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特表2024-523910ＣＯＶＩＤバリアントの検出のための方法およびシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-02
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤバリアントの検出のための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240625BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240625BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240625BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240625BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6888 Z
C12M1/00 A
C12Q1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023578734
(86)(22)【出願日】2022-06-21
(85)【翻訳文提出日】2024-02-19
(86)【国際出願番号】 US2022034331
(87)【国際公開番号】W WO2022271690
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/213,110
(32)【優先日】2021-06-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511172461
【氏名又は名称】ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ， ジョナサン デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】クルーガー， ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】ノーベル， ブライアン マシュー
(72)【発明者】
【氏名】パーカー， スコット
(72)【発明者】
【氏名】アイヤル， ラクシュマナン ケー．
(72)【発明者】
【氏名】ブロシュ， ヘイデン エヌ．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB13
4B029FA01
4B029FA15
4B029GB10
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS32
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントの検出のための方法およびシステムが開示される。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップを含む方法が、開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）前記試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを生成するステップ；
（ｃ）前記試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
【請求項2】
次いで、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡが、ウイルスゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プライマーを使用してさらに増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記タイル型プライマーが、隣接するプライマーが互いにおおよそ６００ｂｐ離れているような間隔で配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップが、前記試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの１本の鎖を、ペアのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを含む一本鎖プローブＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることをさらに含み、第１のプローブが、フォワードプライマーとして機能するように前記プローブＤＮＡ鋳型の３’末端に位置し、第２のプローブが、リバースプライマーとして機能するように前記プローブＤＮＡ鋳型の５’末端に位置する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、プローブ配列に隣接する位置にあるユニバーサルシークエンシングプライマーをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプター配列をさらに含む、請求項４から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
バーコードが、前記試料についての郵便番号または他の地理的識別子に関連付けられる、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
２つの前記プローブ間の配列を埋めて、２つの前記プローブ配列間に前記試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を生成するステップをさらに含む、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記核酸シークエンシングが、全ウイルスゲノムの少なくとも９０％をシークエンシングすることを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値が、前記試料の各々について計算される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ステップ（ｄ）の結果を、バリアントが検出された場合に、さらなる分類のためにデポジトリーにアップロードするステップをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記デポジトリーが、ＣＤＣデータベースである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記対象の地理的位置を同定するステップをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップが、試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインして試料特異的アセンブリおよびコンセンサス配列を生成することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｄ）が、前記試料についての系統をアセスメントすることをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ステップ（ｄ）の組み入れ基準が、＞９０％ゲノムカバー率、カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード；および前記試料についての系統決定を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの前に前記デポジトリーのアップデートが行われたかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項18】
前記ステップのうちの少なくとも複数が、１つまたは複数のデータプロセッサーと、
前記１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに方法ステップのいずれかを含む処理を前記１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
によって制御される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
１つまたは複数のデータプロセッサーと、前記１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定すること；
（ｂ）前記試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成すること；
（ｃ）前記試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行すること；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定すること
を含む処理を前記１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
を含むシステム。
【請求項20】
非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品であって、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定すること；
（ｂ）前記試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成すること；
（ｃ）前記試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行すること；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定すること
を含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させるように構成された命令を含む、コンピュータ－プログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントおよびバリアントのいずれかの株に感染した個体の地理的位置の検出のための方法およびシステムが開示される。
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントおよびバリアントのいずれかの株に感染した個体の地理的位置の検出のための方法およびシステムが開示される。
【背景技術】
【0002】
序論
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｅｔａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属の、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。全てのコロナウイルスは、１６の非構造タンパク質と、４つの構造タンパク質：スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）とをコードする、それらのゲノムの構成および発現の類似性を共有する。この科のウイルスは、人畜共通起源のものである。それらは、軽度の感冒から重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）および新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）などのより重症度の高いものまで多岐にわたる症状を有する疾患を引き起こす。人々を感染させることが公知の他のコロナウイルスとしては、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３およびＨＫＵ１が挙げられる。後述のものは、遍在性であり、感染は、概して、感冒またはインフルエンザ様症状を引き起こす。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｂｅｔａ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属の、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。全てのコロナウイルスは、１６の非構造タンパク質と、４つの構造タンパク質：スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）とをコードする、それらのゲノムの構成および発現の類似性を共有する。この科のウイルスは、人畜共通起源のものである。それらは、軽度の感冒から重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）および新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）などのより重症度の高いものまで多岐にわたる症状を有する疾患を引き起こす。人々を感染させることが公知の他のコロナウイルスとしては、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３およびＨＫＵ１が挙げられる。後述のものは、遍在性であり、感染は、概して、感冒またはインフルエンザ様症状を引き起こす。
【0003】
２０１９新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、大流行の可能性がある病原体として２０１９年１２月に中国、武漢において初めて現れたベータ－コロナウイルスである。初期の報告は、限定的な人から人への伝播が中国国内で起こったことを示唆した。しかし、２０２０年初頭に、２０１９－ｎＣｏＶのさらなる症例が世界中で認められ、それによって持続的な人から人への伝播が示された。これまでのところ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の臨床スペクトルは、軽度の自己限定性上気道感染症から、著しい罹病率および死亡率をもたらす、より重篤な下気道疾患まで多岐にわたっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックが加速するにつれて、ウイルスゲノム配列の多様性について、およびこれらのバリアントが感染の伝播性、感染の重症度または自然免疫もしくはワクチン誘導免疫からのウイルスの回避にどのように影響を与えるかについて、より大きな注目が払われてきた。
【0004】
ウイルスは、変異によって絶えず変化する。ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスの複数のバリアントが、米国においておよび地球規模で記録されている。現れては消えるバリアントもあり、存続し、感染力の増大または症状の重症度の上昇を示すバリアントもある。
【0005】
例えば、２０２１年６月時点で、米国には６つの注目すべきバリアントが存在した。（１）Ｂ．１．１．７：このバリアントは、２０２０年１２月に初めて米国で検出された。それは、英国で最初に検出された。（２）Ｂ．１．３５１：このバリアントは、２０２１年１月の終わりに初めて米国で検出され、２０２０年１２月に南アフリカで最初に検出された。（３）Ｐ．１：このバリアントは、２０２１年１月に初めて米国で検出された－Ｐ．１は、１月初頭に日本の空港で所定のスクリーニング中に検査を受けたブラジルからの旅行者において最初に同定された。（４）Ｂ．１．４２７および（５）Ｂ．１．４２９：これら２つのバリアントは、２０２１年２月に初めてカリフォルニアで同定された。（６）Ｂ．１．６１７．２：このバリアントは、２０２１年３月に初めて米国で検出された。それは、２０２０年１２月にインドで最初に同定された。CDC.gov/coronavirus/2019-ncov/variants。
【0006】
このように、新しいバリアントを同定および追跡する必要がある。パンデミックに対応する公共の保健機関を支援するために感染個体の地理的位置を追跡する必要がさらにある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
要旨
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こし得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および追跡するための方法およびシステムが開示される。方法およびシステムを様々な仕方で具現化することができる。
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こし得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および追跡するための方法およびシステムが開示される。方法およびシステムを様々な仕方で具現化することができる。
【0008】
ある特定の実施形態では、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップを含む方法を含み得る。
【0009】
ある実施形態では、シークエンシングは、ウイルスゲノムの大部分をカバーする。したがって、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムがＲＴ－ＰＣＲにより増幅される、ある特定の実施形態では、得られたｃＤＮＡは、その後、ウイルスゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プライマーを使用してさらに増幅される。ある特定の実施形態では、タイル型プライマーは、隣接するプライマーが互いに６００ｂｐ離れているような間隔で配置される。このようにして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、新たなバリアントの存在または非存在にかかわらず非常に効率的に増幅される。例えば、ある特定の実施形態では、核酸シークエンシングは、全ウイルスゲノムの少なくとも８０％、または必要に応じて少なくとも８５％、または必要に応じて少なくとも９０％、または必要に応じて少なくとも９５％をシークエンシングすることを含む。
【0010】
増幅された核酸分子を、配列を識別する分子バーコードで標識することができる。例えば、ある特定の実施形態では、タイル型プライマーは、バーコード配列の付加のためのアダプター、および／または核酸シーケンシングのためのユニバーサルプライマー部位をさらに含むプライマーである。
【0011】
開示される方法ステップのうちのステップのいずれかを遂行するためのシステム、ならびにシステムのステーションおよび／もしくはコンポーネントのいずれかを実行するようにならびに／または開示される実施形態のいずれかの方法のステップ（単数もしくは複数）を遂行するように構成された命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品も開示される。
【0012】
１つまたは複数のデータプロセッサーと、１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに本明細書で開示される１つまたは複数の方法の一部または全てを１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを含む、システム；および非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータプログラム製品であって、本明細書で開示される１つまたは複数の方法の一部または全てを１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させるように構成された命令を含む、コンピュータプログラム製品も開示される。
【0013】
本明細書に記載のシークエンシングは、バリアントを同定するのに有利である。様々な核酸シークエンシングプロトコルを使用することができる。ある特定の実施形態では、核酸シークエンシングは、ＲＴ－ＰＣＲを含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）シークエンシングプロトコルおよびまたは装置が使用される。
【0014】
さらなる実施形態では、バリアントに感染した個体の地理的位置を同定するための方法およびシステムが開示される。例えば、ある特定の実施形態では、バーコードが、個体の郵便番号または他の地理的識別子に関連付けられる。加えて、本開示は、感染個体の集団および／または一般集団におけるバリアントの保有率を追跡するための方法および／またはシステムを提供する。どちらの場合も、地理的地域は、集団を含み得る。さらなる実施形態では、本開示は、特定のバリアントを感染力（ウイルス伝播）および疾患重症度と相関させるための方法およびシステムを提供する。
【0015】
本開示の方法またはシステムにより生成されるデータを、解析に、他のソースからの同様のタイプの他のデータ、および／または異なるタイプの他のデータと組み合わせることができる。ある特定の実施形態では、データを解析および／または他のデータとの組合せのためにデポジトリーに寄託することができる。ある特定の実施形態では、デポジトリーは、ＣＤＣデータベースである。または、他の政府または大学または私的データベースを用いることができる。
【0016】
以下の非限定的な図を参照することにより、本開示をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【発明を実施するための形態】
【0032】
詳細な説明
定義
試料または患者試料または生体試料または検体という用語は、本明細書では同義で使用される。試料は、上部および下部呼吸器検体を含み得る。そのような検体（試料）は、鼻咽頭もしくは中咽頭スワブ、痰、下気道吸引液、気管支肺胞洗浄物、および鼻咽頭洗浄液／吸引液または鼻腔吸引液を含み得る。試料の他の非限定的な例としては、組織試料（例えば、生検）、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、無細胞ＤＮＡ、尿、液体生検試料、またはこれらの組合せが挙げられる。用語「血液」は、従来通りの定義の、全血、血液製剤、または血液の任意の画分、例えば、血清、血漿、バフィーコートなどを包含する。
定義
試料または患者試料または生体試料または検体という用語は、本明細書では同義で使用される。試料は、上部および下部呼吸器検体を含み得る。そのような検体（試料）は、鼻咽頭もしくは中咽頭スワブ、痰、下気道吸引液、気管支肺胞洗浄物、および鼻咽頭洗浄液／吸引液または鼻腔吸引液を含み得る。試料の他の非限定的な例としては、組織試料（例えば、生検）、血液もしくは血液製剤（例えば、血清、血漿など）、無細胞ＤＮＡ、尿、液体生検試料、またはこれらの組合せが挙げられる。用語「血液」は、従来通りの定義の、全血、血液製剤、または血液の任意の画分、例えば、血清、血漿、バフィーコートなどを包含する。
【0033】
本明細書で使用される場合、対象または個体という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物を指す。対象または個体は、患者であり得、患者は、疾患の診断または処置のために医療提供者の元を訪れるヒトであって、一部の場合には、疾患が病原体による何らかの感染症であり得る、ヒトを指す。また、本明細書で使用される場合、用語「個体」、「対象」または「患者」は、全ての温血動物を含む。
【0034】
本明細書で使用される場合、ＳＭＲＴは、ゼロモード導波管（ＺＭＷ）を使用する一分子リアルタイムシークエンシングを指す。単一ＤＮＡポリメラーゼ酵素が、鋳型としてのＤＮＡの一分子とともにＺＭＷの底部に取り付けられる。ＺＭＷが、組み込まれている単一ヌクレオチドのみを観察するのに十分に小さい照明された観察体積を作り出す。４つのＤＮＡ塩基の各々が、４つの異なる蛍光色素の１つに付着する。ヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれると、蛍光タグが切断され、ＺＭＷの観察エリアから拡散し、そこではその蛍光をもはや観察できない。検出器が、ヌクレオチド組込みの蛍光シグナルを検出し、色素の対応する蛍光に従って塩基コールが行われる。
【0035】
本明細書で使用される場合、ＣＴまたはｃｔは、サイクル閾値、またはＲＴ－ＰＣＲによりウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－３）核酸を増幅および検出するために必要とされる総サイクル数を指す。
【0036】
本明細書で使用される場合、遺伝子座ループ捕捉は、分子反転プローブを使用してウイルスゲノム内の目的の領域に結合し、それを増幅するプロセスである。
【0037】
本明細書で使用される場合、ＣＣＳまたは環状コンセンサスシークエンシングリードは、捕捉されたＤＮＡ断片の長さを複数回シークエンシングすることによって生シークエンシングデータのエラーが補正された、処理されたリードである。
【0038】
本明細書で使用される場合、反復性（またはイントラアッセイ精度）は、同じ被解析物の、同じ測定条件下で行われた、連続測定の結果間の一致の近似性を言い表す。イントラアッセイ反復性は、同じ検体が１回の解析実行中に解析されたときの可変性の測定値である。
【0039】
本明細書で使用される場合、再現性（またはインターアッセイ精度）は、同じ被解析物の、同じ測定条件下で行われた、連続測定の結果間の一致の近似性を言い表す。インターアッセイ反復性は、同じ検体が１回より多くの実行中に解析されたときの可変性の測定値である。
【0040】
