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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】幹細胞由来細胞外小胞体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240628BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240628BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240628BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20240628BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240628BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240628BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240628BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240628BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240628BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775 ZNA
A61K35/28
A61P29/00
A61P37/02
A61P13/10
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P3/10
A61P17/02
A61P25/00
A61P11/00
A61P21/00
A61P17/00
A61P1/04
A61P1/16
A61P37/06
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023580967
(86)(22)【出願日】2022-01-25
(85)【翻訳文提出日】2024-02-26
(86)【国際出願番号】 KR2022001339
(87)【国際公開番号】W WO2023282424
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】10-2021-0088370
(32)【優先日】2021-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0011023
(32)【優先日】2022-01-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 集会による発表 集会名：ＫＳＳＣＲ ２０２１ Ｗｉｎｔｅｒ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ 開催日：２０２１年１月２５日 開催場所：ＷＥＢ開催 主催者（Ｋｏｒｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
(71)【出願人】
【識別番号】518056140
【氏名又は名称】コングク ユニバーシティ インダストリアル コーオペレーション コーポレーション
(71)【出願人】
【識別番号】524001112
【氏名又は名称】ステメクスワン．，リミテッド
(71)【出願人】
【識別番号】516286604
【氏名又は名称】コングク ユニバーシティ グローカル インダストリー－アカデミック コラボレーション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】チョ，サン－グ
(72)【発明者】
【氏名】イム，キョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】アブダル デイエム，アーメド
(72)【発明者】
【氏名】イ，ス ビン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ユジン
(72)【発明者】
【氏名】カン，グン－ホ
(72)【発明者】
【氏名】キム，アラム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AC14
4B065BA10
4B065BB19
4B065BB34
4B065BC03
4B065BC09
4B065BC26
4B065BD15
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB44
4C087BB64
4C087DA31
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA59
4C087ZA68
4C087ZA75
4C087ZA81
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB07
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZB15
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、幹細胞由来細胞外小胞体及びその用途に関する。本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させることによってＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を顕著に減少させるので、様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。特に、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに投与する場合に、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で荒れた膀胱内壁が回復し、炎症程度が緩和され、膀胱内圧が回復し、対照群と類似の排尿周期を示すので、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群に対して優れた治療効能がある。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を顕著に増加させ、傷治癒効果に優れるので、傷治癒用に有用に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させる幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項2】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体又は培養液にＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体に比べて前記タンパク質を高発現させることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項3】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＴＧＦ－β１を高発現させることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項4】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＴＧＦ－β１を５０～１，０００ｐｇ／１×１０９粒子の量で発現させることを特徴とする、請求項３に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項5】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２タンパク質を高発現させることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項6】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成する段階；及び
（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養する段階；を含む方法で製造されたことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項7】
前記幹細胞は、中間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項8】
前記段階（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項9】
前記ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β３であることを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項10】
前記段階（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われることを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項11】
前記回転振盪培養は、５０～７０ｒｐｍの回転速度で行われることを特徴とする、請求項１０に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項12】
前記幹細胞由来細胞外小胞体は、３０～１５０ｎｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞由来細胞外小胞体。
【請求項13】
請求項１の幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む、炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項14】
前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、リウマチ関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身皮膚硬化症、大膓炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発生硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）、又はクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であることを特徴とする、請求項１３に記載の薬学組成物。
【請求項15】
前記膀胱炎は、間質性膀胱炎（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性膀胱炎、及びケタミン誘発膀胱炎から選ばれる１種以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬学組成物。
【請求項16】
請求項１の幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む傷治癒用薬学組成物。
【請求項17】
請求項１の幹細胞由来細胞外小胞体の炎症疾患又は自己免疫疾患治療用途。
【請求項18】
請求項１の幹細胞由来細胞外小胞体をそれを必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、幹細胞由来細胞外小胞体及びその用途に関する。
本発明は、幹細胞由来細胞外小胞体及びその用途に関する。
【0002】
〔背景技術〕
一般に、炎症反応は、生体の細胞や組織に基質的変化をもたらす侵襲による損傷を修復及び再生するための生体防御反応過程であり、この反応過程には、局所の血管、体液の各種組織細胞及び免疫細胞などが作用する。正常に外部侵入菌によって誘導される炎症反応は生体を保護するための防御システムであるのに対し、異常に過度な炎症反応が誘導されると様々な疾患につながるが、このような疾患を炎症疾患と総称する。前記炎症疾患は、外部刺激によって活性化された標的細胞から分泌される様々な炎症媒介物質が炎症を増幅及び持続させて人体の生命を脅かす疾患であり、急性炎症、膀胱炎のような膀胱内での疾患、リウマチ関節炎のような関節内での疾患、乾癬などの形態で現れる皮膚疾患、及び気管支喘息などのアレルギー性炎症疾患などを含む。
一般に、炎症反応は、生体の細胞や組織に基質的変化をもたらす侵襲による損傷を修復及び再生するための生体防御反応過程であり、この反応過程には、局所の血管、体液の各種組織細胞及び免疫細胞などが作用する。正常に外部侵入菌によって誘導される炎症反応は生体を保護するための防御システムであるのに対し、異常に過度な炎症反応が誘導されると様々な疾患につながるが、このような疾患を炎症疾患と総称する。前記炎症疾患は、外部刺激によって活性化された標的細胞から分泌される様々な炎症媒介物質が炎症を増幅及び持続させて人体の生命を脅かす疾患であり、急性炎症、膀胱炎のような膀胱内での疾患、リウマチ関節炎のような関節内での疾患、乾癬などの形態で現れる皮膚疾患、及び気管支喘息などのアレルギー性炎症疾患などを含む。
【0003】
特に、間質性膀胱炎（ＩＣ）は疼痛、例えば骨盤痛の症候、及び下部尿路症候群（ＬＵＴＳ）、例えば増加した頻尿／切迫尿を特徴とする、原因が突き止められていない慢性膀胱疾患である。近年、この用語は、この複合症候を集合的に開示するために、ＩＣと共に疼痛性膀胱症候群（ＰＢＳ）（［ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ ＳＡ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖ Ｕｒｏｌ ２００７；９（１）：９－１６］）又は膀胱疼痛症候群（ＢＰＳ）（［（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｖｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ ５３（２００８）６０－６７］）を含むもの、すなわち、ＩＣ／ＢＰＳ、又はＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳへと変化している。
【0004】
ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳの有病率は、臨床的に確認された疾病を有する１００，０００名の女性当たりに６７～２３０名と多様であり、しばしば子宮内膜炎、再発性尿路感染、過敏性膀胱又は外陰部疼痛と誤診断又は低診断されるため、この数値は恐らくより一層高いだろう（Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｊ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｉｅｒ ２００６；２４（３）：１－８）。ＩＣは生活の質に相当な影響を及ぼし、旅行、家族関係及び活動に影響を及ぼし（Ｓｌａｄｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｕｒｏｌ １９９７；４９（５Ａ Ｓｕｐｐｌ）：１０－３）、また憂鬱性症候群と関連している（Ｒｏｔｈｒｏｃｋ Ｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｕｒｏｌ ２００２；１６７：１７６３－１７６７）。
【0005】
前記ＩＣ／ＰＢＳ／ＢＰＳは、単一の病因は未だ確認されておらず、主に、痛覚過敏、慢性膀胱疼痛及び排尿障害を起こす（Ｆｏｒｒｅｓｔ Ｊ Ｂ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｕｒｉｅｒ ２００６；２４（３）：１－８）。
【0006】
細胞外小胞体は、人間と動物の他にも、昆虫、植物、微生物などの様々な真核細胞から分泌される様々なサイズの脂質二重膜構造の小胞体で、中でも、ナノレベルの粒径を有する微細小胞体をエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）という。エクソソームは、細胞が含有するタンパク質、核酸、脂質、炭水化物などの特定分子を含みながら、脂質二重層でそれらの分子を安定に保護し、分泌後に他の細胞にそれらを伝達する情報伝達の役目を担う。
【0007】
エクソソームは、細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十～数百ナノミリメートルサイズの細胞外小胞体で、内部にはエクソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）などが含まれている。エクソソームカーゴには広範囲な信号伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれ、これらの信号伝達要素は、細胞タイプに特異的であり、分泌細胞の環境によって異なるように調節されることが知られている。エクソソームは、細胞が分泌する細胞間信号伝達媒介体であり、これを通じて伝達された様々な細胞信号は、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞行動を調節するものと知られている。エクソソームは、起源細胞の性質及び状態によって特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来エクソソームは、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関連した幹細胞の特性が反映されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２） ５６９－５７９）。
【0008】
しかしながら、エクソソームを用いた一部疾患の治療に対する可能性提示などの様々な研究がなされているにもかかわらず、より綿密な臨床及び非臨床研究が必要であり、特に、エクソソームが作用する様々な標的を科学的に究明し、エクソソームを様々な疾患治療に応用できる技術の開発が必要な実情である。
【0009】
そこで、本発明者らは、幹細胞から由来したエクソソームの新しい用途に対して鋭意研究を重ねる中で、幹細胞培養液から分離されたエクソソームがＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させることで幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性問題を解決することができ、間質性膀胱炎を含む様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的であることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0010】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、間質性膀胱炎を含む様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的な幹細胞由来細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を提供することにある。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の目的は、間質性膀胱炎を含む様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的な幹細胞由来細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）を提供することにある。
【0011】
本発明の他の目的は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。
【0012】
本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む傷治癒用組成物を提供することにある。
【0013】
〔課題を解決するための手段〕
上記の目的を達成するために、本発明は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させる幹細胞由来細胞外小胞体を提供する。
上記の目的を達成するために、本発明は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させる幹細胞由来細胞外小胞体を提供する。
【0014】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体又は培養液にＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体に比べて前記タンパク質を高発現させることができる。
【0015】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＴＧＦ－β１を高発現させることができる。
【0016】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＴＧＦ－β１を５０～１，０００ｐｇ／１×１０９粒子の量で発現させることができる。
【0017】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２タンパク質を高発現させることができる。
【0018】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成する段階；及び、（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養する段階；を含む方法で製造されたものであってよい。
【0019】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞は、中間葉幹細胞であってよい。
【0020】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われてよい。
【0021】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β３であってよい。
【0022】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記段階（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われてよい。
【0023】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記回転振盪培養は、５０～７０ｒｐｍの回転速度で行われてよい。
【0024】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記幹細胞由来細胞外小胞体は、３０～１５０ｎｍの平均直径を有してよい。
【0025】
また、本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0026】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、リウマチ関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身皮膚硬化症、大膓炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発生硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）、又はクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であってよい。
【0027】
本発明の好ましい一実施例によれば、前記膀胱炎は、間質性膀胱炎（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性膀胱炎、及びケタミン誘発膀胱炎から選ばれる１種以上であってよい。
【0028】
また、本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む傷治癒用薬学組成物を提供する。
【0029】
〔発明の効果〕
