特表 2024-524495 ＣＬＤＮ１８．２結合分子及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ＣＬＤＮ１８．２結合分子及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240628BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240628BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/18

A61K39/395 T

A61K39/395 L

A61P35/00

A61K47/68

A61K45/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023581053

(86)(22)【出願日】2022-07-13

(85)【翻訳文提出日】2023-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2022105392

(87)【国際公開番号】W WO2023284769

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】202110795793.0

(32)【優先日】2021-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524003932

【氏名又は名称】サンヨー バイオファーマシューティカルズ カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100123593

【弁理士】

【氏名又は名称】関根 宣夫

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100217179

【弁理士】

【氏名又は名称】村上 智史

(74)【代理人】

【識別番号】100227592

【弁理士】

【氏名又は名称】孔 詩麒

(72)【発明者】

【氏名】イェン シンティエン

(72)【発明者】

【氏名】ラン クオチュン

(72)【発明者】

【氏名】タン ヨンツォン

(72)【発明者】

【氏名】リウ チャンチュアン

(72)【発明者】

【氏名】コン チャオ

(72)【発明者】

【氏名】イェン ルン

(72)【発明者】

【氏名】リウ ヤールー

(72)【発明者】

【氏名】ヤオ ティエネン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC752

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA21

4C085BB01

4C085BB36

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

本発明は、特異性ＣＬＤＮ１８．２結合分子及び前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を含有する免疫コンジュゲート、組成物に関する。本発明はさらに、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸、及びそれを含む宿主細胞、並びに前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法に関する。なお、本発明は、これらのＣＬＤＮ１８．２結合分子の治療的及び診断的用途に関する。特に、本発明は、これらのＣＬＤＮ１８．２結合分子と他の療法、例えば、治療方式又は治療剤との併用治療に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＬＤＮ１８．２結合分子であって、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、三つの相補性決定領域を含み、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、ここで、
（ａ） ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
（ｂ） ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、及び
（ｃ） ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
ここで、前記アミノ酸変化は、アミノ酸の付加、欠失又は保存的アミノ酸置換であり、好ましくは、前記ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物ＶＨＨ、部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨである、ＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項2】

前記ｓｄＡｂ部分は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３を含有するＣＤＲ３とを含む、請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項3】

前記ｓｄＡｂ部分は、
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列、又は、
（ｉｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項4】

前記ｓｄＡｂ部分は、Ｎ末端又はＣ末端で別のタンパク質ドメインに連結され、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域に連結され、例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのＦｃ領域に連結され、又は、例えば、蛍光タンパク質に連結される、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項5】

（１） ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に高親和性で結合し、例えば、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子と細胞表面ＣＬＤＮ１８．２との間の結合のＥＣ_５０が約０．１ μｇ／ｍＬ～約１０ μｇ／ｍＬであり、好ましくは、約０．１ μｇ／ｍＬ～約１ μｇ／ｍＬであることと、
（２） ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に結合しないことと、
（３） 抗体依存性細胞傷害及び／又は補体依存性細胞傷害作用によってＣＬＤＮ１８．２－陽性癌細胞を死滅させることとのうちの一つ又は複数の特性を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項6】

二重特異性又は多重特異性抗体であり、好ましくは、前記二重特異性抗体分子は、ＣＬＤＮ１８．２分子及び第２の標的タンパク質に特異的に結合し、前記第２の標的タンパク質は、例えば、
（１） 腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、癌胎児性抗原、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｍｕｃｉｎ－１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３７、ｃＭｅｔ、又はアンジオポエチン－２（Ａｎｇ－２）、
（２） 免疫細胞の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、又はＬＡＧ－３、
（３） 免疫細胞の免疫共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ２又はＣＤ２７、
（４） サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３３から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする、単離された核酸。

【請求項8】

請求項７の核酸を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターである、ベクター。

【請求項9】

請求項７の核酸又は請求項８のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、さらに好ましくは、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞から選択され、最も好ましくは、前記宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法であって、前記方法は、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸の発現に適した条件で請求項９の宿主細胞を培養し、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を任意に単離させることを含み、任意選択的に、前記方法は、前記宿主細胞から前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を回収することをさらに含む、方法。

【請求項11】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子及び他の物質、例えば、細胞傷害性薬剤を含む、免疫コンジュゲート。

【請求項12】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び任意選択的な薬用アジュバントを含む、薬物組成物。

【請求項13】

薬物組成物であって、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び他の治療剤、並びに任意選択的な薬用アジュバントを含み、好ましくは、前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞傷害性薬剤から選択される、薬物組成物。

【請求項14】

請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び一つ又は複数の他の治療剤、例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、組み合わせ製品。

【請求項15】

ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患を被験体において治療する方法であって、治療有効量の請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子、請求項１１の免疫コンジュゲート、請求項１２又は１３の薬物組成物、又は請求項１４の組み合わせ製品を被験体に投与することを含み、ここで、ＣＬＤＮ１８．２に関連する前記疾患は、例えば、ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌、例えば、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫及び下垂体腺腫であり、好ましくは、前記癌は、胃癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌又は肺癌である、方法。

【請求項16】

試料におけるＣＬＤＮ１８．２を検出するキットであって、前記キットは、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を含み、
（ａ） 試料を請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子と接触させるステップ、及び
（ｂ） 前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との間の複合体の形成を検出するステップを実施するためのものであり、任意選択的に、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、検出可能に標識される、キット。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

本発明は、特異性ＣＬＤＮ１８．２結合分子及び前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を含有する免疫コンジュゲート、組成物に関する。なお、本発明は、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸、及びそれを含む宿主細胞、並びに前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法に関する。本発明はさらに、これらのＣＬＤＮ１８．２結合分子の治療的及び診断的用途に関し、特に、本発明はさらに、これらのＣＬＤＮ１８．２結合分子と他の療法、例えば、治療方式又は治療剤との併用治療に関する。

【0002】

ＣＬＤＮ１８は、Ｃｌａｕｄｉｎｓタンパク質ファミリーのメンバーに属し、Ｓｈｏｉｃｈｉｒｏ Ｔｓｕｋｉｔａらにより１９９８年に発見され、上皮細胞の緊密な連結を構成する重要な分子であり、上皮細胞の透過性を決定し、細胞膜表面タンパク質及び脂質の拡散を阻止する役割も果たしている（Ｇｕｎｚｅｌ， Ｄ．及びＡ． Ｓ． Ｙｕ （２０１３）． 「Ｃｌａｕｄｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．」 Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ９３（２）： ５２５－５６９） 。ヒトのＣＬＤＮ１８遺伝子は、二つの異なるエクソン１を有し、転写後に可変スプライシングを経て、最終的に、Ｎ末端のみに異なる配列を有する二つのタンパク質サブタイプＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２が生成される。これらの二種類のＣＬＤＮ１８サブタイプタンパク質は、いずれも２６１個のアミノ酸で構成され、四つの膜貫通ドメインを有するが、両者は、異なる組織に分布しており、ＣＬＤＮ１８．１は主に肺組織に発現し、ＣＬＤＮ１８．２は分化した胃粘膜上皮細胞のみに発現し、胃幹細胞に発現しない（Ｓａｈｉｎ，Ｕｇｕｒら、「Ｃｌａｕｄｉｎ－１８ ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ２ ｉｓ ａ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」 ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１４．２３ （２００８）： ７６２４－７６３４）。

【0003】

ＣＬＤＮ１８．２は、様々な腫瘍組織、例えば、非小細胞肺癌（２５％）、胃癌（７０％）、膵臓癌（５０％）及び食道癌（３０％）に高度に発現するが、正常組織にほとんど発現せず（Ｋｕｍａｒ， Ｖ．ら、（２０１８） 「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ－Ｓｔａｇｅ Ｇａｓｔｒｉｃ Ｃａｎｃｅｒ．」 Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９： ４０４）、腫瘍細胞及び正常組織におけるその発現の差異のため、現在、抗腫瘍薬物の作用標的として非常に有望なものとなっている。

【0004】

今まで、ＣＬＤＮ１８．２を標的とする薬物の中で最も進められているのは、ドイツのＧａｎｙｍｅｄ社により開発されたＩＭＡＢ３６２であり、ＩＭＡＢ３６２は、ＣＬＤＮ１８．２を特異的に標的化するヒトマウスキメラＩｇＧ１マブであり、腫瘍細胞に発現するＣＬＤＮ１８．２の１番目の細胞外領域に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ） 及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により腫瘍細胞死を誘導する。ＩＭＡＢ３６２は、胃癌の第２相試験において、標準的な化学療法よりも患者の生存期間を有意に延長し（標準的な化学療法の生存期間は８．４ヶ月であるが、ＩＭＡＢ３６２治療の生存期間は１３．２ヶ月である）、ＩＭＡＢ３６２の治療効果は、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２高発現患者における優位性がより有意である。

【0005】

現在、ＣＬＤＮ１８．２標的を標的とするモノクローナル抗体薬物が臨床的に研究されているが、モノクローナル抗体（１５０ ｋＤ）には、分子質量が大きく、組織を透過しにくいため、腫瘍領域の有効濃度が低く、治療効果が十分でないという問題があり、治療剤として、ＣＬＤＮ１８．２標的を標的とする小分子抗体の開発し続けることが切望されている。

【0006】

単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）（例えば、ナノ抗体） は、現在最も小さい抗体分子であり、その分子量が一般的な抗体の１／１０である。単一ドメイン抗体は、モノクローナル抗体の抗原反応性に加えて、いくつかの独特な機能的特性を有し、例えば、それらは、通常、高い溶解度、良好な熱安定性、組織透過性及びパパインなどによる分解に対する耐性を示し、なお、単一ドメイン抗体は、酵母、植物及び哺乳動物細胞などの様々な宿主細胞に発現することができ、発現量が高く、それによりコスト面での優位性が非常に高い。そのため、当分野では、より高い親和性を有する、ＣＬＤＮ１８．２に結合する新規な単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の開発が望まれている。

