特表 2024-524403 瘢痕診断試薬及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】瘢痕診断試薬及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240628BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240628BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240628BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C07K16/28

C12N15/113 Z

A61K45/00

A61K39/395 N

A61P17/02

G01N33/53 Y

G01N33/53 M

G01N33/53 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023580630

(86)(22)【出願日】2022-07-11

(85)【翻訳文提出日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2022104807

(87)【国際公開番号】W WO2023284660

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】202110789312.5

(32)【優先日】2021-07-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521460077

【氏名又は名称】上海交通大学医学院附属第九人民医院

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＮＩＮＴＨ ＰＥＯＰＬＥ‘Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＡＦＦＩＬＩＡＴＥＤ ＴＯ ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＩＡＯＴＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＳＣＨＯＯＬ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100207561

【弁理士】

【氏名又は名称】柳元 八大

(72)【発明者】

【氏名】章 一新

(72)【発明者】

【氏名】許 恒

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA05

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR48

4B063QR72

4B063QR77

4B063QS33

4B063QS34

4C084AA17

4C084NA14

4C084ZA891

4C084ZA892

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本願は、診断試薬の分野に関し、具体的には、瘢痕診断試薬及びその応用に関する。本願では、初めてケロイド患者の末梢血内のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の顕著な減少を発見し、初めて免疫微小環境のケロイドの発病において重要な役割を果たすことを発見した。また、初めてｓＨＬＡ－Ｅの健常者の体内での発現が肥厚性瘢痕患者とケロイド患者に比べていずれも顕著な差があったことを発見した。ｓＨＬＡ－Ｅを診断マーカーとし、同じ病理学的瘢痕に属すると考えられる肥厚性瘢痕とケロイドとを同定する同定診断に用い、そしてケロイドの治療効果を判断するために用いることができる。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイドの検出及び／又は予後試薬又はキットの製造における応用。

【請求項2】

ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、肥厚性瘢痕及びケロイドを同定する検出試薬又はキットの製造における応用。

【請求項3】

可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイド及び悪性隆起性皮膚線維肉腫を同定する検出試薬又はキットの製造における応用。

【請求項4】

ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１遺伝子、又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイドの治療効果を予測するキットの製造における応用であって、
好ましくは、治療は、手術、放射線療法、レーザー療法、ホルモン療法から選択された少なくとも１種であり、
好ましくは、前記治療は、手術、ホルモン療法、手術と放射線療法との併用療法、又はホルモンとレーザーとの併用療法から選択された少なくとも１種であり、
好ましくは、前記治療は、ホルモン療法から選択され、
好ましくは、前記ホルモン療法は、糖質コルチコイド＋５－フルオロウラシル療法から選択される、
応用。

【請求項5】

ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又は
ＫＬＲＣ１を対象とする検出部材と、
ｂ）、前記検出部材が検出する検出対象試料のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１と、対照試料のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１との偏差に基づいて、病理学的瘢痕の疾病リスク又は予後効果を判断する結果判断部材と、を含む、
ことを特徴とするケロイドの診断及び／又は予後判断システム。

【請求項6】

検出部材で可溶性ヒト白血球抗原Ｅを検出する場合、可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＞３ｎｇ／ｍｌであると、ケロイドであると判断し、
好ましくは、可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＜３ｎｇ／ｍｌであると、非ケロイドであると判断し、
好ましくは、前記非ケロイドは、肥厚性瘢痕又は正常から選択され、
好ましくは、治療後に可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＜３ｎｇ／ｍｌであると、ケロイドが再発しなかったと判断する、
ことを特徴とする請求項５に記載のシステム。

【請求項7】

治療標的としてのＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの、ケロイド治療薬の製造における応用。

【請求項8】

ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤の、ケロイド治療薬の製造における応用。

【請求項9】

ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１を対象とする検出システムと、
ｂ）、投薬システムと、を含み、
好ましくは、前記投薬システムは、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤を含む、
ことを特徴とするケロイド治療システム。

【請求項10】

前記阻害剤は、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの発現を減少させ、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅを分解させ、或いはＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅを拮抗する機能を有する物質から選択され、
好ましくは、前記ＫＬＲＣ１遺伝子の阻害剤は、核酸エフェクター分子を含み、
好ましくは、前記核酸エフェクター分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡ－ヘテロ接合体を含み、
好ましくは、前記核酸エフェクター分子は、ＫＬＲＣ１遺伝子の全体又は一部の発現を阻害し、
好ましくは、前記核酸エフェクター分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びｓｈＲＮＡから選択された少なくとも１種であり、
好ましくは、前記ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤は、抗体及びその機能性断片、又は小分子化合物から選択された少なくとも１種であり、
好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆｖ抗体、又は一本鎖抗体から選択された少なくとも１種であり、
好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体から選択され、
好ましくは、前記抗体は、ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂから選択される、
ことを特徴とする請求項８に記載の応用又は請求項９に記載のシステム。