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させることによってＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を顕著に減少させるので、様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させることによってＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を顕著に減少させるので、様々な炎症疾患の予防、緩和、改善又は治療に効果的である。
【0030】
特に、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに投与する場合に、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で荒れた膀胱内壁が回復し、炎症程度が緩和し、膀胱内圧が回復し、対照群と類似する排尿周期を示すので、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群に対して優れた治療効能がある。
【0031】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を顕著に増加させ、傷治癒効果に優れので、傷治癒用に有用に利用可能である。
【0032】
【0033】
〔図２〕各培養条件によるエクソソームの収率を示す図である。
【0034】
〔図３〕ＴＧＦ－β処理によるＰＤＩ値の変化を示す図であり、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件では単一ピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が見られることを示す。
【0035】
〔図４〕ＴＧＦ－βがＴ細胞増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養条件のみを適用したエクソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件で得たエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も顕著なＴ細胞抑制効果を有することが確認され（図４Ｂ及び図４Ｃ）、本発明の方法によって得られたエクソソームは、収率の他に機能も強化していることが見られた。
【0036】
〔図５〕図５Ａは、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）分析によってエクソソームのサイズを調べた結果を示す図である。図５Ｂは、エクソソームの形態及び構造を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である。図５Ｃは、ＣＤ９、ＣＤ６３、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１及びＡｌｉｘの発現を確認するためのウェスタンブロッティング分析結果を示す。図５Ｄは、流細胞分析によってエクソソーム表面の免疫表現型分析を行った結果を示す。図５Ｅは、生産されたエクソソームのＴＧＦ－β１含有量を酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）によって確認した結果を示す。
【0037】
〔図６〕トランスウェル移動分析によってヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）においてエクソソーム投与による細胞移動能力増加を確認した結果を示す写真であり（左側）、右側は、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて相対的な染色程度を数値化して表現したグラフである。
【0038】
〔図７〕生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与して傷治癒能の経時変化を確認した結果を示す図である。図７Ａは、生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与した後、一定時間ごとに傷部位を撮影した写真である。図７Ｂは、図７Ａの傷部位のサイズを示すグラフである。
【0039】
〔図８〕生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与して時間経過による傷治癒能を確認しながら、傷誘発９日後に傷誘発部位の組織学的分析を行った結果である。
【0040】
〔図９〕Ｒａｗ２６４．７細胞においてＬＰＳで誘導された炎症反応がエクソソームの投与によって有意に減少したことを確認した結果である。
【0041】
〔図１０〕ＬＰＳ及びエクソソームを共に投与して培養したＲａｗ２６４．７細胞の培養液の上澄液内で炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６の濃度が顕著に減少したことを確認した結果である。
【0042】
〔図１１〕ＬＰＳ毒素による内毒素血症マウスモデルにおいてエクソソーム投与によるＴＮＦ－α及びＩＬ－６減少効果を確認した結果を示す図である。
【0043】
〔図１２〕ＳＶ－ＨＵＣ－１（ヒト尿路上皮細胞）にエクソソームを濃度別に処理して細胞増殖を確認した結果を示す図である。図１２Ａは、ＳＶ－ＨＵＣ－１にエクソソームを濃度別に処理した後、細胞増殖率を示すグラフであり、図１２Ｂは、細胞増殖に関連したＰ－ＡＫＴとＰ－ＥＲＫの発現量を確認した結果である。
【0044】
〔図１３〕トランスウェル移動分析を用いて、ヒト尿路上皮細胞（ＳＶ－ＨＵＣ－１）においてエクソソーム投与による細胞移動能力増加を確認した結果を示す図である。図１３Ａは、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を用いて、トランスウェルの反対側に移動した細胞を視覚的に確認した写真である。図１３Ｂは、図１３ＡのＩｍａｇｅ Ｊを用いて示した相対的な細胞コンフルエンシーを示すグラフである。
【0045】
〔図１４〕間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルを製造し、エクソソーム投与による治療効果を評価するための試験デザイン概要図である。
【0046】
〔図１５〕間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与後に膀胱組織の形態及び炎症程度を確認した図である。図１５Ａは、ＩＣ／ＢＰＳマウスモデルの膀胱組織をＨ＆Ｅ染色した結果であり、図１５Ｂは、マッソントリクローム（ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色した結果であり、図１５Ｃは、トルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）染色した結果であり、図１５Ｄは、前記染色によって線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）程度と肥満細胞（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）の浸透を確認した結果を示すグラフである。
【0047】
〔図１６〕間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与後に抽出された膀胱組織からｍＲＮＡを抽出し、炎症関連サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ６）の発現量（図１６Ａ）、尿路上皮マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現量（図１６Ｂ）、及びＩＣ／ＢＰＳにおいて発現する遺伝子（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）の発現量（図１６Ｃ）を確認した結果である。
【0048】
【0049】
〔図１９〕各エクソソームに含まれているタンパク質体分析結果を示す図である。図１９Ａは、各エクソソームに含まれているタンパク質を定量分析した結果である。図１９Ｂは、各エクソソームに含まれている総タンパク質の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）分布を示すグラフである。図１９Ｃは、各エクソソームに対して遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った結果である。図１９Ｄは、Ｖｅｓｉｃｌｅｐｅｄｉａに報告されたデータセットと本研究から発見されたＥＶタンパク質体とを比較した結果である。
【0050】
〔図２０〕図２０Ａは、クラスタリング分析によって導出された４個のクラスターのうち、本発明のエクソソームであるＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ試料において特異的に変化するタンパク質を示す図である。図２０Ｂは、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって各エクソソームグループ間の分離程度を識別指数（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）で示した結果を示す図である。図２０Ｃは、二元比較方式によって培養条件（２Ｄ及び３Ｄ）及びＴＧＦ－β３処理の有無によるＤＥＰ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）数を確認した結果を示す図である。
【0051】
〔図２１〕図２１Ａは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路及びｉｎｔｅｇｒｉｎ１経路での濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ値をそれぞれ示す。図２１Ｂは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって、濃縮された遺伝子グループをＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路及びｉｎｔｅｇｒｉｎ１経路に分けて示す図である。図２１Ｃは、二元比較分析（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶ）によって、各エクソソーム間の差別化したり共通するタンパク質の数を示すベンダイアグラムを生成し、このうち、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ２８の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析結果である。図２１Ｄは、本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて特異的な特徴を有するタンパク質である２８個のＤＥＰのうち５個のタンパク質（Ｓ１００Ａ１０、ＳＤＤＣＰ、ＡＣＴＧ１、ＧＩＰＣ１及びＥＩＦ４Ｅ）がＨｕｒｉデータベースの１１３個の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）と高い信頼点数でマップされた結果を示す図である。図２１Ｅは、本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの生物学的機能及びそのサイクリン依存性タンパク質キナーゼ活性調節関連特徴を示す図である。
【0052】
〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0053】
本発明の一側面は、ＣＯＬ６Ａ１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－１（ＶＩ） ｃｈａｉｎ）、ＣＯＬ６Ａ３（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｌｐｈａ－３（ＶＩ） ｃｈａｉｎ）、ＴＮＣ（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＥＩＦ４Ｅ（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ）、ＨＳＰ９０ＡＢ１（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＳＰ９０－ｂｅｔａ）、ＨＳＰ９０Ｂ１（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｎ）、ＲＡＣ１（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｃ３ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１）、ＴＧＦ－β１（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ｂｅｔａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｇ－ｈ３）、及びＴＧＭ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ２）から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させる幹細胞由来細胞外小胞体に関する。
【0054】
本発明における用語「高発現」は、従来の中間葉幹細胞由来細胞外小胞体、具体的には２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体又は培養液にＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体と比較して、細胞外小胞体内特定タンパク質などの含有量、分泌量又は発現量が測定可能な程度に有意に増加したことを意味し、具体的には、含有量、分泌量又は発現量が４０％以上増加したことを意味し、より具体的には、５０％以上増加したことを意味し、さらに具体的には６０％以上増加したことを意味し、特に具体的には８０％以上増加したことを意味し、最も具体的には１００％以上増加したことを意味する。
【0055】
本発明における用語「細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、様々な細胞において多嚢体と原形質膜の融合によって細胞外環境に分泌される３０～１，０００ｎｍの範囲の直径の脂質二重膜構造の小嚢を意味する。
【0056】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、特に、ＴＧＦ－β１を高発現させる。本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、ＴＧＦ－β１を、５０～１，０００ｐｇ／１×１０９粒子、好ましくは１００～８００ｐｇ／１×１０９粒子、より好ましくは２５０～４００ｐｇ／１×１０９粒子の量で発現させることができる。言い換えると、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＦ－β１発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＦ－β１発現レベルに比べて少なくとも５倍以上、好ましくは５～１５倍、より好ましくは６～１２倍、さらに好ましくは７～１０倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＦ－β１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＦ－β１発現レベルに比べて少なくとも２倍以上、具体的には３倍以上、より具体的には３～１０倍、さらに具体的には３～６倍、特に具体的には３～５倍であってよい。
【0057】
前記ＴＧＦ－β１は、組織の損傷が起きる場合に、当該組織を復旧するための抗炎及び組織再生に非常に重要な役割を担う。特に、間質性膀胱炎疾患において膀胱組織での抗炎、尿路上皮細胞の再生、血管生成、及び小便電解質の透過を防ぐための基質（Ｍａｔｒｉｘ）の生成などの重要な役割を果たすことができる（Ｊｕ，Ｃｙｎｔｈｉａ，ａｎｄ Ｐｒａｎｏｔｉ Ｍａｎｄｒｅｋａｒ．“Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ａｌｃｏｈｏｌ－ｒｅｌａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．” Ａｌｃｏｈｏｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｖｉｅｗｓ ３７．２（２０１５）：２５１．）。
【0058】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ１発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ１発現レベルに比べて少なくとも１０倍以上、好ましくは１０～３０倍、さらに好ましくは１５～２５倍、特に好ましくは１８～２２倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ１発現レベルに比べて少なくとも５倍以上、具体的には５～１０倍、より具体的には６～８倍であってよい。
【0059】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ３発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ３発現レベルに比べて少なくとも１．４倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．５～２．５倍、さらに好ましくは１．５～２倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＣＯＬ６Ａ３発現レベルに比べて少なくとも１．５倍以上、具体的には１．５～３倍、より具体的には１．５～２．５倍であってよい。
【0060】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＮＣ発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＮＣ発現レベルに比べて少なくとも１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは２～４倍、さらに好ましくは２．５～３．５倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＮＣ発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＮＣ発現レベルに比べて少なくとも５倍以上、具体的には５～１０倍、より具体的には７～９倍であってよい。
【0061】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＥＩＦ４Ｅ発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体又はＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＥＩＦ４Ｅ発現レベルに比べて少なくとも２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは３～６倍、さらに好ましくは３．５～５倍であってよい。
【0062】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０ＡＢ１発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０ＡＢ１発現レベルに比べて少なくとも２倍以上、好ましくは２～４倍、より好ましくは３～４倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０ＡＢ１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０ＡＢ１発現レベルに比べて少なくとも１．５倍以上、具体的には１．５～３倍、より具体的には１．５～２倍であってよい。
【0063】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０Ｂ１発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０Ｂ１発現レベルに比べて少なくとも２０倍以上、好ましくは２０～４０倍、より好ましくは２０～３０倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０Ｂ１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＨＳＰ９０Ｂ１発現レベルに比べて少なくとも５倍以上、具体的には５～１０倍、より具体的には６～８倍であってよい。
【0064】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＲＡＣ１発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＲＡＣ１発現レベルに比べて少なくとも２倍以上、好ましくは２～５倍、より好ましくは３～４．５倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＲＡＣ１発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＲＡＣ１発現レベルに比べて少なくとも１．５倍以上、具体的には１．５～３倍、より具体的には１．５～２倍であってよい。
【0065】
また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＭ２発現レベルは、２次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＭ２発現レベルに比べて少なくとも５倍以上、好ましくは５～１５倍、より好ましくは１０～１５倍であってよい。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＭ２発現レベルは、ＴＧＦ－βを添加せずに３次元培養した幹細胞由来細胞外小胞体内のＴＧＭ２発現レベルに比べて少なくとも２倍以上、具体的には２～５倍、より具体的には３～５倍であってよい。
【0066】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、前記ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２から選ばれる１種以上のタンパク質を高発現させることによって、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの量を顕著に減少させ、様々な炎症疾患、好ましくは膀胱炎、特に間質性膀胱炎を予防、緩和、改善又は治療することができる。また、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を顕著に増加させ、傷治癒効果に非常に優れている。
【0067】
一具現例において、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１、及びＴＧＭ２タンパク質を高発現させるものであってよい。
【0068】
一具現例において、本発明の細胞外小胞体は、（ａ）対象体から分離された幹細胞を培養して細胞凝集体（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成する段階；及び、（ｂ）前記細胞凝集体を、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ）を含む培養液で３次元培養する段階；を含む方法で製造されたものであってよい。
【0069】
本発明における用語「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前段階の未分化細胞で、特定分化刺激（環境）下で特定細胞に分化し得る能力を有する細胞を総称する。幹細胞は、細胞分裂が停止した分化された細胞とは違い、細胞分裂によって自身と同じ細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）でき、分化刺激が加えられると刺激の性格に応じて様々な細胞に分化し得る、分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有することが特徴である。