【発明の概要】

【0007】

本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、ＣＬＤＮ１８．２を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含むＣＬＤＮ１８．２結合分子を開発し、それは、
（１）ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に高親和性で結合し、例えば、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子と細胞表面ＣＬＤＮ１８．２との間の結合のＥＣ_５０が約０．１ μｇ／ｍＬ～約１０ μｇ／ｍＬであり、好ましくは、約０．１ μｇ／ｍＬ～約１ μｇ／ｍＬ であり、
（２）ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に結合せず、
（３）抗体依存性細胞傷害及び／又は補体依存性細胞傷害作用によってＣＬＤＮ１８．２－陽性癌細胞を死滅させることができる。

【0008】

そのため、第１の態様では、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子を提供し、それは、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、三つの相補性決定領域を含み、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、ここで、
（ａ） ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
（ｂ） ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、及び
（ｃ） ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
ここで、前記アミノ酸変化は、アミノ酸の付加、欠失又は保存的アミノ酸置換であり、好ましくは、前記ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物ＶＨＨ、部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨである。

【0009】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子における前記ｓｄＡｂ部分は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３を含有するＣＤＲ３とを含む。

【0010】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子における前記ｓｄＡｂ部分は、
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列、又は、
（ｉｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子はさらに、前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端又はＣ末端で別のタンパク質ドメインに連結され、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域に連結され、例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのＦｃ領域に連結され、又は、例えば、蛍光タンパク質に連結される。

【0012】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、二重特異性又は多重特異性抗体であり、好ましくは、前記二重特異性抗体分子は、ＣＬＤＮ１８．２分子及び第２の標的タンパク質に特異的に結合し、前記第２の標的タンパク質は、例えば、
（１） 腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、癌胎児性抗原、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｍｕｃｉｎ－１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３７、ｃＭｅｔ又はアンジオポエチン－２（Ａｎｇ－２）、
（２） 免疫細胞の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３又はＬＡＧ－３、
（３） 免疫細胞の免疫共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ２又はＣＤ２７、
（４） サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３３から選択される。

【0013】

第２の態様では、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法を提供し、前記方法は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸の発現に適した条件下で、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸又は前記核酸を含む発現ベクターが導入された宿主細胞を培養し、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を単離させることを含み、任意選択的に、前記方法は、前記宿主細胞から前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を回収することをさらに含む。

【0014】

第３の態様では、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子及び他の物質、例えば、細胞傷害性薬剤を含む免疫コンジュゲートを提供した。

【0015】

第４の態様では、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は免疫コンジュゲート、及び任意選択的な薬用アジュバントを含む薬物組成物を提供した。

【0016】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は免疫コンジュゲート及び他の治療剤、並びに任意選択的な薬用アジュバントを含む薬物組成物を提供し、好ましくは、前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞傷害性薬剤から選択される。

【0017】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は免疫コンジュゲート、及び一つ又は複数の他の治療剤、例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む組み合わせ製品を提供した。

【0018】

第５の態様では、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患を被験体において治療する方法を提供し、治療有効量の本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子、免疫コンジュゲート、薬物組成物、又は組み合わせ製品を被験体に投与することを含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子、免疫コンジュゲート、薬物組成物、又は組み合わせ製品により治療される、ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患は、例えば、ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌である。

【0020】

第６の態様では、本発明は、試料におけるＣＬＤＮ１８．２を検出するキットを提供し、前記キットは、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子を含み、
（ａ）試料を本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子と接触させるステップ、及び
（ｂ）前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との間の複合体の形成を検出するステップを実施するためのものであり、任意選択的に、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、検出可能に標識され、
これにより、被験体又は個体からの試料にはＣＬＤＮ１８．２発現レベルの上昇が存在するか否かを判断する。

【図面の簡単な説明】

【0021】

以下に詳細に説明される本発明の好ましい実施形態は、以下の図面と併せて読むとより良く理解されるであろう。本発明を説明する目的のために、現在の好ましい実施形態が図に示されている。しかしながら、本発明は、図に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことが理解されるべきである。

【図1】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図を示した図である。試料は、それぞれ、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１、参考品ＩＰＩ（イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ） ） である。レーンＭａｒｋｅｒは、タンパク質分子量の指標である。

【図2A】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４検出のモノマー検出プロファイルを示した図である。

【図2B】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６検出のモノマー検出プロファイルを示した図である。

【図2C】ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１検出のモノマー検出プロファイルを示した図である。

【図3】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＫＥ２９３細胞への結合曲線を示した図であり、ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。

【図4】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞への結合曲線を示した図であり、ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。

【図5】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞への結合曲線を示した図であり、ＭＦＩは平均蛍光強度を表す。

【図6】高濃度（１００ μｇ／ｍＬ）での、抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．１－ＨＥＫ２９３細胞への結合陽性率を示した図である。

【図7】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞への抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示した図である。

【図8】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞への抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示した図である。

【図9】抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６及び対照重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１のｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞への抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

特に限定しない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。なお、本明細書に記載の材料、方法及び例は、単に例示的なものであり、限定することを意図していない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本明細書及び図面、並びに添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
Ｉ． 定義

【0023】

本明細書を説明するために、以下の定義が使用され、且つ適切であれば、単数形で使用される用語は複数も含み、その逆も同様である。要理解、本明細書で使用される用語は、単に具体的実施形態を説明するためのものであり、且つ限定することを意図していないことを理解されたい。

【0024】

「約」という用語は、数字や数値と併用される場合、指定された数字や数値よりも５％小さい下限から指定された数字や数値よりも５％大きい上限までの範囲内の数字や数値をカバーすることを意味する。

【0025】

本明細書で使用されるように、「及び／又は」という用語は、選択肢のうちのいずれか一つ又は選択肢のうちの二つ以上を意味する。

【0026】

本明細書において、「包含」又は「含む」という用語が使用される場合、特に明記しない限り、述べられた要素、整数又はステップからなる場合もカバーされる。例えば、ある具体的な配列を「包含」する抗体可変領域を言及する場合、該具体的な配列からなる抗体可変領域をカバーすることも意図されている。

【0027】

「Ｃｌａｕｄｉｎｓ」という用語は、上皮と内皮との緊密な結合に存在するインテグリン膜タンパク質であり、緊密な連結の重要な構成要素であり、１９９８年にＳｈｏｉｃｈｉｒｏ Ｔｓｕｋｉｔａらにより発見された。該ファミリーには、２４個のメンバーがある。ヒトＣｌａｕｄｉｎ １８遺伝子には二つの選択可能なエクソン１があるため、Ｃｌａｕｄｉｎ １８．１（本明細書では「ＣＬＤＮ１８．１」とも呼ばれる）及びＣｌａｕｄｉｎ １８．２（本明細書では「ＣＬＤＮ１８．２」とも呼ばれる）の二つのタンパク質サブタイプが産生され、両者は、１番目の細胞外ドメインの約５０個のアミノ酸の配列において、７個のみのアミノ酸残基が異なる。

【0028】

癌組織及び正常組織でのＣｌａｕｄｉｎ １８．２の発現に有意な差異があることは、正常組織においてＣｌａｕｄｉｎ １８．２プロモーター領域ＣＲＥＢ結合部位のＣｐＧが高度にメチル化されるが、細胞癌化の間にＣｐＧメチル化レベルが低下し、そしてＣＲＥＢがＣｌａｕｄｉｎ１８．２の転写の活性化に関与することに起因する可能性がある。

【0029】

本明細書で使用される「ＣＬＤＮ１８．２抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２を特異的に標的とする抗体」、「ＣＬＤＮ１８．２を特異的に認識する抗体」という用語は、交換可能に使用され、ＣｌａｕｄｉｎタンパクＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合できる抗体を意味する。特に、いくつかの具体的な実施形態において、ヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体、特にヒトＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが、ヒトＣＬＤＮ１８．１に特異的に結合しない抗体を指す。

【0030】

「抗体」という用語は、本明細書において最も広い意味で使用され、抗原結合部位を含むタンパク質を指し、様々な構造の天然抗体及び人工抗体をカバーし、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体 （例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、完全抗体及び抗体断片を含むが、それらに限らない。好ましくは、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体又は重鎖抗体である。

【0031】

「抗体断片」という用語は、完全抗体の一部を含み、完全抗体が結合する抗原に結合することができる、完全抗体と異なる分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二価もしくは二重特異性抗体又はそれらの断片、ラクダ科抗体（重鎖抗体）、及び抗体断片で形成された二重特異性抗体又は多重特異性抗体を含むが、それらに限らない。

【0032】

「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変ドメインにおいて、配列が高可変であり、且つ構造が確定されたループ （「超可変ループ」） が形成され、及び／又は抗原接触残基 （「抗原接触点」） を含有する領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープとの結合を担当し、Ｎ－末端から順に番号が付けられ、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。所与の重鎖可変領域アミノ酸配列において、各ＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか一つ又はその組み合わせで確定することができ、前記割り当てシステムは、例えば、抗体の三次元構造及びＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ （Ｃｈｏｔｈｉａら． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ８７７－８８３、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら， 「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２７３， ９２７－９４８ （１９９７））、抗体配列可変性に基づくＫａｂａｔ （Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第４版， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９８７））， ＡｂＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ） （ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）、及び多数の結晶構造を利用する近接伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。

【0033】

特に断りのない限り、本発明において、「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲ配列」という用語は、上記いずれか一つの方式で確定されたＣＤＲ配列をカバーする。

【0034】

ＣＤＲはまた、参照ＣＤＲ配列 （例えば、本発明に例示されるＣＤＲのいずれか一つの配列） と同じＡｂＭ番号付け位置を有することに基づいて確定されてもよい。一実施形態において、本発明の単一ドメイン抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ番号付けプロトコルに基づいて位置が確定される。

【0035】

特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域及びＣＤＲにおける残基位置 （重鎖可変領域残基を含む） が言及される場合、ＡｂＭ番号付けシステムに基づく番号付け位置を指す。

【0036】

異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかしながら、ＣＤＲは抗体間で異なるが、ＣＤＲ内には限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与している。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、ＩＭＧＴ及びＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも二つを用いて、最小重複領域を確定することによって、抗原結合用の「最小結合単位」を提供することができる。最小結合単位はＣＤＲのサブパートであってもよい。当業者に明らかなように、抗体の構造とタンパク質の折りたたみによって、ＣＤＲ配列の他の部分の残基を確定することができる。そのため、本発明は、本明細書に提示される任意のＣＤＲの変異体も考慮する。例えば、一つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基は、そのままであってもよいが、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａ又はＡｂＭ又はＩＭＧＴ又はＣｏｎｔａｃｔに基づいて定義された他のＣＤＲ残基は、保存アミノ酸残基に置換されてもよい。

