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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/06 20060101AFI20240628BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240628BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240628BHJP
C12N 1/06 20060101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/06
C12N5/10
C12N15/86 Z
C12N15/63 Z
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N1/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580953
(86)(22)【出願日】2022-06-30
(85)【翻訳文提出日】2024-02-05
(86)【国際出願番号】 US2022035883
(87)【国際公開番号】W WO2023278810
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】63/217,576
(32)【優先日】2021-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513167522
【氏名又は名称】ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】シェストパロフ， イリヤ
(72)【発明者】
【氏名】サイア， グレゴリー ローレンス
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ13
4B063QQ79
4B063QS40
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA44
(57)【要約】
本開示は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を測定するための改良された方法を提供する。より具体的には、本開示は、β－グロビンをコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法を提供する。一態様では、細胞におけるヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を評価するための方法が提供され、この方法は、細胞の集団を改変してグロビン（例えば、β－グロビン）を発現させることと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって、細胞溶解物を形成することと；細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞におけるヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を評価する方法であって、ａ）細胞の集団を改変してβ－グロビンを発現させることと；
ｂ）非変性条件下で前記細胞を溶解し、それにより細胞溶解物を形成することと；
ｃ）前記細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析することであって、
ｉ）前記細胞溶解物をＩＥＸクロマトグラフィーカラムに通すことと；
ｉｉ）ＨｂＦ及び／またはＨｂＡヘモグロビン多量体に結合するヘム基を４１８ｎｍで検出することと、を含む、前記分析することと、
ｄ）ＨｂＡ発現を計算することと、
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記改変することが、β－グロビン遺伝子をコードするベクターを前記細胞の集団に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ベクターが、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記改変することが、ａ）エンドヌクレアーゼ、またはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、
ｂ）β－グロビンをコードするドナー修復テンプレートと、
を前記細胞の集団に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記エンドヌクレアーゼが、ａ）ホーミングエンドヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；
ｂ）ｍｅｇａＴＡＬまたはその機能的バリアント；
ｃ）ＣＲＩＳＰＲ－関連ヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；
ｄ）ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；及び
ｅ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその機能的バリアント、
からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ドナー修復テンプレートが、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、改変後約２４～約９６時間、前記細胞を培養することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
β－グロビン遺伝子をコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法であって、ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）を発現しない細胞の集団に、β－グロビン遺伝子をコードするベクターを形質導入することと；
ｂ）非変性条件下で前記細胞を溶解し、それにより細胞溶解物を形成することと；
ｃ）前記細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析することであって、
ｉ）前記細胞溶解物をＩＥＸクロマトグラフィーカラムに通すことと；
ｉｉ）ＨｂＦ及び／またはＨｂＡヘモグロビン多量体に結合するヘム基を４１８ｎｍで検出することと、を含む、前記分析することと、
ｄ）参照標準ベクターを導入した細胞におけるＨｂＡ発現と比較してＨｂＡ発現を計算することと、
を含む、前記方法。
【請求項11】
前記効力が相対効力である、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
形質導入後２４～９６時間、前記細胞の集団を培養することをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞の集団がＨｂＡを内在的に発現しない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞の集団が、ＨｂＡを発現しないように遺伝的に編集されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞の集団が胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記細胞の集団が、骨髄性白血病細胞株である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記細胞の集団がＫ５６２細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ、約１．０×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、または約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．６×１０６細胞／ｍｌ～約１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．７×１０６細胞／ｍｌ～約１．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．８×１０６細胞／ｍｌ～約１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約０．９×１０６細胞／ｍｌ～約１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記細胞が、改変または形質導入の前に、約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞が組織培養フラスコに播種される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が１２ウェルプレートに播種される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞が２４ウェルプレートに播種される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記細胞が約１ｍｌの総体積で播種される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項32】
前記細胞が約２ｍｌの総体積で播種される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項33】
前記細胞がポリブレンの存在下で形質導入される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記細胞が、約２μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞が、約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される、請求項３３に記載の方法。
【請求項36】
前記細胞が、改変または形質導入の後に約４８～約９６時間培養される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記細胞が、改変または形質導入の後に約６０～約８４時間培養される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記細胞が、改変または形質導入の後に約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、または約９６時間培養される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記細胞が、改変または形質導入の後に約７２±２時間培養される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記細胞が、改変または形質導入の後に約７２時間培養される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記細胞が、溶解後、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを用いて前記細胞溶解物を分析する前に凍結される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記ＨｂＡがαグロビン及びβグロビン鎖の二量体または四量体を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記ＨｂＦがαグロビン及びγグロビン鎖の二量体または四量体を含む、請求項７～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記β－グロビンがヒトβ－グロビンである、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記β－グロビンが、βＡ－Ｔ８７Ｑグロビン、βＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビン、またはβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンである、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記ベクターが、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、及びＧ９ベクター、またはそれらの誘導体である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記ベクターがｂｂ３０５である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記形質導入することが、約５～約４０、約５～約３０、約１０～約４０、または約１０～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項50】
前記形質導入することが、５～４０、５～３０、１０～４０、または１０～３０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記形質導入することが、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、及び／または約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記形質導入することが、約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項53】
前記形質導入することが、異なるウェルまたはプレートにおける、１つ以上のＭＯＩでのベクターの形質導入を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記形質導入することが、異なるウェルまたはプレートにおける、二重での１つ以上のＭＯＩでのベクターの形質導入を含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
前記形質導入することが、異なるウェルまたはプレートにおける、三重での１つ以上のＭＯＩでのベクターの形質導入を含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記形質導入することが、１０、１５、２０、２５、及び３０のＭＯＩでのベクターの形質導入を含む、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記ＩＥＸクロマトグラフィーがＩＥＸ ＨＰＬＣである、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記ＩＥＸクロマトグラフィーがＩＥＸ ＵＰＬＣである、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記ＩＥＸクロマトグラフィーがＩＥＸ ＵＨＬＰＣである、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記ＩＥＸクロマトグラフィーが、液体ベースの第１の移動相及び第２の移動相を含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記カラムが、基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含む固相を含む、請求項１～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記カラムが、基材に共有結合したスルホン酸リガンドを含む固相を含む、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記基材が、シリカ基材である、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
前記基材がポリマーである、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記クロマトグラフィーが波長可変紫外線（ＴＵＶ）検出器を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記クロマトグラフィーがフォトダイオードアレイ紫外線（ＰＤＡ ＵＶ）検出器を含む、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
前記クロマトグラフィーが、ＨｂＦ多量体をＨｂＡ多量体から分離する、請求項１～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
ＨｂＡ及びＨｂＦのクロマトグラフィーによる同定が、ヘモグロビン標準と比較した前記分析物ピークの一致した保持時間に基づいて行われる、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記標準がＡＦＳＣである、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記計算することが、ＨｂＡピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む、請求項１～６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項71】
前記計算することが、ＨｂＦピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記計算することが、ＨｂＡ発現を、ＨｂＡとＨｂＦとの合計に対するＨｂＡのパーセンテージとして決定することを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
前記計算することが、対数用量反応曲線を前記計算されたＨｂＡ発現にフィッティングすることをさらに含む、請求項１～７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項74】
前記計算することが、線形対数用量反応曲線を参照標準及び前記ベクターにフィッティングすることをさらに含む、請求項１～７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
前記対数用量がｌｏｇ１０用量である、請求項７３または請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記フィッティングすることが、相対効力を決定するための平行線アプローチを含む、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
前記相対効力が、次式によって決定される、請求項７６に記載の方法：【数4】
【請求項78】
前記フィッティングすることが補間アプローチを含む、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項79】
前記補間アプローチが、前記参照標準対数用量反応に適用される線形フィッティングを含み、前記ベクターのＨｂＡ％応答が、前記基準曲線フィッティングからＭＯＩを補間するために使用される、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記方法が、インビトロの方法である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項81】
前記方法が、エクスビボの方法である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年７月１日に出願された同時係属中の米国仮出願第６３／２１７，５７６号に対する優先権及びその権益を主張する。前記仮出願の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年７月１日に出願された同時係属中の米国仮出願第６３／２１７，５７６号に対する優先権及びその権益を主張する。前記仮出願の開示は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野
本開示は、ヘモグロビンＡ形成を測定するための改良された方法に関する。より具体的には、本開示は、β－グロビンをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）の効力を評価するための改良された方法を提供する。
本開示は、ヘモグロビンＡ形成を測定するための改良された方法に関する。より具体的には、本開示は、β－グロビンをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）の効力を評価するための改良された方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
関連技術の説明
１９６０年代及び１９７０年代の初期に遺伝子治療の概念が出現し、遺伝子治療が臨床現場に登場したのはつい最近のことであり、ＦＤＡによって承認されている遺伝子治療はほんの一握りである。遺伝子治療技術は、核酸を標的細胞に導入するためのウイルスベクター法と非ウイルスベクター法の両方を含む。
