知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-02
(54)【発明の名称】ＡＡＶ産生方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240625BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240625BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240625BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240625BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240625BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240625BHJP
C12N 15/35 20060101ALN20240625BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240625BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01
A61K48/00
A61K35/76
A61P37/04
C12N5/071
C12N5/10
C12N15/35
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023577659
(86)(22)【出願日】2022-06-17
(85)【翻訳文提出日】2024-01-16
(86)【国際出願番号】 IB2022000347
(87)【国際公開番号】W WO2022263930
(87)【国際公開日】2022-12-22
(31)【優先権主張番号】63/211,877
(32)【優先日】2021-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517271175
【氏名又は名称】メイラグティーエックス ユーケー アイアイ リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】フロリアン ジオパ
(72)【発明者】
【氏名】アナ バリナス
(72)【発明者】
【氏名】バスティアーン リーウィス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BC02
4B065BC07
4B065BD15
4B065BD22
4B065BD33
4B065BD39
4B065BD43
4B065BD50
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA05
4C084NA13
4C084ZB091
4C084ZB092
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA05
4C087NA13
4C087ZB09
(57)【要約】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｓＡＡＶ）粒子の産生方法は、培養培地を含む少なくとも１つの培養容器内における細胞数を増加させることを含む拡大相と、ＡＡＶ末端逆位反復に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを細胞内に導入することと、１つ以上のポリヌクレオチド配列が導入される細胞を培養すること、及びカルシウム（Ｃａ）イオン（例えば、Ｃａ２＋の塩）を産生相培養培地に添加することを含む産生相と、ならびにｒＡＡＶ粒子を単離することとを含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の産生方法であって、前記方法は、（ｉ）培養培地を含有する少なくとも１つの培養容器内の、細胞数を増加させることを含む、拡大相；
（ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを、前記細胞内に導入すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの前記細胞を培養し、かつ前記培養培地中のカルシウム（Ｃａ）イオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満になるように、ステップ（ｉｉ）後、約０～約２４時間に、前記培養培地にＣａイオンを添加することを含む、産生相；ならびに
（ｉｖ）前記ｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、前記方法。
【請求項2】
前記産生相培養培地に前記Ｃａイオンを添加することが、カルシウム塩を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記カルシウム塩が、ＣａＣｌ２を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記Ｃａイオンが、約０．５ｍＭ～約６ｍＭの濃度に添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記Ｃａイオンが、約２ｍＭ～約６ｍＭの濃度に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記Ｃａイオンが、約２ｍＭ～約４ｍＭの濃度に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記Ｃａイオンが、約１ｍＭ～約３ｍＭの濃度に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記Ｃａイオンが、約２ｍＭの濃度に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項9】
前記Ｃａイオンが、ステップ（ｉｉ）後、約０時間～約２４時間で、前記産生相培養培地に添加される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記Ｃａイオンが、ステップ（ｉｉ）後、約６時間～約１８時間で、前記産生相培養培地に添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項11】
前記Ｃａイオンが、ステップ（ｉｉ）後、約１２時間後で、約２ｍＭの前記培養培地中のＣａイオン濃度に添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記産生相（ステップｉｉｉ）が、少なくとも約４８時間、約７２～約１００時間、約９０時間～約１００時間、約９２時間～約９８時間、約９４～約９８時間、または約９６時間である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記産生相が、（ａ）グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチド、及び／または（ｂ）ソルビトールの１つ以上を、前記産生相培地に添加することを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの前記１つ以上が、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの１つ以上から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｉｉ）後、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間の１つ以上で、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドのうちの少なくとも１つが、前記培養培地に添加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（ｉ）で、凝集抑制補助剤が、前記培養培地に添加される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記第一の、前記第二の、及び前記第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、前記第一の、前記第二の、及び前記第三のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターのトランスフェクションによって、前記第一の、前記第二の、及び前記第三のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含む１つ以上のウイルスの感染によって、前記１つ以上のベクターのトランスフェクションと前記１つ以上のウイルスの感染との組合せによって、または前記第一の、前記第二の、及び前記第三のポリヌクレオチド配列のエレクトロポレーションによって、前記細胞内に導入される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記第一の、前記第二の、及び前記第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つが、トランスフェクションによって前記細胞内に導入される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記導入遺伝子が、治療用タンパク質またはレポータータンパク質をコードする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記導入遺伝子が、ＲＰＥ６５、ＲＰＧＲ、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、及びＣＮＧＢ３からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＡＡＶ ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２－レトロ、ＡＡＶ９－レトロ、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される、ＡＡＶ血清型またはＡＡＶ変異体に由来する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞を、懸濁液中で培養する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
前記少なくとも１つの培養容器が、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクタである、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
ステップ（ｉ）で、前記培養培地が約７．２～約７．４のｐＨを有し、前記細胞の培養がＣＯ２スパージングを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
ステップ（ｉｉ）前に、前記培養培地のｐＨを約６．９に変化させ、ＣＯ２のスパージングを停止させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ｒＡＡＶ粒子を単離するステップが、前記細胞を溶解させ、及び任意選択的に、得られた溶解物を清澄化し、前記清澄化された溶解物を精製ステップに供することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記精製ステップが、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法によって産生された、ｒＡＡＶ粒子の集団。
【請求項32】
請求項３１に記載のｒＡＡＶ粒子集団を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１７日出願の、米国仮特許出願第６３／２１１，８７７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年６月１７日出願の、米国仮特許出願第６３／２１１，８７７号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、特定の塩、特に、カルシウム塩、例えば、塩化カルシウムを、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生培地に添加することによって、ＡＡＶベクターを作成するための、方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損型パルボウイルスである。ＡＡＶ粒子は、３つのカプシドタンパク質－ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３－を有するカプシドを含み、カプシドは、約４．８ｋｂの長さの一本鎖ＤＮＡゲノムを包含し、一本鎖ＤＮＡゲノムは、プラス鎖であってもマイナス鎖であってもよい。いずれかの鎖を含む粒子は感染性であり、親細胞が感染する一本鎖を二本鎖形態に変換し、その後に増幅することによって複製が行われ、そこから、子細胞の一本鎖が置き換えられてカプシドにパッケージングされる。