【0037】

「単一ドメイン抗体」という用語は、通常、単一可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ） 又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン、魚ＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ） ） だけで抗原結合を付与することができる抗体を指す。即ち、該単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために、別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科（ラマ及びラクダ） 及び軟骨魚（例えば、コモリザメ） からの単一ドメイン抗体（ＷＯ ２００５／０３５５７２）が挙げられる。ラクダ科に由来する単一ドメイン抗体は、本出願においてＶＨＨとも称され、一つの重鎖可変領域のみで構成され、Ｃ末端からＮ末端まで一本の鎖ＦＲ４－ＣＤＲ３－ＦＲ３－ＣＤＲ２－ＦＲ２－ＣＤＲ１－ＦＲ１のみを含む抗体であり、「ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」とも呼ばれる。単一ドメイン抗体は、目的抗原に結合できる現在既知の最小単位である。

【0038】

「重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｈｃＡｂ） 」という用語は、軽鎖を有しない抗体を指し、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むか、又はＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３を含むか、又はＶＨＨ－ＣＨ２－ＣＨ３などを含んでもよく、ホモ二量体、例えば、軽鎖を有しない重鎖二量体抗体を構成することができる。重鎖抗体には、標準抗体からのＶＨ又は単一ドメイン抗体からのＶＨＨが含まれていてもよい。一実施形態において、本発明の重鎖抗体は、単一ドメイン抗体のＶＨＨを含む。

【0039】

本明細書で使用されるように、「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも二つの抗原結合部位を有する抗体を指し、前記少なくとも二つの抗原結合部位のうちの各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープに結合する。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体である。一実施形態において、本明細書は、第１の抗原及び第２の抗原に対する結合特異性を有する、「二重特異性抗体」とも呼ばれる多重特異性抗体を提供する。

【0040】

「エフェクター機能」は、免疫グロブリンアイソタイプによって変動する、免疫グロブリンＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。免疫グロブリンエフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体媒介性抗原提示細胞による抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御及びＢ細胞の活性化が挙げられる。

【0041】

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、いくつかの細胞傷害エフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）が、標的細胞及び外来宿主細胞に対するキラーを媒介する主なメカニズムの一つである。抗体のＦｃ領域を介して、例えば、ＮＫ細胞に発現するＦｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（即ち、ＣＤ１６ａ）に結合した後に、ＡＤＣＣ作用を果たすようにＮＫ細胞を活性化する。ＣＤ１６ａは、免疫グロブリンスーパーファミリー膜貫通受容体メンバーに属し、そのＮ末端１５８位の対立遺伝子多型差異に応じて、ＣＤ１６ａには１５８位バリン又はフェニルアラニンが差次的に発現し、それにより、ヒト集団にはＣＤ１６ａ－１５８Ｖ／Ｖ（約１５％を占め）、ＣＤ１６ａ－１５８Ｖ／Ｆ（約２５％を占め） 及びＣＤ１６ａ－１５８Ｆ／Ｆ（約６０％を占め） サブタイプが存在する。

【0042】

「補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）」という用語は、補体存在下の標的細胞の開裂を指す。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）とその同じ抗原に結合する抗体（適切なサブクラス）との結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載の方法により、ＣＤＣアッセイを実施することができる。

【0043】

「キメラ抗体」という用語は、（ａ）定常領域又はその一部の改変、置き換え又は交換により、抗原結合部位が、異なるか又は改変されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域又はキメラ抗体に新たな性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物）などに連結され、又は（ｂ）可変領域又はその一部を、異なるか又は改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置き換え又は交換する抗体分子である。例えば、ラクダ抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域に変更することによって修飾され得る。ヒト定常領域に変更されるため、該キメラ抗体は、抗原認識における特異性を保持することができるとともに、元のラクダ抗体に比べて、ヒトにおける抗原性が低下している。

【0044】

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体における全て又は実質的に全てのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体のそのものに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲは、ヒト抗体のそのものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する少なくとも一部の抗体定常領域を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。

【0045】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト又はヒト細胞によって生成されるか又は非ヒト供給源に由来し、ヒト抗体ライブラリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体という定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0046】

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において免疫グロブリン重鎖のＣ末端区域を定義するためのものであり、前記領域は少なくとも一部の定常領域を含む。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル基末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても又は存在しなくてもよい。Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、別段の説明がない限り、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに基づいて行われる。

【0047】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、通常、類似する構造を有し、ここで、各ドメインは、四つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び三つの相補性決定領域 （ＣＤＲ）を含む。（例えば、ＫｉｎｄｔらＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６^ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．ページ９１（２００７）を参照されたい）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるには十分である。

【0048】

本明細書で使用されるように、「結合」又は「特異的に結合」という用語は、結合作用が抗原に対して選択的であり、且つ望ましくないか又は非特異的相互作用と区別することができること意味する。抗体が特定の抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＰＲ又はバイオレイヤー干渉技術又は当分野で既知の他の一般的な結合アッセイによって測定され得る。

【0049】

「免疫チェックポイント分子」という用語は、末梢組織における免疫反応の持続性及び強度を調節することによって組織損傷を回避し、自己抗原に対する耐性の維持に関与する、免疫系に存在する抑制性シグナル分子を指す（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．， Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１２， １２（４）： ２５２－２６４）。研究したところ、腫瘍細胞がインビボ免疫系から逃れて、制御不能になり増殖できる原因の一つは、免疫チェックポイント分子の抑制性シグナル経路を利用してＴリンパ球活性を抑制し、それによりＴリンパ球が腫瘍に対する殺傷効果を効果的に発揮することができなくなることであることが分かった（Ｙａｏ Ｓ， Ｚｈｕ Ｙ及びＣｈｅｎ Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ， ２０１３， １２（２）：１３０－１４６）。免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１ （ＰＤ－１）、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３を含むが、それらに限らない。

【0050】

「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドに特異的に結合することによって、Ｔ細胞の共刺激反応（例えば、限定されないが、増殖）を媒介する、Ｔ細胞における該当する結合パートナーを指す。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンド以外の、有効な免疫応答に役立つ細胞表面分子を指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及びＣＤ２８を含むが、それらに限らない。いくつかの実施形態において、「共刺激分子」は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）及び／又はＣＤ２７である。

【0051】

「サイトカイン」という用語は、一つの細胞群により放出され、細胞間媒体として別の細胞に作用するタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例としては、ＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５のようなリンフォカイン、モノカイン、インターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ－α又はＴＮＦ－βのような腫瘍壊死因子、及びγ－インターフェロンを含む他のポリペプチド因子がある。

【0052】

「免疫コンジュゲート」という用語は、一つ又は複数の他の物質（細胞傷害性薬剤又は標識を含むが、それらに限らない）にコンジュゲートされた抗体を指す。

【0053】

「半有効濃度（ＥＣ_５０）」という用語は、特定の暴露時間後にベースラインと最大値の間の５０％の応答を誘導する薬物、抗体又は毒剤の濃度を指す。本出願の文脈において、ＥＣ_５０の単位は「μｇ／ｍＬ」である。

【0054】

「治療有効量」という用語は、必要な用量で、かつ必要な期間にわたって、所望の予防結果を効果的に達成する量を指す。抗体もしくは抗体断片又はそれらのコンジュゲートもしくは組成物の治療有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別及び体重並びに抗体又は抗体部分が個体において所望の応答を惹起する能力などの様々な要因に依存して変化し得る。治療有効量はまた、抗体もしくは抗体断片又はそれらのコンジュゲートもしくは組成物の任意の毒性又は有害作用が治療上の有益作用に及ばない量でもある。治療されていない対象に対して、「治療有効量」は、測定可能なパラメータ （例えば、腫瘍増殖率、腫瘍体積など） を、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％、６０％又は７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％又は９０％抑制する。化合物が測定可能なパラメータ （例えば、癌）を抑制する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価され得る。

【0055】

「個体」又は「被験体」という用語は、交換可能に使用され、哺乳動物を含む。哺乳動物は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類 （例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ及び齧歯類 （例えば、マウス及びラット） を含むが、それらに限定されない。特に、個体又は被験体は、ヒトである。

【0056】

「腫瘍」及び「癌」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、固形腫瘍及び液性腫瘍をカバーする。

【0057】

「癌」及び「癌性」という用語は、哺乳動物における、細胞増殖が制御できない生理学的疾患を指す。

【0058】

「腫瘍」という用語は、悪性又は良性を問わず、全ての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、互いに排他的というわけではない。

【0059】

「単離されたＣＬＤＮ１８．２結合分子」という用語は、既にその天然環境の成分から単離されたものを指す。いくつかの実施形態において、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動 （ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって確定されたように、ＣＬＤＮ１８．２結合分子を９５％超又は９９％の純度まで精製する。抗体純度を評価するための方法に関する概説は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

【0060】

「サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法）」という用語は、抗体標準化及び品質管理のための重要な方法である。該方法は、主に分子のサイズ大きさ又は流体力学的半径の差異に基づいて分子の単離を行う。ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、抗体は、高分子量形態（ＨＭＭＳ）、主ピーク（主に抗体モノマー）及び低分子量形態（ＬＭＭＳ）の三つの主な形態が単離され得る。抗体純度は、クロマトグラムにおける全てのピーク面積の合計に対する主ピーク面積の割合として算出することができる。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により、製剤製品における抗体モノマーの割合を測定して、可溶性凝集物及びせん断物の含有量の情報を与えることができる。

【0061】

「単離された核酸」という用語は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、該核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、該核酸分子は、染色体外又はその天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。「単離された、ＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸」は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子の鎖又はその断片をコードする一つ又は複数の核酸分子を指し、単一ベクター又は個別のベクターにおけるこのような核酸分子、及び宿主細胞のうちの一つ又は複数の位置に存在するこのような核酸分子を含む。