１９６０年代及び１９７０年代の初期に遺伝子治療の概念が出現し、遺伝子治療が臨床現場に登場したのはつい最近のことであり、ＦＤＡによって承認されている遺伝子治療はほんの一握りである。遺伝子治療技術は、核酸を標的細胞に導入するためのウイルスベクター法と非ウイルスベクター法の両方を含む。
【0004】
現在、サラセミア及び鎌状赤血球症を含む様々なヘモグロビン症の治療のための開発におけるいくつかの遺伝子治療がある。これらの疾患に共通するのは、機能性ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）の欠如である。追求される遺伝子治療技術は、その作用機序において異なるが、最終結果は同じであり、機能的ＨｂＡまたはＨｂＦ（胎児ヘモグロビン）の発現を増加させる。
【0005】
したがって、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターがヘモグロビン症を治療するための遺伝子治療に使用されるかどうかに関わらず、研究者と規制当局の両方は、所望の核酸（例えば、治療用β－グロビンをコードする核酸）を導入して機能的ＨｂＡ及び／またはＨｂＦ発現を増加させるためのベクターの有効性／効力を評価する方法を必要とする。現在の方法は、異なる結果、限定された正確度、不十分な特異性、及び／または実験間及び／またはベクターのバッチ間で比較できないことに苦しむ。したがって、機能的ＨｂＡを検出し、ベクター効力を評価するための改良された方法の必要性が残存する。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、概して、機能的ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を評価するための方法に部分的に関する。いくつかの実施形態では、グロビン遺伝子（例えば、β－グロビン）をコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法が提供される。
【0007】
一態様では、細胞におけるヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を評価するための方法が提供され、この方法は、細胞の集団を改変してグロビン（例えば、β－グロビン）を発現させることと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって、細胞溶解物を形成することと；細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。特定の実施形態では、分析することは、細胞溶解物をＩＥＸクロマトグラフィーカラムに通し、４１８ｎｍでＨｂＦ及び／またはＨｂＡのヘモグロビンの多量体に関連するヘム基を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＨｂＡ発現は、参照標準と比較して計算される。
【0008】
種々の実施形態では、改変することは、グロビン（例えば、β－グロビン）遺伝子をコードするベクターを細胞の集団に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0009】
種々の実施形態では、改変することは、細胞の集団に、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；及びグロビン（例えば、β－グロビン）をコードするドナー修復テンプレートを導入することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；ｍｅｇａＴＡＬまたはその機能的バリアント；ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその機能的バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。いくつかの実施形態では、ドナー修復テンプレートは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0010】
種々の実施形態では、本方法は、改変後約２４～約９６時間、細胞を培養することをさらに含む。
【0011】
別の態様では、グロビン遺伝子（例えば、β－グロビン）をコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法が提供され、この方法は、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）を発現しない細胞の集団に、グロビン遺伝子（例えば、β－グロビン）をコードするベクターを形質導入することと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって細胞溶解物を形成することと；イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを用いて細胞溶解物を分析することと；参照標準ベクターを導入された細胞におけるＨｂＡ発現と比較してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。特定の実施形態では、分析することは、細胞溶解物をＩＥＸクロマトグラフィーカラムに通し、４１８ｎｍでＨｂＦ及び／またはＨｂＡのヘモグロビンの多量体に関連するヘム基を検出することを含む。
【0012】
種々の実施形態では、効力は、相対効力である。いくつかの実施形態では、効力は、参照標準と比較したものである。
【0013】
種々の実施形態では、本方法は、形質導入後２４～９６時間、細胞の集団を培養することをさらに含む。
【0014】
種々の実施形態では、細胞の集団は、ＨｂＡを内在的に発現しない。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＨｂＡを発現しないように遺伝的に編集されている。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）を発現する。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、骨髄性白血病細胞株である。特定の実施形態では、細胞の集団は、Ｋ５６２細胞である。
【0015】
種々の実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ、約１．０×１０６細胞／ｍｌ、約１．５×１０６細胞／ｍｌ、約２．０×１０６細胞／ｍｌ、約２．５×１０６細胞／ｍｌ、または約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．６×１０６細胞／ｍｌ～約１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．７×１０６細胞／ｍｌ～約１．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．８×１０６細胞／ｍｌ～約１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．９×１０６細胞／ｍｌ～約１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。
【0016】
種々の実施形態では、細胞は、組織培養フラスコ内に播種される。種々の実施形態では、細胞は、１２ウェルプレートに播種される。種々の実施形態では、細胞は、２４ウェルプレートに播種される。
【0017】
種々の実施形態では、細胞は、約１ｍｌの総体積で播種される。種々の実施形態では、細胞は、約２ｍｌの総体積で播種される。
【0018】
種々の実施形態では、細胞は、ポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約２μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【0019】
種々の実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約４８～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約６０～約８４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約４８、約６０、約７２、約８４、または約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約７２時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約７２±２時間培養される。
【0020】
種々の実施形態では、細胞は、溶解後、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを用いて細胞溶解物を分析する前に凍結される。
【0021】
種々の実施形態では、ＨｂＦは、α及びγグロビン鎖二量体または四量体を含む。
【0022】
種々の実施形態では、ＨｂＡは、α及びβグロビン鎖二量体または四量体を含む。いくつかの実施形態では、β－グロビンは、ヒトβ－グロビンである。いくつかの実施形態では、β－グロビンは、βＡ－Ｔ８７Ｑグロビン、βＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビン、またはβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンである。
【0023】
種々の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｄ４３２βＡγベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、及びＧ９ベクター、またはそれらの誘導体である。特定の実施形態では、ベクターはｂｂ３０５である。
【0024】
種々の実施形態では、形質導入することは、約５～約４０、約５～約３０、約１０～約４０、または約１０～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、５～４０、５～３０、１０～４０、または１０～３０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、及び／または約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、異なるウェルまたはプレートにおける、１つ以上のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、異なるウェルまたはプレートにおける、二重での１つ以上のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、異なるウェルまたはプレートにおける、三重での１つ以上のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、１０、１５、２０、２５、及び３０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。
【0025】
種々の実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＰＬＣ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＨＬＰＣである。
【0026】
種々の実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーは、液体ベースの第１の移動相及び第２の移動相を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含む固相を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、基材に共有結合したスルホン酸リガンドを含む固相を含む。いくつかの実施形態では、基材はシリカ基材である。いくつかの実施形態では、基材はポリマーである。
【0027】
種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、波長可変紫外線（ＴＵＶ）検出器を含む。
【0028】
種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、フォトダイオードアレイ紫外線（ＰＤＡ ＵＶ）検出器を含む。
【0029】
種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、ＨｂＦ多量体をＨｂＡ多量体から分離する。いくつかの実施形態では、ＨｂＡ及びＨｂＦのクロマトグラフィーによる同定は、ヘモグロビン標準と比較した分析物ピークの一致した保持時間に基づいて行われる。いくつかの実施形態では、標準はＡＦＳＣである。
【0030】
種々の実施形態では、計算することは、ＨｂＡピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＦピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＡ発現を、ＨｂＡとＨｂＦとの合計に対するＨｂＡのパーセンテージとして決定することを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、対数用量反応曲線を計算されたＨｂＡ発現にフィッティングすることをさらに含む。
【0031】
種々の実施形態では、計算することは、線形対数用量反応曲線を参照標準及びベクターにフィッティングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、対数用量はｌｏｇ１０用量である。
【0032】
種々の実施形態では、フィッティングすることは、相対効力を決定するための平行線法を含む。いくつかの実施形態では、相対効力は、次の式によって決定される：
【数1】
【0033】
種々の実施形態では、フィッティングすることは、補間アプローチを含む。いくつかの実施形態では、補間アプローチは、参照標準対数用量反応に適用される線形フィッティングを含み、ベクターのＨｂＡ％応答は、基準曲線フィッティングからＭＯＩを補間するために使用される。
【0034】
種々の実施形態では、本方法は、インビトロの方法である。
【0035】
種々の実施形態では、本方法は、エクスビボの方法である。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1A】レンチウイルスベクター由来のヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）のピークとヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のピークを示す代表的なクロマトグラムを示す。
【図1B】ポリブレンを含む場合と含まない場合の、異なる感染多重度（ＭＯＩ）におけるＨｂＡピーク面積とＨｂＦピーク面積との合計に対するＨｂＡピーク面積に基づくＨｂＡパーセント（ＨｂＡ％）を示す。
【図1C】出発細胞密度の関数としての経時的なＨｂＡ％を示す。
【図2A】レンチウイルスベクターロット２に関する種々の採取時間で、ｌｏｇ１０ ＭＯＩに対してプロットされたＨｂＡ％を示す。
【図2B】レンチウイルスベクターロット３に関する種々の採取時間で、ｌｏｇ１０ ＭＯＩに対してプロットされたＨｂＡ％を示す。
【図4A】異なるＭＯＩ及び種々の培養条件下でのＨｂＡ％を示す。
【図4B】異なるＭＯＩ及び種々の培養条件下でのＨｂＡの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【図4C】異なるＭＯＩ及び種々の培養条件下でのＨｂＦの曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【図5A】β－グロビンをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した細胞からのＨｂＡ％計算を示す。
【図5B】β－グロビンをコードするレンチウイルスベクターを形質導入した細胞からのＨｂＡとＨｂＦのＡＵＣを示す。
【図5C】モック形質導入された試料のＨｂＦのＡＵＣを示す。
【図6A】接着（参照ロット１９）及び懸濁（ロット００３）産生細胞株からのレンチウイルスベクターを形質導入した細胞からのＨｂＡ％計算を示す。
【図6B】接着（参照ロット１９）及び懸濁（ロット００４）産生細胞株からのレンチウイルスベクターを形質導入した細胞からのＨｂＡ％計算を示す。
【図7A】ＨｂＡピーク及びＨｂＦピークに関する予想されたピークＡＵＣ対観察されたピークＡＵＣを示す。
【図7B】予想されたＨｂＡ％対観察されたＨｂＡ％を示す
【図8A】図８は、ブランク及びＡＦＳＣヘモグロビン標準条件と比較した、レンチウイルスベクター（レンチグロビンＢＢ３０５ ＬＶＶ）及びモックトランスフェクト細胞に由来する細胞溶解物からの代表的なクロマトグラムを示す。
【図8B】図８は、ブランク及びＡＦＳＣヘモグロビン標準条件と比較した、レンチウイルスベクター（レンチグロビンＢＢ３０５ ＬＶＶ）及びモックトランスフェクト細胞に由来する細胞溶解物からの代表的なクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【0037】
Ａ． 概要
本開示は、概して、ヘモグロビンＡの発現／形成を検出する改良された方法に部分的に関する。より具体的には、本開示は、β－グロビンをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）の効力を評価するための改良された方法に関する。具体的には、本発明者らは、ＨｂＡ及びＨｂＦの検出に対して高度に正確かつ特異的である一方で、実験及び異なるバッチ／ロットのベクターにわたって結果を比較する能力も有する、改善されたヘモグロビン検出及びベクター効力アッセイを発見した。さらに、アッセイは、比較的短い時間枠で完了することができ、例えば、７日以下で細胞調製、１日でクロマトグラフィーが行われる。したがって、限定された正確度、不十分な特異性、速度、及び／または比較性の欠如の問題は、本明細書にさらに記載されるように、改良された方法によって解決される。
本開示は、概して、ヘモグロビンＡの発現／形成を検出する改良された方法に部分的に関する。より具体的には、本開示は、β－グロビンをコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）の効力を評価するための改良された方法に関する。具体的には、本発明者らは、ＨｂＡ及びＨｂＦの検出に対して高度に正確かつ特異的である一方で、実験及び異なるバッチ／ロットのベクターにわたって結果を比較する能力も有する、改善されたヘモグロビン検出及びベクター効力アッセイを発見した。さらに、アッセイは、比較的短い時間枠で完了することができ、例えば、７日以下で細胞調製、１日でクロマトグラフィーが行われる。したがって、限定された正確度、不十分な特異性、速度、及び／または比較性の欠如の問題は、本明細書にさらに記載されるように、改良された方法によって解決される。
【0038】
一態様では、ヘモグロビンＡ発現を評価するための方法が提供され、この方法は、細胞の集団を改変してβ－グロビン遺伝子を発現させることと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって、細胞溶解物を形成することと；細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。種々の実施形態では、改変することは、（ｉ）細胞の集団にβ－グロビン遺伝子をコードするベクターを細胞の集団に導入すること、または（ｉｉ）細胞の集団に、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ）と、β－グロビン遺伝子をコードするドナー修復テンプレートと、を導入することを含む。
【0039】
別の態様では、β－グロビン遺伝子をコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法が提供され、この方法は、ＨｂＡを発現しない細胞の集団に、β－グロビン遺伝子をコードするベクターを形質導入することと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって細胞溶解物を形成することと；イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを用いて細胞溶解物を分析して参照標準ベクターを導入された細胞におけるＨｂＡ発現と比較してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。
【0040】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、改変または形質導入の後に約２４～９６時間細胞を培養することをさらに含む。
【0041】
種々の実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーは、細胞溶解物をＩＥＸクロマトグラフィーカラムに通し、４１８ｎｍでＨｂＦ及び／またはＨｂＡのヘモグロビンの多量体に関連するヘム基を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、またはＵＨＰＬＣである。
【0042】