【0004】
ＡＡＶは、複製を行うためには、他のウイルス、主にアデノウイルスとの、同時感染に依存する。その一本鎖ゲノムは、３つの遺伝子、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（カプシド）、及びａａｐ（アセンブリ）を含有し、３つのプロモーター、代替翻訳開始部位、及び差次的スプライシングの使用を通して、少なくとも９つの遺伝子産物を生じる。これらのコード配列は、ゲノムの複製及びパッケージングに必要な、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングに関与する、４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、及びＲｅｐ４０）をコードするのに対して、ｃａｐ発現は、ウイルスゲノムを保護する外側カプシドシェルを形成し、かつ細胞の結合と内在化に積極的に関与する、ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を生じる。ａａｐ遺伝子は、ｃａｐ遺伝子と重なる代替リーディングフレームで、アセンブリ－活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。このＡＡＰタンパク質は、カプシドアセンブリに対する足場の機能を提供すると考えられる。
【0005】
ＡＡＶ粒子は、遺伝子治療及び遺伝子ワクチンを含む、治療用途のベクターとして、魅力的となる特徴を有する。ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を含む広範囲の細胞型に感染し、インビボで、多くの異なる組織を標的にする可能性を可能にする。ＡＡＶは、緩慢に分裂する細胞と、分裂しない細胞に感染する。治療用途では、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が使用され、そこでは、ゲノムが異種導入遺伝子を含み、及び、典型的には、ＩＴＲを保持しているが、ウイルスｒｅｐ、ｃａｐ、及びａａｐ遺伝子を欠いている。Ｒｅｐタンパク質が存在しない場合、ＩＴＲに隣接した導入遺伝子は、転写活性のある核外染色体要素またはエピソームを形成することができ、この核外染色体要素またはエピソームは、本質的に、形質導入された細胞の寿命にわたり持続することができる。
【0006】
ｒＡＡＶベクターを産生するための細胞培養系は、ヒト細胞株の一過性トランスフェクション及び哺乳動物または昆虫細胞株の感染を含む。ｒＡＡＶベクター生成方法は、一般的に、ｒＡＡＶ複製及びパッケージングに必要な追加の遺伝子産物の供給源として、ヘルパーベクター（例えば、ヘルパープラスミド、ヘルパーウイルス）と組合せて、ベクター生成のための生合成機構を提供する、生殖細胞型を含む。
【0007】
ｒＡＡＶベクター産生方法の重要な目標は、ＡＡＶカプシド化された残存ＤＮＡ不純物や空のカプシドを含む、産生物関連不純物の生成を最小限に抑えながら、安定した、高いベクター生産性を達成することである。細胞１つ当たり生成されるベクターゲノム（ＶＧ）として測定すると、ｒＡＡＶベクターの生産性は、細胞１つ当たり１０３未満～２×１０５ＶＧの範囲で、非常に可変であり得る。高い費用対効果に加えて、高い生産性の重要な利点は、出発原料が全採取バイオマスに対するｒＡＡＶベクター生成物の比率がより高い場合に、精製がより効率的であってもよいことにある。
【0008】
産生物関連不純物は、ｒＡＡＶベクター自体に類似し、精製プロセス中に、ｒＡＡＶベクターから容易に分離することができない。現在のｒＡＡＶベクター産生システムでは、ＡＡＶ空カプシドが高レベルで生成される。ＡＡＶ２については、細胞培養中に生成された全ＡＡＶ粒子の５０～９５％が、空カプシドである。しかしながら、ＡＡＶカプシドに対する潜在的な有害な免疫応答を制限するには、細胞培養中に空カプシドの生成を最小限に抑え、及び／またはベクター精製中にそれらを実質的に除去することが賢明である。したがって、ｒＡＡＶ生産性を増大させ、及び／または空カプシドなどの産生物関連不純物を低減する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0009】
本開示は、特定の塩、特に、カルシウム塩、例えば、塩化カルシウムを、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）産生培地に添加することによって、ＡＡＶベクターを作成するための、方法を提供する。本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の産生方法であって、以下を含む方法が記載される：
（ｉ）培養培地を含有する少なくとも１つの培養容器内の、細胞数を増加させることを含む、拡大相；
（ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ、及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを、細胞内に導入すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を培養し、かつ培養培地中のカルシウム（Ｃａ）イオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満になるように、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、約０～約２４時間に、培養培地にＣａイオン（すなわち、Ｃａ２＋の塩）を添加することを含む、産生相（ここで、ｒＡＡＶ粒子が生成される）、ならびに
（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を単離すること。
（ｉ）培養培地を含有する少なくとも１つの培養容器内の、細胞数を増加させることを含む、拡大相；
（ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ、及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを、細胞内に導入すること；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を培養し、かつ培養培地中のカルシウム（Ｃａ）イオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満になるように、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、約０～約２４時間に、培養培地にＣａイオン（すなわち、Ｃａ２＋の塩）を添加することを含む、産生相（ここで、ｒＡＡＶ粒子が生成される）、ならびに
（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を単離すること。
【0010】
本方法の実施形態では、培養培地へのＣａイオンの添加は、ＣａＣｌ２などの、Ｃａ塩の添加を含む。カルシウムイオンは、培養培地中のＣａイオンの濃度に、約０．５ｍＭ～約９ｍＭの間、約１ｍＭ～約９ｍＭの間、約１ｍＭ～約８ｍＭの間、約１ｍＭ～約７ｍＭの間、約２ｍＭ～約９ｍＭの間、約２ｍＭ～約８ｍＭの間、約２ｍＭ～約７ｍＭの間、約２ｍＭ～約６ｍＭの間、約２ｍ～約５ｍＭの間、または約２ｍＭ～約４ｍＭの間、添加される。実施形態では、カルシウムイオンは、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍ、または約９．５ｍの濃度に、添加される。実施形態では、カルシウムイオンは、約０．５ｍＭ～約６ｍＭ；約２ｍＭ～約６ｍＭ、約２ｍＭ～約４ｍＭ、または約１ｍＭ～約３ｍＭの濃度に、産生培養培地に添加される。
【0011】
いくつかの実施形態では、Ｃａイオン（Ｃａ塩、例えば、ＣａＣｌ２）は、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの導入後、または産生相の開始時（すなわち、導入後約０時間）に添加される。実施形態では、Ｃａイオンは、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、または産生相の開始後、約０時間～約２４時間（例えば、０、約１、約２、約５、約８、約１２、約１８、約２３、約２４、約２４．５時間）の、任意の時間に添加される。実施形態では、Ｃａイオンは、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、または産生相の開始後、約０時間～約１８時間の、任意の時間に添加される。実施形態では、Ｃａイオンは、第一のポリヌクレオチド配列の導入または産生相の開始後、約６時間～約２０時間、約６時間～約１８時間、または約６時間～約１２時間の、任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、Ｃａイオンは、培養培地中のＣａの総濃度が約２ｍＭとなるように、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の、少なくとも１つの導入（または、産生相の開始）後、約１２時間に添加される。
【0012】
本方法の実施形態では、拡大相培養培地、及び／または産生相培養培地は、血清を含まない。実施形態では、拡大相及び／または産生相は、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上を、拡大相培養培地及び／または産生相培養培地に添加することを含む。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの１つ以上であってもよい。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの少なくとも１つを含む溶液は、例えば、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの導入後、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、及び／または約７２時間に、産生相開始後、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、及び／または約７２時間に、産生相培養培地に添加されてもよい。
【0013】
本方法の実施形態では、拡大相及び／または産生相は、凝集抑制補助剤を、拡大相培養培地及び／または産生相培養培地に添加することを含む。実施形態では、凝集抑制補助剤には、デキストラン硫酸、ヘパリン、及び／または細胞の凝集を抑制する他の硫酸化グリコサミノグリカンが含まれる。実施形態では、凝集抑制補助剤は、約２５μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、例えば、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、及び／または約２００μｇ／ｍｌの濃度に培地に添加されてもよい、ヘパリンナトリウムを含む。実施形態では、凝集抑制補助剤は、産生相に添加されないか、または産生相の終了時、単離ステップ直前にのみ添加され、例えば、産生されたｒＡＡＶ粒子を単離するステップの、約１０時間以内、約５時間以内、約４時間以内、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内に、添加される。
【0014】