【0070】
本発明で用いられる幹細胞は、幹細胞の特性、すなわち、未分化、無限増殖及び特定細胞への分化能を有し、再生しようとする組織に分化誘導が可能な細胞であればいずれも使用可能である。
【0071】
一具現例において、本発明で用いられる幹細胞は、中間葉幹細胞であってよい。
【0072】
本発明における用語「中間葉幹細胞」とは、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞への分化が可能な多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を意味する。中間葉幹細胞は、螺旋状の形態と基本的な細胞表面標識子ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（－）、ＣＤ４５（－）の発現程度によって識別されてよく、多分化能に加えて、免疫反応を調節する機能も有する。
【0073】
一具現例において、前記段階（ａ）は、多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器で幹細胞を浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われてよい。
【0074】
本発明における用語「浮遊培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、培養対象細胞を基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）などに固定させずに、培養液内で浮遊（ｆｌｏａｔｉｎｇ）する状態で培養することを指す。そこで、用語「浮遊培養」は、「３次元培養（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」と同じ意味で使われる。付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）依存性である幹細胞は、浮遊培養時に細胞凝集を起こし、このような凝集に含まれらずに単独で浮遊する細胞は細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘発して死滅するので、細胞はその付着特性に合う環境が作られる必要がある。本発明によれば、複数のウェルを有する多重ウェルで幹細胞を浮遊培養することによって、ウェルサイズによるサイズの細胞凝集体が形成される。そこで、本発明は、同じサイズの規格化された幹細胞凝集体を大量で得ることができる。
【0075】
本発明における用語「細胞凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」は、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）ではなく３次元的な成長が許容された浮遊培養などの環境で培養された細胞が自己凝集（ｓｅｌｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）しながら形成された３次元構造の細胞凝集の塊を意味する。３次元培養の結果として作られた細胞凝集体は、幹細胞が由来した生体内組織と類似な環境を提供し、サイズ及び自己凝集した細胞の数によって球形（ｓｐｈｅｒｅ）であってもよく、球形以外の形態であってもよい。球形の細胞凝集体はスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）と呼ばれるが、スフェロイドは幾何学的に完全な球形である必要はない。
【0076】
本発明における用語「細胞培養液」は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、無機質などのように細胞の成長及び増殖に必須の要素を含む、インビトロで細胞成長及び増殖のための混合物を意味する。
【0077】
前記細胞培養用培地にさらに含み得る成分は、例えば、グリセリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニンヒドロクロリド、Ｌ－システインヒドロクロリド－モノハイドレート、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジンヒドロクロリド－モノハイドレート、Ｌ－リシンヒドロクロリド、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－バリン、Ｌ－アスパラギン－モノハイドレート、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－シスチン２ＨＣｌ、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシンジナトリウム塩ジハイドレート、ｉ－イノシトール、チアミンヒドロクロリド、ナイアシンアミド、ピリドキシンヒドロクロリド、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、リボフラビン、ビタミンＢ１２、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、リン酸水素ナトリウムモノハイドレート（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ）、硫酸銅ペンタハイドレート（ＣｕＳＯ４－５Ｈ２Ｏ）、硫酸第二鉄ヘプタハイドレート（ＦｅＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、硫酸亜鉛ヘプタハイドレート（ＺｎＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、リノレン酸、リポ酸、プトレシン２ＨＣｌ、及びチミジンを含むが、これに限定されるものではない。
【0078】
本発明に係る細胞培養用培地は、人為的に製造して使用したり、或いは商業的に市販されるものを購入して使用することができる。商業的に市販されている培養用培地の例は、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｆ１２（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２）を含むが、これに限定されるものではない。
【0079】
一具現例において、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器は、ウェル当たり３００～５００μｍのサイズを有してよい。より好ましくは、３５０～４５０μｍのサイズを有し、最も好ましくは約３８０～４２０μｍのサイズを有してよい。
【0080】
一具現例において、前記浮遊培養は、前記多重ウェル（ｍｕｌｔｉ－ｗｅｌｌ）培養容器内のウェル当たりに３００～５００個、好ましくは３５０～４５０個、より好ましくは約３８０～４２０個の細胞を分注することによってなされてよい。
【0081】
一具現例において、前記ＴＧＦ－βは、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３から選ばれる１種以上であってよく、好ましくはＴＧＦ－β３であってよい。
【0082】
一具現例において、前記段階（ｂ）は、前記細胞凝集体を浮遊状態で回転振盪培養（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）することによって行われてよい。
【0083】
細胞培養時に回転を加える振盪培養は、３次元細胞凝集体に栄養分と酸素などをより円滑に供給できるという利点がある。このとき、３次元細胞凝集体を振盪培養する時の回転速度が非常に重要である。前記細胞凝集体を４０ｒｐｍ以下の速度で回転させる場合には、不均質な細胞凝集体が現れながら細胞自滅死を誘発するなど、細胞外小胞体の質と収率が非常に悪化することがあり、細胞凝集体を４０ｒｐｍ以上の速度で回転させる場合に、細胞に加えられるストレスが増加してしまう。ただし、細胞凝集体にＴＧＦ－βを適用すると、回転速度が増加することによって、細胞に加えられるストレスを抑制させることができる効果がある。
【0084】
本発明の回転振盪培養は、５０～７０ｒｐｍ、好ましくは５３～６７ｒｐｍ、より好ましくは５５～６５ｒｐｍ、さらに好ましくは５７～６３ｒｐｍの回転速度で行われてよい。
【0085】
一具現例において、本発明の細胞外小胞体は、前記段階（ｂ）で得た培養液から複数回の遠心分離によって細胞外小胞体を分離する段階をさらに含む方法によって得られたものであってよい。
【0086】
従来の方法で培養された幹細胞から遠心分離によって細胞外小胞体を得る場合に、遠心分離の容量限界によって十分な量の細胞外小胞体を確保することが困難であったが、本発明の方法で培養された幹細胞は、細胞当たりの細胞外小胞体の分泌量が顕著に増加することにより、遠心分離だけでも治療的有効量の細胞外小胞体を容易に得ることができる。
【0087】
一具現例において、本発明の細胞外小胞体は、１００～２５０ｎｍの平均直径を有し、具体的には１５０～２２０ｎｍ、より具体的には１８０～２００ｎｍ、さらに具体的には１８５～１９５ｎｍの平均直径を有する。このような範囲の微細直径を有する細胞外小胞体をエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）という（図５Ａ）。
【0088】
本発明の具体的な一実施例によれば、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体、例えばエクソソームは、従来の方法で得たエクソソームと比較して、タンパク質発現プロファイルにおいて明確な相違を示す。下記実施例に見られるように、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体が高発現させるタンパク質（ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＴＮＣ、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１及びＴＧＭ２）は、２次元培養又はＴＧＦ－β３処理無しで３次元培養のみを適用して得た幹細胞由来エクソソームに比べて有意に高発現するタンパク質であり（図２１Ｂ）、本発明のエクソソームの組成自体も従来にはない新規な組性を有することが分かる。
【0089】
また、本発明の具体的な一実施例によれば、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、脂肪細胞原形質膜関連タンパク質、ｐｒｏｌｙｌ ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ １及びｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２から選ばれる１種以上のタンパク質に対して陽性である。下記実施例に見られるように、前記３つのタンパク質は、２次元培養のみを適用して得た幹細胞由来エクソソームからは検出されないタンパク質である。また、前記３つのタンパク質のうち「ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２」は、２次元培養又はＴＧＦ－β３処理無しで３次元培養のみを適用して得た幹細胞由来エクソソームから検出されないタンパク質であり、本発明のエクソソームは全く新しいタンパク質発現プロファイルを有することが分かる（図１９Ｄ）。
【0090】
また、本発明の他の側面は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防又は治療用薬学組成物に関する。
【0091】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体については既に詳述したので、過度な重複を避けるためにその記載を省略する。
【0092】
本発明における用語「予防」は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性のある対象体において疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。
【0093】
本発明における用語「治療」とは、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；又は、（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、Ｔ細胞媒介免疫活性を効率的に抑制することによって、過度な又は不所望の免疫反応を原因とする様々な炎症又は自己免疫疾患の症状の発展を抑制するか、これを除去又は軽減させる役割を担う。したがって、本発明の組成物は、それ自体として前記疾患治療の組成物になってもよく、或いは炎症又は自己免疫疾患に対する治療効果を有する他の薬理成分と併せて投与されて前記疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。そこで、本明細書における用語「治療」又は「治療剤」は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。
【0094】
本発明における用語「投与」とは、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接投与することによって対象体の体内で同一量が形成されるようにすることをいい、「移植」又は「注入」と同じ意味を有する。
【0095】
本発明における用語「治療的有効量」は、本発明の組成物を投与しようとする個体に治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度で含まれた組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。
【0096】
本発明における用語「対象体」は、これに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ギニアピッグ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ又はアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。
【0097】
一具現例において、本発明の組成物は、様々な炎症疾患に対して予防又は治療効果がある。本発明の薬学組成物を適用できる炎症疾患は、当業界に炎症疾患として公知されたものであればよく、特に限定されない。本発明の組成物で予防又は治療される自己免疫疾患又は炎症性疾患は、例えば、リウマチ関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身皮膚硬化症、大膓炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発生硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）、及びクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）を含むが、これに限定されるものではない。好ましくは、膀胱炎であってよい。
【0098】
一具現例において、本発明の組成物で予防又は治療される膀胱炎は、間質性膀胱炎（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性膀胱炎、及びケタミン誘発膀胱炎から選ばれる１種以上であってよく、好ましくは間質性膀胱炎であってよい。
【0099】
本発明の一実施例では、ｉｎ ｖｉｖｏ内毒素血症動物モデルに本発明の幹細胞由来細胞外小胞体を投与する場合に、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６の濃度が顕著に減少することから、ＬＰＳ毒素による内毒素血症治療効果に優れることを具体的に確認した。
【0100】
また、本発明の一実施例では、ｉｎ ｖｉｖｏ間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）動物モデルに本発明の幹細胞由来細胞外小胞体を投与する場合に、ＩＣ／ＢＰＳ誘導過程で荒れた膀胱内壁が回復し、炎症程度が緩和され、膀胱内圧が回復し、対照群と類似の排尿周期を示すなど、間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群に対して優れた治療効能を示すことを具体的に確認した。
【0101】
一具現例において、本発明の薬学組成物は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を単独で含んでもよく、又は１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。
【0102】
薬学的に許容される担体としては、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含んでよい。経口投与用担体は、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含んでよい。また、非経口投与用担体は、水、適切なオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含んでよく、安定化剤及び保存剤をさらに含んでよい。適切な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤としては、ベンズアルコニウムクロリド、メチル－又はプロピル－パラベン、及びクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤などをさらに含んでよい。その他に薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されているものを参考できる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５）。
【0103】
本発明の組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にいかなる方法で投与されてもよい。例えば、経口又は非経口で投与されてよい。非経口の投与方法としては、これに限定されないが、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、骨髄内投与、硬膜内投与、脈絡膜上腔注入（ｓｕｐｒａｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、腸管投与、局所投与、舌下投与又は直腸内投与であってよく、好ましくは静脈内投与であってよい。
【0104】
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路によって、経口投与用又は非経口投与用製剤として剤形化されてよい。
【0105】
経口投与用製剤としては、本発明の組成物は粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液などの形態で当業界に公知の方法によって剤形化されてよい。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体賦形剤と配合した後にそれを粉砕し、適切な補助剤を添加して顆粒混合物として加工することによって、錠剤又は糖衣錠剤を得ることができる。適切な賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール及びマルチトールなどを含む糖類、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、コメ澱粉及びジャガイモ澱粉などを含む澱粉類、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチル－セルロースなどを含むセルロース類、ゼラチン、ポリビニルピロリドンなどのような充填剤が含まれてよい。また、場合によって、架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルジネートなどを崩壊剤として添加できる。なお、本発明の薬学的組成物は、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などをさらに含んでよい。
【0106】
非経口投与用製剤は、注射剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、オイル剤、ゲル剤、エアゾール及び鼻腔吸込剤の形態で当業界に公知の方法によって剤形化されてよい。これらの剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知された処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【0107】
好ましくは、本発明の前記薬学組成物は、経口剤、注射剤及び軟膏剤からなる群から選ばれるいずれか一つの形態で製造されるものであってよく、より好ましくは注射剤であってよい。
【0108】
本発明の薬学組成物は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効量で含むとき、好ましい炎症疾患の予防、改善又は治療効果を提供することができる。本明細書において、「有効量」は、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量のことを指し、好ましくは、炎症疾患、特に間質性膀胱炎を改善又は治療するのに十分な量をいう。前記幹細胞由来細胞外小胞体は、薬学組成物全量に対して５ｘ１０８～５ｘ１０１０粒子／ｍｌ、好ましくは５×１０９～５ｘ１０１０粒子／ｍｌ、より好ましくは１ｘ１０１０～２ｘ１０１０粒子／ｍｌで含まれてよい。このとき、前記幹細胞由来細胞外小胞体の含有量が前記下限値未満であれば、細胞生存率には優れるが、炎症疾患改善又は治療効果が所望の程度に及ばないことがある。逆に、前記上限値を超える場合に、濃度が増加することに比例して炎症疾患の改善又は治療効果が増加しないか、毒性を示すことがある。一方、インビトロ実験の結果、本発明の幹細胞由来細胞外小胞体の濃度が前記範囲である場合には、炎症疾患の改善又は治療に対して有意な効果を示す上で、細胞毒性などの副作用は示さなかった。本発明の薬学組成物に含まれる幹細胞由来細胞外小胞体の有効量は、組成物が製剤化される形態などによって異なるであろう。
【0109】
本発明の薬学的組成物の総有効量は、単一投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与されてもよく、多回投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されてもよい。本発明の薬学組成物は、疾患の程度によって有効成分の含有量が異なってよい。
【0110】
本発明の薬学組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々に処方されてよい。本発明の薬学組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。
【0111】
また、本発明のさらに他の側面は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を有効成分として含む傷治癒用薬学組成物に関する。
【0112】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体、薬学組成物及び有効量については既に詳述したので、過度な重複を避けるためにその記載を省略する。
【0113】
本発明の一実施例では、ｉｎ ｖｉｖｏ傷を生成した動物モデルに本発明の幹細胞由来細胞外小胞体を投与する場合に、傷部位の面積が有意に減少することを具体的に確認した（図７）。
【0114】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体は、細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を顕著に増加させ、優れた傷治癒効果を示すので、傷治癒に有用に利用可能である。
