特表 2024-524308 質量分析法適合性ｐＨ勾配緩衝系

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】質量分析法適合性ｐＨ勾配緩衝系

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/26 20060101AFI20240628BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20240628BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240628BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20240628BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240628BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240628BHJP

   C07K 1/18 20060101ALN20240628BHJP

【ＦＩ】

G01N30/26 A

G01N30/72 C

G01N30/88 J

G01N30/02 B

G01N27/62 X

C07K16/00

C07K1/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579552

(86)(22)【出願日】2022-06-22

(85)【翻訳文提出日】2024-02-21

(86)【国際出願番号】 US2022034559

(87)【国際公開番号】W WO2022271853

(87)【国際公開日】2022-12-29

(31)【優先権主張番号】63/213,562

(32)【優先日】2021-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/325,392

(32)【優先日】2022-03-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523483485

【氏名又は名称】フェノメネックス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】アベリノ シー．サンチェス

【テーマコード（参考）】

2G041

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041GA06

2G041HA01

4H045AA11

4H045AA50

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA50

4H045GA23

(57)【要約】

モノクローナル抗体及びその電荷変異体のｐＨ勾配ＬＣ－ＭＳ特性評価のための改善された移動相緩衝液組成物、方法、及びキットが提供される。
【選択図】図６ー５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体クロマトグラフィーのための即時使用可能な移動相組成物であって、水、
２～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、
１～５０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、その異性体、又はその類似体、及び
室温で約ｐＨ４．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、即時使用可能な移動相組成物。

【請求項2】

２～２５ｍＭの前記カルボン酸アンモニウム、及び
１～１０ｍＭの前記Ｎ－メチルモルホリン、前記その異性体、又は前記その類似体を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記カルボン酸アンモニウムが、酢酸アンモニウム及びギ酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記Ｎ－メチルモルホリン異性体が、２－メチルモルホリン、２－メチルモルホリン、２－メチル－１，３－オキサジナン、３－メチル－１，３－オキサジナン、４－メチル－１，３－オキサジナン、５－メチル－１，３－オキサジナン、及び６－メチル－１，３－オキサジナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記類似体が、アルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、ジアルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、アルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナン、及びジアルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記移動相が、２部水性緩衝系を含み、
前記水性緩衝系の部分Ａが、約１０ｍＭ～約２０ｍＭの酢酸アンモニウム、約３～約８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及びｐＨ５．０～５．５の範囲内にあるｐＨを含み、
前記水性緩衝系の部分Ｂが、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及びｐＨ９．５～１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

部分Ａ緩衝液の前記ｐＨが、酢酸で調節される、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

部分Ｂ緩衝液の前記ｐＨが、水酸化アンモニウムで調節される、請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

部分Ａ緩衝液が、約１４～約１６ｍＭの前記酢酸アンモニウム、約４～約６ｍＭの前記Ｎ－メチルモルホリンを含み、前記ｐＨが、約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．３である、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

部分Ｂ緩衝液が、約４～約６ｍＭの前記酢酸アンモニウム、約１ｍＭ～約３ｍＭの前記Ｎ－メチルモルホリンを含み、前記ｐＨが、約１０．０～約１０．４である、請求項６に記載の組成物。

【請求項11】

前記酢酸アンモニウムの濃度が、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、又は約１５ｍＭ以下である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

１００ｐｐｂ以下の個々の金属不純物を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記液体クロマトグラフィーが、固定相を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記固定相が、イオン交換固定相、サイズ排除固定相、親水性相互作用固定相、及び逆相固定相からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記イオン交換固定相が、カチオン交換固定相である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記カチオン交換固定相が、強カチオン交換固定相及び弱カチオン交換固定相からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記液体クロマトグラフィーが、質量分析計に直接結合（オンライン）される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

試料中の分析物を分離及び／又は特性評価する方法であって、
移動相をクロマトグラフィーカラムを通して流すことであって、前記移動相が、２部水性緩衝系を含み、
前記水性緩衝系の部分Ａが、約１０～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、３～１６ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み、
前記水性緩衝系の部分Ｂが、２～２５ｍＭのカルボン酸アンモニウム、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、流すことと、
前記分析物を含む試料を前記移動相に注入することと、
前記カラムから前記分析物を溶出することと、
溶出液中の前記分析物を検出することと、を含む、方法。

【請求項19】

移動相をクロマトグラフィーカラムを通して流すことであって、前記移動相が、２部水性緩衝系を含み、
前記水性緩衝系の部分Ａが、約１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み、
前記水性緩衝系の部分Ｂが、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、流すことと、
前記分析物を含む試料を前記移動相に注入することと、
前記カラムから前記分析物を溶出することと、
前記溶出液中の前記分析物を検出することと、を含む、請求項１８に記載の試料中の分析物を分離及び／又は特性評価する方法。

【請求項20】

前記分析物が、生体分子である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記生体分子が、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の抗原結合断片、及び／又はその電荷変異体である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記モノクローナル抗体又は断片が、約ｐＩ６．５～約ｐＩ９．５のｐＩを有する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記クロマトグラフィーカラムが、イオン交換固定相、サイズ排除固定相、親水性相互作用固定相、及び逆相固定相からなる群から選択される固定相を含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記イオン交換固定相が、強カチオン交換固定相及び弱カチオン交換固定相からなる群から選択されるカチオン交換固定相である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記検出することが、前記溶出液の前記ＵＶ吸光度を決定することを含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記分析物を質量分析計（ＭＳ）で検出することを含む、請求項１８～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＭＳが、セクタ、飛行時間型（ＴＯＦ）、四重極、イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、及びタンデム質量分析計、又はタンデム若しくは直交プラットフォーム内で組み合わせられた前記質量分析計のうちの２つ以上からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

ＭＳ検出が、分析物イオンを生成することを含む、請求項２６又は２７に記載の方法。

【請求項29】

前記生成することが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザ脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、高速原子爆撃（ＦＡＢ）、化学イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、大気固体分析イオン化（ＡＳＡＩ）、大気圧力光イオン化（ＡＰＰＩ）、脱着エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、及び大気圧力蒸気源（ＡＰＶＳ）からなる群から選択されるイオン化技術を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＭＳ検出が、前記分析物イオンの質量スペクトルを取得することを更に含む、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記分析物イオンの質量スペクトルが、前記Ｎ－メチルモルホリン、その異性体、又は類似体を含まない酢酸アンモニウムを含む移動相緩衝系を用いる同等の方法よりも、分析物アイソフォームに対するより低い電荷状態を呈する、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

分析物アイソフォームに対する前記より低い電荷状態が、前記Ｎ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体を含まない酢酸アンモニウムを含む移動相緩衝系を用いる同等の方法よりも、電荷状態エンベロープ内の増加した分析物質量をもたらす、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記ＭＳ検出が、前記分析物の分子量を決定することを更に含む、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記水性緩衝系の部分Ａは、酢酸でｐＨ５．２に調節された、約１５ｍＭの酢酸アンモニウム、約５ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み、
前記水性緩衝系の部分Ｂは、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された、約５ｍＭの酢酸アンモニウム、約２ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項35】

前記移動相が、約１００ｐｐｂ以下の個々の金属不純物を含有する、請求項１９に記載の方法。

【請求項36】

溶出が、
前記注入の後に前記カラムを通って流れる緩衝液Ａ％に対して、経時的に緩衝液Ｂ％を増加させることであって、前記緩衝液Ａ％＋緩衝液Ｂ％＝前記移動相の１００％である、増加させることを含む、ｐＨ勾配を形成することを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項37】

前記勾配の傾きが、前記溶出液の０．１～１０％Ｂ／ＣＶ、又は０．５～５％Ｂ／カラム体積（ＣＶ）の範囲内にある、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ｐＨ勾配が、線形ｐＨ勾配、セグメント化ｐＨ勾配、湾曲ｐＨ勾配、又はステップｐＨ勾配である、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

キットであって、
水で希釈して、１０～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、３～１６ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体、及び約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ａを得るための第１の濃縮液体組成物の体積を有する第１の容器と、
水で希釈して、２～２５ｍＭのカルボン酸アンモニウム、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ｂを得るための第２の濃縮液体組成物の体積を有する第２の容器と、
使用説明書と、を備える、キット。

【請求項40】

水で希釈して、１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ａを得るための第１の濃縮液体組成物の体積を有する第１の容器と、
水で希釈して、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ｂを得るための第２の濃縮液体組成物の体積を有する第２の容器と、
使用説明書と、を備える、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

前記第１の濃縮液体組成物及び前記第２の濃縮液体組成物が、それぞれ、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍濃縮の前記緩衝液Ａ及び前記緩衝液Ｂからなる群から選択される濃度を含む、請求項３９又は４０に記載のキット。

【請求項42】

クロマトグラフィーカラムを更に備える、請求項３９～４１のいずれか一項に記載のキット。

【請求項43】

前記クロマトグラフィーカラムが、強イオン交換クロマトグラフィーカラム又は弱イオン交換クロマトグラフィーカラムである、請求項４２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０２２年６月２２日に出願され、２０２１年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２１３，５６２号及び２０２１年３月３０日に出願された同第６３／３２５，３９２号の優先権及び利益を主張し、その開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、治療用ｍＡｂの重要な品質属性である。翻訳後修飾は、製造、精製、及び貯蔵中に生じ得る。ＰＴＭは、治療用ｍＡｂｓの有効性、活性、及び安定性に影響を及ぼし得る。一次アミノ酸配列変動及びＰＴＭは、Ｃ末端リジン切断、Ｎ末端ピログルタマート形成、Ｎ－グリコシル化時に存在するシアリル化、及びアスパラギン又はグルタミン残基の脱アミド化を含み得る。これらの修飾は、ｍＡｂの酸性及び塩基性電荷変異体をもたらす分子の等電点（ｐＩ）を変更し得る。

【0003】

モノクローナル抗体は、ＰＴＭの製造及び製剤化中に定期的に監視される。典型的な監視は、溶出のために塩又はｐＨ勾配を使用する紫外線監視（ＵＶ）を伴うイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）の使用を含む。天然高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）に結合されたＩＥＣを有するｍＡｂ ＰＴＭを監視することは、修飾の迅速な同定を可能にする。無傷のｍＡｂｓの天然ＭＳは、ＰＴＭの同定を容易にする、より少ないスペクトルオーバーラップ及びより少ない干渉を伴うより単純なスペクトルを与える。

【0004】

改良された再現性、分解能、感度、及びｐＨ直線性を実証する、モノクローナル抗体のＩＥＣ－ＨＲＭＳ電荷変異体分析のための改良された移動相緩衝組成物及び方法が望ましい。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、ｐＨ勾配移動相緩衝組成物及び方法を提供し、低イオン強度（約５０ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、又は約２０ｍＭ以下）を有する広範囲のｐＨ値（ｐＨ５．２～１０．２）にわたって良好なｐＨ制御を与え、無傷のタンパク質についての改善されたＭＳ感度「より天然な」質量スペクトルを与え、タンパク質アイソフォームについてより低い電荷状態を与え、電荷状態エンベロープ内の増加した質量、並びに向上したｐＨ勾配直線性、堅牢性、及び再現性を与えるという利点を有する。

【0006】

イオン交換クロマトグラフィーを使用するとき、低等電点（ｐＩ）ｍＡｂｓ（例えば、インフリキシマブ、ｐＩ７．６）を含む無傷のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の電荷変異体の改善されたクロマトグラフィー分解能を実証する、移動相ｐＨ勾配緩衝組成物及び方法が提供される。

【0007】

移動相緩衝組成物及び方法は、タンパク質分析物の直接結合したＩＥＣ－ＨＲＭＳにおいて使用され得、例えば、移動相緩衝中の約５０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、又は２０ｍＭ未満の塩濃度に起因する、良好なＭＳ感度を実証し得る。

【0008】

移動相緩衝組成物及び方法は、無傷のタンパク質のより低い電荷状態、すなわち、変性が減少した無傷のタンパク質分析物を示すＭＳスペクトルに起因して、質量分析（ＭＳ）分解能が改善された天然タンパク質分析物のＩＥＣ－ＨＲＭＳ中で使用され得る。

【0009】

本明細書に提供される緩衝組成物及び方法は、無傷のタンパク質分析物のＵＶ及びＨＲＭＳ検出の両方に好適である。

【0010】

本開示は、水、２～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、１～５０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、その異性体、又はその類似体、及び室温で約ｐＨ４．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、液体クロマトグラフィーのための即時使用可能な移動相組成物を提供する。液体クロマトグラフィーのための即時使用可能な移動相組成物は、２～２５ｍＭのカルボン酸アンモニウムと、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、その異性体、又はその類似体と、を含み得る。カルボン酸アンモニウムは、酢酸アンモニウム又はギ酸アンモニウムであり得る。Ｎ－メチルモルホリン、その異性体、又はその類似体は、Ｎ－メチルモルホリンであり得る。Ｎ－メチルモルホリン異性体は、２－メチルモルホリン、２－メチルモルホリン、２－メチル－１，３－オキサジナン、３－メチル－１，３－オキサジナン、４－メチル－１，３－オキサジナン、５－メチル－１，３－オキサジナン、及び６－メチル－１，３－オキサジナンからなる群から選択され得る。Ｎ－メチルモルホリン類似体は、アルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、ジアルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、アルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナン、及びジアルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナンからなる群から選択され得る。

【0011】

水、２～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び室温で約ｐＨ４．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、液体クロマトグラフィーのための即時使用可能な移動相組成物が提供される。