本明細書で使用される場合、一致度は、測定された値と、従来真として受け入れられている値または受け入れられている参照値との間の一致の近似性の尺度となる。これは、「究極の判断基準」、または新たな方法を比較することができる許容されている方法を必要とし得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、解析妥当性は、特定の配列（被解析物）が存在するときに検査が陽性となる確率（解析感度）、およびその配列が非存在であるときに検査が陰性となる確率（解析特異度）を確立することを必要とする。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）において、解析感度は、アッセイが、存在する場合には標的となる配列変化、アッセイから導出される核酸配列、および参照配列を検出することとなる、尤度であり得る。ＮＧＳについて、解析特異度は、アッセイが、配列変化を、存在しない場合、検出しないことになる確率と定義される（偽検出率は、シークエンシングアッセイの有用な測定値である）。
【0042】
本明細書で使用される場合、特異度は、被解析物だけを測定する測定手順の能力を定義する。
【0043】
本明細書で使用される場合、核酸投入量に対するアッセイ許容度は、反応に加えられる被解析物の量の変化に対する許容度である。
【0044】
本明細書で使用される場合、ＧＩＳＡＩＤは、世界的な科学イニシアティブであり、インフルエンザおよびコロナウイルス（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）データについてのゲノムデータへのオープンアクセスを提供する２００８年に設立された主要情報源である。データベースは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列についての世界最大のリポジトリーとなっている。ＧＩＳＡＩＤは、新たなＣＯＶＩＤ－１９ウイルス株の出現をモニターするための、ゲノム疫学およびリアルタイムサーベイランスを容易にする。
【0045】
本明細書で使用される場合、動作が、何かに「基づく」とき、これは、その動作が、その何かの少なくとも一部に、少なくともある程度、基づくことを意味する。
【0046】
ＮＧＳ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株決定のための方法
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こし得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および追跡するための方法およびシステムが開示される。方法およびシステムを様々な仕方で具現化することができる。
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こし得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および追跡するための方法およびシステムが開示される。方法およびシステムを様々な仕方で具現化することができる。
【0047】
ある特定の実施形態では、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップを含む方法を含み得る。
【0048】
方法は、ＣＯＶＩＤステータスが分からない試料を利用することもあり、またはＣＯＶＩＤに対して以前に検査で陽性と出た試料を使用することもある。ある特定の実施形態では、陽性試料は、承認されたＥＵＡ承認ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＴ－ＰＣＲ Ｔｅｓｔ（例えば、Ｌａｂｃｏｒｐ ＥＵＡ２０００１１および／またはＥＵＡ２０３０５７）を使用して同定され得る。このように、結果は、試料中のウイルスＲＮＡの検出後の個体を感染させるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の同定についての結果である。
【0049】
ある実施形態では、シークエンシングは、ウイルスゲノムの大部分をカバーする。したがって、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムがＲＴ－ＰＣＲにより増幅される、ある特定の実施形態では、得られたｃＤＮＡは、その後、ウイルスゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プライマーを使用してさらに増幅される。ある特定の実施形態では、タイル型プライマーは、隣接するプライマーが互いに６００ｂｐ離れているような間隔で配置される。このようにして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、新たなバリアントの存在または非存在にかかわらず非常に効率的に増幅される。例えば、ある特定の実施形態では、核酸シークエンシングは、全ウイルスゲノムの少なくとも８０％、または必要に応じて少なくとも８５％、または必要に応じて少なくとも９０％、または必要に応じて少なくとも９５％をシークエンシングすることを含む。
【0050】
増幅された核酸分子を、配列を識別する分子バーコードで標識することができる。例えば、ある特定の実施形態では、タイル型プライマーは、バーコード配列の付加のためのアダプター、および／または核酸シーケンシングのためのユニバーサルプライマー部位をさらに含むプライマーである。
【0051】
ある特定の実施形態では、試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを生成することを含む。
【0052】
また、ある特定の実施形態では、試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップは、試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐａｎｅｌ）を生成する手段として反転型分子プローブと組み合わせて標的次世代シークエンシングを使用することを含む。例えば、ある特定の実施形態では、試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップは、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの１本の鎖を、ペアのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを含む一本鎖プローブＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることをさらに含み、第１のプローブは、プローブＤＮＡ鋳型の３’末端に位置し、第２のプローブは、プローブＤＮＡ鋳型の５’末端に位置する。このようにして、３’プローブは、フォワードプライマーとして機能し、５’プローブは、リバースプライマーとして機能する。
【0053】
ある特定の実施形態では、プローブ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プローブとして選択される。ある実施形態では、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（ＮＣ＿０４５５１２）（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512で入手可能）が使用される。または、他の公知の参照ゲノムが使用され得る。例えば、代替実施形態では、プローブは、約１００、または２００、または３００、または４００、または５００、または６００、または７００、または８００、または９００塩基対、または１，０００より多くの塩基対分、間隔が空いていることがある。または、この範囲内の間隔（例えば、４５０、５５０、６５０または７５０）が使用され得る。プローブは、３０ｋｂ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの９９％より多く（例えば、９９．６％）にわたってタイリングされ得る。プローブは、配列にわたって、および／または平均で所与のヌクレオチドが２Ｘ、７Ｘ、２２Ｘのもしくはそれより多い配列を提供するように、タイリングされ得る。
【0054】
また、ある特定の実施形態では、一本鎖プローブＤＮＡ鋳型は、プローブ配列に隣接する位置にあるユニバーサルシークエンシングプライマー（例えば、Ｍ１３プライマー）をさらに含む。これらは、ユニバーサルプライマー配列と下流のバイオインフォマティック解析のための特有の試料特異的バーコーディングとをマッチさせることによって濃縮を可能にし得る。加えて、ある特定の実施形態では、および本明細書でより詳細に開示されるように、一本鎖プローブＤＮＡ鋳型は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプター配列をさらに含む。一部の場合には、バーコードを、試料および／または患者の出身地の郵便番号と相関させることができる。また、方法は、２つのプローブ間の配列を埋めて、２つのプローブ配列間に試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を生成すること、次いで、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから遊離させること、および核酸シークエンシングのための鋳型として使用される直鎖状ＤＮＡを生成するための試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型の消化を含み得る。ある特定の実施形態では、次いで、直鎖状プローブＤＮＡ鋳型は、アダプターを付加するために改変され、次いで、ＤＮＡシークエンシングのためにＰＣＲ増幅（濃縮）される。ある特定の実施形態では、濃縮ステップは、精製ステップ（例えば、ビーズによる精製）を含む。例えば、ある特定の実施形態では、シークエンシングのための基質がＲＴ－ＰＣＲにより生成され、次いで、ほとんどの塩基が２２のＭＩＰによってカバーされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの９９．６％からｃＤＮＡに逆転写されたＲＮＡを増幅するように設計された約１０００のタイル型Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ反転プローブ（ＭＩＰＳ）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が同定される。ある特定の実施形態では、ＭＩＰＳの中間に合成された産物は、濃縮され、増幅によって付加され続いてシークエンシングされる試料特異的分子バーコードを有する。
【0055】
ある特定の実施形態では、方法は、全ゲノムシークエンシングを用いる。ある特定の実施形態では、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が使用される。または、他のタイプのシークエンシング、例えば、これらに限定されないが、サンガーシークエンシング、ショットガンシークエンシング、ＳＭＲＴシークエンシング、パイロシークエンシングまたはナノポアシークエンシングが使用され得る。例えば、ある特定の実施形態では、ＰａｃＢｉｏ全ゲノムシークエンシングが、対応するＳＭＲＴ ｌｉｎｋ ９ソフトウェアおよび解析ツールとともに、使用され得る。例えば、一実施形態では、方法は、陽性試料からの残存全核酸抽出物を使用するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株同定にＰａｃＢｉｏ全ゲノムシークエンシング検査を用い得る。ある特定の実施形態では、核酸シークエンシングは、全ウイルスゲノムの少なくとも８０％、または必要に応じて８５％、または必要に応じて９０％、またはそれより多くをシークエンシングすることを含む。
【0056】
ある特定の実施形態では、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップは、試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインして、試料特異的アセンブリおよびコンセンサス配列を生成することを含む。加えて、方法は、試料についての系統をアセスメントするステップを含み得る。ある特定の実施形態では、方法は、対象の地理的位置を同定するステップを含み得る。
【0057】
加えて、本明細書で開示されるように、ある特定の実施形態では、方法は、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの結果を、バリアントが検出された場合にさらなる分類（例えば、系統決定）のためにデポジトリーにアップロードするステップを含み得る。デポジトリーは、ＣＤＣデータベースであり得る。または、他の公共のデポジトリーが使用され得る。
【0058】
方法は、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの前にデポジトリーのアップデートが行われたかどうかを決定するステップをさらに含み得る。
【0059】
方法は、手順における様々なステップで自動化され得る。ある特定の実施形態では、方法は、試料プレート設定のためのＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒロボットとともに使用され得る。これに加えておよび／または代えて、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ Ｍａｎｔｉｓ液体ハンドラーまたは他の自動デバイスが、マスターミックス分配に使用され得る。また、本明細書で開示されるように、方法は、プログラム実装型であり得、および／または方法のステップのいずれかを遂行するように構成された命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品の使用を含み得る。
【0060】
例えば、ある特定の実施形態では、Ｃｔ値＜３１でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性ＲＴ－ＰＣＲ診断検査試料から残存全核酸抽出物が、例えば、本明細書でより詳細に開示されるように、ＲＮＡ抽出プレートから陽性試料のみを含有する９６ウェルプレートへＨａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲを使用してチェリーピッキングされる。次いで、試料は、１つの水無鋳型対照（ＮＴＣ）を伴う９５の試料のシークエンシング実行プレートに分取され得る。方法は、必要に応じて拡大縮小され得る。例えば、ある特定の実施形態では、８つのプレート、または７６０の検体が、１つの生産バッチで処理され得る。
【0061】
図１は、本開示の方法１００の実施形態の例を示す。図１に示されているように、検査のための、必要に応じてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して陽性の試料が、対象から得られる１０２。ある実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡ配列は、ＲＴ－ＰＣＴにより生成される１０４。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡが一連のタイル型プローブとともにインキュベートされ得る１０６。ある特定の実施形態では、タイル型プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにわたって比較的等間隔で配置される。結合後、２つのプローブの中間の領域がＤＮＡポリメラーゼで埋められ、ライゲーションされて、２つのプローブ配列間に位置する試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列を有する閉じた環状分子（すなわち、環状プローブ鋳型）が形成され得る１０８。非結合または不完全ループは、直鎖状分子のままであり、エキソヌクレアーゼ消化によって除去され得る１１０。また、この時点で、環状プローブ鋳型分子が、試料ｃＤＮＡから遊離され得る（すなわち、ＰＣＲ増幅反応での変性中に）１１０。次いで、プローブが直鎖状にされ、３’Ｍ１３ユニバーサル配列および５’試料特異的バーコードを用いる増幅によって濃縮され得る１１２。次いで、試料が等体積でプールされ１１４、ライブラリーがシークエンシングのために調製される１１６。この時点で、試料は、本明細書で開示されるようにシークエンシングされ、結果が解析され３００、報告される４００。
【0062】
図２は、配列解析のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的配列を捕捉するための方法の一部分の代替説明図を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、カスタムＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２捕捉キットが、シークエンシングするための試料を調製するために使用される。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるように、シークエンシングは、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩシーケンサーを使用して遂行される。したがって、逆転写酵素が、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために使用される。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡは、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブのハイブリダイゼーションの標的として使用される（図２、ステップ１）。ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブは、３０ｋｂ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの９９％より多く（例えば、９９．６％）にわたってタイリングされ、おおよそ６００ｂｐ離れている２つの結合部位からなり得る。結合後、２つのプローブの中間の領域が、ＤＮＡポリメラーゼで合成され、ライゲーションされて、閉じた分子が形成される（図２、ステップ２）。非結合または不完全ループは、直鎖状分子のままであり、エキソヌクレアーゼ消化によって除去される（図２、ステップ３）。次いで、環状分子は、鋳型ｃＤＮＡから遊離され（図２、ステップ４）、次いで直鎖状にされ（例えば、Ｘ１での消化により）、３’ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ特異的Ｍ１３ユニバーサル配列および５’試料特異的バーコードを用いる増幅によって濃縮される（図２、ステップ５）。図２中のＰ１およびＰ２は、バーコード付加に使用され得るアダプターである。次いで、試料は、等体積でプールされ、ライブラリーがＰａｃＢｉｏシークエンシングのために調製される。ライブラリー調製は、ＤＮＡ損傷修復、シークエンシングアダプターのライゲーション、ライゲーションされていない産物の酵素消化による除去、およびビーズによる精製を必然的に伴い得る。次いで、ライブラリーは、ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩにおいて、例えば１５時間ムービーを用いて、シークエンシングされ得る。
【0063】
図３に示されているように、この時点で、シークエンシングステップおよびデータ解析ステップが遂行され得る３００。したがって、ある特定の実施形態では、方法は、配列解析のためのコンピュータ実装ステップを含み得る。ある特定の実施形態では、全ゲノムシークエンシングが遂行される３０２。ある特定の実施形態では、シークエンシングは、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）ロングリードシークエンシング技術を利用する。ライブラリー調製から生成された環状鋳型が、ポリメラーゼおよびプライマーと結合され、ＳＭＲＴＣｅｌｌ（シークエンシングセル）にロードされる。一分子産物は、ポリメラーゼが底部に固定化されている８００万のゼロモード導波管（ＺＭＷ）ウェルのうちの１つに拡散する。次いで、リン酸基連結ヌクレオチドがＺＭＷに導入され、次いで、塩基がポリメラーゼにより組み込まれ得る。所与の塩基対が組み込まれると、その付加によってヌクレオチド特異的発光が生じ、それが、ウェルごとにカメラにより検出される。このプロセスは、一定の時間、またはムービー長にわたって反復され、所与のウェル上のヌクレオチドの順序が解析され、長い配列リード出力の際に対応するヌクレオチドに翻訳される。
【0064】
次に、データは、配列ファイルとしてアセンブルされ得る３０３。例えば、ある特定の実施形態では、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ ＬＩＮＫソフトウェアおよびカスタムｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ処理スクリプトが、各試料のＦＡＳＴＱファイルを生成するために使用され得る。ＦＡＳＴＱは、ＣＬＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒバージョン６．５．６を使用して実装されるゲノム解析パイプラインを使用して解析され得る。または、他のシークエンシング解析システムが使用され得る。この時点で、シークエンシングプライマー配列は、除去され３０４、配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（例えば、ＮＣ＿０４５５１２ｖ２）とアラインされて、アラインメントのｂａｍファイルが生成され得る３０６。ある特定の実施形態では、Ｍｉｎｉｍａｐ２が、アラインメントを生成するために使用され得る。または、他のアラインメントプログラムが使用され得る。ある実施形態では、次いで、５０％の最小カバー率を満たす試料は、各試料についてのコンセンサス配列を生成するために、バリアントをコールするためのおよび試料特異的ゲノムアセンブリを生成するための入力データとして使用される３０８。または、他の最小カバー率限度（例えば、２０、３０、４０、６０、７０、８０、９０パーセント）が使用され得る。ある実施形態では、コンセンサス配列は、ＶＣＦｃｏｎｓ（www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.02.26.433111v1で入手可能）を使用して生成され得る。または、別のアルゴリズムが使用され得る。ある実施形態では、コンセンサス配列を生成するための定義された閾値がある。例えば、ある特定の実施形態では、ＶＣＦｃｏｎｓがゲノム構築のためのヌクレオチド配列をコールする場合、それは、その塩基対をカバーする少なくとも４の環状コンセンサスシークエンシング（ＣＣＳ）リード、および＞５０％の参照配列と比較される代替対立遺伝子頻度を有さなければならない。ヌクレオチドが、４未満のリードを有する場合、それは、コンセンサス配列におけるＮ（定義されていないヌクレオチド）として報告される。
【0065】
試料系統の割り当ては、ある特定の実験変数および／または対照を考慮に入れ得る３１０。例えば、ある特定の実施形態では、外部鋳型なし対照（ＮＴＣ）の評価が、結果の妥当性をアセスメントするために使用される３１０。これに加えておよび／または代えて、外部陽性鋳型対照（ＰＴＣ）が、プレートの十分な処理を実証するために加えられ得る３１０。さらに、ある特定の実施形態では、成功した実行からの特有の株（入手可能な場合）が株型ごとにプールされ得、各々の特有のプールされた株が、プレート処理にわたってプレート起源を保証するためにバッチ（例えば、８つ１セットのシークエンシングプレート）にわたってプレートに添加され得る。外部無鋳型対照（ＮＴＣ）は、マスターミックス夾雑事象が所与の増幅プレートに存在しないことを保証するために必要とされ得る。ＮＴＣは、試料添加前にあらゆる９６ウェル陽性プレートの定義された位置（例えば、Ａ１位置）に添加される水（例えば、分子グレードの水）を含み得る。または、他のＮＴＣ（例えば、緩衝液）が使用され得る。次いで、ＮＴＣは、陽性試料とともにシークエンシング実行プレートに移され、シークエンシングおよび（品質管理）ＱＣ解析に付され得る。
【0066】
ある特定の実施形態では、シークエンシング後、所与のプレートの陽性対照の株タイピングが、処理前に添加された記録された株と比較され得る。割り当てられたプレートの株タイピング間の不一致が、個々のプレートを続行するかどうかを決定するために、さらに調査され得る。例えば、ある特定の実施形態では、陽性対照結果を一致させることができないことは、所与の対照のプレートに関連する全ての株の除去につながり得る。他の実施形態では、バッチの他のプレート内の対応する対照によってプレート交換の可能性が排除され得る場合、陽性対照の反応の失敗は、必ずしも結果の除去に至るとは限らない。
【0067】
ある特定の実施形態では、シークエンシングおよびＮＴＣ解析の後、媒体ＣＣＳリードの平均値が１０ＣＣＳリードの判定基準の合格についてコンピュータ解析され得る３１０。ある特定の実施形態では、所与の９６ウェルシークエンシングプレートについて陽性の試料の結果をリリースするには、ＮＴＣが、定義されたレベル中央値の平均値（例えば＜１０）ＣＣＳリードを返さなければならない。プレートの所与のＮＴＣのＣＣＳリード中央値の平均値が、ＣＣＳリードの定義されたレベルよりも高い場合、プレート上の全ての対応する試料は、反復されるようにスケジューリングされ得る。
【0068】
次いで、この時点で、個々の試料についての系統が、コンセンサス配列を使用して割り当てられ得る３１２。ある実施形態では、これは、Ｐａｎｇｏｌｉｎ解析パッケージへの入力として遂行される。または、別の解析が使用され得る。ある特定の実施形態では、株系統結果は、９０％ゲノムカバー率を有する、および／または全ゲノムにわたってリードカバー率中央値の平均値が＞１０環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードである、試料についてリリースされる３１４。ある実施形態では、異なるＣＣＳリード測定基準は、ヌクレオチドレベル（４ＣＣＳリード）におよびゲノムレベル（１０ＣＣＳリード）に基づく。
