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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】アルツハイマー病の治療方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240628BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240628BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240628BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/7125
A61K31/7088
A61P25/28
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023579741
(86)(22)【出願日】2022-07-01
(85)【翻訳文提出日】2023-12-26
(86)【国際出願番号】 EP2022068313
(87)【国際公開番号】W WO2023275376
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】21183395.9
(32)【優先日】2021-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509168656
【氏名又は名称】オーフス ウニベルシテット
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン，オラフ マイケル
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA16
(57)【要約】
本開示は、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡ上の標的部位に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関する。本開示はさらに、前記ＡＳＯを含む組成物に関する。本開示はさらに、医薬にて使用するためのＡＳＯに関する。本開示はさらに、アルツハイマー病（ＡＤ）、またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害の予防、治療、及び／または緩和に使用するためのＡＳＯに関する。本開示はさらに、ＳＯＲＬ１転写物におけるエクソンスキッピングに介在する方法、ＡＳＯ介在性ＳＯＲＬ１エクソンスキッピングの効率を決定する方法、ＳＯＲＬ１突然変異で特定された患者がＡＳＯ介在性エクソンスキッピングによる治療から利益を得るかどうかを調べる方法、及びＡＳＯを製造する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡ上の標的部位に結合する及び／または前記標的部位と相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、前記標的部位のヌクレオチド配列が配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に含まれ、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列に含まれる、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
標的部位に結合する、及び／または標的部位と相補性である前記オリゴヌクレオチドが、ＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、前記エクソンが、配列番号１の配列を有するエクソン２３、配列番号２の配列を有するエクソン２４、配列番号３の配列を有するエクソン２５、配列番号４の配列を有するエクソン２６、配列番号５の配列を有するエクソン２７、配列番号６の配列を有するエクソン２８、配列番号７の配列を有するエクソン２９、配列番号８の配列を有するエクソン３０、配列番号９の配列を有するエクソン３１、配列番号１０の配列を有するエクソン３２、及び配列番号１１の配列を有するエクソン３３から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１～配列番号１１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
前記オリゴヌクレオチドが１０～３０の間のヌクレオチド長、例えば１０～１３のヌクレオチド、例えば１０～１６のヌクレオチド、例えば１０～１９のヌクレオチド、例えば１０～２２のヌクレオチド、例えば１０～２３のヌクレオチド、例えば１０～２６のヌクレオチド、例えば１０～２９のヌクレオチド、例えば１０～３０のヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長、及び／または少なくとも１４ヌクレオチド長、及び／または少なくとも１６ヌクレオチド長及び／または少なくとも１８ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２０、及び／または少なくとも２２ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２４ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２６ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２８ヌクレオチド長、及び／または少なくとも３０ヌクレオチド長である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
前記オリゴヌクレオチドが２１ヌクレオチド長である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
前記オリゴヌクレオチドが４０～６０％、例えば４５～５５％のＧＣ含量を有する、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート（ＰＳ）を含む骨格を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
前記オリゴヌクレオチドがさらに、少なくとも１つのヌクレオチド位置、または各ヌクレオチド位置にて修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
前記修飾が、前記核酸骨格、前記核酸塩基、リボース糖及び／または２’－リボース置換の修飾である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルリボース修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
前記標的部位が、３’スプライス部位境界、５’スプライス部位境界及び／またはエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位にある、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
前記標的部位が、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項14】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項15】
前記オリゴヌクレオチドが、高ストリンジェントな溶液ハイブリッド形成条件下で標的部位と特異的にハイブリッド形成する、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項16】
前記標的部位に結合する際、前記オリゴヌクレオチドはスプライシング因子が結合することを阻止する、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項17】
前記オリゴヌクレオチドが、ある部分またはナノ粒子配合物にコンジュゲートされる、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項18】
前記部分が、細胞を標的とする部分及び／または細胞を透過する部分である、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項19】
前記オリゴヌクレオチドが、トリアンテナリーＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び／またはペプチドにコンジュゲートされる、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項20】
前記オリゴヌクレオチドが５’スプライス部位、３’スプライス部位及び／またはエクソンスプライスエンハンサー部位（ＥＳＥ）を標的とする、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項21】
前記オリゴヌクレオチドがさらに、前記オリゴヌクレオチドの一方または双方の末端に、少なくとも１つの追加のヌクレオチド、少なくとも２つの追加のヌクレオチド、少なくとも３つの追加のヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項22】
先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項23】
前記組成物が医薬組成物である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物がさらに、薬学的に許容される担体を含む、請求項２２～２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項25】
前記オリゴヌクレオチドを１以上含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項26】
医薬で使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項27】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害の予防、治療及び／または緩和に使用するための、請求項１～２１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、及び／または請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項28】
有効量の前記オリゴヌクレオチドが、眼、脊髄、脳髄液、脳及び／または肝臓に投与される、請求項２６～２７のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項29】
個人の近親者がアルツハイマー病と診断された場合に、前記個人に有効量の前記オリゴヌクレオチドが投与される、請求項２７～２８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項30】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害を治療するための薬物の製造における請求項１～２１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項31】
請求項１～２１のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または請求項２２～２５のいずれか１項に記載の組成物を使用して、細胞、組織または臓器にてＳＯＲＬ１転写物におけるエクソンスキッピングに介在する方法であって、前記エクソンが、ＳＯＲＬ１のエクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２及び、及びエクソン３３から成る群から選択される、前記方法。
【請求項32】
１つのＡＳＯが使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
１を超えるＡＳＯ、例えば２つのＡＳＯ、例えば３つのＡＳＯ、例えば５つのＡＳＯ、例えば６つのＡＳＯが使用される、請求項３１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
１つのエクソンのエクソンスキッピングに介在する、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
１を超えるエクソン、例えば２つのエクソン、例えば３つのエクソン、例えば４つのエクソンのエクソンスキッピングに介在する、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
対象にてＡＳＯ介在性のＳＯＲＬ１エクソンスキッピングの効率を決定する方法であって、前記方法が以下の工程：ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる、患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｂ）ＡＳＯによる治療の後に得られる、ａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｃ）ａ）及びｂ）の前記試料における排出ＳＯＲＬＡの前記レベルを比較する工程とを含み、
それによって、ｂ）における排出ＳＯＲＬＡの前記レベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する、前記方法。
【請求項37】
任意で、ＡＳＯによる治療の後に複数の時点で試料ｂ）を得る工程を含み、したがって経時的にＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングの効率をモニターすることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ＳＯＲＬ１に突然変異があると特定された患者が、ＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングによる治療から利益を得るかどうかを調べる方法であって、前記方法が以下の工程：ａ）ＳＯＲＬ１のエクソン２３～３３のいずれか１つにて突然変異を特定する工程と、
ｂ）前記患者にて特定された前記ＳＯＲＬ１の突然変異を細胞株に導入する工程と、
ｃ）前記特定された突然変異を保有する前記エクソンを標的とする１以上のＡＳＯを選択する工程と
ｄ）前記選択された１以上のＡＳＯを含む培地と細胞の第１のアリコートを接触させ、ＡＳＯを含まない培地と細胞の第２のアリコートを接触させる工程と、
ｅ）前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｆ）前記第１のアリコート及び前記第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡの前記レベルを比較する工程とを含み、
それによって、前記第１のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡの前記レベルが前記第２のアリコートより高ければ、前記患者が１以上のＡＳＯによる治療から利益を得ると判定する、前記方法。
【請求項39】
前記方法が試験管内の方法である、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
アルツハイマー病（ＡＤ）患者の治療に好適なＡＳＯを生成する方法であって、前記患者がＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンにて突然変異を保有し、前記方法が以下の工程：ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のＡＳＯを特定する、例えば、コンピューターによって特定する工程と、
ｂ）前記ＡＳＯの前記標的部位が前記突然変異を含むかどうか、または前記ＡＳＯの前記標的部位が前記突然変異を含まないかどうかを決定する工程とを含み、
それによって、前記突然変異を含まない標的部位に結合するＡＳＯがＡＤ患者の治療に好適であると判定する、前記方法。
【請求項41】
前記突然変異がカルシウムケージ突然変異または奇数システイン突然変異である、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記突然変異がヒトＳＯＲＬ１の１０８０位でのアルギニンからシステインへの置換（Ｒ１０８０Ｃ）である、または前記突然変異がヒトＳＯＲＬ１の１１０５位でのアスパラギン酸からヒスチジンへの置換（Ｃ１１０５Ｈ）である、請求項４０～４１のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書で開示されているのは、細胞、組織または動物におけるＳＯＲＬ１のｍＲＮＡのスプライシングを調節するための化合物、組成物及び方法である。また、提供されているのは、アルツハイマー病（ＡＤ）を含む疾患及び障害の治療のための薬物の製造における開示されている化合物及び組成物の使用である。具体的には、本開示はＳＯＲＬ１の転写物にてエクソンスキッピングを引き起こすアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＯＲＬＡは、エンドソームから出たアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の輸送に重要であり、その際、ＳＯＲＬＡによって妨害されなければ、ＡＰＰの病原性断片（すなわちアミロイドβ－ペプチド（Ａβ））へのアミロイド生成性のプロセシングが発生する。このＳＯＲＬＡが支えるＡＰＰの輸送はβ－セクレターゼによるＡＰＰの切断の減少を保証し、それによって、その後さらに処理されてアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドを生成することができるβ－Ｃ末端断片（ＣＴＦ）の生成を減らす。ＡＤでは、Ａβは脳内のアミロイド斑に蓄積し、疾患の最も重要な病理学的特徴である。しかしながら、この疾患の病因は、むしろ、β－ＣＴＦ及び他のカーゴタンパク質のレベルと関連しており、ＡＤではそれらはエンドソームから出て再利用されることができず、エンドソームの腫脹及び機能不全のエンドソーム活性（すなわち、アルツハイマー病に関するエンドソーム交通渋滞仮説）につながる。ＳＯＲＬＡがエンドソームの再利用に関与する能力は、レトロマー複合体との相互作用に重要であり、且つエンドソームから出てカーゴを輸送するのに役立つ細胞質尾部におけるモチーフ（すなわちＦＡＮＳＨＹモチーフ）に関連する。
【0003】
エンドソーム選別受容体ＳＯＲＬＡをコードするＳＯＲＬ１遺伝子は過去１５年間、アルツハイマー病の発症に関連してきた。近年、大規模な全エクソーム配列決定研究によって、ＳＯＲＬ１がＡＤ患者群におけるヒトゲノム全体にわたる最も高い遺伝的変異を抱える遺伝子であることが特定されている。ＳＯＲＬ１に位置する「機能喪失型」（ＬＯＦ）の変異型の組み合わせ群は、早発性ＡＤのオッズ比リスクが３６倍（ＯＲ＝３６）増加し、晩発性ＡＤのリスクが７倍に増加することに関連している。ミスセンス変異型の群全体は、それぞれ早発性ＡＤ及び遅発性ＡＤのリスクが２．７倍及び１．９倍増加することに関連することが分かっている。
【0004】
興味深いことに、アルツハイマー病患者由来のＳＯＲＬ１変異型は、ＳＯＲＬ１遺伝子全体に広がり、したがって、すべての変異型の２５％超が１１の相補体反復（ＣＲ）ドメインをコードするゲノム領域に位置する。ＣＲドメインは、ＣＲドメインのクラスターを含有するすべての既知の受容体における主要なリガンド結合部位である。また、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインのクラスターはＡＰＰを含むリガンドへの結合に関与する。その結果、ＣＲドメインにおける突然変異は、リガンド結合に関しても、タンパク質の誤った折り畳み及びＥＲ保持に関しても、ＳＯＲＬＡの機能に重大な影響を及ぼすことができる。
【0005】
ＡＤ発症のリスクまたは因果関係を予測する遺伝的マーカーに関する知識が得られている一方で、ＡＤに関する実行可能な治療は今のところ得られておらず、ＡＤは患者及び医療制度に対する多大な負担のままである。
【発明の概要】
【0006】
近年、本開示の発明者らは、追加のＳＯＲＬＡ突然変異、すなわち、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインにおける突然変異がＡＤと関連していることを示す証拠を蓄積してきた。１１のＣＲドメインのクラスターをコード化するＳＯＲＬ１の領域に位置するミスセンス変異型の２つの亜群が特定されており、これは、ＡＤのリスク増大と関連する（データは公開されていない）。
【0007】
ＣＲドメインは、ＣＲドメインのクラスターを含有するすべての既知の受容体における主要なリガンド結合部位を表す。また、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインのクラスターはＡＰＰを含むリガンドへの結合に関与している。しかしながら、任意のリガンドの典型的な結合は単離されたＣＲドメインに依存するものではないが、多くの研究はむしろ、多くのＣＲドメインとリガンド上のいくつかのエピトープとの合わせた相互作用によってどのように結合が達成されるかを示している。
【0008】
本開示の発明者らは、生理学及び病理学におけるＳＯＲＬＡドメイン及びそれらの機能性を慎重に検討することによって、個々のＣＲドメインの存在または非存在がＳＯＲＬＡリガンドに対する親和性に微妙な影響しか与えないので、突然変異に起因して機能性ではないＣＲドメインを除去することを目的として、１以上のＳＯＲＬＡのＣＲドメインを標的にすることが実現可能なアプローチであることに気付いた。本明細書に開示されているように、変異したＣＲドメインは、エクソンスキッピング法を採用することによってＳＯＲＬＡから除去され、その際、特異的に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は突然変異を保有するＣＲドメインのエクソンの除去に使用される。結果として、例えば１つのＣＲドメインを欠く、または複数のＣＲドメインにおける突然変異の場合、１より多くのＣＲドメインを欠く機能的ＳＯＲＬＡタンパク質を生成することができる。このアプローチはいくつかの利点を有する。
【0009】
第１に、ＡＤ患者の脳に送達されたＡＳＯは機能的ＳＯＲＬＡタンパク質をその場で回復させることができる。ＣＲ突然変異を保有するＡＤ患者はＳＯＲＬＡタンパク質を産生していてもよいが、突然変異のために、このタンパク質は機能しない。例えば、この変異したＳＯＲＬＡタンパク質は誤った折り畳みを生じることができ、且つ病理学的に小胞体（ＥＲ）に保持され得る。変異したＣＲエクソンをエクソンスキッピングにより除去することによって、リガンド結合に関してその機能性を保持し、且つ多くの重要なドメインを含むＳＯＲＬＡが生理的な方法でエンドソーム経路を介して進むことを保証する機能的なＳＯＲＬＡタンパク質を生成することができる。要約すると、タンパク質全体の機能性を完全に消失させる変異したタンパク質の代わりに、１以上のＣＲドメインを欠く変異型を生成することができ、この変異型は、生理学的機能することができ、または生理学的に近く機能することができる。
【0010】
第２に、変異したＳＯＲＬＡタンパク質は、ＳＯＲＬＡ二量体形成のために、変異していないＳＯＲＬＡ（非罹患対立遺伝子から産生される）に対して主要な負の効果を有することができる。変異したＳＯＲＬＡは誤った折り畳み及び二量体における非変異ＳＯＲＬＡの保持をもたらす場合がある。したがって、機能的なＳＯＲＬＡのレベルは一層さらに低下し、その結果、ＡＰＰの病原性断片へのアミロイド形成性プロセシングはもはや妨げられない。しかしながら、本開示の教示、すなわち、変異したＳＯＲＬＡのＣＲドメインのＡＳＯが介在するエクソンスキッピングを使用することによって、１以上のＣＲドメインを欠くＳＯＲＬＡタンパク質が細胞内で生成されるが、この変異型は、それ自体の誤った折り畳みも、または二量体での影響を受けていない他のＳＯＲＬＡ変異型の誤った折り畳みを誘導することはない。
【0011】
主要な態様では、本開示は、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡ上の標的部位に結合する、及び／または標的部位に相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関するものであり、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性を有する、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列に含まれる。
【0012】
さらなる態様では、本開示は前記オリゴヌクレオチドを含む組成物に関する。
【0013】
さらなる態様では、本開示は薬物で使用するための前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または前記組成物を対象とする。
【0014】
さらなる態様、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害の予防、治療及び／または緩和に使用するための前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または前記組成物を対象とする。
【0015】
さらなる態様、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害を治療するための薬物の製造における前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記組成物の使用を対象とする。