【0012】

移動相は、２部水性緩衝系を含み得、水性緩衝系の部分Ａは、約１０ｍＭ～約２０ｍＭの酢酸アンモニウム、約３～約８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及びｐＨ５．０～５．５の範囲内にあるｐＨを含み、水性緩衝系の部分Ｂは、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及びｐＨ９．５～１０．５の範囲内にあるｐＨを含む。いくつかの実施形態では、部分Ａ緩衝液は、約１４ｍＭ～約１６ｍＭの酢酸アンモニウム、約４ｍＭ～約６ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ５．１～約ｐＨ５．３のｐＨを含み得る。いくつかの実施形態では、部分Ｂ緩衝液は、約４ｍＭ～約６ｍＭの酢酸アンモニウム、約１ｍＭ～約３ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ１０～約ｐＨ１０．４のｐＨを含み得る。

【0013】

部分Ａ緩衝液のｐＨは、酢酸で調節され得る。部分Ｂ緩衝液のｐＨは、水酸化アンモニウムで調節され得る。

【0014】

即時使用可能な移動相組成物は、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、又は約１５ｍＭ以下の酢酸アンモニウム濃度を含み得る。

【0015】

いくつかの実施形態では、即時使用可能な移動相組成物は、１００ｐｐｂ以下の個々の金属不純物を含み得る。

【0016】

即時使用可能な移動相組成物は、固定相を含む液体クロマトグラフィー法で使用され得る。いくつかの実施形態では、固定相は、イオン交換固定相、サイズ排除固定相、親水性相互作用固定相、及び逆相固定相からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、イオン交換固定相は、カチオン交換固定相であり得る。

【0017】

カチオン交換固定相は、強カチオン交換固定相及び弱カチオン交換固定相からなる群から選択され得る。

【0018】

即時使用可能な移動相組成物は、質量分析計に直接（オンライン）連結された液体クロマトグラフィーを含む方法において使用され得る。

【0019】

本開示は、試料中の分析物を分離及び／又は特性評価する方法であって、移動相をクロマトグラフィーカラムを通して流すことであって、移動相が、２部水性緩衝系を含み、水性緩衝系の部分Ａが、約１０～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、３～１６ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくはその類似体、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み、水性緩衝系の部分Ｂが、２～２５ｍＭのカルボン酸アンモニウム、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくはその類似体、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、流すことと、分析物を含む試料を移動相に注入することと、カラムから分析物を溶出することと、溶出液中の分析物を検出することと、を含む、方法を提供する。

【0020】

方法は、試料中の分析物を分離及び／又は特性評価するために提供され、移動相をクロマトグラフィーカラムを通して流すことであって、移動相が、２部水性緩衝系を含み、水性緩衝系の部分Ａが、約１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み、水性緩衝系の部分Ｂが、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む、流すことと、分析物を含む試料を移動相に注入することと、カラムから分析物を溶出することと、溶出液中の分析物を検出することと、を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、分析物は、生体分子である。生体分子は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の抗原結合断片、又はその電荷変異体であり得る。

【0022】

モノクローナル抗体又は断片は、約ｐＩ６．５～約ｐＩ９．５のｐＩを有し得る。

【0023】

クロマトグラフィーカラムは、イオン交換固定相、サイズ排除固定相、親水性相互作用固定相、及び逆相固定相からなる群から選択される固定相を含み得る。イオン交換固定相は、カチオン交換固定相であり得る。カチオン交換固定相は、強カチオン交換固定相及び弱カチオン交換固定相からなる群から選択され得る。

【0024】

いくつかの実施形態では、検出は、溶出液のＵＶ吸光度を決定することを含み得る。いくつかの実施形態では、検出は、質量分析計（ＭＳ）で分析物を検出することを含み得る。ＭＳは、セクタ、飛行時間（ＴＯＦ）、四重極、イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、及びタンデム（タンデム又は直交プラットフォーム内で組み合わされた上記のうちの２つ以上）質量分析計からなる群から選択され得る。

【0025】

ＭＳ検出は、分析物イオンを生成することを含み得る。生成は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザ脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、高速原子爆撃（ＦＡＢ）、化学イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（ＥＩ）、大気固体分析イオン化（ＡＳＡＩ）、大気圧力光イオン化（ＡＰＰＩ）、脱着エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、及び大気圧力蒸気源（ＡＰＶＳ）からなる群から選択されるイオン化技術を含み得る。ＭＳ検出は、分析物イオンの質量スペクトルを取得することを更に含み得る。ＭＳ検出は、分析物の分子量を決定することを更に含み得る。

【0026】

いくつかの実施形態では、本開示の移動相緩衝組成物は、Ｎ－メチルモルホリンを含まない酢酸アンモニウムを含む同等の移動相緩衝系よりも、分析物アイソフォームに対するより低い電荷状態を呈する分析物イオンの質量スペクトルをもたらす。本開示の移動相緩衝組成物の使用は、Ｎ－メチルモルホリンを含まない酢酸アンモニウムを含む同等の移動相緩衝系よりも、分析物アイソフォームに対するより低い電荷状態、及び電荷状態エンベロープ内の分析物の質量をもたらし得る。

【0027】

いくつかの実施形態では、水性緩衝系の部分Ａは、約１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み、水性緩衝系の部分Ｂは、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む。ｐＨは、水酸化アンモニウムを用いて、約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内で調節され得る。移動相は、約１００ｐｐｂ以下の個々の金属不純物を含有し得る。

【0028】

いくつかの実施形態では、溶出は、ｐＨ勾配を形成することを含み得る。ｐＨ勾配は、注射後にカラムを通って流れる緩衝液Ａ％に対して、経時的に緩衝液Ｂ％を増加させることを含み得、緩衝液Ａ％＋緩衝液Ｂ％＝移動相の１００％である。いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配の傾きは、溶出液の０．１～１０％Ｂ／ＣＶ、又は０．５～５％Ｂ／カラム体積（ＣＶ）の範囲内にある。いくつかの実施形態では、ｐＨ勾配は、線形ｐＨ勾配、セグメント化されたｐＨ勾配、湾曲したｐＨ勾配、又はステップｐＨ勾配であり得る。

【0029】

本開示は、水で希釈して、１０～５０ｍＭのカルボン酸アンモニウム、３～１６ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくは類似体、及び約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ａを得るための第１の濃縮液体組成物の体積を有する第１の容器と、２～２５ｍＭのカルボン酸アンモニウム、１～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又はその異性体、若しくはその類似体、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ｂを得るために水で希釈するための第２の濃縮液体組成物の体積を有する第２の容器と、使用説明書と、を備えるキットを提供する。

【0030】

水で希釈して、１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ａを得るための第１の濃縮液体組成物の体積を有する第１の容器と、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ｂを得るために、水で希釈するための第２の濃縮液体組成物の体積を有する第２の容器と、使用説明書と、を備えるキットが提供される。いくつかの実施形態では、緩衝液Ａは、１０～２０ｍＭの酢酸アンモニウム、３～８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ５～約ｐＨ５．５の範囲内にあるｐＨを含み得る。緩衝液Ｂは、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～３ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び約ｐＨ９．５～約ｐＨ１０．５の範囲内にあるｐＨを含む緩衝液Ｂを含み得る。第１の濃縮液体組成物及び第２の濃縮液体組成物は、それぞれ２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍濃縮の緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂからなる群から選択される濃度を含み得る。キットは、クロマトグラフィーカラムを更に備え得る。例えば、クロマトグラフィーカラムは、強イオン交換クロマトグラフィーカラム又は弱イオン交換クロマトグラフィーカラムであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸ弱カチオン交換カラム上のトラスツズマブ－ａｎｎｓからのＨＲＭＳ総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．１を有するモノクローナル抗体トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｊｉｎｔｉ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、表３に従って１５分間にわたる３０～６０％のＢ勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して注入した。

【図1-2】ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のトラスツズマブ－ａｎｎｓに関する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．１を有するモノクローナル抗体トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｊｉｎｔｉ，１０ｍｇ／ｍＬ）を、表２に従って１５分間にわたる２０～５０％Ｂの勾配を使用し、最適化された標準緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに表２、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）に従って、注入した。

【図2-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のリツキシマブ－ａｂｂｓに関する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．４を有するモノクローナル抗体リツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然のＷＣＸ－ＨＲＭＳに供した。１０μＬ（１００μｇ）のアリコートを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに注入し、表４に示されるように１５分間にわたる６５－１００％のＢ勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用してクロマトグラフィーを行った。

【図2-2】ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のリツキシマブ－ａｂｂｓの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．４を有するモノクローナル抗体リツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表４に示されるように、１５分間にわたる６０～１００％のＢ勾配で最適化された標準緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０μＬ（１００μｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラム、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）に注入した。

【図3-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸ カラム上のＮＩＳＴリファレンスｍＡｂに関する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．２を有するモノクローナル抗体ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、１５分間にわたる６５～１００％Ｂの勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して、注入した。

【図3-2】ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のＮＩＳＴｍＡｂに関する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ９．２を有するモノクローナル抗体ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂを、表４に示されるように、最適化された標準緩衝液及び１５分間にわたる６０～１００％のＢ勾配を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０μＬ（１００μｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ １５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、表４に示される勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して、注入した。

【図4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸ カラム上のインフリキシマブの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ７．６を有するモノクローナル抗体インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表５に従って新しい緩衝液及び１５分間にわたる２０～３５％Ｂの勾配を使用して、天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）で、注入した。

【図5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用する、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸ カラム上のセツキシマブに関する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。ｐＩ８．８を有するモノクローナル抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表６に従って新しい緩衝液及び１５分間にわたる２５～５５％Ｂの勾配を使用して、天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、＋ＴＯＦＭＳ（２０００－７００）で注入した。

【図6-1】Ａｂｓ２８０ｎｍのトラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）によって監視されたＵＶクロマトグラムを示す。モノクローナル抗体を、０．３ｍＬ／分の流量で１０分間にわたって、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ及び３５～６５％ＢのｐＨ勾配を含有する新しい緩衝系を使用して、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）上に注入した。

【図6-2】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕＬ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．８３分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図６ー４及び図６ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図6-3】ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる２０～５０％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕＬ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．０９分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図６ー６及び図６ー７に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図6-4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、４．９０９～５．１３１分間の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、トラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷（ｍ／ｚ）範囲が示される。

【図6-5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，８５８～５．２１７分、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６６００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図６ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。同じ質量範囲が、スペクトル６Ｅ及び６Ｆの両方に使用される。

【図6-6】ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び２０～５０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，９６０～５．２１７分、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図６ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【図6-7】ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び２０～５０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、４，９６０～５，２１７分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図7-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる２５～４０％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、インフリキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍによって監視されたＵＶクロマトグラムを示す。変異体の良好な分離は、新しい緩衝系を伴うｐＨ勾配を使用して観察された：３．３５７、４．２４９、５．０１８、５．７５９、及び６．５６３分のＲＴにおいて溶出する５つの別個のピークが観察された。

【図7-2】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分間にわたって２０～３５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。変異体の良好な分離が、新しい緩衝系を用いたｐＨ勾配を使用して観察された：６．０７、６．５７、７．１７、７．８７、及び８．５７分のＲＴにおいて溶出する５つの別個のピークが観察された。８．５７分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図７ー４及び図７ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図7-3】ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１５～２５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．６３分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図７ー６及び図７ー７に示されるＭＳ分析のおおよその面積を例解する。電荷変異体の非常に不十分な分離を、この低ｐＩ ｍＡｂ（ｐＩ＝７．６）の標準緩衝液で与えた。この図と前の図（図７ー２）との比較は、標準緩衝液で日常的に可能なものよりも低いｐＨで良好なｐＨ制御を有することによって得られる性能上の利点を実証する。

【図7-4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び２０～３５％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、８．６２１～９．０３２分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、インフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図7-5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる２０～３５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、８．６２１～９．０３２分のインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６９００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図７ー５に示されるように、新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図７ー６に示される最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【図7-6】ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１５～２５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、５．５９３～５．７３０分のインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図７ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【図7-7】ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び１５～２５％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．５５９～５．６９６分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、インフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６９００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図8-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、セツキシマブ（４ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍによるＵＶクロマトグラムを示す。複数の別個の変異体ピークが、例えば、３．６５、４．０３、４．５８、５．２０、及び５．９３分のＲＴで観察された。

【図8-2】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。複数の別個の変異体ピークが、３．３３、３．９２、４．５４、及び５．２２分のＲＴにおいて観察された。４．５４分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図８ー４及び図８ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図8-3】ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１７～４０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．６８分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図８ー６及び図８ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図8-4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系、及び１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、４．６０１～９．０３２分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、セツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図8-5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．６０１～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図８ー５に示されるように、新しい緩衝系でｐＨ勾配溶出を使用する場合、最も強烈なＭＳピークは、図８ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【図8-6】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１７～４０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．５３３～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図８ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【図8-7】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び１０分にわたる１７～４０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．５３３～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６９００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図9-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる７５～１００％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．４（１０ｍｇ／ｍＬ）を有するリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからのＡｂｓ２８０ｎｍによるＵＶクロマトグラムを示す。５．０３分のＲＴにおける主ピークが観察された。

【図9-2】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる６５～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．８８分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、ＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図9-3】ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び、１０分にわたる５５～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．６５分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図９ー６及び図９ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図9-4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系、及び１０分にわたる６５～１００％ＢのｐＨ勾配、６．０２１～６．３６３分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＬＣ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの範囲内にある質量／電荷、ｍ／ｚデータが示される。

