特表 2024-524109 ヒスチジン選択的ポリマー試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ヒスチジン選択的ポリマー試薬

(51)【国際特許分類】

   C08G 65/333 20060101AFI20240628BHJP

   C08G 65/08 20060101ALI20240628BHJP

   C08F 26/10 20060101ALI20240628BHJP

   C08F 16/06 20060101ALI20240628BHJP

   C08G 73/00 20060101ALI20240628BHJP

   C08F 22/04 20060101ALI20240628BHJP

   C08G 79/02 20160101ALI20240628BHJP

   C08F 20/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C08G65/333

C08G65/08

C08F26/10

C08F16/06

C08G73/00

C08F22/04

C08G79/02

C08F20/00

A61K47/60

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023577647

(86)(22)【出願日】2022-06-17

(85)【翻訳文提出日】2023-12-15

(86)【国際出願番号】 US2022034085

(87)【国際公開番号】W WO2022266498

(87)【国際公開日】2022-12-22

(31)【優先権主張番号】63/211,853

(32)【優先日】2021-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597148884

【氏名又は名称】ネクター セラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】コズロウスキ， アントニ

(72)【発明者】

【氏名】アナンド， ニール ケー．

(72)【発明者】

【氏名】シェン， シャオミン

(72)【発明者】

【氏名】ワン， シャオビン

【テーマコード（参考）】

4C076

4J005

4J030

4J043

4J100

【Ｆターム（参考）】

4C076BB11

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF63

4J005AA02

4J005AA04

4J005BC00

4J005BD04

4J005BD05

4J030CB31

4J030CB43

4J043RA02

4J100AJ02P

4J100AM15P

4J100AM21P

4J100BA02P

4J100BA03P

(57)【要約】

本開示は、（とりわけ）、たとえばペプチド又はタンパク質中のヒスチジン残基に対する選択的コンジュゲーションが可能な新規な水溶性ポリマー試薬、並びに得られたコンジュゲート及び関連組成物を提供する。加えて、ポリマー試薬の調製方法、並びにポリマー試薬を活性薬剤及び他の物質にコンジュゲートするための方法、医薬組成物、並びにコンジュゲートを投与するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉのポリマー試薬：

【化83】

（式中：
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；
Ｘは、リンカー部分であり；
Ｒ_１は、有機基であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；
Ｒ_２は、存在する場合、Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し；
Ｙは、Ｏ及びＳから選択され；
Ｚは、脱離基である）。

【請求項2】

Ｒ_１が、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換シクロアルキル、置換及び非置換アルケニル、置換及び非置換シクロアルケニル、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ヘテロアルキル、置換及び非置換シクロヘテロアルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換アラルキル、置換及び非置換ヘテロアリール、並びに置換及び非置換ヘテロアラルキルから選択される有機基である、請求項１に記載のポリマー試薬。

【請求項3】

Ｒ_１が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキル（それぞれ、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から独立して選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている）から選択される有機基である、請求項１に記載のポリマー試薬。

【請求項4】

Ｒ_１が、低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、ベンジル、ハロ置換ベンジル及びニトロ置換ベンジルからなる群から選択され、前記ベンジル環が１～５つのハロ置換基を有する、請求項３に記載のポリマー試薬。

【請求項5】

前記ハロ置換基がフルオロである、請求項３又は４に記載のポリマー試薬。

【請求項6】

Ｒ_２が存在しない、請求項１に記載のポリマー試薬。

【請求項7】

Ｒ_２が存在する、請求項１に記載のポリマー試薬。

【請求項8】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になって４、５、６又は７つの複素環環原子を含む窒素含有複素環を形成する、請求項１又は請求項７に記載のポリマー試薬。

【請求項9】

前記窒素含有複素環が１～３つの窒素原子を含む、請求項８に記載のポリマー試薬。

【請求項10】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になって、アゼチジン、置換アゼチジン、ジアゼチジン、置換ジアゼチジン、ピロリジン、置換ピロリジン、イミダゾリジン、置換イミダゾリジン、ピペリジン、置換ピペリジン、モルホリン、置換モルホリン、ジアジナン、置換ジアジナン、トリアジナン、置換トリアジナン、アゼパン、置換アゼパン、ジアゼパン及び置換ジアゼパンからなる群から選択される窒素含有複素環を形成する、請求項１又は請求項７に記載のポリマー試薬。

【請求項11】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になってピペリジン又は置換ピペリジンを形成する、請求項７、８、９及び１０のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項12】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、ジアジナン又は置換ジアジナンを形成する、請求項７、８、９及び１０のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項13】

前記ジアジナン又は置換ジアジナンが、それぞれピペラジン又は置換ピペラジンである、請求項１２に記載のポリマー試薬。

【請求項14】

前記窒素含有複素環が、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている、請求項７～１３のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項15】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、（ｉ）非置換又は（ｉｉ）１つ若しくはそれ以上の環位置において低級アルキル、置換低級アルキル、アラルキル、若しくは置換アラルキルで置換された窒素含有複素環を形成する、請求項７～１４のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項16】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、１つ又はそれ以上の環位置において低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、アラルキル、又はハロ置換アラルキルで置換された窒素含有複素環を形成する、請求項１５に記載のポリマー試薬。

【請求項17】

前記窒素含有複素環が一又は二置換されている、請求項７～１６のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項18】

Ｘが存在しない、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項19】

Ｘが存在する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項20】

Ｘが、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_０－６－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０－２－，Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、及び前述したものの任意の１つ又はそれ以上の組み合わせから選択される、請求項１９に記載のポリマー試薬。

【請求項21】

Ｘが、～（ＣＨ_２）_ａ（Ｏ）_ｂ［Ｃ（Ｏ）］_ｃ（ＮＨ）_ｄ（ＣＨ_２）_ｅ～であり、式中：ａは０～６であり；ｂは０，１であり；ｃは０，１であり；ｄは０，１であり；ｅは０～６であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの少なくとも１つは正の整数である、請求項１９に記載のポリマー試薬。

【請求項22】

Ｘが、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、及び－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－から選択される、請求項２０に記載のポリマー試薬。

【請求項23】

ＹがＯである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項24】

ＹがＳである、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項25】

ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド、ジビニル（ｄｉｖｙｉｎｙｌ）エーテル－無水マレイン酸、ポリホスフェート、ポリホスファゼン、並びにそれらのコポリマー及びターポリマーからなる群から選択される水溶性ポリマーである、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項26】

ＰＯＬＹがポリ（アルキレンオキシド）である、請求項２５に記載のポリマー試薬。

【請求項27】

ＰＯＬＹがポリ（エチレングリコール）である、請求項２６に記載のポリマー試薬。

【請求項28】

前記ポリ（エチレングリコール）が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャッピング部分で末端がキャップされている、請求項２７に記載のポリマー試薬。

【請求項29】

前記ポリ（エチレングリコール）がメトキシでエンドキャップされている、請求項２８に記載のポリマー試薬。

【請求項30】

ＰＯＬＹが、直鎖、分岐、又は多アーム状の水溶性ポリマーである、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項31】

ＰＯＬＹが、約１００ダルトン～約１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項32】

ＰＯＬＹが、約２００ダルトン～約８０，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約７０，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約８０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項３１に記載のポリマー試薬。

【請求項33】

ＰＯＬＹが、２００ダルトン、３００ダルトン、４００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、２，５００ダルトン、３，０００ダルトン、５，０００ダルトン、７５００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、４０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、５５，０００ダルトン、及び６０，０００ダルトンからなる群から選択される重量平均分子量を有する、請求項３１に記載のポリマー試薬。

【請求項34】

Ｚが、テトラゾール、イソシアネート、イソチオシアネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アシルアジド、フルオロフェノール、ベンゾトリアゾール、ニトロフェノール、及びトリアゾールからなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項35】

Ｚがテトラゾール脱離基である、請求項３４に記載のポリマー試薬。

【請求項36】

Ｚがフェニルテトラゾールである、請求項３５に記載のポリマー試薬。

【請求項37】

Ｚが、構造：

【化84】

（式中、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ及びｋは、それぞれ独立して０又は１であり（ここで０は非存在を示し、１は存在を示す）、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立してアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から選択される）を有するフェニルテトラゾールである、請求項３６に記載のポリマー試薬。

【請求項38】

前記フェニルテトラゾールが、フェニル環上に単一の置換基を有する、請求項３７に記載のポリマー試薬。

【請求項39】

前記単一の置換基が、前記フェニル環の炭素２にある、請求項３８に記載のポリマー試薬。

【請求項40】

前記単一の置換基が、前記フェニル環の炭素３にある、請求項３８に記載のポリマー試薬。

【請求項41】

前記単一の置換基が、前記フェニル環の炭素４にある、請求項３８に記載のポリマー試薬。

【請求項42】

前記フェニルテトラゾールが、前記フェニル環上に２つの置換基を有する、請求項３７に記載のポリマー試薬。

【請求項43】

前記２つのフェニル置換基がＣ２及びＣ３にある、請求項４２に記載のポリマー試薬。

【請求項44】

前記２つのフェニル置換基がＣ２及びＣ４にある、請求項４２に記載のポリマー試薬。

【請求項45】

前記２つのフェニル置換基がＣ３及びＣ５にある、請求項４２に記載のポリマー試薬。

【請求項46】

前記２つのフェニル置換基がＣ３及びＣ４にある、請求項４２に記載のポリマー試薬。

【請求項47】

前記２つのフェニル置換基がＣ２及びＣ６にある、請求項４２に記載のポリマー試薬。

【請求項48】

前記フェニルテトラゾールが、前記フェニル環上に３つの置換基を有する、請求項３７に記載のポリマー試薬。

【請求項49】

前記３つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３及びＣ４にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項50】

前記３つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３、及びＣ５にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項51】

前記３つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３及びＣ６にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項52】

前記３つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ４、及びＣ６にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項53】

前記３つのフェニル置換基がＣ３、Ｃ４、及びＣ５にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項54】

前記３つのフェニル置換基がＣ３、Ｃ４、及びＣ６にある、請求項４８に記載のポリマー試薬。

【請求項55】

前記フェニルテトラゾールが、前記フェニル環上に４つの置換基を有する、請求項３７に記載のポリマー試薬。

【請求項56】

前記４つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３、Ｃ４、及びＣ５にある、請求項５５に記載のポリマー試薬。

【請求項57】

前記４つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３、Ｃ５、及びＣ６にある、請求項５５に記載のポリマー試薬。

【請求項58】

前記４つのフェニル置換基がＣ２、Ｃ３、Ｃ４、及びＣ６にある、請求項５５に記載のポリマー試薬。

【請求項59】

前記フェニルテトラゾールが、前記フェニル環上に５つの置換基を有する、請求項３７に記載のポリマー試薬。

【請求項60】

前記フェニル環上の前記置換基が同じである、請求項４２～５９のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項61】

前記フェニル環上の前記置換基の１つ又はそれ以上が異なる、請求項４３～６０のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項62】

前記１つ又はそれ以上の置換基がトリフルオロメチルである、請求項３６～６１のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項63】

【化85】

【化86】

（式中、各（ｎ）は：約２～約２，２７３；約４～約１８００；約１１－１５９０；約２３～約１３６３；約１１３～約５６８；約１１３～約６８２；約１１３～約１１３６；約２２７～約１３６３；約２２７～約１１３６；約４５４～約１１３６；約４５４～約９０９；及び約４５４～約１８１８からなる群から選択される範囲内であり；ＬＧは脱離基である）からなる群から選択される、請求項１、３２及び３３のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項64】

【化87】

【化88】

【化89】

（式中、各（ｎ）は、独立して：約２～約２，２７３；約４～約１８００；約１１～１５９０；約２３～約１３６３；約１１３～約５６８；約１１３～約６８２；約１１３～約１１３６；約２２７～約１３６３；約２２７～約１１３６；約４５４～約１１３６；約４５４～約９０９；及び約４５４～約１８１８からなる群から選択される範囲内である）からなる群から選択される、請求項１、３２及び３３のいずれか一項に記載のポリマー試薬。

【請求項65】

請求項１～６４のいずれか一項に記載のポリマー試薬を、活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基と前記ポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進する条件下で、前記１つ又はそれ以上のアミノ基を含む前記活性薬剤と反応させることによって調製されるコンジュゲート。

【請求項66】

前記活性薬剤が、タンパク質、ペプチド及び小分子から選択される、請求項６５に記載のコンジュゲート。

【請求項67】

前記活性薬剤が、アミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含み、前記１つ又はそれ以上のヒスチジンアミノ基が、前記ポリマー試薬の～Ｃ（Ｙ）～炭素に共有結合している、請求項６５又は請求項６６に記載のコンジュゲート。

【請求項68】

式：

【化90】

（式中：
ＰＯＬＹは、水溶性ポリマーであり；
Ｘは、リンカー部分であり；
Ｒ_１は、有機基であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；
Ｒ_２は、存在する場合、Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し；
Ｙは、Ｏ及びＳから選択され；
Ｒ’は、Ｈ又は有機基であり；
Ａ－Ｎ－Ｒ’は、アミノ基を含む活性薬剤である）を有するコンジュゲート。

【請求項69】

式：

【化91】

（式中、

【化92】

は、ヒスチジン残基を含む活性薬剤である）を有する、請求項６８に記載のコンジュゲート。

【請求項70】

前記活性薬剤が、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質である、請求項６９に記載のコンジュゲート。

【請求項71】

Ｒ_１が、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換シクロアルキル、置換及び非置換アルケニル、置換及び非置換シクロアルケニル、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ヘテロアルキル、置換及び非置換シクロヘテロアルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換アラルキル、置換及び非置換ヘテロアリール、並びに置換及び非置換ヘテロアラルキルから選択される有機基である、請求項６８～７０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項72】

Ｒ_１が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキル（それぞれ、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからからなる群から独立して選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている）から選択される有機基である、請求項６８～７０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項73】

Ｒ_１が、低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、ベンジル、ハロ置換ベンジル及びニトロ置換ベンジルからなる群から選択され、前記ベンジル環が１～５つのハロ置換基を有する、請求項７２に記載のコンジュゲート。

【請求項74】

前記ハロ置換基がフルオロである、請求項７２又は７３に記載のコンジュゲート。

【請求項75】

Ｒ_２が存在しない、請求項６８に記載のコンジュゲート。

【請求項76】

Ｒ_２が存在する、請求項６８に記載のコンジュゲート。

【請求項77】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になって、４、５、６又は７つの複素環環原子を含む窒素含有複素環を形成する、請求項６８又は７６に記載のコンジュゲート。

【請求項78】

前記窒素含有複素環が１～３つの窒素原子を含む、請求項７７に記載のコンジュゲート。

【請求項79】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になって、アゼチジン、置換アゼチジン、ジアゼチジン、置換ジアゼチジン、ピロリジン、置換ピロリジン、イミダゾリジン、置換イミダゾリジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ジアジナン、置換ジアジナン、トリアジナン、置換トリアジナン、アゼパン、置換アゼパン、ジアゼパン及び置換ジアゼパンからなる群から選択される窒素含有複素環を形成する、請求項６８又は７６に記載のコンジュゲート。

【請求項80】

Ｒ_２が、Ｒ_１と一緒になってピペリジン又は置換ピペリジンを形成する、請求項７６～７９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項81】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、ジアジナン又は置換ジアジナンを形成する、請求項７６～７９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項82】

前記ジアジナン又は置換ジアジナンが、それぞれピペラジン又は置換ピペラジンである、請求項８１に記載のコンジュゲート。

【請求項83】

前記窒素含有複素環が、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている、請求項７６～８２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項84】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、（ｉ）非置換又は（ｉｉ）１つ若しくはそれ以上の環位置において低級アルキル、置換低級アルキル、アラルキル、若しくは置換アラルキルで置換された窒素含有複素環を形成する、請求項７６～８３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項85】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が、１つ又はそれ以上の環位置において低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、アラルキル、又はハロ置換アラルキルで置換された窒素含有複素環を形成する、請求項８４に記載のコンジュゲート。

【請求項86】

前記窒素含有複素環が一又は二置換されている、請求項７６～８５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項87】

Ｘが存在しない、請求項７６～８５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項88】

Ｘが存在する、請求項７６～８３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項89】

Ｘが、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_０－６－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０－２－，Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、及び前述したものの任意の１つ又はそれ以上の組み合わせから選択される、請求項８７に記載のコンジュゲート。

【請求項90】

Ｘが～（ＣＨ_２）_ａ（Ｏ）_ｂ［Ｃ（Ｏ）］_ｃ（ＮＨ）_ｄ（ＣＨ_２）_ｅ～であり、式中：ａは０～６であり；ｂは０，１であり；ｃは０，１であり；ｄは０，１であり；ｅは０～６であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの少なくとも１つは正の整数である、請求項８８に記載のコンジュゲート。

【請求項91】

Ｘが、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、及び－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２から選択される、請求項８９に記載のコンジュゲート。

【請求項92】

ＹがＯである、請求項６８～９１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項93】

ＹがＳである、請求項６８～９１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項94】

ＰＯＬＹが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、並びにそれらのコポリマー及びターポリマーからなる群から選択される水溶性ポリマーである、請求項６８～９３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項95】

ＰＯＬＹがポリ（アルキレンオキシド）である、請求項９４に記載のコンジュゲート。

【請求項96】

ＰＯＬＹがポリ（エチレングリコール）である、請求項９５に記載のコンジュゲート。

【請求項97】

前記ポリ（エチレングリコール）が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャッピング部分で末端がキャップされている、請求項９６に記載のコンジュゲート。

【請求項98】

前記ポリ（エチレングリコール）がメトキシでエンドキャップされている、請求項９６に記載のコンジュゲート。

【請求項99】

ＰＯＬＹが、直鎖、分岐、又は多アーム状の水溶性ポリマーである、請求項６８～９８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項100】

ＰＯＬＹが、約１００ダルトン～約１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項６８～９９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項101】

ＰＯＬＹが、約２００ダルトン～約８０，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約７０，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約２，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約８０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項１００に記載のコンジュゲート。

【請求項102】

ＰＯＬＹが、２００ダルトン、３００ダルトン、４００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、２，５００ダルトン、３，０００ダルトン、５，０００ダルトン、７５００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、４０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、５５，０００ダルトン、及び６０，０００ダルトンからなる群から選択される重量平均分子量を有する、請求項１００に記載のコンジュゲート。

【請求項103】

式：

【化93】

【化94】

（式中、コンジュゲート１１～１８のそれぞれの（ｎ）は、約２～約２，２７３の範囲であり；
Ｈｉｓは、ヒスチジン残基であり；
Ａ－Ｈｉｓは、ヒスチジン残基を含む活性薬剤である）を有する、請求項６９、１０１又は１０２に記載のコンジュゲート。

【請求項104】

Ａ－Ｈｉｓが、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質である、請求項１０３に記載のコンジュゲート。

【請求項105】

請求項６８～１０４のいずれか一項に記載のコンジュゲート及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項106】

請求項６８～１０４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む組成物であって、前記組成物中のコンジュゲートの少なくとも６０％が、ヒスチジン残基のみにおいて前記活性薬剤に共有結合したＰＯＬＹを含む、組成物。

【請求項107】

前記組成物中のコンジュゲートの少なくとも７５％が、前記活性薬剤のヒスチジン残基のみにおいて前記活性薬剤に共有結合したＰＯＬＹを含む、請求項１０６に記載の組成物。

【請求項108】

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１０６又は請求項１０７に記載の組成物。

【請求項109】

請求項６８～１０４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを対象に投与することを含む、投与方法。

【請求項110】

請求項１０５～１０８のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、投与方法。

【請求項111】

活性薬剤のコンジュゲートの調製方法であって、請求項１～６４のいずれか一項に記載のポリマー試薬を、前記活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基と前記ポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進するのに有効な反応条件下で、前記１つ又はそれ以上のアミノ基を含む前記活性薬剤と反応させることを含む、方法。

【請求項112】

前記活性薬剤が、タンパク質、ペプチド及び小分子から選択される、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記活性薬剤が、前記反応条件下で前記ポリマー試薬と反応し、それによりポリマーコンジュゲートを形成するアミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含む、請求項１１１又は請求項１１２に記載の方法。

【請求項114】

前記反応が、約５．５～６．９のｐＨで行われる、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記反応が、約５．５～６．５のｐＨ、又は約６．０～６．５のｐＨで行われる、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記反応が約２５℃で行われる、請求項１１３～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記活性薬剤がタンパク質又はペプチドであり、前記反応が複数のコンジュゲートを形成するのに有効であり、前記複数を含むコンジュゲートの少なくとも７０モルパーセントが、前記活性薬剤のヒスチジンアミノ酸において前記ポリマーに対する共有結合を有する、請求項１１３～１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記複数を含むコンジュゲートの少なくとも７５モルパーセントが、前記活性薬剤のヒスチジンアミノ酸において前記ポリマーに対する共有結合を有する、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記複数を含むコンジュゲートの少なくとも６０モルパーセント、又は少なくとも７０モルパーセント、又は少なくとも７５モルパーセントが、前記活性薬剤のヒスチジンアミノ酸のみにおいて前記ポリマーに対する共有結合を有する、請求項１１７又は請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

形成された前記ポリマーコンジュゲートが、反応混合物中に含まれ、前記方法が、前記反応混合物から前記ポリマーコンジュゲートを回収することをさらに含む、請求項１１３～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記回収されたポリマーコンジュゲートを精製することをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１７日に提出された米国仮特許出願第６３／２１１，８５３号明細書に対して、優先権の利益を主張し、この開示は、その全体が参照によって本明細書に援用される。

【0002】

本出願は、（とりわけ）、たとえば、ペプチド及びタンパク質中のヒスチジン残基に対する選択的コンジュゲーションが可能な新規な水溶性ポリマー試薬、並びにそのような試薬との反応によって形成されるコンジュゲートに関する。加えて、ポリマー試薬の調製方法、並びにポリマー試薬を活性薬剤及び他の物質にコンジュゲートするための方法、医薬組成物、並びにコンジュゲートを投与するための方法が提供される。

【背景技術】

【0003】

度々「ＰＥＧ化」と称されるポリエチレングリコールの共有結合による生理活性分子の修飾は、新たな且つ差別化された治療薬を提供するのに有効であり得る。ＰＥＧ化は、たとえば、生理活性分子の薬理学的及び薬学的特性を向上させることができ、いくつかの市販製剤の開発に首尾よく使用されている。現在、ＦＤＡにより承認された１０種を超える異なるＰＥＧ化タンパク質治療薬が存在する。たとえば、ＰＥＧ化を用いて、生物薬剤が安定な結合によってポリエチレングリコールに共有結合した市販の製品、たとえば、ＣＩＭＺＩＡ（登録商標）（ＰＥＧ化腫瘍壊死因子（ＴＮＦ））、ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）（ＰＥＧ化顆粒球－コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ））、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（ＰＥＧ化インターフェロンα－２ａ）、及びＡＤＹＮＯＶＡＴＥ（登録商標）（ＰＥＧ化第八因子）が作製されている。これらの製品のほとんどは、リシン残基及びＮ－末端のアミン基との反応による、タンパク質の非特異的ＰＥＧ化に依存している。

【0004】

多くの場合、活性薬剤への１つ又はそれ以上のポリエチレングリコール鎖の安定な共有結合は、未修飾分子と比較した場合、低下した機能活性を有するＰＥＧコンジュゲートをもたらす。活性分子が安定な結合を介して１つ又はそれ以上のポリマー部分に共有結合した際、ポリマー結合活性分子は、共有結合したポリマーが、とりわけ、活性分子を取り囲む立体的及び電子的環境を変化させ得るため、非結合活性分子の機能的特性を保持し又はしない場合がある。リシン残基及びＮ－末端のアミノ基との反応による非選択的ＰＥＧ化は、ＰＥＧ化分子の異種混合物をもたらすことが多く、ここで混合物中の各ＰＥＧコンジュゲートは、異なる又は変更された生物学的活性又は他の機能的生物学的特性を有し得る。

【0005】

上記の問題のいくつかを回避するために、部位特異的ＰＥＧ化が探索されているが、タンパク質又はペプチドへのＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを達成するＰＥＧ化戦略はほとんど存在しない。他の利点のなかでも、部位特異的ＰＥＧ化アプローチは、明確に定義され且つ治療的に有用なＰＥＧ化生成物、典型的には精製、特徴付け、及び再現可能な調製がより容易な、一般に、単一の一ＰＥＧ化生成物を提供する高い可能性を有し得る。

