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▶ プロバイレクス・ジェノーム・エディティング・セラピーズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】新規な単一ドメイン抗原結合分子およびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240628BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240628BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240628BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240628BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240628BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240628BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
A61P31/00
A61P29/00
A61P37/06
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 N
G01N33/531 A
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023581018
(86)(22)【出願日】2022-06-28
(85)【翻訳文提出日】2024-02-27
(86)【国際出願番号】 EP2022067773
(87)【国際公開番号】W WO2023275075
(87)【国際公開日】2023-01-05
(31)【優先権主張番号】21182579.9
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524003208
【氏名又は名称】プロバイレクス・ジェノーム・エディティング・セラピーズ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＶＩＲＥＸ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ＧｍｂＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】カイザー，フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】トレンクル，ビョルン
(72)【発明者】
【氏名】ロートバウアー，ウルリヒ
(72)【発明者】
【氏名】ソナニーニ，ドミニク
(72)【発明者】
【氏名】クナイリング，マンフレート
(72)【発明者】
【氏名】ピヒラー，ベルント
(72)【発明者】
【氏名】ベショルナー，ニクラス
(72)【発明者】
【氏名】ハマン，マルティン
(72)【発明者】
【氏名】ハウバー，ヨアヒム
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA15
4H045GA22
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、ヒトＣＤ４に対する新規な単一ドメイン抗体／ナノボディ、ならびにそれらの診断的／予防的、もしくは治療的使用または器具に関する。本発明のナノボディは、例えば、検出可能な標識、ウイルス粒子、または治療部分と合わせることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＣＤ４に結合するナノボディであって、ａ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＴＦＳＫＬ（配列番号１）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹＬＡ（配列番号２）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＲＥＤＰＰＧ（配列番号３）のアミノ酸配列；もしくは
ｂ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＤＶＤＹＹ（配列番号４）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＩＡＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤ（配列番号５）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＤＡＴＣＰＹＹＣＳＧＳＶＣＹＬＥＴＧＭＤ（配列番号６）のアミノ酸配列；もしくは
ｃ）（ｉ）ＣＤＲ１としてのＳＧＦＡＬＥＹＹ（配列番号７）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてのＭＳＡＳＧＧＶＩＮＹＳＥ（配列番号８）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてのＥＫＡＹＹＧＳＳＷＡＥＣＹＬＭＭＤ（配列番号９）のアミノ酸配列；もしくは
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）において定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列
またはそれぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかにおいて定義されるナノボディの機能保存的変異体
を含むナノボディ。
【請求項2】
ナノボディが、ヒトＣＤ４のドメインＤ１またはドメインＤ３に結合する、請求項１に記載のナノボディ。
【請求項3】
４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、３つの相補性決定領域は、（ｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つ、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含むアミノ酸配列
からなり、好ましくは、ナノボディは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６、配列番号１５７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６もしくは配列番号１５７のアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のナノボディ。
【請求項4】
ナノボディが、検出可能な標識、ウイルス粒子、および／または治療的もしくは薬理学的活性剤のうちの少なくとも１つと関連する、請求項１～３のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項5】
検出可能な標識が、免疫組織化学、光学的イメージング、近赤外イメージング（ＮＩＲ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための検出可能な部分およびトレーサーから選択され、好ましくは、検出可能な標識が、フルオロフォア、放射性核種または磁性粒子から選択される、請求項４に記載のナノボディ。
【請求項6】
ウイルス粒子が、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）粒子、アデノウイルス粒子、またはレンチウイルス粒子であり、好ましくは、ＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９粒子から選択される、請求項４に記載のナノボディ。
【請求項7】
治療的活性剤が活性遺伝子導入剤である、請求項４に記載のナノボディ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディをコードする核酸配列を含み、またはそれからなる核酸であって、別の核酸配列に連結されていてもよい核酸。
【請求項9】
診断方法もしくは予後方法において使用するため、または医薬として使用するため、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞機能および／または細胞枯渇を調節するための、請求項１～６のいずれか一項に記載のナノボディまたは請求項８に記載の核酸。
【請求項10】
インビボでの非侵襲的医学的イメージングにおける造影剤としての使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項11】
試料中のＣＤ４のインビトロ検出のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディ。
【請求項12】
ＡＡＶ、アデノウイルスもしくはレンチウイルスベクターの再標的化に使用するための、または遺伝子導入ベクターを再標的化するための、あるいはウイルス様粒子（ＶＬＰ）または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の標的化に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディまたは請求項８に記載の核酸。
【請求項13】
ナノボディまたはナノボディをコードする核酸が、ＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝子標識、好ましくはＡＡＣカプシドタンパク質ＶＰ１および／またはＶＰ２の遺伝子標識に使用される、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディまたは請求項８に記載の核酸。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのナノボディまたはその組み合わせを含む、バイパラトピックな二価または三価のコンストラクト。
【請求項15】
ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を含むことが疑われる生物学的試料中のＣＤ４＋細胞の存在および／または量および／または活性もしくは分化状態を決定および／または画像化および／またはモニタリングするための方法であって、ａ）前記試料を、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディのうちの少なくとも１つと、または請求項１４に記載の少なくとも１つのコンストラクトと、および適宜、検出可能な標識とコンジュゲートした少なくとも１つの第２の化合物と組み合わせる工程であって、第２の化合物が、ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の別のマーカーに結合する工程と、
ｂ）検出可能な標識を介して、前記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した前記ナノボディからのイメージングシグナル、および、第２の化合物が工程ａ）において追加的に使用された場合には、別のマーカーに結合した前記第２の化合物からのイメージングシグナルを測定する工程と、
ｃ）イメージングシグナルを介して、前記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の存在および／または量および／または活性をイメージングし、決定しおよび／またはモニタリングする工程と
を含み、決定および／またはモニタリングおよび／またはイメージングは、好ましくは、患者を層別化するため、および個別化された免疫療法中の個々の免疫応答をモニタリングするためである方法。
【請求項16】
診断剤としての、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディのうちの少なくとも１つ、または請求項１４に記載の少なくとも１つのコンストラクトの使用であって、好ましくは、診断剤が、患者の疾患関連免疫状態の診断分類、および患者の免疫療法に対する感受性から選択される診断に使用される、使用。
【請求項17】
患者の免疫状態および／または免疫療法に対する感受性を診断および／またはモニタリングするための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の少なくとも１つのナノボディ、または請求項１４に記載の少なくとも１つのコンストラクトが、患者の生物学的試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞を評価および／またはモニタリングするために使用され、ナノボディが、単独でまたはＴ細胞特異的マーカーに結合する第２の化合物と組み合わせて使用され、Ｔ細胞特異的マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＸＣＲ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ（同義語ＣＤ１５４）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７８、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＳＩＧＬＥＣ－９、ＢＴＬＡ（同義語：ＣＤ２７２）、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（同義語：ＶＴＣＮ１）、ＣＤ２７６（同義語：Ｂ７－Ｈ３）、Ａ２ＡＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ－３、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒのうちの少なくとも１つから選択される、方法。
【請求項18】
薬学的に許容される担体または賦形剤と関連して、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノボディのうちの少なくとも１つ、および／または請求項１４に記載の少なくとも１つのコンストラクトを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトＣＤ４に結合する、ナノボディとしても公知である、新規な単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ならびにこのようなナノボディの使用、特に予防、治療、診断または細胞標的化目的に関する。
【0002】
本発明はまた、１つ以上のこのようなナノボディを含むかまたはそれから本質的になるポリペプチドに関する。本発明はまた、このようなナノボディおよびポリペプチドをコードする核酸、このようなナノボディまたはポリペプチドを含む組成物、ならびにこのようなポリペプチド、核酸および組成物の使用、特に予防、治療、診断または細胞標的化目的に関する。
【背景技術】
【0003】
現在、感染症、免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）、自己免疫疾患およびがんの処置のための免疫療法の重要性が増加しており、したがって、異なる免疫細胞集団の分布および浸潤を検出し、モニタリングするための新規で信頼できるプローブが緊急に必要とされている。
【0004】
精密医療では、疾患に関連した免疫状態の診断分類が適切な治療法の選択の指針となるべきである。患者の特異的な免疫細胞組成、活性化状態、および罹患組織の浸潤の包括的分析は、患者の層別化に非常に有益であることが示されている。免疫療法を行う場合、反応者と非反応者の予測、および治療効果のモニタリング、症状発現前でも重篤な有害事象の検出が可能となる。
【0005】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、自己免疫疾患、炎症、がん、および慢性ウイルス感染におけるＴ細胞媒介遅延型過敏反応における免疫応答を調整する上で重要な役割を果たすため、免疫状態の重要な決定因子である。
【0006】
ＣＤ４（表面抗原分類４）は、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの免疫細胞の表面にみられる糖タンパク質である。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ヒトの免疫系に不可欠な白血球である。それらはしばしばＣＤ４＋細胞、ヘルパーＴ細胞、またはＴ４細胞と呼ばれ；それらの主な役割は、ＣＤ８＋キラー細胞を含む他のタイプの免疫細胞にシグナルを送ることであり、次にこの免疫細胞が感染性粒子を破壊する。
【0007】
ＣＤ４は、４つのＮ末端Ｎ－免疫グロブリン（Ｉｇ）様細胞外ドメインからなる単量体Ｉ型膜貫通糖タンパク質であり、短い柄によってＣ末端膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインに接続されている。ドメインＤ１およびＤ３はＩｇ可変ドメインに似ており、ドメインＤ２およびＤ４はＩｇ定常ドメインに似ている。ドメインＤ１は、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と相互作用する。ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞と相互作用するのを助ける。ＣＤ４の細胞質Ｃ末端尾部は、シグナル伝達経路の分子成分を活性化するチロシンキナーゼＬｃｋと相互作用する。
【0008】
ＣＤ４はＭＨＣクラスＩＩに結合するが、これまでに特徴付けられた他のすべての白血球細胞－細胞認識分子と比較して、非常に低い親和性を示す。
【0009】
したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞の動的分布の詳細なモニタリングは、コンパニオン診断に大いに関係する。現在、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在、活性化および分化状態は、患者の末梢血中で評価およびモニタリングすることができる。腫瘍または免疫介在性炎症性疾患（ＩＭＩＤ）の生検からのより包括的な診断手段は、細胞質内フローサイトメトリー分析（ＩＣ－ＦＡＣＳ）、飛行時間によるサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、免疫組織化学およびエクスビボサイトカインアッセイ、またはＲＴ－ＰＣＲ分析を含む一連の方法によって可能となる。がんの不均一性およびＩＭＩＤにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤の不均一性のために、生検は非常に小さな領域に関する非常に変動性が高い情報を提供し、したがって、総ＣＤ４＋Ｔ細胞浸潤を推定するのに不適格である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
浸潤リンパ球の新たな役割および免疫療法の転帰に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の影響を考慮すると、全腫瘍、全転移、またはＩＭＩＤの罹患組織にわたって、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および他のＣＤ４発現細胞を評価するための新規の包括的アプローチが必要である。
【0011】
上述の観点から、本発明の目的は、ＣＤ４＋細胞を同定するかまたは標的化するための新規ツールを提供すること、ならびにＣＤ４＋細胞を同定するかまたは標的化するツールの治療的、診断的または予防的使用を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、ヒトＣＤ４に結合するナノボディ（または単一ドメイン－抗体）を提供し、ナノボディは、
ａ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＴＦＳＫＬ（配列番号１）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹＬＡ（配列番号２）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＲＥＤＰＰＧ（配列番号３）のアミノ酸配列；もしくは
ｂ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＤＶＤＹＹ（配列番号４）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＩＡＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤ（配列番号５）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＤＡＴＣＰＹＹＣＳＧＳＶＣＹＬＥＴＧＭＤ（配列番号６）のアミノ酸配列；もしくは
ｃ）（ｉ）ＣＤＲ１としてのＳＧＦＡＬＥＹＹ（配列番号７）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてのＭＳＡＳＧＧＶＩＮＹＳＥ（配列番号８）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてのＥＫＡＹＹＧＳＳＷＡＥＣＹＬＭＭＤ（配列番号９）のアミノ酸配列；もしくは
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）において定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列
またはそれぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかにおいて定義されるナノボディの機能保存的変異体
を含む。
ａ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＴＦＳＫＬ（配列番号１）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹＬＡ（配列番号２）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＲＥＤＰＰＧ（配列番号３）のアミノ酸配列；もしくは
ｂ）（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＤＶＤＹＹ（配列番号４）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＩＡＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤ（配列番号５）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＤＡＴＣＰＹＹＣＳＧＳＶＣＹＬＥＴＧＭＤ（配列番号６）のアミノ酸配列；もしくは
ｃ）（ｉ）ＣＤＲ１としてのＳＧＦＡＬＥＹＹ（配列番号７）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてのＭＳＡＳＧＧＶＩＮＹＳＥ（配列番号８）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてのＥＫＡＹＹＧＳＳＷＡＥＣＹＬＭＭＤ（配列番号９）のアミノ酸配列；もしくは
ｄ）ａ）、ｂ）、またはｃ）において定義されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列
またはそれぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含む、ａ）、ｂ）またはｃ）のいずれかにおいて定義されるナノボディの機能保存的変異体
を含む。
【0013】
本発明の新規な単一ドメイン抗体（またはナノボディ）は、種々のＣＤ４＋細胞上のその天然状態でヒトＣＤ４受容体を特異的に認識する。本明細書に開示される新規なナノボディを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのＣＤ４＋細胞を選択的に同定するかまたは標的化することが可能であり、それらは、単独で、または追加の物質／分子もしくは方法との組み合わせ／関連（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ／ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）において、診断、予防および治療において貴重なツールとなる。
【0014】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、特異的抗原に選択的に結合することができる単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。単一ドメイン抗体として、本発明のナノボディは、従来の抗体（ＩｇＧ）に対する優れた代替物を表す：ラマなどのラクダ由来の抗体は、軽鎖を欠く重鎖ホモ二量体からなる免疫グロブリンの固有のサブセットを含む。それらの可変領域（ＶＨＨ）は抗体界で見られる最小の抗原結合断片であり、単一ポリペプチド鎖としてタンパク質工学に特に適している。単一ドメイン抗体、または「ナノボディ」は、これらの重鎖抗体のＶＨＨ領域に由来する組換え最小サイズの無傷抗原結合ドメインである。モノクローナル抗体とは異なり、単純な細菌発現系で容易に大量に産生される。さらに、ナノボディは、通常、非常に安定であり、ナノモル範囲で親和性を有する抗原と結合することができ、より小さいサイズ（およそ１５ｋＤａ）であり、それにより、従来のＩｇＧの重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む一本鎖可変断片（ＳｃＦｖｓ）などの抗体断片と比較して、遺伝的に操作しやすい。
【0015】
また、小さなサイズおよびコンパクトな折り畳みナノボディのために、高い化学的安定性、溶解性および速い組織浸透を示す。さらに、ナノボディは、バイパラトピック、二価、三価、四価または他の多特異的コンストラクトなどの多価フォーマットに容易に変換することができ、例えば、同一抗原上の異なるエピトープに対処することができ、本明細書に提示されるナノボディはまた本発明に従って使用することができる。また、ナノボディは、同等の抗原特異性および親和性を有し、ヒト抗体（ＶＨ）断片とのそれらの高い相同性のため、非常に低い免疫原性しか示さない。
【0016】
一実施形態によれば、本発明のナノボディは、ヒトＣＤ４のドメインＤ１またはドメインＤ３に結合する。
【0017】
また、好ましい実施形態では、本発明のナノボディは、ヒトＣＤ４のドメインＤ１に特異的に結合するナノボディから選択され、好ましくは、ナノボディは、ＣＤＲ１としてＳＧＦＴＦＳＫＬ（配列番号１）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹＬＡ（配列番号２）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＲＥＤＰＰＧ（配列番号３）のアミノ酸配列；もしくは（ｉ）ＣＤＲ１としてのＳＧＦＡＬＥＹＹ（配列番号７）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてのＭＳＡＳＧＧＶＩＮＹＳＥ（配列番号８）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてのＥＫＡＹＹＧＳＳＷＡＥＣＹＬＭＭＤ（配列番号９）のアミノ酸配列；または配列、それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含むこれらのナノボディの機能保存的変異体；あるいは上記のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列；または配列、それぞれ、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含む、上記で定義されるナノボディの機能保存的変異体を含む。