【0016】
さらなる態様では、本開示は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは／または前記組成物を使用して、細胞、組織または臓器におけるＳＯＲＬ１転写物にてエクソンスキッピングに介在する方法を対象とするものであり、その際、当該エクソンは、ＳＯＲＬ１のエクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２及びエクソン３３から成る群から選択される。
【0017】
さらなる態様では、本開示は、対象にてＡＳＯが介在するＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングの効率を決定する方法を対象とするものであり、当該方法は以下の工程：
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｂ）ＡＳＯでの処理後に得られるａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する。
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｂ）ＡＳＯでの処理後に得られるａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する。
【0018】
さらなる態様では、本開示は、ＳＯＲＬ１突然変異があると特定された患者が、ＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングによる治療から利益を得るかどうかを調べる方法を対象とするものであり、当該方法は以下の工程：
ａ）ＳＯＲＬ１のエクソン２３～３３のいずれか１つにて突然変異を特定する工程と、
ｂ）患者にて特定されたＳＯＲＬ１突然変異を細胞株に導入する工程と、
ｃ）特定された突然変異を保有するエクソンを標的とする１以上のＡＳＯを選択する工程と、
ｄ）選択された１以上のＡＳＯを含む培地と細胞の第１のアリコートを接触させ、ＡＳＯを含まない培地と細胞の第２のアリコートを接触させる工程と、
ｅ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡの濃度を分析する工程と、
ｆ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、第１のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルが第２のアリコートよりも高ければ、患者が１以上のＡＳＯによる治療から利益を得ると判定する。
ａ）ＳＯＲＬ１のエクソン２３～３３のいずれか１つにて突然変異を特定する工程と、
ｂ）患者にて特定されたＳＯＲＬ１突然変異を細胞株に導入する工程と、
ｃ）特定された突然変異を保有するエクソンを標的とする１以上のＡＳＯを選択する工程と、
ｄ）選択された１以上のＡＳＯを含む培地と細胞の第１のアリコートを接触させ、ＡＳＯを含まない培地と細胞の第２のアリコートを接触させる工程と、
ｅ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡの濃度を分析する工程と、
ｆ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、第１のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルが第２のアリコートよりも高ければ、患者が１以上のＡＳＯによる治療から利益を得ると判定する。
【0019】
さらなる態様では、本開示は、ＡＤ患者の治療に好適なＡＳＯを生成する方法を対象とするものであり、その際、患者はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンにて突然変異を保有し、当該方法は以下の工程：
ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のＡＳＯを特定する、例えば、コンピューターによって特定する工程と、
ｂ）ＡＳＯの標的部位が突然変異を含むかどうか、またはＡＳＯの標的サイズが突然変異を含まないかどうかを判定する工程とを含み、
それによって、突然変異を含まない標的部位に結合するＡＳＯがＡＤ患者の治療に好適であることを決定する。
ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のＡＳＯを特定する、例えば、コンピューターによって特定する工程と、
ｂ）ＡＳＯの標的部位が突然変異を含むかどうか、またはＡＳＯの標的サイズが突然変異を含まないかどうかを判定する工程とを含み、
それによって、突然変異を含まない標的部位に結合するＡＳＯがＡＤ患者の治療に好適であることを決定する。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＳＯＲＬＡドメイン集合体の概略図である。ヒトＳＯＲＬＡポリペプチドは２２１４のアミノ酸を含有し、それらのアミノ酸はＶＰＳ１０ｐドメイン、ＥＧＦドメインと連結されたＹＷＴＤ－ｂ－プロペラドメイン、１１のＣＲドメイン、６の３Ｆｎドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部ドメインを含む多数のタンパク質ドメインに折り畳まれる。ＣＲドメインはエクソン２３～３３によってコードされている。（Ｅｘ＝エクソン）
【図2A】ＳＯＲＬＡのＣＲドメインの構造及び配列を示す。Ａ及びＢ：ＣＲドメイン配列は３つのドメイン内ジスルフィド（システインを接続する黒いバー）を形成する６つの厳密に保存されたシステイン（システイン＝「Ｃ」）を含む約４０のアミノ酸を含有する。酸性側鎖を持つ４つの残基も保存され、それらはカルシウムイオンの８面体配位で機能する。ＣＲ１はここでは例示的なＣＲドメインを示す。
【図2B】ＳＯＲＬＡのＣＲドメインの構造及び配列を示す。Ａ及びＢ：ＣＲドメイン配列は３つのドメイン内ジスルフィド（システインを接続する黒いバー）を形成する６つの厳密に保存されたシステイン（システイン＝「Ｃ」）を含む約４０のアミノ酸を含有する。酸性側鎖を持つ４つの残基も保存され、それらはカルシウムイオンの８面体配位で機能する。ＣＲ１はここでは例示的なＣＲドメインを示す。
【図2C】ＳＯＲＬＡのＣＲドメインの構造及び配列を示す。ＳＯＲＬＡの１１のＣＲドメイン配列の配列比較を示し、ドメイン境界はそれらの個々のエクソン（すなわち、エクソン２３～３３）構造に従う。配列比較の上部の数字はＢ及びＣにおけるアミノ酸間の関係を示す。
【図3】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をエクソンスキッピングにてどのように使用することができるかを示す概略図である。１１のＣＲドメインのそれぞれはそれ自体のエクソン（エクソン２３～３３）によってコードされる。これらのエクソンのそれぞれは３ヌクレオチドの倍数を含有するので、エクソンのスキッピングは下流のエクソンのリーディングフレームに影響を与えない。したがって、３’スプライス部位、５’スプライス部位及び／または１以上のエクソンのスプライスエンハンサー部位（ＥＳＥ）を標的とする個々のエクソンのためのＡＳＯ（波線として図示）を使用して、ここでエクソン２３によって例示されるように、ＳＯＲＬ１転写物から変異したエクソンを除去することによってアルツハイマー病を治療することができる。
【図4A】ＡＳＯ処理及び細胞ＳＯＲＬＡ活性についての概略図である。ＳＯＲＬＡは野生型対立遺伝子から発現し、１１のＣＲドメイン（１１×）を有し、且つエンドソームでのカーゴ再利用にて機能する。
【図4B】ＡＳＯ処理及び細胞ＳＯＲＬＡ活性についての概略図である。病原性ＳＯＲＬ１変異型（黒色ＣＲドメインとして示される）、例えば、ＡＤ患者に特徴的な変異型、例えば、ＯＮＣ型またはＣＣ型の変異型の対立遺伝子からＳＯＲＬＡが発現したが、変異型は受容体の誤った折り畳み及びＥＲ保持を引き起こし、野生型対立遺伝子からの翻訳産物にも影響を及ぼす可能性がある。
【図4C】ＡＳＯ処理及び細胞ＳＯＲＬＡ活性についての概略図である。エクソンスキッピングＡＳＯで処理された疾患対立遺伝子のＳＯＲＬＡは１０の機能的なＣＲドメイン（１０×）を含有し、完全長ＳＯＲＬＡタンパク質と区別できない機能を含有するであろう。
【図5A】エクソン２３を標的とするＡＳＯを示す。エクソン２３のエクソンスキッピングを誘導するための標的設定戦略を示す。表は４つのＡＳＯ（ＡＳＯ２３．１～ＡＳＯ２３．４）、各ＡＳＯ配列及び各ＲＮＡ標的配列を示す。
【図5B】エクソン２７を標的とするＡＳＯを示す。エクソン２７のエクソンスキッピングを誘導するための標的設定戦略を示す。表は４つのＡＳＯ（ＡＳＯ２７．１～ＡＳＯ２７．４）、各ＡＳＯ配列及び各ＲＮＡ標的配列を示す。
【図5C】エクソン３３を標的とするＡＳＯを示す。エクソン３３のエクソンスキッピングを誘導するための標的設定戦略を示す。表は４つのＡＳＯ（ＡＳＯ３３．１～ＡＳＯ３３．４）、各ＡＳＯ配列及び各ＲＮＡ標的配列を示す。
【図5D】前駆体ｍＲＮＡ上のそれらの各結合部位に関して、エクソン２３を標的とするために特定された４つのＡＳＯを示す。灰色のさまざまな色合いのバーはスプライス因子の結合部位を示す。各バーの幅はスプライシング因子によって推定上結合された配列を表す。エクソンのスプライシングを促進または抑制する予測された強度は、各スプライシング因子に対するスコアとして表される。正のスコアはエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を表す一方で、負のスコアはエクソンスプライスリプレッサー（ＥＳＲ）を表す。配列の下の数字は、両側にエクソン＋２５ｂｐの隣接イントロン配列（小文字）を含む配列内でのヌクレオチドの位置を示す。
【図5E】前駆体ｍＲＮＡ上のそれらの各結合部位に関して、エクソン２７を標的とするために特定された４つのＡＳＯを示す。灰色のさまざまな色合いのバーはスプライス因子の結合部位を示す。各バーの幅はスプライシング因子によって推定上結合された配列を表す。エクソンのスプライシングを促進または抑制する予測された強度は、各スプライシング因子に対するスコアとして表される。正のスコアはエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を表す一方で、負のスコアはエクソンスプライスリプレッサー（ＥＳＲ）を表す。配列の下の数字は、両側にエクソン＋２５ｂｐの隣接イントロン配列（小文字）を含む配列内でのヌクレオチドの位置を示す。
【図5F】前駆体ｍＲＮＡ上のそれらの各結合部位に関して、エクソン３３を標的とするために特定された４つのＡＳＯを示す。灰色のさまざまな色合いのバーはスプライス因子の結合部位を示す。各バーの幅はスプライシング因子によって推定上結合された配列を表す。エクソンのスプライシングを促進または抑制する予測された強度は、各スプライシング因子に対するスコアとして表される。正のスコアはエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を表す一方で、負のスコアはエクソンスプライスリプレッサー（ＥＳＲ）を表す。配列の下の数字は、両側にエクソン＋２５ｂｐの隣接イントロン配列（小文字）を含む配列内でのヌクレオチドの位置を示す。
【図6】エクソン２３を標的とするＡＳＯによる形質移入されたヒト細胞株におけるＲＴ－ＰＣＲによって測定されたエクソン２３のスキッピング効率を示す。我々は、ＨＥＫ２９３細胞の形質移入、内在性ＳＯＲＬ１ ｍＲＮＡの回収によってＳＯＲＬ１のエクソン２３のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）エレメントに対して向けられた４つのＡＳＯ（ＡＳＯ２３．１、ＡＳＯ２３．２、ＡＳＯ２３．３及び２３．４）を調べ、エクソン２３の周りの領域にまたがるプライマー対を使用したＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、独立した２つの実験のデータを示す（上図、下図）。双方の実験では、我々は、エクソン２３欠失断片をコードするプラスミド（ｐΔＥｘ２３、対照として使用される組換え産生されたエクソン２３の変異型）を鋳型として使用して生成した生成物と同一に移動するさらに短いＰＣＲ産物（矢印参照）の存在により実証されるように、ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３がエクソン２３のスキッピングを誘導する明確な証拠を観察した。ｐＦＬ（完全長ＳＯＲＬＡをコードするプラスミド）は含まれたエクソン２３を有する断片に相当するＰＣＲ産物を特定するのに対照鋳型として役立った。
【図7】ＳＯＲＬ１デルタ－エクソン２３の発現を示す。Ａ）ＳＯＲＬＡ完全長またはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３をコードする構築物で形質移入したＮ２ａ細胞からの溶解物及び培地のウェスタンブロット分析を示す。溶解物中の完全長ＳＯＲＬＡのレベル（左）は、エクソン２３を含まないＳＯＲＬＡのレベルと区別できないが（注：デルタＥｘ２３の第２の複製におけるバンドは部分的に気泡で覆われている）、それでも、隣接するレーンのバンドと同程度に強い。中程度（右）の完全長ＳＯＲＬＡのレベルは、エクソン２３を含まないＳＯＲＬＡのレベルと区別できない。したがって、エクソン２３を含まないＳＯＲＬＡは、完全長ＳＯＲＬＡと同様に排出され、したがって、その機能性を保持している。Ｂ）ＳＯＲＬＡ完全長、ＳＯＲＬＡ－Ｄ１１０５Ｈ（病原性突然変異）、エクソン２３がないＳＯＲＬＡ、またはＳＯＲＬＡ－Ｒ１０８０Ｃ（病原性突然変異）で形質移入したＮ２ａ細胞からの溶解物及び培地のウェスタンブロット分析を示す。欠失したＣＲ１（すなわちΔエクソン２３）の培地中でのｓＳＯＲＬＡのレベルは、完全長ＳＯＲＬＡの場合と同様であるのに対して、双方の病原性突然変異はｓＳＯＲＬＡ産生の量を大幅に減らす（ｓＳＯＲＬＡ＝排出ＳＯＲＬＡ）。
【図8A】ＳＯＲＬＡデルタ－エクソン２３の機能発現を示す。ＡＰＰ単独で形質移入した（「対照」、レーン１～２）、ＡＰＰ／完全長ＳＯＲＬＡで二重形質移入した（「完全長」、レーン３～４）、またはＡＰＰ／ＳＯＲＬＡ デルタＥｘ２３で二重形質移入した（「デルタエクソン２３」、レーン５～６）Ｎ２ａ細胞からの培地のウェスタンブロット分析を示す。排出ＡＰＰ（すなわちｓＡＰＰａ）の量は、抗体ＷＯ２を使用して検出し、且つ排出ＳＯＲＬＡ（すなわちｓＳＯＲＬＡ）の量は、ＳＯＲＬＡルミナル断片についてのポリクローナル血清を使用して検出する。外来性ＳＯＲＬＡの過剰発現がない細胞（対照）は培地にてｓＡＰＰについて強いシグナルを示す。対照的に、完全長ＳＯＲＬＡまたはエクソン２３の欠失を伴うＳＯＲＬＡ構築物のいずれかを使用して形質移入した細胞由来の培地はｓＡＰＰのレベルが大幅に低下したことを示す。結論として、ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）を欠失したＳＯＲＬＡは完全長ＳＯＲＬＡ受容体と同様にＡＰＰプロセシングを抑制するのに有効である。
【図8B】ＳＯＲＬＡデルタ－エクソン２３の機能発現を示す。独立した実験でも再び、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ２３との間で類似していることが示され、ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）の欠失は受容体生物学に観察可能な影響を有しないことが示された。我々はまた、２つのＳＯＲＬＡ変異型（完全長及びＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３）タンパク質が、ＡＰＰタンパク質分解を減少させることによってｓＡＰＰαの生成を低下させることに対して区別できない効果を有することも再び観察した。
【図8C】ＳＯＲＬＡデルタ－エクソン２３の機能発現を示す。独立した実験でも再び、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ２３との間で類似していることが示され、ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）の欠失は受容体生物学に観察可能な影響を有しないことが示された。我々はまた、２つのＳＯＲＬＡ変異型（完全長及びＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３）タンパク質が、ＡＰＰタンパク質分解を減少させることによってｓＡＰＰαの生成を低下させることに対して区別できない効果を有することも再び観察した。
【図8D】ＳＯＲＬＡデルタ－エクソン２３の機能発現を示す。３回の独立した反復からのブロットを定量し、外来性ＳＯＲＬＡを含まない細胞に対するレベルの反復試料の平均値としてデータを提示した。この定量はさらに、ＳＯＲＬＡのΔＥｘ２３が排出ＡＰＰａ（ｓＡＰＰａ）を低減するのにＷＴと同等に有効であることを示している（ｎｓ＝非有意）。
【図9】ＳＯＲＬ１デルタ－エクソン３３の発現を示す。ＳＯＲＬ１－ＷＴまたはＳＯＲＬ１－ΔＥｘ３３のいずれかの構築物でＮ２ａ細胞に形質移入し、細胞からの溶解物及び調整培地を、（溶解物試料中の）ＳＯＲＬＡまたはアクチン、または（培地試料中の）排出ＳＯＲＬＡに対する抗体を使用してウェスタンブロットによって分析した。内在性ＳＯＲＬＡの発現はＮ２ａ細胞にて低い／存在せず、したがって、形質移入されていない細胞（ブランク）にて検出できない。ＣＲドメイン１１（構築物ＳＯＲＬ１－ΔＥｘ３３から取り除かれているエクソン３３によってコードされる）を欠くＳＯＲＬＡを、野生型ＳＯＲＬＡと比較して溶解物及び培地にて類似したレベルで検出した。培地での同様の検出は、ＣＲ１１の欠失がＳＯＲＬＡ受容体生物学に観察可能な影響を与えないこと、すなわち、ＣＲ１１を欠くＳＯＲＬＡさえもプロセシングされて、ＳＯＲＬＡ－ＷＴと同様に排出されることを示す。
【図10】追加のＳＯＲＬ１のＣＲドメインのエクソンに拡張されたエクソンスキッピング技術。個々のＣＲドメインについて欠失した、すなわちＣＲ１（ΔＥｘ２３）、ＣＲ２（ΔＥｘ２４）、ＣＲ３（ΔＥｘ２５）、ＣＲ４（ΔＥｘ２６）、ＣＲ５（ΔＥｘ２７）、ＣＲ６（ΔＥＸ２８）、ＣＲ７＋８（ΔＥｘ２９＋３０）、ＣＲ８（ΔＥｘ３０）、ＣＲ９（ΔＥ３１）、ＣＲ１０（ΔＥ３２）またはＣＲ１１（ΔＥ３３）ＳＯＲＬＡタンパク質を生成するように操作した構築物でＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入の７２時間後に回収した細胞から溶解物を調製し、２６レーンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＮｕＰＡＧＥシステムによってタンパク質を分離し、ウサギ由来のポリクローナルＳＯＲＬＡ血清（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）を使用してウェスタンブロット分析によって分析した。ＳＯＲＬＡブロットはＨＥＫ細胞でＳＯＲＬＡを発現するときに二重バンドを示すことが知られており、上部バンド（分子サイズが大きいためゲル中でより遅く流れる）は成熟ＳＯＲＬＡを表し、下部バンド（分子サイズが小さいためゲル中でより速く流れる；矢印を参照）。構築物のそれぞれは、特異的なＣＲドメイン欠失ＳＯＲＬＡ受容体の発現をもたらした。興味深いことに、いくつかの欠失は、潜在的に全てのＣＲドメインが、受容体機能を妨害しないで欠失され得るわけではないことを示唆する驚くべき結果を示した、すなわち、ＳＯＲＬＡ二重バンドパターンが妨害されているＣＲ４（ΔＥ２６）及びＣＲ９（ΔＥｘ３１）である。ＦＬ＝完全長ＳＯＲＬＡ、Δ＝デルタは除かれたエクソン／ドメインを示す、Ｅｘ＝エクソン、ＣＲ。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
本明細書で使用されるとき、文脈上明らかにそうでない場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には複数の指示対象が含まれる。
本明細書で使用されるとき、文脈上明らかにそうでない場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には複数の指示対象が含まれる。
【0022】
「いくつかの実施形態」という用語は１または１を超える実施形態を含むことができる。
【0023】
「アルツハイマー病」及び「ＡＤ」という用語は本記載全体を通して相互交換可能に使用される。
【0024】
本文全体で使用される場合、または特許請求の範囲及び／または本明細書にて用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて使用される場合の「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、「１つ」を意味してもよいが、それはまた「１以上」、「少なくとも１」、及び「１または１以上」の意味とも一致する。したがって、例えば、「ＡＳＯ」への言及は、複数のそのようなＡＳＯ、例えば、１以上のＡＳＯ、少なくとも１つのＡＳＯ、または２以上のＡＳＯを含む。
【0025】
本明細書で使用されるとき「ＳＯＲＬＡ」という用語は、ＳＯＲＬＡ、ソルチリン関連の受容体、ソルチリン関連の受容体１、ＳＯＲＬ１、１１のリガンド結合反復と関連する低密度リポタンパク質受容体、１１のリガンド結合反復と関連するＬＤＬＲ、ＬＲ１１、ＳｏｒＬＡ－１、ＬＤＬＲクラスＡ反復を含有する選別タンパク質関連受容体及びｇｐ２５０という用語と同義である。ヒトｓｏｒＬＡは、ＵｎｉＰｒｏｔにおいて受入番号Ｑ９２６７３でアノテーションされている。
【0026】
本明細書で定義されるときポリヌクレオチド（またはポリペプチド）に関する相同性、同一性及び類似性という用語は、相互交換可能に使用され、配列を並べ、必要に応じてギャップを導入して最大のパーセント同一性／類似性を達成し、ＮＣＩＵＢ規則（ｈｆｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｕｌ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｍｉｓｃ／ｎａｓｅｑ．ｈｔｍｌ；ＮＣ－ＩＵＢ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５））に従って配列同一性の一部として保存的置換を検討したのち、対応するネイティブ核酸（またはアミノ酸）の残基とそれぞれ相同である、同一であるまたは類似する、候補配列における核酸（またはアミノ酸）の割合を指す。特に、類似性の割合は類似の物理化学的特性で保存された残基の割合を指す。５’または３’の伸長も、挿入（核酸の場合）も、またはＮ’もしくはＣ’の伸長も、挿入（ポリペプチドの場合）も同一性または類似性の低下をもたらさない。配列比較のための方法及びコンピュータプログラムは当該技術分野にて周知である。一般に、２つの配列間の所与の類似性は、これらの配列間の同一性が少なくとも類似性に等しいことを意味する；例えば、２つの配列が互いに８０％類似する場合、それらは互いに８０％未満の同一性は得られないが、９０％の同一性を共有し得る。
【0027】
本明細書で定義されるように、「少なくとも８０％の相同性、類似性または同一性」という用語は、本開示全体を通して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性、類似性または同一性を意味する。
【0028】
ＡＳＯが介在するエクソンスキッピング
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、プレｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡとも呼ばれる）転写物にてエクソンスキッピングを誘導することができる。この種類のアンチセンスが介在するスプライシング調節は、例えば、スプライシング因子のプレｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡとも呼ばれる）転写物への結合を立体的に阻止することによって、スプライシングを操作するのにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、プレｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡとも呼ばれる）転写物にてエクソンスキッピングを誘導することができる。この種類のアンチセンスが介在するスプライシング調節は、例えば、スプライシング因子のプレｍＲＮＡ（前駆体ｍＲＮＡとも呼ばれる）転写物への結合を立体的に阻止することによって、スプライシングを操作するのにアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用する。
【0029】
主要な態様では、本開示は、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡ上の標的部位に結合する、及び／または標的部位と相補性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関するものであり、当該標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性を有する、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列に含まれる。
【0030】