【0006】

たとえば、部位特異的ＰＥＧ化は、システインへの共有結合、又はより詳細にはシステインのチオール基への共有結合により提供することができる。システイン残基はタンパク質中のアミノ酸に豊富に存在せず、タンパク質の総アミノ酸含有量の１パーセント未満を占めている。さらに、タンパク質中に存在するシステインは、ジスルフィド結合を形成することが多く、それによって多くのチオール特異的ＰＥＧ化試薬との反応に利用できないようにされている。ＰＥＧ化のためのタンパク質候補中のシステインの欠如又は利用不可能性を回避するために、１つ又はそれ以上のシステイン残基をタンパク質の特定の位置に遺伝的にコードすることによってシステインムテインが調製され得る。次いで、チオール選択的又はチオール特異的ＰＥＧ化試薬とのシステインムテインの反応を行って、特定のシステイン挿入部位に共有結合したＰＥＧ部分を有するタンパク質を調製することができる。システインとの反応に適したＰＥＧ試薬には、チオール、ジスルフィド、マレイミド、ビニルスルホン、オルトピリジルジスルフィド、及びヨードアセトアミドなどの反応性基を有するものが含まれる。システイン指向性部位特異的ＰＥＧ化のための一般に使用されている１つのアプローチは、システイン－ムテイン又はシステイン含有タンパク質とマレイミド官能化ＰＥＧ試薬との反応を含む。

【0007】

部位特異的ＰＥＧ化を達成するための別のアプローチでは、腫瘍壊死因子α及びインターフェロンα－２ａ（ＩＦＮ）に結合するドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むＨｉｓ－タグ特異的ＰＥＧ化タンパク質を形成するために、ポリヒスチジンタグが使用されている（Ｃｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１２，２３－２４８－２６３）。６－ヒスチジンタグをｄＡｂのＣ末端に加えると共に、８－ヒスチジンタグをＩＦＮのＮ－末端に挿入し、次いで、ビス－アルキル化による部位特異的ＰＥＧ化が可能なＰＥＧ－ビス－スルホン試薬と反応させ、次いで１等量のスルフィン酸を排除して対応するＰＥＧ－モノ－スルホンを形成した。

【0008】

上述したアプローチは両方とも、目的のペプチド若しくはタンパク質配列中へのシステイン残基の挿入（未修飾タンパク質中に反応性システインが存在しない限り）又はポリ－ヒスチジン配列の挿入を必要とする。
システインと同様、ヒスチジンは球状タンパク質中の発生頻度が比較的低く（約２％）、ヒスチジンの約半分のみが表面アクセス可能であり、ヒスチジンを部位特異的ＰＥＧ化のための魅力的な標的としている。さらに、システイン残基とは対照的に、ヒスチジンは、リシンと同様、イミダゾール環内にアミン指向性ＰＥＧ化のための反応性アミノ基を提供する。ヒスチジン指向性コンジュゲートは以前に調製されているが、これらのコンジュゲートは不安定であることが見出され、生理学的条件下で水性緩衝液中で加水分解を受けることが報告された。たとえば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．、米国特許出願公開第２００９／０１８５９９８号明細書；Ｌｅｅ，Ｓ．，ＭｃＮｅｍａｒ，Ｃ．、米国特許第５，９８５，２６３号明細書を参照されたい。本出願人らの知る限りでは、これまで、たとえば、タンパク質又はペプチドのヒスチジン残基のアミノ基への共有結合による安定に結合した（たとえば、放出不可能な）コンジュゲートの形成が可能なＰＥＧ試薬、及び得られるコンジュゲートは、当技術分野で知られていない。
本開示は、とりわけ、たとえばペプチド又はタンパク質中のヒスチジンの部位選択的修飾が可能な新規なＰＥＧ試薬を提供する。得られたコンジュゲートは、生理学的ｐＨを含む幅広いｐＨにわたって安定であり、それにより容易なクロマトグラフィー精製が可能であり、またたとえば、一貫し且つ有利な薬物動態及び薬力学特性を有する、理想的には、非選択的／非特異的に共有結合した１つ又はそれ以上のＰＥＧ部分を有する生物薬剤と比較した場合、改善された生物活性を有する、再現可能に調製され、明確に定義された、均質なＰＥＧ化生物薬剤製品の提供が可能である。本出願人らの知る限りでは、本明細書に記載されるポリマー、コンジュゲート、組成物及び方法は、新規であり、当技術分野で全く示唆されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００９／０１８５９９８号明細書

【特許文献2】米国特許第５，９８５，２６３号明細書

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｃｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１２，２３－２４８－２６３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

第１の態様では、式Ｉ：

【化1】

（式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり；Ｘはリンカー部分であり；Ｒ_１は有機基であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；Ｒ_２は、存在する場合、Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し；Ｙは、Ｏ（酸素）又はＳ（硫黄）のいずれかであり；Ｚは脱離基である）のポリマー試薬が提供される。ポリマー試薬は、たとえばペプチド又はタンパク質中のヒスチジンの部位選択的修飾に使用することができる。

【0012】

いくつかの実施形態では、Ｒ_１は、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換シクロアルキル、置換及び非置換アルケニル、置換及び非置換シクロアルケニル、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ヘテロアルキル、置換及び非置換シクロヘテロアルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換アラルキル、置換及び非置換ヘテロアリール、並びに置換及び非置換ヘテロアラルキルから選択される有機基である。

【0013】

いくつかのさらなる実施形態では、Ｒ_１は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキル（それぞれ、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から独立して選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている）から選択される有機基である。

【0014】

さらなる１つ又はそれ以上の特定の実施形態では、Ｒ_１は、低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、ベンジル、ハロ置換ベンジル及びニトロ置換ベンジルからなる群から選択され、ここでベンジル環は、１～５つのハロ置換基を有する。前述したものに関連したいくつかの実施形態では、ハロ置換基はフルオロである。

【0015】

式（Ｉ）の１つ又はそれ以上の実施形態において、Ｒ_２は存在しない。

【0016】

式（Ｉ）のさらなるいくつかの他の実施形態では、Ｒ_２は存在する。Ｒ_２が存在する場合、いくつかの実施形態では、Ｒ_２は、Ｒ_１と一緒になって、４、５、６又は７つの複素環環原子を含む窒素含有複素環、たとえば、非芳香族、飽和、窒素含有複素環を形成する。いくつかの他の実施形態では、Ｒ_２が存在する場合、窒素含有複素環は、１～３つの窒素原子（たとえば、１つ、２つ、又は３つの窒素原子）を含む。例示的な窒素含有複素環としては、たとえば、アゼチジン、置換アゼチジン、ジアゼチジン、置換ジアゼチジン、ピロリジン、置換ピロリジン、イミダゾリジン、置換イミダゾリジン、ピペリジン、置換ピペリジン、モルホリン、置換モルホリン、ジアジナン、置換ジアジナン、トリアジナン、置換トリアジナン、アゼパン、置換アゼパン、ジアゼパン及び置換ジアゼパンが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、Ｒ_２は、Ｒ_１と一緒になってピペリジン又は置換ピペリジンを形成する。いくつかの他の実施形態では、Ｒ_１と一緒になったＲ_２は、ジアジナン又は置換ジアジナンを形成する。さらなるいくつかの追加の特定の実施形態では、ジアジナン又は置換ジアジナンは、それぞれピペラジン又は置換ピペラジンである。

【0017】

Ｒ_１と一緒になったＲ_２が窒素含有複素環を形成する実施形態を参照して、いくつかの実施形態では、窒素含有複素環は、１つ又はそれ以上の置換基、たとえば、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルで場合により置換されている。

【0018】

いくつかのより特定の実施形態では、Ｒ_１と一緒になったＲ_２は、（ｉ）非置換又は（ｉｉ）１つ若しくはそれ以上の環位置において低級アルキル、置換低級アルキル、アラルキル、若しくは置換アラルキルで置換された窒素含有複素環を形成する。またいくつかのさらなる実施形態では、置換低級アルキル又は置換アラルキル置換基は、ハロ置換されている。

【0019】

また１つ又はそれ以上のさらなる実施形態では、Ｒ_１と一緒になったＲ_２は、一又は二置換された窒素含有複素環を形成する。

【0020】

式（Ｉ）のいくつかの実施形態では、Ｘは存在しない（すなわち、（Ｘ）_０である）。さらなるいくつかの他の実施形態では、Ｘは存在する（すなわち、（Ｘ）_１である）。いくつかの実施形態では、Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－ －Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_０－６－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０－２－，Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、及び前述したものの任意の１つ又はそれ以上の組み合わせから選択される。いくつかのさらなる実施形態では、Ｘは～（ＣＨ_２）_ａ（Ｏ）_ｂ［Ｃ（Ｏ）］_ｃ（ＮＨ）_ｄ（ＣＨ_２）_ｅ～であり、式中：ａは０～６であり；ｂは０、１であり；ｃは０、１であり；ｄは０、１であり；ｅは０～６であり、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの少なくとも１つは、正の整数である。いくつかの他の実施形態では、Ｘは、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－又は－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２である。

【0021】

１つ又はそれ以上の実施形態において、ＹはＯ（酸素）である。

【0022】

さらなるいくつかの他の実施形態では、ＹはＳ（硫黄）である。

【0023】

水溶性ポリマー、ＰＯＬＹは、いくつかの実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド、ジビニル（ｄｉｖｙｉｎｙｌ）エーテル－無水マレイン酸、ポリホスフェート、ポリホスファゼン、並びにそれらのコポリマー及びターポリマーから選択される。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＹは、水溶性ポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＯＬＹは、ポリ（エチレングリコール）である。いくつかの他の好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、エンドキャッピング部分、たとえば、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ又は置換アリールオキシで末端がキャップされている。いくつかの好ましい実施形態では、ポリ（エチレングリコール）は、低級アルキル基、たとえば、メトキシでエンドキャップされている。

【0024】

１つ又はそれ以上の実施形態において、ＰＯＬＹは、直鎖、分岐、又は多アーム状の水溶性ポリマーである。たとえば、いくつかの実施形態では、ＰＯＬＹは、直鎖水溶性ポリマーである。他の実施形態では、ＰＯＬＹは、分岐水溶性ポリマーである。またいくつかのさらなる実施形態では、ＰＯＬＹは、多アーム状水溶性ポリマーである。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＰＯＬＹは、約１００ダルトン～約１００，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0026】

１つ又はそれ以上の追加の実施形態において、ＰＯＬＹは、約２００ダルトン～約８０，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約７０，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約８０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する。

【0027】

またいくつかのさらなるより特定の実施形態では、ＰＯＬＹは、約２００ダルトン、又は約３００ダルトン、又は約４００ダルトン、又は約５００ダルトン、又は約７５０ダルトン、又は約１，０００ダルトン、又は約２，５００ダルトン、又は約３，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン、又は約７５００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン、又は約１５，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン、又は約２５，０００ダルトン、又は約３０，０００ダルトン、又は約４０，０００ダルトン、又は約５０，０００ダルトン、又は約５５，０００ダルトン、又は約６０，０００ダルトン、又は約６５，０００ダルトン、又は約７０，０００ダルトン、又は約７５，０００ダルトン、又は７５，０００ダルトンを超える重量平均分子量を有する。

【0028】

１つ又はそれ以上の実施形態において、Ｚは、テトラゾール、イソシアネート、イソチオシアネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アシルアジド、フルオロフェノール、ベンゾトリアゾール、ニトロフェノール、及びトリアゾールからなる群から選択される。

【0029】

１つ又はそれ以上の実施形態において、Ｚは、～Ｎ（Ｒ_１）Ｃ（Ｙ）－と一緒になった場合に尿素結合を形成する脱離基である。

【0030】

いくつかの好ましい実施形態では、Ｚはテトラゾール脱離基である。例示的なテトラゾール脱離基としては、フェニルテトラゾールが挙げられる。たとえば、Ｚは、構造：

【化2】

を有するフェニルテトラゾールであり得る（式中、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ及びｋは、それぞれ独立して０又は１であり（ここで０は非存在を示し、１は存在を示す）、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７のそれぞれは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から独立して選択される）。いくつかの実施形態では、フェニルテトラゾールは、炭素２、炭素３、又は炭素４のいずれか１つにおいて、フェニル環上に単一の置換基を有する。さらなるいくつかの他の実施形態では、フェニルテトラゾールは、フェニル環上に２つの置換基を有する。たとえば、２つのフェニル置換基は、（ｉ）Ｃ２及びＣ３に、又は（ｉｉ）Ｃ２及びＣ４に、又は（ｉｉｉ）Ｃ３及びＣ５に、又は（ｉｖ）Ｃ３及びＣ４に、又はＣ２及びＣ６にあってもよい。またいくつかのさらなる実施形態では、フェニルテトラゾールは、フェニル環上に、たとえば、（ｉ）Ｃ２、Ｃ３及びＣ４に、又は（ｉｉ）Ｃ２、Ｃ３、及びＣ５に、又は（ｉｉｉ）Ｃ２、Ｃ３及びＣ６に、又は（ｉｖ）Ｃ２、Ｃ４、及びＣ６に、又は（ｖ）Ｃ３、Ｃ４、及びＣ５に、又は（ｖｉ）Ｃ３、Ｃ４、及びＣ６に３つの置換基を有する。さらなるいくつかの他の実施形態では、フェニルテトラゾールは、フェニル環上に、たとえば、（ｉ）Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、及びＣ５に、又は（ｉｉ）Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、及びＣ６に、又は（ｉｉｉ）Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、及びＣ６に４つの置換基を有する。さらなるいくつかの他の実施形態では、フェニルテトラゾールは、フェニル環上に５つの置換基を有する。フェニルテトラゾールがフェニル環上に１つを超える置換基を有する前述したものの任意の１つ又はそれ以上に関連したいくつかの実施形態では、フェニル環上の置換基は同じである。さらなるいくつかの代替的な実施形態では、フェニル環上の置換基の１つ又はそれ以上は異なる。いくつかの実施形態では、置換基の１つ又はそれ以上はトリフルオロメチルである。いくつかの他の特定の実施形態では、Ｚはビス（トリフルオロメチル）フェニルテトラゾールである。

【0031】

いくつかのさらなる実施形態では、ポリマー試薬は：

【化3】

【化4】

（式中、各（ｎ）は独立して：約２～約２，２７３；約４～約１８００；約１１－１５９０；約２３～約１３６３；約１１３～約５６８；約１１３～約６８２；約１１３～約１１３６；約２２７～約１３６３；約２２７～約１１３６；約４５４～約１１３６；約４５４～約９０９；及び約４５４～約１８１８からなる群から選択される範囲内にあり；ＬＧは脱離基である）から選択される。試薬１’、２’、３’、４’、５’、６’、７’、８’及び９’に関連する１つ又はそれ以上の実施形態において、ＬＧは、３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾールである。

【0032】

尚さらなる態様では、たとえば、式Ｉのポリマー試薬の調製方法が提供される。

【0033】

さらに別の態様では、活性薬剤の水溶性ポリマーコンジュゲートが提供され、水溶性ポリマーと活性薬剤との間の結合は、尿素－イミダゾリル又はチオ尿素－イミダゾリル部分を含み、イミダゾリル基は、活性薬剤のヒスチジン残基の一部を形成する。

【0034】

さらに別の態様では、上記に提供され且つ本明細書に開示されるあらゆる実施形態を包含する式（Ｉ）のポリマー試薬を、活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基とポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進するのに有効な条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ基を含む活性薬剤と反応させることによって調製されるコンジュゲートが本明細書に提供される。そのようなコンジュゲートに関連する１つ又はそれ以上の実施形態では、活性薬剤は、タンパク質、ペプチド及び小分子から選択される。さらなるいくつかの他の実施形態では、活性薬剤は、アミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含み、１つ又はそれ以上のヒスチジンアミノ基は、ポリマー試薬の～Ｃ（Ｙ）～炭素に共有結合される。

【0035】

さらなるいくつかの他の態様では、コンジュゲートは、式：

【化5】

（式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり；Ｘはリンカー部分であり；Ｒ_１は有機基であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；Ｒ_２は、存在する場合、Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し；Ｙは、Ｏ及びＳから選択され；Ｒ’はＨ又は有機基であり、Ａ－Ｎ－Ｒ’は、アミノ基（～ＮＲ’）を含む活性薬剤（Ａ）であり、ここでＰＯＬＹ、Ｘ、Ｒ_２、Ｒ_１、及びＹは、上述し、さらに本明細書に開示されるあらゆる実施形態を包含する）のものである。いくつかの好ましい実施形態では、～Ｎ－Ｒ’は、Ａと一緒になった場合、活性薬剤に含まれるヒスチジンのイミダゾリル環内に含まれるアミン（窒素原子）である。

【0036】

１つ又はそれ以上の実施形態において、コンジュゲートは、式：

【化6】

（式中、Ａ－ＮＲ’は、ヒスチジン残基を含む活性薬剤であり、ＰＯＬＹ、Ｘ、Ｒ_２、Ｒ_１、及びＹは、前述したとおりである）を有する。上の式において、ヒスチジンは単一のアミノ酸として示されるが、第２の構造では、ヒスチジンは、ポリペプチドの一部としてより詳細に示される。しかしながら、上の構造に示されるヒスチジンは、単一のアミノ酸として描かれているが、ペプチド又はポリペプチド中に含まれるその存在も包含することが意図されることを理解するべきである。コンジュゲーションはヒスチジンイミダゾール環のいずれの窒素でも行われ得、前述した構造は、両方の異性体を包含することが意図されることを理解するべきである。いくつかのさらに好ましい実施形態では、活性薬剤は、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質である。

【0037】

本開示によるコンジュゲートは、たとえば

【化7】

【化8】

（式中、コンジュゲート１１～１８のそれぞれの（ｎ）は、独立して約２～約２，２７３の範囲（上述され及び本明細書の他の箇所に記載されるその様々な実施形態を含む）であり；Ｈｉｓはヒスチジン残基であり、ここで結合は、ヒスチジン窒素原子にあり；Ａ－Ｈｉｓは活性薬剤、たとえば、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質である）を含む。

【0038】

さらに別の態様では、式（ＩＩ）のコンジュゲート（上記及び本明細書の他の箇所に示されるその実施形態を含む）及び薬学的に許容される賦形剤を含有する医薬組成物が本明細書に提供される。

【0039】

さらに別の態様では、式（ＩＩ）によるコンジュゲート（上記及び本明細書の他の箇所に示されるその実施形態を含む）を含む組成物が提供され、ここで組成物中のコンジュゲートの少なくとも６０％、又はコンジュゲートの少なくとも７５％は、ヒスチジン残基のみにおいて活性薬剤に共有結合したＰＯＬＹを含む。いくつかのさらに関連した実施形態では、組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤を含む。

【0040】

またさらなる態様では、活性薬剤のコンジュゲートの調製方法が提供され、方法は、式（Ｉ）のポリマー試薬（本明細書に提供されるあらゆる実施形態を含む）を、活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基とポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進するのに有効な条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ基を含む活性薬剤と反応させることを含む。いくつかの好ましい実施形態では、活性薬剤は、反応条件下でポリマー試薬と反応し、それによりポリマーコンジュゲートを形成するアミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含む。

【0041】

追加の態様及び実施形態を、以下の説明及び特許請求の範囲に示す。

【図面の簡単な説明】

【0042】

【図1】例示的なヒスチジン選択的水溶性ポリマー試薬、ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール（試薬１）の合成のための例示的な反応スキームを提供する。

【図2-1】実施例１０に記載されるように、ＰＥＧ部分とＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する、破線ボックスで示される多様なスペーサー基（すなわち、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）を含む例示的なヒスチジン選択的ポリ（エチレングリコール）試薬と、異なるｐＨ条件下で、５時間の反応時間で形成されたコンジュゲートのパーセントに基づくそれらの反応性の表である。

【図2-2】実施例１０に記載されるように、ＰＥＧ部分とＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する、破線ボックスで示される多様なスペーサー基（すなわち、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）を含む例示的なヒスチジン選択的ポリ（エチレングリコール）試薬と、異なるｐＨ条件下で、５時間の反応時間で形成されたコンジュゲートのパーセントに基づくそれらの反応性の表である。

【図3】実施例１０に記載されるように、ＰＥＧ部分と例示的な～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する多様なアミノ基（Ｘ）を含む例示的なヒスチジン選択的ポリ（エチレングリコール）試薬についての、ｐＨ５．０で２５℃で経時的に形成されるヒスチジン結合コンジュゲートのパーセントを示すプロットである。

【図4】実施例１４に記載されるように、ＰＥＧ部分と、モデル化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジンの例示的な共有結合ヒスチジンとの間に介在する多様なスペーサー部分を含む例示的なヒスチジン結合ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートについての加水分解安定性研究の結果を示すプロットである。詳細には、プロットは、生理学的条件（３７℃でｐＨ７．４）下での経時的な無傷ヒスチジン結合コンジュゲートのパーセントを示す。

【図5】例示的なヒスチジン選択的ＰＥＧ試薬（ＰＥＧ部分と例示的な～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在するアミノ基、Ｘで示される）とカルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの、実施例１０に記載されるようなｐＨ５．５で２５℃での反応性を示すプロットである。詳細には、プロットは、経時的に形成されたｍＰＥＧ－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。

【図6】例示的なヒスチジン選択的ＰＥＧ試薬（ＰＥＧ部分と例示的な～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在するアミノ基、Ｘで示される）とカルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの、実施例１０に記載されるようなｐＨ６．０で２５℃での反応性を示すプロットである。詳細には、プロットは、経時的に形成されたｍＰＥＧ－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。

【図7】例示的なヒスチジン選択的ＰＥＧ試薬（ＰＥＧ部分と例示的な～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在するアミノ基、Ｘで示される）とカルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの、実施例１０に記載されるようなｐＨ６．５で２５℃での反応性を示すプロットである。詳細には、プロットは、経時的に形成されたｍＰＥＧ－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。示されるように、反応条件を適切に変更することによって、たとえば、この場合、ｐＨ）を増加させることによって、ヒスチジン結合コンジュゲートの良好な収量を得ることができる。

【図8】例示的なヒスチジン選択的ＰＥＧ試薬、ｍＰＥＧ－４－アミノピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤと、モデル化合物、カルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの、４つの異なるｐＨ（５．０、５．５、６．０及び６．５）での反応性を示す。プロットは、実施例１０に記載されるように異なるｐＨのそれぞれで経時的に形成されたｍＰＥＧ－４－アミノピペリジン－Ｃ（Ｏ）－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。示されるように、反応性は、たとえば、ｐＨを変化させることにより変更することができる。図に示すように、１０時間後、ｐＨ５．０、５．５、６．０及び６．５で、形成されたコンジュゲートのパーセント（％）は、それぞれ４．７、１５、５７及び９３であった。

【図9】１つの例示的なヒスチジン選択的ＰＥＧ試薬、ｍＰＥＧ－４－アミノメチルピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤと、モデル化合物、カルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの、実施例１０に記載されるように４つの異なるｐＨ（５．０、５．５、６．０及び６．５）での反応性を示す。プロットは、異なるｐＨのそれぞれで経時的に形成されたｍＰＥＧ－４－アミノメチルピペリジン－Ｃ（Ｏ）－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。示されるように、反応性は、たとえばｐＨを変化させることにより変更することができる。図に示すように、１０時間後、ｐＨ５．０、５．５、６．０及び６．５で、形成されたコンジュゲートのパーセントは、それぞれ２．０、７、３０及び６８であった。これらのデータはまた、ｍＰＥＧ－４－アミノピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール試薬と比較して低いｍＰＥＧ－４－アミノメチルピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール試薬の相対的反応性も示し、２つの試薬は、カルバメート窒素とピペリジン環の４－炭素との間に挟まれる～ＣＨ_２～基の非存在又は存在において異なる。

【図10】例示的なＰＥＧ試薬、試薬２（ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）と、モデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨとの１：１０のモル比での、リン酸緩衝液中２５℃でのコンジュゲーションのための反応スキームを提供する。反応は、図１１のデータにより支持されるように、試薬のヒスチジン選択性を示す。

【図11】リン酸緩衝液中２５℃で、異なるアミノ酸又はオリゴペプチド標的：α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨとモル比１：１０で反応させた際の、本明細書に提供される例示的なＰＥＧ試薬、試薬２（Ｒ_２は、－ＮＲ_１と一緒になった場合、ピペラジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ピペラジン－Ｃ（Ｏ）～である）の選択性を示すプロットである。結果は、実施例１１に記載されるように、本明細書に提供される試薬の、リシンよりもヒスチジンに対する顕著な選択性を示す。