【図9-5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び６５～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、６．０２１～６．３６３分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６８００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図９ー５に示されるように、新しい緩衝系でｐＨ勾配を使用する場合、最も強力なＭＳピークは、図９ー６に示される、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【図9-6】ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる５５～１００％ＢのｐＨ勾配、４．５５０～４．７７２分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６８００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図９ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【図9-7】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び５５～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，５５０～４．７７２分のリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図10-1】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる９５～１００％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．２（１０ｍｇ／ｍＬ）を有するＮＩＳＴｍＡｂのＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍにおいて監視されたＵＶクロマトグラムを示す。

【図10-2】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる９０～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．３９～４．８２のＲＴのピーク内にボックスを形成する点線は、ＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図10-3】ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．５分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図１０ー６及び図１０ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【図10-4】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び９０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．０１２～５．６２７分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの範囲にわたる質量／電荷（ｍ／ｚ）データが示される。

【図10-5】ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び９０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．０１２～５．６２７分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６９００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図１０ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【図10-6】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、４．２５９～４．８４１分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図１０ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【図10-7】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．２５９～４．８４１分のＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６８００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【図11】ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び６０～１００％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、５００℃、４．７７２～５．０１２分で、弱カチオン交換ＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＷＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～７０００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、ＷＣＸ－ＨＲＭＳを使用するＮＩＳＴｍＡｂに関する生のＭＳスペクトルはまた、図１０ー６に示されるＳＣＸ－ＨＲＭＳの生のスペクトルと同様に、＋２５～＋３０の最も強力なＭＳピークを呈する。

【発明を実施するための形態】

【0032】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、治療用タンパク質の重要かつ急速に成長している分野である。それらの固有の複雑さ及び多種多様な可能性のある翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、効果的な特性評価及び品質監視を困難にする。ｍＡｂの電荷変異体は、一般に、製造プロセス中に生じるＰＴＭに由来する。Ｃ末端リジンクリッピング及びＮ－グリコシル化などのこれらのＰＴＭは、天然タンパク質に対して塩基性及び／又は酸性残基の欠失／付加をもたらし、このため、分子の全体的な電荷に差異を付与する。典型的には、ｍＡｂ及び他の生体分子分析物の分析は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び質量分析法（ＭＳ）の組み合わせを使用して実施される。高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）を使用する電荷変異体分析（ＣＶＡ）のためのＩＥＣの有用性を示すいくつかの研究が発表されている。本開示では、最適化されたＭＳ適合性緩衝系が開発され、ＨＲＭＳにオンラインで結合されたイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）を使用する場合、ｐＨ勾配の制御、このためｍＡｂの電荷変異体の分解能を改善するために使用された。異なるカチオン交換体タイプ（強／弱）、吸着剤粒径、カラム長、流量、緩衝系、及び勾配の傾きを使用した。方法及び試薬は、広範囲のｐＩに及ぶ市販のｍＡｂを使用して開発されている。本開示は、ルーチン分析における最適な性能のための改善された緩衝系及び方法を提供する。

【0033】

天然モノクローナル抗体などのタンパク質分析物のＩＥＣ－ＨＲＭＳの問題に対処するアプローチが説明されているが、各々に著しい欠点がある。

【0034】

Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８は、電荷変異体天然質量分析法が、モノクローナル抗体の無傷の質量分析の質量精度及びダイナミックレンジに利益をもたらすことを記載している。ｐＨ勾配溶出によるＩＥＣ分離を可能にするために、ＭＳ適合方法が求められた。移動相緩衝液Ａは、５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）、ｐＨ調節なしでｐＨ６．６であり、緩衝液Ｂは、水酸化アンモニウムを使用してｐＨ１０．１に調節した５０ｍＭの酢酸アンモニウムであった。酢酸アンモニウムは、４．７５の＋／－１ｐＨ単位（酢酸ｐＫａ）及び９．２５の＋／－１ｐＨ単位（アンモニウムｐＫａ）内の緩衝を提供する。ｐＫａ値の間に広いギャップがあるため、酢酸アンモニウムを使用するｐＨ勾配は、実験的な直線性の点で損なわれ得る。ＩＥＣ分離中のｐＨ勾配の不十分な直線性を呈した。Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８ＭＡＢＳ，ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．８，１２１４－１２２５．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１９４０８６２．２０１８．１５２１１３１。

【0035】

Ｆｕｓｓｌ ｅｔ ａｌ．２０１８は、高分解能天然質量分析法への直接結合ｐＨ勾配カチオン交換クロマトグラフィーを使用するモノクローナル抗体の電荷変異体分析を実施した。Ｆｕｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ９０，２０１８－４６６９。２５ｍＭの重炭酸アンモニウム、３０ｍＭの酢酸、ｐＨ５．３（緩衝液Ａ）、及び２ｍＭの酢酸、ｐＨ１０．８（緩衝液Ｂ）中の１０ｍＭの水酸化アンモニウムを有する揮発性ｐＨ勾配緩衝系を、５マイクロメートルの粒径を有するＭＡｂＰａｃＳＣＸ－１０ＲＳスルホン酸強カチオン交換カラムを使用して用いた。混合後、緩衝液を室温で２４時間休息させた。２４時間の休息期間は、問題があることが見出され、本発明者らは、著者の結果を再現することができなかった。Ｆｕｓｓｌ緩衝液の組成及び化学的性質に基づいて、化学変化（ガス放出、「ビカルボナート」の濃度における変化及びｐＨ）は、「休息」期間中に生じ得る。加えて、ｐＨ制御は、特に、このｐＨ範囲にわたる不十分な緩衝能力に起因して、ｐＨ７～８では困難であった。

【0036】

Ｆｕｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９は、天然分解能Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法にオンラインでハイフン化された（ｈｙｐｈｅｎａｔｅｄ）電荷変異体分析を介したアダリムマブの不均一性の特性評価を記載している。緩衝液Ａは、水中に２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム及び３０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．３）からなり、緩衝液Ｂは、水中に１０ｍＭの水酸化アンモニウム（ｐＨ１０．９）からなる。緩衝液を、５倍ストックで調製し、使用前に４℃で２週間保存した。ＭＳ検出のために重要である、相対的に低いイオン強度の溶離液の使用は、低い緩衝能力をもたらすと言われ、これは、高いｐＩ値を有するｍＡｂの分析を損なう可能性がある。Ｆｕｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９ＭＡＢＳ ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．１，１１６－１２８，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１８．１５３１６６４。

【0037】

ｐＨ勾配緩衝系もまた市販されている。例えば、ＣＸ－１ｐＨ勾配緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、４つの両性イオン性緩衝塩、すなわちＮａＣｌ及びＮａＯＨに加えて、（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸、３ー（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸、及び３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸）を含有する。この緩衝系は、ｐＨ＝５．６～１０．２のｐＨ勾配を提供し、それに伴ってわずかなイオン強度勾配を提供するように調整されると想定される。ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅＣＸｐＨ緩衝液（Ｗａｔｅｒｓ）はまた、コハク酸、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、トリエタノールアミン及びＮ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸を含む４つの緩衝塩を含み、ｐＨ＝５．０～１０．２のｐＨ勾配を提供すると想定される。Ｆａｒｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０ Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，ｖｏｌ．１６２６，３０ Ａｕｇ ２０２０，４６１３５０。

【0038】

本開示は、試料中の分析物を分離及び／又は特性評価するための方法及び組成物を提供する。本方法は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含み得る。ＬＣは、任意の適切なＬＣ方法を伴う可能性がある。ＬＣ方法は、分析物の特性評価のための分析ＬＣを含み得る。ＬＣ方法は、分析物の分離及び／又は精製のためのプロセスＬＣを含み得る。例えば、ＬＣは、ＵＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、及び／又は逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を含み得る。したがって、液体クロマトグラフィーカラム、超高性能クロマトグラフィーカラム、高速クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーカラム、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、親水性相互作用クロマトグラフィーカラム、逆相クロマトグラフィーカラムが、本開示の方法において使用され得る。

【0039】

本明細書において説明された方法は、親和性クロマトグラフィー（例えば、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ）、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、低ｐＨウイルス不活性化、ウイルス濾過、限外濾過、及び／又は透析濾過などの追加のプロセスを上流又は下流に更に含み得る。

【0040】

液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、質量分析計に結合され得る。液体クロマトグラフィーは、質量分析計に直接結合され得る。

【0041】

分析物は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／又はその電荷変異体などの生体分子であり得る。ｍＡｂにおける電荷変異体を特性評価するために使用される最も一般的なＬＣ技法のうちの１つは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）である。

【0042】

定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示を限定することは意図されていない。

【0043】

単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示していない限り、複数形も含むことを意図している。

【0044】

「及び／又は」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上との任意及び全ての可能な組み合わせを指し、包含する。

【0045】

「約」という用語は、化合物の量、容量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合、指定された量の±１０％、５％、１％、０．５％、又は更には０．１％の変動を包含することを意味する。

【0046】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、記載された特徴、整数、ステップ、作用、要素、及び／又は構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、作用、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。別段の定義がない限り、本説明で使用される技術的及び科学的用語を含む全ての用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。用語に矛盾のある場合、本明細書が優先する。

【0047】

「室温」という用語は、別段の指定がない限り、２３℃（２９３～２９８Ｋ、７１°Ｆ）の温度及び１気圧（１４．６９６ｐｓｉ、１０１．３２５ｋＰａ）の絶対圧力を指す。

【0048】

「異性体」という用語は、同じ化学式を有するが、分子内の原子の異なる配置を有する２つの化合物を指す。

【0049】

「類似体」又は「構造的類似体」という用語は、別の化合物と同様の分子構造を有するが、特定の成分に関して異なる化合物を指す。

【0050】

本明細書において参照される全ての特許、特許出願、及び公開は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0051】

本開示の一態様に記載される実施形態は、記載される態様に限定されない。また、実施形態は、本開示のこれらの態様がその意図された目的のために作用することを妨げない限り、本開示の異なる態様に適用され得る。

【0052】

カチオン交換クロマトグラフィーは、正味の表面変化に基づいて、分子を分離するために使用され得るイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の一形態である。カチオン交換クロマトグラフィーは、正味の正の表面電荷を有する分子に対する親和性を有する負に帯電したイオン交換樹脂を用いる。

【0053】

タンパク質の正味表面電荷は、タンパク質の等電点（ｐＩ）によって決定される際ｐＨと共に変化し得る。ｐＩに等しいｐＨでは、タンパク質は、正味電荷を持たないことになる。ｐＩ未満のｐＨでは、タンパク質は、正味の正電荷を担持することになる。ｐＩを上回るｐＨでは、タンパク質は、正味の負電荷を担持することになる。タンパク質のｐＩは、その一次アミノ酸配列によって計算され得る。負に帯電したカチオン交換樹脂は、対象のタンパク質が作業ｐＨで正味の正電荷を担持する場合に選択され得る。緩衝液ｐＨは、タンパク質の正味表面電荷に影響を与えることになる。タンパク質は全てのｐＨで安定ではない可能性があるため、タンパク質の安定性及び緩衝液の選択は、精製のための適切なＩＥＸ培地を決定するのに役立ち得る。

【0054】

カチオン交換クロマトグラフィーカラム樹脂は、樹脂上の官能基のｐＫａによって分類され得る。強酸又は塩基を含有するこれらの樹脂は、「強」イオン交換体と呼称されるが、弱酸又は塩基を含有するものは「弱」イオン交換体と呼称される。

【0055】

「強カチオン交換」（ＳＣＸ）又は「強カチオン交換樹脂」又は「強カチオン交換固定相」という用語は、Ｓと指定され得るメチルスルホネート官能基（例えば、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＳＯ３－）又はＳＰと指定され得るスルホニル官能基（例えば、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２ＳＯ３－）などのスルホン酸官能基を含むイオン交換樹脂を指す。Ｓ強カチオン交換樹脂の典型的なｐＨ範囲は、ｐＨ２～１２であり得る。ＳＰ強カチオン交換樹脂の典型的なｐＨ範囲は、ｐＨ２～１４であり得る。

【0056】

「弱カチオン交換」（ＷＣＸ）又は「弱カチオン交換樹脂」又は「弱カチオン交換固定相」という用語は、典型的には、ＣＭと指定され得るカルボキシメチル官能基（例えば、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ２－）、又はＣと指定され得る他のカルボン酸官能基（－ＣＯ２－）などのカルボン酸官能基を含むイオン交換樹脂を指す。

【0057】

「ＳＥＣ」という用語は、サイズ排除クロマトグラフィーを指す。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子サイズに比例して、最大から最小までのサイズに基づいて、分子を分離することを伴う。非常に大きい分子が、充填床から除外され、第一に空隙体積内で溶出される。より小さい分子は、サイズに応じて、様々な程度に細孔を貫通し得る。最小の分子が最も遠くの細孔に拡散し、最後に溶出する。異なる移動相は、例えば、流体力学的半径又は回転半径に起因して、溶液中のサイズ変化のために、溶出順序に影響を及ぼし得る。ＳＥＣは、モノクローナル抗体などのタンパク質を凝集体、断片、複合体、賦形剤、不純物などから分離するために使用され得る。ＳＥＣは、生物学的化合物のサイズベースの分離に使用され得る。例えば、ＳＥＣは、生物学的治療分子の研究、開発、及び製造における凝集体及び断片分析に適切である。