種々の実施形態では、細胞の集団は、ＨｂＡを内在的に発現しないか、またはＨｂＡを発現しないように遺伝的に編集されている。種々の実施形態では、細胞は、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄性白血病細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。
【0043】
種々の実施形態では、形質導入することは、約５～約４０、約５～約３０、約１０～約４０、または約１０～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でのベクターの形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、異なるウェルまたはプレートにおける、１つ以上のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。
【0044】
種々の実施形態では、効力は、相対効力である。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＡピーク及び／またはＨｂＦを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＡ発現を、ＨｂＡとＨｂＦとの合計に対するＨｂＡのパーセンテージとして決定することを含む。
【0045】
種々の実施形態では、計算することは、対数用量（例えば、ｌｏｇ１０）反応曲線を計算されたＨｂＡ発現にフィッティングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、フィッティングすることは線形フィッティングである。いくつかの実施形態では、フィッティングすることは、平行線アプローチまたは補間アプローチを含む。いくつかの実施形態では、補間アプローチは、参照標準対数用量反応に適用される線形フィッティングを含み、ベクターのＨｂＡ％応答は、基準曲線フィッティングからＭＯＩを補間するために使用される。
【0046】
特定の実施形態では、ＨｂＡ及びＨｂＦのクロマトグラフィーによる同定は、ヘモグロビン標準（例えば、ＡＦＳＣ）と比較して分析物ピークの一致した保持時間に基づいて行われる。
【0047】
組換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成、イムノアッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製及び関連する技術及び手順のための技術は、一般に、本明細書を通して引用及び考察されるような、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学、及び免疫学における種々の一般的及び特定の参考文献に記載されるように実施され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及び、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの雑誌におけるモノグラフを参照されたい。
【0048】
Ｂ． 定義
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。
【0049】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を特定の実施形態の実施または試験において使用することができるが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料を本明細書に記載する。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。
【0050】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つまたは１つ以上）を指すように使用している。例として、「要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【0051】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味するものと理解されたい。
【0052】
「及び／または」という用語は、選択肢の一方または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
【0053】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下の量で変動する、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【0054】
一実施形態では、範囲、例えば１～５、約１～５、または約１～約５は、範囲によって包含されるそれぞれの数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、「１～５」の範囲は、１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０という表現に等しい。
【0055】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同一である効果、例えば生理学的効果を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【0056】
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと」は、述べられたステップ、もしくは要素、またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他のステップ、もしくは要素、またはステップもしくは要素の群を排除することを意味しないことが理解されるだろう。「～からなる」とは、「～からなる」という語句に先行するものを含み、かつこれらに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、挙げられる要素が必要または必須であり、かつ他の要素は存在し得ないことを示す。「～から本質的になる」とは、語句の前に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について本開示で指定された活性または作用を妨害しないか、またはそれらに寄与しない他の要素に限定される。したがって、「～から本質的になる」という語句は、挙げられる要素は必要または必須であるが、挙げられた要素の活性または作用に重大な影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
【0057】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしもすべてが同一の実施形態を参照しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。一実施形態におけるある特徴の肯定的な記載は、特定の実施形態におけるその特徴を除外するための根拠となることも理解される。
【0058】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、非ウイルス法によって、例えば、液体ナノ粒子の使用によって、ネイキッドＤＮＡを細胞に導入するプロセスを指す。
【0059】
本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、ウイルスベクターを使用して細胞に外来ＤＮＡを導入するプロセスを指す。
【0060】
本明細書で使用される場合、「形質導入」という用語は、ウイルスベクターを使用する細胞ゲノムへの外来ＤＮＡの導入を指す。
【0061】
本明細書で使用される場合、「グロビン」という用語は、ヘム部分に共有的または非共有的に結合することができ、したがって酸素を輸送または貯蔵することができるタンパク質またはタンパク質サブユニットを指す。脊椎動物及び無脊椎動物ヘモグロビン、脊椎動物及び無脊椎動物ミオグロブリン、またはそれらの変異体のサブユニットは、グロビンという用語に含まれる。この用語は、ヘモシアニンを除外する。グロビンの例としては、α－グロビンまたはそのバリアント、β－グロビンまたはそのバリアント、γ－グロビンまたはそのバリアント、及びδ－グロビンまたはそのバリアントが挙げられる。
【0062】
「ヘモグロビン」という用語は、赤血球（赤血球）中の多量体、鉄含有、酸素輸送金属タンパク質を指す。ヘモグロビンは、典型的には四次構造、すなわち、４つのタンパク質サブユニット（グロビン分子）を含み、それぞれのサブユニット／鎖は、非タンパク質ヘム基と堅固に結合する。例えば、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）「多量体」は、α－グロビン及びβ－グロビン鎖の二量体または四量体を含む。ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）「多量体」は、α－グロビン及びγ－グロビン鎖の二量体または四量体を含む。
【0063】
「外来性」分子は、通常細胞中に存在しないが、１つ以上の遺伝子学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入される分子である。外来性分子としては、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上述の分子の任意の修飾された誘導体、または上述の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が挙げられるがこれらに限定されない。細胞に外来性分子を導入するための方法が当業者に知られており、脂質媒介導入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、生体高分子ナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、及びウイルスベクター媒介導入を含むが、これらに限定されない。
【0064】
「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階にある特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内在性分子は、タンパク質、例えば、内在性β－グロビンまたはγ－グロビンを含み得る。
【0065】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような制御配列がコード配列及び／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず）を含む。遺伝子としては、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答エレメント、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位）、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【0066】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチリル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。
【0067】
本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」、「遺伝子編集」、または「遺伝的な編集」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、及び／または改変する、細胞ゲノム中の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、及び／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、１つ以上のエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入して、細胞のゲノム中の標的部位にＤＮＡ損傷を生成し、グロビンまたはグロビン多量体（例えば、β－グロビン及び／またはＨｂＡ）の発現を破壊、低減、または排除することを含む。さらに他の実施形態において企図されるゲノム編集は、１つ以上のエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、グロビン（β－グロビン）をコードするドナー修復テンプレートと、を細胞に導入することを含む。
【0068】
さらなる定義は、本開示全体を通して記載されている。
【0069】
Ｃ． ＨｂＡ発現を測定する方法
ヘモグロビンの多くの型及びバリアントがあり、これには、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）、及びヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）が含まれるが、これらに限定されない。成体ヘモグロビンとしても知られるＨｂＡは、α－グロビン及びβ－グロビン鎖の二量体または四量体からなり、成体ヒトにおける主要な酸素結合タンパク質である。ＨｂＦは、α－グロビン及びγ－グロビン鎖の二量体及び四量体からなり、ヒト胎児における主要な酸素結合タンパク質である。ＨｂＳ及びＨｂＣは、それぞれ鎌状赤血球症及び鎌状赤血球形質に関連する異常なヘモグロビンバリアントである。
ヘモグロビンの多くの型及びバリアントがあり、これには、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）、及びヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）が含まれるが、これらに限定されない。成体ヘモグロビンとしても知られるＨｂＡは、α－グロビン及びβ－グロビン鎖の二量体または四量体からなり、成体ヒトにおける主要な酸素結合タンパク質である。ＨｂＦは、α－グロビン及びγ－グロビン鎖の二量体及び四量体からなり、ヒト胎児における主要な酸素結合タンパク質である。ＨｂＳ及びＨｂＣは、それぞれ鎌状赤血球症及び鎌状赤血球形質に関連する異常なヘモグロビンバリアントである。
【0070】
本開示全体を通して考察されるように、本発明者らは驚くべきことに、細胞ペレット試料中のＨｂＡ％の測定に適した範囲にわたって特異性、頑健性、精密度、及び直線性を実証する、ＨｂＡ発現及びベクター効力を評価するための方法を発見した。本開示はまた、グロビン（例えば、β－グロビン）をコードするベクター（例えば、ウイルスベクター）の効力を評価するための改良された方法に関する。
【0071】
一態様では、細胞におけるヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）形成を評価するための方法が提供され、この方法は、細胞の集団を改変してβ－グロビンを発現させることと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって、細胞溶解物を形成することと；細胞溶解物をイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーで分析してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。
【0072】
別の態様では、β－グロビン遺伝子をコードするウイルスベクターの効力を評価するための方法が提供され、この方法は、ＨｂＡを発現しない細胞の集団に、β－グロビン遺伝子をコードするベクターを形質導入することと；非変性条件下で細胞を溶解し、したがって細胞溶解物を形成することと；イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーを用いて細胞溶解物を分析して参照標準ベクターと比較してＨｂＡ発現を計算することと、を含む。特定の実施形態では、効力は、相対効力である。
【0073】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞にベクターを導入するステップを含む。種々の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。ベクターを細胞に導入するためのベクター型及び方法（例えば、形質導入、トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションによる）は、当該技術分野で公知であり、以下でさらに論じられる。簡潔に述べると、特定の実施形態では、ベクターは、グロビンをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、グロビンは、ヒトβ－グロビン、ヒトδ－グロビン、抗シックリンググロビン、ヒトγ－グロビン、ヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ－グロビン、ヒトβＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビン、またはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンタンパク質である。特定の実施形態では、グロビンはヒトβ－グロビンタンパク質である。特定の実施形態では、グロビンは、抗シックリンググロビンタンパク質である。特定の実施形態では、グロビンはヒトγ－グロビンタンパク質である。特定の実施形態では、グロビンはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ－グロビンタンパク質である。特定の態様では、グロビンはヒトβＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビンタンパク質である。特定の態様では、グロビンはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンタンパク質である。特定の実施形態では、β－グロビンは、ヒトβ－グロビンである。特定の実施形態では、β－グロビンはβＡ－Ｔ８７Ｑグロビンである。
【0074】
種々の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、ＴＮＳ９．３ベクター、ＴＮＳ９．３．５５ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはそれらの誘導体である。
【0075】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９．３ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９．３．５５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチグロビンＢＢ３０５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＢＧ－１ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＢＧＭ－１ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＧＬＯＢＥベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、βＡＳ３－ＦＢベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはＶ５ベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖ５ｍ３ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖ５ｍ３－４００ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｇ９ベクターまたはその誘導体である。
【0076】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターはｂｂ３０５である。
【0077】
種々の実施形態では、改変することは、細胞の集団に、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド；及びグロビン遺伝子（例えば、β－グロビン）をコードするドナー修復テンプレートまたはベクターを導入することを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）またはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ｍｅｇａＴＡＬ、またはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼまたはその機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその機能的バリアントである。
【0078】
種々の実施形態では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0079】
種々の実施形態では、ドナー修復テンプレートは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0080】