実施形態では、産生相は、ソルビトールを産生相培地に添加することを含む。実施形態では、ソルビトールは、産生相中の１つ以上の時点で、産生相培地に添加され、例えば、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つの導入後、約６時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間（すなわち、産生相開始後、約６時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間）に添加される。実施形態では、ソルビトールは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの濃度に、産生培地に添加される。実施形態では、ソルビトールは、約１００ｍＭの濃度に、産生培地に添加される。
【0015】
実施形態では、産生相は、少なくとも約４８時間（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、または９７時間）である。好ましい実施形態では、産生相は、約７２時間～約１００時間、約９０時間～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４時間～約９８時間である。一実施形態では、産生相は、約９６時間である。
【0016】
本方法の実施形態では、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つは、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターのトランスフェクションによって、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含む１つ以上のウイルスベクターの感染によって、１つ以上のベクターのトランスフェクションと１つ以上のウイルスの感染との組合せによって、または第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列のエレクトロポレーションによって、細胞内に導入される。実施形態では、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つは、トランスフェクションによって細胞内に導入される。
【0017】
本方法の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質またはレポータータンパク質をコードする。導入遺伝子の例の非排他的なリストには、ＲＰＧＲ、ＲＰＥ６５、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、及びＣＮＧＢ３が含まれる。いくつかの実施形態では、２つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。本方法では、ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＡＰＨＰ．５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２－レトロ、ＡＡＶ９－レトロ、及びそれらのハイブリッドなどの、ＡＡＶ血清型またはＡＡＶ変異体であってもよい。実施形態では、１つ以上のヘルパー遺伝子には、１つ以上のアデノウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子、またはバキュロウイルス遺伝子の、全部または一部が含まれてもよい。
【0018】
本方法の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）は、懸濁液中での培養に適合させてもよい。少なくとも１つの培養容器は、例えば、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクタの、１つ以上であってもよい。実施形態では、拡大相用の培養培地は、約７．１～約７．５（例えば、約７．２～約７．４）のｐＨを有してもよく、細胞を培養するステップは、ＣＯ２スパージングを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つを導入するステップの前に、培養培地のｐＨを、約６．９～約７．３の間でドリフトさせる。実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトを細胞内に導入する前に、培養培地のｐＨを約６．９に変化させ、ＣＯ２スパージングを停止させる。
【0019】
実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を単離することは、産生相後に細胞を溶解するステップを含む。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び／または第三のポリヌクレオチド配列の導入（上記ステップ（ｉｉ））後、約４８時間以上（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、９７時間）に、単離されてもよい。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の導入後、約９０～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４～約９８時間に、単離されてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び／または第三のポリヌクレオチド配列の導入後、約９６時間（例えば、上記ステップ（ｉｉ）後、約９６時間）に、単離される（例えば、細胞を溶解する）。実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、溶解物中に存在し、溶解物は、少なくとも１つのフィルタを使用して清澄化され、清澄化された溶解物をもたらす。そのような実施形態では、方法は、清澄化された溶解物を１つ以上の精製ステップに供することを、更に含んでもよい。任意の適切な精製ステップ（複数可）、例えば、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー、及び／またはイオン交換クロマトグラフィーの、１つ以上を使用してもよい。実施形態では、方法は、細胞１つ当たり少なくとも約４０，０００～約２００，０００のｒＡＡＶ粒子を提供し、及び／または１リットルのトランスフェクトされた培養培地から、精製されたｒＡＡＶ粒子約８×１０１２～約１×１０１４の平均収率を提供する。実施形態では、方法は、少なくとも約３０％、例えば、約３０％～４０％、少なくとも６５％、約６５％～９０％などの、ｒＡＡＶ粒子対空ＡＡＶ粒子比を提供する。実施形態では、方法は、溶解物または清澄化された溶解物の一部から、カプシド濃度、ウイルスゲノム力価、及びｒＡＡＶ粒子対空ＡＡＶ粒子比の、少なくとも１つを決定することを更に含む。本方法の実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、空ＡＡＶ粒子から分離される。
【0020】
また、本発明は、本方法によって産生されたｒＡＡＶ粒子集団、及びｒＡＡＶ粒子集団を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1A】ＲＰＧＲ導入遺伝子を含むｒＡＡＶ５ベクターを産生するためのフラスコモデルにおける、Ｃａ２＋補充の結果を示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ＲＰＧＲトランスジーンプラスミド、ヘルパープラスミド、及びＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドでトランスフェクトし、０．５ｍＭまたは２ｍＭのＣａＣｌ２を、トランスフェクション後、６時間または２０時間のいずれかで添加した。トランスフェクション後、７２時間または９６時間のいずれかで、細胞を溶解させた。７２時間及び９６時間のトランスフェクション後溶解物における、ＡＡＶ５－ＲＰＧＲの、ベクターゲノム（ＶＧ）、及びカプシドの全：空（Ｆ：Ｅ）比が提供される。
【図1B】ＧＡＤ６７導入遺伝子を含むｒＡＡＶ２ベクターを産生するためのフラスコモデルにおける、Ｃａ２＋補充の結果を示すグラフである。ＨＥＫ２９３細胞を、ＧＡＤ６７トランスジーンプラスミド、ヘルパープラスミド及びＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後、２０時間または２４時間で、１００ｍＭのソルビトール、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、または２ｍＭのＣａＣｌ２／ＭｇＣｌ２を、培養培地に添加した。トランスフェクション後、７２時間または９６時間のいずれかで、細胞を溶解させた。７２時間及び９６時間のトランスフェクション後溶解物における、ＡＡＶ２－ＧＡＤ６７の、ベクターゲノム（ＶＧ）が提供される。
【図2】Ａ及びＢは、２５０ｍＬのバイオリアクタにおける、産生相中の、Ｃａ２＋補充、凝集抑制剤（ＡＣＡ）の添加、及び／または濃縮された必須栄養素フィードの添加後の、ｒＡＡＶ２産生を示すグラフである。Ａは、（トランスフェクション後）９６時間の採取からの溶解物における、ＶＧ力価をＶＧ／ｍＬとして示す。Ｂは、（トランスフェクション後）９６時間の採取からの溶解物における、全対空（Ｆ：Ｅ）比（百分率）を示す。
【図3】Ａ及びＢは、トランスフェクション後１２時間での、異なる塩の添加からの、ｒＡＡＶ２産生に対する効果を示すグラフである。Ａは、ＶＧ力価をＶＧ／ｍＬとして示し、Ｂは、Ｆ：Ｅ比（百分率）を示す。
【図4】Ａ及びＢは、トランスフェクション後－１～２４時間での、２ｍＭへのＣａＣｌ２添加からの、ｒＡＡＶ２産生に対する効果を示すグラフである。対照は、ＡＡＶ２－無塩であった。Ａは、ＶＧ力価をＶＧ／ｍＬとして示し、Ｂは、Ｆ：Ｅ比（百分率）を示す。
【図5】Ａ及びＢは、トランスフェクション後１２時間での、０ｍＭ（対照）～１０ｍＭの濃度へのＣａＣｌ２の添加からの、ｒＡＡＶ２産生に対する効果を示すグラフである。Ａは、ＶＧ力価をＶＧ／ｍＬとして示し、Ｂは、Ｆ：Ｅ比（百分率）を示す。
【図6】Ａ及びＢは、トランスフェクション後１２時間での、２ｍＭへのＣａＣｌ２の添加の、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、またはｒＡＡＶ８産生に対する効果を示すグラフである。Ａは、ＶＧ力価をＶＧ／ｍＬとして示し、Ｂは、Ｆ：Ｅ比（百分率）を示す。
【発明の詳細な説明】
【0022】
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生方法を提供する。ｒＡＡＶ粒子を産生する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）培養培地を含有する少なくとも１つの培養容器内の、細胞数を増加させることを含む、拡大相；
（ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを、細胞内に導入するステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を培養し、かつ培養培地中のカルシウム（Ｃａ）イオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満になるように、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、約０～約２４時間に、培養培地にＣａイオンを添加することを含む、産生相、ならびに
（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を単離するステップ。
（ｉ）培養培地を含有する少なくとも１つの培養容器内の、細胞数を増加させることを含む、拡大相；
（ｉｉ）ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に隣接する導入遺伝子を含む、第一のポリヌクレオチド配列と、及び任意選択的に、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含む、第二のポリヌクレオチド配列と、及び／または１つ以上のヘルパー遺伝子を含む、第三のポリヌクレオチド配列とを、細胞内に導入するステップ；
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を培養し、かつ培養培地中のカルシウム（Ｃａ）イオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満になるように、第一のポリヌクレオチド配列の導入後、約０～約２４時間に、培養培地にＣａイオンを添加することを含む、産生相、ならびに
（ｉｖ）ｒＡＡＶ粒子を単離するステップ。
【0023】