【図12】リン酸緩衝液中２５℃で、異なるアミノ酸又はオリゴペプチド標的：α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨとモル比１：１０で反応させた際の、本明細書に提供される例示的なＰＥＧ試薬、試薬９（Ｒ_２は、－ＮＲ_１と一緒になった場合、ピペラジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ピペラジン－Ｃ（Ｏ）～である）の選択性を示すプロットである。結果は、実施例１３に記載されるように、本明細書に提供される試薬の、リシンよりもヒスチジンに対する顕著な選択性を示す。

【図13】リン酸緩衝液中２５℃で、異なるアミノ酸又はオリゴペプチド標的：α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨとモル比１：１０で反応させた際の、本明細書に提供される例示的なＰＥＧ試薬、試薬７（Ｒ_２は、－ＮＲ_１と一緒になった場合、ピペリジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ピペラリン－Ｃ（Ｏ）～である）の選択性を示すプロットである。結果は、実施例１３に記載されるように、本明細書に提供される試薬の、リシンよりもヒスチジンに対する顕著な選択性を示す。

【図14A】実施例１５に記載されるように、本明細書に提供されるポリマー試薬のヒスチジン選択性のさらなる証拠を提供する。より詳細には、図１４Ａは、試薬１とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．４、２５℃）を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。ヒスチジンコンジュゲート、たとえば試験した例示的なコンジュゲートは、ヒドロキシルアミンと反応した際、非コンジュゲートヒスチジン化合物が放出される逆反応を受ける。対照的に、ヒドロキシルアミンは、典型的には、リシン結合コンジュゲートと反応してリシン－ポリマー結合を切断することによって親リシン化合物を放出することはない。約２２時間までに、１００％のコンジュゲートがα－ＣＢＺ－Ｈｉｓを放出して消失している。図１４Ｂは、試薬２とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により形成されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．３、２５℃）を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。約４２時間において、４％のみの無傷コンジュゲートが残留している。

【図14B】実施例１５に記載されるように、本明細書に提供されるポリマー試薬のヒスチジン選択性のさらなる証拠を提供する。より詳細には、図１４Ａは、試薬１とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．４、２５℃）を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。ヒスチジンコンジュゲート、たとえば試験した例示的なコンジュゲートは、ヒドロキシルアミンと反応した際、非コンジュゲートヒスチジン化合物が放出される逆反応を受ける。対照的に、ヒドロキシルアミンは、典型的には、リシン結合コンジュゲートと反応してリシン－ポリマー結合を切断することによって親リシン化合物を放出することはない。約２２時間までに、１００％のコンジュゲートがα－ＣＢＺ－Ｈｉｓを放出して消失している。図１４Ｂは、試薬２とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により形成されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．３、２５℃）を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。約４２時間において、４％のみの無傷コンジュゲートが残留している。

【発明を実施するための形態】

【0043】

定義
本開示のある特徴について記載し、主張する際には、特に明記しない限り、以下の術語を、下記に記載される定義に従って使用した。

【0044】

本明細書において使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、文脈上、明らかに他の意味を示す場合を除き、複数形の指示対象を含む。したがって、たとえば、「ポリマー」への言及は、単一のポリマー及び２つ以上の同じ又は異なるポリマーを含み、「コンジュゲート」への言及は、単一のコンジュゲート及び２つ以上の同じ又は異なるコンジュゲートを指し、「賦形剤」への言及は、単一の賦形剤及び２つ以上の同じ又は異なる賦形剤を含む、などとなる。

【0045】

「水溶性非ペプチド性ポリマー」は、室温で、水中で、少なくとも３５％（重量で）可溶性であるポリマーを指す。しかしながら、好ましい水溶性非ペプチド性ポリマーは、水中で、好ましくは７０％（重量で）超、より好ましくは９５％超（重量で）可溶性である。通常、「水溶性」ポリマーの濾過されてない水溶性調製物は、濾過した後の同じ溶液が透過する光の量の少なくとも７５％を透過する。好ましくは、そのような濾過されてない水溶性調製物は、濾過した後の同じ溶液が透過する光の量の少なくとも９５％を透過する。水中で少なくとも９５％（重量で）可溶性である又は水中で完全に可溶性である水溶性ポリマーが、最も好ましい。「非ペプチド性」に関して、ポリマーが３５％未満（重量で）のアミノ酸残基を含有する場合、ポリマーは非ペプチド性となる。

【0046】

用語「モノマー」、「モノマーサブユニット」、及び「モノマー単位」は、本明細書において区別なく使用され、ポリマーの基本的構造単位の１つを指す。ホモポリマーの場合、単一の反復構造単位が、ポリマーを形成する。コポリマーの場合、２つ以上の構造単位が、あるパターンで又はランダムに反復して、ポリマーを形成する。本発明に関連して使用される好ましいポリマーは、ホモポリマーである。水溶性非ペプチド性ポリマーは、連続的に付加された３つ以上のモノマーを含み、モノマーの鎖を形成する。

【0047】

本明細書において使用される「ＰＥＧ」又は「ポリエチレングリコール」は、任意の水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含することを意図する。特に明記しない限り、「ＰＥＧポリマー」又はポリエチレングリコールは、実質的にすべての（好ましくはすべての）モノマーサブユニットがエチレンオキシドサブユニットであるが、ポリマーが、たとえばコンジュゲーションのために、特異なエンドキャッピング成分又は官能基を含有してもよいものである。ＰＥＧポリマーは、末端の酸素が、たとえば合成変換の間に、置き換えられたかどうかに依存して、２つの以下の構造のうちの１つを一般に含む：「－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－」又は「－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ－１ＣＨ_２ＣＨ_２－」。上記のように、ＰＥＧポリマーについて、変数（ｎ）は、約２～約２２７３の範囲にわたり、末端基及び全体的なＰＥＧの構成は、変動し得る。「ｎ」についてのその他の部分範囲は、本明細書において記載される。本開示に関連したＰＥＧポリマーは、典型的にはエンドキャップされ、好ましいエンドキャッピング基は低級アルキル基であり、最も好ましいエンドキャッピング基は、メチル（隣接する酸素原子を考慮する場合、メトキシとも称される）である。

【0048】

本開示の文脈において、１つの構造又は式に関して提供される変数の定義は、文脈が特に指示しない限り、異なる構造で繰り返される同じ変数に適用できることを認識するべきである。したがって、たとえば、ポリマー試薬に関する「ＰＯＬＹ」、「リンカー部分（Ｘ）」、有機基（Ｒ_１）などの定義は、本明細書に提供される水溶性ポリマーコンジュゲート又はポリマー中間体（適宜）に等しく適用することができる。

【0049】

ＰＥＧなどのような水溶性ポリマーに関する分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量として表わすことができる。特に明記しない限り、本明細書における分子量への言及はすべて、重量平均分子量を指す。両方の分子量測定、数平均及び重量平均は、ゲル浸透クロマトグラフィー又は他の液体クロマトグラフィー技術（たとえばゲル濾過クロマトグラフィー）を使用して測定することができる。最もよく用いられるのは、ゲル浸透クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーである。分子量を決定するための他の方法は、数平均分子量を決定するための末端基分析又は束一性の測定（たとえば凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧）又は重量平均分子量を決定するための光散乱技術、超遠心分離法、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ、若しくはビスコメトリーの使用を含む。ＰＥＧポリマーは、通常、多分散であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量及び重量平均分子量は、等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、さらにより好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散度（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｖａｌｕｅ）を持つ。

【0050】

ポリマーの幾何学的配置又は全体的な構造に関する「分岐」は、分岐点又は中央にある構造的な特徴から伸長する２つのポリマー「アーム」又は「鎖」を有するポリマーを指す。ある好ましい分岐ポリマーの例は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を有するものである：２つのポリマーアームを有する、同じ構造を有するポリマー鎖から構成される（たとえば、同じモノマーサブユニットから構成される）、及び同じ重量平均分子量を有するポリマーアームから構成される。

【0051】

ポリマーの幾何学的形状又は全体構造に関する「多アーム状」は、３つ以上のポリマー含有鎖又は「アーム」を有するポリマーを指す。したがって、多アーム状ポリマーは、その構成及びコア構造に応じて３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、５つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、７つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム又はそれ以上を有し得る。

【0052】

「安定した」連結又は結合は、水中で実質的に安定している、すなわち、長期間にわたって任意の評価可能な程度まで、生理学的条件下で加水分解又は分解を受けない化学結合を指す。加水分解的に安定した連結の例は、一般に、以下のものを含むが、これらに限定されない：炭素－炭素結合（たとえば脂肪鎖において）、エーテル結合、アミド結合、アミン結合、及びその他同種のもの。しかしながら、化学技術の熟練者によって理解されるように、任意のある特定の化学結合の安定性は、結合が置かれる分子の特定の構造的特徴並びにある特定の分子内の主題の連結の配置、近接する及び隣接する原子、並びにその他同種のものによって影響を及ぼされ得ることが理解されるべきである。当業者は、たとえば、関心がある条件下に（たとえば生理学的条件下に）関心がある連結含有分子を配置し、適した時間にわたる遊離の証拠について試験することによって、ある特定の連結が、ある特定の状況において安定しているか遊離可能かどうかを決定することができる。一般に、安定した連結は、例えば、生理学的条件下で１日当たり約１～２％未満の加水分解の速度を示すものである。代表的な化学結合の加水分解速度は、標準的な有機化学のテキストにおいて見つけることができる。

【0053】

「アルキル」は、通常、長さが約１～１５原子の範囲にわたる炭化水素鎖を指す。そのような炭化水素鎖は、必ずではないが、好ましくは飽和されており、分岐であっても直鎖であってもよいが、通常、直鎖が好ましい。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、３－メチルペンチル、及びその他同種のものを含む。

【0054】

「低級アルキル」は、１～６の炭素原子を含有するアルキル基を指し、メチル、エチル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、及びｔ－ブチルによって例示されるように、直鎖であっても分岐であってもよい。

【0055】

「アルコキシ」は、－ＯＲ基を指し、ここで、Ｒは、アルキル又は置換アルキル、好ましくはＣ_１～６アルキル（たとえば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ等）である。

【0056】

たとえば「置換アルキル」でのような「置換」という用語は、これらに限定されないが、アルキル、Ｃ_３～８シクロアルキル、たとえばシクロプロピル、シクロブチル、及びその他同種のもの；ハロ、たとえばフルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；並びにその他同種のものなどのような１つ又はそれ以上の非干渉性の置換基により置換される成分（たとえばアルキル基）を指す。「置換アリール」は、置換基として１つ又はそれ以上の非干渉性の基を有するアリールである。フェニル環の置換について、置換基は、任意の配向をしていてもよい（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）。ナフタレン又はフルオレンコアなどのような、より複雑な系の一部であるアリール部分の置換基は、別の状況ではその構造において占められることはない、アリール環の任意の位置を占めてもよい。

【0057】

「非干渉性の置換基」は、分子中に存在する場合、分子内に含有される他の官能基と通常、非反応性である基である。

【0058】

「アリール」は、それぞれ５又は６のコア炭素原子の、１つ又はそれ以上の芳香環を意味する。アリールは、ナフチルでのように融合されてもよい又はビフェニルでのように非融合であってもよい多数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ又はそれ以上の環式炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環と融合されてもよい又は非融合であってもよい。本明細書において使用されるように、「アリール」は、ヘテロアリールを含む。芳香族部分（たとえばＡｒ^１、Ａｒ^２等）は、アリールを含有する構造を意味する。

【0059】

「ヘテロアリール」は、１～４のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素又はその組み合わせを含有するアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ又はそれ以上の環式炭化水素、複素環、アリール環、又はヘテロアリール環と融合されてもよい。

【0060】

「ヘテロ環」又は「複素環」は、不飽和又は芳香族性を有し又は有しておらず、炭素ではない少なくとも１つの環原子を有する、５～１２原子、好ましくは５～７原子の１つ又はそれ以上の環を意味する。好ましいヘテロ原子は、硫黄、酸素、及び窒素を含む。

【0061】

「置換ヘテロアリール」は、置換基として１つ又はそれ以上の非干渉性の基を有するヘテロアリールである。

【0062】

「置換ヘテロ環」は、非干渉性の置換基から形成される１つ又はそれ以上の側鎖を有するヘテロ環である。

【0063】

「保護基」は、特定の反応条件下で分子内の特定の化学反応性官能基の反応を防止又は遮断する部分である。保護基は、保護される化学反応性基のタイプ、並びに使用される反応条件、及び分子内の追加の反応性又は保護基の存在に応じて変動するであろう。保護され得る官能基としては、例として、カルボン酸基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、カルボニル基などが挙げられる。カルボン酸の代表的な保護基には、エステル（たとえばｐ－メトキシベンジルエステル）、アミド及びヒドラジドが含まれ；アミノ基の場合、カルバメート（たとえばｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）及びアミド；ヒドロキシル基の場合、エーテル及びエステル；チオール基の場合、チオエーテル及びチオエステル；カルボニル基の場合、アセタール及びケタール；などである。そのような保護基は当業者に周知であり、たとえば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９９、及びＧｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，２０１４、並びにそれらに引用される参考文献に記載されている。

【0064】

「保護形態」における官能基は、保護基を有する官能基を指す。本明細書で使用される場合、用語「官能基」若しくはその任意の同義語、又は特定の官能基への参照は、適宜、その保護形態を包含することが意図される。

【0065】

たとえば、ポリマー試薬及びそれらのコンジュゲートを含む、本明細書に記載される分子実体は、適用可能な場合、薬学的に許容される塩を含む塩形態を包含することが意図される。たとえば、Ｓｔａｈｌ，Ｐ．Ｈ．，Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｅｄｓ．），Ｃ．Ｇ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ａｎｄ ＶＨＣＡ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），２００２を参照されたい。

【0066】

用語「リンカー」は、たとえば、式（Ｉ）に示される水溶性ポリマー（ＰＯＬＹ）及び窒素含有複素環又は窒素原子（～ＮＲ_１）などの相互接続部分を結合するのに使用される原子又は原子の集合を指すために本明細書で使用される。リンカー（リンカー部分とも称される）は、加水分解的に安定であり得、又は生理学的に加水分解性若しくは酵素分解性の結合を含むことができる。好ましくは、本明細書で使用される場合、リンカーは、加水分解的に安定である。

【0067】

「小分子」は、典型的には約１０００ダルトン未満の分子量を有する有機、無機、又は有機金属化合物として広く定義され得る。

【0068】

本明細書において使用される「有機ラジカル」は、アルキル、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含むものとする。

【0069】

「実質的に」又は「本質的に」は、ほとんど全く又は完全に、たとえば、ある特定の数量の９５％又はそれ以上を意味する。

【0070】

同様に、本明細書において使用される「約」又は「およそ」は、ある特定の数量のプラス又はマイナス５％の範囲内にあることを意味する。

【0071】

「任意選択の」又は「任意選択で」は、続いて記載される状況が、必ずしも生じる必要はないが、生じてもよいことを意味し、その記載によって、状況が生じる場合及び生じない場合が含まれることになる。

【0072】

「薬学的に許容される賦形剤」又は「薬学的に許容されるキャリア」は、本明細書において記載される組成物中に含まれてもよく、対象に著しい有害な毒性の効果を引き起こさない構成成分を指す。

【0073】

本明細書において使用される「患者」又は「対象」という用語は、癌などのような、本明細書において提供される化合物若しくは組成物又は組み合わせの投与によって予防する又は治療することができる状態を患っている又はその傾向がある生物を指し、ヒト及び動物の両方を含む。対象は、哺乳動物（たとえばネズミ科の動物、類人猿、ウマ科の動物、ウシ属の動物、ブタ、イヌ科の動物、ネコ科の動物、及びその他同種のもの）を含むが、これらに限定されず、好ましくはヒトである。

【0074】

概要
本開示は、とりわけ、たとえばペプチド又はタンパク質中のヒスチジンの部位選択的修飾が可能な新規なＰＥＧ試薬、及びそれらの対応するコンジュゲートに関する。この新規なポリマー試薬は、活性分子内のヒスチジン部位に対するコンジュゲーションを指向させることによって、水溶性ポリマー－活性薬剤コンジュゲーションの可能性を高めることができる。このアプローチは、ほとんどのタンパク質治療薬において利用可能なリシンの豊富さに起因して、リシンの側鎖及びＮ－末端においてタンパク質アミノ基を標的とする（これは異なるＰＥＧ結合部位、及びタンパク質に結合した異なる数のＰＥＧ部分を有する、コンジュゲートの異種混合物の形成をもたらし得る）ＰＥＧ化反応体と比較して有意な利点を提供することができる。ヒスチジンは、タンパク質中の比較的稀なアミノ酸であり；ヒスチジンは、タンパク質中の他の求核性残基、たとえば、リシン及びアルギニンなどよりも低いｐＫａを有し、それにより、本明細書に提供されるような特定の革新的な試薬のための反応条件を、ヒスチジン選択的コンジュゲーションに有利なように調整することができる。リシン残基よりもヒスチジン残基と選択的に反応することが可能な水溶性ポリマー試薬の発見及び設計は、注目すべきいくつかの利点を提供する。ヒスチジン残基を含む標的タンパク質の場合、選択的コンジュゲーションは、システイン若しくは非天然アミノ酸などの所望のコンジュゲーション部位を導入するようにタンパク質を操作する必要なく、又は代替的に、競合コンジュゲーションを受ける競合するアミノ酸の置換の必要なく行うことができるが、それらのアプローチは本開示の範囲内である。一般に、ポリマー試薬は、より少ない位置異性体を含むコンジュゲート生成物、及び活性分子に結合した実質的に同じ数のＰＥＧ（又は他の水溶性ポリマー）部分を有するコンジュゲート生成物を形成することが予想される。一般にイミダゾリル尿素又はチオ尿素結合を含む、対応するコンジュゲートは、生理学的ｐＨを含む幅広いｐＨにわたって安定であり、それにより容易なクロマトグラフィー精製及び取り扱いが可能となり、またたとえば、一貫し且つ有利な薬物動態及び薬力学特性を有する、理想的には、非選択的／非特異的に多数のＰＥＧ部分に安定に共有結合した生物薬剤と比較した場合、改善された生物活性を有する、再現可能に調製され、明確に定義された、実質的に均質なＰＥＧ化生物薬剤製品の提供が可能となる。

【0075】

これら及び他の態様、並びに実施形態は、以下の節でより詳細に記載される。

【0076】

ポリマー試薬
第１の態様に目を向けると、独特のポリマー試薬が提供される。以前に開示したように、ポリマー試薬は、生物学的に活性な分子などの標的分子内のヒスチジンと選択的に、すなわち優先的に反応することが可能である。

【0077】

ポリマー試薬は、一般に以下の式（式Ｉ）により記述される：

【化9】

式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｘはリンカー部分であり（「０」下付き文字は、その非存在を示し、「１」下付き文字は、その存在を示す）、Ｒ_１は有機基であり、場合によっては、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；Ｒ_２は、存在する場合（「０」下付き文字は、その非存在を示し、「１」下付き文字は、その存在を示す）Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し、Ｙは酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）から選択され、Ｚは脱離基である。

【0078】

水溶性ポリマー部分に関して、水溶性ポリマーは、ポリマーが水溶性及び非ペプチド性である限り、任意のポリマーを含むことができる。ポリ（エチレングリコール）が好ましいが、水溶性ポリマーは、たとえば、他の水溶性ポリマー、たとえば他のポリ（アルキレンオキシド）、たとえばエチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メチルアクリルアミド、ジビニル（ｄｉｖｙｉｎｙｌ）エーテル－無水マレイン酸、ポリホスフェート、ポリホスファゼン、並びにそれらのコポリマー及びターポリマーであってもよい。水溶性ポリマーは、ホモポリマーであってもよく、又は、上述したように、コポリマー若しくはターポリマーであってもよく；そのようなコポリマー又はターポリマーは、非ランダム又はランダムであり得る。加えて、水溶性ポリマーは直鎖であってもよいが、他の幾何形態、たとえば分岐、フォーク状、多アーム状などであってもよい。さらに、ポリ（エチレングリコール）などのポリ（アルキレンオキシド）ポリマーは、典型的には、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャッピング部分で末端がキャップされる。好ましいエンドキャッピング基は、低級アルコキシ（Ｃ１～Ｃ６アルコキシ）及びベンジルオキシを含み；特に好ましい末端キャッピング基はメトキシであり、そのような末端キャップされたポリ（エチレングリコール）ポリマーは、多くの場合、メトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧと称される。或いは、ＰＯＬＹは、その末端に、たとえば、ヒドロキシ、アミノ、エステル、カーボネートアルデヒド、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、スルホン、チオール、カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、ヒドラジド、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、シラン、脂質、リン脂質、ビオチン、フルオレセインなどを含むがこれらに限定されない官能基又は反応性部分を含んでもよく、ここで反応性基は、たとえば、脱離基、「Ｚ」に対して遠位の末端においてさらなるカップリング又は転換を可能にするために、保護形態にあり得る。

【0079】

上述したように、試薬の水溶性ポリマー部分は、数個の幾何形態のいずれか、たとえば直鎖、分岐、多アーム状などを有し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＯＬＹは直鎖である。さらなるいくつかの他の実施形態では、ＰＯＬＹは分岐である。分岐ポリマーは、たとえば、そこから２つの水溶性ポリマー「アーム」又は鎖が延びる中心コア基又は分岐点を含むことができる。たとえば、分岐又は多アーム状ポリマー、「ＰＯＬＹ」は、以下のような一般構造を有することができ：

【化10】

ここでポリ_ａ及びポリ_ｂは、本明細書に記載される（また同じ又は異なり得る）水溶性ポリマー、たとえば、メトキシポリ（エチレングリコール）であり；Ｒ”は、非反応性部分、たとえばＨ、メチル又は追加の水溶性ポリマー、ポリｃ（たとえば、メトキシポリ（エチレングリコール）、ここでポリ_ｃは、ポリ_ａ及び／又はポリ_ｂと同じ又は異なり得る）であり、Ｐ及びＱは、非反応性結合である。

【0080】

１つの例示的な分岐水溶性ポリマー（ＰＯＬＹ）は、以下のような構造を有するリシン－分岐ＰＥＧであり、ここで２つのポリ（エチレングリコール）鎖は、カルバメート結合を介してリシンのアミノ基に結合し、ＣＨ炭素は、さらなる修飾のための部位を提供する：

【化11】

ここでｎの値は、本明細書に提供される例示的な分子量範囲の任意の１つ又はそれ以上に含まれ得る。

【0081】

分岐構造を有する別の例示的なＰＯＬＹは、以下である：

【化12】

ここで、中心コア基（ここからポリ（エチレングリコール）鎖が発散する）は、（～ＨＣ（ＣＨ_２Ｏ－）_２）であり、ポリ（エチレングリコール）鎖の両方は、カルバメート結合を介してコア基に結合し、カルバメート窒素原子はポリマー鎖に近接し、ｎの値は、本明細書に提供される例示的な分子量範囲の任意の１つ又はそれ以上に含まれ得る。或いは、分岐ＰＯＬＹは、カルバメート結合の配向が逆転し、中心コア基が（～ＨＣ（ＣＨ_２ＮＨ－）_２）である前述した構造のような構成

【化13】

を有することができる。数個の分岐ポリ（エチレングリコール）部分のいずれも同様に想定することができ、本開示はこの点に関して限定されない。

【0082】

追加の例示的な分岐水溶性ポリマーは、数個の分子配置のいずれか、たとえば

【化14】

を有することができ、ここでｎの値は、本明細書に提供される例示的な分子量範囲の任意の１つ又はそれ以上に含まれ得る。前述した分岐ポリマー構造のそれぞれにおいて、

【化15】

は、式（Ｉ）におけるように、（Ｘ）_０，１に対する結合を示す。様々な例示的な結合部分（Ｘ）が本明細書に詳細に記載される。数個の有機分子のいずれかをコアとして使用して、そこから２つ以上のポリマー鎖が発散して分岐又は多アーム状のポリマー、ＰＯＬＹを提供することができる。適切なコア基としては、ポリオール、ポリチオール、及びポリアミンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なポリオールコア基には、グリセロール、トリメチロールプロパン、ソルビトール又はペンタエリトリトールなどの還元糖、及び、ヘキサグリセロールなどのグリセロールオリゴマーから誘導されるものが含まれ；前述したポリオールのポリチオール及びポリアミノコア基対応物も同様に使用することができる。