本明細書に記載の方法に有用な細胞は、ＨｂＡを発現しない、または低レベルのＨｂＡを発現する（例えば、ＨｂＦ発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍少ない発現）、任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄性白血病細胞株である。特定の実施形態では、骨髄性白血病細胞株は、ＨｂＡを内在的に発現しないか、または低レベルのＨｂＡを発現する（例えば、ＨｂＦ発現と比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍少ない発現）。
【0081】
ＨｂＡは、α－グロビン及びβ－グロビン鎖の二量体または四量体を含む。したがって、特定の実施形態では、細胞はβ－グロビンを発現しない。いくつかの実施形態では、細胞はα－グロビンを発現する。特定の実施形態では、細胞はα－グロビンを発現し、β－グロビンを発現しない。
【0082】
ＨｂＦは、α－グロビン及びγ－グロビン鎖の二量体または四量体を含む。したがって、種々の実施形態では、細胞はＨｂＦを発現する。いくつかの実施形態では、細胞はＨｂＦを内在的に発現する。いくつかの実施形態では、細胞はＨｂＦを外来的に発現する。したがって、特定の実施形態では、細胞は内在的または外来的にγ－グロビンを発現する。特定の実施形態では、細胞は、α－グロビン及びγ－グロビンを内在的または外来的に発現する。さらにより特定の実施形態では、細胞は、α－グロビン及びγ－グロビン鎖の二量体または四量体を内在的または外来的に発現する。好ましい実施形態では、細胞はＫ５６２細胞である。
【0083】
種々の実施形態では、細胞は、ベクターの導入（例えば、形質導入による）または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．０×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．０×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．５×１０６細胞／ｍｌ～約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約２．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌ～約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。
【0084】
種々の実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．６×１０６細胞／ｍｌ～約１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．７×１０６細胞／ｍｌ～約１．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．８×１０６細胞／ｍｌ～約１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．９×１０６細胞／ｍｌ～約１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。
【0085】
いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．７×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．８×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約０．９×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．７×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．８×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約１．９×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．２×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．３×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．４×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．７×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．８×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約２．９×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、ベクターの導入または改変の前に、約３．０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種される。
【0086】
種々の実施形態では、細胞は、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、または組織培養フラスコに播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、１２ウェルプレートに播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、２４ウェルプレートに播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、組織培養フラスコ内に播種される。
【0087】
いくつかの実施形態では、細胞は、約１ｍｌの総体積で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、１ｍｌの総体積で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、約２ｍｌの総体積で播種される。いくつかの実施形態では、細胞は、２ｍｌの総体積で播種される。
【0088】
種々の実施形態では、細胞は、ポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約２μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約３μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約７μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【0089】
いくつかの実施形態では、細胞は、約２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約３μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約７μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【0090】
種々の実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約５～約４０、約５～約３０、約１０～約４０、または約１０～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約５～約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約５～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約１０～約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約１０～約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、５～４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、５～３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、１０～４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、１０～３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。
【0092】
種々の実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、及び／または約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約５の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約１０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約１５の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約２０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約２５の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約３０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約３５の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、約４０の感染多重度（ＭＯＩ）でウイルスベクターを形質導入することを含む。
【0093】
種々の実施形態では、細胞へのベクターの導入は、異なるウェルまたはプレートにおける、１種以上のＭＯＩでウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、異なるウェルまたはプレートにおける、二重での１種以上のＭＯＩでウイルスベクターを形質導入することを含む。いくつかの実施形態では、細胞へのベクターの導入は、異なるウェルまたはプレートにおける、三重での１種以上のＭＯＩでウイルスベクターを形質導入することを含む。
【0094】
種々の実施形態では、形質導入することは、約１０、約１５、約２０、約２５、及び約３０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、１０、１５、２０、２５、及び３０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約５、約１０、約２０、及び約３０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、５、１０、２０、及び３０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約１０、約２０、約３０、及び約４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、１０、２０、３０、及び４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約５、約１０、約２０、約３０、及び約４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、５、１０、２０、３０、及び４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、約５、約１０、約２０、及び約４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。いくつかの実施形態では、形質導入することは、５、１０、２０、及び４０のＭＯＩでのベクターによる形質導入を含む。
【0095】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、改変または形質導入の後に細胞を培養するステップを含む。種々の実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約２４～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約３６～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約４８～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約６０～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約７２～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約８４～約９６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約６０～約８４時間培養される。
【0096】
いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約２４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約３６時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約４８時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約６０時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約７２時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約８４時間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約９６時間培養される。
【0097】
種々の実施形態では、細胞は、改変または形質導入の後に約７２±２時間培養される。
【0098】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、培養することの後に細胞を溶解するステップを含む。いくつかの実施形態では、溶解することは、非変性条件下で行われる。いくつかの実施形態では、非変性条件は、細胞を凍結させることを含む。いくつかの実施形態では、溶解することは、細胞を凍結させることと、凍結した細胞溶解物を水に再懸濁することと、溶解物を遠心分離することと、分析のために溶解物を回収することと、を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、溶解後、クロマトグラフィーを用いて細胞溶解物を分析する前に凍結される。
【0099】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、細胞溶解物を分析するステップを含む。特定の実施形態では、分析することは、細胞溶解物をクロマトグラフィーカラムに通すステップを含む。
【0100】
特定の実施形態では、クロマトグラフィーは、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィーである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、またはＵＰＬＣ（商標）である。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはＵＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーはＵＰＬＣである。種々の実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＬＰＣである。ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、及び／またはＵＰＬＣを行うための方法及びシステムは当該技術分野で公知であり、以下でさらに論じる。
【0101】
種々の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、ＩＥＸクロマトグラフィー）は、液体ベースの第１の移動相及び第２の移動相を含む。種々の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、ＩＥＸクロマトグラフィー）は、固相を含む。いくつかの実施形態では、固相は、基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含む。いくつかの実施形態では、固相は、基材に共有結合したスルホン酸リガンドを含む。いくつかの実施形態では、基材はシリカ基材である。いくつかの実施形態では、基材はポリマーである。
【0102】
特定の実施形態では、分析することは、ＨｂＦ及び／またはＨｂＡヘモグロビン多量体に結合するヘム基を検出することを含む。種々の実施形態では、分析すること／クロマトグラフィーシステムは、検出器を含む。いくつかの実施形態では、分析すること／クロマトグラフィーシステムは、検出器を含み、ＨｂＦ及びＨｂＡ多量体は、４１８ｎｍで吸光度を測定することによって検出される。いくつかの実施形態では、分析すること／クロマトグラフィーシステムは、紫外線（ＵＶ）検出器を含む。いくつかの実施形態では、分析すること／クロマトグラフィーシステムは、波長可変紫外線（ＴＵＶ）検出器を含む。いくつかの実施形態では、分析すること／クロマトグラフィーシステムは、フォトダイオードアレイ紫外線（ＰＤＡ ＵＶ）検出器を含む。種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、検出器によって測定されるＨｂＦ多量体／ピークをＨｂＡ多量体／ピークから分離する。
【0103】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、計算するステップを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＡピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＦピークを決定することと、曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することとを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、ＨｂＡ発現を、ＨｂＡとＨｂＦとの合計に対するＨｂＡのパーセンテージとして決定することを含む。
【0104】
種々の実施形態では、計算することは、対数用量反応曲線を参照標準及びベクターにフィッティングすることをさらに含む。種々の実施形態では、計算することは、線形対数用量反応曲線を参照標準及びベクターにフィッティングすることをさらに含む。特定の実施形態では、対数用量反応曲線は、ｌｏｇ１０用量反応曲線である。
【0105】
種々の実施形態では、フィッティングすることは、相対効力を決定するための平行線法を含む。いくつかの実施形態では、相対効力は、次の式によって決定される：
【数2】
【0106】
種々の実施形態では、フィッティングすることは、補間アプローチを含む。いくつかの実施形態では、補間アプローチは、参照標準対数用量反応に適用される線形フィッティングを含み、ベクターのＨｂＡ％応答は、基準曲線フィッティングからＭＯＩを補間するために使用される。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＨｂＡ及びＨｂＦのクロマトグラフィーによる同定は、ヘモグロビン標準と比較した分析物ピークの一致した保持時間に基づいて行われる。いくつかの実施形態では、標準はＡＦＳＣである。
【0108】
Ｄ． ベクター及び形質導入
特定の実施形態では、グロビン遺伝子（例えば、治療用β－グロビン）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクター／方法によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、グロビン遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクター／方法によって細胞に導入され得る。特定の実施形態では、グロビン遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法または異なる方法によって、及び／または同じベクターまたは異なるベクターによってもたらされ得る。特定の実施形態では、細胞は、ＨｂＡを発現しない（例えば、Ｋ５６２細胞）、またはＨｂＡを発現しないように遺伝的に編集された細胞である。
特定の実施形態では、グロビン遺伝子（例えば、治療用β－グロビン）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクター／方法によって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、グロビン遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクター／方法によって細胞に導入され得る。特定の実施形態では、グロビン遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法または異なる方法によって、及び／または同じベクターまたは異なるベクターによってもたらされ得る。特定の実施形態では、細胞は、ＨｂＡを発現しない（例えば、Ｋ５６２細胞）、またはＨｂＡを発現しないように遺伝的に編集された細胞である。
