特表 2024-524351 自動プラスミド抽出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】自動プラスミド抽出

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240628BHJP

   B01J 41/12 20170101ALI20240628BHJP

   B01J 49/60 20170101ALI20240628BHJP

   B01J 41/20 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 100Z

B01J41/12

B01J49/60

B01J41/20

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580349

(86)(22)【出願日】2022-07-04

(85)【翻訳文提出日】2024-02-26

(86)【国際出願番号】 EP2022068461

(87)【国際公開番号】W WO2023275406

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】BE2021/5517

(32)【優先日】2021-07-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523324797

【氏名又は名称】エクスプレス バイオロジクス

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドーカン マルク

(72)【発明者】

【氏名】ルドン フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ロドリゲス クリスチャン

(57)【要約】

微生物から不連続的にプラスミドを抽出し、目的のプラスミドを精製する方法であって、方法は、穏やかな機械的攪拌下に、中和溶液を添加し、次いで複数のオリフィスを介して沈殿溶液を添加することを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物によって合成されたプラスミドを抽出する方法であって、以下の連続したステップを含み、
前記連続したステップは、
抽出ポンプ（８）に結合された容器（１）を取得するステップであって、前記容器（１）が機械的攪拌手段（９）を備えるステップと、
抽出される前記プラスミドを含む前記微生物の細胞懸濁液（２）を取得するステップと、
アルカリ溶解液（３）を前記細胞懸濁液（２）に所定流量Ｑ１で添加し、均一な混合物を形成するステップと、
前記均質混合物を前記容器（１）に所定流量Ｑ２で入れるステップと、
所定時間後、好ましくは優しく攪拌しながら、複数のオリフィス（７）を介して、前記容器の酢酸からなる中和溶液（５）を所定流量Ｑ３で添加するステップと、
所定時間後、複数のオリフィス（７）を介して、前記容器の沈殿溶液（６）を所定流量Ｑ４で添加するステップと、
優しく攪拌しながら所定時間後、形成された懸濁液を、前記抽出ポンプ（８）を介して所定流量Ｑ５で抽出するステップと、
抽出された混合物を清澄化し、好ましくは遠心分離して、目的の前記プラスミドを含む清澄化された上清を回収するステップと、である方法。

【請求項2】

前記細胞懸濁液（２）と前記溶解液（３）とは、静的混合システム（４）を介して前記容器の上流で均質化される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶解液（３）は、１２．０～１２．５の間のｐＨを有し、好ましくは、ｐＨは、アルカリの水酸化物によって固定される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記溶解液（２）は、さらに洗浄剤、好ましくは、０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記中和溶液（５）は、４．５～５．７の間のｐＨを有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記中和溶液（５）は、１Ｍを超える濃度の酢酸からなり、好ましくは、前記中和溶液は、酢酸／酢酸混合物によって固定されたｐＨを有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記溶液は、ｐＨ７．０未満、好ましくは６．０未満、好ましくはｐＨ４．５以上、好ましくは５．０以上に中和される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記沈殿溶液（６）は、３．５～６Ｍ、好ましくは約５Ｍの濃度の水溶性カルシウム塩からなる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記沈殿溶液を添加後の溶液のカルシウム濃度は、少なくとも０．８Ｍ、好ましくは少なくとも１．０Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１．２Ｍである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記複数のオリフィス（７）は、有孔配管システムである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記中和溶液の添加に使用される前記複数のオリフィス（７）と前記沈殿溶液の添加に使用される前記複数のオリフィス（７）とは、同じ複数のオリフィス（７）である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記中和液（５）および／または沈殿液（６）は、実質的に前記容器（１）の底部に添加され、好ましくは、前記中和液および／または沈殿液の少なくとも５０重量％は、前記容器の底部２０％に添加される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４およびＱ５は、独立して、０．５Ｌ／分～２５Ｌ／分の間、より好ましくは１Ｌ／分～１０Ｌ／分の間、さらに２Ｌ／分～８Ｌ／分の間である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

