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特表2024-524251上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）阻害剤および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）阻害剤の併用癌治療法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）阻害剤および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）阻害剤の併用癌治療法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20240628BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240628BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20240628BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20240628BHJP
A61K 31/47 20060101ALI20240628BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240628BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20240628BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K31/5377
A61K31/4545
A61K31/47
A61P35/02
C07K16/18 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579192
(86)(22)【出願日】2022-06-24
(85)【翻訳文提出日】2024-02-16
(86)【国際出願番号】 US2022034882
(87)【国際公開番号】W WO2022272047
(87)【国際公開日】2022-12-29
(31)【優先権主張番号】63/215,016
(32)【優先日】2021-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】596118493
【氏名又は名称】アカデミア シニカ
【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
【住所又は居所原語表記】１２８ Ｓｅｃ ２，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｒｏａｄ，Ｎａｎｋａｎｇ，Ｔａｉｐｅｉ １１５２９ ＴＷ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ウー，ハン－チュン
(72)【発明者】
【氏名】リー，チー－チウ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA20
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB271
4C084ZC022
4C084ZC202
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC28
4C086BC36
4C086BC73
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の遊走／浸潤を阻害し、腫瘍サイズを縮小させ、および／または癌患者の生存を延長させるのに有効である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(i) 上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）シグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置するための方法。
【請求項2】
第１の阻害剤が、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）の産生（または放出）を減少させ、ＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合を阻止し、および／またはＥｐＥＸ誘導性ＨＧＦＲリン酸化を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
第２の阻害剤が、ＨＧＦのＨＧＦＲへの結合を阻止する、請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
第１の阻害剤が、ＥｐＥＸに対する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１から３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
抗体が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインＩおよびＩＩに特異的に結合する、請求項４記載の方法。
【請求項6】
ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ ２７～３７）（配列番号２０）およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに対して特異的な結合親和性を有する、請求項４記載の方法。
【請求項7】
抗体または抗原結合フラグメントが、(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む、請求項４から６のいずれか一項記載の方法、
【請求項8】
第１の阻害剤が、ＴＡＣＥおよびＰＳ２のリン酸化のシグナル伝達を阻害するのに有効である、請求項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項9】
第２の阻害剤が、フォレチニブ、クリゾチニブおよびカボザンチニブからなる群より選択される、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である、請求項１から９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
癌細胞の遊走／浸潤を阻害すること、および／または腫瘍サイズを減少させるのに有効である、請求項１から１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
対象の生存を延長するのに有効である、請求項１から１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
癌が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される、請求項１から１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤；および(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤
を含む、キットまたは医薬組成物。
【請求項15】
第１の阻害剤が、請求項１、２および４から８のいずれか一項記載のものであり、かつ／または第２の阻害剤が、請求項３または９に記載のものである、請求項１４記載のキットまたは医薬組成物。
【請求項16】
癌を処置するための薬剤またはキットを製造するための、(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する第１の阻害剤、および(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する第２の阻害剤、の組合せの使用。
【請求項17】
第１の阻害剤が、請求項１、２および４から６のいずれか一項記載のものであり、かつ／または第２の阻害剤が、請求項３または７に記載のものである、請求項１６記載の使用。
【請求項18】
薬剤またはキットが、癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である、請求項１６または１７記載の使用。
【請求項19】
薬剤またはキットが、癌細胞の遊走／浸潤を阻害すること、および／または腫瘍サイズを減少させるのに有効である、請求項１６から１８のいずれか一項記載の使用。
【請求項20】
薬剤またはキットが、対象の生存を延長するのに有効である、請求項１６から１９のいずれか一項記載の使用。
【請求項21】
癌が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および精巣癌からなる群より選択される、請求項１６から２０のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて２０２１年６月２５日に提出された米国仮出願番号第６３／２１５，０１６号について優先権の利益を主張し、その内容全体を引用により本明細書に包含される。
本出願は、米国特許法第１１９条に基づいて２０２１年６月２５日に提出された米国仮出願番号第６３／２１５，０１６号について優先権の利益を主張し、その内容全体を引用により本明細書に包含される。
【0002】
技術分野
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の遊走／浸潤を阻害し、腫瘍サイズを縮小させ、および／または癌患者の生存期間を延長させるのに有効である。
本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤および肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）阻害剤を用いた癌の併用療法に関する。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤は、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。この併用療法は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、癌細胞の遊走／浸潤を阻害し、腫瘍サイズを縮小させ、および／または癌患者の生存期間を延長させるのに有効である。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
ＥｐＣＡＭは３１４個のアミノ酸を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ、２６５アミノ酸）、単一の膜貫通ドメイン、および短い細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ、２６アミノ酸）を含む。よく知られた腫瘍関連抗原として、ＥｐＣＡＭは様々な癌腫に豊富に存在し、正常上皮における同型細胞間接着にも関与していることが知られている（Dolle et al, 2015）。ＥｐＣＡＭは大多数の健康な上皮の扁平上皮細胞には存在しないかまたは弱く発現しているが、扁平上皮癌では強く発現している（Balzar et al, 1999）。さらに、扁平上皮癌におけるＥｐＣＡＭの発現は細胞増殖の増加および分化の低減と相関している（Litvinov et al, 1996）。本発明者らのグループは以前にＥｐＣＡＭに対する中和抗体ＥｐＡｂ２．６を開発しており、これは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の処置に用いられ得る可能性が高い（Chen et al, 2020；Liang et al, 2018；Liao et al, 2015）。ＣＲＣの治療標的として有望であるにもかかわらず、ＥｐＣＡＭが腫瘍形成および転移に寄与する機序はまだ完全には分かっていない。
ＥｐＣＡＭは３１４個のアミノ酸を有するＩ型膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ、２６５アミノ酸）、単一の膜貫通ドメイン、および短い細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ、２６アミノ酸）を含む。よく知られた腫瘍関連抗原として、ＥｐＣＡＭは様々な癌腫に豊富に存在し、正常上皮における同型細胞間接着にも関与していることが知られている（Dolle et al, 2015）。ＥｐＣＡＭは大多数の健康な上皮の扁平上皮細胞には存在しないかまたは弱く発現しているが、扁平上皮癌では強く発現している（Balzar et al, 1999）。さらに、扁平上皮癌におけるＥｐＣＡＭの発現は細胞増殖の増加および分化の低減と相関している（Litvinov et al, 1996）。本発明者らのグループは以前にＥｐＣＡＭに対する中和抗体ＥｐＡｂ２．６を開発しており、これは結腸直腸癌（ＣＲＣ）の処置に用いられ得る可能性が高い（Chen et al, 2020；Liang et al, 2018；Liao et al, 2015）。ＣＲＣの治療標的として有望であるにもかかわらず、ＥｐＣＡＭが腫瘍形成および転移に寄与する機序はまだ完全には分かっていない。
【0004】
ＨＧＦＲ（ｃ－ＭＥＴ）は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ、Scatter Factorとしても公知）によって活性化され、ＭＥＴ遺伝子（Lai et al, 2009; Peschard ＆ Park, 2007）によってコードされる高親和性受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＨＧＦＲのチロシンキナーゼドメインには１２３４位および１２３５位の２つのチロシン残基があり、ＨＧＦＲ受容体の活性化にはこの２つの部位のリン酸化が必須である（Koch et al, 2020； Ponzetto et al, 1994）。多くの報告が、腫瘍形成、細胞増殖、生存および転移におけるＨＧＦＲの重要な役割を実証している（Cao et al, 2019； Li et al, 2018； Mazzone ＆ Comoglio, 2006）。正常組織では、ＨＧＦＲは上皮細胞に発現しており、周囲の間葉系細胞由来あるいは循環中のＨＧＦによって活性化される（Birchmeier et al, 2003）。ＨＧＦによってＨＧＦＲが活性化されると、細胞の遊走および浸潤を促進する形態形成プログラムが開始される。その既知の機能に基づき、ＨＧＦＲは通常、胚発生、成体組織の恒常性維持および再生に関与する癌原遺伝子であると考えられている。注目すべきは、ＨＧＦＲに関する初期の研究から、それが成長因子受容体およびＲＴＫファミリーの両方と相同性を有することが示されたことである（Dean et al, 1985）。その後、ＨＧＦＲがＨＧＦの同族ＲＴＫであり、肝細胞増殖因子(scatter factor）と呼ばれるＨＧＦＲリガンドと同一であることが証明された（Koch et al., 2020;Naldini et al., 1991）。
【0005】
上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、癌の進行および転移に関連している（Iwatsuki et al, 2010）。ＥＭＴの過程には、上皮細胞接着の喪失および細胞の間葉系表現型の誘導につながる一連の複雑な可逆的事象が含まれる。ＥＭＴを受けた癌細胞はまた、間葉系の性質の誘導および上皮細胞接着の喪失を通じて、細胞の運動性および浸潤の亢進を示す。ＥＭＴの指標としては、ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、スネイル（Ｓｎａｉｌ）、スラグ（Ｓｌｕｇ）などの間葉系マーカーの発現の増加と共に、Ｅ－カドヘリンなどの上皮系マーカーの発現の減少が挙げられる（Singh ＆ Settleman, 2010）。多くの報告が、ＨＧＦＲシグナルがＥＭＴプログラムを促進し、それによって癌細胞の浸潤性および転移性を高めることを示した（Gumustekin et al, 2012; Jiao et al, 2016）。
【0006】
ＥｐＥＸは２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインを含み、局所腫瘍微小環境における可溶性増殖因子として機能し得る。これまでの報告では、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の活性化がＥｐＣＡＭの制御された膜内タンパク質分解（ＲＩＰ）を引き起こし、ＥＭＴを誘導することが示された（Hsu et al, 2016）。特記すべきは、ＥＧＦＲが種々の腫瘍で過剰発現されていることから、多くの種類の癌に関連性の高いＲＴＫであることである（Normanno et al, 2006）。ＥＧＦＲの作用と同様に、ＨＧＦＲの過剰な活性化は、ＡＫＴ、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ、ＲＡＳおよびＳＲＣ（Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017）などの多くの下流エフェクターを介して作用し、癌細胞の増殖、生存および遊走を促進する（Kim et al, 2014; Simiczyjew et al, 2018）。興味深いことに、基底型乳癌ではＨＧＦＲ発現はＥＧＦＲ発現と正の相関があり（Mueller et al, 2010）、癌細胞ではＨＧＦＲファミリー受容体およびＥＧＦファミリー受容体がしばしば共発現する（Shattuck et al, 2008）。さらに、表皮癌細胞をＥＧＦＲリガンドで刺激すると、ＥＧＦＲ依存性のＨＧＦＲのリン酸化および活性化が起こることが報告されている（Jo et al, 2000）。ＥＧＦＲシグナルが上昇した細胞におけるＨＧＦＲのこのような交差活性化は、いくつかのタイプの腫瘍でも観察されている（Tang et al, 2008）。しかしながら、重要なことに、この交差活性化効果の根底にあるメカニズムは、これまで特定されていなかった。
【発明の概要】
【0007】
発明の概要
本明細書では、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤を併用した癌治療法を記載している。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤はＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。併用療法は、癌細胞のアポトーシス誘導、癌細胞の遊走／浸潤の抑制、腫瘍サイズの縮小、および／または癌患者の生存期間の延長に有効である。
本明細書では、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤を併用した癌治療法を記載している。具体的には、ＥｐＣＡＭ阻害剤はＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）に対する抗体である。併用療法は、癌細胞のアポトーシス誘導、癌細胞の遊走／浸潤の抑制、腫瘍サイズの縮小、および／または癌患者の生存期間の延長に有効である。
【0008】
一局面において、本発明は、癌を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を投与することを含む方法を提供する。
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤
を投与することを含む方法を提供する。
【0009】
ある態様において、第１の阻害剤は、ＥｐＥＸの産生（または放出）を減少させ、ＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合を阻害し、および／またはＥｐＥＸ誘導性ＨＧＦＲリン酸化を阻害する。
【0010】
ある態様において、第２の阻害剤はＨＧＦのＨＧＦＲへの結合を阻害する。
【0011】
ある態様において、第１の阻害剤は、ＥｐＥＸに対する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【0012】
ある態様において、本明細書に記載の抗ＥｐＥＸ抗体は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインＩおよびＩＩに特異的に結合する。特定の例では、本明細書に記載の抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ ２７～３７）（配列番号２０）、およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに特異的結合親和性を有する。
【0013】
いくつかの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
(a) 配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、
(b) 配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ ＣＤＲ２）、および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
【0014】
いくつかの態様において、ＶＨは配列番号１５のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＬは配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの態様において、第１の阻害剤は、ＴＡＣＥおよびＰＳ２シグナルのリン酸化を阻害するのに有効である。
【0016】
いくつかの態様において、第２の阻害剤は、フォレチニブ、クリゾチニブおよびカボザンチニブからなる群より選択される。
【0017】
いくつかの態様において、本発明の方法は、癌細胞のアポトーシスを誘導するのに有効である。
【0018】
いくつかの態様において、本発明の方法は、癌細胞の遊走／浸潤を阻害すること、および／または腫瘍サイズを縮小することに有効である。
【0019】
いくつかの態様において、本発明の方法は、対象の生存期間の延長に有効である。
【0020】
いくつかの態様において、癌は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される。
【0021】
別の態様において、本発明は、
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤、
を含む医薬組成物のキットを提供する。
(i) ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤；および
(ii) ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤、
を含む医薬組成物のキットを提供する。