【請求項11】

検出された検出試料は、血液から選択され、
好ましくは、前記検出試料は、末梢血の血液から選択され、
好ましくは、前記検出試料は、末梢血の血清から選択される、
ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の応用又はシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、診断試薬の分野に関し、具体的には、瘢痕診断試薬及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ケロイド（Ｋｅｌｏｉｄ）は、皮膚の傷口が癒着するか又は不明な原因による皮膚の損傷が癒着した後に形成された過剰成長による異常瘢痕組織であり、前胸、耳たぶ、下顎及び背部は、ケロイドが発症するリスクの高い領域である。病変は、単一部位で発症する可能があり、全身が多発する可能性もあり、非自己制限的な成長状態であり、痒み、痛みなどの不快感を伴うことが多い。ケロイドの病理学的挙動は、組織内の線維芽細胞が過度に増殖して細胞外マトリックスを分泌することであり、ＴＧＦ－βはこの過程で重要な役割を果たす。しかしながら、この疾患の発病メカニズムが明らかではなく、病変組織を切除した後にケロイドの再発率が１００％に近く、ＴＧＦ－β拮抗剤などの方法を用いてもケロイドの成長を抑制することができないため、ケロイドの発病メカニズムを探求し、更に効果的な治療方法を開発することは臨床的な痛点である。現在、古典的な治療方法は、組織内に糖質コルチコイドを注射することであり、治療の再発率が高くて３０～５０％であるが、病変成長を制御して徐々に小さくすることができる。糖質コルチコイドは、古典的な免疫阻害剤として、例えばＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制し、調節性Ｔ細胞の機能を増強するという免疫細胞の増殖、機能を調整するという作用を有する。

【0003】

ケロイドの発病メカニズム及び確実かつ有効な診断方法については、現在報告されていない。

【発明の概要】

【0004】

一態様によれば、本願は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイドの検出及び／又は予後試薬又はキットの製造における応用を提供する。

【0005】

本願において、ＫＬＲＣ１遺伝子の検出は、ＫＬＲＣ１遺伝子が発現する中間生成物の検出を含み、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａ／ＫＬＲＣ１の検出を含み、具体的には、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｔ－ｂｅｔ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａという５つのタンパク質からなるｐａｎｅｌによって検出された特定の細胞群のＮＫＧ２Ａ発現に差があることを含む。

【0006】

本願において、単細胞分析方法を用いて初めてケロイド患者の末梢血内のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の顕著な減少を発見し、フローサイトメトリーで検証したところ、当該細胞群の病原蛋白がいずれも顕著に減少することを提示した。相関転写因子、分化関連タンパク質、増殖タンパク質がいずれも減少したが、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞のアポトーシス状況が明らかに変化しなかった。

【0007】

単細胞分析においてＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を抽出して更に分析し、ｄｏｔｐｌｏｔ分析技術を用いて健常者と患者の試料間で差次的に発現している上位１１位になる遺伝子を選別し、ＫＬＲＣ１遺伝子が患者の試料において高発現していることを発見した（図３Ａ）。

【0008】

フローサイトメトリーを用いてＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ－ｂｅｔ＋細胞傷害性Ｔ細胞内のＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合を検出したところ、結果として、ケロイド患者の末梢血内のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ－ｂｅｔ＋細胞傷害性Ｔ細胞内のＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合が健常者より顕著に高いことが示唆されたため（図３Ｂ、ｐ＜０．０００１）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の減少は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントの媒介によるものである可能性がある。

【0009】

本願の検出結果は、ケロイド患者の体内のｓＨＬＡ－Ｅが健常者より顕著に高いことを提示し、ケロイド患者の体内で高発現しているｓＨＬＡ－ＥがＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の高発現しているＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントと結合した後にＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合及び機能を阻害したことを直接的に証明した。

【0010】

一態様によれば、本願は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、肥厚性瘢痕及びケロイドを同定する検出試薬又はキットの製造における応用を提供する。

【0011】

一態様によれば、本願は、可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイド及び悪性隆起性皮膚線維肉腫を同定する検出試薬又はキットの製造における応用を提供する。

【0012】

一態様によれば、本願は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、ＫＬＲＣ１又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの検出試薬の、ケロイドの治療効果を予測するキットの製造における応用を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記治療は、手術、放射線療法、レーザー療法、ホルモン療法から選択された少なくとも１種であり、いくつかの実施形態では、前記治療は、手術、ホルモン療法、手術と放射線療法との併用療法、又はホルモンとレーザーとの併用療法から選択された少なくとも１種であり、いくつかの実施形態では、前記治療は、ホルモン療法から選択され、いくつかの実施形態では、前記ホルモン療法は、糖質コルチコイド＋５－フルオロウラシル療法から選択される。

