ）。一元配置分散分析では、経時的にスキャフォールドの平均重量に有意な変化はない（Ｆ（４，１０）＝０．０４８、ｐ＝０．７５）ことが判定された。しかしながら、スキャフォールドの外観は、２８日間の研究を通して変化した。２１日後にスキャフォールドは半透明性ではなくなり、２８日目にはほぼ白く見えた（図５Ｂ）が、これは培地中のＦＢＳによるタンパク質沈着による可能性がある。
水和したスキャフォールド重量の変化を、静置培養条件で２８日間にわたって評価した。０日目のスキャフォールドの平均重量は４５．８±９．７８ｍｇであったが、２８日目のスキャフォールドの平均重量は４２．７±４．８１ｍｇであった（図５Ａ）。一元配置分散分析では、経時的にスキャフォールドの平均重量に有意な変化はない（Ｆ（４，１０）＝０．０４８、ｐ＝０．７５）ことが判定された。しかしながら、スキャフォールドの外観は、２８日間の研究を通して変化した。２１日後にスキャフォールドは半透明性ではなくなり、２８日目にはほぼ白く見えた（図５Ｂ）が、これは培地中のＦＢＳによるタンパク質沈着による可能性がある。
【0121】
図５Ａ～５Ｂは、３％ＳＰＡスキャフォールドの分解を示す。図５Ａは、２８日間の分解研究で重量の変化を測定し、異なる時点で有意差を見出されなかったことを示す。データは、平均±ＳＤとして示される。図５Ｂは、０、７、２１、及び２８日間の培養におけるスキャフォールドの代表的な画像を示す。
【0122】
組織学及び細胞生存率評価
細胞及びスキャフォールドの両方の形態を可視化するために、組織切片をＨ＆Ｅで染色した（図６Ａ、上部）。ＳＰＡ及び従来のアガロースの両方におけるヒト膵島及びｅＢＣは、同様の形態を示す。ＳＰＡセクションは、点線の輪郭で示されるスキャフォールド内の開放領域（細孔）を表示する。細孔は、スキャフォールド全体、及びカプセル化された細胞の近く（＜１０μｍ、図６Ａ、上部）に分布しているように見える。
細胞及びスキャフォールドの両方の形態を可視化するために、組織切片をＨ＆Ｅで染色した（図６Ａ、上部）。ＳＰＡ及び従来のアガロースの両方におけるヒト膵島及びｅＢＣは、同様の形態を示す。ＳＰＡセクションは、点線の輪郭で示されるスキャフォールド内の開放領域（細孔）を表示する。細孔は、スキャフォールド全体、及びカプセル化された細胞の近く（＜１０μｍ、図６Ａ、上部）に分布しているように見える。
【0123】
成人ヒト膵島及びｅＢＣ生存率を、最適化されたＳＰＡ製剤及び従来の非乳化アガロースの両方におけるカプセル化直後に測定した（図６Ａ、下部）。複数の細胞クラスターを、ヒト膵島及びｅＢＣの両方についてイメージングした（図６Ｂ）。ＳＰＡスキャフォールドにおいて、ヒト膵島は、９５．８±３％（ｎ＝１１）が生存可能であり、ｅＢＣは、９５．８±２％（ｎ＝７）が生存可能であった。非乳化３％アガローススキャフォールドにおいて、ヒト膵島及びｅＢＣは、９６．１±３％（ｎ＝９）及び９６．６±３％（ｎ＝５）が生存可能であった。死細胞の多くは膵島の周辺部で観察された。ｅＢＣについては、死細胞は主に周辺部に見られたが、ＳＰＡスキャフォールド内のクラスターの中心でわずかに観察された。二元配置分散分析により、異なるスキャフォールド間の平均生存率に有意差はなく（Ｆ（１，２８）＝０．２１０９、ｐ＝０．６５）、異なる細胞型間にも有意差はない（Ｆ（１，１２８）＝０．０５０、ｐ＝０．８３）と判定された。全体として、高い生存率は、カプセル化プロセスが細胞を損傷しないことを実証し、更なる動的グルコース刺激インスリン分泌評価を可能にした。
【0124】
図６Ａ～６Ｂは、３％の従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣの組織学的評価及び生存率を提示する。図６Ａは、従来のアガロース及びＳＰＡスキャフォールドにおけるヒト膵島及びｅＢＣのＨ＆Ｅ及び生存率染色からの代表的な画像を示す。Ｈ＆Ｅ染色は、核及び細胞質を示し、点線は、ＳＰＡ内のカプセル化された細胞クラスターを取り囲む細孔（矢印）を示す。スケールバーは、長さが５０μｍを表す。生存率染色は、蛍光顕微鏡でイメージングした死細胞及び生細胞を示す。図６Ｂは、平均＋ＳＤとして報告された生存率の結果を提示する。ヒト膵島は、ＳＰＡスキャフォールドで９５．８±３％生存可能であり、従来のアガローススキャフォールドで９６．６±３％生存可能であった。ｅＢＣは、ＳＰＡスキャフォールドで９５．８±２％生存可能であり、従来のアガローススキャフォールドで９６．６±３％生存可能であった。二元配置分散分析により、群の平均生存率の間に有意差はなかったと判定された。