【0018】
上記のナノボディは、ＣＤ４の同じドメイン、すなわちドメインＤ１に結合するが、ＣＤ４のドメイン１の異なるエピトープに結合する。
【0019】
一実施形態では、ナノボディは、ＣＤ４のドメインＤ３に結合し、（ｉ）ＣＤＲ１としてＳＧＦＤＶＤＹＹ（配列番号４）、（ｉｉ）ＣＤＲ２としてアミノ酸配列ＩＡＳＳＤＧＳＴＹＹＡＤ（配列番号５）、および（ｉｉｉ）ＣＤＲ３としてＤＡＴＣＰＹＹＣＳＧＳＶＣＹＬＥＴＧＭＤ（配列番号６）のアミノ酸配列；または上記のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、または配列、それぞれ配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６のうちの１つ、２つ、もしくは３つの配列における１つもしくは２つのアミノ酸の保存的置換を含む上記で定義されるナノボディの機能保存的変異体を含む。
【0020】
ＣＤ４のドメインＤ１は、長さが１００アミノ酸であり、アミノ酸位置２６～１２５を含むように指定され、一方、ドメインＤ３は長さが１１４アミノ酸であり、アミノ酸位置２０４～３１７を含むように指定される。
【0021】
好ましい実施形態によれば、本発明のナノボディは、アミノ酸Ｔｈｒ １７とＬｙｓ ７５の間のヒトＣＤ４のドメインＤ１、またはアミノ酸Ｔｈｒ １７とＧｌｕ ９１の間のヒトＣＤ４のドメイン１に結合し、したがって、本発明のナノボディはまた、それぞれの領域において結合し、本明細書において定義されるアミノ酸構造を含むナノボディである。
【0022】
さらに、好ましい実施形態によれば、本発明のナノボディは、４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）を含み、３つの相補性決定領域は、
（ｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つ、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含むアミノ酸配列
からなり、好ましくは、ナノボディは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６、配列番号１５７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６もしくは配列番号１５７のアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つ、または
（ｉｉ）アミノ酸配列ａ）～ｃ）のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３；もしくは配列番号４、配列番号５、および配列番号６；もしくは配列番号７、配列番号８、および配列番号９のうちの１つ、２つまたは３つの配列における１つまたは２つのアミノ酸の保存的置換を含むアミノ酸配列
からなり、好ましくは、ナノボディは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６、配列番号１５７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１５６もしくは配列番号１５７のアミノ酸配列のうちの１つと少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0023】
本発明の好ましい実施形態によれば、ナノボディは、本発明のナノボディのヒト化変異体である。
【0024】
本発明の別の好ましい実施形態において、ナノボディは、リジン残基がアルギニンと交換されている本発明のナノボディのヒト化変異体である。
【0025】
好ましい実施形態によれば、ナノボディは、配列番号１０を有するナノボディのヒト化変異体であり、すべてのリジン残基がアルギニンと交換されており；好ましくは、このナノボディは配列番号１５７を有する。
【0026】
本発明において、本発明のナノボディは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でのＴ細胞増殖またはサイトカイン発現に影響しないことが示されている。
【0027】
また、本発明のナノボディを標識することにより、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において、例えば、マウス異種移植片またはノックインモデルにおいて、ＣＤ４＋細胞の存在および位置を追跡することが可能であった／可能である。
【0028】
本発明のナノボディを用いて、マウスの光学的または分子的イメージングにおいて高いシグナル対ノイズ比を実証することも可能であった。
【0029】
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、物品の文法的対象物の１つまたは１を超える（例えば、少なくとも１つ）を指す。
【0030】
用語「または」とは、本明細書において、文脈上別の意味が明確に示されない限り、用語「および／または」を意味するために使用され、それと互換的に使用される。
【0031】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、ならびに用語「ナノボディ」および「単一ドメイン抗体」も同様である。
【0032】
「約」および「およそ」とは、一般に、測定の性質または精度を与えられて測定された量についての許容可能な誤差の程度を意味するものとする。誤差の例示的な程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、典型的には、１０％以内であり、より典型的には５％以内である。
【0033】
本発明の方法および組成物は、特定された配列を有するポリペプチドおよび核酸、またはそれらと実質的に同一もしくは類似の配列、例えば、特定された配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％同一またはそれより高い配列を有するポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列との関連において、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することができるように、第２のアミノ酸配列における整列されたアミノ酸残基とｉ）同一であるか、またｉｉ）その保存的置換である、十分な数または最小数のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸を指すために使用される。例えば、参照配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列。他の実施形態では、アミノ酸配列は、参照配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性パーセンテージを達成するために、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換（例えば、保存的置換）を含有することができる。ヌクレオチド配列との関連において、用語「実質的に同一の」は、本明細書において、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列が共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造的ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列において整列したヌクレオチドと同一である、十分な数または最小数のヌクレオチドを含有する第１の核酸配列を指すために使用される。例えば、参照配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【0034】
本明細書で使用される本発明のナノボディの「機能保存的変異体」とは、抗原親和性および／または抗原特異性などの所望の特性を変化させることなく、１つ以上のアミノ酸残基が修飾されているナノボディまたは断片を意味する。このような変異体には、限定されないが、類似の特性を有するアミノ酸で置換された特定のアミノ酸が含まれる。例えば、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。このような保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）～（ｅ）の別のアミノ酸残基によって置換される：（ａ）小さな脂肪族、非極性または弱極性残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、（ｂ）極性、負に荷電した残基、およびそれらの（荷電していない）アミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）、（ｃ）極性、正に荷電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、（Ｄ）大きな脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、および（ｅ）芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【0035】
特に好ましい保存的置換は、ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒ、ＡｒｇからＬｙｓ、ＡｓｎからＧｌｎもしくはＨｉｓ、ＡｓｐからＧｌｕ、ＣｙｓからＳｅｒ、ＧｌｎからＡｓｎ、ＧｌｕからＡｓｐ、ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏ、ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎ、ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌ、ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌ、ＬｙｓからＡｒｇもしくはＧｌｎもしくはＧｌｕ、ＭｅｔからＬｅｕもしくはＴｙｒもしくはＩｌｅ、ＰｈｅからＭｅｔもしくはＬｅｕもしくはＴｙｒ、ＳｅｒからＴｈｒ、ＴｈｒからＳｅｒ、ＴｒｐからＴｙｒ、ＴｙｒからＴｒｐ、および／またはＰｈｅからＶａｌもしくはＩｌｅもしくはＬｅｕであり、特に好ましい置換はＬｙｓからＡｒｇである。
【0036】
好ましい実施形態は、配列番号１０におけるすべてのＬｙｓ（リジン）残基のＡｒｇ（アルギニン）への置換であり、以下の配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＲＬＡＭＳＷＨＲＥＰ ＰＧＲＧＲＥＷＬＡＤ ＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹ ＬＡＳＶＲＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹ ＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤ ＴＧＶＹＹＣＡＳＲＥ ＤＰＰＧＹＷＧＱＧＴ ＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５６）をもたらす。
【0037】
好ましい実施形態では、ナノボディは、配列番号１０を有するナノボディのヒト化変異体であり、すべてのリジン残基がアルギニンと交換されており、好ましくは、このナノボディは、配列ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＬＡＭＳＷＨＲＱＰ ＰＧＲＧＲＥＷＬＡＤ ＩＤＳＳＧＳＴＴＤＹ ＬＡＳＶＲＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＲＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＴＥＤ ＴＧＶＹＹＣＡＳＲＥ ＤＰＰＧＹＷＧＱＧＴ ＴＶＴＶＳＳ（配列番号１５７）を有する。
【0038】
ナノボディのアミノ酸配列および構造は、３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって中断される４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」を含むと考えられ得るが、これらに限定されない。
ナノボディ内のアミノ酸残基の総数は、１１０～１３０の範囲であり得る。
ナノボディ内のアミノ酸残基の総数は、１１０～１３０の範囲であり得る。
【0039】
したがって、本発明の一態様によれば、ＣＤ４特異的ナノボディは、ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の検出およびインビボイメージングのために使用され、例えば、患者の層別化のための免疫－ＰＥＴのため、および個別化された免疫療法中の個人の免疫応答のモニタリングのための汎用性のあるプローブのみならず、例えば、遺伝子治療における細胞標的化のための治療的または医薬的使用のための貴重なツールとなる。
【0040】
本発明の１つの態様によれば、本発明のナノボディは、検出可能な標識、ウイルス粒子、および／または治療的もしくは薬理学的に活性な薬剤のうちの少なくとも１つと合わされている。
【0041】
本発明のナノボディに関連して使用される場合、用語「と合わされる」とは、診断部分／薬剤として、または治療的もしくは薬理学的に活性な部分もしくは薬剤として使用される／使用され得る別の部分によるナノボディの任意の修飾を指す。修飾により、薬剤または部分（ナノボディがそれと合わされる）は、間接的または直接的にナノボディに結合しているか、またはナノボディに組み込まれている。
【0042】
例えば、このような修飾は、検出可能な標識、ウイルス粒子、および／または治療的もしくは薬理学的に活性な薬剤であり得、および／または、例えば、ナノボディの半減期、溶解性および／または吸収を変更し／増加させ、ナノボディの免疫原性および／または毒性を減少させ、ナノボディの任意の望ましくない副作用を除去または減弱させ、および／またはナノボディに他の有利な特性を付与し、および／またはナノボディの望ましくない特性を減少させる、１つ以上の官能基または薬剤もしくは部分；あるいは前述の２つの組み合わせの（例えば、コンジュゲーション、生物学的もしくは化学的結合、共有結合による、または任意の他の適切な方法での）導入を含み得る。このような官能基の例、およびそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであり、一般に、上記で引用した一般的背景技術に記載されたすべての官能基および技術、ならびに医薬タンパク質の修飾、特に抗体または抗体断片の修飾のための、それ自体が公知である官能基および技術を含むことができる。このような官能基は、また当業者に明らかであるように、例えば、本発明において使用されるナノボディに直接的（例えば、共有結合的）に、または適宜、適切なリンカーもしくはスペーサーを介して連結され得る。
【0043】
本明細書で使用される場合、ナノボディ／コンストラクトとの関連において使用される場合の用語「標識」、「マーカー」およびそれらの変異体とは、化合物の検出を容易にするために、本明細書に開示されるナノボディまたはコンストラクトに直接的もしくは間接的に連結され、合わされまたはコンジュゲートされる検出可能な化合物、組成物または分子を指す。当該技術分野において公知である標識の非限定的な例としては、蛍光タグ、酵素リンケージ、および放射性同位体が挙げられる。１つの例において、「標識されたナノボディ」とは、検出可能な化合物、組成物または分子のナノボディへの直接的または間接的なコンジュゲーションを指す。さらにまたは代替として、検出可能な化合物、組成物または分子は、直接的または間接的なコンジュゲーション以外の手段によってナノボディ構造内に組み込むことができる。このような組み込みの例示的な方法は、ナノボディのアミノ酸残基を、それが検出可能になるように（例えば、放射性標識により）修飾されたアミノ酸残基で置換することである。標識は、直接的に検出可能であり得るか、またはさらなる化合物、組成物もしくは分子との接触後にのみ検出可能であり得る。１つの非限定的な例では、標識は、当該技術分野において公知である方法に従って直接的に検出可能な放射性標識されたアミノ酸の組み込みであり得る。さらなるまたは代替の非限定的な例では、標識は、印を付けられたアビジン（例えば、当該技術分野において公知である光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）との接触後に検出可能である、ビオチニル部分のナノボディへの付着であり得る。タンパク質を標識する種々の方法が当該技術分野において公知であり、使用することができる。ポリペプチドのための標識の例としては、限定されないが、以下：放射性同位体もしくは放射性核種（例えば、３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ＴＣ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎおよび１２５Ｉ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、または磁性剤（例えば、ガドリニウムキレート）が挙げられる。一部の実施形態では、標識は、本明細書に開示されるナノボディまたはコンストラクトの結合のための潜在的立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【0044】
本発明のナノボディを標識するために、この分野において公知である任意の方法を適用することができる。一般に、例えば陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）用に本発明のナノボディを標識するために、ＰＥＴトレーサーは、ナノボディ内に位置する、反応性ユニット（例えば、第一級アミノ基、ＤＢＣＯと組み合わせたアジド基、Ｃ末端システイン、Ｈｉｓ６－タグ）を介してキレート剤（例えば、ＮＯＤＡＧＡ）またはクリック試薬にカップリングされ、次に、それを介して放射性核種が導入される。
【0045】
「治療的または薬理学的に活性な薬剤」は、治療的処置を必要とする患者において治療効果、すなわち有益な治療効果をもたらす任意の治療的に活性な薬剤を含み得る。薬剤の非限定的な例としては、例えば、サイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、細胞毒性剤、および細胞増殖抑制剤が挙げられる。
【0046】
本発明の一態様によれば、検出可能な標識は、免疫組織化学、光学的イメージング、近赤外線イメージング（ＮＩＲ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための検出可能な部分およびトレーサーから選択され、好ましくは、検出可能な標識は、フルオロフォア、放射性核種または磁性粒子から選択される。
【0047】
検出可能な標識または「造影剤」で修飾された本発明のナノボディを用いて、細胞を画像化するための異なるアプローチを行うことができる。
【0048】
非侵襲的イメージングアプローチは、現在の診断基準と比較して大きな利益を提供する。今日まで、放射性標識された抗体は、前臨床モデルにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞を画像化するために適用されている。新生児Ｆｃ受容体によって仲介されるリサイクル効果のために、全長抗体は、高コントラスト画像が獲得され得る前に長いクリアランス時間（数日間）を必要とする、長い血清半減期（約１～３週間）を有する。さらに、Ｆｃ領域を介したエフェクター機能は、増殖またはサイトカイン放出の誘導を含むＣＤ４＋細胞の枯渇または機能的変化を誘導することが示された。本明細書に提示されるＣＤ４－ナノボディを用いて、これらの欠点および不利益をすべて克服することができる。
【0049】
本発明の別の態様によれば、ナノボディは、ウイルス粒子と合わされており、ウイルス粒子は、アデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）粒子、アデノウイルス粒子、またはレンチウイルス粒子であり、好ましくは、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９粒子から選択される。
【0050】
したがって、別の好ましい実施形態では、本発明のナノボディは、治療活性剤と合わされており、治療活性剤は活性遺伝子導入剤である。
【0051】
本発明において、上記で指示されるウイルス粒子と合わされている本発明のナノボディは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を標的化するために効率的に使用することができ、例えば、遺伝子治療、好ましくは疾患関連末梢血ＣＤ４＋白血球の遺伝子治療に使用することができることが示されている。
【0052】
遺伝子導入剤は、臨床医が、目的とする治療に関連する核酸配列（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、直接患者（インビボ遺伝子治療）に、または患者もしくはドナーから単離された細胞（エクスビボ遺伝子治療）に導入することを可能にする。遺伝子治療後に形質導入細胞によって産生される治療導入遺伝子（ナノボディを含むポリペプチドをコードする）は、直接投与されるタンパク質と比較して、対象において比較的一定のレベルに維持され得る。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型に依存して、一過性（数時間から数週間のオーダーで）であり得るか、または持続性（数週間から数か月またはそれ以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、インテグレーティングまたは非インテグレーティングの線状コンストラクト、環状プラスミド、ウイルスベクターとして導入することができる。さらに、これらの導入遺伝子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）または化学的ナノ粒子担体（例えば、脂質ナノ粒子；ＬＮＰ）によって導入することができる。
【0053】
本発明はまた、本発明のナノボディをコードする核酸配列を含むかまたはそれからなり、別の核酸配列に連結されていてもよい核酸に関する。
【0054】
本発明はまた、本明細書に記載されるナノボディのフレームワーク領域１、ＣＤＲ１、フレームワーク領域２、ＣＤＲ２、フレームワーク領域３、ＣＤＲ３およびフレームワーク領域４を含むアミノ酸配列をコードする核酸、ならびに本明細書に記載される少なくとも１つのナノボディを含むポリペプチドに関する。
【0055】
本明細書に記載される態様のいくつかにおいて、本発明のナノボディをコードする核酸配列、またはそれらの任意のモジュールは、ベクターに作動可能に連結される。一般に、本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど、適切な制御因子が付随する場合に複製が可能であり、遺伝子配列を細胞に伝達することができる任意の遺伝因子を指す。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体、ならびにウイルスベクターを含む。「組換えベクター」とは、インビボで発現することができる異種核酸配列、または「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。本発明のナノボディをコードする配列またはその成分のデリバリーに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織におけるナノボディまたはその成分の発現に十分な１つ以上の調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含むことができる。
【0056】
一実施形態では、本発明のナノボディは、診断方法もしくは予後方法における使用のため、または医薬としての使用のため、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞機能および／もしくは細胞枯渇の調節のため、またはインビボでの非侵襲的医学的イメージングにおける造影剤としての使用のためである。
【0057】
「診断方法」または「診断」とは、ここでは、個人が病理学または特定の状態、例えば、処置状態、または疾患状態に苦しんでいるかどうかを決定する可能性を与える方法を意味する。
【0058】
「予後方法」または「予後」とは、ここでは、個人が病理を発症するリスクがあるかどうかを決定する可能性を与える方法を意味する。
【0059】
好ましくは、本発明の一実施形態では、上述のナノボディは、異なる生物組織または体液中のＣＤ４＋Ｔ細胞の浸潤の診断に使用される。
【0060】
「医薬としての使用」または薬剤とは、ナノボディの医薬または薬剤としての一般的な使用、すなわち、疾患を治療するためのものを意味する。使用は、本発明の治療有効量のナノボディまたはコンストラクトを、それを必要とする患者に投与することを含む処置方法を含むことができる。
【0061】
本発明のナノボディを用いて治療的に処置および／またはモニタリングすることができる疾患または状態は、がん、ウイルス感染、自己免疫疾患、関節リウマチ、大腸炎、同種幹細胞移植、臓器移植拒絶反応、後天性免疫不全疾患から選択される。
【0062】
例えば、本発明のナノボディまたはコンストラクトは、ＣＤ４機能、または、例えば、自己免疫疾患またはがんの処置に使用することができるＭＨＣＩＩへのその結合をブロックするために使用することができる。
【0063】
以下により詳細に記載するように、本発明のナノボディは、例えば、経口的に、吸入により、適切な形態で非経口経路を介して投与することができる。非経口経路が意図される場合、ナノボディは、注射可能な溶質およびアンプルまたはフラスコにパッケージされた懸濁液の形態であり得る。非経口投与のための形態は、通常、ナノボディを緩衝剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、等張剤および懸濁剤と混合することによって得られる。公知の技術によれば、これらの混合物は、次に、滅菌され、その後、静脈注射の形態でパッケージされる。投与されるナノボディまたはコンストラクトの量は、投与方法、患者の大きさおよび／または体重、およびそれに関連し得る治療活性剤の性質に自然に依存する。
【0064】
本発明の一実施形態では、ナノボディは、試料中のＣＤ４のインビトロ検出に使用される。
【0065】
一実施形態では、本発明のナノボディ、または本発明の核酸は、ＡＡＶ、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターの再標的化に使用するため、または遺伝子導入ベクターを再標的化するため、またはウイルス様粒子もしくは脂質ナノ粒子の標的化に使用するためのものである。
【0066】