【0062】

配列間の配列同一性の計算は以下のように行われる。

【0063】

二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の同一性の割合を確定するために、最適な比較を目的として前記配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入するか又は比較するために非相同配列を棄却してもよい）。一好ましい実施形態において、比較するために、アラインメントされる参照配列の長さは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％の参照配列長さである。その後に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列中の対応する位置における同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、前記分子はこの位置において同じである。

【0064】

二つの配列の間の配列比較及び同一性割合の計算は、数学的アルゴリズムを利用して実現され得る。一好ましい実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａ及びＷｕｎｓｃｈ （（１９７０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのアミノ酸配列の間の同一性割合を確定する。さらに別の好ましい実施形態において、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びにギャップ重み４０、５０、６０、７０又は８０及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定する。特に好ましいパラメータセット（及び別段の説明がない限り使用されるべきパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアマトリックスである。

【0065】

さらに、ＰＡＭ１２０重み付け余数表、ギャップ長さペナルティ１２、ギャップペナルティ４）を用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれたＥ． Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ． Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム、（ （１９８９） ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１－１７）を利用して、二つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定することができる。

【0066】

追加的に又は代替的に、本明細書に記載の核酸配列及びタンパク質配列は、共通データベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバー配列又は関連する配列を同定するために、「照会配列」としてさらに使用されてもよい。

【0067】

「トランスフェクション」という用語は、核酸を真核細胞、特に哺乳動物細胞に導入するプロセスを指す。トランスフェクションに用いられる解決策及び技術は、リポフェクション、エレクトロポレーションなどの化学的及び物理的方法によるトランスフェクションを含むが、これらに限定されない。多くのトランスフェクション技術は当分野に周知のものであり、例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄａｖｉｓら，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｃｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。

【0068】

「蛍光活性化細胞選別」又は「ＦＡＣＳ」という用語は、特別なタイプのフローサイトメトリーを指す。それは、各細胞の特定の光散乱及び蛍光特徴に基づき、１回に１つの細胞、生物細胞の異種混合物を２つ以上の容器に選別する方法を提供する（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｃ．「Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｏｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ」．２０１７－１１－０９）。ＦＡＣＳを行うための機器は、当業者に知られて一般に市販されているものである。このような機器の例は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）からのＥｐｉｃｓ Ｃ及びＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）からのＭｏＦｌｏを含む。

【0069】

「ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患」という用語は、ＣＬＤＮ１８．２（例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）の発現又は活性の増加により引き起こされる、悪化した又は他の形でそれに関連する任意の病症を指す。

【0070】

「薬物組成物」という用語は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形態で存在し、且つ前記組成物が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する他の成分を含まない組成物を指す。

【0071】

「薬用アジュバント」という用語は、活物質と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）、賦形剤又は安定剤などを指す。

【0072】

本明細書に用いられる場合、「治療」は、既に存在する症状、病態、状態又は疾患の進行又は重症度を減速、中断、阻止、寛解、停止、低下、又は逆転することを指す。所望の治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の、任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮減、転移の予防、病状進行の速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含むが、それらに限らない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の進行を遅延させるか、又は疾患の進行を減速させることに用いられる。

【0073】

本明細書に記載の「治療剤」という用語は、腫瘍（例えば、癌）の治療に有効な任意の物質をカバーし、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、低分子薬物又は免疫調節剤を含む。

【0074】

本明細書に使用される「化学療法剤」という用語は、癌の治療に役立つ化学化合物を含み、抗腫瘍剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤、並びに非ステロイド系抗アンドロゲン剤等を含むが、それらに限らない。化学療法剤の例は、ＷＯ２０１５／１５３５１３又はＷＯ２０１６／０２８６７２又はＷＯ２０１５／１３８９２０に開示されるものを参照されたい。

【0075】

本明細書で使用される「免疫調節剤」は、免疫応答を抑制又は調節する天然の又は合成される活性剤又は薬物を指す。免疫応答は、体液性応答又は細胞応答であってもよい。免疫調節剤は、免疫チェックポイント分子の阻害剤と、共刺激分子の活性化剤とを含む。

【0076】

本明細書で使用されるように、「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞機能を抑制又は阻止し、及び／又は細胞死又は細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤の例は、ＷＯ２０１５／１５３５１３、ＷＯ２０１６／０２８６７２又はＷＯ２０１５／１３８９２０に開示されるものを参照されたい。

【0077】

「組み合わせ製品」という用語は、１つの投与量単位形態の固定又は非固定の組み合わせ又は組み合わせ投与のための部分のキットを指し、ここで、二つ以上の治療剤は、独立して、同じ時間で同時に投与されるか、又は一定の時間間隔内、特に、これらの時間間隔が、組み合わせされた各治療剤が協働、例えば、相乗効果を示すことを可能にする場合に、個別に投与され得る。「固定の組み合わせ」という用語は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子と組み合わせパートナー（例えば、他の治療剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）が、単一の実体又は投与量の形態で患者に同時に投与されることを指す。「非固定の組み合わせ」は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子と組み合わせパートナー（例えば、他の治療剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）が、個別の実体として、同時に、並行、又は連続して、特定の時間制限なしに患者に投与されることを意味し、ここで、このような投与は、患者の体における二つの治療剤の治療有効レベルを提供する。後者はまた、カクテル治療、例えば、三つ又はより多くの治療剤の投与に適用される。一好ましい実施形態において、薬物の組み合わせは非固定の組み合わせである。

【0078】

「組み合わせ療法」又は「併用療法」という用語は、本開示に記載される癌を治療するために二つ又はより多くの治療剤を投与することを指す。このような投与は、これらの治療剤を、例えば、一定の割合の活性成分を有する単一カプセルで、実質的に同時に、共同で投与することを含む。又は、このような投与は、複数の又は個別の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末及び液体）における各活性成分の共同投与、個別投与又は逐次投与を含む。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の投与量に再構成又は希釈することができる。いくつかの実施形態において、投与は、各タイプの治療剤をほぼ同じ時間、又は異なる時間で順番に使用することをさらに含む。いずれの場合においても、治療レジメンは、本明細書に記載の病症又は病態の治療における薬物組み合わせの有益な効果を提供する。

【0079】

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」という用語は、本明細書で使用される場合、それと連結される別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及びそれを導入した宿主細胞のゲノムに結合するベクターを含む。いくつかのベクターは、それに有効に連結される核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

【0080】

「宿主細胞」という用語は、外因性ポリヌクレオチドがすでにそれに導入された細胞、及びこのような細胞の子孫を指す。宿主細胞は、継代数を考慮せず、一次形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含む「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含む。子孫は、核酸物質について親細胞と完全に同じではない場合があり、突然変異を含んでもよい。本明細書において、最初に形質転換された細胞からスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫を含む。宿主細胞は、本発明の抗体分子を産生することに用いられ得る任意のタイプの細胞系であり、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞と、原核細胞、例えば、大腸菌細胞とを含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養された植物組織もしくは動物組織内部の細胞も含む。

【0081】

「被験体／患者試料」という用語は、患者又は被験体から得た細胞、組織又は体液の集合を指す。組織又は細胞試料の供給源は、固形組織であってもよく、例えば、新鮮で、凍結及び／又は保存された器官又は組織試料もしくは生検試料もしくは穿刺試料からのもの、血液又は任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液 （羊水）、腹膜液 （腹水）、又は間質液のような体液、被験体からの妊娠中又は任意の発育段階の細胞である。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などのような自然界において組織と天然に混合しない化合物を含み得る。本明細書において、腫瘍試料の例としては、腫瘍生検、微細針吸引物、気管支洗浄液、胸膜液 （胸水）、痰、尿、手術検体、循環中の腫瘍細胞、血清、血漿、循環中の血漿タンパク質、腹水、腫瘍に由来するか又は腫瘍様性質を示す初代細胞培養物又は細胞株、及びホルマリンで固定され、パラフィンに包埋される腫瘍試料又は凍結される腫瘍試料のような保存された腫瘍試料を含むが、それらに限らない。

【0082】

「包装インサート」という用語は、通常治療用製品の商業包装に含まれる取扱説明書を指し、このような治療用製品の応用に関連する適応症、使用方法、投与量、投与、併用療法、禁忌症及び／又は警告に関する情報を含む。
ＩＩ． 本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子

【0083】

本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合するが、ＣＬＤＮ１８．１に結合しないか又は実質的に結合しない少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、Ｎ末端からＣ末端まで、三つの相補性決定領域を含み、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、ここで、
（ａ） ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
（ｂ） ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、及び
（ｃ） ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
ここで、前記アミノ酸変化は、アミノ酸の付加、欠失又は保存的アミノ酸置換である。

【0084】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、哺乳動物ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に結合する。例えば、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ヒトＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン１（ＥＣＤ１）に特異的に結合する。

【0085】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、
（１）ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に高親和性で結合し、例えば、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子と細胞表面ＣＬＤＮ１８．２との間の結合のＥＣ_５０が約０．１ μｇ／ｍＬ～約１０ μｇ／ｍＬであり、好ましくは、約０．１ μｇ／ｍＬ～約１ μｇ／ｍＬであることと、
（２）ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に結合しないことと、
（３）抗体依存性細胞傷害及び／又は補体依存性細胞傷害作用によってＣＬＤＮ１８．２－陽性癌細胞を死滅させることとのうちの一つ又は複数の特性を有する。

【0086】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子における前記ｓｄＡｂ部分は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３を含有するＣＤＲ３とを含む。

【0087】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分はＶＨＨである。いくつかの実施形態において、前記ＶＨＨは、
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列、
（ｉｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、又は
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列に比べて、１つ又は複数（好ましくは、１０個以下であり、さらに好ましくは、６、５、４、３、２、１個以下） のアミノ酸変化（好ましくは、アミノ酸置換であり、さらに好ましくは、アミノ酸保存的置換） を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらの配列で構成され、好ましくは、前記アミノ酸変化は、ＣＤＲ領域に発生しない。

【0088】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨである。ラクダ科動物のＶＨＨに比べて、本発明の部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨは、人体に対して減少したヒト抗ラクダ科抗体反応を有し、抗体応用の安全性を向上させ、親和性が成熟したＶＨＨである。