【0109】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を導入または輸送することができる核酸分子を指すために本明細書で使用される。輸送される核酸は、一般的に、ベクター核酸分子に連結される（例えば、挿入される）。ベクターは、細胞内で自律複製を誘導する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。
【0110】
当業者に明らかなように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の導入もしくは細胞のゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）、または核酸導入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すために広く使用される。ウイルス粒子は、典型的には、種々のウイルス成分を含み、場合によっては、核酸（複数可）に加えて宿主細胞成分も含む。「ウイルスベクター」という用語は、細胞に核酸を導入することができるウイルスまたはウイルス粒子または導入された核酸自体を指し得る。ウイルスベクター及び導入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的遺伝要素及び／または機能的遺伝要素を含む。
【0111】
特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドを、ＨｂＡを内在的に発現しない細胞に送達する。一実施形態では、ベクターはインビトロで合成されるかまたは合成的に調製される、グロビン遺伝子及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。
【0112】
いくつかの実施形態では、細胞に導入されるポリヌクレオチドまたはベクターは、グロビンをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、グロビンは、ヒトβ－グロビン、ヒトδ－グロビン、抗シックリンググロビン、ヒトγ－グロビン、ヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ－グロビン、ヒトβＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビン、またはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトβ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトδ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンは、抗シックリンググロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトγ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトβＡ－Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａ／Ｔ８７Ｑ－グロビンタンパク質である。いくつかの実施形態では、グロビンはヒトβＡ－Ｔ８７Ｑ／Ｋ９５Ｅ／Ｋ１２０Ｅ－グロビンタンパク質である。
【0113】
非ウイルスベクターの例示的な例としては、ｍＲＮＡ、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、及び細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0114】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドまたはベクターの非ウイルス送達の例示的な方法としては、限定されないが、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、リン酸カルシウム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入、遺伝子銃、及び熱ショックが挙げられる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0115】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に適したポリヌクレオチド及び／またはベクター送達系の例示的な例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；及びＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照されたい。抗体標的化、細菌由来、非生存ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【0116】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なウイルスベクター系の例示的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、及びワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0117】
種々の実施形態では、β－グロビンをコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を細胞に形質導入することによって、細胞、例えば、Ｋ５６２細胞に導入される。
【0118】
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）、複製能欠損の、主にエピソームである、非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列、ならびに５’及び３’のＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲ及びカプシド配列を含む。
【0119】
いくつかの実施形態では、キメラｒＡＡＶを使用し、ＩＴＲ配列を１つのＡＡＶ血清型から単離し、カプシド配列を異なるＡＡＶ血清型から単離する。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つ由来のカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ６由来のカプシド配列を含む。好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列及びＡＡＶ２由来のカプシド配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドに操作方法及び選択方法を適用して、それらを目的の細胞に形質導入する可能性をより高めることができる。
【0121】
ｒＡＡＶベクターの構築、その生成及び精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号；同第９，１６９，４９２号；同第９，０１２，２２４号；同第８，８８９，６４１号；同第８，８０９，０５８号；及び同第８，７８４，７９９号に開示されており、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。
【0122】
種々の実施形態では、β－グロビンをコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを細胞に形質導入することによって、細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）に導入される。
【0123】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0124】
「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む、構造的遺伝要素及び機能的遺伝要素またはその一部を含むレトロウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」及び「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、特定の実施形態では、レンチウイルス導入プラスミド及び／または感染性レンチウイルス粒子を指すために使用され得る。クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントを本明細書で参照する場合、これらのエレメントの配列は、本明細書で企図されるレンチウイルス粒子中にＲＮＡ形態で存在し、本明細書で企図されるＤＮＡプラスミド中にＤＮＡ形態で存在することを理解されたい。
【0125】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複雑なレトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；１型ＨＩＶ及びＨＩＶ２を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列要素）が好ましい。
【0126】
種々の実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で論じられるように、１つ以上のＬＴＲと、以下のアクセサリーエレメントの１つ以上または全部とを含む：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、搬出エレメント、ポリ（Ａ）配列、及び任意選択でＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インスレーターエレメント、選択マーカー、及び細胞自殺遺伝子を含み得る。
【0127】
特定の実施形態では、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組込み型または非組込み型または組込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み不能ウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0128】
インテグラーゼ活性を低下させるのに適したＨＩＶ－１ ｐｏｌ遺伝子の例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【0129】
一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、またはＥ１５２Ａ変異；Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、及びＥ１５２Ｇ変異；またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、及びＥ１５２Ａ変異を含む。
【0130】
一実施形態では、ＨＩＶ－１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
【0131】
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、これは、それらの天然の配列の文脈において、直接反復であり、そしてＵ３、Ｒ及びＵ５領域を含む。
【0132】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、その配列がレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２）の中央ポリプリン配列及び中央終結配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む、核酸を指す。適切なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ及び／またはＣＴＳエレメントに１つ以上の変異を有するＦＬＡＰエレメントを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳエレメントのいずれかを含む。さらに別の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴとＣＴＳエレメントのいずれも含まない。
【0133】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシドまたは粒子への挿入に必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置するｐｓｉ［Ψ］配列を指す（例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１－２１０９を参照）。
【0134】
「搬出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写産物の輸送を調節するｃｉｓ作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ搬出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３；及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照されたい）、及びＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない
【0135】
特定の実施形態では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、及び任意選択で転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって増加される。種々の転写後調節エレメントは、タンパク質における異種核酸の発現を増加させ得る（例えば、ウッドチャック型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＲＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）；Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，５：３８６４）など（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６））。
【0136】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変する結果として、いくつかの安全性増強を含む。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、複製欠損ベクターを指し、例えば、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、ウイルス複製の最初のラウンドを超えるウイルス転写を防止するように改変されている（例えば、欠失または置換によって）。追加の安全性増強は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性のシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、前最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【0137】
本明細書で使用される場合、「偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）」または「偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）」という用語は、好ましい特徴を有する別のウイルスのタンパク質で置換されたウイルスエンベロープタンパク質を有するウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質を用いて偽型化され得、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が通常、ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化するので、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することを可能にする。
【0138】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、公知の方法に従って生成される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２－６７５０－９－１０；Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５－５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【0139】
本明細書で企図される特定の具体的な実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全部は、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源が使用され得るか、または組み合わされ、特定のレンチウイルス配列における多くの置換及び変更が、本明細書に記載される機能を実行する導入ベクターの能力を損なうことなく適応され得ることを理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ，１９９６ｂ，ａｎｄ １９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号を参照でき、その多くが、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは導入プラスミドを生成するように適合され得る。
【0140】
種々の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクター、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクター、ＴＮＳ９ベクター、ＴＮＳ９．３ベクター、ＴＮＳ９．３．５５ベクター、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクター、レンチグロビンＢＢ３０５ベクター、ＢＧ－１ベクター、ＢＧＭ－１ベクター、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクター、ＧＬＯＢＥベクター、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクター、βＡＳ３－ＦＢベクター、Ｖ５ベクター、Ｖ５ｍ３ベクター、Ｖ５ｍ３－４００ベクター、Ｇ９ベクター、またはそれらの誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＡｎｋＴ９Ｗベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ９Ａｎｋ２Ｗベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９．３ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＴＮＳ９．３．５５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチグロビンＨＰＶ５６９ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、レンチグロビンＢＢ３０５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＢＧ－１ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＢＧＭ－１ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｍＬＡＲβΔγＶ５ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＧＬＯＢＥベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｇ－ＧＬＯＢＥベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、βＡＳ３－ＦＢベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはＶ５ベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖ５ｍ３ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖ５ｍ３－４００ベクターまたはその誘導体である。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｇ９ベクターまたはその誘導体である。
【0141】