本発明のナノボディを用いて、ＡＡＶ、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターをＣＤ４＋細胞、特にＣＤ４＋Ｔ細胞に対して再方向付けすることができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）では、ウイルスカプシド、とりわけウイルス指向性が定義される。現在、霊長類では、１３のＡＡＶ血清型が同定されており、それらが感染する組織および細胞が異なるが、血清型は通常、かなり広範な組織特異性を示す。例えば、遺伝子導入のために最もよく研究されている血清型であるＡＡＶ２は、多数の細胞型および組織に感染する広範な指向性によって特徴付けされる。また、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を特異的であり、効率的に形質導入するためのすべてのＡＡＶ血清型の欠損は、特にヒト血液リンパ球細胞への直接なインビボ遺伝子導入が必要な場合、かなりの技術的障害を表す。この欠点はここで対処され、ＣＤ４を発現するこれらの細胞を直接標的化することができる本発明のナノボディによって克服することができる。
【0067】
一実施形態では、本発明のナノボディ、またはナノボディをコードする核酸は、ＡＡＶカプシドタンパク質の遺伝的標識、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１および／またはＶＰ２の遺伝的標識に使用される。
【0068】
本発明のナノボディを用いると、例えば、ヒトＣＤ４＋細胞のＡＡＶベクター形質導入は、例えば、組換え酵素またはヌクレアーゼを導入することができる手段として、初代ヒトＴリンパ球を含めて改善することができる。
【0069】
別の態様によれば、本発明はまた、本発明の少なくとも１つのナノボディを含む、マルチパラトピック、好ましくはバイパラトピック、多価、好ましくは二価もしくは三価のコンストラクト、またはそれらの組み合わせに関する。
【0070】
本明細書で使用され、一般に理解される「マルチパラトピックコンストラクト」とは、１つの抗原上の２つ以上の異なるエピトープ、例えば、２つ（＝バイパラトピック）または３つ（＝トリパラトピック）に結合するポリペプチドコンストラクトを指す。したがって、本発明はまた、本発明のナノボディの少なくとも２つの結合配列を含むコンストラクトを含む。
【0071】
一方、「多価コンストラクト」は、少なくとも２つの抗原結合部位／結合単位を有するコンストラクトである。一部の実施形態では、多価コンストラクトは、二価コンストラクト、三価コンストラクトまたは四価コンストラクトである。
【0072】
本発明はまた、ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞を含むことが疑われる生物学的試料中のＣＤ４＋細胞の存在および／または量および／または活性もしくは分化状態を決定および／または画像化および／またはモニタリングする方法に関し、該方法は、
ａ）上記試料を、本発明の少なくとも１つのナノボディ、または本発明の少なくとも１つのコンストラクトと、適宜、検出可能な標識とコンジュゲートした少なくとも１つの第２の化合物と組み合わせる工程であって、第２の化合物が、ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の別のマーカーに結合する工程と、
ｂ）検出可能な標識を介して、前記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した前記ナノボディからのイメージングシグナル、および、第２の化合物が工程ａ）において追加的に使用された場合には、別のマーカーに結合した前記第２の化合物からのイメージングシグナルを測定する工程と、
ｃ）イメージングシグナルを介して、上記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の存在および／または量および／または活性を画像化し、決定しおよび／またはモニタリングする工程と
を含み、決定および／またはモニタリングおよび／または画像化は、好ましくは、患者を層別化するため、および個別化された免疫療法中の個々の免疫応答をモニタリングするためである。
ａ）上記試料を、本発明の少なくとも１つのナノボディ、または本発明の少なくとも１つのコンストラクトと、適宜、検出可能な標識とコンジュゲートした少なくとも１つの第２の化合物と組み合わせる工程であって、第２の化合物が、ＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の別のマーカーに結合する工程と、
ｂ）検出可能な標識を介して、前記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞に結合した前記ナノボディからのイメージングシグナル、および、第２の化合物が工程ａ）において追加的に使用された場合には、別のマーカーに結合した前記第２の化合物からのイメージングシグナルを測定する工程と、
ｃ）イメージングシグナルを介して、上記試料中のＣＤ４＋細胞、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞の存在および／または量および／または活性を画像化し、決定しおよび／またはモニタリングする工程と
を含み、決定および／またはモニタリングおよび／または画像化は、好ましくは、患者を層別化するため、および個別化された免疫療法中の個々の免疫応答をモニタリングするためである。
【0073】
本明細書中で使用される「生物学的試料」とは、より大きな生物学的因子の一部であることを意味する。好ましくは、試料は生物学的起源の物質である。生体試料の例としては、限定されないが、臓器または組織の一部、例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺など、動脈、静脈など、血液、例えば全血、およびその化合物、例えば血漿、血清、血小板、血液細胞の部分集団など、ならびに唾液、痰、または口および咽頭領域から採取された任意の試料、さらには、例えば、唾液または痰試料を含有する口内洗浄液またはリンスを使用することによって得られたるものが例示される。生物学的試料は、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒト由来である。また、好ましくは、生物学的試料は、哺乳動物、好ましくはヒト、例えば初代細胞または（確立された）細胞株に由来する細胞を含む細胞培養物であり得、「初代細胞培養物」は、目的とする組織から直接単離され、その起源組織の形態学的および機能的特徴を保持する細胞の培養物である。一方、細胞株は、長期間にわたって継続的に継代され、均一な遺伝子型および表現型特性を獲得した細胞であり；それらは有限または連続的であり得る。
【0074】
本発明のナノボディは、ＣＤ４＋Ｔ細胞だけでなく、他のＣＤ４発現細胞、例えば、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの免疫細胞上または中でも使用することができる。したがって、本発明の一実施形態では、ＣＤ４を発現する細胞は、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞から選択される。
【0075】
本発明はまた、診断剤としての、本発明のナノボディの少なくとも１つ、または本発明の少なくとも１つのコンストラクトの使用に関し、好ましくは、診断剤は、患者の疾患関連免疫状態の診断分類、および患者の免疫療法に対する感受性から選択される診断に使用される。
【0076】
本発明はまた、患者の免疫状態および／または免疫療法に対する感受性を診断および／またはモニタリングする方法に関し、本発明の少なくとも１つのナノボディ、または本発明の少なくとも１つのコンストラクトは、患者の生物学的試料中のＣＤ４＋Ｔ細胞を評価および／またはモニタリングするために使用され、ナノボディが、単独でまたはＴ細胞特異的マーカーに結合する第２の化合物と組み合わせて使用され、Ｔ細胞特異的マーカーが、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ３８、ＣＤ６９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＸＣＲ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ４０Ｌ（同義語ＣＤ１５４）、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７８、ＳＩＧＬＥＣ－７、ＳＩＧＬＥＣ－９、ＢＴＬＡ（同義語：ＣＤ２７２）、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７－Ｈ４（同義語：ＶＴＣＮ１）、ＣＤ２７６（同義語：Ｂ７－Ｈ３）、Ａ２ＡＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＬＡＩＲ－３、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２００Ｒのうちの少なくとも１つから選択される。
【0077】
本発明はまた、薬学的に許容される担体または賦形剤と合わせて、本発明のナノボディの少なくとも１つ、および／または本発明の少なくとも１つのコンストラクトを含む医薬組成物に関する。
【0078】
本発明の組成物は、本発明の組成物／ナノボディによる処置を必要とする患者に投与／使用するために製剤化された、本発明の少なくとも１つのナノボディを含む。
【0079】
用語「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトに投与された場合に、二次的、アレルギー的または他の不幸な反応を生じない分子実体および組成物を指す。したがって、「薬学的に許容される担体」とは、疾患の処置の分野において典型的に使用され、生体、好ましくはヒトへの本発明の生成物の投与を単純化もしくは可能にし、および／またはその安定性および／もしくは活性を改善する任意の賦形剤、添加剤、または媒体を意味することが理解される。医薬組成物にはまた、結合剤、希釈剤または潤滑剤を組み込むことができる。薬学的な担体または他の添加物の選択は、意図された投与経路および標準的な薬学的実践に基づいて行うことができる。薬学的に許容される担体使用は、分散剤もしくは懸濁剤、界面活性剤、等張剤、散布剤もしくは乳化剤、保存剤、カプセル化剤、固体結合媒体、凍結乾燥保護剤、膨張剤、安定剤などの１つ以上の溶媒、増量剤、または他の液体結合媒体で構成または含むことができ、これは、何がそれぞれの用量計画に最も適しており、同様に本発明による化合物と適合するかに依存する。このような追加成分の概要は、例えば、Rowe (Ed.) et al.: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition, 2012, Pharmaceutical Pressに見出すことができる。
【0080】
医薬組成物は、例えば、生理学的に許容されるｐＨ（例えば、ｐＨ７～８．５）の水性緩衝液、ポリマーベースのナノ粒子媒体、リポソームなどを含むことができる。医薬組成物は、液体、ゲル、固体、クリーム、またはペースト剤形などの任意の適切な剤形でデリバリーすることができる。
【0081】
当業者に公知である任意の投与方法を、本発明によるナノボディまたは医薬組成物を患者に投与するために使用することができる。特に、ナノボディ／医薬組成物は、例えば、経口、吸入または非経口経路、特に注射、例えば、皮下、血管内、筋肉内または腹腔内により投与することができる。非経口経路が選択される場合、ナノボディ／医薬組成物は、注射可能な溶液および懸濁液の形態であり得、アンプルまたはフラスコにパッケージされ得る。非経口投与形態は、本発明によるナノボディを緩衝剤、安定剤、保存剤、可溶化剤、等張剤および懸濁剤と混合することによって通常得られる。公知の技術によれば、これらの混合物は、滅菌され得るか、または静脈注射としてパッケージされ得る。当業者は、例えば、緩衝液としてリン酸塩に基づく緩衝液を使用することができる。
【0082】
「凍結乾燥保護剤」とは、目的とするタンパク質と組み合わされた場合、凍結乾燥およびその後の保存の際にタンパク質の化学的および／または物理的な不安定性を有意に防止または減少する分子である。例示的な凍結乾燥保護剤には、糖、例えばスクロース、ソルビトール、またはトレハロース；アミノ酸、例えばグルタミン酸一ナトリウムまたはヒスチジン；メチルアミン、例えばベタイン；リオトロピック塩、例えば硫酸マグネシウム；ポリオール、例えば三価またはより多価の糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトールが含まれる。
【0083】
「安定剤」とは、目的とするタンパク質（例えば、ナノボディ／単一ドメイン抗体分子）と組み合わされた場合、凍結乾燥、復元、液体または保存形態における目的とするタンパク質の化学的および／または物理的な不安定性を実質的に防止または減少する分子を指す。例示的な安定剤には、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニン、および塩酸アルギニンが含まれる。
【0084】
本明細書中の目的とする「希釈剤」は、薬学的に許容されるもの（ヒトへの投与に関して安全であり、非毒性）であり、復元された製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤は、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液を含む。
【0085】
「保存剤」とは、例えば、多用途復元製剤の製造を容易にするように、復元製剤中の細菌作用を本質的に減少させるために希釈剤に加えることができる化合物である。潜在的な保存剤の例としては、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖化合物である塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、およびベンゼトニウムクロリドが挙げられる。他のタイプの保存剤には、芳香族アルコール、例えば、フェノール、ブチルおよびベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノールおよびｍ－クレゾールが含まれる。本明細書において最も好ましい保存剤は、ベンジルアルコールである。
【0086】
「膨張剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」とは、凍結乾燥混合物に重量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開口孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。膨張剤の例としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが挙げられる。
【0087】
ナノボディ／医薬組成物の投与量は、投与経路／方法、患者の大きさおよび／または体重、使用される検出技術、およびそれに関連し得るアクセサリー部分の性質に自然に依存する。
【0088】
本発明の医薬組成物は、界面活性剤、膨張剤、安定剤、保存剤、および緩衝液、例えば組成物のｐＨを調節するための緩衝液を含み得る。一部の実施形態では、製剤は、液体製剤、凍結乾燥製剤、復元凍結乾燥製剤、エーロゾル製剤、またはバルク保存製剤（例えば、凍結バルク保存製剤）である。
【0089】
患者は、好ましくはヒトである。
【0090】
本明細書で使用される「生物学的試料」は、好ましくは、組織試料、体液試料、好ましくは痰試料および唾液試料、血液試料、好ましくは全血試料、血漿試料または血清試料からなる群から選択される。生物学的試料は、好ましくは、上述のように、哺乳動物、好ましくはヒト由来である。また、好ましくは、生物学的試料は、哺乳動物、好ましくはヒト、例えば初代細胞または（確立された）細胞系に由来する細胞を含む細胞培養物であり得、「初代細胞培養物」は、目的とする組織から直接単離され、それらの起源組織の形態学的および機能的特徴を保持する細胞の培養物である。一方、細胞株は、長期間にわたって継続的に継代され、均一な遺伝子型および表現型特性を獲得した細胞であり；それらは有限または連続的であり得る。
【0091】
本発明のナノボディのアミノ酸配列を提供することにより、当業者は、ポリペプチドを製造するための従来技術により、本発明および本明細書に記載されるナノボディを製造することができる。例えば、それらは、固相中で周知の合成方法を使用することによって合成することができる。
【0092】
あるいは、本発明によるナノボディは、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 51-54 and 412-430）を用いて合成することができる。例えば、それらは、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、これらのベクターを目的とするポリペプチドを発現する適切な原核生物または真核生物宿主に導入した後、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、次に、当業者に周知の技術を用いてそこから単離することができる。したがって、本発明はまた、本明細書に開示されるポリペプチドおよびナノボディをコードする核酸を含むベクター、ならびにこのような核酸またはベクターをトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。
【0093】
さらなる利点は、実施形態の説明および添付の図面から続く。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0094】
本発明の範囲から逸脱することなく、上述の特徴および以下で説明する特徴を、各々特定された組み合わせにおいて用いることができるだけでなく、他の組み合わせにおいても、また、それら自体においても用いることができることは言うまでもない。
【0095】
本発明のいくつかの実施形態を図面に例示し、以下の説明においてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0096】
【図1-1】図１は、本発明のヒトＣＤ４に対するナノボディの同定および特徴付けのための実験の結果を示す；（Ａ）２ラウンドのバイオパニング後に選択された固有のＣＤ４－Ｎｂからの相補性決定領域（ＣＤＲ）３のアミノ酸配列。（Ｂ）固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いたＣＤ４－Ｎｂの組換え発現および精製。２μｇの精製したＮｂのクーマシー染色を示す。（Ｃ）４℃（上段の行）で３０分間、または３７℃（下段の行）で６０分間、ＣＤ４－Ｎｂで染色した生ＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞の代表的な画像、スケールバー：５０μｍ。（Ｄ）バイオレイヤー干渉法に基づく親和性測定について、ビオチン化ｈＣＤ４をストレプトアビジンバイオセンサー上に固定化した。１５．６ｎＭ～１０００ｎＭの範囲の４つの濃度の精製したＮｂを用いて速度論的測定を行った。一例として、指示された濃度でのＣＤ４－Ｎｂ１のセンソグラムを示す。（Ｅ）フローサイトメトリーによるＥＣ５０の決定。ＣＤ４－Ｎｂ１について例示的に示された、陽性染色されたＣＨＯ－ｈＣＤ４のパーセンテージ（親の頻度）は、指示された濃度のＣＤ４－Ｎｂに対してプロットされた。表１ ＢＬＩ（左側）およびフローサイトメトリーのＥＣ５０値（右側）により決定された親和性（ＫＤ）、会合（Ｋｏｎ）および解離定数（Ｋｏｆｆ）の要約。（Ｆ）配列番号１６、１７および１８の配列アラインメント。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【0097】
【図2-1】図２は、ＣＤ４－ナノボディ結合エピトープの局在化の実験の結果を示す；（Ａ）蛍光標識したＣＤ４－Ｎｂ（ＣＦ５６８）で染色されたｈＣＤ４の完全長またはドメイン欠失突然変異体を発現する生ＣＨＯ細胞の代表的な画像。（Ｂ）ｈＣＤ４（ＰＤＢｅ １ｗｉｑ）の表面構造モデルとＣＤ４－Ｎｂ１－３のＨＤＸ－ＭＳエピトープマッピング結果を示す。異なる色は、ＣＤ４－Ｎｂ１（青色）、ＣＤ４－Ｎｂ２（赤色）またはＣＤ４－Ｎｂ３（黄色）によって保護されたアミノ酸残基を強調する。Ｎｂ１とＮｂ３の両方で保護されている重なり合った残基は緑色で示した。これらの特異的領域のより詳細な表面マップ（％ΔＤ）は、対応するＣＤ４アミノ酸配列を有するＣ（ＣＤ４－Ｎｂ１）、Ｄ（ＣＤ４－Ｎｂ３）およびＥ（ＣＤ４－Ｎｂ２）に示される。
【図2-2】同上。
【0098】
【図3-1】図３は、蛍光標識したＣＤ４ナノボディで染色されたヒトＰＢＭＣのサイトメトリー分析の結果を示す；（Ａ）ドナー由来のＣＤ３＋ＣＤ４＋二重陽性細胞についての最終ゲーティング工程の模式図。（Ｂ）抗ＣＤ４抗体および陰性対照Ｎｂ（ＧＦＰ－Ｎｂ、１μＭ）と比較して、ＣＤ４－Ｎｂ１もしくはＣＤ４－Ｎｂ２（１００ｎＭ）、またはＣＤ４－Ｎｂ３もしくはＣＤ４－Ｎｂ４（１μＭ）で染色した３人のドナーの二重陽性細胞のパーセンテージ。表２ 指示された濃度でＣＤ４－Ｎｂを用いて染色された３人のドナー由来の二重陽性ＰＢＭＣのパーセンテージ。
【図3-2】同上。
【0099】
【図4-1】図４は、Ｔ細胞の活性化、増殖およびサイトカイン放出におけるＣＤ４ナノボディの影響を分析するための実験を示す；細胞をＣＦＳＥで染色し、５μＭのＮｂまたはｗ／ｏで１時間処理し（各々１回の反復）、洗浄し、次に５μｇ／ｍｌのＭＨＣ－クラスＩＩペプチド、１０μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激するかまたは刺激せず、１２日間培養した。（Ａ）細胞は、４、６、８日目に増殖（ＣＦＳＥ陰性画分）および活性化（ＣＤ２５およびＣＤ６９）についてフローサイトメトリーにより分析された。ＭＨＣクラスＩＩペプチド（複数可）（左側）またはＰＨＡ（右側）による刺激後のＣＤ４＋細胞の増殖。（Ｂ）ＣＤ４＋細胞上の活性化マーカー、上段：ＭＨＣＩＩペプチド（複数可）（左）またはＰＨＡ（右）で刺激した後のＣＤ２５発現；下段：ＭＨＣＩＩペプチド（複数可）（左）またはＰＨＡ（右）で刺激した後のＣＤ６９発現。３人のドナーの平均パーセンテージは、平線または点線で示される。（Ｃ）サイトカインおよびＣＤ４＋細胞の活性化マーカー発現－ＴＮＦ、ＩＦＮ－ｙ、ＣＤ１５４（左のｙ軸）またはＩＬ－２（右のｙ軸）。１２日目に細胞をＭＨＣ－クラスＩＩペプチド（複数可）またはＤＭＳＯ（バックグラウンド）で、Ｇｏｌｇｉ ＳｔｏｐおよびブレフェルジンＡの存在下で１４時間再刺激し、フローサイトメトリーにより分析した。エラーバーはＳＥＭを表示する。ゲーティング戦略を下記の図９に示すが、すべてのパーセンテージはＣＤ４＋Ｔ細胞内で与えられる。
【図4-2】同上。
【0100】
【図5-1】図５は、ＣＤ４ナノボディＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５の光学的イメージング（ＯＩ）実験の結果を示す；５μｇのＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５またはＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５は、ヒトＣＤ４＋ＨＰＢ－ＡＬＬを保持するＮＳＧマウスにｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．で投与され、腫瘍生物学的分布は、２４時間にわたる反復ＯＩ測定によってモニタリングされた。（Ａ）ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５（左、ＣＤ４）またはＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５（右、ｃｔｒｌ）のいずれかを注射された１匹のマウスの各測定時点の代表的な画像。赤い丸および白い矢印は右上腹部における腫瘍の局在を示す。（Ｂ）腫瘍からの蛍光シグナルの定量（群あたりｎ＝４、平均放射効率±ＳＥＭの算術平均）。（Ｃ）最終イメージング時点の後、腫瘍をエクスビボのＯＩのために摘出し、ＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５と比較してＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５の蓄積が増加していることが確認された（群あたりｎ＝２、算術平均±ＳＥＭ）。
【図5-2】同上。
【0101】
【0102】
【0103】
【図8-1】図８は、ヒトＰＢＭＣ中に存在するＣＤ４＋細胞に対する本発明のＣＤ４－ナノボディの結合研究の結果のダイアグラムを示す。上段は、ＣＤ４＋ＣＤ３＋二重陽性ヒトＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。中段および下段は、指示された濃度で抗ＣＤ４抗体（ＣＤ４ ａｂ）、抗ＧＦＰ対照Ｎｂ（ＧＦＰ－Ｎｂ）、またはＣＤ４－Ｎｂ１－ＣＤ４－Ｎｂ４で染色されたドナー１（Ａ）、ドナー２（Ｂ）、およびドナー３（Ｃ）についての最終的なゲーティング工程およびこれらの細胞の定量化を示す。
【図8-2】同上。
【図8-3】同上。
【0104】
【図9】図９は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４－ナノボディの影響の決定の結果を示す；Ａ）刺激後のＣＤ４＋細胞の増殖および活性化の分析のためのゲーティング戦略。左から右の上段の行：タイムゲート、単一細胞、生細胞、リンパ球、ＣＤ４＋細胞。中段および下段の行：ゲートを増殖中のＣＦＳＥ陰性ＣＤ４＋細胞（左）、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋細胞（中）およびＣＤ６９＋ＣＤ４＋細胞（右）上に置いた。ヒストグラムオーバーレイは、ＣＤ４＋細胞内でのＣＦＳＥ標識としての分裂の数を示す。６日目の１つの代表例（ドナー２）を示す。（Ｂ）培養１２日後および再刺激１４時間後の細胞内染色におけるＣＤ４＋細胞の活性化マーカーおよびサイトカイン発現の分析のためのゲーティング戦略（ドナー３）。左から右の上段の行：タイムゲート、単一細胞、生細胞、リンパ球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４／ＣＤ８染色（ＣＤ８ｎｅｇ細胞上でのゲーティング）。中段および下段の行は、ＭＨＣクラスＩＩペプチドまたは対照ＤＭＳＯ／水で再刺激した後のＴＮＦ、ＩＦＮ－γ、ＣＤ１５４およびＩＬ－２の発現を示す。
【0105】
【図10-1】図１０は、ＣＤ４－Ｎｂによる処理後のドナーの全血試料から分泌されるサイトカインの決定結果を示す。３人のドナーの血液試料を５μＭのＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ４、ＧＦＰ－Ｎｂ（対照）またはｗ／ｏ Ｎｂとともにインキュベートし、対照としてリポ多糖類（ＬＰＳ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）または培地のみで刺激した。分泌されたサイトカイン（図２０Ｂに列挙される）を測定し、収容された、開発されたマイクロスフェアベース（Ｌｕｍｉｎｅｘ）マルチプレックスサンドイッチイムノアッセイを用いて定量した。１つの生物学的実験の結果は、１つの個体の測定されたサイトカインレベルを示すカラードットとして示される。
【図10-2】同上。
【図10-3】同上。
【0106】
【0107】