代わりの態様では、本開示は、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡ上の標的部位に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に関するものであり、当該標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に、または配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性を有する、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列に含まれる。
【0031】
当業者は、ＡＳＯの標的部位への十分な結合には相補性の塩基を介した結合が必要であることを理解するであろう。
【0032】
当業者は、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡが、各エクソン（複数可）に隣接する上流配列及び／または下流配列から転写されるような追加のヌクレオチドの有無にかかわらず１以上のＳＯＲＬ１エクソンからの転写物として理解されることを認識するであろう。例えば、ＳＯＲＬ１のプレｍＲＮＡは以下を含んでもよい：
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２３転写物（配列番号３６）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２４転写物（配列番号３７）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２５転写物（配列番号３８）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２６転写物（配列番号３９）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２７転写物（配列番号４０）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２８転写物（配列番号４１）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２９転写物（配列番号４２）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３０転写物（配列番号４３）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３１転写物（配列番号４４）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３２転写物（配列番号４５）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３３転写物（配列番号４６）、
その際、エクソン２３はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１をコードし、エクソン２４はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン２をコードし、エクソン２５はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン３をコードし、エクソン２６はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン４をコードし、エクソン２７はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン５をコードし、エクソン２８はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン６をコードし、エクソン２９はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン７をコードし、エクソン３０はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン８をコードし、エクソン３１はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン９をコードし、エクソン３２はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１０をコードし、及びエクソン３３はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１１をコードする。
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２３転写物（配列番号３６）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２４転写物（配列番号３７）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２５転写物（配列番号３８）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２６転写物（配列番号３９）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２７転写物（配列番号４０）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２８転写物（配列番号４１）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン２９転写物（配列番号４２）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３０転写物（配列番号４３）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３１転写物（配列番号４４）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３２転写物（配列番号４５）、
－上流／下流の隣接イントロンから転写される１００のヌクレオチドを含むエクソン３３転写物（配列番号４６）、
その際、エクソン２３はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１をコードし、エクソン２４はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン２をコードし、エクソン２５はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン３をコードし、エクソン２６はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン４をコードし、エクソン２７はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン５をコードし、エクソン２８はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン６をコードし、エクソン２９はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン７をコードし、エクソン３０はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン８をコードし、エクソン３１はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン９をコードし、エクソン３２はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１０をコードし、及びエクソン３３はＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１１をコードする。
【0033】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３６のヌクレオチド配列、または配列番号３６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0034】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３７のヌクレオチド配列、または配列番号３７に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0035】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３８のヌクレオチド配列、または配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0036】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号３９のヌクレオチド配列、または配列番号３９に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0037】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４０のヌクレオチド配列、または配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0038】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４１のヌクレオチド配列、または配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0039】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４２のヌクレオチド配列、または配列番号４２に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0040】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４３のヌクレオチド配列、または配列番号４３に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0041】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４４のヌクレオチド配列、または配列番号４４に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0042】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４５のヌクレオチド配列、または配列番号４５に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0043】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位のヌクレオチド配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列、または配列番号４６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0044】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位に結合する及び／または標的部位に相補性であるオリゴヌクレオチドは、ＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは、配列番号１に示されているエクソン２３、配列番号２に示されているエクソン２４、配列番号３に示されているエクソン２５、配列番号４に示されているエクソン２６、配列番号５に示されているエクソン２７、配列番号６に示されているエクソン２８、配列番号７に示されているエクソン２９、配列番号８に示されているエクソン３０、配列番号９に示されているエクソン３１、配列番号１０に示されているエクソン３２、及び配列番号１１に示されているエクソン３３から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または、配列番号１～配列番号１１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0045】
本開示のいくつかの実施形態では、エクソンは、配列番号１に示されているエクソン２３、配列番号２に示されているエクソン２４、配列番号３に示されているエクソン２５、配列番号４に示されているエクソン２６、配列番号５に示されているエクソン２７、配列番号６に示されているエクソン２８、配列番号７に示されているエクソン２９、配列番号８に示されているエクソン３０、配列番号９に示されているエクソン３１、配列番号１０に示されているエクソン３２、及び配列番号１１に示されているエクソン３３から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または、配列番号１～配列番号１１のいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0046】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号１に示されているエクソン２３から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0047】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号２に示されているエクソン２４から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0048】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号３に示されているエクソン２５から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0049】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号４に示されているエクソン２６から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0050】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号５に示されているエクソン２７から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0051】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号６に示されているエクソン２８から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0052】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号７に示されているエクソン２９から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0053】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号８に示されているエクソン３０から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0054】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号９に示されているエクソン３１から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0055】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号１０に示されているエクソン３２から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0056】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンのエクソンスキッピングを引き起こし、その際、当該エクソンは配列番号１１に示されているエクソン３３から成るヌクレオチド配列を含む、またはそれから成る。
【0057】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０～３０の間のヌクレオチド長、例えば１０～１３のヌクレオチド、例えば１０～１６のヌクレオチド、例えば１０～１９のヌクレオチド、例えば１０～２２のヌクレオチド、例えば１０～２３のヌクレオチド、例えば１０～２６のヌクレオチド、例えば１０～２９のヌクレオチド、例えば１０～３０のヌクレオチドである。
【0058】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド長、例えば、少なくとも１２ヌクレオチド長、及び／または少なくとも１４ヌクレオチド長、及び／または少なくとも１６ヌクレオチド長及び／または少なくとも１８ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２０ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２２ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２４ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２６ヌクレオチド長、及び／または少なくとも２８ヌクレオチド長、及び／または少なくとも３０ヌクレオチド長である。
【0059】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは２１ヌクレオチド長である。
【0060】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４０～６０％、例えば、４５～５５％のＧＣ含量を有する。
【0061】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエート（ＰＳ）を含む骨格を含む。
【0062】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはさらに、少なくとも１つのヌクレオチド位置、または各ヌクレオチド位置に修飾を含む。
【0063】
本開示のいくつかの実施形態では、修飾は、核酸骨格、核酸塩基、リボース糖及び／または２’－リボース置換の修飾である。
【0064】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾を含む。
【0065】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルリボース修飾を含む。
【0066】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は３’スプライス部位境界、５’スプライス部位境界、及び／またはエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位にある。
【0067】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0068】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号１２に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１２に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0069】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号１３に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１３に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0070】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号１４に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１４に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0071】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号１５に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１５に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0072】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２０に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２０に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0073】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２１に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２１に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0074】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２２に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２２に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0075】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２３に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２３に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0076】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２８に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２８に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0077】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号２９に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２９に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0078】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３０に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３０に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0079】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３１に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３１に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0080】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３６に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0081】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３７に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３７に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0082】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３８に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３８に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0083】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号３９に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３９に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0084】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４０に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0085】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４１に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0086】