【0014】

一態様によれば、本願は、
ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１を対象とする検出部材と、
ｂ）、前記検出部材が検出する検出対象試料のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１と、対照試料のＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１遺伝子の発現との偏差に基づいて、病理学的瘢痕の疾病リスク又は予後効果を判断する結果判断部材と、を含むケロイドの診断及び／又は予後判断システムを提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、検出部材が可溶性ヒト白血球抗原Ｅを検出する場合、可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＞３ｎｇ／ｍｌであると、ケロイドであると判断し、
いくつかの実施形態では、可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＜３ｎｇ／ｍｌであると、非ケロイドであると判断し、いくつかの実施形態では、前記非ケロイドは、肥厚性瘢痕又は正常から選択され、いくつかの実施形態では、治療後に可溶性ヒト白血球抗原Ｅの含有量＜３ｎｇ／ｍｌであると、ケロイドが再発しなかったと判断する。

【0016】

一態様によれば、本願は、治療標的としてのＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの、ケロイド治療薬の製造における応用を提供する。

【0017】

一態様によれば、本願は、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤の、ケロイド治療薬の製造における応用を提供する。

【0018】

一態様によれば、本願は、
ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫＧ２Ａ、可溶性ヒト白血球抗原Ｅ又はＫＬＲＣ１を対象とする検出システムと、
ｂ）、投薬システムと、を含む、ケロイド治療システムを提供する。

【0019】

いくつかの実施形態では、投薬システムは、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、前記阻害剤は、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの発現を減少させ、ＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅを分解させ、或いはＫＬＲＣ１遺伝子、ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅを拮抗する機能を有する物質から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、前記ＫＬＲＣ１遺伝子阻害剤は、核酸エフェクター分子を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、前記核酸エフェクター分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡ－ヘテロ接合体を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、前記核酸エフェクター分子は、ＫＬＲＣ１遺伝子の全体又は一部の発現を阻害する。

【0024】

いくつかの実施形態では、前記核酸エフェクター分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びｓｈＲＮＡから選択された少なくとも１種である。

【0025】

いくつかの実施形態では、前記ＮＫＧ２Ａ又は可溶性ヒト白血球抗原Ｅの阻害剤は、抗体及びその機能性断片、又は小分子化合物から選択された少なくとも１種である。

【0026】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ナノ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆｖ抗体、又は一本鎖抗体から選択された少なくとも１種である。

【0027】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体から選択される。

【0028】

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂから選択される。

【0029】

いくつかの実施形態では、検出された検出試料は、血液から選択され、いくつかの実施形態では、検出された検出試料は、末梢血の血液から選択され、いくつかの実施形態では、検出された検出試料は、末梢血の血清から選択される。

【0030】

本願における「検出」は、診断と同じであり、病理学的瘢痕の早期（例えば、病歴１年以内）の診断に加え、病理学的瘢痕の中期及び後期の診断も含み、病理学的瘢痕のスクリーニング、リスク評価、予後、疾患認識、病症段階の診断及び治療性標的の選択も含む。

【0031】

本願において発見されたケロイド患者の末梢血管内でＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が顕著に減少したことは、ケロイド疾患に全身免疫系異常が存在することを提示し、系統的な治療方法、例えば、抗原刺激、細胞のインビトロ増殖後の養子、細胞の薬物による増殖、及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対して拮抗する作用を有するサイトカイン、細胞などの作用の阻害を応用することができることを提示する。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】末梢血内の異なる種類の単核細胞の変化に対する単細胞シーケンシングと分析を示す。（Ａ）、単細胞シーケンシング概略図であり、２名の健常者及び２名の患者から末梢血を抽出した後、単核細胞行を単離して１０×単細胞シーケンシングと分析を行った。表１は、図（Ａ）で用いた患者情報である。（Ｂ）、単細胞シーケンシングと分析を示し、ｔ－ｓｎｅ分析で見られた全ての試料の末梢血単核細胞を１１個の群に分けることができる。（Ｃ）、ｔｒａｃｋｐｌｏｔ分析方法を用いて、異なる細胞群内の細胞種類関連タンパク質の発現を調べた。（Ｄ）、ｔ－ｓｎｅを用いて、４つの試料における１１個の細胞群の数をそれぞれ分析した。（Ｅ）、図（Ｃ）及び図（Ｄ）を組み合わせて４つの試料の棒グラフを作成して１１個の細胞群の割合を分析してそれらを定義し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ）が患者の試料において顕著に減少した。（Ｆ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ）に対して、その標識タンパク質の遺伝子発現であるＣＤ３Ｅ、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＧＺＭＢ、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１を更に分析した。それらの発現が顕著であり、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ）の生物学的定義に適合することを発見した。