【0022】
また、本発明では、癌を処置するための医薬品またはキットを製造するための、(i) ＥｐＣＡＭシグナルの活性化を阻害する第１の阻害剤；および、(ii) ＨＧＦＲシグナルの活性化を阻害する第２の阻害剤、の組合せの使用も提供する。
【0023】
本発明の１以上の態様の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの態様の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲から明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【0024】
図面の簡単な説明
上記のまとめおよび以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読むと、よりよく理解され得る。本発明を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図示された正確な配置性および機能性に限定されるものではないことを理解されたい。
上記のまとめおよび以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と合わせて読むと、よりよく理解され得る。本発明を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図示された正確な配置性および機能性に限定されるものではないことを理解されたい。
【0025】
【図1】図１Ａから１Ｊ。ＥｐＥＸはＨＧＦＲと相互作用し、ＨＧＦＲのリン酸化を誘導する。（図１Ａ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞における、ＨＧＦＲに結合した内因性ＥｐＣＡＭの免疫沈降（ＩＰ）。（図１Ｂ）ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にＨＧＦＲＥＣＤ－ｃ－ＭｙｃおよびＥｐＣＡＭ－Ｖ５をトランスフェクトした。ＩＰは対照ＩｇＧ、抗Ｖ５抗体または抗ｃ－Ｍｙｃ抗体で行い、その後ウェスタンブロッティングを行った。（図１Ｃ）ＥｐＥＸ－ＦｃおよびＨＧＦＲ－Ｈｉｓ組換えタンパク質（２．５μｇ／ｍｌ）の相互作用は、Dynabeads プロテインＧを用いたＩＰおよび抗６Ｘ Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより調べた。（図１Ｄ）飢餓状態のＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を、異なる用量のＥｐＥＸ－Ｈｉｓで１５分間処理し、飢餓状態のＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を５０ｎＭ ＥｐＥＸ－Ｈｉｓを用いて示された時間処理した。ＨＧＦＲのリン酸化をウェスタンブロッティングで調べた。（図１Ｅ）野生型（ＷＴ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ） ＨＣＴ１１６細胞およびＨ２９細胞を１６時間飢餓状態にした後、ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）で１５分間処理した。リン酸化ＨＧＦＲのレベルは、ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１２６４５１）を用いてアッセイした。（図１Ｆ）ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞に、ＨＧＦＲＥＣＤ－ｃ－Ｍｙｃおよび全長またはＥＧＦ様ドメイン欠失変異体ＥｐＣＡＭ－Ｖ５をトランスフェクトした。タンパク質の相互作用は、抗Ｖ５抗体または抗ｃ－Ｍｙｃ抗体によるＩＰ、ならびに抗Ｖ５抗体または抗ｃ－Ｍｙｃ抗体によるウェスタンブロッティングによってプローブした。（図１Ｇ）ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞にｃ－ＭｙｃまたはＨＧＦＲＥＣＤ－ｃ－Ｍｙｃおよび全長またはＥＧＦ様ドメイン欠失変異体ＥｐＥＸ－Ｈｉｓをトランスフェクトした。タンパク質相互作用は、抗ｃ－Ｍｙｃ抗体によるＩＰ、ならびに抗ｃ－Ｍｙｃ抗体および抗Ｈｉｓ抗体によるウェスタンブロッティングによってプローブした。（図１Ｈ）ＨＧＦＲ－Ｈｉｓ組換えタンパク質（２μｇ／ｍｌ）を、ＥＧＦ様ドメイン欠失変異体－Ｆｃコート（１μｇ／ｍｌ）ＥＬＩＳＡプレートに添加し、ＴＭＢ比色ペルオキシダーゼアッセイで検出した。ＨＣＴ１１６細胞を飢餓状態にし、野生型またはＥＧＦドメイン欠失変異型ＥｐＥＸで処理し、リン酸化ＨＧＦＲを（図１Ｉ）ウェスタンブロッティングおよび（図１Ｊ）ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１２６４５１）で分析した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。*, ｐ＜０．０５。
【図2】図２Ａから２Ｋ。ＥｐＥＸはＨＧＦＲシグナル伝達を介して腫瘍の進行を促進する。（図２Ａ）ＨＧＦ（０．５ｎＭ）で１５分間処理したＷＴまたはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞。ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化をウェスタンブロッティングで調べた。（図２Ｂ）ＷＴまたはＫＯ ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を、２％ＦＢＳを含むＨＧＦ（０．５ｎＭ）で示された時間処理した。細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイで調べた。（図２Ｃ）飢餓状態のＨＣＴ１１６細胞をＨＧＦＲ阻害剤ＳＵ１１２７４（ＳＵ、１０μＭ）で１時間処理した後、５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで１５分間処理した。リン酸化されたＨＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのレベルを、ウェスタンブロッティングにより調べた。ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を５０ｎＭのＥｐＥＸおよびＳＵ（１０μＭ）で処理した。（図２Ｄ）細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイにより示された時間処理した後に調べた。（図２Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞をｓｈＬｕｃまたはＨＧＦＲ ｓｈＲＮＡで処理した後、５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで１５分間処理した。ＨＧＦＲノックダウンＨＣＴ１１６細胞において、リン酸化ＨＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＥＲＫおよびＡＫＴのレベルをウェスタンブロッティングにより調べた。（図２Ｆ）リン酸化されたＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のレベルをウェスタンブロッティングで調べた。（図２Ｇ）活性型β－カテニンの核内移行を、ウェスタンブロッティングを用いてアッセイした。（図２Ｈ）ＨＣＴ１１６細胞をｓｈＬｕｃまたはＨＧＦＲ ｓｈＲＮＡで処理した後、５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで示した時間処理した。細胞増殖をＷＳＴ－１アッセイで調べた。（図２Ｉ）ｓｈＬｕｃおよびｓｈＨＧＦＲ処理後のＨＣＴ１１６細胞を、２％ＦＢＳを含む５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで７日間処理した。コロニー形成をクリスタルバイオレット染色で調べた。下のパネルにおける核内β－カテニンの定量。（図２Ｊ）ＨＣＴ１１６細胞をＨＧＦ（０．５ｎＭ）で指定時間処理し、培養液中のＥｐＥＸタンパク質レベルを免疫沈降およびウェスタンブロッティングで調べた。（図２Ｋ）ＨＣＴ１１６細胞をＨＧＦ（０．５ｎＭ）で１５分間処理した。細胞溶解液中のリン酸化ＨＧＦＲ、プレセニリン２、ＡＤＡＭ１７タンパク質量をウェスタンブロット法で解析し、培養液中のＥｐＥＸタンパク質レベルを免疫沈降法およびウェスタンブロット法で調べた。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５； ＊＊, ｐ＜０．０１。
【図3】図３Ａから３Ｈ。ＥｐＥＸはＥＲＫおよびＦＡＫ－ＡＣＴシグナル伝達経路の活性化を誘導する。ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ処理後の野生型（ＷＴ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ）ＨＣＴ１１６細胞。（図３Ａ）リン酸化されたＨＧＦＲ、ＡＫＴ、ＦＡＫ、ＧＳＫ３β、ＥＲＫ、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のレベルを、ウェスタンブロッティングで測定した。（図３Ｂ）コロニー形成をクリスタルバイオレット染色で調べた。（図３Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞をＴＡＰＩ（ＡＤＡＭ１７阻害剤）またはＤＡＰＴ（γ－セクレターゼ阻害剤）で２４時間処理し、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化をウェスタンブロッティングで解析し、そして培養液中のＥｐＥＸタンパク質レベルを免疫沈降およびウェスタンブロッティングにより調べた。（図３Ｄ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を１６時間飢餓状態にした後、ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）およびＨＧＦ（０．５ｎＭ）で１５分間処理した。リン酸化されたＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのレベルをウェスタンブロッティングにより調べた。（図３Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞を１６時間飢餓状態にした後、５０ｎＭ ＥｐＥＸ－Ｈｉｓで１５分間処理した。ＨＧＦＲ阻害剤であるＳＵ１１２７４（ＳＵ、１０μＭ）、ＡＫＴ阻害剤であるＬＹ２９４００２（ＬＹ、２５μＭ）、ＥＲＫ阻害剤であるＵ０１２６（Ｕ０、２０μＭ）、またはＦＡＫ阻害剤であるＰＦ－５６２２７１（ＰＦ、１０μＭ）を、ＥｐＥＸ処理の１時間前に適用した。ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化をウェスタンブロッティングにより調べた。（図３Ｆ）ＨＣＴ１１６細胞を１６時間飢餓状態にした後、５０ｎＭのＥｐＥＸ、およびＳＵ（１０μＭ）、ＬＹ（２５μＭ）、Ｕ０（２０μＭ）またはＰＦ（１０μＭ）で処理した。コロニー形成を、７日間処理した後、クリスタルバイオレット染色で調べた。相対的なコロニー密度を示す。遊走能を（図３Ｇ）創傷治癒アッセイにより示された時間で調べた。（図３Ｈ）２４時間処理後、遊走細胞数をトランスウェルで評価した。＊, ｐ＜０．０５。
【0026】
【図4】図４Ａから４Ｌ。ＥｐＥＸは、ＧＳＫ３β活性を低下させることによってβ－カテニンおよびＳｎａｉｌを安定化させ、ＥＭＴおよび浸潤を誘導する。（図４Ａ）ＥｐＥＸ処理後の野生型（ＷＴ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ）ＨＣＴ１１６細胞において、ＥＭＴマーカーおよび調節因子（regulator）のタンパク質発現をウェスタンブロット法で検出した。（図４Ｂ）細胞の浸潤は、マトリゲルを用いたトランスウェルチャンバーアッセイで調べた。（図４Ｃ）ＷＴまたはＫＯ ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を１６時間飢餓状態にした後、２％ＦＢＳを含む０．５ｎＭのＨＧＦで２４時間処理した。ＥＭＴ関連タンパク質発現（Ｅ－カドヘリン、ビメンチンおよびスネイル）をウェスタンブロット法で調べた。（図４Ｄ）ＷＴまたはＫＯ ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞をＨＧＦ（０．５ｎＭ）で２４時間処理した。ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞による浸潤は、マトリゲルを用いたトランスウェルチャンバーアッセイで調べた。（図４Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を１６時間飢餓状態にした後、２％ＦＢＳを加えた０．５ ｎＭのＨＧＦで２４時間処理し、ＥＭＴ関連タンパク質（Ｅ－カドヘリン、ビメンチンおよびスネイル）の発現をウェスタンブロッティングで調べた。（図４Ｆ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を１６時間飢餓状態にした後、２％ＦＢＳを加えた０．５ｎＭのＨＧＦで２４時間処理し、マトリゲルを用いたトランスウェルアッセイで細胞浸潤を評価した。（図４Ｇ）ｓｈＬｕｃおよびｓｈＨＧＦＲ処理後のＨＣＴ１１６細胞を、５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで処理した。ｓｈＬｕｃおよびｓｈＨＧＦＲ処理後のＨＣＴ１１６細胞を、２％ＦＢＳを加えた５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで２４時間処理し、ＥＭＴ関連タンパク質（Ｅ－カドヘリン、ビメンチンおよびスネイル）の発現をウェスタンブロッティングで調べた。（図４Ｈ）細胞の浸潤を、マトリゲルを用いたトランスウェルチャンバーアッセイで調べた。（図４Ｉ）飢餓状態のＨＣＴ１１６細胞をＳＵ（１０μＭ）で１時間処理した後、ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）で２４時間処理した。リン酸化ＧＳＫ３β、活性型β－カテニンおよびスネイルをウェスタンブロッティングで検出した。（図４Ｊ）ＨＣＴ１１６細胞を１６時間飢餓状態にした後、５０ｎＭのＥｐＥＸ－Ｈｉｓで２４分間処理した。ＡＫＴ阻害剤であるＬＹ２９４００２（２５μＭ）、ＥＲＫ阻害剤であるＵ０１２６（２０μＭ）、またはＰＦ－５６２２７１（１０μＭ）を、ＥｐＥＸ処理の１時間前に適用した。リン酸化ＧＳＫ３βおよびスネイルのタンパク質発現をウェスタンブロッティングで調べた。（図４Ｋ）ＨＣＴ１１６細胞を１６時間飢餓状態にした後、５０ｎＭのＥｐＥＸ、およびＳＵ（１０μＭ）、ＬＹ（２５μＭ）、Ｕ０（２０μＭ）またはＰＦ（１０μＭ）で処理した。細胞浸潤を、マトリゲルを用いたトランスウェルチャンバーアッセイで調べた。（図４Ｌ）ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）処理したＨＣＴ１１６細胞を、２μＭのＧＳＫ３β阻害剤（ＢＩＯ）で２４時間処理した後、ウェスタンブロットでタンパク質発現を解析した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５；＊＊, ｐ＜０．０１。
【0027】
【図5】図５Ａから図５Ｉ。ＥｐＥＸは、ユビキチン化を介したプロテアソーム分解を阻害することにより、スネイル（Ｓｎａｉｌ）タンパク質の安定性を促進する。（図５Ａ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞の野生型（ＷＴ）またはＥｐＣＡＭノックアウト（ＫＯ）におけるＥＭＴマーカーおよび調節因子の遺伝子発現をｑＲＴ－ＰＣＲで検出した。（図５Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞のＷＴまたはＫＯにおけるＳｎａｉｌタンパク質の安定性。細胞をシクロヘキサミド（ＣＨＸ）１００μｇ／ｍｌで示された時間間隔で処理し、ウェスタンブロッティングした。（図５Ｃ）Ｓｎａｉｌタンパク質発現は、ＷＴまたはＫＯ ＨＣＴ１１６細胞を１０ｍＭ ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）で６時間処理または処理せずに、ウェスタンブロッティングで解析した。（図５Ｄ）ＷＴまたはＫＯ ＨＣＴ１１６細胞を、細胞回収前に１０μＭ ＭＧ１３２で６時間処理した。細部溶解物を、抗Ｓｎａｉｌ抗体およびＩｎｐｕｔを用いて免疫沈降した。ユビキチン化されたＳｎａｉｌタンパク質を検出するために、指定の抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。（図５Ｅ）ＥｐＥＸ（５０ｎＭ）で２４時間処理後のＨＣＴ１１６細胞におけるＳｎａｉｌタンパク質の安定性。細胞をシクロヘキサミド（ＣＨＸ；１００μｇ／ｍｌ）で示された時間間隔で処理した後、ウェスタンブロッティングを行った。（図５Ｆ）ＳＮＡＩＬをコードする遺伝子の発現を、ＥｐＥＸ（５０ｎＭ）で２４時間処理後のＨＣＴ１１６細胞においてｑＲＴ－ＰＣＲにより検出した。（図５Ｇ）ＨＣＴ１１６細胞におけるＳｎａｉｌタンパク質発現は、ＥｐＥＸ（５０ｎＭ）で２４時間処理後、および１０μＭ ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）で６時間処理または処理なしで、ウェスタンブロッティングにより解析した。（図５Ｈ）Ｓｎａｉｌリン酸化モチーフ内の変異体の位置を模式的に示す。（図５Ｉ）ＨＣＴ１１６細胞をＳｎａｉｌ－ＷＴ、２ＳＡ、４ＳＡおよび６ＳＡで２４時間トランスフェクトし、さらにＥｐＥＸ（５０ｎＭ）で２４時間処理した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５； ＊＊, ｐ＜０．０１。
【図6】図６Ａから図６Ｊ。ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲシグナル伝達を阻害し、ＧＳＫ３βの活性化を介して活性型β－カテニンおよびＳｎａｉｌタンパク質の分解を促進する。（図６Ａ）ＨＣＴ１１６細胞を、１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ（正常マウスＩｇＧ、ＮＭＩｇＧ）またはマウスＥｐＡｂ２－６（ＥｐＡｂ２－６）で１６時間処理し、その後、ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）で１５分間処理した。リン酸化ＨＧＦＲ、ＡＫＴ、ＦＡＫ、ＧＳＫ３β、ＥＲＫ、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のレベルをウェスタンブロッティングにより調べた。（図６Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞を１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧまたはマウスＥｐＡｂ２－６で１６時間処理した後、ＨＧＦ（０．５ｎＭ）を添加しないか、または添加した状態で１５分間処理した。リン酸化されたＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのレベルをウェスタンブロッティングで調べた。ＨＣＴ１１６細胞をマウスＥｐＡｂ２－６（１０μｇ／ｍｌ）およびＨＧＦ（０．５ｎＭ）で処理した。（図６Ｃ）細胞遊走は創傷治癒アッセイにより、示された時間毎に調べた。（図６Ｅ）ＨＣＴ１１６細胞をＮＭＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６で６時間処理した後、抗ＥｐＣＡＭ（ＩＰ：ＥｐＣＡＭ）抗体または抗ＨＧＦＲ（ＩＰ：ＨＧＦＲ）抗体で免疫沈降させ、ウェスタンブロッティングを行った。（図６Ｆ）１μｇのＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６と共処理したＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（２μｇ／ｍｌ）を、ＨＧＦＲ－Ｆｃコート（１μｇ／ｍｌ）したＥＬＩＳＡプレートに添加し、ＴＭＢ比色ペルオキシダーゼアッセイにより検出した。（図６Ｇ）ＮＭＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６で２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞において、ＥＭＴ関連タンパク質レベルをウェスタンブロッティングにより検出した。（図６Ｈ）ＥｐＡｂ２－６および２μＭ ＧＳＫ３β阻害剤（ＢＩＯ）で２４時間処理したＨＣＴ１１６細胞において、タンパク質発現をウェスタンブロッティングにより検出した。（図６Ｉ）ＨＣＴ１１６細胞を１０μＭ ＭＧ１３２およびＥｐＡｂ２－６で６時間処理した後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングを行った。（図６Ｊ）ＮＭＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６で処理したＨＣＴ１１６細胞におけるＳｎａｉｌタンパク質の安定性。細胞をシクロヘキサミド（ＣＨＸ）１００μｇ／ｍｌで示された時間間隔で処理し、ウェスタンブロッティングした。下のグラフは、示したグループにおけるＳｎａｉｌの半減期の定量を示す。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜ ０．０５； ＊＊, ｐ ＜ ０．０１。