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４２に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４２に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0087】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４３に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４３に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0088】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４４に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４４に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0089】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４５に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４５に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0090】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位は配列番号４６に示されているヌクレオチド配列、または配列番号４６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0091】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号３５から成る群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0092】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号１６に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0093】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号１７に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１７に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0094】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号１８に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１８に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0095】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号１９に示されているヌクレオチド配列、または配列番号１９に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0096】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号２４に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２４に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0097】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号２５に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２５に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0098】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号２６に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２６に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0099】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号２７に示されているヌクレオチド配列、または配列番号２７に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0100】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号３２に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３２に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0101】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号３３に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３３に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0102】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号３４に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３４に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0103】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号３５に示されているヌクレオチド配列、または配列番号３５に対して少なくとも８０％の配列同一性もしくは相同性、例えば、それに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性もしくは相同性を有するヌクレオチド配列から成る、またはそれを含む。
【0104】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、高ストリンジェント溶液ハイブリッド形成条件下で標的部位と特異的にハイブリッド形成する。
【0105】
本開示のいくつかの実施形態では、標的部位への結合の際、オリゴヌクレオチドはスプライシング因子が結合するのを防止する。
【0106】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは部分またはナノ粒子配合物にコンジュゲートされる。
【0107】
本開示のいくつかの実施形態では、部分は細胞標的化部分及び／または細胞透過部分である。
【0108】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはトリアンテナリーＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び／またはペプチドにコンジュゲートされる。
【0109】
本開示のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは５’スプライス部位、３’スプライス部位及び／またはエクソンスプライスエンハンサー部位（ＥＳＥ）を標的とする。
【0110】
前記オリゴヌクレオチドがさらに、前記オリゴヌクレオチドの一方または双方の末端に、少なくとも１つの追加のヌクレオチド、少なくとも２つの追加のヌクレオチド、少なくとも３つの追加のヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【0111】
さらなる態様では、本開示は前記オリゴヌクレオチドを含む組成物を対象とする。
【0112】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。
【0113】
本開示のいくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。
【0114】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は前記オリゴヌクレオチドの１以上を含む。
【0115】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１７に示されているＡＳＯを含む。
【0116】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１８に示されているＡＳＯを含む。
【0117】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0118】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１７及び配列番号１８に示されているＡＳＯを含む。
【0119】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１７及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0120】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0121】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１７及び配列番号１８に示されているＡＳＯを含む。
【0122】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0123】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0124】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯを含む。
【0125】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２５に示されているＡＳＯを含む。
【0126】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２６に示されているＡＳＯを含む。
【0127】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0128】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２５及び配列番号２６に示されているＡＳＯを含む。
【0129】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２５及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0130】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0131】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２５及び配列番号２６に示されているＡＳＯを含む。
【0132】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0133】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２５及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0134】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号２４及び配列番号２５及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯを含む。
【0135】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３３に示されているＡＳＯを含む。
【0136】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３４に示されているＡＳＯを含む。
【0137】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0138】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３３及び配列番号３４に示されているＡＳＯを含む。
【0139】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３３及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0140】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0141】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３３及び配列番号３４に示されているＡＳＯを含む。
【0142】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0143】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３３及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0144】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号３２及び配列番号３３及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯを含む。
【0145】
さらなる態様では、本開示は医薬で使用するための前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または前記組成物を対象とする。
【0146】
さらなる態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害の予防、治療及び／または緩和に使用するための前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または前記組成物を対象とする。
【0147】
当業者は、本明細書に開示されている発明が、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインにて病的突然変異を保有するＡＤ患者にてＡＤを防止する及び／またはＡＤを治療する及び／またはＡＤの症状を緩和するのに使用され得ることを理解するであろう。ＡＤは構造的レベルで脳に影響を及ぼす破壊的疾患である。したがって、初期段階で、例えば、症状の発症前、またはＡＤ初期段階で、または実質的な構造的脳リモデリングの前に、病的に変異したＣＲドメインのＡＳＯが介在するエクソンスキッピングを提供することが有益であってもよい。例えば、本明細書に記載されているアプローチは、疾患発生前のＡＤ患者の家族の治療に適用可能であろう。
【0148】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯまたは本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物は、ＡＤ症状の発症前に個人に投与される。
【0149】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯまたは本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物は、ＡＤ症状の発症前に個人に投与される。
【0150】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯ、または本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物は、家族がＡＤと診断されたときに個人に投与される。
【0151】
あるいは、本明細書に開示されている発明は早期症状がある患者を治療するのに適用可能であろう。
【0152】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯまたは本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物は早期ＡＤ症状がある個人に投与される。
【0153】
あるいは、本明細書に開示されている発明はＡＤの種々の疾患段階における患者の治療に適用可能であろう。
【0154】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯまたは本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物は種々の程度のＡＤ症状がある個人に投与される。
【0155】
さらに、本明細書に開示されている発明は、生理的ＳＯＲＬＡ機能を回復させるというその性質から、ＡＤの後期段階の患者の治療に適用可能であろう。
【0156】
本開示のいくつかの実施形態では、本発明の１以上のＡＳＯまたは本発明の１以上のＡＳＯを含む組成物はＡＤ後期段階である患者に投与される。
【0157】
本開示のいくつかの実施形態では、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは眼、脊髄、脳脊髄液、脳及び／または肝臓に投与される。
【0158】
本開示のいくつかの実施形態では、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個人の近親者がアルツハイマー病と診断された場合に、前記個人に投与される。
【0159】
本開示のいくつかの実施形態では、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個人の近親者がアルツハイマー病に今罹患している、またはアルツハイマー病にずっと罹患していることが判明した場合に、前記個人に投与される。
【0160】
例えば、ある個人の近親者がＡＤに罹患していることは、前記近親者が臨床医によって診断されたときに判明してもよい。あるいは、例えば、前記個人の近親者がアルツハイマー病に今罹患している、またはずっと罹患していることは、家族の記録または思い出のような他の供給源から情報を得ることによって判明してもよい。
【0161】
ある個人の近親者は個人の家族の一員として理解されてもよい。
【0162】
ある個人の近親者は前記個人と遺伝物質を共有している人として理解されてもよい。
【0163】
例えば、個人の近親者は曾祖母である。
例えば、個人の近親者は曾祖父である。
例えば、個人の近親者は祖母である。
例えば、個人の近親者は祖父である。
例えば、個人の近親者は母である。
例えば、個人の近親者は父である。
例えば、個人の近親者は曾祖父である。
例えば、個人の近親者は祖母である。
例えば、個人の近親者は祖父である。
例えば、個人の近親者は母である。
例えば、個人の近親者は父である。
【0164】
例えば、個人の近親者は同胞である。
例えば、個人の近親者は兄弟である。
例えば、個人の近親者は娘である。
例えば、個人の近親者は息子である。
例えば、個人の近親者は兄弟である。
例えば、個人の近親者は娘である。
例えば、個人の近親者は息子である。
【0165】
本開示のいくつかの実施形態では、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個人の家族の１人以上がアルツハイマー病に罹患していることが証明された時点で、前記個人に投与される。
【0166】
本開示のいくつかの実施形態では、有効量のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、個人の家族の１人以上がアルツハイマー病に罹患していることが証明された時点で、前記個人に投与される。
【0167】
当業者は、ＡＤを発症するリスクの遺伝的素因を理解するであろう。当業者は、ＡＤを発症するリスクがある個人に、例えば、ＡＤと診断された人の近親者である場合にリスクを有する個人に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することは、例えば、疾患の発症前にＡＤを予防する可能性、またはＡＤの症状を軽減する可能性を提供することを理解するであろう。
【0168】
さらなる態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害を治療するための薬物の製造における、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは前記組成物の使用を対象とする。
【0169】
さらなる態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病に関連する疾患もしくは障害を治療するための薬物の調製のための前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を対象とする。
【0170】
さらなる態様では、本開示は、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及び／または前記組成物を使用して細胞、組織または臓器におけるＳＯＲＬ１転写物にてエクソンスキッピングに介在する方法を対象とするものであり、その際、エクソンは、ＳＯＲＬ１のエクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２及びエクソン３３から成る群から選択される。
【0171】
本開示のいくつかの実施形態では、１つのＡＳＯが前記方法に使用される。
【0172】
本開示のいくつかの実施形態では、２つ以上のＡＳＯ、例えば２つのＡＳＯ、例えば３つのＡＳＯ、例えば４つのＡＳＯ、例えば５つのＡＳＯ、例えば６つのＡＳＯが前記方法にて使用される。
【0173】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１６及び配列番号１７に示されているＡＳＯである。
【0174】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１６及び配列番号１８に示されているＡＳＯである。
【0175】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１６及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0176】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１７及び配列番号１８に示されているＡＳＯである。
【0177】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１７及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0178】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0179】
本開示のいくつかの実施形態では、組成物は配列番号１６及び配列番号１７及び配列番号１８に示されているＡＳＯを含む。
【0180】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１６及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0181】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0182】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号１６及び配列番号１７及び配列番号１８及び配列番号１９に示されているＡＳＯである。
【0183】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２５に示されているＡＳＯである。
【0184】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２６に示されているＡＳＯである。
【0185】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0186】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２５及び配列番号２６に示されているＡＳＯである。
【0187】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２５及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0188】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0189】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２５及び配列番号２６に示されているＡＳＯである。