【0115】
また、本発明のさらに他の側面は、前記幹細胞由来細胞外小胞体の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に関する。
【0116】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体については既に詳述したので、過度な重複を避けるためにその記載を省略する。
【0117】
前記治療用途は、炎症疾患又は自己免疫疾患、好ましくは炎症疾患の治療用途であってよい。
【0118】
前記炎症疾患又は自己免疫疾患は、膀胱炎、リウマチ関節炎、反応性関節炎、１型糖尿病、２型糖尿病、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、特発性線維性肺胞炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、限局性強皮症、全身皮膚硬化症、大膓炎、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レイノー現象（Ｒａｙｎａｕｄ’ｓ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、ベーチェット病（Ｂｅｃｈｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、川崎病（Ｋａｗａｓａｋｉ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性胆汁性硬化症（ｐｒｉｍａｒｙ ｂｉｌｉａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、原発生硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｏｌｉｔｉｓ）、移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）、又はクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）であってよい。
【0119】
前記膀胱炎は、間質性膀胱炎（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、慢性膀胱炎、及びケタミン誘発膀胱炎から選ばれる１種以上であってよい。
【0120】
また、本発明のさらに他の側面は、前記幹細胞由来細胞外小胞体を必要とする対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与する段階を含む炎症疾患又は自己免疫疾患の予防、改善又は治療方法に関する。
【0121】
本発明の幹細胞由来細胞外小胞体については既に詳述したので、過度な重複を避けるためにその記載を省略する。
【0122】
前記「対象体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、予防、改善、治療、観察又は実験の対象である哺乳動物のことを指し、好ましくは、炎症疾患又は自己免疫疾患の予防、改善及び／又は治療を必要とするヒト又は哺乳動物であってよい。
【0123】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、次の実施例によって本発明が限定されるものではない。
【0124】
＜実施例＞
実施例１：中間葉幹細胞の３次元細胞培養
幹細胞の３次元細胞培養のために、ウェル当たりに４００μｍサイズのマイクロウェル約５９００個を含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌＴＭ４００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；＃３４４２５）にＦ１２７溶液を処理し、ウェル当たりに約４００個の臍帯由来の中間葉幹細胞（コングク大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０２０１０－ＢＲ－４０７）をシードして１２０～２００μｍ直径の範囲の均一なスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を生産した。非吸着培養皿にＴＧＦ－β３が含まれた培養液にスフェロイドをシードした後、３日間回転振盪器（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ，ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｃｅｌｔｒｏｎ；＃６９４５５）で６０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、得られた培養液からエクソソームを分離した。
実施例１：中間葉幹細胞の３次元細胞培養
幹細胞の３次元細胞培養のために、ウェル当たりに４００μｍサイズのマイクロウェル約５９００個を含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌＴＭ４００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；＃３４４２５）にＦ１２７溶液を処理し、ウェル当たりに約４００個の臍帯由来の中間葉幹細胞（コングク大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０２０１０－ＢＲ－４０７）をシードして１２０～２００μｍ直径の範囲の均一なスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を生産した。非吸着培養皿にＴＧＦ－β３が含まれた培養液にスフェロイドをシードした後、３日間回転振盪器（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ，ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ Ｃｅｌｔｒｏｎ；＃６９４５５）で６０ｒｐｍ、３７℃で振盪培養（ｓｈａｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）した。３日後、得られた培養液からエクソソームを分離した。
【0125】
実施例２：エクソソーム分離及び定量
培養液３００ｇを１０分間遠心分離して細胞残渣を除去し、２０００ｇで１０分間遠心分離した後に上澄液を新しいチューブに移し、再び１０，０００ｇで３０分間遠心分離して上澄液を１８７，０００ｇで２時間さらに遠心分離し、ペレットをＰＢＳ ２００μｌに懸濁した。前記懸濁液からエクソソームを精製するためにｏｐｔｉｐｒｅｐ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ；Ｍ１２４８）を用いて濃度勾配遠心分離（５０％、３０％、１０％）を行った。分離するためのエクソソームサンプル（懸濁液）を５０％ ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液に混ぜてロードし、１２０，０００ｇで２時間遠心分離して１０％～３０％の間のエクソソームを得た。得られたエクソソームは１８７，０００ｇでもう一度遠心分離してＰＢＳ １００μｌに懸濁した。
培養液３００ｇを１０分間遠心分離して細胞残渣を除去し、２０００ｇで１０分間遠心分離した後に上澄液を新しいチューブに移し、再び１０，０００ｇで３０分間遠心分離して上澄液を１８７，０００ｇで２時間さらに遠心分離し、ペレットをＰＢＳ ２００μｌに懸濁した。前記懸濁液からエクソソームを精製するためにｏｐｔｉｐｒｅｐ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ；Ｍ１２４８）を用いて濃度勾配遠心分離（５０％、３０％、１０％）を行った。分離するためのエクソソームサンプル（懸濁液）を５０％ ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液に混ぜてロードし、１２０，０００ｇで２時間遠心分離して１０％～３０％の間のエクソソームを得た。得られたエクソソームは１８７，０００ｇでもう一度遠心分離してＰＢＳ １００μｌに懸濁した。
【0126】
前記培養液からエクソソームを分離した後、ＮＴＡ装備（ＮＳ３００，ＮＡＮＯＳＩＧＨＴ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてメーカーの指示に従ってＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行うことによってエクソソームの数及びピーク（ｐｅａｋ）を確認した。その結果、振盪（ｓｈａｋｉｎｇ，６０ｒｐｍ）無しで３Ｄ培養のみを適用した場合に、一般的な２Ｄ培養環境における収率と大差がなく、３次元培養自体による効果は有意でないことを示した。なお、振盪（６０ｒｐｍ）無しで３Ｄ培養においてＴＧＦ－β３のみを添加するか、ＴＧＦ－β３無しで３Ｄ振盪培養条件のみを適用した場合に比べて、３Ｄ、振盪（６０ｒｐｍ）及びＴＧＦ－β３を全て適用した群において顕著な収率増加が確認できた（図２）。なお、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件では単一ピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が現れ、均質のエクソソームが生産されることが確認された（図３）。
【0127】
実施例３：ＰＢＭＣ増殖アッセイ
実施例２の方法で得たエクソソームに対して、従来に報告された方法によって（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１０６），ｅ５３２６５，ｄｏｉ：１０．３７９１／５３２６５（２０１５））ＰＢＭＣ増殖アッセイを行うことで、ＴＧＦ－βを処理した培養液から得られたエクソソームが対照群（一般細胞培養液）に比べてＴ細胞抑制効果があるか否かを確認した。血液（コングク大学校病院、コングク大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）からフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、培養５日後にＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｃ３４５５４）でＰＢＭＣを染色し、流細胞分析でＰＢＭＣの増殖を確認した。ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ；＃Ｌ１６６８）を処理してＴ細胞の増殖を伴う炎症環境を誘導した後、中間葉幹細胞自体のＰＢＭＣ抑制効果を陽性対照群として設定した後、一般細胞培養液から得られたエクソソーム（ＥＶ）、３Ｄ振盪培養条件のみを適用したエクソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、及び３Ｄ振盪培養条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＰＢＭＣ抑制効果を確認した（図４Ａ）。
実施例２の方法で得たエクソソームに対して、従来に報告された方法によって（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．（１０６），ｅ５３２６５，ｄｏｉ：１０．３７９１／５３２６５（２０１５））ＰＢＭＣ増殖アッセイを行うことで、ＴＧＦ－βを処理した培養液から得られたエクソソームが対照群（一般細胞培養液）に比べてＴ細胞抑制効果があるか否かを確認した。血液（コングク大学校病院、コングク大学校生命倫理委員会承認番号：７００１３５５－２０１７０５－ＢＲ－１８１）からフィコール（ｆｉｃｏｌｌ）を用いてＰＢＭＣを分離した後、培養５日後にＣＦＳＥ（Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；＃Ｃ３４５５４）でＰＢＭＣを染色し、流細胞分析でＰＢＭＣの増殖を確認した。ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ；＃Ｌ１６６８）を処理してＴ細胞の増殖を伴う炎症環境を誘導した後、中間葉幹細胞自体のＰＢＭＣ抑制効果を陽性対照群として設定した後、一般細胞培養液から得られたエクソソーム（ＥＶ）、３Ｄ振盪培養条件のみを適用したエクソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、及び３Ｄ振盪培養条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＰＢＭＣ抑制効果を確認した（図４Ａ）。
【0128】
その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件で得た本発明のエクソソーム（Ｔ－３ａＤ－ＥＶ）が、４３．１％にも達していたＭＳＣ処理群の増殖性Ｔ細胞を９．６％まで減少させ、陽性対照群に比べても８０％に近い顕著な減少率を示す上、最も優れたＴ細胞抑制効果を示した（図４Ｂ及び図４Ｃ）。
【0129】
そこで、本発明の方法によって得られたエクソソームは、収率の他に機能も大きく強化されていることが分かった。
【0130】
実施例４：各エクソソームの特性分析
４－１：エクソソームのサイズ及び形態分析
エクソソームのサイズは、Ｎａｎｏ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いた動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）分析によって調べ、ＥＶの数は、ナノ粒子追跡分析機ＮＳ３００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｅｒｙ，ＵＫ）を用いて測定した（図５Ａ）。エクソソームの形態及び構造は、８０ｋＶで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＭ－１０１０，Ｎｉｐｐｏｎ Ｄｅｎｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、観察の結果、エクソソームの形態はカップ形又は球形であった（図５Ｂ）。
４－１：エクソソームのサイズ及び形態分析
エクソソームのサイズは、Ｎａｎｏ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を用いた動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）分析によって調べ、ＥＶの数は、ナノ粒子追跡分析機ＮＳ３００（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｅｒｙ，ＵＫ）を用いて測定した（図５Ａ）。エクソソームの形態及び構造は、８０ｋＶで透過電子顕微鏡（ＴＥＭ，ＪＥＭ－１０１０，Ｎｉｐｐｏｎ Ｄｅｎｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて分析し、観察の結果、エクソソームの形態はカップ形又は球形であった（図５Ｂ）。
【0131】
４－２：エクソソーム関連マーカー発現確認
Ｇｒｉｄ（Ｆｏｒｍｖａｒ／Ｃａｒｂｏｎ ３００Ｍｅｓｈ，Ｃｏｐｐｅｒ＿ＦＣＦ３００－ＣＵ５０／ｐｋ）上にエクソソームを付着させ、１％ホスホタングステン酸水和物（ｓｉｇｍａ，Ｐ４００６）を用いて陰性染色を行った。エクソソーム関連陽性マーカーを確認するために、免疫ブロッティングでＣＤ９（ａｂ２６３０２３，ａｂｃａｍ）、ＣＤ６３（ａｂ１３４０４５，ａｂｃａｍ）、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１（＃１８６３４，ＣＳＴ）、Ａｌｉｘ（＃２１７１，ＣＳＴ）タンパク質の発現を調べた。ウェスタンブロッティングの結果、エクソソームの陽性マーカーは発現したし、エクソソーム陰性マーカーであるＧＭ１３０（＃１２４８０，ＣＳＴ）タンパク質発現は観察されなかった（図５Ｃ）。
Ｇｒｉｄ（Ｆｏｒｍｖａｒ／Ｃａｒｂｏｎ ３００Ｍｅｓｈ，Ｃｏｐｐｅｒ＿ＦＣＦ３００－ＣＵ５０／ｐｋ）上にエクソソームを付着させ、１％ホスホタングステン酸水和物（ｓｉｇｍａ，Ｐ４００６）を用いて陰性染色を行った。エクソソーム関連陽性マーカーを確認するために、免疫ブロッティングでＣＤ９（ａｂ２６３０２３，ａｂｃａｍ）、ＣＤ６３（ａｂ１３４０４５，ａｂｃａｍ）、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１（＃１８６３４，ＣＳＴ）、Ａｌｉｘ（＃２１７１，ＣＳＴ）タンパク質の発現を調べた。ウェスタンブロッティングの結果、エクソソームの陽性マーカーは発現したし、エクソソーム陰性マーカーであるＧＭ１３０（＃１２４８０，ＣＳＴ）タンパク質発現は観察されなかった（図５Ｃ）。
【0132】
４－３：エクソソーム表面の免疫表現型分析
流細胞分析によってエクソソーム表面の免疫表現型分析を行った。まず、エクソソームのサイズは、流細胞分析機を用いて分析できないサイズであるため、エクソソームの陽性マーカーであるＣＤ９抗体が結合している２．７ｕｍ Ｄｙｎａｂｅａｄ（１０６２０Ｄ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９ Ｆｌｏｗ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ））をエクソソームに付けてサイズを大きくした後、ＣＤ９－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４３０４７）、ＣＤ６３－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５６０２０）、ＣＤ８１－ＡＰＣ（ｍａｃｓ ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｍ１３０－１１９－７８７）抗体で標識した。後に、流細胞分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、標識された抗体で生成される蛍光強度を測定した。その結果、エクソソームにおいてＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１の蛍光発現量が９６％以上であることを確認した（図５Ｄ）。分離されたエクソソームが、エクソソーム陽性マーカーが９６～９８％発現することからして、均質なエクソソームが分離されたことが確認できる。
流細胞分析によってエクソソーム表面の免疫表現型分析を行った。まず、エクソソームのサイズは、流細胞分析機を用いて分析できないサイズであるため、エクソソームの陽性マーカーであるＣＤ９抗体が結合している２．７ｕｍ Ｄｙｎａｂｅａｄ（１０６２０Ｄ，ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｘｏｓｏｍｅ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ９ Ｆｌｏｗ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ））をエクソソームに付けてサイズを大きくした後、ＣＤ９－ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，７４３０４７）、ＣＤ６３－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５６０２０）、ＣＤ８１－ＡＰＣ（ｍａｃｓ ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ，Ｍ１３０－１１９－７８７）抗体で標識した。後に、流細胞分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて、標識された抗体で生成される蛍光強度を測定した。その結果、エクソソームにおいてＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１の蛍光発現量が９６％以上であることを確認した（図５Ｄ）。分離されたエクソソームが、エクソソーム陽性マーカーが９６～９８％発現することからして、均質なエクソソームが分離されたことが確認できる。
【0133】
４－４：エクソソームに内在されたＴＧＦ－β１含有量測定
エクソソームに内在されたＴＧＦ－β１含有量分析のために、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β１ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ－２４０－０５） Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂ製品をＡｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ００７）にコートして使用した。ＴＧＦ－β１が酸化されつつ活性化される性質を用いて、ＴＧＦ－β１の非活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の精密な測定を目標に、標本酸性化（ｓａｍｐｌｅ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をするためにＳａｍｐｌｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｋｉｔ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ０１０）を使用した。
エクソソームに内在されたＴＧＦ－β１含有量分析のために、Ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β１ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ－２４０－０５） Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂ製品をＡｎｃｉｌｌａｒｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ００７）にコートして使用した。ＴＧＦ－β１が酸化されつつ活性化される性質を用いて、ＴＧＦ－β１の非活性型（ｉｎａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）と活性型（ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍ）の精密な測定を目標に、標本酸性化（ｓａｍｐｌｅ ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）をするためにＳａｍｐｌｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｋｉｔ １（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＹ０１０）を使用した。
【0134】
以降の実験過程を簡略に説明すると、Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｂを２μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌロードして室温で一晩コートした後、サンプル（活性（ａｃｔｉｖｅ）／潜在（ｌａｔｅｎｔ）型）を１００μｌロードして２時間反応させ、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌ追加して再び２時間反応させた後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｂを付着させた。最後に、１００μｌの基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を追加して反応させた後、５０μｌの停止液で反応を終了させ、吸光度を測定した。吸光度は、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ波長で測定した。
【0135】