【図12-1】図１２は、低親和性結合ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５のインビボ光学的イメージング（ＯＩ）の結果を示す；５μｇのＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５またはＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５は、ヒトＣＤ４＋ＨＰＢ－ＡＬＬを保持するＮＳＧマウスにｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．で投与され、腫瘍生物学的分布は、２４時間にわたる反復ＯＩ測定によってモニタリングされた。（Ａ）ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５（左、ＣＤ４）またはＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５（右、ｃｔｒｌ）のいずれかを注射された４匹のマウスの各測定時点の代表的な画像。白い矢印は右上腹部における腫瘍の局在を示す。（Ｂ）腫瘍からの蛍光シグナルの定量（群あたりｎ＝４、平均放射効率±ＳＥＭの算術平均）。（Ｃ）最終イメージング時点の後、腫瘍をエクスビボのＯＩのために摘出し、ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５およびＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５の同様の蓄積を示した（群あたりｎ＝２、算術平均±ＳＥＭ）。
【図12-2】同上。
【0108】
【図13】図１３は、エクスビボのＨＰＢ－ＡＬＬ腫瘍の免疫蛍光染色実験の結果を示す；エクスビボのＨＰＢ－ＡＬＬ腫瘍由来の凍結切片は、異種移植されたマウスにおける全身注射から結合Ｎｂ（青色）についてイメージングし、ＣＤ４特異的抗体（赤色）および核ＤＡＰＩ染色（緑色）と同時染色した。２時間のＮｂ注射後、ＣＤ４－Ｎｂ１（Ａ）または対照ＧＦＰ－Ｎｂ（Ｂ）とＣＤ４抗体蛍光の画像オーバーレイ。（Ｃ、Ｄ）ＡおよびＢからの指示された画像切片のラインスキャンによる定量化。（Ｅ、Ｆ）全身Ｎｂ注射の２４時間後のＡおよびＢと同じ。（Ｇ、Ｈ）強染色領域（Ｇ）または弱染色領域（Ｈ）のＥから指示された画像切片のラインスキャン分析。
【0109】
【図14-1】図１４は、本発明において使用される例示としてのナノボディ配列およびＡＡＶ２－ナノボディ設計に関するデータを示す：Ａ）本研究において使用されるナノボディのアミノ酸アラインメント。インビボイメージングのための完全な特徴付けおよび適用を記載する、上記の研究に従ったナノボディアノテーション。Ｎｂ（ナノボディ）１ａは、Ｎｂ１（アラインメント中のアミノ酸１０１～１１７）として同一の相補的決定領域３（ＣＤＲ３）を共有する。Ｂ）ＡＡＶ２粒子産生に使用されるプラスミドコンストラクトおよび得られるカプシドの概略図。等量のプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。明確にするために、すべての共トランスフェクションに含まれるＧＦＰレポーターをコードするＡＡＶヘルパープラスミドおよびベクターゲノムは、ここでは可視化されない。最適化されたウイルスカプシドタンパク質ＶＰ１－３に対する本質的な変化が指示される－より明るい：突然変異／黒：ｗｔを示す。ＡＴＧ－開始コドン；ＳＡ－スプライスアクセプター部位；ＮＢ－ナノボディ；Ｒ５８５Ａ／Ｒ５８８Ａ－それぞれ残基５８５および５８８（盲検）におけるＡｒｇからＡｌａへのアミノ酸置換。
【図14-2】同上。
【0110】
【0111】
【図16-1】図１６は、ＡＡＶ２ ＣＤ４－ナノボディを含有する粒子を用いたＣＤ４を発現する細胞の形質導入実験の結果を示す：Ａ）本研究において使用された細胞株上でのＣＤ４発現。細胞を抗ＣＤ４－Ｃｙ７抗体で染色し、未染色の模擬対照と比較した。模擬細胞中のＣＤ４シグナルを手動で１００ ａｕに調節し、フローサイトメトリーにより染色細胞と比較した。ヒストグラムは、同等のピーク高さを可視化するために、モード様式によって正規化される。Ｂ）２つのＨｅＬａ（ｗｔおよびＴＺＭｂｌ）および２つのＴリンパ球（１Ｇ５およびＳｕｐＴ１）細胞株を、細胞あたりの指示されたウイルスゲノムコピー（ｇｃ／細胞）で形質導入した。感染３日後、フローサイトメトリーにより、ＧＦＰ陽性細胞％を測定したｎ＝２～４。エラーバーはＳＤを指示する。Ｃ）１Ｇ５細胞を１０．０００ｇｃ／細胞の濃度で指示されたＡＡＶ２粒子で形質導入した。形質導入３日後、ＣＤ４発現に対して染色し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。代表的なデータを示す。
【図16-2】同上。
【図16-3】同上。
【0112】
【図17-1】図１７は、混合培養実験におけるナノボディ特異性の結果を示す：Ａ）混合培養実験の代表的分析。ＨｅＬａ ｗｔ（ＣＤ４陰性）を、ＡＡＶ２形質導入前にＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ（ＣＤ４陽性）と１：１の比で混合し、その後、種々のウイルス希釈で形質導入した。形質導入の３日後、細胞を回収し、ＣＤ４について染色し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。Ｂ 独立したＨｅＬａ混合培養実験からの蓄積データ。適応となるのは、ＣＤ４陽性細胞および陰性細胞のそれぞれに対するＧＦＰ陽性細胞の相対頻度である（Ｂの左パネル）。ＡＡＶ２ ＣＤ４特異的形質導入は、個々の細胞集団（ＣＤ４陰性に対してＣＤ４陽性の倍数）からの比として計算される。倍数変化を右側に指示する；ｎ＝２～６は平均値とＳＤを示す。
【図17-2】同上。
【0113】
【図18-1】図１８は、初代ＣＤ４＋ＴおよびＰＢＭＣにおけるＡＡＶＳ ＶＰ１ ＣＤ４ナノボディ特異性を分析する実験の結果を示す；Ａ）２人の健常ドナー由来の初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化され、指示されたウイルスストック（２０，０００ｇｃ／細胞）で形質導入された。形質導入の３日後、細胞をＣＤ４について染色し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。エラーバーはＳＤを指示する；ｎ＝４。Ｂ）初代ヒトＰＢＭＣは、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激され、続いて示されたウイルス株（１０，０００ｇｃ／細胞）に感染させた。感染３日後、細胞をＣＤ４に対して染色し、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーを介して評価した（左パネル）。ＣＤ４陽性細胞に対する倍数特異性（右パネル）は、それぞれＣＤ４陰性および陽性細胞における相対的ＧＦＰ陽性集団から決定された。１つの代表的な実験データ。
【図18-2】同上。
【0114】
【図19-1】図１９は、混合培養実験におけるＡＡＶ２－ＶＰ１二価－ＣＤ４ナノボディ特異性の結果を示す；Ａ）ＶＰ１－ＣＤ４一価を二価ナノボディコンストラクトと比較する混合培養実験の代表的な分析。ＨｅＬａ ｗｔ（ＣＤ４陰性）をＡＡＶ２形質導入前にＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ（ＣＤ４陽性）と１：１の比で混合し、その後、異なるウイルス希釈で形質導入した。形質導入後の３日目に、細胞を回収し、ＣＤ４について染色し、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。Ｂ）３つの独立したＨｅＬａ混合培養実験の要約。適応となるのは、ＣＤ４陽性細胞および陰性細胞のそれぞれに対するＧＦＰ陽性細胞の相対頻度である（左パネル）。ＡＡＶ２ ＣＤ４特異的形質導入は、個々の細胞集団（ＣＤ４陰性に対してＣＤ４陽性の倍数）からの比として計算される。倍数変化を右側に指示する；ｎ＝３は平均値とＳＤを示す。
【図19-2】同上。
【0115】
【0116】
【図21-1】図２１は、本発明のＣＤ４特異的ナノボディを有する例示的に操作されたＡＡＶ２ ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を示し、以下の凡例を伴う：Ａ）ＡＡＶ２ ＶＰ１オリジナル配列、修飾されたアミノ酸（太字）、ナノボディ挿入により置換された配列（太字、下線およびイタリック）；Ｂ）ＡＡＶ ＶＰにおけるナノボディ配列、Ｎ末端／中央リンカー配列（太字およびイタリック）、Ｃ末端リンカー配列（太字および下線）；Ｃ）ＡＡＶ２ ＶＰ２オリジナル配列、修飾されたアミノ酸（太字）；Ｄ）ＡＡＶ ＶＰ２におけるナノボディ配列、Ｃ末端リンカー配列（太字および下線）。
【図21-2】同上。
【0117】
【図22-2】同上。
【0118】
【図23-1】図２３は、６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１がＣＤ４＋Ｔ細胞に富んだ臓器に特異的に蓄積することを示す：Ａ）６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１の静脈内（ｉ．ｖ．）注射３時間後のヒトＣＤ４ノックイン（ｈＣＤ４ＫＩ）および野生型（ｗｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの代表的な最大強度投影ＰＥＴ／ＭＲ画像；白い矢印はリンパ節の局在化を示す；Ｂ）脾臓、リンパ節および肝臓の例示的な横断的ＰＥＴ／ＭＲ画像（注射３時間後）、および６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１の２４時間にわたる動的臓器取り込みの定量化［１群あたりｎ＝３、ｍｌあたりの注射用量％（％ＩＤ／ｍｌ）の算術平均±ＳＥＭ、３時間時点の対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５］；白い矢印は標的臓器を示す；Ｃ）ｈＣＤ４ＫＩマウス（丸グラフ）のリンパ節、脾臓、および肝臓における６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１蓄積を野生型同腹児と比較した模式図（四角グラフ）。
【図23-2】同上。
【0119】
【発明を実施するための形態】
【0120】
本発明において、一組のヒトＣＤ４特異的ナノボディ（「Ｎｂ」においても）を生成し、組換えおよび細胞ＣＤ４に対するそれらの結合特性を調べ、サブドメイン分解能を有するそれらのエピトープを決定した。一連の免疫学的分析を行い、単離したヒトＰＢＭＣおよび全血中のＴ細胞増殖および活性化およびサイトカイン産生におけるそれらの影響を評価した。さらに、部位特異的蛍光標識による光学的イメージングのためにＮｂをＣＤ４免疫プローブに変換し、インビボ光学的イメージングによりマウス異種移植モデルにおいてヒトＣＤ４陽性組織を可視化するそれらの能力を調べた。
【実施例】
【0121】
１．ヒトＣＤ４のインビボイメージングにおけるＣＤ４－ナノボディの使用
【0122】
材料および方法
【0123】
ナノボディライブラリーの生成
【0124】
アルパカ免疫化およびＮｂライブラリー構築は、前述のように行われた。動物免疫化は、Ｕｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａの政府により承認されている（許可番号：５５．２－１－５４－２５３２．０－８０－１４）。簡単に説明すると、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）は、ＨＥＫ２９３細胞（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｏｎｌｉｎｅ ＧｍｂＨ、Ａａｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で組換え的に産生されたヒトＣＤ４（ａａ２６－３９０）の精製した細胞外ドメインを用いて免疫化された。最初に１ｍｇでプライミングした後、２週間ごとに０．５ｍｇのｈＣＤ４を６回ブースト注射した。初回免疫化から８７日後、約１００ｍｌの血液を回収し、リンパ球分離培地（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ）を用いたＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によりリンパ球を単離した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。Ｎｂレパートリーは、以下のプライマーの組み合わせ（１）ＣＡＬＬ００１およびＣＡＬＬ００２、（２）フォワードプライマーセットＦＲ１－１、ＦＲ１－２、ＦＲ１－３、ＦＲ１－４およびリバースプライマーＣＡＬＬ００２、ならびに（３）ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限部位を導入するフォワードプライマーＦＲ１－ｅｘｔ１およびＦＲ１－ｅｘｔ２、ならびにリバースプライマーセットＦＲ４－１、ＦＲ４－２、ＦＲ４－３、ＦＲ４－４、ＦＲ４－５およびＦＲ４－６を用いた３つのその後のＰＣＲ反応において単離された。ＮｂライブラリーをｐＨＥＮ４ファージミドベクターのＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。
【0125】
Ｎｂスクリーニング
【0126】
ＣＤ４特異的Ｎｂの選択のために、固定化された組換え抗原とＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞の両方を用いて、２つの連続したファージ富化ラウンドを行った。ｐＨＥＮ４中のＣＤ４－Ｎｂ－ライブラリーを含む大腸菌ＴＧ１細胞をＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させ、Ｎｂ提示ファージを作製した。各ラウンドについて、ＣＤ４－Ｎｂ－ライブラリーの１×１０１１個のファージを、ｈＣＤ４（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した免疫チューブ上に１回ずつ塗布した。各選択ラウンドにおいて、ＰＢＳ－Ｔ中の５％ミルクまたはＢＳＡを用いて抗原およびファージの広範なブロッキングを行い、パンニングラウンドの増加に伴いＰＢＳ－Ｔ洗浄のストリンジェンシーが増加した。結合したファージを、１００ｍＭトリエチルアミン、ＴＥＡ（ｐＨ１０．０）中で溶出させ、続いて、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４を用いて即時中和した。細胞ベースのパンニングでは、２×１０６個のＣＨＯ－ｈＣＤ４またはＨＥＫ２９３－ｈＣＤ４を、解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて非酵素的に分離し、ＰＢＳ中の５％ＦＣＳに懸濁した。抗原発現細胞は、４℃で３時間、一定の混合下で１×１０１１個のファージとともにインキュベートされた。細胞をＰＢＳ中の５％ＦＣＳで３回洗浄した。ファージをｐＨ２．３の７５ｍＭクエン酸緩衝液を用いて５分間溶出させた。非ＣＤ４特異的ファージを枯渇させるために、溶出されたファージを１×１０７ｗｔ細胞と３回インキュベートした。指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細胞を、両方のパニング戦略からの溶出されたファージに感染させ、次のパニングラウンドのために選択プレート上に広げた。各ラウンドの抗原特異的富化は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数することによりモニタリングされた。
【0127】
全細胞ファージＥＬＩＳＡ
【0128】
ポリスチレンＣｏｓｔａｒ ９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆し、Ｈ２Ｏで１回洗浄した。ＣＨＯ－ｗｔおよびＣＨＯ－ｈＣＤ４を１００μｌでウェルあたり２×１０４細胞でプレーティングし、一晩コンフルエントになるまで増殖させた。翌日、７０μｌのファージ上清を各細胞型の培地に添加し、４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中の５％ＦＣＳで５回洗浄した。Ｍ１３－ＨＲＰで標識された抗体（Ｐｒｏｇｅｎ）を濃度０．５ｎｇ／ｍｌで添加して１時間おき、ＰＢＳ中の５％ＦＣＳで３回洗浄した。Ｏｎｅｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ ３２０４８ ＥＬＩＳＡ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、色の変化が見えるまでインキュベートし、１００μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止した。検出は、Ｐｈｅｒａｓｔａｒプレートリーダーで４５０ｎｍにて生じさせ、ファージＥＬＩＳＡ陽性クローンは、ｗｔ対照細胞よりも２倍高いシグナルによって定義された。
【0129】
発現コンストラクト
【0130】
ヒトＣＤ４のｃＤＮＡ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１７３０）は、フォワードプライマーｈＣＤ４ ｆｗｄおよびリバースプライマーｈＣＤ４ ｒｅｖを用いたＰＣＲによって、ｈＣＤ４－ｍＯｒａｎｇｅプラスミドＤＮＡ（ｈＣＤ４－ｍＯｒａｎｇｅはＳｅｒｇｉ Ｐａｄｉｌｌａ Ｐａｒｒａ；ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０１９２；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１１０１９２；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１１０１９２）から増幅され、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター変異体（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＩＲＥＳ ＧＦＰ、Ｋａｔｈｌｅｅｎ＿Ｌ Ｃｏｌｌｉｎｓからの贈与物；ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃５１４０６；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：５１４０６；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿５１４０６）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位に導入された。ネオマイシン耐性遺伝子（ＮｅｏＲ）を、ベクターのＸｍａＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位への組込みにより、フォワードプライマーｂｓｄ ｆｗｄおよびリバースプライマーｂｓｄ ｒｅｖで増幅したブラスチシジンＳ－デアミナーゼ（ｂｓｄ）のｃＤＮＡに置換した。ＣＤ４ドメイン欠失突然変異体は、製造業者のプロトコールに従ってＱ５部位特異的突然変異誘発キット（ＮＥＢ）を用いて生成した。ｈＣＤ４のドメインＤ１を欠損する突然変異体については、Ｎ末端ＢＣ２タグを導入した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１＿ＣＤ４＿ΔＤ１＿ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰの生成のために、フォワードプライマーΔＤ１ ｆｗｄおよびリバースプライマーΔＤ１ ｒｅｖを使用した；ｐｃＤＮＡ３．１＿ＣＤ４＿ΔＤ１ΔＤ２＿ＩＲＥＳ－ｅＧＦＰではフォワードプライマーΔＤ１ΔＤ２ ｆｗｄおよびリバースプライマーΔＤ１ ΔＤ２ｒｅｖを使用した；ｐｃＤＮＡ３．１＿ＣＤ４＿ΔＤ３ΔＤ４＿ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰでは、フォワードプライマーΔＤ３ΔＤ４ ｆｗｄおよびリバースプライマーΔＤ３ΔＤ４ ｒｅｖを使用した。Ｎｂの細菌発現のために、配列をｐＨＥＮ６ベクター中にクローニングし、それによって、Ｃ末端ソルターゼタグＬＰＥＴＧを加え、続いて、前述のようにＩＭＡＣ精製のために６×Ｈｉｓ－タグを加えた。Ｅｘｐｉ２９３細胞におけるｈＣＤ４の細胞外ドメインＤ１－４のタンパク質産生のために、対応するｃＤＮＡを、フォワードプライマーＣＤ４－Ｄ１－４ ｆおよびリバースプライマーＣＤ４－Ｄ１－４ ｒを用いて、完全長ヒトＣＤ４ ｃＤＮＡ（ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１１０１９２）を含有するプラスミドＤＮＡから増幅した。６×Ｈｉｓタグをリバースプライマーによって導入した。Ｅｓｐ３ＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、ｃＤＮＡを、シグナルペプチドＭＧＷＴＬＶＦＬＦＬＳＶＴＡＧＶＨＳを有するｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに、抗体ＪＦ５から導入した。
【0131】
細胞培養、トランスフェクション、安定した細胞株の生成
【0132】
ＨＥＫ２９３ＴおよびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＣＬ－６１、ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＧｍｂＨ、Ｗｅｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた。本研究には細胞株特異的分析は含まれないため、追加の認証なしで細胞を使用した。細胞を標準プロトコールに従って培養した。簡単に説明すると、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、Ｌ－グルタミンおよびペニシリン－ストレプトマイシン（すべてＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴＦＳ）由来）を補足したＤＭＥＭ（ＨＥＫ２９３）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＣＨＯ）（両方とも高グルコース、ピルビン酸塩、ＴＦＳ）を含有する増殖培地を培養のために使用した。細胞を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＳＦ）を用いて継代し、加湿チャンバー内で３７℃および５％ＣＯ２雰囲気で培養した。プラスミドＤＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、リポフェクタミン２０００（ＴＳＦ）を用いてトランスフェクトした。安定なＨＥＫ２９３－ｈＣＤ４およびＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞株の生成のために、トランスフェクションの２４時間後に、細胞を５μｇ／ｍｌのブラスチシジンＳ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて２週間の選択期間に供し、続いて単細胞分離した。個々のクローンを、ＧＦＰおよびＣＤ４発現のそれらのレベルおよび均一性に関して、生細胞蛍光顕微鏡により分析された。
【0133】
タンパク質の発現および精製
【0134】
ＣＤ４特異的Ｎｂを発現させ、以前に公開されたように精製した。ヒトＣＤ４のドメインＤ１－４およびＣ末端Ｈｉｓ６－タグを含むヒトＣＤ４の細胞外断片を、製造業者のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＥｘｐｉ２９３細胞中に発現させた。細胞上清を、トランスフェクションの４日後に遠心分離により回収し、滅菌濾過し、前述のプロトコールに従って精製した。品質管理のために、標準的な手順に従って、すべての精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して分析した。したがって、タンパク質試料を、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．８；２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ；５％（ｖ／ｖ）２－メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ブロンフェノールブルーを含有する２×ＳＤＳ試料緩衝液中で変性（５分、９５℃）させた。すべてのタンパク質をＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）染色により可視化した。イムノブロットのために、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移し、抗Ｈｉｓ一次抗体（Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、＃３４６６０、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて検出を行い、続いてＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；励起６３３ｎｍ、発光フィルター設定６７０ｎｍ ＢＰ３０）を用いてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したロバ抗マウス二次抗体を用いて検出を行った。
【0135】
生細胞免疫蛍光法
【0136】
ＣＤ４ドメイン欠失突然変異体を一過性に発現するＣＨＯ－ｈＣＤ４およびＣＨＯ ｗｔ細胞を、μｃｌｅａｒ ９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ、カタログ＃６５５０９０）のウェルあたり約１０，０００細胞でプレーティングし、標準条件で培養した。翌日、培地を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、核染色のために２μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１ｎＭ～１００ｎＭ濃度の標識または非標識ＣＤ４－Ｎｂを補足した生細胞可視化培地ＤＭＥＭｇｆｐ－２（Ｅｖｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＭＣ１０２）に置換した。非標識ＣＤ４－Ｎｂを２．５μｇ／ｍｌの抗ＶＨＨ二次Ｃｙ５ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗アルパカＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の添加によって可視化した。画像はＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ ＸＬシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて２０×または４０×で獲得した。
【0137】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）
【0138】
組換えｈＣＤ４に対する精製したＮｂの結合親和性を決定するために、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩｔｚ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を行った。第１に、ＣＤ４は、３倍モル過剰のビオチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルによってビオチン化された。次に、ＣＤ４は、製造業者のプロトコールに従って、単一使用の高精度ストレプトアビジンバイオセンサー（ＳＡＸ）で固定化された。各Ｎｂについて、それぞれのナノボディの親和性に適した濃度（全体で１５．６ｎＭ～１μＭ）で４回の会合／解離実験を行った。参照ランとして、会合工程でＮｂの代わりにＰＢＳを使用した。陰性対照として、ＧＦＰ－Ｎｂ（５００ｎＭ）を結合研究に適用した。記録されたセンソグラムをＢＬＩｔｚＰｒｏソフトウェアを用いて分析し、解離定数（ＫＤ）を大域適合に基づいて計算した。エピトープ競合分析のために、最初の会合後３０秒の短い解離期間で、２つの連続した適用工程を行った。