【図2】フローサイトメトリーによる単細胞分析の結果への検証を示す。（Ａ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、健常者と患者との間に顕著な差がなかった。（Ｂ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ、Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ及びＩＦＮ－γ陽性の細胞を検出し、その結果、ケロイド患者のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性機能関連タンパク質が減少した。（Ｃ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、細胞傷害性に関連する転写因子Ｔ－ｂｅｔを検出し、ケロイド試料内において低下したことを提示した。（Ｄ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋Ｋｉ６７＋（細胞傷害性細胞の増殖機能）、Ｂｃｌ２（細胞傷害性細胞のアポトーシス）及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋ＫＬＲＧ１＋（細胞傷害性細胞の分化転写）を検出し、その結果、ケロイド患者のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性細胞の増殖及び分化転写能力が低下したが、アポトーシスが明らかに変化しなかった。（Ｅ）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ Ｔ細胞傷害性細胞をゲーティングして選択した後、枯渇関連タンパク質であるＰＤ－１、Ｌａｇ３陽性細胞を検出し、健常者と患者に顕著な差がなかった。注：ＨＤは、健常者であり、ＮＴＫは、ケロイド患者である。

【図3】１０×単細胞シーケンシングと分析を行ったところ、ＫＬＲＣ１でコード化されたＮＫＧ２ＡがＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の割合が低下した原因である可能性があることを示す。（Ａ）、単細胞シーケンシングでＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を選別した後、ｄｏｔｐｌｏｔを用いて、差次的に発現している上位１１位の遺伝子を分析した。（Ｂ）、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ－ｂｅｔ＋細胞傷害性Ｔ細胞内のＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の発現割合がケロイド患者の体内で顕著に上昇したことを検証した。注：ＨＤは、健常者であり、ＮＴＫは、ケロイド患者である。

【図4】ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントリガンドＨＬＡ－Ｅが末梢血内にあり、即ちｓＨＬＡ－Ｅが顕著に増加した。（Ａ）、ｓＨＬＡ－Ｅの標準値曲線に対して線形フィッティング分析を行い、機械で読み取られたＯＤ値とｓＨＬＡ－Ｅ濃度（ｎｇ／ｍｌ）の換算方法を取得することを示す。（Ｂ）、健常者及び治療を受けていないケロイド患者の末梢血ｓＨＬＡ－Ｅの発現をｔ検定で分析した。

【図5】ｓＨＬＡ－Ｅの診断効力を示す。（Ａ）、健常者、肥厚性瘢痕患者及び治療を受けていないケロイド患者の末梢血ｓＨＬＡ－Ｅの発現を分散分析した。（Ｂ）、健常者、治療を受けていないケロイド患者及び糖質コルチコイド療法を受けた患者の末梢血ｓＨＬＡ－Ｅの発現を分析した。

【発明を実施するための形態】

【0033】

汎用実験手順

【0034】

材料及び方法

【0035】

１）病人及び試料情報
凝血促進チューブを用いて患者から血液を抽出して取得した。患者の記録及び診断情報は、病院記録システム及び電話で定期的に病人を訪問観察することにより取得された。本研究は、上海交通大学医学院付属第九人民病院倫理委員会の同意を得て、そして血液を抽出する前に患者の同意を得た。

【0036】

治療を受けた患者は、古典的な糖質コルチコイド＋５－ＦＵ病巣局所注射による治療を受け、具体的な配合は、（糖質コルチコイド（トリアムシノロンアセトニド）１ｍｌ＋５－ＦＵ０．５ｍｌ＋リドカイン４ｍｌ）であり、リドカインは、局所麻酔薬である。患者が治療を受けた６ヵ月後に血液を抽出して検出した。

【0037】

２）末梢血単核細胞と血清の単離
末梢血単核細胞を取得する際に抗凝固チューブを用いて採血した後、１０ｍｌのｆｉｃｏｌｌ溶媒を加え、十分に均一に混合させた後、遠心分離機に入れて８００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離して成層した後、中間白色層を取り出した。赤血球溶解液を用いて残留の赤血球を溶解させた後、遠心分離機に入れて８００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１×ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁した。７０μｍの濾網で細胞を濾過し、再び遠心分離機に入れて８００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離した後、上清を捨て、細胞を２ｍｌの１×ＰＢＳ内に再懸濁し、それぞれ２つの２ｍｌのＥＰチューブ内に置いて－８０℃の冷蔵庫に凍結させた。

【0038】

末梢血の血清を取得する際に凝血促進チューブを用いて末梢血を２ｍｌ収集し、４℃で静置して血液を完全に凝固させた。その後に凝血試料を２５００～３０００回転／分間で遠心分離し、凝血チューブ中のゲル上層の上清をＥＰチューブに抽出し、－８０℃の冷蔵庫に保存し、次の試験に用いた。

【0039】

３）単細胞シーケンシングと分析
病歴が１０年以上で、最近３年間内にいずれの治療も受けず、ケロイドが持続的に成長し、半年に風邪／創傷の病歴がなく、基礎疾患がなく、薬物を服用せず、ケロイドに関する合併症（例えば、潰瘍、感染、出血）がないケロイド患者を２名選択し、半年に風邪／創傷の病歴がなく、基礎疾患がなく、薬物を服用しない健常者を２名選択した。末梢血の単核細胞行１０×単細胞シーケンシング＋分析を行った（この部分は北京ノボジーンテクノロジー株式会社によって行われた）。

