特表 2024-524334 核酸増幅のための酵素製剤および反応混合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】核酸増幅のための酵素製剤および反応混合物

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/10 20060101AFI20240628BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240628BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10 ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/6876 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023579757

(86)(22)【出願日】2022-06-29

(85)【翻訳文提出日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 US2022035456

(87)【国際公開番号】W WO2023278529

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/217,560

(32)【優先日】2021-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500169900

【氏名又は名称】ジェン－プローブ・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】シャボー， ビンセント ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】フィリポウスキー， マーク イー．

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR07

4B063QR32

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

(57)【要約】

少なくとも１つのポリメラーゼと、α－シクロデキストリンと、ポリソルベート２０とを含む製剤および反応混合物が開示される。開示される製剤および反応混合物を調製するための関連方法、ならびに核酸増幅のための関連キットおよび方法も開示される。製剤および反応混合物は、例えば、核酸増幅反応に対する試料抽出洗浄剤の阻害効果を緩和するのに有用である。製剤は、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤であり得る。この製剤は凍結保護剤を更に含み得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水性ポリメラーゼ製剤であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、水性ポリメラーゼ製剤。

【請求項2】

前記α－シクロデキストリン濃度が、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

前記α－シクロデキストリン濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬ、または約１２．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の製剤。

【請求項4】

前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項5】

前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）または約０．０２％（ｖ／ｖ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項5】

請求項５ａ。前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１～５のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項6】

核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、請求項１～５ａのいずれか一項に記載の製剤。

【請求項7】

凍結保護剤を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項8】

前記凍結保護剤が、トレハロースである、請求項７に記載の製剤。

【請求項9】

前記トレハロースが、約０．２Ｍ～約０．４Ｍの濃度で存在する、請求項８に記載の製剤。

【請求項10】

前記トレハロースが、約０．２６Ｍまたは約０．３Ｍの濃度で存在する、請求項９に記載の製剤。

【請求項11】

凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）請求項７～１０のいずれか一項に記載の水性製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を凍結乾燥して、前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を形成することと
を含む、方法。

【請求項12】

請求項１１に記載の方法によって調製された、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【請求項13】

請求項７～１０のいずれか一項に記載の水性製剤への再構成を可能にする、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【請求項14】

水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）請求項１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと
を含む、方法。

【請求項15】

キットであって、
請求項１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含有する第１の密封容器を含む、キット。

【請求項16】

希釈剤を含有する第２の密封容器を更に含む、請求項１５に記載のキット。

【請求項17】

増幅反応混合物であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、増幅反応混合物。

【請求項18】

前記α－シクロデキストリン濃度が、約８ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の反応混合物。

【請求項19】

前記α－シクロデキストリン濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１７に記載の反応混合物。

【請求項20】

前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００１５％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項21】

前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００２１％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項22】

前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項23】

凍結保護剤を更に含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項24】

前記凍結保護剤が、トレハロースである、請求項２３に記載の反応混合物。

【請求項25】

前記トレハロースが、約０．１Ｍ～約０．２９Ｍの濃度で存在する、請求項２４に記載の反応混合物。

【請求項26】

前記トレハロースが、約０．１５Ｍの濃度で存在する、請求項２５に記載の反応混合物。

【請求項27】

核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項28】

標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを更に含む、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の反応混合物。

【請求項29】

前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを更に含む、請求項２８に記載の反応混合物。

【請求項30】

前記標的核酸を更に含む、請求項２８または２９に記載の反応混合物。

【請求項31】

少なくとも１つの洗浄剤を更に含む、請求項３０に記載の反応混合物。

【請求項32】

前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、請求項３１に記載の反応混合物。

【請求項33】

増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと
を含む、方法。

【請求項34】

前記水性製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

工程（ｂ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合することを更に含む、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）請求項１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと、
（ｃ）前記再構成製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと、
を含む、方法。

【請求項37】

前記再構成製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

工程（ｃ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合する工程を更に含む、請求項３６または３７に記載の方法。

【請求項39】

前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、請求項３５または３８に記載の方法。

【請求項40】

前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、請求項３５および３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

増幅反応を行うための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有する試料を提供することと、
（ｂ）前記試料を、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
α－シクロデキストリンと、
ポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸と、
少なくとも１つの補因子と、
前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーと、を含む水性混合物と接触させることであって、
前記試料を前記水性混合物と接触させることにより、前記α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する反応混合物を提供することと、
（ｃ）前記反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、前記標的核酸が、前記試料中に存在する場合、前記標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用されることと
を含む、方法。

【請求項43】

前記１またはそれを超えるアンプリコンを検出することを更に含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記検出する工程が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応物を、前記１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記検出する工程が、リアルタイムで行われる、請求項４３または４４に記載の方法。

【請求項46】

前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、請求項４２～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、請求項４６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年７月１日に出願された米国仮出願第６３／２１７，５６０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年６月８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、「ＧＰＲ＿７９１０ ＰＣ＿２０２２０６０８＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ ２５」と名付けられ、サイズは４，９７４バイトである。

【背景技術】

【0003】

背景
核酸増幅法は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含む多くのバイオサイエンス用途で広く使用されている。生物学的試料からの標的核酸を増幅するための方法は、典型的には、抽出された試料中に、ポリメラーゼ酵素に対して阻害性であることが多い１またはそれを超える残留洗浄剤を残す試料抽出工程（複数可）を用いる。このような残留洗浄剤の阻害効果は、ポリメラーゼ酵素および増幅反応混合物の製剤に課題を与える。

【発明の概要】

【0004】

要旨
一態様では、本発明は、水性ポリメラーゼ製剤を提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、一般に、少なくとも１つのポリメラーゼと、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤と、を含む。特定の変形例では、製剤は、凍結保護剤を更に含む。特に適切な凍結保護剤はトレハロースであり、トレハロースは、例えば約０．２Ｍ～約０．４Ｍの濃度で存在し得る。

【0005】

別の態様では、本発明は、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法を提供する。この方法は、一般に、（ａ）上記の水性製剤を提供することと、（ｂ）水性製剤を凍結乾燥して凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を形成することと、を含む。別の態様では、本発明は、前述の方法によって調製された凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供する。

【0006】

別の態様では、本発明は、上記の水性製剤への再構成を可能にする凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供する。

【0007】

別の態様では、本発明は、水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法を提供する。この方法は、一般に、（ａ）上記の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して再構成製剤を提供することと、を含む。

【0008】

別の態様では、本発明は、上記の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含有する第１の密封容器を有するキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、希釈剤を含有する第２の密封容器を更に含む。

【0009】

別の態様では、本発明は、増幅反応混合物を提供する。反応混合物は、一般に、少なくとも１つのポリメラーゼと、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤と、を含む。いくつかの変形例では、反応混合物は、核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む。他の相互に排他的でない実施形態では、反応混合物は、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマー、および／または標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含む。更に他の相互に排他的でない実施形態では、反応混合物は、増幅される標的核酸および／または例えばアニオン性洗浄剤等の少なくとも１つの洗浄剤を更に含む。特に好適なアニオン性洗浄剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）が挙げられる。

【0010】

別の態様では、本発明は、増幅反応混合物を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、一般に、（ａ）上記の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）水性製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと、を含み、いくつかのそのような変形例では、本方法は、工程（ｂ）で生成された混合物を、標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合することを更に含む。他の実施形態では、本方法は、一般に、（ａ）上記の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して再構成製剤を提供することと、（ｃ）標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と再構成製剤を混合することを含み、いくつかのそのような変形例では、本方法は、工程（ｃ）で生成された混合物を、標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合する工程を更に含む。試料とのさらなる混合物を含む上記のいくつかの実施形態では、試料は、例えばアニオン性洗浄剤等の少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である。特に好適なアニオン性洗浄剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）が挙げられる。試料とのさらなる混合物を含む上記の他の相互に排他的でない実施形態では、標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料は、反応混合物の少なくとも約２０％または少なくとも約４０％を構成する。

【0011】

別の態様では、本発明は、増幅反応を行うための方法を提供する。本方法は、一般に、（ａ）標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料を提供することと、（ｂ）試料を、少なくとも１つのポリメラーゼと、α－シクロデキストリンと、ポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤と、核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸と、少なくとも１つの補因子と、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーと、を含む水性混合物と接触させることであって、試料を水性混合物と接触させることにより、α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する反応混合物を提供することと、（ｃ）反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、標的核酸が、試料中に存在する場合、標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用されることと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１またはそれを超えるアンプリコンを検出すること（例えば、１またはそれを超えるアンプリコンをリアルタイムで検出すること）を更に含み、いくつかのそのような変形例では、検出する工程は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、核酸増幅反応物を、１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料は、例えばアニオン性洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ））等の少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である。その他では、試料は、工程（ｂ）として生成された反応混合物の少なくとも約２０％または少なくとも約４０％を構成する。

【発明を実施するための形態】

【0012】

これらの態様の代表的な実施形態を以下に更に説明する。

【0013】

実施形態
実施形態１．水性ポリメラーゼ製剤であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、水性ポリメラーゼ製剤。

【0014】

実施形態２．前記α－シクロデキストリン濃度が、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、実施形態１に記載の製剤。

【0015】

実施形態３．前記α－シクロデキストリン濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬ、または約１２．５ｍｇ／ｍＬである、実施形態１に記載の製剤。

【0016】

実施形態４．前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の製剤。

【0017】

実施形態５．ポリソルベート２０濃度が、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）または約０．０２％（ｖ／ｖ）である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の製剤。

【0018】

実施形態６．前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態１～５のいずれか１つに記載の製剤。

【0019】

実施形態７．前記製剤が、少なくとも２つＤＮＡポリメラーゼを含み、第１のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素であり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態６に記載の製剤。

【0020】

実施形態８．前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）変異型逆転写酵素である、実施形態７に記載の製剤。

【0021】

実施形態９．前記少なくとも１つの緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、実施形態１～８のいずれか１つに記載の製剤。

【0022】

実施形態１０．前記Ｔｒｉｓ緩衝剤が、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で存在する、実施形態９に記載の製剤。