本発明はまた、本方法によって産生されたｒＡＡＶ粒子集団、及びｒＡＡＶ粒子集団を含む医薬組成物を提供する。
【0024】
実施形態では、本方法は、増加した産生力価、及び／またはより高い全：空カプシドの比（Ｆ：Ｅ）を提供する。より具体的には、本開示は、例えば、Ｃａイオン（例えば、ＣａＣｌ２などの、カルシウム塩）を産生培地に添加することによって、トランスフェクトされた細胞による、ｒＡＡＶの産生力価、及び／またはＦ：Ｅ比を増加させる方法を提供する。実施形態では、産生力価は、Ｃａイオンが産生培地に添加されない場合の産生力価と比較して、約１．５倍、約１．８倍、約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍、またはそれ以上、増加する。実施形態では、Ｆ：Ｅ比は、Ｃａイオンが産生培地に添加されない場合のＦ：Ｅ比と比較して、約１．３倍、約１．５倍、約２倍、約５倍、約８倍、約１０倍、約１２倍、またはそれ以上、増加する。
【0025】
本方法は、製造規模に対して、例えば、約５～約１０リットル、約１０～約２０リットル、約２０～約５０リットル、約５０～約１００リットル、約１００～約２００リットル、またはそれ以上の培養物に、拡大可能であり、多様なＡＡＶ血清型／カプシド変異体を含むｒＡＡＶに適用可能である。
【0026】
本明細書に開示される方法によって産生されたｒＡＡＶベクターは、標的細胞において導入遺伝子を発現するのに有用である。これらのｒＡＡＶベクターは、標的細胞で維持発現され得る導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを、標的細胞内に導入することができるため、遺伝子治療に使用することが可能であり、ｒＡＡＶベクターは、ヒト患者の標的細胞に異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療用タンパク質またはレポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、及びタンパク質発現のための調節因子）を送達することが可能である。導入遺伝子の例の非排他的なリストには、ＲＰＧＲ、ＲＰＥ６５、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、及びＣＮＧＢ３が含まれる。いくつかの実施形態では、２つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。本方法では、ＡＡＶｃａｐ遺伝子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＰＨＰ．５、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２－レトロ、ＡＡＶ９－レトロ、及びそれらのハイブリッドなどの、ＡＡＶ血清型またはＡＡＶ変異体であってもよい。実施形態では、１つ以上のヘルパー遺伝子には、１つ以上のアデノウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス１型遺伝子、またはバキュロウイルス遺伝子の、全部または一部が含まれてもよい。
【0027】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドを標的細胞内に導入するためのビヒクルを指す。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター、ＨＳＶベクター）もしくはプラスミドなどの非ウイルスベクター、またはリポソーム、ゼラチン、もしくはポリアミンなどの化合物に関連したＤＮＡであってもよい。発現ベクターは、宿主細胞または標的細胞における発現のための調節因子を有する、遺伝子産物（例えば、タンパク質またはＲＮＡ）をコードする、ポリヌクレオチド配列を含むベクターである。
【0028】
「ｒＡＡＶ」、「ｒＡＡＶベクター」、「ｒＡＡＶ粒子」、または「ｒＡＡＶビリオン」は、エクスビボ、インビトロ、またはインビボの、標的細胞のその後の感染のために、カプシドタンパク質にパッケージングされる（すなわち、カプシドタンパク質によってカプシド化される）、組換えＡＡＶベクターゲノムを指す。これらの語句は、標的細胞で発現すべき導入遺伝子を含む、完全な組換えＡＡＶゲノムを欠く、空のＡＡＶカプシド及びＡＡＶカプシドを除外している。したがって、カプシドに加えて、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶゲノムを含む。「ｒＡＡＶゲノム」または「ｒＡＡＶベクターゲノム」は、ｒＡＡＶ粒子を形成するように、最終的にパッケージングまたはカプシド化される、目的の導入遺伝子を含むポリヌクレオチド配列を指す。典型的には、ｒＡＡＶについては、ＡＡＶゲノム（例えば、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びａａｐ遺伝子を含む）の大部分が削除されており、一方または両方のＩＴＲ配列は、導入遺伝子とともにｒＡＡＶゲノムの一部として残存している。本明細書で使用される「導入遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質またはレポータータンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列、及び標的細胞での遺伝子産物の発現のための調節因子を指す。
【0029】
「空カプシド」及び「空粒子」は、ＡＡＶカプシドシェルを有するが、導入遺伝子配列と１つまたは２つのＩＴＲとを含む組換えＡＡＶゲノム全体または一部が欠失している、ＡＡＶ粒子を指す。そのような空カプシドは、導入遺伝子を１つ以上の標的細胞内に導入する機能はない。実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、空ＡＡＶ粒子から分離される。
【0030】
ｒＡＡＶゲノム（例えば、ＩＴＲを含む）は、同一の株もしくは血清型（または、サブグループもしくは変異体）に基づいていてよく、またはそれらが互いに異なっていてもよい。非限定的な例として、１つの血清型ゲノムに基づく、ｒＡＡＶプラスミド、またはベクターゲノムもしくは粒子（カプシド）は、ベクターゲノムをパッケージングする１つ以上のカプシドタンパク質と同一であってもよい。更に、ｒＡＡＶゲノムは、ｒＡＡＶベクターゲノムをパッケージングする１つ以上のカプシドタンパク質とは異なる、ＡＡＶゲノムから誘導してもよい（例えば、ＡＡＶ２ゲノムから誘導される、１つ以上のＩＴＲを含む）。
【0031】
本明細書に開示されている方法によって産生されてもよいｒＡＡＶベクターには、任意のＡＡＶ株または血清型に由来するカプシド及びゲノムを含む、任意のｒＡＡＶベクターが含まれる。非限定的な例として、ｒＡＡＶベクターカプシド及び／またはゲノムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＰＨＰ－５、ＡＡＶ－ＰＨＰ－Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ－ｅＢ、ＡＡＶ２－レトロ、ＡＡＶ９－レトロ、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｒｈ、ＡＡＶｒｈ．１０（すなわち、ＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ及びＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）などに基づいてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、同一のＡＡＶ株または血清型に由来するゲノム及びカプシドタンパク質を含む。例えば、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ２ベクター（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）であってもよい。
【0032】
実施形態では、ＡＡＶベクターは、１つのＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、及び異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質を含む、偽型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態では、偽型ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ２／５（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／８（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／９（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ）、ｒＡＡＶ２／１０（すなわち、ＡＡＶ２ ＩＴＲ及びＡＡＶ１０カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ）である。実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２変異体ｒＡＡＶ２－レトロ（国際公開第２０１７／２１８８４２号からの配列番号４４、参照により本明細書に組み込まれる）などの変異体ＡＡＶカプシドである、カプシドタンパク質を含む。
【0033】
細胞系
【0034】
本明細書に記載されるｒＡＡＶベクター産生方法は、一般的に、例えば、（ｉ）ｒＡＡＶ産生のための許容宿主細胞（プロデューサー細胞）、（ｉｉ）例えば、アデノウイルスヘルパー機能を提供する遺伝子を含む適切なコンストラクトによって供給され得る、ヘルパーウイルス機能、（ｉｉｉ）トランスパッケージングｒｅｐ／ｃａｐコンストラクト、及び（ｉｖ）適切な産生培地を含む、特定の要素を必要とする。
【0035】
プロデューサー細胞は、ｒＡＡＶゲノムコンストラクト、ヘルパー機能コンストラクト、及びＡＡＶ機能を提供するコンストラクト（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）が存在する場合に、ｒＡＡＶを産生するための許容宿主細胞である、任意の細胞である。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫も含まれてもよい。したがって、プロデューサー細胞はまた、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた宿主細胞、またはそのＤＮＡ配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれた宿主細胞の子孫である。単一の親細胞の子孫は、自然的、偶発的、または意図的な突然変異のために、形態、またはゲノムＤＮＡ補体もしくは総ＤＮＡ補体において、元の親と必ずしも完全に同一である必要はないことが、理解される。
【0036】
実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を産生するために使用される細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、及びＨｅＬａ細胞を含む、哺乳動物細胞である。例示的なプロデューサー／宿主細胞には、ＨＥＫ２９３などの、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞が含まれる。好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、懸濁液に適合したＨＥＫ２９３細胞を含む、懸濁液中での成長のために適合される。更に好ましい実施形態では、プロデューサー細胞は、無血清培地中での増殖のために適合される。実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクタの、１つ以上であってもよい、少なくとも１つの培養容器内で増加する。
【0037】
本明細書に開示されるｒＡＡＶ産生方法で使用されてもよい、プロデューサー細胞株には、哺乳動物または昆虫細胞株が含まれる。用語「細胞株」は、適切な培養条件下で、インビトロで、連続的または長期の増殖及び分裂が可能な細胞集団を指す。細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。細胞株では、このようなクローン集団の保管または移動の間、ならびに組織培養における長期の継代の間、核型において、自発的または誘発される変化が生じてもよい。したがって、細胞株に由来する子孫細胞は、先祖細胞または培養物と、正確に同一ではなくてもよい。