【0058】

質量スペクトルにおける「ｍ／ｚ」という用語は、個々の分子の質量対電荷比を表し、各分子の正確な同位体組成を表す。最も強烈なピークは、最も可能性の高い同位体の組成から生じる。

【0059】

「電荷エンベロープ」又は「電荷状態エンベロープ」という用語は、例えば、無傷のｍＡｂのＬＣ／ＭＳ生データにおけるピークの群を指す。タンパク質は、エレクトロスプレーイオン化中に多重帯電イオンを形成する。モノクローナル抗体などの大きいタンパク質は、電荷分布エンベロープ、又は「電荷エンベロープ」又は「電荷状態エンベロープ」を有する。例えば、トラスツズマブのための新しい緩衝系を使用して、エンベロープの中心は、図６ー５に示されるように電荷＋２４である。これは、図６ー６に示されるように、エンベロープの中心が電荷＋２７である、トラスツズマブの標準緩衝系と比較される。複数のピークが観察され、これらは、ｍＡｂの異なる糖型又は電荷変異体に起因するものである。ＥＳＩ－ＭＳにおける天然タンパク質の電荷状態は、いくつかのパラメータの複雑な関数であり、これらの相対的な重要性は依然として議論されている。議論された異なるパラメータのうち、溶液中のタンパク質の立体配座（溶媒がアクセス可能な表面積）、タンパク質配列（タンパク質の「表面」での荷電ＡＡの数、溶媒アクセス可能なＡＡ）、及びイオン化環境における成分の気相塩基性が、典型的には重要であると考えられる。より低い電荷状態は、デコンボリューションされた質量スペクトルにおいてより高い分解能を与えることができるため、分析物の電荷状態は、生体巨大分子のＭＳ検出において重要である。低減されたタンパク質変性（「より天然の」立体配座）若しくはより少ない付加物、又は両方を示すため、より低い電荷状態は、概して、生体分子の天然ＭＳにおいて好ましい。いくつかの実施形態では、新しい緩衝系は、標準緩衝系と比較して、タンパク質分析物の生の質量スペクトルにおいて、少なくとも約３又は少なくとも約２の電荷状態のより低い電荷状態エンベロープをもたらす。

【0060】

ＬＣ溶出液の検出は、任意の適切な方法によるものであり得る。溶出液は、ＵＶ検出によって、例えば、ＵＶ検出器による事前選択された波長における吸光度の測定によって、及び／又はＵＶ範囲内での、例えば、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用して、監視され得る。ＵＶ検出は、任意の適切なＵＶ波長における吸光度によって溶出液を監視することを含み得る。例えば、タンパク質アミド結合（２２０ｎｍ）、オフピーク（２３０ｎｍ）、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ（２８０ｎｍ）、若しくは核酸（２６０ｎｍ）のタンパク質芳香族アミノ酸側鎖、又はその間の任意の他の適切なＵＶ波長値のＵＶ検出。ＬＣ溶出液はまた、質量分析法（ＭＳ）、屈折率（ＲＩ）、レーザ光散乱（ＬＳ）、蛍光検出器（ＦＬ）、又は任意の他の適切な検出方法によって監視され得る。ｐＨメータはまた、緩衝系によってオンラインで提供される流出物のｐＨ応答を監視するためにも用いられ得る。

【0061】

「分解能」という用語は、２つのピークがいかに良好に分離されているかの尺度を指す。分解能は、Ｒｓ＝（ｔｒ，２－ｔｒ，１）／（０．５×（ｗ１＋ｗ２））によって決定され得、式中、ｔｒは、ピーク１又はピーク２のいずれかの保持時間であり、ｗ１は、ピーク１又はピーク２の半分の高さでのピーク幅である。同様の様式で、分解能及びピーク容量は、所与の分離空間内に収まることができるピークの数の尺度を指すために使用される。

【0062】

ピーク容量は、Ｐｃ＝１＋（ｔ／ｗａｖｇ）として決定され得、式中、ｔは、所与の分離空間に対応する時間であり、ｗａｖｇは、所与の分離におけるピークについて観察された半分の高さでの平均ピーク幅である。

【0063】

総イオン電流（「ＴＩＣ」）クロマトグラムのピーク高さ及びＴＩＣピークの信号対ノイズ比は、ＬＣ－ＭＳ分析の感度を定義するために使用され得る２つの値である。ＴＩＣ信号対ノイズは、移動相の選択によって影響を受け得る。

【0064】

クロマトグラフィー分解能に加えて、ＬＣ－ＭＳ方法は、それらが提供する質量スペクトルの品質によって評価され得る。

【0065】

「溶離液」という用語は、クロマトグラフィーにおいて使用される緩衝液又は緩衝液混合物であり、移動相と同義である。

【0066】

「溶出液」という用語は、クロマトグラフィーカラムから出る分析物及び溶媒を含有する溶液を指す。溶出液は、分離の過程中に生じる。

【0067】

「流出物」という用語は、分離が行われているかどうかにかかわらず、クロマトグラフィーカラムから出てくる流れを指す。

【0068】

質量分析法（「ＭＳ」）は、試料から形成された荷電分子又は分子断片の質量電荷比を測定する分析技術である。ＭＳは、対象の試料の質量、化学組成、及び／又は化学構造を分析するために使用され得る。概して、ＭＳは、３つのステップ：試料をイオン化して、荷電分子又は分子断片（すなわち、イオン）を形成することと、それらの質量電荷比に従って、イオンを分離することと、分離されたイオンを検出して、質量電荷信号（すなわち、スペクトル）を形成することと、を含む。イオンの形成は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、高速原子爆撃（ＦＡＢ）、化学イオン化（ＣＩ）、電子インパクト（ＥＩ）、大気固体分析イオン化（ＡＳＡＩ）、大気圧力光イオン化（ＡＰＰＩ）、脱着エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、大気圧力蒸気源（ＡＰＶＳ）、マトリックス支援レーザ脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）などの所定のＭＳイオン化技術によって達成することができる。ＭＳデバイスには多くの異なるタイプがある。例えば、セクタ、飛行時間（ＴＯＦ）、四重極、イオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、及びタンデム（タンデム又は直交で組み合わされた上記のうちの２つ以上）質量分析計は、ＭＳデバイスであると考えられる全ての異なる機器である。ＭＳ分析の特定の特性評価としては、例えば、質量精度、分解能、感度、ダイナミックレンジ、選択性、及び特異性などが挙げられる。

【0069】

質量分析法（ＭＳ）は、試料の調製及び導入、イオン形成、質量分離、並びにデータ処理を含み得る。

【0070】

ＭＳイオン形成は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又はマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）を含み得る。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）では、対象の試料を含有する溶液は、細かい液滴に噴霧される。液滴は、乾燥し、サイズが低減され、より小さい液滴に分割され、最終的には、１つ以上の残留電荷を有する脱溶媒和分析物イオンを生成する。タンパク質は、エレクトロスプレー分析中に多重帯電イオンを形成する傾向があり、質量分析法による分析を容易にする。質量分離は、例えば、四重極、ＴＯＦ、Ｏｒｂｉｔｒａｐを含み得る。

【0071】

ＭＳデータ処理は、生のＭＳスペクトルのデコンボリューションを含み得る。例えば、ＥＳＩ ＭＳ質量スペクトルは、数学的デコンボリューションに供して、ｍ／ｚを含む生の質量スペクトルをタンパク質分析物質量データに変換し得る。例えば、
ｍ／ｚ＝質量対電荷比
Ｍｒ＝タンパク質の質量
ｎ＝ｍ／ｚに対する電荷の数
ｍｐ＝Ｈ＋の質量＝１．００７３
所与のｍ／ｚ１＝（Ｍｒ＋ｎｌｍｐ）／ｎ１
かつｎ２＝ｎ１＋１
ｎ１を解くために並べ替えることができる：
ｎ１＝（ｍ／ｚ２－ｍｐ）／（ｍ／ｚ１－ｍ／ｚ２）及び
ｃａｌｃＭｒ１＝（ｎ１＊ｍ／ｚ１）－（ｎ１＊１．００７３）＝Ｍｒ１
ｃａｌｃＭｒ２＝（ｎ２＊ｍ／ｚ２）－（ｎ２＊１．００７３）＝Ｍｒ２。

【0072】

例えば、Ｃｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｂｙ ｉｏｎ－ｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２：１１，１９８８を参照されたい。生質量スペクトルのコンピュータ支援によるデコンボリューションも実施され得る。Ｍａｎｎ，Ｍ．、Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｋ．、Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ｃｈａｒｇｅｄ Ｉｏｎｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８９，６１，１７０２－１７０８、Ｌａｂｏｗｓｋｙ，Ｍ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｆｅｎｎ，Ｊ．Ｂ．Ｔｈｒｅｅ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ｃｈａｒｇｅｄ Ｓｐｅｃｔｒａ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９３，７，７１－８４、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ａ．Ｇ．Ａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｆａｓｔ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｈａｒｇｅ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｍａｓｓーｔｏ－Ｃｈａｒｇｅ Ｒａｔｉｏ Ｓｐｅｃｔｒａ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９８，９，２２５－２３３。

【0073】

ＭＡＬＤＩは、天然モノクローナル抗体ＭＳなどの天然タンパク質分析に適した軟イオン化技術である。

【0074】

ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩイオン形成プロセスは、競合的であり、異なる化合物は、イオン化効率において大きい変動を有し得る。イオン抑制は、塩、洗剤、ポリマーによって引き起こされる場合がある。タンパク質分析物は、イオン化ステップの前に干渉材料から分離され得る。様々な塩及び緩衝成分の許容濃度は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．ｈｔｔｐｓ：／／ｍａｓｓｓｐｅｃ．ｆａｓ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｆｉｌｅｓ／ｓｍｍｓ／ｆｉｌｅｓ／ｓａｌｔｂｕｆｆｅｒによって記載されている。不揮発性塩（例えば、ＮａＣｌ）は、不十分な検出感度につながる無傷のタンパク質の抑制を引き起こす可能性があるため、これらの化合物のＭＳへの導入を最小限に抑えることが重要である。

【0075】

従来、ＭＳイオン抑制を回避するために、希釈、透析／緩衝交換、ジップチップ、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルタ、及び／又は脱塩カラムなどのオフライン試料洗浄及び脱塩技術が利用されてきた。例えば、ＢｉｏＲａｄ Ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏｓｐｉｎ Ｐ－６ゲルカラムは、ＭＷＣＯ ６０００Ｄａで、小分子、塩を除去する。オフライン試料クリーンアップの欠点は、１０ｕＬを超える試料及び／又は高濃度の試料、沈殿に起因するタンパク質損失を最小限に抑えるための方法開発のための時間及び試料、培地への付着又は培地からの溶出の失敗、並びに分析物タンパク質の分解を含む。試料が、事前の最適化なしに制限されている場合、オフラインの脱塩／クリーンアップは、実行不可能な場合がある。ＬＣ－ＭＳのための典型的なオンライン脱塩技術としては、例えば、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、サイズ排除、又は毛細血管電気泳動を含み得る。ＲＰ脱塩カラムは、例えば、フェニル、ジフェニル、ポリフェニル、Ｃ４、Ｃ８、又はポリマー逆相（ＰＬＲＰ－Ｓ）を利用し得る。ＲＰオンライン調製カラムは、質量分析計へのタンパク質溶出前に、塩を洗浄して廃棄することを可能にするタンパク質を保持することになる。しかしながら、脱塩カラムの使用は、無傷の抗体に対して少なくとも数分間分、労力及びサイクル時間を増加させ得る。本開示は、ＭＳイオン抑制を回避するための低塩濃度を含み、再現可能なｐＨ勾配溶出を提供し、ＵＶ及びＭＳ検出の両方に対応する、ＩＥＣ－ＨＲＭＳに対して好適な単一移動相緩衝系を提供する。高分解能質量分析法への直接結合ｐＨ勾配カチオン交換クロマトグラフィーを含む方法が提供される。

【0076】

いくつかの実施形態では、本開示の移動相緩衝組成物は、５０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下の塩濃度、約２０ｍＭ以下の塩濃度、又は約１５ｍＭ以下の塩濃度を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、２～２５ｍＭ、２～２０ｍＭ、又は２～１５ｍＭの塩濃度を含有し得る。塩は、カルボン酸アンモニウム塩であり得る。カルボン酸アンモニウムは、Ｃ１－Ｃ２カルボン酸アンモニウムであり得る。カルボン酸アンモニウムは、酢酸アンモニウム又はギ酸アンモニウムであり得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、２ｍＭ～２５ｍＭ、２ｍＭ～２０ｍＭ、又は２ｍＭ～１５ｍＭの酢酸アンモニウム濃度を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、又は約１５ｍＭ以下の酢酸アンモニウム濃度を含有し得る。

【0077】

いくつかの実施形態では、移動相緩衝組成物は、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約２５ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、又は約２ｍＭ～約５ｍＭのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）又はその異性体、若しくはその類似体を更に含む。

【0078】

Ｎ－メチルモルホリンの異性体としては、２－メチルモルホリン、２－メチルモルホリン、２－メチル－１，３－オキサジナン、３－メチル－１，３－オキサジナン、４－メチル－１，３－オキサジナン、５－メチル－１，３－オキサジナン、及び６－メチル－１，３－オキサジナンを含み得る。

【0079】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、任意の適切なアルキル若しくはジアルキルモルホリン、又はアルキル若しくはジアルキル１，３－オキサジナンを含み得る。Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、アルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、ジアルキルＣ１－Ｃ６モルホリン、アルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナン、及びジアルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナンからなる群から選択され得る。