【0069】
ある特定の実施形態では、株決定結果のアセスメントは、ＮＴＣ解析、およびＮＴＣが不合格となったプレート上の任意の試料の除去の後に遂行される。次いで、個々の試料結果がＣＣＳリード中央値の平均値＞１０ＣＣＳについてコンピュータで調査され、ゲノムカバー率パーセントは、＞９０％である。ある特定の実施形態では、検査結果は、地方、州および連邦政府の要請に従って医療提供者および関連公共保健機関に報告され得る。ある特定の実施形態では、これらの基準を満たさない試料は、解析で不合格となり、株タイピングは報告されない。これに加えておよび／または代えて、陽性試料のみが検査されるとき、方法は、感染ステータスがウイルスの全ゲノムシークエンシング結果によって左右されないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ステータスの検出には使用されない。
【0070】
データ解析
配列データの解析は、ある特定の実施形態では、前処理（すなわち、上流）ステップおよび後処理（すなわち、下流）ステップを含み得る。ある特定の実施形態では、これらのステップの少なくとも一部は、データ解析のためのコンピュータ実装ステップを含む。上流解析は、完了についてシーケンサー実行をモニターすることと、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するために逆多重化することと、アラインメントおよびバリアントコールを生成するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとの各々のアラインメントを始動させることとを含み得る。各ＳＭＲＴＣｅｌｌにおける試料についての下流解析は、各試料についての系統分類を含む結果全てを生成することから構成され得る。
配列データの解析は、ある特定の実施形態では、前処理（すなわち、上流）ステップおよび後処理（すなわち、下流）ステップを含み得る。ある特定の実施形態では、これらのステップの少なくとも一部は、データ解析のためのコンピュータ実装ステップを含む。上流解析は、完了についてシーケンサー実行をモニターすることと、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するために逆多重化することと、アラインメントおよびバリアントコールを生成するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとの各々のアラインメントを始動させることとを含み得る。各ＳＭＲＴＣｅｌｌにおける試料についての下流解析は、各試料についての系統分類を含む結果全てを生成することから構成され得る。
【0071】
上流解析
シークエンシングデータの上流解析のための方法の例４００が、図４に示されている。このように、ある特定の実施形態では、解析起動のために、ＰａｃＢｉｏ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ生シークエンシングデータが寄託され、作成されたＣＣＳ ＢＡＭファイルが逆多重化のためにコピーされ得る。ある実施形態では、シーケンサーで不首尾に終わった試料は、データファイルを生成しない。反復されるように指定されるこれらの試料は、配列解析を続けない。
シークエンシングデータの上流解析のための方法の例４００が、図４に示されている。このように、ある特定の実施形態では、解析起動のために、ＰａｃＢｉｏ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ生シークエンシングデータが寄託され、作成されたＣＣＳ ＢＡＭファイルが逆多重化のためにコピーされ得る。ある実施形態では、シーケンサーで不首尾に終わった試料は、データファイルを生成しない。反復されるように指定されるこれらの試料は、配列解析を続けない。
【0072】
この時点で、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルの生成が遂行され得る。ある実施形態では、ＣＣＳ ＢＡＭファイルの生成、逆多重化、およびＦＡＳＴＱファイルの生成は、本明細書における実施例で開示されるように遂行される。または、他の方法が使用され得る。したがって、ある特定の実施形態では、前処理は、環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）ＢＡＭファイルを生成するステップ（４０２）；中間ＢＡＭファイルをマージするステップ（４０４）；異なるバーコードの組合せに対応する個々の生成したＢＡＭファイルを使用して逆多重化するステップ（４０６）；逆多重化された出力データを試料名および／または患者識別子ごとに組み合わせるステップ（４０８）；配列からバーコードを除去し、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するステップ（４１０）；配列をバーコードとアラインし、バーコードをトリミングするステップ（４１２）；ＢＡＭファイルをＦＡＳＴＱファイルに変換し、ＦＡＳＴＱおよびＣＣＳ ＢＡＭファイルを最終位置にコピーするステップ（４１４）；ならびにＣＬＣワークフローを始動させるステップ（４１６）のうちの少なくとも一部を含み得る。
【0073】
ＣＬＣ解析ワークフローは、以下のステップを使用して遂行され得る。先ず、ＮＧＳデータ解析ワークフローが、現行の有効性が認められているＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒバージョンを使用して、各試料に対して実行され得る４１８。次に、各試料のＦＡＳＴＱファイルについて、以下のステップが遂行され得る。先ず、リードが、２５０～５０００ｂｐ長のリードを保持するようにフィルタリングされ得る４２０。次に、リードは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（例えば、「ＮＣ＿０４５５１２ｖ２」）とアラインされる４２２。このアラインメントは、ＢＡＭファイルを生成するためにｍｉｎｉｍａｐ２を使用して遂行され得る。または他のアラインメント方法が使用され得る。この時点で、ローカルリアラインメントが遂行され、バリアントコールが行われ得る４２４。これは、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｅｒｖｅｒでＬｏｗ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎツールを使用して遂行され得る。または、他の方法が使用され得る。この時点で、アセンブリ（ＢＡＭファイル）および検出されたバリアント（ｃｆ）の両方が、下流の後処理解析に入力される４２６。スクリプトがＣＬＣプロセス完了を検出し、それによって、各ＳＭＲＴｃｅｌｌにおける試料の下流解析の開始が生じる。
【0074】
下流解析
下流（後処理）解析のフローチャートの例５００が、図５に示されている。後処理第１部（５０１）のステップは、ある特定の実施形態では、次の通りであり得る。適切な参照ファイルを使用して、ＶＣＦＣｏｎｓが、各試料についての配列アラインメントおよびバリアントコールに基づいてコンセンサス配列を生成するために使用され得る５０２。この解析のために、４ＣＣＳリードの最小カバー率および０．５の最小代替頻度が、塩基を各ゲノム位置に割り当てるために使用され得る。または、異なる閾値が適用され得る。ある実施形態では、この基準を満たさない位置は、曖昧塩基「Ｎ」に割り当てられる。次に、配列塩基組成が生成され得る５０４。ある実施形態では、これは、後に非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、この解析は、Ｓｅｑｔｋまたは代替アルゴリズムを用いて遂行され得る。この時点で、コンセンサス配列を入力データとして使用して、（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異コーリング、および（ｃ）試料配列品質チェックのいずれか１つまたは全てを、必要に応じて生じさせることができる５０６。ある実施形態では、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅがこの解析に使用される。または、ある特定の実施形態では、他のアルゴリズムが使用され得る。この時点で、系統が割り当てられる５０８。ある特定の実施形態では、Ｐａｎｇｏｌｉｎは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること（Ｐａｎｇｏ命名法として公知）、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統（Ｐａｎｇｏ系統）を割り当てることにより、コンセンサス配列に系統を割り当てる。ある実施形態では、Ｐａｎｇｏｌｉｎは、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮するように設定される。最後に、カバー率統計データが生成され得る５１０。ある特定の実施形態では、ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔが、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ、ＰａｎｇｏｌｉｎおよびＳｅｑｔｋからの結果をコンパイルし、アンプリコンカバー率中央値の平均値およびゲノムカバー率パーセントをはじめとする、後のＱＣに必要なカバー率統計データを生成する。または、別のアルゴリズムがコンパイルに使用され得る。ある特定の実施形態では、この解析のために、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値が、試料の各々について計算される。または、他の閾値が使用され得る。次いで、これらのカバー率値（最小値、第１四分位値、平均値、中央値、第３四分位値、および最大値）の分布の統計データが、各試料について計算され得る。また、ゲノムカバー率パーセントが、総配列長で割った非曖昧塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の数として計算され得、系統分類が集約され、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コールを生じさせる試料のみが、さらなる処理のために保持される。
下流（後処理）解析のフローチャートの例５００が、図５に示されている。後処理第１部（５０１）のステップは、ある特定の実施形態では、次の通りであり得る。適切な参照ファイルを使用して、ＶＣＦＣｏｎｓが、各試料についての配列アラインメントおよびバリアントコールに基づいてコンセンサス配列を生成するために使用され得る５０２。この解析のために、４ＣＣＳリードの最小カバー率および０．５の最小代替頻度が、塩基を各ゲノム位置に割り当てるために使用され得る。または、異なる閾値が適用され得る。ある実施形態では、この基準を満たさない位置は、曖昧塩基「Ｎ」に割り当てられる。次に、配列塩基組成が生成され得る５０４。ある実施形態では、これは、後に非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、この解析は、Ｓｅｑｔｋまたは代替アルゴリズムを用いて遂行され得る。この時点で、コンセンサス配列を入力データとして使用して、（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異コーリング、および（ｃ）試料配列品質チェックのいずれか１つまたは全てを、必要に応じて生じさせることができる５０６。ある実施形態では、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅがこの解析に使用される。または、ある特定の実施形態では、他のアルゴリズムが使用され得る。この時点で、系統が割り当てられる５０８。ある特定の実施形態では、Ｐａｎｇｏｌｉｎは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること（Ｐａｎｇｏ命名法として公知）、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統（Ｐａｎｇｏ系統）を割り当てることにより、コンセンサス配列に系統を割り当てる。ある実施形態では、Ｐａｎｇｏｌｉｎは、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮するように設定される。最後に、カバー率統計データが生成され得る５１０。ある特定の実施形態では、ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔが、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ、ＰａｎｇｏｌｉｎおよびＳｅｑｔｋからの結果をコンパイルし、アンプリコンカバー率中央値の平均値およびゲノムカバー率パーセントをはじめとする、後のＱＣに必要なカバー率統計データを生成する。または、別のアルゴリズムがコンパイルに使用され得る。ある特定の実施形態では、この解析のために、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値が、試料の各々について計算される。または、他の閾値が使用され得る。次いで、これらのカバー率値（最小値、第１四分位値、平均値、中央値、第３四分位値、および最大値）の分布の統計データが、各試料について計算され得る。また、ゲノムカバー率パーセントが、総配列長で割った非曖昧塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の数として計算され得、系統分類が集約され、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コールを生じさせる試料のみが、さらなる処理のために保持される。
【0075】
この時点で、後処理第２部（５０３）が開始され得る。したがって、適切な参照ファイル、株サーベイランス特異的メタデータ５０９、５１０（人口統計データ、ゲノムカバー率パーセント、およびＲＴ－ＰＣＲアッセイからのＣｔ値）を再び使用してＱＣが遂行され、データが結果に加えられる５１２。ある実施形態では、メタデータを欠いている試料は、結果セットから除外される５１６。また、無鋳型ＱＣは、鋳型なし対照（ＮＴＣ）に基づいて遂行される５１６。また、ある特定の実施形態では、２９のゲノム領域のカバー率中央値の平均値が、＞１０ＣＣＳリードである場合には、同じプレート上のシークエンシングされた全ての試料が除去される５１６。最後に、カバー率ＱＣが遂行される５１６。ある実施形態では、ゲノムカバー率＞＝９０％を有する試料が、結果に保持される。また、ある実施形態では、およびカバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリードを有する試料が、結果に保持された。次いで、結果は、対応するＰａｎｇｏｌｉｎ系統を伴う患者レポートを生成するためにＲｅｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍの場所に転送され得る５１４。ある実施形態では、結果を生じさせることができなかった試料は、系統を決定することができなかったと報告される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが検出されても、系統情報が報告されないことがある。
【0076】
ある特定の実施形態では、系統コーリング基準は、次の通りであり得る。組み入れ基準：（１）ＣＴ＜３１；（２）対応するメタデータ（株サーベイランス）；（３）＞９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード；（４）合格ＮＴＣ対照；ならびに（５）Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コール。除外基準：（１）ＣＴ＞３１；（２）欠測メタデータ（株サーベイランス）；（３）＜９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＜１０ＣＣＳリード；および（４）不合格ＮＴＣ対照。
【0077】
再検証
ある特定の実施形態では、アッセイは、新たなバリアントの出現に応じて再検証される。ある特定の実施形態では、これらのステップの少なくとも一部は、再検証解析のためのコンピュータ実装ステップを含む。ある特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新たなバリアント（すなわち、系統）の出現およびｐａｎｇｏｌｉｎ分類ソフトウェアの付随する変更に応じて、Ｖｉｒｓｅｑアッセイ６００の分類精度を再検証することが、図６に描示されているように遂行され得る（実施例５も参照されたい）。図６に描示されている解析は、ｐａｎｇｏｌｉｎ用に開発されたものであるが、ウイルスの系統発生学的割り当て用の他のデータベースに適用することができる。ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェアは、Ｄｏｃｋｅｒｈｕｂによって（hub.docker.com/r/staphb/pangolinで）配給されている。したがって、ある特定の実施形態では、ｐａｎｇｏｌｉｎサイトがモニターされ６０２、アップデートされたｄｏｃｋｅｒコンテナを一定間隔で（例えば、週１回、２週間に１回、月１回）ダウンロードし、インストールすることによってアップデートについてチェックされ得る６０４。ある実施形態では、アップデートがない場合、何もする必要がない６０６。
ある特定の実施形態では、アッセイは、新たなバリアントの出現に応じて再検証される。ある特定の実施形態では、これらのステップの少なくとも一部は、再検証解析のためのコンピュータ実装ステップを含む。ある特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新たなバリアント（すなわち、系統）の出現およびｐａｎｇｏｌｉｎ分類ソフトウェアの付随する変更に応じて、Ｖｉｒｓｅｑアッセイ６００の分類精度を再検証することが、図６に描示されているように遂行され得る（実施例５も参照されたい）。図６に描示されている解析は、ｐａｎｇｏｌｉｎ用に開発されたものであるが、ウイルスの系統発生学的割り当て用の他のデータベースに適用することができる。ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェアは、Ｄｏｃｋｅｒｈｕｂによって（hub.docker.com/r/staphb/pangolinで）配給されている。したがって、ある特定の実施形態では、ｐａｎｇｏｌｉｎサイトがモニターされ６０２、アップデートされたｄｏｃｋｅｒコンテナを一定間隔で（例えば、週１回、２週間に１回、月１回）ダウンロードし、インストールすることによってアップデートについてチェックされ得る６０４。ある実施形態では、アップデートがない場合、何もする必要がない６０６。
【0078】
アップデートがあった場合、社内実験室データを使用して回帰解析が遂行され得る６０１。ある実施形態では、新たなｐａｎｇｏｌｉｎバージョンが、社内参照試料６０８の系統を決定するために使用され得る６１０。参照試料セット６０８は、様々なセット（例えば、発生および／またはＣＯＶＩＤ型の、日付に基づく）からのデータを含み得る。例えば、データセットは、主としてデルタバリアントおよび／またはオミクロン系統であると定義され得る。または、他の型が解析され得る。ある実施形態では、参照セット中の各試料は、そのコンセンサス配列、ならびに以前のｐａｎｇｏｌｉｎバージョンにより行われたその系統分類の履歴を含む。参照試料セット６０８は、ｐａｎｇｏｌｉｎバージョンがアップデートされるにつれてより新しい、より保有率が高い系統を代表する試料を含むように、定期的にアップデートされ得る。
【0079】
次に、ｐａｎｇｏｌｉｎ出力形式の変更があったかどうかを決定するために、ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェア出力の形式が以前のバージョンのものと比較され得る６１２。何らかの変更があった場合、これらの変更が記録され、実験室パイプラインがその変更に対応するように修正され得る。次いで、修正バージョンが、検査のためのＱＣ環境に配備され得る６１４。次に、系統コールのあらゆる変更が、アセスメントされ、ソフトウェアアップデート変更記録から予想されるものと比較され得る６１６。例えば、ある特定の実施形態では、予想される変更は、亜系統間の再割り当てを含む。系統の何らかの予想外の変更（例えば、アルファへのデルタ亜系統の変更）があった場合、これらが詳細に調査され、記録される６１８。
【0080】
この時点で、第２の回帰検定が、公表されている（ＧＩＳＡＩＤ）配列およびそれらのメタデータを使用して遂行され得る６０３。または他の公共データベースが使用され得る。この解析のために、最新のＧＩＳＡＩＤ配列がダウンロードされ、全てのＧＩＳＡＩＤ配列についてのメタデータおよびｐａｎｇｏｌｉｎ系統が得られ、懸念されるバリアント（ＶＯＣ）（すなわち、ＣＤＣおよび／または他の保健機関により積極的に追跡されているバリアント）および注目すべきバリアント（ＶＯＩ）（すなわち、ＣＤＣおよび／または他の保健機関によりモニターされているバリアント）のリストが、系統についてのＷＨＯアップデートおよび最新の完全リストに基づいてアップデートされ得る６２０。次に、データシミュレーターが、社内アッセイのカバー率およびエラー特性をモデル化するために使用され得る６２２。ある実施形態では、シミュレーターは、ＧＩＳＡＩＤ配列を出発点として使用し、シミュレーションしたカバー率およびエラーを社内試料の収集物からの経験的カバー率プロファイルおよび最大－マイナー対立遺伝子頻度に基づいてインポーズする。得られたシミュレーション試料は、ｐａｎｇｏｌｉｎに通され、系統分類が、元のＧＩＳＡＩＤ配列のものと比較される。分類安定性は、変異配列がそれらの予想系統分類を維持する率として定義される。ある実施形態では、回帰に関する２つの実験が、シミュレーションによる分類安定性をアセスメントするために実行される。したがって、方法は、各ＶＯＣ／ＶＯＩについての最大１００のＧＩＳＡＩＤ配列をランダムにサンプリングして、これらの重要な系統の分類安定性を、入手可能なシークエンシングデータ中のそれらの頻度に関係なく、アセスメントすることができる６２４。または、各ＶＯＣ／ＶＯＩについてのより多くのまたはより少ないＧＩＳＡＩＤ配列（例えば、５０、２００、４００、５００またはそれより多く）を、解析の必要に応じて、サンプリングすることができる。これは、新興バリアントおよび既存のものの新たな亜系統の、分類安定性をアセスメントすることを可能にし得る。加えて、方法は、系統分類安定性の頻度に基づくレトロスペクティブ解析のためにデータベースから１０，０００のＧＩＳＡＩＤ配列をランダムにサンプリングすることができる６２６。または、より多くのまたはより少ないレトロスペクティブＧＩＳＡＩＤ配列を、解析の必要に応じて、サンプリングすることができる。これは、安定性を過去の保有率と比較して定量化することを可能にし得る。
【0081】
次いで、データシミュレーター実験の出力データが再考され、ＶＯＣ／ＶＯＩデータついてのＧＩＳＡＩＤデータ６２８およびレトロスペクティブデータ６３０を使用して以前の回帰検定に関する分類安定性の予想外の変更がチェックされる。ある特定の実施形態では、あらゆる予想外の不安定性が調査され、記録される６３２。ある特定の実施形態では、ある特定のパラメーターを満たすとアップグレードが受け入れられる。一部の場合には、シミュレーションデータと参照配列との間のＶＯＣ／ＶＯＩ一致度中央値が少なくとも９０％であった場合、アップグレードがリクエストされる６４０。これらの基準が満たされない場合、追加の調査が必要とされ得る。
【0082】
ある特定の実施形態では、新たな不一致系統が新規のものであった場合、試料は、確認のために検査され得る。不一致バリアントが、新規バリアントでなかった場合、方法は、不一致の根本原因を見つけるためのさらなる調査を含み得る。これは、参照配列のカバー率はもちろん、それが特定の領域における塩基カバー率の望ましくない降下でないことを保証するためにシミュレーションした配列も、調べることを含み得る。これに加えておよび／または代えて、これは、この不一致が再現されるかどうかを見るために別のシードでのシミュレーションを再実行することを含み得る。再現された場合、アップグレードは中止され得る。
【0083】
この時点で、新規バリアントは、本明細書で開示される方法およびシステムを使用してアセスメントされ得る６５０。新興バリアント（系統）のサーベイランス成功のために、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析を行うことによりｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ反転プローブ増幅に対する潜在的影響を再考することは、有益であり得る。したがって、方法は、新興系統の個々の配列バリアントおよび関連ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブの位置を同定して、プローブ結合に干渉する可能性をアセスメントするステップをさらに含み得る。ある実施形態では、任意のプローブとオーバーラップする新規配列バリアントがハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことになるという控えめな推定が使用される。これに加えておよび／または代えて、領域内の隣接するプローブが、新規配列バリアントのカバー率を確保するために再考され得る。特定の領域内のカバー率の低下をもたらし得る任意の配列バリアントについて、ｐａｎｇｏｌｉｎ系統アップデート検証サマリー内の影響を受けるプローブが記録される。