【0089】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、そのｓｄＡｂ部分のＮ末端又はＣ末端が免疫グロブリンのＦｃ領域に連結され、任意選択的に、アミノ酸リンカーを介して連結され、例えば、長さが１～２０個のアミノ酸のアミノ酸リンカーを介して連結される。いくつかの実施形態において、前記アミノ酸リンカーのうちの少なくとも９０％は、グリシン及び／又はセリンアミノ酸である。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのものである。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域はＩｇＧ１からのものである。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１からのものである。

【0090】

本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸の置換、插入又は欠失を含む。好ましくは、本明細書に記載のアミノ酸変化は、アミノ酸置換であり、好ましくは、保存的置換である。

【0091】

好ましい実施形態において、本発明に記載のアミノ酸変化は、ＣＤＲの外の領域（例えば、ＦＲ）で起こる。より好ましくは、本発明に記載のアミノ酸変化は、ＶＨＨの外の領域で起こる。いくつかの実施形態において、置換は保存的置換である。保存的置換は、一つのアミノ酸が同じクラス内の別のアミノ酸で置換され、例えば、一つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸で置換され、一つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸で置換され、又は一つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸で置換されることを指す。例示的置換は、以下の表１に示すとおりである。

【0092】

【表1】

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書によるＣＬＤＮ１８．２結合分子は、改変することによってそのグリコシル化程度を増加又は低下させる。ＣＬＤＮ１８．２結合分子のグリコシル化部位への付加又は欠失は、一つ又は複数のグリコシル化部位を産生又は除去するようにアミノ酸配列を改変することによって容易に実現することができる。ＣＬＤＮ１８．２結合分子がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に連結される糖類を変えることができる。いくつかの用途において、望ましくないグリコシル化部位修飾の除去は有用であり得、例えば、フコースモジュールの除去は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を向上させることができる（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２） ＪＢＣ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の用途において、ガラクトシル化修飾を行って補体依存性細胞傷害 （ＣＤＣ）を調節することができる 。いくつかの実施形態において、本明細書によるＣＬＤＮ１８．２結合分子のＦｃ領域に一つ又は複数のアミノ酸修飾を導入して、Ｆｃ領域変異体を産生することにより、例えば、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の癌の治療における有効性を強化することができる。

【0094】

いくつかの実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、二重特異性又は多重特異性抗体分子の形態である。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、ＣＬＤＮ１８．２及びＰＤ－１に結合する。多重特異性抗体分子は、例えば、三重特異性抗体分子であってもよく、ＣＬＤＮ１８．２に対する第１の結合特異性と、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＯＸ４０又はＬＡＧ－３のうちの一つ又は複数の分子に対する第２及び第３の結合特異性とを含む。
ＩＩＩ．免疫コンジュゲート

【0095】

本発明はさらに、他の物質とコンジュゲートするＣＬＤＮ１８．２結合分子（「免疫コンジュゲート」）に関する。いくつかの実施形態において、他の物質は、例えば、治療剤 （例えば、細胞傷害性薬剤） である。細胞傷害性薬剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。免疫コンジュゲートを形成することに適した細胞傷害性薬剤 （例えば、化学療法剤） の例は、当分野において既知である。例えば、細胞傷害性薬剤は、放射性同位体、成長阻害剤、その断片及び／又は変異体を含む、低分子毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的活性毒素のような毒素、及び既知の様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を含むが、それらに限らない。

【0096】

免疫コンジュゲートの形成に適した細胞傷害性薬剤（例えば、化学療法剤） の例はさらに、例えば、ＷＯ２０１５／１５３５１３又はＷＯ２０１５／１３８９２０などを参照されたい。

【0097】

本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子はまた、固相支持体に連結されてもよく、前記支持体は、特に免疫アッセイ又は標的抗原の精製に用いられ得る。このような固相支持体は、玻璃、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含むが、それらに限らない。

【0098】

いくつかの実施形態において、前記免疫コンジュゲートは、腫瘍を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、腫瘍は癌である。
ＩＶ． 本発明の核酸及びそれを含む宿主細胞

【0099】

一態様では、本発明は、以上の任意のＣＬＤＮ１８．２結合分子又はその断片又はそのいずれか一つの鎖をコードする核酸を提供する。一実施形態において、前記核酸を含むベクターが提供される。一実施形態において、ベクターは発現ベクターである。一実施形態において、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又は２９３細胞）又は抗体又はその抗原結合断片の調製に適した他の細胞から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。

【0100】

例えば、本発明の核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５、８、９から選択されるいずれか一つに示すアミノ酸配列をコードする核酸、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５、８、９から選択されるいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。

【0101】

本発明はさらに、ストリンジェントな条件下で下記核酸とハイブリダイズする核酸、又は下記核酸に比べて一つ又は複数のアミノ酸置換 （例えば、保存的置換）、欠失又は挿入を有するポリペプチド配列をコードする核酸をカバーする：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５、８、９から選択されるいずれか一つに示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、５、８、９から選択されるいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸。

【0102】

一実施形態において、前記核酸を含む一つ又は複数のベクターが提供される。一実施形態において、ベクターは、発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ又は酵母人工染色体 （ＹＡＣ） を含むが、それらに限らない。一実施形態において、ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターである。

【0103】

発現するための発現ベクター又はＤＮＡ配列が製造されると、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクト又は導入してもよい。様々な技術、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、逆転写ウイルスの形質導入、ウイルストランスフェクト、遺伝子ガン、リポフェクション又は他の一般的な技術は、この目的の実現に用いられ得る。プロトプラスト融合の場合に、培地中で細胞を培養し、適切な活性をスクリーニングする。産生されたトランスフェクト細胞を培養し、産生された抗体分子を回収するための方法及び条件は、当業者に既知であり、且つ本明細書及び従来技術に既知の方法に基づいて、使用される特定の発現ベクター及び哺乳動物宿主細胞に応じて変更又は最適化され得る。

【0104】

また、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする一つ又は複数のマーカーを導入することによって、既にＤＮＡをその染色体に安定的に組み込んだ細胞を選定することができる。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に原栄養株、殺生物耐性（例えば、抗生物質） 又は重金属 （例えば、銅） 耐性などを提供することができる。選択可能な標識遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列と直接連結されるか又は同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡを最適に合成するために、追加のエレメントが必要になることもある。これらのエレメントは、スプライシングシグナル、転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルを含んでもよい。

【0105】

一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、又は抗体の製造に適した他の細胞から選択される。適切な宿主細胞は、大腸菌のような原核微生物を含む。宿主細胞はさらに、糸状菌もしくは酵母のような真核微生物、又は様々な真核細胞、例えば、昆虫細胞などであってもよい。また、脊椎動物細胞を宿主として用いてもよい。例えば、懸濁成長に適するように操作された哺乳動物細胞株を用いてもよい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ２９３又は２９３Ｆ細胞）、２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、ザル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＮＳＯ細胞、Ｙ０、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などのような骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質の産生に適した哺乳動物宿主細胞株に関する概説は、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏによる編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、ページ２５５～２６８（２００３）を参照されたい。一好ましい実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である。
Ｖ． 本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の生産及び精製

【0106】

一実施形態において、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法を提供し、ここで、前記方法は、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸の発現に適した条件下で、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸又は前記核酸の発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を任意に単離させることとを含む。ある実施形態において、前記方法は、前記宿主細胞 （又は宿主細胞培地） からＣＬＤＮ１８．２結合分子を回収することをさらに含む。

【0107】

本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子を組換え産生するために、まず本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸を単離させ、宿主細胞においてさらにクローニング及び／又は発現を行うために、前記核酸をベクターに挿入する。このような核酸は、通常の規程で単離及び配列決定を行うことが容易であり、例えば、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行われる。

【0108】

本明細書に記載されるように調製された本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、既知の従来技術、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製され得る。特定のタンパク質を精製するための実際の条件はまた、正味の電荷、疎水性、親水性などの要素に依存し、且つこれらは当業者にとって明らかである。本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の純度は、複数の周知の分析方法のうちのいずれか一つの方法によって確定することができ、前記周知の分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。
ＶＩ． 本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の活性測定法

【0109】

本明細書によるＣＬＤＮ１８．２結合分子は、当分野に既知の複数の測定法によって同定し、スクリーニングし、又はその物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性を特徴づけることができる。一方、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子に対してその抗原結合活性を試験し、例えば、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ又はＷｅｓｔｅｒｎブロットなどの既知の方法によって行われる。ＣＬＤＮ１８．２への結合は、当分野に既知の方法によって測定することができ、本明細書には例示的な方法が開示された。いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳを用いて、細胞表面ＣＬＤＮ１８．２ （例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２）への本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の結合を測定する。

【0110】

本発明は、生物学的活性を有するＣＬＤＮ１８．２結合分子を同定するための測定法をさらに提供した。生物学的活性は、例えば、ＡＤＣＣ作用、ＣＤＣ作用などを含んでもよい。

【0111】

任意の上記インビトロ測定法に用いられる細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を天然に発現するか又はＣＬＤＮ１８．２を発現するように操作される細胞株を含む。前記の、ＣＬＤＮ１８．２を発現するように操作される細胞株は、正常にはＣＬＤＮ１８．２を発現せず、ＣＬＤＮ１８．２をコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトした後にＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞株である。

【0112】

理解できるように、任意の上記測定法は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子の代わりに、本発明の免疫コンジュゲートを用いて行われ得る。
ＶＩＩ． 薬物組成物及び薬物製剤

【0113】

いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の任意のＣＬＤＮ１８．２結合分子又はその免疫コンジュゲートを含む組成物を提供し、好ましくは、組成物は薬物組成物である。一実施形態において、前記組成物は、薬用アジュバントをさらに含む。一実施形態において、組成物（例えば、薬物組成物）は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又はその免疫コンジュゲート、一つ又は複数の他の治療剤 （例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、低分子薬物又は免疫調節剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）の組み合わせを含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、前記組成物は、腫瘍を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、腫瘍は癌である。

【0115】

本発明は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子又はその免疫コンジュゲートを含む組成物（薬物組成物又は薬物製剤を含む）及び／又はＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む組成物（薬物組成物又は薬物製剤を含む）をさらに含む。これらの組成物は、当分野に既知の薬用ベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤のような適切な薬用アジュバントをさらに含んでもよい。