【0080】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、アルキルモルホリン化合物を含み得る。アルキルモルホリン化合物は、アルキルＣ１－Ｃ６モルホリン化合物、アルキルＣ１－Ｃ４モルホリン化合物、又はアルキルＣ１－Ｃ３モルホリン化合物を含み得る。アルキルモルホリンは、例えば、エチルモルホリン、プロピルモルホリン、イソプロピルモルホリン、ブチルモルホリン、又はイソブチルモルホリンなどであり得る。

【0081】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、Ｎ－アルキルモルホリン化合物を含み得る。Ｎ－アルキルモルホリン化合物は、Ｎ－アルキルＣ１－Ｃ６モルホリン化合物、Ｎ－アルキルＣ１－Ｃ４モルホリン化合物、又はＮ－アルキルＣ１－Ｃ３モルホリン化合物を含み得る。Ｎ－アルキルモルホリンは、例えば、Ｎ－エチルモルホリン、Ｎ－プロピルモルホリン、Ｎ－イソプロピルモルホリン、Ｎ－ブチルモルホリン、又はＮ－イソブチルモルホリンなどであり得る。

【0082】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、ジアルキルモルホリンを含み得る。ジアルキルモルホリン化合物は、ジアルキルＣ１－Ｃ６モルホリン化合物、ジアルキルＣ１－Ｃ４モルホリン化合物、又はジアルキルＣ１－Ｃ３モルホリン化合物を含み得る。ジアルキルモルホリンは、２，２－ジアルキルモルホリン、２，３－ジアルキルモルホリン、２，４－ジアルキルモルホリン、２，５－ジアルキルモルホリン、２，６－ジアルキルモルホリン、３，３－ジアルキルモルホリン、３，４－ジアルキルモルホリン、又は３，５－ジアルキルモルホリンなどであり得る。

【0083】

例えば、ジアルキルモルホリンは、２，２－ジメチルモルホリン、２，３－ジメチルモルホリン、２，４－ジメチルモルホリン、２，５－ジメチルモルホリン、２，６－ジメチルモルホリン、３，３－ジメチルモルホリン、３，４－ジメチルモルホリン、又は３，５－ジメチルモルホリンなどであり得る。

【0084】

ジアルキルモルホリン又はジアルキル－１，３－オキサジナンは、任意の構成であり得る。ある特定のジアルキルモルホリン又は１，３－オキサジナン化合物は、シス配置、トランス配置、又はシス及びトランス配置の混合物であり得る。例えば、シス、トランス－２，６－ジメチルモルホリン、シス－２，６－ジメチルモルホリン、又はトランス－２，６－ジメチルモルホリン、又はこれらの任意の組み合わせである。

【0085】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、アルキル１，３－オキサジナン化合物を含み得る。

【0086】

アルキル１，３－オキサジナン化合物は、アルキルＣ１－６－１，３－オキサジナン化合物、アルキルＣ１－４－１，３－オキサジナン化合物、アルキルＣ１－３－１，３－オキサジナン化合物、Ｎ－アルキルＣ１－６－１，３－オキサジナン化合物、Ｎ－アルキルＣ１－４－１，３－オキサジナン化合物、又はＮ－アルキルＣ１－３－１，３－オキサジナン化合物を含み得る。

【0087】

例えば、Ｎ－アルキル１，３－オキサジナンは、Ｎ－メチル－１，３－オキサジナン、Ｎ－エチル－１，３－オキサジナン、Ｎ－プロピル－１，３－オキサジナン、Ｎ－イソプロピル－１，３－オキサジナン、Ｎ－ブチル－１，３－オキサジナン、Ｎ－イソブチル－１，３－オキサジナンなどを含み得る。

【0088】

Ｎ－メチルモルホリンの類似体は、ジアルキル１，３－オキサジナン化合物を含み得る。Ｎ－メチルモルホリンの異性体は、ジアルキルＣ１－Ｃ６－１，３－オキサジナン、ジアルキルＣ１－Ｃ４－１，３－オキサジナン、又はジアルキルＣ１－Ｃ３－１，３－オキサジナンを含み得る。ジアルキル１，３－オキサジナンは、２，４－ジアルキル－１，３－オキサジナン、２，５－ジアルキル－１，３－オキサジナン、２，６－ジアルキル－１，３－オキサジナン、３，５－ジアルキル－１，３－オキサジナン、３，４－ジアルキル－１，３－オキサジナン、２，２－ジアルキル－１，３－オキサジナン、又は３，３－ジアルキル－１，３－オキサジナンであり得る。例えば、ジアルキル１，３－オキサジナンは、２，４－ジメチル－１，３－オキサジナン、２，５－ジメチル－１，３－オキサジナン、２，６－ジメチル－１，３－オキサジナン、３，５－ジメチル－１，３－オキサジナン、３，４－ジメチル－１，３－オキサジナン、２，２－ジメチル－１，３－オキサジナン、又は３，３－ジメチル－１，３－オキサジナンであり得る。

【0089】

「アルキル」という用語は、Ｃ１－６アルキル、又はＣ１－４アルキル、又はＣ１－３アルキル、又はＣ１－２アルキルを指し得る。アルキルは、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。例えば、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシルなどであり得る。

【0090】

「分析物」は、生体分子であり得る。分析物は、タンパク質、ペプチド、グリカン、又はこれらの組み合わせであり得る。分析物は、複数のタンパク質、複数のペプチド、複数のグリカン、又はこれらの組み合わせを含むことができる。タンパク質は、抗体、その抗原結合断片、又は抗体－薬剤複合体（ＡＤＣ）であり得る。生体分子分析物は、組み換え、合成、又は単離された生体分子であり得る。生体分子は、タンパク質分析物であり得る。

【0091】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチドと呼ばれるアミノ酸のポリマー鎖を指す。タンパク質はまた、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、リン酸化、脂質化、プレニル化、硫酸化、ヒドロキシル化、アセチル化、炭水化物の添加（グリコシル化及び糖化）、人工基又は補因子の添加、ジスルフィド結合の形成、タンパク質分解、高分子複合体への組み立てなどを含む、多数の修飾を含み得る。抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又はポリクローナル抗体、若しくはその抗原結合断片であり得る。抗体は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）であり得、又は抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、テトラボディ、トリアボディ、断片）のみを含み得、及び機能性に影響を及ぼすように修飾され得、一価、二価、三価、四価であり得、より高い価を有し得るか、又は抗体複合体であり得る。抗原結合断片は、例えば、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、又は拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位を含み得る。生体分子分析物は、天然のｍＡｂ及びその電荷変異体であり得る。

【0092】

組成物
水性移動相緩衝系は、モノクローナル抗体などの無傷の生体分子の分析における高分解能質量分析法に任意選択的に直接結合された液体クロマトグラフィーにおける使用のために提供される。いくつかの実施形態では、ＬＣは、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）又はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。

【0093】

全ての成分が、揮発性であり、タンパク質分析のために一般的に使用されるＵＶ波長で著しいＵＶ吸光度を有するものはないため、本明細書において提供される新しい移動相緩衝系は、ＵＶ及びＭＳ検出の両方に好適である。新しい移動相緩衝系は、約２５ｍＭ以下の低塩濃度を含み、ＨＲＭＳに直接結合されたＩＥＣにおけるｐＨ勾配溶出における使用に好適である。

【0094】

新しい移動相緩衝系は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの天然生体分子の分析において最適なｐＨ制御、感度、及び分解能を提供する。緩衝組成物及びｐＨ値は、ｍＡｂ電荷変異体分析のために最適化されている。勾配範囲及び傾きは、各分析物、例えば、天然ｍＡｂについて最適化され得る。ＭＳ条件は、感度を最大化及び／又は付加物を最小限に抑えるように最適化され得る。緩衝成分に使用される含有物は、好ましくは、感度を改善し、金属付加物によって引き起こされるスペクトルの複雑さを低減するために、高純度、微量金属グレードである。

【0095】

緩衝液ｐＨ及びイオン強度は、全ての形態のイオン交換クロマトグラフィーに対して重要である。典型的には、緩衝液ｐＨは、塩濃度が調節された後に調節され得る。緩衝液ｐＨ及びイオン強度は、カラム樹脂へのタンパク質の結合に大きく影響するため、ｐＨが適切に調節され、適切な対イオンが使用されることを確認することが重要である。

【0096】

本明細書において説明された技術は、高分解能質量分析法（オンラインＨＲＭＳ）に直接結合されたイオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、ｐＨ勾配溶出の非線形性及び不十分なクロマトグラフィー再現性などの従来技術で発見された問題を解決する。

【0097】

本明細書において説明された技術は、ＨＲＭＳを用いたイオン交換クロマトグラフィーにおける移動相緩衝液中の過剰な塩濃度に起因する不十分なＭＳ感度を含む、先行技術で発見された問題を解決する、典型的には、約４０ｍＭ以上の塩濃度が、ＭＳ感度を低減させ得ることが発見されている。本開示は、ＨＲＭＳにおける使用に適切な最低のイオン強度と組み合わせて、最高の緩衝液容量を有する緩衝系を提供する。いくつかの実施形態では、２５ｍＭ以下の塩濃度のイオン強度が用いられる。

【0098】

本明細書において説明された技術は、高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーを使用する場合、無傷のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、の電荷変異体の不十分なクロマトグラフィー分解能、特に低等電点（ｐＩ）ｍＡｂ（例えば、インフリキシマブ、ｐＩ７．６）などの従来技術で発見された問題を解決する。

【0099】

本明細書において説明された技術は、ＩＥＣ－ＨＲＭＳにおける無傷のタンパク質の高電荷状態、すなわち、著しいタンパク質変性を示すＭＳスペクトルに起因する、低減された質量分析（ＭＳ）分解能を含む、先行技術で発見された問題を解決する。

【0100】

本明細書において提供された新しい移動相緩衝系緩衝系は、イオン交換クロマトグラフィーを使用する無傷のモノクローナル抗体の電荷変異体分析など、１）改善されたｐＨ制御、２）改善されたＭＳ感度、及び３）増加した質量スペクトル分解能（「より天然な」状態を示す無傷のタンパク質のためのより高い質量スペクトル電荷エンベロープ）をもたらす質量分析（ＭＳ）検出（すなわち、ＭＳ互換性）で、ｐＨ勾配に基づくクロマトグラフィー分離に使用され得る。

【0101】

本明細書において提供される改良された緩衝系の他の利点は、無傷のｍＡｂ電荷変異体のより良好なクロマトグラフィー及び質量分析分解能を含む。これらは、多くの場合、生物療法剤の開発及び製造中に特定及び特性評価されなければならない重要な品質属性である。

【0102】

改良された緩衝系は、弱イオン交換固定相又は強イオン交換固定相材料のいずれか及びカラムと共に利用され得る。

【0103】

具体的には、新しいｐＨ勾配緩衝系成分は、ｍＡｂなどの生体分子の一次関心のｐＨ範囲に及ぶｐＫａ値、すなわち、ｐＨ４．５～１０．８、ｐＨ４．５～１０．５、ｐＨ５～１０．５、又はｐＨ５．２～１０．２の範囲内にあるｐＫａ値を有する。例えば、酢酸塩ｐＫａ＝４．８、Ｎ－メチルモルホリンｐＫａ＝７．４、アンモニアｐＫａ＝９．２である。Ｎ－メチルモルホリンが新しい緩衝系における使用のために選択された１つの理由は、約７．４の中間ｐＫａであり、これにより、ｐＨ勾配がより線形であり、より再現可能になる。

【0104】

新しい緩衝系はまた、ＵＶ適合性であり、これは、他の弱塩基と比較してＮ－メチルモルホリンを使用することの更なる利点である。Ｎ－メチルモルホリンは、塩基形態であり得る。所望の範囲に近いｐＫａを有する他の潜在的なＭＳ適合性弱塩基（例えば、ピリジン系）は、有意なＵＶ吸収を有する。Ｎ－メチルモルホリンは、生体治療薬に一般的に使用されるＵＶ波長（２８０ｎｍ）において良好な透明性を有し、ＭＳ及びＵＶ検出の両方に同じ緩衝液を使用することを可能にする。これは、全てのピーク（不純物を含む）の保持時間／溶出順序が、典型的に、ＭＳを使用して識別され、次いで、ＭＳで決定された保持時間（ＲＴ）／溶出順序を使用して、ＵＶ検出によるルーチン監視が実施されるため、有益である。各検出器に対して使用される緩衝液を変更すると、この作業が非常に複雑になる可能性がある。

【0105】

生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、及び／又はグリカン）ＬＣ－ＭＳは、単に高感度検出を達成することに関するものではない。この方法の能力は、クロマトグラフィーの分解能によって大きく影響される。

【0106】

本開示は、ＬＣ分離、及び任意選択的に、生体分子分析物のＭＳにおける使用に適切なｐＨ勾配緩衝系を提供する。

【0107】

例えば、本ｐＨ勾配緩衝系の開発は、インフリキシマブｐＩ７．６（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、セツキシマブｐＩ８．８（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ）、トラスツズマブｐＩ９．１（例えば、Ｋａｎｊｉｎｔｉ）、ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂｐＩ９．２、及びリツキシマブｐＩ９．４（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ）を含む、関連するｐＩの範囲に及ぶ５つの無傷の天然モノクローナル抗体の分析を伴った。本明細書で提供される緩衝系は、弱イオン交換クロマトグラフィー及び／又は強イオン交換クロマトグラフィーにおける使用に適切である。例えば、本明細書に提供される緩衝系は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６ｕｍ ＷＣＸなどの弱イオン交換カラム、又はＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ｍＡｂＰａｃ（商標）５ｕｍ ＳＣＸなどの強イオン交換カラムを使用する天然ｍＡｂの電荷変異体などの分析物の分離に適している。