【0139】
フローサイトメトリーによる親和性決定
【0140】
細胞ベースの親和性決定のために、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ４を無酵素細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて脱着し、ＦＡＣＳ緩衝液（５％ＦＣＳを含むＰＢＳ）に再懸濁した。各染色条件について、２００，０００細胞を、適切な希釈系列のＣＤ４ナノボディとともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、Ｃｙ５ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗アルパカＩｇＧ、ＶＨＨドメイン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１５分間適用した。ＰＢＭＣ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＺＫＴ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ ＧｍｂＨ）を新たに解凍し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。各試料について、２００，０００細胞は、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１：５００希釈物と組み合わせて、ＣＦ５６８にカップリングされた適切な濃度のＣＤ４ナノボディとともに４℃で３０分間インキュベートされた。対照染色には、ＰＥ／Ｃｙ５で標識された抗ヒトＣＤ４抗体（ＲＰＡ－Ｔ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いた。２回の洗浄工程の後、試料を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒで分析した。最終データ分析はＦｌｏＪｏ１０（登録商標）ソフトウェアを用いて行われた。
【0141】
ナノボディのソルターゼ標識
【0142】
ｐＥＴ２９中のソルターゼＡ五量体（ｅＳｒｔＡ）は、Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃７５１４４；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：７５１４４； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿７５１４４）からの贈与であり、以前に記載されたように発現させ、精製した。ＣＦ５６８をカップリングさせたペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｄｏａ－Ｌｙｓ－ＮＨＯＡ（ソルターゼ基質）をＩｎｔａｖｉｓ ＡＧによりカスタム合成した。クリック化学では、ペプチドＨ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－プロピルアジドを合成した。簡単に説明すると、ソルターゼをカップリングする５０μＭナノボディについては、ソルターゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解した２５０μＭソルターゼペプチド、および１０μＭソルターゼをカップリング緩衝液（１０ｍＭ ＣａＣｌ２を含むソルターゼ緩衝液）中で混合し、４時間、４℃でインキュベートした。カップリングしていないナノボディおよびソルターゼをＩＭＡＣにより枯渇させた。未結合の過剰な未反応ソルターゼペプチドを、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ＃８９８９０）を用いて除去した。アジドをカップリングさせたＮｂをＳＰＡＡＣ（歪促進アジド－アルキン環化付加）クリック化学反応により、２時間、２５℃で２倍モル過剰のＤＢＣＯ－Ｃｙ５．５（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。続いて、透析により過剰のＤＢＣＯ－Ｃｙ５．５を除去した（ＧｅＢＡｆｌｅｘ－チューブ、６～８ｋＤａ、Ｓｃｉｅｎｏｖａ）。最後に、タグ付けされていないナノボディ（ソルターゼ反応の副生成物）を除去するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ－Ｓ ＦＦ、Ｃｙｔｉｖａ）を使用した。ＤＢＣＯ－Ｃｙ５．５をカップリングさせたＮｂの結合は５０ｍＭのＨ２ＮａＰＯ４、１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．２で生じた。溶出は５０ｍＭのＨ２ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２を用いて行われた。色素で標識されたタンパク質画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、続いてＴｙｐｈｏｏｎ Ｔｒｉｏ（ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＣＦ５６８：励起５３２ｎｍ、発光フィルター設定５８０ｎｍ ＢＰ３０；Ｃｙ５．５励起６３３ｎｍ、発光フィルター設定６７０ｎｍ ＢＰ３０；５４６）で蛍光スキャンし、その後、クーマシー染色を行った。最終生成物の同定および純度は、ＬＣ－ＭＳ（ＣＤ４－Ｎｂ－ＣＦ５６８、＞６０％；ＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５、約９４％；ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５、約９９％；ＧＢＰ－Ｃｙ５．５；約９４％；ＣＤ４－Ｎｂ１－３、約９９％；ｂｉｖＧＦＰ－Ｎｂ、約９９％）によって決定された。
【0143】
水素－重水素交換
【0144】
ＣＤ４重水素化速度およびエピトープ解明
５．１ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ１）、６．５ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ２）、および７５．３ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ３）（ＢＬＩ分析により予め決定される）のアフィニティー定数に基づいて、Ｋｏｃｈｅｒｔら（Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry to Study Protein Complexes, Methods Mol Biol (2018) 1764:153-71）に従って、９０％の複合体形成を確実にするように、抗原対Ｎｂのモル比を計算した。ＣＤ４（５μｌ、６５．５μＭ）は、１０分間、２５℃でＣＤ４特異的Ｎｂ（Ｎｂ１、Ｎｂ２、およびＮｂ３に対してそれぞれ５μｌ；６０．３、６７．４、および１４３．１μＭ）とともにプレインキュベートされた。ＣＤ４のみを含有する重水素化試料を、Ｎｂの代わりにＰＢＳとともにプレインキュベートした。予めインキュベートした試料のＨＤＸは、Ｄ２Ｏで調製されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１：１０希釈することによって開始され、最終濃度９０％Ｄ２Ｏにした。２５℃で５分間および５０分間インキュベートした後、２０μｌのアリコートを採取し、２０μｌの氷冷停止溶液（１００ｍＭギ酸アンモニウム溶液ｐＨ２．２中の１．５％ギ酸および４ＭグアニジンＨＣｌを含有する０．２Ｍ ＴＣＥＰ）を添加することにより停止し、最終ｐＨを２．５とした。停止した試料を直ちにスナップ凍結した。固定化されたペプシン（ＴＦＳ）は、６０μｌの５０％スラリー（ギ酸アンモニウム溶液ｐＨ２．５）を用いて調製され、次に遠心分離された（３分間、０℃で１，０００×ｇ）。上清を捨てた。各分析の前に、試料を解凍し、ペプシンビーズに添加した。水氷浴中で２分間消化後、０．２２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１，０００×ｇで３０秒間、０℃で遠心分離することによってビーズから分離し、直ちにＬＣ－ＭＳで分析した。各複合体およびＣＤ４単独の非重水素化対照試料を、Ｄ２Ｏの代わりにＨ２Ｏを用いて同じ条件下で調製した。さらに、各Ｎｂを、ＣＤ４を添加せずに消化し、Ｎｂ由来の消化性ペプチドのリストを作成した。ＣＤ４－Ｎｂ複合体のＨＤＸ実験を三重にして行った。１４の合成ペプチドの標準ペプチド混合物を用いて決定した方法の逆交換は２４％であった。
５．１ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ１）、６．５ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ２）、および７５．３ｎＭ（ＣＤ４－Ｎｂ３）（ＢＬＩ分析により予め決定される）のアフィニティー定数に基づいて、Ｋｏｃｈｅｒｔら（Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry to Study Protein Complexes, Methods Mol Biol (2018) 1764:153-71）に従って、９０％の複合体形成を確実にするように、抗原対Ｎｂのモル比を計算した。ＣＤ４（５μｌ、６５．５μＭ）は、１０分間、２５℃でＣＤ４特異的Ｎｂ（Ｎｂ１、Ｎｂ２、およびＮｂ３に対してそれぞれ５μｌ；６０．３、６７．４、および１４３．１μＭ）とともにプレインキュベートされた。ＣＤ４のみを含有する重水素化試料を、Ｎｂの代わりにＰＢＳとともにプレインキュベートした。予めインキュベートした試料のＨＤＸは、Ｄ２Ｏで調製されたＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて１：１０希釈することによって開始され、最終濃度９０％Ｄ２Ｏにした。２５℃で５分間および５０分間インキュベートした後、２０μｌのアリコートを採取し、２０μｌの氷冷停止溶液（１００ｍＭギ酸アンモニウム溶液ｐＨ２．２中の１．５％ギ酸および４ＭグアニジンＨＣｌを含有する０．２Ｍ ＴＣＥＰ）を添加することにより停止し、最終ｐＨを２．５とした。停止した試料を直ちにスナップ凍結した。固定化されたペプシン（ＴＦＳ）は、６０μｌの５０％スラリー（ギ酸アンモニウム溶液ｐＨ２．５）を用いて調製され、次に遠心分離された（３分間、０℃で１，０００×ｇ）。上清を捨てた。各分析の前に、試料を解凍し、ペプシンビーズに添加した。水氷浴中で２分間消化後、０．２２μｍフィルター（Ｍｅｒｃｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１，０００×ｇで３０秒間、０℃で遠心分離することによってビーズから分離し、直ちにＬＣ－ＭＳで分析した。各複合体およびＣＤ４単独の非重水素化対照試料を、Ｄ２Ｏの代わりにＨ２Ｏを用いて同じ条件下で調製した。さらに、各Ｎｂを、ＣＤ４を添加せずに消化し、Ｎｂ由来の消化性ペプチドのリストを作成した。ＣＤ４－Ｎｂ複合体のＨＤＸ実験を三重にして行った。１４の合成ペプチドの標準ペプチド混合物を用いて決定した方法の逆交換は２４％であった。
【0145】
クロマトグラフィーおよび質量分析
【0146】
ＨＤＸ試料は、ＲＳＬＣポンプ（ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣｎａｎｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、クロマトグラフィー用冷却デバイス（ＭｅＣｏｕｒ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｇｒｏｖｅｌａｎｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）および質量分析計Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で構成されるＬＣ－ＭＳシステムで分析された。冷却デバイスは、ＬＣカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、３００Å、１ｍｍ×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ ＧｍｂＨ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ））、ＨＰＬＣ溶媒の冷却ループ、試料ループ、およびインジェクションバルブを含有し、すべての成分を０℃に保った。試料は、５０μｌ／分の流速で２段階２０分の直線勾配を用いて分析された。溶媒Ａは０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）を含む８０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）であった。１０％Ｂで３分間脱塩した後、１０～２５％Ｂの９分間の直線勾配を適用し、続いて２５～６８．８％の８分間の直線勾配を適用した。実験は、以下：シースガス流量２５；ａｕｘガス流量５；ＳレンズＲＦレベル５０；スプレー電圧３．５ｋＶおよび毛細管温度３００℃の７０，０００解像度の器具構成を有するＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。
【0147】
ＨＤＸデータ分析
【0148】
予備的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ実験においてペプチド配列、保持時間および荷電状態を含有する消化性ペプチドリストを作成した。プロテオーム・ディスカバーｖ２．１．０．８１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によるタンパク質データベース検索および実装したＳＥＱＵＥＳＴ ＨＴ検索エンジンを用いて、ペプチドを正確な質量およびそれらの断片イオンスペクトルにより同定した。タンパク質データベースはＣＤ４およびペプシン配列を含有した。前駆体および断片の質量耐性をそれぞれ６ ｐｐｍおよび０．０５Ｄａに設定した。酵素選択性は適用されなかったが、同定されたペプチドは、アルギニン、ヒスチジン、リジン、プロリンおよびプロリン後の残基の後の切断によって生じたペプチドを除外するために手動で評価された。さらに、各Ｎｂについて別々のペプチドのリストを作成し、抗原消化物と質量、保持時間、および荷電が重複するペプチドを手動で除去した。重水素化試料をＭＳモードのみで記録し、生成したペプチドリストをＨＤＥｘａｍｉｎｅｒ ｖ２．５．０（Ｓｉｅｒｒａ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ、Ｍｏｄｅｓｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）にインポートした。重水素取り込みは重水素化ペプチドの重心質量の増加を用いて計算された。ＨＤＸは、ＣＤ４アミノ酸配列の８７％～８８％について追跡可能であった。ＣＤ４－ＮｂとＣＤ４－のみの間の各ペプチドの重水素取り込みの計算されたパーセンテージを比較した。Ｎｂ結合時に取り込みが５％以上減少したペプチドはいずれも保護されていると考えられた。
【0149】
エンドトキシンの決定および除去
【0150】
Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細菌エンドトキシン濃度を決定し、製造業者のプロトコールに従ってＥｎｄｏＴｒａｐ ＨＤ １ｍｌ（Ｌｉｏｎｅｘ）を用いて除去を行った。
【0151】
ＰＢＭＣ単離、細胞凍結、および解凍
【0152】
免疫学部またはＺＫＴ Ｔｕｅｂｉｎｇｇｅｎ ｇＧｍｂＨの健常ボランティアから、新鮮な血液、軟膜、または単核血球濃縮物を採取した。参加者はインフォームド・コンセントを与えられ、研究はＴｕｅｂｉｎｇｅｎ大学倫理審査委員会、プロジェクト１５６／２０１２Ｂ０１および７１３／２０１８ＢＯ２によって承認された。血液生成物をＰＢＳ １×（自家製、１０×Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で希釈し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＢｉｏｃｏｌｌ分離溶液（Ｂｉｏｃｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた密度勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣをＰＢＳ １×で２回洗浄し、ＮＣ－２５０細胞カウンター（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で計数し、１０％ＤＭＳＯ（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する熱不活化（ｈ．ｉ．）ウシ胎児血清（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁した。細胞を、直ちに、冷凍容器（Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）中の－８０℃冷凍庫に移した。少なくとも２４時間後、凍結細胞を液体窒素タンクに移し、使用するまで凍結保存した。実験のために、２．５％ ｈ．ｉ．ヒト血清（ＨＳ；ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、および５０μｍのβ－メルカプトエタノール（β－ＭＥ；Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補足したＩＭＤＭ（＋Ｌ－グルタミン＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）中で細胞を解凍し、１回洗浄し、計数し、下流のアッセイに使用した。
【0153】
合成ペプチド
【0154】
刺激には、以下のＨＬＡクラスＩＩペプチドを用いた：ＭＨＣクラスＩＩプール（ＨＣＭＶＡ ｐｐ６５ ａａ １０９－１２３ ＭＳＩＹＶＹＡＬＰＬＫＭＬＮＩ（配列番号１３）、ＨＣＭＶ ｐｐ６５ ａａ ３６６－３８２ ＨＰＴＦＴＳＱＹＲＩＱＧＫＬＥＹＲ（配列番号１４）、ＥＢＶＢ９ ＥＢＮＡ２ ａａ ２７６－２９０ ＰＲＳＰＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ（配列番号１５）、ＥＢＶＢ９ ＥＢＮＡ１ ａａ ５１４－５２７ ＫＴＳＬＹＮＬＲＲＧＴＡＬＡ（配列番号１６）、ＥＢＶ ＢＸＬＦ２ ａａ １２６－１４０ ＬＥＫＱＬＦＹＹＩＧＴＭＬＰＮＴＲＰＨＳ（配列番号１７）、ＥＢＶ ＢＲＬＦ１ ａａ １１９－１３３ ＤＲＦＦＩＱＡＰＳＮＲＶＭＩＰ（配列番号１８）、ＥＢＶＢ９ ＥＢＮＡ３ ａａ ３８１－３９５ ＰＩＦＩＲＲＬＨＲＬＬＬＭＲＡ（配列番号１９）、ＥＢＶＢ９ ＧＰ３５０ ａａ １６７－１８１ ＳＴＮＩＴＡＶＶＲＡＱＧＬＤＶ（配列番号２０）、ＩＡＢＡＮ ＨＥＭＡ ａａ ３０６－３１８ ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２１）またはＣＭＶｐｐ６５ ａａ ５１０－５２４ ＹＱＥＦＦＷＤＡＮＤＩＹＲＩＦ（配列番号２２））。すべてのペプチドを合成し、水１０％ＤＭＳＯに溶解した。
【0155】
ＰＢＭＣの刺激および培養
【0156】
ＭＨＣクラスＩＩペプチドに対するエクスビボＣＤ４＋Ｔ細胞反応性について事前にスクリーニングしたドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、１μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＴ細胞培地（ＴＣＭ；ＩＭＤＭ＋１×Ｐ／Ｓ＋５０μＭ β－ＭＥ＋１０％ｈ．ｉ．ＨＳ）中、２～３×１０６細胞／ｍＬの濃度で３７℃、７．５％ＣＯ２で休止した。休止後、細胞を１回洗浄し、計数し、最大１×１０８細胞を、１．５－２μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）を用いて１ｍＬのＰＢＳ １×中で２０分間標識した。細胞を、ＣＦＳＥ標識後に１０％ＦＢＳを含有する培地中で２回洗浄し、無血清ＩＭＤＭ培地中で５μＭ、０．５μＭ、または０．０５μＭのＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ４、または対照Ｎｂとともに１時間、３７℃でインキュベートした。濃度および期間は、臨床適用中に予想されるおおよその濃度および血清保持時間を模倣するように選択された。インキュベーション後、細胞を２回洗浄し、計数し、各条件を３つの部分に分け、４８ウェル細胞培養プレート（１．６～２．５×１０６細胞／ウェル、三重にして）に播種した。細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ－Ｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μｇ／ｍＬのＭＨＣクラスＩＩペプチド（複数可）を用いて刺激するか、または刺激せずに放置し、３７℃および７．５％ＣＯ２で培養した。２ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を３、５、および７日目に添加した。４日目に培養の１／３、６日目および８日目に培養の１／２、および１２日目に残りの細胞を回収し、計数し、フローサイトメトリー分析のために染色した。ドナー１については、増殖／活性化状態およびサイトカイン産生を２つの異なる実験で分析したが、ドナー２および３については、３つのアッセイのために単一の実験由来の細胞を使用した。
【0157】
Ｔ細胞の増殖および活性化の評価
【0158】
４、６、および８日目からの細胞を９６ウェル丸底プレートに移し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナトリウム（Ｒｏｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）＋２％ｈ．ｉ．ＦＢＳで２回洗浄した。細胞外染色は、ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｃｙ７（ＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８ ＢＶ６０５（ＲＰＡ－Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、死細胞マーカーＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＣ９６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ６９ ＰＥ（ＦＮ５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行い、４℃で２０分間インキュベートした。すべての抗体は、事前に試験された最適濃度で使用された。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。同日、ＤＩＶＡソフトウェア（バージョン６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を装備したＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）ＳＯＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いておよそ５００，０００個の細胞を獲得した。増殖ＣＤ４＋細胞のパーセンテージは、ＣＦＳＥ陰性細胞の評価、ＣＤ６９＋またはＣＤ２５＋のパーセンテージによる活性化によって測定された。
【0159】
細胞内サイトカイン染色によるＴ細胞機能の評価
【0160】
１２日目に、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（複数可）で刺激され、培養された細胞を９６ウェル丸底プレート（０．５～１×１０６細胞／ウェル）に移し、１０μｇ／ｍｌの同ペプチド（複数可）、１０μｇ／ｍｌのブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；陽性対照）、または１０％ＤＭＳＯ（陰性対照）を用いて再刺激した。タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を刺激と同時に添加した。３７℃および７．５％ＣＯ２で１４時間刺激した後、細胞を蛍光標識抗体ＣＤ４ ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ８ ＢＶ６０５、およびＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａで細胞外染色し、４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を１回洗浄し、次に、製造業者の指示に従ってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて固定および透過処理し、ＴＮＦ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（Ｍａｂ１１）、ＩＬ－２ ＰＥ－Ｃｙ７（ＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＩＦＮ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ７００（４Ｓ．Ｂ７）およびＣＤ１５４ ＡＰＣ（２４３１）抗体（すべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）７９で細胞内染色し、２回洗浄した。同日、ＤＩＶＡソフトウェア（バージョン６、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を装備したＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）ＳＯＲＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いておよそ５００，０００個の細胞を獲得した。フローサイトメトリー分析はすべて、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．６．２を用いて行われ、ゲーティング戦略を図９に示す。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン９．０．０を用いて行われた。
【0161】
全血刺激およびサイトカイン放出アッセイ
【0162】