【0084】
ＮＧＳ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株決定のためのシステム
本明細書における方法を遂行するためのシステムも開示される。例えば、システムは、方法の様々なステップを遂行するためのステーションまたはコンポーネント（単数または複数）を含み得る。ある特定の実施形態では、ステーションまたはコンポーネントは、方法のステップ（単数または複数）を遂行するための、ロボットまたはコンピュータによる制御ステーションまたはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップのうちの少なくとも一部を遂行するためのシステムが、開示される。
本明細書における方法を遂行するためのシステムも開示される。例えば、システムは、方法の様々なステップを遂行するためのステーションまたはコンポーネント（単数または複数）を含み得る。ある特定の実施形態では、ステーションまたはコンポーネントは、方法のステップ（単数または複数）を遂行するための、ロボットまたはコンピュータによる制御ステーションまたはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップのうちの少なくとも一部を遂行するためのシステムが、開示される。
【0085】
したがって、システムは、検査用の試料を得るためのステーションまたはコンポーネントを含み得る。試料は、ＣＯＶＩＤステータスが分からないものであることも、ＣＯＶＩＤに対して以前に検査で陽性と出た試料であることもある。ある特定の実施形態では、陽性試料は、承認されたＥＵＡ承認ＣＯＶＩＤ－１９ ＲＴ－ＰＣＲ Ｔｅｓｔ（例えば、Ｌａｂｃｏｒｐ ＥＵＡ２０００１１および／またはＥＵＡ２０３０５７）を使用して同定され得る。このように、結果は、試料中のウイルスＲＮＡの検出後の個体を感染させるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の同定についての結果である。
【0086】
ある特定の実施形態では、システムは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを生成することを含む試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップを遂行するためのステーションまたはコンポーネントを含み得る。システムは、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの１本の鎖を、ペアのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを含む一本鎖プローブＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせるためのステーションまたはコンポーネントも含み得、第１のプローブは、プローブＤＮＡ鋳型の３’末端に位置し、第２のプローブは、プローブＤＮＡ鋳型の５’末端に位置する。ある特定の実施形態では、プローブ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プローブとして選択される。例えば、代替実施形態では、プローブは、約１００、または２００、または３００、または４００、または５００、または６００、または７００、または８００、または９００塩基対、または１，０００より多くの塩基対分、間隔が空いていることがある。または、この範囲内の間隔（例えば、４５０、５５０、６５０または７５０）が使用され得る。プローブは、３０ｋｂ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの９９％より多く（例えば、９９．６％）にわたってタイリングされ得る。また、ある特定の実施形態では、一本鎖プローブＤＮＡ鋳型は、プローブ配列の内部に位置するユニバーサルシークエンシングプライマー（例えば、Ｍ１３プライマー）をさらに含む。加えて、一本鎖プローブＤＮＡ鋳型は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプター配列をさらに含み得る。また、システムは、２つのプローブ間の配列を埋めて２つのプローブ配列間に試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を生成すること、次いで、試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから遊離させること、および核酸シークエンシングのための鋳型として使用される直鎖状ＤＮＡを生成するための試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型の消化のための、ステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、システムは、アダプターを付加させるために直鎖状プローブＤＮＡ鋳型を改変し、次いで、直鎖状ＤＮＡ鋳型をＤＮＡシークエンシングのために増幅するための、ステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、濃縮ステップは、精製ステップ（例えば、ビーズによる精製）を含む。
【0087】
システムは、ＤＮＡシークエンシングのためのステーションおよび／またはコンポーネントをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、方法は、全ゲノムシークエンシングを用いる。ある特定の実施形態では、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が使用される。または、他のタイプのシークエンシング、例えば、これらに限定されないが、サンガーシークエンシング、ショットガンシークエンシング、ＳＭＲＴシークエンシング、パイロシークエンシングまたはナノポアシークエンシング。例えば、ある特定の実施形態では、ＰａｃＢｉｏ全ゲノムシークエンシングが、対応するＳＭＲＴ ｌｉｎｋ ９ソフトウェアおよび解析ツールとともに、使用され得る。
【0088】
システムは、データ解析のためのステーションおよび／またはコンポーネントをさらに含み得る。したがって、システムは、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを、試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインして試料特異的アセンブリおよびコンセンサス配列を生成することによって決定するための、ならびに／または試料についての系統をアセスメントするための、ステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、システムは、対象の地理的位置を同定するためのステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。
【0089】
加えて、本明細書で開示されるように、ある特定の実施形態では、システムは、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの結果をバリアントが検出された場合にさらなる分類のためにデポジトリーにアップロードすることを含み得る、ステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。デポジトリーは、ＣＤＣデータベースであり得る。または、他の公共のデポジトリーが使用され得る。
【0090】
本明細書で開示されるように、システムは、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの前にデポジトリーのアップデートが行われたかどうかを決定するためのステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。
【0091】
システムは、手順の様々なステップを自動化するためのステーションおよび／またはコンポーネントを含み得る。ある特定の実施形態では、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒロボットが、試料プレート設定のために使用され得る。これに加えておよび／または代えて、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ Ｍａｎｔｉｓ液体ハンドラーまたは他の自動デバイスが、マスターミックス分配に使用され得る。
【0092】
図７は、本開示の方法ステップのいずれかを遂行するためのシステム７００の実施形態を示す。図７に示されているように、システムは、検査用の試料を得るためのステーションまたはコンポーネント７０２を含み得る。ある特定の実施形態では、試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して陽性である。ある実施形態では、システムは、ＲＴ－ＰＣＴによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡ配列を生成するためのコンポーネントのステーション７０４を含む。システムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを一連のタイル型プローブとともにインキュベートするためのステーションまたはコンポーネント７０６をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、タイル型プローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにわたって比較的等間隔で配置される。例えば、代替実施形態では、プローブは、約１００、または２００、または３００、または４００、または５００、または６００、または７００、または８００、または９００塩基対、または１，０００より多くの塩基対分、間隔が空いていることがある。または、この範囲内の間隔（例えば、４５０、５５０、６５０または７５０）が使用され得る。プローブは、３０ｋｂ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの９９％より多く（例えば、９９．６％）にわたってタイリングされ得る。結合後、２つのプローブの中間の領域が、ＤＮＡポリメラーゼで埋められ、ライゲーションされて、閉じた分子が形成され得る。これは、タイル型プローブとともにインキュベートするステップと同じステーションで、または異なるステーションで、異なるコンポーネントを使用して、行われ得る７０８。非結合または不完全ループは、直鎖状分子のままであり、エキソヌクレアーゼ消化によって除去され得る。これは、タイル型プローブとともにインキュベートするステップと同じステーションで、または異なるステーションで、異なるコンポーネントを使用して、行われ得る。システムは、鋳型ｃＤＮＡからの環状分子の遊離、ならびに３’Ｍ１３ユニバーサル配列および５’試料特異的バーコードを用いる増幅による濃縮のためのステーション７１０をさらに含み得る。システムは、試料のプーリングおよびライブラリー生成のためのステーションおよび／またはコンポーネント７１２をさらに含み得る。
【0093】
システムは、本明細書で開示される方法を使用する、ＤＮＡをシークエンシングするためのステーションおよび／またはコンポーネント７１４、ならびにコンティグアラインメントおよびバリアント同定のためのステーションおよび／またはコンポーネント７１６をさらに含み得る。また、システムは、本明細書で開示されるように、結果を検証および報告するためのステーションおよび／またはコンポーネント７１８を含み得る。
【0094】
本明細書で例証されるように、方法ステップ、ステーションまたはコンポーネントのいずれかは、少なくとも一部はコンピュータ８００および／またはプログラム可能なソフトウェアにより、自動化、ロボット制御、および／または制御され得る。したがって、システムは、システムもしくはシステムの任意の部分（例えば、ステーションもしくはコンポーネント）を実行するようにならびに／または開示される実施形態のいずれかの方法のステップ（単数もしくは複数）を遂行するように構成された命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のデータプロセッサーと、１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに、１つまたは複数のデータプロセッサーに、本明細書で開示される１つもしくは複数の方法もしくはプロセスの一部もしくは全てを遂行させるおよび／または本明細書で開示されるシステムの部分のいずれかを実行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを含む、システムが提供される。
【0095】
例えば、１つまたは複数のデータプロセッサーと、１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップのうちの少なくとも１つを指示する動作を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを含む、システムが開示される。
【0096】
システムを実行するようにおよび／または開示される実施形態のいずれかの方法のステップ（単数もしくは複数）を遂行するように構成された命令を含む非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品も、開示される。例えば、ある特定の実施形態では、非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品は、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップのうちの少なくとも１つを指示する動作を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させるように構成された命令を含む。これに加えておよび／または代えて、ある特定の実施形態では、非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品は、（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップのうちの少なくとも１つを指示する動作を遂行するようにシステムのコンポーネントおよび／またはステーションの少なくとも１つに指示する動作を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させるように構成された命令を含む。
【0097】
システムおよびコンピュータ製品は、本明細書で開示される方法のいずれかを遂行し得る。本明細書に記載される１つまたは複数の実施形態は、プログラマティックモジュール、エンジンまたはコンポーネントを使用して実装され得る。プログラマティックモジュール、エンジン、またはコンポーネントは、１つまたは複数の定められたタスクまたは機能を遂行することができる、プログラム、サブルーチン、プログラムの一部分、ソフトウェアコンポーネントまたはハードウェアコンポーネントを含み得る。本明細書で使用される場合、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュールまたはコンポーネントとは無関係にハードウェアコンポーネント上に存在し得る。あるいは、モジュールまたはコンポーネントは、他のモジュール、プログラムまたは機械の共有要素またはプロセスであり得る。
【0098】
図８は、病原体の検出および／または定量化に使用される解析システム８００のブロック図を示す。図８に示されているように、１つまたは複数のプロセッサーにより実行可能なモジュール、エンジン、またはコンポーネント（例えば、プログラム、コード、または命令）が、様々な実施形態による解析装置システムの様々なサブシステムを実装するために使用され得る。モジュール、エンジン、またはコンポーネントは、非一時的なコンピュータ媒体に記憶され得る。必要に応じて、モジュール、エンジン、またはコンポーネントの１つまたは複数がシステムメモリー（例えば、ＲＡＭ）にロードされ、解析装置システムの１つまたは複数のプロセッサーにより実行され得る。図８に描示されている例には、本開示の方法を実装するためのモジュール、エンジン、またはコンポーネントが示されている。
【0099】
したがって、図８は、本開示によるシステムおよび方法での使用に好適なコンピュータデバイス８００の例を示す。コンピュータデバイスの例８００は、１つまたは複数の通信バス８１５を使用してメモリー８１０およびコンピュータデバイス８００の他のコンポーネントと通信している、プロセッサー８０５を含む。プロセッサー８０５は、図１～７に示されているものまたは本明細書の他の箇所で開示されるものなどの異なる例に従って、１つもしくは複数の方法を遂行するために、または病原体レベルを検出するための１つもしくは複数のステーションもしくはコンポーネントを作動させるために、メモリー８１０に記憶されているプロセッサー実行可能命令を実行するように構成されている。この例では、メモリー８１０は、本明細書で論じられるような試料または検査ユニット確認の結果を解析すること８２０ができるプロセッサー実行可能命令８２５を記憶し得る。
【0100】
この例におけるコンピュータデバイス８００は、ユーザー入力を受け入れるための１つまたは複数のユーザー入力デバイス８３０、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、マイクロホンなども含み得る。コンピュータデバイス８００は、ユーザーに映像出力を提供するためのディスプレイ８３５、例えば、ユーザーインターフェースも含み得る。コンピュータデバイス８００は、通信インターフェース８４０も含み得る。一部の例では、通信インターフェース８４０は、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）；広域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、例えば、インターネット；メトロポリタンエリアネットワーク（「ＭＡＮ」）；二地点間またはピアツーピア接続などを含む、１つまたは複数のネットワークを使用して通信を可能にし得る。他のデバイスとの通信は、任意の好適なネットワークプロトコルを使用して果たされ得る。例えば、１つの好適なネットワークプロトコルは、インターネットプロトコル（「ＩＰ」）、伝送制御プロトコル（「ＴＣＰ」）、ユーザーデータグラムプロトコル（「ＵＤＰ」）、またはこれらの組合せ、例えば、ＴＣＰ／ＩＰもしくはＵＤＰ／ＩＰを含み得る。
【実施例】
【0101】
本開示の方法およびシステムのある特定の実施形態を、本明細書における以下の実施例でより詳細に提供する。
【0102】
（実施例１）
全体的な方法および結果の解析
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用して、多数の試料に関して、ならびに懸念される変異およびバリアントをそれらが生じた場合に追跡するのに十分な数のウイルスゲノムを生成するために、サーベイランス検査を遂行することができる。全体的な検査原理は、次の通りである。先ず、第一鎖合成のためにランダムプライミングを使用してウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、１６時間のハイブリダイゼーション中に反転プローブを標的にアニールする。次に、ギャップを重合およびライゲーションによって埋める。次に、反応しなかった直鎖状プローブを除去し、プローブを標的ＤＮＡから遊離させる。次に、捕捉された標的を、非対称バーコードを使用するＰＣＲ増幅により濃縮する。次に、ＰＣＲ産物をプールし、定量化し、ＳＭＲＴｂｅｌｌヘアピンアダプターをアンプリコンにライゲーションし、１５時間ムービーを使用してＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩでシークエンシングする。
全体的な方法および結果の解析
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用して、多数の試料に関して、ならびに懸念される変異およびバリアントをそれらが生じた場合に追跡するのに十分な数のウイルスゲノムを生成するために、サーベイランス検査を遂行することができる。全体的な検査原理は、次の通りである。先ず、第一鎖合成のためにランダムプライミングを使用してウイルスＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、１６時間のハイブリダイゼーション中に反転プローブを標的にアニールする。次に、ギャップを重合およびライゲーションによって埋める。次に、反応しなかった直鎖状プローブを除去し、プローブを標的ＤＮＡから遊離させる。次に、捕捉された標的を、非対称バーコードを使用するＰＣＲ増幅により濃縮する。次に、ＰＣＲ産物をプールし、定量化し、ＳＭＲＴｂｅｌｌヘアピンアダプターをアンプリコンにライゲーションし、１５時間ムービーを使用してＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩでシークエンシングする。
【0103】
この時点で、ＮＧＳ配列データの処理に基づいて系統コールを行う。この解析のために、「チェリーピッキングされる」（より詳細に本明細書中で論じられる）どの凝縮陽性も、９６ウェル凝縮陽性プレートのウェルＡ１における鋳型なし対照（ＮＴＣ）（すなわち、分子グレードの水）を含む。所与のＳＭＲＴｃｅｌｌの結果ファイルの生成の前にＮＴＣ結果を再考する。ＮＴＣが無効であることが分かった場合、影響を受けるプレート上の全ての患者試料についての結果が報告されない。所与のシークエンスセルについてのＮＧＳ結果の処理の完了時に、結果ファイルを生成し、保存する。この時点で、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴＬＮＫソフトウェアおよびカスタムｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ処理スクリプトを使用して、試料の各々についてのＦＡＳＴＱファイルを生成する。ＣＬＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒバージョン６．５．６で実装されるゲノム解析パイプラインを使用して、ＦＡＳＴＱ結果を解析する。このワークフローは、試料レベルｆａｓｔｑファイルによって開始し、プライマーをトリミングし、次いで、Ｍｉｎｉｍａｐ２を使用してＳＡＲＳ－ＣＯＶＩＤ１９参照ゲノム（「ＮＣ＿０４５５１２ｖ２」）とアラインしてアラインメントのｂａｍファイルを生成する。カバー率をチェックした後、ｂａｍファイルを、バリアントをコールするためのおよび試料特異的ゲノムアセンブリを生成するための入力データとして使用する。４ＣＣＳリードのカバー率および各塩基における５０％の代替対立遺伝子頻度を必要とする「ＶＣＦｃｏｎｓ」を使用して、各試料についてのコンセンサス配列を生成する。Ｐａｎｇｏｌｉｎパッケージを使用して、個々の試料についての系統を割り当てる。
【0104】
（実施例２）
ＶｉｒＳｅｑ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＧＳ株の決定方法および決定の検証
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムシークエンシングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の株を決定することができる。株情報は、ウイルスに対する公衆衛生上の対応または将来の臨床処置に役立つ有益な情報を臨床医および疫学者に提供できる可能性がある。所与の株の決定は、ＤＮＡシークエンシング結果の、元の武漢参照株との比較から検出されるゲノムの複数の変化の組合せに基づく。このアプローチによって、時が経つにつれてウイルスが変化したとき再検証なしにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のあらゆる新しいおよび新興株の同定が可能になる。このアッセイの使用目的は、少なくとも９０％ゲノムカバー率を生じさせる試料に関してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統または株のコールをもたらすことである。
ＶｉｒＳｅｑ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＧＳ株の決定方法および決定の検証
ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムシークエンシングは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定の株を決定することができる。株情報は、ウイルスに対する公衆衛生上の対応または将来の臨床処置に役立つ有益な情報を臨床医および疫学者に提供できる可能性がある。所与の株の決定は、ＤＮＡシークエンシング結果の、元の武漢参照株との比較から検出されるゲノムの複数の変化の組合せに基づく。このアプローチによって、時が経つにつれてウイルスが変化したとき再検証なしにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のあらゆる新しいおよび新興株の同定が可能になる。このアッセイの使用目的は、少なくとも９０％ゲノムカバー率を生じさせる試料に関してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統または株のコールをもたらすことである。
【0105】