【0083】

水溶性ポリマーの重量平均分子量は変動し得るが、任意の所与の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、典型的には約１００ダルトン～約２００，０００ダルトン、又は約１００ダルトン～約１５０，０００ダルトン、又は約１００ダルトン～約１００，０００ダルトンの範囲であろう。いくつかのさらなる実施形態では、ＰＯＬＹの例示的な重量平均分子量は、たとえば、約１２０ダルトン～約１００，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約３～約２２７２の範囲の場合）、又は約２５０ダルトン～約６０，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約４．５～約１３６３の範囲の場合）、又は約１２０ダルトン～約６，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約３～約１３６の範囲の場合）、又は約６，０００ダルトン～約８０，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約１３６～約１８１８の範囲の場合）、又は約５，０００～約２５，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約１１３～約５６８の範囲の場合）、又は約１０，０００～約２５，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）が約２２７～約５６８の場合）の範囲である。当業者が理解するように、「（ｎ）」の例示的な値は、直鎖ポリ（エチレングリコール）鎖について計算される。したがって、たとえば、分岐ポリ（エチレングリコール）が約２０，０００ダルトンの全体の重量平均分子量を有する、ＰＯＬＹが２つのポリマー鎖（ポリマー鎖は同じである）を含む分岐ポリ（エチレングリコール）である実施形態では、分岐ポリマーを含む２つのポリマー鎖のそれぞれは、各ポリマー鎖の「（ｎ）」の値が約２２７であるように、約１０，０００ダルトンの重量平均分子量を有することが理解されるであろう。同様の計算を、３つ以上のポリマー鎖を含む多アーム状ポリマーについて行うことができる。

【0084】

さらなるいくつかの他の実施形態では、ＰＯＬＹは、たとえば、約２００ダルトン～約８０，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約７０，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約８０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する。

【0085】

しかしながら、例示的な範囲は、以下の範囲の重量平均分子量を含む：約８８０ダルトン～約５，０００ダルトン（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約２０～約１１３の範囲である）；５，０００ダルトン超～約１００，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約１１３～約２２７２の範囲である）；約６，０００ダルトン～約９０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約１３６～約２０４５の範囲である）；約１０，０００ダルトン～約８５，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約２２７～約１９３２の範囲である）；１０，０００ダルトン超～約８５，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約２３０～約１９３２の範囲である）；約２０，０００ダルトン～約８５，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約４５４～約１９３２の範囲である）；約２５，０００ダルトン～約１２０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約５６８～約２７２７の範囲である）；約２９，０００ダルトン～約１２０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約６５９～約２７２７の範囲である）；約３５，０００ダルトン～約１２０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約７９５～約２７２７の範囲である）；約８８０ダルトン～約６０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約２０～約１３６４の範囲である）；約４４０ダルトン～約４０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約１０～約９０９の範囲である）；約４４０ダルトン～約３０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約１０～約６８２の範囲である）；約１０，０００ダルトン～約２５，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約２２７～約５６８の範囲である）、又は約１５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約３４１～約５６８の範囲である）、及び約４０，０００ダルトン～約１２０，０００ダルトンの範囲（たとえば、ポリ（エチレングリコール）の（ｎ）は、約９０９～約２７２７の範囲である）。

【0086】

ＰＯＬＹの例示的な重量平均分子量としては、たとえば、約１００ダルトン、約１２０ダルトン、約２００ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約４４０ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約１６，０００ダルトン、約１７，０００ダルトン、約１８，０００ダルトン、約１９，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約８５，０００ダルトン、約９０，０００ダルトン、約９５，０００ダルトン、及び約１００，０００ダルトンが挙げられる。

【0087】

さらなるいくつかの特定の実施形態では、ＰＯＬＹは、２００ダルトン、３００ダルトン、４００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、２，５００ダルトン、３，０００ダルトン、５，０００ダルトン、７５００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、４０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、５５，０００ダルトン、６０，０００ダルトン、及び６５，０００ダルトンから選択される重量平均分子量を有する。

【0088】

上述したように、ＰＯＬＹは、好ましくはポリエチレングリコールである。ＰＥＧがポリマー試薬中の水溶性ポリマーとして使用される場合、ＰＥＧは、ＰＥＧがどのように定義されるかに応じて、典型的には数個の（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）モノマー（又は（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）モノマーを含む。本明細書全体で使用されるように、反復単位の数は、「（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎ」における添字「ｎ」により特定される。したがって、（ｎ）の値は、典型的には、本明細書に提供される範囲の１つ又はそれ以上に含まれる。分子量が既知の任意の所与のポリマーの場合、ポリマーの総重量平均分子量を反復モノマーの分子量で割ることによって、モノマー反復単位の数（すなわち、「ｎ」）を決定することができる。たとえば、ＰＯＬＹが約１０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールの場合、（ｎ）の値は約２２７であり；ＰＯＬＹが約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールの場合、（ｎ）の値は約４５４である、などである。

【0089】

式（Ｉ）を参照して、ポリマー試薬は、リンカー部分、Ｘを含み得る。リンカー部分は、存在する場合、水溶性ポリマーと、Ｒ_２の存在又は非存在に応じて、Ｒ_２とＲ_１Ｎ又はＮＲ_１との間に形成された窒素含有複素環

【化16】

のいずれかとの間に挟まれる。いくつかの実施形態では、Ｘは存在しない。１つ又はそれ以上のさらなる実施形態では、Ｘ及びＲ_２の両方が存在しない。いくつかの他の実施形態では、Ｘは存在する。１つ又はそれ以上のさらなる実施形態では、Ｘ及びＲ_２の両方が存在する。好ましくは、Ｘは、加水分解的に安定なリンカーである。リンカー部分は、単一の原子又は原子の集合を含み得る。一般に、リンカー部分（本明細書でときには単に「リンカー」と称される）、Ｘは、約１個の原子～約２５個の原子、又は約１個の原子～約２０個の原子の原子長を有する。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、約２個の原子～約１０個の原子の鎖長を有する。代表的なリンカーは、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の原子の長さを有する。原子の集合の鎖長を参照すると、－ＣＨ_２－は、たとえば、メチレン基自体は合計３つの原子を含むが、水素原子が炭素上の置換基であるため、１つの原子の長さを有するとみなされ、－ＣＨ_２ＣＨ_２－は、たとえば、２つの炭素原子の鎖長を有するとみなされる、などである。同様に、－ＯＣ（Ｏ）－は、２つの原子の長さを有するとみなされ、一方、－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－は、３つの原子の長さを有するとみなされる、などである。例示的なリンカー部分は、たとえば、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_０－６－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０－２－、Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨＣＨ_２、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－Ｃ（Ｓ）－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－Ｓ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｓ）－Ｓ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）ＣＨ_２－、－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_０－６－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_０－２－，Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－、－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）
_１－６－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－、－Ｓ－Ｃ（Ｓ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２から選択されるものなどの原子又は原子の群を含むことができる。リンカー部分はまた、前述した原子又は原子の群の任意の２つ以上の組み合わせを、任意の配向で含み得る。

【0090】

いくつかの実施形態では、リンカー部分は、一般構造：～（ＣＨ_２）_ａ（Ｏ）_ｂ［Ｃ（Ｏ）］_ｃ（ＮＨ）_ｄ（ＣＨ_２）_ｅ～によって特徴付けられ、式中、（ａ）は、０～６の値を有する整数であり；（ｂ）は０又は１であり；（ｃ）は０又は１であり；（ｄ）は０又は１であり；（ｅ）は、０～６の値を有する整数であり、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つは、正の整数である（すなわち、ゼロではない）。たとえば、いくつかの実施形態では、（ａ）はゼロであり、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）はすべてゼロではく、したがってリンカーは構造：～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_１～６～を有し、例示的なリンカーは：～ＯＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ_２～、～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２～、～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３～、～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_４～、～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_５～、及び～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_６～から選択される構造を有する。いくつかの他の実施形態では、（ａ）及び（ｅ）の両方がゼロであり、したがってリンカーは構造：～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ～を有する。いくつかの他の実施形態では、（ａ）、（ｄ）、及び（ｅ）はゼロである一方、（ｂ）及び（ｃ）は両方とも１であり、したがってリンカーは構造：～ＯＣ（Ｏ）～を有する。いくつかの他の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は１であり、（ｅ）はゼロであり、したがってリンカーは構造：～（ＣＨ_２）_１～６ＯＣ（Ｏ）ＮＨ～を有する、などである。したがって、いくつかの実施形態では、リンカー部分は、～ＯＣ（Ｏ）～、～ＯＣ（Ｏ）ＮＨ～、及び～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_１～６～（すなわち、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）～、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_２～、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_３～、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_４～、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_５～、又は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_６～）から選択される。たとえば、例示的な試薬２’、７’、８’及び９’を参照されたい。

【0091】

式（１）のポリマー試薬

【化17】

を参照して、Ｒ_１は、窒素原子（すなわち、～Ｃ（Ｙ）Ｚに隣接する窒素原子）に結合した有機基であり、場合によっては、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環

【化18】

を形成することができる。Ｒ_２は、存在しないか、又は存在する場合、Ｒ_１（すなわち、Ｒ_１－Ｎ）と一緒になって、窒素含有複素環を形成する。Ｒ_１は、たとえば、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換シクロアルキル、置換及び非置換アルケニル、置換及び非置換シクロアルケニル、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ヘテロアルキル、置換及び非置換シクロヘテロアルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換アラルキル、置換及び非置換ヘテロアリール、並びに置換及び非置換ヘテロアラルキルから選択されてもよい。例示的な有機基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキル（それぞれ、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルから独立して選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されている）が挙げられる。

【0092】

いくつかの特定の実施形態では、たとえば、Ｒ_２が存在しない場合、Ｒ_１は、低級アルキル（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ハロ置換（たとえば、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード置換）低級アルキル、ベンジル、ハロ置換ベンジル、及びニトロ置換ベンジルから選択される。好ましい実施形態において、ハロ置換された基、たとえば、ハロ置換低級アルキル又はハロ置換ベンジルは、１つ又はそれ以上のフルオロ又はクロロ原子で置換されている。たとえば、ハロ置換ベンジルは、ベンジル環上に１、２、３、４若しくは５つのハロ置換基を有し得、及び／又はベンジルメチレン基上に１つ又はそれ以上のハロ置換基を有し得る。ベンジルフェニル環上の置換基は、任意の位置、すなわち、任意の利用可能な環炭素上にあり得る。いくつかの実施形態では、Ｒ_１上の１つ又はそれ以上の置換基は、電子吸引性である。いくつかのさらなる実施形態では、Ｒ_１上の１つ又はそれ以上の置換基は、フッ素である。例示的な置換Ｒ_１基は、たとえば、～ＣＨ_２Ｘ、ＣＨＸ_２、～ＣＨ_２ＣＨ_２Ｘ、～ＣＨ_２ＣＨＸ_２、～ＣＨ_２ＣＸ_３、ＣＨＸＣＨ_３、～ＣＸ_２ＣＨ_３、～ＣＨＸＣＨ_２Ｘ、～ＣＨＸＣＨＸ_２、ＣＨＸＣＸ_３、～ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｘ、～ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨＸ_２、～ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＸ_３を含み、各Ｘは、独立してハロ（たとえば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）である。いくつかの実施形態では、各Ｘは、同じハロである。いくつかの好ましい実施形態では、各Ｘは、フルオロである。たとえば、それぞれＲ_１基～ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ、～ＣＨ_２ＣＨＦ_２、～ＣＨ_２ＣＨＦ_３、及び～ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５を有する例示的な試薬３’、４’、５’及び６’を参照されたい。

【0093】

いくつかの他の実施形態では、Ｒ_２は存在し、Ｒ_１－Ｎと一緒になった場合、窒素含有複素環、すなわち、非芳香族窒素含有複素環を形成し、窒素含有複素環は、置換され又は非置換であり得る。窒素含有複素環は、飽和又は不飽和であり得、複素環式環原子の１つ（Ｎ－Ｒ_１以外）は、Ｘ（存在する場合）又はＰＯＬＹに結合している。１つ又はそれ以上の好ましい実施形態では、窒素含有複素環は飽和である。適切な窒素含有複素環は、たとえば、４、５、６又は７つの複素環環原子を含み得、３つまでの窒素（たとえば、１つ、２つ又は３つ）の窒素環原子を含み得る。いくつかの実施形態では、窒素含有複素環は、１つの窒素原子（すなわち、～Ｎ－Ｒ_１）を含む。さらなるいくつかの他の実施形態では、窒素含有複素環は、２つの窒素原子を含む。窒素含有複素環は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、窒素含有複素環は、１つ又はそれ以上の環位置において、低級アルキル、置換低級アルキル、アラルキル、又は置換アラルキル、たとえば、ハロ置換低級アルキル又はハロ置換アラルキルなどで置換されている。いくつかの好ましい実施形態では、置換された窒素含有複素環は、一置換又は二置換されている。いくつかの特定の実施形態では、置換された窒素含有複素環は、一置換されている。いくつかのさらなるより特定の実施形態では、窒素含有複素環は、フルオロ置換低級アルキルで一置換されている。１つ又はそれ以上の追加の好ましい実施形態では、Ｒ_２が存在する（したがって、Ｒ_１－Ｎと一緒になった場合、窒素含有複素環を形成する）場合、Ｘも存在する。

【0094】

Ｒ_２をＲ_１と一緒にして形成される例示的な窒素含有複素環には、例示的な非置換窒素含有複素環について以下に示すように、アゼチジン、置換アゼチジン、ジアゼチジン、置換ジアゼチジン、ピロリジン、置換ピロリジン、イミダゾリジン、置換イミダゾリジン、ピペリジン、置換ピペリジン、モルホリン、置換モルホリン、ジアジナン（１，２－、１，３－、１，４－ジアジナン）置換ジアジナン、トリアジナン（１，２，３－、１，２，４－、１，３，５－）、置換トリアジナン、アゼパン、置換アゼパン、ジアゼパン（１，２－、１，３－、１，４－）、及び置換ジアゼパンなどが含まれ、

【化19】

は、－Ｃ（Ｙ）Ｚへの結合を示し、任意の１つ又はそれ以上の環位置は、上述した置換基を含むことができる。以下に示される例示的な窒素含有複素環は、ＰＯＬＹ－（Ｘ）_０，１～に結合した炭素又は窒素環原子において、水素がＰＯＬＹ－（Ｘ）_０，１～への結合によって置き換えられることが理解されるであろう。

【化20】

いくつかの好ましい実施形態では、Ｒ_２は、Ｒ_１と一緒になってピペリジン又は置換ピペリジンを形成する。いくつかの他の好ましい実施形態では、Ｒ_２は、Ｒ_１と一緒になってジアジナン又は置換ジアジナン、たとえば、ピペラジン又は置換ピペラジンなどを形成する。

【0095】

したがって、たとえば付随する実施例に提供される例示的なポリマー試薬は、式（Ｉ）による以下の窒素含有複素環：

【化21】

を含んで、対応するポリマー試薬：

【化22】

を形成する。たとえば、試薬２、７、８及び９を参照されたい。

【0096】

式（Ｉ）を参照して、Ｙは酸素（Ｏ）又は硫黄（Ｓ）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＹはＯである。

【0097】

上述したように、ポリマー試薬は、脱離基、Ｚを含む。脱離基は、置換反応などの反応中に分子の残りの部分から置き換えられる原子又は原子の集合（たとえば、官能基）である。脱離基、Ｚは、Ｚと一緒になって～Ｃ（Ｙ）により形成されるポリマー試薬の反応性基内に含まれ得る。たとえば、ヒスチジンアミノ基などのアミノ基を有する活性薬剤とのポリマー試薬の反応（たとえば、バイオコンジュゲーション反応において）後、Ｚは脱離基として機能する。適切な反応性基には、とりわけ、たとえば、テトラゾール、イソシアネート、イソチオシアネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、カルボジイミド、アシルアジド、カーボネート、ヨードエステル、フルオロフェニルエステル、ベンゾトリアゾール、及びパラ－ニトロフェニルカーボネートが含まれる。そのような反応性基の例としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル、ＮＨＳカーボネートエステル、スクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルグルタレート、パラ－ニトロフェニルカーボネート、及びベンゾトリアゾールカーボネートが挙げられる。適切な脱離基、Ｚとしては、とりわけ、たとえば、テトラゾール、イソシアネート、イソチオシアネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、アシルアジド、フルオロフェノール、ベンゾトリアゾール、ニトロフェノール、及びトリアゾールが挙げられる。

【0098】

１つ又はそれ以上の実施形態において、好ましい脱離基は、たとえば、フェニルテトラゾール及びベンゾトリアゾールなどのテトラゾールを含む。いくつかの特に好ましい実施形態では、脱離基は、置換ベンゾトリアゾール又はフェニルテトラゾール若しくは置換フェニルテトラゾール、たとえば５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール（ＢＴＭＰ）である。

【0099】

フェニルテトラゾール脱離基は、以下のような構造を有し得る：

【化23】

（式中、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ及びｋは、それぞれ独立して０又は１（０は非存在を示し、１は存在を示す）であり、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６及びＲ_７は、それぞれ独立してアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アラルキル、置換アラルキル、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から選択される）。たとえば、フェニルテトラゾール脱離基は、非置換（すなわち、、ｈ、ｉ、ｊ、及びｋは、それぞれ０である）であり得る。或いは、フェニルテトラゾールは、フェニル環上に（たとえば、炭素２（Ｃ２）に、炭素３（Ｃ３）に、又は炭素４（Ｃ４）に）単一の置換基を有し得る。いくつかのさらなる実施形態では、フェニル環は、２つの置換基（たとえば、炭素２（Ｃ２）及び炭素３（Ｃ３）に、炭素２（Ｃ２）及び炭素４（Ｃ４）に、炭素３（Ｃ３）及び炭素５（Ｃ５）に、炭素３（Ｃ３）及び炭素４（Ｃ４）に、又は炭素２（Ｃ２）及び炭素６（Ｃ６）に）を有した。フェニルテトラゾールはまた、フェニル環上に（たとえば、Ｃ２、Ｃ３及びＣ４に；又はＣ２、Ｃ３、及びＣ５に；又はＣ２、Ｃ３及びＣ６に；又はＣ２、Ｃ４、及びＣ６に；又Ｃ３、Ｃ４及びＣ５に；又はＣ３、Ｃ４、及びＣ６に）３つの置換基を有し得る。またいくつかのさらなる実施形態では、フェニルテトラゾール脱離基は、フェニル環上に（たとえば、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４及びＣ５に；又はＣ２、Ｃ３、Ｃ５及びＣ６に；又はＣ２、Ｃ３、Ｃ４及びＣ６に）４つの置換基を有し得る。さらなるいくつかの追加の実施形態では、フェニルテトラゾール脱離基は、フェニル環上に５つの置換基を有し得る。フェニル環上に１つを超える置換基を有する、上述したような置換フェニルテトラゾールに関して、置換基は、同じであってもよく、又は異なっていてもよい（又は組み合わせであってもよく、ここで２つ以上の置換基は同じであり、さらなる置換基は前者とは異なる）。いくつかの好ましい実施形態では、フェニル環上の１つ又はそれ以上の置換基は、トリフルオロメチルである。より特定の好ましい実施形態では、脱離基は、以下に示すような、Ｃ３及びＣ５にトリフルオロメチル置換基を有する二置換フェニルテトラゾール（すなわち、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール（ＢＴＭＰ））である：

【化24】

【0100】

例示的なヒスチジン選択的ポリマー試薬は、さらに表１及び実施例に記載される。表１に提供されるように、多様な構造的特徴を有するポリマー試薬が調製されている。本開示による例示的なポリマー試薬は、以下に示され、式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマー（好ましくはポリ（エチレングリコール）ポリマー）であり、ＬＧは、前述したような脱離基である：

【化25】

【0101】

より特定の例示的なポリ（エチレングリコール）ポリマー試薬は、以下を含む：

【化26】

【化27】

式中、各（ｎ）は、独立して：約２～約２，２７３；約４～約１８００；約１１～１５９０；約２３～約１３６３；約１１３～約５６８；約１１３～約６８２；約１１３～約１１３６；約２２７～約１３６３；約２２７～約１１３６；約４５４～約１１３６；約４５４～約９０９；及び約４５４～約１８１８からなる群から選択される範囲内にあり；ＬＧは、前述したような脱離基である。１つ又はそれ以上の好ましい実施形態では、脱離基は、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール（ＢＴＭＰ））である。

【0102】

作製方法
本明細書に記載される一般構造及び機能的特徴を有するヒスチジン選択的ポリマー試薬は、本開示に照らして従来の有機及びポリマー化学技術を用いて合成することができる。例示的なポリマー試薬１～８（及びそれらの対応するコンジュゲート）の合成は、付随する実施例に記載され；式Ｉによる追加のポリマー試薬は、同様に調製することができる。本明細書で例示したものとは異なる合成戦略及びアプローチも、本発明によるポリマー試薬の調製に使用することができ、本明細書に提供される構造及び支持情報に基づいて、そのような代替的な合成は、合成有機化学の当業者のレベルの範囲内であることが理解されるであろう。

【0103】

本開示によるヒスチジン選択的ポリマー試薬は、適切な水溶性ポリマー出発材料から調製することができる。好ましい実施例として水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールを採用し（任意の適切な水溶性ポリマーを同様に官能化することができると認識した上で）、対象ヒスチジン選択的ポリマー試薬は、ポリ（エチレングリコール）、又は好ましくはエンドキャップされたポリ（エチレングリコール）、たとえば、メトキシ（ポリエチレングリコール）などの出発材料から調製することができ、ここでポリマーは、本明細書に前述したように、直鎖、分岐などであり得、それにより～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－Ｎ（Ｒ_１）－Ｃ（Ｙ）－Ｚの特徴をポリマーに導入することができる。