【0116】

本明細書で使用されるように、「薬用ベクター」は、生理学的に適合性の任意の全ての溶媒、分散媒体、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。本発明に適する薬用ベクターは、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物又は合成供給源のものを含む油及び水のような無菌の液体であってもよい。薬物組成物が静脈内投与される場合、水は好適なベクターである。また、生理食塩水、水性デキストロース及びグリセリン溶液を液体ベクター、特に注射用溶液として用いてもよい。適切な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリルモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用及びその用途については、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」， 第五版， Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ， Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ 及びＳ．Ｃ．Ｏｗｅｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｌｏｎｄｏｎ， Ｃｈｉｃａｇｏも参照されたい。所望であれば、前記組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤をさらに含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉末、持続放出製剤などの形態をとることができる。

【0117】

本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を含む薬物製剤は、所望の純度を有する本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子を、一つ又は複数の任意選択的な薬用アジュバント （Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６ 版，Ｏｓｏｌ，Ａ． による編集（１９８０）） と混合することによって、好ましくは、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で製造され得る。

【0118】

本発明の薬物組成物又は製剤は、治療される特定の適応症に必要とされる一つ超の活性成分をさらに含んでもよく、好ましくは、互いに悪影響を及ぼしない、相補的活性を有するそれらの活性成分を有する。例えば、他の抗癌活性成分、例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、低分子薬物又は免疫調節剤、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体などをさらに提供することが望ましい。前記活性成分は、目的用途に有効な量で適切に組み合わせて存在する。

【0119】

持続放出製剤を製造することができる。持続放出製剤の好適な例としては、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の固体疎水性ポリマーを含有する半透過性マトリックスが挙げられ、前記マトリックスは、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態を呈する。
ＶＩＩＩ． 組み合わせ製品又はキット

【0120】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又はその抗原結合断片、又はその免疫コンジュゲート、及び一つ又は複数の他の治療剤 （例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害性薬剤、低分子薬物又は免疫調節剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。いくつかの実施形態において、他の抗体は、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0121】

いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品は、腫瘍を治療するためのものである。いくつかの実施形態において、腫瘍は癌などである。

【0122】

いくつかの形態において、前記組み合わせ製品のうちの二つ又は複数の成分は、被験体に順次、別々又は同時に併用投与され得る。

【0123】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子、薬物組成物、免疫コンジュゲート又は組み合わせ製品を含むキット、及び投与を指示する任意選択的な包装インサートをさらに提供した。

【0124】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子、薬物組成物、免疫コンジュゲート、組み合わせ製品を含む薬物製品をさらに提供し、任意選択的に、前記薬物製品は、投与を指示する包装インサートをさらに含む。
ＩＸ． 本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の用途

【0125】

一態様では、本発明は、ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患を被験体において治療する方法に関し、該方法は、治療有効量の本明細書に開示されたＣＬＤＮ１８．２結合分子又はそれを含む薬物組成物又は免疫コンジュゲート又は組み合わせ製品を対象に投与することを含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌を被験体において治療する方法に関し、前記方法は、治療有効量の本明細書に開示されたＣＬＤＮ１８．２結合分子又はそれを含む薬物組成物又は免疫コンジュゲート又は組み合わせ製品を前記被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌は、例えば、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫及び下垂体腺腫であり、好ましくは、前記癌は、胃癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌又は肺癌である。

【0127】

被験体は、哺乳動物、例えば、霊長類、好ましくは、高度な霊長類、例えば、ヒト （例えば、本明細書に記載の疾患に罹患しているか又は本明細書に記載の疾患に罹患するリスクのある患者）であり得る。一実施形態において、被験体は、本明細書に記載の疾患 （例えば、本明細書に記載の腫瘍）に罹患しているか又は本明細書に記載の疾患に罹患するリスクがある。いくつかの実施形態において、被験体は、他の治療、例えば、化学療法治療及び／又は放射線療法を受けるか又は既に受けた。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の癌は、固形腫瘍、血液癌、軟部腫瘍及び転移病巣を含むが、それらに限らない。

【0129】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療方法は、本明細書に開示されたＣＬＤＮ１８．２結合分子又は薬物組成物又は免疫コンジュゲート又は組み合わせ製品、及び一つ又は複数の他の療法、例えば、治療方式及び／又は他の治療剤を前記被験体又は個体に併用投与することをさらに含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、治療方式は、外科手術（例えば、腫瘍切除術）、放射線療法（例えば、それに照射領域が設計される三次元原体放射線療法に関する外粒子線療法）、局所照射（例えば、予め選択された標的又は器官に向けられた照射）又は集束照射）などを含む。集束照射は、定位的放射線手術、分割照射による定位的放射線手術及び強度変調放射線療法から選択され得る。集束照射は、ＷＯ ２０１２／１７７６２４において記述されているように、粒子線（プロトン）、コバルト－６０（光子）及び線形加速器（Ｘ線）から選択される放射線源を有し得る。

【0131】

放射線療法は、いくつかの方法のうちの一つ又は方法の組み合わせによって投与することができ、前記方法は、外粒子線療法、内部放射線療法、インプラント照射、定位的放射線手術、全身放射線療法、放射線療法及び永続的又は一時的間質近接放射線療法を含むが、それらに限らない。

【0132】

いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、低分子薬物又は免疫調節剤（例えば、共刺激分子の活性化剤又は免疫チェックポイント分子の阻害剤）から選択される。

【0133】

例示的な他の抗体は、免疫チェックポイント分子の阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ－３、抗ＣＥＡＣＡＭ又は抗ＬＡＧ－３）、免疫細胞を刺激する抗体（例えば、アゴニストＧＩＴＲ抗体又はＣＤ１３７抗体）などを含むが、それらに限らない。好ましくは、他の抗体は、抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択される。さらに好ましくは、前記抗ＰＤ－１抗体は、ブリストル・マイヤーズスクイブ（ＢＭＳ）社のニボルマブ （Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、メルク（Ｍｅｒｃｋ）社のペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）であり、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）が開発したａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ドイツのメルク（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）及び米国のファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ） が共同開発したａｖｅｌｕｍａｂ、アストラゼネカが開発したｄｕｒｖａｌｕｍａｂである。

【0134】

いくつかの実施形態において、免疫調節剤は、共刺激分子の活性化剤又はアゴニストである。一実施形態において、共刺激分子のアゴニストは、以下の分子のアゴニスト（例えば、アゴニスト抗体又はその抗原結合断片、又は可溶性融合物）から選択される：ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１ （ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ （ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ （ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３又はＣＤ８３リガンド。

【0135】

本発明の併用療法は、併用投与（ここで、二つ又はそれ以上の治療剤が同一の製剤又は個別の製剤に含まれる）及び個別投与をカバーする。個別投与の場合に、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は免疫コンジュゲートなどの投与は、他の療法の投与の前、同時及び／又は後に実施され得る。

【0136】

一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２結合分子の投与と他の療法 （例えば、治療方式又は治療剤） の投与とは、互いに約一か月以内、又は約一、二もしくは三週間以内、又は約１、２、３、４、５又は６日以内に発生する。

【0137】

本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子（及びそれを含む薬物組成物又は免疫コンジュゲート）は、任意の適切な方法で投与されてもよく、非経口投与、肺内投与及び鼻内投与を含み、且つ、局所治療が必要であれば、病巣内投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。投薬が短期的であるか長期的であるかにある程度応じて、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によって投薬を行うことができる。本明細書は、様々な投薬ホライズンをカバーし、単回投与又は複数の時点での複数回投与、ボーラス注入投与及びパルス注入を含むが、それらに限らない。

【0138】

疾患を予防又は治療するために、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子の適切な用量（単独で又は一つ又は複数の他の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患のタイプ、ＣＬＤＮ１８．２結合分子のタイプ、疾患の重症度及び進行、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床病歴及び前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子に対する応答、並びに主治医の判断力に依存する。前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、一回の治療又は一連の治療によって患者に適切に投与される。ＣＬＤＮ１８．２結合分子の用量及び治療計画は、当業者によって確定され得る。

【0139】

理解できるように、任意の上記予防又は治療は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子の代わりに、本発明の免疫コンジュゲート又は組成物又は組み合わせ製品を用いて行われ得る。
Ｘ． 診断及び検出のための方法及び組成物

【0140】

いくつかの実施形態において、本明細書による任意のＣＬＤＮ１８．２結合分子は、生物学的試料におけるＣＬＤＮ１８．２の存在の検出に用いることができる。「検出」という用語は、本明細書で使用される場合、定量又は定性検出を含み、例示的検出方法は、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子と複合体化された磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定法に関してもよい。いくつかの実施形態において、生物試料は、血、血清又は生物由来の他の体液試料である。いくつかの実施形態において、生物試料は、細胞又は組織を含む。いくつかの実施形態において、生物試料は、過剰増殖性又は癌性病巣からのものである。

【0141】

一実施形態において、診断又は検出方法に用いられるＣＬＤＮ１８．２結合分子を提供した。別の態様では、ＣＬＤＮ１８．２の生物学的試料での存在を検出する方法を提供した。いくつかの実施形態において、方法は、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の生物学的試料での存在を検出することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２はヒトＣＬＤＮ１８．２である。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との結合が許容される条件下で、生物学的試料を本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子と接触させ、ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との間に複合体が形成されたか否かを検出することを含む。複合体の形成は、ＣＬＤＮ１８．２が存在することを表す。該方法は、インビトロ又はインビボ方法であってもよい。一実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子による治療に適した被験体を選択することに用いられ、例えば、ここで、ＣＬＤＮ１８．２は、前記被験体を選択するための生物マーカーである。

【0142】

一実施形態において、本発明のＣＬＤＮ１８．２結合分子を用いて、癌又は腫瘍を診断することができ、例えば、対象における本明細書に記載の疾患（例えば、過剰増殖性又は癌性疾患）の治療又は進行、その診断及び／又はステージを評価（例えば、モニタリング）する。いくつかの実施形態において、標識されたＣＬＤＮ１８．２結合分子が提供される。標識は、直接検出された標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識及び放射性標識）、及び例えば、酵素的反応又は分子相互作用によって、間接的に検出された部分、例えば、酵素又はリガンドを含むが、それらに限らない。例示的標識は、放射性同位体^３２Ｐ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体のような蛍光団、ローダミン及びその誘導体、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、蛍ルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、フルオレセイン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、溶解酵素、炭水化物オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸脱水素酵素、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような複素環オキシダーゼ、並びにＨＲのような過酸化水素酸化染料前駆体を利用する酵素、ラクトパーオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、ファージ標識、安定ラジカルなどを含むが、それらに限らない。