穏やかな攪拌は、宿主からプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを剪断するには不十分な剪断応力を発生させる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記溶液は、蠕動ポンプにより添加および／または抽出される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の前記清澄化上清から目的の前記プラスミドを精製するプロセスであって、
前記プラスミドを含む清澄化上清を採取するステップと、
前記清澄化上清を、０．１～０．４μｍ、好ましくは０．１５～０．３μｍ、有利には０．２μｍ付近の気孔率を有するフィルターで濾過し、前記プラスミドを含む濾過溶液を取得するステップと、
任意で、濾過された前記溶液を限外濾過するステップと、
陰イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー研磨ステップであって、好ましくは、ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルシクロヘキシルエーテルを含む溶液により、樹脂上に固定されたプラスミドを洗浄するステップを含む研磨ステップと、
前記プラスミドを最終溶液に製剤化するステップと、
を含むプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細菌によって産生される目的のプラスミドの自動抽出に関する。

【背景技術】

【0002】

大腸菌などの細菌における目的のプラスミドの産生は、アルカリ溶解とそれに続く中和および沈殿ステップと同様に知られている（例えば、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏｌｌｙ，１９７９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，１５１３－１５２３頁）。

【0003】

この方法は、実施が簡単で、バッチモードでうまく機能する。多くてもグラムオーダーのような少量のプラスミドを産生するのに適している。

【0004】

特許出願ＷＯ２０１０／１３６５０３（特にＥＰ２４３５５６９Ｂ１、ＵＳ８，８２２，６７２およびＵＳ９，４１６，４００でも公開されている）には、異なる溶液およびその混合物のための配管配置システムとポンプによる流量制御とに基づく連続プラスミド抽出法が記載されている。一般的には、酢酸／酢酸緩衝液からなる中和溶液に加えて、この方法では濃縮沈殿溶液を添加する。中和溶液と沈殿溶液とは、局所的にベンチュリー効果を生み出すように配管の内径を適合させることによって、均質に混合される。実際、この特許出願の発明者は、このような量の粘性溶液の場合、機械的攪拌は不可能であり、ゲノムＤＮＡやプラスミドさえも剪断する危険性があり、ベンチュリー効果による攪拌とは異なり、容認できないと指摘している。さらに、有利なことに、このシステムは、シングルユースなので、洗浄の必要がない。しかし、このシステムは、精製するプラスミドが非常に大量、例えば１００ｇのプラスミドには非常に効果的であるが、精製するプラスミドが少量である場合には、固定費（シングルユース装置、プラスミドの損失）が大きくなる。

【0005】

したがって、バッチ法では処理しにくく、上記の連続法ではあまり効率的に処理できない量の範囲がある。

【0006】

実際、バッチモードのシステムの効率は、容器の大きさ、溶液を接触させるのにかかる時間、あるいは急速な均質化の必要性などの物理的パラメータによって制限される。このように、バッチモードでは、少量で理想的な精製が達成されるため、混合物をうまくコントロールすることができるが、大規模産生は著しく複雑になる。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、微生物が合成したプラスミドを抽出する方法に関し、
方法は、以下の連続するステップ、
抽出ポンプ８に結合された容器１を取得するステップであって、容器１は機械的攪拌手段９を備えるステップと、
抽出されるプラスミドを含む微生物の細胞懸濁液２を取得するステップと、
アルカリ溶解液３を細胞懸濁液２に所定流量Ｑ１で添加し、均一な混合物を形成するステップと、
均質混合物を容器１に所定流量Ｑ２で入れるステップと、
所定時間後、好ましくは優しく攪拌しながら、容器の酢酸からなる中和溶液５を、複数のオリフィス７を介して、所定流量Ｑ３で添加するステップと、
所定時間後、複数のオリフィス７を介して、容器の沈殿溶液６を所定流量Ｑ４で添加するステップと、
優しく攪拌しながら所定時間後、形成された懸濁液を抽出ポンプ８を介して所定流量Ｑ５で抽出するステップと、
抽出された混合物を清澄化し、好ましくは遠心分離し、目的のプラスミドを含む清澄化された上清を回収するステップと、を備える。