【図7】図７Ａから７Ｇ。ＥｐＡｂ２－６はＥｐＥＸと結合し、Ｆ（ａｂ’）２によってアポトーシスを誘導し、制御された膜内タンパク質分解（ＲＩＰ）の活性化およびＨＧＦＲシグナル伝達を阻害する。（図７Ａ）一晩コートしたＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（１μｇ／ｍｌ）に対するＩｇＧ ＥｐＡｂ２－６（マウス）およびＦ（ａｂ’）２の結合親和性を、ＥＬＩＳＡを用いて検査した（ＯＤ４５０）。（図７Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞を１００μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ、ＦｃまたはＥｐＡｂ２－６のＦ（ａｂ’）２で２４時間処理し、アポトーシス細胞およびネクローシス細胞をフルオレセイン・アネキシンＶ‐ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識で定量化した。（図７Ｃ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を、１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ、ＭＴ２０１、ヒト化ＥｐＡｂ２－６（ｈＥｐＡｂ２－６）またはマウスハイブリドーマＥｂＡｂ２－６（ｍＥｐＡｂ２－６）で２４時間処理した。アポトーシス細胞およびネクローシス細胞を、フルオレセイン・アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識により定量化した。（図７Ｄ）ＨＣＴ１１６細胞を１０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ、ＭＴ２０１、ｈＥｐＡｂ２－６またはｍＥｐＡｂ２－６で１６時間処理し、その後ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ（５０ｎＭ）で１５分間処理した。リン酸化されたＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫ、ならびに（図７Ｅ）ＲＩＰタンパク質ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のレベルをウェスタンブロッティングにより調べた。抗ＥｐＣＡＭ抗体およびクリゾチニブは結腸癌細胞において協調的にアポトーシスを誘導する。（図７Ｆ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を、１０μｇ／ｍｌのＮＭＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６および４μＭのＨＧＦＲ阻害剤であるクリゾチニブで２４時間処理した。アポトーシス細胞およびネクローシス細胞を、フルオレセイン・アネキシンＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ二重標識によって定量化した。（図７Ｇ）ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞を、１０μｇ／ｍｌのＮＭＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６および１０μＭのＨＧＦＲ阻害剤クリゾチニブで処理した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５。
【0028】
【図8】図８Ａから８Ｇ。ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩの両方に結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に全長またはＥＧＦ様ドメイン欠失変異型ＥｐＣＡＭ－Ｖ５をトランスフェクトした。抗体結合を、（図８Ａ）ウェスタンブロッティング、（図８Ｂ）フローサイトメトリー、および（図８Ｃ）免疫蛍光法で評価した。（図８Ｄ）ＥＧＦ－Ｉ（Ｙ３２Ａ）およびＥＧＦ－ＩＩ（Ｌ９４Ａ、Ｙ９５ＡまたはＤ９６Ａ）ドメインのアミノ酸を置換したＥｐＣＡＭ変異体を構築した。ＥｐＣＡＭ野生型および変異型タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。ＭＴ２０１、ＥｐＡｂ２－６およびＥｐＡｂ２３－１のＥｐＣＡＭ野生型および変異体への結合を、（図８Ｅ）免疫蛍光法、（図８Ｆ）フローサイトメトリー、および（図８Ｇ）細胞ＥＬＩＳＡで評価した。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５； ＊＊, ｐ＜０．０１。
【図9】図９Ａから９Ｋ。ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブは協調的に腫瘍の進行および転移を抑制する。（図９Ａ）転移モデル動物におけるＥｐＡｂ２－６および／またはクリゾチニブの効果を評価する試験のタイムライン。（図９Ｂ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに５×１０６ ＨＣＴ１１６細胞を静脈内注射し、その後対照ＩｇＧ、ＥｐＡｂ２－６および／またはクリゾチニブで処理した（ｎ＝５）。生存曲線、生存日数の中央値、および転移モデル動物における肺組織の代表的なＨ＆Ｅ染色。（図９Ｃ）ＥｐＡｂ２－６および／またはクリゾチニブを同所性動物モデルで評価する実験のタイムライン。（図９Ｄ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ細胞を同所移植し、腫瘍接種３日後から対照ＩｇＧ（正常マウスＩｇＧ、ＮＭＩｇＧ）、クリゾチニブ、ＥｐＡｂ２－６またはクリゾチニブとＥｐＡｂ２－６の併用投与を行った（ｎ＝５）。腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ ２００イメージングシステムで生物発光を調べることにより測定した。（図９Ｅ）生物発光定量法で測定したＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ腫瘍細胞。（図９Ｆ）ＨＣＴ１１６同所性動物モデルにおける各処置群の体重。（図９Ｇ）ＨＣＴ１１６同所性動物モデルにおける各処置群の生存曲線および生存日数中央値。（図９Ｈ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞を定位移植し、腫瘍接種３日後から対照ＩｇＧ、クリゾチニブ、ＥｐＡｂ２－６またはクリゾチニブとＥｐＡｂ２－６の併用投与を行った（ｎ＝５）。腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ ２００イメージングシステムで生物発光を調べることにより測定した。（図９Ｉ）生物発光定量法で測定したＨＴ２９－Ｌｕｃ腫瘍細胞。（図９Ｊ）ＨＴ２９同所性動物モデルにおける、各処置群の示された処置後のマウス体重。（図９Ｋ）ＨＴ２９同所性動物モデルにおける各処置群の生存曲線および生存日数中央値。すべてのデータは平均値±ＳＥＭで示した。＊, ｐ＜０．０５； ＊＊, ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【0029】
発明の詳細な説明
以下の説明は、単に本発明の種々の態様を説明するためのものである。そのため、本明細書で説明する特定の態様または改変は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更または均等態様が実施され得ることは理解し得る。
以下の説明は、単に本発明の種々の態様を説明するためのものである。そのため、本明細書で説明する特定の態様または改変は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではない。当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更または均等態様が実施され得ることは理解し得る。
【0030】
本発明を明確かつ容易に理解するために、まず特定の用語を定義する。その他の定義は、詳細な説明の中に記載されている。別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0031】
本明細書で用いる、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈で別段の明確な記載がない限り、複数の対象を含む。よって、例えば、“構成要素（a component）”への言及には、複数のそのような構成要素および当業者に既知のそれらの均等物が含まれる。
【0032】
用語“含む（comprise）”または“含むこと（comprising）”とは、一般的に、１以上の特徴、成分または構成要素の存在を許容することを意味する、含む（include）／含むこと（including）という意味で用いられる。用語“含む”または“含むこと”は、用語“～からなる（consist）”または“～からなる（consisting of）”を包含する。
【0033】
本明細書で用いる用語“ポリペプチド”とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。用語“タンパク質”とは、通常、比較的大きなポリペプチドを意味する。用語“ペプチド”とは、通常、比較的短いポリペプチド（例えば、最大１００アミノ酸残基、９０アミノ酸残基、７０アミノ酸残基、５０アミノ酸残基、３０アミノ酸残基、２０アミノ酸残基または１０アミノ酸残基を含む）を意味する。
【0034】
本明細書で用いる用語“約（approximately）”または“約（about）”は、当業者に理解され得る許容可能な逸脱の程度を意味し、それが用いられる文脈によってある程度変化し得る。具体的には、“約”とは、指示される数値の±１０％または±５％または±３％の範囲を有する数値を意味し得る。
【0035】
本明細書で用いる用語“実質的に同一”とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性（homology）を有する２つの配列を意味する。
【0036】
本明細書で用いる用語“抗体”（複数形が互換的に用いられる）は、特定の標的抗原性分子に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いる用語“抗体”には、インタクトな（すなわち全長の）抗体分子だけでなく、抗原結合能を保持するその抗原結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖも含まれる。かかるフラグメントも当技術分野ではよく知られており、インビトロでもインビボでも常用されている。用語“抗体”には、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のその他の修飾構成（抗体のアミノ酸配列変異体、抗体のグリコシル化変異体、および共有結合的に修飾された抗体を含む）も含まれる。
【0037】
インタクトなまたは完全な抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。各重鎖は可変領域（ＶＨ）および第１、第２および第３の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、各軽鎖は可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を含む。抗体は“Ｙ”字型をしており、Ｙの軸はジスルフィド結合を介して結合した２本の重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、１本の軽鎖の可変領域および定常領域に結合した１本の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域が抗原結合を担っている。両鎖の可変領域は、一般的に、抗原結合を担っており、各々３つの高度に可変の領域、すなわち、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ、ならびにＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、ＬＣ ＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲを含む。３つのＣＤＲはフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に隣接しており、これらの領域はＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変領域を支える足場を形成している。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合には関与していないが、種々のエフェクター機能に関与している。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類される。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要なクラスがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。
【0038】
本明細書では、用語“抗原結合フラグメント”または“抗原結合ドメイン”とは、抗原結合を担うインタクトな抗体分子の一部または領域を意味する。抗原結合フラグメントは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合できる。抗原結合フラグメントの例としては、(i) ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖からなる一価フラグメントであり得るＦａｂフラグメント；(ii) ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントからなる二価フラグメントであり得るＦ（ａｂ’）２フラグメント；(iii) 抗体分子のＶＨドメインおよびＶＬドメインが非共有結合で結合したＦｖフラグメント；(iv) ペプチドリンカーを介してＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される一本鎖ポリペプチド鎖であり得る単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；(v) ペプチドリンカーによって連結された２つのＶＨドメインおよびジスルフィド橋を介して２つのＶＨドメインと結合している２つのＶＬドメインを含み得る（ｓｃＦｖ）２、が挙げられるが、これらに限定されない。
【0039】
本明細書で用いる用語“キメラ抗体”とは、異なる供給源、例えば異なる種由来のポリペプチドを含む抗体を意味する。ある態様において、キメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、ある種の哺乳動物（例えば、マウス、ウサギおよびラットなどの非ヒト哺乳動物）由来の抗体の可変領域を模倣し得るが、一方で定常領域は、ヒトなどの別の哺乳動物由来の抗体の配列と相同であってもよい。
【0040】
本明細書で用いる用語“ヒト化抗体”とは、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１以上のＣＤＲを含む抗体を意味する。
【0041】
本明細書で用いる用語“ヒト抗体”とは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖および重鎖の配列の本質的に全体がヒト遺伝子由来の抗体を意味する。ある場合には、ヒト抗体は、例えば、可能性のある免疫原性を減少させ、親和性を増加させ、望ましくない折り畳み（フォールディング）を引き起こし得るシステインを除去するなどのために、１以上のＣＤＲ、または１以上のＦＲに変異を加えるなどして、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされていない１以上のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【0042】
本明細書で用いる用語“特異的に結合する（specific binds, specifically binding）”とは、標的抗原のエピトープへの抗体の結合など、２分子間の非ランダムな結合反応を意味する。標的抗原またはエピトープに“特異的に結合する”抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、そのような特異的結合を決定する方法も当技術分野でよく知られている。抗体が標的抗原と“特異的に結合”するのは、他の物質と結合するよりも高い親和性／結合力（avidity）で、より容易に、および／またはより長時間結合するときである。換言すれば、この定義を読めば、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合しても、または結合しなくてもよいことも理解される。そのため、“特異的結合”または“優先的結合”は、必ずしも排他的結合を必要としない（含めることはできる）。一般的に、結合の親和性は解離定数（ＫＤ）で定義され得る。一般的には、抗体に関して用いられるとき、特異的に結合するとは、約１０７Ｍ未満、約１０８Ｍ未満、約１０９Ｍ未満、約１０１０Ｍ未満、約１０１１Ｍ未満、約１０１２Ｍ未満、またはそれ以下などのＫＤ値でその標的に特異的に結合（認識）し、かつ非特異的抗原（ＢＳＡまたはカゼインなど）への結合に対する親和性よりも少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、または少なくとも１０，０００倍低いＫＤに対応する親和性で特異的標的に結合する抗体を意味し得る。
【0043】
本明細書で用いる用語“核酸”または“ポリヌクレオチド”とは、ヌクレオチド単位からなるポリマーを意味し得る。ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（“ＤＮＡ”）およびリボ核酸（“ＲＮＡ”）のような天然核酸、ならびに天然に存在しないヌクレオチドを有する核酸類縁体が含まれる。ポリヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成機を用いて合成できる。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されるとき、“Ｕ”が“Ｔ”に置き換わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれることが理解され得る。用語“ｃＤＮＡ”とは、一本鎖または二本鎖の形態で、ｍＲＮＡと相補的または同一のＤＮＡを意味する。
【0044】
本明細書で用いる用語“相補的”とは、２つのポリヌクレオチドの相互作用する表面の位相的な互換性または一致を意味する。第１のポリヌクレオチドは、そのヌクレオチド配列が第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一であるとき、第２のポリヌクレオチドと相補的である。したがって、配列が５’－ＡＴＡＴＣ－３’であるポリヌクレオチドは、配列が５’－ＧＡＴＡＴ－３’であるポリヌクレオチドと相補的である。
【0045】
本明細書で用いる用語“をコードする”とは、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）中のヌクレオチドの特定の配列が、ＲＮＡ転写物（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡである）の所定の配列またはアミノ酸の所定の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する天然特性、およびそこから生じる生物学的特性を意味する。したがって、遺伝子は、その遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写および翻訳によって、細胞またはその他の生物学的システムでタンパク質が産生されるとき、タンパク質をコードしている。遺伝子コードの縮重の結果、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解される。また、当業者は、常套技術を用いて、ポリペプチドが発現される特定の宿主生物のコドン利用を反映させるために、そこに記載されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解される。したがって、別段の定めがない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”とは、互いに縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。
【0046】
本明細書で用いる用語“組換え核酸”とは、天然には互いに結合していない配列を有するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。組換え核酸はベクターの形態で存在してもよい。“ベクター”は、目的のヌクレオチド配列および調節配列を含み得る。ベクターは、所定のヌクレオチド配列を発現させるため（発現ベクター）、または所定のヌクレオチド配列を複製、操作または異なる場所間（例えば、異なる生物間）で移動させるために維持するために使用できる。ベクターは、上記の目的のために適当な宿主細胞に導入できる。“組換え細胞”とは、組換え核酸が導入された宿主細胞を意味する。“形質転換された細胞”とは、組換えＤＮＡ技術によって、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ分子が導入された細胞を意味する。
【0047】
ベクターは、プラスミド、コスミド、エピソーム、フォスミド、人工染色体、ファージ、ウイルスベクターなどを含む種々のタイプのものであってよい。一般的には、ベクターにおいて、所定のヌクレオチド配列は、ベクターが宿主細胞に導入されるとき、所定のヌクレオチド配列が調節配列の制御下で宿主細胞において発現され得るように、調節配列に作動可能に連結されている。調節配列としては、例えば、これらに限定されないが、プロモーター配列（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、Ｔ７プロモーターおよびアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）プロモーター）、開始コドン、複製起点、エンハンサー、分泌シグナル配列（例えば、α－交配因子（mating factor）シグナル)、停止コドン、および他の制御配列（例えば、シャイン・ダルガーノ配列、終止配列）が挙げられ得る。好ましくは、ベクターは、その後のスクリーニング／選択手順のためのマーカー配列（例えば、抗生物質耐性マーカー配列）をさらに含み得る。タンパク質産生の目的のために、ベクターでは、目的の所定のヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドが産生され、その後の精製手順に有益となるように、上記の調節配列以外の別のヌクレオチド配列に連結され得る。前記融合ポリペプチドは、精製を目的としたタグ、例えばＨｉｓタグを含む。
【0048】
本明細書で用いる用語“処置”とは、障害、障害の症状もしくは状態、または障害の進行をケア、治癒、緩和、寛解、変更、救済、軽減、改善または影響を及ぼす目的で、前記障害に罹患している、障害の症状もしくは状態、障害によって誘発される障害、または障害の進行を有する対象への１以上の活性薬剤の適用または投与を意味する。
【0049】
本発明は、少なくとも部分的には、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤を用いた併用癌治療法の開発に基づく。
【0050】
ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインであるＥｐＥＸは、２つの上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメインを含み、腫瘍局所微小環境における可溶性増殖因子として機能し得る。ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の活性化は、ＥｐＣＡＭの制御された膜内タンパク質分解（ＲＩＰ）を誘発し、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を誘導できる（Hsu et al., 2016）。ＥＧＦＲはＲＴＫの１つであり、種々の腫瘍で過剰発現していることから、多くの種類の癌に深く関係している（Normanno et al, 2006）。ＨＧＦＲの過剰な活性化は、ＡＫＴ、細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ）、ホスホイノシチド３－キナーゼ、ＲＡＳおよびＳＲＣなどの多くの下流エフェクターを介して、癌細胞の増殖、生存および遊走を促進する（Normanno et al, 2006）（Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017)。ＨＧＦＲ発現は、基底型乳癌ではＥＧＦＲ発現と正の相関があり（Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017）、ＨＧＦＲおよびＥＧＦファミリー受容体はしばしば癌細胞で共発現する（Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017）。さらに、表皮がん細胞をＥＧＦＲリガンドで刺激すると、ＥＧＦＲ依存的なリン酸化およびＨＧＦＲの活性化が生じる（Comoglio et al, 2008; Ortiz-Zapater et al, 2017）。ＥＧＦＲシグナルが上昇した細胞におけるＨＧＦＲのこのような交差活性化は、いくつかの腫瘍タイプでも観察されている（Tang et al, 2008）。
【0051】
本発明において、驚くべきことに、ＥｐＥＸがＨＧＦＲに結合し、その下流のシグナル伝達を活性化して、細胞の増殖、遊走および浸潤を促進することが見出された。また、ＥｐＣＡＭ中和抗体であるＥｐＡｂ２－６がＨＧＦＲのリン酸化を抑制し、癌細胞の転移を阻害することもわかった。したがって、本発明の結果は、癌転移に対抗するためにＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲシグナル伝達を同時に標的とすることの機序的根拠を提供するものである。
【0052】
本明細書で用いる“併用療法”とは、２以上の治療薬またはアプローチを組み合わせた治療を意味する。“併用”とは、２以上の治療薬または治療アプローチが、同じ対象に、同時にまたは順番に投与されることを意味する。好ましくは、併用療法は相乗効果をもたらす。
【0053】
本明細書で用いる用語“相乗効果”とは、２以上の活性物質の組合せにおいて、２以上の活性物質の組み合わせ活性が各活性物質単独の活性の合計を超えるような組み合わせ作用を意味し、またそれを含む。また、用語“相乗効果”とは、２以上の活性物質を併用したとき、単一物質を用いたときと比較して、同等の活性または増強された活性を達成するために、それぞれのより低用量を用い得るような併用活性を提供することも意味し得る。
【0054】
したがって、本発明は、癌を処置するための併用療法であって、（i）ＥｐＣＡＭシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第１の阻害剤（ＥｐＣＡＭ阻害剤）；および、（ii）ＨＧＦＲシグナル伝達の活性化を阻害する有効量の第２の阻害剤（ＨＧＦＲ阻害剤）を含む組み合わせを、それを必要とする対象に投与することを含む、併用療法を提供する。
【0055】
いくつかの態様において、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩ（ＥｐＣＡＭのａａ２７～５９）およびＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩＩ（ＥｐＣＡＭのａａ６６～１３５）に特異的に結合する。具体的には、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥＧＦ様ドメインＩに位置するＣＶＣＥＮＹＫＬＡＶＮ（ａａ２７～３７）（配列番号２０）、およびＥＧＦ様ドメインＩＩに位置するＫＰＥＧＡＬＱＮＮＤＧＬＹＤＰＤＣＤ（ａａ ８３～１００）（配列番号１９）の配列内のエピトープに特異的結合親和性を有する。より具体的には、本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体は、ＥｐＣＡＭのドメインＩ内のＮＹＫモチーフ（ａａ ３１－３３）およびドメインＩＩ内のＬＹＤモチーフ（ａａ ９４－９６）を認識する。対照的に、他の多くの抗体（例えば、ＭＴ２０１、Ｍ９７、３２３／Ａ３およびエドレコロマブ）は、ＥｐＣＡＭのよく知られているＥＧＦ Ｉドメインのみを標的としている。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体の、他の抗体とは異なる特徴を以下に述べる。
【0056】
本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体の１つは、以下の実施例に示すＥｐＡｂ２－６である。ＥｐＡｂ２－６の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびにそれらの相補性決定領域（ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２およびＨＣ ＣＤＲ３）（ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２およびＬＣ ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を、以下の表１に示す。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体には、ＥｐＡｂ２－６およびその機能変異体が含まれる。
【0057】
【表1】
【0058】
いくつかの態様において、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体は、(a) 配列番号２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、(b) 配列番号９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬを含むことを特徴とするＥｐＡｂ２－６の機能的変異体、またはその抗原結合フラグメントである。
【0059】
いくつかの態様において、(a) 配列番号２のＨＣ ＣＤＲ１、配列番号４のＨＣ ＣＤＲ２、および配列番号６のＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに、(b) 配列番号９のＬＣ ＣＤＲ１、配列番号１１のＬＣ ＣＤＲ２、および配列番号１３のＬＣ ＣＤＲ３を含むＶＬを有する、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体は、配列番号１５またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むＶＬを含み得る。具体的には、本発明の抗ＥｐＥＸ抗体、配列番号１５と少なくとも８０％（例えば、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６と少なくとも８０％（例えば、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％または９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。本発明の抗ＥｐＥＸ抗体には、本明細書に記載の関連するＶＨまたはＶＬアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列によってコードされる、遺伝子組換え（engineered）由来の抗体も含まれる。
【0060】
用語“実質的に同一”とは、変異体の関連アミノ酸配列（例えば、ＦＲ、ＣＤＲ、ＶＨ、またはＶＬにおいて）が参照（reference）抗体と比較して実質的に差異がなく、変異体が参照抗体に対して実質的に同等の結合活性（例えば、親和性、特異性またはその両方）および生物活性を有することを意味し得る。このような変異体には、わずかなアミノ酸の変化が含まれ得る。ポリペプチドは、その活性または機能とは無関係に、ポリペプチドのある部分内でなされ得る限られた数の変化または修飾を有していてもよく、それでもなお、同等または類似の生物学的活性または機能の許容可能なレベルを有する変異体が得られることが理解され得る。いくつかの例では、アミノ酸残基の変化は保存的アミノ酸置換であり、これは別のアミノ酸残基と類似の化学構造のアミノ酸残基を意味し、ポリペプチドの機能、活性または特性に対する他の生物学的影響は小さいか、実質的に影響しない。通常、ＦＲ領域では、ＣＤＲ領域とは対照的に、抗体の結合機能および生物活性に悪影響を与えない限り（例えば、元の抗体と比較して結合親和性を５０％以上低下させるなど）、比較的多くの置換を行うことができる。ある態様において、配列同一性は、参照抗体と変異体との間で、約８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、または９９％、またはそれ以上であり得る。変異体は、当業者に公知のポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得、例えば、そのような方法をまとめた文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されている。例えば、アミノ酸の保存的置換には、以下のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ｉ）Ａ、Ｇ；（ｉｉ）Ｓ、Ｔ；（ｉｉｉ）Ｑ、Ｎ；（ｉｖ）Ｅ、Ｄ；（ｖ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｖｉ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；および、（ｖｉｉ）Ｋ、Ｒ、Ｈ。
【0061】
本明細書に記載の抗体は、動物抗体（例えば、マウス由来抗体）、キメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ抗体）、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。本明細書に記載の抗体は、抗原結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（ｓｃＦｖ）２も含み得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、当技術分野で公知の方法により調製できる。
【0062】
本明細書で用いる抗ＥｐＥＸ抗体の詳細は、米国特許第９，１８７，５５８号に記載されている通りであり、それぞれの関連する記載は、本明細書で言及される目的または主題について、引用により本明細書に包含させる。
【0063】
抗体またはその抗原結合フラグメントを得るためには、この技術分野で従来から用いられている数多くの方法が利用可能である。
【0064】
ある態様において、本明細書で提供される抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製できる。一般に、標的抗原、例えば腫瘍抗原を、要すれば担体タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ、および／またはアジュバント、例えば完全フロイントアジュバントと混合し、その抗原に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫するために使用できる。モノクローナル抗体を分泌するリンパ球を採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製する。このようにして形成されたハイブリドーマクローンをスクリーニングし、目的のモノクローナル抗体を分泌するものを同定し選択する。
【0065】
ある態様において、本明細書で提供される抗体は組換え技術によって調製できる。関連する局面において、開示されたアミノ酸配列をコードする単離された核酸もまた、そのような核酸を含むベクターおよびその核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞とともに、提供される。
【0066】
例えば、このような抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、常套技術により発現ベクター（例えば、大腸菌ベクターのような細菌ベクター、酵母ベクター、ウイルスベクター、または哺乳動物ベクター）にクローニングでき、抗体の発現のために、いずれかのベクターを適切な細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）に導入できる。本明細書に記載の抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列の例を表１に示す。哺乳動物宿主細胞株の例としては、ヒト胚性腎臓株（２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ細胞）、およびヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２細胞）が挙げられる。本明細書に記載の抗体を発現させるための組換えベクターは、通常、構成性または誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含む。一般的なベクターは、抗体をコードする核酸の発現制御に有用な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列ならびにプロモーターを含む。ベクターは、要すれば、原核生物系および真核生物系の両方の選択マーカーを含み得る。いくつかの例では、重鎖および軽鎖の両方のコーディング配列が同じ発現ベクターに含まれている。他の例では、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれを個別のベクターにクローニングし、別々に作製した後、抗体の組み立てに適した条件下でインキュベートできる。
【0067】
本明細書に記載の抗体を発現させるための組換えベクターは、通常、構成性または誘導性のいずれかのプロモーターに作動可能に連結された抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含む。組換え抗体は、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物細胞などの原核生物または真核生物の発現系で生産できる。一般的なベクターは、抗体をコードする核酸の発現制御に有用な転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、開始配列ならびにプロモーターを含む。ベクターは、要すれば、原核生物系と真核生物系の両方の選択マーカーを含み得る。産生された抗体タンパク質は、さらに単離または精製して、さらなるアッセイおよび適用のために実質的に均質な調製物を得ることができる。適切な精製手順としては、例えば、免疫親和性カラムまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、硫酸アンモニウム沈殿、およびゲルろ過が挙げられる。
【0068】
完全長抗体が望まれるとき、本明細書に記載のＶＨ鎖およびＶＬ鎖の何れかのコーディング配列を免疫グロブリンのＦｃ領域のコーディング配列に連結でき、完全長抗体重鎖および軽鎖をコードする得られた遺伝子を適当な宿主細胞、例えば植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、または昆虫細胞で発現させ、組み立てることができる。
【0069】
抗原結合フラグメントは常套法で調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは全長抗体分子のペプシン消化によって生成でき、ＦａｂフラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって作製することができる。あるいは、このようなフラグメントは、適切な宿主細胞で重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを発現させ、インビボまたはインビトロのいずれかで所望の抗原結合フラグメントを形成するように集合させることにより、組換え技術によって調製することもできる。１本鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することにより、組換え技術によって調製できる。好ましくは、フレキシブルリンカーが２つの可変領域の間に組み込まれている。
【0070】
抗体のＮ末端および／またはＣ末端に、別のタンパク質および／または薬物もしくは担体など、１以上の追加の要素を結合させるために、１つの抗体をさらに修飾できる。好ましくは、追加の要素を結合させた抗体は、所望の結合特異性および治療効果を保持する一方で、例えば、溶解性、保存または他の取り扱い特性、細胞透過性、半減期、過敏症の軽減、送達および／または分布の制御を補助する追加の要素に起因する追加の特性を提供する。他の態様には、アッセイ、検出、追跡などのための色素または蛍光色素などの標識の結合が含まれる。ある態様では、抗体をペプチド、色素、フルオロフォア、炭水化物、抗癌剤、脂質などの追加の要素に結合させ得る。さらに、抗体は、例えば、免疫リポソームを形成するために、Ｆｃ領域を介してリポソームの表面に直接結合させることができる。
【0071】
ある態様において、第２の阻害剤（ＨＧＦＲ阻害剤）は、ＨＧＦのＨＧＦＲへの結合を阻害する。
【0072】
ある態様において、第２の阻害剤（ＨＧＦＲ阻害剤）は、ＨＧＦＲの低分子チロシンキナーゼ受容体阻害化合物である。表２に、低分子ＨＧＦＲ阻害化合物の例をいくつか示す。
【0073】
【表2-1】
【表2-2】
【0074】
本発明に有用なＨＧＦＲ阻害化合物のさらなる例としては、ＡＭＥＰ（Bioalliance）、ＥＭＤ－１２０４８３１（Merck KgaA/EMD Serono）、ＩＮＣＢ－０２８０６０（Incyte/Novartis）、ＡＲＱ１９７（ArQule）、ＡＭＧ１０２（Amgen）およびＲＧ－３６３８（Roche/Genentech）などが挙げられるが、これらに限定されない。詳細は、例えばＷＯ２０１２０４２４２１Ａ１に記載されており、引用によりその内容全体が本明細書に包含される。
【0075】
本明細書で用いる用語“低分子ＨＧＦＲ阻害化合物”または“低分子ＨＧＦＲ阻害剤”としては、ＨＧＦＲを阻害する、またはＨＧＦＲに結合する低分子化合物が含まれる。別段に他の記載がない限り、本明細書において低分子ＨＧＦＲ阻害剤に言及する場合、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物および複合体、ならびにその薬学的に許容される塩（その多形、立体異性体、同位体標識体を含む）の溶媒和物、水和物および複合体への言及を含む。
【0076】
本明細書で用いる用語“薬学的に許容される塩”には酸付加塩が含まれる。“薬学的に許容される酸付加塩”とは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いて形成される、遊離塩基の生物学的効果および特性を保持する塩を意味する。用語“薬学的に許容される塩”には塩基塩も含まれる。適切な塩基性塩は、無毒性の塩を形成する塩基から形成される。例えば、アルミニウム塩、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオラミン塩、グリシン塩、リジン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、亜鉛塩などが挙げられる。
【0077】
本明細書で用いる用語“有効量”とは、処置された対象または細胞に所望の生物学的効果を付与するための有効成分の量を意味する。有効量は、投与経路および投与頻度、当該医薬を投与される個体の体重および種類、投与目的などの種々の理由により変化し得る。当業者は、本明細書の記載、確立された方法、および自身の経験に基づいて、それぞれの場合の投与量を決定できる。
【0078】
本明細書に記載の処置方法によって処置される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳類動物には、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長動物、馬、犬、猫、マウス、ラットなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0079】
本明細書で用いる“薬学的に許容される担体”とは、担体が組成物中の有効成分と適合性があり、好ましくは当該有効成分を安定化させることができ、受容する個体に対して安全であることを意味する。前記担体は、有効成分に対する希釈剤、ビークル、賦形剤またはマトリックスであってもよい。一般に、有効成分、例えばＥｐＣＡＭ阻害剤、ＨＧＦＲ阻害剤、またはそれらの組合せを含む組成物は、水溶液、例えば生理食塩水のような溶液の形態で製剤化することもでき、粉末の形態で提供することもできる。適切な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要な薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのｐＨ調整剤および緩衝剤をさらに含んでいてもよい。組成物の形態は、錠剤、丸薬、粉末、ロゼンジ、分包、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、ローション、溶液、シロップ、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、および包装粉末であり得る。本発明の組成物は、経口法、経腸法（筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内など）、経皮法、座薬法、経鼻法など、生理学的に許容される何れかの経路で送達できる。特定の態様において、本発明の組成物は、即時使用可能な剤形として、または再構成可能な安定粉末として提供され得る液体注射剤形として投与される。
【0080】