【0143】

本明細書による任意の発明のいくつかの実施形態において、試料は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子による治療前に得られた。いくつかの実施形態において、試料は、癌が既に転移した後に得られた。いくつかの実施形態において、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィン（ＦＦＰＥ）に包埋される。いくつかの実施形態において、試料は、生検（例えば、コア生検）、手術検体（例えば、手術切除からの検体）、又は微細針吸引物である。

【0144】

いくつかの実施形態において、ＣＬＤＮ１８．２は、治療前、例えば、治療開始前又は治療間隔後のある治療の前に検出される。

【0145】

いくつかの実施形態において、腫瘍を治療する方法を提供し、前記方法は、被験体（例えば、試料）（例えば、癌細胞を含む被験体試料）に対してＣＬＤＮ１８．２の存在を検査し、それによってＣＬＤＮ１８．２値を確定し、ＣＬＤＮ１８．２値を対照値（例えば、健康な個体の試料におけるＣＬＤＮ１８．２の値）と比較し、且つＣＬＤＮ１８．２値が対照値より大きい場合、一つ又は複数の他の療法と任意に組み合わせるＣＬＤＮ１８．２結合分子（例えば、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子）の治療有効量を被験体に投与し、それによって腫瘍を治療することを含む。

【0146】

理解できるように、本発明の各部分に記述されている各実施形態、例えば、疾患、治療剤、治療方式及び投与などは、本発明の他の部分の実施形態にも同様に適し、又は他の部分の実施形態と組み合わせることができる。本発明の各部分に記述されている、ＣＬＤＮ１８．２結合分子に適した性質、用途及び方法などの実施形態は、ＣＬＤＮ１８．２結合分子を含む組成物、コンジュゲート、組み合わせ製品及びキットなどにも同様に適する。

【0147】

実施例

【0148】

以下の実施例は、本発明を単に例示的に説明することを意図するため、いかなる方式で本発明を限定するものと見なされるべきではない。

【0149】

実施例１ 過剰発現細胞株の構築及び同定
１．１ ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＮＵＧＣ４細胞株の構築及び同定

【0150】

ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する胃癌細胞株ＮＵＧＣ４細胞株（以下では、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４と略称される）は、レンチウイルストランスフェクションの方式で構築され、抗体ＩＭＡＢ３６２（ドイツＧａｎｙｍｅｄ社、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する抗体である） によって同定された。

【0151】

具体的な方法は、以下の通りである。５×１０^４個の状態が良好なヒト胃癌細胞（ＮＵＧＣ４細胞、ＢＮＣＣ菌種バンクから入手され、番号がＢＮＣＣ３４１９６２である）を取り、３０：１の感染多重度（ＭＯＩ）で、ヒトＣＬＤＮ１８．２配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）を含有する、包装されたレンチウイルス（ＣＮ１０９４８５７３４Ｂ実施例３のレンチウイルス包装方法を参照）を加え、十分で均一混合し、そして５ μｇ／ｍＬポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ、和元生物）を含有するＩＭＤＭ完全培地（Ｇｉｂｉｃｏ、２１９２７３１）を加え、均一に混合し、３７℃で、ＣＯ_２濃度が５％である恒温インキュベータにおいて２０時間インキュベートし、そして、培地を除去し、新鮮なＩＭＤＭ完全培地に交換して２４時間インキュベートし続け、次に、平均０．５個の細胞／ウェルの細胞密度でレンチウイルストランスフェクション後のＮＵＧＣ４細胞を９６ウェルプレートに接種し、最終濃度が２ μｇ／ｍＬのピューロマイシンを加えて耐性加圧スクリーニングを行い、３７℃で、ＣＯ_２濃度が５％である恒温インキュベータにおいて２～３週間培養し、クローンを選択し、抗体ＩＭＡＢ３６２を用いて同定し、最終的には、ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＮＵＧＣ４細胞株の取得に成功し、本明細書では、「ｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞株」とも呼ばれる。
１．２ ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株の構築及び同定

【0152】

全長ヒトＣＬＤＮ１８．２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）のＤＮＡ配列をｐＬＶＸ－ｐｕｒｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃６３２１６４）に構築した。そして、得られたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３^ＴＭ）にエレクトロポレーションした。スクリーニングにより、実施例１．１を参照して細胞培養を行い、ピューロマイシンで耐性加圧スクリーニングを行い、抗体ＩＭＡＢ３６２を用いてクローンを同定し、最終的には、ヒトＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株の取得に成功し、本明細書では、「ｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞株」とも呼ばれる。
１．３ ＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）－ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株の構築及び同定

【0153】

まず、ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を構築する：ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ） ＤＮＡ配列を含むｐＧＬ４．３０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｅ８４８１） を、エレクトロポレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｏｎ^ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＰ９２２９４７）によりＪｕｒｋａｔ 細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１５２）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、最終濃度が５００ μｇ／ｍＬであるハイグロマイシンＢ（源培、Ｓ１６０Ｊ７） を用いて、耐性加圧スクリーニングを行い、２～３週間程度で細胞株クローンの成長状況を観察し、クローンが形成された細胞株を選択して同定した。同定方法は、以下の通りである。一部のクローンを取って９６ウェルのホワイト底板（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３６１０）に移し、ＰＭＡ（１０ ｎｇ／ｍＬ）及びイオノマイシン（１ ｎＭ）刺激を行い、３７℃で、５％ＣＯ_２のインキュベータにおいて６ｈ培養した後にＢｒｉｇｈｔ ｇｌｏ（Ｖａｚｙｍｅ、ＤＤ１２０４－０１）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘ）によりシグナル値を読み取った後に異なるクローンＮＦ－κＢの発現レベルを評価して、ＮＦ－ＡＴ遺伝子を高発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株と略称される）を得た。

【0154】

ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株を取り、２０：１の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ｐ０８６３７、第１５８位のアミノ酸がＦフェニルアラニンである） を含有する、包装されたレンチウイルスを加え、最終濃度が２ μｇ／ｍＬであるピューロマイシンを添加して耐性加圧スクリーニングを行い、３７℃で、ＣＯ_２濃度が５％である恒温インキュベータにおいて２～３週間培養し、クローンを選択して同定し（同定方法は本出願の実施例７を参照）、最終的には、ＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）－ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株の取得に成功した。

【0155】

実施例２ 抗ＣＬＤＮ１８．２ナノ抗体の親和性成熟改変

【0156】

ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１とヒトＣＬＤＮ１８．２との特異的に結合を向上させるために、本実施例は、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１に対して親和性成熟改変を行った。

【0157】

ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１のＡｂＭで定義された三つのＣＤＲのうちの各ＣＤＲに対して、単一部位又は連続した二つの部位の突然変異を行い、親和性が成熟したファージディスプレイライブラリーを構築し、ファージディスプレイ技術を利用して、親和性成熟後の分子をスクリーニングし、スクリーニング方法は、ＷＯ ２０２０２３８７３０Ａ１における実施例３を参照されたい。

【0158】

親和性成熟改変により、候補ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４を得た。ＡｂＭでＣＤＲを定義する方式により、候補ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４の相補性決定領域配列を確定し、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は表２に示す通りである。

【0159】

【表2】

【0160】

実施例３ 親和性が成熟したナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４のヒト化改変

【0161】

ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４の可変領域配列をヒト抗体生殖系列遺伝子（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）データベースとアライメントし、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４との相同性が高い１～３本の生殖系列遺伝子を見つけ、それとともに生殖系列遺伝子の創薬可能性を考慮し、適切な生殖系列遺伝子Ｇｅｒｍｌｉｎｅテンプレートを選択してアライメントを行った。

【0162】

ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４に対して相同性モデリングを行い、相同性モデリングについて、ＰＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）のナノ抗体構造モデルを参照した。ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４の構造モデル及び非ヒト由来部位の状況を合わせて、組み合わせ復帰突然変異設計を行い、復帰突然変異設計により、潜在的な翻訳後修飾部位の導入を回避し、最終的には、ヒト化程度が９６．６７％に達する候補ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４－ｈＶＨ６を設計した。

【0163】

候補ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４及びＮｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４－ｈＶＨ６のアミノ酸配列（重鎖単一ドメイン可変領域）は表３に示す通りである。

【0164】

【表3】

【0165】

実施例４ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体の構築

【0166】

ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４－ｈＶＨ６アミノ酸配列のＣ末端を、それぞれヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示すアミノ酸配列）のＮ末端に連結して、抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４及びＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６を構築した。

【0167】

具体的には、ＰＣＲ法による増幅でナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４、ナノ抗体Ｎｂ－ＮＡ３Ｓ－Ｈ１－Ｔ４－ｈＶＨ６の遺伝子配列、及びｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６に示すアミノ酸配列）遺伝子配列をそれぞれ得て、重複伸長ＰＣＲ法により、各ナノ抗体の遺伝子配列をｈＩｇＧ１ Ｆｃ領域遺伝子配列に連結し、次に相同組換え方法により、改変された真核発現ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、品番：Ｋ８３０００１） にそれぞれ構築し、各抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体が連結されている該遺伝子配列の発現ベクターを大腸菌ＳＳ３２０細胞に形質転換し、３７℃で一晩培養した。エンドトキシンプラスミドのない抽出キット（ＯＭＥＧＡ、Ｄ６９５０－０１）を利用してプラスミド抽出を行い、真核発現用の、エンドトキシンのない抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体プラスミドを得た。

【0168】

抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体に対応するアミノ酸配列は表４に示す通りである。

【0169】

【表4】

【0170】

実施例５ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体の発現、精製及び物理化学的特性分析
５．１ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体の発現及び精製