【0008】

この抽出精製されたプラスミドは、そのまま、あるいは滅菌濾過、限外濾過、および／または研磨クロマトグラフィーの後に、有利に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明による容器の半概略図である。

【図2】図２は、本発明による自動化された方法で抽出されたプラスミドのＨＰＬＣ分析を示す。

【図3】図３は、好ましい自動化方法で行われたバリエーション＃１、＃２、＃３、＃４の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明者らは、バッチモード法の柔軟性を保ちながら、大量のプラスミドを処理でき、抽出収量と純度が非常に高いプラスミド抽出法を開発することに成功した。

【0011】

この発明の第１の側面は、合成されたプラスミドを抽出する方法であり、以下の連続するステップを含み、
前記連続するステップは、
抽出ポンプ８に結合された容器１を取得するステップであって、容器１は機械的攪拌手段９を備えるステップと、
抽出されるプラスミドを含む細胞懸濁液２を取得するステップと、
アルカリ溶解液３を細胞懸濁液２に所定流量Ｑ１で添加し、均一な混合物を形成するステップと、
均質混合物を容器１に所定の流量Ｑ２で入れるステップと、
所定時間後、好ましくは優しく攪拌しながら、複数のオリフィス７を介して、容器の酢酸からなる中和溶液５を所定流量Ｑ３で添加するステップと、
所定時間後、複数のオリフィス７を介して、容器の沈殿溶液６を所定流量Ｑ４で添加するステップと、
優しく攪拌しながら所定時間後、形成された懸濁液を、前記抽出ポンプ８を介して所定流量Ｑ５で抽出し、抽出された混合物を清澄化し、好ましくは遠心分離し、目的のプラスミドを含む清澄化された上清を回収するステップと、である。

【0012】

目的のプラスミドを合成する細胞は、一般的には、グラム陰性細菌、例えば大腸菌である。しかしながら、他のグラム陰性細菌、あるいはグラム陽性細菌、あるいは他の微生物、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｓｐ．やＰｉｃｈｉａ Ｓｐ．も適している。

【0013】

プラスミドは、有利には、いわゆる「スーパーコイル状」である。

【0014】

この方法は大きなプラスミドでも機能するので、プラスミドのサイズは制限因子ではない。しかしながら、後述するように、より大きなサイズのプラスミド（例えば１０ｋｂ以上、例えば１０～２０ｋｂの間で、ウイルスベクターをコードするプラスミド、および／または反復配列および／または反転配列からなるプラスミドを含む）は、特にアルカリ溶解培地との接触時間、中和液の添加および接触時間に関して、より正確なタイミング制御を必要とする。

【0015】

容器１の大きさは特に限定されない。容器１が小さすぎると、十分な量のプラスミドを処理することができない。一方、容器１が過剰に大量の溶液で満たされると、ポンピング時間が長くなりすぎる危険性があり、これは異なる時間の制御を複雑にするか、あるいは妨げるので不利である。実際、溶液は１つずつ汲み上げられるので、各ステップの開始時に不均一性がある。

【0016】

本発明者らは、最後に（溶液２＋３＋５＋６を入れた後に）５～１０リットルの溶液を入れた容器１が非常に簡単に使用できることを見出した。一方、最後に（溶液２＋３＋５＋６を入れた後に）１００リットルの溶液を入れた容器１は、コントロールが難しくなりすぎる。したがって、容器の使用可能量の好ましいサイズは、１リットル～５０リットルの間、好ましくは２．５リットル～２０リットルの間、さらに好ましくは５リットル～１０リットルの間である。

【0017】

明らかに、たとえ最大２．５～１０リットルのみ充填することを意図していても、容量がより大きい、あるいは（５０リットルや１００リットルより）かなり大きい容器１を使用することができる。

【0018】

驚くべきことに、本発明者らは、この異質性、潜在的な二重の異質性は、コントロールされている限り、および／または過剰でない限り、致命的ではないことを発見した。

【0019】

例えば、本発明者らは、細胞懸濁液と溶解液との接触時間は、有利には２～５分であると決定した。したがって、本発明者らは、溶液２および３は、例えば１分で、何の問題も生じることなく添加できると推論した。