いくつかの態様において、本発明で用いる２つの活性成分、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤は、対象への同時投与、個別投与または逐次投与のために、混合物として、または独立して、キットの形態で製剤化できる。各成分は、適切な投与経路のために、適切な薬学的に許容される担体と共に製剤化できる。ある態様において、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤は、ＥｐＣＡＭ阻害剤またはそれを含む組成物およびＨＧＦＲ阻害剤またはそれを含む組成物が別個の包装単位内に存在する適切な包装単位で提供され得る。
【0081】
本発明によれば、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤の併用は、ＥｐＣＡＭ阻害剤またはＨＧＦＲ阻害剤単独と比較して、癌の治療、特に癌細胞の遊走／浸潤の阻害、腫瘍サイズの縮小、腫瘍の進行、転移の軽減または抑制、および／または癌患者の生存期間の延長において相乗効果をもたらす。特に、実施例（例えば、実施例２．８）に示す、転移性および同所性動物モデルにおいて、対照ＩｇＧおよびＨＧＦＲ阻害剤（クリゾチニブ）投与群では全ての動物が有意な腫瘍および不良な生存期間を示すが、ＥｐＣＡＭ阻害剤としてＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）を投与した群では腫瘍の進行が遅く、生存期間中央値が高い、そして驚くべきことに、ＥｐＣＡＭ阻害剤としてのＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）およびＨＧＦＲ阻害剤（クリゾチニブ）を用いた併用療法は、腫瘍進行の抑制において相乗的な顕著な効果をもたらすことが示されている。
【0082】
いくつかの態様において、ＥｐＣＡＭ阻害剤およびＨＧＦＲ阻害剤は、相乗的な抗癌作用または抗転移効果を提供するために、同時に、別個にまたは逐次的に投与され、特に、癌は相乗的な組み合わせに対して感受性である。
【0083】
いくつかの態様において、癌は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、胃癌、頭頸部癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌および精巣癌からなる群より選択される。
【0084】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定ではなく実証の目的で提供される。当業者であれば、本明細書の記載に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、記載されている特定の態様に多くの変更を加えても、同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【実施例】
【0085】
ＥｐＣＡＭシグナル伝達は結腸癌の進行および転移を促進することが知られている。転移は癌処置の失敗の主な原因の１つであるが、転移過程におけるＥｐＣＡＭシグナル伝達の関与は不明である。本発明は、ＥｐＣＡＭの可溶性細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）がＨＧＦＲに結合し、大腸癌細胞において下流のシグナル伝達を誘導することを示す。本発明者らはまた、ＨＧＦ処置によりＥｐＥＸ産生が上昇し、ＥｐＥＸおよびＨＧＦがＨＧＦＲシグナル伝達を協調的に制御することも示す。さらに、ＥｐＥＸは、ＥＲＫおよびＦＡＫ－ＡＣＴシグナル伝達経路を活性化することによって結腸癌細胞の転移能を増強させ、ＧＳＫ３β活性を低下させることによって活性化β－カテニンおよびスネイルタンパク質をさらに安定化させる。最後に、抗ＥｐＣＡＭ中和抗体（ＥｐＡｂ２－６）およびＨＧＦＲ阻害剤（クリゾチニブ）の併用療法が、大腸癌の転移性および同所性動物モデルにおいて、腫瘍の進行を有意に抑制し、生存期間を延長することを示す。この知見は、ＥｐＣＡＭシグナル伝達による大腸癌転移促進の分子メカニズムを明らかにし、ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用が大腸癌治療の有効な戦略となり得ることをさらに示唆するものである。
【0086】
１．材料および方法
１．１ 化合物および抗体
抗α－チューブリン抗体およびＧＡＰＤＨ抗体はSigma-Aldrichから入手した。ヒトＥｐＣＡＭ、全ＥＲＫおよびＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４－リン酸化ＥＲＫ、全ＡＫＴ、Ｓｅｒ４７３－リン酸化ＡＫＴ、全ＨＧＦＲ、Ｔｙｒ１２３４／１２３５－リン酸化ＨＧＦＲ、非リン酸化（活性型）β－カテニン（Ｓｅｒ４５）、β－カテニン、Ｅ－カドヘリン、ビメンチン、スネイル、スラグおよびツイストに対する抗体は、Cell Signaling Technology社から入手した。ＬＹ２９４００２（ＡＫＴ阻害剤）もCell Signaling Technology社から入手した。フォレチニブ（ＨＧＦＲ阻害剤）、ＳＵ１１２７４（ＨＧＦＲ阻害剤）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）、ＰＦ－５６２２７１（ＦＡＫ阻害剤）およびＢＩＯ（ＧＳＫ３β阻害剤）は、Selleck Chemicalsから入手した。クリゾチニブ（ＨＧＦＲ阻害剤）は、Med Chem Expressから入手した。全ＧＳＫ３β、リン酸化ＧＳＫ３β（ホスホＳ９）、リン酸化ＡＤＡＭ１７（ホスホＴ７３５）、全ＡＤＡＭ１７、リン酸化プレセニリン２／ＡＤ５（ホスホＳ３２７）、全プレセニリン２／ＡＤ５、Ｖ５タグ、６ｘ Ｈｉｓタグ、ｃ－Ｍｙｃタグに対する抗体、ならびにＭｅｔ（ｐＹ１２３４／ｐＹ１２３５）＋全Ｍｅｔ ＥＬＩＳＡ キット（ａｂ１２６４５１）はAbcamから入手した。ヒトＨＧＦＲ（ｃ－ＭＥＴ）およびＨＧＦ組換えタンパク質はSino Biological社から入手した。
１．１ 化合物および抗体
抗α－チューブリン抗体およびＧＡＰＤＨ抗体はSigma-Aldrichから入手した。ヒトＥｐＣＡＭ、全ＥＲＫおよびＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４－リン酸化ＥＲＫ、全ＡＫＴ、Ｓｅｒ４７３－リン酸化ＡＫＴ、全ＨＧＦＲ、Ｔｙｒ１２３４／１２３５－リン酸化ＨＧＦＲ、非リン酸化（活性型）β－カテニン（Ｓｅｒ４５）、β－カテニン、Ｅ－カドヘリン、ビメンチン、スネイル、スラグおよびツイストに対する抗体は、Cell Signaling Technology社から入手した。ＬＹ２９４００２（ＡＫＴ阻害剤）もCell Signaling Technology社から入手した。フォレチニブ（ＨＧＦＲ阻害剤）、ＳＵ１１２７４（ＨＧＦＲ阻害剤）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ阻害剤）、ＰＦ－５６２２７１（ＦＡＫ阻害剤）およびＢＩＯ（ＧＳＫ３β阻害剤）は、Selleck Chemicalsから入手した。クリゾチニブ（ＨＧＦＲ阻害剤）は、Med Chem Expressから入手した。全ＧＳＫ３β、リン酸化ＧＳＫ３β（ホスホＳ９）、リン酸化ＡＤＡＭ１７（ホスホＴ７３５）、全ＡＤＡＭ１７、リン酸化プレセニリン２／ＡＤ５（ホスホＳ３２７）、全プレセニリン２／ＡＤ５、Ｖ５タグ、６ｘ Ｈｉｓタグ、ｃ－Ｍｙｃタグに対する抗体、ならびにＭｅｔ（ｐＹ１２３４／ｐＹ１２３５）＋全Ｍｅｔ ＥＬＩＳＡ キット（ａｂ１２６４５１）はAbcamから入手した。ヒトＨＧＦＲ（ｃ－ＭＥＴ）およびＨＧＦ組換えタンパク質はSino Biological社から入手した。
【0087】
１．２ 細胞株および培養
以下のヒト細胞株を用いた:ＨＥＫ２９３Ｔ、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２４７）、ＨＴ２９。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Gibco）および１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ； Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco）で、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター中で培養した。
以下のヒト細胞株を用いた:ＨＥＫ２９３Ｔ、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２４７）、ＨＴ２９。細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Gibco）および１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ； Gibco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Gibco）で、３７℃、５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター中で培養した。
【0088】
１．３ 哺乳動物レンチウイルスｓｈＲＮＡ
ノックダウン実験のために、ｐＬＫＯベクター中のヒトＥｐＣＡＭ ｓｈＲＮＡを中央研究院のＲＮＡｉコア施設から入手した。レンチウイルスは標準プロトコルに従って作製し、若干の修正を加えた。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を１００ｍｍディッシュに７０％の密度で播種し、パッケージングベクター（すなわち、ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子を含む））、エンベロープベクター（すなわち、ｐＭＤ２.Ｇ；ＶＳＶ－Ｇ発現プラスミド）、および個々のｓｈＲＮＡベクターでトランスフェクトした。ポリジェットトランスフェクション試薬（SignaGen Laboratories）を用いて、ｓｈＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。一晩培養後、培地をＢＳＡ含有培地に変えた。ＨＣＴ１１６細胞を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を含むウイルス上清で２４時間感染させ、感染手順を繰り返した後、細胞をピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）中で７日間インキュベートし、安定したｓｈＲＮＡ発現を有する細胞を選択した。
ノックダウン実験のために、ｐＬＫＯベクター中のヒトＥｐＣＡＭ ｓｈＲＮＡを中央研究院のＲＮＡｉコア施設から入手した。レンチウイルスは標準プロトコルに従って作製し、若干の修正を加えた。簡単に説明すると、２９３Ｔ細胞を１００ｍｍディッシュに７０％の密度で播種し、パッケージングベクター（すなわち、ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１（ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｒｅｖ遺伝子を含む））、エンベロープベクター（すなわち、ｐＭＤ２.Ｇ；ＶＳＶ－Ｇ発現プラスミド）、および個々のｓｈＲＮＡベクターでトランスフェクトした。ポリジェットトランスフェクション試薬（SignaGen Laboratories）を用いて、ｓｈＲＮＡプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。一晩培養後、培地をＢＳＡ含有培地に変えた。ＨＣＴ１１６細胞を、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）を含むウイルス上清で２４時間感染させ、感染手順を繰り返した後、細胞をピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）中で７日間インキュベートし、安定したｓｈＲＮＡ発現を有する細胞を選択した。
【0089】
１．４ ＥｐＣＡＭ遺伝子ノックアウト
ＥｐＣＡＭノックアウトのために、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ ｇＲＮＡコンストラクトをGenescriptから購入した。レンチウイルスを産生するために、２９３Ｔ細胞にＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ ｇＲＮＡプラスミド、ＥｐＣＡＭ ｇＲＮＡ（標的配列：ＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＣ、配列番号２１）、パッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１）およびエンベロープ発現プラスミド（ｐＭＤ.Ｇ）を一過性にトランスフェクトした。ＨＣＴ１１６細胞またはＨＴ２９細胞をレンチウイルス含有培地で培養し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。選択したプールから単一細胞クローンを単離し、ウェスタンブロッティングでＥｐＣＡＭの発現を調べた。
ＥｐＣＡＭノックアウトのために、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ ｇＲＮＡコンストラクトをGenescriptから購入した。レンチウイルスを産生するために、２９３Ｔ細胞にＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９ ｇＲＮＡプラスミド、ＥｐＣＡＭ ｇＲＮＡ（標的配列：ＧＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡＣ、配列番号２１）、パッケージングプラスミド（ｐＣＭＶ－ΔＲ８．９１）およびエンベロープ発現プラスミド（ｐＭＤ.Ｇ）を一過性にトランスフェクトした。ＨＣＴ１１６細胞またはＨＴ２９細胞をレンチウイルス含有培地で培養し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。選択したプールから単一細胞クローンを単離し、ウェスタンブロッティングでＥｐＣＡＭの発現を調べた。
【0090】
１．５ ＥｐＥＸ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の産生および精製
組換えタンパク質はＥｘｐｉ２９３発現系を用いて発現させ、精製した。細胞はＥｘｐｉ２９３発現培地で培養し、エンハンサー試薬の添加によりタンパク質発現を誘導した。遠心分離により上清を回収し、８０００ｇで２０分間、４℃で遠心後、上清をニッケルキレートアフィニティー樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡ、Qiagen）を用いて４℃で２時間インキュベートした。樹脂を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含む洗浄バッファーで洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファーで溶出した。
組換えタンパク質はＥｘｐｉ２９３発現系を用いて発現させ、精製した。細胞はＥｘｐｉ２９３発現培地で培養し、エンハンサー試薬の添加によりタンパク質発現を誘導した。遠心分離により上清を回収し、８０００ｇで２０分間、４℃で遠心後、上清をニッケルキレートアフィニティー樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡ、Qiagen）を用いて４℃で２時間インキュベートした。樹脂を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含む洗浄バッファーで洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールを含む溶出バッファーで溶出した。
【0091】
１．６ ＥｐＣＡＭ ＥＧＦ様ドメイン欠失変異体の構築
ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインには、アミノ酸２７－５９（第１ＥＧＦ様ドメイン）およびアミノ酸６６－１３５（第２ＥＧＦ様ドメイン）の２つのＥＧＦ様ドメイン、ならびにシステイン不含有モチーフが含まれる（Schnell et al., 2013）。ＥｐＣＡＭ ＥＧＦ様ドメイン欠失変異体は、第１の順方向変異誘発欠失プライマー（５’－ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ－３’、配列番号２２）、第１の逆方向変異誘発欠失プライマー（５’－ＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣ－３’、配列番号２３）、第２の順方向プライマー（５’－ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡ－３’、配列番号２４）および第２の逆方向プライマー（５’－ＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴ－３’、配列番号２５）を用いた標準的なQuikChange(商標)欠失変異システムを用いて作製した。ＰＣＲ増幅はKAPA HiFi Hot Start DNAポリメラーゼ（Kapa Biosystems）を用いて行い、生成物は制限酵素ＤｐｎＩ（Thermo Scientific）で処理してメチル化された親ＤＮＡを消化した。
ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインには、アミノ酸２７－５９（第１ＥＧＦ様ドメイン）およびアミノ酸６６－１３５（第２ＥＧＦ様ドメイン）の２つのＥＧＦ様ドメイン、ならびにシステイン不含有モチーフが含まれる（Schnell et al., 2013）。ＥｐＣＡＭ ＥＧＦ様ドメイン欠失変異体は、第１の順方向変異誘発欠失プライマー（５’－ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ－３’、配列番号２２）、第１の逆方向変異誘発欠失プライマー（５’－ＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣ－３’、配列番号２３）、第２の順方向プライマー（５’－ＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＡＡＴＣＴＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＧＡ－３’、配列番号２４）および第２の逆方向プライマー（５’－ＴＣＴＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＴ－３’、配列番号２５）を用いた標準的なQuikChange(商標)欠失変異システムを用いて作製した。ＰＣＲ増幅はKAPA HiFi Hot Start DNAポリメラーゼ（Kapa Biosystems）を用いて行い、生成物は制限酵素ＤｐｎＩ（Thermo Scientific）で処理してメチル化された親ＤＮＡを消化した。
【0092】
１．７ 免疫沈降アッセイ
プロテアーゼ阻害剤（Roche）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ ＮＰ－４０）で細胞を溶解した。免疫沈降では、細胞溶解液を抗体とともに４℃で６時間インキュベートした。その後、２０μＬのDynabeads Protein Gを加え、４℃で２時間インキュベートし、抗体結合タンパク質をプルダウンした。免疫沈降サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルバッファーで変性させ、ウェスタンブロッティングで分析した。
プロテアーゼ阻害剤（Roche）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ ＮＰ－４０）で細胞を溶解した。免疫沈降では、細胞溶解液を抗体とともに４℃で６時間インキュベートした。その後、２０μＬのDynabeads Protein Gを加え、４℃で２時間インキュベートし、抗体結合タンパク質をプルダウンした。免疫沈降サンプルをＰＢＳで３回洗浄し、サンプルバッファーで変性させ、ウェスタンブロッティングで分析した。
【0093】
１．８ モノクローナル抗体の作製およびＩｇＧの精製
ＥｐＡｂ２－６および対照ＩｇＧの生成は、上記（Liao et al., 2015）の通りに行った。実験プロトコルは、中央研究院動物実験倫理委員会の承認を得た（AS IACUC: 11-04-166）。
ＥｐＡｂ２－６および対照ＩｇＧの生成は、上記（Liao et al., 2015）の通りに行った。実験プロトコルは、中央研究院動物実験倫理委員会の承認を得た（AS IACUC: 11-04-166）。
【0094】
１．９ タンパク質の抽出および免疫ブロッティング
全細胞抽出液をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ）で調製した。細胞溶解液のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定した。溶解液を１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をＰＢＳＴ中３％ＢＳＡで１時間ブロックした。その後、膜を一次抗体と共に一晩インキュベートした。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ関連二次抗体（Millipore）を適用し、膜を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。その後、タンパク質バンドを化学発光試薬（Millipore）で可視化し、BioSpectrum 600 Imaging system（ＵＶＰ）で検出した。タンパク質レベルを、Gel-Pro analyzer 3.1（Media Cybernetics）を用いてバンド強度から定量した。
全細胞抽出液をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．４、１％ ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ）で調製した。細胞溶解液のタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイで測定した。溶解液を１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。膜をＰＢＳＴ中３％ＢＳＡで１時間ブロックした。その後、膜を一次抗体と共に一晩インキュベートした。適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ関連二次抗体（Millipore）を適用し、膜を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。その後、タンパク質バンドを化学発光試薬（Millipore）で可視化し、BioSpectrum 600 Imaging system（ＵＶＰ）で検出した。タンパク質レベルを、Gel-Pro analyzer 3.1（Media Cybernetics）を用いてバンド強度から定量した。