【0104】

たとえば、式（Ｉ）によるポリマー試薬、たとえば、例示的な試薬１、３、４、５及び６（ここでＸ及びＲ_２は存在しない）の合成では、適切なポリ（エチレングリコール）出発材料、たとえばメトキシポリエチレングリコール（「ｍＰＥＧ－ＯＨ」）を、ヒドロキシ末端を良好な脱離基に変換するのに有効な試薬と反応させ得る。例示的な脱離基としては、トシレート（ｐ－トルエンスルホネート）、トリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）、メシレート（メタンスルホネート）、クロリド、ブロミドなどが挙げられ、対応する試薬を使用して導入することができる。たとえば、メトキシ（ポリエチレングリコール）を、末端ヒドロキシを良好な脱離基で置き換えるのに有効な条件下で、たとえば、メシル塩、トシル塩、若しくはトリフレート塩、たとえば、それぞれ塩化メシル、塩化トシル、若しくは塩化トリフレート、又は他の適切な試薬と反応させ得る。たとえば、実施例１．１を参照されたい。良好な脱離基を有する得られたポリマー中間体を、次いで適切なアミン（又は対応するアミン塩）と反応させることによって脱離基を置き換え、ポリマー試薬の対応する（～ＮＲ_１）部分を導入することができ、ここでＲ_１は有機基（本明細書の他の箇所に詳細に記載されている）であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成し得る。そのような変換は、単一の転換により行うことができ、又は１つを超える転換ステップを必要とし得る。いくつかの好ましい実施形態では、Ｒ_１は、低級アルキル、ハロ置換低級アルキル、ベンジル、又はハロ置換ベンジルであり、ベンジル環は１～５つのハロ置換基（たとえば、フルオロ、クロロ、又はブロモ）を有する。例示的なアミン試薬は、ＮＨ_２Ｒ_１（その塩形態を含む）を含む。反応は、塩基性条件下、たとえば、化学転換の詳細に応じて、約１１．０～１４．０、又は約１２～１４の範囲のｐＨで行うことができる。所望のポリマー－アミン中間体を次いで典型的には回収し、所望であればさらに精製することができる。例示として、メチルアミン塩酸塩を使用して試薬１のポリマーアミン中間体（ｍＰＥＧ－ＮＨＣＨ_３）を形成し；２－フルオロエチルアミン塩酸塩をアミン反応体として使用して試薬３のポリマーアミン中間体（ｍＰＥＧ－ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）を形成し；２，２－ジフルオロエチルアミンをアミン反応体として使用して試薬４のポリマーアミン中間体（ｍＰＥＧ－ＮＨＣＨ_２ＣＨＦ_２）を形成し、水酸化アンモニウムをアミン反応体として使用して試薬５の前駆体ポリマーアミン中間体、ｍＰＥＧアミンを形成した後、トリフルオロ酢酸無水物と反応させることによって、アミノ窒素上へのトリフルオロ酢酸塩基の導入を促進し、その後、適切な還元剤（たとえば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化ホウ素又はジボランなどのボラン）で還元して試薬５のポリマーアミン中間体、ｍＰＥＧ－ＮＨＣＨ_２ＣＦ_３を形成した。或いは、出発材料として使用される多様な分子量を有するＰＥＧアミンは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ又はＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの販売会社から購入することもできる。前駆体ＰＥＧアミン、ｍＰＥＧアミンはまた、ｍＰＥＧアミンを還元剤の存在下、ペンタフルオロベンゼン反応体、ペンタフルオロベンズアルデヒドと反応させることによって、試薬６のポリマーアミン中間体、ｍＰＥＧ－ＮＨＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５の調製に使用することができる。多様なＲ_１基を有する他のポリマーアミン中間体は、本明細書に記載されるポリマー試薬を調製するために同様に調製することができ、ここで適切なＲ_１基は、たとえば、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換シクロアルキル、置換及び非置換アルケニル、置換及び非置換シクロアルケニル、置換及び非置換アルキニル、置換及び非置換ヘテロアルキル、置換及び非置換シクロヘテロアルキル、置換及び非置換アリール、置換及び非置換アラルキル、置換及び非置換ヘテロアリール、並びに置換及び非置換ヘテロアラルキルを含み；より詳細には、例示的なＲ_１基は、たとえば、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、及びヘテロアラルキル（それぞれ、ハロ、アルキルハロ、ヒドロキシ、アルキルヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、スルフヒドリル、アルキルスルフヒドリル、ニトロ、アルキルニトロ、シアノ、アルキルシアノ、チオシアノ、アルキルチオシアノ、イミノ、アルキルイミノ、カルバメート、アルキルカルバメート、ホスフェート、アルキルホスフェート、アルキルカルボニル、カルボキサミド、アルキルカルボキサミド、アルコキシカルボニル、チオアルキル、チオエステル、及びアルキルチオエステルからなる群から独立して選択される１つ又はそれ以上の置換基で場合により置換される）を含む。

【0105】

例示的な試薬２、７、８及び９（ここでＸ及びＲ_２は両方とも存在し、さらにＸはエステル官能基、～ＯＣ（Ｏ）～を含み、Ｒ_１及びＲ_２は、一緒になって窒素含有複素環を形成する）などの試薬の合成では、対応するヒスチジン選択的試薬をポリ（エチレングリコール）活性化エステル出発材料、たとえばメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネート又はメトキシポリエチレングリコールクロロギ酸エステルから調製することができる。このような活性化水溶性ポリマー試薬を、次いでアミン含有化合物、たとえばアミン含有複素環と反応させて、対応するアミドを形成することができ、ここで試薬２及び９の場合と同様、得られたアミドアミノ基は窒素含有複素環（例示的な試薬２及び９の場合、ピペラジン）の一部を形成する。或いは、新たに形成されたアミド基の窒素原子は、窒素含有複素環の一部を形成しなくてもよいが、そこに近接し得（たとえば、試薬７を参照されたい）、又は、例示的な試薬８の場合のように、それと窒素含有複素環との間に、１つ又はそれ以上の介在する原子又は一連の原子を有し得る。例示的な試薬は、たとえば、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－、及び－ＯＣ（Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_１～６などのＸ基を含むが、Ｘはこの点に関して限定されない。

【0106】

活性化ＰＥＧエステルは、メトキシＰＥＧ－ＯＨ（又は任意の他の適切にエンドキャップされた水溶性ポリマー）から直接調製することができ、又はたとえば、Ａｘｉｓ Ｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）などの商業的供給源から購入することができる。ｍＰＥＧ活性化エステル試薬、たとえばｍＰＥＧ－ＳＣ（メトキシＰＥＧスクシンイミジルカーボネート、ｍＰＥＧ ＮＨＳエステルとも称される）の調製は、メトキシＰＥＧ－ＯＨを適切なエステル活性化剤、たとえばＮ、Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネートと適切な有機溶媒又は溶媒の混合物中で反応させることによって行うことができる。同様に、ｍＰＥＧクロロギ酸エステルは、メトキシＰＥＧ－ＯＨをホスゲンと適切な有機溶媒又は溶媒の混合物中で無水条件下で反応させることによって調製することができる。他の活性化ＰＥＧ試薬も同様に調製することができる。活性化ＰＥＧ試薬の形成後、場合によりリンカー、Ｘを介した窒素含有複素環の導入を行うことができ、又は代替的に、インサイチュ環形成反応を行うことができる。たとえば、ｍＰＥＧ活性化エステルをアミン含有複素環、好ましくは４、５、６又は７つの環原子を含むアミン含有複素環と反応させてＰＥＧ－Ｘ－Ｒ_２－ＮＲ_１Ｈを形成することができる。例示的な複素環としては、アゼチジン、置換アゼチジン、ジアゼチジン、置換ジアゼチジン、ピロリジン、置換ピロリジン、イミダゾリジン、置換イミダゾリジン、ピペリジン、置換ピペリジン、ジアジナン、置換ジアジナン、トリアジナン、置換トリアジナン、アゼパン、置換アゼパン、ジアゼパン及び置換ジアゼパンが挙げられるが、これらに限定されず；いくつかの好ましい複素環は、ピペリジン及びピペラジン（その置換形態を含む）を含む。実例的な実施例２では、ｍＰＥＧ活性化エステルを有機溶媒中で例示的な窒素含有複素環、ピペラジンと反応させて、対応する窒素含有複素環官能化ＰＥＧ中間体を形成する。実施例７では、ｍＰＥＧ活性化エステルを、ブチル化ヒドロキシトルエン及び塩基の存在下、不活性雰囲気下でアミノ置換窒素含有複素環、４－アミノピペリジンと反応させて、対応する窒素含有複素環官能化ＰＥＧ中間体を形成し、ここでピペリジンアミノ基は、非環アミノ基と活性化ＰＥＧ試薬とのカップリングを促進するために保護形態にあった。実施例８では、ｍＰＥＧ活性化エステルを、ブチル化ヒドロキシトルエン及び塩基の存在下、不活性雰囲気下でアミノ置換窒素含有複素環、より詳細には、アルキルアミノ置換窒素含有複素環、４－アミノメチルピペリジンと反応させて、対応する窒素含有複素環官能化ＰＥＧ中間体を形成し、ここでピペリジンアミノ基は、非環アミノ基と活性化ＰＥＧ試薬とのカップリングを促進するために保護形態にあった。実施例９では、活性化ＰＥＧ試薬、メトキシポリエチレングリコールクロロギ酸エステルを、塩基の存在下、有機溶媒中でハロアルキル置換基を含む窒素含有複素環、トリフルオロメチル－ピペラジンと反応させた。反応は不活性雰囲気下で行い；２－トリフルオロメチルピペラジン環の４－アミノ基は保護形態にあった。窒素含有複素環反応体、４－アミノ－ピペリジン（たとえば、保護形態にあり得る）、４－アミノメチル－ピペリジン（たとえば、保護形態にあり得る）、及び２－トリフルオロメチル－ピペラジン（たとえば、保護形態にあり得る）は例示であり；他の窒素含有複素環又は置換窒素含有複素環反応体を同様に使用して窒素含有複素環含有ＰＥＧ（又は他の適切な水溶性ポリマー）中間体

【化28】

を形成することができる。保護基の除去後（存在する場合）、次いで中間体を回収し、場合によりさらに精製することができる。たとえば、ＰＥＧ中間体は、たとえば、ＰＥＧ中間体の溶解度が低い又はＰＥＧ中間体が実質的に溶解性を有さない溶媒、たとえばエーテル（たとえば、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジエチルエーテルなど）、イソプロピルアルコール、又は類似の有機溶媒を使用して、沈殿後回収することができる。ＰＥＧ中間体の追加の精製も、クロマトグラフィーなどの従来の精製技術を用いて行うことができる。

【0107】

ポリマーアミン中間体、ＰＯＬＹ－（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－Ｎ（Ｒ_１）Ｈの形成後、カルボニル官能基（～Ｃ（Ｙ）～）を導入するアミノ基の官能化を、適切な反応体、たとえば、ホスゲン、ジホスゲン、又はトリホスゲンなどのホスゲンを用いて行うことができ；他の適切な反応体としては、金属カーボネート／ＣＯ_２、ジメチルカーボネート、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ベンゾトリアゾリルカーボネートなどが挙げられる。たとえば、対応するポリマーハロゲン化カルバモイル（たとえば、塩化カルバモイル）又は他のポリマーカルバモイル中間体を形成するための、カルボニル基の導入に続いて、所望であれば、反応性脱離基（Ｚ）を導入して所望のヒスチジン選択的ポリマー試薬を形成することができる。適切な反応性脱離基としては、とりわけ、たとえば、テトラゾール、イソシアネート、イソチオシアネート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル、塩化スルホニル、カルボジイミド、アシルアジド、カーボネート、ヨードエステル、エポキシド、フルオロフェニルエステル、無水物、ベンゾトリアゾール、及びパラ－ニトロフェニルカーボネートが挙げられる。好ましい脱離基としては、たとえば、置換ベンゾトリアゾール又は置換フェニルテトラゾール、たとえば５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール（ＢＴＭＰ）が挙げられる。

【0108】

調製されたら、ポリマー試薬を単離することができる。公知の方法、たとえば沈殿を用いてポリマー試薬を単離することができる。たとえば、減圧下での蒸発により、ポリマー試薬を含有する粗生成物の混合物から溶媒を除去又は実質的に除去して粗生成物の残留物を提供し、その後、ポリマー試薬の沈殿を達成するのに適した溶媒を加えることができる。ポリマー試薬の沈殿に適し得る溶媒としては、たとえば、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル及びジエチルエーテルなどのエーテル、並びにイソプロピルアルコールなどのアルコールが挙げられる。追加の精製が所望の場合、ポリマー試薬（及び、所望であれば、ポリマー試薬をもたらすポリマー中間体）は、当技術分野で公知の標準的な精製方法、たとえばクロマトグラフィーを用いてさらに精製することができる。適切なクロマトグラフィー方法としては、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、順相及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。

【0109】

試薬、反応条件、溶媒、温度、単離及び精製技術などを含む例示的な合成は、実施例１～９に提供される。

【0110】

コンジュゲート
本開示はまた、式（Ｉ）のポリマー試薬を、活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基とポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進するのに有効な条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ基を含む活性薬剤、たとえば生物学的に活性な薬剤又は表面と反応させることによって得ることができる／得られるコンジュゲートを含む。好ましい実施形態において、コンジュゲートは、水溶性ポリマー試薬と活性薬剤との間の結合が尿素－イミダゾリル又はチオ尿素－イミダゾリル部分を含み、且つイミダゾリル基が活性薬剤のヒスチジン残基の一部を形成するように、式（Ｉ）のポリマー試薬を、アミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含む活性薬剤と反応させることによって得ることができる／得られる。

【0111】

本開示によるコンジュゲートは、好ましくは式（ＩＩ）に対応する：

【化29】

（式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマー（たとえば、ポリ（エチレングリコール）又はメトキシポリ（エチレングリコール））であり；Ｘはリンカー部分であり；Ｒ_１は有機基であり、Ｒ_２と一緒になった場合、窒素含有複素環を形成することができ；Ｒ_２は、存在する場合、Ｒ_１と一緒になって窒素含有複素環を形成し；Ｙは、Ｏ及びＳから選択され；Ｒ’はＨ又は有機基であり、

【化30】

は、アミノ基（ＮＲ’）を含む活性薬剤である）。コンジュゲート成分ＰＯＬＹ、Ｘ、Ｒ_２、Ｒ_１及びＹは、上述し、且つ本明細書の他の箇所に記載されたあらゆる実施形態を包含する。水溶性ポリマーセグメント、ＰＯＬＹは、たとえば、約２００ダルトン～約８０，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約７０，０００ダルトン、又は約１，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約２，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、又は約５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約６０，０００ダルトン、又は約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン～約４０，０００ダルトン、又は約２０，０００ダルトン～約８０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有することができる。いくつかのより特定の実施形態では、ＰＯＬＹは、２００ダルトン、３００ダルトン、４００ダルトン、５００ダルトン、７５０ダルトン、１，０００ダルトン、２，５００ダルトン、３，０００ダルトン、５，０００ダルトン、７５００ダルトン、１０，０００ダルトン、１５，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、２５，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、４０，０００ダルトン、５０，０００ダルトン、５５，０００ダルトン、及び６０，０００ダルトンからなる群から選択される重量平均分子量を有する。好ましい実施形態において、～Ｎ－Ｒ’は、Ａと一緒になった場合、活性薬剤に含まれるヒスチジンのイミダゾリル環に含まれるアミンである。活性薬剤は、好ましくは、たとえば、小分子、ペプチド及びタンパク質を含む生物学的に活性な薬剤である。好ましくは、活性薬剤は、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質であり、これは天然に存在し得るか、又は、たとえば、部位指向性変異誘発などの公知のタンパク質工学技術を用いて標的タンパク質若しくはペプチドに（付加又は置換により）導入され得る。

【0112】

したがって、活性薬剤のヒスチジンとの反応により形成されるコンジュゲートについて、コンジュゲートは、好ましくは以下の式に対応するであろう：

【化31】

ここで、式（ＩＩ）を参照して、Ａ－ＮＲ’は、ヒスチジン残基（単一のアミノ酸として上記の式に示されるが、ヒスチジンはペプチド又はポリペプチド鎖内に含まれ得ることが理解される）を含む活性薬剤であり、ＰＯＬＹ、Ｘ、Ｒ_２、Ｒ_１、及びＹは、前述したとおりである。ペプチド又はポリペプチド（たとえば、タンパク質）内に含まれるヒスチジンをより詳細に示す式を、下記に示す：

【化32】

コンジュゲーションは、ヒスチジンイミダゾール環上のいずれかの窒素で行われ得、前述した構造は、両異性体を包含することが意図されることを理解するべきである。異性体コンジュゲート（ヒスチジンに対する共有結合の位置に関して）のそれぞれの構造を以下に提供し；イミダゾール環の窒素原子（Ｎε２）の立体障害が少ないと思われるため、すぐ下の構造に示される共有結合が好ましい可能性があることが想定されるが、他の環窒素、Ｎδ１（下記の第２の構造を参照）における置換も起こり得る。

【化33】

上記の２つの構造は、ペプチド又はポリペプチド鎖内（たとえば、アミノ酸の配列中）にヒスチジンを含む活性薬剤を包含することが意図されるが、さらに明確にするために、以下の２つの構造は、より長いアミノ酸配列内、たとえばペプチド又はポリペプチド中に含まれるヒスチジンの存在をより詳細に示す。

【化34】

【0113】

例示的なコンジュゲートは、たとえば

【化35】

【化36】

を含み、式中、「Ｈｉｓ」は、活性薬剤、Ａのヒスチジン残基であり、ＰＯＬＹは、前述したような水溶性ポリマーである。

【0114】

たとえば、ＰＯＬＹが直鎖ポリ（エチレングリコール）ポリマーの場合、コンジュゲートは：

【化37】

【化38】

から選択される構造を有することができる（式中、コンジュゲート１１～１８のそれぞれの（ｎ）は、独立して約２～約２，２７３（（ｎ）の前述した下位範囲及び特定の値を含む）の範囲であり；Ｈｉｓはヒスチジン残基であり、ここで結合は、ヒスチジン窒素原子にあり；Ａ－Ｈｉｓは活性薬剤、たとえば、ヒスチジン残基を含むペプチド又はタンパク質である。各（ｎ）の値は、たとえば、約４～約１８００；又は約１１～約１５９０；又は約２３～約１３６３；又は約１１３～約５６８；約１１３～約６８２；又は約１１３～約１１３６；又は約２２７～約１３６３；又は約２２７～約１１３６；又は約４５４～約１１３６；又は約４５４～約９０９；又は約４５４～約１８１８の範囲に含まれ得る。

【0115】

本明細書に記載されるポリマー試薬は、アミノ基を含む活性薬剤に対するコンジュゲーションに有用である。したがって、活性薬剤のコンジュゲートの調製方法も提供され、該方法は、本明細書に提供されるポリマー試薬を、活性薬剤の１つ又はそれ以上のアミノ基とポリマー試薬とのコンジュゲーションを促進するのに有効な条件下で、１つ又はそれ以上のアミノ基を含む活性薬剤と反応させることを含む。好ましくは、活性薬剤は、使用される反応条件下でポリマー試薬と反応し、それによりポリマーコンジュゲートを形成するアミノ基（「ヒスチジンアミノ基」）を含む１つ又はそれ以上のヒスチジン残基を含む。付随する実施例に示すように、たとえばペプチド又はタンパク質中のヒスチジンと選択的に反応するのに有効な、新規なポリマー試薬が本明細書に提供される。

【0116】

適切なコンジュゲーション条件は、タンパク質構造（活性薬剤がタンパク質の場合において）を実質的に維持すると共に、ポリマー試薬と活性薬剤とのコンジュゲーションを促す、時間、温度、ｐＨ、試薬濃度、ポリマー試薬の反応性、活性薬剤中の利用可能な官能基、溶媒などの条件を含む。さらに、付随する実施例に示すように、反応条件は、リシンよりもヒスチジンにおける、又は活性薬剤、たとえばタンパク質若しくはペプチドのＮ－末端におけるコンジュゲーションに有利なように調整され得る。当技術分野で公知のように、特定の条件は、とりわけ、活性薬剤、反応混合物中の他の材料の存在などに依存するであろう。任意の特定の場合においてコンジュゲーションを達成する反応条件は、本開示を読み、関連する文献を参照し、及び／又は日常的な実験を介して、当業者が決定することができる。

【0117】

たとえば、ヒスチジン残基（リシンよりも豊富でない）における選択的コンジュゲーションに有利にするために、コンジュゲーションは、タンパク質に対するポリマー試薬の少ないモル過剰、たとえば、ポリマー試薬の約１．１倍～２０倍のモル過剰を有するように、等モル未満（たとえば、約１：２０～約１：１０）のポリマー試薬と活性薬剤（たとえば、タンパク質）のモル比、又はポリマー試薬とタンパク質の約１：５、若しくは約１：２モル比からほぼ等モル（約１：１）を用いて行うことができる。ポリマー試薬と活性薬剤（たとえば、タンパク質）のさらなる例示的な比は、ポリマー試薬の約１．１倍～１０倍のモル過剰、又はポリマー試薬の約１．１倍～約５倍のモル過剰である。コンジュゲーションは、典型的には約０℃～約６０℃、又は約０℃～約４０℃、又は約０℃～約３０℃、又は約０℃～約１０℃であるが必ずしもそうではない幅広い温度にわたって行うことができる。反応は、たとえば、周囲温度で行うことができる。コンジュゲーション反応は、典型的には、適切な溶媒、たとえば、タンパク質又はペプチドのコンジュゲーションの場合、水性溶媒中で行われ；小分子との反応の場合、有機溶媒が使用され得る。コンジュゲーションは、適切な緩衝溶液、たとえば、リン酸ナトリウム、又は酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどのリン酸塩を含有する水溶液中で行うことができる。活性薬剤、たとえばタンパク質の濃度は、典型的には約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌの範囲である。反応のｐＨは、好ましくはわずかに酸性であり、約４．５～約６．８、又は約４．８～約６．８の範囲のｐＨである。ポリマー試薬の反応性及び活性薬剤の１つ又はそれ以上のヒスチジン残基のアクセス可能性に応じて、コンジュゲーションは、好ましくは約５．０～約６．８のｐＨで行われ得る。ポリマー試薬の反応性（Ｘ、Ｒ_２及びＲ_１に応じて）は変動し得るが、試薬のヒスチジン反応性は、一般に、表１に示すように、約４．５～約６．８の範囲、又はより詳細には約５．０～約６．５の範囲で、ｐＨの増加と共に増加する傾向に従うように思われる。スペーサー、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１～内に電子吸引基を含むポリマー試薬は、電子吸引基が存在しない同じ又は類似の構造を有するポリマー試薬よりも反応性が高いように思われる。したがって、コンジュゲーション反応に使用されるポリマー試薬の反応性、並びに反応変数及び条件に応じて、反応時間は、１時間未満～数時間の範囲、場合によっては２４時間まで、又はそれ以上でさえもあり得る。コンジュゲーション反応は、実質的にさらにコンジュゲーションが起こらなくなるまで進行させ、これは一般に、反応の進行を経時的に監視することによって決定され得る。反応の進行は、反応混合物からアリコートを様々な時点で引き出し、反応混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ若しくはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析又は任意の他の適切な分析方法により分析することによって監視することができる。形成されたコンジュゲートの量又は残留する未コンジュゲートポリマーの量についてプラトーに達したら、反応は完了したと見なされる。

【0118】

好ましくは、単一のヒスチジン、たとえば、表面アクセス可能なヒスチジンを含むタンパク質などの活性薬剤の場合、適切な反応条件下での本開示のポリマー試薬との反応は、主にヒスチジン結合ポリマー修飾タンパク質を含む生成物の混合物をもたらし、すなわち、形成されたコンジュゲートの大部分がヒスチジン結合位置異性体であり、たとえば、コンジュゲートの少なくとも約５０モルパーセント以上は、活性薬剤のヒスチジン残基に共有結合した（たとえば、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｙ）～を介して間接的に）ポリマー（ＰＯＬＹ）を含み、又はコンジュゲートの少なくとも約６０モルパーセント以上は、活性薬剤のヒスチジン残基に共有結合したポリマー（ＰＯＬＹ）を含む。場合によっては、形成されたコンジュゲートの大部分は、ヒスチジン結合位置異性体であり、たとえば、コンジュゲートの少なくとも約７５モルパーセント以上は、活性薬剤のヒスチジン残基に共有結合した（たとえば、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｙ）～を介して間接的に）ポリマー（ＰＯＬＹ）を含む。場合によっては、組成物は、水溶性ポリマーＰＯＬＹがヒスチジン残基のみで活性薬剤に共有結合したコンジュゲートを含むであろう。たとえば、例示的な組成物は、形成されたコンジュゲートの大部分がヒスチジン結合位置異性体であるものを含み、たとえば、コンジュゲートの少なくとも約５０モルパーセント以上が、活性薬剤のヒスチジン残基のみで共有結合した（たとえば、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｙ）～を介して間接的に）ポリマー（ＰＯＬＹ）を含み、又はコンジュゲートの少なくとも約６０モルパーセント以上が、活性薬剤のヒスチジン残基のみで共有結合したポリマー（ＰＯＬＹ）を含む。場合によっては、形成されたコンジュゲートの大部分は、ヒスチジン結合位置異性体であり、たとえば、コンジュゲートの少なくとも約７５モルパーセント以上が、活性薬剤のヒスチジン残基のみで共有結合した（たとえば、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｙ）～を介して間接的に）ポリマー（ＰＯＬＹ）を含む。