【0020】

さらに好ましくは、細胞懸濁液２と溶解液３とは、例えば静的混合システム４を介して、容器１の上流で均質化される。

【0021】

本発明の文脈では、「静的ミキサ」という用語は、好ましくは、細胞の懸濁液２と溶解液３との合流流に乱流を生じさせ、この合流流の迅速な均質化をもたらす任意の装置を意味すると理解される。本発明者らは、この種の混合物が、過度に高い剪断力を伴わない点で有利であることに注目した。

【0022】

細胞の懸濁液は、好ましくは、ＴＲＩＳ－ＥＤＴＡ緩衝液に取り込まれた細胞培養ペレットであり、懸濁液は１０～３００、好ましくは５０～２００、さらに好ましくは７５～１５０、例えば約１００ｇ／Ｌ（細胞の重量：懸濁液の総容量）の濃度である。

【0023】

これによって、剪断力の関与なしに初期均質化が可能になる。２つの溶液はこのレベルで組み合わされるため、潜在的な不均質性は大幅に低減される。

【0024】

好ましくは、溶解液３のｐＨは１２．０～１２．５の間であり、溶解液のｐＨは好ましくはアルカリ性水酸化物によって固定される。

【0025】

これにより、ゲノムＤＮＡの迅速な溶解と変性とが可能になる。ＮａＯＨのようなアルカリ性水酸化物を使用すると、緩衝能の低い非常に塩基性のｐＨにすることができ、その後の中和が簡単になる。しかしながら、ｐＨを注意深く固定しないと、十分な溶解と変性とが得られない、逆に目的のプラスミドを不可逆的に変性させてしまう危険性がある。

【0026】

好ましくは、溶解液３は、さらに洗浄剤、好ましくは０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムを含む。

【0027】

有利には、中和溶液５は、４．５～５．７の間のｐＨを有する。この溶液は、好ましくは、１Ｍを超える濃度の酢酸からなり、さらに好ましくは、中和溶液は、酢酸／酢酸混合物によってｐＨが約５．５に固定されている。これにより、中和溶液（溶液２、３および５を合わせたもの）のｐＨが７．０より低く、好ましくは６．０より低く、好ましくは（論理的には）ｐＨが４．５より高く、好ましくは５．０より高くなる。

【0028】

好ましくは、プラスミドを含む懸濁液は、中和溶液の存在下に少なくとも１分間、例えば２～３分間とどまる。接触時間が長すぎるとゲノムＤＮＡが再変性し、有害である。したがって、このバッチプロセスでは、中和溶液５と沈殿溶液６とを素早く添加することが好ましい。

【0029】

したがって、サイズが１０ｋｂ未満のプラスミドでは、中和液との接触時間は２０秒～８０秒が有利である。

【0030】

逆に、１０ｋｂより大きいプラスミド、特に繰り返し配列および／または反転配列を含むプラスミドでは、中和溶液との接触時間は１～３分が好ましい。この場合、溶液５および６の添加時間は非常に注意深くコントロールしなければならないパラメータとなり、理想的にはそれぞれ約３０秒である。

【0031】

しかし、流量を完全に自由に採用することはできない。特に（ｉ）溶液２＋３＋５を含む混合液と（ｉｉ）溶液６とは非常に粘性が高いため、物理的な流量制約、したがって圧力制約を尊重しなければならない。加えて、効率的なメンテナンスが可能な、堅牢かつ／または一般的に使用されているポンプを使用することが望ましい。必要であれば、特に大きなプラスミドの場合は、溶液、特に溶液５と溶液６とを迅速に加えることができるように、異なる溶液の容量を減らす（上記段落を参照）。