【0125】
インスリン産生の評価
３６μＬのＳＰＡ中に５００個のＩＥＱ又はｅＢＣを有するヒト膵島（ｎ＝４）又はｅＢＣ（ｎ＝８）のいずれかを含有するＳＰＡスキャフォールドを、インビトロＧＳＩＳアッセイを使用してｉＢＡＰで試験した。第１の低グルコース曝露中の平均インスリン産生は、ヒト膵島では６．８±２．７ｐｇ／分／ＩＥＱ（図７Ａ）であり、ｅＢＣでは２．１±０．９ｐｇ／分／ｅＢＣ（図７Ｂ）であった。より高いレベルのグルコース（２８ｍＭ）に曝露した場合、成人ヒト膵島及びｅＢＣの両方がインスリン産生を増加させ、二相性インスリン応答を示した。２８ｍＭのグルコース濃度に曝露した後の第１相インスリン産生は、ヒト膵島では８３．４±２０．５ｐｇ／分／ＩＥＱであり、ｅＢＣでは８．０±２．７ｐｇ／分／ｅＢＣであった。第２相中、インスリン産生は第１相のピークから徐々に減少し、ヒト膵島及びｅＢＣの平均インスリン産生は、それぞれ２７．８±１４．０ｐｇ／分／ＩＥＱ及び３．３±２．１ｐｇ／分／ｅＢＣであった。全てのスキャフォールドは、第２相中、ベースラインインスリンレベルを上回るインスリン産生を維持し、第２の低グルコース曝露後にインスリン産生のわずかなスパイクを示した。第２の低グルコース曝露中、基礎インスリン産生は、高グルコース刺激前のレベル（６．４±３．３ｐｇ／分／ＩＥＱ及び２．０±１．６ｐｇ／分／ｅＢＣ）に戻った。刺激指数（ＳＩ）、すなわち基礎インスリン産生に対する高グルコース曝露中の第１相インスリン産生の比は、ヒト膵島で１３．６±６．１であり、ｅＢＣで４．９±３．４であった。
３６μＬのＳＰＡ中に５００個のＩＥＱ又はｅＢＣを有するヒト膵島（ｎ＝４）又はｅＢＣ（ｎ＝８）のいずれかを含有するＳＰＡスキャフォールドを、インビトロＧＳＩＳアッセイを使用してｉＢＡＰで試験した。第１の低グルコース曝露中の平均インスリン産生は、ヒト膵島では６．８±２．７ｐｇ／分／ＩＥＱ（図７Ａ）であり、ｅＢＣでは２．１±０．９ｐｇ／分／ｅＢＣ（図７Ｂ）であった。より高いレベルのグルコース（２８ｍＭ）に曝露した場合、成人ヒト膵島及びｅＢＣの両方がインスリン産生を増加させ、二相性インスリン応答を示した。２８ｍＭのグルコース濃度に曝露した後の第１相インスリン産生は、ヒト膵島では８３．４±２０．５ｐｇ／分／ＩＥＱであり、ｅＢＣでは８．０±２．７ｐｇ／分／ｅＢＣであった。第２相中、インスリン産生は第１相のピークから徐々に減少し、ヒト膵島及びｅＢＣの平均インスリン産生は、それぞれ２７．８±１４．０ｐｇ／分／ＩＥＱ及び３．３±２．１ｐｇ／分／ｅＢＣであった。全てのスキャフォールドは、第２相中、ベースラインインスリンレベルを上回るインスリン産生を維持し、第２の低グルコース曝露後にインスリン産生のわずかなスパイクを示した。第２の低グルコース曝露中、基礎インスリン産生は、高グルコース刺激前のレベル（６．４±３．３ｐｇ／分／ＩＥＱ及び２．０±１．６ｐｇ／分／ｅＢＣ）に戻った。刺激指数（ＳＩ）、すなわち基礎インスリン産生に対する高グルコース曝露中の第１相インスリン産生の比は、ヒト膵島で１３．６±６．１であり、ｅＢＣで４．９±３．４であった。
【0126】
図７Ａ～７Ｂは、最適化されたＳＰＡ製剤におけるヒト膵島及びｅＢＣインスリン産生のインビトロ評価を示す。ＳＰＡスキャフォールドにおけるインスリン産生は、５ｍＭのグルコース（Ｇ５）、２８ｍＭのグルコース（Ｇ２８）、続いて第２のＧ５段階へのＧＳＩＳ曝露中に、図７Ａのヒト膵島（ｎ＝４）及び図７ＢのｅＢＣ（ｎ＝８）の両方について示される。データは、平均±ＳＤを表す。
【0127】
考察
ｉＢＡＰ内のｅＢＣ及び膵島生存率並びにインスリン産生を支持する新規の超多孔性アガロース系細胞スキャフォールドを作製した。このスキャフォールドは、２つの方法で膵島への及び膵島からの主要溶質の物質移動を最適化することを目的とする。第一に、高多孔性（超多孔性）構造により、透水性及び多孔性実験によって示されるように、スキャフォールド全体にわたって限外ろ過液の透過を可能にし、したがって、限外ろ過液から膵島又はｅＢＣまでの拡散距離（＜１０μｍ）を最小限に抑える。第ニに、スキャフォールドの高い透水性は、細胞スキャフォールドを通るＳＮＭ生成限外ろ過液の流れを制限しない。