全体的な検査原理は、次の通りである。残存ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡＡ診断検査陽性試料からの残存全核酸抽出物を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＴＡＲを使用して実行プレートから凝縮陽性プレートにチェリーピッキングし、１つの生産バッチに８プレートまたは７６８検体で、９６のシークエンシング実行プレートに分取した。次いで、ＰａｃＢｉｏにおいてＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｃａｐｔｕｒｅを使用して、ＰａｃＢｉｏシークエンシングまで試料を処理した。先ず、Ｌｏｏｐキットの特異的Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＶＩＬＯ逆転写酵素を使用してＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを標的として使用して、表１で概説されるようにｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブにアニールした。ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブを全３０ＫＢ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムにわたってタイリングした。これらのプローブは、おおよそ６００ｂｐ離れている２つの結合部位を含む。
【0106】
【表1】
【0107】
結合後、２つのプローブの中間のおおよそ６００ｂｐ領域をＤＮＡポリメラーゼで合成し、表１におけるハイブリダイゼーション条件を使用してさらに６０分間、ライゲーションして、閉じた分子を形成した。非結合または不完全ループは、直鎖状分子のままであり、それらをエキソヌクレアーゼ消化によって除去した（すなわち、試料クリーンアップ）。クリーンアップのためのインキュベーション時間を表２に示す。試料を、約２時間以内に次のステップに使用しない場合、－２０℃で保管した。
【0108】
【表2】
【0109】
次いで、得られた環状分子（２つのプローブ部位の間に挿入された試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を含有する）を鋳型ｃＤＮＡから遊離させ、試料特異的バーコードを用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅に使用した条件を表３に示す。７６８の非対称バーコードの組合せが１つのバッチ（すなわち、７６８の試料および対照）を処理するために必要である。これを行うために、Ｍ１３バーコード付きプライマーのプレートを調製し（図９）、次いで、２０μＬのＭ１３フォワードバーコード付きプライマーおよび３０μＬのＭ１３リバースバーコード付きプライマーを添加することにより１０の９６ウェルプレートを作出した（図１０）。図９に示されているように、第１～４列は、バーコード１００１～１０３２を尾部に有するＭ１３フォワードプライマーであり、第７～１０列は、バーコード１０４９～１０７９および１０８２を尾部に有するＭ１３リバースプライマーであった。３２のフォワードプライマーの各々を異なるリバースプライマーと組み合わせて、プレートの１つの例について図１０に示されているような非対称にバーコードが付けられたペアを作出した。
【0110】
【表3】
【0111】
次に、試料をプールした（またはプーリングを遂行するまで－２０℃で保管した）。プーリングのために、８つの反応プレートを保管場所から取り出し、遠心沈降させ、各反応のアリコート（例えば、５μＬ）を８ｍＬ管に移した。一般に、７６８の試料に加えて対照をシークエンシングの前にプールした。
【0112】
この時点で、ＡＭＰｕｒｅ ＰＢビーズでのビーズによる精製を使用して試料を精製した。５００μＬのプールを使用して、３５０μＬのＰＢ ＡＭＰｕｒｅビーズを添加し、混合し、遠心分離にかけてビーズをペレット化し、５分間、室温でインキュベートし、遠心分離にかけ、磁気分離してビーズを回収することにより、ＡＭＰｕｒｅ ＰＢ Ｂｅａｄ（０．７０Ｘ）クリーンアップを遂行した。上清を除去し、ビーズを８０％エタノールで洗浄し、溶出緩衝液でビーズからＤＮＡを溶出させ、定量した。
【0113】
この時点で、１０００ｎｇのプールされたＤＮＡを使用してＳＭＲＴｂｅｌｌライブラリーを調製した。プールされたＤＮＡを緩衝液（ＤＮＡ Ｐｒｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ）、ＮＡＤ、ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｉｘ ｖ．２と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。４℃に戻した後、Ｅｎｄ Ｐｒｅｐ Ｍｉｘ、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ １の添加、２０℃で３０分間、６５℃で３０分間、インキュベートとすること、その後、反応を４℃に戻すことにより、末端修復を遂行した。この時点で、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ ２、Ｏｖｅｒｈａｎｄ Ａｄａｐｔｅｒ ｖ３、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＡｄｄｉｔｉｖｅおよびＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒを使用してアダプターを付加させ、試料を、プローブ構築物をライゲーションするために２０℃で６０分間、リガーゼを不活性化するために６５℃で１０分間、インキュベートし、その後、４℃に戻した。次いで、酵素クリーンアップを遂行し、１００ｕＬの溶出緩衝液を使用して上記のＡＭＰｕｒｅ（０．６Ｘ）ビーズで試料を精製した。次いで、小体積（２０ｕＬ）の溶出緩衝液を使用しＡＭＰｕｒｅビーズクリーンアップを反復し、ＤＮＡを定量した。
【0114】
試料をＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ ＩＩでシークエンシングした。１０のバッチにおける各９６ウェルプレートは非対称バーコードの特有のセットを必要とする。図１０は、１つのプレートについてのマップの一例を示す。特有の組合せを有する１０のプレートを使用するような他の組合せを他のプレートに使用した。例えば、第２のプレートでは、ウェルＡ１～Ｈ４は、Ｍ１３フォワードプライマー１００１～１０３２とＭ１３リバースプライマー１０５２の組合せとなり、ウェルＡ５～Ｈ８は、Ｍ１３フォワードプライマー１００１～１０３２とＭ１３リバースプライマー１０５３の組合せとなり、ウェルＡ９～Ｈ１２は、Ｍ１３フォワードプライマー１００１～１０３２とＭ１３リバースプライマー１０５４の組合せとなり、さらなるプレートについては、その他様々である。
【0115】
シークエンシング後、ＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴＬＮＫソフトウェアおよびカスタムｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ処理スクリプトを使用して、各試料についてのＦＡＳＴＱファイルを生成した。ＣＬＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒバージョン６．５．６で実装されるゲノム解析パイプラインを使用してＦＡＳＴＱを解析した。このワークフローは、試料レベルｆａｓｔｑファイルによって開始し、プライマーをトリミングし、Ｍｉｎｉｍａｐ２を使用してＳＡＲＳ－ＣＯＶＩＤ１９参照ゲノム（「ＮＣ＿０４５５１２ｖ２」）とアラインしてアラインメントのｂａｍファイルを生成した。カバー率をチェックした後、このｂａｍファイルを、バリアントをコールするためのおよび試料特異的ゲノムアセンブリを生成するための入力データとして使用した。４ＣＣＳリードのカバー率および各塩基における５０％の代替対立遺伝子頻度を必要とする「ＶＣＦｃｏｎｓ」を使用して、各試料についてのコンセンサス配列を生成した。次いで、Ｐａｎｇｏｌｉｎパッケージを使用して個々の試料についての系統を割り当て、その結果を得た。
【0116】
以下の対照を含めた。試料および試薬にわたって夾雑がないことを実証するために全てのステップの実行時に各プレートに鋳型なし対照（ＮＴＣ）を含めた。この対照をシークエンシングにより解析した。不合格ＮＴＣは、９０％ゲノムカバー率を有する株のコールを生じさせる試料であった。陽性対照を実行の各プレートに含めた。検証のために、以前に実行した試料を陽性対照として使用した。試料が合格したのか不合格であったのかを決定するための測定基準は、ゲノムカバー率パーセント、カバー率の最小深度、および株系統コール解決率を含んだ。
【0117】
検体要件は、次の通りであった。約９０％成功率のために２６未満のＣＴでのＥＵＡ承認ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＮＡＡ検査からの陽性結果を有する試料に由来する抽出核酸。より高いＣＴまたはＣＴのないメタデータ試料は、許容可能であるとみなされたが、結果を報告できないリスクを増大した。
【0118】
許容可能な結果測定基準は、次の通りであった：＞９０％ゲノムカバー率、およびリードカバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード。
【0119】
Ａ．結果
精度（反復性）：イントラアッセイ
イントラアッセイ反復性を、現行のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＤＣサーベイランス検査からの様々な推測タイピングの１１の核酸試料の３回の反復実験でアセスメントした。試料は、元の実行ではＣＴ値および広範なリードカウントに幅があった。さらに、試料を１：４希釈して、全てのイントラおよびインターアッセイ実験への十分な全核酸投入を可能にした。判定基準を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの≧９０％カバー率の報告閾値に達する全ての株の≧９５％反復性と定義した。
精度（反復性）：イントラアッセイ
イントラアッセイ反復性を、現行のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＣＤＣサーベイランス検査からの様々な推測タイピングの１１の核酸試料の３回の反復実験でアセスメントした。試料は、元の実行ではＣＴ値および広範なリードカウントに幅があった。さらに、試料を１：４希釈して、全てのイントラおよびインターアッセイ実験への十分な全核酸投入を可能にした。判定基準を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの≧９０％カバー率の報告閾値に達する全ての株の≧９５％反復性と定義した。
【0120】
株コール、ゲノムカバー率パーセント（欠測パーセントとして表示する）、およびリードカウントを比較した（表４）。全１１試料の株コールは、３回の反復実験にわたって１００％の一致度であり、全ての反復実験が、９０％ゲノムカバー率および十分なリード深度を満たした。９０％ゲノムカバー率を有する株の９５％精度の判定基準を満たした。
【0121】
【表4】
【0122】
精度（再現性）：インターアッセイ
インターアッセイ反復性を、現行のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＤＣサーベイランスからの様々な推測タイピングの１０の核酸試料の３回の反復実験でアセスメントした。試料は、イントラアッセイ実験で使用したものと同一であり、最終実行から意図せず除外されたことから欠落した試料が１つあった。試料は、元の実行ではＣＴ値および広範なリードカウントに幅があった。さらに、試料を１：４希釈して、全てのイントラおよびインターアッセイ実験への十分な全核酸投入を可能にした。判定基準を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの≧９０％カバー率の報告閾値に達する全ての株の≧９５％反復性と定義した。
インターアッセイ反復性を、現行のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＣＤＣサーベイランスからの様々な推測タイピングの１０の核酸試料の３回の反復実験でアセスメントした。試料は、イントラアッセイ実験で使用したものと同一であり、最終実行から意図せず除外されたことから欠落した試料が１つあった。試料は、元の実行ではＣＴ値および広範なリードカウントに幅があった。さらに、試料を１：４希釈して、全てのイントラおよびインターアッセイ実験への十分な全核酸投入を可能にした。判定基準を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの≧９０％カバー率の報告閾値に達する全ての株の≧９５％反復性と定義した。
【0123】
株コール、ゲノムカバー率パーセント（欠測パーセントとして表示する）、およびリードカウントを比較した（表５）。全１０回の反復実験について、不一致の結果はなかった。９つの試料が、予想された系統コールを三連反復実験にわたって生じさせた。境界リードカバー率のために意図的に選択した１つの試料は、ゲノムカバー率の欠如に起因してどの回も結果を生じさせることができなかった。全体的に見て、試料の９３％が同一の株タイピングを生じさせ、試料の１００％が、判定基準を満たす正確な結果をリリースした。
【0124】
【表5】
【0125】
一致度
相対精度を、代替法により生成したものとの結果の直接比較によって確立した。陽性の比較に使用した２つの方法、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングおよびアンプリコンＰａｃｂｉｏシークエンシング、があった。Ｐａｃｂｉｏは、有効性が認められたシークエンシング技術である一方、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ法は、旧来のアンプリコンシークエンシングとはプレシークエンシングステップが機構的に異なる。陰性は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのみでシークエンシングした。
相対精度を、代替法により生成したものとの結果の直接比較によって確立した。陽性の比較に使用した２つの方法、ＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングおよびアンプリコンＰａｃｂｉｏシークエンシング、があった。Ｐａｃｂｉｏは、有効性が認められたシークエンシング技術である一方、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ法は、旧来のアンプリコンシークエンシングとはプレシークエンシングステップが機構的に異なる。陰性は、Ｉｌｌｕｍｉｎａのみでシークエンシングした。
【0126】
使用した個々の比較研究を下に列挙する。
・Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｒｔｉｃシークエンシング
○９３の陰性ＮＡＡ試料
○２０２０年の冬にシークエンシングした７２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料
○Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいてＣＭＢＰで以前にシークエンシングした２９の試料
○Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいてＤＮＡ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎで以前にシークエンシングした５０の試料
・Ｐａｃｂｉｏアンプリコンシークエンシング
○９０％カバー率でアンプリコンシークエンシングし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいて二連で実行した、１２２の試料
・Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｒｔｉｃシークエンシング
○９３の陰性ＮＡＡ試料
○２０２０年の冬にシークエンシングした７２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料
○Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいてＣＭＢＰで以前にシークエンシングした２９の試料
○Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいてＤＮＡ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎで以前にシークエンシングした５０の試料
・Ｐａｃｂｉｏアンプリコンシークエンシング
○９０％カバー率でアンプリコンシークエンシングし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいて二連で実行した、１２２の試料
【0127】
最小リードカバー率のベースラインを設定するために、検証実行からの１１０のＮＴＣおよび検証タイムライン中に実行した現行のＲＵＯ株サーベイランスを使用して、４ＣＣＳリードで最小リードカバー率閾値セットを設定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ一致度のために、９３の陰性をＣＭＢＰ ＮＡＡ診断用生産実行からランダムに選択し、十分な体積を確保するために最初の検査後に再抽出した。２０２０年の冬に流布し、２０２１年１月にシークエンシングした、株の７２の試料を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐで再シークエンシングした。さらに、ＣＭＢＰおよびＤＮＡからの７９の試料を、多様性を確保するために最初の株コール、ＣＴおよびリードカバー率に基づくＩｌｌｕｍｉｎａ並行検査に選択した。当初はＰａｃｂｉｏでアンプリコンシークエンシングした３８２の試料を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐにおいて二連で再処理した。二連反復実験は、同等であることを以前に示したＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＶＩＬＯ ＲＴマスターミックスのそれらの組成がほんのわずか異なった。最初のアンプリコンシークエンシング実行では、３８２の試料のうちの１２２が、＞９０％ゲノムカバー率を生じさせた。最初の９０％カバー率を有する試料のみを、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ結果のさらなる解析に使用した。
【0128】
判定基準は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの≧９０％カバー率の報告閾値に達する全ての株の≧９５％精度であった。
【0129】
リードカバー率閾値：ここでは平均リードカバー率と呼ぶアンプリコンカバー率中央値の平均、最小および最大平均値を、検証実行および生産実行について解析した。平均リードカバー率の分布を図１１に示す。最小、最大および平均は、それぞれ、０．２４、９および１．７ＣＣＳリードであった。典型的な閾値を、３Ｘ標準偏差プラス平均により設定し、これはこの解析については６．６７に等しい。しかし、迅速な処理のために、株タイピングに使用する塩基対についてのカットオフリードカバー率を、１０ＣＣＳリード、または１０％プラス最大ＮＴＣで設定した。
【0130】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ａｒｔｉｃシークエンシング：陰性であると以前に決定された９３の試料をＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＬｏｏｐにおいておよびＩｌｌｕｍｉｎａにおいて二連で並行してシークエンシングした。Ｉｌｌｕｍｉｎａにおける報告対象ゲノムをもたらす２つの試料、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおけるものに関して、２つの技術間に９８．３％の一致度があった。さらなる調査により、Ｉｌｌｕｍｉｎａにおいて得られた両方の試料は、実際には核酸増幅（ＮＡＡ）に対して陽性であり、誤って検証に含まれたことが明らかになった。二連での他の９１の試料についての平均リードカウントは、控えめなリード深度閾値をさらに確証した（図１２）。
【0131】
２０２１年１月に流布した株からのＩｌｌｕｍｉｎａにおいて以前にシークエンシングした７２の試料を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいて再シークエンシングした。流布している現行の株を提示するために、ＣＭＢＰおよびＤＮＡ同定時にＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいて以前にシークエンシングした７９の試料を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐおよびＩｌｌｕｍｉｎａにおいて並行して再シークエンシングした。検査現場間の輸送中に損傷したまたは比較シークエンシング反応に失敗した試料の除去後、両方のプラットフォームで生じさせることに成功した１２３の株コールを解析した（図１３）。
【0132】
７２の試料のうち、５１は、７１％成功率のための１０ＣＣＳリード深度および９０％ゲノムカバー率のＱＣ閾値を満たした。この報告対象ゲノム率は、検証の月中の７２．５％のＤＮＡでのＣＤＣ株サーベイランス報告対象ゲノム率と似ていた。５１の報告対象結果のうちの全ての株の結果が１００％の一致度であった（表６）。平均で１０ＣＣＳ未満のリード深度を有する結果の組み入れによって、１０／１３（７７％）のマッチする株の結果、および６１／６４、９５．３％、の完全一致度が得られた。ゲノムカバー率が９０％未満の試料の解析は、同一の株の結果を２／７のしか有さなかった。
【0133】
【表6】
【0134】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＬｏｏｐにおいてＣＭＢＰおよびＤＮＡで当初シークエンシングした７２の試料のうちの６６を希釈後にＩｌｌｕｍｉｎａおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐにおいて十分なリード深度でシークエンシングするのに成功した。７２の試料全てが９０％カバー率を生じさせ、そのうち７１の株タイピングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ参照法と同一の株コールできた。全体的に見て、全ての報告対象結果は、並列技術間で１００％の一致度であった（表７）。
【0135】
【表7】
【0136】
アンプリコンＰａｃｂｉｏシークエンシング：アンプリコンシークエンシングで９０％カバー率を有した１２２の試料のうち、１１６を両方の反復実験について９０％カバー率で反復した。１１６のｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ反復株タイピング間に１００％の一致度があった。全体的に見て、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐと旧来のアンプリコンシークエンシング間での並行検査は、９８．２％の一致度であった。
【0137】
解析感度／特異度
熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株Ｂ．１．１．７（ＶＲ－３３２６ＨＫ（商標））、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＶＭ２０００１０６１およびＩｔａｌｙ－ＩＮＭＩ１ゲノムは、ＡＴＣＣにより特徴付けられている。解析感度のために、全てのバリアントを、解析パイプラインを使用して同定し、公開ＡＴＣＣ株バリアントデータセットと比較した。旧来、ヒトゲノムシークエンシングでは、注目すべきバリアントを解析し、検証し、偽発見率（ＦＤＲ）、偽陽性（ＦＰ）を全ての陰性ではなく全ての陽性コール（ＦＰ＋ＴＰ、ここでＴＰ＝真陽性）に対して正規化する。しかし、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２では、株コールをもたらす、所与の株の定義された位置における４～２０＋バリアントの組合せがある。また、ウイルスＲＮＡの完全ゲノムシークエンシングに起因して、現行の株タイピングにとって適切でないシークエンシングデータの変化を引き起こすことが公知の複数の高反復領域がある。Ｎｅｘｔｃｌａｄｅなどの株タイピングプログラムは、これを考慮に入れることができる。したがって、株について記録されているコールされたバリアントの数を総バリアント数で割ることによって感度を決定した。ＦＤＲに加えて、正確にシークエンシングされた塩基対と比較してコールされた偽バリアントの総数によって特異度を計算した。バリアントをコールし、株タイピングを出力するＰａｎｇｏｌｉｎにおいて、入力データとして、アセンブルされたゲノムを使用した。バリアントをコールせず、株をさらなる解析のためにのみ出力した。それ故、別のゲノムバリアントコーラー、ＣＬＣ、および反復することを考慮に入れるＮｅｘｔｃｌａｄｅ Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２特異的バリアントコーラーであって、バリアントコールを行うときにウイルス領域をシークエンシングすることが難しいＮｅｘｔｃｌａｄｅ Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２特異的バリアントコーラー、からのバリアントコールを使用して、感度および特異度を計算した。判定基準は、次の通りであった：（１）最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡで≧９０％の解析感度；および（２）最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡで≧９０％の解析特異度。最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡでの偽発見率を記録したが、判定基準を設定しなかった。