【0190】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0191】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２５及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0192】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号２４及び配列番号２５及び配列番号２６及び配列番号２７に示されているＡＳＯである。
【0193】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３３に示されているＡＳＯである。
【0194】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３４に示されているＡＳＯである。
【0195】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0196】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３３及び配列番号３４に示されているＡＳＯである。
【0197】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３３及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0198】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0199】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３３及び配列番号３４に示されているＡＳＯである。
【0200】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0201】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３３及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0202】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法に使用されるＡＳＯは配列番号３２及び配列番号３３及び配列番号３４及び配列番号３５に示されているＡＳＯである。
【0203】
本開示のいくつかの実施形態では、１つのエクソンのエクソンスキッピングには前記方法が介在する。
【0204】
本開示のいくつかの実施形態では、１を超えるエクソン、例えば２つのエクソン、例えば３つのエクソン、例えば４つのエクソンのエクソンスキッピングには前記方法が介在する。
【0205】
代わりのさらなる態様では、本開示は、対象にてＡＳＯが介在するＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングの効率を判定する方法を対象とするものであり、当該方法は以下の工程：
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる、患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｂ）ＡＳＯによる治療後に得られる、ａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する。
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる、患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｂ）ＡＳＯによる治療後に得られる、ａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する。
【0206】
代わりの態様では、本開示は、対象にてＡＳＯが介在するＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングの効率を判定する方法を対象とするものであり、当該方法は以下の工程：
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる、患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｂ）ＡＳＯによる治療後に得られる、ａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程と、
ｄ）ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する工程とを含む。
ａ）ＡＳＯによる治療の前に得られる、患者由来の脳脊髄液を含む第１の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｂ）ＡＳＯによる治療後に得られる、ａ）と同じ患者由来の脳脊髄液を含む第２の試料にて排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と
ｃ）ａ）及びｂ）の試料における排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程と、
ｄ）ｂ）における排出ＳＯＲＬＡのレベルがａ）よりも高ければエクソンスキッピングと判定する工程とを含む。
【0207】
当業者は、本明細書に開示されている実施例にも記載されているように、排出ＳＯＲＬＡのレベルが、細胞内で生理的に処理されるので生理的プロセスに従って排出され得る機能的なＳＯＲＬＡの指標として使用されてもよいことを理解するであろう。例えば、１以上のＣＲドメインにおける突然変異のせいで誤って折り畳まれている機能的ではないＳＯＲＬＡは生理的に処理されず、排出されない、または排出の程度が低くなる。例えば、本明細書に開示されているＡＳＯを使用するエクソンスキッピング法によって機能性が回復すると、変異したエクソンをそのように除去し、ＳＯＲＬＡのプロセシング及び排出が回復する。
【0208】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法は任意で、ＡＳＯによる治療後のいくつかの時点で試料ｂ）を得る工程を含むので、ＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングの効率を経時的にモニターすることを含む。
【0209】
さらなる態様では、本開示は、ＳＯＲＬ１突然変異があると特定された患者がＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングによる治療から利益を得るかどうかを調べる方法を対象とするものであり、当該方法は以下の工程：
ａ）ＳＯＲＬ１のエクソン２３～３３のいずれか１つにて突然変異を特定する工程と、
ｂ）当該患者にて特定されたＳＯＲＬ１突然変異を細胞株に導入する工程と
ｃ）特定された突然変異を保有するエクソンを標的とする１以上のＡＳＯを選択する工程と
ｄ）選択された１以上のＡＳＯを含む培地と細胞の第１のアリコートを接触させ、ＡＳＯを含まない培地と細胞の第２のアリコートを接触させる工程と、
ｅ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｆ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、第１のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルが第２のアリコートよりも高ければ、患者が１以上のＡＳＯによる治療から利益を得ると判定する。
ａ）ＳＯＲＬ１のエクソン２３～３３のいずれか１つにて突然変異を特定する工程と、
ｂ）当該患者にて特定されたＳＯＲＬ１突然変異を細胞株に導入する工程と
ｃ）特定された突然変異を保有するエクソンを標的とする１以上のＡＳＯを選択する工程と
ｄ）選択された１以上のＡＳＯを含む培地と細胞の第１のアリコートを接触させ、ＡＳＯを含まない培地と細胞の第２のアリコートを接触させる工程と、
ｅ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを分析する工程と、
ｆ）第１のアリコート及び第２のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルを比較する工程とを含み、
それによって、第１のアリコートにおける排出ＳＯＲＬＡのレベルが第２のアリコートよりも高ければ、患者が１以上のＡＳＯによる治療から利益を得ると判定する。
【0210】
本開示のいくつかの実施形態では、前記方法は試験管内の方法である。
【0211】
さらなる態様では、本開示は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の治療に好適なＡＳＯを生成する方法を対象とするものであり、その際、患者はＳＯＲＬＡの相補体型反復（ＣＲ）ドメインをコードするエクソンにて突然変異を保有し、当該方法は以下の工程：
ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のＡＳＯを特定する、例えば、コンピューターによって特定する工程と、
ｂ）ＡＳＯの標的部位が突然変異を含むかどうか、またはＡＳＯの標的サイズが突然変異を含まないかどうかを決定する工程とを含み、
それによって、突然変異を含まない標的部位に結合するＡＳＯがＡＤ患者の治療に好適であると判定する。
ａ）請求項１～２１のいずれか１項に記載のＡＳＯを特定する、例えば、コンピューターによって特定する工程と、
ｂ）ＡＳＯの標的部位が突然変異を含むかどうか、またはＡＳＯの標的サイズが突然変異を含まないかどうかを決定する工程とを含み、
それによって、突然変異を含まない標的部位に結合するＡＳＯがＡＤ患者の治療に好適であると判定する。
【0212】
当業者は、ＡＳＯ標的部位における突然変異がＡＳＯの効果的な結合を損なう場合があることを理解するであろう。
【0213】
本開示のいくつかの実施形態では、前記突然変異は、カルシウムケージ突然変異または奇数システイン突然変異である。
【0214】
本開示のいくつかの実施形態では、前記突然変異はヒトＳＯＲＬ１の１０８０位におけるアルギニンからシステインへの置換（Ｒ１０８０Ｃ）である、または当該突然変異はヒトＳＯＲＬ１の１１０５位におけるアスパラギン酸からヒスチジンへの置換（Ｃ１１０５Ｈ）である。
【実施例】
【0215】
実施例１：ＳＯＲＬ１特異的エクソンスキッピングＡＳＯの開発
目的
概念実証を提供するために、我々はＳＯＲＬ１のエクソン２３、ＳＯＲＬ１のエクソン２７及びＳＯＲＬ１のエクソン３３のエクソンスキッピングを誘導する、または誘導する候補である個々のＡＳＯを特定した。
目的
概念実証を提供するために、我々はＳＯＲＬ１のエクソン２３、ＳＯＲＬ１のエクソン２７及びＳＯＲＬ１のエクソン３３のエクソンスキッピングを誘導する、または誘導する候補である個々のＡＳＯを特定した。
【0216】
背景：
ヒトＳＯＲＬＡポリペプチドは、ＶＰＳ１０ｐドメイン、ＥＧＦドメインと連結されたＹＷＴＤ－ｂ－プロペラドメイン、１１のＣＲドメイン、６の３Ｆｎドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部ドメインを含む多数のタンパク質ドメインに折り畳まれる２２１４のアミノ酸を含有する（図１）。ＣＲドメインはエクソン２３～３３によってコードされている。ＣＲドメイン配列は、３つのドメイン内ジスルフィドを形成する６つの厳密に保存されたシステインを含む約４０のアミノ酸を含有する（図２Ａ及びＢ）。また、酸性側鎖を持つ４つの残基も保存され、それらはカルシウムイオンの８面体配位で機能する。図２ＣはＳＯＲＬＡの１１のＣＲドメイン配列の配列比較を示し、ドメイン境界はそれらの個々のエクソン構造（すなわち、エクソン２３～３３）に従う。
ヒトＳＯＲＬＡポリペプチドは、ＶＰＳ１０ｐドメイン、ＥＧＦドメインと連結されたＹＷＴＤ－ｂ－プロペラドメイン、１１のＣＲドメイン、６の３Ｆｎドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部ドメインを含む多数のタンパク質ドメインに折り畳まれる２２１４のアミノ酸を含有する（図１）。ＣＲドメインはエクソン２３～３３によってコードされている。ＣＲドメイン配列は、３つのドメイン内ジスルフィドを形成する６つの厳密に保存されたシステインを含む約４０のアミノ酸を含有する（図２Ａ及びＢ）。また、酸性側鎖を持つ４つの残基も保存され、それらはカルシウムイオンの８面体配位で機能する。図２ＣはＳＯＲＬＡの１１のＣＲドメイン配列の配列比較を示し、ドメイン境界はそれらの個々のエクソン構造（すなわち、エクソン２３～３３）に従う。
【0217】
図３はアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をエクソンスキッピングにてどのように使用することができるかを示す概略図である。１１のＣＲドメインのそれぞれはそれ自体のエクソン（エクソン２３～３３）によってコードされている。これらのエクソンのそれぞれは３ヌクレオチドの倍数を含有するので、エクソンのスキッピングは下流のエクソンのリーディングフレームに影響を与えない。したがって、３’スプライス部位、５’スプライス部位及び／または１以上のエクソンのスプライスエンハンサー部位（ＥＳＥ）を標的とする個々のエクソンに対するＡＳＯを使用して、本明細書でエクソン２３によって例示されるように、ＳＯＲＬ１転写物から変異したエクソンを除去することによってアルツハイマー病を治療することができる。
【0218】
興味深いことに、アルツハイマー病患者由来のＳＯＲＬ１変異型はＳＯＲＬ１遺伝子全体に広がっており、したがって、すべての変異型の２５％超が１１のＣＲドメインをコードするゲノム領域に位置する（Ｈｏｌｓｔｅｇｅ，２０２０）。
【0219】
我々は最近、ＣＲドメイン配列におけるＯＮＣ（奇数システイン）変異型及びＣＣ（カルシウムケージ）変異型の分布を分析した（データは示さない）。最近公開されたエクソーム配列決定データのＡＤ患者にて特定されたＳＯＲＬ１変異型を、ＡＤ患者及び非認知症対照からマッピングした。１１のＣＲドメインはそれぞれ、ＡＤ患者由来の突然変異を抱いている
【0220】
図４はＡＳＯ処理及びＳＯＲＬＡ活性へのその後の効果の根拠を示す。図４Ａは正常なタンパク質機能及びエンドソームプロセシングをもたらす野生型（ＷＴ）ＳＯＲＬ１の遺伝子発現を説明している。野生型対立遺伝子から発現されるＳＯＲＬＡは、１１のＣＲドメイン（１１×）を有し、エンドソームでのカーゴ再利用にて機能する。図４Ｂは野生型対立遺伝子からの翻訳生成物にも影響を及ぼす可能性がある受容体の誤った折り畳み及びＥＲ保持につながるＯＮＣ型またはＣＣ型のＡＤ変異（黒色のＣＲドメインとして示される）がある対立遺伝子から発現されたＳＯＲＬＡを示す。結果として、変異したＳＯＲＬＡは、正常なエンドソームでのプロセシングを受けることができず、ＡＰＰのアミロイド形成性プロセシングを妨げることができないのでＡＤにつながる。図４Ｃは、１０の機能的なＣＲドメイン（１０×）を含有し、且つ完全長ＳＯＲＬＡタンパク質と区別できない機能、すなわち、正常なタンパク質機能及びエンドソームでのプロセシングの機能を有する、エクソンスキッピングＡＳＯで処理した疾患対立遺伝子由来のＳＯＲＬＡを説明している。その結果、ＡＤ症状が軽減し、理想的にはＡＤが治癒するであろう。
【0221】
エクソン２３、エクソン２７またはエクソン３３を標的とするＡＳＯ候補の特定
材料及び方法：
エクソン２３、２７及び３３における予測されたＥＳＥ（エクソンスプライスエンハンサー）エレメントに基づいて、我々はエクソン２３（以下に記載されているＡＳＯ２３．１、２３．２、２３．３、２３．４）、エクソン２７（ＡＳＯ２７．１、２７．２、２７．３、２７．４）及びエクソン３３（以下に記載されているＡＳＯ ３３．１、３３．２、３３．３、３３．４）を標的とするＡＳＯ候補を特定した。第１セットの実験では、これらの分子が初期細胞実験に好適であり、細胞培養実験でこれらの分子を調べているので、我々は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）リボース修飾を持つ標準骨格ホスホロチオエート（ＰＳ）ＡＳＯ（ＡＳＯ ２３．１、２３．２、２３．３、２３．４）を購入した。エクソン２７及び３３を標的とするＡＳＯ候補も購入し、追跡実験で調べる。
材料及び方法：
エクソン２３、２７及び３３における予測されたＥＳＥ（エクソンスプライスエンハンサー）エレメントに基づいて、我々はエクソン２３（以下に記載されているＡＳＯ２３．１、２３．２、２３．３、２３．４）、エクソン２７（ＡＳＯ２７．１、２７．２、２７．３、２７．４）及びエクソン３３（以下に記載されているＡＳＯ ３３．１、３３．２、３３．３、３３．４）を標的とするＡＳＯ候補を特定した。第１セットの実験では、これらの分子が初期細胞実験に好適であり、細胞培養実験でこれらの分子を調べているので、我々は２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）リボース修飾を持つ標準骨格ホスホロチオエート（ＰＳ）ＡＳＯ（ＡＳＯ ２３．１、２３．２、２３．３、２３．４）を購入した。エクソン２７及び３３を標的とするＡＳＯ候補も購入し、追跡実験で調べる。
【0222】
スキッピング効率を向上させるために、我々は、最適な配列を系統的に定義し、さまざまな骨格及びリボースの化学の影響を調査し、追加の実験にて、エクソンスキッピングに最も大きな効果があるＥＳＥを標的とするＡＳＯを選択する一次評価からの結果に基づいて、一連の新しいＡＳＯを設計するであろう。
【0223】
リボースの化学的性質について、我々は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾に対する効果を調べる予定である。特に、我々は、ホスホロジアミデートモルホリンオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びロック核酸（ＬＮＡ）を含む修飾された骨格化学を有するＡＳＯを調べるであろう（Ｄｈｕｒｉ ２０２０に概説されている）。
【0224】
結果：
我々は、オンラインツールＳｐｌｉｃｅＡｉｄ（Ｐｉｖａ ２００９）を使用して、（予測された）強力なエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を特定するためにコンピューターによる分析を行った。ＳＯＲＬＡのＣＲドメイン（４０の位置のうちの１４の位置が１１のＣＲドメインにて保存されたアミノ酸を含有する）間での高い配列類似性のため、我々は３’ｓｓの境界を標的とする配列を優先することを決定した。３’ｓｓでの転写物を標的とすることのさらなる利点は、ＡＳＯはカルシウムケージに影響を及ぼす疾患変異型を含有するエクソンを標的とすることができるはずなので、最適な状況ではＡＳＯ配列の一部ではなく、疾患対立遺伝子にとってミスマッチとなる、カルシウムケージの一部である残基をコードする配列までの距離である。さらなる実験では、他の選択肢、例えば、エクソン２３～３３のいずれか１つに関する３’スプライス部位（３’ｓｓ）境界、５’スプライス部位（５’ｓｓ）境界、及び／または１以上のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位を標的とする他の選択肢が探索されるであろう。
我々は、オンラインツールＳｐｌｉｃｅＡｉｄ（Ｐｉｖａ ２００９）を使用して、（予測された）強力なエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を特定するためにコンピューターによる分析を行った。ＳＯＲＬＡのＣＲドメイン（４０の位置のうちの１４の位置が１１のＣＲドメインにて保存されたアミノ酸を含有する）間での高い配列類似性のため、我々は３’ｓｓの境界を標的とする配列を優先することを決定した。３’ｓｓでの転写物を標的とすることのさらなる利点は、ＡＳＯはカルシウムケージに影響を及ぼす疾患変異型を含有するエクソンを標的とすることができるはずなので、最適な状況ではＡＳＯ配列の一部ではなく、疾患対立遺伝子にとってミスマッチとなる、カルシウムケージの一部である残基をコードする配列までの距離である。さらなる実験では、他の選択肢、例えば、エクソン２３～３３のいずれか１つに関する３’スプライス部位（３’ｓｓ）境界、５’スプライス部位（５’ｓｓ）境界、及び／または１以上のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）部位を標的とする他の選択肢が探索されるであろう。
【0225】
３つのエクソン２３，２７及び３３のそれぞれについて、我々はスプライシング増強配列の存在を予測する最も高い正のスコア（負のスコアは、スプライシング抑制配列を予測する）を持つＥＳＥを標的とする合計４つの配列を選択した：（図５及び表１～３に概説されているようにＡＳＯ２３．１、ＡＳＯ２３．２、ＡＳＯ２３．３、ＡＳＯ２３．４（Ｅｘ２３については図５Ａ，Ｄを参照のこと）、ＡＳＯ２７．１、ＡＳＯ２７．２、ＡＳＯ２７．３、ＡＳＯ２７．４（Ｅｘ２７については図５Ｂ、Ｅを参照のこと）、ならびにＡＳＯ３３．１、ＡＳＯ３３．２、ＡＳＯ３３．３、及びＡＳＯ３３．４（Ｅｘ３３は図５Ｃ、Ｆを参照のこと）。
図５Ｄ～Ｆでは、灰色のさまざまな色合いのバーはスプライス因子の結合部位を示す。ＡＳＯがこれらの部位を標的とする場合、ＡＳＯは標的配列へのスプライス因子のアクセスを遮断し、その結果、スプライシングが阻害され、エクソンがスキッピングされるので、エクソンスキッピングを誘導する可能性が高い。
図５Ｄ～Ｆでは、灰色のさまざまな色合いのバーはスプライス因子の結合部位を示す。ＡＳＯがこれらの部位を標的とする場合、ＡＳＯは標的配列へのスプライス因子のアクセスを遮断し、その結果、スプライシングが阻害され、エクソンがスキッピングされるので、エクソンスキッピングを誘導する可能性が高い。
【0226】
【表1】
【0227】
以下の配列（５’－３’、センス鎖）はエクソン２３（大文字）と、５’及び３’隣接イントロン配列（小文字）とを示す：
ｔｃｃｃｃｔｇｃｃｇｃａｃｔｃｔｇａｔｇｇｇｔａｇＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＴＣＧＣＡＡＣＣＡＧＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＧＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＣＣｇｔｇａｇｔｃｔｔｃｔｇｇａｔｔｇｇａｃｇｔｔａａ
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【0228】
エクソン２３を含むそれぞれの（部分的な）前駆体ｍＲＮＡ転写物は（下線部：ＡＳＯ２３.１－ＡＳＯ２３.４の標的部位）である：
ｕｃｃｃｃｕｇｃｃｇｃａｃｕｃｕｇａｕｇｇｇｕａｇＡＧＡＡＣＡＣＣＵＧＵＣＵＵＣＧＣＡＡＣＣＡＧＵＡＵＣＧＣＵＧＣＡＧＣＡＡＣＧＧＧＡＡＣＵＧＵＡＵＣＡＡＣＡＧＣＡＵＵＵＧＧＵＧＧＵＧＵＧＡＣＵＵＵＧＡＣＡＡＣＧＡＣＵＧＵＧＧＡＧＡＣＡＵＧＡＧＣＧＡＵＧＡＧＡＧＡＡＡＣＵＧＣＣｇｕｇａｇｕｃｕｕｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｇｕｕａａ
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【0229】
【表2】
【0230】
以下の配列（５’－３’、センス鎖）はエクソン２７（大文字）と、５’及び３’の隣接イントロン配列（小文字）とを示す：
ｔｃｔｇｔｇｔｔｇｔｔｇａａｔｔｃｔａｔｔｔｃａｇＡＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＧＡＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧｇｔｇａｇｔｔｃａｔｔｃｃｔｔｇｃｃｃｃｃａｇｇａ
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【0231】
エクソン２７を含むそれぞれの（部分的な）前駆体ｍＲＮＡ転写物は（下線部：ＡＳＯ２７．１－ＡＳＯ２７．４の標的部位）である：
ｕｃｕｇｕｇｕｕｇｕｕｇａａｕｕｃｕａｕｕｕｃａｇＡＧＡＡＧＡＡＧＵＧＣＡＡＵＧＧＡＵＵＣＣＧＣＵＧＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＡＣＵＵＧＣＡＵＣＣＣＡＵＣＣＡＧＣＡＡＡＣＡＵＵＧＵＧＡＵＧＧＵＣＵＧＣＧＵＧＡＵＵＧＣＵＣＵＧＡＵＧＧＣＵＣＣＧＡＵＧＡＡＣＡＧＣＡＣＵＧＣＧｇｕｇａｇｕｕｃａｕｕｃｃｕｕｇｃｃｃｃｃａｇｇａ
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【0232】
【表3】
【0233】
以下の配列（５’－３’、センス鎖）はエクソン３３（大文字）と、５’及び３’の隣接イントロン配列（小文字）とを示す：
ｃｔｔａａｇａａｇｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｔｔｔｃａｇＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＴＴＧＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＴＧＡＡＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＴＧｇｔｇａｇｔｇｃｃｇｇｔｃｃａｃｇｇｇｃｔｇｇｇｃ
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【0234】
エクソン３３を含むそれぞれの（部分的な）前駆体ｍＲＮＡ転写物は（下線部：ＡＳＯ３３．１－ＡＳＯ３３．４の標的部位）である：