【0119】

付随する実施例に示し及び前述したように、ヒスチジンと反応することができるポリマー試薬が本明細書に提供される。たとえば、破線ボックスで示される、ＰＥＧ部分とＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する多様な例示的なスペーサー基（すなわち、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）を含む例示的なヒスチジン反応性ポリ（エチレングリコール）試薬、及び、実施例１０に記載されるように、５時間の反応時間における異なるｐＨ条件（５．０、５．５及び６．５）下で形成されたコンジュゲートのパーセントに基づくそれらの反応性の表を提供する図２を参照されたい。これらのデータは、対象ポリマー試薬のヒスチジン反応性の特徴を支持し、さらに、試薬の反応性が、所与の用途及び反応条件に適した最適な反応性のために、スペーサー部分の成分の選択によって効果的に調整することができることを示す。試薬の反応性は、一般に、所与の条件下でｐＨの増加と共に増加する傾向に従うように思われる。一例として、図３は、実施例１０に記載されるように、ＰＥＧ部分と、例示的な～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する多様なアミノ基（Ｘ）を含む例示的なヒスチジン選択的ポリ（エチレングリコール）試薬についての、２５℃でｐＨ５．０で経時的に形成されるヒスチジン結合コンジュゲートのパーセントを示すプロットである。同様に、図５、６及び７は、実施例１０に記載されるように、ＰＥＧ部分と、～Ｃ（Ｏ）ＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する多様なアミノ基（Ｘ）を含む例示的なヒスチジン選択的ポリ（エチレングリコール）試薬についての、２５℃でそれぞれｐＨ５．５、６．０及び６．５で経時的に形成されるヒスチジン結合コンジュゲートのパーセントを示すプロットである。図８及び９に示す結果も参照されたい。図８は、４つの異なるｐＨ（５．０、５．５、６．０及び６．５）でのｍＰＥＧ－４－アミノピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤとモデル化合物、カルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの反応性を示す。実施例１０に記載されるように、反応性は、たとえば、ｐＨを変化させることにより変更することができる。図に示すように、１０時間後、ｐＨ５．０、５．５、６．０及び６．５では、形成されたコンジュゲートのパーセント（％）は、それぞれ４．７、１５、５７及び９３であった。同様に、図９は、実施例１０に記載されるように、４つの異なるｐＨ（５．０、５．５、６．０及び６．５）におけるｍＰＥＧ－４－アミノメチルピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤと、モデル化合物、カルボキシベンジル（ＣＢＺ）－ヒスチジンとの反応性を示す。図に示すように、１０時間後、ｐＨ５．０、５．５、６．０及び６．５では、形成されたコンジュゲートのパーセントは、それぞれ２．０、７、３０及び６８であった。これらのデータはまた、ｍＰＥＧ－４－アミノピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール試薬と比較して相対的に低いｍＰＥＧ－４－アミノメチルピペリジン－Ｃ（Ｏ）－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール試薬の反応性を示し、ここで２つの試薬は、カルバメート窒素と、ピペリジン環の４－炭素との間に挟まれる～ＣＨ_２～基の非存在又は存在において異なり、それにより標的活性薬剤に対するポリマー試薬の選択、及び所望の用途を調整する能力を示している。

【0120】

選択的コンジュゲーションのための反応条件は、当業者によってさらに最適化することができる。本明細書に記載されるポリマー試薬のヒスチジン選択性の特徴をさらに支持するために、実施例１１及び１２は、例示的なポリマー試薬２が、使用される反応条件下で、モデル化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジン、α－ＣＢＺ－リシン、及びトリペプチド、ω－ＣＢＺ－リシン－グリシン－グリシン－ＯＨにおいてリシンよりもヒスチジンと選択的に反応する傾向を示す。たとえば、表２にまとめた結果を参照されたい。図１１は、リン酸緩衝液中２５℃で、異なるアミノ酸又はオリゴペプチド標的：α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨとモル比１：１０で反応させた際の、本明細書に提供される例示的なＰＥＧ試薬、試薬２（Ｒ_２は、－ＮＲ_１と一緒になった場合、ピペラジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は、～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ピペラジン－Ｃ（Ｏ）～である）の選択性を示す。結果は、実施例１１に記載されるように、本明細書に提供される試薬の、リシンよりもヒスチジンに対する顕著な選択性を示す。追加の証拠として、図１２は、リン酸緩衝液中２５℃、モル比１：１０で、異なるアミノ酸又はオリゴペプチド標的：α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ、α－ＣＢＺ－Ｌｙｓ、及びω－ＣＢＺ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨと反応した際の例示的なＰＥＧ試薬、試薬９（Ｒ_２と一緒になった場合、－ＮＲ_１はピペラジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ピペラジン－Ｃ（Ｏ）～である）の選択性を示す。結果はさらに、実施例１３に記載されるように、リシンと比較してヒスチジンに対する本明細書に提供される試薬の顕著な選択性を示す。本明細書に提供されるポリマー試薬のヒスチジン選択性のさらなる証拠を提供する、実施例１３に詳細に記載される試薬７（Ｒ_２と一緒になった場合、－ＮＲ_１はピペリジンを形成し、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）～）は～Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－ピペリジン－Ｃ（Ｏ）～である）のヒスチジン選択性を示す図１３も参照されたい。

【0121】

本ポリマー試薬との反応によって形成されるヒスチジン－コンジュゲートの別の顕著な特徴及び利点は、たとえば、図４に示すように、それらの加水分解安定性である。図４に示すように、ＰＥＧ部分と、ヒスチジンに対する共有結合との間に介在する多様なスペーサー部分（～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）－Ｈｉｓ）を含む例示的なヒスチジン結合ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートについての加水分解安定性研究の結果を示すプロットにより、及びさらに実施例１４に示すように、モデルヒスチジン含有化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジンと、本明細書に提供される例示的なヒスチジン選択的ポリマー試薬との反応によって形成されるコンジュゲートは、約８．０までのｐＨで水性緩衝液中で比較的安定である。評価され、他のコンジュゲートと比較して最も高い程度の加水分解安定性を示した尿素結合コンジュゲート、コンジュゲート１０、１７及び１８は、場合によりＲ_２（存在する場合）と組み合わされたＲ_１が、一般式

【化39】

を参照して、メチル及びピペリジンであるものである。試験した他のコンジュゲートと比較して中程度の加水分解安定性を有するコンジュゲート１１は、リンカーＸ、～ＯＣ（Ｏ）～に加えて、ピペラジン部分（Ｎと組み合わせてＲ_１及びＲ_２により形成された）を含む。試験した他のコンジュゲートと比較して中程度の加水分解安定性を同様に有するコンジュゲート１４は、Ｒ_１として、～ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＦ_３を有する。最後に、試験条件下で最も高い程度の加水分解を示すコンジュゲート、コンジュゲート１６は、リンカーＸ、～ＯＣ（Ｏ）～に加えて、トリフルオロメチル置換ピペラジン（Ｎと組み合わせてＲ_１及びＲ_２により形成された）を含む。得られたコンジュゲートの加水分解安定性（所与のｐＨ及び温度で、たとえば、生理学的条件又は生理学的条件を模倣する条件下で）は、Ｒ_１、Ｒ_２及びＸの選択による影響を受け、ここで電子吸引基の存在は、より高い程度の加水分解に寄与するように思われる。したがって、本明細書に一般に記載され、且つスペーサー全体、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１～内に１つ又はそれ以上の電子吸引基又は原子を含むコンジュゲートは、そのような電子吸引部分が存在しないコンジュゲートと比較した場合、減少した加水分解安定性を示すことが予想される。したがって、ポリマー試薬（ひいては、それとの反応によって形成されるコンジュゲート）は、Ｘ、Ｒ_２及びＲ_１などのポリマー試薬成分の適切な選択によって、所望の標的分子又は表面との反応に最適な反応性、選択性及びコンジュゲート安定性を有するように設計することができる。

【0122】

試験した例示的なコンジュゲートなどのヒスチジンコンジュゲートは、ヒドロキシルアミンで処理された場合、非コンジュゲートヒスチジン化合物が放出される逆反応を受ける。対照的に、ヒドロキシルアミンは、典型的には、リシン結合コンジュゲートと反応してリシン－ポリマー結合を切断することによって親リシン化合物を放出することはない。図１４Ａは、ヒスチジンコンジュゲート（試薬１とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製）とヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．４、２５℃）を示すプロットである。このプロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示している。このモデル反応では、約２２時間までに、１００％のコンジュゲートがα－ＣＢＺ－Ｈｉｓを放出して消失している。同様に、図１４Ｂは、異なるヒスチジンコンジュゲート（試薬２とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製）とヒドロキシルアミンとの反応（ｐＨ７．３、２５℃）を示す。このプロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示し、約４２時間において４％のみの無傷コンジュゲートが残留している。したがって、これらの実験は、ヒドロキシルアミンの存在下での形成されたコンジュゲートの破壊によって示されるように（リシン結合コンジュゲートでは典型的には起こらないであろう）、本明細書に提供されるポリマー試薬のヒスチジン選択性をさらに支持する。

【0123】

ペプチド又はタンパク質のイプシロンアミノ基（たとえば、リシン）に対するコンジュゲーションに有利であることを所望する場合、コンジュゲーション反応は塩基性条件下、たとえば、約７．５～約１０、又は約８．０～約１０の範囲のｐＨで行われ得る。

【0124】

反応時間は、典型的には、反応の進行を経時的に監視することによって決定される。コンジュゲーション反応の進行は、反応混合物からアリコートを様々な時点で引き抜き、反応混合物をＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ若しくはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析又は任意の他の適切な分析方法で分析することによって監視することができる。生成物の混合物は、クロマトグラフィー、ＭＡＬＤＩ、キャピラリー電気泳動、及び／又はゲル電気泳動などの分析方法を用いてさらに特徴付けることができる。

【0125】

次いで、得られた生成物の混合物を、好ましくは精製して、過剰なＰＥＧ若しくは他の試薬、未反応活性薬剤（たとえば、タンパク質又はペプチド）、他の可能な副生物の１つ若しくはそれ以上を低減若しくは除去し、又は異なる数の共有結合した水溶性ポリマーを有するポリマーコンジュゲートを分離する（適宜）。

【0126】

たとえば、コンジュゲート含有反応混合物を精製して、異なるコンジュゲート種を得／単離し、又は所望のコンジュゲート種、たとえば、ヒスチジン結合コンジュゲートにさらに富んだ組成物を提供することができる。

【0127】

所望であれば、異なる分子量を有するコンジュゲートを、ゲル濾過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離することができる。たとえば、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、異なる数の水溶性ポリマーと活性薬剤の比（たとえば、１－ｍｅｒ、２－ｍｅｒ、３－ｍｅｒなど、ここで「１－ｍｅｒ」は、活性薬剤に共有結合した（たとえば、ヒスチジン残基において）１つの水溶性ポリマーなどを示す）を有するコンジュゲートを、それらの異なる分子量に基づいて、分離することができる。

【0128】

ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて未反応ポリマー試薬及び異なる分子量を有するコンジュゲートを分離することができるが、このアプローチは一般に、タンパク質又は他の活性分子に対して異なる結合部位を有する位置アイソフォームを分離するのに有効ではない。このタイプの分離を行うのに適したゲル濾過カラムは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムを含む。特定のカラムの選択は、所望の分画範囲に依存するであろう。溶離は、一般に、リン酸塩、酢酸塩などの適切な緩衝液を使用して行われる。収集した画分は、多数の異なる方法、たとえば、（ｉ）タンパク質含有量についての２８０ｎｍでの吸光度、（ｉｉ）標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する染料ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含有量についてのヨウ素試験（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０７：６０－６３）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）、次いでヨウ化バリウムによる染色、及び（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析することができる。

【0129】

或いは、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、上述した分離／精製を行うことができる。たとえば、溶離に適した緩衝液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーを用いて、精製されたコンジュゲート組成物を提供することができる。カチオン交換カラム及び適切な担体は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを含む様々は供給業者から入手可能である。

【0130】

所望であれば、位置アイソフォームの分離は、適切なカラム（たとえば、Ａｇｉｌｅｎｔ又はＶｙｄａｃなどの会社から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用した逆相－高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いた逆相クロマトグラフィー、又はイオン交換カラム、たとえば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーによって行うことができる。このようなアプローチは、同じ分子量を有する位置異性体（すなわち、タンパク質に対する結合部位が異なる位置アイソフォーム、たとえば、ヒスチジン対リシン）の分離に使用することができる。

【0131】

得られたコンジュゲート、特にヒスチジン結合コンジュゲートは、生理学的ｐＨ（たとえば、図４参照）を含む幅広いｐＨ範囲にわたって安定であり、それにより容易なクロマトグラフィー精製が可能である。たとえば、ＰＥＧ部分と、共有結合したヒスチジン（モデル化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジンの）との間に介在する多様なスペーサー部分を含むヒスチジン結合ポリ（エチレングリコール）コンジュゲートの加水分解安定性が評価された、実施例１４に記載した結果を参照されたい。

【0132】

本開示はまた、本明細書に提供されるコンジュゲートと医薬賦形剤との組み合わせを含む医薬製剤も含む。一般に、コンジュゲート自体は、固体又は液体形態のいずれかであり得る１つ又はそれ以上の適切な医薬賦形剤と組み合わせることができる固体形態（たとえば、沈殿物）であろう。

【0133】

例示的な賦形剤としては、炭水化物、無機塩、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝液、酸、塩基、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0134】

医薬製剤は、全タイプの製剤、特に、注射に適したもの、たとえば、再構成できる粉末、並びに縣濁液及び溶液を包含する。組成物中のコンジュゲート（すなわち、本明細書に記載される活性薬剤とのポリマーとの間で形成されるコンジュゲート）の量は、いくつかの要因に応じて変動するが、最適には、組成物が単位用量容器（たとえば、バイアル）内に保存される場合、治療的有効用量であろう。加えて、医薬製剤は、注射器に収容され得る。治療的有効用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを生じるかを決定するために、増加する量のコンジュゲートを反復投与することによって実験的に決定することができる。

【0135】

組成物中の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性と、組成物の特定の必要性に応じて変動するであろう。典型的には、任意の個々の賦形剤の最適な量は、日常的な実験、すなわち、様々な量（少量～多量の範囲）の賦形剤を含有する組成物を調製し、安定性及び他のパラメーターを調べ、次いで有意な有害効果を有さずに最適なパフォーマンスを得る範囲を決定することによって決定される。

【0136】

しかしながら、一般に、賦形剤は、約１重量％～約９９重量％、好ましくは約５重量％～９８重量％、より好ましくは約１５～９５重量％の賦形剤の量で組成物中に存在するであろう。

【0137】

前述したこれらの医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」，（２０２０）、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」，ＰＤＲ，ＬＬＣ．，オンラインバージョン（２０２１）、及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，９^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｓｈｅｓｋｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｂ．Ｃ．，Ｍｏｓｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｇｏｌｄｆａｒｂ，Ｄ．Ｊ．，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０２０）に記載されている。

【0138】

本開示の医薬製剤は、必ずしもそうではないが、典型的には注射を介して投与され、したがって一般に、投与直前に液体溶液又は縣濁液である。医薬製剤はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形態であってもよい。経肺、直腸、経皮、経粘膜、経口、髄腔内、皮下、動脈内などの他の投与モードも含まれる。

【0139】

前述したように、コンジュゲートは、静脈内注射により非経口的に、又はあまり好ましくないが筋肉内若しくは皮下注射により投与することができる。非経口投与に適した製剤タイプには、とりわけ、注射の準備が整った（ｒｅａｄｙ－ｆｏｒ－ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）溶液、使用前に溶媒と組み合わされる乾燥粉末、注射の準備が整った縣濁液、使用前にビヒクルと組み合わされる乾燥不溶性組成物、並びに投与前に希釈されるエマルション及び濃縮液が含まれる。

【0140】

以下の実施例は、とりわけ、（ｉ）新規なヒスチジン選択的水溶性ポリマー試薬、（ｉｉ）そのような試薬の合成方法；（ｉｉｉ）リシンと比較してヒスチジンとの好ましい反応性／選択性、（ｉｖ）対象試薬との反応により形成されるコンジュゲート、及び（ｖ）対応するコンジュゲートの生理学的条件下での加水分解安定性を示す。

【0141】

本明細書において参照されるすべての論文、本、特許、特許公報、及び他の刊行物は、それらの全体が参照によって援用される。本明細書の教示及び参照によって援用される技術の間に矛盾が生じた場合、本明細書における教示及び定義の説明が、優先されるものとする（特に、本明細書に添付される請求項において使用される用語に関して）。たとえば、本出願及び参照によって援用される公報が、同じ用語を異なって定義する場合、用語の定義は、定義について書かれている本文の教示の範囲内にとどめられるものとする。

【実施例】

【0142】

前述の説明及び続く実施例が、本明細書において提供される本発明を例証し、その範囲を限定するものではないことを意図するものであることが理解されるべきである。本発明の範囲内にある他の態様、利点、及び変更は、当業者らに明らかであろう。

【0143】

材料及び方法
本開示は、特に明記しない限り、当業者によって理解され、文献において説明される有機合成の従来の技術及びその他同種のものを利用する。以下の実施例では、使用される数（たとえば量、温度等）に関して、正確さを確実にするように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差が、含まれるはずである。特に明記しない限り、温度は、摂氏度とし、気圧は、海面気圧又はその付近とする。

【0144】

試薬、反応条件、溶媒、温度、単離及び精製技術などを含む例示的な合成は、付随する実施例に提供され；これらの実施例は、限定ではなく例示を意図し、本開示に照らして式（Ｉ）による多様なポリマー試薬を調製するためのガイドラインを提供する。

【0145】

ヒスチジン結合コンジュゲートに関して、コンジュゲーションは、ヒスチジンイミダゾール環上のいずれの窒素（Ｎε２又はＮδ１）でも起こり得、示される構造は、両方の異性体が明示的に示されなくても、両方の異性体を包含することが意図されることを理解するべきである。

【0146】

ＰＥＧ試薬を除いて、すべての試薬は、特に明記しない限り、市販で得た。すべてのＰＥＧ原材料は、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬのＮｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから購入した。Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓで生成されたすべてのＮＭＲデータは、Ｂｒｕｋｅｒ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって製造された３００又は４００ＭＨｚ ＮＭＲシステムを使用して得た。

【0147】

略語：
ＡＣＮ アセトニトリル
ａｎｈ 無水
ＢＨＴ ブチル化ヒドロキシトルエン
ジ－ＢＴＣ ジベンゾトリアゾイルカーボネート
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＣＣ Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＡＰ ４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＥＤＡＣ ＨＣｌ １－エチル－３－（３’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ＨＣｌ
ＨＯＢＴ ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＭＴＢＥ メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＮＨＳ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
Ｐｙｒ ピリジン
ＲＢ 丸底
ＲＴ 室温、２０～２５℃
ＳＣ スクシンイミジルカーボネート
ＴＨＦ テトラヒドロフラン

【0148】

実施例１
ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａ（試薬１）の合成
１．１． ｍＰＥＧ－メシレート、５ｋＤａの調製

【化40】

ｍＰＥＧ－ＯＨ ５ｋＤａ（３０ｇ、６ｍｍｏｌ）を３００ｍＬのトルエンに溶解し、次いで溶媒を乾燥するまで留去した。残留物を３００ｍＬの無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、トリエチルアミン（１．２５ｍＬ、９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を窒素流下で５分間撹拌し、塩化メタンスルホニル（０．５１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら滴加した。反応混合物を窒素雰囲気下で周囲温度で一晩撹拌した。

【0149】

次に、溶媒を蒸発させ、６００ｍＬのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を加えることにより生成物を沈殿させた。沈殿物を真空濾過により収集し、減圧下で乾燥した。収量：２９．２ｇ；ＣＤＣＬ_３中の^１Ｈ ＮＭＲは、完全な置換を示した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ，ｐｐｍ ４．３８（ｍ，－ＣＨ_２－ＯＭｓ，２Ｈ），３．６５（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３８（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．０９ ｐｐｍ（ｓ，－ＣＨ_３ メシラート，３Ｈ）．

【0150】

１．２． ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_３）、５ｋＤａの調製

【化41】

メチルアミン塩酸塩（１９．５８ｇ、２９０ｍｍｏｌ）を１８０ｍＬのＤＩ水に溶解し、溶液を０～５℃に冷却した。１２０ｍＬのＤＩ水に溶解した水酸化ナトリウム（１１．６ｇ、２９０ｍｍｏｌ）を、メチルアミン塩酸塩溶液に加えた。次いで、１．０Ｍ ＮａＯＨを加えることによりｐＨを１３～１４に調整した。温度が周囲温度に上昇した後、ｍＰＥＧ－メシレート５ｋＤａ（２９ｇ、５．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で２日間撹拌した。

【0151】

次に、ＮａＣｌ（３０ｇ）を加え、生成物をＤＣＭ（１００ｍＬ、５０ｍＬ×２）で抽出した。抽出物を無水ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、溶媒を留去した。残留物をＩＰＡ／ジエチルエーテル（１：１；２５０ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を収集し、真空下で一晩乾燥した。収量：２７ｇ；純度約９０％（Ｄ_２Ｏ中の^１Ｈ ＮＭＲ）。

【0152】

ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量２３．５ｇ。Ｄ_２Ｏ中の^１Ｈ ＮＭＲによる純度１００％．^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：ｄ（ｐｐｍ）３．７３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．４１（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８４（ｔ，－ＣＨ_２－Ｎ－，２Ｈ），２．４３（ｓ，ＣＨ_３Ｎ－，３Ｈ）．

【0153】

１．３． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化42】

ｍＰＥＧ－メチルアミン５ｋＤａ（３．０ｇ、０．５９００ｍｍｏｌ）を２５０ｍＬの丸底フラスコ内の５０ｍＬのトルエンに溶解した。溶媒を減圧下で乾燥するまで留去した（ロータリーエバポレーター）。乾燥した残留物を１０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解した。４０ｍＬの無水トルエンを加えた後、９．０３ｍＬ（１．７８ｍｍｏｌ）のトルエン中のホスゲン溶液を加えた。次に、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0154】

溶媒を減圧下で乾燥するまで留去し、５０ｍＬのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加えることにより残留物（粗ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｃｌ ５ｋＤａ）を沈殿させた。沈殿物を真空濾過により収集し、減圧下で一晩乾燥して２．８５ｇの生成物を得た。ＣＤＣｌ_３中の^１Ｈ ＮＭＲによる純度９５．７％．^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ（ｐｐｍ）３．６４（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３８（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．２１及び３．１２（ｓ，ＣＨ_３Ｎ－，３Ｈ）．

【0155】

１．４． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化43】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｃｌ（２００ｍｇ、０．０４００ｍｍｏｌ）を、５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール（０．１２００ｍｍｏｌ）を含有するアセトニトリル溶液（１．２ｍＬ）に溶解した。ピリジン（０．４８ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0156】

次に、溶媒を減圧下で留去し、２０ｍＬ ＭＴＢＥを加えることにより生成物を沈殿させた。沈殿物を収集し、真空下で乾燥して１７２ｍｇの所望の生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ（ｐｐｍ）８．７２（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０３（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），３．６４（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３８（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．３６及び３．２８（ｓ，ＣＨ_３Ｎ－，３Ｈ）．

【0157】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0158】

実施例２
ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａ（試薬２）の合成
２．１． ｍＰＥＧ－スクシンイミジルカーボネート（ｍＰＥＧ－ＳＣ）５ｋＤａの調製

【化44】

ｍＰＥＧ－ＯＨ、５ｋＤａ（２０ｇ、４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのクロロホルムに溶解し、溶媒を乾燥するまで蒸発させた。残留物を１５０ｍＬの無水アセトニトリルに溶解した。次いで、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）（２．０５ｇ、８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌し、ピリジン（１．６１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0159】

反応混合物のサンプルをＮＭＲにより分析し、９０％置換を示し、その後、さらに追加の３０％の試薬を加えた（ＤＳＣ：０．６２ｇ；ピリジン：０．４８ｍＬ）。反応混合物を周囲温度で６時間撹拌した。次いで、溶媒を乾燥するまで蒸発させ、３００ｍＬのＩＰＡ／エチルエーテル（７：３）の混合物を加えることにより残留物を沈殿させた。沈殿物を収集し、真空下で一晩乾燥した。

【0160】

粗生成物を４０ｍＬのＤＭＦに溶解し（暖めながら）、１６０ｍＬのＭＴＢＥを加えることにより沈殿させた。沈殿物を収集し、１００ｍＬのジエチルエーテルで洗浄し、真空下で４時間乾燥して１７．３ｇの生成物を得た。

【0161】

１７．３ｇの生成物を２０ｍＬのＤＣＭに溶解し、０～５℃でＩＰＡ（２００ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を周囲温度で１５分間撹拌した。沈殿物を収集し、真空下で一晩乾燥した。収量：１６．２ｇ、純度：約１００％；ＤＣＳ及び遊離ＮＨＳなし（ＮＭＲ）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．４６（ｍ，－ＣＨ_２－Ｏ－ＮＨＳ，２Ｈ），３．６４（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３８（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８４（ｓ，－ＣＨ_２ＣＨ_２－，ＮＨＳ，４Ｈ）．

【0162】

２．２ ｍＰＥＧ－ピペラジン、５ｋＤａの調製

【化45】

ピペラジン（６８９ｍｇ、８．０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＤＣＭに溶解した。次に、ｍＰＥＧ－ＳＣ、５ｋＤａ（２．０ｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を溶液に加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、ＤＣＭを蒸発させ、４０ｍＬのＩＰＡを加えることにより残留物を沈殿させた。沈殿物を収集し、１０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：１．８９ｇ；末端基置換９３％；（ＨＰＬＣ）。