【0038】
ｒＡＡＶ産生を行うためには、プロデューサー細胞株は、ｒＡＡＶゲノム産生コンストラクト、ヘルパー機能コンストラクト、及び／またはＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐコンストラクトの１つ以上が、プロデューサー細胞内に存在することが必要となる場合がある。これらは、３つのコンストラクト（例えば、３つのプラスミド）として導入されてもよく、またはプロデューサー細胞は、これらの機能の一部または全てを安定的にプロデューサー細胞ゲノムに組み込む、１つ以上のコンストラクトを既に有していてもよい。本明細書で使用される場合、細胞に関する用語「安定した」または「安定的に組み込まれた」は、選択可能なマーカー、及び／または異種核酸配列もしくはプラスミドもしくはベクター（もしくは、その一部）などの核酸配列が、（例えば、相同組換え、非相同末端結合、トランスフェクションなどによって）染色体に挿入されているか、または染色体外でレシピエント細胞もしくは宿主生物に保持されており、染色体内に残存していたか、もしくは染色体外に一定時間保持されていることを、意味する。
【0039】
プロデューサー細胞株の拡大
【0040】
本明細書に記載の方法の実施形態では、（ｒＡＡＶゲノムを含む）ｒＡＡＶゲノム産生コンストラクト、及び／またはヘルパーウイルス機能及びＡＡＶ機能を提供する他のコンストラクトを導入するステップ前に、拡大相または拡大ステップを使用して、プロデューサー細胞の数を増加させる。拡大相または拡大ステップを、１つ以上の細胞培養容器において実施してもよい。例えば、拡大相または拡大ステップを、体積が増加する一連の細胞培養容器において実施してもよい。プロデューサー細胞株の拡大に使用される細胞培養培地は、プロデューサー細胞の増殖（すなわち、数の増加）に適切な、任意の培地であってもよい。好ましい実施形態では、拡大相培養培地は動物成分を含まず、例えば、血清または動物由来の他の成分を含まない。化学的に規定された、動物成分を含まない培地は、市販されている。
【0041】
実施形態では、本明細書では時に凝集抑制剤（ＡＣＡ）と呼ばれる、凝集抑制補助剤が、細胞凝集を低減するために拡大培地に添加される。ＡＣＡは、例えば、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されている。凝集抑制補助剤は、１つ以上の時点で、拡大相培養培地に添加されてもよい。実施形態では、凝集抑制補助剤には、デキストラン硫酸、ヘパリン、及び／または細胞の凝集を抑制する他の硫酸化グリコサミノグリカンが含まれる。実施形態では、凝集抑制補助剤は、約２５μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、例えば、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、及び／または約２００μｇ／ｍｌの濃度に培地に添加されてもよい、ヘパリンナトリウムを含む。
【0042】
実施形態では、拡大相培養培地は、約２ｍＭ～約６ｍＭ（例えば、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、または約６ｍＭ）の濃度の、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上を含み、及び／またはこれらを含むように補充される。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの、１つ以上であってもよい。ジペプチドＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンとして提供されるグルタミン補充剤の、市販されている例は、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）である。
【0043】
実施形態では、拡大相培養培地は、非イオン性ポリオール界面活性剤、例えば、ポロキサマー１８８（ポリエチレン及びポリプロピレンエーテルグリコールのコポリマー）を含み、及び／またはこれを含むように補充される。実施形態では、非イオン性ポリオール界面活性剤は、拡大相培養培地中に、約０．０５％～約０．２％（ｗ：ｖ）（例えば、約０．０５％、約０．１％、約０．１％、または約０．２％）で存在する。実施形態では、拡大相培養培地は、約４ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンジペプチド、及び０．１％（ｗ：ｖ）のポロキサマー１８８を含む。
【0044】
実施形態では、拡大相培養培地のｐＨは、約７．１～約７．５（例えば、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４または約７．５）のｐＨで維持される。実施形態では、ｐＨは、ＣＯ２スパージングによって、約７．２～約７．４で維持される。実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトを細胞内に導入する前に、培養培地のｐＨを約６．９に変化させ、ＣＯ２のスパージングを停止させる。
【0045】
１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトの導入
【0046】
ｒＡＡＶベクターの産生は、典型的には、基本的な生合成機構を提供するプロデューサー細胞株、ならびに（ｉ）ｒＡＡＶゲノム（目的の導入遺伝子及びＡＡＶ ＩＴＲに隣接する関連する調節因子）を提供するコンストラクト、及び（ｉｉ）ｒＡＡＶベクター産生を指示するのに必要な遺伝子産物を提供する追加の遺伝子を含む１つ以上のコンストラクト、を必要とする。これらの追加の遺伝子には、ベクターゲノムの複製及びパッケージングを支援するのに必要な、ＡＡＶ由来の遺伝子（例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ）、ならびにヘルパーウイルス由来の遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ）が含まれる。
【0047】
本方法の実施形態では、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つは、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターのトランスフェクションによって、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含む１つ以上のウイルスの感染によって、１つ以上のベクターのトランスフェクションと１つ以上のウイルスの感染との組合せによって、または第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列のエレクトロポレーションによって、細胞内に導入される。
【0048】
「ヘルパーウイルス遺伝子」または「ヘルパーウイルス由来の遺伝子」とは、ＡＡＶ遺伝子産物が複製に依存している、非ＡＡＶ由来のウイルス遺伝子を指す。この用語には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、及びＡＡＶ ＤＮＡ複製に関与するものを含む、ＡＡＶ複製において必要なタンパク質及び／またはＲＮＡが含まれる。ヘルパーウイルス遺伝子は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアウイルスなどの、既知のＡＡＶヘルパーウイルスのいずれかから、誘導されてもよい。したがって、「ヘルパーウイルス機能」は、ＡＡＶ産生に必要なヘルパーウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、及びＶＡ）によって提供されるこれらの機能を指す。これらのヘルパーウイルス機能は、プロデューサー細胞内に導入された１つ以上のベクター上に提供してもよく、安定的にプロデューサー細胞によって発現してもよく、あるいは両者の組合せとしてもよい。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ機能」または「ＡＡＶアクセサリ機能」は、産生的ＡＡＶ複製及びパッケージングのために、トランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために、プロデューサー細胞で発現され得るＡＡＶ由来のコード配列を指す。したがって、ＡＡＶ機能には、ｒｅｐ及びｃａｐを含めたＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、特定のＡＡＶ血清型のａａｐなどの他のものとが含まれる。このようなＡＡＶ機能は、１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトによって提供されており、これは、プラスミドベクター、非プラスミドベクター、またはＡＡＶヘルパー機能を提供する、プロデューサー細胞の染色体に組み込まれたポリヌクレオチドコンストラクトであってもよい。本明細書に開示された方法で使用されてもよいＡＡＶ機能を提供するプラスミドは、市販されている。
【0050】
本方法の実施形態では、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子は、プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）によって構成的に発現され、一方、他のヘルパーウイルス遺伝子は、例えば、ＡＡＶ産生に必要な残りのヘルパーウイルス遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトのトランスフェクションによって、プロデューサー細胞内に導入される。ＡＡＶ由来の遺伝子（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）は、１つ以上のヘルパーウイルス遺伝子を含む同一のポリヌクレオチドコンストラクト中に含まれてもよく、別々のポリヌクレオチドコンストラクト上に含まれてもよく、ｒＡＡＶゲノムを含むポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、ｒＡＡＶゲノム産生ベクター）がプロデューサー細胞株に導入された後に、ｒＡＡＶ粒子が生成される。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、（ｉ）ｒＡＡＶゲノム産生ベクターと、ならびに（ｉｉ）ヘルパーウイルス遺伝子（例えば、Ｅ４、Ｅ２ａ、及びＶＡ）及びＡＡＶ遺伝子（例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ）を提供する１つ以上のベクターとを、プロデューサー細胞に一過的にトランスフェクトした後に産生される。実施形態では、これらのベクターは、プラスミドである。
【0051】
本明細書に開示された方法の実施形態では、拡大相に続いて、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含む第一のポリヌクレオチドコンストラクトと、ならびにヘルパーウイルス遺伝子及びＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とを含む第二のポリヌクレオチドコンストラクトとが、拡大されたプロデューサー細胞内に導入される。第一の、及び第二のポリヌクレオチドコンストラクトがプラスミドである場合、この系は、２プラスミド系と呼ばれてもよい。
【0052】
本明細書に開示された方法の実施形態では、拡大相に続いて、ＩＴＲに隣接する導入遺伝子を含む第一のポリヌクレオチドコンストラクトと、ヘルパーウイルス遺伝子を含む第二のポリヌクレオチドコンストラクトと、ならびにＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とを含む第三のポリヌクレオチドコンストラクトとが、拡大されたプロデューサー細胞内に導入される。第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチドコンストラクトがプラスミドである場合、この系は、３プラスミド系と呼ばれてもよい。
【0053】