２Ｄ培養条件のみを適用したエクソソーム（２Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養条件のみを適用したエクソソーム（ａ３Ｄ－ＥＶ）、及び３Ｄ振盪培養条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエクソソーム（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ）中に内在されたＴＧＦ－β１の量をＥＬＩＳＡで測定した結果、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ勾配精製（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ－ｇｒａｄｉｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を経る前には、それぞれ、８６．３４ｐｇ／１×１０９、３０６．９５ｐｇ／１×１０９、３５２．９１ｐｇ／１×１０９の濃度で測定された。精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を経た後には、２Ｄ－ＥＶではＴＧＦ－β１が検出されなかったし、ａ３Ｄ－ＥＶでは８６．３ｐｇ／１×１０９、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶでは３１０．６ｐｇ／１×１０９の濃度で測定され、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶのＴＧＦ－β１発現量がａ３Ｄ－ＥＶに比べて約３．５倍以上増加したことが確認できた。精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程を経た各ＥＶを用いて酸性化（ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いたＴＧＦ－β１の活性型及び非活性型の含有量を測定したときも、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶでのＴＧＦ－β１含有量が他の群に比べて顕著に高く測定された（図５Ｅ）。具体的には、ＴＧＦ－β１活性型は、ａ３Ｄ－ＥＶにおいて３．８ｐｇ／１×１０９、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて３６．９ｐｇ／１×１０９の濃度で測定され、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶのＴＧＦ－β１活性型の含有量がａ３Ｄ－ＥＶに比べて約１０倍以上と示された。また、ＴＧＦ－β１非活性型は、ａ３Ｄ－ＥＶにおいて８２．４ｐｇ／１×１０９、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて２７３．６ｐｇ／１×１０９の濃度で測定され、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶのＴＧＦ－β１活性型含有量が、ａ３Ｄ－ＥＶに比べて約３．３倍以上と示された。
【0136】
要するに、前記Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶは、精製過程を経た後には、活性型であれ、非活性型であれ、活性型及び非活性型の総和であれ、ＴＧＦ－β１含有量が、ＴＧＦ－β３添加無しで３Ｄ振盪培養条件のみを適用して得られたａ３Ｄ－ＥＶに比べて少なくとも２倍以上、具体的には３倍以上、より具体的には３～１０倍、さらに具体的には３～６倍、特に具体的には３～５倍であることが見られた。一方、２Ｄ培養のみで得られた２Ｄ－ＥＶではＴＧＦ－β１が検出されなかった。
【0137】
したがって、本発明の方法で得られたＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいててのみタンパク質ＴＧＦ－β１が高発現することが分かる。
【0138】
実施例５：各エクソソームの傷治癒能分析（Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ）
５－１：トランスウェル移動分析（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
それぞれのエクソソームが正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ，Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ－１２３０２）の移動性に及ぼす影響を評価しようとした。
５－１：トランスウェル移動分析（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
それぞれのエクソソームが正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ，Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ－１２３０２）の移動性に及ぼす影響を評価しようとした。
【0139】
まず、ＮＨＤＦを２４ウェル８．０μｍポリカーボネートメンブレントランスウェル（３４２２，ｃｏｓｔａｒ）の上側ウェルに５×１０４細胞をシードし、ＤＭＥＭ高グルコース（Ｄ６４２９，ｓｉｇｍａ）に１０％ ＦＢＳと１％ペニシリンストレプトマイシン（Ｃａｔ ｎｏ．１５１４－１６３，ｇｉｂｃｏ）を入れた培地（ｍｅｄｉａ）で培養した。２４時間後に、上側ウェルに、１％ペニシリンストレプトマイシンを入れたＤＭＥＭ高グルコースＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）を入れ、下側ウェルにＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）にそれぞれの細胞外小胞体を１×１０９粒子／ウェルの濃度に希釈して処理した。２４時間後に、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，１００１０－０３１）で１回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（ｂｉｏｓｅｓａｎｇ，Ｐ２０３１）を入れて常温で２０分間インキュベーションした。その後、ＧｉｂｃｏＴＭ ＤＰＢＳで１回洗浄した後、１％クリスタルバイオレット（ｓｉｇｍａ，Ｖ５２６５）を入れて常温で１５～２０分間染色した。その後、ＤＰＢＳで２～３回洗浄した後、写真を撮った。全ての過程において溶液は上側ウェルに１００μｌ、下側ウェルに５００μｌを入れて行った。Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて相対的な細胞のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）をグラフで示した。
【0140】
Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて相対的な染色程度を確認した結果、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶグループにおいて細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）がそれぞれ、約４．３５倍、７．８５倍、１０．４倍増加することを確認した（図６）。
【0141】
５－２：インビボ傷治癒能確認
６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを１週間適応させた後、実験に使用した。麻酔後に、背部に８ｍｍの生検パンチ（Ｋａｉ，ＢＰ－８０Ｆ）を用いて全層傷を生成した後、エクソソーム（１×１０９粒子）を傷の周囲に３回に分けて注射し、対照群にはＰＢＳを注射した。傷部位を保護するために、８ｍｍ生検パンチを用いて穴を開けたシリコン（０．５ｍｍＴ）とテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ ｔａｐｅ，１６２２Ｗ）を用いたし、一定時間ごとに傷部位写真撮影時に、８ｍｍの穴が開いたシリコンを用いて比較写真を撮った。
６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを１週間適応させた後、実験に使用した。麻酔後に、背部に８ｍｍの生検パンチ（Ｋａｉ，ＢＰ－８０Ｆ）を用いて全層傷を生成した後、エクソソーム（１×１０９粒子）を傷の周囲に３回に分けて注射し、対照群にはＰＢＳを注射した。傷部位を保護するために、８ｍｍ生検パンチを用いて穴を開けたシリコン（０．５ｍｍＴ）とテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ ｔａｐｅ，１６２２Ｗ）を用いたし、一定時間ごとに傷部位写真撮影時に、８ｍｍの穴が開いたシリコンを用いて比較写真を撮った。
【0142】
それぞれ６匹のマウスに生検パンチで形成させた傷部位のサイズを比較した結果、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ処理グループにおいて傷部位の面積が有意に減少したことを確認した（図７）。０日基準で相対的な傷面積を表１に示した。
【0143】
【表1】
【0144】
上記の表１及び図７から、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ処理グループにおいて傷部位の面積が顕著に減少する効果を示すことが確認できる。
【0145】
５－３：組織学的分析
５－２の実験において、傷誘発９日後に、円形傷全体が含まれた組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液に２４時間固定した後、傷中央を通過する切片を取って脱水させた後、パラフィンブロックに包埋した。組織切片器で組織を切断した後、ポリリシンでコートされたスライドに付けてパラフィン除去及び含水過程を行った後、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。一方、マッソントリクローム染色のためにスライドをＷｅｉｇｅｒｔ’ｓ鉄ヘマトキシリン（Ｉｒｏｎ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液に１０分、Ｂｉｅｂｒｉｃｈ緋酸フクシン（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ Ｓｃａｒｌｅｔ－Ａｃｉｄ Ｆｕｃｈｓｉｎ）とアニリンブル（Ａｎｉｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ）にそれぞれ５分間置いた。
５－２の実験において、傷誘発９日後に、円形傷全体が含まれた組織を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液に２４時間固定した後、傷中央を通過する切片を取って脱水させた後、パラフィンブロックに包埋した。組織切片器で組織を切断した後、ポリリシンでコートされたスライドに付けてパラフィン除去及び含水過程を行った後、Ｈ＆Ｅ（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ）染色を行った。一方、マッソントリクローム染色のためにスライドをＷｅｉｇｅｒｔ’ｓ鉄ヘマトキシリン（Ｉｒｏｎ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液に１０分、Ｂｉｅｂｒｉｃｈ緋酸フクシン（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ Ｓｃａｒｌｅｔ－Ａｃｉｄ Ｆｕｃｈｓｉｎ）とアニリンブル（Ａｎｉｌｉｎｅ Ｂｌｕｅ）にそれぞれ５分間置いた。
【0146】
Ｈ＆Ｅ染色及びマッソントリクローム染色を用いて傷誘発部位の組織学的分析を行った結果、Ｈ＆Ｅ染色によって傷部位の面積が、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理した組織において非常に減少することを確認した。また、マッソントリクローム染色によってＴ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理した組織において傷治癒の最後の段階であるＥＣＭリモデリングが多く進行されたことを確認した（図８）。
【0147】
実施例６：各エクソソームの抗炎症効能分析
６－１：ＬＰＳ誘導炎症サイトカインの濃度分析
Ｒａｗ２６４．７細胞を４８ウェルプレートに１．５×１０５細胞をシードし、１２時間後に、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１－１ＭＧ，Ｓｉｇｍａ）とデキサメタゾン１０ｕＭ（５０００２２２０，ｂｉｏｇｅｍｓ）、それぞれのエクソソーム（１×１０９粒子）を５００μｌの１０％エクソソーム除去（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＤＭＥＭ－高グルコースに処理した。培養液に処理して２４時間後に、培養液からＧｒｉｅｓｓ試薬（５％リン酸中の０．１％ Ｎ－（１－ナフチル）エチレンジアミドジヒドロクロリド及び１％スルファニルアミド）と反応させた後に５４０ｎｍで吸光度を測定し、一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）を測定した。Ｒａｗ２６４．７をＬａｂｏｚｏｌ試薬（ＬａｂｏＰａｓｓ，ＣＭＲＺ００１）で溶解させ、メーカーの説明書に従って総ＲＮＡを分離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮＤ－ＯＮＥ）を用いて、精製されたＲＮＡの定量化した。ｃＤＮＡ合成は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写キット（Ｌａｂｏｐａｓｓ，ＣＭＲＴ０１０）及びオリゴｄＴプライマーを用いて行った。実時間ＰＣＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７５００）は、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ，ＲＯＸ，５００ｒｘｎ）（ＥＬＰＩＳＢＩＯＴＥＣＨ，ＥＢＴ－１８０２）を使用した。使用されたプライマー配列を下記の表２に記載した。
６－１：ＬＰＳ誘導炎症サイトカインの濃度分析
Ｒａｗ２６４．７細胞を４８ウェルプレートに１．５×１０５細胞をシードし、１２時間後に、ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１－１ＭＧ，Ｓｉｇｍａ）とデキサメタゾン１０ｕＭ（５０００２２２０，ｂｉｏｇｅｍｓ）、それぞれのエクソソーム（１×１０９粒子）を５００μｌの１０％エクソソーム除去（ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＤＭＥＭ－高グルコースに処理した。培養液に処理して２４時間後に、培養液からＧｒｉｅｓｓ試薬（５％リン酸中の０．１％ Ｎ－（１－ナフチル）エチレンジアミドジヒドロクロリド及び１％スルファニルアミド）と反応させた後に５４０ｎｍで吸光度を測定し、一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）を測定した。Ｒａｗ２６４．７をＬａｂｏｚｏｌ試薬（ＬａｂｏＰａｓｓ，ＣＭＲＺ００１）で溶解させ、メーカーの説明書に従って総ＲＮＡを分離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮＤ－ＯＮＥ）を用いて、精製されたＲＮＡの定量化した。ｃＤＮＡ合成は、Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写キット（Ｌａｂｏｐａｓｓ，ＣＭＲＴ０１０）及びオリゴｄＴプライマーを用いて行った。実時間ＰＣＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ７５００）は、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ，ＲＯＸ，５００ｒｘｎ）（ＥＬＰＩＳＢＩＯＴＥＣＨ，ＥＢＴ－１８０２）を使用した。使用されたプライマー配列を下記の表２に記載した。
【0148】
【表2】
【0149】
各エクソソームの抗炎症効果を確認するために、Ｒａｗ２６４．７をＬＰＳで刺激し、デキサメタゾン、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶをそれぞれ処理した後、培養液から酸化窒素の濃度を確認し、細胞からそれぞれの炎症反応因子のｍＲＮＡ発現レベルを確認した結果、Ｒａｗ２６４．７細胞においてＬＰＳで誘導された炎症反応がＴ－ａ３Ｄ－ＥＶによって有意に減少し得ることを確認した（図９）。
【0150】
また、前記培養液上澄液からｍＴＮＦ－ａｌｐｈａ（ＢＧＫ０６８０４，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－６（ＢＧＫ０８５０５，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－１０（ＢＧＫ１８８９３，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡキットを用いて各サイトカインの濃度を測定した結果、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶグループにおいて顕著な減少が確認できた（図１０）。
【0151】
このような結果から、本発明のＴ－ａ３Ｄ－ＥＶが炎症性サイトカインの発現及び生成を抑制し、ＬＰＳ毒素による内毒素血症マウスモデルの治療効果を呈し、炎症性疾患の予防又は治療用途に有用に利用可能であることが分かる。
【0152】
６－２：内毒素血症マウスモデル
８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１週間適応させた後、実験に使用した。ＬＰＳ ２．５ｍｇ／ｋｇ単独投与、又はそれぞれのエクソソーム（５×１０９粒子）と共に総２００μｌを２８Ｇニードルを用いて尾静脈（ｔａｉｌ－ｖｅｉｎ）に注射した。２時間後にマウスを犠牲させ、脾臓を剥がしてＰＢＳで洗浄し、使用するまで－８０℃に保管した。前記脾臓はプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（８７７８６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有のＲＩＰＡバッファー（ＣＢＲ００２，ＬＰＳ溶液）を用いてタンパク質を抽出したし、ｍＴＮＦ－ａｌｐｈａ（ＢＧＫ０６８０４，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－６（ＢＧＫ０８５０５，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－１０（ＢＧＫ１８８９３，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡキットを用いて各サイトカイン濃度を測定した。
８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１週間適応させた後、実験に使用した。ＬＰＳ ２．５ｍｇ／ｋｇ単独投与、又はそれぞれのエクソソーム（５×１０９粒子）と共に総２００μｌを２８Ｇニードルを用いて尾静脈（ｔａｉｌ－ｖｅｉｎ）に注射した。２時間後にマウスを犠牲させ、脾臓を剥がしてＰＢＳで洗浄し、使用するまで－８０℃に保管した。前記脾臓はプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（８７７８６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有のＲＩＰＡバッファー（ＣＢＲ００２，ＬＰＳ溶液）を用いてタンパク質を抽出したし、ｍＴＮＦ－ａｌｐｈａ（ＢＧＫ０６８０４，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－６（ＢＧＫ０８５０５，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ｍＩＬ－１０（ＢＧＫ１８８９３，ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）ＥＬＩＳＡキットを用いて各サイトカイン濃度を測定した。
【0153】
その結果、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理したグループにおいてＴＮＦ－α、ＩＬ－６の濃度が顕著に減少することを確認した（図１１）。
【0154】
実施例７：各エクソソームの間質性膀胱炎治療効能分析
７－１：細胞増殖及びシグナル確認
ヒトの尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＳＶ－ＨＵＣ－１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－９５２０）にエクソソームを濃度別に処理した後、細胞の増殖を確認した。
７－１：細胞増殖及びシグナル確認
ヒトの尿路上皮（ｕｒｏｔｈｅｌｉｕｍ）細胞であるＳＶ－ＨＵＣ－１（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－９５２０）にエクソソームを濃度別に処理した後、細胞の増殖を確認した。
【0155】
各エクソソームの濃度別効果を確認するために９６ウェルプレート（３００９６，ＳＰＬ）に１．５×１０４細胞をシードし、１２時間後にエクソソーム（２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、Ｔ－ａ３Ｄ ＥＶ）を濃度別（１×１０７、１×１０８粒子／ウェル）で処理した。２４時間後にｅｚ－ｃｙｔｏｘ（ＥＺ－３０００，ＤＯＧＥＮ）を処理し、１時間後にＢｉｏ－ＲＡＤ ｘ－Ｍａｒｋ ＴＭ分光光度計（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
【0156】
また、前記各エクソソームを処理したＳＶ－ＨＵＣ－１細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテール（８７７８６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有のＲＩＰＡバッファー（ＣＢＲ００２，ＬＰＳ溶液）を用いて溶解させ、ＷＣＬ（Ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を分離した。得られたタンパク質は、ＢＣＡ ａｎａｌｙｓｉｓ（２３２２７，Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて定量した後、４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｆｌｕｓ Ｇｅｌｓ（ＮＷ０４１２５ＢＯＸ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＮＷ０４１２２ＢＯＸ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動し、ＮＣメンブレン（ＩＢ２３００１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転移させた。１次抗体（１：１０００）を４℃で一晩反応させ、１ｘ ＴＢＳＴ（ＴＬＰ－１１８．１，ＴｒｎａｓＬａｂ）を用いて３回洗浄した。２次抗体を常温で２時間反応させ、１ｘ ＴＢＳＴで洗浄した。全ての抗体は１ｘブロッキングバッファー（ＴＬＰ－１１５．１Ｇ，Ｔｒａｎｓｌａｂ）に希釈して使用したし、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ ｉＢｒｉｇｈｔＴＭ Ｉｍａｇｅｒｓ（ＣＬ－１０００）を用いて確認した。前記１次及び２次抗体は、次のような製品を使用した：Ｐ－ＡＫＴ（ｓｃ－２９３１２５，ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）、Ｔ－ＡＫＴ（ＣＳＢ－ＰＡ０００８５５，ｃｕｓａｂｉｏ）、Ｐ－ＥＲＫ（ＣＳＢ－ＰＡ０００７４９，ｃｕｓａｂｉｏ）、Ｔ－ＥＲＫ（Ｂ７０７４，Ｔｅｂｕ－ｂｉｏ）、β－ａｃｔｉｎ（ｓｃ－４７７７８，ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）、ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（７０７４，ＣＳＴ）、及びＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（７０７６，ＣＳＴ）。