【0023】

実施形態１１．核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の製剤。

【0024】

実施形態１２．ＥＤＴＡを更に含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の製剤。

【0025】

実施形態１３．前記ＥＤＴＡが、約０．０５ｍＭ～約０．５ｍＭの濃度で存在する、実施形態１２に記載の製剤。

【0026】

実施形態１４．前記ＥＤＴＡが、約０．１６ｍＭまたは約０．１４ｍＭの濃度で存在する、実施形態１２に記載の製剤。

【0027】

実施形態１５．凍結保護剤を更に含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の製剤。

【0028】

実施形態１６．前記凍結保護剤が、トレハロースである、実施形態１５に記載の製剤。

【0029】

実施形態１７．前記トレハロースが、約０．２Ｍ～約０．３５Ｍまたは約０．２Ｍ～約０．４Ｍの濃度で存在する、実施形態１６に記載の製剤。

【0030】

実施形態１８．前記トレハロースが、約０．２６Ｍまたは約０．３Ｍの濃度で存在する、実施形態１７に記載の製剤。

【0031】

実施形態１９．凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の水性製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を凍結乾燥して、前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を形成することと
を含む、方法。

【0032】

実施形態２０．実施形態１９の方法によって調製された、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【0033】

実施形態２１．実施形態１５～１８のいずか１つに記載の水性製剤への再構成を可能にする、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【0034】

実施形態２２．水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）実施形態２０または２１に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと
を含む、方法。

【0035】

実施形態２３．キットであって、
実施形態２０または２１に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含有する、第１の密封容器を含む、キット。

【0036】

実施形態２４．希釈剤を含有する第２の密封容器を更に含む、実施形態２３に記載のキット。

【0037】

実施形態２５．増幅反応混合物であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、増幅反応混合物。

【0038】

実施形態２６．前記α－シクロデキストリン濃度が、約８ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、実施形態２５に記載の反応混合物。

【0039】

実施形態２７．前記α－シクロデキストリン濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬである、実施形態２５に記載の反応混合物。

【0040】

実施形態２８．前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００１５％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）である、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0041】

実施形態２９．前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００２１％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）である、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0042】

実施形態３０．前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態２５～２９のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0043】

実施形態３１．前記反応混合物が、少なくとも２つＤＮＡポリメラーゼを含み、第１のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素であり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態３０に記載の反応混合物。

【0044】

実施形態３２．前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）変異型逆転写酵素である、実施形態３１に記載の反応混合物。

【0045】

実施形態３３．前記少なくとも１つの緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、実施形態２５～３２のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0046】

実施形態３４．前記Ｔｒｉｓ緩衝剤が、約５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で存在する、実施形態３３に記載の反応混合物。

【0047】

実施形態３５．核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、実施形態２５～３４のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0048】

実施形態３６．ＥＤＴＡを更に含む、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0049】

実施形態３７．前記ＥＤＴＡが、約０．０２５ｍＭ～約０．２５ｍＭの濃度で存在する、実施形態３６に記載の反応混合物。

【0050】

実施形態３８．前記ＥＤＴＡが、約０．０８ｍＭの濃度で存在する、実施形態３６に記載の反応混合物。

【0051】

実施形態３９．凍結保護剤を更に含む、実施形態２５～３８のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0052】

実施形態４０．前記凍結保護剤がトレハロースである、実施形態３９に記載の反応混合物。

【0053】

実施形態４１．前記トレハロースが、約０．１Ｍ～約０．２Ｍの濃度で存在する、実施形態４０に記載の反応混合物。

【0054】

実施形態４２．前記トレハロースが、約０．１５Ｍの濃度で存在する、実施形態４１に記載の反応混合物。

【0055】

実施形態４３．標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを更に含む、実施形態２５～４２のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0056】

実施形態４４．標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、実施形態４３に記載の反応混合物。

【0057】

実施形態４５．前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを更に含む、実施形態４３または４４に記載の反応混合物。

【0058】

実施形態４６．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、化学発光標識または蛍光標識を含む、実施形態４５に記載の反応混合物。

【0059】

実施形態４７．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、蛍光標識および非蛍光クエンチャーを含む、実施形態４５に記載の反応混合物。

【0060】

実施形態４８．少なくとも１つの補因子をさらに含む、実施形態２５～４７のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0061】

実施形態４９．前記少なくとも１つの補因子が、約１ｍＭ～約５ｍＭの濃度の塩化マグネシウムである、実施形態４８に記載の反応混合物。

【0062】

実施形態５０．前記標的核酸を更に含む、実施形態４３～４９のいずれか１つに記載の反応混合物。

【0063】

実施形態５１．前記標的核酸が、ＲＮＡである、実施形態５０に記載の反応混合物。

【0064】

実施形態５２．少なくとも１つの洗浄剤を更に含む、実施形態５０または５１に記載の反応混合物。

【0065】

実施形態５３．前記少なくとも１つの洗浄剤が、アニオン性洗浄剤である、実施形態５２に記載の反応混合物。

【0066】

実施形態５４．前記アニオン性洗浄剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、実施形態５３に記載の反応混合物。

【0067】

実施形態５５．増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）実施形態１～１８のいずれか１つに記載の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと
を含む、方法。

【0068】

実施形態５６．前記第２の製剤が、前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、実施形態５５に記載の方法。

【0069】

実施形態５７．前記水性製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、実施形態５５または５６に記載の方法。

【0070】

実施形態５８．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、化学発光標識または蛍光標識を含む、実施形態５７に記載の方法。

【0071】

実施形態５９．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、蛍光標識および非蛍光クエンチャーを含む、実施形態５７に記載の方法。

【0072】

実施形態６０．前記水性製剤を、少なくとも１つの補因子と混合することを更に含む、実施形態５５～５９のいずれか１つに記載の方法。

【0073】

実施形態６１．前記少なくとも１つの補因子が、塩化マグネシウムである、実施形態６０に記載の方法。

【0074】

実施形態６２．前記塩化マグネシウムを、約１ｍＭ～約５ｍＭの最終濃度に混合する、実施形態６１に記載の方法。

【0075】

実施形態６３．工程（ｂ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合する工程を更に含む、実施形態５５～６２のいずれか１つに記載の方法。

【0076】

実施形態６４．増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）実施形態２０または２１に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと、
（ｃ）前記再構成製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと、
を含む、方法。

【0077】

実施形態６５．前記第２の製剤が、前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、実施形態６４に記載の方法。

【0078】

実施形態６６．前記再構成製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、実施形態６４または６５に記載の方法。

【0079】

実施形態６７．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、化学発光標識または蛍光標識を含む、実施形態６６に記載の方法。

【0080】

実施形態６８．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、蛍光標識および非蛍光クエンチャーを含む、実施形態６６に記載の方法。

【0081】

実施形態６９．前記再構成製剤を、少なくとも１つの補因子と混合することを更に含む、実施形態６４～６８のいずれか１つに記載の方法。

【0082】

実施形態７０．前記少なくとも１つの補因子が、塩化マグネシウムである、実施形態６９に記載の方法。

【0083】

実施形態７１．前記塩化マグネシウムを、約１ｍＭ～約５ｍＭの最終濃度に混合する、実施形態７０に記載の方法。

【0084】

実施形態７２．工程（ｃ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合する工程を更に含む、実施形態６４～７１のいずれか１つに記載の方法。

【0085】

実施形態７３．前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、実施形態６３～７２に記載の方法。

【0086】

実施形態７４．前記少なくとも１つの洗浄剤が、アニオン性洗浄剤である、実施形態７３に記載の方法。

【0087】

実施形態７５．前記アニオン性洗浄剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、実施形態７４に記載の方法。

【0088】

実施形態７６．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約２０％を構成する、実施形態６３および７２～７５のいずれか１つに記載の方法。

【0089】

実施形態７７．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、実施形態７６に記載の方法。

【0090】

実施形態７８．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約４０％～約５０％を構成する、実施形態７７に記載の方法。

【0091】

実施形態７９．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の約４２．９％を構成する、実施形態７８に記載の方法。

【0092】

実施形態８０．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約５０％～約７０％を構成する、実施形態７７に記載の方法。

【0093】

実施形態８１．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の約６２．５％を構成する、実施形態８０に記載の方法。

【0094】

実施形態８２．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約２０％～約３３％を構成する、実施形態７６に記載の方法。

【0095】

実施形態８３．増幅反応を行うための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料を提供することと、
（ｂ）前記試料を、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
α－シクロデキストリンと、
ポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸と、
少なくとも１つの補因子と、
前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーと、を含む水性混合物と接触させることであって、
前記試料を前記水性混合物と接触させることにより、前記α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在することと、
（ｃ）前記反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、前記標的核酸が、前記試料中に存在する場合、前記標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用されることと
を含む、方法。

【0096】

実施形態８４．前記α－シクロデキストリンが、前記反応混合物中に約８ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、実施形態８３に記載の方法。

【0097】

実施形態８５．前記α－シクロデキストリンが、前記反応混合物中に約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、実施形態８３に記載の方法。

【0098】

実施形態８６．前記ポリソルベート２０が、前記反応混合物中に約０．００１５％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、実施形態８３～８５のいずれか１つに記載の方法。

【0099】

実施形態８７．前記ポリソルベート２０が、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００２１％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で反応混合物中に存在する、実施形態８３～８５のいずれか１つに記載の方法。

【0100】

実施形態８８．前記水性混合物が、前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む、実施形態８３～８７のいずれか１つに記載の方法。

【0101】

実施形態８９．前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態８３～８８のいずれか１つに記載の方法。

【0102】

実施形態９０．前記水性混合物が、少なくとも２つＤＮＡポリメラーゼを含み、第１のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素であり、第２のＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、実施形態８９に記載の方法。

【0103】

実施形態９１．前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）変異型逆転写酵素である、実施形態９０に記載の方法。

【0104】

実施形態９２．前記少なくとも１つの緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、実施形態８３～９１のいずれか１つに記載の方法。

【0105】

実施形態９３．前記Ｔｒｉｓ緩衝剤が、前記反応混合物中に約５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で存在する、実施形態９２に記載の方法。