１つ以上の組換えプラスミドを使用してｒＡＡＶベクターを産生する場合、「ｒＡＡＶゲノム産生プラスミド」は、導入遺伝子（調節配列に作動可能に連結されている）、及びｒＡＡＶへのパッケージングを意図した１つ以上のＩＴＲを含むプラスミド、ならびにプラスミドのクローニング及び増幅に重要であるが、ｒＡＡＶベクターにパッケージングまたはカプシド化されない非ｒＡＡＶゲノム成分（プラスミド骨格）を指す。
【0054】
用語「導入」及び「トランスフェクト」は、宿主細胞または標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指す。実施形態では、宿主細胞は、プロデューサー細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。実施形態では、ｒＡＡＶゲノム産生プラスミドは、ヘルパーウイルス機能及びＡＡＶ機能を提供する１つ以上のプラスミドと一緒に、一過性トランスフェクション法によってプロデューサー細胞内に導入される。導入遺伝子及びＩＴＲ（複数可）（例えば、ｒＡＡＶゲノム産生ベクター）を含む第一のポリヌクレオチドコンストラクト、ならびに任意選択的に、ＡＡＶ機能（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）及びヘルパーウイルス機能を提供する、第二の、及び／または第三のポリヌクレオチドコンストラクトを導入する、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム共沈、カチオン性脂質ベースのトランスフェクション、及びカチオン性ポリマーベースのトランスフェクションを含む、標準的なトランスフェクション法によって達成されてもよい。カチオン性脂質ベースのトランスフェクションには、例えば、リポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ（２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンジニウムトリフルオロアセート）、及びＤＯＰＥ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）の、３：１混合物）が含まれる。カチオン性ポリマーベースのトランスフェクションには、例えば、直鎖状、及び／または分枝鎖状の、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－アルギニン、及びポリアミドアミンデンドリマーなどが含まれる。実施形態では、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションは、ＰＥＩベースのトランスフェクション試薬を使用して行われる。ＰＥＩは、直鎖状または分枝鎖状ポリマーであってもよい。実施形態では、ＰＥＩは、２０～２５ｋＤの直鎖状ＰＥＩである。例えば、実施形態では、ＰＥＩは、ｊｅｔＰＥＩまたはＰＥＩｐｒｏ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓから入手可能）である。加えて、プロデューサー細胞の一過性トランスフェクションを、カチオン性脂質とカチオン性ポリマーとの両方を含むトランスフェクション試薬を使用して行ってもよい。
【0055】
ｒＡＡＶは、代替的には、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞（例えば、ｓｆ９細胞）内で、またはＨＳＶ感染ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＢＨＫ２１）内で、産生されてもよい。いずれの方法でも、ｒＡＡＶ産生は、ｒＡＡＶゲノムを保有する２つ以上の組換えウイルスと、１つ以上のＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ、ならびにｒＡＡＶ複製及びパッケージングに必要なヘルパーウイルス機能との同時感染によって、宿主細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞内で各々誘発される。
【0056】
ｒＡＡＶ粒子の産生
【0057】
本明細書に開示される方法は、ｒＡＡＶゲノムベクター、及び／またはヘルパーウイルス機能及び／またはＡＡＶ機能を提供するベクターを、プロデューサー細胞内に導入するステップ後、産生相（産生ステップとも呼ばれる）を含む。本明細書に記載の方法では、ｒＡＡＶゲノムベクターの導入後、少なくとも約４８時間（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、または９７時間）にわたり細胞を培養することによって、ｒＡＡＶ粒子を産生する。実施形態では、トランスフェクトされたプロデューサー細胞を、約７２～約１００時間、約９０時間～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４～約９８時間培養する（すなわち、産生相を維持する）。実施形態では、産生相は、約９６時間維持される。
【0058】
産生相培地は、プロデューサー細胞におけるｒＡＡＶの産生に適切な、任意の細胞培養培地であってもよい。実施形態では、産生培地は、血清などの動物性産物を含まない。この文脈において「含まない」とは、培地が、血清などの動物性産物の検出不可能なレベルを有することを意味する。実施形態では、産生培地のｐＨは、拡大相培地のｐＨと比較して低下している。実施形態では、産生培地は、約６．８～約７．４（例えば、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、または約７．１４）のｐＨで維持される。実施形態では、ｐＨは、約６．９～約７．３で維持される。
【0059】
本方法の実施形態では、産生相は、産生相細胞培養培地へのカルシウムイオンの添加を含む。従来技術では、細胞凝集を低減または防止するために、懸濁細胞培養プロセスで使用される培地製剤において、カルシウムイオンのレベルは、典型的には、低レベル（通常は、約０．１ｍＭ）で維持される。細胞接着に関与するタンパク質、例えば、Ｅ－カドヘリンは、カルシウム依存性である。Ｅ－カドヘリンの細胞外ドメインは、カルシウム依存性の同種親和性トランス－ダイマーを形成し、隣接する細胞との特異的な相互作用をもたらす一方で、細胞質ドメインはアクチン細胞骨格に結合している。したがって、本技術分野では、一般的に、低レベルのカルシウムを維持することが望ましいと考えられる。
【0060】
本明細書ではカルシウム補充とも呼ばれる、産生培地にカルシウムイオンを添加することは、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）をカルシウム塩、例えば、ＣａＣｌ２の形態で添加することを含む。カルシウムイオンは、産生相中、ｒＡＡＶゲノムベクターの導入後（例えば、トランスフェクション後）に１回以上添加されてもよい。例えば、カルシウムイオンは、産生相開始から（すなわち、トランスフェクション後）、約０時間～約４８時間の間の１つ以上の時間、例えば、約１時間、約６時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、及び／または約４８時間で、添加されてもよい。実施形態では、カルシウムイオンは、産生相開始後（すなわち、トランスフェクション後）、約０時間～約２４時間の間の１つ以上の時間、約０時間～約２０時間、約０時間～約１８時間、または約６時間～約１２時間で、産生培地に添加される。実施形態では、カルシウムイオンは、トランスフェクション後、約６時間で、産生相培地に添加される。
【0061】
培養培地中のカルシウムイオンの総濃度が、０．３ｍＭ超～１０ｍＭ未満となるように、カルシウムイオンを産生培地に添加してもよい。実施形態では、カルシウムイオンは、約１ｍＭ～約９ｍＭの間、約１ｍＭ～約８ｍＭの間、約１ｍＭ～約７ｍＭの間、約２ｍＭ～約９ｍＭの間、約２ｍＭ～約８ｍＭの間、約２ｍＭ～約７ｍＭの間、約２ｍＭ～約６ｍＭの間、約２ｍ～約５ｍＭの間、または約２ｍＭ～約４ｍＭの間の総濃度に添加される。実施形態では、カルシウムイオン（例えば、ＣａＣｌ２）は、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、または約９．５ｍＭの濃度に添加される。
【0062】
実施形態では、産生相は、グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上を、産生相培地に添加することを含む。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの１つ以上は、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン、グルタミン酸塩、グリシル－Ｌ－グルタミン、グルタミンタンパク質加水分解物、Ｌ－グルタミン酸、及びグルタミンジペプチドの、１つ以上であってもよい。グルタミン、グルタミン前駆体、またはグルタミンを含むアミノ酸ジペプチドの少なくとも１つを含む溶液は、例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１２時間、約２４時間、約４８時間、または約７２時間の１つ以上で、産生相培地に添加されてもよい。
【0063】
実施形態では、産生相は、ソルビトールを産生相培地に添加することを含む。ソルビトールは、産生相の間の１つ以上の時点で、例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、及び／または約４８時間で、産生相培地に添加されてもよい。実施形態では、ソルビトールは、約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約８０ｍＭ～約１２０ｍＭの濃度に、産生培地に添加される。実施形態では、ソルビトールは、約１００ｍＭの濃度に、産生培地に添加される。
【0064】
実施形態では、産生相は、凝集抑制補助剤を産生相培地に添加することを含む。凝集抑制補助剤は、１つ以上の時点で（例えば、トランスフェクション後、約６時間、約１０時間、約１２時間、約２０時間、約２４時間、約４８時間または約７２時間の１つ以上で）、産生相培養培地に添加されてもよい。実施形態では、凝集抑制補助剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、及び／または細胞の凝集を抑制する他の硫酸化グリコサミノグリカンを含む。実施形態では、凝集抑制補助剤は、約２５μｇ／ｍｌ～約２５０μｇ／ｍｌ、例えば、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、及び／または約２００μｇ／ｍｌの濃度に培地に添加されてもよい、ヘパリンナトリウムを含む。
【0065】
実施形態では、凝集抑制補助剤は、産生相培地に添加されないか、または産生相の終了直前に、例えば、産生相の終了の、約２４時間以内、約１２時間以内、約６時間以内、約３時間以内、約２時間以内、または約１時間以内にのみ、産生相培地に添加される。
【0066】
ｒＡＡＶの単離
【0067】
本明細書に記載される方法の実施形態は、産生相の終了時にｒＡＡＶ粒子を単離するステップを含む。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び／または第三のポリヌクレオチド配列の導入後（上記ステップ（ｉｉ）後、換言すれば、産生相の開始後）、約４８時間以上（例えば、４７．５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９６．５、９７時間）で、単離されてもよい。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び第三のポリヌクレオチド配列の導入後、約９０～約１００時間、約９２時間～約９８時間、または約９４～約９８時間で、単離されてもよい。実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、第一の、第二の、及び／または第三のポリヌクレオチド配列の導入、約９６時間（例えば、上記ステップ（ｉｉ）後、約９６時間）で、単離される（例えば、細胞が溶解される）。ｒＡＡＶの単離は、例えば、プロデューサー細胞を溶解するステップ、溶解物を清澄化するステップ、及び後続する精製ステップを含む、複数のステップを含んでもよい。
【0068】
ｒＡＡＶ粒子は、生成後にプロデューサー細胞内に保持されてもよく、細胞内ｒＡＡＶベクターを放出する方法は、物理的及び化学的破壊、例えば、界面活性剤の使用、マイクロ流動化、及び／または均質化を含む。細胞溶解の間、及び／または細胞溶解の後同時に、夾雑物ＤＮＡを分解するために、ベンゾナーゼのようなヌクレアーゼが添加されてもよい。