熱不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株Ｂ．１．１．７（ＶＲ－３３２６ＨＫ（商標））、Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／ＶＭ２０００１０６１およびＩｔａｌｙ－ＩＮＭＩ１ゲノムは、ＡＴＣＣにより特徴付けられている。解析感度のために、全てのバリアントを、解析パイプラインを使用して同定し、公開ＡＴＣＣ株バリアントデータセットと比較した。旧来、ヒトゲノムシークエンシングでは、注目すべきバリアントを解析し、検証し、偽発見率（ＦＤＲ）、偽陽性（ＦＰ）を全ての陰性ではなく全ての陽性コール（ＦＰ＋ＴＰ、ここでＴＰ＝真陽性）に対して正規化する。しかし、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２では、株コールをもたらす、所与の株の定義された位置における４～２０＋バリアントの組合せがある。また、ウイルスＲＮＡの完全ゲノムシークエンシングに起因して、現行の株タイピングにとって適切でないシークエンシングデータの変化を引き起こすことが公知の複数の高反復領域がある。Ｎｅｘｔｃｌａｄｅなどの株タイピングプログラムは、これを考慮に入れることができる。したがって、株について記録されているコールされたバリアントの数を総バリアント数で割ることによって感度を決定した。ＦＤＲに加えて、正確にシークエンシングされた塩基対と比較してコールされた偽バリアントの総数によって特異度を計算した。バリアントをコールし、株タイピングを出力するＰａｎｇｏｌｉｎにおいて、入力データとして、アセンブルされたゲノムを使用した。バリアントをコールせず、株をさらなる解析のためにのみ出力した。それ故、別のゲノムバリアントコーラー、ＣＬＣ、および反復することを考慮に入れるＮｅｘｔｃｌａｄｅ Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２特異的バリアントコーラーであって、バリアントコールを行うときにウイルス領域をシークエンシングすることが難しいＮｅｘｔｃｌａｄｅ Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２特異的バリアントコーラー、からのバリアントコールを使用して、感度および特異度を計算した。判定基準は、次の通りであった：（１）最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡで≧９０％の解析感度；および（２）最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡで≧９０％の解析特異度。最小カバー率より上であるセグメントにおけるバリアントについて対照ＲＮＡでの偽発見率を記録したが、判定基準を設定しなかった。
【0138】
両方のバリアントコーリングプラットフォームは、バリアントを検出するそれらの能力の点で高感度であり、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅで９６．２３％、ＣＬＣで９８．１１％の感度であった（表８）。ゲノムにわたって塩基対を決定する全体的特異度を比較したとき、両方とも＞９９．９％特異的であった。しかし、反復する、シークエンシングが困難な、領域について調整するＮｅｘｔｃｌａｄｅの能力は、２３での調整プロセスのないＣＬＣと比較して３での検出される偽バリアントの数から明らかであった。これは、偽バリアント発見が反復ウイルス領域をシークエンシングすることが困難な場合のものであることを示す、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅについて５．３６およびＣＬＣについて３０．２６であるバリアントの偽発見率の食い違いにつながり、これらの領域は、現行の株タイピングにとって適切でない。まとめると、全ての判定基準を満たしており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐプロセスは、高感度かつ全体的に特異的であり、現行の株タイピングアルゴリズムで解析されないウイルス領域からの高いＦＤＲを有する。
【0139】
【表8】
【0140】
アッセイ許容度
核酸投入量に対するアッセイ許容度は、反応に加えられる被解析物の量の変化に対する許容度と考えることができる。通常はｃｐ／μＬで表されるが、アッセイした試料の約８０％は、各試料の対応するサイクル閾値（ＣＴ）の値を提供するＥＵＡ ＮＡＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査からのものとなる。それ故、解析およびガイダンスのための投入量測定基準としてｃｐ／μＬの代わりにＣＴを使用した。残存ＮＡＡ検査からウイルスゲノムをシークエンシングすることは、本質的に、高い失敗率を有し、これは、検体のウイルス力価およびＲＮＡ完全性と直接関係しており、試料間で劇的に異なり得る。失敗率は、ＲＮＡ力価（ＣＴ）によって左右されるが、バックグラウンドを控えめに設定すると、より高いＣＴの試料において観察される失敗の増加は、食い違った結果をもたらすことにならず、アッセイの費用を単に増加させることになる。この検証のアッセイ許容度実験の目的は、所与のＣＴで予想成功率のベースラインを設定することであったが、シークエンシングされたゲノムを有するように試みるのがどの試料であるのかを限定しない。
核酸投入量に対するアッセイ許容度は、反応に加えられる被解析物の量の変化に対する許容度と考えることができる。通常はｃｐ／μＬで表されるが、アッセイした試料の約８０％は、各試料の対応するサイクル閾値（ＣＴ）の値を提供するＥＵＡ ＮＡＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査からのものとなる。それ故、解析およびガイダンスのための投入量測定基準としてｃｐ／μＬの代わりにＣＴを使用した。残存ＮＡＡ検査からウイルスゲノムをシークエンシングすることは、本質的に、高い失敗率を有し、これは、検体のウイルス力価およびＲＮＡ完全性と直接関係しており、試料間で劇的に異なり得る。失敗率は、ＲＮＡ力価（ＣＴ）によって左右されるが、バックグラウンドを控えめに設定すると、より高いＣＴの試料において観察される失敗の増加は、食い違った結果をもたらすことにならず、アッセイの費用を単に増加させることになる。この検証のアッセイ許容度実験の目的は、所与のＣＴで予想成功率のベースラインを設定することであったが、シークエンシングされたゲノムを有するように試みるのがどの試料であるのかを限定しない。
【0141】
３カ所の現場にわたって９，７１８の生産結果を、それらのヌクレオカプシド標的＃１（Ｎ１）ＣＴ値に基づく結果を生じさせる成功率について解析した。先ず、試料を、ゲノムを生じさせる能力によって９０％でビニングし、ＣＴ値を１整数刻みで最も近い整数に切り上げた。例えば、３０．１のＣＴを３１ビン未満で計算した。＜１６のＣＴを有する全ての試料を１６ビンに含めた。ＣＴメタデータを欠いている全ての試料を解析から除去した。判定基準は、（１）使用する入力濃度の許容可能な変化を有するシークエンシング用のＲＮＡの１０，０００コピーについての製造業者推奨が、解析についての以下の判定基準を満たす；および少なくとも２０試料のＣＴ群、であった。
【0142】
８８１５／９７１８を上回る生産試料が、対応するＣＴメタデータを有した。＜１６～２４ＣＴ解析ビンから約９０％ゲノムカバー率を生成する能力の低下はなかった（図１４）。２５ＣＴで出発して、９０％カバー率でゲノムを生成する所与のＣＴでの試料の能力の急落があり、３０．１→３１ＣＴビンは、７．６５％試料しか報告しなかった。アッセイ入力データのＣＴカットオフが必要とされる場合には、試料は＜２６ＣＴでなければならないことが推奨され、それらは７８％ゲノム産生率を有した。
【0143】
被解析物安定性
この検証における試料を、試料を臨床実験室で検査する期間を超える最低４週間の期間、保管した。長期安定性は、研究試料と同じ条件下で少なくとも３つのアリコートを保管することによって決定するべきである。試料の体積は、３回の別々の機会に解析するのに十分なものでなければならない。意図された保管温度で生体マトリックスにおける被解析物の安定性を確立するべきである。
この検証における試料を、試料を臨床実験室で検査する期間を超える最低４週間の期間、保管した。長期安定性は、研究試料と同じ条件下で少なくとも３つのアリコートを保管することによって決定するべきである。試料の体積は、３回の別々の機会に解析するのに十分なものでなければならない。意図された保管温度で生体マトリックスにおける被解析物の安定性を確立するべきである。
【0144】
様々な保管条件下での被解析物の安定性を、様々な保管長での一致度の測定により確立した。ＮＡＡ診断検査後、抽出した核酸を検査する実験室にドライアイスを用いて発送し、シークエンシングまで－２０℃で保管した。検証に使用した全ての試料は、残存生産試料であった。下で説明する安定性実験は、試料を収集し、シークエンシング実験室に発送するプロセスに加えてである。被解析物安定性を２つの別々の実験で測定した。第１の実験では、インターアッセイ精度に使用した１０の試料を、１ヵ月の時点を越えて３回、解凍し、アッセイし、再凍結した。試料は、様々な株、ＣＴ値、および元のリードカバー率を示した。第２の実験では、幅がある元のリード配列深度を有する懸念されるアルファ、ベータおよびデルタバリアント（ＶＯＣ）を含む１２の試料を、３回の凍結融解を必然的に伴う１ヵ月の－２０℃での保管後に再シークエンシングした。試料が、定義された保管長後に同じ株検出を生じさせ、かつ報告対象株の結果について≧９０％の精度を生じさせた場合、保管条件を好適とみなすように、判定基準を定義した。
【0145】
安定性研究で使用したインターアッセイ結果は、上の表５で見つけられる。１つの試料、１５８３８０５０６７、の２回の反復実験のみは、９０％再現性のための９０％カバー率および１０ＣＣＳリードを生じさせることができなかった。さらに、３回の別々のシークエンシング実行（ＰＢＴ５０７３、ＰＢＴ５０７５およびＰＢＴ５０８０）については最後の安定性時点（ＰＢＴ５０８０）で試料特異的リードカウントの低下が観察されなかった（図１５）。
【0146】
ＶＯＣを再処理すると、９／１２試料に、同一の株の結果を生じさせた。１つの試料は、元の結果は１．６１７．２であったが、ＡＹ．３を生じさせた。ＡＹ．３と１．６１７．２の両方がデルタＶＯＣを含み、元の第２４週以降の結果は、今はデルタＶＯＣの別個の亜株として分類されている。さらなる調査によって２つの結果間で３８のＣＬＣバリアントは同一であることが判明し、株タイピングは、Ｐａｎｇｏｌｉｎ株コーラーバージョンの違いに起因した。１つの試料は、一致したが、結果を報告するのに十分なリード深度がなかった。真の不一致のものは、当初報告されたＢ．１．１．７および反復時のＢ．１．６２１．１のみであった。当初のシークエンシングと安定性シークエンシングの両方が、実行間のコールされるバリアントの最小限の共有で十分なリードカバー率を生じさせる結果となったので、食い違いは、試料交換によって生じた可能性があると考えられる。全体的な精度は、９１．６％であり、食い違った結果は、安定性の問題によるものとは考えられなかった。
【0147】
（実施例３）
チェリーピッキング
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ液体ハンドラーを使用して、陽性患者試料と陰性患者試料の両方を含有するソースプレートから、シークエンシング用の陽性試料のみを含有する凝縮ＰＣＲプレートに検体を移した。非公式に、このプロセスを「チェリーピッキング」と呼ぶ。検体は、ＣＴ＜３１で陽性検体から抽出された全核酸であった。
チェリーピッキング
Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ液体ハンドラーを使用して、陽性患者試料と陰性患者試料の両方を含有するソースプレートから、シークエンシング用の陽性試料のみを含有する凝縮ＰＣＲプレートに検体を移した。非公式に、このプロセスを「チェリーピッキング」と呼ぶ。検体は、ＣＴ＜３１で陽性検体から抽出された全核酸であった。
【0148】
（実施例４）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株決定のためのシークエンシングデータの解析
上流解析は、完了についてシーケンサー実行をモニターすることと、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するために逆多重化することと、アラインメントおよびバリアントコールを生成するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとの各々のアラインメントを始動させることとを含んだ。各ＳＭＲＴＣｅｌｌにおける試料についての下流解析は、各試料についての系統分類を含む結果全てを生成することを含んだ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株決定のためのシークエンシングデータの解析
上流解析は、完了についてシーケンサー実行をモニターすることと、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するために逆多重化することと、アラインメントおよびバリアントコールを生成するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとの各々のアラインメントを始動させることとを含んだ。各ＳＭＲＴＣｅｌｌにおける試料についての下流解析は、各試料についての系統分類を含む結果全てを生成することを含んだ。
【0149】
上流解析
上流解析についてのフローチャートの例を図４に示す。解析起動のために、ＰａｃＢｉｏ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ生データをシーケンサーからＡＷＳ ｄｒｏｐ ｄｉｒｅｃｔｏｒｙに寄託した。実行完了ファイルが作成されるとスクリプトが検出し、逆多重化の準備が整ったフォルダーにデータをコピーした。シーケンサーで不首尾に終わった試料は、データファイルを生成しなかった。これらの試料を反復するように指定し、配列解析に使用しなかった。
上流解析についてのフローチャートの例を図４に示す。解析起動のために、ＰａｃＢｉｏ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｏｏｐ生データをシーケンサーからＡＷＳ ｄｒｏｐ ｄｉｒｅｃｔｏｒｙに寄託した。実行完了ファイルが作成されるとスクリプトが検出し、逆多重化の準備が整ったフォルダーにデータをコピーした。シーケンサーで不首尾に終わった試料は、データファイルを生成しなかった。これらの試料を反復するように指定し、配列解析に使用しなかった。
【0150】
この時点で、逆多重化および個々の試料ＦＡＳＴＱファイルの生成を、以下のステップを使用して遂行した：（１）ＰａｃＢｉｏのＳＭＲＴＬＩＮＫ ＣＣＳプログラムを使用する環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）ＢＡＭファイルの生成ステップ；（２）ｓａｍｔｏｏｌを使用して中間ＢＡＭファイルをマージするステップ；（３）ＰａｃＢｉｏ ｌｉｍａプログラムを使用して逆多重化して、実行マニフェストにおける異なるバーコードの組合せに対応する個々のＢＡＭファイルを生成するステップ；（４）逆多重化された出力データを試料名および／または患者識別子ごとに組み合わせるステップ；（５）配列からバーコードを除去し、個々の試料ＦＡＳＴＱファイルを生成するステップ；（６）配列をバーコードとアラインし、バーコードを（例えば、ＰａｃＢｉｏトリムスクリプトを使用して）トリミングするステップ；（７）ＢＡＭファイルをＦＡＳＴＱファイルに（例えば、ｂａｍｔｏｏｌを使用して）変換するステップ；（８）ＦＡＳＴＱおよびＣＣＳ ＢＡＭファイルを最終位置にコピーするステップ；（９）ならびにＦＡＳＴＱファイルおよび対応する実行マニフェストをドロップ位置にコピーして、ＣＬＣワークフローを始動させるステップ。
【0151】
ＣＬＣ解析ワークフローは、以下のステップを使用して遂行した：（１）ＮＧＳデータ解析ワークフローを、現行の有効性が認められているＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒバージョンを使用して、各試料に対して実行する；（２）各試料のＦＡＳＴＱファイルについて、（ａ）２５０～５０００ｂｐ長のリードを保持するようにリードをフィルタリングした；（ｂ）ｍｉｎｉｍａｐ２を使用してリードをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（「ＮＣ＿０４５５１２ｖ２」）とアラインしてＢＡＭファイルを生成した；（ｃ）ローカルリアラインメントを遂行し、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＳｅｒｖｅｒにおけるＬｏｗ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｖａｒｉａｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎツールを使用してバリアントコールを行った；および（ｄ）アセンブリ（ＢＡＭファイル）と検出されたバリアント（ｃｆ）の両方を下流の後処理解析に入力した。スクリプトがＣＬＣプロセス完了を検出し、それによって、各ＳＭＲＴｃｅｌｌにおける試料の下流解析の開始が生じた。
【0152】
下流解析
下流（後処理）解析のフローチャートの例を図５に示す。後処理第１部は、図５の第１のブロックで表される。後処理第１部のステップは、次の通りであった。（１）適切な参照ファイルを使用することにより、ＶＣＦＣｏｎｓを使用して、各試料についての配列アラインメントおよびバリアントコールに基づいてコンセンサス配列を生成した。この解析には、塩基を各ゲノム位置に割り当てるために４ＣＣＳリードの最小カバー率、および０．５の最小代替頻度が必要であり、この基準を満たさない位置を曖昧塩基「Ｎ」に割り当てた。（２）Ｓｅｑｔｋを使用して配列塩基組成を生成し、それを後に非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために使用した。（３）Ｎｅｘｔｃｌａｄｅを使用して、コンセンサス配列を入力データとして使用して（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異コーリング、および（ｃ）試料配列品質チェックを生じさせた。次いで、（４）Ｐａｎｇｏｌｉｎを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること（Ｐａｎｇｏ命名法として公知）、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統（Ｐａｎｇｏ系統）を割り当てることにより、コンセンサス配列に系統を割り当てた。Ｐａｎｇｏｌｉｎは、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮する。（５）ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔを使用して、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ、ＰａｎｇｏｌｉｎおよびＳｅｑｔｋからの結果をコンパイルし、アンプリコンカバー率中央値の平均値およびゲノムカバー率パーセントをはじめとする、後のＱＣに必要なカバー率統計データを生成した。この解析のために、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値を試料の各々について計算した。これらのカバー率値（最小値、第１四分位値、平均値、中央値、第３四分位値、および最大値）の分布の統計データを各試料について計算した。また、ゲノムカバー率パーセントを、総配列長で割った非曖昧塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の数として計算し、系統分類を集約し、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コールを生じさせた試料のみを、さらなる処理のために保持した。
下流（後処理）解析のフローチャートの例を図５に示す。後処理第１部は、図５の第１のブロックで表される。後処理第１部のステップは、次の通りであった。（１）適切な参照ファイルを使用することにより、ＶＣＦＣｏｎｓを使用して、各試料についての配列アラインメントおよびバリアントコールに基づいてコンセンサス配列を生成した。この解析には、塩基を各ゲノム位置に割り当てるために４ＣＣＳリードの最小カバー率、および０．５の最小代替頻度が必要であり、この基準を満たさない位置を曖昧塩基「Ｎ」に割り当てた。（２）Ｓｅｑｔｋを使用して配列塩基組成を生成し、それを後に非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために使用した。（３）Ｎｅｘｔｃｌａｄｅを使用して、コンセンサス配列を入力データとして使用して（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異コーリング、および（ｃ）試料配列品質チェックを生じさせた。次いで、（４）Ｐａｎｇｏｌｉｎを使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること（Ｐａｎｇｏ命名法として公知）、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統（Ｐａｎｇｏ系統）を割り当てることにより、コンセンサス配列に系統を割り当てた。Ｐａｎｇｏｌｉｎは、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮する。（５）ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔを使用して、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ、ＰａｎｇｏｌｉｎおよびＳｅｑｔｋからの結果をコンパイルし、アンプリコンカバー率中央値の平均値およびゲノムカバー率パーセントをはじめとする、後のＱＣに必要なカバー率統計データを生成した。この解析のために、全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値を試料の各々について計算した。これらのカバー率値（最小値、第１四分位値、平均値、中央値、第３四分位値、および最大値）の分布の統計データを各試料について計算した。また、ゲノムカバー率パーセントを、総配列長で割った非曖昧塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の数として計算し、系統分類を集約し、Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コールを生じさせた試料のみを、さらなる処理のために保持した。
【0153】
この時点で、後処理第２部を、図５において「患者メタデータを組み合わせる」ブロック、「品質チェック」ブロック、および「最終レポートを生成する」ブロックに示されているように開始した。したがって、適切な参照ファイル、株サーベイランス特異的メタデータ（人口統計データ、ゲノムカバー率パーセント、およびＲＴ－ＰＣＲアッセイからのＣｔ値）を再び使用してＱＣを遂行し、データを結果に加えた。メタデータを欠いている試料を結果セットから除外した。また、無鋳型ＱＣを、無鋳型対照に基づいて遂行した。２９のゲノム領域のカバー率中央値の平均値が、＞１０ＣＣＳリードであった場合には、同じプレート上のシークエンシングされた全ての試料を除去した。最後に、カバー率ＱＣを遂行した。ゲノムカバー率＞＝９０％を有する試料を結果に保持し、カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリードを有する試料を結果に保持した。次いで、結果を、対応するＰａｎｇｏｌｉｎ系統を伴う患者レポートを生成するためにＲｅｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍの場所に転送した。結果を生じさせることができなかった試料は、系統を決定することができなかったと報告した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが検出されても、系統情報が報告されないことがある。
【0154】
系統コーリング基準は、次の通りであった。組み入れ基準：（１）ＣＴ＜３１；（２）対応するメタデータ（株サーベイランス）；（３）＞９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード；（４）合格ＮＴＣ対照；ならびに（５）Ｎｅｘｔｃｌａｄｅ結果およびＰａｎｇｏｌｉｎ系統コール。除外基準：（１）ＣＴ＞３１；（２）欠測メタデータ（株サーベイランス）；（３）＜９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＜１０ＣＣＳリード；および（４）不合格ＮＴＣ対照。
【0155】
（実施例５）
可能性のある新たなバリアントおよび分類のアセスメント