【0040】

４）フローサイトメトリーによる分析
フローサイト抗体であるＣＤ３、ＣＤ８、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ、ＩＦＮ－γ、Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ、Ｔ－ｂｅｔ、Ｋｉ６７、Ｂｃｌ２、ＫＬＲＧ１、ＰＤ－１、Ｌａｇ３を用意した。末梢血単核細胞の膜タンパク質＋核内染色を行い、その後、フローサイトメトリー検出を行った（この部分は上海ユナイブバイオテクノロジ株式会社によって行われた）。

【0041】

５）ＥＬＩＳＡ検出
ａ）ＥＬＩＳＡ検出を開始する前にＥＬＩＳＡキットにおける各試薬を取り出し、試薬を室温まで平衡化し、－８０℃で保存された患者の血清を取り出し、室温に回復させる。

【0042】

ｂ）標準品作動液の調製では、標準品を１００００×ｇで１分間遠心分離し、標準品と試料希釈液１．０ｍｌを凍結乾燥標準品に入れ、チューブ蓋を締め付け、１０分間静置し、数回上下ひっくり返し、十分に均一に混合させて溶解させ、２０ｎｇ／ｍｌの標準品作動液に調製し、調製過程で十分に均一に混合させ、泡立ちをできるだけ回避する。その後、必要に応じて倍加希釈を行った。調製濃度を２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０ｎｇ／ｍｌとした。倍加希釈方法では、７本のＥＰチューブを取って、各チューブに標準品＆試料希釈液を５００μｌ加え、２０ｎｇ／ｍｌの標準品作動液から５００μｌを吸い取ってそのうちの１本のＥＰチューブに入れて均一に混合させて１０ｎｇ／ｍｌの標準品作動液に調製し、以降この手順で順に吸い取って均一に混合させた。

【0043】

ｃ）試料の加えでは、ブランクウェル、標準ウェル、検出対象試料ウェルをそれぞれ設けた。ブランクウェルに試料希釈液１００μｌを加え、残りのウェルに標準品又は検出対象試料１００μｌをそれぞれ加えた。ＥＬＩＳＡ用プレートに被膜し、３７℃で９０分間インキュベートした。

【0044】

ｄ）ビオチン化抗体作動液の調製では、次の試験を開始する前の１５分間ビオチン化抗体希釈液を調製し、試験前に等級試験に必要な使用量（１００μｌ／ウェルで計算）を計算し、実際に調製する場合に１００～２００μｌを多く調製すべきである。使用前の１５分間に、濃縮ビオチン化抗体を８００×ｇで１分間遠心分離し、ビオチン化抗体希釈液で１００×濃縮ビオチン化抗体を１×作動濃度に希釈した。

【0045】

ｅ）液体を捨て、振り切り乾燥させ、洗浄せず、各ウェルにビオチン化抗体の作動液を１００μｌ加え（使用前の１５分間に調製した）、ＥＬＩＳＡ用プレートに被膜を加え、３７℃で１時間インキュベートした。

【0046】

ｆ）洗浄液の調製では、濃縮洗浄液を二重蒸留水で希釈した（１：２４）。

【0047】

ｇ）ウェル内の液体を捨て、振り切り乾燥させ、洗浄液でプレートを３回洗浄し、毎回１～２分間浸漬し、約３５０μｌ／ウェルとし、振り切り乾燥させ、ティッシュペーパーに軽く叩いてウェル内の液体を完全に除去した。

【0048】

ｈ）酵素結合物作動液の調製では、使用前の１５分間から調製を開始し、試験前に等級試験に必要な使用量（１００μｌ／ウェルで計算）を計算し、実際に調製する場合に１００～２００μｌを多く調製すべきである。使用前の１５分間に、濃縮ＨＲＰ酵素結合物を８００×ｇで１分間遠心分離し、酵素結合物希釈液で１００×濃縮ＨＲＰ酵素結合物を１×作動濃度に希釈した。

【0049】

ｉ）各ウェルにＨＲＰ酵素結合物作動液（使用前の１５分間に調製した）１００μｌを加え、被膜を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。

【0050】

ｊ）ウェル内の液体を捨て、振り切り乾燥させ、ステップｇと同じ方法でプレートを５回洗浄した。

【0051】

ｋ）各ウェルに基質溶液９０μｌを加え、ＥＬＩＳＡ用プレートに被膜を加え、３７℃で１５分間遮光インキュベートした。

【0052】

ｌ）各ウェルに停止液５０μｌを加え、反応を停止し、この時、青色が直ちに黄色に変化した。

【0053】

ｍ）直ちに又は半時間内にＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍ波長で各ウェルの光学濃度（ＯＤ値）を測定した。事前にＥＬＩＳＡリーダーの電源をオンにし、機器を予熱し、検出プログラムを設定すべきである。