限外ろ過に使用されるほとんどのポリマー膜は、膵島生存率及びインスリン産生を維持するのに必要な膜厚（３０～１００μｍ）のために、不十分な透水性を示さない［６］。従来のポリマー膜とは異なり、ＳＮＭは１μｍ未満の厚さであり、非常に均一な孔径分布を有し、より多量の限外ろ過を可能にし、膵島の機能性を向上させることできる［６，７，２］。ｉＢＡＰ設計がカプセル化された膵島に十分な量の限外ろ過液を送達するためには、細胞スキャフォールドの透水性がＳＮＭよりも大きくなければならない。高いアガロース濃度（６％ｗ／ｖ）は、その小さな孔径のために、バイオ分離及びクロマトグラフィープロセスで広く使用され、好まれている［８］。高濃度のアガロースでは孔径が小さいため、硬質の微小環境が作り出され、カプセル化された膵島でメカノトランスダクションが開始されることが知られている［９］。また、高濃度のアガロースでは孔径が小さいため、透水性が制限される可能性があり［１０］、これは、３％（ｗ／ｖ）ＳＰＡスキャフォールドが６％（ｗ／ｖ）ＳＰＡスキャフォールドよりも有意に高い透水性を有していたという我々の発見と一致している。３％（ｗ／ｖ）のアガロースで作製されたＳＰＡスキャフォールドは、ＳＮＭよりも７０倍高い透水性を有する（それぞれ０．６６及び０．０１０ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）［７］。透水性は、流体の流れに対する抵抗と反比例するため、したがって、スキャフォールドの高い透水性は、ＳＮＭよりも流体の流れに対する抵抗が小さくなる。ｉＢＡＰの限外ろ過速度を最大化するために、細胞スキャフォールド（Ｌｐ）とＳＮＭ（ＬＳＮＭ）の透水性の逆和を取ることによって、全体の透水性（Ｌｏ）を計算することができる（式２）［１１］。
したがって、支配的な水圧抵抗はＳＮＭとなり、限外ろ過速度はＳＮＭの水圧抵抗に大きく依存することになる。したがって、ＳＰＡスキャフォールドの使用は、ｉＢＡＰによる全体的な限外ろ過速度を低下させない。
ｉＢＡＰ内のｅＢＣ及び膵島生存率並びにインスリン産生を支持する新規の超多孔性アガロース系細胞スキャフォールドを作製した。このスキャフォールドは、２つの方法で膵島への及び膵島からの主要溶質の物質移動を最適化することを目的とする。第一に、高多孔性（超多孔性）構造により、透水性及び多孔性実験によって示されるように、スキャフォールド全体にわたって限外ろ過液の透過を可能にし、したがって、限外ろ過液から膵島又はｅＢＣまでの拡散距離（＜１０μｍ）を最小限に抑える。第ニに、スキャフォールドの高い透水性は、細胞スキャフォールドを通るＳＮＭ生成限外ろ過液の流れを制限しない。限外ろ過に使用されるほとんどのポリマー膜は、膵島生存率及びインスリン産生を維持するのに必要な膜厚（３０～１００μｍ）のために、不十分な透水性を示さない［６］。従来のポリマー膜とは異なり、ＳＮＭは１μｍ未満の厚さであり、非常に均一な孔径分布を有し、より多量の限外ろ過を可能にし、膵島の機能性を向上させることできる［６，７，２］。ｉＢＡＰ設計がカプセル化された膵島に十分な量の限外ろ過液を送達するためには、細胞スキャフォールドの透水性がＳＮＭよりも大きくなければならない。高いアガロース濃度（６％ｗ／ｖ）は、その小さな孔径のために、バイオ分離及びクロマトグラフィープロセスで広く使用され、好まれている［８］。高濃度のアガロースでは孔径が小さいため、硬質の微小環境が作り出され、カプセル化された膵島でメカノトランスダクションが開始されることが知られている［９］。また、高濃度のアガロースでは孔径が小さいため、透水性が制限される可能性があり［１０］、これは、３％（ｗ／ｖ）ＳＰＡスキャフォールドが６％（ｗ／ｖ）ＳＰＡスキャフォールドよりも有意に高い透水性を有していたという我々の発見と一致している。３％（ｗ／ｖ）のアガロースで作製されたＳＰＡスキャフォールドは、ＳＮＭよりも７０倍高い透水性を有する（それぞれ０．６６及び０．０１０ｍＬ／分／ｃｍ２／ｍｍＨｇ）［７］。透水性は、流体の流れに対する抵抗と反比例するため、したがって、スキャフォールドの高い透水性は、ＳＮＭよりも流体の流れに対する抵抗が小さくなる。ｉＢＡＰの限外ろ過速度を最大化するために、細胞スキャフォールド（Ｌｐ）とＳＮＭ（ＬＳＮＭ）の透水性の逆和を取ることによって、全体の透水性（Ｌｏ）を計算することができる（式２）［１１］。
【数2】
【0128】