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新たなバリアント（すなわち、系統）の出現およびｐａｎｇｏｌｉｎ分類ソフトウェアの付随する変更に応じてＶｉｒｓｅｑアッセイの分類精度の再検証を、図６で概説されるように遂行した。ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェアは、Ｄｏｃｋｅｒｈｕｂによって（hub.docker.com/r/staphb/pangolinで）配給されている。Ｐａｎｇｏｌｉｎサイトをモニターし、アップデートされたｄｏｃｋｅｒコンテナを一定間隔で（例えば、週１回）ダウンロードし、インストールすることによってアップデートについてチェックした。アップデートがなかった場合、何もする必要がないと判断した。ドキュメントｄｏｃｋｅｒコンテナは、リリースノートとともに変更ログがアップデートされた。アップデートされたｄｏｃｋｅｒファイルは、変更記録ならびにｐａｎｇｏｌｉｎの最新バージョン、ｐａｎｇｏＬＥＡＲＮ、ｐａｎｇｏ－ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ、ｓｃｏｒｐｉｏ、およびｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎを含有した（github.com/cov-lineagesを参照されたい）。
可能性のある新たなバリアントおよび分類のアセスメント
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの新たなバリアント（すなわち、系統）の出現およびｐａｎｇｏｌｉｎ分類ソフトウェアの付随する変更に応じてＶｉｒｓｅｑアッセイの分類精度の再検証を、図６で概説されるように遂行した。ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェアは、Ｄｏｃｋｅｒｈｕｂによって（hub.docker.com/r/staphb/pangolinで）配給されている。Ｐａｎｇｏｌｉｎサイトをモニターし、アップデートされたｄｏｃｋｅｒコンテナを一定間隔で（例えば、週１回）ダウンロードし、インストールすることによってアップデートについてチェックした。アップデートがなかった場合、何もする必要がないと判断した。ドキュメントｄｏｃｋｅｒコンテナは、リリースノートとともに変更ログがアップデートされた。アップデートされたｄｏｃｋｅｒファイルは、変更記録ならびにｐａｎｇｏｌｉｎの最新バージョン、ｐａｎｇｏＬＥＡＲＮ、ｐａｎｇｏ－ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ、ｓｃｏｒｐｉｏ、およびｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎを含有した（github.com/cov-lineagesを参照されたい）。
【0156】
アップデートがあった場合、社内実験室データを使用して回帰解析を遂行した。本質的に、ステップを以下のように遂行した。新しいｐａｎｇｏｌｉｎバージョンを使用して、過去のＶｉｒｓｅｑ配列の参照セット内に含有されていた試料の系統を決定した。参照セットは、主としてデルタ系統で構成されている、２０２１年１０月からの初期ＳＭＲＴ ｃｅｌｌを含んだ。それは、２０２１年１２月および２０２２年３月に行われたオミクロン系統の２つのアップデートも含有した。参照セットの中の各試料は、そのコンセンサス配列、ならびに以前のｐａｎｇｏｌｉｎバージョンにより行われたその系統分類の履歴を含んだ。参照セットを、ｐａｎｇｏｌｉｎバージョンがアップデートされるにつれてより新しい、より保有率が高い系統を代表する試料を含むように、定期的にアップデートした。
【0157】
次に、ｐａｎｇｏｌｉｎソフトウェア出力の形式を以前のバージョンのものと比較して、ｐａｎｇｏｌｉｎ出力形式の変更があったかどうかを決定した。ＣＳＶ出力データに何らかの変更（すなわち、追加のカラム、カラム名の変更）があった場合、これらを記録し、実験室Ｖｉｒｓｅｑパイプラインを変更に対応するように必要に応じて修正した。次いで、修正バージョンを検査のためのＱＡ環境に配備した。
【0158】
次に、系統コールのあらゆる変更をアセスメントし、ソフトウェアアップデート変更記録から予想されるものと比較した。予想される変更は、概して、亜系統間の再割り当てを含む。系統の何らかの予想外の変更（例えば、デルタ亜系統からアルファへ）があった場合、これらを詳細に調査し、記録した。
【0159】
判定基準および行った動作は、次の通りであった。系統分類の相違は、主として、より新しいバージョンでのバリアントのｐａｎｇｏＬＥＡＲＮ／ｐａｎｇｏ－ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ定義の改善に起因する。これらの大部分は、亜系統の再割り当てであるが、モデルによるバリアント定義の変更に起因することもあり得る。亜系統の再割り当てを再考して、それらが、親デルタ系統におけるＡＹ間の再割り当てなどの親系統の下で予想された変更であることを確実にした。＜９０％ゲノムカバー率を有する試料には別の不一致源が存在することがあり得る。上記の亜系統再割り当てまたはゲノムカバー率の問題により説明され得るいずれの不一致も記録し、承認のためにさらに再考した。次に、ＧＩＳＡＩＤ回帰検定を遂行した。不一致を上記のように説明できず、アップグレードで新しいｐａｎｇｏｌｉｎ系統が追加されなかった場合、アップグレードを中止し、ｐａｎｇｏｌｉｎの現行バージョンで生産を継続した。上記のようなアップデートに伴う不一致を記録し、記憶させた。新たな情報が入手可能になり、記録されるように、またはｐａｎｇｏｌｉｎの次のリリースについてのこのプロトコルの開始が不一致を解決できるように、不一致をさらに調査した。
【0160】
この時点で、第２の回帰検定を、公表されている（ＧＩＳＡＩＤ）配列およびそれらのメタデータを使用して遂行した。最新のＧＩＳＡＩＤ配列をダウンロードし、全てのＧＩＳＡＩＤ配列についてのメタデータおよびｐａｎｇｏｌｉｎ系統を得、ＶＯＣおよびＶＯＩのリストを、系統についてのＷＨＯアップデートおよび最新の完全リストに基づいてアップデートした。次に、データシミュレーターを使用して、Ｖｉｒｓｅｑアッセイのカバー率およびエラー特性をモデル化した。シミュレーターは、ＧＩＳＡＩＤ配列を出発点として使用し、シミュレーションしたカバー率およびエラーを、Ｖｉｒｓｅｑ試料の収集物からの経験的カバー率プロファイルおよび最大－マイナー対立遺伝子頻度に基づいてインポーズした。得られたシミュレーション試料をｐａｎｇｏｌｉｎに通し、系統分類を元のＧＩＳＡＩＤ配列のものと比較した。分類安定性を、変異配列がそれらの予想系統分類を維持する率として定義した。この回帰検定では、２つの実験を実行して、シミュレーションによる分類安定性をアセスメントした。第１に、最大１００のＧＩＳＡＩＤ配列を各ＶＯＣ／ＶＯＩについてランダムにサンプリングして、これらの重要な系統の分類安定性を、入手可能なシークエンシングデータ中のそれらの頻度に関係なく、アセスメントした。これによって、新興バリアントおよび既存のものの、新たな亜系統の分類安定性のアセスメントが可能になった。第２に、系統分類安定性の頻度に基づくレトロスペクティブ解析のためにデータベースから１０，０００のＧＩＳＡＩＤ配列をランダムにサンプリングした。これによって、安定性を過去の保有率と比較して定量化することが可能になった。
【0161】
この時点で、データシミュレーター実験の出力データを再考し、全ての既知のＶＯＣ／ＶＯＩについてのＧＩＳＡＩＤデータ、およびレトロスペクティブＧＩＳＡＩＤデータを使用して、以前の回帰検定に関する分類安定性の予想外の変更をチェックした。あらゆる予想外の不安定性を調査し、記録した。その結果、ある特定のパラメーターを満たすとアップグレードが受け入れられた。一部の場合には、シミュレーションデータと参照配列との間のＶＯＣ／ＶＯＩ一致度中央値が少なくとも９０％であった場合、アップグレードがリクエストされた。これらの基準を満たされなかった場合、追加の調査が指示された。
【0162】
新たな不一致系統が新規のものであった場合、新規系統を検査して、それらが、本明細書で開示される方法を使用して検出されるかどうかを決定した。不一致バリアントが、新規バリアントでなかった場合、それらを調査して不一致の根本原因を見つけた。これは、参照配列のカバー率はもちろん、特定の領域における塩基カバー率の望ましくない降下がないことを保証するためにシミュレーションした配列も、調べることを含んだ。また、別のシードでシミュレーションを再実行して、不一致が再現されるかどうかを決定した。再現された場合、アップグレードを中止した。
【0163】
この時点で、新規バリアントを、本明細書で開示される方法を使用してアセスメントした。新興バリアント（系統）のサーベイランス成功のために、例えば、新興系統における個々の配列バリアントおよび関連ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐプローブの位置を同定することによるような、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ解析を行うことにより、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｏｏｐ反転プローブ増幅に対する潜在的影響を再考して、プローブ結合への干渉の可能性をアセスメントした。例えば、任意のプローブとオーバーラップする新規配列バリアントがハイブリダイゼーションに影響を及ぼすことになるという非常に控えめな推定をその際に使用することになる。また、新規配列バリアントのカバー率を確保するために領域内の隣接するプローブ全てを再考した。特定の領域内のカバー率の低下をもたらし得る任意の配列バリアントについて、ｐａｎｇｏｌｉｎ系統アップデート検証サマリー内の影響を受けるプローブを記録した。
【0164】
（実施例６）
実施形態
以下の非限定的な実施形態を参照することにより、本開示をよりよく理解することができる。
Ａ１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
Ａ２．試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを生成することを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ３．次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡが、ウイルスゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プライマーを使用してさらに増幅される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．タイル型プライマーが、隣接するプライマーが互いにおおよそ６００ｂｐ離れているような間隔で配置される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．１ 試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの１本の鎖を、ペアのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを含む一本鎖プローブＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることをさらに含み、第１のプローブが、フォワードプライマーとして機能するようにプローブＤＮＡ鋳型の３’末端に位置し、第２のプローブが、リバースプライマーとして機能するようにプローブＤＮＡ鋳型の５’末端に位置する、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムが、新たなバリアントの存在または非存在にかかわらず非常に効率的に増幅される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．３ タイル型プライマーが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号におよび／または核酸シークエンシングのためのユニバーサルプライマー部位と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプターをさらに含むプライマーである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ５．一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、プローブ配列の内部に位置するユニバーサルシークエンシングプライマーをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ６．一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプター配列をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ７．２つのプローブ間の配列を埋めて、２つのプローブ配列間に試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を生成するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ８．試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから遊離させるステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ９．試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップのための鋳型として使用される直鎖状ＤＮＡを生成するための試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型の消化をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１０．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの結果を、バリアントが検出された場合にさらなる分類のためにデポジトリーにアップロードするステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１１．デポジトリーが、ＣＤＣデータベースである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１２．核酸シークエンシングが、全ウイルスゲノムの少なくとも８０％、または必要に応じて８５％、または必要に応じて９０％をシークエンシングすることを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１３．対象の地理的位置を同定するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１４．核酸シークエンシングが、全ゲノムシークエンシングを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップが、試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインして、試料特異的アセンブリおよびコンセンサス配列を生成することを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．１ 少なくとも５０％の最小カバー率を有する試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸配列が、各試料についてのコンセンサス配列を生成するために、バリアントをコールするためのおよび／または試料特異的ゲノムアセンブリを生成するための入力データとして使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．２ コンセンサス配列を生成するための定義された閾値がある、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．３ 定義された閾値が、個々の塩基対をカバーする少なくとも４の環状コンセンサスシークエンシング（ＣＣＳ）リード、および／または＞５０％の参照と比較した代替対立遺伝子頻度を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．４ 結果の妥当性をアセスメントするための外部鋳型なし対照（ＮＴＣ）および／または外部陽性鋳型対照（ＰＴＣ）の評価をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．５ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、２５０～５０００ｂｐ長のリードを保持するようにフィルタリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．６ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（ＮＣ＿０４５５１２ｖ２）とアラインされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．７ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインされた後、ローカルリアラインメントが遂行され、バリアントコールが行われる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．８ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸配列塩基組成の決定が、非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために生み出される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．９ コンセンサス配列を入力データとして使用して（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異の決定および（ｃ）試料配列品質チェックのいずれか１つまたは全てを、必要に応じて生じさせることができる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ（ｄ）が、試料についての系統をアセスメントすることをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１ 系統が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統を割り当てることにより、コンセンサス配列に割り当てられる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．２ 系統割り当てが、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮するように設定される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．３ 株系統結果が、９０％ゲノムカバー率を有する試料についてリリースされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．４ 株系統結果が、＞１０環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードである全ゲノムにわたってのリードカバー率中央値の平均値を有する試料についてリリースされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．５ 異なるＣＣＳリード測定基準が、ヌクレオチドレベル（４ＣＣＳリード）におよびゲノムレベル（１０ＣＣＳリード）に基づく、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．６ Ｐａｎｇｏｌｉｎが、系統を割り当てるために使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．７ カバー率統計データを生成するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．８ カバー率統計データが、ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔを使用して生成される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．９ 全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値が、試料の各々について計算される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１０ ２９のゲノム領域のカバー率中央値の平均値が、＞１０ＣＣＳリードである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１１ ゲノムカバー率＞＝９０％を有する試料が、結果に保持される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１２ カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリードを有する試料が、結果に保持される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１３ 人口統計データ、ゲノムカバー率パーセント、およびＲＴ－ＰＣＲアッセイからのＣｔ値を使用して、ＱＣが遂行され、データが結果に加えられる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１４ 結果が、対応する系統および／または地理的割り当てを伴う患者レポートを生成するために使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１５ 組み入れ基準が、（１）ＣＴ＜３１；（２）対応するメタデータ（株サーベイランス）；（３）＞９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード；（４）合格ＮＴＣ対照；および（５）系統コールを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１６ 除外基準が、（１）ＣＴ＞３１；（２）欠測メタデータ（株サーベイランス）；（３）＜９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＜１０ＣＣＳリード；および（４）不合格ＮＴＣ対照を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．デポジトリーのアップデートが行われたかどうかを決定することにより系統割り当てを再検証するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１ 再検証するステップが、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの前に遂行される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．２ 再検証が、以前に割り当てられた系統を変更するべきかどうかを決定するために社内データを使用する回帰解析を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．３ 社内データが、発生日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統、試料の地理的起源、系統分類の履歴、または系統分類に使用されるアルゴリズムのアップデートのうちの少なくとも１つにより定義されるデータセットを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．４ アップデートが、社内データについての系統または亜系統の変更を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．５ 再検証が、デポジトリーからのデータを使用する回帰解析を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．６ デポジトリーが、ＧＩＳＡＩＤである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．７ ＧＩＳＡＩＤ配列がダウンロードされ、全てのＧＩＳＡＩＤ配列についてのメタデータおよび系統が得られ、ＶＯＣおよびＶＯＩのリストが、系統についてのＷＨＯアップデートおよび最新の完全リストに基づいてアップデートされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．８ データシミュレーターを使用して、社内アッセイのカバー率およびエラー特性をモデル化するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．９ シミュレーターが、ＧＩＳＡＩＤ配列を出発点として使用し、シミュレーションしたカバー率およびエラーを試料の収集物からの経験的カバー率プロファイルおよび最大－マイナー対立遺伝子頻度に基づいてインポーズし、得られたシミュレーション試料が系統アルゴリズムに通され、系統分類が、元のＧＩＳＡＩＤ配列のものと比較される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１０ 分類安定性が、変異配列がそれらの予想系統分類を維持する率として定義される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１１ シミュレーションのために、１００のＧＩＳＡＩＤ配列が、各ＶＯＣおよび／またはＶＯＩについてランダムにサンプリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１２ シミュレーションのために、データベースから１０，０００のＧＩＳＡＩＤ配列が、系統分類安定性の頻度に基づくレトロスペクティブ解析のためにランダムにサンプリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１３ シミュレーションデータと参照配列間のＶＯＣ／ＶＯＩ一致度中央値が少なくとも９０％であった場合、アップグレードがリクエストされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１８．ステップの少なくとも一部が、コンピュータおよび／または非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品により制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１８．１ ステップの少なくとも一部が、