【0108】

本発明の緩衝系は、２５ｍＭ未満の酢酸アンモニウム、約２～約２５ｍＭの酢酸アンモニウム、約２～２０ｍＭの酢酸アンモニウム、又は約５ｍＭ～約１５ｍＭの酢酸アンモニウムの即時使用可能な緩衝液濃度を含み得る。本発明の移動相緩衝系は、約１ｍＭ～約１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、約２ｍＭ～約８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又は約２ｍＭ～約５ｍＭのＮ－メチルモルホリンの即時使用可能な緩衝濃度を含み得る。本発明の緩衝系は、２５ｍＭ未満の酢酸アンモニウム、２０ｍＭ以下の酢酸アンモニウム、約２～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、約２～約２０ｍＭの酢酸アンモニウム、約２～約１５ｍＭの酢酸アンモニウム、又は約５ｍＭ～約１５ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約１ｍＭ～約１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、約２ｍＭ～約８ｍＭのＮ－メチルモルホリン、又は約２ｍＭ～約５ｍＭのＮ－メチルモルホリンの即時使用可能な緩衝液濃度を含み得る。緩衝系は、約ｐＨ４．５～約ｐＨ１０．５、ｐＨ５～１０．５、又はｐＨ５．２～１０．２の範囲内にあるか、又はこれらの範囲に及ぶｐＨを含み得る。

【0109】

本開示は、１つ以上、２つ以上、又は３つ以上の部分を含む水性緩衝系を提供する。緩衝系は、２部水性緩衝系を含む移動相を含み得る。２部水性緩衝系は、部分Ａ緩衝液及び部分Ｂ緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、水性緩衝系の部分Ａは、酢酸で調節された約ｐＨ４．５～約ｐＨ５．５のｐＨにおいて、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約２ｍＭ～約１０ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み得る。ある特定の実施形態では、水性緩衝系の部分Ａは、酢酸で調節された約ｐＨ５～約ｐＨ５．５のｐＨにおいて、約１０ｍＭ～約２０ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約３ｍＭ～約８ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み得る。いくつかの実施形態では、水性緩衝系の部分Ｂは、水酸化アンモニウムで調設されたｐＨ９～約１０．５において、約２ｍＭ～約１０ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約１ｍＭ～約５ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み得る。ある特定の実施形態では、水性緩衝系の部分Ｂは、水酸化アンモニウムで調節されたｐＨ９．５～約１０．５において、約３ｍＭ～約８ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約１ｍＭ～約３ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み得る。２部水性緩衝系は、ｐＨ４．５～１０．５、ｐＨ５～１０．５、又はｐＨ５．２～１０．２のｐＨ範囲に及ぶように設計され得る。約ｐＨ３．８～１０．８のより広いｐＨ範囲が用いられてもよい。

【0110】

移動相添加剤は、約１００ｐｐｂ以下の任意の個々の金属不純物を含み得る。換言すると、移動相添加剤中に含有される各金属不純物は、約１００ｐｐｂを超える量では存在しない。いくつかの実施形態では、移動相添加剤は、各々、約９０ｐｐｂ、８０ｐｐｂ、７０、ｐｐｂ、６０、ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、４０ｐｐｂ、３０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、又は１０ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を含む。いくつかの実施形態では、移動相添加剤は、各々、約９５ｐｐｂ、８５ｐｐｂ、７５、ｐｐｂ、６５、ｐｐｂ、５５ｐｐｂ、４５ｐｐｂ、３５ｐｐｂ、２５ｐｐｂ、又は１５ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を含む。金属不純物は、質量スペクトルの望ましい特徴、例えば、質量スペクトルの品質に影響を与える任意の金属である。金属不純物は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ニッケル、銅、及び／又は鉄であり得る。本技術のこれらの態様は、上で説明された移動相添加剤を用いて後に調製された即時使用可能な移動相又はその任意の濃縮物に及ぶ。

【0111】

緩衝系は、ＬＣ／ＭＳグレードの水、ＭＳグレードの水、又は０．２マイクロメートルフィルタを通して濾過された約１８．２メガオーム－ｃｍの比抵抗を有するタイプ１試薬グレードの水を使用する脱イオン水（重量／重量又は体積／体積）を用いてもよい。

【0112】

水は、２０ｐｐｂ以下の微量不純物を有し得る。移動相添加剤と同様に、水は、約１００ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物、又は約９５ｐｐｂ、８５ｐｐｂ、７５、ｐｐｂ、６５、ｐｐｂ、５５ｐｐｂ、４５ｐｐｂ、３５ｐｐｂ、２５ｐｐｂ、又は１５ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を有し得る。

【0113】

移動相は、約１００ｐｐｂ、９０ｐｐｂ、８０ｐｐｂ、７０ｐｐｂ、６０ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、４０ｐｐｂ、３０ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、又は１０ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を有し得る。移動相は、約５０ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を有し得る。移動相は、約２０ｐｐｂ未満の任意の個々の金属不純物を有し得る。個々の金属不純物は、例えば、アルミニウム、バリウム、カドミウム、カルシウム、クロム、コバルト、銅、鉄、鉛、マグネシウム、マンガン、ニッケル、カリウム、銀、ナトリウム、スズ、又は亜鉛であり得る。

【0114】

本開示の組成物は、即時使用可能な緩衝液、希釈のための濃縮された緩衝液、並びにＬＣカラム又はデバイスと共に本開示による緩衝液からなる組み合わされた生成物などのキットの構成要素の形態で市販され得る。希釈のための即時使用可能な緩衝液又は濃縮された緩衝液は、任意の適切な容器内に貯蔵され得る。容器は、清潔で、抽出可能な材料／残留物が含まれていないはずである。例えば、緩衝液貯蔵容器は、適切なプラスチック又はガラス貯蔵容器であり得る。いくつかの実施形態では、例えば、ガラスからの汚染物質の浸出を低減するために、緩衝液貯蔵のためのプラスチック容器の使用が好ましい。容器は、任意の適切なプラスチック材料を含み得る。いくつかの実施形態では、容器は、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、又はポリスチレン（ＰＳ）プラスチック材料を含み得る。容器は、例えば、汚染物質を排除するために封止され得る。

【0115】

キットは、クロマトグラフィーカラム、一定量の濃縮移動相を有する容器、及び使用説明書、並びに／又は使用説明書のウェブサイトアドレスを含み得る。クロマトグラフィーカラムは、カラム内側に固定相材料を有する。固定相材料は、本明細書において説明される任意の固定相材料、例えば、イオン交換固定相、サイズ排除固定相、親水性相互作用固定相、及び／又は逆相固定相であり得る。

【0116】

移動相組成物は、即時使用可能な緩衝液の形態の、又は濃縮された緩衝液中の液体であり得る。濃縮緩衝液は、使用前の希釈のための２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、又は２０倍以上の濃度、又はその間の任意の値であり得る。いくつかの実施形態では、移動相緩衝液は、１０倍濃縮物である。任意選択的に、アセトニトリル又はイソプロパノールなどの有機溶媒は、最大１０％ｖ／ｖの濃度で用いられ得る。濃縮物は、希釈されて、１倍緩衝系を調製し得る。いくつかの実施形態では、移動相緩衝液は、即時使用可能な移動相緩衝組成物である。

【0117】

使用説明書は、ユーザに、試料マトリックス中に少なくとも１つの生体分子（例えば、ｍＡｂプロセス試料又はｍＡｂ精製試料などのタンパク質）を含有する試料を得るように、並びに移動相濃縮物を適切な水で希釈して、約２ｍＭ～約２５ｍＭの酢酸アンモニウム、約２ｍＭ～約２０ｍＭの酢酸アンモニウム、（両端の値を含む）、又は約５ｍＭ～約１５ｍＭの酢酸アンモニウム、及び約１ｍＭ～１０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約５ｍＭのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）を得るように指示し得る。２部緩衝系中の各希釈移動相濃縮物のｐＨは、それぞれ、約ｐＨ５．２及び約ｐＨ１０．２であり得る。

【0118】

ユーザは、少なくとも１つの生体分子（例えば、ｍＡｂなどのタンパク質）を実質的に分解して保持するために、希釈された移動相又は即時使用可能な移動相を有する試料をカラムを通して流すように指示され得る。加えて、この指示は、ユーザに、検出器を使用して少なくとも１つの生体分子（例えば、ｍＡｂなどのタンパク質）を検出するように指示する。

【0119】

安定性研究は、工場で約４℃の冷蔵温度で封止されて貯蔵された場合、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月以上の１０倍緩衝系濃縮物の許容可能な保存寿命を示す。任意選択的に、貯蔵寿命を延長させるために、アセトニトリル又はイソプロパノールなどの有機溶媒は、最大１０％ｖ／ｖの濃度で用いられ得る。安定性研究は、工場で約４℃の冷蔵温度で封止されて貯蔵された場合、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月以上の即時使用可能な緩衝液の許容可能な保存寿命を示す。室温での緩衝液の予備保存寿命の研究が行われ、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月以上の室温における即時使用可能な１０倍緩衝系濃縮物の見込みのある工場封止保存寿命の結果が示された。即時使用可能な緩衝液の室温貯蔵寿命は、微生物の増殖を最小限に抑えるために適切な容器で少なくとも１ヶ月である（流入する空気は濾過される）。

【0120】

使用
分析物を試料から分離する方法が提供され、方法は、移動相をクロマトグラフィーカラムを通して流すことであって、移動相が、２部水性緩衝系を含み、水性緩衝系の部分Ａが、約１０～２５ｍＭの酢酸アンモニウム、３～１０ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び酢酸でｐＨ４．５～５．５に調節されたｐＨを含み、水性緩衝系の部分Ｂが、２～１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１～５ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含み、水酸化アンモニウムで調節されたｐＨ９．５～約１０．５である、流すことと、分析物を含む試料を移動相に注入することと、カラムから分析物を溶出することと、を含む。方法は、溶出液中の分析物を検出することを更に含み得る。方法は、カラムを溶出する前に、注入後にカラムを洗浄することを更に含み得る。方法は、分析物の分子量を決定することを更に含み得る。方法は、分析物を質量分析計で検出することを更に含み得る。方法は、分析物イオンを生成することを更に含み得る。方法は、分析物イオンの質量スペクトルを取得することを更に含み得る。

【0121】

いくつかの実施形態では、水性緩衝系の部分Ａは、酢酸でｐＨ５．２に調節された、約１５ｍＭの酢酸アンモニウム、約５ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、水性緩衝系の部分Ｂは、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された、約５ｍＭの酢酸アンモニウム、約２ｍＭのＮ－メチルモルホリンを含む。

【0123】

実施形態では、酢酸アンモニウム、酢酸、水酸化アンモニウム、及びＮ－メチルモルホリンは、各々、約１００ｐｐｂ以下の個々の金属不純物を含有し得る。

【0124】

分析物は、タンパク質であり得る。タンパク質は、抗体であり得る。タンパク質は、モノクローナル抗体、抗体の抗原結合断片、単離されたタンパク質、合成タンパク質、及び組み換えタンパク質からなる群から選択され得る。

【0125】

いくつかの実施形態では、タンパク質分析物は、勾配溶出又はステップイソクラティック溶出を使用するカラムから溶出され得る。勾配溶出は、ｐＨ勾配溶出であり得る。ｐＨ勾配溶出は、線形勾配、セグメント化勾配、湾曲勾配、ステップ勾配などから選択され得る。線形ｐＨ勾配は、クロマトグラフィー分離を実施する過程にわたって、より低いｐＨからより高いｐＨへの移動相ｐＨにおける線形変化を含み得る。ステップｐＨ勾配は、クロマトグラフィー分離の過程にわたる移動相ｐＨにおける段階的変化を含み得る。セグメント化されたｐＨ勾配は、クロマトグラフィー分離の過程にわたって、より低いｐＨからより高いｐＨまでの異なる傾きの２つ以上の線形勾配を含み得る。湾曲したｐＨ勾配は、クロマトグラフィー分離の過程にわたって凸状又は凹状の湾曲したｐＨ勾配を含み得る。勾配溶出は、線形勾配であり得る。線形勾配は、線形ｐＨ勾配であり得る。勾配は、溶出液の０．１～１０％Ｂ／ＣＶ、又は０．５～５％Ｂ／カラム体積（ＣＶ）の範囲内の傾きを含み得る。勾配は、溶出液の１～３％Ｂ／カラム体積（ＣＶ）の範囲内の傾きを含み得る。

【0126】

クロマトグラフィーカラムは、液体クロマトグラフィーカラムであり得る。クロマトグラフィーカラムは、イオン交換樹脂を含み得る。クロマトグラフィーカラムは、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。イオン交換樹脂は、カチオン交換樹脂であり得る。カチオン交換樹脂は、強カチオン交換樹脂か、又は弱カチオン交換樹脂であり得る。

【0127】

実施例２及び３における結果は、異なる装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ対Ｓｃｉｅｘ Ｘ５００Ｂ ＭＳ）を使用して、契約施設（Ｉｎｔｅｒｔｅｋ）で再現されている。