種々の実施形態では、β－グロビンをコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスを細胞に形質導入することによって、細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）に導入される。
【0142】
アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いることで、高い力価及び高いレベルの発現が得られてきている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に産生することができる。多くのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠損遺伝子機能を補充するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは、インビボにおいて、肝臓、腎臓、及び筋肉において見出されるもののような、非分裂の分化細胞を含む、複数の型の組織を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな担持能を有する。
【0143】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成及び増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胚性腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３と称される固有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムに必須ではない（Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９７８）ので、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｄ３のいずれかまたは両方の領域に外来ＤＮＡを有する（Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍ ＆ Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究は、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注入（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、末梢静脈注入（Ｈｅｒｚ ＆ Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）及び脳への定位性接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を含む。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例には、筋肉内注入での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含まれている（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３－９（１９９８））。
【0144】
種々の実施形態では、β－グロビンをコードする１つ以上のポリヌクレオチドまたはベクターは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２）によって細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）を形質導入することによって細胞に導入される。
【0145】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有するエンベロープ型二十面体カプシドからなる。一実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須のＨＳＶ遺伝子を欠損している。一実施形態では、ＨＳＶに基づくウイルスベクターは、複製欠損である。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために、１つ以上の中間初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現を生じ得る潜伏期に入る能力、及び２５ｋｂまでの外来性ＤＮＡ挿入物を収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、及び同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、第ＷＯ９６／０４３９４号、第ＷＯ９８／１５６３７号、及び第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されており、そのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【0146】
特定の実施形態では、細胞は、ポリカチオン性ポリマーの存在下で、本明細書に記載のベクターを用いて形質導入される。いくつかの実施形態では、ポリカチオン性ポリマーは、ポリブレン、硫酸プロタミン、ポリエチレンイミン、またはポリエチレングリコール／ポリ－Ｌ－リジンブロックコポリマーである。いくつかの実施形態では、細胞は、ポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約２μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約３μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約７μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約２μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約３μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約４μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、約７μｇ／ｍｌ～約８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で形質導入される。
【0147】
エンドヌクレアーゼを使用して、標的配列にＤＳＢを導入することができ；ＤＳＢは、１つ以上のドナー修復テンプレートの存在下で、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介して修復することができる。いくつかの実施形態では、ドナー修復テンプレートを用いて、配列をゲノムに挿入する。特に好ましい実施形態では、ドナー修復テンプレートを用いて、グロビン遺伝子／タンパク質（例えば、治療用β－グロビン）をコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。
【0148】
本明細書の他の箇所で企図されるように、エンドヌクレアーゼは、ウイルス法または非ウイルス法によって導入され得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼポリペプチドが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが細胞に導入される。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、本明細書で企図されるウイルス法または非ウイルス法、例えば、トランスフェクション、形質導入、もしくはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。
【0149】
種々の実施形態では、細胞は、グロビン遺伝子を発現するように改変され、改変は、（ａ）エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、及び（ｂ）β－グロビンをコードするドナー修復テンプレートを細胞に導入することを含む。
【0150】
特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；ｍｅｇａＴＡＬまたはその機能的バリアント；ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはその機能的バリアント；及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはその機能的バリアントからなる群から選択される。
【0151】
本明細書の他の箇所で企図されるように、ドナー修復テンプレートは、ウイルス法または非ウイルス法によって細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ドナー修復テンプレートは、細胞を、ドナー修復テンプレートを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど）、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターで形質導入することによって導入される。
【0152】
特定の実施形態では、ドナー修復テンプレートは、エンドヌクレアーゼの二本鎖切断部位に隣接する１つ以上のホモロジーアームを含む。本明細書で使用される場合、「ホモロジーアーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一であるか、またはほぼ同一である、ドナー修復テンプレート中の核酸配列を指す。一実施形態では、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位の５’のＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む５’ホモロジーアームを含む。一実施形態では、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ切断部位の３’のＤＮＡ配列３´と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む３’ホモロジーアームを含む。好ましい実施形態では、ドナー修復テンプレートは、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームを含む。ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位からの任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態では、ドナー修復テンプレートは、ゲノム配列に対して約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ、またはそれ以上の相同性を有する核酸配列（任意の介在する長さの相同配列を含む）を含む。
【0153】
特定の実施形態において企図されるホモロジーアームの適切な長さの例示的な例は、すべての介在する長さのホモロジーアームを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、もしくは約３０００ｂｐ、またはそれ以上のホモロジーアームから独立して選択することができ、これらを含むがこれらに限定されない。
【0154】
適切なホモロジーアームの長さの追加の例示的な例としては、約１００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐ（すべての介在する長さのホモロジーアームを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0155】
特定の実施形態では、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの長さは、独立して、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐから選択される。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約１５００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約１０００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約２００ｂｐ～約６００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約２００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約２００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約３００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約３００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約４００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約４００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約５００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約５００ｂｐである。一実施形態では、５’ホモロジーアームは約６００ｂｐであり、３’ホモロジーアームは約６００ｂｐである。
【0156】
種々の実施形態では、ドナー修復テンプレートは、トランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションによって導入される。
【0157】
Ｅ． クロマトグラフィー
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法／プロセスは、液体クロマトグラフィーを使用して、異なる形態のヘモグロビン、例えばＨｂＦ及びＨｂＡ、を分離する。本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」、「ＬＣ」という用語は、試料の成分が、移動相（すなわち、液体移動相）及び固定相との試料の相互作用に基づいて分離されるプロセスを指す。液体移動相は、固体固定相（分離された成分と共に）を通って、適切な検出及び／または定量のための検出ユニットに渡された。液体クロマトグラフィープロセスの非限定的な例としては、ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣが挙げられる。
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法／プロセスは、液体クロマトグラフィーを使用して、異なる形態のヘモグロビン、例えばＨｂＦ及びＨｂＡ、を分離する。本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィー」、「ＬＣ」という用語は、試料の成分が、移動相（すなわち、液体移動相）及び固定相との試料の相互作用に基づいて分離されるプロセスを指す。液体移動相は、固体固定相（分離された成分と共に）を通って、適切な検出及び／または定量のための検出ユニットに渡された。液体クロマトグラフィープロセスの非限定的な例としては、ＨＰＬＣ及びＵＰＬＣが挙げられる。
【0158】
「高速液体クロマトグラフィー」、「高圧液体クロマトグラフィー」、及び「ＨＰＬＣ」という用語は、ポンプを使用して、試料混合物を含む加圧液体溶媒を、固体／固定吸着性物質または基材で満たされたカラムに通す液体クロマトグラフィー技術を指す。典型的には、ＨＰＬＣシステムは約５００～６０００ｐｓｉの圧力で動作する。
【0159】
「超高速液体クロマトグラフィー」、「ＵＨＰＬＣ」、「超高性能液体クロマトグラフィー」、及び「ＵＰＬＣ」という用語は、ポンプを使用して、試料混合物を含む高加圧液体溶媒を、固体／固定吸着性物質または基材で満たされたカラムに通す液体クロマトグラフィー技術を指す。しかしながら、ＨＰＬＣシステムとは対照的に、ＵＰＬＣシステムは６０００ｐｓｉより高い圧力（例えば、約１５０００ｐｓｉ）で動作する。一般的に、ＨＰＬＣシステム（例えば、約５ミクロンの粒径）と比較して、固相基材／材料としてより小さい粒子（例えば、２ミクロン未満の粒径）を使用するため、ＵＨＰＬＣ及びＵＰＬＣシステムは、より高い圧力で動作する。さらに、ＵＨＰＬＣカラムの内径は、一般に、ＨＰＬＣシステムよりも小さい。例えば、ＨＰＬＣカラムでは約２．５ｍｍ～約５ｍｍ、ＵＰＬＣカラムでは約２．１ｍｍ以下（例えば、１ｍｍ）である。
【0160】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、クロマトグラフィーカラムに細胞溶解物を通すことを含む、液体クロマトグラフィーシステムで細胞溶解物を分析するステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法はＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、本方法はＵＨＰＬＣまたはＵＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、イオン交換液体クロマトグラフィーである。特定の実施形態では、ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、またはＵＰＬＣは、イオン交換ＨＰＬＣ、ＵＨＰＬＣ、またはＵＰＬＣである。
【0161】
ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、またはＵＨＰＬＣのいずれであれ、目的の分子を含む試料は、分子の存在量を検出し、経過時間（保持時間）に関連してクロマトグラフィーカラム上でのそれらの保持を示す検出器を用いて分析される。保持時間は、固定相、分析される分子、希釈剤、及び使用される移動相溶媒（複数可）の間の相互作用に依存して変化する。代謝産物を含む試料は、手動で、または自動オートサンプラーによって移動相に注入される。代謝産物の極性、使用したカラム（複数可）の固定相、及び移動相（複数可）は、代謝産物の保持時間、ならびに干渉からのその分離、及び定量性の程度を決定する。
【0162】
したがって、本明細書に開示される種々の実施形態では、クロマトグラフィー分離後、ヘモグロビンタンパク質／複合体は、４１８ｎｍでの紫外線（ＵＶ）光吸収を測定することによって、結合するヘム分子／基を検出することによって検出され得る。種々の実施形態では、クロマトグラフィーは、ＵＶ検出器を含む。いくつかの実施形態では、ＵＶ検出器は、波長可変紫外線（ＴＵＶ）検出器である。いくつかの実施形態では、ＵＶ検出器は、フォトダイオードアレイ紫外線（ＰＤＡ ＵＶ）検出器である。
【0163】
「イオンクロマトグラフィー」、「イオン交換クロマトグラフィー」、「イオン交換液体クロマトグラフィー」、及び「ＩＥＸ」という用語は、固体／固定相（例えば、イオン交換体）に結合した荷電部位に対するそれらの親和性に基づいてイオン及び極性分子を分離するクロマトグラフィー方法を指す。例示的なイオン交換体は、ポリスチレン樹脂、セルロース及びデキストランイオン交換体（ゲル）、ならびに制御細孔ガラスまたは多孔質シリカを含むが、これらに限定されない。
【0164】
一般に、２種類のＩＥＸ、すなわち陰イオン交換及び陽イオン交換がある。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、固定相は負に帯電し、分離される分子は正に帯電する（すなわち、クロマトグラフィーのｐＨは、分子ｐＩより低い）。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、固定相は正に帯電し、分離される分子は負に帯電する（すなわち、クロマトグラフィーのｐＨは、分子ｐＩより高い）。いずれの場合も、分離される電荷分子（例えば、タンパク質、アミノ酸、及びペプチド）は、不溶性固体／固定相に対してイオン結合を形成することによって逆電荷である部位に結合する。次いで、結合した分子を、カラムを通して、またはカラムのｐＨを変化させることによって、より高い濃度のイオン（陰イオンまたは陽イオン）を有する溶出剤を使用して溶出し、収集する。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、正に帯電したナトリウムイオンの添加により、正に帯電した分子を固体／固定相から移動させることができる。
【0165】
種々の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ヘモグロビンタンパク質（例えば、ＨｂＦ及びＨｂＡ）を分離するＩＥＸクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＰＬＣである。いくつかの実施形態では、ＩＥＸクロマトグラフィーはＩＥＸ ＵＨＬＰＣである。
【0166】