【0157】
前記ＳＶ－ＨＵＣ－１に各エクソソームを濃度別に処理して増殖を確認した結果、濃度別に細胞増殖が増加したし、２Ｄ－ＥＶやａ３Ｄ－ＥＶに比べてＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて細胞増殖程度が高いことを確認した（図１２Ａ）。また、細胞増殖に関連したＡＫＴ、ＥＲＫシグナルを確認した時にも、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理したグループにおいてＰ－ＡＫＴとＰ－ＥＲＫの発現量が増加したことを確認した（図１２Ｂ）。
【0158】
７－２：トランスウェル移動分析（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ＳＶ－ＨＵＣ－１細胞をＦ－１２Ｋ栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ）（２１１２７－０２２，Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＢＳと１％ペニシリンストレプトマイシン（１５１４０－１６３，ＧＩｂｃｏ）を入れた培地培養した。各エクソソームの濃度による細胞の移動程度を確認するために、２４ウェル８．０μｍポリカーボネートメンブレントランスウェル（３４２２，ｃｏｓｔａｒ）の上側ウェルに１．５×１０５細胞をシードし、１２時間後にエクソソームを下側ウェルに処理した。２４時間後に、ＤＰＢＳ（１００１０－０３１，ＧＩｂｃｏ）で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（Ｐ２０３１，Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を処理し、室温で２０分固定した。固定された細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、１００％メタノールで常温で２０分間インキュベーション過程を経て１％クリスタルバイオレット（Ｖ５２６５，ｓｉｇｍａ）で常温１５～２０分染色した。染色液をＤＰＢＳで２～３回洗浄した後、メンブレンの上側に残っている細胞を綿棒で拭い取った。ＤＰＢＳ洗浄で拭い取った細胞破片を除去した後、観察した。細胞の移動程度を確認するために、ｉｍａｇｅ Ｊの平均（ｍｅａｎ）値で細胞のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を比較してグラフで示した。
ＳＶ－ＨＵＣ－１細胞をＦ－１２Ｋ栄養混合物（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ）（２１１２７－０２２，Ｇｉｂｃｏ）に１０％ ＦＢＳと１％ペニシリンストレプトマイシン（１５１４０－１６３，ＧＩｂｃｏ）を入れた培地培養した。各エクソソームの濃度による細胞の移動程度を確認するために、２４ウェル８．０μｍポリカーボネートメンブレントランスウェル（３４２２，ｃｏｓｔａｒ）の上側ウェルに１．５×１０５細胞をシードし、１２時間後にエクソソームを下側ウェルに処理した。２４時間後に、ＤＰＢＳ（１００１０－０３１，ＧＩｂｃｏ）で洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（Ｐ２０３１，Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ）を処理し、室温で２０分固定した。固定された細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、１００％メタノールで常温で２０分間インキュベーション過程を経て１％クリスタルバイオレット（Ｖ５２６５，ｓｉｇｍａ）で常温１５～２０分染色した。染色液をＤＰＢＳで２～３回洗浄した後、メンブレンの上側に残っている細胞を綿棒で拭い取った。ＤＰＢＳ洗浄で拭い取った細胞破片を除去した後、観察した。細胞の移動程度を確認するために、ｉｍａｇｅ Ｊの平均（ｍｅａｎ）値で細胞のコンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を比較してグラフで示した。
【0159】
ＳＶ－ＨＵＣ－１に各エクソソームを濃度別に処理した結果、トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）での移動程度が増加したことを確認した（図１３Ａ）。また、各エクソソームの中でも２Ｄ－ＥＶ＜ａ３Ｄ－ＥＶ＜Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶの順に細胞の移動程度が増加したことを確認した（図１３Ｂ）。
【0160】
７－３：間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデル
８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＯｒｉ雌マウスを受けて２週間適応期間を置いた。アルファキサン（Ａｌｆａｘａｎ）とラムプン（ｒｕｍｐｕｎ）を４：１の比率に混ぜ、マウス当たりに９０ｕｌを腹腔注射して麻酔させた。尿道にカテーテル（３８２４１２，ＢＤ）を挿入して膀胱内部の尿を除去し、ＰＢＳ ５０μｌを入れて洗浄した。５ｍｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩（Ｐ３３６９，Ｓｉｇｍａ）を注入し、３０分後にＰＢＳで洗浄した。ＬＰＳ ３０μｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１，Ｓｉｇｍａ）を注入した後、ＰＢＳで洗浄した。ホットプレートでマウスの回復を確認し、１週間飼育した。この過程を４回反復してマウスＩＣ／ＢＰＳモデルを誘導した。実験５週目にはマウスを同じ方法で麻酔した後、マウスの下腹部を切開して膀胱の表面に各エクソソームを５×１０８粒子／３０μｌずつ注入した。下腹部を縫合して麻酔から回復することを確認した後、飼育した。１週後にマウスを麻酔させた後、膀胱を摘出して実験に使用した（図１４）。一部の膀胱は均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）後にＲＮＡを抽出し、一部は組織セレクション及び染色によって膀胱の形態及び炎症程度を確認した。
８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＯｒｉ雌マウスを受けて２週間適応期間を置いた。アルファキサン（Ａｌｆａｘａｎ）とラムプン（ｒｕｍｐｕｎ）を４：１の比率に混ぜ、マウス当たりに９０ｕｌを腹腔注射して麻酔させた。尿道にカテーテル（３８２４１２，ＢＤ）を挿入して膀胱内部の尿を除去し、ＰＢＳ ５０μｌを入れて洗浄した。５ｍｇ／ｍｌのプロタミン硫酸塩（Ｐ３３６９，Ｓｉｇｍａ）を注入し、３０分後にＰＢＳで洗浄した。ＬＰＳ ３０μｇ／ｍｌ（Ｌ４３９１，Ｓｉｇｍａ）を注入した後、ＰＢＳで洗浄した。ホットプレートでマウスの回復を確認し、１週間飼育した。この過程を４回反復してマウスＩＣ／ＢＰＳモデルを誘導した。実験５週目にはマウスを同じ方法で麻酔した後、マウスの下腹部を切開して膀胱の表面に各エクソソームを５×１０８粒子／３０μｌずつ注入した。下腹部を縫合して麻酔から回復することを確認した後、飼育した。１週後にマウスを麻酔させた後、膀胱を摘出して実験に使用した（図１４）。一部の膀胱は均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）後にＲＮＡを抽出し、一部は組織セレクション及び染色によって膀胱の形態及び炎症程度を確認した。
【0161】
また、マウスの膀胱組織をセレクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）してＨ＆Ｅ染色をした結果、ＩＣ／ＢＰＳ誘導マウスでは膀胱内壁が荒れていることを確認したし、各エクソソームを処理したグループでは内壁が回復していることを確認した（図１５Ａ）。さらにマッソントリクローム染色とトルイジンブルー染色によって線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）程度と肥満細胞（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）の浸透を確認し、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理したグループにおいて炎症程度が緩和されたことを確認した（図１５Ｂ、図１５Ｃ、及び図１５Ｄ）。
【0162】
７－４：ｑＰＣＲ
抽出された膀胱を均質化した後、Ｌａｂｏｚｏｌ試薬（ＣＭＲＺ００１，コスモジンテック）に再懸濁した。クロロホルム（Ｃ２４３２，Ｓｉｇｍａ）をＬａｂｏｚｏｌと５：１の比率に混ぜてボルテックスした。１３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離してＲＮＡが溶けている上澄液を２－プロパノール（６４６０５－０３８０，ｊｕｎｓｅｉ）と１：１に混ぜ、１３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、ＤＥＰＣにＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡは、ｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＥＢＴ－１３１９，ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いてｃＤＮＡを合成したし、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ，ＲＯＸ）（ＥＢＴ－１８０２，ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いて遺伝子の発現量を確認した（７５００，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
抽出された膀胱を均質化した後、Ｌａｂｏｚｏｌ試薬（ＣＭＲＺ００１，コスモジンテック）に再懸濁した。クロロホルム（Ｃ２４３２，Ｓｉｇｍａ）をＬａｂｏｚｏｌと５：１の比率に混ぜてボルテックスした。１３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離してＲＮＡが溶けている上澄液を２－プロパノール（６４６０５－０３８０，ｊｕｎｓｅｉ）と１：１に混ぜ、１３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離した。ＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍ、１０分遠心分離し、ＤＥＰＣにＲＮＡを再懸濁した。ＲＮＡは、ｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ５ｘ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＥＢＴ－１３１９，ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いてｃＤＮＡを合成したし、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ，ＲＯＸ）（ＥＢＴ－１８０２，ＥＬＰＩＳＢＩＯ）を用いて遺伝子の発現量を確認した（７５００，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【0163】
膀胱組織からｍＲＮＡを抽出して炎症関連サイトカイン（ＴＮＦ－ａｌｐｈａ、ＩＬ６）の発現を確認した結果、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理した群において発現度が有意に低くなったことを確認した（図１６Ａ）。また、尿路上皮（Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ）マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現を確認した結果、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理した群において発現度が有意に高くなったことを確認した（図１６Ｂ）。さらに、バイオインフォマティクス（ｂｉｏ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）によってＩＣ／ＢＰＳで発現するものと分類した遺伝子（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）の発現が有意に低くなったことを確認した（図１６Ｃ）（韓国公開特許公報第１０－２３３１１３８号参照）。
【0164】
７－５：アウェイク膀胱内圧測定法（ａｗａｋｅ ｃｙｓｔｏｍｅｔｒｙ）
ＩＣ／ＢＰＳを誘導したマウスの膀胱にカテーテルを挿入するために、膀胱測定３日前に麻酔を誘導し、カフ付きポリエチレンカテーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃａｔｈｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｕｆｆ）（ＰＥ－５０；Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を腹部切開後に膀胱に挿入した。その後、このカテーテルを、皮下空間を通して動物の背を開けて外部に固定した。アウェイク膀胱内圧測定のために、膀胱に対する留置カテーテルを、Ｔ－チューブを通じて圧力変換器（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に連結された両方向バルブと微細注入ポンプ（ＰＨＤ ＵＬＴＲＡＴＭ Ｓｙｒｉｎｇｅ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した。排尿量は、滅菌食塩水を０．４ｍＬ／ｍｉｎの速度で膀胱に注入する状態で、変換器（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に連結された流体収集器によって８分間連続して記録した。ＩＶＰ（膀胱内圧）及び排尿量は、ＬａｂＳｃｒｉｂｅ ３．６３７ソフトウェア（ｉｗｏｒｋｓ，６２ Ｌｉｔｔｌｅｗｏｒｔｈ Ｒｏａｄ Ｄｏｖｅｒ，ＮＨ ０３８２０，ＵＳＡ）を有するｉＷｏｒｋ ＩＸ－ＲＡ－８３４データ収集システムを用いて持続して記録した。
ＩＣ／ＢＰＳを誘導したマウスの膀胱にカテーテルを挿入するために、膀胱測定３日前に麻酔を誘導し、カフ付きポリエチレンカテーテル（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃａｔｈｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｃｕｆｆ）（ＰＥ－５０；Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を腹部切開後に膀胱に挿入した。その後、このカテーテルを、皮下空間を通して動物の背を開けて外部に固定した。アウェイク膀胱内圧測定のために、膀胱に対する留置カテーテルを、Ｔ－チューブを通じて圧力変換器（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に連結された両方向バルブと微細注入ポンプ（ＰＨＤ ＵＬＴＲＡＴＭ Ｓｙｒｉｎｇｅ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用した。排尿量は、滅菌食塩水を０．４ｍＬ／ｍｉｎの速度で膀胱に注入する状態で、変換器（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ；Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に連結された流体収集器によって８分間連続して記録した。ＩＶＰ（膀胱内圧）及び排尿量は、ＬａｂＳｃｒｉｂｅ ３．６３７ソフトウェア（ｉｗｏｒｋｓ，６２ Ｌｉｔｔｌｅｗｏｒｔｈ Ｒｏａｄ Ｄｏｖｅｒ，ＮＨ ０３８２０，ＵＳＡ）を有するｉＷｏｒｋ ＩＸ－ＲＡ－８３４データ収集システムを用いて持続して記録した。
【0165】
ＩＣ／ＢＰＳが誘導されたマウスは、膀胱の疼痛及び機能の低下によって頻尿を示すが、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶを処理した群では膀胱内圧が回復し、対照群と類似の排尿周期を示す程度に回復することが見られた（図１７及び図１８）。
【0166】
上記の実験結果から、本発明の細胞外小胞体（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ）が間質性膀胱炎（ＩＣ）などの膀胱疼痛症候群（ＢＰＳ）の治療に有用に利用可能であることが判断される。
【0167】
実施例８：エクソソーム発現タンパク質の分析
実験方法
タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）同定／定量のためのサンプル準備
ＷＪ－ＭＳＣ由来エクソソームから分離したタンパク質（２０μｇ）を、遠心真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，ＣｅｎｔｒｉＶａｐ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて凍結乾燥させた。前記ペレットを５％ドデシル硫酸ナトリウム及び５０ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ ７．５５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で構成された１００ｍＬ溶解緩衝液で溶解させた。サンプルは、トリプシン／ＬｙｓＣ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を除いてメーカーのプロトコルに従ってＳ－ＴｒａｐＴＭマイクロスピンカラム消化プロトコル（Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）で処理された。前記凍結乾燥したペプチドを０．１％ギ酸で溶解させた。前記溶液内のタンパク質及びペプチドの量を確認するために、溶解（ｌｙｓｉｓ）後にＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質の量を測定したし、ペプチド濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０５ｎｍで吸光度を測定した。
実験方法
タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）同定／定量のためのサンプル準備
ＷＪ－ＭＳＣ由来エクソソームから分離したタンパク質（２０μｇ）を、遠心真空濃縮器（ＬＡＢＣＯＮＣＯ，ＣｅｎｔｒｉＶａｐ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）を用いて凍結乾燥させた。前記ペレットを５％ドデシル硫酸ナトリウム及び５０ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ ７．５５，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で構成された１００ｍＬ溶解緩衝液で溶解させた。サンプルは、トリプシン／ＬｙｓＣ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を除いてメーカーのプロトコルに従ってＳ－ＴｒａｐＴＭマイクロスピンカラム消化プロトコル（Ｍｉｃｒｏ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）で処理された。前記凍結乾燥したペプチドを０．１％ギ酸で溶解させた。前記溶液内のタンパク質及びペプチドの量を確認するために、溶解（ｌｙｓｉｓ）後にＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）でタンパク質の量を測定したし、ペプチド濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０５ｎｍで吸光度を測定した。
【0168】
ヒトＷＪ－ＭＳＣの細胞ペレットをプロテアーゼ及びフォスファターゼ抑制剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｈａｌｔ）と共に５％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ｐＨ ７．５５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解させた。前記サンプルをＣｏｖａｒｉｓ ｍｉｃｒｏＴＵＢＥ－１３０ ＡＦＡ（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓｅｄ Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ） Ｆｉｂｅｒ Ｓｃｒｅｗ－Ｃａｐｓ（５２０２１６）に移し、Ｓｃｒｅｗ－Ｃａｐ ｍｉｃｒｏＴＵＢＥ－１３０ホルダー（５００３３９）のＣｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ ＡＦＡで超音波処理した。前記ＡＦＡ機器の媒介変数は、次の通りである：冷却器設定点－５℃、最大入射電力１７５Ｗ、デューティーファクター１０％、バースト当たりのサイクル数２００、持続時間３６０秒。消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）段階は、トリプシン／ＬｙｓＣ混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を除いて、メーカーのプロトコルに従ってＳ－ＴｒａｐＴＭミニスピンカラム消化プロトコル（Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）で行われた。溶出緩衝液（０．２％ギ酸含有物及び５０％アセトニトリル含有物）に含まれているペプチドを遠心真空濃縮器で凍結乾燥させた。凍結乾燥したペプチドを５０ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩に再懸濁し、２８０ｎｍ波長でＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて「１Ａｂｓ＝１ｍｇ／ｍＬ」に設定されたサンプル類型オプションを用いてペプチド濃度を決定した。その後、メーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指針に従ってそれぞれのサンプルをＴＭＴ１０－１３０Ｎ、ＴＭＴ１０－１３０Ｃ、及びＴＭＴ１０－１３１を除いた１０－ｐｌｅｘ ＴＭＴ試薬（Ｌｏｔ ｎｕｍｂｅｒ：ＵＨ２８４２５１）１００μｇで標識した。前記標識及び処理後に、ＴＭＴ－標識されたサンプルは、Ｃ１８カートリッジを用いた固体相抽出（Ｓｅｐ－Ｐａｋ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）で脱塩する前に１：１：１：１：１：１の比率にプーリングされた。
【0169】