【0095】
１．１０ 細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、ＷＳＴ－１（４－［３－（４－ヨードフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－２ Ｈ－５－テトラゾリオ]－１, ３－ベンジンジスルホン酸）アッセイでミトコンドリア脱水素酵素活性を測定することによりアッセイした。細胞を９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。ＥＧＦ、ＥｐＥＸまたはｄｅｇｌｙｃａｎ－ＥｐＥＸを示した濃度で添加した新しい培地を細胞に添加した。処理期間終了後、各ウェルに１０μｌのＷＳＴ－１増殖試薬（５μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、分光光度計マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで検出した。
細胞生存率は、ＷＳＴ－１（４－［３－（４－ヨードフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－２ Ｈ－５－テトラゾリオ]－１, ３－ベンジンジスルホン酸）アッセイでミトコンドリア脱水素酵素活性を測定することによりアッセイした。細胞を９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルの密度で播種し、２４時間培養した。ＥＧＦ、ＥｐＥＸまたはｄｅｇｌｙｃａｎ－ＥｐＥＸを示した濃度で添加した新しい培地を細胞に添加した。処理期間終了後、各ウェルに１０μｌのＷＳＴ－１増殖試薬（５μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、分光光度計マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの吸光度を４５０ｎｍで検出した。
【0096】
１．１１ コロニー形成アッセイ
細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０４細胞／ウェル）、７日間培養した。その後、細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。プレートの画像を撮影した後、０．５％ ＳＤＳ溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度を測定し、細胞の相対密度を決定した。試験はトリプリケートで行った。
細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０４細胞／ウェル）、７日間培養した。その後、細胞を４％のホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。プレートの画像を撮影した後、０．５％ ＳＤＳ溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの吸光度を測定し、細胞の相対密度を決定した。試験はトリプリケートで行った。
【0097】
１．１２ トランスウェル遊走および浸潤アッセイ
細胞の遊走および浸潤を、８μｍ孔径のトランスウェル遊走チャンバー（Millicell社製）を用いて、１０％マトリゲルなし、または１０％マトリゲルありで、アッセイした。細胞（１×１０５）を５００μｌの無血清ＤＭＥＭ中の上部チャンバーに加えた。次に、１０％ＦＢＳを含む７００μｌのＤＭＥＭを化学誘引物質として下部チャンバーに加えた。遊走および浸潤は、標準的な細胞培養インキュベーター中、３７℃で１６時間進行させた。その後、綿棒で膜の上面から細胞を取り除き、下面に移動した細胞を４％パラホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ中）中の０．０５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで１５分間染色し、水で洗浄した。膜を１５－２０分間乾燥させた後、高倍率で観察した膜上の少なくとも４つのランダムフィールドを、各実験条件についてカウントした。
細胞の遊走および浸潤を、８μｍ孔径のトランスウェル遊走チャンバー（Millicell社製）を用いて、１０％マトリゲルなし、または１０％マトリゲルありで、アッセイした。細胞（１×１０５）を５００μｌの無血清ＤＭＥＭ中の上部チャンバーに加えた。次に、１０％ＦＢＳを含む７００μｌのＤＭＥＭを化学誘引物質として下部チャンバーに加えた。遊走および浸潤は、標準的な細胞培養インキュベーター中、３７℃で１６時間進行させた。その後、綿棒で膜の上面から細胞を取り除き、下面に移動した細胞を４％パラホルムアルデヒド（１×ＰＢＳ中）中の０．０５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで１５分間染色し、水で洗浄した。膜を１５－２０分間乾燥させた後、高倍率で観察した膜上の少なくとも４つのランダムフィールドを、各実験条件についてカウントした。
【0098】
１．１３ アポトーシスアッセイ
細胞を播種し、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたは阻害剤で６時間処理した。適切な希釈率で用いた無関係のマウス骨髄腫免疫グロブリンを、ＩｇＧ２ａ（Invitrogen ＃02-6200）のアイソタイプ対照として用いた。アポトーシス細胞はアネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびＰＩを用いて検出し、フローサイトメーター（BD Immmunocytometry Systems）を用いて分析した。初期アポトーシスは、アネキシンＶ－ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩＩ（BD Pharmingen）を用いて測定した。後期アポトーシス核はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で検出した。
細胞を播種し、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたは阻害剤で６時間処理した。適切な希釈率で用いた無関係のマウス骨髄腫免疫グロブリンを、ＩｇＧ２ａ（Invitrogen ＃02-6200）のアイソタイプ対照として用いた。アポトーシス細胞はアネキシンＶ－ＦＩＴＣおよびＰＩを用いて検出し、フローサイトメーター（BD Immmunocytometry Systems）を用いて分析した。初期アポトーシスは、アネキシンＶ－ＦＩＴＣアポトーシス検出キットＩＩ（BD Pharmingen）を用いて測定した。後期アポトーシス核はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色で検出した。
【0099】
１．１４ ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）
全ＲＮＡ抽出、一本鎖ｃＤＮＡ合成、ＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎベースのリアルタイムＰＣＲは、製造元の説明書に記載されている通りに行った。全ＲＮＡを抽出するため、TRIzol試薬（Invitrogen）を用いて細胞を溶解し、クロロホルムを用いてTRIzolからタンパク質およびフェノールを除去した。遠心分離後、上部の無色層を集め、イソプロパノールと混合してＲＮＡペレットを沈殿させた。その後、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、室温で風乾した後、ＲＮａｓｅ不含有水に溶解した。第一鎖ｃＤＮＡ合成には、５μｇの全ＲＮＡを用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびSuperScriptIII逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、５０℃で６０分間逆転写を行った。標的遺伝子レベルは、LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix（Roche）およびLightCycler480 System（Roche）を用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した。すべてのｑ－ＰＣＲ反応を標準化するために、内因性ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を測定した。ｑＰＣＲ反応は９５℃で５分間、その後９５℃で１０秒間の変性、６０℃で１０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を４０サイクル行った。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するために用いたプライマー配列を表３に示す。
全ＲＮＡ抽出、一本鎖ｃＤＮＡ合成、ＳＹＢＲ－ｇｒｅｅｎベースのリアルタイムＰＣＲは、製造元の説明書に記載されている通りに行った。全ＲＮＡを抽出するため、TRIzol試薬（Invitrogen）を用いて細胞を溶解し、クロロホルムを用いてTRIzolからタンパク質およびフェノールを除去した。遠心分離後、上部の無色層を集め、イソプロパノールと混合してＲＮＡペレットを沈殿させた。その後、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、室温で風乾した後、ＲＮａｓｅ不含有水に溶解した。第一鎖ｃＤＮＡ合成には、５μｇの全ＲＮＡを用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびSuperScriptIII逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、５０℃で６０分間逆転写を行った。標的遺伝子レベルは、LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix（Roche）およびLightCycler480 System（Roche）を用いた定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により評価した。すべてのｑ－ＰＣＲ反応を標準化するために、内因性ハウスキーピング対照としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を測定した。ｑＰＣＲ反応は９５℃で５分間、その後９５℃で１０秒間の変性、６０℃で１０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を４０サイクル行った。目的遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出するために用いたプライマー配列を表３に示す。
【0100】
【表3】
【0101】
１．１５ 結腸癌転移動物モデル
ＰＢＳ中の結腸癌ＨＣＴ１１６またはＨＴ２９（５×１０６細胞／マウス）を４－６週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに尾静脈から注射した。その後、マウスを体重別に異なる処置群に無作為に振り割けた。３日後、抗体を尾静脈注射で週２回、４週連続で投与した。クリゾチニブは週５日、毎日経口投与された（治療期間は４週間）。治療試験では、担癌マウスにアイソタイプ対照ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、クリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）、またはクリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）とＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）との併用を投与した。マウスの生存率を測定した。動物飼育は台湾中央研究院のガイドラインに従って行われた。プロトコルは中央研究院動物実験倫理委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ： ２０－０５－１４６８）の承認を得た。
ＰＢＳ中の結腸癌ＨＣＴ１１６またはＨＴ２９（５×１０６細胞／マウス）を４－６週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに尾静脈から注射した。その後、マウスを体重別に異なる処置群に無作為に振り割けた。３日後、抗体を尾静脈注射で週２回、４週連続で投与した。クリゾチニブは週５日、毎日経口投与された（治療期間は４週間）。治療試験では、担癌マウスにアイソタイプ対照ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、クリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）、またはクリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）とＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）との併用を投与した。マウスの生存率を測定した。動物飼育は台湾中央研究院のガイドラインに従って行われた。プロトコルは中央研究院動物実験倫理委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ： ２０－０５－１４６８）の承認を得た。
【0102】
１．１６ 同所移植および治療試験
同所性腫瘍モデルは既報のように作成した（Chen et al., 2020）。簡単に説明すると、ＮＳＣＩＤマウスを用いて、あらかじめＬｅｎｔｉ－ｌｕｃウイルス（ルシフェラーゼ遺伝子を含むレンチウイルス）に感染させたＨＣＴ１１６細胞を同所移植した。マウスは、アベルチン、２，２，２－トリブロモ－エタノール（Sigma-Aldrich）を２５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射（i.p.）して麻酔した。腫瘍成長は、生物発光イメージングによって測定した。治療試験では、担癌マウスにアイソタイプ対照ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、クリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）、またはクリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）とＥｐＡｂ２－６（１５ ｍｇ／ｋｇ）の併用を投与した。腫瘍の進行は、生物発光の定量化によって測定した。マウスの生存率も測定した。動物飼育は中央研究院のガイドラインに従って行われた。プロトコルは中央研究院動物実験倫理委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ： ２０－０５－１４６８）の承認を得た。
同所性腫瘍モデルは既報のように作成した（Chen et al., 2020）。簡単に説明すると、ＮＳＣＩＤマウスを用いて、あらかじめＬｅｎｔｉ－ｌｕｃウイルス（ルシフェラーゼ遺伝子を含むレンチウイルス）に感染させたＨＣＴ１１６細胞を同所移植した。マウスは、アベルチン、２，２，２－トリブロモ－エタノール（Sigma-Aldrich）を２５０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射（i.p.）して麻酔した。腫瘍成長は、生物発光イメージングによって測定した。治療試験では、担癌マウスにアイソタイプ対照ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇ）、クリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＥｐＡｂ２－６（１５ｍｇ／ｋｇ）、またはクリゾチニブ（２０ｍｇ／ｋｇ）とＥｐＡｂ２－６（１５ ｍｇ／ｋｇ）の併用を投与した。腫瘍の進行は、生物発光の定量化によって測定した。マウスの生存率も測定した。動物飼育は中央研究院のガイドラインに従って行われた。プロトコルは中央研究院動物実験倫理委員会（ＡＳ ＩＡＣＵＣ： ２０－０５－１４６８）の承認を得た。
【0103】
１．１７ 統計分析
すべてのデータは、表示された試験回数の平均値±ＳＥＭで示される。実験培養 対 対照培養における発現パーセンテージの解析には、対にならないスチューデントのｔ検定を用いた。ｐ値が０．０５未満を統計的に有意とした。
すべてのデータは、表示された試験回数の平均値±ＳＥＭで示される。実験培養 対 対照培養における発現パーセンテージの解析には、対にならないスチューデントのｔ検定を用いた。ｐ値が０．０５未満を統計的に有意とした。
【0104】
２．結果
２．１ ＥｐＥＸはＨＧＦＲとの相互作用を通じてＨＧＦＲのリン酸化を誘導する
本発明者らの以前の研究では、Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）アッセイを実施し、ＥｐＥＸがＨＣＴ１１６細胞においてＥＧＦＲおよびＨＧＦＲの両方のリン酸化を誘導することを見出した（Liang et al., 2018）。ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９結腸癌細胞株において、内在性のＥｐＣＡＭがＨＧＦＲと直接相互作用するかどうかを調べるため、架橋剤であるＤＴＳＳＰを用いて、推定上のＥｐＣＡＭ－ＨＧＦＲ複合体を安定化させた。予想通り、ＥｐＣＡＭとＨＧＦＲの相互作用は免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロッティングで確認された（図１Ａ）。さらに、膜結合型ＥｐＣＡＭがＨＧＦＲの細胞外ドメイン（ＨＧＦＲＥＣＤ）と結合できるかどうかを調べるため、ＥｐＣＡＭ－Ｖ５およびＨＧＦＲＥＣＤ－ｃ－Ｍｙｃ－ｔａｇの両方を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてｃｏ－ＩＰ試験を行った。その結果、外因性ＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲの相互作用が確認された（図１Ｂ）。次に、組換えＥｐＥＸ－ＦｃとＨＧＦＲＥＣＤ－Ｈｉｓ組換えタンパク質との直接相互作用を調べるためにＩＰを行った。（図１Ｃ）。大腸癌細胞におけるＨＧＦＲのリン酸化に対するＥｐＥＸの効果を調べるため、ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞におけるリン酸化ＨＧＦＲのレベルを分析した。ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡの結果から、ＥｐＣＡＭおよびＥｐＥＸの両方が、両細胞型においてＨＧＦＲのリン酸化を誘導することが示された。実際、ＥｐＣＡＭ不存在下でＨＧＦＲのリン酸化を誘導できたのはＥｐＥＸだけであった（図１Ｄ、図１Ｅ）。
２．１ ＥｐＥＸはＨＧＦＲとの相互作用を通じてＨＧＦＲのリン酸化を誘導する
本発明者らの以前の研究では、Human Phospho-RTK Array Kit（R&D Systems）アッセイを実施し、ＥｐＥＸがＨＣＴ１１６細胞においてＥＧＦＲおよびＨＧＦＲの両方のリン酸化を誘導することを見出した（Liang et al., 2018）。ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９結腸癌細胞株において、内在性のＥｐＣＡＭがＨＧＦＲと直接相互作用するかどうかを調べるため、架橋剤であるＤＴＳＳＰを用いて、推定上のＥｐＣＡＭ－ＨＧＦＲ複合体を安定化させた。予想通り、ＥｐＣＡＭとＨＧＦＲの相互作用は免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロッティングで確認された（図１Ａ）。さらに、膜結合型ＥｐＣＡＭがＨＧＦＲの細胞外ドメイン（ＨＧＦＲＥＣＤ）と結合できるかどうかを調べるため、ＥｐＣＡＭ－Ｖ５およびＨＧＦＲＥＣＤ－ｃ－Ｍｙｃ－ｔａｇの両方を過剰発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてｃｏ－ＩＰ試験を行った。その結果、外因性ＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲの相互作用が確認された（図１Ｂ）。次に、組換えＥｐＥＸ－ＦｃとＨＧＦＲＥＣＤ－Ｈｉｓ組換えタンパク質との直接相互作用を調べるためにＩＰを行った。（図１Ｃ）。大腸癌細胞におけるＨＧＦＲのリン酸化に対するＥｐＥＸの効果を調べるため、ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞におけるリン酸化ＨＧＦＲのレベルを分析した。ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡの結果から、ＥｐＣＡＭおよびＥｐＥＸの両方が、両細胞型においてＨＧＦＲのリン酸化を誘導することが示された。実際、ＥｐＣＡＭ不存在下でＨＧＦＲのリン酸化を誘導できたのはＥｐＥＸだけであった（図１Ｄ、図１Ｅ）。
【0105】
ＥｐＥＸは２つのＥＧＦ様ドメインから構成されている（Schnell et al, 2013）ため、どのドメインがＨＧＦＲと相互作用するのかを明らかにしようとした。そのために、様々なＥＧＦ様ドメイン欠失変異体（ＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩ＋ＩＩ、ＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩ、ＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩＩ）プラスミドを構築した。驚くことに、ＥＧＦ様ドメインの欠失を１つだけ有する変異体（ＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩおよびＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩＩ）はＨＧＦＲと相互作用できたが、両方のドメインを欠失した変異体（ＥｐＣＡＭΔＥＧＦＩ＋ＩＩ）はそのような結果を示さなかった（図１Ｆ）。同様の結果は、ＨＧＦＲＥＣＤと可溶性ＥｐＥＸ野生型または変異型タンパク質との結合を評価した場合にも観察された（図１Ｇ）。全体として、これらの知見は、膜結合型ＥｐＣＡＭおよび分泌型ＥｐＥＸの両方が、ＥｐＣＡＭ／ＥｐＥＸのＥＧＦドメインＩまたはＩＩのいずれかを介してＨＧＦＲと結合できることを示している。