１００μｌのリチウム－ヘパリン血液を１時間、３７℃および７．５％ＣＯ２でインキュベートした。その後、血液を、２５０μｌの最終体積中、５μＭのＮｂ（ＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ４または対照Ｎｂ）、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＵＳＡ）、または２μｇ／ｍＬのＰＨＡ－Ｌ（無血清ＩＭＤＭ培地）で刺激するか、または３７℃および７．５％ＣＯ２において２４時間刺激しなかった。２回の遠心後、赤血球を移すことなく上清を回収した。上清をサイトカイン測定するまで－８０℃で凍結した。ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒａ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦのレベルは、市販の捕捉抗体および検出抗体ならびにキャリブレータータンパク質からなる「自家開発した」Ｌｕｍｉｎｅｘベースのサンドイッチ免疫アッセイのセットを用いて決定された。正確性、精度、平行度、頑健性、特異性および感受性に関して、すべてのアッセイを研究前に徹底的に検証した。試料を少なくとも１：４またはそれ以上に希釈した。予め希釈した試料またはキャリブレータータンパク質を捕捉被覆したマイクロスフェアとともにインキュベートした後、ビーズを洗浄し、ビオチン化した検出抗体とともにインキュベートした。ストレプトアビジン－フィコエリトリンは、視覚化のためのさらなる洗浄工程の後に添加された。対照の目的で、各マイクロタイタープレートにキャリブレーターおよび品質管理試料を含めた。すべての測定は、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）４．２ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭａｐ（登録商標）３Ｄアナライザシステム上で行われた。データ分析には、ＭａｓｔｅｒＰｌｅｘ ＱＴバージョン５．０を採用した。標準曲線および品質管理試料は、適切なアッセイ性能を確実にするために、ウェストガード規則に適合した内部基準に従って評価された。
【0163】
フローサイトメトリーによるマウスＣＤ４
＋
細胞への交差種反応性結合の分析
【0164】
マウスＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上での正の選択によりＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスの脾臓およびリンパ節から単離された。ヒトＣＤ４＋細胞は、ＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）全血ＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて血液から抽出された。単一の細胞懸濁液は、１％ウシ胎児血清／ＰＢＳ中の０．７５μｇ／ｍｌのＣＤ４－Ｎｂ－Ｃｙ５．５（約４７～６０ｎＭ）またはＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５（約５１ｎＭ）とともに、４℃で２０分間インキュベートされ、その後、ＬＳＲ－ＩＩサイトメーター（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析された。
【0165】
ＣＤ４を発現するＨＰＢ－ＡＬＬ腫瘍の光学的イメージング
【0166】
ヒトＴ細胞白血病ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｕｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨ、ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。１０７個のＨＰＢ－ＡＬＬ細胞を、７週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤガンママウス（ＮＳＧ、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｕｌｚｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の右上腹部に皮下注射し、腫瘍増殖を２～３週間モニタリングした。腫瘍が直径約７ｍｍに達した場合、５μｇのＣＤ４－Ｎｂ－Ｃｙ５．５または対照Ｎｂ（ＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５）を各々２匹のマウスの尾静脈に投与した。光学イメージング（ＯＩ）を、ＩＶＩＳスペクトルインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、２４時間にわたって短期イソフルラン麻酔において繰り返し行った。最初のＮｂ投与から４日後、ＣＤ４－Ｎｂ－Ｃｙ５．５群にＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５（およびその逆）を投与し、２４時間にわたりＯＩにより腫瘍の生体内分布を同一に分析した。最終イメージング時点の後、動物を屠殺し、腫瘍をエクスビボＯＩ分析のために摘出した。データを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．４ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分析した。蛍光強度は、腫瘍境界周辺の目的とする領域を引くことによって定量化し、Ｎｂ注射前のバックグラウンド蛍光シグナルによって差し引いた平均放射効率（光子／ｓ）／（μＷ／ｃｍ２）で表した。すべての実験はドイツ動物保護法に従って行われ、地方自治体（Ｒｅｇｅｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ）の承認を得た。
【0167】
移植された異種移植腫瘍の免疫蛍光染色
【0168】
ｈＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５含有マウス腫瘍の新しく凍結された５μｍ切片は、ＬＳＭ ８００レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて分析された。その後、切片をペルジョデート－リジン－パラホルムアルデヒドを用いて固定し、ロバ血清を用いてブロックし、一次ウサギ抗ＣＤ４抗体（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ、ＵＳＡ）を用いて染色した。結合抗体は、ロバ－抗ウサギ－Ｃｙ３二次抗体（Ｄｉａｎｏｖａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可視化された。ＹＯ－ＰＲＯ－１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を核染色に使用した。同じ領域の獲得された画像を手動で重ね合わせた。
【0169】
ＮＯＤＡＧＡおよび
６４
Ｃｕによる放射性同位元素標識
【0170】
６４Ｃｕによるコンジュゲーションおよび放射性同位元素標識のためのすべての手順は、金属を含まないデバイスおよびＣｈｅｌｅｘ １００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）前処理緩衝液を用いて行われた。アジド修飾されたＮｂ（１００μｇ）は、２５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中の４μｌの５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて３０分間、室温で処理された。タンパク質は、２５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６中の１５モル当量のＢＣＮ－ＮＯＤＡＧＡ（ＣｈｅＭａｔｅｃｈ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）と３０分間、室温で反応させ、続いて４℃で１８時間インキュベートした。過剰のキレート剤は、同じ緩衝液を用いて限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍｌ、３ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって除去された。［６４Ｃｕ］ＣｕＣｌ２（０．１Ｍ ＨＣｌ中１５０ＭＢｑ）を１．５体積の０．５Ｍ酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ６）を添加することにより中和し、ｐＨ５．５とした。この溶液に、５０μｇのコンジュゲートを添加し、４２℃で６０分間インキュベートした。次に、１μｌの２０％ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）溶液を添加して標識反応を停止させた。放射性同位元素の完全な取り込みは、薄層クロマトグラフィー（ｉＴＬＣ－ＳＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；移動相０．１Ｍクエン酸ｐＨ５）および高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ；ＢｉｏＳｅｐ ＳＥＣ－ｓ２０００、３００×７．８ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ；０．５ｍＭ ＥＤＴＡを有する移動相ＤＰＢＳ）による各放射合成後に確認された。インビボＰＥＴイメージングに使用されたすべての放射性標識された調製物は、≧９７％（ｉＴＬＣ）および≧９４％（ＨＰＳＥＣ）の放射化学的純度を有した。
【0171】
インビトロラジオイムノアッセイ
【0172】
ここで、１０７のＨＰＢ－ＡＬＬまたはＤＨＬ細胞は、１時間、３７℃で、１ｎｇ（３ＭＢｑ／μｇ）の放射性標識された６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１または６４Ｃｕ－ＧＦＰ－Ｎｂとともに三重にしてインキュベートされ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄された。残りの細胞結合放射能は、Ｗｉｚａｒｄ ２４８０ガンマカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて測定され、総添加活性のパーセンテージとして定量した。
【0173】
ＰＥＴ／ＭＲＩ
【0174】
ヒトＣＤ４ノックイン（ｈＣＤ４ＫＩ、ｇｅｎＯｗａｙ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）およびｗｔ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に５μｇ（約１５ＭＢｑ）の６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１を静脈内注射した。スキャン中、マウスを１００％酸素中の１．５％イソフルランで麻酔し、水を満たした加熱マットで加温した。１．５、３、６、および２４時間後に、専用の小動物Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒｓ、Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ、ＴＮ、ＵＳＡ；取得時間：６００秒）を用いて１０分間の静的ＰＥＴスキャンを行った。解剖学的情報については、小動物７ Ｔ ＣｌｉｎＳｃａｎ磁気共鳴スキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ＧｍｂＨ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＰＥＴスキャンした直後に連続Ｔ２ ＴｕｒｂｏＲＡＲＥ ＭＲ画像を獲得した。注射後最初の９０分の動的ＰＥＴデータを２匹のマウスで得て、１０分フレームに分けた。コバルト５７点源による減衰補正後、ＰＥＴ画像を規則化サブセット期待最大化（ＯＳＥＭ３Ｄ）アルゴリズムを用いて再構成し、Ｉｎｖｅｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）により分析した。各臓器の目的とする体積を解剖学的ＭＲＩに基づいて描出し、対応するＰＥＴトレーサー取り込みを獲得した。得られた値を減衰補正し、体積あたりの注射線量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｍｌ）で表した。各臓器の重量および放射能を測定することにより、最終イメージング時点の後にエクスビボｇ－カウントを行った。定量のために、注射された放射性トレーサーの標準化されたアリコートを測定に加えた。
【0175】
分析および統計
【0176】
フローサイトメトリーデータのデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．６．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＴ、Ａｓｈｌａｎｄ、Ｏｒｅｇａｎ、ＵＳＡ）を用いて行い、グラフ調整および統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８．３．０以上）を用いて行われた。
【0177】
結果
【0178】
高親和性ＣＤ４ナノボディの生成
【0179】
ヒトＣＤ４（ｈＣＤ４）に対して方向付けされたＮｂを生成するために、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）を、８７日間の免疫化プロトコールに従って、ｈＣＤ４の組換え細胞外部分を用いて免疫化した。その後、動物の重鎖抗体（ＶＨＨまたはＮｂ）の可変重鎖の全レパートリーを表す約４×１０７クローンを含むＮｂファージミドライブラリーを生成した。ファージディスプレイは、完全長ヒトＣＤ４（ＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞株）を安定に発現する受動吸着された精製したｈＣＤ４またはＣＨＯ細胞のいずれかを用いて行われた。各条件について２サイクルのファージディスプレイ後、合計６１２個の個々のクローンを全細胞ファージＥＬＩＳＡによって分析し、２１個の陽性結合体を同定した。配列分析により、相補性決定領域（ＣＤＲ）３に従って、５つの異なるＢ細胞系統を表す１３個の固有のＮｂが明らかになった（図１Ａ）。ＣＤ４－Ｎｂ１－ＣＤ４－Ｎｂ５と呼ばれる各系統の１つの代表的なＮｂを細菌（大腸菌）中で発現させ、固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて高純度で単離し、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った（図１Ｂ）。選択されたＮｂが哺乳類細胞の原形質膜に局在化する完全長ｈＣＤ４に結合することができるかどうかを試験するために、ＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞の生細胞染色を行った（図１Ｃ）。４℃で実施した画像は原形質膜の染色を示すが、３７℃では蛍光シグナルは細胞体全体に局在化し、おそらく受容体結合したＮｂのエンドサイトーシスによる取り込みの結果であると考えられる。ＣＨＯ ｗｔ細胞は、両方の温度で５つのＣＤ４－Ｎｂのいずれによっても染色されなかった（データを示さず）。ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３はいずれも全細胞パンニングによって同定され、ＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞の強い染色を提示した。組換えｈＣＤ４によるパンニングに由来するＮｂのうち、ＣＤ４－Ｎｂ２はまた強い細胞染色を示したが、ＣＤ４－Ｎｂ４による染色は弱いシグナルを示し、ＣＤ４－Ｎｂ５はこれらの条件下では染色を示さず、その結果、さらなる分析から除外された（図１Ｃ）。
【0180】
親和性を定量的に評価するために、センサーチップに固定化したｈＣＤ４のビオチン化細胞外ドメイン上でＮｂの連続希釈を測定するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を行った。ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ２について、決定されたＫＤ値は、それぞれ約５および約７ｎＭの低いナノモル範囲にあり、一方、ＣＤ４－Ｎｂ３およびＣＤ４－Ｎｂ４は、それぞれ、７５ｎＭおよび１３５ｎＭの低い親和性を提示した（図１Ｄ、表１、図６Ａ）。さらに、対応するＥＣ５０値は、フローサイトメトリーにより、ＨＥＫ２９３－ｈＣＤ４細胞上の完全長原形質膜に位置するｈＣＤ４を用いて決定された。細胞染色および生化学的に決定された親和性に従って、これらの値は、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ２に対する強い機能的結合を示し、ＥＣ５０値はナノモル以下（約０．７ｎＭ）であったが、ＣＤ４－Ｎｂ３およびＣＤ４－Ｎｂ４は、実質的に低い細胞親和性を提示した（図１Ｅ、表１、図６Ａ）。本明細書では、例示的に、単離され、細胞常在性ｈＣＤ４に結合する４つのＣＤ４－Ｎｂが生成された。ＣＤ４－Ｎｂ４はより低い親和性を示したが、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ２は低いナノモル範囲で高い親和性を提示した。
【0181】
ドメインマッピング
【0182】
次に、酵素的カップリングを、ＣＤ４－Ｎｂの部位指向性官能化のためにソルターゼＡを用いて適用した。それによって、単一のフルオロフォアにコンジュゲートしたペプチドをＣＤ４－ＮｂのＣ末端に連結させ、１：１４２の定義された標識比を得た。蛍光色素ＣＦ５６８にカップリングさせたＣＤ４－Ｎｂソルターゼを採用する生細胞免疫蛍光イメージングは、すべてのＣＤ４－ＮｂがＣＨＯ－ｈＣＤ４細胞の細胞常在性ｈＣＤ４に結合するそれらの能力を保持することを示した（データを示さず）。選択されたＣＤ４－Ｎｂの結合部位を局在化するために、ｈＣＤ４のドメイン欠失突然変異体を生成した。これらの突然変異体の発現および表面局在化は、ＣＤ４のドメインＤ１に結合する抗体ＲＰＡ－Ｔ４で染色することによって確認された。ドメインＤ１を欠損する突然変異体については、Ｎ末端ＢＣ２タグ４３を導入して、蛍光標識ｂｉｖＢＣ２－Ｎｂ ４２を用いた生細胞表面検出を可能にした（データを示さず）。一過性に発現されたドメイン欠失突然変異体を、生細胞免疫蛍光イメージングによりＣＦ５６８で標識されたＣＤ４－Ｎｂの結合について試験した。対照として、非特異的に蛍光標識したＧＦＰ結合Ｎｂ（ＧＦＰ－Ｎｂ）を添加した（図２Ａ；データを示さず）。
【0183】
これらの結果に基づいて、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３の結合はドメインＤ１に割り当てられ、一方、ＣＤ４－Ｎｂ２およびＣＤ４－Ｎｂ４はドメインＤ３および／またはｈＣＤ４のＤ４に結合する。ＧＦＰ－Ｎｂの結合は検出されなかった。異なるＣＤ４－Ｎｂの組合せ結合をさらに調べるために、ＢＬＩによりエピトープビニング分析を行った。組換え完全長ｈＣＤ４をセンサーチップに固定し、ＣＤ４－Ｎｂの組み合わせを連続的に結合させた（図７）。驚くことではないが、異なるドメインに結合するＣＤ４－Ｎｂは、組合せ結合を提示した。興味深いことに、ＣＤ４－Ｎｂ１とＣＤ４－Ｎｂ３の組み合わせについて同時に結合が検出され、両方のｈＣＤ４の標的ドメインＤ１は、両方のＣＤ４－ＮｂがドメインＤ１内の異なるエピトープに結合することを指示した。対照的に、ＣＤ４－Ｎｂ２およびＣＤ４－Ｎｂ４に対する同時結合は観察されず、後者のＮｂ対のドメインＤ３／４における近接または重複エピトープの可能性が示唆された。これらの知見をさらに支持し、それぞれの結合部位をより正確に位置決めするために、ＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ２またはＣＤ４－Ｎｂ３に結合したｈＣＤ４の水素－重水素交換（ＨＤＸ）質量分析を行った（図２Ｂ－Ｅ）。その低い親和性のために、ＣＤ４－Ｎｂ４はＨＤＸ－ＭＳ分析に供されなかった。ドメイン欠失突然変異体の免疫蛍光染色および組合せ結合分析から得られたデータによれば、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３の結合は、ＨＤＸからドメインＤ１の配列を保護し、一方、ＣＤ４－Ｎｂ２は、ドメインＤ３およびｈＣＤ４のＤ４の配列を保護した（図２Ｂ）。
【0184】
ＣＤ４－Ｎｂ１の結合に関して得られた結果（図２Ｃ）は、ＣＤ４－Ｎｂ３の結果（図２Ｄ）と類似しており、いずれかのＮｂの結合によって、アミノ酸残基（ａａ）Ｔ１７～Ｎ７３の範囲の配列の交換が低下するが、個々の配列セクションでは保護の程度が異なる。ＣＤ４－Ｎｂ１では、ＨＤＸからの最大の保護は、ドメインＤ１の免疫グロブリン折り畳みのβ鎖Ｃ’およびＣ’’に対応するａａ Ｋ３５－Ｌ４４、およびβ鎖ＤおよびＥを含む残基ａａ Ｋ４６－Ｋ７５の範囲の配列で観察された。対照的に、ＣＤ４－Ｎｂ３の結合は、後者の配列内ではＨＤＸのわずかな減少しか付与されないが、さらにβ鎖ＧおよびＦならびにそれらの中間ループに対応する配列ａａ Ｃ８４－Ｅ９１を保護する。ＣＤ４－Ｎｂ２の結合は、配列ａａ Ｗ２１４－Ｆ２２９（β鎖ＣおよびＣ’）およびａａ Ｋ２３９－Ｌ２５９（β鎖Ｃ’’－Ｅ）を保護し、ドメインＤ４のβ鎖Ａの一部として、少数の配列ａａ Ｒ２９３－Ｌ２９６を保護する（図２Ｅ）。要約すると、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３は、ｈＣＤ４のドメインＤ１に位置するそれらのエピトープと同時に結合することができ、一方、ＣＤ４－Ｎｂ２のエピトープは、主にドメインＤ３に位置する。ＣＤ４－Ｎｂ４がＣＤ４－Ｎｂ２と同時にｈＣＤ４に結合することができないことに基づいて、後者の２つのＮｂは、近接または重複したエピトープを有すると評価された。
【0185】
ＣＤ４－ＮｂのヒトＰＢＭＣへの結合
【0186】
すべての選択されたＮｂが組換え体および外因性に過剰発現された細胞ｈＣＤ４に結合することを実証し、次に、ヒトＰＢＭＣ上の内因性ＣＤ４の生理学的に関連するレベルへの結合の能力および特異性を決定した。３人のドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、抗ＣＤ３抗体と組み合わせてＣＦ５６８（高親和性ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ２については１００ｎＭ；低親和性ＣＤ４－Ｎｂ３およびＣＤ４－Ｎｂ４については１０００ｎＭ）にカップリングさせたＣＤ４－Ｎｂ１－４と共染色し、フローサイトメトリーにより二重陽性細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）のパーセンテージを分析した（図３Ａ、図８）。陽性対照としての抗ＣＤ４抗体による染色と比較して、すべてのＣＤ４－Ｎｂは、試験されたすべてのドナーについて同程度の割合の細胞を染色したが、一方、非特異的ＧＦＰ－Ｎｂは、最高濃度（１０００ｎＭ）においてさえ、無視できる程度の割合の二重陽性細胞を生じた（図３Ｂ、表２）。さらに分析は、従来の抗ＣＤ４抗体で観察されるように、ＣＤ４－ＮｂはＣＤ３－細胞のかなりの部分を染色することを明らかにし、すべての選択された候補が、より低いレベルのＣＤ４を発現する単球、マクロファージ、または樹状細胞などの細胞を認識することができることを指示する。
【0187】
ＣＤ４－ＮｂがＣＤ４＋Ｔ細胞および免疫細胞の活性化、増殖およびサイトカイン放出に及ぼす影響
【0188】
臨床イメージングトレーサーとしての想定される用途に向けて、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化、増殖およびサイトカイン放出に対するそれらの影響に関する、ＣＤ４－Ｎｂと関連する基本的な問題を評価した。第１に、ＣＤ４－Ｎｂ１－４調製物中に存在する細菌性エンドトキシンの有害作用を除外するために、デプリーションクロマトグラフィーによりエンドトキシンを除去し、ＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ４および非特異的ＧＦＰ－Ｎｂについて、０．２５ＥＵ／ｍｇ未満のＦＤＡ許容エンドトキシンレベルを得た。
【0189】
結果として、これらの実験的研究は、対照としてＣＤ４－Ｎｂ１、ＣＤ４－Ｎｂ４およびＧＦＰ－Ｎｂを用いて継続した。簡単に説明すると、３人の予備選択された健常ドナー由来のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識されたヒトＰＢＭＣを、３７℃で１時間、０．０５μＭ～５μＭ濃度のＣＤ４－Ｎｂまたは対照Ｎｂで予備処理し、臨床適用中の期待される概算濃度および血清保持時間を模倣した。次に、細胞を洗浄してＮｂを除去し、抗原性（同族ＭＨＣＩＩペプチド）または非抗原性刺激（フィトヘマグルチニン、ＰＨＡ－Ｌ）で刺激し、４、６および８日後に、フローサイトメトリーにより、図９Ａに示されるゲーティング戦略を用いて分析した。観察された非常に類似したＣＦＳＥ強度プロファイルによれば、細胞分裂の総数は、異なるＮｂ処理によって影響されなかった（例示的に、６日目の３人のドナーのうちの１人について示された；図９Ａ）。同じドナーおよび時点の試料について、増殖細胞のパーセンテージにおける実質的な差異は、Ｎｂ添加なしと個々のＮｂ処理の間で観察されなかった。ドナー間では異なるが、両方の刺激について、増殖細胞の平均パーセンテージは時間とともに増加し、条件間に顕著な差はなかった（図４Ａ）。また、細胞活性化の定量的指標として、ＣＤ４＋Ｔ細胞上の非常に早期の活性化マーカー（ＣＤ６９）およびＩＬ－２受容体α鎖（ＣＤ２５）の細胞表面誘導を測定した（図４Ｂ）。同じドナーの試料および刺激の中で、すべてのＮｂ処理について非常に類似した活性化プロファイルが見出された。ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージは、ＭＨＣＩＩペプチド刺激に対して経時的に着実に増加したが、ＰＨＡ刺激条件では、陽性細胞のパーセンテージは、分析の全時点で同様に高かった。重要なことは、ドナー間の差にかかわらず、分析において、同じドナーからの個々のＮｂ処理は、いずれの時点においても、両方の刺激についてＣＤ４＋ＣＤ２５＋またはＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞のパーセンテージにおいて有意差を生じさせなかったことである。
【0190】
次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン発現は、同族ＭＨＣＩＩペプチドによる再刺激後の細胞内サイトカイン染色によって分析された。対応するゲーティング戦略を図９Ｂに示す。異なるＮｂで処理された同じドナーの試料は、刺激なしで、およびＭＨＣＩＩペプチドで刺激した場合に、サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＦＮ－γもしくはＩＬ－２）または活性化マーカー（ＣＤ１５４）陽性細胞の割合が非常に類似していた（図４Ｃ）。全体として、ＣＤ４－Ｎｂへの曝露は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖、活性化またはサイトカイン産生に影響を及ぼさなかった。さらに、さらに３人のドナーの全血試料からのサイトカイン放出に対するＣＤ４－Ｎｂの潜在的効果を分析した。リポ多糖類（ＬＰＳ）またはＰＨＡ Ｌで刺激した場合、一連の炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインを用いて血清濃度を測定した（図２０Ｂ）。いくつかのサイトカインについてドナー間に有意差があったが、ＣＤ４－Ｎｂの存在は刺激試料と非刺激試料のいずれにおいても有意差をもたらさなかった（図１０）。
【0191】
ＣＤ４－Ｎｂのインビボ光学的イメージング
【0192】