ヒトＷＪ－ＭＳＣから分離された標識されたペプチドサンプルのサンプル複雑性を減らすために、結合しているサンプルを、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ ｉｄ×２５０ｍｍ長、気孔サイズ１３０Å、及び粒子サイズ５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）が装着されたＳｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＨＰＬＣ機器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を用いて、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで分画した。その後、移動相Ａとして１０ｍＭトリメチルアミン重炭酸塩（ＴＥＡＢ，ｐＨ ８．５）を使用し、移動相Ｂとして９０％アセトニトリル（ｐＨ １０）に溶かした１０ｍＭ ＴＥＡＢを使用した。前記サンプルを２００μＬ移動相Ａに溶かした後、２，１００μＬサンプルループに注入した。溶液Ｂを５～５％で１５分、さらに５～４５％で６２．５分、４５～６０％で５分、６０～６０％で１２．５分、６０～５％で７．５分、及び５～５％で２０分間流し、前記カラムを１００％及び５０％移動相Ｂでそれぞれ３０分間洗浄した。前記分画により、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）のＦＲＣ－１０Ａ分画収集器を用いて３０秒ごとに溶離液を収集した。生成された１６８個の分画を連結方式で混合することによって２４個の分画を得た。各分画を凍結乾燥させ、使用するまで－２０℃で保管した。
【0170】
質量分析機（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析
Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣナノＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でサンプルを分析した。分析のために、前記ペプチドをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００トラップカラム（１００ｍｍ×２ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ、Ｃ１８、５ｍｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ＥＡＳＹ－ＳｐｒａｙＴＭ Ｃ１８ＬＣ分析カラム（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ）（ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、７５ｍｍ×５０ｃｍ、Ｃ１８、２ｍｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分離した。各ペプチドの液体クロマトグラフィータンデム質量分析機分析のために、溶離液Ａは０．１％ギ酸含有５％ジメチルスルホキシド、及び溶離液Ｂは０．１％ギ酸含有８０％アセトニトリル及び５％ジメチルスルホキシドを使用し、５０℃（溶離液Ｂを５～４０％に１５０分以上；４０～９５％に２分以上；９５％に２３分維持；９５～５％に１０分以上；５％に１５分維持）で２５０ｎＬ／ｍｉｎの流速で１５０分勾配で溶離した。
Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ－Ｘ質量分析機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣナノＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でサンプルを分析した。分析のために、前記ペプチドをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００トラップカラム（１００ｍｍ×２ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ、Ｃ１８、５ｍｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、ＥＡＳＹ－ＳｐｒａｙＴＭ Ｃ１８ＬＣ分析カラム（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ）（ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、７５ｍｍ×５０ｃｍ、Ｃ１８、２ｍｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分離した。各ペプチドの液体クロマトグラフィータンデム質量分析機分析のために、溶離液Ａは０．１％ギ酸含有５％ジメチルスルホキシド、及び溶離液Ｂは０．１％ギ酸含有８０％アセトニトリル及び５％ジメチルスルホキシドを使用し、５０℃（溶離液Ｂを５～４０％に１５０分以上；４０～９５％に２分以上；９５％に２３分維持；９５～５％に１０分以上；５％に１５分維持）で２５０ｎＬ／ｍｉｎの流速で１５０分勾配で溶離した。
【0171】
質量スペクトルは、全体スキャン（ＭＳ１，ｍ／ｚ ３５０－１８００）と２０個のデータ従属ＭＳ／ＭＳ（ＭＳ２）スキャンとの間に自動転換されるデータ従属モードで獲得した。
【0172】
全体スキャン質量スペクトルの目標値は、最大注入時間１００ｍｓ及び解像度６０，０００（ｍ／ｚ ４００）で３，０００，０００であった。ＭＳ／ＭＳのイオン目標値は、正規化された衝突エネルギー（２７％）及び単離ウィンドウ（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ：１．７ｍ／ｚ）を適用して最大注入時間５０ｍｓ及び解像度１５，０００（ｍ／ｚ ４００）で１００，０００に設定された。反復するペプチドの動的排除を２０秒間適用した。各生物学的サンプルに対して３回反復して行われた。ＴＭＴ標識されたサンプルは、ＬＣ媒介変数がエクソソームサンプルと同じ方式で行われたし、ＭＳ媒介変数は次の通りである：ＭＳ１においてスキャン範囲（ｍ／ｚ）３５０－１５００；ＭＳ１において解像度１２０，０００、ＭＳ２において解像度４５，０００；ＭＳ１のＡＧＣターゲット３ｅ６、ＭＳ２のＡＧＣターゲット１ｅ５；ＭＳ１において最大ＩＴ（ｍｓ）は５０、ＭＳ２において最大ＩＴ（ｍｓ）は９６であった。データ従属モードの周期は、単離ウィンドウ（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗｉｎｄｏｗ：０．７ｍ／ｚ）、１１０ｍ／ｚの固定された一番目の質量及び３２％のＨＣＤ衝突エネルギーにおいて各周期当たりに最も豊富な前駆体２０個までＭＳ／ＭＳをトリガーするように設定された。
【0173】
データベース検索及び無標識定量
ＭａｘＱｕａｎｔ １．６．１７．０を用いて、ペプチド及びタンパク質同定及び定量化を行った。ＭａｘＱｕａｎｔに含まれたＡｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを用いたＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（２０２０年５月に発売、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から質量分析原始（ｒａｗ）ファイルを検索した。ＭａｘＱｕａｎｔの汚染物データベースを使用した。次のＭａｘＱｕａｎｔ検索媒介変数が使用された：トリプシンを特異的酵素として選択し、システインのカルバミドメチル化を固定変形として設定し、Ｎ末端タンパク質のアセチル化及び酸化（Ｍ）を可変変形として設定した。タンパク質定量値ＬＦＱ強度が、ＭａｘＱｕａｎｔで使用する前駆体強度ベース無標識定量化アルゴリズムによって生成され、「実行間一致」機能を可能にした。ＬＦＱ強度は、エクソソームサンプルに対するＭａｘ－ＬＦＱアルゴリズムの出力である。レポーターイオンは、ＷＪ－ＭＳＣタンパク質体定量化のために、１０フレックス媒介変数で修正された７フレックスＴＭＴに設定された。ＦＤＲは、タンパク質及びペプチドスペクトル一致レベルの全てにおいて０．０１に設定された。少なくとも一つの独特のペプチドによって確認されたタンパク質が使用された。他の設定は基本値に維持された。
ＭａｘＱｕａｎｔ １．６．１７．０を用いて、ペプチド及びタンパク質同定及び定量化を行った。ＭａｘＱｕａｎｔに含まれたＡｎｄｒｏｍｅｄａ検索エンジンを用いたＳｗｉｓｓＰｒｏｔヒトデータベース（２０２０年５月に発売、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から質量分析原始（ｒａｗ）ファイルを検索した。ＭａｘＱｕａｎｔの汚染物データベースを使用した。次のＭａｘＱｕａｎｔ検索媒介変数が使用された：トリプシンを特異的酵素として選択し、システインのカルバミドメチル化を固定変形として設定し、Ｎ末端タンパク質のアセチル化及び酸化（Ｍ）を可変変形として設定した。タンパク質定量値ＬＦＱ強度が、ＭａｘＱｕａｎｔで使用する前駆体強度ベース無標識定量化アルゴリズムによって生成され、「実行間一致」機能を可能にした。ＬＦＱ強度は、エクソソームサンプルに対するＭａｘ－ＬＦＱアルゴリズムの出力である。レポーターイオンは、ＷＪ－ＭＳＣタンパク質体定量化のために、１０フレックス媒介変数で修正された７フレックスＴＭＴに設定された。ＦＤＲは、タンパク質及びペプチドスペクトル一致レベルの全てにおいて０．０１に設定された。少なくとも一つの独特のペプチドによって確認されたタンパク質が使用された。他の設定は基本値に維持された。
【0174】
タンパク質体及び実験データの統計分析
サンプル間のタンパク質体データの差分分析のためにソフトウェアＰｅｒｓｅｕｓ（バージョン１．６．１４．０）が使用された。まず、様々な汚染物と逆データベースから同定されるデータを全て除去した。データセットの品質を評価するために、ＰｅｒｓｅｕｓソフトウェアがＰＣＡに使用された。エクソソームＥＶサンプル及びＴＭＴ標識サンプル（中央値排除による正規化）に対する正規化されたタンパク質存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）値をｌｏｇ２スケールに変換した。各サンプルの３回反復試験物がグループ化されたし、少なくとも３個の有効な値が１つ以上のグループ化に必要だった。欠落した値は、基本媒介変数（幅：０．３、下方移動：１．８）を用いて正規分布から取り込んだ乱数で代替された。標本間の統計的に有意な差異を探すために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ（０．０５ ｃｕｔ－ｏｆｆ）を使用してｔ検定を行った。濃縮Ｚ点数値の階層的クラスタリングは、ＩｎｓｔａｎｔＣｌｕｅソフトウェアを用いて行われた。ユークリッド距離をメトリックとして使用し、平均連結媒介変数を用いて階層的クラスタリングを行った。各クラスターに属するタンパク質存在量値（Ｌｏｇ２値）は、ＩｎｓｔａｎｔＣｌｕｅによって決定されたｙ軸と共に、上位及び下位四分位数、中央値、最小値及び最大値、全ての個別データポイントがある箱プロットで表示される。データは、ＦｕｎＲｉｃｈ ｖ３．１．３及びＳｈｉｎｙＧＯ ｖ０．６１を用いて処理され、遺伝子オントロジー（ＧＯ）を行った。豊富な署名遺伝子の評価は、１，０００個の順列と基本媒介変数を使用するＧＳＥＡアルゴリズムで行われた。
サンプル間のタンパク質体データの差分分析のためにソフトウェアＰｅｒｓｅｕｓ（バージョン１．６．１４．０）が使用された。まず、様々な汚染物と逆データベースから同定されるデータを全て除去した。データセットの品質を評価するために、ＰｅｒｓｅｕｓソフトウェアがＰＣＡに使用された。エクソソームＥＶサンプル及びＴＭＴ標識サンプル（中央値排除による正規化）に対する正規化されたタンパク質存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）値をｌｏｇ２スケールに変換した。各サンプルの３回反復試験物がグループ化されたし、少なくとも３個の有効な値が１つ以上のグループ化に必要だった。欠落した値は、基本媒介変数（幅：０．３、下方移動：１．８）を用いて正規分布から取り込んだ乱数で代替された。標本間の統計的に有意な差異を探すために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ（０．０５ ｃｕｔ－ｏｆｆ）を使用してｔ検定を行った。濃縮Ｚ点数値の階層的クラスタリングは、ＩｎｓｔａｎｔＣｌｕｅソフトウェアを用いて行われた。ユークリッド距離をメトリックとして使用し、平均連結媒介変数を用いて階層的クラスタリングを行った。各クラスターに属するタンパク質存在量値（Ｌｏｇ２値）は、ＩｎｓｔａｎｔＣｌｕｅによって決定されたｙ軸と共に、上位及び下位四分位数、中央値、最小値及び最大値、全ての個別データポイントがある箱プロットで表示される。データは、ＦｕｎＲｉｃｈ ｖ３．１．３及びＳｈｉｎｙＧＯ ｖ０．６１を用いて処理され、遺伝子オントロジー（ＧＯ）を行った。豊富な署名遺伝子の評価は、１，０００個の順列と基本媒介変数を使用するＧＳＥＡアルゴリズムで行われた。
【0175】
エクソソームＥＶ収率に対して得たデータに対して、ＮＴＡ結果（平均±標準偏差、ｎ＝６）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、対を成していない両側スチューデントｔ検定で分析された。傷掻き分析のために実験を少なくとも３回反復した（ｎ＝３又は６）。ＰＢＭＣを健康な寄贈者から分離し、実験を４回反復した。グラフィックデータの誤差棒は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。統計的有意性は、ｐ＜０．０５に設定された。
【0176】
試験結果
８－１：各エクソソームから差別的に発現したタンパク質（ＤＥＰ）のタンパク質体分析
各エクソソームに含まれたタンパク質の定量分析
受容細胞に対するＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの強力な効能を理解するために、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのタンパク質含有量を、ＬＣ－ＭＳベースＬＦＱ（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて分析した。タンパク質は、各エクソソームＥＶサンプルから得た同一量のＥＶ（２０ｍｇ）から抽出されたし、総３９４個のタンパク質グループが３回反復して同定された。このうち、２Ｄ－ＥＶは１３８±１個のタンパク質グループ、ａ３Ｄ－ＥＶは３０４±５個のタンパク質グループ、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶは３２０±１４個のタンパク質グループがそれぞれ定量化された。興味深く、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて、ＢＣＡ分析によって溶解後に分析されたＥＶタンパク質の量はそれぞれ、３３μｇ、２６μｇ、及び２９μｇであったし（図１９Ａ）、タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）の存在量分布は、前記タンパク質の量と同じパターンを示した。対照的に、本研究の全てのＥＶサンプルにおいて以前に知られたＴｏｐ １００ＥＶマーカータンパク質のうち４４個のＥＶマーカータンパク質（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｃａｒｔａ．ｏｒｇ／ｅｘｏｓｏｍｅ＿ｍａｒｋｅｒｓ＿ｎｅｗ）が同定されたし、前記ＥＶマーカータンパク質の定量的分布がサンプル間に非常に類似することが見られた（図１９Ｂ）。このような結果は、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶがそれぞれ類似量のタンパク質を含有しているが、ａ３Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶに含まれたタンパク質体の複雑性が２Ｄ－ＥＶに比べてより多く増加していることを意味する。
８－１：各エクソソームから差別的に発現したタンパク質（ＤＥＰ）のタンパク質体分析
各エクソソームに含まれたタンパク質の定量分析
受容細胞に対するＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの強力な効能を理解するために、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのタンパク質含有量を、ＬＣ－ＭＳベースＬＦＱ（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を用いて分析した。タンパク質は、各エクソソームＥＶサンプルから得た同一量のＥＶ（２０ｍｇ）から抽出されたし、総３９４個のタンパク質グループが３回反復して同定された。このうち、２Ｄ－ＥＶは１３８±１個のタンパク質グループ、ａ３Ｄ－ＥＶは３０４±５個のタンパク質グループ、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶは３２０±１４個のタンパク質グループがそれぞれ定量化された。興味深く、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて、ＢＣＡ分析によって溶解後に分析されたＥＶタンパク質の量はそれぞれ、３３μｇ、２６μｇ、及び２９μｇであったし（図１９Ａ）、タンパク質体（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）の存在量分布は、前記タンパク質の量と同じパターンを示した。対照的に、本研究の全てのＥＶサンプルにおいて以前に知られたＴｏｐ １００ＥＶマーカータンパク質のうち４４個のＥＶマーカータンパク質（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｏｃａｒｔａ．ｏｒｇ／ｅｘｏｓｏｍｅ＿ｍａｒｋｅｒｓ＿ｎｅｗ）が同定されたし、前記ＥＶマーカータンパク質の定量的分布がサンプル間に非常に類似することが見られた（図１９Ｂ）。このような結果は、２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶがそれぞれ類似量のタンパク質を含有しているが、ａ３Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶに含まれたタンパク質体の複雑性が２Ｄ－ＥＶに比べてより多く増加していることを意味する。
【0177】
遺伝子オントロジー分析
２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのそれぞれのサンプルセットに対する遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。
２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのそれぞれのサンプルセットに対する遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った。
【0178】
その結果、タンパク質が細胞質、核小体、リボソーム、細胞外基質及びエクソソームのうち、エクソソームに最も多く含まれていることが分かった。特に、２Ｄ－ＥＶにおいて、他のＥＶサンプルセットに比べて、エクソソーム内にタンパク質がより大きい割合で含まれていることが見られた。一方、ａ３Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶは、２Ｄ－ＥＶとは違い、細胞質、核小体、リボソーム及び細胞外基質に、より多いタンパク質が含まれていたことが見られた（図１９Ｃ）。
【0179】
また、Ｖｅｓｉｃｌｅｐｅｄｉａに報告されたデータセットと本研究で発見されたＥＶタンパク質体とを比較した結果、大部分のタンパク質が既存ＥＶタンパク質体と共通していたが、本発明の方法で得られたＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのタンパク質のうち３種のタンパク質（脂肪細胞原形質膜関連タンパク質、ｐｒｏｌｙｌ ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ １、ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）は、既存に知られたＥＶタンパク質体でないものが見られた（図１９Ｄ）。前記３種のタンパク質は２Ｄ－ＥＶでは検出されず、ａ３ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３ｄ－ＥＶでのみ検出されるタンパク質であり、前記３種のタンパク質の中でも「ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｇ／Ｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ２」は、２Ｄ－ＥＶ又はａ３ｄ－ＥＶでは検出されず、本発明の方法で得られたＴ－ａ３ｄ－ＥＶでのみ現れるタンパク質であるので、前記Ｔ－ａ３ｄ－ＥＶは新しいタンパク質発現プロファイルを有することが分かる。
【0180】
クラスタリング分析
Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）が０．０５以下である存在量を正規化するＺ点数を使用した階層的クラスタリング分析を行い、４個のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）に分類した（図２０Ａ）。図２０Ａに示すように、各サンプルセットでのみ増加するクラスターを見出すことができる（クラスター２：Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶの４７個タンパク質グループ、クラスター３：ａ３Ｄ－ＥＶの１１個タンパク質グループ、クラスター４：２Ｄ－ＥＶのそれぞれ６３個タンパク質グループ）。８２個のタンパク質グループがあるクラスター１は、ａ３Ｄ－ＥＶとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの両方で増加したタンパク質を示し、このようなタンパク質が３Ｄ培養の特徴であることが分かる。
Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ＦＤＲ（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）が０．０５以下である存在量を正規化するＺ点数を使用した階層的クラスタリング分析を行い、４個のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）に分類した（図２０Ａ）。図２０Ａに示すように、各サンプルセットでのみ増加するクラスターを見出すことができる（クラスター２：Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶの４７個タンパク質グループ、クラスター３：ａ３Ｄ－ＥＶの１１個タンパク質グループ、クラスター４：２Ｄ－ＥＶのそれぞれ６３個タンパク質グループ）。８２個のタンパク質グループがあるクラスター１は、ａ３Ｄ－ＥＶとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの両方で増加したタンパク質を示し、このようなタンパク質が３Ｄ培養の特徴であることが分かる。
【0181】
タンパク質の生物学的特徴比較分析
遺伝子オントロジーツールを用いて各クラスターに対する生物学的過程範ちゅうの機能的特性を調べた結果、クラスター２に属するタンパク質（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶグループでのみ増加したタンパク質）が免疫反応と関連があることを具体的に確認した。
遺伝子オントロジーツールを用いて各クラスターに対する生物学的過程範ちゅうの機能的特性を調べた結果、クラスター２に属するタンパク質（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶグループでのみ増加したタンパク質）が免疫反応と関連があることを具体的に確認した。
【0182】
主成分分析
また、３個のＥＶサンプルセット間の固有な傾向を識別するための主成分分析（ＰＣＡ；ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、このようなタンパク質グループが培養条件（２Ｄ対３Ｄ培養）によってかなり異なることを示している（成分１：６１．６％）（図２０Ｂ）。ＴＧＦ－β３処理の有無の差も、前記主成分分析（ＰＣＡ）結果（成分２：２７．１％）に明確に反映されたが、培養方法と違い、有意な差はなかった。このＰＣＡ結果は、３Ｄ培養条件（ａ３Ｄ及びＴ－ａ３Ｄ）によるタンパク質体特性が、２Ｄ培養条件によるタンパク質体特性とかなり異なり、３Ｄ培養においてＴＧＦ－β３によるタンパク質体特性変化がそれほど大きくないことを示す。