【0069】
典型的には、得られた溶解物を清澄化することで、細胞破片が除去され、清澄化された細胞溶解物が提供される。濾過技術は、細胞破片などの比較的大きな粒子からｒＡＡＶベクターを分離する（精密濾過）のに有用であり、可溶性タンパク質不純物などの比較的小さな分子からｒＡＡＶベクターを分離する（限外濾過）のにも有用である。例えば、破壊されたｒＡＡＶベクター含有細胞は、１つ以上のミクロン径の細孔径のフィルタ（例えば、０．１～１０．０μｍの細孔径のフィルタ、例えば、０．４５μｍ、及び／または細孔径０．２μｍのフィルタ）を通過させてもよい。２段階の０．４５／０．２μｍカートリッジフィルタを使用して、フィルタ透過液に回収されるｒＡＡＶベクターを、フィルタによって保持される細胞破片から、分離してもよい。実施形態では、本方法は、溶解物または清澄化された溶解物の一部から、カプシド濃度、ウイルスゲノム力価、及びｒＡＡＶ粒子と空ＡＡＶ粒子との比の、少なくとも１つを決定することを更に含む。
【0070】
清澄化された溶解物中のｒＡＡＶベクターは、超遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び接線流濾過（ＴＦＦ）を含む、１つ以上の追加の精製方法を使用することによって、更に単離（精製）されてもよい。
【0071】
実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、空ＡＡＶ粒子から分離され、方法は、少なくとも約３０％、例えば、約３０％～４０％、少なくとも６５％、約６５％～９０％などの、ｒＡＡＶ粒子対空ＡＡＶ粒子との比を提供する。ヌクレアーゼ抵抗性ＡＡＶカプセル化ＤＮＡ不純物のレベルは、ヘルパープラスミド中の関連する配列用に設計された、プライマー及びプローブを使用するｑＰＣＲによって、または高コピー数ゲノム配列に対して、評価されてもよい。ｑＰＣＲ前に行われるヌクレアーゼ処理への感受性により、ヌクレアーゼ感受性の「裸の」残留ＤＮＡ不純物と、ヌクレアーゼ不感受性のカプセル化された残留ＤＮＡ不純物とを、区別することができる。全ＡＡＶカプシドは、カプシド特異的ＥＬＩＳＡアッセイ、及びカプシド粒子力価とＶＧ力価との比較により決定された空カプシドの量を使用して、測定してもよい。分光光度法は、非ＡＡＶカプシド不純物が実質的に除去された試料に、使用してもよい。
【実施例】
【0072】
実施例１．シェーカーフラスコモデルでのＡＡＶ産生における、塩化カルシウム添加の評価
【0073】
Ｅ１２５シェーカーフラスコ内で培養したＨＥＫ２９３細胞に適合させた懸濁液において、異なる産生時点及び濃度での塩化カルシウム添加、ならびに産生長さを評価した。フラスコ法の終了時に、培養物を採取し、化学的に溶解させた。条件間の成績を、物理的カプシド及びウイルスゲノム力価に基づいて評価した。
【0074】
シードトレイン及び拡大：
【0075】
ＨＥＫ２９３細胞を、エルレンマイヤーフラスコ（Ｅ１０００）中での試験に十分な数まで拡大させ、ＣＯ２振盪培養器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓ４１ｉ）中で培養した。シードトレインフラスコに、（２００ｍｌのシード体積中１ｍＬあたり）２×１０５個の生存細胞（ＶＣ）の播種密度で播種した。このシード培地は、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．１％ｗ：ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８を補充した、化学的に規定された培地であった。播種後４８時間で、化学的に規定された培地１８０ｍＬを添加した（９：１０、フィード：シード培地体積比）。
【0076】
細胞凝集を制御するために、凝集抑制剤（ＡＣＡ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、最初の継代の間１ｍＬ／Ｌで、その後周期的に添加した。
【0077】
ＨＥＫ２９３細胞を、１インチ軌道回転１５０ｒｐｍで撹拌しながら、３７°Ｃ、ＣＯ２８％で培養した。４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．１％ｗ：ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８を補充した、化学的に規定された培地中で、細胞を培養した。
【0078】
ＡＡＶ５－ＲＰＧＲに対するトランスフェクション条件：
【0079】
Ｅ１０００のバッフルなしフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＨＥＫ２９３細胞を、約１．８～２．４×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度で、接種後９６時間で、プラスミド：ヘルパー（ｐＦＤ６ｋ，１５．４ｋｂ）；Ｒｅｐ／Ｃａｐ（ｐＲＣ２～５ｋ，８．１ｋｂ）；導入遺伝子（ｐＲＰＧＲ－ｋ，７．７ｋｂ）を、１：１：２のプラスミドコピー数比で、トランスフェクション時１０６個の生存細胞あたり総ＤＮＡ量０．９５μｇで、トランスフェクトした。
【0080】
トランスフェクション混合物を、３０ｍｇ／ＬのＤＮＡ濃度を有する、１．３：１（ｖ：ｗ）のＰＥＩ：ＤＮＡ比で調製した。トランスフェクション混合物用の培地を、化学的に規定された培養培地とした（補充なし）。ヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及び導入遺伝子コンストラクトを、培地に添加した。ＰＥＩを培地に添加して混合し、次いで、混合物をＤＮＡミックスに添加し、続いて、１５分間回転及びインキュベートした。１５分間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスをフラスコに添加し、これを、振盪培養器に戻した。
【0081】
ｒＡＡＶ２－ＧＡＤ６７に対するトランスフェクション条件：
【0082】
Ｅ１０００のバッフルなしフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＨＥＫ２９３細胞を、約１．８～２．４×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度で、接種後９６時間で、プラスミド：ヘルパー（ｐＦＤ６ｋ，１５．４ｋｂ）；Ｒｅｐ／Ｃａｐ（ｐＮＬＲｅｐ２－２～２ｋ，１０．３ｋｂ）；導入遺伝子（ｐＧＡＤ６７ｋ，７．１ｋｂ）を、２：１．５：１のプラスミドコピー数比で、トランスフェクション時１０６個の生存細胞あたり総ＤＮＡ量１．０μｇで、トランスフェクトした。
【0083】
トランスフェクション混合物を、８０ｍｇ／ＬのＤＮＡ濃度を有する、１．５：１（ｖ：ｗ）のＦｅｃｔｏＶＩＲ：ＤＮＡ比で調製した。トランスフェクション混合物用の培地を、化学的に規定された培養培地とした（補充なし）。ヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及び導入遺伝子コンストラクトを、培地に添加した。ＦｅｃｔｏＶＩＲを培地に添加して混合し、次いで、混合物をＤＮＡミックスに添加し、続いて、１５分間回転及びインキュベートした。１５分間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスをフラスコに添加し、これを、振盪培養器に戻した。
【0084】
ＡＡＶ産生条件：
【0085】
ＡＡＶ５－ＲＰＧＲプラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞については、トランスフェクション後１時間の細胞を、Ｅ１２５のバッフルなしフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に投下して、１インチ軌道回転１５０ＲＰＭで、３７℃、ＣＯ２８％でインキュベーションを継続した。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１インチ軌道回転１８０ＲＰＭで、３７°Ｃ、８％のＣＯ２でインキュベートして、及び１ＭのＣａＣｌ２ストック溶液を、トランスフェクション後、６時間または２４時間のいずれかで、０．５ｍＭまたは２．０ｍＭの濃度に添加した。対照フラスコについては、ストック溶液を添加しなかった。
【0086】
ＡＡＶ５－ＧＡＤ６７プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞については、トランスフェクション後１時間の細胞を、Ｅ１２５のバッフルなしフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に投下して、１インチ軌道回転１５０ＲＰＭで、３７℃、ＣＯ２８％でインキュベーションを継続した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１インチ軌道回転１５０ＲＰＭで、３７°Ｃ、ＣＯ２８％でインキュベートして、以下の１つ：トランスフェクション後２０時間で、４Ｍ Ｄ－ソルビトールを１００ｍＭソルビトール濃度に；トランスフェクション後２０時間で、４Ｍ ＮａＣｌストック溶液を５０ｍＭ ＮａＣｌ濃度に；トランスフェクション後２４時間で、１Ｍ ＣａＣｌ２ストック溶液を２ｍＭ ＣａＣｌ２濃度に；トランスフェクション後２４時間で、１Ｍ ＭｇＣｌ２ストック溶液を２ｍＭ ＭｇＣｌ２濃度に；トランスフェクション後２４時間で、１Ｍ ＣａＣｌ２及び１Ｍ ＭｇＣｌ２ストック溶液を２ｍＭ ＣａＣｌ２及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２濃度に、添加した。対照フラスコについては、ストック溶液を添加しなかった。
【0087】
溶解条件：
【0088】
細胞をトランスフェクション後９６時間で採取した。５０Ｘ溶解緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ－１００、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのトリス、１２５Ｕ／１０７個のベンゾナーゼ細胞の、最終濃度を達成するように配合）を、細胞培養に２％ｖ／ｖで添加し、３７°Ｃ及び１５０ＲＰＭで２時間インキュベートした。
【0089】
ウイルスカプシド及びウイルスゲノム力価の測定：
【0090】
ウイルスカプシド（ＶＣ）力価は、製造業者のガイドラインに従って、Ｐｒｏｇｅｎ（登録商標）製のＡＡＶ滴定ＥＬＩＳＡキット、またはＧｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＧＹＲＯＬＡＢ（登録商標）ＡＡＶＸ滴定キットを使用して、ＥＬＩＳＡによって行った。
【0091】
ウイルスゲノム（ＶＧ）濃度及び力価を、ｑＰＣＲによって決定した。試料をＤＮＡｓｅ Ｉ処理に供し、続いてプロテイナーゼ Ｋ処理に供した。適量のサンプルを、各導入遺伝子の特定の領域を標的とするヌクレオチド、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びＴａｑｍａｎプローブを含む、ｑＰＣＲマスターミックスと混合することによって、４つの系列希釈を評価した。標的領域を含むプラスミドＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、７点標準曲線を作成し、これを使用して、試料１つあたりのウイルスゲノム数を評価した。
【0092】
結果：
【0093】
トランスフェクション後、６時間または２０時間で、０．５ｍＭまたは２ｍＭのＣａＣｌ２を添加した後、ウイルスゲノム（ＶＧ）力価は、補充なしの対照培養と比較して、ｒＡＡＶ５に関して３．５倍増加した。図１Ａを参照のこと。Ｃａ２＋補充は、ｒＡＡＶ２に関するウイルスゲノム（ＶＧ）力価を、補充なしの対照培養と比較して、約４～５倍増加させた。図１Ｂを参照のこと。加えて、全対空カプシド（Ｆ：Ｅ）比は、対照培養において１０～１５％から、ｒＡＡＶ５に関して３０～４０％に増加した。図１Ａを参照のこと。Ｃａ２＋補充を、トランスフェクション後９６時間へと延長された産生時間と組合せた場合、ウイルスゲノム力価及びＦ：Ｅ比は、共に有意に増加した。図１Ａ及び図１Ｂを参照のこと。ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２の補充は、対照と比較して、ＶＧ力価を増加させなかったが、ソルビトールの補給は、トランスフェクション後９６時間で採取した場合、ｒＡＡＶ２のＶＧ力価に何らかの改善を提供するよう見られる。図１Ｂを参照のこと。