【0106】
次に、ＥｐＥＸ－ＦｃのＥＧＦ様ドメイン欠失変異体のいくつかの変異体とＨＧＦＲ－Ｈｉｓタンパク質との潜在的相互作用を調べるためにＥＬＩＳＡを行った。その結果、ＥｐＥＸΔＥＧＦＩ＋ＩＩ変異タンパク質へのＨＧＦＲ結合が完全に消失したことから、ＥｐＥＸはその両ドメインを介してＨＧＦＲに結合することが確認された（図１Ｈ）。野生型ＥｐＥＸのリン酸化結果（図１ＤおよびＥ）と同様に、ＥｐＥＸΔＥＧＦＩおよびＥｐＥＸΔＥＧＦＩＩの両方がＨＧＦＲのリン酸化を誘導し、ＥｐＥＸΔＥＧＦＩ＋ＩＩタンパク質のリン酸化は誘導できなかった（図１Ｉおよび図１Ｊ）。これらの結果から、ＥｐＥＸはＨＧＦＲに結合し、その結果リン酸化を誘導できると結論づけた。
【0107】
２．２ ＥｐＥＸはＨＧＦＲシグナルを介して腫瘍の進行を促進する
ＥｐＣＡＭがＨＧＦＲのリン酸化を誘導することから、この経路が結腸癌細胞の腫瘍形成に部分的に関与している可能性が示唆された。ＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲの活性化が協同して癌の進行および転移を制御しているかどうかを調べるため、ＨＧＦ処置の有無にかかわらず、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞におけるリン酸化ＥＲＫおよびＡＫＴのレベルを調べた。ウェスタンブロッティングの結果、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞では、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化はＨＧＦ処置によって影響を受けないことが示された（図２Ａ）。さらに、細胞増殖アッセイの結果、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は野生型ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞よりも増殖が遅かったが、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞をＨＧＦで処理することにより、細胞増殖の軌跡を回復させることができた（図２Ｂ）。
ＥｐＣＡＭがＨＧＦＲのリン酸化を誘導することから、この経路が結腸癌細胞の腫瘍形成に部分的に関与している可能性が示唆された。ＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲの活性化が協同して癌の進行および転移を制御しているかどうかを調べるため、ＨＧＦ処置の有無にかかわらず、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞におけるリン酸化ＥＲＫおよびＡＫＴのレベルを調べた。ウェスタンブロッティングの結果、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞では、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化はＨＧＦ処置によって影響を受けないことが示された（図２Ａ）。さらに、細胞増殖アッセイの結果、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞は野生型ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞よりも増殖が遅かったが、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞をＨＧＦで処理することにより、細胞増殖の軌跡を回復させることができた（図２Ｂ）。
【0108】
ＥｐＥＸがＨＧＦＲシグナルを介して癌の進行および浸潤を誘導できるかどうかを調べるため、ＥｐＥＸ－ＨｉｓおよびＨＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害剤であるＳＵ１１２７４を組み合わせて処理した後の結腸癌細胞におけるＥＧＦＲ、ＥＲＫ、ＡＫＴのリン酸化を解析した。その結果、ＳＵ１１２７４は、ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞において、ＥｐＥＸを介したＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化を抑制できることがわかった（図２Ｃ）。このような阻害が細胞増殖に及ぼす影響をさらに理解するため、ＥｐＥＸ処置単独ではＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞の増殖が促進される一方、ＳＵ１１２７４は結腸癌細胞におけるＥｐＥＸ誘導性の細胞生存率および増殖の増加を消失させることを見出した（図２Ｄ）。
【0109】
さらに、ＨＧＦＲノックダウンにより、ＨＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、ＥＲＫのリン酸化レベルが低下した。興味深いことに、ＨＧＦＲノックダウンはＥＧＦＲリン酸化レベルも低下させた（図２Ｅ）。さらに、ＨＧＦＲノックダウンは、ＥｐＥＸ誘発ＲＩＰ（リン酸化ＡＤＡＭ１７とプレセニリン２）（図２Ｆ）および活性型β－カテニンの核内翻訳（図２Ｇ）を減少させた。加えて、ＨＣＴ１１６細胞では、ＨＧＦＲノックダウンにより、ＥｐＥＸ誘発細胞増殖およびコロニー形成の両方が有意に減少した（図２Ｈおよび図２Ｉ）。実際、ＩＰアッセイを用いて、ＨＣＴ１１６細胞のＨＧＦ処理後にＥｐＥＸ産生が上昇することを見出した（図２Ｊ）。また、ＨＧＦ処理によって、ＨＣＴ１１６細胞におけるＡＤＡＭ１７のリン酸化、プレセニリン２のリン酸化、およびＥｐＥＸ産生が増加することも見出した（図２Ｋ）。
【0110】
２．３ ＥｐＥＸはＥＲＫおよびＦＡＫ－ＡＣＴシグナルを活性化する
ＥｐＣＡＭは、その下流のエフェクターを介してがん細胞の増殖、生存および転移に影響を及ぼすことが知られている。そのシグナル伝達の過程で、ＥｐＣＡＭのタンパク質分解はＥｐＥＸを産生し、ＥｐＥＸはさらにＲＩＰを刺激してＥｐＩＣＤを放出し、それがＥｐＣＡＭシグナルを伝達すると考えられる（Lin et al, 2012）。さらに、ＨＣＴ１１６細胞へのＥｐＥＸ処置は、ＴＡＣＥおよびγセクレターゼの触媒サブユニットであるプレセニリン２のリン酸化を介してＲＩＰを増加させ得ることが以前に示されている（Liang et al., 2018）。そのため、本発明者らは、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞をＥｐＥＸで処理したところ、ＡＫＴ、ＦＡＫおよびＥＲＫのリン酸化、ならびにＲＩＰタンパク質（ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２）のリン酸化などのＨＧＦＲ下流シグナル伝達が部分的に回復した（図３Ａ）。以前の研究では、ＧＳＫ３βアンタゴニストがＡＫＴを介してＥＭＴを刺激することが示された（An et al, 2020）。このメカニズムに沿って、ＥｐＥＸは、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞において、ＧＳＫ３βの抑制的リン酸化（Ｓ９、不活性ＧＳＫ３β）をレスキューし、同時にＧＳＫ３βの活性化リン酸化（Ｙ２１６、活性ＧＳＫ３β）を低下させることを見出した（図３Ａ）。また、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞において、ＥｐＥＸがコロニー形成を増加させることも見出し（図３Ｂ）、またＥｐＩＣＤではなく、内因性ＥｐＥＸの脱落を阻害すると、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化が低下することから、内因性ＥｐＥＸがＨＧＦＲシグナル活性化に重要であることも示唆された（図３Ｃ）。
ＥｐＣＡＭは、その下流のエフェクターを介してがん細胞の増殖、生存および転移に影響を及ぼすことが知られている。そのシグナル伝達の過程で、ＥｐＣＡＭのタンパク質分解はＥｐＥＸを産生し、ＥｐＥＸはさらにＲＩＰを刺激してＥｐＩＣＤを放出し、それがＥｐＣＡＭシグナルを伝達すると考えられる（Lin et al, 2012）。さらに、ＨＣＴ１１６細胞へのＥｐＥＸ処置は、ＴＡＣＥおよびγセクレターゼの触媒サブユニットであるプレセニリン２のリン酸化を介してＲＩＰを増加させ得ることが以前に示されている（Liang et al., 2018）。そのため、本発明者らは、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞をＥｐＥＸで処理したところ、ＡＫＴ、ＦＡＫおよびＥＲＫのリン酸化、ならびにＲＩＰタンパク質（ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２）のリン酸化などのＨＧＦＲ下流シグナル伝達が部分的に回復した（図３Ａ）。以前の研究では、ＧＳＫ３βアンタゴニストがＡＫＴを介してＥＭＴを刺激することが示された（An et al, 2020）。このメカニズムに沿って、ＥｐＥＸは、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞において、ＧＳＫ３βの抑制的リン酸化（Ｓ９、不活性ＧＳＫ３β）をレスキューし、同時にＧＳＫ３βの活性化リン酸化（Ｙ２１６、活性ＧＳＫ３β）を低下させることを見出した（図３Ａ）。また、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞において、ＥｐＥＸがコロニー形成を増加させることも見出し（図３Ｂ）、またＥｐＩＣＤではなく、内因性ＥｐＥＸの脱落を阻害すると、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化が低下することから、内因性ＥｐＥＸがＨＧＦＲシグナル活性化に重要であることも示唆された（図３Ｃ）。
【0111】
次に、本発明者らは、ＥｐＥＸがＨＧＦ誘導ＨＧＦＲシグナル伝達を増強するかどうかを試験した。可溶性ＥｐＥＸとＨＧＦを併用したＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞のインキュベーションにより、ＥｐＥＸまたはＨＧＦ単独処理と比較して、ＨＧＦＲのリン酸化、およびそれに続くＡＫＴおよびＥＲＫを含む下流のリン酸化が上昇した（図３Ｄ）。ＥｐＥＸはＨＧＦＲ活性化を誘発するため、ＨＧＦＲシグナル伝達のメディエーターに対するＥｐＥＸの影響をさらに調べた。本明細書中、ＡＫＴシグナル伝達およびＥＲＫシグナル伝達は、ＥＭＴ、細胞周期、生存および癌の進行の制御において種々の生理学的役割を果たすため、癌関連シグナル伝達経路の中でも最も重要な２つの経路である（Chang et al, 2013; Sun et al, 2015）。それゆえ、本発明者らは、ＨＧＦＲ阻害剤（ＳＵ１１２７４）、ＡＫＴ阻害剤（ＬＹ２９４００２）、ＥＲＫ阻害剤（Ｕ０１２６）およびＦＡＫ阻害剤（ＰＦ－５６２２７１）が、ＨＣＴ１１６細胞におけるＥｐＥＸ誘導シグナル伝達に影響を与えるかどうかを試験した。ＥｐＥＸは、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化レベル（図３Ｅ）、コロニー形成能（図３Ｆ）、創傷治癒能（図３Ｇ）および遊走能（図３Ｈ）を上昇させた。これらの結果から、ＥｐＥＸは結腸癌細胞においてＨＧＦＲの活性化を誘導することにより、ＥＲＫおよびＦＡＫ－ＡＣＴシグナル伝達経路を増加させることが示された。
【0112】
２．４ ＥｐＥＸはＧＳＫ３β活性の下方制御を介して活性型β－カテニンおよびスネイルの発現を誘導し、ＥＭＴおよび浸潤を促進する
本発明者らは、ＥｐＣＡＭをノックアウトすると、ＨＣＴ１１６細胞ではＥ－カドヘリンの発現が増強される一方で、間葉系マーカーであるビメンチンの発現ならびにＥＭＴ制御因子であるスネイルタンパク質レベルが抑制されることを見出した（図４Ａ）。ＥｐＥＸはまた、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞にも細胞浸潤を誘導した（図４Ｂ）。
本発明者らは、ＥｐＣＡＭをノックアウトすると、ＨＣＴ１１６細胞ではＥ－カドヘリンの発現が増強される一方で、間葉系マーカーであるビメンチンの発現ならびにＥＭＴ制御因子であるスネイルタンパク質レベルが抑制されることを見出した（図４Ａ）。ＥｐＥＸはまた、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞にも細胞浸潤を誘導した（図４Ｂ）。
【0113】
ＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲの活性化が協同して癌細胞の浸潤を制御しているかどうかを調べるため、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞をＨＧＦ処理の有無にかかわらず試験した。本発明者らは、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞では、ＥＭＴ関連タンパク質の発現ならびに細胞浸潤特性が、野生型細胞に比べて有意に低下したことを見出した。ＨＧＦ誘導性のＥＭＴおよび浸潤活性もまた、ＥｐＣＡＭノックアウト細胞で減少した（図４Ｃおよび図４Ｄ）。ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞をＥｐＥＸとＨＧＦの併用と共にインキュベートすると、ＥｐＥＸまたはＨＧＦの単独処理と比較して、ＥＭＴおよび細胞浸潤のレベルが上昇した（図４Ｅおよび図４Ｆ）。さらに、ＨＧＦＲのノックダウンにより、ＥｐＥＸによるＥＭＴ関連タンパク質の発現および細胞浸潤が阻止された（図４Ｇおよび図４Ｈ）。これらの結果は、ＥｐＥＸがＨＧＦＲの活性化を促進し、結腸癌細胞のＥＭＴおよび転移を誘導することを示唆している。
【0114】
これまでの報告では、ＧＳＫ３βアンタゴニストがＡＫＴシグナルによってＥＭＴを刺激し、その結果、リン酸化およびユビキチンを介したタンパク質分解を介してスネイルタンパク質のターンオーバーに影響を与えることが示されていた（An et al., 2020）。このメカニズムに関連して、本発明者らは、ＥｐＥＸがＧＳＫ３βの抑制的リン酸化（Ｓ９、不活性ＧＳＫ３β）を誘導し、一方で、タンパク質の活性化リン酸化（Ｙ２１６、活性ＧＳＫ３β）を減少させることを見出した。これらの変化は、ＨＣＴ１１６細胞におけるスネイルタンパク質の発現増加と一致していた。しかしながら、ＳＵ１１２７４は、ＥｐＥＸ介在性ＧＳＫ３β活性を減弱させ、ＨＣＴ１１６細胞におけるＥｐＥＸ誘導性の活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質の発現を消失させることができた（図４Ｉ）。また、ＨＧＦＲ下流メディエーターの阻害剤（すなわち、ＬＹ２９４００２、Ｕ０１２６およびＰＦ－５６２２７１）は、ＥｐＥＸ介在性のＧＳＫ３β活性およびスネイルタンパク質の発現を減弱させることを見出した（図４Ｊ）。ＥｐＥＸ誘導性浸潤は、ＬＹ２９４００２、Ｕ０１２６およびＰＦ－５６２２７１によっても抑制された（図４Ｋ）。注目すべきは、活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質の発現が、ＧＳＫ３β阻害剤であるＢＩＯで処理した後、対照およびＥｐＥＸ処理細胞の両方で上昇したことである（図４Ｌ）。これらの結果は、ＥｐＥＸがＧＳＫ３β活性の下方制御を介して活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質の発現を誘導することにより、ＥＭＴおよび浸潤を促進することを示唆している。
【0115】
２．５ ＥｐＥＸはユビキチン化を介したプロテアソーム分解を阻害することで、スネイルタンパク質の安定性を促進する
本発明者らは、Ｃａｓ９およびＥｐＣＡＭを標的とするｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いて大腸癌細胞をトランスフェクトすることにより、ＥｐＣＡＭがＥＭＴ関連遺伝子発現に及ぼす影響を分析した。その結果、ＥｐＣＡＭノックアウトはＥ－カドヘリンの遺伝子発現を増加させ、ＶＩＭの遺伝子発現を減少させた。しかしながら、ＥｐＣＡＭノックアウトはＳＮＡＩＬ遺伝子発現レベルには影響を与えなかった（図５Ａ）。実際、シクロヘキサミド処理によって、ＥｐＣＡＭをノックアウトしたスネイルタンパク質の半減期が短くなることがわかった（図５Ｂ）。一方、ＭＧ１３２（２６Ｓプロテアソームの阻害剤）で処理すると、スネイル（Snail）の定常状態のタンパク質レベルが増加し、タンパク質レベルがプロテアソーム分解によって大きく制御されていることが示された（図５Ｃ）。ＥｐＣＡＭノックアウトによって、ユビキチン化されたスネイルのレベルも、対照細胞に比べて上昇した（図５Ｄ）。さらに、シクロヘキサミド処理によって、ＥｐＥＸがスネイルタンパク質の半減期を延長することがさらに確認された（図５Ｅ）。ＥｐＥＸは、Ｓｎａｉｌ遺伝子の発現レベルには影響を与えなかったが（図５Ｆ）、ＭＧ１３２は、ＥｐＥＸ処理の有無にかかわらず、ＨＣＴ１１６細胞におけるスネイル定常状態タンパク質レベルを増加させた（図５Ｇ）。
本発明者らは、Ｃａｓ９およびＥｐＣＡＭを標的とするｓｇＲＮＡを発現するレンチウイルスを用いて大腸癌細胞をトランスフェクトすることにより、ＥｐＣＡＭがＥＭＴ関連遺伝子発現に及ぼす影響を分析した。その結果、ＥｐＣＡＭノックアウトはＥ－カドヘリンの遺伝子発現を増加させ、ＶＩＭの遺伝子発現を減少させた。しかしながら、ＥｐＣＡＭノックアウトはＳＮＡＩＬ遺伝子発現レベルには影響を与えなかった（図５Ａ）。実際、シクロヘキサミド処理によって、ＥｐＣＡＭをノックアウトしたスネイルタンパク質の半減期が短くなることがわかった（図５Ｂ）。一方、ＭＧ１３２（２６Ｓプロテアソームの阻害剤）で処理すると、スネイル（Snail）の定常状態のタンパク質レベルが増加し、タンパク質レベルがプロテアソーム分解によって大きく制御されていることが示された（図５Ｃ）。ＥｐＣＡＭノックアウトによって、ユビキチン化されたスネイルのレベルも、対照細胞に比べて上昇した（図５Ｄ）。さらに、シクロヘキサミド処理によって、ＥｐＥＸがスネイルタンパク質の半減期を延長することがさらに確認された（図５Ｅ）。ＥｐＥＸは、Ｓｎａｉｌ遺伝子の発現レベルには影響を与えなかったが（図５Ｆ）、ＭＧ１３２は、ＥｐＥＸ処理の有無にかかわらず、ＨＣＴ１１６細胞におけるスネイル定常状態タンパク質レベルを増加させた（図５Ｇ）。
【0116】
この点に関して、スネイルのセリンリッチ領域にある２つのコンセンサスモチーフ（モチーフ１：Ｓ９７、Ｓ１０１；モチーフ２：Ｓ１０８、Ｓ１１２、Ｓ１１６、Ｓ１２０）は、転写後の制御およびユビキチン化を介したプロテアソーム分解に極めて重要である（Zhou et al, 2004）。ＨＣＴ１１６細胞に、野生型（Ｓｎａｉｌ－ＷＴ）および３種の変異型（Ｓｎａｉｌ－２ＳＡ、－４ＳＡ、および－６ＳＡ）のスネイル構築物をトランスフェクトした（図５Ｈ）。ＥｐＥＸでトランスフェクトした細胞を処理すると、Ｓｎａｉｌ－ＷＴおよび－２ＳＡの発現は有意に増加したが、Ｓｎａｉｌ－４ＳＡおよび－６ＳＡ変異体の発現にはそのような効果は見られなかった（図５Ｉ）。これらのデータは、癌細胞においてＥｐＥＸが、セリンに富んだスネイルのコンセンサスモチーフ２を介して、スネイルのタンパク質安定性を制御していることを示唆している。以上の試験結果から、ＥｐＥＸは大腸癌細胞においてスネイルタンパク質の安定性を促進することにより、ＥＭＴの制御に重要な役割を果たしていることが明らかになった。
【0117】
２．６ ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭおよびＨＧＦＲのシグナル伝達を阻害し、ＧＳＫ３βの活性化を介して活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質の分解を促進する
【0118】
以前、本発明者らはＥｐＥＸを標的とし、癌細胞のアポトーシスを誘導する中和抗体ＥｐＡｂ２－６を開発した（Liang et al., 2018；Liao et al., 2015）。そこで、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６を用いて大腸癌細胞におけるＥｐＥＸの機能を阻止し、ＨＣＴ１１６細胞におけるＨＧＦＲ、ＡＫＴ、ＦＡＫ、ＧＳＫ３β、ＥＲＫ、ＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のリン酸化レベルを分析した。ＥｐＡｂ２－６処理により、対照ＩｇＧ処理と比較して、ＨＧＦＲ、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＦＡＫのリン酸化が減少した（図６Ａ）。ＨＧＦ処理により、ＨＣＴ１１６細胞においてＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化レベルが増加した。一方、ＥｐＡｂ２－６で処理した細胞では、これらのリン酸化タンパク質のレベルは有意に減少した。さらに、ＨＣＴ１１６細胞の浸潤および遊走活性も、ＥｐＡｂ２－６処理によって有意に低下した（図６Ｂ）。ＨＣＴ１１６細胞をＥｐＡｂ２－６の後にＨＧＦで処理すると、浸潤および遊走に対するＥｐＡｂ２－６の効果は部分的に鈍化した（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【0119】
興味深いことに、ＥｐＡｂ２－６は、ＨＣＴ１１６細胞における内因性タンパク質のＩＰによって検出されるように、ＥｐＣＡＭとＨＧＦＲの結合を減少させた（図６Ｅ）。組換えＥｐＥＸがＨＧＦＲに直接結合するかどうかを評価するため、本発明者らはＥＬＩＳＡを行い、精製ＥｐＥＸ－ＨｉｓとＨＧＦＲ－Ｆｃタンパク質との相互作用を調べた。ＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合活性をＥＬＩＳＡによりさらに確認し、抗ＥｐＣＡＭモノクローナル抗体ＥｐＡｂ２－６がＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合を阻害することも示した（図６Ｆ）。
【0120】
これらの試験に続いて、本発明者らは、対照ＩｇＧまたはＥｐＡｂ２－６で処理したＨＣＴ１１６細胞におけるＥＭＴタンパク質の発現レベルを分析した。その結果、ＥｐＡｂ２－６はＥ－カドヘリンのレベルを増加させ、スネイルおよび活性型β－カテニンを減少させたことが示された（図６Ｇ）。さらに、ＥｐＡｂ２－６はＧＳＫ３βのＳ９での抑制的リン酸化（不活性ＧＳＫ３β）を減少させ、同時にＹ２１６での活性化リン酸化（活性ＧＳＫ３β）を増加させた。これらの変化はＧＳＫ３β活性を増加させると予期され、観察された活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質の減少と一致していた。これに対応して、活性型β－カテニンおよびスネイルタンパク質は、ＧＳＫ３β阻害剤であるＢＩＯで処理すると増加した（図６Ｈ）。活性型β－カテニンおよびスネイルの定常状態のタンパク質レベルはＥｐＡｂ２－６で処理すると減少したが、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）で処理すると活性型β－カテニンおよびスネイルの定常状態のタンパク質レベルが増加した（図６Ｉ）。さらに、シクロヘキサミド処理アッセイで示されたように、ＥｐＡｂ２－６はスネイルタンパク質の半減期を短縮した（図６Ｊ）。これらの結果は、ＥｐＡｂ２－６がＨＧＦＲシグナル伝達を下方制御することによって転移プロセスを阻害し、ＧＳＫ３β活性の増加を介して活性β－カテニンおよびスネイルタンパク質の分解を可能にすることを示唆している。