【0106】

実施形態９４．前記水性混合物が、ＥＤＴＡを更に含む、実施形態８３～９３のいずれか１つに記載の方法。

【0107】

実施形態９５．前記ＥＤＴＡが、前記反応混合物中に約０．０２５ｍＭ～約０．２５ｍＭの濃度で存在する、実施形態９４に記載の方法。

【0108】

実施形態９６．前記ＥＤＴＡが、前記反応混合物中に約０．０８ｍＭの濃度で存在する、実施形態９４に記載の方法。

【0109】

実施形態９７．前記水性混合物が、凍結保護剤を更に含む、実施形態８３～９６のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

実施形態９８．前記凍結保護剤が、トレハロースである、実施形態９７に記載の方法。

【0111】

実施形態９９．前記トレハロースが、前記反応混合物中に約０．１Ｍ～約０．２Ｍの濃度で存在する、実施形態９８に記載の方法。

【0112】

実施形態１００．前記トレハロースが、前記反応混合物中に約０．１５Ｍの濃度で存在する、実施形態９９に記載の方法。

【0113】

実施形態１０１．前記１またはそれを超えるアンプリコンを検出することを更に含む、実施形態８３～１００のいずれか１つに記載の方法。

【0114】

実施形態１０２．前記検出する工程が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応物を、前記１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、実施形態１０１に記載の方法。

【0115】

実施形態１０３．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、化学発光標識または蛍光標識を含む、実施形態１０２に記載の方法。

【0116】

実施形態１０４．前記少なくとも１つの検出プローブオリゴマーが、蛍光標識および非蛍光クエンチャーを含む、実施形態１０２に記載の方法。

【0117】

実施形態１０５．前記検出する工程が、リアルタイムで行われる、実施形態１０１～１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0118】

実施形態１０６．前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、実施形態８３～１０５のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

実施形態１０７．前記少なくとも１つの洗浄剤が、アニオン性洗浄剤である、実施形態１０６に記載の方法。

【0120】

実施形態１０８．前記アニオン性洗浄剤が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、実施形態１０７に記載の方法。

【0121】

実施形態１０９．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約２０％を構成する、実施形態８３～１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0122】

実施形態１１０．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、実施形態１０９に記載の方法。

【0123】

実施形態１１１．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約４０％～約５０％を構成する、実施形態１１０に記載の方法。

【0124】

実施形態１１２．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の約４２．９％を構成する、実施形態１１１に記載の方法。

【0125】

実施形態１１３．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約５０％～約７０％を構成する、実施形態１１０に記載の方法。

【0126】

実施形態１１４．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の約６２．５％を構成する、実施形態１１３に記載の方法。

【0127】

実施形態１１５．前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる前記試料が、前記反応混合物の約２０％～約３３％を構成する、実施形態１０９に記載の方法。

【0128】

実施形態１１６．前記α－シクロデキストリン濃度が、約１７．５ｍｇ／ｍＬであり、
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００３５％（ｖ／ｖ）である、実施形態１に記載の製剤。

【0129】

実施形態１１７．前記α－シクロデキストリン濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬであり、
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００２％（ｖ／ｖ）である、実施形態２５に記載の反応混合物。

【0130】

実施形態１１８．前記α－シクロデキストリン濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬであり、
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００２％（ｖ／ｖ）である、実施形態８３に記載の方法。

【0131】

本発明のこれらおよび他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参照することによって明らかになるであろう。

【0132】

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、特に指定されない限り、それらに帰する意味を有する。

【0133】

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。

【0134】

「試料」は、標的核酸を含有し得る任意の検体を含む。試料は、生きているまたは死んだヒトに由来する任意の組織または材料を含む「生物学的試料」を含む。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊するように処置され、したがって、分析用に生物学的試料を調製するために使用される酵素、緩衝液、塩、洗浄剤等を更に含有し得る溶液中に細胞内成分を放出し得る。また、試料は、１またはそれを超える成分が濃縮または精製された試料等の処置された試料を含み得る。処置される試料には、例えば、試料を濾過装置の上もしくは中に通過させることによって、または遠心分離後に、または培地、マトリックスもしくは支持体への付着によって得られるものが含まれる。

【0135】

「洗浄剤」は、乳化によって疎水性物質（例えば、脂質）を水に分散させることができ、その後の分析のために生物学的試料を溶解または可溶化するために使用することができる物質を指す。洗浄剤は、イオン性または非イオン性であり得る。

【0136】

本明細書で使用される場合、「凍結保護剤」という用語は、凍結乾燥およびその後の貯蔵時のタンパク質または他の物質の化学的および／または物理的不安定性を防止または低減する分子を指す。例示的な凍結保護剤としては、スクロースまたはトレハロース等の糖；グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸；ベタイン等のメチルアミン；硫酸マグネシウム等のリオトロピック塩；３価以上の糖アルコール等のポリオール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等；プルロニクス；ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、トレハロースまたはスクロース等の非還元糖である。本明細書に記載のα－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０を含む水性製剤または反応混合物の文脈で使用される場合、「凍結保護剤」という用語は、α－シクロデキストリン以外の分子を指すが、α－シクロデキストリンは依然として二次凍結保護剤として作用し得る。

【0137】

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」という用語は、ヌクレオチド（その類縁体を含む）の核酸鎖への重合を触媒することができる任意の酵素を意味する。典型的には、そのようなヌクレオチド重合は、鋳型依存的様式で起こる。そのようなポリメラーゼとしては、例えば、天然に存在するポリメラーゼならびにその任意のサブユニットおよび切断型、突然変異体ポリメラーゼ、バリアントポリメラーゼ、組換え、融合または他の操作されたポリメラーゼ、化学修飾ポリメラーゼ、合成分子または集合体、ならびにそのような重合を触媒する能力を保持するその任意の類縁体、ホモログ、誘導体または断片が挙げられ得る。必要に応じて、ポリメラーゼは、１またはそれを超えるアミノ酸の他のアミノ酸による置換、ポリメラーゼからの１またはそれを超えるアミノ酸の挿入もしくは欠失、または異なる種もしくはファミリーのポリメラーゼからの２またはそれを超える部分の連結を含む２またはそれを超えるポリメラーゼの部分の連結を含む、１またはそれを超える突然変異を含む突然変異体ポリメラーゼであり得る。例示的なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼまたは逆転写酵素が挙げられる。他の変形例では、ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼである。

【0138】

「補因子」という用語は、ポリメラーゼ酵素活性に必要な二価カチオンまたはその塩を指す。ポリメラーゼと共に使用するのに適した補因子は、当技術分野で一般的に公知であり、例えば、マグネシウム（Ｍｇ^２＋）およびマンガン（Ｍｎ^２＋）が挙げられる。ポリメラーゼ反応混合物に使用するための典型的な二価カチオン塩としては、塩化物塩（例えば、塩化マグネシウム、塩化マンガン）が挙げられる。

【0139】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素塩基（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖はリボースである。ＤＮＡにおいて、５炭素糖は２’－デオキシリボースである。

【0140】

「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、共に連結されてバイオポリマーを形成するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類縁体を含む多量体化合物を指す。バイオポリマーには、従来のＲＮＡ、従来のＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、およびそれらのバージョンを含有するヌクレオチド類縁体が含まれる。核酸「骨格」は、１またはそれを超える糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせを含む、様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換を有する類似の化合物、例えば、リボースの２’位にメトキシ、フルオロまたはハロゲン化物基を有する類縁体（本明細書では、「２’－Ｏ－Ｍｅ」もしくは「２’－メトキシ」または２’－フルオロもしくは「２’－ハロゲン化物」とも呼ばれる）であり得る。窒素塩基は、従来の塩基、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）、ならびにそれらの類縁体（例えば、イノシン、５メチル２’デオキシキソシトシン（「５－Ｍｅ－ｄＣ」または「５ＭｅＣ」）、およびイソグアニン）であり得る。核酸は、骨格が、ポリマーの位置（複数可）に対して窒素塩基を含まない１またはそれを超える「脱塩基」残基を含み得る。

【0141】

「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は、下限約５ｎｔおよび上限約９００ｎｔを有するサイズ範囲のものを含む、一般に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指す。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬に対するいかなる特定の機能も示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴマーは、官能名（例えば、捕捉プローブ、検出プローブ、プライマーまたはプロモータープライマー）によって言及され得るが、当業者は、そのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。

【0142】

本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、増幅される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、増幅されない可能性がある、標的配列以外の他の配列を含み得る。

【0143】

本明細書で使用される場合、「標的配列」または「標的核酸配列」という用語は、増幅および／または検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＴＭＡ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体形成する複合体形成配列を含む。文脈がそうでないことを明確に示さない限り、標的核酸が元々一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列を指し、標的核酸が元々二本鎖である場合、「標的配列」という用語はセンス（＋）鎖とアンチセンス（－）鎖の両方を指す。

【0144】

「核酸増幅」は、標的核酸配列の複数のコピーを生成する任意の周知のイｉｎ ｖｉｔｒｏ手順を指す。そのような手順の例としては、転写関連方法、例えば転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）等（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，４３７，９９０号、第５，１３０，２３８号、第４，８６８，１０５号、および第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号明）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０３２０３０８号）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が挙げられる。

【0145】

「アンプリコン」または「増幅産物」とは、核酸増幅反応で生成され、標的核酸に由来する核酸分子を意味する。アンプリコンまたは増幅産物は、標的核酸と同じまたは反対のセンスであり得る標的核酸配列を含有する。

【0146】

「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」は、標的核酸にハイブリダイズし、例えばプライマーとして働く核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーは、核酸増幅反応の一部として重合によって伸長される３’末端を有することができる。増幅オリゴマーは、代替的に、重合によって伸長されないが、核酸増幅を促進する成分、例えば増幅オリゴマーの標的特異的配列に５’結合されたプロモーター配列を提供する３’末端を有することができる。このような増幅オリゴマーは、プロモーター提供体と呼ばれる。重合によって伸長可能な３’標的特異的配列と５’プロモーター配列の両方を提供する増幅オリゴマーは、プロモータープライマーと呼ばれる。増幅オリゴマーは、タグ、（言及される）プロモーター、またはプライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるもしくは有用な他の配列等の５’非標的特異的配列を含むように必要に応じて修飾されてもよい。