ｃｕｕａａｇａａｇｃｃｕｃｕｃｕｇｕｇｕｕｕｃａｇＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＣＣＵＵＧＡＣＵＵＧＣＡＵＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＵＵＣＣＡＧＵＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＧＧＡＧＧＣＣＵＧＣＡＵＵＧＵＧＣＵＣＵＣＧＧＡＧＣＧＣＵＧＣＧＡＣＧＧＣＵＵＣＣＵＧＧＡＣＵＧＣＵＣＧＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＡＵＧＡＡＡＡＧＧＣＣＵＧＣＡＧＵＧｇｕｇａｇｕｇｃｃｇｇｕｃｃａｃｇｇｇｃｕｇｇｇｃ
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【0235】
意図したエクソンスキッピングに対する効果を評価するために、我々は、標的とされるエクソンにまたがるプライマーのセットを設計して、さまざまなＡＳＯの漸増量（２０、５０、１００及び２００ナノモル）で形質移入した細胞にてＳＯＲＬ１転写物を増幅できるようにした。エクソンのスキッピングは、エクソン２３、２７及び３３のそれぞれについて、それぞれ１１４ｂｐ、１０８ｂｐまたは１３２ｂｐ未満のさらに小さなサイズのアンプリコンをもたらす。
【0236】
ＡＳＯの親和性、特異性、効率、安定性及び耐性は単量体及び骨格の内部の構造の化学修飾により増加させることができる。したがって、最終的な一連の実験では、我々は、エクソンスキッピングに対する効果を増大させるように意図した多数の化学修飾を伴う最も効果的なＡＳＯ配列を使用して実験を繰り返す。また、可能であればエクソン特異性を失うことなく、我々は、長さ（１８塩基長まで短く、または２５塩基長まで長く）、ＧＣ含量（４５～５５％を目指す）、ＲＮＡ二次構造（最適融点を目指す）、多量体よりも好ましい二量体構造の予測など、配列の最適化を行うであろう。
【0237】
さらに、表４は、この実施例に記載されているＡＳＯ及び手順を使用してエクソン２３～２４のいずれか１つを標的とするのに使用することができるイントロン／エクソン境界及び３’スプライスアクセプターまたは５’スプライスドナーの部位を示す。下線を引いたヌクレオチドはエクソンを表し、下線を引いていないヌクレオチドは隣接するイントロンの一部を表す。太字ヌクレオチドは、イントロンとエクソンとの間の境界、すなわちイントロン（ａｇ／ｇｔ）の末端のヌクレオチドを表す。
【表4】
【0238】
ＡＳＯが介在するエクソンスキッピング
材料及び方法：
標準的な形質移入試薬、例えば、リポフェクタミンを使用して、野生型のＳＯＲＬ１遺伝子型を持つヒトリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）にＡＳＯで形質移入する。形質移入してから２４時間後または４８時間後のいずれかで細胞を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ単離キットを使用して全ＲＮＡを抽出する。鋳型としての全ＲＮＡとともに１段階のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴを使用して転写物を増幅する。エクソン２３のスキッピングを評価するために、Ｅｘ２０ｆｗ（ｆｗ＝順行）及びＥｘ２６ｒｅｖ（ｒｅｖ＝逆行）のプライマーならびに標準的なＰＣＲ条件を使用してＳＯＲＬ１転写物を増幅する。エクソン２７のスキッピングを評価するために、Ｅｘ２４ｆｗ及びＥｘ３０ｒｅｖのプライマー対を使用してＳＯＲＬ１の転写物を増幅し、エクソン３３のスキッピングを評価するために、Ｅｘ３０ｆｗ及びＥｘ３６ｒｅｖのプライマーを使用してＳＯＲＬ１の転写物を増幅する。ＰＣＲアンプリコンは、トリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液中の２％アガロースゲルにて分画する。相対的なエクソンスキッピング効率は、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用する画像の濃度測定分析を介して推定する。
材料及び方法：
標準的な形質移入試薬、例えば、リポフェクタミンを使用して、野生型のＳＯＲＬ１遺伝子型を持つヒトリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）にＡＳＯで形質移入する。形質移入してから２４時間後または４８時間後のいずれかで細胞を回収し、ＲＮＡｅａｓｙ単離キットを使用して全ＲＮＡを抽出する。鋳型としての全ＲＮＡとともに１段階のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴを使用して転写物を増幅する。エクソン２３のスキッピングを評価するために、Ｅｘ２０ｆｗ（ｆｗ＝順行）及びＥｘ２６ｒｅｖ（ｒｅｖ＝逆行）のプライマーならびに標準的なＰＣＲ条件を使用してＳＯＲＬ１転写物を増幅する。エクソン２７のスキッピングを評価するために、Ｅｘ２４ｆｗ及びＥｘ３０ｒｅｖのプライマー対を使用してＳＯＲＬ１の転写物を増幅し、エクソン３３のスキッピングを評価するために、Ｅｘ３０ｆｗ及びＥｘ３６ｒｅｖのプライマーを使用してＳＯＲＬ１の転写物を増幅する。ＰＣＲアンプリコンは、トリス－酢酸－ＥＤＴＡ緩衝液中の２％アガロースゲルにて分画する。相対的なエクソンスキッピング効率は、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用する画像の濃度測定分析を介して推定する。
【0239】
別の実験では、ヒトＨＥＫ２９３細胞にＡＳＯで形質移入し、形質移入の２４時間後に、細胞及び培地を回収する。別の実験では、形質移入にｉＰＳＣ由来のニューロンを使用し、上記に記載されているようにＲＴ－ＰＣＲを行う。
【0240】
エクソン２３を標的とする上記に記載されているＡＳＯ候補の場合、エクソンスキッピングは試験管内で調べた。ＡＳＯ処理のために、４ウェルディッシュ上に１ウェルあたり１×１０５細胞の密度でＨＥＫ細胞を播種した。翌日、製造業者のプロトコールに従って無血清培地にて希釈したオリゴフェクタミン形質移入試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ，＃１２２５５０１１）を使用して、エクソン２３スプライシングを標的とするＡＳＯによって最終濃度２５０ｎＭで細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後に細胞を回収し、その後、製造業者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ抽出を行い、次いでｃＤＮＡキットに対するＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，＃４３８７４０６）によってｃＤＮＡを調製した。以下のプライマー：順行，５’－ＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＧＴ－３’（配列番号４７）；逆行：５’－ＣＧＧＣＡＣＴＧＧＴＧＣＡＴＴＴＣＡＣ－３’（配列番号４８）を使用してＲＴ－ＰＣＲによってエクソン２３のスキッピングを検証した。
【0241】
結果：
ＨＥＫ２９３細胞の形質移入、内在性ＳＯＲＬ１ ｍＲＮＡの回収によって、ＳＯＲＬ１のエクソン２３のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）エレメントに対して向けられた４つのＡＳＯ（ＡＳＯ２３．１、ＡＳＯ２３．２、ＡＳＯ２３．４及び２３．４）を調べ、且つエクソン２３の周りの領域にまたがるプライマー対を使用したＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、独立した２つの独立した実験からのデータを示す（図６、上図及び下図）。双方の実験では、我々は、鋳型としてのエクソン２３欠失断片をコードするプラスミド（ｐΔＥｘ２３、対照として使用したエクソン２３を欠いている組換え生成された変異型）を使用して生成した生成物と同一に移動するさらに短いＰＣＲ産物（矢印参照）の存在によって実証されているように、ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３がエクソン２３のスキッピングを誘導する明確な証拠を観察した。ｐＦＬは含まれたエクソン２３を有する断片に相当するＰＣＲ産物を特定するのに対照鋳型として役立った。同様にさらに短いＰＣＲ産物のかすかなバンドも見られるので、潜在的に、ＡＳＯ２３．１及びＡＳＯ２３．４も特定のエクソンスキッピング効率を有する。
ＨＥＫ２９３細胞の形質移入、内在性ＳＯＲＬ１ ｍＲＮＡの回収によって、ＳＯＲＬ１のエクソン２３のエクソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）エレメントに対して向けられた４つのＡＳＯ（ＡＳＯ２３．１、ＡＳＯ２３．２、ＡＳＯ２３．４及び２３．４）を調べ、且つエクソン２３の周りの領域にまたがるプライマー対を使用したＲＴ－ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、独立した２つの独立した実験からのデータを示す（図６、上図及び下図）。双方の実験では、我々は、鋳型としてのエクソン２３欠失断片をコードするプラスミド（ｐΔＥｘ２３、対照として使用したエクソン２３を欠いている組換え生成された変異型）を使用して生成した生成物と同一に移動するさらに短いＰＣＲ産物（矢印参照）の存在によって実証されているように、ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３がエクソン２３のスキッピングを誘導する明確な証拠を観察した。ｐＦＬは含まれたエクソン２３を有する断片に相当するＰＣＲ産物を特定するのに対照鋳型として役立った。同様にさらに短いＰＣＲ産物のかすかなバンドも見られるので、潜在的に、ＡＳＯ２３．１及びＡＳＯ２３．４も特定のエクソンスキッピング効率を有する。
【0242】
結論：
我々の結果は、我々の候補ＡＳＯの少なくとも２つによるエクソン２３のスキッピングによって例示されているように、ＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングを達成できることを示している。我々はさらに、ヒトＳＯＲＬ１転写物のエクソン２７またはエクソン３３、ならびにＣＲドメインをコードする他のエクソンのスキッピングを誘導することができるＡＳＯを特定するであろう。このアプローチは、エクソン２３～３３のいずれか１つまたはいくつかを標的にして取り除くのに使用することができる。
我々の結果は、我々の候補ＡＳＯの少なくとも２つによるエクソン２３のスキッピングによって例示されているように、ＡＳＯ介在性のエクソンスキッピングを達成できることを示している。我々はさらに、ヒトＳＯＲＬ１転写物のエクソン２７またはエクソン３３、ならびにＣＲドメインをコードする他のエクソンのスキッピングを誘導することができるＡＳＯを特定するであろう。このアプローチは、エクソン２３～３３のいずれか１つまたはいくつかを標的にして取り除くのに使用することができる。
【0243】
実施例２：修飾されたＳＯＲＬＡタンパク質（１以上のＣＲドメインを欠く）の保持された機能性
目的
目的は、ＣＲドメイン１（取り除かれたエクソン２３に相当）によって例示されるＣＲドメインがＳＯＲＬＡにとって不要であるかどうかを決定することである。
目的
目的は、ＣＲドメイン１（取り除かれたエクソン２３に相当）によって例示されるＣＲドメインがＳＯＲＬＡにとって不要であるかどうかを決定することである。
【0244】
材料及び方法：
完全長ＳＯＲＬ１のための特定のプライマー及び発現構築物を使用して、エクソン２３の欠失につながる断片をＰＣＲによって生成した。これらの断片をギブソンアセンブリを使用して結合させた。
完全長のＳＯＲＬＡタンパク質またはエクソン２３欠失ＳＯＲＬＡタンパク質のいずれかをコードするプラスミドによってＮ２ａ細胞に形質移入した。形質移入細胞由来の溶解物及び調整培地のウェスタンブロットを記載されているように行った。ＨＥＫ細胞における特徴的な二重バンドとは対照的に、Ｎ２Ａ細胞にてＳＯＲＬＡはウェスタンブロットにて約２５０ｋＤａの１つのバンドとして示されることに留意のこと。
完全長ＳＯＲＬ１のための特定のプライマー及び発現構築物を使用して、エクソン２３の欠失につながる断片をＰＣＲによって生成した。これらの断片をギブソンアセンブリを使用して結合させた。
完全長のＳＯＲＬＡタンパク質またはエクソン２３欠失ＳＯＲＬＡタンパク質のいずれかをコードするプラスミドによってＮ２ａ細胞に形質移入した。形質移入細胞由来の溶解物及び調整培地のウェスタンブロットを記載されているように行った。ＨＥＫ細胞における特徴的な二重バンドとは対照的に、Ｎ２Ａ細胞にてＳＯＲＬＡはウェスタンブロットにて約２５０ｋＤａの１つのバンドとして示されることに留意のこと。
【0245】
ＳＯＲＬ１のｃＤＮＡ構築物の生成
ＳＯＲＬ１のｃＤＮＡにおける個々のエクソンの欠失は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏベクターにてＳＯＲＬ１－ｗｔ ｃＤＮＡを鋳型として使用して、ギブソンアセンブリ技術によって実施した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。特定のプライマーセット（表５）と共にハーキュラーゼＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してベクター及びＳＯＲＬ１断片を増幅した。ＰＣＲ産物を先ずＤｐｎｌ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、メチル化ＤＮＡ鋳型を除去し、続いてＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃２８１０４）を使用して精製した。ギブソンアセンブリキット（ＮＥＢ、＃５５１０Ｓ）を使用して精製断片を連結し、製造業者のプロトコール（ＮＥＢ、＃Ｃ２９８７１）に従って連結産物によってＮＥＢ ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。各プラスミドにおけるエクソンの正しい欠失はサンガー配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって検証した。
ＳＯＲＬ１のｃＤＮＡにおける個々のエクソンの欠失は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｚｅｏベクターにてＳＯＲＬ１－ｗｔ ｃＤＮＡを鋳型として使用して、ギブソンアセンブリ技術によって実施した（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。特定のプライマーセット（表５）と共にハーキュラーゼＩＩ融合ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してベクター及びＳＯＲＬ１断片を増幅した。ＰＣＲ産物を先ずＤｐｎｌ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、メチル化ＤＮＡ鋳型を除去し、続いてＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、＃２８１０４）を使用して精製した。ギブソンアセンブリキット（ＮＥＢ、＃５５１０Ｓ）を使用して精製断片を連結し、製造業者のプロトコール（ＮＥＢ、＃Ｃ２９８７１）に従って連結産物によってＮＥＢ ５αコンピテントＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。各プラスミドにおけるエクソンの正しい欠失はサンガー配列決定（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって検証した。
【表5】
【0246】
ＳＯＲＬ１エクソン欠失構築物による細胞の形質移入
ＡＰＰプロセシング及びＳＯＲＬＡ排出の分析については、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンで補完したＤＭＥＭにてＮ２ａ細胞を培養し、形質移入の前日にウェルあたり５×１０５細胞を６ウェルプレートに播種した。次に、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＦｕｇｅｎｅ ＨＤ形質移入試薬を使用して、ＡＰＰをコードするｍｙｃフラグ付き構築物及びＳＯＲＬ１－ｗｔ構築物またはエクソン欠失構築物のいずれかで細胞に一時的に同時形質移入した。４８時間の回復後、培養培地を条件付き無血清培地に交換し、さらに４８時間後、溶解物及び培地の回収を行った。
ＡＰＰプロセシング及びＳＯＲＬＡ排出の分析については、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンで補完したＤＭＥＭにてＮ２ａ細胞を培養し、形質移入の前日にウェルあたり５×１０５細胞を６ウェルプレートに播種した。次に、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＦｕｇｅｎｅ ＨＤ形質移入試薬を使用して、ＡＰＰをコードするｍｙｃフラグ付き構築物及びＳＯＲＬ１－ｗｔ構築物またはエクソン欠失構築物のいずれかで細胞に一時的に同時形質移入した。４８時間の回復後、培養培地を条件付き無血清培地に交換し、さらに４８時間後、溶解物及び培地の回収を行った。
【0247】
ウェスタンブロット
Ｎ２ａ形質移入細胞の溶解物及び培地からの等量のタンパク質をＮｕｐａｇｅ４～１２％のビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＮＰ０３２１ＢＯＸ）に負荷し、ｉＢｌｏｔ２ゲル移動装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロース膜に移した。以下の一次抗体、抗ｍｙｃ（１：１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＡＰＰ（ＷＯ２，１：１０００，Ｓｉｇｍａ，ＭＡＢＮ１０）、ＬＲ１１（１：５００，ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｓｏｌＳＯＲＬＡ（１：１０００，ＩｇＧ５３８７，Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）、及び抗アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ、Ａ２０６６）によって４℃にて一晩、膜を探索した。翌日、膜を洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体（抗マウス、抗ウサギ；１：１５００、）と共に室温で１時間インキュベートした。ｉＢｒｉｇｈｔ画像解析システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質を検出した。
Ｎ２ａ形質移入細胞の溶解物及び培地からの等量のタンパク質をＮｕｐａｇｅ４～１２％のビストリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃ＮＰ０３２１ＢＯＸ）に負荷し、ｉＢｌｏｔ２ゲル移動装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してニトロセルロース膜に移した。以下の一次抗体、抗ｍｙｃ（１：１０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＡＰＰ（ＷＯ２，１：１０００，Ｓｉｇｍａ，ＭＡＢＮ１０）、ＬＲ１１（１：５００，ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、抗ｓｏｌＳＯＲＬＡ（１：１０００，ＩｇＧ５３８７，Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）、及び抗アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ、Ａ２０６６）によって４℃にて一晩、膜を探索した。翌日、膜を洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体（抗マウス、抗ウサギ；１：１５００、）と共に室温で１時間インキュベートした。ｉＢｒｉｇｈｔ画像解析システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ最大感度基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質を検出した。
【0248】
結果：
我々は、ＳＯＲＬＡのＣＲクラスターの第１のＣＲドメインをコードするエクソン２３を欠失したヒトＳＯＲＬＡをコードするｃＤＮＡを調製した。形質移入した細胞は溶解物にて区別できない発現レベルを示した（図７Ａ、左パネル）。細胞表面から培地に排出されたＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）の量は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔまたはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３で形質移入した細胞では区別できなかったが（図７Ａ、右パネル）、その結果、エクソン２３に対応するＣＲドメインを欠いたＳＯＲＬＡ変異型は、ｗｔ ＳＯＲＬＡと同様の輸送及び成熟を受けると思われ、機能性である。このことは、ＳＯＲＬＡがエンドソームへの輸送及び成熟を受けるためには、それぞれのリガンドと相互作用する必要があるという事実に起因する。エクソン２３に対応するＣＲドメインを欠く排出ＳＯＲＬＡは完全長ＳＯＲＬＡと同程度のレベルで検出され得るので、この相互作用は機能性であると思われる。
我々は、ＳＯＲＬＡのＣＲクラスターの第１のＣＲドメインをコードするエクソン２３を欠失したヒトＳＯＲＬＡをコードするｃＤＮＡを調製した。形質移入した細胞は溶解物にて区別できない発現レベルを示した（図７Ａ、左パネル）。細胞表面から培地に排出されたＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）の量は、ＳＯＲＬＡ－ｗｔまたはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３で形質移入した細胞では区別できなかったが（図７Ａ、右パネル）、その結果、エクソン２３に対応するＣＲドメインを欠いたＳＯＲＬＡ変異型は、ｗｔ ＳＯＲＬＡと同様の輸送及び成熟を受けると思われ、機能性である。このことは、ＳＯＲＬＡがエンドソームへの輸送及び成熟を受けるためには、それぞれのリガンドと相互作用する必要があるという事実に起因する。エクソン２３に対応するＣＲドメインを欠く排出ＳＯＲＬＡは完全長ＳＯＲＬＡと同程度のレベルで検出され得るので、この相互作用は機能性であると思われる。
【0249】
結論：
我々は、その第１のＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡが、野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で細胞内にて発現され、且つ選別されることができると結論付けている。
我々は、その第１のＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡが、野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で細胞内にて発現され、且つ選別されることができると結論付けている。
【0250】
実施例３：同じＣＲドメインに位置する病原性ＳＯＲＬ１変異型に対応する変異タンパク質と比べて１つのＣＲドメイン（スキッピングされたエクソン２３に対応）を欠いたＳＯＲＬＡタンパク質の保持された機能性
目的：
目的は、最もＮ末端のＣＲドメインによって例示されているＣＲ欠失タンパク質またはＳＯＲＬＡに対するＣＲ変異タンパク質の活性を比較することである。
目的：
目的は、最もＮ末端のＣＲドメインによって例示されているＣＲ欠失タンパク質またはＳＯＲＬＡに対するＣＲ変異タンパク質の活性を比較することである。
【0251】
材料及び方法：
完全長ＳＯＲＬＡ、変異Ｄ１１０５Ｈがある完全長ＳＯＲＬＡ、変異Ｒ１０８０Ｃがある完全長ＳＯＲＬＡ、またはＣＲ１が欠失した（エクソン２３によりコードされた配列の除去により）ＳＯＲＬＡのいずれかをコードするプラスミドでＮ２ａ細胞に形質移入した。市販の抗体ＬＲ１１（抗ＳＯＲＬＡ抗体、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ２５００９７９）によって、形質移入細胞からの溶解物及び調整培地のウエスタンブロット分析を行った。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
完全長ＳＯＲＬＡ、変異Ｄ１１０５Ｈがある完全長ＳＯＲＬＡ、変異Ｒ１０８０Ｃがある完全長ＳＯＲＬＡ、またはＣＲ１が欠失した（エクソン２３によりコードされた配列の除去により）ＳＯＲＬＡのいずれかをコードするプラスミドでＮ２ａ細胞に形質移入した。市販の抗体ＬＲ１１（抗ＳＯＲＬＡ抗体、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ２５００９７９）によって、形質移入細胞からの溶解物及び調整培地のウエスタンブロット分析を行った。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
【0252】
結果：