光学的インビボイメージングについて、ＣＤ４－Ｎｂは、アジド基のソルターゼ媒介付着によりフルオロフォアＣｙ５．５（ＣＤ４－Ｎｂ－Ｃｙ５．５）で標識し、続いて、ＤＢＣＯ－Ｃｙ５．５をクリック化学的に添加した。第１に、マウスＣＤ４＋リンパ球に対する４つのＣｙ５．５で標識されたＣＤ４－Ｎｂの潜在的交差反応性を試験した。注目すべきことに、フローサイトメトリー分析は、選択されたＣＤ４－ＮｂのいずれもマウスＣＤ４＋細胞に結合することができないことを示し、ヒトＣＤ４への排他的結合を示唆した。さらに、低親和性結合ＣＤ４－Ｎｂ４は、ここで使用した濃度（０．７５μｇ／ｍｌ、約４９ｎＭ）では、マウスおよびヒトＣＤ４＋細胞のいずれにも結合しなかった（図１１）。ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ４は、マウス異種移植モデルを用いてインビボ標的特異性および動的分布についてさらに分析された。
【0193】
ヒトＣＤ４＋を発現する腫瘍を確立するために、ＮＳＧマウスにＣＤ４＋Ｔ細胞白血病ＨＰＢ－ＡＬＬ細胞４４を皮下接種した。２～３週間後、ＨＰＢ－ＡＬＬ異種移植片を移植したマウスに５μｇのＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５、ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５、または対照Ｎｂ（ＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５）を注射し、２４時間にわたって光学的に画像化した（図５Ａ、図１２Ａ）。対照ＮｂのＣｙ５．５シグナル強度（ＳＩ）は１０～２０分以内にピークに達し、その後、それぞれ２時間および２４時間で最大レベルの半分および４分の１に急速に低下した（図５Ｂ、図１２Ｂ）。ＳＩ低親和性ＣＤ４－Ｎｂ４－Ｃｙ５．５は、いつでも対照ＮｂのＳＩを超えなかったが（図１２Ｂ）、ＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５は、ＨＰＢ－ＡＬＬ内で対照Ｎｂの約１．８倍の最大ＳＩに達し、３０分後には最大値の約９０％、４時間後には最大値の約８０％まで徐々に低下した（図５Ｂ）。ＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５とＧＦＰ－Ｎｂ－Ｃｙ５．５の間の実験マウスのＨＰＢ－ＡＬＬ異種移植片のＳＩの違いに基づいて、最適標的蓄積と特異性は注射後６０～１２０分の間で観察された（図５Ｂ）。２４時間後、マウスを安楽死させ、外植した腫瘍内のフルオロフォアで標識されたＣＤ４ Ｎｂの存在をＯＩにより分析した（図５Ｃ、図１２Ｃ）。対照と比較して、ＣＤ４－Ｎｂ１－Ｃｙ５．５を注射されたマウス由来の腫瘍は、約４倍高いＣｙ５．５ ＳＩを有し、Ｎｂ由来の蛍光標識された免疫プローブに対する良好なシグナル対ノイズ比が後の時点においてさえも指示された。
【0194】
異種移植片内のＣＤ４－Ｎｂ１のＣＤ４特異的標的化を確認するために、注射の２時間後および２４時間後にＨＰＢ－ＡＬＬ腫瘍のエクスビボ免疫蛍光法を行った（図１３）。インビボでのＯＩシグナルがピークに達した初期の時点で、ＣＤ４－Ｎｂ１は腫瘍全体に広く分布していたが、ＧＦＰ－Ｎｂを注射されたマウスではＣｙ５．５シグナルは検出されなかった（図１３Ａ、Ｂ）。単一細胞レベルでの半定量分析では、ＨＢＰ－ＡＬＬ細胞の表面に強いＣＤ４－Ｎｂ１結合が認められ、ＣＤ４抗体シグナルおよび一部の細胞におけるＣＤ４－Ｎｂ１の内在化と相関していた（図１３Ｃ）。無関係なＧＦＰ－Ｎｂの投与では、Ｎｂ結合は観察されなかった（図１３Ｄ）。強く内在化されたＣＤ４－Ｎｂ１（図１３Ｅ、Ｇ）の注射２４時間後の領域が観察されたが、残存ＣＤ４－Ｎｂ１取り込みが低い領域も観察された（図１３Ｅ、Ｈ）。
【0195】
異種移植片モデルからの光学的イメージングデータは、ＣＤ４－Ｎｂ４ではなく高親和性ＣＤ４－Ｎｂ１が、投与後の短時間（３０～１２０分）内でインビボでＣＤ４＋細胞を特異的に可視化するのに適していることを明確に指示する。このモデルは、生物におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の自然な分布を反映していないため、ＣＤ４＋免疫細胞の生理学的組成を可視化することができるモデルを用いて継続した。このように、正常な免疫学的機能およびＴ細胞分布が回復する間に、マウスＣＤ４抗原の細胞外画分をｈＣＤ４に置換したヒト化ＣＤ４マウスノックインモデル（ｈＣＤ４ＫＩ）を用いた。
【0196】
６４
Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１はＣＤ４＋Ｔ細胞に富む臓器に特異的に蓄積する
【0197】
免疫ＰＥＴ適合トレーサーを生成するために、アジドをカップリングさせたＮｂに添加された銅キレート化ＢＣＮ－ＮＯＤＡＧＡ基を用いて、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＧＦＰ－ＮｂをＰＥＴ同位体６４Ｃｕで標識した。放射性化学的純度が高く（≧９５％）、ＣＤ４を発現するＨＢＰ－ＡＬＬ細胞へのインビトロでの６４Ｃｕ－ｈＣＤ４－Ｎｂ１の特異的結合（４６．５％±５．６％）が、ＣＤ４陰性ＤＨＬ細胞への非特異的結合または放射性標識された６４Ｃｕ－ＧＦＰ－Ｎｂ対照よりも約３０倍高かった（データを示さず）。その後、６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１をｈＣＤ４ＫＩおよびｗｔ Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて静脈内注射し、ＰＥＴ／ＭＲＩを２４時間にわたって繰り返し行った。ｈＣＤ４ＫＩ動物のうち２匹では、最初の９０分間にわたるトレーサーの生体内分布に加えて、続いて動的ＰＥＴを行った。小型の免疫トレーサーで予想されたように、最初の１０分以内の初期の取り込みピーク後、６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１は腎排泄を介して血液、肺、および肝臓から速やかに除去された。野生型と比較して、Ｔ細胞上にｈＣＤ４抗原を保有するマウスは、リンパ節、胸腺、肝臓、および脾臓におけるトレーサー蓄積の増加を示した（図２３Ａを参照されたい）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を多数保有することが公知であるこれらの臓器では、臓器バックグラウンドからのＣＤ４＋特異的シグナルの識別は、注射後３時間で最適であった（図２３Ｂを参照されたい）。ここで、リンパ節は、ｈＣＤ４ＫＩマウスにおいて、ｗｔ同腹仔と比較して、約３倍、脾臓で約２．５倍、および肝臓で約１．４倍高い６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１蓄積を生じた（図２３Ｃを参照されたい）。対照的に、血液、筋肉、肺、および腎臓の類似した取り込みレベルが両群において観察された。トレーサー注射後２４時間のエクスビボ生体分布を分析したところ、ｈＣＤ４を発現するマウスのリンパ節および脾臓における６４Ｃｕ－ＣＤ４－Ｎｂ１の持続的蓄積が確認されたが、１群あたりの動物数は限られていたため、統計学的分析はできなかった。
【0198】
上記のデータは、高親和性結合ＣＤ４－Ｎｂ１が、非侵襲的光学的イメージングおよびＰＥＴベースのイメージングによってインビボでＣＤ４＋細胞を可視化するのに適していることを強く指示する。
【0199】
ＣＤ４－Ｎｂ１の標的化修飾／官能化
【0200】
アミン反応性架橋剤を用いて、利用可能なＮ末端アミノ基で特異的に標的化修飾／官能化を可能にするために、ＣＤ４－Ｎｂ１中のすべてのリジン残基をアルギニン残基に置換した。ナノボディの突然変異体バージョンは、細菌中で容易に発現され、その突然変異していない対応物と同様の産生レベルをもたらした。機能分析のために、本発明者らはバイオレイヤー干渉法を用いて突然変異体ナノボディの結合親和性を測定した。アルギニン残基に対するリジン残基の交換（配列の誘導：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＲＬＡＭＳＷＨＲＥＰ ＰＧＲＧＲＥＷＬＡＤ ＩＤＳＳＧＤＴＴＤＹ ＬＡＳＶＲＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹ ＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤ ＴＧＶＹＹＣＡＳＲＥ ＤＰＰＧＹＷＧＱＧＴ ＱＶＴＶＳＳ（配列番号１５６））は、ヒトＣＤ４に対する突然変異体ＣＤ４－Ｎｂ１の親和性（ＫＤ）が約１ｎＭであることによって反映されるように、結合特性には影響を及ぼさず、突然変異していないＣＤ４－Ｎｂ１対して以前に決定された親和性（ＫＤ ５．１ｎＭ）と同等であった（図２４参照）。
【0201】
検討の要約
【0202】
本明細書に提示された本発明において、生物学的に不活性なナノボディとして、例えば、種々の生物医学的研究用途におけるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の可視化およびモニタリングのための新規な免疫プローブとして、非侵襲的なインビボイメージングに焦点を当てて使用することができるＣＤ４ Ｎｂを開発した。診断薬としての用途を超えて、ＣＤ４－Ｎｂは様々な治療機会を提供する。ＣＤ４の細胞機能を考慮すると、詳細なエピトープの特徴付けは、例えば、ＣＤ４とＭＨＣＩＩ複合体の間に生じる一過性の相互作用に影響を与えることによって、またはリガンド結合の遮断を通じて、Ｎｂが認識されたエピトープに依存して内因性ＣＤ４を調節する可能性があるため、特に興味深い。ＭＨＣ－ＩＩ結合はＣＤ４抗原のドメインＤ１に位置するが、ＴＣＲとＣＤ４の共局在化がドメインを介してブロックされた場合、Ｔ細胞の活性化は停止する。
【0203】
本発明で生成されたデータから、新しく生成されたＮｂは生物学的に不活性であり、したがって、全長抗体または他の抗体断片と比較して有益であると結論付けることができる。また、提供されたデータは、新しく生成されたＣＤ４－Ｎｂがインビボイメージングに適したプローブであることを証明する。選択されたＣＤ４ ＮｂがヒトＣＤ４に排他的に結合するが、マウスのホモログには結合しないことを考慮して、ヒト由来ＨＢＰ－ＡＬＬ細胞に基づいてＣＤ４＋Ｔ白血病腫瘍モデルを実施する異種移植マウスモデルを使用した。このモデルを用いて、ＨＢＰ－ＡＬＬ由来の異種移植片上の高親和性ＣＤ４－Ｎｂ１の特異的濃縮を、光学的インビボイメージングによりモニタリングすることができた。
【0204】
２．ナノボディ修飾されたＡＡＶ２遺伝子治療ベクターによるＣＤ４＋Ｔ細胞の標的化
【0205】
材料および方法
【0206】
プラスミド構築
【0207】
野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドｐＡＡＶ２／２（Ａｄｄｉｎｅ ＃１０４９６３）は、カプシドの最適化および盲検化の出発点として役立った。カプシド最適化のためのアミノ酸置換（Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００ＦおよびＹ７３０Ｆ）、ならびに一次天然ＡＡＶ２ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）結合部位（Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ）の破壊（盲検化）は、以前に記載されている。それぞれのヌクレオチドの遺伝的修飾は、逆並列配向のＤＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドｏＭＨ１９－ｏＭＨ１９；図２２）およびＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた部位特異的突然変異（ＳＤＭ）ＰＣＲにより行われた；ＰＣＲプログラム：初期変性２分８℃、１８サイクル変性１０’’９８℃、アニーリング３０’’５５℃、伸長６分７２℃、および最終伸長３分７２℃。ＰＣＲに続いて、ＤｐｎＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）消化物、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）による５’末端リン酸化、およびＴ４ ＤＮＡライゲーション（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む「ワンポット」反応を行った。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）への形質転換およびプラスミド単離後、導入されたヌクレオチド変化をＳａｎｇｅｒ配列決定により検証した。ＳＤＭ反応の連続ラウンドにより、全４つの最適化を有するＡＡＶ２カプシドタンパク質をコードするコンストラクトｐＡＡＶ２／２－ｏ、ならびに全４つの最適化と２つのＨＳＰＧ盲検化されたアミノ酸置換をコードするｐＡＡＶ２／２－ｂｏが生成された。
【0208】
ＡＡＶ２のキャップ発現は３つのカプシドタンパク質ＶＰ１－３を生成する：ＶＰ１はスプライシングされていないｍＲＮＡから翻訳されるが、Ｖ２とＶ３はスプライシングされたｍＲＮＡからの翻訳産物である。ＶＰ１発現のみを達成するために、主要スプライスアクセプター（ＳＡ）部位を突然変異させた。上述のように、ＳＤＭ ＰＣＲ（オリゴヌクレオチドｏＭＨ４７およびｏＭＨ４８；図２２を参照されたい）とアンプリコンライゲーションおよびその後のコンストラクト検証を行い、コンストラクトｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡを生成した。対照的に、ＡＡＶ２キャップ開始コドン（ｓｃ）の突然変異後、新生コンストラクトはＶＰ２およびＶＰ３発現のみを可能にする。上述のプロトコールに類似して、ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ｓｃは、オリゴヌクレオチドｏＭＨ４５およびｏＭＨ４６を用いて生成された（図２２を参照されたい）。
【0209】
ＶＰ１修飾されたナノボディコンストラクトの生成
【0210】
ナノボディおよびリンカー配列をＶＰ１のＧＨ２／ＧＨ３表面ループ領域内に遺伝的に挿入した。これを達成するために、キャップ内のそれぞれの位置でのＮｏｔＩ認識部位をｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡに導入した（ｏＭＨ６７およびｏＭＨ６８を用いるＳＤＭ ＰＣＲ）。その後のライゲーション反応と並行して、５’リンカー配列を一対のアニールされたオリゴヌクレオチド（ｏＭＨ６９およびｏＭＨ７０；図２２を参照されたい）によって導入し、ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡ－標的－ベクターを生成した。
【0211】
続いて、ナノボディおよび３’リンカー配列は、ＮｏｔＩ／ＸｃｍＩ線形化ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡ－標的－ベクター断片、ならびに一価ナノボディ、３’リンカーおよびキャップ配列を含む単一ＰＣＲ断片を用いて、製造業者（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＮＥＢ）の指示に従って、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーにより導入され、キャップ内部ＸｃｍＩ制限部位（挿入断片）にライゲートされた。この挿入断片を生成するために、２つの単一のＰＣＲアンプリコンを重複伸長ＰＣＲにより融合させた。第１に、ナノボディ配列は、標的ベクター（フォワードオリゴ）に対する５’相同性、ならびに標的ベクター（リバースオリゴ）に対する３’リンカー配列＋３’相同性を含有するＰＣＲオリゴ（図２２に列挙した各ナノボディに対するオリゴ）を用いて、上記プラスミドからＰＣＲ増幅された。キャップ内のＸｃｍＩ部位への３’リンカー配列に及ぶ第２のＰＣＲ断片を、オリゴｏＭＨ８５／８６を用いて生成した。
【0212】
得られたＶＰ１修飾されたナノボディコンストラクト（ＶＰ１－ＣＤ４－Ｎｂ１、－Ｎｂ１ａ、－Ｎｂ３、－Ｎｂ４およびＰｅｐＮｂ）を配列決定により検証した。最終コンストラクトのアミノ酸配列を図２１に示す。
【0213】
ＶＰ２修飾されたナノボディコンストラクトの生成
【0214】
第１に、最適化され、盲検化されたＶＰ２オープンリーディングフレームは、ＡＡＶ２／２－ｂｏ ｃＤＮＡ由来の隣接するＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅された（オリゴヌクレオチド：ｏＭＨ１６およびｏＭＨ１８；図２２を参照されたい）。ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩアンプリコン消化後、それぞれの断片をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ線形化ｐＢＣ１２／ＣＭＶベクター骨格中にライゲートし、コンストラクトｐＢＣ１２－ＣＭＶｉｎｔ－ＶＰ２を得た。次に、ナノボディ配列は、リンカー配列を介してＶＰ２オープンリーディングフレームの５’末端に遺伝的に融合され、アミノ末端ナノボディ－リンカー－ＶＰ２融合ペプチドの発現を達成した。この目的のために、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ線形化ｐＢＣ１２－ＣＭＶｉｎｔ－ＶＰ２ベクター断片、ＸｂａＩ／ＸｈｏＩ適合末端を有するアニールされたオリゴヌクレオチドｏＭＨ３３およびｏＭＨ３４からなるリンカー断片、ならびにＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ適合末端を有するナノボディＰＣＲ挿入断片（ＰＣＲ増幅に使用されるナノボディ特異的オリゴヌクレオチドを図２２に列挙する）を含む３つの断片ライゲーション戦略を適用した。すべての最終コンストラクト（ＶＰ２－ＣＤ４－Ｎｂ１、－Ｎｂ１ａ、－Ｎｂ３、－Ｎｂ４、－Ｎｂ５およびＰｅｐＮｂ）は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって検証された。最終コンストラクトのアミノ酸配列を図２１に提供する。
【0215】
ＶＰ１修飾された二価ナノボディコンストラクトの生成
【0216】
タンデムＶＰ１－ｂｉＣＤ４－Ｎｂ１および対照ＶＰ１－ｂｉＰｅｐＮＢコンストラクトは、ＮｏｔＩ／ＸｃｍＩ制限部位、各ナノボディに隣接するリンカー配列、およびＶＰ１配列を含有する合成ＤＮＡ断片（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から、最適化され、盲検修飾を用いて生成された。ＧｅｎｅＡｒｔ合成プラスミドとｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡ－標的ベクターの両方をＮｏｔＩ／ＸｃｍＩで消化し、二価ナノボディ挿入物をＶＰ１－ベクターにライゲートし、ｐＡＡＶ２／－ｂｏ－ＳＡ－ＶＰ１－ｂｉＣＤ４および－ｂｉＰｅｐＮＢを得た。最終コンストラクトは、ＤＮＡ配列決定によって検証された。
アミノ酸配列を図２１に示す。
アミノ酸配列を図２１に示す。
【0217】
細胞培養
【0218】
本研究において使用したすべての細胞株は以前に記載され、３７℃および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下において、標準条件下で培養された。接着性細胞株ＨＥＫ ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－３２１６）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２）およびＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ（ＮＩＢＳＣ：ＡＲＰ５０１１）を０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて継代し、１０％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を補足したＤＭＥＭ増殖培地（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で培養した。懸濁Ｔ細胞株ＳｕｐＴ１（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１９４２）およびＪｕｒｋａｔ １Ｇ５（ＮＩＢＳＣ：５０１０）を１０％ウシ胎児血清（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃ）および５０Ｕ／ｍｌペニシリン－ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ １６４０増殖培地（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。
【0219】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常ドナーの軟膜から分離した。軟膜からのＣＤ４＋Ｔ細胞の単離は、ＲｏｂｏＳｅｐネガティブ選択ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを使用して、製造業者の指示に従って、ＲｏｂｏＳｅｐ自動細胞分離デバイス（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともに行われた。単離された細胞を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび５００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む、１０％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ １６４０（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。
【0220】
ＡＡＶ粒子の生成、精製および定量
【0221】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）トランスフェクションを介したＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＡＶ産生は、以前に記載されるように行われた。簡単に説明すると、トランスフェクション後の１日目に、１０ｃｍディッシュあたり４×１０６細胞を播種した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中の４：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比を用いて、ディッシュあたり合計１０．５μｇのプラスミドＤＮＡ（すなわち、４２μｇのＰＥＩ：１０．５μｇのＤＮＡ）でトランスフェクションを行った。ＰＥＩトランスフェクションプロトコールは、製造業者の指示に従って、ディッシュあたり６ｍＬの最終体積で行われた。すべての共トランスフェクション反応において、ヘルパープラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ａｄｄｉｎｅ ＃１１２８６７）、および構成的ＣＡＧプロモーター下でＧＦＰ導入遺伝子をコードするＡＡＶ２ベクターｐｓｃＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ（Ａｄｄｉｎｅ ＃８３２７９）が含まれた。さらにプラスミドを必要に応じて混合物に添加した（ｏｐｔ：ｐＡＡＶ２／２－ｏ；ｏｐｔ－盲検：ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ；ＶＰ１－ナノボディ：ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ｓｃ＋ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ－ＳＡ－ＶＰ１－ＮｂＸ；ＶＰ２－ナノボディ：ｐＡＡＶ２／２－ｂｏ＋ｐＢＣ１２－ＣＭＶｉｎｔ－ＶＰ２－ＮｂＸ）。すべてのプラスミドを等モル量で共トランスフェクションした。トランスフェクションの３０時間後、６ｍＬの新鮮培地を培養物に添加した。トランスフェクションの３日後、細胞をディッシュからスクラップし、上清と合わせた。遠心分離（１５分、２，８００×ｇ）後、上清を捨て、細胞ペレットを８００μＬの溶解緩衝液（水中１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０）に再懸濁し、１．５ｍＬ反応チューブに移した。３サイクルの凍結／解凍（－８０℃で２０分間、３７℃で５分間）は細胞を開き、内部ＡＡＶ粒子を放出した。その後のベンゾナーゼ処理（５０Ｕ、３７℃、１時間；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）は、残存プラスミドＤＮＡの汚染を減少させた。細胞残渣（２０，０００×ｇ、４℃、１５分）から分離した後、得られた粗ＡＡＶ上清のアリコートを使用するまで－８０℃で保存した。
【0222】
初代ヒト細胞を用いた実験（すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＰＢＭＣ）について、粗ＡＡＶ上清のイオジキサノール勾配精製を行った。粗ＡＡＶ上清（２０個の１０ｃｍディッシュ、９ｍＬ溶解緩衝液、４５０Ｕベンゾナーゼ）の大規模産生後、９ｍＬの粗ＡＡＶ上清を、以前に記載されるように、イオジキサノール工程勾配上で精製した。超遠心分離（４℃、３５０，０００×ｇ、９０分；Ｂｅｃｋｍａｎ ７０Ｔｉローター）後、ＡＡＶ２粒子を含有する４０％イオジキサノール画分を針および注射器で回収した。洗浄、ＰＢＳ－Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）交換、およびさらなる濃縮は、フィルターカラム遠心分離（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５，１００ｋＤａ ＭＷＣＯ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって達成された。精製したＡＡＶ上清のアリコートを使用するまで－８０℃で保存した。
【0223】
すべてのＡＡＶ上清について、ｑＰＣＲによりウイルス力価を測定した。このために、１μＬのＡＡＶ上清をＤＮａｓｅＩおよびその後のプロテイナーゼＫ処理に供し、残存プラスミドＤＮＡ汚染を除去し、カプシドからウイルスベクターゲノムを放出させた。１μＬのＡＡＶ上清（１×ＤＮａｓｅＩ緩衝液中の１０ＵのＤＮａｓｅＩ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する１００μＬの反応物を３７℃で１６時間インキュベートし、続いて７５℃で３０分間、ＤＮａｓｅＩを不活性化した。次に、２μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ；ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し、５５℃で２時間インキュベートした。プロテイナーゼＫを９５℃で３０分間、不活性化した。この反応から、参照としてプラスミド標準（ｐｓｃＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ）を用いて、１μＬをベクターゲノムの絶対定量に供した。Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、製造業者の指示に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ７５００リアルタイムＰＣＲサイクラー（ｑＰＣＲプログラム：初期変性９５℃３分；変性９５℃１５’’およびアニーリング／伸長６０℃３０’’の４０サイクル；その後の融解曲線；オリゴヌクレオチドｏＭＨ９３およびｏＭＨ９４を図２２に列挙する）と組み合わせて使用した。イオジキサノール工程勾配精製したベクター調製物からのカプシド定量は、製造者の指示に従って、ＡＡＶ２滴定ＥＬＩＳＡキット（ＰＲＯＧＥＮ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行われた。