【0054】

６）ｓＨＬＡ－Ｅ濃度の計算
標準濃度及び対応するＯＤ値に基づいてＳＰＳＳソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １６．０、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて線形フィッティング分析を行い、線形曲線及び濃度とＯＤ値の換算方法を取得した。その後に、健常者、肥厚性瘢痕患者及びケロイド患者のｓＨＬＡ－Ｅ濃度を計算した。

【0055】

７）データ分析
ＳＰＳＳソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １６．０、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を用いて統計学的分析を行い、２つの変数間の差異について対応のあるｔ検定を用いた。３つ以上の試料を比較して、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、Ｆ分布を用いた）を用いた。 データがガウス分布に従わない場合、Ｗｉｌｃｏｘｏｎペアリング符号平均順位和検定とＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を２種類のノンパラメータ検定とした。全ての測定データをいずれもｍｅａｎ±ＳＤで表した。Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。

【0056】

（実施例１）
末梢血内の異なる種類の単核細胞の変化に対する１０×単細胞シーケンシングと分析

【0057】

病人及び試料情報について
２名の健常者及び２名のケロイド患者から末梢血を抽出した後、単核細胞行を単離して１０×単細胞シーケンシングと分析を行った。４人は、いずれも他の基礎疾患がなく、長期薬物服用歴がなく、１年間内に風邪及び創傷などの病歴がなく、２名の患者は、病歴がそれぞれ１４年と１０年であり、最近３年間内にいずれの治療も受けず、かつ局所感染、潰瘍等の合併症がない（図１Ａ及び表１）。

【0058】

単細胞シーケンシング用試料情報

【表1】

【0059】

ｔ－ｓｎｅ分析で見られた全ての試料の末梢血単核細胞を０～１０という１１個の細胞サブセットに分けることができる（図１Ｂ）。ｔｒａｃｋｐｌｏｔ分析方法を用いて、異なる細胞群内の細胞種類関連タンパク質の発現を調べた後に細胞を定義した（図１Ｃ）。ｔ－ｓｎｅを用いて、４つの試料における１１個の細胞群の数をそれぞれ分析した（図１Ｄ）。その後に、図（Ｃ）及び図（Ｄ）を組み合わせて４つの試料の棒グラフを作成して１１個の細胞群の割合を分析してそれらを定義し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＴＬ）が患者の試料において顕著に減少したことを発見した（図１Ｅ）。患者の試料において減少した細胞群がＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ）であることを更に確定するために、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の標識タンパク質の遺伝子発現であるＣＤ３Ｅ、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＧＺＭＢ、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１を更に分析した。それらの発現が顕著であり、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（即ちＣＤ８＋ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｔ ｃｅｌｌ）の生物学的定義に適合することを発見した（図１Ｆ）。

【0060】

（実施例２）
フローサイトメトリーによる単細胞分析の結果への検証

【0061】

病人及び試料情報について
上海交通大学医学院付属第九人民病院で治療を受けているケロイド患者（３４名）及び健常者（３６名）を組み入れた。

【0062】

ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、健常者と患者との間に顕著な差がなかった（図２Ａ）。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ、Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ及びＩＦＮ－γ陽性の細胞、即ち細胞傷害性に関連するサイトカインを検出し、その結果、ケロイド患者のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性機能関連タンパク質が減少したことを示している（図２Ｂ）。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、細胞傷害性に関連する転写因子Ｔ－ｂｅｔを検出し、ケロイド試料内において低下したことを提示した（図２Ｃ）。細胞群の一般的な機能を分析し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をゲーティングして選択した後、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋Ｋｉ６７＋（細胞傷害性細胞の増殖機能）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋Ｂｃｌ２（細胞傷害性細胞のアポトーシス）及びＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋ＫＬＲＧ１＋（細胞傷害性細胞の分化転写）を検出し、その結果、ケロイド患者のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性細胞の増殖及び分化転写能力が低下したが、アポトーシスが明らかに変化しなかった（図２Ｄ）。ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の減少が細胞機能枯渇に関与する可能性があると推測したため、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ Ｔ細胞傷害性細胞をゲーティングして選択した後、枯渇関連タンパク質であるＰＤ－１、Ｌａｇ３陽性細胞を検出し、健常者と患者に顕著な差がなかったことを発見した（図２Ｅ）。

【0063】

（実施例３）
単細胞シーケンシングと分析でＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の減少の可能性がある原因を掘り出す

【0064】

病人及び試料情報は、実施例１と同じであった。

【0065】

単細胞分析においてＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を抽出して更に分析し、ｄｏｔｐｌｏｔ分析技術を用いて健常者と患者の試料間で差次的に発現している上位１１位になる遺伝子を選別し、ＫＬＲＣ１遺伝子が患者の試料において高発現していることを発見し、例えば図３Ａに示されるケロイドが対応するＫＬＲＣ１の丸がより大きい（丸の大きさが発現の割合を示し、色が発現の強度を示す）。