【実施例】

【0128】

実施例１．緩衝液の調製
この実施例では、再現可能なＭＳ適合性クロマトグラフィー方法、例えば、カチオン交換クロマトグラフィーを使用するｐＨ勾配溶出のための新しい緩衝系を開発した。全ての材料は、微量金属ベースで９９．９９＋％の純度であった。総金属不純物＜１００ｐｐｂ。微量金属試薬は、ＭＳにおいて観察される金属付加物を低減するために重要である。

【0129】

標準酢酸アンモニウム緩衝系を、比較用緩衝系として使用するために最適化した。従来技術と比較して、ＭＳ適合性を最適化するために、比較用標準緩衝液中の酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）の濃度を減少させた：ＮＨ４Ａｃ濃度は、４０～５０ｍＭのＮＨ４Ａｃを有する従来技術のｐＨ勾配緩衝系と比較して、約２０ｍＭ以下のＮＨ４Ａｃに減少した。比較用に最適化された標準緩衝液（酢酸アンモニウムのみ）を以下のように調製した。緩衝液Ａ＝酢酸でｐＨ５．２に調節した２０ｍＭのＮＨ４Ａｃ。緩衝液Ｂ＝水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節した５ｍＭのＮＨ４Ａｃ。比較用に最適化された標準ＮＨ４Ａｃのみの緩衝系は、室温（入口エアフィルタ下）で少なくとも約４週間安定であることが見出された。最適化された酢酸アンモニウムのみの比較用緩衝液は、低ｐＩ ｍＡｂの良好な分離を達成するために利用され得るが、その使用は、著しい最適化（非常に浅い勾配）及び日々の傾き調節（緩衝液ｐＨの非常にわずかな変化に感受性である）を必要とし、バッチ間の変動に苦しむ。

【0130】

酢酸アンモニウム及びＮ－メチルモルホリンを用いる新しいｐＨ勾配緩衝系は、以下のように調製した。新しい緩衝系１倍緩衝液Ａ＝酢酸でｐＨ５．２に調節された、１５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、及び１倍緩衝液Ｂ＝水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された、５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋２ｍＭのＮ－メチルモルホリン。手順：酢酸アンモニウムを１ＬのＭＳグレードの水に溶解し、Ｎ－メチルモルホリンを添加し、次いで混合し、酢酸でｐＨ５．２に調節する。酢酸アンモニウムを１ＬのＭＳグレードの水に溶解し、Ｎ－メチルモルホリンを添加し、次いで混合し、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節する。ｐＨ調節のためにｐＨプローブを用いた。好ましくは、ｐＨプローブは、ｐＨプローブ塩で緩衝液を汚染するのを回避するために、バルク緩衝溶液内に浸漬されるべきではない。代わりに、アリコートのｐＨは、ｐＨ調節中に試験されるべきである。酢酸アンモニウム及びＮＭＭを含む新しい緩衝液は、より急な、より実用的な勾配、並びに非常に浅い勾配で再現可能な性能を与え、日々、又はバッチごとに変化しない。天然ＭＳを実施するときの堅牢性及び使いやすさは、新しいＮＭＭ緩衝液が解決する大きな問題である。酢酸アンモニウム及びＮＭＭを含む新しい緩衝液は、ＵＶ及びＭＳ検出の両方に好適である。

【0131】

新しい１倍緩衝系は、室温（入口エアフィルタ）で少なくとも約４週間安定であることが見出された。入口エアフィルタは、実験室の雰囲気からの微生物汚染の侵入を防止するか又は大幅に低減させる。緩衝系は、ＬＣ／ＭＳグレードの水、ＭＳグレードの水、又は０．２マイクロメートルフィルタを通して濾過された１８．２メガオーム－ｃｍの比抵抗を有するタイプ１試薬グレードの水を使用する脱イオン水を用いる。水は、２０ｐｐｂ以下の微量不純物を有し得る。

【0132】

１０倍緩衝系は、使用前に希釈のために調製される。緩衝液Ａ＝酢酸でｐＨ５．２に調節された１５０ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋５０ｍＭのＮ－メチルモルホリン。緩衝液Ｂ＝水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された５０ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋２０ｍＭのＮ－メチルモルホリン。手順：酢酸アンモニウムを１ＬのＭＳグレードの水に溶解し、Ｎ－メチルモルホリンを添加し、次いで混合し、酢酸でｐＨ５．２に調節する。酢酸アンモニウムを１ＬのＭＳグレードの水に溶解し、Ｎ－メチルモルホリンを添加し、次いで混合し、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節する。ｐＨプローブを、ｐＨ調節のために用いる。

【0133】

溶離液の溶液は、ＬＣ／ＭＳグレードの水、ＭＳグレードの水、又は０．２マイクロメートルフィルタを通して濾過された約１８．２メガオーム－ｃｍの比抵抗を有するタイプ１試薬グレードの水を使用して、脱イオン水（重量／重量又は体積／体積）で１０倍緩衝液Ａ及びＢを希釈することによって、１０倍から調製され得る。水は、２０ｐｐｂ以下の微量不純物を有し得る。例えば、１００ｍＬの１０倍緩衝液は、１Ｌの１倍緩衝液を提供するために、９００ｍＬのＭＳグレードの水で希釈され得る。標準のベンチトップｐＨメータで、１倍緩衝液Ａ及び１倍緩衝液ＢのｐＨを測定し、記録する。

【0134】

実施例２．天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳを使用するｍＡｂの電荷変異体分析に対するクロマトグラフィー結果
この実施例では、弱カチオン交換カラムを使用する様々なｐＩ値の５つのｍＡｂに対して新しい緩衝系を使用するｐＨ勾配を開発した。ｍＡｂは、測定されたｐＩ値を用いて表１Ａに示される。全ての実施例では、ＷＣＸカラムを、高分解能質量分析計、すなわち、オンライン天然ＨＲＭＳに直接結合した。スペクトルを、２０００～７０００のｍ／ｚ範囲にわたってＥＳＩ＋モードで収集した。

【表1】

【0135】

全てのｍＡｂ試料は、インフリキシマブｐＩ７．６（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、セツキシマブｐＩ８．８（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、トラスツズマブｐＩ９．１（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）、ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂ ｐＩ９．２、及びリツキシマブｐＩ９．４（Ｒｉｔｕｘａｎ）を含む１０ｍｇ／ｍＬであった。５つ全てのｍＡｂを、新しい緩衝系でカチオン交換クロマトグラフィーを使用して分析した。３つのｍＡｂを、トラスツズマブ－ａｎｎ、リツキシマブ－ａｂｂ、及びＮＩＳＴリファレンスｍＡｂを含む、比較用標準緩衝系でカチオン交換クロマトグラフィーを使用して試験した。ｐＨ勾配を、表１Ｂ及び表２に示される例示的なｐＨ勾配から開始して、各ｍＡｂに対して最適化した。

【0136】

ＬＣ系は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ系：Ｂｉｎａｒｙポンプ：Ｇ７１２０Ａ（ＪｅｔＷｅａｖｅｒ Ｖ３５）、Ｍｕｌｔｉｓａｍｐｌｅｒ：Ｇ７１６７Ｂ（２０ｕＬループ）、Ｍｕｌｔｉｃｏｌｕｍｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ：Ｇ７１１６Ｂ、及びＤＡＤ：Ｇ７１１７Ｂ．質量分析計は、正イオンエレクトロスプレーモード（ＥＳＩ＋）で作用するＳｃｉｅｘ Ｘ５００Ｂ四極飛行時間質量分析計であった。取得した質量範囲は、ｍ／ｚ２０００～７０００であった。

【0137】

弱カチオン交換カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍ、モノ化ポリマー非多孔質粒子［－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＯ２－）－ＣＨ（ＣＯ２－）－ＣＨ２－］であった。

【0138】

クロマトグラフィー条件は、（高速均衡法）、流量：０．３ｍＬ／分、＿温度：３０℃、Ｉｎｊ Ｖｏｌ：１０ｕＬ（カラム上１００ｕｇ）を含んだ。表１Ｂに示されるように、新しい緩衝液に対して使用される第１の例示的なｐＨ勾配は、１５分間にわたる２０～５０％Ｂ（傾き＝１．２％Ｂ／ＣＶ）を含む。カラム平衡化中の流量は、高速平衡化に対して０．６ｍＬ／分に増加される。

【0139】

新しい緩衝系は、緩衝液Ａ＝１５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋５ｍＭのＮ－メチルモルホリン、酢酸でｐＨ５．２（ＨＡｃ）、及び緩衝液Ｂ＝５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋２ｍＭのＮ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２（ＮＨ４ＯＨ）を含んだ。

【0140】

比較用に最適化された標準緩衝系は、緩衝液Ａ＝２０ｍＭのＮＨ４Ａｃ、ＨＡｃでｐＨ５．２、及び緩衝液Ｂ＝５ｍＭのＮＨ４Ａｃ、ＮＨ４ＯＨでｐＨ１０．２を含んだ。上で挙げられたように、最適化された比較用標準緩衝系中の酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）の量は、従来技術の参考文献と比較して著しく低減された。

【表2】

【0141】

１５分間にわたる２０～５０％Ｂ（傾き＝１．２％Ｂ／ＣＶ）を含む、比較用の標準緩衝液を使用する第２の例示的なｐＨ勾配は、表２に示される。標準緩衝系は、緩衝液Ａ＝ＨＡｃでｐＨ５．２に調節された、２０ｍＭのＮＨ４Ａｃ、及び緩衝液Ｂ＝ＮＨ４ＯＨでｐＨ１０．２に調節された５ｍＭのＮＨ４Ａｃを含んだ。

【表3】

【0142】

クロマトグラフィー結果
実施例２Ａ．トラスツズマブ－ａｎｎｓのＷＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ９．１を有するモノクローナル抗体トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｊｉｎｔｉ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、表３に従って１５分間にわたる３０～６０％のＢ勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して注入した。ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸ弱カチオン交換カラムでトラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）からのＨＲＭＳ総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを、図１ー１に示す。

【表4】

【0143】

ｐＩ９．１を有するモノクローナル抗体トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｊｉｎｔｉ，１０ｍｇ／ｍＬ）を、表２に従って１５分間にわたる２０～５０％Ｂの勾配を使用し、最適化された標準緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに表２、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）に従って、注入した。ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用するｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラムでトラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）に対する総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図１ー２に示される。

【0144】

実施例２Ｂ．リツキシマブ－ａｂｂｓのＷＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ９．４を有するモノクローナル抗体リツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然のＷＣＸ－ＨＲＭＳに供した。表４に示されるように、１０μＬ（１００μｇ）のアリコートを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに注入し、１５分にわたる６５～１００％のＢ勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用してクロマトグラフィーを行った。ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用するｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のリツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ）の総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図２－１に示される。

【表5】

【0145】

ｐＩ９．４を有するモノクローナル抗体リツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表４に示されるように、１５分間にわたる６０～１００％のＢ勾配で最適化された標準緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０μＬ（１００μｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラム、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）に注入した。ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用する、ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のリツキシマブ－ａｂｂｓ（Ｒｉｔｕｘａｎ）の総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図２－２に示される。

【0146】

実施例２Ｃ．ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂのＷＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ９．２を有するモノクローナル抗体ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、新しい緩衝液を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、１５分間にわたる６５～１００％Ｂの勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して、注入した。ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用するｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のＮＩＳＴリファレンスｍＡｂの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図３ー１に示される。

【0147】

ｐＩ９．２を有するモノクローナル抗体ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂを、表４に示されるように、最適化された標準緩衝液及び１５分間にわたる６０～１００％のＢ勾配を使用して天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０μＬ（１００μｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ １５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、表４に示される勾配、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）を使用して、注入した。ＮＭＭを含まない標準緩衝系ＮＨ４Ａｃを使用する、ｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のＮＩＳＴｍＡｂの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図３ー２に示される。

【0148】

実施例２Ｄ．インフリキシマブのＷＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ７．６を有するモノクローナル抗体インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表５に従って新しい緩衝液及び１５分間にわたる２０～３５％Ｂの勾配を使用して、天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）で、注入した。ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用するｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のインフリキシマブの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図４に示される。

【表6】

【0149】

実施例２Ｅ．セツキシマブのＷＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ８．８を有するモノクローナル抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、表６に従って新しい緩衝液及び１５分間にわたる２５～５５％Ｂの勾配を使用して、天然ＷＣＸ－ＨＲＭＳに供し、１０ｕＬ（１００ｕｇ）を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍ ＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍの弱カチオン交換カラムに、＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００－７００）で注入した。ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを有する新しい緩衝系を使用するｂｉｏＺｅｎ ＷＣＸカラム上のセツキシマブの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが、図５に示される。

【表7】

【0150】

実施例３．改善されたｐＨ勾配のための新しいＭＳ互換緩衝液を使用するＳＣＸ－ＨＲＭＳデータ
この例では、方法は、新しい緩衝系（酢酸アンモニウム＋Ｎ－メチルモルホリン）によるｐＨ勾配溶出、又は最適化された標準緩衝系（酢酸アンモニウムのみ）によるｐＨ勾配溶出を使用して、高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）に直接結合した強カチオン交換液体クロマトグラフィー（ＳＣＸ）によって、５つのモノクローナル抗体及びその電荷変異体の分析のために開発された。

【0151】

インフリキシマブｐＩ７．６（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、セツキシマブｐＩ８．８（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、トラスツズマブｐＩ９．１（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）、ＮＩＳＴリファレンスｍＡｂｐＩ９．２、及びリツキシマブｐＩ９．４（Ｒｉｔｕｘａｎ）を含む５つの異なるｍＡｂを試験した。