【0032】

蠕動ポンプは、流量がよく制御され、剪断を起こさないので有利である。

【0033】

有利には、沈殿溶液６は、３．５～６Ｍ、好ましくは約５Ｍの濃度の水溶性カルシウム塩（ＣａＣｌ_２など）からなる。

【0034】

この濃縮カルシウム溶液のおかげで、沈殿溶液（溶液２、３、５および６を合わせたもの）を添加した後の（懸濁）溶液中のカルシウム濃度は、少なくとも０．８Ｍ、例えば少なくとも１．０Ｍ、さらには少なくとも１．２Ｍである。本発明者らは、十分な最終カルシウム濃度を保証しながら適度な容量を維持するために、粘性にもかかわらず非常に濃縮された沈殿溶液を使用することを好む。このような最終カルシウム濃度（０．８Ｍ以上、あるいは１Ｍ以上）により、不純物、特に変性する時間がなかったＲＮＡやゲノムＤＮＡ、さらにはタンパク質やエンドトキシン（出発細胞がそれらを合成する場合）、あるいは少なくともエンドトキシンのかなりの部分を沈殿させることができる。

【0035】

有利には、複数のオリフィス７は有孔配管システムである。このシステムは、単純な有孔パイプ、コイル、あるいはリングであってもよい。

【0036】

複数のオリフィスを設ける利点は、中和溶液５および／または沈殿溶液６を容器内の複数の場所に注入することであり、その結果、質量不均一ではなく、複数のミクロ不均一が生じる。これは、穏やかな機械的攪拌９と組み合わされ、非剪断で迅速な均質化を可能にする。これは、上述の不均一性の二重の問題に対応するものである。

【0037】

本発明者らは、このアプローチによって、上記のような剪断の問題を引き起こすことなく、溶液を十分に迅速に均質化できることに驚いた。

【0038】

有利なことに、中和溶液５の添加に使用される複数のオリフィス７と、沈殿溶液６の添加に使用される複数のオリフィス７とは、同じ複数のオリフィス７である。沈殿溶液および中和溶液を収容する容器は、容器１の上流で接続されている。これにより、複数の装置を持つ必要がなくなり、また、中和溶液を全てパージすることが可能となる。

【0039】

有利には、中和溶液５および／または沈殿溶液６は、容器１の底部から実質的に添加され、好ましくは、前記中和溶液および／または沈殿溶液の少なくとも３０、４０、あるいは（少なくともまたは正確に）５０重量％および／または体積が容器の底部２０％に添加される。これにより、溶液の制御された注入が可能になり、その拡散が増大する。

【0040】

変形例によれば、中和溶液５は、容器１の底部から実質的に添加され、好ましくは中和溶液５の少なくとも３０、４０、あるいは（少なくともまたは正確に）５０重量％および／または体積が容器の底部２０％に添加され、沈殿溶液６は、容器１の頂部から実質的に添加され、好ましくは沈殿溶液６の少なくとも３０、４０、あるいは（少なくともまたは正確に）５０重量％が前記容器の頂部２０％に添加される。これは、複数のオリフィス７からなるシステムの高さを変えることによって、または複数の別々のオリフィス７からなる２つのシステムを使用することによって行うことができる。

【0041】

第２の変形例によれば、中和溶液５は、実質的に容器１の上部に添加され、好ましくは中和溶液５の少なくとも３０、４０、あるいは（少なくともまたは正確に）５０重量％が容器の上部２０％に添加され、沈殿溶液６は、実質的に容器１の底部を介して添加され、好ましくは沈殿溶液６の少なくとも３０、４０、あるいは（少なくともまたは正確に）５０重量％および／または体積が容器の底部２０％に添加される。これは、複数のオリフィス７からなるシステムの高さを変えることによって、または複数の別々のオリフィス７からなる２つのシステムを使用することによって行うことができる。

【0042】

好ましくは、流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４およびＱ５は、それぞれ独立に０．５Ｌ／分～２５Ｌ／分、より好ましくは１Ｌ／分～１０Ｌ／分である。