【0163】

ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＳカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量：１．２８ｇ；ＨＰＬＣは、１００％の置換を示した。
^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）：δ（ｐｐｍ）４．２３（ｍ，－ＣＨ_２－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－，２Ｈ），３．６８（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３６（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８０（ｍ，－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－，ピペラジン，４Ｈ）．

【0164】

２．３ ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化46】

ｍＰＥＧ－ピペラジン５ｋＤａ（１．２８ｇ、０．２６００ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのトルエンに溶解し、溶媒を乾燥するまで蒸発させた。残留物を１０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解した。ピリジン（０．０３ｍＬ、０．３８００ｍｍｏｌ）をＰＥＧ溶液に加え、混合物を窒素雰囲気下で０～５℃に冷却し、トリホスゲン（３７．９８ｍｇ、０．１３００ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）溶液で処理した。トリホスゲン溶液を加えた後、溶液を０℃で１時間、次いで周囲温度で一晩撹拌した。

【0165】

溶媒を減圧下で留去し、５０ｍＬのＭＴＢＥを加えた。得られた沈殿を濾去し、真空下で乾燥して１．２５ｇの所望の生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．２６（ｍ，－ＣＨ_２－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0166】

２．４ ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化47】

ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａ（５００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール（３ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液に溶解した。ピリジン（１．２ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0167】

混合物のアリコートをＨＰＬＣにより検査し、残った出発材料は示されなかった。溶媒を減圧下で留去し、残留物を５０ｍＬのＤＣＭに溶解した。この溶液を１０％ Ｈ_２ＮａＰＯ_４＋５％のＮａＣｌ（１０ｍＬ×２）の溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、濾過し、溶媒を乾燥するまで蒸発させた。４０ｍＬのＩＰＡを加えることにより粗生成物を沈殿させた。沈殿物を収集し、１０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄し、真空下で３時間乾燥して４３０ｍｇの所望の生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．７１（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０４（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），４．３０（ｍ，－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｎ－），３．６５（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３８（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0168】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0169】

実施例３
ＭＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａ（試薬３）の合成
３．１ ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）、５ｋＤａの調製

【化48】

２－フルオロエチルアミン塩酸塩（５ｇ、５０ｍｍｏｌ）をＤＩ水（１００ｍＬ）に溶解した後、ｐＨを１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１２．５に調整し、ｍＰＥＧ－メシレート５ｋＤａ（１０ｇ、２ｍｍｏｌ、実施例１．１に記載の手順により調製）を加えた。混合物を２０℃で６３時間撹拌した。次いで、溶液中で１０％ ＮａＣｌを形成するのに十分な量でＮａＣｌを加え、次いでＤＣＭ（５０ｍＬ×３）で抽出した。抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。固体を濾去し、濾液を乾燥するまで濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）から沈殿させた。粉末を濾過により収集し、ＩＰＡ（３０ｍＬ）で１回洗浄し、３００ｐｐｍのＢＨＴを含むＭＴＢＥで２回（２０ｍＬ×２）洗浄した。固体を真空下で１２時間乾燥した。収量：９．７ｇ。

【0170】

ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量：２．４５ｇ。ＨＰＬＣによる純度：９６．３％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）４．５０（ｔ，－ＣＨ_２－Ｆ，１Ｈ），４．３８（ｔ，－ＣＨ_２－Ｆ，１Ｈ），３．５０（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８３（ｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｆ，１Ｈ），２．７６（ｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｆ，１Ｈ），２．６８（ｔ，－ＣＨ_２－ＮＨ－，２Ｈ）．

【0171】

３．２ ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化49】

ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）、５ｋＤａ（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の３０ｍＬのトルエンに溶解した。溶媒を減圧下で乾燥するまで留去した。残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（２０ｍＬ）の混合物に溶解し、０℃でトルエン中２０％ホスゲン溶液（５．０ｍＬ）に加え、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0172】

反応溶液を乾燥するまで慎重に蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（１５ｍＬ）から沈殿させた。得られた生成物をアルゴン雰囲気下で濾過により収集し、ＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で６時間乾燥した。収量：０．９ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．６６（ｄｑ，－ＣＨ_２Ｆ，２Ｈ），３．９３（ｄｔ，－Ｎ（ＣＯ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｆ，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0173】

３．３ ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化50】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｆ）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａ（０．９ｇ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）に加え、次いでフラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた後、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールのアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ、５ｍＬ）（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン雰囲気下で周囲温度で４８時間撹拌した。溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加えた後、残留物を沈殿させた。粉末を濾過により収集し、ＩＰＡ（１０ｍＬ）及びＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で週末にわたり乾燥した。収量：９２０ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．６７（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０２（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），４．７６（ｔ，－ＣＨ_２－Ｆ，２Ｈ），４．０５（ｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨ_２Ｆ，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３６（ｓ，３Ｈ）．

【0174】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0175】

実施例４
ＭＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａ（試薬４）の合成
４．１ ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）、５ｋＤａの調製

【化51】

２，２－ジフルオロエチルアミン（５．６ｍＬ、７９ｍｍｏｌ）をＤＩ水（１００ｍＬ）に溶解した。１Ｎ ＮａＯＨを加えることにより溶液のｐＨを１２．５に調整し、次いでｍＰＥＧ－メシレート、５ｋＤａ（１０ｇ、２ｍｍｏｌ、実施例１．１に記載の手順により調製）を室温で加えた。混合物を５５～６０℃で６３時間撹拌した。溶液中１０％ ＮａＣｌを形成するのに十分な量でＮａＣｌを加えた後、ＤＣＭ（５０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥した。固体を濾去した後、濾液を乾燥するまで濃縮した。粗生成物をＭＴＢＥ（３０ｍＬ）から沈殿させ、濾過し、ＩＰＡ（１５ｍＬ）で洗浄した後、２００ｐｐｍ ＢＨＴを含むＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄した。得られた固体を真空下で１２時間乾燥した。収量：９．５ｇ。

【0176】

ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより生成物を精製した。収量：５．１ｇ。ＨＰＬＣによる純度：１００％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）５．９７（ｔ，－ＣＨＦ_２，１Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８９（ｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨＦ_２，２Ｈ），２．７０（ｂｓ，－ＣＨ_２－ＮＨ－，２Ｈ）．

【0177】

４．２ ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化52】

ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）、５ｋＤａ（３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の３０ｍＬのトルエンに溶解した。次いで、溶媒を減圧下で乾燥するまで留去し、残った残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を０℃でトルエン（９．０ｍＬ）中２０％ホスゲン溶液に加え、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0178】

溶媒を乾燥するまで慎重に蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（１５ｍＬ）から沈殿させた。沈殿した生成物をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：２．８ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）６．０３（ｔｔ，－ＣＨＦ_２，１Ｈ），３．９５（ｄｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨＦ_２，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0179】

４．３ ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化53】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）－ＣＯ－Ｃｌ ５ｋＤａ（２．６ｇ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）に加え；次いでフラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた。次に、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールのアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ、１０ｍＬ；Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン雰囲気下で周囲温度で４８時間撹拌した後、減圧下で乾燥するまで蒸発させることにより溶媒を除去した。残留物をＭＴＢＥ（２５ｍＬ）で沈殿させた。粉末を濾過により収集し、ＩＰＡ（１５ｍＬ）及びＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：２．４ｇ ^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．６９（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０３（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），６．２５（ｔ，－ＣＨＦ_２，１Ｈ），４．１３（ｔ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨＦ_２，２Ｈ），３．９０（ｔ，－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_２ＣＨＦ_２）－ＣＯ－，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３６（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0180】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0181】

実施例５
ＭＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール５ｋＤａ（試薬５）の合成
５．１ ｍＰＥＧ－ＮＨ_２、５ｋＤａの調製

【化54】

ｍＰＥＧ－メシレート５ｋＤａ（２０ｇ、４ｍｍｏｌ、実施例１．１に記載の手順により調製）を、塩化アンモニウム（３０ｇ）を含む水酸化アンモニウム（５００ｍＬ）と共に２５℃で４８時間撹拌した。ＮａＣｌ（５０ｇ）及びＤＩ水（２００ｍＬ）を反応混合物に加えた後、ＤＣＭ（１００ｍＬ×４）で抽出した。抽出物を合わせ、１Ｎ ＨＣｌ（０．５ｍＬ）で処理し、硫酸ナトリウム（１５ｇ）上で乾燥し、濾過した。濾液を乾燥するまで濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）から沈殿させた。粗生成物を濾過により収集し、ＩＰＡ（２５ｍＬ×２）で洗浄し、次いで２００ｐｐｍのＢＨＴを含むＭＴＢＥ（２５ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：１９．０ｇ。

【0182】

粗生成物の一部（１５ｇ）を、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した。収量１２．５ｇ。ＨＰＬＣによる純度：９８．５％。^１Ｈ－ＮＭＲによる置換：９３．０％。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．６５（ｔ，－ＣＨ_２－ＮＨ_２，２Ｈ）．

【0183】

５．２ ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＯＣＦ_３）、５ｋＤａの調製

【化55】

ｍＰＥＧ－アミン、５ｋＤａ（６．０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．８ｍＬ、１０ｅｑ）を無水ＤＣＭ（４５ｍＬ）中で混合した後、撹拌しながらトリフルオロ酢酸無水物（０．７２ｍＬ、４．５ｅｑ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、溶液を乾燥するまで濃縮した。得られた残留物を、ＭＴＢＥ（３０ｍＬ）を加えることにより沈殿させた。固体を濾過により収集し、ＩＰＡ（２０ｍＬ）及びＭＴＢＥ（２０ｍＬ×２）で洗浄した。得られた生成物を真空下で一晩乾燥した。収量：６．０ｇ。ＨＰＬＣによる純度：１００％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0184】

５．３ ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＦ_３）、５ｋＤａの調製

【化56】

ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＯＣＦ_３）、５ｋＤａ（６．０ｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びＢＨＴ（１０ｍｇ）の無水トルエン（２００ｍＬ）溶液を乾燥するまで共沸蒸留した。無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）をフラスコに加え、氷浴内で冷却した後、ＴＨＦ中のボラン溶液（０．９Ｍ、３０ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を滴加した。０℃で２時間撹拌した後、混合物をアルゴン雰囲気下で７２時間還流撹拌した。

【0185】

次に、反応混合物を室温に冷却し、メタノール（１００ｍＬ）を加え、混合物を還流下でさらに５時間撹拌した。溶媒の蒸発後、残留物を１０％ ＮａＣｌ水溶液に溶解した。溶液のｐＨを１Ｎ ＮａＯＨで１１に調整した。粗生成物をＤＣＭで３回（５０ｍＬ×３）抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ_４上で乾燥した。固体不純物を濾去した後、濾液を乾燥するまで蒸発させ、粗生成物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で沈殿させた。固体沈殿を濾過により収集し、ＢＨＴ（３０ｍｇ）を含むＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：５．７ｇ。

【0186】

次に、生成物を１Ｎ ＮａＯＨ（３０ｍＬ）に溶解し、溶液を室温で一晩撹拌し、上述した後処理により単離した。最後に、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより生成物を精製した。収量：１．５ｇ。ＨＰＬＣによる純度：１００％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｍ，－ＯＣＨ_３ ＆ －Ｎ－ＣＨ_２－ＣＦ_３，５Ｈ），２．７５（ｑ，－ＣＨ_２－ＮＨ－，２Ｈ），２．２５（ｍ，－ＮＨ－）．

【0187】

５．４． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化57】

ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＦ_３）５ｋＤａ（０．９ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の３０ｍＬのトルエンに溶解した。次に、溶媒を減圧下で乾燥するまで留去した。残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（２０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を０℃で、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈したトルエン（５．０ｍＬ）中２０％ホスゲン溶液に加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0188】

反応溶液を乾燥するまで慎重に濃縮した。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）から沈殿させた。生成物をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥ（５ｍＬ×２）で２回洗浄し、真空下で３時間乾燥した。収量：０．８４ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．３４（ｑ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＦ_３，１Ｈ），４．２１（ｑ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＦ_３，１Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0189】

５．５ ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化58】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａ（０．８４ｇ）を丸底フラスコ（２５ｍＬ）に加えた。次いで、フラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた後、アセトニトリル中の５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール溶液（０．２５Ｍ、５ｍＬ；Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン雰囲気下で周囲温度で４８時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加えることにより残留物を沈殿させた。生成物を濾過により収集し、ＩＰＡ（１０ｍＬ）で洗浄した後、ＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で５時間乾燥した。収量：０．８０ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．７０（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０３（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），４．６８（ｂｒ，－Ｎ－ＣＨ_２－ＣＦ_３，２Ｈ），３．９６（ｓ，－ＣＨ_２－Ｎ－ＣＨ_２ＣＦ_３，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0190】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0191】

実施例６
ＭＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール５ｋＤａ（試薬６）の合成
６．１． ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）５ｋＤａの調製

【化59】

ｍＰＥＧ－アミン、５ｋＤａ（３ｇ、０．６ｍｍｏｌ、実施例５．１に記載の手順により調製）、ペンタフルオロベンズアルデヒド（７００μＬ、１０ｅｑ）及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５０ｍｇ、４．２ｅｑ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中で混合した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で３０℃で蒸発させた後、残留物をＭＴＢＥ（２０ｍＬ）で沈殿させた。固体を濾過により収集し、ＩＰＡ（１５ｍＬ）、次いでＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で順次洗浄した。フィルターケーキを真空下で２時間乾燥した。収量：３．１ｇ。ＨＰＬＣによる純度：９０％。

【0192】

ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量：１．４ｇ。ＨＰＬＣによる純度：９６．５％；^１Ｈ－ＮＭＲによる置換：約１００％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）３．８２（ｓ，－Ｎ－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｆ_５，２Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．６２（ｔ，－ＣＨ_２－Ｎ－，２Ｈ）．

【0193】

６．２． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化60】

ｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）、５ｋＤａ（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の３０ｍＬのトルエンに溶解した後、溶媒を蒸留により減圧下で乾燥するまで除去した。残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を０℃でトルエン（９．０ｍＬ）中の２０％ホスゲン溶液に加え、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0194】

溶媒を乾燥するまで慎重に蒸発させた。次いで、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加えることにより残留物を沈殿させた。粉末をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥで２回（１０ｍＬ×２）洗浄し、真空下で６時間乾燥した。収量：１．０ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．９３（ｓ，－Ｎ－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｆ_５，１Ｈ），４．７６（ｓ，－Ｎ－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｆ_５，１Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格 ＆ －ＣＨ_２－Ｎ－ＣＯＣｌ），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0195】

６．３． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化61】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２Ｃ_６Ｆ_５）－ＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａ（１．０ｇ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）に加え、次いでフラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた。次に、アセトニトリル（０．２５Ｍ、５ｍＬ）中の５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾールの溶液（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。次いで、撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン下で周囲温度で４８時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ）を加えることにより残留物を沈殿させた。生成物を濾過により収集し、ＩＰＡで３回（１０ｍＬ×３）、ＭＴＢＥで２回（１０ｍＬ×２）洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：０．８５ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．７８（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０２（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），５．０４（ｂｓ，－Ｎ（ＣＯ）－ＣＨ_２－Ｃ_６Ｆ_５，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0196】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0197】

実施例７
ＭＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（ピペリジン－４－イル）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール５ｋＤａ（試薬７）の合成
７．１． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（ピペリジン－４－イル）５ｋＤａの調製

【化62】

ステップ１． ４－アミノ－１－Ｂｏｃ－ピペリジン（２．２ｇ、１１ｍｍｏｌ）及びＢＨＴ（２０ｍｇ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した後、ｍＰＥＧ－ＳＣ ５ｋＤａ（５．５ｇ、１．１ｍｍｏｌ、実施例２．１に記載の手順により調製）及びＴＥＡ（４ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下で周囲温度で一晩撹拌した。溶液を乾燥するまで濃縮し、生成物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で沈殿させた。固体を濾過により収集し、ＩＰＡで１回（２５ｍＬ）、次いでＭＴＢＥで２回（２５ｍＬ×２）洗浄した。固体を真空下で１時間乾燥した。収量：５．４ｇ。

【0198】

ステップ２． 得られた固体及びＢＨＴ（５０ｍｇ）をジオキサン（１０ｍＬ）に溶解し、氷浴内で冷却した。撹拌している間、ジオキサン中ＨＣｌ（４Ｍ、１５ｍＬ）を縣濁液にゆっくり加え、混合物を０℃で周囲温度まで一晩撹拌した。溶液を乾燥するまで濃縮した。残留物をＤＩ水（２００ｍＬ）に溶解し、Ｎａ_２ＣＯ_３（２０ｇ）を用いて溶液のｐＨをｐＨ１０．５～１１に調整した。塩化ナトリウムを加えることにより１０％ ＮａＣｌに飽和させた後、溶液をＤＣＭ（４０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ_４上で乾燥した。固体を濾去した後、濾液を乾燥するまで蒸発させた。ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量：３．５ｇ；ＨＰＬＣによる純度：９８．３％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）４．０３（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格 ＆ －Ｎ－ＣＨ＜），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．８８（ｄｄ，ＮＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ），２．４４（ｄｄ，ＮＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ），１．６４（ｄｄ，－ＮＨＣＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ），１．２９（ｍ，－ＮＨＣＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0199】

７．２． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（１－ＣＯＣｌ－ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａの調製

【化63】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａ（６１０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の５０ｍＬのトルエンに溶解した。次に、溶媒を減圧下で乾燥するまで留去した。残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を０℃で、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈したトルエン中２０％ホスゲン溶液（５．０ｍＬ）に加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0200】

溶媒を乾燥するまで慎重に蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（３０ｍＬ）で沈殿させた。生成物をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥで２回（１５ｍＬ×２）洗浄し、真空下で３時間乾燥した。収量：５４０ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ（ｐｐｍ）４．２１－４．２４（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－ ＆ －ＣＨ_２（－ＣＨ_２）Ｎ－ＣＯＣｌ，４Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格 ＆ －ＯＣＯＮＨ－ＣＨ＜），３．３６（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．２－３．０（ｄｔ，－ＣＨ_２（－ＣＨ_２）Ｎ－ＣＯＣｌ，２Ｈ），２．００（ｂｒ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ），１．４４（ｂｒ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0201】

７．３． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（ピペリジン－４－イル）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化64】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（１－ＣＯＣｌ－ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａ（０．５４ｇ）を丸底フラスコ（２５ｍＬ）に加え、フラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた。次に、アセトニトリル中の５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール溶液（０．２５Ｍ、５ｍＬ；Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン下で周囲温度で２４時間撹拌した。溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残留物をＭＴＢＥ（４０ｍＬ）で沈殿させた。生成物を濾過により収集し、ＩＰＡで１回（３０ｍＬ）洗浄し、次いでＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で２回洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：０．４９ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）８．６５（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．４３（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），７．４４（ｓ，－ＮＨ－，１Ｈ），４．２１（ｄ，－ＮＨ－ＣＨ＜，１Ｈ），４．０６（ｓ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格 ＆ －（ＣＨ_２）_２－Ｎ－ＣＯ－），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），１．９９－１．８０（ｄｄ，ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ），１．５３（ｍ，ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0202】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0203】

実施例８
ＭＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール５ｋＤａ（試薬８）の合成
８．１． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａの調製

【化65】

４－アミノメチル－１－Ｂｏｃ－ピペリジン（２．２ｇ、１１ｍｍｏｌ）及びＢＨＴ（２０ｍｇ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解した後、ｍＰＥＧ－ＳＣ ５ｋＤａ（５．０ｇ、１ｍｍｏｌ、実施例２．１に記載した手順により調製）及びＴＥＡ（４ｍＬ、２９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン雰囲気下で周囲温度で一晩撹拌した。次に、溶媒を蒸留により乾燥するまで除去した。粗生成物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で沈殿させ、濾去し、ＩＰＡ（２５ｍＬ）及びＭＴＢＥ（２５ｍＬ×２）で洗浄し、次いで真空下で２時間乾燥した。収量：４．７７ｇ。

【0204】

粗生成物及びＢＨＴ（２０ｍｇ）をジオキサン（５ｍＬ）に溶解した後、氷浴内で冷却しながらジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（２０ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌しながら０℃から周囲温度に一晩暖めた。溶媒の蒸発後、残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）から沈殿させた。濾過後、フィルターケーキを１００ｍＬのＤＩ水に溶解した。Ｎａ_２ＣＯ_３を使用して溶液のｐＨをｐＨ１１に調整した。ＮａＣｌで１０％ ＮａＣｌまで飽和させた後、溶液をＤＣＭで３回（４０ｍＬ×３）抽出した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で沈殿させた。粗生成物を濾過により収集し、真空下で２時間乾燥した。重量：４．６ｇ。

【0205】

ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。重量：３．３ｇ。ＨＰＬＣによる純度：９８．８％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）４．０３（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），２．９０（ｄｔ，－ＣＯＮＨ－ＣＨ_２－，２Ｈ），２．８２（ｔ，－ＣＨ_２－ＮＨ（ＣＨ_２－），２Ｈ），２．３７（ｄｔ，－ＣＨ_２－ＮＨ（ＣＨ_２－）－，２Ｈ），１．５５（ｂｄ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ），１．４５（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＣＨ＜，１Ｈ），０．９７（ｄｑ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0206】

８．２． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（１－ＣＯＣｌ－ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａの調製

【化66】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａ（５００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の５０ｍＬのトルエンに溶解した。次に、溶媒を蒸留により減圧下で乾燥するまで除去した。残留物を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）及び無水トルエン（３０ｍＬ）の混合物に溶解し、得られた溶液を、トルエン（５．０ｍＬ）中２０％ホスゲンの溶液に０℃で加え、無水トルエン（３０ｍＬ）で希釈した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0207】

次に、溶媒を乾燥するまで慎重に蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）から沈殿させた。生成物をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥ（１５ｍＬ×２）で２回洗浄し、真空下で３時間乾燥した。収量：４００ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ（ｐｐｍ）５．００（ｔ，－ＯＣＯＮＨ－，１Ｈ），４．３４（ｄ，－ＯＣＯＮＨ－ＣＨ_２－，２Ｈ），４．２０（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．０８－２．８６（ｍ，－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＯＣｌ）－ＣＨ_２－４Ｈ），１．７７（ｂｒ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，３Ｈ），１．２４（ｂｒ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）－ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0208】

８．３． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａの調製

【化67】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（１－ＣＯＣｌ－ピペリジン－４－イル）、５ｋＤａ（０．４０ｇ）を丸底フラスコ（２５ｍＬ）に加え、次いでフラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた後、アセトニトリル中の５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール溶液（０．２５Ｍ、５ｍＬ；Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（１ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液を周囲温度でアルゴン雰囲気下で７２時間撹拌した。次に、溶媒を蒸留により減圧下で乾燥するまで除去した。残留物をＭＴＢＥ（４０ｍＬ）から沈殿させ、濾過により収集し、ＩＰＡで１回（３０ｍＬ）６０分間、ＭＴＢＥで２回（１５ｍＬ×２）洗浄し、真空下で３時間乾燥した。収量：０．３８ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）８．６９（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．０２（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），５．０６（ｔ，－ＣＯＮＨ－，１Ｈ），４．５５（ｄ，－ＣＯＮＨ－ＣＨ_２－，１Ｈ），４．２１（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．２０（ｂｒ，－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_２－）－ＣＯ－，４Ｈ），２．０１（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，１Ｈ），１．８４（ｂｒ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ），１．４２（ｔ，－ＣＨ（ＣＨ_２－）ＣＨ_２－，２Ｈ）．

【0209】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0210】

実施例９
ＭＰＥＧ－ＯＣＯ－（２－ＣＦ_３－ピペラジン－１－イル）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール、５ｋＤａ（試薬９）の合成
９．１． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－Ｃｌ、５ｋＤａの調製