【0066】

ＫＬＲＣ１でコード化されたタンパク質はＮＫＧ２Ａであり、ＮＫＧ２Ａは一般的にＣＤ９４と組み合わされて免疫チェックポイントとして作動する。この免疫チェックポイントが作動すると、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が阻害される。このメカニズムは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞がケロイド患者の体内で低下したことを解釈することができる。したがって、フローサイトメトリーを用いてＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ－ｂｅｔ＋細胞傷害性Ｔ細胞内のＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合を検出したところ、結果として、ケロイド患者の末梢血内のＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ－ｂｅｔ＋細胞傷害性Ｔ細胞内のＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合が健常者より顕著に高いことが示唆されたため（図３Ｂ、ｐ＜０．０００１）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の減少は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントの媒介によるものである可能性がある。

【0067】

（実施例４）
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントリガンドの検出

【0068】

病人及び試料情報は、実施例２と同じであった。

【0069】

ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントの特異的リガンドは、ヒト白血球抗原Ｅ（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ）であり、当該タンパク質は、末梢血内で遊離の形態で存在する（ｓｏｌｕｂｌｅ ＨＬＡ－Ｅ、ｓＨＬＡ－Ｅ）。ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の減少がＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントによって調節されているため、ｓＨＬＡ－Ｅがそれに応じて変化し、即ち患者の体内で顕著に増加すると仮定した。

【0070】

まず、標準濃度試料とそれに対応するＯＤ値に基づいて線形フィッティング分析を行って、標準曲線及び濃度とＯＤ値との間の換算方法を取得し（図４Ａ）、換算式はＹ＝０．１９１６×Ｘ＋０．０８５２４（ＹがＯＤ値であり、Ｘが濃度（ｎｇ／ｍｌ）である）であり、Ｒ２＝０．９９４８であり、線形フィッティング強度が高く、次にこの換算方法を用いて全ての試料の濃度値を計算した。

【0071】

この換算方法によれば、健常者と治療を受けていないケロイド患者とを対比すると、治療を受けていないケロイド患者の発現量は５．６１±１．５４ｎｇ／ｍｌであり、健常者の０．５０±０．４６ｎｇ／ｍｌよりも顕著に高くなった（ｐ＜０．０００１、図４Ｂ）。

【0072】

ｓＨＬＡ－ＥがＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの特異的リガンドであるため、両者が結合した後、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを発現するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を顕著に阻害することができる。本実施例の検出結果は、ケロイド患者の体内のｓＨＬＡ－Ｅが健常者より顕著に高いことを提示し、ケロイド患者の体内で高発現しているｓＨＬＡ－ＥがＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の高発現しているＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ免疫チェックポイントと結合した後にＣＤ９４＋ＮＫＧ２Ａ＋細胞の割合及び機能を阻害したことを直接的に証明した。

【0073】

（実施例５）
ｓＨＬＡ－Ｅ値を用いて健常者、肥厚性瘢痕及びケロイドの患者を同定することができる

【0074】

病人及び試料情報について
上海交通大学医学院付属第九人民病院で収容治療されたが治療を受けていないケロイド患者（３４名）、健常者（３６名）及び肥厚性瘢痕患者（２７名）を組み入れた。

【0075】

健常者と、肥厚性瘢痕患者と治療を受けていないケロイド患者とを対比するとき、肥厚性瘢痕患者の末梢血内のｓＨＬＡ－Ｅは、健常者に比べて顕著に増加し（１．４９±０．６５ｖｓ．０．５０±０．４６ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１）、治療を受けていないケロイド患者の発現量は５．６１±１．５４ｎｇ／ｍｌであり、健常者及び肥厚性瘢痕患者に比べていずれも顕著な差があった（ｐ＜０．０００１、図５Ａ）。

【0076】

本実施例によれば、従来の分類において、同じ病理学的瘢痕に属する、肥厚性瘢痕患者のｓＨＬＡ－Ｅ発現は、ケロイド患者に比べて明らかに減少したが、健常者よりも高いことを証明した。

【0077】

（実施例６）
ｓＨＬＡ－Ｅ値を用いてケロイド患者が糖質コルチコイド療法を受けた後の状況を判断することができる

【0078】

病人及び試料情報は、実施例２と同じであった。

【0079】

健常者と、治療を受けていないケロイド患者と、糖質コルチコイド療法を受けた患者とを対比すると、治療を受けていないケロイド患者の発現量は、５．６１±１．５４ｎｇ／ｍｌであり、健常者の０．５０±０．４６ｎｇ／ｍｌよりも顕著に高く（ｐ＜０．０００１）、古典的な糖質コルチコイド療法を受けたケロイド患者のｓＨＬＡ－Ｅの発現は、２．１５±１．７３ｎｇ／ｍｌであり、治療を受けていない患者（ｐ＜０．０００１、図５Ｂ）よりも顕著に低いが、健常者よりも高かった。