ヒト膵島は、ＳＰＡスキャフォールドにおけるグルコース刺激に応答して動的インスリン産生を示した。最初の低グルコース曝露中のベースラインインスリン産生速度は、６～７ｐｇ／分／ＩＥＱであり、約５ｍＭのグルコース濃度でのインビトロの他のヒト膵島研究と一致していた［１２］。灌流されたヒト膵島を使用した研究では、１６．７ｍＭのグルコースに曝露したときに１２～４０ｐｇ／分／ＩＥＱからのインスリン産生ピークを示したが［１２～１４］、ＳＰＡスキャフォールドは２８ｍＭのグルコースでより高い産生（６０～９９ｐｇ／分／ＩＥＱ）を示した。臨床移植評価のための静的ＧＳＩＳアッセイで伝統的に使用されているため、グルコース刺激の濃度として２８ｍＭの濃度を選択した［５］。グルコース刺激に応答する別個の二相性曲線は、インスリン療法の有望性を示しているが、確認のためにインスリン応答の長期評価及び糖尿病ブタ研究が必要である。これらの研究は、初期の実現可能性と、明確な第１相及び低グルコースレベルへ戻った後のインスリン産生の停止を伴う高グルコース刺激に対する二相応答とを実証し、インビトロでのＳＰＡスキャフォールドにおける生理学的膵島機能を示した。
【0129】
最近では、インスリン分泌を改善するために、ｈＰＳＣからβ細胞を形成し、成熟したβ細胞に類似した応答を示すようにするという進歩があった［３、１５、１６］が、これらの細胞を移植可能なデバイスに組み込みはまだ初期段階である。Ｓｅｍｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの子会社、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）及びＶｉａＣｙｔｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など、前臨床研究及び臨床試験を実施し、前世代のｈＰＳＣ由来細胞を用いたＢＡＰデバイスを研究しているグループがある［１７～２０］。ヒト膵島及びｅＢＣは、ＳＰＡスキャフォールドにおけるグルコース刺激と同様のインスリン応答プロファイルを示すことが見出された。この研究は、インビトロでマクロカプセル化デバイスにおいて、幹細胞由来のβ細胞を用いた動的インスリン分泌動態を実証した最初のものであると考えられる。第１相は、グルコース－インスリン動態に遅れがないことを示す高グルコースチャレンジの最初の時点で、両方の細胞型で始まった［２１］。インスリン分泌の大きさは、ヒト膵島よりもｅＢＣの方がかなり小さく、この知見は、本研究で使用されるＭＥＬ－１ ＩＮＳＧＦＰ／ｗ株が１つの機能的インスリン対立遺伝子しか持っていないという事実に加えて、他の多くのｈＰＳＣ由来β細胞研究［２２～２４］と一致する［２３］。ｅＢＣ内の他のインスリン対立遺伝子は、選別目的のためにＧＦＰによって置き換えられ［３］、第２のインスリン対立遺伝子を回復させれば、理論的にインスリン産生を２倍にすることができる。更に、ｅＢＣ及びヒト膵島の両方において、第２の低グルコース濃度培地への曝露後に、第２のインスリン産生ピークが観察された。Ｈｅｎｑｕｉｎらは、インスリンが基礎レベルに戻る前にピークに達する灌流された乳児及び成人ヒト膵島において、オフレスポンスと呼ばれる同様の観察を行った［２５］。他の報告では、ｈＰＳＣ由来のβ細胞は、未成熟のβ細胞の特徴である、低下したグルコース濃度に対するインスリン応答を終わらせることができないことが示されている［１９、２６、２７］。ｅＢＣにおけるインスリン産生の上昇の適切な停止は、それらが成人ヒト膵島と同様に機能し、低血糖を予防することができることを示す［１５、２８］。全体的なインスリン産生は、ｅＢＣの方が低かったが、ＳＰＡスキャフォールドにおける最適な物質輸送は、ｉＢＡＰにおいて正常酸素環境を維持しながら、より大きな細胞密度を支持する有望性を示した。要約すると、本知見は、ｅＢＣがＳＰＡスキャフォールドの成人ヒト膵島とグルコース刺激に対する同様のインスリン応答プロファイルを有することを初めて実証した。
【0130】