【0147】

「検出プローブオリゴマー」、「検出プローブ」または「プローブ」は、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅産物を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズしたプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的に連結する中間構造にハイブリダイズしたプローブ）のいずれかであり得る。プローブの標的特異的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きな配列内の特異的配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列（複数可）および非標的特異的配列（複数可）を含み得る。そのような非標的特異的配列は、検出および／または増幅を容易にするために使用することができるヘアピン構造等の所望の二次または三次構造を与える配列を含むことができる。

【0148】

「標識」または「検出可能な標識」は、検出されるかまたは検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に結合された部分または化合物を指す。直接結合は、共有結合または非共有結合相互作用（例えば、水素結合、疎水性またはイオン性相互作用、およびキレートまたは配位錯体の形成）を使用してもよく、一方、間接結合は、架橋部分またはリンカー（例えば、検出可能なシグナルを増幅する抗体または追加のオリゴヌクレオチド（複数可）を介して）を使用してもよい。任意の検出可能な部分、例えば、放射性核種、ビオチンまたはアビジン等のリガンド、酵素、酵素基質、反応基、検出可能な色を付与する色素または粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）等の発色団、発光化合物（例えば、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物等の生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物（すなわち、フルオロフォア）を使用することができる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接しているときに光を吸収してバックグラウンド蛍光を減少させるクエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。検出可能に標識されたプローブとしては、例えば、加水分解（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ、ＡＥ標識プローブ、分子トーチおよび分子ビーコンが挙げられる。

【0149】

「構成される」という用語は、参照されるオリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を表す。例えば、標的配列から特定のアンプリコンを生成するように構成された増幅オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズし、アンプリコンを生成するための増幅反応に使用することができるポリヌクレオチド配列を有する。また、一例として、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されたオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。

【0150】

本明細書で使用される場合、「希釈剤」という用語は、本明細書に記載の例示的または適切な濃度を変更または達成するのに適した溶液を指す。

【0151】

「容器」という用語は、例えば貯蔵（例えば、ホルダ、レセプタクル、容器等）のために、物体または液体を中に配置または含有することができるものを指す。

【0152】

本明細書における数値範囲（例えば、「ＸからＹ」または「ＸからＹ」）への言及は、範囲を定義する終点および範囲内に入る全ての値を含む。

【0153】

文脈から明らかでない限り、値が「約」Ｘまたは「およそ」Ｘとして表される場合、Ｘの記載値は±１０％まで正確であると理解される。

【0154】

説明
本発明は、α－シクロデキストリンとポリソルベート２０との組み合わせを含む水性ポリメラーゼ製剤および反応混合物（そのような製剤および反応混合物を調製および使用するための関連方法を含む）を提供する。製剤および反応混合物は、一部には、α－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０が、試料抽出緩衝液（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）等の洗浄剤）でしばしば使用される洗浄剤の存在下で観察されるポリメラーゼ活性の阻害の緩和において相乗効果を提供するという驚くべき観察に基づく。特定の態様では、ポリメラーゼ阻害に対するこの緩和効果は、例えば、増幅および検出アッセイにおける感度の増加、ならびに増幅反応混合物に使用される残留洗浄剤（複数可）を含有する抽出試料のより大きな割合を可能にする等の利点を提供する。他の態様では、本発明は、（例えば、一次凍結保護剤の濃度を増加させると、凍結乾燥生成物の再構成が不完全になる状況において）第２の凍結保護剤として作用するα－シクロデキストリンに起因して、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を安定化するのに役立つ。

【0155】

特定の実施形態では、ポリメラーゼ製剤は水性製剤である。そのような製剤は、例えば、予備凍結乾燥製剤または凍結乾燥形態から再構成された製剤であり得る。いくつかの変形例では、製剤は、少なくとも１つのポリメラーゼと、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤と、を含む、水性ポリメラーゼ製剤として提供される。いくつかの実施形態では、α－シクロデキストリンは、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１６ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、または約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、より具体的な変形例では、α－シクロデキストリンは、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬまたは約１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．００２％～約０．０４％（ｖ／ｖ）、約０．００２％～約０．０３％（ｖ／ｖ）、約０．００３％～約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．００３％～約０．０４％（ｖ／ｖ）、または約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、より具体的な変形例では、ポリソルベート２０は、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）、または約０．０２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。

【0156】

本発明に従って使用するのに適したポリメラーゼには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ、および２種類以上のポリメラーゼ活性を有する酵素が含まれ、酵素は熱不安定性または熱安定性であり得る。２またはそれを超える酵素の混合物を使用することもできる。例示的なポリメラーゼには、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ（「Ｐｏｌ Ｉ」）、Ｐｏｌ Ｉ、Ｔ４、Ｔ７のクレノウ断片、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）Ｔ７、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）バージョン２．０ Ｔ７、Ｔｕｂ、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｐｆｘ、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ、Ｔｆｌ、Ｔｌｉおよびパイロコッカス属種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＧＢ－Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ；ならびに逆転写酵素、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＲＮＡｓｅ Ｈ－ＭＭＬＶ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標））、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、ＨＩＶ－１およびＲＡＶ２逆転写酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、例えば逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ変異型逆転写酵素）およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）等の少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼを含む。

【0157】

緩衝剤は、典型的には、増幅アッセイにおけるポリメラーゼの使用に適したｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．０～約９．０、約６．５～約８．５、約６．５～約８．０、または約６．５～約７．５の範囲のｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。適切な緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ（２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸））、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩およびヒスチジンが挙げられる。特定の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝剤は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭまたは約２０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度で存在する。本発明による製剤のための緩衝液の他の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。

【0158】

上記のようなポリメラーゼ製剤は、１またはそれを超える追加の成分を更に含み得る。例えば、製剤は、核酸増幅（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）および／またはキレート剤を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含有し得る。適切なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＥＧＴＡ）が含まれる。キレート剤としてＥＤＴＡを含むいくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．０５ｍＭ～約０．５ｍＭの濃度で（例えば、約０．１６ｍＭまたは約０．１４ｍＭの濃度で）存在する。

【0159】

特定の変形例では、製剤（凍結乾燥に適したもの、凍結乾燥形態から再構成されたもの、または本明細書に記載の水性製剤に再構成するための凍結乾燥製剤等）は、凍結保護剤を含有し得る。例示的な凍結保護剤としては、非還元糖、例えばスクロース、ラフィノースまたはトレハロース；グリセロール；およびアミノ酸、例えばグリシン、アルギニンまたはメチオニン等が挙げられる。凍結乾燥時の担体分子の許容できない量の分解および／または凝集を防止するための適切な濃度の選択を含む凍結保護剤の使用は、当技術分野で一般的に周知である。特に適切な凍結保護剤はトレハロースであり、これは、例えば、約０．２Ｍ～約０．３５Ｍまたは約０．２Ｍ～約０．４Ｍの濃度で水性製剤中に存在し得る。凍結保護剤としてトレハロースを含むいくつかの変形例では、トレハロースは約０．２６Ｍまたは約０．３Ｍの濃度で存在する。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリメラーゼ製剤は、増幅反応混合物の調製のためのバルク生成物として使用され得る１またはそれを超えるポリメラーゼの濃縮調製物である。

【0161】

典型的な変形例では、製剤は長期間にわたって安定である。例えば、製剤は、少なくとも約２週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、または少なくとも約６ヶ月間安定であり得る。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１４ヶ月間、少なくとも約１８ヶ月間、少なくとも約２４ヶ月間、または少なくとも約３０ヶ月間安定である。

【0162】

本明細書に記載されるポリメラーゼ製剤は、約－８０℃～約４０℃、約－２０℃～約２５℃、約０℃～約２５℃、約０℃～約１５℃、約０℃～約１０℃、または約２℃～約８℃の温度で保存され得る。様々な実施形態では、製剤は、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃で保存され得る。一般に、製剤は安定であり、これらの範囲で活性を保持する。いくつかの変形例では、製剤は、約－８０℃～約２５℃または約４℃～約２５℃で安定である。より特定の変形例では、液体製剤は、約－８０℃～約－２０℃、約－８０℃～約４℃、または約－８０℃～約２５℃の温度で安定である。他の特定の変形例では、凍結乾燥製剤は、約４℃～約２５℃または約４℃～約４０℃の温度で安定である。上記の温度の中間の範囲、例えば約２℃～約１８℃もまた、本発明の一部であることが意図される。例えば、上に列挙された値のいずれかの組み合わせを上限および／または下限として使用する値の範囲が含まれることが意図される。

【0163】

特定の実施形態では、長期保存のために、本明細書に記載の水性製剤を、例えばバイアル、アンプルまたは他の容器に分注し、当技術分野で公知の手順に従って凍結乾燥してもよい。凍結乾燥生成物は、典型的には、粉末またはケーキとなる。次いで、容器を密封し、いくつかのそのような変形例では、シールは、後でシールを通って容器内に希釈剤を注入することを可能にする。水性製剤からそのような凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法、ならびにそのような方法によって調製された凍結乾燥製剤は、本発明の追加の態様である。更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載の水性遠赤色色素プローブ製剤への再構成を可能にする安定化凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供する。

【0164】

本明細書に記載の凍結乾燥製剤から水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法も本発明に包含される。そのような方法は、一般に、（ａ）本明細書に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を適切な希釈剤に溶解して再構成製剤を提供することと、を含む。適切な希釈剤は、当業者によって容易に選択され得、例えば、水または緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）を含有する水溶液を含み得る。