【化68】

ｍＰＥＧ－ＯＨ ５ｋＤａ（４．０ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１００ｍＬ）に溶解した。次に、溶媒を乾燥するまで留去した。残留物を無水トルエン（２０ｍＬ）及び無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）の混合物に溶解した。溶液をアルゴン雰囲気下で撹拌しながら、トルエン中２０％－ホスゲン溶液（２ｍＬ、５ｅｑ）を加え、混合物をアルゴン下で周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を乾燥するまで慎重に蒸発させ、次いで粗生成物をＭＴＢＥ（１００ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を濾過により収集し、ＭＴＢＥ（５０ｍＬ×２）で洗浄した。生成物を真空下で３時間乾燥した。収量：４．０ｇ。ＮＭＲは、９２．３％置換を示した。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）４．４４（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－Ｃｌ，２Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0211】

９．２． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－（２－ＣＦ_３－ピペラジン－１－イル）５ｋＤａの調製

【化69】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－Ｃｌ ５ｋＤａを無水ＤＣＭ（２５ｍＬ）に溶解した。アルゴン下で撹拌しながら、４－Ｂｏｃ－２－トリフルオロメチル－ピペラジン（２５０ｍｇ、１．３ｅｑ）及び無水ピリジン（３ｍＬ）を順次加えた。反応混合物を周囲温度でアルゴン雰囲気下で一晩撹拌した。濃縮後、残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）から沈殿させた。固体を濾過により収集し、ＩＰＡで２回（２５ｍＬ×２）、２時間洗浄した。粉末を再度濾過により収集した。フィルターケーキをＭＴＢＥ（２５ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：３．８ｇ。

【0212】

得られた粉末及びＢＨＴ（２０ｍｇ）をジオキサン（１０ｍＬ）に溶解した後、氷浴内で冷却しながらジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（１５ｍＬ）を加えた。溶液を撹拌しながら０℃から周囲温度に一晩暖めた。溶媒の蒸発後、残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を濾過により収集し、次いで１００ｍＬのＤＩ水に溶解した。溶液のｐＨをＮａ_２ＣＯ_３を使用して１１に調整した。溶液を１０％ ＮａＣｌに飽和させた後、ＤＣＭ（４０ｍＬ×３）を用いた抽出により生成物を回収した。合わせた抽出物をＭｇＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、濾液を乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍＬ）で処理した。固体を濾過により収集し、真空下で２時間乾燥した。収量：３．７ｇ。ＨＰＬＣによる純度：２５．８％。

【0213】

次いで、ＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラムを使用するカチオン交換クロマトグラフィーにより残留物を精製した。収量：７２０ｍｇ。ＨＰＬＣによる純度：１００％。^１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）４．５４（ｂｒ，ＣＦ_３－ＣＨ－，１Ｈ），４．１６（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．８２（ｄ，－ＣＯ－Ｎ（ＣＨ－）－ＣＨ_２－，１Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．１９（ｄ，－ＣＯ－Ｎ（ＣＨ－）－ＣＨ_２－，１Ｈ），２．９０－２．８０（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－，３Ｈ），２．５４（ｔ，－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－，１Ｈ）．

【0214】

９．３． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－（４－ＣＯＣｌ－２－ＣＦ_３－ピペラジン－１－イル）、５ｋＤａの調製

【化70】

ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－（２－ＣＦ_３－ピペラジン－１－イル）、５ｋＤａ（３１０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ（１００ｍＬ）内の１５ｍＬのトルエンに溶解した。次いで、溶媒を減圧下で乾燥するまで留去した。次に、残留物を無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び無水トルエン（３０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を、トルエン（５．０ｍＬ）中の２０％ホスゲン溶液に０℃で加え、無水トルエン（５ｍＬ）で希釈した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0215】

反応溶液を乾燥するまで慎重に蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（２０ｍＬ）から沈殿させた。生成物をアルゴン下で濾過により収集し、ＭＴＢＥ（１０ｍＬ×２）で洗浄し、真空下で４時間乾燥した。収量：２３０ｍｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：ｄ（ｐｐｍ）４．８１（ｂｒ，ＣＦ_３－ＣＨ－，１Ｈ），４．６４（ｂｒ，－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＯＣｌ）－，１Ｈ），４．３２（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－Ｎ＜ ＆ －ＣＨ_２－Ｎ（ＣＯＣｌ）－，４Ｈ），４．１５（ｂｒ，＞Ｎ－ＣＨ_２－，１Ｈ），３．６３（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３７（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．２６－３．０２（ｍ，＞Ｎ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＯＣｌ）－，３Ｈ）．

【0216】

９．４． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－（１－（２－ＣＦ_３－ピペラジニル）－４－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）、５ｋＤａの調製

【化71】

ｍＰＥＧ－（４－クロロカルボニル－２－トリフルオロメチル－ピペラジン－１－イル）－カルボキシレート５ｋＤａ（０．２３ｇ）を丸底フラスコ（２５ｍＬ）に加えた。次いで、フラスコを隔膜でキャップし、アルゴンを入れた後、アセトニトリル中の５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－２Ｈ－テトラゾール溶液（０．２５Ｍ、５ｍＬ；Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ４２（登録商標）溶液；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。撹拌している間、無水ピリジン（０．５ｍＬ）を注射器を介して加えた。溶液をアルゴン雰囲気下で周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。生成物をＭＴＢＥ（４０ｍＬ）で沈殿させた。沈殿物を濾過により収集し、ＩＰＡで１回（３０ｍＬ）３０分間、ＭＴＢＥで２回（１０ｍＬ×２）洗浄し、真空下で一晩乾燥した。収量：０．１７ｇ。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ（ｐｐｍ）８．６７（ｓ，Ａｒ，２Ｈ），８．４５（ｓ，Ａｒ，１Ｈ），４．９５（ｂｒ，ＣＦ_３－ＣＨ－，１Ｈ），４．２２－３．９６（ｂｒ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－ ＆ ＣＦ_３ＣＨ－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＯ－）－，４Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ）．

【0217】

本明細書に記載の多様な分子量のＰＥＧ出発材料を使用して、上記の例示的な合成を適切に行うことができる。

【0218】

実施例１０
ＰＨ５．０、５．５、６．０及び６．５で２５℃での試薬１～９のα－ＣＢＺ－ヒスチジンとの反応性（１：１０） － ヒスチジン反応性の検討
試薬１との例示的な反応：

【化72】

例示的なヒスチジン含有モデル化合物としてのα－ＣＢＺ－ヒスチジン（５．７９ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、５つの異なるｐＨ（５．０、５．５、６．０及び６．５）の１．０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解した。試薬１（ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）（１０ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を各溶液に加えた。得られた混合物を２５℃で撹拌し、異なる時間間隔でＲＰ－ＨＰＬＣにより分析した。

【0219】

前段落のｐＨ範囲で、２５℃でα－ＣＢＺ－ヒスチジンとの試薬２～９の反応性評価を行った。結果を表１（図２）にまとめ、図３（ｐＨ５．０）、図５（ｐＨ５．５、４コンジュゲート）、図６（ｐＨ６．０、４コンジュゲート）、図７（ｐＨ６．５、４コンジュゲート）、図８（試薬７の反応性）、及び図９（試薬８の反応性）に示した。

【0220】

【表1】

【0221】

上記の表に示すように、ポリマー部分と例示的なＢＴＭＰ－テトラゾール（又は他の適切な）脱離基との間に介在する異なるスペーサー部分（すなわち、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１－Ｃ（Ｏ）－ＢＴＭＰ－テトラゾール）全体を有する本開示による例示的な試薬は、一連のｐＨ条件下で評価した場合、ヒスチジン含有反応体と異なる反応性を有する。これらのデータは、本明細書に記載されるポリマー試薬の特徴がヒスチジン反応性であることを支持し、さらに、所与の用途及び反応条件に適した最適な反応性を達成するために、スペーサー部分の成分の選択によって試薬の反応性を効果的に調整できることを示す。理解し得るように、試薬の反応性は、一般に、所与の条件下で、ｐＨの増加と共に増加する傾向に従うように思われる。

【0222】

実施例１１
ＰＨ５．０及び５．５で２５℃でのα－ＣＢＺ－リシンとの試薬２のコンジュゲーション（１：１０） － リシン反応性の検討

【化73】

例示的なリシン含有反応体としてのα－ＣＢＺ－リシン（５．６１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、それぞれｐＨ５．０及び５．５の、それぞれ１．０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液に溶解した。試薬２（ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール））（１０ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を各溶液に加えた。得られた溶液を２５℃で撹拌し、異なる時間間隔でＲＰ－ＨＰＬＣにより分析した。結果を以下の表に提供する。

【0223】

【表2】

【0224】

表２の結果から明らかであり得るように、モデル化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジン、α－ＣＢＺ－リシン及びトリ－ペプチド、ω－ＣＢＺ－リシン－グリシン－グリシン－ＯＨ（以下の実施例１２に記載）を用いて行った反応により証明されるように、例示的な試薬２は、示される反応条件下で、アミノ酸、リシンとの反応と比較して、アミノ酸、ヒスチジンとの反応について有意に高い選択性を示し、例示的なポリマー試薬のヒスチジン選択性を示した。ｐＨ５．０では、５時間の反応時間及び示した反応条件下で、試薬２との反応により１４％のヒスチジン－コンジュゲートが形成され、一方、単一のアミノ酸、α－ＣＢＺ－リシンとの試薬２の反応により検出可能なコンジュゲートは形成されず、トリペプチド、ω－ＣＢＺ－リシン－グリシン－グリシン－ＯＨとの反応の結果、１．２％のみのコンジュゲートが形成された。ｐＨ５．５では、５時間の反応時間及び示した反応条件下で、試薬２との反応により３０％のヒスチジン－コンジュゲートが形成され、一方、単一のアミノ酸、α－ＣＢＺ－リシンとの試薬２の反応により単に０．５％コンジュゲートが形成され、トリペプチド、ω－ＣＢＺ－リシン－グリシン－グリシン－ＯＨとの反応の結果、３．１％％のみのコンジュゲートが形成された。

【0225】

実施例１２
２５℃でＰＨ５．０及びＰＨ５．５でのトリペプチド、Ｈ_２Ｎ－ＬＹＳ（α－ＣＢＺ）－ＧＬＹ－ＧＬＹ－ＯＨとの試薬２のコンジュゲーション（１：１０） － リシン反応性の検討

【化74】

トリペプチドＨ_２Ｎ－Ｌｙｓ（α－ＣＢＺ）－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（５．６１ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、それぞれｐＨ５．０及び５．５の１．０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液のそれぞれに溶解した。試薬２（ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール））（１０ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を各溶液に加えた。得られた溶液を２５℃で撹拌し、異なる時間間隔でＲＰ－ＨＰＬＣにより分析した。

【0226】

結果を表２にまとめ、本明細書で提供されるポリマー試薬のヒスチジン選択性の特徴をさらに支持する。

【0227】

実施例１３
α－ＣＢＺ－ヒスチジンを有する例示的なコンジュゲートの合成
１３．１． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－α－ＣＢＺ－ヒスチジン、５ｋＤａ（コンジュゲート１０）の調製

【化75】

α－ＣＢＺ－ヒスチジン（８３．８８ｍｇ、０．２９００ｍｍｏｌ）を６ｍｌのＤＭＦに溶解した。ピリジン（０．０５ｍＬ、０．５８００ｍｍｏｌ）を加えた後、ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｃｌ（５００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0228】

２０時間の反応後、１００ｍｌのＭＴＢＥを加えることにより反応生成物を沈殿させた。沈殿物を収集し、２０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄し、真空下で３時間乾燥して５１５ｍｇの粗生成物を得た。ＧＦＣ：約３４％の所望の生成物。

【0229】

ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。収量１１５ｍｇ；ＧＦＣにより純度９８％。^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ_６）：δ、ｐｐｍ ７．９７（ｓ，－^εＨヒスチジン，１Ｈ），７．５３（ｄ，－^δＨヒスチジン，１Ｈ），７．３３（ｂｒ，Ａｒ－Ｈ，５Ｈ），４．９９（ｓ，－ＣＨ_２ベンジル，２Ｈ），４．２７（ｂｓ，－^αＨヒスチジン，１Ｈ），３．５１（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．２４（ｓ，－ＯＣＨ_３，３Ｈ），３．００（ｓ，－ＮＣＨ_３，３Ｈ），２．９４（ｂｄ，－^βＨヒスチジン，１Ｈ），２．８３（ｍ，－^βＨヒスチジン，１Ｈ）。

【0230】

１３．２． ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－α－ＣＢＺ－ヒスチジン、５ｋＤａ（コンジュゲート１１）の調製

【化76】

α－ＣＢＺ－ヒスチジン（１１．５７ｍｇ、０．０４００ｍｍｏｌ）を２ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。ｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール（１００ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）をα－ＣＢＺ－ヒスチジン溶液に加えた。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0231】

ＨＰＬＣは、対応するヒスチジンコンジュゲートへのＰＥＧ試薬の完全な変換を示した。反応混合物を１０％ ＮａＣｌで５０ｍＬまで希釈した。生成物をＤＣＭ（１０ｍＬ×３）で抽出した。抽出物をＮａ_２ＳＯ_４／ＭｇＳＯ_４混合物で乾燥し、濾過し、溶媒を乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭＴＢＥ（５０ｍｌ）で沈殿させ、濾過により回収し、真空下で乾燥した。

【0232】

粗生成物（９０ｍｇ）を３０ｍＬの温ＩＰＡに再溶解した。３０分間撹拌した後、沈殿物を収集し、真空下で乾燥して５２ｍｇの精製生成物を得た。

【0233】

ＨＰＬＣ分析は、出発試薬、５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾールで汚染されていない純生成物の１つのピークを示した。生成物の化学構造をＮＭＲ解析により確認した。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ_２Ｃｌ_２）：δ，ｐｐｍ ８．５１（ｓ，－^εＨヒスチジン，１Ｈ），７．３４（ｂｓ，Ａｒ－Ｈ，５Ｈ），７．２４（ｄ，－^δＨヒスチジン，１Ｈ），６．２８（ｄ，－ＮＨＣＯ－，１Ｈ），５．０５（ｓ，－ＣＨ_２ベンジル，２Ｈ），４．６５（ｔ，－^αＨヒスチジン，１Ｈ），４．２４（ｔ，－ＣＨ_２－ＯＣＯ－，２Ｈ），３．６０（ｂｓ，ＰＥＧ骨格），３．３３（ｓ，－ＯＣＨ_３ ＆ －^βＨヒスチジン，４Ｈ），３．１７（ｂｒ，－^βＨヒスチジン，１Ｈ）。

【0234】

１３．３． ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－α－ＣＢＺ－ヒスチジン、５ｋＤａ（コンジュゲート１４）の調製

【化77】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_２ＣＦ_３）－ＣＯ－５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル－２Ｈ－テトラゾール、５Ｋ（３００ｍｇ、０．０６００ｍｍｏｌ）を、α－ＣＢＺ－ヒスチジン（８６．７９ｍｇ、０．３０００ｍｍｏｌ）を含有する１０ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解した。反応混合物を周囲温度で３日間撹拌した。

【0235】

反応混合物を濾過し、Ｄ．Ｉ．水で２０ｍＬまで希釈した。２ｇのＮａＣｌを加え、１．０Ｎ ＨＣｌを加えることにより溶液のｐＨを３．０に調整した。得られたコンジュゲート生成物をＤＣＭ（１０ｍＬ×２）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、抽出物を濾過した。溶媒を乾燥するまで蒸発させ、ＩＰＡ（５０ｍＬ）を加えることにより残留物を沈殿させた。沈殿した生成物を濾過により回収し、１０ｍＬのジエチルエーテルで洗浄し、真空中で３時間乾燥して２３７ｍｇの粗生成物を得た。

【0236】

ＨＰＬＣ分析は、９２％の所望の生成物及び８％のｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_２ＣＦ_３）を示した。

【0237】

１３．４． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－（２－ＣＦ_３－ピペラジン－１－イル）－ＣＯ－α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ ５ｋＤａ（コンジュゲート１６）の調製

【化78】

４－（ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）－２－トリフルオロメチル－ピペラジン－１－イル）－ｍＰＥＧ－カルバメート５ｋＤａ（５０ｍｇ、０．０１００ｍｍｏｌ）を、α－ＣＢＺ－ヒスチジン（２８．９３ｍｇ、０．１０００ｍｍｏｌ）を含有する５ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解した。反応混合物を周囲温度で週末にわたり撹拌した。

【0238】

ＨＰＬＣは、９１％の所望のコンジュゲート、９％のｍＰＥＧ－ＣＦ_３－ピペリジン、５ｋＤａを示し、出発ＰＥＧ試薬は示さなかった。反応混合物を濾過し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心分離濃縮器（ＭＷＣＯ ３０００）を使用して濾液を濃縮した。濃縮後、溶液を凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより８８％純度を有する３５ｍｇの固体生成物を提供した。

【0239】

１３．５． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－（ピペリジン－４－イル）－ＣＯ－α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ ５ｋＤａ（コンジュゲート１７）の調製

【化79】

α－ＣＢＺ－ヒスチジン（１１．５７ｍｇ、０．０４００ｍｍｏｌ）を５ｍＬのＤＭＦに溶解した。（１－（ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）－ピペリジン－４－イル）－ｍＰＥＧ－カルバメート５ｋＤａ（１００ｍｇ、０．０２００ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．０２ｍＬ、０．１２００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。

【0240】

ＨＰＬＣにより検査したサンプルは、約３％の未反応出発材料の存在を示した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．０２ｍＬ、０．１２００ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を周囲温度で一晩撹拌した。ＤＣＭを蒸発させ、残留物をＭＴＢＥ（７０ｍＬ、冷）で沈殿させた。沈殿物を収集し、真空下で一晩乾燥して、ＨＰＬＣにより９８．３％の純度を有する９２ｍｇの所望のコンジュゲート生成物を得た。

【0241】

１３．６． ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）－α－ＣＢＺ－Ｈｉｓ ５ｋＤａ（コンジュゲート１８）の調製

【化80】

（１－（ＣＯ－５－（３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル）－２Ｈ－テトラゾール）－ピペリジン－４－イル）－メチル－ｍＰＥＧ－カルバメート５ｋ（１０ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）を、α－ＣＢＺ－ヒスチジン（５．７９ｍｇ；０．０２００ｍｍｏｌ）を含有する１ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解した。溶液を濾過し、室温で撹拌した。反応の進行を異なる時間間隔でＲＰ－ＨＰＬＣにより監視した。５時間後、約３６％のコンジュゲートが形成されていた。１０時間後、約６８％のコンジュゲートが形成されていた。１５時間後、８７％のコンジュゲートが形成されていた。

【0242】

上記の反応を異なるｐＨ（５．０、５．５及び６．０）でさらに３回繰り返し、反応混合物を合わせた。ＨＰＬＣ分析は、８８％の所望の生成物及び１２％のｍＰＥＧ ｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）を示した。

【0243】

合わせた溶液を水（ＭＥＣＯ ３Ｋ）（３Ｌ×３）に対して透析した。透析後、溶液をＰＯＲＯＳ ５０ＨＳカラム（５ｍＬ）に通してｍＰＥＧ－ＯＣＯ－ＮＨ－ＣＨ_２－（ピペリジン－４－イル）を除去した。溶離液を遠心濾過により濃縮した。０．１Ｎ ＮａＯＨを加えることにより濃縮溶液のｐＨを７．０に調整し、溶液を一晩凍結乾燥して、ＨＰＬＣにより９７％純度を有する３５ｍｇの所望の生成物を得た。

【0244】

追加のコンジュゲートを同様に調製した。

【0245】

実施例１４
ＰＢＳ緩衝液中、ＰＨ７．４、３７℃でのコンジュゲート１０～１８の加水分解安定性
１４．１． ＰＢＳ緩衝液中、ｐＨ７．４、３７℃でのコンジュゲート１０（ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）－５ｋＤａの加水分解安定性の決定

【化81】

ｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－ヒスチジン（α－ＣＢＺ）－５ｋＤａ（１０．０ｍｇ）を１．０ｍＬのＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４に溶解した。反応混合物を３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣで周期的に分析した。１０日後、１．８％のコンジュゲートのみが加水分解を受けてｍＰＥＧ－ＮＨ（ＣＨ_３）を生成した。

【0246】

１４．２． ＰＢＳ緩衝液中、ｐＨ７．４、３７℃でのコンジュゲート１１、１４、１６、１７及び１８の加水分解安定性の決定
コンジュゲート１１、１４、１６、１７及び１８の加水分解安定性を、コンジュゲート１０について上述した方法に従って決定した。安定性結果を表３にまとめ、図４に示す。

【0247】

【表3】

【0248】

モデルヒスチジン含有化合物、α－ＣＢＺ－ヒスチジンと、本明細書に提供される例示的なヒスチジン選択的ポリマー試薬との反応により形成されたコンジュゲートは、約８．０までのｐＨで水性緩衝液中で比較的安定である。評価され、他のコンジュゲートと比較して最も高い程度の加水分解安定性を示した尿素結合コンジュゲート、コンジュゲート１０、１７及び１８は、場合によりＲ_２（存在する場合）と組み合わされたＲ_１が、一般式

【化82】

を参照して、メチル及びピペリジンであるものである。試験した他のコンジュゲートと比較して中程度の加水分解安定性を有するコンジュゲート１１は、リンカーＸ、～ＯＣ（Ｏ）～に加えてピペラジン部分（Ｎと組み合わせてＲ_１及びＲ_２により形成される）を含む。試験した他のコンジュゲートと比較して同様に中程度の加水分解安定性を有するコンジュゲート１４は、Ｒ_１として、～ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＦ_３を有する。最後に、試験条件下で最も高い程度の加水分解を示すコンジュゲート、コンジュゲート１６は、リンカーＸ、～ＯＣ（Ｏ）～に加えてトリフルオロメチル置換ピペラジン（Ｎと組み合わせてＲ_１及びＲ_２により形成された）を含む。得られたコンジュゲートの加水分解安定性（所与のｐＨ及び温度で、たとえば、生理学的条件又は生理学的条件を模倣する条件下で）は、Ｒ_１、Ｒ_２及びＸの選択による影響を受け、電子吸引基の存在は、より高い程度の加水分解に寄与するように思われる。したがって、本明細書に一般に記載され、スペーサー全体、～（Ｘ）_０，１－（Ｒ_２）_０，１－ＮＲ_１～内に１つ又はそれ以上の電子吸引基又は原子を含むコンジュゲートは、そのような電子吸引部分が存在しないコンジュゲートと比較した場合、減少した加水分解安定性を示すことが予想される。したがって、前述したように、ポリマー試薬（ひいては、それとの反応によって形成されたコンジュゲー）は、Ｘ、Ｒ_２及びＲ_１などのポリマー試薬成分の適切な選択によって、所望の標的分子又は表面との反応に最適な反応性、選択性及びコンジュゲート安定性を有するように設計することができる。

【0249】

実施例１５
例示的なコンジュゲートのヒスチジン選択性 － ＰＨ７．４、２５℃でのヒドロキシルアミンとの反応
図１４Ａ及び１４Ｂは、それらの対応するヒスチジン結合コンジュゲートとヒドロキシルアミンとの反応により示される、本明細書に提供される例示的なポリマー試薬のヒスチジン選択性のさらなる証拠を提供する。以下に記載されるデータは、ヒスチジン結合ポリマーコンジュゲートとヒドロキシルアミンとの反応から生じるヒスチジン結合分子の置き換えによる、本明細書に提供されるポリマー試薬とアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド又は他の活性ヒスチジン含有分子のヒスチジン残基との共有結合を評価するための間接的方法を代表する。

【0250】

より詳細には、図１４Ａは、試薬１とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとのｐＨ７．４、２５℃での反応を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示す。ヒスチジンコンジュゲート、たとえば試験した例示的なコンジュゲートは、ヒドロキシルアミンで処理した際、非コンジュゲートヒスチジン化合物が放出されるように逆反応を受ける。対照的に、ヒドロキシルアミンは、典型的には、リシン結合コンジュゲートと反応してリシン－ポリマー結合を切断し、それにより親リシン化合物を放出することはない。約２２時間までに、１００％のコンジュゲートがα－ＣＢＺ－Ｈｉｓを放出して消失した。

【0251】

同様に、図１４Ｂは、試薬２とモデル化合物、α－ＣＢＺ－Ｈｉｓとの反応により調製されたヒスチジンコンジュゲートと、ヒドロキシルアミンとのｐＨ７．３、２５℃での反応を示すプロットである。プロットは、経時的に残留するｍＰＥＧ－ピペラジン－ＣＯ－Ｈｉｓ（α－ＣＢＺ）コンジュゲートのパーセントを示し、約４２時間で４％のみの無傷コンジュゲートが残留した。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【国際調査報告】