【0080】

実施例５、６の結果は、ｓＨＬＡ－Ｅが病理学的瘢痕の発生と顕著な関連性があり、そして異なる種類の病理学的瘢痕、即ち肥厚性瘢痕とケロイドとの間の発現が異なることを証明した。この結果は、２種類の瘢痕が発病メカニズムに同じ点を有するが、病原因子の強度に明らかな差があることを示唆している。これは、両者の臨床的な表現が異なる原因であり、即ち肥厚性瘢痕の成長が自己制限的であり、元の傷口の境界を超えず、ケロイドの成長が非自己制限であり、既存の傷口の境界を超えて周囲の正常組織に絶えず進展することができる。ケロイド治療後、ｓＨＬＡ－Ｅが明らかに減少したことは、糖質コルチコイド＋５－ＦＵの治療有効性が末梢血の血清中で反応し得ることを示唆している。

【0081】

（実施例７）
集団試料においてｓＨＬＡ－Ｅの同定効果を検証する

【0082】

病人及び試料情報は、５１２名の健常なドナー、１００名の干渉症例患者（他の疾患（即ち、非ケロイド）と診断された患者）及び１０４名のケロイド患者（治療を受けていない）である。

【0083】

血清ｓＨＬＡ－Ｅについて、健常なドナーの場合、１．２６±１．００ｎｇ／ｍｌであり、干渉症例患者の場合、２．０５±２．４１ｎｇ／ｍｌであり、いずれもケロイド患者より顕著に低かった（６．３４±２．５８、Ｐ＜０．０００１、表２）。本発明者らは、ｓＨＬＡ－Ｅの臨界値を３ｎｇ／ｍｌに設定して、感受性（８２．６９％）と特異性（非ケロイド（健常なドナー＋干渉症例）ｖｓケロイド＝９２．１６％、健常なドナー（非ケロイド）ｖｓケロイド＝９４．７３％（特異性）、干渉症例（非ケロイド）ｖｓケロイド症例＝７９．００％（特異性）があるｓＨＬＡ－Ｅ診断ケロイドを評価した（表２）。本発明者ら、６１名のケロイド患者を追跡し、それらは＞３回の病巣内治療（トリアムシノロンアセトニド＋５－ＦＵ）を受けた。治療を停止した後、１３名の患者（２１．３１％）のケロイドが＜６ヵ月に再発した。これら１３名の患者は、最後の治療を受けた後に血清ｓＨＬＡ－Ｅが４．０６±１．７０ｎｇ／ｍｌであり、他の患者よりも顕著に高かった（１．７３±１．０７、Ｐ＜０．０００２、表２）。

【0084】

健常なドナー、干渉病例患者及びケロイド患者体内の可溶性ヒト白血球抗原Ｅ（ｓＨＬＡ－Ｅ）のレベル

【表2】

【0085】

（実施例８）
悪性隆起性皮膚線維肉腫の検出効果

【0086】

悪性隆起性皮膚線維肉腫は、皮膚軟部組織肉腫のうちの一般的な種類であり、治療では手術を主とするが、手術の切除範囲が大きく、再発率が高いため、組織構造、形態破壊が大きい。特に、面部頸部の悪性隆起性皮膚線維肉腫は、顔器官、構造の奇形、ひいては失いをもたらすことが多い。患者への心理的な影響が大きく、社会に戻すことができないことが多い。悪性隆起性皮膚線維肉腫が発病原因、発展形態及び外観においてケロイドと高度に類似するため、しばしば治療誤診を引き起こし、治療のタイミングを遅延させて、肉腫組織が大きすぎて成長し、範囲が拡大してしまい、続いて手術の切除範囲が拡大して大きな軟部組織の破壊を引き起こす。現在、局所生検を行うか又は切除してから病理検査を行うことのほか、簡単な実行可能な同定診断方法に乏しいことに鑑み、本実施例は、臨床で診断マーカーで診断を補助することを提出し、以上の臨床応用シーンに対して大きな臨床応用価値がある。

【0087】

病人及び試料情報について
５１２名の健常なドナー、１４名の悪性隆起性皮膚線維肉腫患者及び１０４名のケロイド患者（治療を受けていない）であった。

【0088】

検出したところ、血清ｓＨＬＡ－Ｅについて、健常なドナーの場合、１．２６±１．００ｎｇ／ｍｌであり、ケロイド患者の場合、６．３４±２．５８であった（表３）。結果は、実施例５と一致した。更に対比したところ、悪性隆起性皮膚線維肉腫患者は、血清ｓＨＬＡ－Ｅが１．２４±０．５９ｎｇ／ｍｌであり、ケロイド患者より顕著に低いことを発見した（Ｐ＜０．０００１、表３）。ｓＨＬＡ－Ｅは、悪性隆起性皮膚線維肉腫患者及びケロイド患者の体内に顕著な差があり、悪性隆起性皮膚線維肉腫の診断に新しい構想を提供した。

【0089】

【表3】

開示された発明の原理を応用できる多くの可能な実施例に鑑み、示された実施例は、本願の好適な例に過ぎず、本願の範囲を制限するものと見なされるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本願の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定される。したがって、これらの請求項の範囲及び精神から逸脱しない全ての発明の保護を求めている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】