【0165】

本発明の特定の態様では、本明細書に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含む容器は、１またはそれを超える他の成分、例えば希釈剤を含有する第２の容器を有するキットで提供される。ポリメラーゼ製剤は、様々な異なる実施形態で包装されてもよく、当業者は、本発明が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。例えば、キットは、標的領域を増幅するための１またはそれを超える増幅オリゴマーを含有する容器を更に含んでもよく、必要に応じて、増幅される標的領域を検出するための１またはそれを超える検出プローブを有してもよい。キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅を行うのに適した他の試薬、例えば緩衝液、塩溶液および／または適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を含有し得る。特定の実施形態では、キットは、本発明による方法を実施するための説明書のセットを更に含み、説明書は、キットまたはその構成要素の添付文書および／または包装に関連付けられ得る。

【0166】

他の態様では、本発明は、増幅反応混合物を提供する。そのような反応混合物は、例えば、濃縮されたバルク生成物として本明細書に記載の水性製剤を使用して調製され得る。本開示の反応混合物は、典型的には、少なくとも１つのポリメラーゼと、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤と、を含む。いくつかの実施形態では、α－シクロデキストリンは、約５ｍｇ／ｍＬ～約１７．５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１２．５ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約１７．５ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、または約８ｍｇ／ｍＬ～約１２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、より具体的な変形例では、α－シクロデキストリンが約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、約０．００１％～約０．０２％（ｖ／ｖ）、約０．００１％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）、約０．００１５％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）、約０．００１５％～約０．０２％（ｖ／ｖ）、または約０．００１５％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、より具体的な変形例では、ポリソルベート２０は、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００２１％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。

【0167】

反応混合物に使用するのに適したポリメラーゼには、上記のポリメラーゼ製剤に適したものが含まれる。例えば、反応混合物は、少なくとも２つのＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ変異型逆転写酵素）およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を含み得る。

【0168】

緩衝剤は、典型的には、増幅アッセイにおけるポリメラーゼの使用に適したｐＨを維持するのに十分な濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．０～約９．０、約６．５～約８．５、約６．５～約８．０、または約６．５～約７．５の範囲のｐＨを維持するのに十分な濃度で存在する。適切な緩衝剤には、上記のようなポリメラーゼ製剤に適した緩衝剤が含まれる。特定の実施形態では、Ｔｒｉｓ緩衝剤は、約５ｍＭ～約５０ｍＭまたは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度で存在する。本発明による反応混合物のための緩衝液の他の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。

【0169】

特定の実施形態では、増幅反応混合物は、凍結保護剤を含有し得る（例えば、増幅反応混合物が、凍結乾燥形態から再構成された水性ポリメラーゼ製剤を使用して調製される場合等）。いくつかのこのような実施形態では、凍結保護剤はトレハロースであり、トレハロースは、例えば、約０．１Ｍ～約０．２Ｍの濃度で反応混合物中に存在し得る。トレハロースを含む反応混合物のいくつかの変形例では、トレハロースは約０．１５Ｍの濃度で存在する。

【0170】

上記の反応混合物は、増幅アッセイを行うための１またはそれを超える追加の成分を更に含み得る。例えば、反応混合物は、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを更に含有し得る。いくつかのこのような実施形態では、反応混合物は、増幅アッセイの複数サイクルで標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマー（例えば、第１の増幅オリゴマーおよび第２の増幅オリゴマー）を含有する。他の相互に排他的でない変形例では、反応混合物は、増幅される標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを含む。増幅反応混合物に使用するための検出プローブオリゴマーは、典型的には、例えば化学発光化合物またはフルオロフォア等の検出可能な標識を含む。特定の実施形態では、反応混合物中の少なくとも２つの増幅オリゴマーおよび少なくとも１つの検出プローブオリゴマーは、標的領域を増幅し、例えばリアルタイムＰＣＲアッセイまたはリアルタイム転写媒介増幅（ＴＭＡ）アッセイ等でリアルタイムで増幅産物を検出するように構成される。リアルタイム検出のための特に適切な検出プローブオリゴマーには、蛍光標識および非蛍光クエンチャー（例えば、加水分解プローブ、分子トーチ、または分子ビーコン）を含むオリゴマーが含まれる。

【0171】

他の相互に排他的でない実施形態では、反応混合物は、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、無機塩（例えば、ＫＣｌ）、および補因子から選択される１またはそれを超える追加の適切な増幅アッセイ成分を含む。いくつかの変形例では、キレート剤はＥＤＴＡであり、例えば、約０．０２５ｍＭ～約０．２５ｍＭ（例えば、約０．０８ｍＭの濃度で）の濃度で存在してもよい。特に適切な補因子は塩化マグネシウムであり、これは例えば約１ｍＭ～約５ｍＭの濃度で存在し得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、上記のような反応混合物は、標的核酸または標的核酸を含有すると疑われる試料を更に含む。例えば、少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む上記のような反応混合物は、少なくとも１つの増幅オリゴマーによって標的化される標的核酸、または標的核酸を含有すると疑われる試料を更に含有し得る。標的核酸は、目的の任意の標的核酸であってもよく、ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。特定の実施形態では、標的核酸は、ウイルス、細菌、原虫、真菌、またはヒトもしくは動物の疾患の原因となる他の微生物等の病原体に由来する。

【0173】

いくつかの実施形態では、上記の反応混合物は、少なくとも１つの洗浄剤を更に含む。例えば、反応混合物は、標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料から反応混合物に導入される少なくとも１つの洗浄剤を含有してもよく、試料は、試料抽出に使用される１またはそれを超える残留洗浄剤を含有する。特定の変形例では、洗浄剤は、例えばドデシル硫酸塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸カリウムまたはドデシル硫酸リチウム（本明細書ではラウリル硫酸リチウムとも呼ばれる））またはＮ－ラウロイルサルコシン等のアニオン性洗浄剤である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄剤を含有する試料は、体積で反応混合物の少なくとも約２０％または少なくとも約４０％を構成する。より具体的な変形例では、少なくとも１つの洗浄剤を含有する試料は、体積で反応混合物の約４０％～約５０％、約５０％～約７０％、約２０％～約３３％、約４２．９％、または約６２．５％を構成する。

【0174】

他の態様では、本発明は、増幅反応混合物を調製する方法を提供する。特定の実施形態では、反応混合物を調製する方法は、（ａ）記の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）水性ポリメラーゼ製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマー（例えば、少なくとも２つの増幅オリゴマー）を含有する第２の製剤と混合することと、を含む。他の実施形態では、反応混合物を調製する方法は、（ａ）上記の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、（ｂ）凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して再構成製剤を提供することと、（ｃ）再構成製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマー（例えば、少なくとも２つの増幅オリゴマー）を含む第２の製剤と混合することと、を含む。適したポリメラーゼとしては、上記のポリメラーゼ製剤または反応混合物に適したものが挙げられる。特定の変形例では、上記の方法は、水性または再構成製剤を１またはそれを超える追加の増幅アッセイ成分と混合することを更に含む。そのような追加の成分（複数可）は、第２の製剤内に含有されてもよく、または水性もしくは再構成ポリメラーゼ製剤と混合された１もしくはそれを超える別個の製剤に含有されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような１またはそれを超える追加の成分は、（ｉ）標的領域（例えば、化学発光標識もしくは蛍光標識等の標識を含むか、または蛍光標識および非蛍光クエンチャーを含むプローブ）内に含有される配列決定された標的に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマー、（ｉｉ）ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、（ｉｉｉ）少なくとも１つのキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、ならびに／または（ｉｖ）少なくとも１つの補因子（例えば、塩化マグネシウム）を含む。いくつかの実施形態では、水性または再構成ポリメラーゼ製剤は、本明細書に記載のヌクレオチド三リン酸および／またはキレート剤を更に含む製剤であり、水性または再構成製剤と混合された１またはそれを超える追加の成分は、（ｉ）標的領域内に含有される配列決定された標的に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマー、および／または（ｉｉ）少なくとも１つの補因子を含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、反応混合物を調製するための方法は、標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と、水性もしくは再構成製剤、または水性もしくは再構成製剤を含む上記の混合物を混合することを更に含む。いくつかのこのような実施形態では、試料は、生物学的試料を１またはそれを超える洗浄剤で処理することに由来する抽出試料であり、それにより、抽出試料は残留成分として１またはそれを超える洗浄剤を含有する。残留洗浄剤は、例えばドデシル硫酸塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸カリウムまたはドデシル硫酸リチウム）またはＮ－ラウロイルサルコシン等のアニオン性洗浄剤であってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出された試料は、体積で反応混合物の少なくとも約２０％または少なくとも約４０％（例えば、体積で反応混合物の約４０％～約５０％、約５０％～約７０％、約２０％～約３３％、約４２．９％、または約６２．５％）を構成する。

【0176】

上記のように反応混合物を調製するための方法の特定の実施形態では、混合物成分の最終アッセイ濃度は、増幅反応混合物について本明細書で前述した濃度を含み得る。例えば、α－シクロデキストリンを約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度まで混合してもよく、ポリソルベート２０を、約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度まで混合してもよく、Ｔｒｉｓを、存在する場合、約５ｍＭ～約５０ｍＭの濃度まで混合してもよく、ＥＤＴＡを、存在する場合、約０．０２５ｍＭ～約０．２５ｍＭの濃度まで混合してもよく、トレハロースを、存在する場合、約０．１Ｍ～約０．２Ｍの濃度に混合してもよく、および／または塩化マグネシウムを、存在する場合、約１ｍＭ～約５ｍＭの濃度まで混合してもよい。

【0177】

他の態様では、本発明は、増幅反応を行うための方法を提供する。特定の実施形態では、本方法は、（ａ）標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料を提供することと、（ｂ）試料を、少なくとも１つのポリメラーゼと、α－シクロデキストリンと、ポリソルベート２０と、少なくとも１つの緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ）と、核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）と、少なくとも１つの補因子（例えば、塩化マグネシウム）と、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマー（例えば、少なくとも２つの増幅オリゴマー）と、を含む水性混合物と接触させることと、を含み、試料を水性混合物と接触させることにより、α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する反応混合物を提供する、試料を水性混合物と接触させることと、（ｃ）反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、標的核酸が、試料中に存在する場合、標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用される、反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を行うことと、を含む。適したポリメラーゼとしては、上記のポリメラーゼ製剤または反応混合物に適したものが挙げられる。特定の変形例では、上記のような方法は、試料を、１またはそれを超える追加のアッセイ成分、例えば、１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマー、および／または（ｉｉｉ）少なくとも１つのキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）と接触させることを更に含む。ポリメラーゼを含む水性混合物は、例えばトレハロース等の凍結保護剤（例えば、水性製剤が再構成される凍結乾燥製剤に使用される）を更に含有し得る。混合物成分の最終増幅アッセイ濃度は、増幅反応混合物について本明細書で前述した濃度を含み得る。標的核酸の標的領域の増幅は、例えば、いくつか例を挙げると、転写関連増幅（例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）または核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ））、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、レプリカーゼ媒介増幅、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む様々な既知の核酸増幅反応を使用して達成することができる。