ｉＢＡＰ内のＳＰＡマクロ多孔性スキャフォールドは、限外ろ過液と膵島との間の拡散距離を最小限に抑えることによって、マクロカプセル化されたインスリン産生細胞に十分な物質移動を提供するように見えた。ＳＮＭベースのｉＢＡＰの以前の報告では、限外ろ過液を媒介した対流ベースの物質移動が、ＳＮＭを横切って、アガロース細胞スキャフォールドを介して膵島機能を支持することが示されている［２］。従来のアガロースは、膵島カプセル化に幅広く使用されているが［２９～３１］、溶質の高い流束を可能にしていない。ＳＰＡスキャフォールドの更なる特徴付けにより、相対的なＰＦＤ液滴面積（＞１３．２±２．７％）に基づくより高い多孔性及び２８日間にわたる最小限の分解が示された。ＰＦＤが液滴としてどれだけ残っており、どれだけのＰＦＤが除去された開気孔が形成されるのかは現在のところ不明である。ＳＰＡスキャフォールドにおける見かけの色の変化は、ＦＢＳからのタンパク質又はアルブミンの沈着のいずれかに起因する可能性がある。別の仮説には、経時的にエマルションが不安定になることが含まれる。現在進行中のフッ素核磁気共鳴（ｆＮＭＲ）分光法の研究は、ＳＰＡスキャフォールド内のＰＦＤレベルを経時的に決定するのに役立つ。ＳＰＡスキャフォールドの組織学的評価では、膵島の外面を取り囲む細孔（細孔から膵島表面まで＜１０μｍ）が明らかになり、限外ろ過液が膵島表面をほぼ直接横切って流れることを可能にした。したがって、限外ろ過液から膵島の中心までの拡散距離は、島の直径によって定義される。更に、スキャフォールドをアガロースからＳＰＡに変更すると、透水性又は流体速度が増加し、したがって、レイノルズ数が増加し、スキャフォールド内の全体的な物質移動が改善される［１１、３２］。短い拡散距離及び増加した透水は、細胞スキャフォールド内の酸素、グルコース、及びインスリンの輸送を有意に増加させる。膵島カプセル化のためのＳＰＡ細胞スキャフォールドは、正常酸素状態を維持し、対流ベースのデバイス内のヒト膵島及び幹細胞由来のｅＢＣの両方に高速グルコース－インスリン動態を提供するのに理想的であり、血管内生体人工膵臓におけるその潜在的な用途を実証する。
【0131】
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３．Ｎａｉｒ ＧＧ，Ｌｉｕ ＪＳ，Ｒｕｓｓ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ β ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１９；２１：２６３－２７４．
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１８．Ｐｕｌｌｅｎ ＬＣ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｈａｖｅ Ｎｏｗ Ｂｅｅｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｐａｔｉｅｎｔｓ：Ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ＩＰＩＴＡ ２０１８．Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ２０１８；１８：１５８１－１５８２．
１９．Ｐａｇｌｉｕｃａ ＦＷ，Ｍｉｌｌｍａｎ ＪＲ，Ｇｕｒｔｌｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ β Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ ２０１４；１５９：４２８－４３９．
２０．Ｊｅｌｌａｌｉ Ｒ，Ｅｓｓａｏｕｉｂａ Ａ，Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｂｉｏ－ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｏｎ（Ｂｉｏ－）Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．７７－１０８．
２１．Ｃｏｌｔｏｎ ＣＫ．Ｏｘｙｇｅｎ ｓｕｐｐｌｙ ｔｏ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４；６７－６８：９３－１１０．
２２．Ｍａｓｓｕｍｉ Ｍ，Ｐｏｕｒａｓｇａｒｉ Ｆ，Ｎａｌｌａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａｎ Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｂｅｔａ－Ｌｉｋｅ Ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１６；１１：ｅ０１６４４５７．