我々は、ＳＯＲＬＡのＣＲクラスターの第１のＣＲドメインをコードするエクソン２３を欠失したヒトＳＯＲＬＡをコードするｃＤＮＡを調製した。標準的な部位特異的変異誘発を使用して、我々は、変異型Ｄ１１０５ＨまたはＲ１０８０Ｃに対応する変異型構築物を調製した。変異型Ｒ１０８０Ｃは奇数のシステインを有し、病原性があると見なされる特定された変異型の群に相当する。変異型Ｄ１１０５Ｈは、ＣＲドメインにてＡｓｘターンを形成するのに重要な残基に影響を及ぼすだけでなく、カルシウムケージに影響を及ぼす変異型と同程度に、強く病原性であると考えられる。
我々は、ＳＯＲＬＡのＣＲクラスターの第１のＣＲドメインをコードするエクソン２３を欠失したヒトＳＯＲＬＡをコードするｃＤＮＡを調製した。標準的な部位特異的変異誘発を使用して、我々は、変異型Ｄ１１０５ＨまたはＲ１０８０Ｃに対応する変異型構築物を調製した。変異型Ｒ１０８０Ｃは奇数のシステインを有し、病原性があると見なされる特定された変異型の群に相当する。変異型Ｄ１１０５Ｈは、ＣＲドメインにてＡｓｘターンを形成するのに重要な残基に影響を及ぼすだけでなく、カルシウムケージに影響を及ぼす変異型と同程度に、強く病原性であると考えられる。
【0253】
形質移入した細胞は溶解物にて区別できない発現レベルを示した（図７Ｂ、左パネル）。ＳＯＲＬＡ－ｗｔまたはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３で形質移入した細胞では、細胞表面から培地へ排出されたＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）の量は区別できなかったのに対して、病原性ＳＯＲＬ１変異型（ここでは、変異Ｄ１１０５Ｈ及びＲ１０８０Ｃによって表されている）を発現する細胞ではそれは大きく減少した（図７Ｂ、下パネル）。
【0254】
結論：
我々は、ＣＲ１（エクソン２３）にて病原性変異型を持つＳＯＲＬＡが強く低減された排出、したがって強く低減されたｓＳＯＲＬＡの生成を示すのに対して、その第１のＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡは野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で排出されると結論付けている。
我々は、ＣＲ１（エクソン２３）にて病原性変異型を持つＳＯＲＬＡが強く低減された排出、したがって強く低減されたｓＳＯＲＬＡの生成を示すのに対して、その第１のＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡは野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で排出されると結論付けている。
【0255】
我々はさらに、病原性ＳＯＲＬ１変異型を発現する細胞ではｓＳＯＲＬＡの産生が損なわれており、ｓＳＯＲＬＡをモニターすることはＡＳＯ誘導性のエクソンスキッピングの効率を評価するのに非常に効率的な方法であると結論付けている。変異したエクソンに相当するＣＲドメインを欠くＳＯＲＬＡ変異型のみが排出されるようになる一方で、ＣＲドメイン変異がある完全長ＳＯＲＬＡはＥＲに保持される可能性が高く、エンドソームでのプロセシングを受けることができないので、このことはさらに、ＳＯＲＬ１変異型を是正するようにＡＳＯで治療された患者は、その脳脊髄液（ＣＳＦ）でのｓＳＯＲＬＡの増加を伴うことを意味する。このデータは、ＳＯＲＬ１関連ＡＤを治すための本明細書に開示されているエクソンスキッピング戦略を支持している。
【0256】
実施例４：エクソン２３のＡＳＯ介在性エクソンスキッピングのＡＤ治療効果についての適応
目的：
目的は、エクソン２３によってコードされたＣＲドメインを欠失するＳＯＲＬＡが、ＡＰＰを（エンドソーム）プロセシングから保護することができることを実証することである。
目的：
目的は、エクソン２３によってコードされたＣＲドメインを欠失するＳＯＲＬＡが、ＡＰＰを（エンドソーム）プロセシングから保護することができることを実証することである。
【0257】
材料及び方法
ＡＰＰ単独（対照）で、またはＳＯＲＬＡ－ｗｔ（完全長）もしくはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３（ｃＤＮＡクローニング戦略によるエクソン２３の欠失）のいずれかと組み合わせたＡＰＰでＮ２ａ細胞に形質移入した。ＡＰＰ、ＳＯＲＬＡもしくはアクチン（溶解物試料中）、または排出されたＡＰＰα（ｓＡＰＰα）もしくはＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）（培地試料中）に対する抗体を使用したウェスタンブロットによって細胞からの溶解物及び調整培地を分析した。使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
ＡＰＰ単独（対照）で、またはＳＯＲＬＡ－ｗｔ（完全長）もしくはＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３（ｃＤＮＡクローニング戦略によるエクソン２３の欠失）のいずれかと組み合わせたＡＰＰでＮ２ａ細胞に形質移入した。ＡＰＰ、ＳＯＲＬＡもしくはアクチン（溶解物試料中）、または排出されたＡＰＰα（ｓＡＰＰα）もしくはＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）（培地試料中）に対する抗体を使用したウェスタンブロットによって細胞からの溶解物及び調整培地を分析した。使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
【0258】
結果：
実験１：この設定では、Ｎ２ａ細胞は内在性ＳＯＲＬＡを全く発現しない、または無視できる量で発現する、すなわち、ウェスタンブロットでは、内在性ＳＯＲＬＡは外因性ＳＯＲＬＡ（形質移入による過剰発現）と比べて検出することができない。ＳＯＲＬＡの細胞外ドメイン（５３８７）またはＡＰＰ（細胞形態については抗ｍｙｃまたは排出ｓＡＰＰａについてはＷＯ２）についての抗体を使用して、形質移入された細胞からの溶解物（データは示されていない）及び調整培地をウェスタンブロットによって分析した。
外因性ＳＯＲＬＡの過剰発現がない細胞（対照）は培地にてｓＡＰＰについて強いシグナルを示す。対照的に、完全長ＳＯＲＬＡまたはエクソン２３の欠失があるＳＯＲＬＡ構築物のいずれかを使用して形質移入した細胞由来の培地はｓＡＰＰのレベルが大幅に低下したことを示す（図８Ａ）。
実験１：この設定では、Ｎ２ａ細胞は内在性ＳＯＲＬＡを全く発現しない、または無視できる量で発現する、すなわち、ウェスタンブロットでは、内在性ＳＯＲＬＡは外因性ＳＯＲＬＡ（形質移入による過剰発現）と比べて検出することができない。ＳＯＲＬＡの細胞外ドメイン（５３８７）またはＡＰＰ（細胞形態については抗ｍｙｃまたは排出ｓＡＰＰａについてはＷＯ２）についての抗体を使用して、形質移入された細胞からの溶解物（データは示されていない）及び調整培地をウェスタンブロットによって分析した。
外因性ＳＯＲＬＡの過剰発現がない細胞（対照）は培地にてｓＡＰＰについて強いシグナルを示す。対照的に、完全長ＳＯＲＬＡまたはエクソン２３の欠失があるＳＯＲＬＡ構築物のいずれかを使用して形質移入した細胞由来の培地はｓＡＰＰのレベルが大幅に低下したことを示す（図８Ａ）。
【0259】
実験２：
再び我々は、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ２３との間で類似していること観察したということは、ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）の欠失は受容体生物学に対して観察可能な影響を有しないことを示している。
我々はまた、２つのＳＯＲＬＡ変異型（完全長及びＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３）タンパク質が、ＡＰＰタンパク質分解を減少させることによってｓＡＰＰαの生成を低下させることに対して区別できない効果を有することも再び観察した（図８、Ｂ～Ｃ）。
３回の独立した反復からのブロットを定量し、外来性ＳＯＲＬＡを含まない細胞に対する相対的なレベルの２つ組試料の平均値としてデータを提示した（図８Ｄ）。この定量はさらに、ＳＯＲＬＡのΔＥｘ２３が排出ＡＰＰａ（ｓＡＰＰａ）を低減するのにＷＴと同等に有効であることを示している。
再び我々は、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ２３との間で類似していること観察したということは、ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）の欠失は受容体生物学に対して観察可能な影響を有しないことを示している。
我々はまた、２つのＳＯＲＬＡ変異型（完全長及びＳＯＲＬＡ－デルタ－エクソン２３）タンパク質が、ＡＰＰタンパク質分解を減少させることによってｓＡＰＰαの生成を低下させることに対して区別できない効果を有することも再び観察した（図８、Ｂ～Ｃ）。
３回の独立した反復からのブロットを定量し、外来性ＳＯＲＬＡを含まない細胞に対する相対的なレベルの２つ組試料の平均値としてデータを提示した（図８Ｄ）。この定量はさらに、ＳＯＲＬＡのΔＥｘ２３が排出ＡＰＰａ（ｓＡＰＰａ）を低減するのにＷＴと同等に有効であることを示している。
【0260】
結論：
ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）を欠失したＳＯＲＬＡは完全長ＳＯＲＬＡ受容体と同様にＡＰＰプロセシングを抑制するのに有効である。このことは、変異したエクソン２３のスキッピングを誘導するためのＡＳＯによるＣＲ１の標的化欠失が機能性の受容体につながることを実証している。
ＣＲ１（エクソン２３によりコードされた）を欠失したＳＯＲＬＡは完全長ＳＯＲＬＡ受容体と同様にＡＰＰプロセシングを抑制するのに有効である。このことは、変異したエクソン２３のスキッピングを誘導するためのＡＳＯによるＣＲ１の標的化欠失が機能性の受容体につながることを実証している。
【0261】
実施例５：ＣＲドメイン１１を欠く修飾されたＳＯＲＬＡタンパク質の保持された機能性
目的
目的は、ＣＲドメイン１１（取り除かれたエクソン３３に相当）によって例示されるＣＲドメインがＳＯＲＬＡにとって不要であるかどうかを決定することである。
目的
目的は、ＣＲドメイン１１（取り除かれたエクソン３３に相当）によって例示されるＣＲドメインがＳＯＲＬＡにとって不要であるかどうかを決定することである。
【0262】
材料及び方法：
ＳＯＲＬ１－ＷＴまたはＳＯＲＬ１－ΔＥｘ３３のいずれかの構築物でＮ２ａ細胞に形質移入し、ＳＯＲＬＡまたはアクチン（溶解物試料中の）または排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）（培地試料中の）に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって細胞由来の溶解物及び調整培地を分析した。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
ＳＯＲＬ１－ＷＴまたはＳＯＲＬ１－ΔＥｘ３３のいずれかの構築物でＮ２ａ細胞に形質移入し、ＳＯＲＬＡまたはアクチン（溶解物試料中の）または排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）（培地試料中の）に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって細胞由来の溶解物及び調整培地を分析した。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
【0263】
結果：
我々は、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ３３との間で類似していることが観察されたということは、ＣＲ１１（エクソン３３によりコード）の欠失がＳＯＲＬＡ受容体の生物学に観察可能な影響を与えないこと、すなわち、ＣＲ１１を欠いているＳＯＲＬＡさえも処理されて、ＳＯＲＬＡ－ＷＴと同様のように排出されることを観察した（図９；培地試料）。
我々は、排出ＳＯＲＬＡ（ｓＳＯＲＬＡ）のレベルがＳＯＲＬＡ－ＷＴとＳＯＲＬＡ－ΔＥｘ３３との間で類似していることが観察されたということは、ＣＲ１１（エクソン３３によりコード）の欠失がＳＯＲＬＡ受容体の生物学に観察可能な影響を与えないこと、すなわち、ＣＲ１１を欠いているＳＯＲＬＡさえも処理されて、ＳＯＲＬＡ－ＷＴと同様のように排出されることを観察した（図９；培地試料）。
【0264】
結論：
我々は、ＣＲドメイン１１を欠失したＳＯＲＬＡが野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で細胞内にて発現され、且つ選別されることができると結論付けている。我々のデータは、本明細書にてＣＲ１１によって例示されている、病的突然変異を含み得る特定のＣＲドメインの欠失がＳＯＲＬＡのプロセシング及び機能を損なっておらず、したがって、それぞれのＣＲドメインのエクソンスキッピングは実現可能な治療戦略であることを示している。
我々は、ＣＲドメイン１１を欠失したＳＯＲＬＡが野生型ＳＯＲＬＡと区別できない方法で細胞内にて発現され、且つ選別されることができると結論付けている。我々のデータは、本明細書にてＣＲ１１によって例示されている、病的突然変異を含み得る特定のＣＲドメインの欠失がＳＯＲＬＡのプロセシング及び機能を損なっておらず、したがって、それぞれのＣＲドメインのエクソンスキッピングは実現可能な治療戦略であることを示している。
【0265】
実施例６：さらなるＣＲドメインエクソンへの技術拡張
目的：
我々は、どのＳＯＲＬ１のエクソンがＡＳＯ誘導性のエクソンスキッピング治療戦略に好適であるかを決定することを望んだ。
目的：
我々は、どのＳＯＲＬ１のエクソンがＡＳＯ誘導性のエクソンスキッピング治療戦略に好適であるかを決定することを望んだ。
【0266】
材料及び方法：
実施例３～５は、ＳＯＲＬＡ機能（例えば、細胞でのプロセシング処理、排出、ＡＰＰプロセシングへの影響）を保持しつつ、特定のＳＯＲＬＡエクソンがスキッピングされてもよいことを示している。我々はさらなるエクソンの欠失を調べ、エクソン２３～３３（組換え産生構築物）の系統的な欠失を行った。単一のＣＲドメイン（ＣＲＦ７＋８のタンデム欠失；ΔＥｘ２９＋３０に含まれていたＣＲ７を除く）を欠失したＳＯＲＬＡをコードするプラスミドを生成した。個々のＣＲドメインについて欠失したＳＯＲＬＡタンパク質、すなわちＣＲ１（ΔＥｘ２３）、ＣＲ２（ΔＥｘ２４）、ＣＲ３（ΔＥｘ２５）、ＣＲ４（ΔＥｘ２６）、ＣＲ５（ΔＥｘ２７）、ＣＲ６（ΔＥｘ２８）、ＣＲ７＋８（ΔＥｘ２９＋３０）、ＣＲ８（ΔＥｘ３０）、ＣＲ９（ΔＥ３１）、ＣＲ１０（ΔＥ３２）またはＣＲ１１（ΔＥ３３）を生成するように操作した構築物でＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入の７２時間後に回収した細胞から溶解物を調製し、２６レーンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＮｕＰＡＧＥシステムによってタンパク質を分離し、ＳＯＲＬＡの細胞外断片（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）に対して産生させたウサギ由来のポリクローナルＳＯＲＬＡ血清によるウェスタンブロット分析によって分析した。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
実施例３～５は、ＳＯＲＬＡ機能（例えば、細胞でのプロセシング処理、排出、ＡＰＰプロセシングへの影響）を保持しつつ、特定のＳＯＲＬＡエクソンがスキッピングされてもよいことを示している。我々はさらなるエクソンの欠失を調べ、エクソン２３～３３（組換え産生構築物）の系統的な欠失を行った。単一のＣＲドメイン（ＣＲＦ７＋８のタンデム欠失；ΔＥｘ２９＋３０に含まれていたＣＲ７を除く）を欠失したＳＯＲＬＡをコードするプラスミドを生成した。個々のＣＲドメインについて欠失したＳＯＲＬＡタンパク質、すなわちＣＲ１（ΔＥｘ２３）、ＣＲ２（ΔＥｘ２４）、ＣＲ３（ΔＥｘ２５）、ＣＲ４（ΔＥｘ２６）、ＣＲ５（ΔＥｘ２７）、ＣＲ６（ΔＥｘ２８）、ＣＲ７＋８（ΔＥｘ２９＋３０）、ＣＲ８（ΔＥｘ３０）、ＣＲ９（ΔＥ３１）、ＣＲ１０（ΔＥ３２）またはＣＲ１１（ΔＥ３３）を生成するように操作した構築物でＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入の７２時間後に回収した細胞から溶解物を調製し、２６レーンのＳＤＳ－ＰＡＧＥ ＮｕＰＡＧＥシステムによってタンパク質を分離し、ＳＯＲＬＡの細胞外断片（ｓｏｌ－ＳＯＲＬＡ）に対して産生させたウサギ由来のポリクローナルＳＯＲＬＡ血清によるウェスタンブロット分析によって分析した。
使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
【0267】
結果：
図１０のウエスタンブロットは、ＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１～１１に対応する各エクソン２３～３３それぞれの系統的な欠失の結果を示している。ＳＯＲＬＡのブロットは、ＨＥＫ細胞でＳＯＲＬＡを発現させると二重バンドを示すことが知られており、上部バンド（分子サイズが大きいためゲル中でより遅く流れる）は成熟ＳＯＲＬＡを表し、下部バンド（分子サイズが小さいためゲル中でより速く流れる）。これは、例えば、レーン１及び２における完全長（ＦＬ）ＳＯＲＬＡについて示された二重バンドにて見ることができる。
構築物のそれぞれは、特異的なＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡ受容体の発現をもたらした。興味深いことに、いくつかの欠失は、潜在的に全てのＣＲドメインが、受容体機能を妨害しないで欠失され得るわけではないことを示唆する驚くべき結果を示した、すなわち、ＣＲ４（ΔＥ２６）及びＣＲ９（ΔＥｘ３１）ではＳＯＲＬＡ二重バンドパターンが妨害されている（＊）。我々は追跡実験にてこれをさらに分析するであろう。同様の結果は実験を反復した場合に得られた。エクソン２９の欠失に関する課題は実施例７にて以下で議論されている。エクソン２９をスキッピングすると、エクソン２８とエクソン３０との間の新規のエクソン－エクソンの境界にて意図しない停止コドンが生じる。したがって、エクソン２９における変異型を標的とするには隣接するＣＲドメインの同時欠失が必要になる。
図１０のウエスタンブロットは、ＳＯＲＬＡのＣＲドメイン１～１１に対応する各エクソン２３～３３それぞれの系統的な欠失の結果を示している。ＳＯＲＬＡのブロットは、ＨＥＫ細胞でＳＯＲＬＡを発現させると二重バンドを示すことが知られており、上部バンド（分子サイズが大きいためゲル中でより遅く流れる）は成熟ＳＯＲＬＡを表し、下部バンド（分子サイズが小さいためゲル中でより速く流れる）。これは、例えば、レーン１及び２における完全長（ＦＬ）ＳＯＲＬＡについて示された二重バンドにて見ることができる。
構築物のそれぞれは、特異的なＣＲドメインを欠失したＳＯＲＬＡ受容体の発現をもたらした。興味深いことに、いくつかの欠失は、潜在的に全てのＣＲドメインが、受容体機能を妨害しないで欠失され得るわけではないことを示唆する驚くべき結果を示した、すなわち、ＣＲ４（ΔＥ２６）及びＣＲ９（ΔＥｘ３１）ではＳＯＲＬＡ二重バンドパターンが妨害されている（＊）。我々は追跡実験にてこれをさらに分析するであろう。同様の結果は実験を反復した場合に得られた。エクソン２９の欠失に関する課題は実施例７にて以下で議論されている。エクソン２９をスキッピングすると、エクソン２８とエクソン３０との間の新規のエクソン－エクソンの境界にて意図しない停止コドンが生じる。したがって、エクソン２９における変異型を標的とするには隣接するＣＲドメインの同時欠失が必要になる。
【0268】
結論：
我々は、ＳＯＲＬ１のいくつかのエクソンが、これらのエクソンにおける病原性ＳＯＲＬ１変異型の保有者についてのＡＤに対する本明細書に開示されているＡＳＯ誘導性のエクソンスキッピング療法に好適であると結論付けている。我々の結果はさらに、特定のＣＲドメインが、他のＣＲドメインのように、例えば、エクソンスキッピングを介した欠失にさらに好適である場合があることを示している。
我々は、ＳＯＲＬ１のいくつかのエクソンが、これらのエクソンにおける病原性ＳＯＲＬ１変異型の保有者についてのＡＤに対する本明細書に開示されているＡＳＯ誘導性のエクソンスキッピング療法に好適であると結論付けている。我々の結果はさらに、特定のＣＲドメインが、他のＣＲドメインのように、例えば、エクソンスキッピングを介した欠失にさらに好適である場合があることを示している。
【0269】
実施例７：エクソン２９の欠失の試み：二重欠失ＡＳＯ処理
目的：
エクソン２９をスキッピングすると、エクソン２８とエクソン３０との間の新規のエクソン－エクソンの境界にて意図しない停止コドンが生じる。したがって、エクソン２９における変異型を標的とするには隣接するＣＲドメインの同時欠失が必要になる。
目的：
エクソン２９をスキッピングすると、エクソン２８とエクソン３０との間の新規のエクソン－エクソンの境界にて意図しない停止コドンが生じる。したがって、エクソン２９における変異型を標的とするには隣接するＣＲドメインの同時欠失が必要になる。
【0270】
材料及び方法：
我々は、ＳＯＲＬＡのエクソン２９及び隣接するＣＲドメイン、例えば、エクソン２８またはエクソン３０のエクソンスキッピングを確立する。２つのエクソンを欠失させるには、それぞれエクソン２８及びエクソン２９またはエクソン２９及びエクソン３０の標的部位を標的とする２つのＡＳＯを必要とする。使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
我々は、ＳＯＲＬＡのエクソン２９及び隣接するＣＲドメイン、例えば、エクソン２８またはエクソン３０のエクソンスキッピングを確立する。２つのエクソンを欠失させるには、それぞれエクソン２８及びエクソン２９またはエクソン２９及びエクソン３０の標的部位を標的とする２つのＡＳＯを必要とする。使用した材料及び方法に関するさらなる詳細は実施例２に記載されている。
【0271】
結果：
我々は、エクソン２８＋２９を欠失したＳＯＲＬＡ及びエクソン２９＋３０を欠失したＳＯＲＬＡについてのｃＤＮＡを調製する。
我々は、エクソン２８＋２９を欠失したＳＯＲＬＡ及びエクソン２９＋３０を欠失したＳＯＲＬＡについてのｃＤＮＡを調製する。
【0272】
結論：
１を超えるエクソンのＡＳＯ介在性エクソンスキッピングの実現可能性が示されるであろう。
１を超えるエクソンのＡＳＯ介在性エクソンスキッピングの実現可能性が示されるであろう。
【0273】
実施例８：ＡＳＯレスキュー実験
目的：
我々は、変異したＳＯＲＬ１のエクソン２３／２７／３３を標的とするＡＳＯが処理された対立遺伝子の活性を増大させるという証拠を提供する。
目的：
我々は、変異したＳＯＲＬ１のエクソン２３／２７／３３を標的とするＡＳＯが処理された対立遺伝子の活性を増大させるという証拠を提供する。
【0274】
材料及び方法：
ＥＢＶを使用して患者由来の細胞株（すなわちリンパ芽球）を不死化する。並行して健康な保有者からの対照細胞を得て、並行して不死化する。双方の起源の細胞をＡＳＯで４８時間処理する、または対照のために未処理のままにする。ウェスタンブロット及びＳＯＲＬＡに対する抗体を使用して細胞溶解物及び調整培地を分析する。
ＥＢＶを使用して患者由来の細胞株（すなわちリンパ芽球）を不死化する。並行して健康な保有者からの対照細胞を得て、並行して不死化する。双方の起源の細胞をＡＳＯで４８時間処理する、または対照のために未処理のままにする。ウェスタンブロット及びＳＯＲＬＡに対する抗体を使用して細胞溶解物及び調整培地を分析する。
【0275】
結果：
健康な保有者からの未処理の細胞は、成熟完全長ＳＯＲＬＡと未成熟完全長ＳＯＲＬＡに対応する溶解物における２つの明瞭なバンドを示すのに対して、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインの病原性変異型を持つ患者の未処理の細胞は大部分、未成熟な受容体変異型のみを示す。
ＡＳＯで処理した細胞は双方とも溶解物にて成熟タンパク質についての強いシグナルを示す。培地試料のＷＢ分析は、細胞内成熟ＳＯＲＬＡタンパク質を有する細胞に由来する高レベルのｓＳＯＲＬＡがある同様のパターンを示す。
健康な保有者からの未処理の細胞は、成熟完全長ＳＯＲＬＡと未成熟完全長ＳＯＲＬＡに対応する溶解物における２つの明瞭なバンドを示すのに対して、ＳＯＲＬＡのＣＲドメインの病原性変異型を持つ患者の未処理の細胞は大部分、未成熟な受容体変異型のみを示す。
ＡＳＯで処理した細胞は双方とも溶解物にて成熟タンパク質についての強いシグナルを示す。培地試料のＷＢ分析は、細胞内成熟ＳＯＲＬＡタンパク質を有する細胞に由来する高レベルのｓＳＯＲＬＡがある同様のパターンを示す。
【0276】
結論：
我々は、ＡＳＯが病原性の誤って折り畳まれたＳＯＲＬＡタンパク質（１１のＣＲドメインを持ち、そのうち１つが病的に変異している）の産生を是正することができ、ＡＳＯ処理により、病原性変異型を保有するエクソンのスキッピングがもたらされ、これらの細胞が、溶解物における成熟ＳＯＲＬＡの存在及び培地におけるｓＳＯＲＬＡの存在によって証明されるように機能性タンパク質（変異ＣＲドメインを取り除いた１０のＣＲドメインを持つ）を発現すると結論付けている。
我々は、ＡＳＯが病原性の誤って折り畳まれたＳＯＲＬＡタンパク質（１１のＣＲドメインを持ち、そのうち１つが病的に変異している）の産生を是正することができ、ＡＳＯ処理により、病原性変異型を保有するエクソンのスキッピングがもたらされ、これらの細胞が、溶解物における成熟ＳＯＲＬＡの存在及び培地におけるｓＳＯＲＬＡの存在によって証明されるように機能性タンパク質（変異ＣＲドメインを取り除いた１０のＣＲドメインを持つ）を発現すると結論付けている。