【0178】

上記のように増幅反応を行うための方法のいくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料を１またはそれを超える洗浄剤で処理することに由来する抽出試料であり、それにより、抽出試料は、残留成分として１またはそれを超える洗浄剤を含有する。残留洗浄剤は、例えばドデシル硫酸塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸カリウムまたはドデシル硫酸リチウム）またはＮ－ラウロイルサルコシン等のアニオン性洗浄剤であってもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出された試料は、体積で反応混合物の少なくとも約２０％または少なくとも約４０％（例えば、体積で反応混合物の約４０％～約５０％、約５０％～約７０％、約２０％～約３３％、約４２．９％、または約６２．５％）を構成する。

【0179】

特定の実施形態では、上記のような増幅反応を行うための方法は、増幅前の試料中の他の成分から標的核酸を精製する工程を更に含む。そのような精製は、試料に含有される生物を他の試料成分から分離および／もしくは濃縮する方法、または非核酸試料成分、例えばタンパク質、炭水化物、塩、脂質等を除去もしくは分解する方法を含み得る。特定の実施形態では、標的核酸は、特異的または非特異的に捕捉され、他の試料成分から分離される。標的捕捉は、典型的には、ハイブリダイズ条件下で標的核酸の標的配列にハイブリダイズする１またはそれを超える捕捉プローブオリゴマーを含有する溶液相混合物中で起こる。捕捉プローブテールを含む実施形態の場合、標的：捕捉－プローブ複合体は、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするハイブリダイゼーション条件を使用することによって捕捉される。特定の実施形態は、粒子状固体支持体、例えば常磁性ビーズを使用する。選択的および非特異的標的捕捉方法は、例えば、米国特許第６，１１０，６７８号および国際特許出願公開第２００８／０１６９８８号（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。いくつかの実施形態では、精製工程（例えば、特異的または非特異的な標的捕捉を含む精製工程）は、例えばアニオン性洗浄剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸リチウム）等の１またはそれを超える洗浄剤を利用する。

【0180】

上記のような標的核酸を増幅するための方法は、１またはそれを超えるアンプリコンを検出することを更に含み得る。検出工程は、例えば、増幅産物を標識検出プローブとハイブリダイズさせ、標識プローブから生じるシグナル（いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション後にプローブから放出された標識を含む）を検出すること等によって、増幅された標的配列に特異的に関連するシグナルを検出するための様々な公知の技術のいずれかを使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、標識プローブは、第１の標識と相互作用するクエンチャーまたは他の部分等の第２の部分を含む。検出は、増幅反応の完了後に行ってもよく、標的領域の増幅と同時に、例えばリアルタイムで行ってもよい。リアルタイム検出を使用する特定の変形例では、検出プローブは、例えば、分子ビーコン、分子トーチ、またはプローブが増幅産物（例えば、蛍光標識と消光部分の両方を含む二重標識ヘアピンプローブ）に結合したときに検出されるレポーター部分で標識されたハイブリダイゼーションスイッチプローブ等のヘアピンプローブであり得る。リアルタイム検出のための他の実施形態では、検出プローブは、例えば、フルオロフォアと消光部分（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）の両方で標識されたオリゴマー等の線状オリゴマーである。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。そのようなプローブの様々な形態が以前に記載されている（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号；同第５，１１８，８０１号；５，３１２，７２８号；同第５，９２５，５１７号；同第６，１５０，０９７号；同第６，８４９，４１２号；同第６，８３５，５４２号；同第６，５３４，２７４号；および同第６，３６１，９４５号；ならびに米国特許出願公開２００６００６８４１７号Ａ１および同第２００６０１９４２４０号Ａ１を参照；それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）。

【実施例】

【0181】

以下の実施例は、特定の開示された実施形態を説明するために提供され、決して本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0182】

実施例１
洗浄剤を含有する試料で試験するために、いくつかのＰＣＲ反応混合物を調製した。０．４６Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、０．５Ｕ／μＬの逆転写酵素、０．２Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、それぞれ０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、０．０５ｍＭのｄＵＴＰ、８１ｍＭおよび５．１ｍＭのＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含む無機塩、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ならびにインフルエンザＡ標的核酸の増幅および検出のためのいくつかのプライマーおよびプローブ（配列番号８～１４、０．６４μＭ～１．２９μＭ）を含有するように初期マスターミックスを調製した。１．０Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、３．２Ｕ／μＬの逆転写酵素、０．５３ｍＭのｄＮＴＰ、１．０６ｍＭのｄＵＴＰ、１７３ｍＭおよび１０．９３ｍＭのＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含む無機塩、０．２１ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに同じ標的核酸の増幅および検出のためのいくつかのプライマーおよびプローブ（配列番号８～１４、０．６４μＭ～１．２９μＭ）を含有するように第２のマスターミックスを調製した。初期マスターミックスを条件（Ａ）～（Ｆ）に分け、条件（Ｂ）および（Ｄ）は、０．０２５％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を更に含有し、条件（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｆ）は１２．５ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンを更に含有し、条件（Ｃ）は０．１３％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を更に含有し、条件（Ｅ）は５０ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンを更に含有した。

【0183】

試料は、８．３コピー／ｍＬのインフルエンザＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ標的核酸（配列番号７）を、適切な培地、例えば、Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ Ｍ４培地（Ｒｅｍｅｌ Ｉｎｃ．カタログ番号Ｒ１２５００）、Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ Ｍ５ウイルス輸送培地（Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｒ１２５１５）、Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ Ｍ６ウイルス輸送培地（Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｒ１２５３０）、Ｍｉｃｒｏ Ｔｅｓｔ Ｍ４ＲＴウイルス輸送培地（Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｒ １２５０５）またはＣｏｐａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ輸送培地（Ｃｏｐａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号３３０Ｃ）にスパイクすることによって調製した。標的核酸は、配列番号７のＲＮＡ転写物であった。３６０μＬの調製された試料を、１００μｇのポリＴ（配列番号２）被覆磁性微粒子および２０ピコモルの標的捕捉オリゴマー（配列番号１）を含有する緩衝試薬中、９３６μＬの最終反応体積で別々にインキュベートして、標的核酸を磁性固体支持体に結合させた。磁場の印加によって磁性微粒子および結合核酸を溶液から分離し、［捕捉標的］：［捕捉プローブ］：［磁性微粒子］の組み合わせから上清を除去した。次いで、磁性微粒子を洗浄緩衝液に再懸濁した。再懸濁した微粒子をもう１回の分離、上清除去、および洗浄緩衝液中での再懸濁に供した。２回目の洗浄緩衝液の分離および除去後、微粒子を５０ｕＬの溶出緩衝液（保存剤を含む水中５ｍＭ Ｔｒｉｓ）中でインキュベートした。磁場の印加により磁性粒子を分離し、核酸を含有する溶出液を回収した。溶出液を別々の容器に分割し、溶出液部分の一方に３０％（ｖ／ｖ）の洗浄緩衝液を更にスパイクして、１００ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶出液を生成して、上流の試料処理工程からの洗浄緩衝液のキャリーオーバをシミュレートした。洗浄緩衝液中に存在する洗浄剤は、核酸増幅反応を阻害または減少させることが知られている。

【0184】

上記マスターミックス条件（Ａ）～（Ｆ）のそれぞれをマルチウェルプレートのウェルに添加し、洗浄緩衝液をスパイクした溶出液のアリコートおよび洗浄緩衝液を含まない溶出液（２０μＬマスターミックス、１０μＬ溶出液、３０μＬ総反応体積）と合わせた。各条件は、１９の複製で調製した条件（Ｅ）を除いて、２０の複製で調製した。リアルタイム増幅および検出反応を条件ごとに２０（１９）の複製について設定し、反応を熱サイクル機器（Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。結果を以下の表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0185】

これらのデータは、α－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０の反応混合物への添加が、洗浄緩衝液洗浄剤が核酸増幅反応に及ぼすマイナスの効果／阻害効果を緩和したことを示す。これらのデータはまた、これらの２つの試薬の組み合わせが、α－シクロデキストリン単独またはポリソルベート２０単独のいずれかを使用して観察された緩和効果と比較して、洗浄緩衝液誘導阻害に対して相乗的な緩和効果を有したことを示す。

【0186】

実施例２
ＰＣＲマスター混合物を実質的に実施例１に記載のように調製し、第２のマスター混合物と呼んだ。このマスター混合物において、プライマーおよびプローブは配列番号４～６であり、マスター混合物は更に０．４Ｍトレハロースを含有していた。マスター混合物を別々の条件に分離し、条件（Ｇ１）は更に２６．７ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンおよび０．００５７％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、条件（Ｇ２）は更に２８．０ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンおよび０．００６３％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、条件（Ｇ３）は更に２５．４ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンおよび０．００５１％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、（Ｇ４）はさらなる添加剤を含有しなかった。