２３．Ｖｅｌａｚｃｏ－Ｃｒｕｚ Ｌ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｍａｘｗｅｌｌ ＫＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ β Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１９；１２：３５１－３６５．
２４．Ｍｉｃａｌｌｅｆ ＳＪ，Ｌｉ Ｘ，Ｓｃｈｉｅｓｓｅｒ ＪＶ，ｅｔ ａｌ．ＩＮＳ（ＧＦＰ／ｗ）ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２０１２；５５：６９４－７０６．
２５．Ｈｅｎｑｕｉｎ Ｊ－Ｃ，Ｎｅｎｑｕｉｎ Ｍ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔｓ ｆｒｏｍ Ｎｏｒｍａｌ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１６；１１：ｅ０１６５９６１．
２６．Ｒｅｚａｎｉａ Ａ，Ｂｒｕｉｎ ＪＥ，Ａｒｏｒａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１４；３２：１１２１－１１３３．
２７．Ｒｕｓｓ ＨＡ，Ｐａｒｅｎｔ ＡＶ，Ｒｉｎｇｌｅｒ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｅｔａ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０１５；３４：１７５９－１７７２．
２８．Ｈｒｖａｔｉｎ Ｓ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ ＣＷ，Ｄｅｎｇ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｓｅｍｂｌｅ ｆｅｔａｌ，ｎｏｔ ａｄｕｌｔ，β ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１４；１１１：３０３８－３０４３．
２９．Ｇｉｎ Ｈ，Ｄｕｐｕｙ Ｂ，Ｂａｑｕｅｙ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ａｇａｒｏｓｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ：ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ １９８７；４：２３９－２４２．
３０．Ｄｉｍｉｔｒｉｏｇｌｏｕ Ｎ，Ｋａｎｅｌｌｉ Ｍ，Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｖｉｎｇ ｔｈｅ ｗａｙ ｆｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｓｌｅｔ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０１９；２４：７３７－７４８．
３１．Ｔｅｒａｍｕｒａ Ｙ，Ｉｗａｔａ Ｈ．Ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｃｏａｔｉｎｇ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２０１０；６２：８２７－８４０．
３２．Ｐｒａｄａｎｏｓ Ｐ，Ａｒｒｉｂａｓ ＪＩ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ Ａ．Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，Ｍａｓｓ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧｓ ｉｎ Ｃｒｏｓｓ－ｆｌｏｗ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９２；２７：２１２１－２１４２．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【国際調査報告】