クロマトグラフィーカラム（例えば、ＩＥＸ液体クロマトグラフィーカラム）は、典型的には、２つのポートを含み、１つの入口ポートは、試料を受け取り、１つの出口ポートは、試料を含んでも含まなくてもよい溶出液を排出する。液体クロマトグラフィーに適したカラムは、充填材料／基材を含む固相を含み、該充填材料／基材は、３～５０ミクロンの直径及び約６０～１５００オングストロームの孔径を有する、非常に小さく通常は球形の粒子、例えば、シリカ粒子を含む。他の適切な充填材料／基材としては、ポリスチレン樹脂、セルロース及びデキストランイオン交換体（ゲル）、ならびに制御細孔ガラスまたは多孔質シリカが挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態では、固相は、イオンの変化またはイオンの対合を可能にする分子（例えば、アミノ酸）（例えば、アスパラギン酸鎖またはスルホン酸リガンド）も含み得る。
【0167】
したがって、種々の実施形態では、カラムは、基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含む固相を含む。特定の実施形態では、カラムは、基材に共有結合したスルホン酸リガンドを含む固相を含む。いくつかの実施形態では、基材はポリマー基材である。特定の実施形態では、基材はシリカ基材である。いくつかの実施形態では、基材は、約５μｍの粒径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約４μｍの粒径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約３μｍの粒径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約２μｍの粒径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約１μｍの粒径を有する。
【0168】
いくつかの実施形態では、基材は、約６０オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約１００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約２００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約３００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約４００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約５００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約６００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約７００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約８００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約９００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約１０００オングストロームの孔径を有する。いくつかの実施形態では、基材は、約１５００オングストロームの孔径を有する。
【0169】
液体クロマトグラフィーカラムの内径は、使用される用途または方法（例えば、ＨＰＬＣまたはＵＰＬＣ）に応じて、変化し得る。ＨＰＬＣカラムの内径は、典型的には、ＵＨＰＬＣ／ＵＰＬＣカラムの内径よりも大きい。例えば、ＨＰＬＣカラムの内径は、約２．５ｍｍ～約５ｍｍで変化し得るが、ＵＨＰＬＣカラムの内径は、典型的には、２．５ｍｍ未満（例えば、約２．１ｍｍ以下）である。したがって、本明細書に記載のいくつかの実施形態では、カラムは、約５ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約４ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約３ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．５ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約２ｍｍ以下の内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ以下の内径を含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ～約５ｍｍの内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ～約４ｍｍの内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ～約３ｍｍの内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ～約２．５ｍｍの内径を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、約１ｍｍ～約２．１ｍｍの内径を含む。
【0171】
特定の実施形態では、カラムは、約３μｍの粒径を有するポリマー基材に結合されたスルホン酸リガンドを含み、約２．１ｍｍの内径を含む。特定の実施形態では、カラムは、約５μｍの粒径及び約１０００オングストロームの孔径を有するシリカ基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含み、ここで、カラムは、約２．１ｍｍの内径を有する。特定の実施形態では、カラムは、約５μｍの粒径及び約１０００オングストロームの孔径を有するシリカ基材に共有結合したアスパラギン酸鎖を含み、ここで、カラムは、約１ｍｍの内径を有する。いくつかの実施形態では、カラム長は１５０ｍｍである。いくつかの実施形態では、カラム長は１００ｍｍである。
【0172】
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、液体ベースの移動相を含む。本明細書に記載されるように、移動相は、ヘモグロビンタンパク質／複合体を溶出するための異なる溶媒または溶媒混合物を含み得る。例えば、液体クロマトグラフィーは、混合物中に異なる量の溶媒を有する勾配モード、混合物中に連続的に固定された量の溶媒を有するアイソクラティックモード、または部分的にアイソクラティックで部分的に勾配の混合モードを用いて行うことができる。適切な溶媒及び溶媒混合物は、ナトリウムまたはリチウム緩衝液（陽イオン交換ＨＰＬＣの場合）またはアセトニトリル（逆相ＨＰＬＣの場合）を含む。他の例示的な移動相は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＫＣＮ、及び／またはＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、移動相はトリエチルアミン（ＴＥＡ）を含む。
【0173】
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、液体ベースの第１の移動相及び第２の移動相を含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相は、分離される試料を含み、固相への結合を促進するように配合される。いくつかの実施形態では、成分（ヘモグロビンタンパク質／複合体）が溶出される場合に、第２の移動相は、試料分離を駆動するように配合される。
【0174】
いくつかの実施形態では、第１の移動相は、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＫＣＮを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＫＣＮ、及びＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約３８ｍＭ～約４２ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約３８ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約４０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約４２ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約２．９ｍＭ～約３．１のＫＣＮを含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約２．９ｍＭのＫＣＮを含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約３．０ｍＭのＫＣＮを含む。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約３．１ｍＭのＫＣＮを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．１Ｍ～約０．３ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．１ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．１９ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．２０ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．２１ＭのＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、第２の移動相は、約０．３ＭのＮａＣｌを含む。
【0175】
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、表１及び表２に示すような移動相の勾配を含む。
【表1】
【表2】
【0176】
種々の実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．０～約７．０のｐＨを有する。種々の実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．４～約６．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．３のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．７のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約７．０のｐＨを有する。
【0177】
いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、６．０±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．１±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．２±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．３±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．４±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．５±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．６±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．７±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．８±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約６．９±０．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の移動相及び／または第２の移動相は、約７．０±０．１のｐＨを有する。
【0178】
いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２５℃～約３０℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２５℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２６℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２７℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２８℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約２９℃である。いくつかの実施形態では、カラムの温度は、約３０℃である。
【0179】
本明細書に記載の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用いるヘモグロビン分離は、自動または手動の試料注入及び調整可能で一貫した再現可能な溶媒流量を用いて、任意の市販のＬＣ装置／システムを用いて行うことができる。当該技術分野で公知の例示的なシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ（ＨＰＬＣまたはＵＨＰＬＣ）、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）、Ａｇｉｌｅｎｔ（例えば、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ）、及びＡＫＴＡ（商標）（例えば、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0180】
本明細書で引用されたすべての刊行物、特許出願、及び発行された特許は、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許が、参照により本明細書に組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【0181】
上述の実施形態を理解の明瞭化ために図示及び実施例を用いてある程度詳しく記載しているが、本明細書に企図される教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の変化及び改変をそれに対してなし得ることが、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、単に例として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。当業者であれば、本質的に同様な結果をもたらすために変更または修正ができるであろう種々の重要性の低いパラメータがあることを容易に認識するであろう。
【実施例】
【0182】
実施例１
培養密度及び形質導入条件
レンチウイルス形質導入細胞におけるＨｂＡの測定、及びＫ５６２細胞を用いたβ－グロビンをコードするレンチウイルス粒子（例えば、βＡ－Ｔ８７ＱグロビンをコードするＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５）の機能的効力の測定のための方法を開発するために、重要な培養及び形質導入のパラメータを定義するための実験を行った。Ｋ５６２マスター細胞バンク由来の細胞を、０．５×１０６、１．０×１０６、及び３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ（１ｍＬ総体積）の濃度で１２ウェルプレートに播種した。播種の後、細胞に、ヘモグロビンＡＴ８７Ｑをコードする接着性レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を、５、１０、及び２０のＭＯＩで、８μｇ／ｍＬポリブレンを用いて、及び用いずに形質導入した。試料を形質導入後４８時間及び７２時間で採取し、ＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ ２００×２．１ｍｍ、５μｍ、１０００Ａカラムを用いてＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣにより分析した。
培養密度及び形質導入条件
レンチウイルス形質導入細胞におけるＨｂＡの測定、及びＫ５６２細胞を用いたβ－グロビンをコードするレンチウイルス粒子（例えば、βＡ－Ｔ８７ＱグロビンをコードするＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５）の機能的効力の測定のための方法を開発するために、重要な培養及び形質導入のパラメータを定義するための実験を行った。Ｋ５６２マスター細胞バンク由来の細胞を、０．５×１０６、１．０×１０６、及び３．０ｘ１０６細胞／ｍＬ（１ｍＬ総体積）の濃度で１２ウェルプレートに播種した。播種の後、細胞に、ヘモグロビンＡＴ８７Ｑをコードする接着性レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を、５、１０、及び２０のＭＯＩで、８μｇ／ｍＬポリブレンを用いて、及び用いずに形質導入した。試料を形質導入後４８時間及び７２時間で採取し、ＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ ２００×２．１ｍｍ、５μｍ、１０００Ａカラムを用いてＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣにより分析した。
【0183】
実験の結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。試料の代表的なクロマトグラムを図１Ａに示し、ＬＶＶ由来ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）のピーク及び内在的に発現したヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）のピークを示す。結果を、ＨｂＡピーク面積とＨｂＦピーク面積の合計と比較したＨｂＡピーク面積に基づくＨｂＡパーセント（ＨｂＡ％）として計算する。ＭＯＩに依存するＨｂＡ％の増加は、形質導入された細胞において観察され、ポリブレンの使用は、形質導入効率を改善し、そしてＨｂＡ％の改善をもたらす（図１Ｂ）。図１Ｃは、出発細胞密度の関数として可変ＨｂＡ％を示し、約１×１０６細胞／ｍＬは、ＨｂＡ％のより高い、より一貫した時間依存性増加を示す。
【0184】
実施例２
ＭＯＩ分析
収穫時間及びＭＯＩを評価するために、１×１０６のＫ５６２細胞を、２つの異なるＬＶＶベクターロットを用いて、ＭＯＩ５、１０、２０、４０、及び１００で三重で形質導入し、形質導入後９日まで分析した。経時分析に必要な繰り返しサンプリングを容易にするために、Ｔ２５フラスコ中で形質導入を行い、ＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ ２００×２．１ｍｍ、５μｍ、１０００Ａカラムを用いたＨＰＬＣによって試料を分析した。
ＭＯＩ分析
収穫時間及びＭＯＩを評価するために、１×１０６のＫ５６２細胞を、２つの異なるＬＶＶベクターロットを用いて、ＭＯＩ５、１０、２０、４０、及び１００で三重で形質導入し、形質導入後９日まで分析した。経時分析に必要な繰り返しサンプリングを容易にするために、Ｔ２５フラスコ中で形質導入を行い、ＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ ２００×２．１ｍｍ、５μｍ、１０００Ａカラムを用いたＨＰＬＣによって試料を分析した。
【0185】
データは、Ｒ２値を比較して、用量反応データを最もよく予測した線形フィッティングモデルを同定することによって評価した。曲線下のＨｂＡ面積とＨｂＡ％読み出し値の両方を用い、ＭＯＩ範囲５～１００及び５～４０にわたり、ＭＯＩ及びｌｏｇ１０変換ＭＯＩを用いて線形フィッティングを評価した。結果を表３に示し、ＭＯＩのｌｏｇ１０変換は、用量反応の改善されたフィッティングをもたらし、一方、用量をＭＯＩ４０のｌｏｇ１０の最大値に制限することは、フィッティングをさらに改善したことを示す。さらに他の実験では、１０～３０のＭＯＩの範囲もフィッティングを改善するのに十分であり、場合によっては好ましい。ＨｂＡ％の使用は、生のＨｂＡの曲線下面積値に対するフィッティングの平均を有意に改善しなかったが、ＨｂＡ％は、観察された最小Ｒ２値及び三重の形質導入にわたる読み出しの精密度を著しく改善した（表３、表４）。ＨｂＡパーセントを、それぞれの採取時間についてｌｏｇ１０ＭＯＩに対してプロットし、曲線を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
【表3】
【表4】
【0186】
実施例３
収穫時間分析
図２のフィッティングに基づいて（及び、表３及び４の事後分析によって裏付けられて）、４８、７２、及び９６時間の収穫時間で１０、２０、及び４０のＭＯＩを調べるためのさらなる実験を行った。ＬＶＶを検出するための方法の特異性も、この実験で評価した。１ロットのＬＶＶ試験物（ロット３、１．８２×１０８ＴＵ／ｍＬ）を、オフターゲットＧＦＰ ＬＶＶベクター（３．４２×１０８ＴＵ／ｍＬ）と混合することによって、１００％、５０％、及び０％の相対活性で調製した。１０、２０、及び４０のＭＯＩを、総形質導入単位数（すなわち、ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶ＋ＧＦＰ ＬＶＶ）に基づいてＴ－２５フラスコで対象とした。１００％Ｌｅｎｔｉ－ＧＦＰからなる試験物は、アッセイにおいて分析物シグナルを示さず（図３）、形質導入依存性ＨｂＡを検出するための方法の特異性を実証した。