【0187】

季節性コロナウイルス型ＯＣ４３（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘカタログ番号０８１００２４ＣＦ）を全血試料マトリックスまたは試料輸送培地（ＳＴＭ）にスパイクして、各試料タイプにおいて０．１２５ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの最終ウイルス力価を得た。４００ｕＬの全血マトリックスまたはＳＴＭマトリックスを、１００μｇのポリＴ（配列番号２）被覆磁性微粒子および２０ピコモルの標的捕捉オリゴマー（配列番号３）を含有する緩衝試薬中、９７６μＬの最終反応体積で別々にインキュベートして、標的核酸を磁性固体支持体に結合させた。磁性微粒子と結合した核酸とを実施例１において概説したように分離し、標的核酸を含む溶出液を回収した。次いで、溶出液を２等分し、１部に、溶出液を３０％（ｖ／ｖ）の洗浄緩衝液で更にスパイクして、１００ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶出液を生成し、上流の試料処理工程からの洗浄緩衝液のキャリーオーバをシミュレートした。洗浄緩衝液中に存在する洗浄剤は、核酸増幅反応を阻害または減少させることが知られている。

【0188】

上記マスターミックス条件（Ｇ１）～（Ｇ４）の各々をマルチウェルプレートのウェルに添加し、洗浄緩衝液スパイク溶出液のアリコートまたは洗浄緩衝液スパイクを受けなかった溶出液のアリコート（（Ｇ４）条件が、２０μＬマスターミックス、５μＬ溶出液、２５μＬ総体積である以外は、１５μＬマスターミックス、２５μＬ溶出液、４０μＬ総反応体積、）と組み合わせた。非スパイク溶出液を含む条件（Ｇ１）を２０の複製で調製したことを除いて、各条件を２４の複製で調製した。ＲＴ－ＰＣＴ反応を、熱サイクル機器（Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して行った。条件（Ｇ４）は、１５μＬマスターミックスおよび２５μＬ溶出液を使用して調製した場合よりも５．３倍少ない標的核酸を有するように調製される。したがって、同一の反応条件下で、（Ｇ４）は、代替反応条件（理論的に２．４のＣｔ）を用いて調製した場合よりも高いＣｔを有する。結果を以下の表２に示す。

【表2】

【0189】

これらのデータは、条件（Ｇ４）と比較して、条件（Ｇ１）、（Ｇ２）および（Ｇ３）についてより低いＣｔ値およびより高いＲＦＵ値を示す。条件（Ｇ４）ａに対して比較すると、これらのデータは、－５．１、－５．３、および－４．７のＣｔ改善を示し、条件（Ｇ１）ａ、（Ｇ２）ａ、および（Ｇ３）ａに対してそれぞれ＋１１２％、＋１２７％、および＋１０２％のＲＦＵ改善を示す。（Ｇ４）ｂと比較して、これらのデータは、－３．２、－３．４、および－３．０のＣｔ改善を示し、条件（Ｇ１）ｂ、（Ｇ２）ｂ、および（Ｇ３）ｂについてそれぞれ＋６１％、＋７２％、および＋５６％のＲＦＵ改善を示す。（Ｇ４）ｃと比較して、これらのデータは、－５．５、－５．５、および－６．４のＣｔ改善を示し、条件（Ｇ１）ｃ、（Ｇ２）ｃ、および（Ｇ３）ｃについてそれぞれ＋７２％、＋３５％、および＋６７％のＲＦＵ改善を示す。（Ｇ４）ｄと比較して、これらのデータは、－３．２、－４．１、および－３．２のＣｔ改善を示し、条件（Ｇ１）ｄ、（Ｇ２）ｄ、および（Ｇ３）ｄについてそれぞれ＋５７％、＋４４％、および＋４６％のＲＦＵ改善を示す。これらの結果は、阻害物質を含有し、様々な濃度のα－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０で処置した試料を、そのような処置を行わない阻害物質を含有する試料と比較した場合、Ｃｔの実質的な改善を示す。

【0190】

実施例３
季節性コロナウイルス型ＯＣ４３（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘカタログ番号０８１００２４ＣＦ）をいくつかの血漿および血清試料にスパイクして、１．１５ｍＬの総試料体積で７０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの最終ＯＣ４３ウイルス力価を得た。次いで、スパイクした試料を、１０％（ｖ／ｖ）ラウリル硫酸リチウムを含む試薬と合わせた。この試薬の他の成分には、緩衝液、塩、配列番号２でコーティングされた磁性粒子、配列番号１、および標的捕捉オリゴマー（配列番号３）が含まれた。各試料をオービタルシェーカー（約２００ｒｐｍ、１分）で混合した。次いで、試料を４３℃の水浴中で４分間、次いで６３℃で２９分間、次いで４３℃で１５分間インキュベートした。磁場の印加により磁性粒子を分離し、核酸を含有する溶出液を回収した。それぞれが配列番号４、５および６、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素ｄＮＴＰ、無機塩、ＢＳＡおよびＲＮａｓｅ阻害剤を含有する２つの逆転写ＰＣＲ反応混合物を調製した。ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物の一方は、１２．５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０および０．００２６％（ｖ／ｖ）のα－シクロデキストリンを更に含有していた。２０μＬのＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を各試料タイプからの５μＬの溶出液と合わせて、以下の４つの条件を調製した：（Ａ）ポリソルベート２０およびα－シクロデキストリンを含有するＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を含む血漿試料溶出液、（Ｂ）ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を含む血漿試料溶出液－ニート（ｎｅａｔ）、（Ｃ）ポリソルベート２０およびα－シクロデキストリンを含有するＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を含む血清試料溶出液、ならびに（Ｄ）ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を含む血清試料溶出液－ニート。ＲＴ－ＰＣＲ反応を９～１１の複製で調製し（表３参照）、内部対照をスパイクした。ＲＴ－ＰＣＲ反応を行い、データを表３に示す。

【表3】

【0191】

表３のデータは、残留ＬＬＳの存在下で、試料が、ＬＬＳの影響を緩和する試薬を含有する反応物について生成されたものよりも高いＣｔ、低いＲＦＵおよびより高い試料間変動性を有するＲＴ－ＰＣＲ結果を生成したことを示す。これは、α－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０の添加がＲＮＡの検出に１ｌｏｇ超（添加剤ありでは４Ｃｔ超低い）有意に役立ったことを示す。

【0192】

実施例４
α－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０を含有する一連の水性混合物を調製した。この一連の混合物を、一定濃度のポリソルベート２０を用いて設定し、いくつかの濃度のα－シクロデキストリンと組み合わせたか、または一定濃度のα－シクロデキストリンを用いて、いくつかの異なる濃度のポリソルベート２０と組み合わせた（表４）。混合物１～７中の各組み合わせは、核酸増幅反応混合物中の洗浄剤の阻害効果を緩和するのに有効であった。各水性混合物を氷上で１時間保持し、次いで混合物を遠心分離して沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）が存在するかどうかを評価した。氷上での１時間のインキュベーション後、混合物１～６中に様々なレベルの沈殿物が見られた。

【表4】

【0193】

様々な濃度のα－シクロデキストリンおよびポリソルベート２０を含有するように、いくつかの乾燥ＲＴ－ＰＣＲ反応混合物を調製した。ＲＴ－ＰＣＲマスター混合物を、１．０Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、３．２Ｕ／μＬの逆転写酵素、０．４Ｍトレハロース、０．５３ｍＭのｄＮＴＰ、１．０６ｍＭのｄＵＴＰ、０．２１ｍＭのＥＤＴＡ、１．６μＭの各配列番号４および５、ならびに１．０７μＭの配列番号６を含有するように調製した。次いで、このマスターミックスを別々の条件に分け、条件（１）は１６ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンおよび０．００３４％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、条件（２）は２０ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリンおよび０．０２％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０を含有し、条件（３）はα－シクロデキストリンもポリソルベート２０も含有しなかった。次いで、これらの条件のそれぞれを、条件ごとにいくつかの反応ウェルに２４μＬでアリコートし、アリコートを凍結乾燥技術を使用して乾燥させて、単回単位用量凍結乾燥ペレットを形成した。

【0194】

季節性コロナウイルス型ＯＣ４３（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘカタログ番号０８１００２４ＣＦ）を全血試料マトリックス、血漿試料マトリックス、血清試料マトリックス、または試料輸送培地（ＳＴＭ）にスパイクして、各試料タイプにおいて１４．２ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬの最終ウイルス力価を得た。４００μＬの全血マトリックス、または２００μＬの血漿もしくは血清マトリックス、または３６０μＬのＳＴＭマトリックスを、１００μｇのポリＴ（配列番号２）被覆磁性微粒子および２０ピコモルの標的捕捉オリゴマー（配列番号３）を含有する緩衝試薬中、９３６μＬの最終反応体積で別々にインキュベートして、標的核酸を磁性固体支持体に結合させた。磁性微粒子と結合した核酸とを実施例１において概説したように分離し、標的核酸を含む溶出液を回収した。次いで、溶出液を２等分し、１部に、溶出液を３０％（ｖ／ｖ）の洗浄緩衝液で更にスパイクして、１００ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含有する溶出液を生成し、上流の試料処理工程からの洗浄緩衝液のキャリーオーバをシミュレートした。

【0195】

条件（１）～（３）の凍結乾燥ペレットを、それぞれＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液２５μＬで再水和し、再水和した反応混合物１５μＬを条件（１）および（２）の溶出液２５μＬと合わせ、再水和した反応混合物（３）２０μＬを５μＬの溶出液と（いずれも複製６で）合わせた。ＲＴ－ＰＣＴ反応は、熱サイクル機器を使用して行った。結果を表５に示す。

【表5】

【0196】

これらのデータは、α－シクロデキストリンとポリソルベート２０との組み合わせを含有する反応について、これらの添加剤を含まない同等の反応と比較して、より低いＣｔ値およびより高いＲＦＵ値を示す。

【0197】

実施例５
０．６５Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ、それぞれ０．３５ｍＭのｄＮＴＰ、０．７ｍＭのｄＵＴＰ、８１および５．１ｍＭのＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２を含む無機塩、０．２６Ｍのトレハロース、０．１４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、１７．５ｍｇ／ｍＬのα－シクロデキストリン、および０．００３５％のポリソルベート２０からなる増幅試薬混合物を調製した。試薬混合物は、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）に特異的なプライマーおよびプローブ（配列番号１５～１７；表６を参照）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）検出に特異的なプライマーおよびプローブ（配列番号１８～２０；表６を参照）のいずれかを含有していた。