【0277】
実施例９：ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３の最適化
目的：
目的は、例えば、実施例１に記載されている結果に基づいて、ＳＯＲＬ１のエクソン２３を標的とする主力ＡＳＯを最適化することである。
目的：
目的は、例えば、実施例１に記載されている結果に基づいて、ＳＯＲＬ１のエクソン２３を標的とする主力ＡＳＯを最適化することである。
【0278】
材料及び方法：
ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３が、形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を使用する我々の予備試験（実施例１）にてＳＯＲＬ１のエクソン２３の最も効率的な除外を示したという我々の記載された観察に基づいて、我々は、その効率性の最適化を目的としてこれら２つのＡＳＯの新しい変異型を調製する。
先ず、標的配列の５’側と３’側にその時点で１塩基ずつ移動することによって、また、ＡＳＯの長さを伸ばすように試す、もしくは配列を短くするように試すことによって配列を整える。次に、例えば、ホスホロジアミデートモルホリンオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びロック核酸（ＬＮＡ）（Ｄｈｕｒｉ ２０２０ ｅｔ ａｌ．に概説されている）を調べる骨格化学に関して各ＡＳＯを最適化する。
エクソンスキッピング効率を分析するために、ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ）に形質移入し、標準的なＲＮＡ抽出プロトコールを使用して形質移入から４８時間後にＲＮＡを回収する。ｃＤＮＡの調製後、Ｅｘ２３に隣接するエクソンに特異的なプライマーを使用してＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、次いでＥｘ２３の排除が成功した転写物のレベルを定量する。
ＡＳＯ２３．２及びＡＳＯ２３．３が、形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を使用する我々の予備試験（実施例１）にてＳＯＲＬ１のエクソン２３の最も効率的な除外を示したという我々の記載された観察に基づいて、我々は、その効率性の最適化を目的としてこれら２つのＡＳＯの新しい変異型を調製する。
先ず、標的配列の５’側と３’側にその時点で１塩基ずつ移動することによって、また、ＡＳＯの長さを伸ばすように試す、もしくは配列を短くするように試すことによって配列を整える。次に、例えば、ホスホロジアミデートモルホリンオリゴマー（ＰＭＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びロック核酸（ＬＮＡ）（Ｄｈｕｒｉ ２０２０ ｅｔ ａｌ．に概説されている）を調べる骨格化学に関して各ＡＳＯを最適化する。
エクソンスキッピング効率を分析するために、ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３及びＳＨ－ＳＹ５Ｙ）に形質移入し、標準的なＲＮＡ抽出プロトコールを使用して形質移入から４８時間後にＲＮＡを回収する。ｃＤＮＡの調製後、Ｅｘ２３に隣接するエクソンに特異的なプライマーを使用してＲＴ－ＰＣＲ分析を行い、次いでＥｘ２３の排除が成功した転写物のレベルを定量する。
【0279】
結果：
本発明者らは、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３をスキッピングするために、ヒト細胞への適用に最適化された１以上のＡＳＯを特定する。
本発明者らは、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３をスキッピングするために、ヒト細胞への適用に最適化された１以上のＡＳＯを特定する。
【0280】
結論：
特定された１以上のＡＳＯは、臨床的有効性を調べるための試験に使用される。
特定された１以上のＡＳＯは、臨床的有効性を調べるための試験に使用される。
【0281】
実施例１０：ＳＯＲＬ１関連アルツハイマー病（ＳＡＡＤ）細胞モデル（ｉＰＳＣ）の調製
目的：
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３の遺伝子操作した変異型を持つ人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株を生成することを目的とする。
目的：
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３の遺伝子操作した変異型を持つ人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株を生成することを目的とする。
【0282】
材料及び方法：
アルツハイマー病の病理学的特徴であるアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドはメソスケール発見アッセイを使用して決定し、エンドソームサイズはＲａｂ５抗体を適用する免疫細胞化学及びＩｍａｇｅＪプラグインを使用する共焦点画像からのＲａｂ５陽性構造の定量を使用して決定する。
アルツハイマー病の病理学的特徴であるアミロイドベータ（Ａβ）ペプチドはメソスケール発見アッセイを使用して決定し、エンドソームサイズはＲａｂ５抗体を適用する免疫細胞化学及びＩｍａｇｅＪプラグインを使用する共焦点画像からのＲａｂ５陽性構造の定量を使用して決定する。
【0283】
結果：
ＳＯＲＬ１変異型Ｄ１１０５Ｈ及びＲ１０８０Ｃ（例えば、実施例３）を持つＮ２ａ細胞における我々の研究に基づいて、これらが病原性変異型であるという証拠を提供する場合、我々は、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＰＳ－Ｃａｓ９方法論のための標準的なプロトコールに従ってこれらの２つの突然変異を個別に導入する。突然変異の導入は、配列決定と、選択された突然変異タンパク質を発現するクローンとを使用して検証される。各細胞株は、公開された分化プロトコールに従ってヒトニューロンを生成するために使用され、その後、標準的なプロトコールに従ってアミロイドベータ分泌及びエンドソーム膨潤の測定を行うためのアッセイによって「表現型決定」される。
ＳＯＲＬ１変異型Ｄ１１０５Ｈ及びＲ１０８０Ｃ（例えば、実施例３）を持つＮ２ａ細胞における我々の研究に基づいて、これらが病原性変異型であるという証拠を提供する場合、我々は、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＰＳ－Ｃａｓ９方法論のための標準的なプロトコールに従ってこれらの２つの突然変異を個別に導入する。突然変異の導入は、配列決定と、選択された突然変異タンパク質を発現するクローンとを使用して検証される。各細胞株は、公開された分化プロトコールに従ってヒトニューロンを生成するために使用され、その後、標準的なプロトコールに従ってアミロイドベータ分泌及びエンドソーム膨潤の測定を行うためのアッセイによって「表現型決定」される。
【0284】
結論：
我々は、Ｅｘ２３に存在する病原性ＳＯＲＬ１変異型をそれぞれ保有する２つのｉＰＳＣモデルを生成し、Ｒａｂ５陽性エンドソーム構造及びアミロイド前駆体タンパク質のアミロイドベータペプチドへのエンドソームプロセシングに基づいて疾患の表現型を確立する。これらの細胞モデルは有効性実験に使用されるであろう。
我々は、Ｅｘ２３に存在する病原性ＳＯＲＬ１変異型をそれぞれ保有する２つのｉＰＳＣモデルを生成し、Ｒａｂ５陽性エンドソーム構造及びアミロイド前駆体タンパク質のアミロイドベータペプチドへのエンドソームプロセシングに基づいて疾患の表現型を確立する。これらの細胞モデルは有効性実験に使用されるであろう。
【0285】
実施例１１：リンパ芽球疾患モデルの調製
目的：
我々は、ＡＤ患者及びＳＯＲＬ１のＥｘ２３病原性変異型の保有者に由来するリンパ芽球細胞を生成することを目的とする。
目的：
我々は、ＡＤ患者及びＳＯＲＬ１のＥｘ２３病原性変異型の保有者に由来するリンパ芽球細胞を生成することを目的とする。
【0286】
材料及び方法：
ＳＯＲＬＡの成熟は、病原性変異型の保有者に由来する細胞を対照細胞と比較する細胞溶解物のＷＢ分析を使用して決定する。
ＳＯＲＬＡの成熟は、病原性変異型の保有者に由来する細胞を対照細胞と比較する細胞溶解物のＷＢ分析を使用して決定する。
【0287】
結果：
ＳＯＲＬ１の病原性変異型は成熟欠陥タンパク質をもたらす。野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照の個人からのリンパ芽球の溶解物のウェスタンブロット分析は、成熟したＳＯＲＬＡタンパク質と未成熟なＳＯＲＬＡタンパク質との双方を示すのに対して、病原性ＳＯＲＬ１変異型の保有者から単離された細胞の溶解物では、比較的未熟なＳＯＲＬＡタンパク質が多く、成熟したＳＯＲＬＡタンパク質は少ない。
さらに、排出されたｓＳＯＲＬＡ断片を生成する排出は、成熟ＳＯＲＬＡについてのみ生じるので、これらの細胞からの培地中のｓＳＯＲＬＡのレベルは野生型ＳＯＲＬ１ヒト由来の細胞と比較して、ＳＯＲＬ１変異型保有者由来のリンパ芽球からのｓＳＯＲＬＡのレベルが低いことを示す。
ＳＯＲＬ１の病原性変異型は成熟欠陥タンパク質をもたらす。野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照の個人からのリンパ芽球の溶解物のウェスタンブロット分析は、成熟したＳＯＲＬＡタンパク質と未成熟なＳＯＲＬＡタンパク質との双方を示すのに対して、病原性ＳＯＲＬ１変異型の保有者から単離された細胞の溶解物では、比較的未熟なＳＯＲＬＡタンパク質が多く、成熟したＳＯＲＬＡタンパク質は少ない。
さらに、排出されたｓＳＯＲＬＡ断片を生成する排出は、成熟ＳＯＲＬＡについてのみ生じるので、これらの細胞からの培地中のｓＳＯＲＬＡのレベルは野生型ＳＯＲＬ１ヒト由来の細胞と比較して、ＳＯＲＬ１変異型保有者由来のリンパ芽球からのｓＳＯＲＬＡのレベルが低いことを示す。
【0288】
結論：
我々は、Ｅｘ２３で病原性ＳＯＲＬ１変異型を保有する個人からの患者由来リンパ芽球細胞株を生成し、ＳＯＲＬＡの成熟と分泌に基づく疾患表現型を確立する。
我々は、Ｅｘ２３で病原性ＳＯＲＬ１変異型を保有する個人からの患者由来リンパ芽球細胞株を生成し、ＳＯＲＬＡの成熟と分泌に基づく疾患表現型を確立する。
【0289】
実施例１２： ｉＰＳＣ疾患モデルのＡＤ表現型をレスキューするために必要な有効性レベルを確立する
目的：
目的は、細胞性疾患の表現型を元に戻して野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照細胞と区別がつかなくなるようにするのに必要とされるＥｘ２３スキッピングのレベルを決定することである。
目的：
目的は、細胞性疾患の表現型を元に戻して野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照細胞と区別がつかなくなるようにするのに必要とされるＥｘ２３スキッピングのレベルを決定することである。
【0290】
材料及び方法：
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３病原性突然変異を持つｉＰＳＣ細胞及び同系の対照細胞からニューロンを調製し、次いでＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導する我々の主力ＡＳＯ（複数可）で細胞を処理する。我々は、２ｎＭ～５００ｎＭの範囲の濃度を使用する我々のＡＳＯ（複数可）の用量設定を行い、同様に、複数の可変時間経過で処理を実施する。
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３病原性突然変異を持つｉＰＳＣ細胞及び同系の対照細胞からニューロンを調製し、次いでＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導する我々の主力ＡＳＯ（複数可）で細胞を処理する。我々は、２ｎＭ～５００ｎＭの範囲の濃度を使用する我々のＡＳＯ（複数可）の用量設定を行い、同様に、複数の可変時間経過で処理を実施する。
【0291】
結果：
突然変異型ＳＯＲＬ１を持つ細胞では、疾患表現型が徐々にレスキューされ、得られたエクソンスキッピングの程度が最も高い細胞に対して最大の効果が見られる。アミロイドβ分泌のレベル及びＲａｂ５陽性エンドソームのサイズは、疾患表現型のパラメーターとして使用される。エクソンスキッピングの程度は、Ｅｘ２３欠失転写物を検出するｑＰＣＲアッセイを使用して評価されるであろう。
突然変異型ＳＯＲＬ１を持つ細胞では、疾患表現型が徐々にレスキューされ、得られたエクソンスキッピングの程度が最も高い細胞に対して最大の効果が見られる。アミロイドβ分泌のレベル及びＲａｂ５陽性エンドソームのサイズは、疾患表現型のパラメーターとして使用される。エクソンスキッピングの程度は、Ｅｘ２３欠失転写物を検出するｑＰＣＲアッセイを使用して評価されるであろう。
【0292】
結論：
これらの実験から、疾患表現型に対する効果と誘導されたＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングのレベルとを相関させることができるであろう。我々は、変異したＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導するＡＳＯがｉＰＳＣモデルの細胞表現型を非疾患細胞に類似されたものに戻すために必要な有効性を特定する。
これらの実験から、疾患表現型に対する効果と誘導されたＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングのレベルとを相関させることができるであろう。我々は、変異したＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導するＡＳＯがｉＰＳＣモデルの細胞表現型を非疾患細胞に類似されたものに戻すために必要な有効性を特定する。
【0293】
実施例１３：リンパ芽球性疾患モデルのＡＤ表現型をレスキューするのに必要な有効性レベルを確立する
目的：
目的は、細胞性疾患の表現型を元に戻して野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照細胞と区別がつかなくなるようにするのに必要とされるＥｘ２３スキッピングのレベルを決定することである。
目的：
目的は、細胞性疾患の表現型を元に戻して野生型ＳＯＲＬ１を持つ対照細胞と区別がつかなくなるようにするのに必要とされるＥｘ２３スキッピングのレベルを決定することである。
【0294】
材料及び方法：
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導する我々の主力ＡＳＯ（複数可）で（保有者及び非保有者由来の）リンパ芽球細胞を処理する。我々は、２ｎＭ～５００ｎＭの範囲の濃度を使用する我々のＡＳＯ（複数可）の用量設定を行い、同様に、複数の可変時間経過で処理を実施する。突然変異型ＳＯＲＬ１を持つ細胞では、疾患表現型が徐々にレスキューされ、得られたエクソンスキッピングの程度が最も高い細胞に対して最大の効果が見られる。ＳＯＲＬＡ成熟及びｓＳＯＲＬＡ分泌のレベルは疾患表現型のパラメーターとして使用される。エクソンスキッピングの程度は、Ｅｘ２３欠失転写物を検出するｑＰＣＲアッセイを使用して評価されるであろう。
我々は、ＳＯＲＬ１のＥｘ２３のスキッピングを誘導する我々の主力ＡＳＯ（複数可）で（保有者及び非保有者由来の）リンパ芽球細胞を処理する。我々は、２ｎＭ～５００ｎＭの範囲の濃度を使用する我々のＡＳＯ（複数可）の用量設定を行い、同様に、複数の可変時間経過で処理を実施する。突然変異型ＳＯＲＬ１を持つ細胞では、疾患表現型が徐々にレスキューされ、得られたエクソンスキッピングの程度が最も高い細胞に対して最大の効果が見られる。ＳＯＲＬＡ成熟及びｓＳＯＲＬＡ分泌のレベルは疾患表現型のパラメーターとして使用される。エクソンスキッピングの程度は、Ｅｘ２３欠失転写物を検出するｑＰＣＲアッセイを使用して評価されるであろう。
【0295】
結果：
これらの実験から、疾患表現型に対する効果と誘導されたＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングのレベルとを相関させることができるであろう。
これらの実験から、疾患表現型に対する効果と誘導されたＳＯＲＬ１のエクソンスキッピングのレベルとを相関させることができるであろう。
【0296】
結論：
我々は、変異したＳＯＲＬ１ Ｅｘ２３のスキッピングを誘導するＡＳＯがリンパ芽球モデルの細胞表現型を非疾患細胞に類似されたものに戻すために必要な有効性を特定する。
我々は、変異したＳＯＲＬ１ Ｅｘ２３のスキッピングを誘導するＡＳＯがリンパ芽球モデルの細胞表現型を非疾患細胞に類似されたものに戻すために必要な有効性を特定する。
【0297】
【表6】
【0298】
配列番号４９～配列番号７５：ＳＯＲＬ１断片の増幅に使用されたＰＣＲプライマー（実施例２、表５）。以下は、上記の表で使用された命名の説明例である：
－「順方向－ＳＯＲＬ１Ｅ１ ΔΕ２３－Δ２８，及びΔΕ３０－ΔΕ３３」は、この配列が、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３（Ｅ１－２２ＰＣＲ産物）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２４（Ｅ１－２３）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２５（Ｅ１－２４）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２６（Ｅ１－２５）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２７（Ｅ１－２６）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２８（Ｅ１－２７）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３０（Ｅ１－２９）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３１（Ｅ１－３０）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３２（Ｅ１－３１）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３３（Ｅ１－３２）のための順行プライマーであることを意味する。
－「逆行－ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３－Ｅ１－２２」は、この配列が、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３（Ｅ１－２２ＰＣＲ産物）のための逆行プライマー（５’－３’）であることを意味する。
－「順方向－ＳＯＲＬ１Ｅ１ ΔΕ２３－Δ２８，及びΔΕ３０－ΔΕ３３」は、この配列が、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３（Ｅ１－２２ＰＣＲ産物）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２４（Ｅ１－２３）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２５（Ｅ１－２４）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２６（Ｅ１－２５）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２７（Ｅ１－２６）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２８（Ｅ１－２７）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３０（Ｅ１－２９）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３１（Ｅ１－３０）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３２（Ｅ１－３１）、ＳＯＲＬ１－ΔＥ３３（Ｅ１－３２）のための順行プライマーであることを意味する。
－「逆行－ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３－Ｅ１－２２」は、この配列が、ＳＯＲＬ１－ΔＥ２３（Ｅ１－２２ＰＣＲ産物）のための逆行プライマー（５’－３’）であることを意味する。
【0299】
参照文献
Ｄｈｕｒｉ ２０２０，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ａｒｅａ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．２０２０，Ｊｕｎ．２６；９（６）：２００４．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９０６２００４．
Ｈｏｌｓｔｅｇｅ ２０２０，Ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ＡＤ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．２４，２０２０，Ｊｕｌｙ．２４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．２２．２０１５９２５
Ｊａｃｏｂｓｅｎ ２００１，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓａｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＳｏｒＬＡ／ＬＲ１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，Ｊｕｎ．２２；２７６（２５）：２２７８８－９６．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１００８５７２００．Ｅｐｕｂ．２００１，Ａｐｒ．９．
Ｐｉｖａ ２００９，ＳｐｌｉｃｅＡｉｄ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｔｉｆｓ ｂｏｕｎｄ ｂｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９，Ｍａｙ．１；２５（９）：１２１１－３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ１２４．Ｅｐｕｂ．２００９，Ｍａｒ．４．
Ｄｈｕｒｉ ２０２０，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ａｒｅａ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．２０２０，Ｊｕｎ．２６；９（６）：２００４．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｊｃｍ９０６２００４．
Ｈｏｌｓｔｅｇｅ ２０２０，Ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ＡＤ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ．２４，２０２０，Ｊｕｌｙ．２４，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．２２．２０１５９２５
Ｊａｃｏｂｓｅｎ ２００１，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓａｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＳｏｒＬＡ／ＬＲ１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，Ｊｕｎ．２２；２７６（２５）：２２７８８－９６．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１００８５７２００．Ｅｐｕｂ．２００１，Ａｐｒ．９．
Ｐｉｖａ ２００９，ＳｐｌｉｃｅＡｉｄ：ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｍｏｔｉｆｓ ｂｏｕｎｄ ｂｙ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９，Ｍａｙ．１；２５（９）：１２１１－３．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ１２４．Ｅｐｕｂ．２００９，Ｍａｒ．４．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D-1】
【図5D-2】
【図5D-3】
【図5E-1】
【図5E-2】
【図5E-3】
【図5F-1】
【図5F-2】
【図5F-3】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-18
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】