【0121】
本発明者らはさらに、ＥｐＡｂ２－６の二価抗体フラグメントＦ（ａｂ’）２がＥｐＥＸと結合し、アポトーシスを誘導できるかどうかを試験した。その結果、ＥｐＡｂ２－６のＦ（ａｂ’）２は実際にＥｐＥＸと結合し（図７Ａ）、結腸癌細胞にアポトーシスを誘導することが示された（図７Ｂ）。また、アポトーシスアッセイを用いて、ヒト化ＥｐＡｂ２－６（ｈＥｐＡｂ２－６）およびヒト抗ＥｐＣＡＭ抗体アデカツムマブ（ＭＴ２０１）が同様の活性を有するかどうかを評価した。ＥｐＡｂ２－６およびｈＥｐＡｂ２－６は、アポトーシスを誘導するという点で同様の機能特性を示したが、ＭＴ２０１はＨＣＴ１１６癌細胞またはＨＴ２９癌細胞でそのような効果を示さなかった（図７Ｃ）。本発明者らはまた、ＥｐＡｂ２－６およびｈＥｐＡｂ２－６は両方とも、ＨＧＦＲ、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化を阻害したが、ＭＴ２０１は阻害しなかったことを見出した（図７Ｄ）。リン酸化されたＡＤＡＭ１７およびプレセニリン２のレベルも、ＥｐＡｂ２－６またはｈＥｐＡｂ２－６処理後に低下したが、ＭＴ２０１抗体にはそのような効果はなかった（図７Ｅ）。本発明者らのデータは、ＥｐＥＸおよびＨＧＦＲが協調して下流のＨＧＦＲシグナルを刺激し、腫瘍の進行および細胞浸潤を促進することを示唆した。そこで本発明者らは、ＥｐＣＡＭシグナル伝達およびＨＧＦＲシグナル伝達の両方を同時に遮断することによって、抗腫瘍効果をさらに試験したいと考えた。さらに、本発明者らは、ＨＧＦＲ阻害剤クリゾチニブが、ＨＣＴ１１６癌細胞およびＨＴ２９癌細胞に対するＥｐＡｂ２－６のアポトーシス効果を増強することも見いだした（図７Ｆ）。細胞浸潤アッセイでは、クリゾチニブは対照ＩｇＧと比較して、ＨＣＴ１１６細胞およびＨＴ２９細胞の浸潤に対するＥｐＡｂ２－６の阻害効果を増強した（図７Ｇ）。
【0122】
２．７ ＥｐＡｂ２－６はＥｐＣＡＭのＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩに結合する
以前の研究では、ＥｐＡｂ２－６抗体の結合エピトープがＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフであることが同定されており、これはアミノ酸残基９４－９６に相当する。特に残基９５（Ｙ９５）がＥｐＡｂ２－６の結合において主要な役割を果たしている（Liao et al, 2015）。ここで、本発明者らは、ＥｐＥＸはＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩを介してＨＧＦＲに結合すること（図１Ｆおよび図１Ｇ）、ＥｐＡｂ２－６はＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合を阻害できることを見出した（図６Ｅおよび図６Ｆ）。そこで、本発明者らは、この抗体がＥｐＥＸのＥＧＦ様ドメインの両方でＥｐＣＡＭと結合するかどうかを調べたいと考えた（図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃ）。ＥｐＡｂ２－６がＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフを認識することを確認するため、本発明者らは、ＥｐＣＡＭの第１のＥＧＦ様反復配列（ａａ ２７－５９；ＥＧＦ－Ｉドメイン）および第２のＥＧＦ様反復配列（ａａ ６６－１３５；ＥＧＦ－ＩＩ／ＴＹドメイン）をコードするｃＤＮＡ配列を構築した。次いで、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入法を用いて、各ドメインに変異を導入した（図８Ｄ）。これらのＥｐＣＡＭ変異体に対するＥｐＡｂ２－６抗体の反応性を、免疫蛍光法（図８Ｅ）、フローサイトメトリー法（図８Ｆ）、および細胞ＥＬＩＳＡ法（図８Ｇ）で評価した。ＥｐＣＡＭのＹ３２位（ＥＧＦ－Ｉドメイン）またはＹ９５位（ＥＧＦ－ＩＩドメイン）のアミノ酸変異は、ＥｐＡｂ２－６結合の顕著な減少を引き起こしたが、ＭＴ２０１結合には影響を与えなかった。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６はＥｐＥＸのＥＧＦ－ＩドメインおよびＥＧＦ－ＩＩドメインに結合し、それぞれアミノ酸残基Ｙ３２およびＹ９５を標的とすると結論した。
以前の研究では、ＥｐＡｂ２－６抗体の結合エピトープがＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフであることが同定されており、これはアミノ酸残基９４－９６に相当する。特に残基９５（Ｙ９５）がＥｐＡｂ２－６の結合において主要な役割を果たしている（Liao et al, 2015）。ここで、本発明者らは、ＥｐＥＸはＥＧＦ様ドメインＩおよびＩＩを介してＨＧＦＲに結合すること（図１Ｆおよび図１Ｇ）、ＥｐＡｂ２－６はＥｐＥＸのＨＧＦＲへの結合を阻害できることを見出した（図６Ｅおよび図６Ｆ）。そこで、本発明者らは、この抗体がＥｐＥＸのＥＧＦ様ドメインの両方でＥｐＣＡＭと結合するかどうかを調べたいと考えた（図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃ）。ＥｐＡｂ２－６がＥｐＣＡＭのＬＹＤモチーフを認識することを確認するため、本発明者らは、ＥｐＣＡＭの第１のＥＧＦ様反復配列（ａａ ２７－５９；ＥＧＦ－Ｉドメイン）および第２のＥＧＦ様反復配列（ａａ ６６－１３５；ＥＧＦ－ＩＩ／ＴＹドメイン）をコードするｃＤＮＡ配列を構築した。次いで、ＰＣＲを用いた部位特異的変異導入法を用いて、各ドメインに変異を導入した（図８Ｄ）。これらのＥｐＣＡＭ変異体に対するＥｐＡｂ２－６抗体の反応性を、免疫蛍光法（図８Ｅ）、フローサイトメトリー法（図８Ｆ）、および細胞ＥＬＩＳＡ法（図８Ｇ）で評価した。ＥｐＣＡＭのＹ３２位（ＥＧＦ－Ｉドメイン）またはＹ９５位（ＥＧＦ－ＩＩドメイン）のアミノ酸変異は、ＥｐＡｂ２－６結合の顕著な減少を引き起こしたが、ＭＴ２０１結合には影響を与えなかった。したがって、本発明者らは、ＥｐＡｂ２－６はＥｐＥＸのＥＧＦ－ＩドメインおよびＥＧＦ－ＩＩドメインに結合し、それぞれアミノ酸残基Ｙ３２およびＹ９５を標的とすると結論した。
【0123】
２．８ ＥｐＡｂ２－６は結腸癌動物モデルにおけるクリゾチニブ治療の有効性を改善する
動物モデルでは、移植７２時間後に処置を開始した（図９Ａ）。まず、本発明者らは、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６の転移に対するクリゾチニブおよびＥｐＡｂ２－６の効果を調べた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨＣＴ１１６細胞を静脈注射し、細胞注射の３日後にクリゾチニブおよびＥｐＡｂ２－６を共投与するか、または同量の対照ＩｇＧを投与した。ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用投与を受けたＨＣＴ１１６細胞を移植したマウスの生存期間中央値および全生存期間は、対照ＩｇＧ群と比較して延長され（図９Ｂ）、このことは、ＥｐＡｂ２－６がインビボでクリゾチニブの抗転移作用を改善できるという考えを支持した。
動物モデルでは、移植７２時間後に処置を開始した（図９Ａ）。まず、本発明者らは、大腸癌細胞ＨＣＴ１１６の転移に対するクリゾチニブおよびＥｐＡｂ２－６の効果を調べた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＨＣＴ１１６細胞を静脈注射し、細胞注射の３日後にクリゾチニブおよびＥｐＡｂ２－６を共投与するか、または同量の対照ＩｇＧを投与した。ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用投与を受けたＨＣＴ１１６細胞を移植したマウスの生存期間中央値および全生存期間は、対照ＩｇＧ群と比較して延長され（図９Ｂ）、このことは、ＥｐＡｂ２－６がインビボでクリゾチニブの抗転移作用を改善できるという考えを支持した。
【0124】
次に、本発明者らは、大腸癌の同所性マウスモデルにおいて、治療戦略としてのＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用効果を試験した。図９Ｃに示すように、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞およびＨＣＴ１１６－Ｌｕｃ細胞のインビボモニタリングによって腫瘍増殖を評価した。治療開始前（腫瘍細胞移植３日後）には、すべてのマウスで腫瘍増殖が観察された。治療後、ＥｐＡｂ２－６またはＥｐＡｂ２－６とクリゾチニブの併用投与を受けたマウスの生物発光強度は、対照ＩｇＧまたはクリゾチニブ単独投与群に比べて、有意に低下した。同様の効果は、ＨＣＴ１１６細胞（図９Ｄおよび図９Ｅ）またはＨＴ２９細胞（図９Ｈおよびず９Ｉ）を移植した同所モデルでも観察された。さらに、ＨＣＴ１１６細胞（図９Ｆ）またはＨＴ２９細胞（図９Ｊ）の同所移植モデルでは、体重は治療群間で有意差はなかった。ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用投与を受けたＨＣＴ１１６細胞（図９Ｇ）またはＨＴ２９細胞（図９Ｋ）を移植したマウスの生存期間中央値および全生存期間は、対照ＩｇＧ群と比較して、有意に延長された。全体として、転移モデルおよび同所モデル動物を用いた実験の結果、対照ＩｇＧ群およびクリゾチニブ群では、全ての動物に顕著な腫瘍が発生し、生存率も悪かった。一方、ＥｐＡｂ２－６処置群は、対照ＩｇＧ処置群またはクリゾチニブ処置群に比べ、腫瘍の進行が顕著に遅く、生存期間中央値も高かった。重要なことは、腫瘍進行の抑制は併用処置群で最も顕著であったことである。
【0125】
３． 考察
ＥｐＣＡＭの発現は、多くの癌において腫瘍形成および転移と相関しているため、本発明者らは、この試験ではその基礎となるメカニズムの解明を目指した。ここではさらに、ＥｐＥＸが誘導する腫瘍の進行および転移がＨＧＦＲシグナル伝達に介在することを示す。
ＥｐＣＡＭの発現は、多くの癌において腫瘍形成および転移と相関しているため、本発明者らは、この試験ではその基礎となるメカニズムの解明を目指した。ここではさらに、ＥｐＥＸが誘導する腫瘍の進行および転移がＨＧＦＲシグナル伝達に介在することを示す。
【0126】
多くの研究が、ＨＧＦＲの高発現または活性化と癌患者の予後不良との関連性を明らかにしている（Birchmeier et al., 2003）。ＨＧＦＲの高発現は、甲状腺がんおよび非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ)における予後不良を示し、結腸癌では腫瘍浸潤およびリンパ節転移の予測因子となる（Al-Saad et al, 2017; Takeuchi et al, 2003）。これまでの報告でも、胃癌およびＣＲＣのモデルにおいて、ＨＧＦＲシグナル伝達を遮断することで、インビトロおよびインビボでの腫瘍細胞の増殖および転移を抑制できることが示されている（Smolen et al, 2006; Toiyama et al, 2012; Zou et al, 2007）。
【0127】
ＨＧＦは上皮細胞の増殖を調節するサイトカインであり、主に間葉系細胞から発現および分泌される（Lassus et al, 2006; Taher et al, 2002）。ＨＧＦシグナル伝達の主要なコーディネーターはＨＧＦＲであり、このシグナル伝達経路によって誘導される複合プログラムは、増殖、生存、マトリックス分解および遊走を促進する。ＨＧＦＲおよびＨＧＦは共に、創傷の閉鎖および血管新生に必要な、上皮および間葉の重要な相互作用の基盤を形成している（Comoglio ＆ Trusolino, 2002）。本発明者らの結果は、ＥｐＣＡＭノックアウトが結腸癌細胞におけるＨＧＦＲのリン酸化を抑制し、ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１１６細胞の細胞増殖能および遊走能が野生型細胞に比べて有意に低下したことを示す。ＥｐＣＡＭノックアウトＨＣＴ１６細胞にＨＧＦ処理を戻すと、ＥｐＣＡＭによる細胞増殖および遊走への影響は部分的に逆転した。ＨＧＦＲのリン酸化を制御するＥｐＣＡＭの能力は、この経路が結腸癌細胞において重要な役割を果たしている可能性を強く示唆している。
【0128】
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、キナーゼドメインのＡＴＰ結合ポケットにＡＴＰが到達しないようにすることで、リガンドの存在に関係なく活性化ＲＴＫを標的とできる低分子薬剤である（Pasquini ＆ Giaccone, 2018）。通常、薬剤耐性は、ＴＫＩの効果を消失させるＲＴＫの変異の獲得、またはＨＧＦＲのような同様のシグナル伝達を刺激する別のＲＴＫの増幅によって生じる（Sacher et al, 2014）。以前、本発明者らのグループは、ヒトホスホ－ＲＴＫアレイキットを用いて、ＥｐＥＸ－Ｆｃ処理したＨＣＴ１１６結腸癌細胞およびＦｃ処理したＨＣＴ１１６結腸癌細胞におけるＲＴＫのリン酸化をスクリーニングした。その結果、ＨＧＦＲ（ＭＥＴ）－チロシンリン酸化がＥｐＥＸ処理によって刺激されることが示された（Liang et al., 2018）。本試験では、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞を可溶性ＥｐＥＸ－Ｈｉｓタンパク質と共にインキュベートすることで、ＨＧＦＲリン酸化が誘導されることを見出した。興味深いことに、ＨＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＳＵ１１２７４）は、ＥｐＥＸ介在性のＥＲＫおよびＡＫＴのリン酸化を抑制した。さらに、本発明者らは、ＨＧＦＲの枯渇が、ＨＧＦＲ阻害剤の効果と一致するように、ＥｐＥＸ誘発細胞の増殖および浸潤を抑制できることを確認した。
【0129】
多くの研究が、ＥＭＴが癌の進行および転移に関連していることを示している（Iwatsuki et al., 2010）。ＥＭＴの過程には、上皮細胞との接着が失われ、かつ細胞に間葉系表現型が誘導される一連の複雑な可逆的事象が含まれる。ＥＭＴは、間葉系の特徴を獲得するのに必要な幹細胞のような可塑的特徴を腫瘍に与え、腫瘍細胞の播種および浸潤を可能にする（Sacchetti et al, 2021; Thiery ＆ Sleeman, 2006）。ＥＭＴを受けた癌細胞は、上皮細胞との接着が失われ、かつ間葉系の性質が誘導されるとともに、細胞の運動性および浸潤性が増強された。ＥＭＴの指標としては、ビメンチン、スネイルおよびスラッグなどの間葉系マーカーの発現の増加と、細胞間結合を破壊するＥ－カドヘリンなどの上皮系マーカーの発現の減少が挙げられる（Meng et al, 2012）。さらに、ＥＭＴを経た細胞はアポトーシスに対しても抵抗性を示す。種々の癌種におけるＥＭＴが、様々なタイプの治療薬に対する耐性を促進し得ることが、多くの報告で示されている（Singh ＆ Settleman, 2010）。治療目的でＥＭＴを阻害することは、腫瘍細胞におけるＥＭＴプログラムの活性化に寄与する腫瘍微小環境の構成要素を標的とすることで達成され得る（Shibue ＆ Weinberg, 2017）。例えば、ＨＧＦはＨＧＦＲシグナル伝達を介してＥＭＴプログラムを誘導し、それによって癌細胞の浸潤および転移能を高め、細胞が固定されない状態で血流中で生存できるようにする。これまでの報告では、ＦＡＫ－ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路が、結腸癌および神経膠芽腫における遊走および転移を促進することが示されていた（Golubovskaya, 2014; Song et al, 2016）。本発明者らのデータは、これらの分子の阻害剤（すなわち、ＳＵ１１２７４、ＬＹ２９４００２、Ｕ０１２６およびＰＦ－５６２２７１）が、ＨＣＴ１１６細胞におけるＥｐＥＸ誘導性の遊走および浸潤を減弱できることを示した。
【0130】
ＥｐＥＸシグナル伝達によるＧＳＫ３βの阻害は、β－カテニンおよびスネイルの両方を安定化させ、ＥＭＴに関連した細胞遊走および浸潤を協調的に誘導する。注目すべきは、ＥＭＴは非リン酸化（活性化）β－カテニンの高発現およびβ－カテニンの核内移行と相関しているが、β－カテニンの過剰発現だけでは必ずしもＥＭＴ関連プロセスを促進しないことである（Kim et al, 2000; Zhou et al, 2004）。さらに、スネイルは亜鉛フィンガー転写因子であり、Ｅ－カドヘリン発現を抑制することによってＥＭＴを誘発する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ、ＭＡＰＫおよびＷｎｔなど多くの発癌性シグナルがＧＳＫ３βを阻害し、スネイルの安定化とその後のＥＭＴを引き起こすことが示されている（Zhou et al., 2004）。本発明者らのデータは、ＥｐＥＸがＧＳＫ３β活性の低下を介して活性型β－カテニンおよびスネイルを安定化させることにより、ＥＭＴおよび浸潤を誘導することを示した。さらに、本発明者らの抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＧＳＫ３β活性を上昇させ、活性型β－カテニンおよびスネイルの分解を導くことによって、ＥＭＴおよび浸潤を阻害する。
【0131】
ＨＧＦＲシグナル伝達は抗癌剤治療の重要な標的であり、この経路のアンタゴニストを開発するために多大な努力が払われてきた。現在、ＨＧＦＲチロシンキナーゼドメインに対する多くの低分子阻害剤が臨床治験で評価されている。ＨＧＦＲの過剰発現は、多くの癌細胞で薬剤耐性を促進することが知られており、その結果、治療効果が乏しくなり、患者の生存期間が短くなる（Yang et al, 2021; Zhao et al, 2020）。例えば、ＨＧＦＲシグナル伝達経路が多発性骨髄腫患者における多剤耐性の主要な駆動因子であることを示す強力な前臨床および臨床証拠がある（Moschetta et al, 2013）。ＨＧＦＲ活性化の主な機序がリガンド非依存性のＨＧＦＲ過剰発現であるため、ＨＧＦＲ阻害剤の多くは、ＨＧＦリガンドではなく、そのＲＴＫ活性を直接標的としている（Koch et al., 2020;Liang et al., 2020）。現在、２種の非選択的ＨＧＦＲ ＴＫＩが承認されている:ＡＬＫおよびＲＯＳ１陽性ＮＳＣＬＣに対するクリゾチニブ（２０１１年に初承認）、甲状腺癌および腎臓癌に対するカボザンチニブ（２０１６年に初承認）（Kobayashi et al, 2016; Shaw et al, 2014）。ＨＧＦＲ阻害の妥当性については、クリゾチニブに関するいくつかの臨床治験が進行中であり、精力的に評価が行われている。あるクリゾチニブの治験結果は、ＨＧＦＲエクソン１４スキップ変異を有するＮＳＣＬＣの治療にある程度の見込みがあることが示唆された（Paik et al, 2015）。第Ｉ相ＭＥｒＣｕＲＩＣ１治験は、増幅ＨＧＦＲおよび野生型または変異ＲＡＳを有するＣＲＣ患者コホートにおいて、クリゾチニブとＭＥＫ阻害剤の併用を評価している（ＮＣＴ０２５１０００１）（Van Schaeybroeck et al, 2015）。以前の報告では、クリゾチニブがＨＧＦ／ＳＴＡＴ３／ＳＯＸ１３／ＨＧＦＲのフィードバックループを阻害し、ＳＯＸ１３が介在するＣＲＣの遊走、浸潤および転移を抑制し得ることが示された（Du et al, 2020）。
【0132】
本発明者らのグループは、ＥｐＥＸの機能を阻害するために用いられ得るＥｐＥＸ中和抗体ＥｐＡｂ２－６を作製した。ＥｐＡｂ２－６処置は、ＥｐＣＡＭ切断を促進し、次いでＥｐＥＸおよびＥｐＩＣＤ産生を増加させる正のフィードバックループを含むＥｐＥＸ／ＥＧＦＲ／ＡＤＡＭ１７を軸とするシグナル伝達を破壊することが知られている（Liang et al., 2018;Liao et al., 2015）。注目すべきは、ＥｐＡｂ２－６処理後にリン酸化ＨＧＦＲレベルの低下が観察されたことである。さらに、ＥｐＡｂ２－６はＨＣＴ１１６細胞の浸潤能および遊走能を減弱させたが、ＨＧＦ処理後は部分的に回復した。これまでの報告では、ＥｐＡｂ２－６がアポトーシスを誘導し得ることが示されており、本発明者らは、クリゾチニブ処理後、ＨＣＴ１１６細胞がヒト化－ＥｐＡｂ２－６およびＥｐＡｂ２－６誘導アポトーシスに感作されることを確認した。同所結腸癌動物モデルの結果からも、ＥｐＡｂ２－６およびクリゾチニブの併用投与により腫瘍増殖が有意に抑制されることが示された。
【0133】
ＮＳＣＬＣに対する潜在的な治療法の中で、クリゾチニブおよび他のＨＧＦＲ標的療法は、最も有益な治療法のひとつである。この事実は、ＨＧＦＲ活性化を阻害するために使用できるメカニズムを深く理解することの重要性を強調している。本発明者らは、ＥｐＣＡＭまたはＥｐＥＸがＨＧＦＲ－ＥＲＫ－ＡＣＴシグナル軸を誘導することを見出した。これらの知見によれば、ＥｐＣＡＭはクリゾチニブとの併用療法の優れた標的となり得る。実際、本発明者らの試験では、ＥｐＡｂ２－６はリン酸化ＨＧＦＲのレベルを低下させ、動物モデルにおけるクリゾチニブの治療効果を改善した。従って、本発明者らの発見は、ＨＧＦＲシグナル伝達の制御におけるＥｐＣＡＭの新規作用を明らかにし、ＥｐＣＡＭ／ＨＧＦＲ標的併用療法の新たな戦略を示唆するものである。
【0134】
本発明において、本発明者らは、ＥｐＣＡＭ／ＥｐＥＸが結腸癌細胞において、ＨＧＦＲ活性化、ＧＳＫ３β－スネイルおよびβ－カテニンシグナル伝達を誘導することにより、ＥＲＫおよびＦＡＫ－ＡＣＴを介して腫瘍の進行および転移を誘導することを見出した。本発明者らはさらに、ＥｐＣＡＭシグナル伝達の阻害または枯渇が、ＨＧＦＲ活性化とその下流シグナル伝達の減少につながることを示した。抗ＥｐＣＡＭ ｍＡｂ ＥｐＡｂ２－６による処置は、結腸癌の進行および転移を抑制し、重要なことに、同所性腫瘍および転移モデルマウスの生存率を改善した。したがって、本発明者らのデータは、ＥｐＣＡＭを標的とする治療用抗体とＨＧＦＲ阻害剤の併用が、結腸癌治療に大きな可能性を有することを示唆している。これらの知見から得られた知見は、転移を抑制し、患者の予後を改善する、新規の抗癌剤の開発に役立つ有用であり得る。
【0135】
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【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】