【0043】

流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４および／またはＱ５は、独立して、一定とすることができ、あるいは、流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４および／またはＱ５は、独立して、可変とすることができる。例えば、流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４および／またはＱ５、好ましくはＱ３および／またはＱ４は、これらの粘性溶液を添加する際の不均一性を制限するように、経時的に増加させることができる（ポンピング開始時に最も低く、終了時に最も高く）。流量を増加させる有利な方法は、流量／体積比を一定または実質的に一定に維持することである。流量Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３および／またはＱ４は可変（経時的に増加）であってもよいが、それとは無関係に、流量Ｑ５は好ましくは一定である。抽出８は、好ましくは、凝集物が邪魔にならないように、非常に急速である。したがって、流量Ｑ５は好ましくは一定であり、最も速い。流量Ｑ１とＱ２とは、（ｉ）細胞懸濁液２と溶解液３とのすべてが同時に送液され、（ｉｉ）例えば静的ミキサ４の出口での混合液の濃度（細胞中の含有量、ｐＨ）が一定になるように、好ましくは一致させる（一緒に決定する）。

【0044】

有利なことに、穏やかな攪拌９は、ホストからプラスミドＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを剪断するには不十分な剪断応力を発生させる。

【0045】

したがって、微生物の種類、精製されるプラスミドのサイズ、溶液の濃度によって、剪断応力の許容性をテストすることが、予備段階として考えられる。

【0046】

本発明の関連する態様は、上記による清澄化上清から目的のプラスミドを精製する方法であって、
プラスミドを含む清澄化上清を採取するステップと、
清澄化した上清を、０．１～０．４μｍ、好ましくは０．１５～０．３μｍ、有利には０．２μｍ付近の気孔率を有するフィルターで濾過し、プラスミドを含む濾過溶液を取得するステップと、
任意で、濾過された溶液を限外濾過するステップと、
陰イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー研磨ステップであって、好ましくは、ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルシクロヘキシルエーテルを含む溶液により、樹脂上に固定されたプラスミドを洗浄するステップを含む研磨ステップと、
プラスミドを最終溶液に製剤化するステップと、を含む。

【0047】

（実施例）
本発明は、上述した実施形態に決して限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることを理解されたい。

【0048】

（比較例）
本発明者らは、「インボルト」バッチ法を開発しようとした。参照を容易にするため、容器１の上流に配管とポンプシステムとだけでなく、要素４および７を有することのない図１を参照する。これを行うために、プラスミドを産生する濃縮細胞懸濁液２（１００ｇの細胞／リットルのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ培地）０．３リットルを容量２リットルの容器１に挿入し、次にアルカリ溶解液３（ＮａＯＨ；ｐＨ１２．５；ＳＤＳ ０．１重量％）０．３リットルを素早く加え、容器１をオペレータが手動で正確に９０秒間撹拌した。次に、０．６リットルの中和溶液５（ＡｃＯＨ １５％ｖ：ｖ／３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４．５～５．７）を素早く加え、容器１の内容物を手動で正確に９０秒間撹拌した。最後に、０．２３リットルの沈殿溶液６（ＣａＣｌ_２、５Ｍ）を素早く加え、容器１の内容物を手動で正確に９０秒間撹拌した。その後、混合物を遠心分離によって清澄化するために抽出した。

【0049】

本発明者らは、１リットルあたり２００ｍｇのプラスミドしか回収できず、このプラスミドには測定可能な量のゲノムＤＮＡとＲＮＡとが含まれていた。この手作業による方法を改良する目的で繰り返すことにより、本発明者らは、シングルからダブルまで様々な収量を得たが、汚染ＲＮＡおよび「オープンサーキュラー」形態のプラスミドの含有量も様々であり、最高の収量は汚染物質の含有量の増加と関連していた。したがって、オープンサーキュラー型のプラスミドＤＮＡの比率は、７～１２％の間で変動した。実際、望ましい形態は、いわゆる「スーパーコイル型」であり、この２つの細胞は、重なり合う傾向があるため、ＨＰＬＣやその他の手段でこの２つの形態を分離することは困難である。