収穫時間分析
図２のフィッティングに基づいて（及び、表３及び４の事後分析によって裏付けられて）、４８、７２、及び９６時間の収穫時間で１０、２０、及び４０のＭＯＩを調べるためのさらなる実験を行った。ＬＶＶを検出するための方法の特異性も、この実験で評価した。１ロットのＬＶＶ試験物（ロット３、１．８２×１０８ＴＵ／ｍＬ）を、オフターゲットＧＦＰ ＬＶＶベクター（３．４２×１０８ＴＵ／ｍＬ）と混合することによって、１００％、５０％、及び０％の相対活性で調製した。１０、２０、及び４０のＭＯＩを、総形質導入単位数（すなわち、ＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶ＋ＧＦＰ ＬＶＶ）に基づいてＴ－２５フラスコで対象とした。１００％Ｌｅｎｔｉ－ＧＦＰからなる試験物は、アッセイにおいて分析物シグナルを示さず（図３）、形質導入依存性ＨｂＡを検出するための方法の特異性を実証した。
【0187】
１００％のＬＶＶ試料応答をＭＯＩの対数（ｌｏｇ１０）に対してプロットし、線形回帰をフィッティングすることによって、正確度の予備評価を行った。５０％のＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶ／５０％ Ｌｅｎｔｉ－ＧＦＰ試料からの応答を用いて、曲線フィッティングに基づいてＭＯＩを逆計算した。逆計算ＭＯＩを公称ＭＯＩと比較して正確度を決定した（表５）。５０％のＬｅｎｔｉＧｌｏｂｉｎ ＢＢ３０５ ＬＶＶ／５０％ Ｌｅｎｔｉ－ＧＦＰ試料は、良好な正確度を示し、それぞれの収集時点で４４～５４％の範囲であった（ＭＯＩ１０、４８時間の６７％を除く）。
【表5】
【0188】
実施例４
ＨｂＦ発現に対する血清ロット及び細胞継代数の影響
血清ロット及び細胞継代数のＨｂＡ％読み取り値に対する影響を評価するために実験を設計した。ここで、標準的な細胞培養条件を、異なる／第２のロットのＦＢＳに対して、及び高い継代の細胞に対して試験した（融解後４日間を使用する典型的な実施に対して）。細胞を解凍し、２つの異なるロットのＦＢＳ中で別々に培養し、４日後、１×１０６細胞を２４ウェルプレートに播種し、３分の１の活性細胞培養を維持し、合計７回継代した。細胞を１０～４０の範囲のＭＯＩで接着性ＬＶＶで形質導入した。培地を約２４時間後に交換し、細胞を形質導入の約７２時間後にＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ分析のために回収した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
ＨｂＦ発現に対する血清ロット及び細胞継代数の影響
血清ロット及び細胞継代数のＨｂＡ％読み取り値に対する影響を評価するために実験を設計した。ここで、標準的な細胞培養条件を、異なる／第２のロットのＦＢＳに対して、及び高い継代の細胞に対して試験した（融解後４日間を使用する典型的な実施に対して）。細胞を解凍し、２つの異なるロットのＦＢＳ中で別々に培養し、４日後、１×１０６細胞を２４ウェルプレートに播種し、３分の１の活性細胞培養を維持し、合計７回継代した。細胞を１０～４０の範囲のＭＯＩで接着性ＬＶＶで形質導入した。培地を約２４時間後に交換し、細胞を形質導入の約７２時間後にＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ分析のために回収した。結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。
【0189】
この実験において、血清の第２ロット及びより後の継代の細胞は、対照条件よりも著しく高い絶対ＨｂＡ％値を示した（図４Ａ）。ＨｂＡとＨｂＦのピーク面積を分離する場合、ピーク面積の差は、ＨｂＡの増加とＨｂＦの減少の両方によって決定される（図４Ｂ及び図４Ｃ）。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、Ｋ５６２細胞におけるＨｂＦの制御された発現が細胞培養条件によって影響を受け、これは絶対ＨｂＡ％の結果に大きな影響を及ぼすことを示唆する。
【0190】
変動性を評価するために別の実験を行い、この実施例において上記に記載したのと同じ方法を用いた（図５Ａ～図５Ｃを参照されたい）。ＨｂＡ％の変動性を図５Ａに示す（図５Ａは、試験過程にわたるＭＯＩ２０での対照ＬＶＶ（ロット４）のＨｂＡ％の結果を示す）。これらのデータは、絶対ＨｂＡ％読み出しに影響を及ぼす未同定因子を示すさらなる変動性を実証する。
【0191】
さらに、図５Ｂは、ＨｂＡ及びＨｂＦのピーク面積の相対変動性を示し、これは、試験したアッセイプレートにわたって、それぞれ、３６％及び７２％のＣＶ値を実証した。ＨｂＡピーク面積の変動性は、アッセイ特異的な変動を捕捉し、これは、ＨｂＦピーク面積のより大きな変動性が、本方法の技術的側面に関連するものを超える要因に起因し、生物学的な性質のもの（例えば、Ｋ５６２細胞における内在性ＨｂＦレベルの制御された発現、または所与のペレットにおける細胞の変動）である可能性が高いことを示す。
【0192】
最後に、図５Ｃは、ＬＶＶ形質導入の影響から切り離されるピーク面積変動を示すために、それぞれのアッセイプレートにおけるモック形質導入試料のＨｂＦピーク面積を示す。同様のパターン及びピーク面積の変動性が観察された（ＣＶ７８％）。
【0193】
実施例５
相対効力計算
Ｋ５６２細胞におけるＨｂＦ発現の生物学的変動性を考慮して、相対効力の報告可能な結果フォーマットを、レンチウイルスベクターの所定のロットの効力を測定する方法として評価した。この点に関して、平行線アプローチと補間アプローチの両方を、参照標準に基づいて効力を正確かつ精密に計算するように、評価及び決定した。
相対効力計算
Ｋ５６２細胞におけるＨｂＦ発現の生物学的変動性を考慮して、相対効力の報告可能な結果フォーマットを、レンチウイルスベクターの所定のロットの効力を測定する方法として評価した。この点に関して、平行線アプローチと補間アプローチの両方を、参照標準に基づいて効力を正確かつ精密に計算するように、評価及び決定した。
【0194】
平行線アプローチは、用量反応曲線を参照標準及び試験物にフィッティングさせ、フィッティングパラメータを使用して相対効力を決定することに依存する。このアプローチでは、Ｆ－ｔｅｓｔ、等価性試験、または平行用量応答を確認する他の手段を使用することができ、その後、参照物及び試験物を共通の傾きにフィッティングさせる。計算は、対数用量反応曲線の線形フィッティングパラメータを用いて、次の式に従って相対効力を決定する：
【数3】
【0195】
補間アプローチでは、線形フィッティングが参照標準対数用量反応に適用され、試験物のＨｂＡ％応答は、基準曲線フィッティングからＭＯＩを補間するために使用される。公称ＭＯＩに対する補間されたＭＯＩは、相対効力（ＲＰ）である。
【0196】
これらのアプローチを試験するために、参照ベクター及び第２のベクターロットの既知の希釈物を複数のアッセイにわたって試験することによって、正確度及び室内再現精度を評価することができるように、十分なデータ体を生成した（表６を参照されたい）。具体的には、ポリブレンの存在下で、参照標準、１００％レベル、及び試験物に対して１０、１５、２０、２５、及び３０のＭＯＩ、５０％レベルに対して５、７．５、１０、１２．５、及び１５のＭＯＩ、１５０％レベルに対して１５、２２．５、３０、３７．５、及び４５のＭＯＩで、１×１０６細胞／ｍＬの密度のＫ５６２細胞を形質導入した。相対効力パーセントを補間アプローチ及びＰＬＡアプローチによって計算し、相対バイアスを式：１００×（（測定された効力／目標効力）－１）を用いて決定した。試験物を複数の独立したアッセイにわたって評価し、平均相対効力、標準偏差、及び変動係数パーセントを、補間アプローチ及びＰＬＡ計算アプローチを使用して決定した。両方の例において、方法は、２１％以下のＣＶ％で良好な精密度を示した。
【表6】
【0197】
実施例６
ＬＶＶの強制分解に対する方法の感受性
ストレスを受けたＬＶＶ材料の評価を、方法開発プロセスの異なる点で行い、その結果を表７に示す。凍結融解サイクル条件に曝露することによって、ＬＶＶにストレスを加えた。ベクターを冷凍庫から取り出し、周囲温度に３～６時間曝露し、－６５℃以下に最低１２時間戻した。合計３回及び５回の凍結融解サイクルを、２つのベクターロットについて行った。このベクターを、２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬで播種したＫ５６２細胞に、１０～４０（プレストレス力価に基づく）の範囲の目標ＭＯＩで適用した。溶解物を、ＴＵＶ検出器及びＰｏｌｙ ＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ １５０×１．０ｍｍ、５ｕｍ、１０００Ａカラムを備えたＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣを用いて分析した。ストレスを受けていない材料に対する効力を、補間アプローチに基づいて計算した。
ＬＶＶの強制分解に対する方法の感受性
ストレスを受けたＬＶＶ材料の評価を、方法開発プロセスの異なる点で行い、その結果を表７に示す。凍結融解サイクル条件に曝露することによって、ＬＶＶにストレスを加えた。ベクターを冷凍庫から取り出し、周囲温度に３～６時間曝露し、－６５℃以下に最低１２時間戻した。合計３回及び５回の凍結融解サイクルを、２つのベクターロットについて行った。このベクターを、２４ウェルプレートに１×１０６細胞／ｍＬで播種したＫ５６２細胞に、１０～４０（プレストレス力価に基づく）の範囲の目標ＭＯＩで適用した。溶解物を、ＴＵＶ検出器及びＰｏｌｙ ＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ １５０×１．０ｍｍ、５ｕｍ、１０００Ａカラムを備えたＷａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣを用いて分析した。ストレスを受けていない材料に対する効力を、補間アプローチに基づいて計算した。
【0198】
ロット４の２つの調製及びロット１の１つの調製において、３回の繰り返し凍結融解によるストレスは、ストレスを受けていないロットと比較して３７～６２％の相対効力（ＲＰ）をもたらし、５回の繰り返し凍結融解によるストレスは、ストレスを受けていないロットと比較して２５％～４９％未満の効力をもたらした。患者由来のＣＤ３４＋細胞も、このストレスを受けた材料で形質導入し、ベクターコピー数（ＶＣＮ）について試験し、細胞除核及び応答の同等の減少を測定する機能アッセイを観察し、この方法のＬＶＶ機能活性の減少を検出する能力が裏付けられた（データ示さず）。
【0199】
さらに、ストレスによって誘導される活性の低下の推定される第２のメカニズムにおいて、２日間ベンチトップ上に残されたロット６は、ストレスを受けていないロットと比較して２５％未満の効力を示した。
【表7】
【0200】
実施例７
方法の併行精度
ＵＰＬＣアッセイの併行精度を、ＡＦＳＣ（ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ、及びＨｂＣの混合物を含むヘモグロビン対照標準）、ＬＶＶ形質導入されたＫ５６２、及びモック形質導入されたＫ５６２の３つの技術的反復の３つの群を、５２回を超える注射の連続にわたって注入することによって評価した。細胞ペレットを１００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁し、１５秒間ボルテックスすることによって溶解物を調製した。溶解物を遠心沈殿させ、上清をＵＰＬＣ分析のために注入して、試料の連続の経過に対する保持時間及びピーク面積の一貫性を決定した。
方法の併行精度
ＵＰＬＣアッセイの併行精度を、ＡＦＳＣ（ＨｂＡ、ＨｂＦ、ＨｂＳ、及びＨｂＣの混合物を含むヘモグロビン対照標準）、ＬＶＶ形質導入されたＫ５６２、及びモック形質導入されたＫ５６２の３つの技術的反復の３つの群を、５２回を超える注射の連続にわたって注入することによって評価した。細胞ペレットを１００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に再懸濁し、１５秒間ボルテックスすることによって溶解物を調製した。溶解物を遠心沈殿させ、上清をＵＰＬＣ分析のために注入して、試料の連続の経過に対する保持時間及びピーク面積の一貫性を決定した。
【0201】
表８は、ＨｂＡ及びＨｂＦのピークの保持時間及びピーク面積に対するすべての反復にわたるＣＶが２％以下であり、良好な併行精度を示すことを示す。さらに、それぞれの群系列内の最初と最後の注入の間の保持時間及びピーク面積の変化は、平均から±５％未満の差であり、これは、５０回を超える注入の間にわたる実行の一貫性内であることを示唆する。
【表8】
【0202】
実施例８
レンチウイルスロット試験
効力アッセイの室間再現精度を調べるために、同じアッセイ条件下でいくつかのレンチウイルスロットを試験した。簡潔に述べると、１×１０６のＫ５６２細胞を２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種し、ＭＯＩ０、１０、１５、２０、２５、及び３０でＬＶＶを二連で形質導入した。細胞形質導入を、８μｇポリブレンの存在下で行った。形質導入後、細胞を３日間（約７２時間）、維持した。次いで、細胞を回収し、カラムをＫ５６２溶解物でコンディショニングし、ＴＵＶ検出器を使用したことを除いて、実施例１０に従ってＵＨＰＬＣによって分析した。相対効力パーセントを、補間アプローチを用いて計算した。ロット試験結果の概要を表９に示し、試験プレートのそれぞれは内部許容基準を満たす。
レンチウイルスロット試験
効力アッセイの室間再現精度を調べるために、同じアッセイ条件下でいくつかのレンチウイルスロットを試験した。簡潔に述べると、１×１０６のＫ５６２細胞を２４ウェルプレートのそれぞれのウェルに播種し、ＭＯＩ０、１０、１５、２０、２５、及び３０でＬＶＶを二連で形質導入した。細胞形質導入を、８μｇポリブレンの存在下で行った。形質導入後、細胞を３日間（約７２時間）、維持した。次いで、細胞を回収し、カラムをＫ５６２溶解物でコンディショニングし、ＴＵＶ検出器を使用したことを除いて、実施例１０に従ってＵＨＰＬＣによって分析した。相対効力パーセントを、補間アプローチを用いて計算した。ロット試験結果の概要を表９に示し、試験プレートのそれぞれは内部許容基準を満たす。
【表9】
【0203】
データは、本方法の再現可能な性能、及び選択されたＬＶＶ参照ロットの上下の相対効力応答の範囲を示す。同じロットの繰り返し可能な試験は、許容可能な方法の精密度を示し、参照ロットの目標希釈は、許容可能な方法の正確度を示す。
【0204】
懸濁ＬＶＶロット００３及び００４は、接着性ＬＶＶ参照ロット１９と同様の用量反応曲線を示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。これは、この方法が、最小の順応を伴うかまたは順応を伴わずに、懸濁ＬＶＶ産物との使用に適し得ることを示唆する。
【0205】
実施例９
方法の直線性
直線性は、形質導入されたＫ５６２溶解物をモック形質導入されたＫ５６２溶解物に希釈することによって評価した。モック形質導入された溶解物は、ＨｂＦを含むが、ＨｂＡを含まず、したがって、成分比が変化するにつれて、ＨｂＡパーセントの変化の評価を可能にする。
方法の直線性
直線性は、形質導入されたＫ５６２溶解物をモック形質導入されたＫ５６２溶解物に希釈することによって評価した。モック形質導入された溶解物は、ＨｂＦを含むが、ＨｂＡを含まず、したがって、成分比が変化するにつれて、ＨｂＡパーセントの変化の評価を可能にする。
【0206】
簡潔に述べると、希釈した溶解物を、ＴＵＶ検出器を備えたｗａｔｅｒｓ ＵＨＰＬＣを介して、１００％形質導入～０％形質導入した溶解物の範囲のレベルで分析した。それぞれのレベルについてピーク面積を決定し、全体として、これらの結果を用いて線形曲線を作成した。この曲線から、それぞれのレベルのバイアスを決定した。
【0207】
データは、表１０に提示される。ピークＡＵＣにおける直線関係は、形質導入された溶解物が純粋濃度の１５％まで希釈された場合に観察され、これは、それぞれの希釈レベルにおける相対バイアスのパーセントが±１０％以内に入ることによって証明される。加えて、予想されたピークＡＵＣ対観察されたピークＡＵＣのプロットは、ＨｂＦ及びＨｂＡのピークに対する全体的な直線性をそれぞれ示す１．００及び１．０３の傾きを示す（図７Ａ）。保持時間は、それぞれの分析物について変化せず、希釈系列にわたるピーク保持時間の最大差は、０．０２分より短かった（データ示さず）。形質導入された溶解物がＨｂＦを発現するモック形質導入された溶解物で希釈されるので、ＨｂＡ分析物が希釈されるにつれて総ＨｂＡ％は減少すると予想されるが、ＨｂＦ分析物は比較的一定のままである。予想されたＨｂＡ％を計算し、観察されたＨｂＡ％に対してプロットすると、１．０２の傾きが観察され（図７Ｂ）、それぞれの点における相対バイアスの割合は±１０％以内である（データ示さず）。
【0208】
まとめると、本方法は、形質導入された溶解物の直線性を、約１０％のＨｂＡに対応する無希釈の形質導入レベルのＨｂＡ％の５％まで示す。この直線性のより低い範囲は、ストレスを受けたＬＶＶ試料において観察された最低ＨｂＡ％レベルより低く、効力の５０％を超える損失を示す。
【表10】
【0209】
実施例１０
例示的なイオン交換ＵＰＬＣ法
１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種したＫ５６２細胞を、ポリブレンの存在下、ＭＯＩ２０でＬＶＶにより形質導入した。培地を培養２４時間後に交換し、形質導入７２時間後に細胞を回収し、細胞ペレットとして凍結させた。形質導入されたＫ５６２細胞ペレットを、１００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で溶解することによって調製し、ボルテックスし、遠心分離によって清澄化し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）で調整したＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ １５０×１．０ｍｍ、５μΜ、１０００オングストロームのカラムを有するＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ Ｉクラス系に注入し、ＰＤＡ検出器を用いて測定した。第１の移動相及び第２の移動相は、それぞれ０．２ＭのＮａＣｌを含む及び含まないｐＨ６．５のトリス緩衝ＫＣＮであった。結果を図８に示し、これは、十分なピーク分離及び同定を示す。まとめると、本発明者らは、驚くべきことに、ヘモグロビン形成バイオアッセイから生成された細胞ペレット試料におけるＨｂＡ％（成分ＨｂＡ及びＨｂＦ分析物ピークから計算される）の測定に適した範囲にわたって特異性、頑健性、精密度、及び直線性を示す、ＨｂＡ発現及びベクター効力を評価するための方法を発見した。
例示的なイオン交換ＵＰＬＣ法
１×１０６細胞／ｍＬの密度で播種したＫ５６２細胞を、ポリブレンの存在下、ＭＯＩ２０でＬＶＶにより形質導入した。培地を培養２４時間後に交換し、形質導入７２時間後に細胞を回収し、細胞ペレットとして凍結させた。形質導入されたＫ５６２細胞ペレットを、１００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水中で溶解することによって調製し、ボルテックスし、遠心分離によって清澄化し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）で調整したＰｏｌｙＬＣ ＰｏｌｙＣＡＴ Ａ １５０×１．０ｍｍ、５μΜ、１０００オングストロームのカラムを有するＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ Ｉクラス系に注入し、ＰＤＡ検出器を用いて測定した。第１の移動相及び第２の移動相は、それぞれ０．２ＭのＮａＣｌを含む及び含まないｐＨ６．５のトリス緩衝ＫＣＮであった。結果を図８に示し、これは、十分なピーク分離及び同定を示す。まとめると、本発明者らは、驚くべきことに、ヘモグロビン形成バイオアッセイから生成された細胞ペレット試料におけるＨｂＡ％（成分ＨｂＡ及びＨｂＦ分析物ピークから計算される）の測定に適した範囲にわたって特異性、頑健性、精密度、及び直線性を示す、ＨｂＡ発現及びベクター効力を評価するための方法を発見した。
【0210】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではなく、すべての可能な実施形態を、そのような特許請求の範囲に付与される均等物の全範囲と共に含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3-1】
【図3-2】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【国際調査報告】