【0094】
実施例２：バイオリアクタにおけるＡＡＶ産生時の塩化カルシウムの添加の評価（２５０ｍｌスケール）
【0095】
この試験では、ＡＡＶ産生相の間に、２５０ｍＬのスケールの撹拌槽バイオリアクタを使用して、ＣａＣｌ２の添加、ＣａＣｌ２の添加時間、ＡＣＡ添加、ＧｌｕｔａＭＡＸの添加、及び特定のフィードの添加を評価する。
【0096】
シードトレイン：
懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３細胞を、エルレンマイヤーフラスコ（Ｅ１２５、Ｅ２５０、Ｅ５００、及びＥ１０００）中での試験に十分な数まで拡大させ、ＣＯ２振盪培養器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓ４１ｉ）中で培養した。シードトレインフラスコに、播種密度１．５または３．０×１０５ＶＣ／ｍＬのいずれかで播種し、各々、９６時間及び７２時間の培養時間にわたって拡大させた。
懸濁液に適合されたＨＥＫ２９３細胞を、エルレンマイヤーフラスコ（Ｅ１２５、Ｅ２５０、Ｅ５００、及びＥ１０００）中での試験に十分な数まで拡大させ、ＣＯ２振盪培養器（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓ４１ｉ）中で培養した。シードトレインフラスコに、播種密度１．５または３．０×１０５ＶＣ／ｍＬのいずれかで播種し、各々、９６時間及び７２時間の培養時間にわたって拡大させた。
【0097】
細胞凝集を制御するために、凝集抑制剤（ＡＣＡ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、最初の継代の間１ｍＬ／Ｌで、その後周期的に添加した。
【0098】
ＨＥＫ２９３細胞を、１インチ軌道回転１５０ｒｐｍで撹拌しながら、３７°Ｃ、ＣＯ２８％で培養した。４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．１％ｗ：ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８を補充した、化学的に規定された培地中で細胞を培養した。
【0099】
バイオリアクタ細胞拡大
【0100】
２５０ｍＬの撹拌タンクバイオリアクタ中で拡大させるためのシード培地に、４ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、及び０．１％ｗ：ｖのＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８を補充した、化学的に規定された培地を添加した。ＨＥＫ２９３細胞を、総作業体積（１１３ｍＬ）の４５％の体積で、２．０×１０５ＶＣ／ｍＬの標的シード密度で播種した。
【0101】
接種後４８時間で、細胞に、化学的に定義された培地（補充なし培地）を、総作業体積（１００ｍＬ）の４０％の供給体積で供給した。
【0102】
温度設定値は、３７℃であり、ｐＨ設定値は、７．３０±０．０５であり、ＤＯ設定値は、５０％であった。バイオリアクタ中の空気と純粋な酸素をスパージングして、ＤＯ濃度を制御し、ＣＯ２（酸）と水酸化ナトリウム（塩基）を添加して、ｐＨを制御した。撹拌を、総作業体積４５％で７．５Ｗ／ｍ３と、総作業体積８５％で１７．５Ｗ／ｍ３との間で変化させた。
【0103】
トランスフェクション
【0104】
ＨＥＫ２９３細胞を、約１．６～２．２×１０６ＶＣ／ｍＬの細胞密度で、接種後９６時間で、プラスミド：ヘルパー（ｐＦＤ６ｋ，１５．４ｋｂ）；Ｒｅｐ／Ｃａｐ（ｐＮＬＲｅｐ２－２－ｋ，１０．３ｋｂ）；導入遺伝子（ｐＧＡＤ６７ｋ，７．１ｋｂ）を、２：１．５：１のプラスミドコピー数比で、トランスフェクション時１０６個の生存細胞あたり総ＤＮＡ量１．０μｇで、トランスフェクトした。
【0105】
トランスフェクション混合物を、ＦｅｃｔｏＶＩＲ：ＤＮＡ比１．５：１（ｖ：ｗ）、及びトランスフェクション混合物中のＤＮＡ濃度８０ｍｇ／Ｌで調製した。トランスフェクション混合物用の培地は、化学的に規定された培養培地（補充なし）であった。ヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及び導入遺伝子コンストラクトを、培地に添加した。ＦｅｃｔｏＶＩＲを培養培地に添加して混合し、次いで、混合物をＤＮＡミックスに添加し、続いて、１５分間回転及びインキュベートした。１５分間のインキュベーション後、トランスフェクションミックスをバイオリアクタに添加した。
【0106】
ｒＡＡＶ産生
【0107】
ｒＡＡＶ産生パラメータ：温度を３７°Ｃに設定；ＤＯ設定値を５０％；ｐＨ設定値を６．９、ＣＯ２添加なし；ならびに撹拌設定値を１７．５Ｗ／ｍ３、及び総作業体積を８５％とした。試験した産生条件は表１に記載される。
【0108】
フィードを添加した条件について、ＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３フィードを、産生相の間に、添加当たり３％ｖ／ｖ（添加当たり６．４ｍＬ）で、４回（第一のカルシウム添加時、トランスフェクション後２４時間、４８時間、及び７２時間で）添加した。ＣａＣｌ２を添加した試験では、ＣａＣｌ２の１Ｍストック溶液を、トランスフェクション後、６時間、１２時間、または２０時間のいずれかで、２ｍＭＣａＣｌ２の濃度に添加した。ＡＣＡを添加した試験では、２ｍＬ／ＬのＡＣＡをトランスフェクション後２０時間で添加した。産生相の間にＧｌｕｔａＭＡＸを添加した試験では、ＧｌｕｔａＭＡＸを、４回（トランスフェクション後、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間）添加して、バイオリアクタ中、添加量当たり１ｍＭ（添加量あたり１．１ｍＬ）の、ＧｌｕｔａＭＡＸの濃度を達成した。ＣａＣｌ２、ＡＣＡ、ＢａｌａｎＣＤ ＨＥＫ２９３フィード、またはＧｌｕｔａＭＡＸを同時に添加する場合には、個々の溶液を組合せた。
【表1】
【0109】
細胞溶解
【0110】
細胞をトランスフェクション後９６時間で採取した。５０Ｘ溶解緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ－１００、２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１ｍＭのトリスの最終濃度を達成するように配合）を、ベンゾナーゼ１２５Ｕ／１０７全細胞と共に２％ｖ／ｖでバイオリアクタに添加し、３７℃、及び１７．５Ｗ／ｍ３で、全作業体積８５％で、２時間インキュベートした。
【0111】
ウイルスカプシド及びウイルスゲノム力価の決定
【0112】
ウイルスカプシド及びウイルスゲノム力価の決定は、上記のように行った、
【0113】
結果：
【0114】
バイオリアクタスケールダウンモデルでの、ｒＡＡＶ産生相中のカルシウム補充は、ｒＡＡＶ２について、ＶＧ力価を、対照と比較して７～８倍増加させ、Ｆ：Ｅ比を、５～１０％から６５～９０％に増加させた。図２Ａ及び２Ｂを参照のこと。Ｃａ２＋（ＡＣＡ）補充に加えて、産生相中に、ＡＣＡ及びグルコースベースのフィードを添加すると、ＡＣＡまたはグルコースベースのフィードを含まないＣａ２＋（ＡＣＡ）補充と比較して、Ｆ：Ｅ比が低下した。しかしながら、Ｆ：Ｅ比は、対照よりも依然として約４倍高かった。図２Ｂを参照のこと。グルタミン補充は、産生相中に、（ＣａＣｌ２を含む）同一の補充を含むがグルタミンを含まない試験と比較して、ＶＧ力価が改善すると見られる。図２Ａを参照のこと。
【0115】
実施例３：ｒＡＡＶ産生時の塩添加のタイミング及び濃度の評価
【0116】
異なる時点または異なる濃度でＣａＣｌ２を添加した後の、ＶＧ力価とＦ：Ｅカプシド比を試験することによって、及び他の塩を添加した効果を評価することによって、ｒＡＡＶ２及びｒＡＡＶ５血清型の産生を評価した。ＣａＣｌ２（２ｍＭの最終濃度に）の添加のタイミングを、ＣａＣｌ２を、トランスフェクション前１時間で（－１時間）、トランスフェクション時で（０時間）、またはトランスフェクション後、６時間、１２時間、１８時間、及び２４時間で添加して評価した。ＣａＣｌ２濃度の範囲を、ＣａＣｌ２を、トランスフェクション後１２時間で、０．３ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、または１０ｍＭの最終濃度に添加して試験した。更に、２ｍＭの最終濃度へのＣａＣｌ２の添加を、２ｍＭの最終濃度へのＭｇＣｌ２の添加、または４ｍＭの最終濃度へのＮａＣｌの添加（各々、トランスフェクション後１２時間での添加）と比較した、
【0117】
シードトレイン及び拡大、トランスフェクション、産生、並びに溶解の方法は、ＡＣＡをトランスフェクション後いかなる条件にも添加しなかったことを除いて、ｒＡＡＶ２－ＧＡＤ６７及びｒＡＡＶ５－ＲＰＧＲについて上記されたものと、実質的に同一であった。産生相を終了し、トランスフェクション後９６時間で、細胞を溶解させた。
【0118】
結果：
ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２を産生相培養培地に添加しても、ＶＧ力価またはＦ：Ｅカプシド比は増加しなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。トランスフェクション前１時間で、ＣａＣｌ２を２ｍＭに添加することによるカルシウム補充は、対照（カルシウム補充なし）と比較して、ＶＧ力価及びＦ：Ｅカプシド比が有意に低下させた。図４Ａ及び４Ｂを参照のこと。トランスフェクション後、０～１８時間で、ＣａＣｌ２を２ｍＭに添加することによるカルシウム補給は、対照と比較して、ＶＧ力価を１．５倍上昇させた。図４Ａを参照のこと。トランスフェクション後０時間で、ＣａＣｌ２を添加した場合、Ｆ：Ｅカプシド比の増加が観察された。図４Ｂを参照のこと。ＶＧ力価の改善は、ＣａＣｌ２を、２～６ｍＭの最終濃度に添加した場合（図５Ａ）に観察され、最も高いＦ：Ｅ比は、ＣａＣｌ２を、２ｍＭまたは４ｍＭの濃度に添加した場合に生じた（図５Ｂ）。
ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２を産生相培養培地に添加しても、ＶＧ力価またはＦ：Ｅカプシド比は増加しなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。トランスフェクション前１時間で、ＣａＣｌ２を２ｍＭに添加することによるカルシウム補充は、対照（カルシウム補充なし）と比較して、ＶＧ力価及びＦ：Ｅカプシド比が有意に低下させた。図４Ａ及び４Ｂを参照のこと。トランスフェクション後、０～１８時間で、ＣａＣｌ２を２ｍＭに添加することによるカルシウム補給は、対照と比較して、ＶＧ力価を１．５倍上昇させた。図４Ａを参照のこと。トランスフェクション後０時間で、ＣａＣｌ２を添加した場合、Ｆ：Ｅカプシド比の増加が観察された。図４Ｂを参照のこと。ＶＧ力価の改善は、ＣａＣｌ２を、２～６ｍＭの最終濃度に添加した場合（図５Ａ）に観察され、最も高いＦ：Ｅ比は、ＣａＣｌ２を、２ｍＭまたは４ｍＭの濃度に添加した場合に生じた（図５Ｂ）。
【0119】
実施例４：２５０ｍｌのバイオリアクタにおける、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８の産生
【0120】
ｒＡＡＶ２－ＧＡＤ６７、ｒＡＡＶ５－ＲＰＥ６５、及びｒＡＡＶ８－ＣＮＧＢ３の産生を、撹拌槽タンクバイオリアクタ中で、２５０ｍＬのスケールで実施し、ＶＧ力価及びＦ：Ｅ比に対するＣａＣｌ２の添加の影響を評価した。シードトレイン、拡大、トランスフェクション、産生、及び溶解の方法を、上記の実施例３に記載されるようにして実施した。具体的には、トランスフェクション後１２時間で、ＣａＣｌ２を産生培養物に添加し２ｍＭにした。トランスフェクション後いかなる条件にも、ＡＣＡを添加しなかった。産生相を終了し、トランスフェクション後９６時間で細胞を溶解させた。
【0121】
結果：
【0122】
１２時間のトランスフェクション後で、ＣａＣｌ２を２ｍＭに添加することによるカルシウム補充は、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、及びｒＡＡＶ８に対して、各々、１．５倍、１．４倍、及び１．５倍の、ＶＧ力価の改善をもたらした（図６Ａ）。更に、カルシウム補充は、ｒＡＡＶ５について、Ｆ：Ｅ比を３倍に増加させた（図６Ｂ）。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】