【0050】

これらの結果に直面した本発明者らは、汚染物質レベルの増加は、この手作業による抽出の際に、より大きな剪断力が加わるためであり、この剪断力の強さはバッチ（オペレータの身元、オペレータの潜在的な疲労度）によって異なると考えている。

【0051】

（実施例１）
本発明者らは、効果がないと考えたこのシステムを発展させることを思いついた。そのために、プラスミドを含む濃縮細胞懸濁液２（同じＴｒｉｓ－ＥＤＴＡ培地に１００ｇ／リットルの細胞）を１．２リットル、容量１０リットルの容器１に、アルカリ溶解液３（ＮａＯＨ；ｐＨ１２．５；ＳＤＳ ０．１重量％）１．２リットルと同時に蠕動ポンプで注入し、これら２つの溶液は、静的ミキサ４を通過させた。注入時間は３０秒であった。容器は９０秒間、ゆっくりとした機械的攪拌９（非剪断）を受けた。次に、比較例と同じ中和溶液５を２．４Ｌ、蠕動ポンプと多数のオリフィス７とが穿孔された拡散リングを介して、底部に素早く添加され（流量６Ｌ／分）、容器１の内容物を機械的に攪拌９したが、非剪断で正確に９０秒間攪拌した。最後に、０．９２Ｌの沈殿溶液６（ＣａＣｌ２、５Ｍ）を、蠕動ポンプとオリフィス７とが穿孔された同じ装置を介して素早く加え（流速２．３Ｌ／分）、ゆっくりとした機械的攪拌９のもとで、正確に９０秒間行った。その後、混合物を遠心分離によって清澄化するために抽出８した。

【0052】

本発明者らは、約４００ｍｇ／Ｌのプラスミドを回収したが、このプラスミドには測定可能な量のゲノムＤＮＡは含まれておらず、ＲＮＡもほとんど含まれていなかった。

【0053】

攪拌は、９０秒間行われるため、本発明者らは、攪拌時間をわずかに変更することにより、この装置を容易に適合させることができると結論付けている（容量、流量）。

【0054】

（実施例２）
本発明者らは、本発明による方法で得られたプラスミドをＨＰＬＣで分析した。その結果、抽出収量は８４％であり、「オープンサーキュラー」プラスミド含量はわずか７．２％であった（したがって、スーパーコイル型では略９３％）。図２参照、左の最初のピークは残留塩を表し、２番目のピークはＲＮＡを表し、二重のピークはプラスミドを表し、右のピークは最も大きく、スーパーコイル型であり、ここではＨＰＬＣシグナルは飽和している。

【0055】

これに加えて、本発明による方法の主な利点は、再現性と、より大規模な産生との可能性に関するものである。本発明による複数の反応器は、１人のオペレータによって並行して管理することができるが、手動撹拌はボトル１本につき１人のオペレータを必要とし、あまり迅速に実施することができない。

【0056】

（実施例３－比較例）
本発明者らは、４つの条件を本発明による条件と比較した（図３のＨＰＬＣプロファイル参照）。
１．拡散リングをボトルの底ではなく真ん中に置く、
２．拡散リングは省略されている、
３．静的ミキサは省略されている、
４．拡散リングも静的ミキサも省略されている。

【0057】

目視検査では、条件＃２と＃３とのボトル上部に強い不均質性が見られる。条件＃４は、単純な目視分析の結果、不均一性の影響は少ない。条件＃１は、拡散リングが底にある方法と、拡散リングを容器の中央に移動させた方法との間で、中間レベルの不均質を示している。

【0058】

ろ過パラメータも低下し、条件＃１と＃４とでは２回、条件＃２では１回のフィルター交換が必要となった。

【0059】

しかしながら、最も顕著な違いは収量に見られ、条件＃１では６７％に低下したが、条件＃２、＃３、＃４では２２．６、１４、３０％にとどまった。「オープンサーキュラー」プラスミドの割合も増加し、条件＃１では１６％、条件＃３では９．９％、条件＃４では１３．７％であった。ＲＮＡコンタミネーション（ＲＮＡ：プラスミド）も条件＃３を除いて増加した。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【国際調査報告】