【0224】
免疫金電子顕微鏡
【0225】
イオジキサノール工程勾配精製したＡＡＶ２試料をグロー放電炭素被覆グリッドに１０分間吸着させた。プロテインＡ／Ｇ金コンジュゲートのブロッキング溶液（ＵＲＩＯＮ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と５分間インキュベートした後、試料を一次抗体（１０μｇ／ｍＬ、ポリクローナルヤギ抗アルパカＩｇＧ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ、ＰＡ）とともに３０分間インキュベートし、続いて５分間洗浄した。その後、二次抗体を添加して１５分間おいた（１：１０、ウサギ抗ヤギＩｇＧ １０ｎｍ金コンジュゲート；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ｄｄＨ２Ｏで洗浄した後、試料を１％酢酸ウラニルで染色し、風乾した。透過型電子顕微鏡写真を、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｖｅｌｅｔａ ＣＣＤカメラを装備したＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２０を用いて８０ｋＶで撮影した。明瞭にするために、対応するスケールバーを有する代表的な画像をクロップしだ。
【0226】
ウエスタンブロット法
【0227】
カプシド組成をウエスタンブロット法により分析した。イオジキサノール精製したウイルスベクター粒子を、製造業者の指示に従ってＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ Ｒｅｓｉｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒａｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて濃縮し、８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（レーンあたり５×１０１０個のカプシド）上で分離し、次の一次抗体：ＡＡＶ２特異的抗体Ａ６９を含有するハイブリドーマ細胞上清（ＶＰ１／ＶＰ２タンパク質を認識する；１：１０希釈）（ＰＲＯＧＥＮ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、標準ウエスタンブロット法に供した。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰをコンジュゲートした抗体を二次抗体（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ－Ｂｉｏｍｏｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１：２，０００希釈）として使用し、シグナルをＦｕｓｉｏｎ ＦＸ Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔシステム（Ｐｅｑｌａｂ）と組み合わせてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質またはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて検出した。
【0228】
カプシド熱安定性アッセイ
【0229】
簡単に説明すると、カプシド熱安定性アッセイのために、反応あたりベクター調製物の１×１０１０個のウイルスカプシドをＰＢＳ中で希釈し、指定の温度で１５分間インキュベートし、次にＰＢＳ中でさらに希釈した。温度勾配（６５～８５℃）を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ１ ９６システム（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）により、以下のプログラム：２サイクル（３７℃で１０秒；温度勾配で９００秒；３７℃で１０秒）、１サイクル（３７℃で３０秒）を用いて生じさせた。試料を真空ブロッターを用いてニトロセルロース膜に移し、ブロック（ＴＢＳ－Ｔ中の５％ミルク）し、抗ＡＡＶ２特異的抗体Ａ２０（無傷のカプシドを認識する）（ＰＲＯＧＥＮ、１：５希釈）を含有するハイブリドーマ細胞上清とともにインキュベートした。抗マウスＩｇＧ ＨＲＰをコンジュゲートした抗体を二次抗体（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ－Ｂｉｏｍｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１：２，０００希釈）として使用し、シグナルをＦｕｓｉｏｎ ＦＸ Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔシステム（Ｐｅｑｌａｂ）と組み合わせてＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質またはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて検出した。
【0230】
ＡＡＶ形質導入およびフローサイトメトリー
【0231】
詳細不明の場合、細胞を、細胞あたりの指示されたゲノムコピー数（ｇｃ／細胞）で粗ＡＡＶ２溶解物を形質導入した。感染の１日前に、ウェルあたり２．５×１０４細胞を１２ウェルディッシュに播種した。混合培養実験において、ＨｅＬａ野生型およびＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ細胞を、形質導入の２４時間前に、ウェルあたり総計２．５×１０４細胞を約１：１の比率で播種した。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞および軟膜由来のＰＢＭＣの形質導入のために、培養物をＣＤ３／ＣＤ２８磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２４時間、前刺激した。前刺激後、細胞を計数し、ウェルあたり４×１０４細胞を有する９６ウェルプレートに播種した。イオジキサノール勾配精製したＡＡＶ粒子を、５００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２の存在下で、細胞あたりの指示されたゲノムコピー数で培養物に添加した。すべての細胞培養実験において、形質導入後３日目に細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中のＰＥ－Ｃｙ７をコンジュゲートした抗ＣＤ４抗体（ＲＰＡ－Ｔ４；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で４℃にて３０分間、２％ＦＣＳで染色した。ＰＢＳで２ラウンド洗浄した後、細胞をＣＤ４および／またはＧＦＰ発現について分析した。Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）デバイスでデータを獲得した。
【0232】
ＡＡＶ結合および内在化
【0233】
カプシド結合および内在化アッセイについては、簡単に説明すると、ＨｅＬａ ｗｔまたはＴＺＭｂｌ細胞を、感染の２４時間前に１２ウェルあたり２．５×１０５細胞の密度で播種した。形質導入の３０分前に、細胞を４℃に冷却し、続いて、選択された精製したＡＡＶ２調製物を１０．０００ｇｃ／細胞で接種した。４℃で１時間インキュベートした後、細胞スクレーパー（ＡＡＶ２結合試料）で細胞を回収する前に、細胞を氷冷ＰＢＳで４回洗浄した。ＡＡＶ２内在化の分析のために、結合したＡＡＶ２粒子を有する細胞を３７℃に移し、さらに１時間インキュベートした。その後、細胞をトリプシンで回収し、ＰＢＳ（ＡＡＶ２内在化試料）で３回洗浄した。ゲノムＤＮＡは、製造業者の指示に従って、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離した。ベクターゲノムの定量ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドｏＭＨ９３およびｏＭＨ９４を用いて上記のように行われた（表図２２）。細胞ゲノムの定量は、製造業者の指示に従って、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ－ＵＤＧ（Ｌｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と組み合わせたヒトベータ－グロビン遺伝子（ＨＢＧ）に特異的なＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いて行われた。
【0234】
データ分析および統計
【0235】
すべてのフローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．７ソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ ｖ９（Ｐｒｉｓｍ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）で処理した。データは、標準偏差（図の凡例に指示されている実験数）を示す誤差バーのある平均値を表す。
【0236】
結果
【0237】
ナノボディ操作されたＡＡＶＳ粒子の生成
【0238】
上記ナノボディのそれぞれのＮｂ ｃＤＮＡを合成し、ＡＡＶ２カプシド（ｃａｐ）遺伝子の遺伝子修飾に使用した。以前、カプシド修飾の目的で、異種配列をＶＰ１の共通領域のＧＨ２／ＧＨ３表面ループに挿入するか、またはＶＰ２のアミノ末端に融合させた。両方の戦略を用いて、Ｎｂタンデムコンストラクトを含む選択されたＣＤ４－Ｎｂコード配列を、ＶＰ１および／またはＶＰ２コード配列とフレーム内で融合させ、それらの表面上にヒトＣＤ４特異的Ｎｂを提示するＡＡＶ２カプシド粒子をもたらした（図１４）。すべてのコンストラクトは、自己相補的ＡＡＶ２ゲノム構成を用いて生成された。ＣＤ４－ナノボディ特異的結合を制御するために、さらに、非関連ペプチドエピトープに結合するナノボディ（ＰｅｐＮｂ）を含めた。
【0239】
さらに、ベクター形質導入効率を最適化するために、４つの表面露出したカプシド残基（Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、およびＹ７３０Ｆ）を突然変異させて、それらのリン酸化、ユビキチン化に導く可能性のある翻訳後修飾、続いて標的細胞の細胞質内に入ってくるベクターのプロテアソーム分解を防止した。すべてのベクターＮｂ修飾は、キャップＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａバックグラウンドにおいて行われ、それによって、得られたベクターが一次プロテオグリカン受容体に結合するのを妨げた（盲検化）。さらに、すべてのベクターは、構成的ＣＡＧプロモーターおよびＳＶ４０のポリＡ部位によって駆動されるｅＧＦＰマーカーを発現した。ＶＰ２－Ｎｂ修飾されたベクターの産生戦略は、産生細胞におけるｗｔおよびＮｂ修飾されたＶＰ２タンパク質の共発現をもたらした。したがって、ｗｔとＮｂ修飾されたＶＰ２の両方を含有するハイブリッドカプシドは、本ＶＰ２－Ｎｂベクター調製物のすべてに存在する可能性が高い。
【0240】
それぞれのＡＡＶ２ ＣＤ４－Ｎｂ提示粒子は、確立されたプロトコールに従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＡＶヘルパー、カプシドおよびトランスファーベクタープラスミドと一過性に共トランスフェクションすることによって産生された（上記の材料および方法を参照されたい）。選択された勾配精製したベクターバッチを電子顕微鏡によって分析し、ウイルス粒子がＮｂ修飾されているかどうかに関係なく、野生型様の表現型ＡＡＶ出現を明らかにした（図１５Ａ）。さらに、アルパカＩｇＧに対する一次抗体を用いた免疫金染色により、ナノボディ修飾されたベクターバッチドのカプシド表面におけるアクセス可能なナノボディ部分が明らかになった（図１５Ｂ）。ウエスタンブロット分析は、ナノボディ部分あたりおよそ１５ｋＤａだけアップシフトするＶＰ１／ＶＰ２タンパク質バンドによって指示されるように、ナノボディの取り込みを確認した。ｑＰＣＲおよびカプシドＥＬＩＳＡを用いてゲノムおよびカプシド力価を決定したところ、パッケージング効率、すなわちカプシド／ゲノムの比率は、対照ベクター（それぞれｏｐｔ：１１．１３および盲検：６．９１）およびＮｂ修飾されたベクター（それぞれＶＰ１－ＣＤ４－Ｎｂ１：７．１７、ＶＰ２－ＣＤ４－Ｎｂ１：７．８８およびＶＰ１－ビＣＤ４－Ｎｂ１：８．７４）で非常に類似していることが明らかになり、Ｎｂ修飾された粒子中の非影響ゲノムパッケージングを示した（Ｓ２表）。さらに、カプシド熱安定性を、ベクターカプシドを徐々に加熱し、無傷なカプシドを特異的に検出することによりアッセイした。ＡＡＶ盲検およびＮｂ修飾されたベクターカプシドは同一の熱安定性（最大７０．３℃）を示し、Ｎｂ操作がカプシドの安定性に負の影響を及ぼさないことを指示する。これらのデータは、Ｎｂ修飾されたＡＡＶ２粒子がＡＡＶ２野生型様形態およびゲノムパッケージング能力を有し、それらの外側カプシド表面上にＮｂを提示することを示す。
【0241】
ＣＤ４発現細胞株の形質導入
【0242】
第１に、種々の細胞株を、フローサイトメトリーによりＣＤ４表面発現に関して分析した。示されるように、ＣＤ４欠損ＨｅＬａ野生型（ｗｔ）およびＣＤ４＋ ＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ細胞は、細胞表面上のＣＤ４分子を欠損または発現して、予想される表現型を提示した（図１６Ａ）。ヒトＪｕｒｋａｔ １Ｇ５ Ｔ細胞はＣＤ４を中程度に発現したが、関連するＳｕｐＴ１細胞は強いＣＤ４発現によって特徴付けられた（図１６Ａ）。次に、これらの細胞株は、対照ＡＡＶ２ｏｐｔ（Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）およびＡＡＶ２盲検（Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、プラスＲ５８５Ａ、Ｒ５８８Ａ）を含む、ＡＡＶベクター調製物、ならびに陰性Ｎｂ対照（ＰｅｐＮｂ、非特異的対照ペプチドを認識する）を含む一組のカプシド（Ｎｂ）操作されたベクターで個々に形質導入された。対照ベクターＡＡＶ２ｏｐｔを用いたＨｅＬａ細胞の形質導入は、細胞あたりの入力ベクターゲノムコピー数（ｇｃ／細胞）の全範囲にわたって高い形質導入率をもたらし、すべての実験において１０，０００～１０ｇｃ／細胞の範囲であった（図１６Ｂ、上段パネル）。これらの結果は、形質導入ＨｅＬａ細胞が陰性（ＨｅＬａ ｗｔ）であるかまたはＣＤ４受容体陽性（ＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ）かに関係なく観察された。
【0243】
対照ベクターＡＡＶ２盲検およびＰｅｐＮｂを分析した場合、１０，０００ｇｃ／細胞の最高濃度でのみ、同等の低い形質導入率が記録され、一次受容体結合の消失による感染能の強い減少が確認された。対照的に、種々のＣＤ４ Ｎｂ特異的コンストラクト（ＣＤ４－Ｎｂ）の検査、特にＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３の場合（図１４Ａに概略的に概説される）は、ＣＤ４受容体依存的に、高ベクターゲノムコピー数で最大の形質導入を示した（図１６Ｂ、上段パネル）。興味深いことに、ＣＤ４－Ｎｂ１は、Ｎｂ配列挿入部位とは独立して、同様の形質導入効率を提示したが（ＶＰ１の内部ループ対ＶＰ２のアミノ末端）、一方、対照的に、ＣＤ４－Ｎｂ３は、ＶＰ１が遺伝的に修飾された場合にのみ良好に機能した。
【0244】
同様の結果が、Ｔ細胞株ＳｕｐＴ１およびＪｕｒｋａｔ １Ｇ５（図１６Ｂ、下段パネル）において得られた。形質導入効率は、入力ベクターの全範囲（すなわち、ｇｃ／細胞）にわたって全体的に低かったが、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３は、特に、染色によりＣＤ４が高い陽性であったＳｕｐＴ１細胞と同等であり、最大の形質導入率を示した（図１６Ａ）。上述のように、ＣＤ４－Ｎｂ３コンストラクトは、ＶＰ１における融合として発現された場合にのみ、ＣＤ４＋細胞の形質導入に正の影響を与えた。これらのデータはまた、１０，０００ｇｃ／細胞を用いてＣＤ４－Ｎｂ１またはＣＤ４－Ｎｂ３ベクターで形質導入し、ｅＧＦＰおよびＣＤ４について二重染色し、その後、形質導入後３日目にフローサイトメトリー分析を行ったＪｕｒｋａｔ １Ｇ５細胞を用いて確認された（図１６Ｃ）。フローサイトメトリープロットの検査により、ＣＤ４を強く発現する細胞の形質導入の増強が明らかになった。上記のように、この効果はＣＤ４－Ｎｂ１ ＶＰ１およびＶＰ２修飾されたウイルス粒子、ならびにＣＤ４－Ｎｂ３ ＶＰ１－修飾されたＡＡＶ２に対して観察された。
【0245】
さらに、Ｎｂ修飾されたカプシドのベクター侵入と輸送を調べた。ＶＰ１修飾されたＣＤ４－Ｎｂ１および－Ｎｂ３ベクターを、ＨｅＬａ ｗｔ（ＣＤ４陰性）およびＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ（ＣＤ４陽性）細胞上で、ＶＰ１－ＰｅｐＮＢ陰性対照およびＡＡＶ２ｏｐｔベクターと比較した。結果は、ＣＤ４－Ｎｂベクターの両方が、ＣＤ４細胞表面発現に関係なく、ＡＡＶ２ｏｐｔベクターと同程度にＨｅＬａ ｗｔおよびＴＺＭｂｌ細胞に結合する（またはむしろ付着する）ことを示す。対照的に、ＰｅｐＮｂベクター粒子は、ＡＡＶ２ｏｐｔベクターと比較して、両方の細胞株に結合／付着することが有意に少ない。粒子内在化を分析した場合、異なるパターンが出現した。ＨｅＬａ ｗｔ細胞において、すべてのＮｂ修飾されたカプシドは、ＡＡＶ２ｏｐｔベクター粒子と比較して有意に低く内在化され、突然変異したＨＳＰＧ結合モチーフおよびこれらの細胞の表面でのＣＤ４発現の欠如と一致した。ＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ細胞のＣＤ４－Ｎｂ１カプシドでは、これまでの実験で最も性能の良いコンストラクトが、フローサイトメトリーデータに沿って、ＡＡＶ２ｏｐｔベクターと比較して、４倍以上効果的に取り込まれた。
【0246】
総合すると、これらの実験は、ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３が、ＡＡＶ２由来遺伝子ベクターを細胞、特に表面にＣＤ４を発現する細胞に標的化するための有用な試薬であることを指示した。
【0247】
混合細胞培養物中のＣＤ４＋細胞の好ましい標的化
【0248】
次に、ＡＡＶ２ ＣＤ４－Ｎｂ１およびＣＤ４－Ｎｂ３コンストラクトによるＣＤ４特異的細胞標的化を競合実験において分析し、２つの異なる細胞集団であるＣＤ４陰性ＨｅＬａ ｗｔ細胞およびＣＤ４陽性ＨｅＬａ ＴＺＭｂｌ細胞を１：１の比で混合した。上記の結果と一致して、これらの混合細胞培養物にそれぞれのＣＤ４－Ｎｂ修飾されたベクター粒子および対照ベクターを添加し、続いてフローサイトメトリーを行ったところ、それぞれの培養物におけるＣＤ４発現サブ集団の好ましい形質導入が明らかになった（図１７Ａ）。対照的に、ＡＡＶ２ｏｐｔベクターは、すべてのベクター入力濃度において、およびＣＤ４表面受容体が発現されたかどうかにかかわらず、再び効率的であり、無差別に形質導入された標的細胞であった（図１６Ｂおよび１７Ａを比較する）。残りのベクター対照であるＡＡＶ２盲検およびＰｅｐＮｂはまた、しかしながら以前に記録したように、無差別細胞形質導入を示したが（図１６Ｂ）、使用したベクター粒子濃度が最高値（１０，０００ｇｃ／細胞）でのみであった。
【0249】
続いて、３つの完全なセットの独立した実験からのＣＤ４＋およびＣＤ４－細胞におけるｅＧＦＰ特異的シグナルの相対頻度を計算し、ＣＤ４＋／ＣＤ４－比として提示した（図１７Ｂ）。これらのデータは、特にＮｂ１およびＮｂ３をコードする配列をＶＰ１に融合させ、中等度または低度の入力ベクター粒子（すなわち、１，０００～１０ｇｃ／細胞）を使用した場合、予想されるＣＤ４－Ｎｂ依存性の形質導入効率の増加を確認した。それぞれの頻度は、ＣＤ４－組織培養細胞上のＣＤ４＋の形質導入率が２０～１９９倍増加することを指示した（図１７Ｂ）。
【0250】
特定の条件下では、相同なＮｂタンデムリピートが特定のＮｂの親和性を増加させる可能性のあることが以前に報告されている。したがって、ＣＤ４－Ｎｂ１をホモ二量体としてＶＰ１に挿入し（図１４Ｂに記述される）、上記のように試験した。分析の結果、二価ＣＤ４－Ｎｂ１（すなわち、タンデムＮｂ１反復）は、一価Ｎｂ１に匹敵する特異性を示すが、特異的なＣＤ４＋細胞への感染においてはそれほど強力ではないことが明らかになった（図１９）。これは、二価Ｎｂ１ベクターの構築には８８５ヌクレオチド（ｎｔ）の遺伝子内挿入が必要であることから、いくつかの構造的干渉によって説明することができ、このサイズは、ｍＣｈｅｒｒｙマーカータンパク質をコードする７２０ｎｔ配列を含む、以前にこの部位について報告された最大の異種挿入より明らかに大きい。
【0251】
要約すると、これらのデータは、ＣＤ４－Ｎｂ修飾されたＡＡＶ２ベクターが、混合細胞培養物中のＣＤ４受容体発現細胞の特異的標的化を可能にすることを示す。さらに、一価Ｎｂ１カプシドは、比較的低いベクター量でさえも、すでに特異性および高い形質導入効率を示すようである。
【0252】
初代ヒトＣＤ４＋細胞の形質導入の増強
【0253】
ＡＡＶ由来の遺伝子治療ベクターは、主に異種性遺伝子ペイロードのインビボデリバリーに使用されるため、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞およびヒトＰＢＭＣの形質導入を次に分析した。第１に、２名の健常ドナー由来の精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を形質導入し、上記のようにＧＦＰ陽性細胞に関してアッセイした。ここでは、模擬形質導入対照、対照ＡＡＶ２ｏｐｔおよびＰｅｐＮＢをＡＡＶ６コンストラクトと同様に含めた。後者は、ＡＡＶ６ベクターが複数の組織に対して指向性を示すことが報告されており、樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＣ）、ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む種々のヒト初代細胞を形質導入することができるという事実のために含まれた。上記で調べたヒト細胞株とは対照的に、形質導入効率は一次細胞において明らかに低かった（図１８Ａ）。それにもかかわらず、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の形質導入の成功が、特にＡＡＶ２ ＣＤ４－Ｎｂ１およびＡＡＶ６によって観察された。形質導入特異性を解明するために、次に、ヒトＰＢＭＣ培養物を形質導入し、上記で概説したように形質導入されたＣＤ４＋／ＣＤ４－細胞の比を計算した。ＡＡＶ２ ＣＤ４－Ｎｂ１およびＮｂ３修飾されたベクター粒子は、ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ４受容体を欠損しているかまたは弱くしか発現していない細胞よりも約４～５倍効率的に形質導入した（図１８Ｂ）。予想されたように、そのかなり広範な指向性のために、ＡＡＶ６は、この分析において、ＣＤ４＋ＰＢＭＣを特異的に形質導入することができなかった。
【0254】
総合すると、これらのデータは、ＣＤ４ Ｎｂカプシド操作されたＡＡＶ２ベクターがＣＤ４＋ヒトＰＢＭＣに対して改善された指向性を示すことを実証する。
【0255】
検討の要約
【0256】
本発明において、ＡＡＶベクター指向性は、適切にカプシド修飾されたＡＡＶ２ベクターによって増強されたＣＤ４＋細胞の標的化を達成するために、特異的カプシド操作によって成功裏に改変され、それによってその臨床的適用性が得られた。
【0257】
本研究では、ＡＡＶ２カプシドを、本発明の上記ナノボディを用いて修飾した。カプシドＶＰ１タンパク質の表面におけるこれらのＮｂの提示は、アミノ末端ＶＰ２融合としてより効果的であるようであった（図１６および図１７を比較する）。同様に、ＶＰ１へのＣＤ４－Ｎｂ１の相同なタンデム反復の同一挿入はまた、ＣＤ４＋細胞に対するこのベクターの特異性を増強したが、さらには改善しなかった（図１９）。これらの知見は、ＶＰ１におけるこの部位が実際に少なくとも２つのＮｂをコードする配列を収容することができ、同じＡＡＶベクターコンストラクトを用いて異なる受容体を標的化する異種Ｎｂタンデム反復の挿入を可能にする可能性があることを確認した。
【0258】
明らかに、ここに提示されたＮｂ媒介カプシド修飾は、初代ヒトＴリンパ球を含むＣＤ４＋細胞を標的化するＡＡＶ２ベクターの能力を改善した。後者は、例えば、治療用ゲノム編集の分野において、新規な実験的治療法を開発するために特に興味深く、デザイナーヌクレアーゼまたはリコンビナーゼのＣＤ４＋リンパ球への直接的、特異的、および効率的な導入が必要とされる。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；すなわち、プロウイルス）の染色体に組み込まれたゲノムは、ＣＤ４＋Ｔ細胞内で無限に存続し、古典的な抗レトロウイルス療法によって根絶することはできない。しかしながら、ＣＤ４－Ｎｂ標的化されたＡＡＶ遺伝子ベクターを用いたこのような抗ウイルスデザイナーリコンビナーゼのインビボでの直接的デリバリーの可能性は、最終的には、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対するスケーラブルな治癒的療法の臨床開発を可能にする。
【0259】
結論として、本明細書に提示された知見は、ヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球への特異的遺伝子導入のためのより強力なＡＡＶベクターの開発に向けた重要な一歩である。
【0260】
要約すると、本発明およびそれに関連して提示されたデータは、一方で、ヒトＣＤ４に特異的なＮｂの生成および詳細な特徴付け、ならびに種々の生物医学的研究アプローチにおけるそれらの適用を初めて実証する。特に、ＣＤ４－Ｎｂ１はヒトと同様にマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の非侵襲的全身研究の有望な候補である。
【0261】
他方、ナノボディ修飾されたＡＡＶ２遺伝子治療ベクターによるヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の改善された標的化に関連して本明細書に提示されたデータを用いて、特定の遺伝子治療、特に疾患に関連する末梢血ＣＤ４＋白血球のための戦略が開示され、記載される。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図17-1】
【図17-2】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
【図21-1】
【図21-2】
【図22-1】
【図22-2】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【配列表】
【国際調査報告】