【0152】

新しい緩衝系は、酢酸でｐＨ５．２に調節された緩衝液Ａ＝１５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋５ｍＭのＮ－メチルモルホリン。緩衝液Ｂ＝水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された５ｍＭのＮＨ４Ａｃ＋２ｍＭのＮ－メチルモルホリンであった。

【0153】

比較用に最適化された標準緩衝系は、酢酸でｐＨ５．２に調節された緩衝液Ａ＝２０ｍＭのＮＨ４Ａｃ。緩衝液Ｂ＝水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節された５ｍＭのＮＨ４Ａｃであった。

【0154】

両方の緩衝系は、別段の指定がない限り、実施例１に従って調製された。

【0155】

強カチオン交換（ＳＣＸ）カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｒ＆Ｄによって調製された実験用３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍであった。

【0156】

ＬＣカラム溶出液を、２８０ｎｍのＵＶ吸光度、又はＨＲＭＳ総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを使用して監視した。新しい及び標準緩衝系の生のＭＳスペクトルデータを以下のように比較した。

【0157】

この実施例に示される結果は、新しい緩衝液を使用するＭＳ信号強度及びスペクトル分解能が、最適化された標準ｐＨ勾配で以前に観察されたものと同様であることを示す。しかしながら、最適化された標準緩衝系（ＮＨ４Ａｃのみ）と比較して、新しい緩衝系（ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ）を有する最も強烈なＭＳピークは、より高い質量／より低い電荷状態（新しい緩衝液での＋２２～＋２７対最適化された標準緩衝液で＋２５～＋３０）にシフトされる。この現象は、トラスツズマブ（図６ー５対ＦＩＧ．６Ｆ）、インフリキシマブ（図７ー５対図７ー６）、セツキシマブ（図８ー５対図８ー６）、リツキシマブ（図９ー５対図９ー６）、及びＮＩＳＴｍＡｂ（図１０ー５対図１０ー６）を含む、試験した全てのｍＡｂについて見られる。この現象はまた、ＷＣＸカラムを使用しても見られた（データ図示せず）。最適化された標準緩衝液を使用して、ＷＣＸ－ＨＲＭＳにおけるＮＩＳＴｍＡｂについての生のＭＳデータ（図１１）は、ＳＣＸ－ＨＲＭＳにおけるＮＩＳＴｍＡｂについての生のＭＳデータ（図１０ー６）と同様に、＋２５～＋３０で最も強烈なピークを示す。概して、再構築された無傷の質量スペクトルで微分することができる質量差が、より低い電荷（より小さい分母）で改善されるため、より高い質量／より低い電荷状態が好ましい。

【0158】

系：
Ｂｉｎａｒｙポンプ：Ｇ７１２０Ａ（ＪｅｔＷｅａｖｅｒ Ｖ３５）を使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣシステム、
Ｍｕｌｔｉｓａｍｐｌｅｒ：Ｇ７１６７Ｂ（２０ｕＬループ）、
Ｍｕｌｔｉｃｏｌｕｍｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｔ：Ｇ７１１６Ｂ、
ＤＡＤ：Ｇ７１１７Ｂ、
＋ＴＯＦ ＭＳ（２０００～７０００）。

【0159】

条件：流量：０．３ｍＬ／分、
温度：３０℃、
検出：２８０ｎｍでのＵＶ、
Ｉｎｊ Ｖｏｌ：４μＬ（カラム上４０μｇ）、又は１０μＬ（ＮＩＳＴｍＡｂ及びセツキシマブのカラム上１００μｇ）。

【0160】

勾配：％Ｂが及び、このため、ｐＨ勾配を、実験用３ｕｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍカラムｐＨ勾配（傾き＝１．２％Ｂ／ＣＶ、５．６ＣＶ平衡）を使用して、各ｍＡｂに対して最適化した。表７は、３５～６５％Ｂ／１０分の例示的なｐＨ勾配を示す。

【表8】

【0161】

実施例３Ａ．トラスツズマブのＳＣＸ－ＨＲＭＳ
トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳを実施した。

【0162】

トラスツズマブ－ａｎｎｓ（Ｋａｎｊｉｎｔｉ）（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）を、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分間にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配を使用する、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）上に注入した。Ａｂｓ２８０ｎｍによって監視されたＵＶクロマトグラムは、図６ー１に示される。主ピークは、５．７８４分ＲＴで溶出した。

【0163】

図６ー２は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕＬ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．８３分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図６ー４及び図６ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0164】

図６ー３は、ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる２０～５０％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕＬ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．０９分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図６ー６及び図６ー７に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0165】

図６ー４は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、４．９０９～５．１３１分間の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、トラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷（ｍ／ｚ）範囲が示される。

【0166】

図６ー５は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３５～６５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，８５８～５．２１７分、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６６００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図６ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。同じ質量範囲が、スペクトル６Ｅ及び６Ｆの両方に使用される。

【0167】

図６ー６は、ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び２０～５０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，９６０～５．２１７分、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ ｉｎｊ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図６ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【0168】

図６ー７は、ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び２０～５０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、４，９６０～５，２１７分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．１を有するトラスツズマブ－ａｎｎｓ（４ｕｌ、１０ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0169】

実施例３Ｂ．インフリキシマブのＳＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ７．６を有するインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳを実施した。

【0170】

図７ー１は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量において１０分にわたる２０～３５％ＢのｐＨ勾配で強カチオン交換カラム（実験用３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するインフリキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍによって監視されたＵＶクロマトグラムを示す。変異体の良好な分離は、新しい緩衝系を伴うｐＨ勾配を使用して観察された：３．３５７、４．２４９、５．０１８、５．７５９、及び６．５６３分のＲＴにおいて溶出する５つの別個のピークが観察された。

【0171】

図７ー２は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分間にわたる２０～３５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。変異体の良好な分離が、新しい緩衝系を用いたｐＨ勾配を使用して観察された：６．０７、６．５７、７．１７、７．８７、及び８．５７分のＲＴにおいて溶出する５つの別個のピークが観察された。８．５７分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図７ー４及び図７ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0172】

図７ー３は、ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１５～２５％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．６３分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図７ー６及び図７ー７に示されるＭＳ分析のおおよその面積を例解する。電荷変異体の非常に不十分な分離を、この低ｐＩ ｍＡｂ（ｐＩ＝７．６）の標準緩衝液で与えた。この図と前の図（図７ー２）との比較は、標準緩衝液で日常的に可能なものよりも低いｐＨで良好なｐＨ制御を有することによって得られる性能上の利点を実証する。

【0173】

図７ー４は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び２０～３５％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、８．６２１～９．０３２分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、インフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0174】

図７ー５は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる２０～３５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、８．６２１～９．０３２分のインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６９００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図７ー５に示されるように、新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図７ー６に示される最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【0175】

図７ー６は、ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１５～２５％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、５．５９３～５．７３０分のインフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図７ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【0176】

図７ー７は、ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び１５～２５％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．５５９～５．６９６分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、インフリキシマブ（４ｕｌ、５ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６９００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0177】

実施例３Ｃ．セツキシマブのＳＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ８．８を有するセツキシマブのＳＣＸ－ＨＲＭＳを実施した。

【0178】

図８ー１は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するセツキシマブ（４ｍｇ／ｍＬ）のＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍによるＵＶクロマトグラムを示す。複数の別個の変異体ピークが、例えば、３．６５、４．０３、４．５８、５．２０、及び５．９３分のＲＴで観察された。

【0179】

図８ー２は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。複数の別個の変異体ピークが、３．３３、３．９２、４．５４、及び５．２２分のＲＴにおいて観察された。４．５４分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図８ー４及び図８ー５に示されるようなＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0180】

図８ー３は、ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び１７～４０％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．６８分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図８ー６及び図８ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0181】

図８ー４は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系、及び１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、４．６０１～９．０３２分の＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、セツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0182】

図８ー５は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び１０分にわたる３０～６０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．６０１～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図８ー５に示されるように、新しい緩衝系でｐＨ勾配溶出を使用する場合、最も強烈なＭＳピークは、図８ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【0183】

図８ー６は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる１７～４０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．５３３～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図８ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【0184】

図８ー７は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び１０分にわたる１７～４０％ＢのｐＨ勾配、＋ＴＯＦ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．５３３～４．８９２分のセツキシマブ（５ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６９００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0185】

実施例３Ｄ．リツキシマブのＳＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ９．４を有するリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳを実施した。

【0186】

図９ー１は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる７５～１００％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．４（１０ｍｇ／ｍＬ）を有するリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからのＡｂｓ２８０ｎｍによるＵＶクロマトグラムを示す。５．０３分のＲＴにおける主ピークが観察された。

【0187】

図９ー２は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる６５～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍ ＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。５．８８分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、ＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0188】

図９ー３は、ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び、１０分にわたる５５～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．６５分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図９ー６及び図９ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0189】

図９ー４は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系、及び１０分にわたる６５～１００％ＢのｐＨ勾配、６．０２１～６．３６３分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＬＣ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの範囲内にある質量／電荷、ｍ／ｚデータが示される。

【0190】

図９ー５は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び６５～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、６．０２１～６．３６３分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６８００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。図９ー５に示されるように、新しい緩衝系でｐＨ勾配を使用する場合、最も強力なＭＳピークは、図９ー６に示される、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【0191】

図９ー６は、ＮＭＭのないＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び１０分にわたる５５～１００％ＢのｐＨ勾配、４．５５０～４．７７２分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、リツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６８００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図９ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【0192】

図９ー７は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び５５～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４，５５０～４．７７２分のリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ、４ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0193】

実施例３Ｅ．ＮＩＳＴｍＡｂのＳＣＸ－ＨＲＭＳ
ｐＩ９．２を有するＮＩＳＴｍＡｂのＳＣＸ－ＨＲＭＳを実施した。

【0194】

図１０ー１は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる９５～１００％ＢのｐＨ勾配で、強カチオン交換カラム（試験的に、３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ｐＩ９．２（１０ｍｇ／ｍＬ）を有するＮＩＳＴｍＡｂのＳＣＸ－ＵＶ分析からのＡｂｓ２８０ｎｍにおいて監視されたＵＶクロマトグラムを示す。

【0195】

図１０ー２は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び０．３ｍＬ／分の流量で１０分にわたる９０～１００％ＢのｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．３９～４．８２のＲＴのピーク内にボックスを形成する点線は、ＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0196】

図１０ー３は、ＮＨ４Ａｃのみを含有する標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、３０℃、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、ＭＳ温度５００℃で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。４．５分のＲＴにおいて主ピーク内にボックスを形成する点線は、図１０ー６及び図１０ー７に示されるＭＳ分析のためのおおよその面積を例解する。

【0197】

図１０ー４は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び９０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．０１２～５．６２７分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳからの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～７０００Ｄａの範囲にわたる質量／電荷（ｍ／ｚ）データが示される。

【0198】

図１０ー５は、ＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭを含有する新しい緩衝系及び９０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、５．０１２～５．６２７分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用するＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を用いた天然分析物の最高の強度（約４８００～６９００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。新しい緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図１０ー６に示されるように、最適化された標準ＮＨ４Ａｃ緩衝系（＋２５～＋３０）で見られるよりも高い質量／より低い電荷（＋２２～＋２７）で現れる。

【0199】

図１０ー６は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、４．２５９～４．８４１分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換ＬＣカラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、ＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲は、この緩衝系を伴う、天然分析物（約４８００～６９００Ｄａ）に関して最高の強度を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、最も強烈なＭＳピークは、図１０ー５に示されるように、新しいＮＨ４Ａｃ＋ＮＭＭ緩衝系（＋２２～＋２７）と比較した場合、より低い質量／より高い電荷（＋２５～＋３０）で現れる。

【0200】

図１０ー７は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する最適化された標準緩衝系及び８０～１００％Ｂ／１０分のｐＨ勾配、＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）で、強カチオン交換カラム（試験的に３μｍＳＣＸ、１００×２．１ｍｍ）を使用する、４．２５９～４．８４１分のＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＳＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。２０００～６８００Ｄａの質量／電荷範囲が示される。

【0201】

図１１は、ＮＭＭなしのＮＨ４Ａｃを含有する標準緩衝系及び６０～１００％ＢのｐＨ勾配、４．７７２～５．０１２分の＋ＴＯＦＭＳ（２０００～７０００）、５００℃で、弱カチオン交換ＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ｂｉｏＺｅｎ ６μｍＷＣＸ、１５０×２．１ｍｍ）を使用する、ＮＩＳＴｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｕＬ ｉｎｊ）のＷＣＸ－ＨＲＭＳ分析からの生のＭＳスペクトルを示す。表示されたｍ／ｚ範囲を、この緩衝系を用いた天然分析物の最高強度（約４８００～７０００Ｄａ）を与えるものに絞った。追加的に、電荷状態エンベロープ内の分析物イオンの電荷が示される。最適化された標準緩衝系では、ＷＣＸ－ＨＲＭＳを使用するＮＩＳＴｍＡｂに関する生のＭＳスペクトルはまた、図１０ー６に示されるＳＣＸ－ＨＲＭＳの生のスペクトルと同様に、＋２５～＋３０の最も強力なＭＳピークを呈する。

【0202】

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【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図6-6】

【図6-7】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図7-6】

【図7-7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図8-6】

【図8-7】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図10-4】

【図10-5】

【図10-6】

【図10-7】

【図11】

【国際調査報告】