【0198】

試料は、血液輸送培地に１：４の比で希釈されたヒト全血、尿輸送培地に１：２の比で希釈されたヒト尿、または希釈されていないヒト血漿からなった。これらの試料の各々４００μＬを、２７０μｇのポリＴ（配列番号２；５’－（Ｔ）１４－３’）被覆磁性微粒子および２２０ピコモルの標的捕捉オリゴマー（配列番号１；５’－（Ｋ）１８（Ｔ）３（Ａ）３０－３’）を含有する９７６μＬの最終反応体積で別々にインキュベートして、標的核酸を磁性固体支持体に結合させた。磁場の印加によって磁性微粒子および結合核酸を溶液から分離し、［捕捉標的］：［捕捉プローブ］：［磁性微粒子］の組み合わせから上清を除去した。次いで、磁性微粒子を洗浄緩衝液に再懸濁した。再懸濁した微粒子をもう１回の分離、上清除去、および洗浄緩衝液中での再懸濁に供した。２回目の洗浄緩衝液の分離および除去後、微粒子を５０μＬの溶出緩衝液（保存剤を含む水中５ｍＭ Ｔｒｉｓ）中でインキュベートした。磁場の印加により磁性粒子を分離し、核酸を含有する溶出液を回収した。

【0199】

上記のマスターミックス条件のそれぞれをマルチウェルプレート（２０μＬマスターミックス、１５μＬ溶出液、３５μＬ総反応体積）のウェル内で合わせた。抽出された試料についてリアルタイム増幅および検出反応を設定し、熱サイクル機器（Ｐａｎｔｈｅｒ Ｆｕｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して反応を行った。

【0200】

ＥＢＶ検出の直線性を、血液輸送培地で希釈したヒト全血については２．４５ｌｏｇＩＵ／ｍＬ～９．８６ｌｏｇＩＵ／ｍＬの範囲にわたって、および希釈していないヒト血漿については１．９８ｌｏｇＩＵ／ｍＬ～９．２６ｌｏｇＩＵ／ｍＬの範囲にわたって評価した。ＢＫＶ検出の直線性を、尿輸送培地で希釈したヒト尿については２．１１ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬ～９．３８ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬの範囲にわたって、および未希釈ヒト血漿については１．８０ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬ～９．０８ｌｏｇ ＩＵ／ｍＬの範囲にわたって評価した。直線性は、全ての条件について試験した範囲にわたって実証された。

【表6-1】

【表6-2】

【0201】

以上から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【配列表】

2024524334000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-01-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

水性ポリメラーゼ製剤であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、水性ポリメラーゼ製剤。

【請求項2】

凍結保護剤を更に含む、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）請求項２に記載の水性製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を凍結乾燥して、前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を形成することとを含む、方法。

【請求項4】

請求項３に記載の方法によって調製された、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【請求項5】

請求項２に記載の水性製剤への再構成を可能にする、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。

【請求項6】

水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）請求項４または５に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと
を含む、方法。

【請求項7】

キットであって、
請求項４または５に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含有する第１の密封容器を含む、キット。

【請求項8】

増幅反応混合物であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、増幅反応混合物。

【請求項9】

増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと
を含む、方法。

【請求項10】

増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）請求項４または５に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと、
（ｃ）前記再構成製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと、
（ｄ）工程（ｃ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合することであって、前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料であることと
を含む、方法。

【請求項11】

前記再構成製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が前記反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

増幅反応を行うための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有する試料を提供することであって、前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料であることと、
（ｂ）前記試料を、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
α－シクロデキストリンと、
ポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸と、
少なくとも１つの補因子と、
前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーと、を含む水性混合物と接触させることであって、
前記試料を前記水性混合物と接触させることにより、前記α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する反応混合物を提供することと、
（ｃ）前記反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、前記標的核酸が、前記試料中に存在する場合、前記標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用されることと
を含む、方法。

【請求項15】

前記１またはそれを超えるアンプリコンを検出することを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記検出する工程が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応物を、前記１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記検出する工程が、リアルタイムで行われる、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

前記水性混合物が、凍結保護剤を更に含み、前記水性混合物が、凍結乾燥製剤から再構成される、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記標的核酸を含有する試料が、工程（ｂ）で生成された前記反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、請求項１４に記載の方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０２０１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0201】

以上から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることが理解されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
水性ポリメラーゼ製剤であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００２％～約０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、水性ポリメラーゼ製剤。
（項目２）
前記α－シクロデキストリン濃度が、約１６ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、項目１に記載の製剤。
（項目３）
前記α－シクロデキストリン濃度が、約２０ｍｇ／ｍＬ、約１７．５ｍｇ／ｍＬ、または約１２．５ｍｇ／ｍＬである、項目１に記載の製剤。
（項目４）
前記ポリソルベート２０の濃度が、約０．００３％～約０．０３％（ｖ／ｖ）である、項目１～３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目５）
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００４２％（ｖ／ｖ）、約０．００３５％（ｖ／ｖ）、約０．００２６％（ｖ／ｖ）または約０．０２％（ｖ／ｖ）である、項目１～３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目５）
項目５ａ。前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目１～５のいずれか一項に記載の製剤。
（項目６）
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、項目１～５ａのいずれか一項に記載の製剤。
（項目７）
凍結保護剤を更に含む、項目１～６のいずれか一項に記載の製剤。
（項目８）
前記凍結保護剤が、トレハロースである、項目７に記載の製剤。
（項目９）
前記トレハロースが、約０．２Ｍ～約０．４Ｍの濃度で存在する、項目８に記載の製剤。
（項目１０）
前記トレハロースが、約０．２６Ｍまたは約０．３Ｍの濃度で存在する、項目９に記載の製剤。
（項目１１）
凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）項目７～１０のいずれか一項に記載の水性製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を凍結乾燥して、前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を形成することとを含む、方法。
（項目１２）
項目１１に記載の方法によって調製された、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。
（項目１３）
項目７～１０のいずれか一項に記載の水性製剤への再構成を可能にする、凍結乾燥ポリメラーゼ製剤。
（項目１４）
水性ポリメラーゼ製剤を調製する方法であって、
（ａ）項目１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと
を含む、方法。
（項目１５）
キットであって、
項目１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を含有する第１の密封容器を含む、キット。
（項目１６）
希釈剤を含有する第２の密封容器を更に含む、項目１５に記載のキット。
（項目１７）
増幅反応混合物であって、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度のα－シクロデキストリンと、
約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
を含む、増幅反応混合物。
（項目１８）
前記α－シクロデキストリン濃度が、約８ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬである、項目１７に記載の反応混合物。
（項目１９）
前記α－シクロデキストリン濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬである、項目１７に記載の反応混合物。
（項目２０）
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００１５％～約０．０１５％（ｖ／ｖ）である、項目１７～１９のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２１）
前記ポリソルベート２０濃度が、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００２１％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）である、項目１７～１９のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２２）
前記少なくとも１つのポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、項目１７～２１のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２３）
凍結保護剤を更に含む、項目１７～２２のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２４）
前記凍結保護剤が、トレハロースである、項目２３に記載の反応混合物。
（項目２５）
前記トレハロースが、約０．１Ｍ～約０．２９Ｍの濃度で存在する、項目２４に記載の反応混合物。
（項目２６）
前記トレハロースが、約０．１５Ｍの濃度で存在する、項目２５に記載の反応混合物。
（項目２７）
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸を更に含む、項目１７～２６のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２８）
標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも２つの増幅オリゴマーを更に含む、項目１７～２７のいずれか一項に記載の反応混合物。
（項目２９）
前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーを更に含む、項目２８に記載の反応混合物。
（項目３０）
前記標的核酸を更に含む、項目２８または２９に記載の反応混合物。
（項目３１）
少なくとも１つの洗浄剤を更に含む、項目３０に記載の反応混合物。
（項目３２）
前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、項目３１に記載の反応混合物。
（項目３３）
増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）項目１～１０のいずれか一項に記載の水性ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記水性製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと
を含む、方法。
（項目３４）
前記水性製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
工程（ｂ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合することを更に含む、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
増幅反応混合物を調製する方法であって、
（ａ）項目１２または１３に記載の凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を提供することと、
（ｂ）前記凍結乾燥ポリメラーゼ製剤を希釈剤に溶解して、再構成製剤を提供することと、
（ｃ）前記再構成製剤を、標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーを含む第２の製剤と混合することと、
を含む、方法。
（項目３７）
前記再構成製剤を、前記標的領域内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと混合することを更に含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
工程（ｃ）で生成された前記混合物を、前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料と混合する工程を更に含む、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、項目３５または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記標的核酸を含有するまたは含有すると疑われる試料が反応混合物の少なくとも約４０％を構成する、項目３５および３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
増幅反応を行うための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有する試料を提供することと、
（ｂ）前記試料を、
少なくとも１つのポリメラーゼと、
α－シクロデキストリンと、
ポリソルベート２０と、
少なくとも１つの緩衝剤と、
核酸増幅を行うのに適したヌクレオチド三リン酸と、
少なくとも１つの補因子と、
前記標的核酸の標的領域を増幅するように構成された少なくとも１つの増幅オリゴマーと、を含む水性混合物と接触させることであって、
前記試料を前記水性混合物と接触させることにより、前記α－シクロデキストリンが約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ポリソルベート２０が約０．００１％～約０．０２５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する反応混合物を提供することと、
（ｃ）前記反応混合物を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応を実施することであって、前記標的核酸が、前記試料中に存在する場合、前記標的領域に対応する１またはそれを超えるアンプリコンを生成するための鋳型として使用されることと
を含む、方法。
（項目４３）
前記１またはそれを超えるアンプリコンを検出することを更に含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記検出する工程が、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸増幅反応物を、前記１またはそれを超えるアンプリコン内に含有される標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記検出する工程が、リアルタイムで行われる、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記試料が、少なくとも１つの洗浄剤を含有する抽出試料である、項目４２～４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記少なくとも１つの洗浄剤がアニオン性洗浄剤であり、必要に応じて、前記アニオン性洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）である、項目４６に記載の方法。

【国際調査報告】