１つまたは複数のデータプロセッサーと、
１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに方法ステップのいずれかを含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
によって制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ｂ１．前記または後記の方法実施形態のいずれかを遂行するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含むシステム。
Ｂ２．（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれかを遂行するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含むシステム。
Ｂ３．ステップの少なくとも一部が、コンピュータおよび／または非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品により制御される、前記または後記の実施形態のいずれか１つのシステム。
Ｂ．４ ステップの少なくとも一部が、
１つまたは複数のデータプロセッサーと、
１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに方法ステップのいずれかを含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
によって制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つのシステム。
Ｃ１．非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品であって、１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定すること；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成すること；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行すること；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定すること
を含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる、コンピュータ－プログラム製品。
Ｄ１．非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品であって、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
のいずれかを遂行するためにシステムの少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを実行するように構成された命令を含む、コンピュータ－プログラム製品。
実施形態
以下の非限定的な実施形態を参照することにより、本開示をよりよく理解することができる。
Ａ１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントを同定および／または追跡するための方法であって、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
を含む方法。
Ａ２．試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡを生成することを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ３．次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡが、ウイルスゲノムに沿って間隔を空けて結合するタイル型プライマーを使用してさらに増幅される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．タイル型プライマーが、隣接するプライマーが互いにおおよそ６００ｂｐ離れているような間隔で配置される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．１ 試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡの１本の鎖を、ペアのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを含む一本鎖プローブＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることをさらに含み、第１のプローブが、フォワードプライマーとして機能するようにプローブＤＮＡ鋳型の３’末端に位置し、第２のプローブが、リバースプライマーとして機能するようにプローブＤＮＡ鋳型の５’末端に位置する、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムが、新たなバリアントの存在または非存在にかかわらず非常に効率的に増幅される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ４．３ タイル型プライマーが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号におよび／または核酸シークエンシングのためのユニバーサルプライマー部位と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプターをさらに含むプライマーである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ５．一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、プローブ配列の内部に位置するユニバーサルシークエンシングプライマーをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ６．一本鎖プローブＤＮＡ鋳型が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試料特異的核酸を試料番号と相関させるために使用されるバーコード配列の付加のためのアダプター配列をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ７．２つのプローブ間の配列を埋めて、２つのプローブ配列間に試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を生成するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ８．試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型を試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから遊離させるステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ９．試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップのための鋳型として使用される直鎖状ＤＮＡを生成するための試料ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃＤＮＡに特異的な配列を含む環状一本鎖プローブＤＮＡ鋳型の消化をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１０．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの結果を、バリアントが検出された場合にさらなる分類のためにデポジトリーにアップロードするステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１１．デポジトリーが、ＣＤＣデータベースである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１２．核酸シークエンシングが、全ウイルスゲノムの少なくとも８０％、または必要に応じて８５％、または必要に応じて９０％をシークエンシングすることを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１３．対象の地理的位置を同定するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１４．核酸シークエンシングが、全ゲノムシークエンシングを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップが、試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインして、試料特異的アセンブリおよびコンセンサス配列を生成することを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．１ 少なくとも５０％の最小カバー率を有する試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸配列が、各試料についてのコンセンサス配列を生成するために、バリアントをコールするためのおよび／または試料特異的ゲノムアセンブリを生成するための入力データとして使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．２ コンセンサス配列を生成するための定義された閾値がある、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．３ 定義された閾値が、個々の塩基対をカバーする少なくとも４の環状コンセンサスシークエンシング（ＣＣＳ）リード、および／または＞５０％の参照と比較した代替対立遺伝子頻度を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．４ 結果の妥当性をアセスメントするための外部鋳型なし対照（ＮＴＣ）および／または外部陽性鋳型対照（ＰＴＣ）の評価をさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．５ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、２５０～５０００ｂｐ長のリードを保持するようにフィルタリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．６ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノム（ＮＣ＿０４５５１２ｖ２）とアラインされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．７ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸シークエンシングリードが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照ゲノムとアラインされた後、ローカルリアラインメントが遂行され、バリアントコールが行われる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．８ 試料ＳＡＲ－ＣｏＶ－２核酸配列塩基組成の決定が、非曖昧塩基のパーセンテージを決定するために生み出される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１５．９ コンセンサス配列を入力データとして使用して（ａ）クレード割り当て、（ｂ）変異の決定および（ｃ）試料配列品質チェックのいずれか１つまたは全てを、必要に応じて生じさせることができる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ（ｄ）が、試料についての系統をアセスメントすることをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１ 系統が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統を生成すること、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列系統を割り当てることにより、コンセンサス配列に割り当てられる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．２ 系統割り当てが、少なくとも５０％非曖昧塩基を有するゲノムのみを考慮するように設定される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．３ 株系統結果が、９０％ゲノムカバー率を有する試料についてリリースされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．４ 株系統結果が、＞１０環状コンセンサス配列（ＣＣＳ）リードである全ゲノムにわたってのリードカバー率中央値の平均値を有する試料についてリリースされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．５ 異なるＣＣＳリード測定基準が、ヌクレオチドレベル（４ＣＣＳリード）におよびゲノムレベル（１０ＣＣＳリード）に基づく、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．６ Ｐａｎｇｏｌｉｎが、系統を割り当てるために使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．７ カバー率統計データを生成するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．８ カバー率統計データが、ＳｕｍｍａｒｙＳｔａｔを使用して生成される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．９ 全ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに及ぶ２９のオーバーラップ１．２ｋｂ領域における塩基のカバー率中央値が、試料の各々について計算される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１０ ２９のゲノム領域のカバー率中央値の平均値が、＞１０ＣＣＳリードである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１１ ゲノムカバー率＞＝９０％を有する試料が、結果に保持される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１２ カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリードを有する試料が、結果に保持される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１３ 人口統計データ、ゲノムカバー率パーセント、およびＲＴ－ＰＣＲアッセイからのＣｔ値を使用して、ＱＣが遂行され、データが結果に加えられる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１４ 結果が、対応する系統および／または地理的割り当てを伴う患者レポートを生成するために使用される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１５ 組み入れ基準が、（１）ＣＴ＜３１；（２）対応するメタデータ（株サーベイランス）；（３）＞９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＞１０ＣＣＳリード；（４）合格ＮＴＣ対照；および（５）系統コールを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１６．１６ 除外基準が、（１）ＣＴ＞３１；（２）欠測メタデータ（株サーベイランス）；（３）＜９０％ゲノムカバー率；（４）カバー率中央値の平均値＜１０ＣＣＳリード；および（４）不合格ＮＴＣ対照を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．デポジトリーのアップデートが行われたかどうかを決定することにより系統割り当てを再検証するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１ 再検証するステップが、核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップの前に遂行される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．２ 再検証が、以前に割り当てられた系統を変更するべきかどうかを決定するために社内データを使用する回帰解析を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．３ 社内データが、発生日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２系統、試料の地理的起源、系統分類の履歴、または系統分類に使用されるアルゴリズムのアップデートのうちの少なくとも１つにより定義されるデータセットを含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．４ アップデートが、社内データについての系統または亜系統の変更を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．５ 再検証が、デポジトリーからのデータを使用する回帰解析を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．６ デポジトリーが、ＧＩＳＡＩＤである、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．７ ＧＩＳＡＩＤ配列がダウンロードされ、全てのＧＩＳＡＩＤ配列についてのメタデータおよび系統が得られ、ＶＯＣおよびＶＯＩのリストが、系統についてのＷＨＯアップデートおよび最新の完全リストに基づいてアップデートされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．８ データシミュレーターを使用して、社内アッセイのカバー率およびエラー特性をモデル化するステップをさらに含む、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．９ シミュレーターが、ＧＩＳＡＩＤ配列を出発点として使用し、シミュレーションしたカバー率およびエラーを試料の収集物からの経験的カバー率プロファイルおよび最大－マイナー対立遺伝子頻度に基づいてインポーズし、得られたシミュレーション試料が系統アルゴリズムに通され、系統分類が、元のＧＩＳＡＩＤ配列のものと比較される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１０ 分類安定性が、変異配列がそれらの予想系統分類を維持する率として定義される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１１ シミュレーションのために、１００のＧＩＳＡＩＤ配列が、各ＶＯＣおよび／またはＶＯＩについてランダムにサンプリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１２ シミュレーションのために、データベースから１０，０００のＧＩＳＡＩＤ配列が、系統分類安定性の頻度に基づくレトロスペクティブ解析のためにランダムにサンプリングされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１７．１３ シミュレーションデータと参照配列間のＶＯＣ／ＶＯＩ一致度中央値が少なくとも９０％であった場合、アップグレードがリクエストされる、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１８．ステップの少なくとも一部が、コンピュータおよび／または非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品により制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ａ１８．１ ステップの少なくとも一部が、
１つまたは複数のデータプロセッサーと、
１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに方法ステップのいずれかを含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
によって制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つの方法。
Ｂ１．前記または後記の方法実施形態のいずれかを遂行するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含むシステム。
Ｂ２．（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
を含む、前記または後記の方法実施形態のいずれかを遂行するための少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを含むシステム。
Ｂ３．ステップの少なくとも一部が、コンピュータおよび／または非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品により制御される、前記または後記の実施形態のいずれか１つのシステム。
Ｂ．４ ステップの少なくとも一部が、
１つまたは複数のデータプロセッサーと、
１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに方法ステップのいずれかを含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる命令を含有する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と
によって制御される、前記または後記の方法実施形態のいずれか１つのシステム。
Ｃ１．非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品であって、１つまたは複数のデータプロセッサーで実行されたときに、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定すること；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成すること；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行すること；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定すること
を含む処理を１つまたは複数のデータプロセッサーに遂行させる、コンピュータ－プログラム製品。
Ｄ１．非一時的な機械可読記憶媒体で有形に具現化されるコンピュータ－プログラム製品であって、
（ａ）対象からの試料をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に対しておよび／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体に対して陽性と同定するステップ；
（ｂ）試料から試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を生成するステップ；
（ｃ）試料特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸に関して核酸シークエンシングを遂行するステップ；ならびに
（ｄ）核酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント配列を含むかどうかを決定するステップ
のいずれかを遂行するためにシステムの少なくとも１つのステーションまたはコンポーネントを実行するように構成された命令を含む、コンピュータ－プログラム製品。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【国際調査報告】