また、３個のＥＶサンプルセット間の固有な傾向を識別するための主成分分析（ＰＣＡ；ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）は、このようなタンパク質グループが培養条件（２Ｄ対３Ｄ培養）によってかなり異なることを示している（成分１：６１．６％）（図２０Ｂ）。ＴＧＦ－β３処理の有無の差も、前記主成分分析（ＰＣＡ）結果（成分２：２７．１％）に明確に反映されたが、培養方法と違い、有意な差はなかった。このＰＣＡ結果は、３Ｄ培養条件（ａ３Ｄ及びＴ－ａ３Ｄ）によるタンパク質体特性が、２Ｄ培養条件によるタンパク質体特性とかなり異なり、３Ｄ培養においてＴＧＦ－β３によるタンパク質体特性変化がそれほど大きくないことを示す。
【0183】
二元比較
また、二元比較方式を用いてＤＥＰ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＤＲ ５％、ｌｏｇ２（ｒａｔｉｏ）３ｌ又は￡－１）を探そうとした（図２０Ｃ）。ＤＥＰは、有意に発現が高い又は低いタンパク質を分析したものである。ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶの火山プロットは、培養条件（２Ｄ及び３Ｄ）によって誘発されたＤＥＰの数が、３ＤにおいてＴＧＦ－β３処理によって誘発されたものに比べてより大きいことが見られた。また、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶの火山プロットは、ＴＧＦ－β３処理後にＴ－ａ３Ｄ－ＥＶグループにおいて５３個のタンパク質が上方調節されたが、１４個のタンパク質は下方調節されたことが見られた。
また、二元比較方式を用いてＤＥＰ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＦＤＲ ５％、ｌｏｇ２（ｒａｔｉｏ）３ｌ又は￡－１）を探そうとした（図２０Ｃ）。ＤＥＰは、有意に発現が高い又は低いタンパク質を分析したものである。ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶの火山プロットは、培養条件（２Ｄ及び３Ｄ）によって誘発されたＤＥＰの数が、３ＤにおいてＴＧＦ－β３処理によって誘発されたものに比べてより大きいことが見られた。また、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶの火山プロットは、ＴＧＦ－β３処理後にＴ－ａ３Ｄ－ＥＶグループにおいて５３個のタンパク質が上方調節されたが、１４個のタンパク質は下方調節されたことが見られた。
【0184】
８－２：各エクソソームから差別的に発現するタンパク質（ＤＥＰ）の機能的特性化
遺伝子セット濃縮分析
ＥＶタンパク質体データを用いてＥＶの機能的特徴を調べるために、まず、遺伝子セット濃縮分析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＧＳＥＡ）を行った。これは、経路又は遺伝子オントロジーのような生物学的特性を共有する一部タンパク質グループが統計的意味で表現され得るか否かを明らかにすることができる。２つの生物学的状態を把握し、発現特性の類似性を評価した。統計的に有意な発現パターンを有するタンパク質はクラスタリングされてよく、他のタンパク質はＧＳＥＡによって分離されてよい。この研究においてＧＳＥＡは代表的な経路又は遺伝子オントロジーを説明できる最先端のタンパク質下位集合を提示した。
遺伝子セット濃縮分析
ＥＶタンパク質体データを用いてＥＶの機能的特徴を調べるために、まず、遺伝子セット濃縮分析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＧＳＥＡ）を行った。これは、経路又は遺伝子オントロジーのような生物学的特性を共有する一部タンパク質グループが統計的意味で表現され得るか否かを明らかにすることができる。２つの生物学的状態を把握し、発現特性の類似性を評価した。統計的に有意な発現パターンを有するタンパク質はクラスタリングされてよく、他のタンパク質はＧＳＥＡによって分離されてよい。この研究においてＧＳＥＡは代表的な経路又は遺伝子オントロジーを説明できる最先端のタンパク質下位集合を提示した。
【0185】
Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶと他のサンプル間のＧＳＥＡ結果は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路（２４個タンパク質）とｉｎｔｅｇｒｉｎ１経路（１７個タンパク質）において差異を示した（図２１Ａ）。図２１Ａは、本分析における遺伝子セット濃縮分析結果であり、濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）、及びｐ値が提示されており、ＮＥＳが高くてｐ値が低いほど、有意な発見である可能性が大きい。この分析で濃縮された遺伝子グループを図２１Ｂに示した。
【0186】
これらの経路から確認された３０個のタンパク質のうち１１個のタンパク質が共通に参加するタンパク質として確認された。特に、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３及びＴＮＣタンパク質は、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶセットでのみ発現が増加した。また、ＰＩ３ＡＫＴ信号伝達経路又はｉｎｔｅｒｇｒｉｎ１経路でのみ発見されるタンパク質のうち、ＥＩＦ４Ｅ、ＨＳＰ９０ＡＢ１、ＨＳＰ９０Ｂ１、ＲＡＣ１、ＴＧＦ－β１及びＴＧＭ２は、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶでのみ発現が増加した（図２１Ｂ、図５Ｅ）。
【0187】
前記各エクソソームにおいて発現するるタンパク質の発現量を相対的濃度比で数値化し、下記の表３に示した。
【0188】
【表3】
【0189】
上記の表３に示すように、前記タンパク質はいずれも、２Ｄ－ＥＶ及びａ３Ｄ－ＥＶに比べて本発明のＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて顕著に高発現することが確認できる。
【0190】
このような結果から、本発明の方法で得たエクソソームが比較群のエクソソームと差別化した効能を有することが、上記のタンパク質発現の差異によるものであることが類推できる。
【0191】
Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ特異的タンパク質の同定
また、ＥＶタンパク質が受容細胞に伝達されたとき、各培養条件のＥＶにおいてＤＥＰの予想役目を分析しようと試みた。各培養条件で有意に変化するタンパク質グループを探すために、試料間の二元比較分析（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶ）を行い、ベンダイアグラムを生成した（図２１Ｃ）。この分析から、６８個のＤＥＰ（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶのＤＥＰ４０個、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ２８個）が、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／２Ｄ－ＥＶｓ比較においてＴＧＦ－β３処理と関連したＤＥＰとして選択可能であったし、ＴＧＦ－β３処理に特異的な５３個のＤＥＰが、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓのＤＥＰ２５個、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／２Ｄ－ＥＶｓとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ ２８個）から確認できる（図２１Ｂ）。したがって、２８個のタンパク質が細胞培養方法の影響を受けず、ＴＧＦ－β３と強く関連していると推測して遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析をすることにより、このタンパク質が小胞媒介輸送、細胞外流出及び免疫反応と関連があることを具体的に確認した。興味深く、この２８個のタンパク質のうちＣＡＰＺＡ１タンパク質を除く全てのタンパク質の発現がＴ－ａ３Ｄ－ＥＶセットにおいて増加した。ＥＶのタンパク質は受容体細胞に内在化した後、試験管内及び生体内で様々な経路を活性化することが知られている。
また、ＥＶタンパク質が受容細胞に伝達されたとき、各培養条件のＥＶにおいてＤＥＰの予想役目を分析しようと試みた。各培養条件で有意に変化するタンパク質グループを探すために、試料間の二元比較分析（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶ）を行い、ベンダイアグラムを生成した（図２１Ｃ）。この分析から、６８個のＤＥＰ（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶのＤＥＰ４０個、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ２８個）が、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／２Ｄ－ＥＶｓ比較においてＴＧＦ－β３処理と関連したＤＥＰとして選択可能であったし、ＴＧＦ－β３処理に特異的な５３個のＤＥＰが、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓのＤＥＰ２５個、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／２Ｄ－ＥＶｓとＴ－ａ３Ｄ－ＥＶｓ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ ２８個）から確認できる（図２１Ｂ）。したがって、２８個のタンパク質が細胞培養方法の影響を受けず、ＴＧＦ－β３と強く関連していると推測して遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析をすることにより、このタンパク質が小胞媒介輸送、細胞外流出及び免疫反応と関連があることを具体的に確認した。興味深く、この２８個のタンパク質のうちＣＡＰＺＡ１タンパク質を除く全てのタンパク質の発現がＴ－ａ３Ｄ－ＥＶセットにおいて増加した。ＥＶのタンパク質は受容体細胞に内在化した後、試験管内及び生体内で様々な経路を活性化することが知られている。
【0192】
ＨｕＲｉ（ヒト基準タンパク質相互作用マッピングプロジェクト）データベース分析
我らの重要なタンパク質と相互作用するタンパク質を同定し、受容細胞での役目と経路を予測するために、前記同定されたＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて特異的な特徴を有するタンパク質であるＤＥＰ２８ケに対して、ＨｕＲｉ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）データベースを用いて、ＤＥＰ間の相互作用を説明するネットワークモデル分析を行った。
我らの重要なタンパク質と相互作用するタンパク質を同定し、受容細胞での役目と経路を予測するために、前記同定されたＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて特異的な特徴を有するタンパク質であるＤＥＰ２８ケに対して、ＨｕＲｉ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ）データベースを用いて、ＤＥＰ間の相互作用を説明するネットワークモデル分析を行った。
【0193】
その結果、前記２８個のＤＥＰのうち５個のタンパク質（Ｓ１００Ａ１０、ＳＤＤＣＰ、ＡＣＴＧ１、ＧＩＰＣ１、及びＥＩＦ４Ｅ）が信頼点数３０．９で、Ｈｕｒｉデータベースの１１３個の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）とマップされた（図２１Ｄ）。相互作用体がある前記５個のＤＥＰに対する注釈データベース（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅ）（ＳｈｉｎｙＧＯ ｖ０．６１）検索結果から、受恵者細胞で活性化され得る様々な信号経路を具体的に確認した（図２１Ｄ）。前記信号経路のうち一つは、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶの強力な機能を支援するサイクリン依存性タンパク質キナーゼ活性の調節であった（図２１Ｅ）。また、本発明のＴ－ａ３Ｄ－ＥＶから観察されるＤＥＰのうちＳＤＣＢＰは、主に様々なタンパク質と相互作用するタンパク質であり、このタンパク質は、免疫調節、エクソソーム生合成、及び腫瘍形成に関与することが知られている。結論的に、前記Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶから発見された特定タンパク質は、動物及び細胞実験から確認された結果を裏付ける。
【0194】
以上に述べた好ましい実施例を挙げて本発明を説明してきたが、発明の要旨及び範囲から逸脱することなく様々な修正や変形を行うことが可能である。また、添付する特許請求の範囲は、本発明の要旨に属する上記の修正や変形も含む。
【図面の簡単な説明】
【0195】
【図2】各培養条件によるエクソソームの収率を示す図である。
【図3】ＴＧＦ－β処理によるＰＤＩ値の変化を示す図であり、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件では単一ピーク（ｏｎｅ ｐｅａｋ）が見られることを示す。
【図4】ＴＧＦ－βがＴ細胞増殖に及ぼす影響を示す図である。それぞれＰＨＡを用いてＰＢＭＣの増殖を誘発した後、陰性対照群（無処理群）、陽性対照群（ＭＳＣ処理群）、３Ｄ振盪培養条件のみを適用したエクソソーム（３Ｄ－ＥＶ）、３Ｄ振盪培養条件下でＴＧＦ－β３を培養液に添加して得られたエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）のＴ細胞抑制効果を確認した（図４Ａ）。その結果、ＴＧＦ－βを処理した３Ｄ振盪培養条件で得たエクソソーム（Ｔ－３Ｄ－ＥＶ）が最も顕著なＴ細胞抑制効果を有することが確認され（図４Ｂ及び図４Ｃ）、本発明の方法によって得られたエクソソームは、収率の他に機能も強化していることが見られた。
【図5】図５Ａは、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ，ＤＬＳ）分析によってエクソソームのサイズを調べた結果を示す図である。図５Ｂは、エクソソームの形態及び構造を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である。図５Ｃは、ＣＤ９、ＣＤ６３、Ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ－１及びＡｌｉｘの発現を確認するためのウェスタンブロッティング分析結果を示す。図５Ｄは、流細胞分析によってエクソソーム表面の免疫表現型分析を行った結果を示す。図５Ｅは、生産されたエクソソームのＴＧＦ－β１含有量を酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）によって確認した結果を示す。
【図6】トランスウェル移動分析によってヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）においてエクソソーム投与による細胞移動能力増加を確認した結果を示す写真であり（左側）、右側は、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて相対的な染色程度を数値化して表現したグラフである。
【図7】生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与して傷治癒能の経時変化を確認した結果を示す図である。図７Ａは、生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与した後、一定時間ごとに傷部位を撮影した写真である。図７Ｂは、図７Ａの傷部位のサイズを示すグラフである。
【図8】生検パンチで傷を生成した動物モデルにエクソソームを投与して時間経過による傷治癒能を確認しながら、傷誘発９日後に傷誘発部位の組織学的分析を行った結果である。
【図9】Ｒａｗ２６４．７細胞においてＬＰＳで誘導された炎症反応がエクソソームの投与によって有意に減少したことを確認した結果である。
【図10】ＬＰＳ及びエクソソームを共に投与して培養したＲａｗ２６４．７細胞の培養液の上澄液内で炎症性サイトカインであるＴＮＦ－α及びＩＬ－６の濃度が顕著に減少したことを確認した結果である。
【図11】ＬＰＳ毒素による内毒素血症マウスモデルにおいてエクソソーム投与によるＴＮＦ－α及びＩＬ－６減少効果を確認した結果を示す図である。
【図12】ＳＶ－ＨＵＣ－１（ヒト尿路上皮細胞）にエクソソームを濃度別に処理して細胞増殖を確認した結果を示す図である。図１２Ａは、ＳＶ－ＨＵＣ－１にエクソソームを濃度別に処理した後、細胞増殖率を示すグラフであり、図１２Ｂは、細胞増殖に関連したＰ－ＡＫＴとＰ－ＥＲＫの発現量を確認した結果である。
【図13】トランスウェル移動分析を用いて、ヒト尿路上皮細胞（ＳＶ－ＨＵＣ－１）においてエクソソーム投与による細胞移動能力増加を確認した結果を示す図である。図１３Ａは、クリスタルバイオレット（Ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）染色を用いて、トランスウェルの反対側に移動した細胞を視覚的に確認した写真である。図１３Ｂは、図１３ＡのＩｍａｇｅ Ｊを用いて示した相対的な細胞コンフルエンシーを示すグラフである。
【図14】間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルを製造し、エクソソーム投与による治療効果を評価するための試験デザイン概要図である。
【図15】間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与後に膀胱組織の形態及び炎症程度を確認した図である。図１５Ａは、ＩＣ／ＢＰＳマウスモデルの膀胱組織をＨ＆Ｅ染色した結果であり、図１５Ｂは、マッソントリクローム（ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色した結果であり、図１５Ｃは、トルイジンブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）染色した結果であり、図１５Ｄは、前記染色によって線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）程度と肥満細胞（Ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）の浸透を確認した結果を示すグラフである。
【図16】間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与後に抽出された膀胱組織からｍＲＮＡを抽出し、炎症関連サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ６）の発現量（図１６Ａ）、尿路上皮マーカー（ＵＰＫ１Ａ、ＵＰＫ１Ｂ、ＵＰＫ２）の発現量（図１６Ｂ）、及びＩＣ／ＢＰＳにおいて発現する遺伝子（ＫＬＲＢ１、ＰＳＭＢ９、ＩＴＧＡＬ）の発現量（図１６Ｃ）を確認した結果である。
【図17】間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与による膀胱内圧及び排尿周期の回復効果を確認した結果を示す図である。
【図18】間質性膀胱炎／膀胱疼痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）誘導マウスモデルにおいてエクソソーム投与による膀胱内圧及び排尿周期の回復効果を確認した結果を示す図である。
【図19】各エクソソームに含まれているタンパク質体分析結果を示す図である。図１９Ａは、各エクソソームに含まれているタンパク質を定量分析した結果である。図１９Ｂは、各エクソソームに含まれている総タンパク質の存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）分布を示すグラフである。図１９Ｃは、各エクソソームに対して遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行った結果である。図１９Ｄは、Ｖｅｓｉｃｌｅｐｅｄｉａに報告されたデータセットと本研究から発見されたＥＶタンパク質体とを比較した結果である。
【図20】図２０Ａは、クラスタリング分析によって導出された４個のクラスターのうち、本発明のエクソソームであるＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ試料において特異的に変化するタンパク質を示す図である。図２０Ｂは、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって各エクソソームグループ間の分離程度を識別指数（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）で示した結果を示す図である。図２０Ｃは、二元比較方式によって培養条件（２Ｄ及び３Ｄ）及びＴＧＦ－β３処理の有無によるＤＥＰ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）数を確認した結果を示す図である。
【図21】図２１Ａは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶのＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路及びｉｎｔｅｇｒｉｎ１経路での濃縮された遺伝子セット、標準化された濃縮点数（ＮＥＳ）及びｐ値をそれぞれ示す。図２１Ｂは、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）によって、濃縮された遺伝子グループをＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ信号伝達経路及びｉｎｔｅｇｒｉｎ１経路に分けて示す図である。図２１Ｃは、二元比較分析（Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ、及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶ）によって、各エクソソーム間の差別化したり共通するタンパク質の数を示すベンダイアグラムを生成し、このうち、Ｔ－ａ３Ｄ－ＥＶ／２Ｄ－ＥＶ及びＴ－ａ３Ｄ－ＥＶ／ａ３Ｄ－ＥＶｓ間に共通する領域のＤＥＰ２８の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析結果である。図２１Ｄは、本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶにおいて特異的な特徴を有するタンパク質である２８個のＤＥＰのうち５個のタンパク質（Ｓ１００Ａ１０、ＳＤＤＣＰ、ＡＣＴＧ１、ＧＩＰＣ１及びＥＩＦ４Ｅ）がＨｕｒｉデータベースの１１３個の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）と高い信頼点数でマップされた結果を示す図である。図２１Ｅは、本発明のエクソソームＴ－ａ３Ｄ－ＥＶの生物学的機能及びそのサイクリン依存性タンパク質キナーゼ活性調節関連特徴を示す図である。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図21D】
【図21E】
【配列表】
【国際調査報告】