【0171】

抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体の発現は、ＥｘｐｉＣＨＯ一過性発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ａ２９１３３）を用いる。具体的な方法は、以下の通りである。トランスフェクション当日、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞密度を７×１０^６～１×１０^７個の活細胞／ｍＬ程度、細胞生存率を＞９８％にした。３７℃に予熱された新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ発現培地を用いて、細胞を最終濃度が６×１０^６個の細胞／ｍＬになるように調整した。４℃に予冷されたＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭ ＳＦＭで目的プラスミドを希釈し（１ ｍＬの前記培地に実施例４で調製した抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体プラスミドを１ μｇ加え）、それとともに、ＯｐｔｉＰＲＯ^ＴＭＳＦＭでＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭＣＨＯを希釈し、両者を等体積混合して軽くピペッティングして均一に混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ混合液を調製し、室温で１～５ ｍｉｎインキュベートし、用意したＥｘｐｉＣＨＯ細胞懸濁液に徐々に加えながら軽く振とうし、最後に細胞培養シェーカーに置いて、３７℃で、８％ ＣＯ_２の条件下で培養した。トランスフェクション後の１８～２２ ｈに、培養液にＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭＥｎｈａｎｃｅｒ及びＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭＦｅｅｄを添加し、振とうフラスコを３２℃のシェーカー及び５％ ＣＯ_２の条件下で培養し続けた。トランスフェクション後の５日目に、同体積のＥｘｐｉＣＨＯ^ＴＭＦｅｅｄを添加し、徐々に加えながら細胞懸濁液を軽くて均一に混合した。トランスフェクションの７～１５日後に、目的タンパク質が発現している細胞培養上清を１５０００ ｇで１０ ｍｉｎ高速遠心分離し、得られた上清に対してＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ（ＧＥ、１７５４７４０３） で親和性精製を行い、そして１００ ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で目的タンパク質を溶出させ、次に１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌで中和し、最後に限外濾過濃縮管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０９６）によって、得られたタンパク質をＰＢＳ緩衝液に置き換えた。
５．２ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定

【0172】

非還元溶液の調製：各重鎖抗体及び参考品イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ＩＰＩとも略称され、実施例５．１と類似する方法で調製された） １ μｇに５×ＳＤＳサンプリング緩衝液及び４０ ｍＭヨードアセトアミドを加え、７５ ℃乾燥浴で１０ ｍｉｎ加熱し、室温まで冷却した後、１２０００ ｒｐｍで５ ｍｉｎ遠心分離し、上清を取った。

【0173】

還元溶液の調製：各重鎖抗体及び参考品ＩＰＩ ２ μｇに５×ＳＤＳサンプリング緩衝液及び５ ｍＭ ＤＴＴを加え、１００ ℃乾燥浴で１０ ｍｉｎ加熱し、室温まで冷却した後、１２０００ ｒｐｍで５ ｍｉｎ遠心分離し、上清を取った。

【0174】

各上清をＢｉｓ－ｔｒｉｓ ４－１５％勾配ゲル（金斯瑞から購入）に加え、１１０ Ｖの定電圧で電気泳動し、クマシーブリリアントブルーがゲルの底部に移行した場合、運行を停止し、ゲルシートを取り出してクマシーブリリアントブルー染色液に１～２ ｈ静置し、染色液を捨て、脱色液を加え、必要に応じて脱色液を２～３回変更し、ゲルの背景が透明になるまで脱色した後に脱イオン水中に保存した。脱色後に、ＥＰＳＯＮ Ｖ５５０カラースキャナーでスキャンし、ＩｍａｇｅＪによりピーク面積正規化法で還元及び非還元バンド純度を計算した。

【0175】

結果は図１に示す通りである。各重鎖抗体及び参考品ＩＰＩ非還元ゲルのバンドは、いずれも予想される大きさに一致し、純度がいずれも９０％以上であった。
５．３ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のＳＥＣ－ＨＰＬＣモノマーの純度同定

【0176】

材料の準備：１、移動相：１５０ ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ ７．４、２、試料の調製：各抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体をいずれも移動相溶液で０．５ ｍｇ／ｍＬまで希釈した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００クロマトグラフィーカラム（ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ ＳＥＣ ３．５ μｍ， ７．８ ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３０ ｃｍ、Ｗａｔｅｒｓ）の流速を０．８ ｍＬ／ｍｉｎに設定し、試料注入体積が２０ μＬであり、ＶＷＤ検出器の波長が２８０ ｎｍ及び２１４ ｎｍであった。

【0177】

本実施例の抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）結果は以下の通りである。面積正規化法で試料における高分子ポリマー、抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体モノマー及び低分子物質の割合を計算し、結果が図２Ａ～２Ｃ及び表５に示す通りである。

【0178】

図２Ａ～２Ｃ及び表５から分かったように、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６の発現量は、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１の３倍以上、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４のほぼ２倍であり、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果に示すように、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６モノマーの割合が最も高く、これはまた、生成物における可溶性凝集物及びせん断物の含有量が最も低いことを意味している。

【0179】

【表5】

【0180】

実施例６ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体の親和活性分析
６．１ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞への結合能力

【0181】

指数増殖期のｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞を収集し、３００ ｇで遠心分離して上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で細胞を再懸濁させ、計数し細胞懸濁液の密度を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。その後、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１００ μＬで９６ウェル丸底プレートに加え、３００ ｇで遠心分離して上清を除去した。対応するウェルに異なる濃度の重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１及びアイソタイプ対照としてのヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を加え、細胞を再懸濁させた後に４℃に置いて１ ｈインキュベートした。インキュベート後の細胞混合液を３回洗浄した後に、ＰＥ標識抗ヒト－ＩｇＧ－Ｆｃフローサイトメトリー用抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：９８５９６）を加え、再懸濁させた後に４℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベート後の細胞混合液を３回洗浄した後に２００ μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁させ、最後にフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＡＯＯ－１－１１０２）によってオンマシンで検出し分析した。ＰＲＩＳＭ^ＴＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によってデータを分析し、且つＥＣ_５０値を計算した。

【0182】

ＦＡＣＳ結合アッセイの結果は図３に示す通りであり、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４及びＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、いずれも対照としてのＮＡ３ＳＨ１よりも有意に優れたＣＬＤＮ１８．２への結合能力を示し、ここで、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４のＥＣ_５０＝０．２７３６ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６のＥＣ_５０＝０．３０９９ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１のＥＣ_５０＝０．５３５６ μｇ／ｍＬであった。
６．２ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞への結合能力

【0183】

指数増殖期のｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞を収集し、３００ ｇで遠心分離して上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で細胞を再懸濁させ、計数し細胞懸濁液の密度を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。その後、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞を１ウェルあたり１００ μＬで９６ウェル丸底プレートに加え、３００ ｇで遠心分離して上清を除去した。対応するウェルに異なる濃度の重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１及びアイソタイプ対照としてのヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を加え、細胞を再懸濁させた後に４℃に置いて１ ｈインキュベートした。インキュベート後の細胞混合液を３回洗浄した後に、ＰＥ標識抗ヒト－ＩｇＧ－Ｆｃフローサイトメトリー用抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：９８５９６）を加え、再懸濁させた後に４℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。インキュベート後の細胞混合液を３回洗浄した後に２００ μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁させ、最後にフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＡＯＯ－１－１１０２）によってオンマシンで検出し分析した。ＰＲＩＳＭ^ＴＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によってデータを分析し、且つＥＣ_５０値を計算した。

【0184】

ＦＡＣＳ結合アッセイの結果は図４に示す通りであり、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、いずれも対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１よりも有意に優れたＣＬＤＮ１８．２への結合能力を示し、ここで、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４のＥＣ_５０＝０．４０４７ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６のＥＣ_５０＝０．８４６５ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１のＥＣ_５０＝２．１４７ μｇ／ｍＬであった。
６．３ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞への結合能力

【0185】

ｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞は自製であり、調製方法は、ＣＮ１１２４８０２４８Ａの実施例１におけるヒトＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ腫瘍細胞株の構築を参照した。

【0186】

実施例６．１に記載の類似する方法を用い、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞を用い、抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞への結合能力を測定した。ＰＲＩＳＭ^ＴＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によってデータを分析し、且つＥＣ_５０値を計算した。

【0187】

ＦＡＣＳ結合アッセイの結果は図５に示す通りであり、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、いずれも対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１よりも有意に優れたＣＬＤＮ１８．２への結合能力を示し、ここで、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４のＥＣ_５０＝０．３２９８ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６のＥＣ_５０＝０．３９８４ μｇ／ｍＬであり、ＮＡ３ＳＨ１のＥＣ_５０＝０．６１８３ μｇ／ｍＬであった。
６．４ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．１－ＨＥＫ２９３細胞への結合能力

【0188】

１００ μｇ／ｍＬの重鎖抗体及び目的細胞ｈＣＬＤＮ１８．１－ＨＥＫ２９３（自製、調製方法はＣＮ１１２４８０２４８Ａの実施例１の１．３．２を参照）を４℃で１ ｈインキュベートし、次に上記ＦＡＣＳ緩衝液で三回リンスし、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号：ａｂ９８５９６）を ０．５ μｇ（０．５ ｍｇ／ｍＬ）加え、４℃で３０ ｍｉｎインキュベートした。その後、ＦＡＣＳ緩衝液で３回リンスし、細胞に２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて細胞を再懸濁させ、最後にフローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＡＯＯ－１－１１０２）によって検出し、結合強度及び細胞結合陽性率を記録する。

【0189】

図６に示すように、１００ μｇ／ｍＬの高濃度下で、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１とｈＣＬＤＮ１８．１－ＨＥＫ２９３細胞との結合陽性率は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体とｈＣＬＤＮ１８．１－ＨＥＫ２９３細胞との結合陽性率に非常に近く、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４及びＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６がいずれもｈＣＬＤＮ１８．１タンパク質に結合しないことが示された。

【0190】

実施例７ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のＡＤＣＣ効果

【0191】

抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のＦｃ末端をＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）又はＣＤ１６ａ（Ｖ１５８）に結合、ＶＨＨ末端が細胞におけるＣＬＤＮ１８．２に結合した後、Ｊｕｒｋａｔ細胞内部ＮＦ－ＡＴタンパク質の発現を活性化し、ＮＦ－ＡＴとＮＦ－ＡＴ応答エレメントの結合により、その下流のルシフェラーゼ発現が誘発され、異なる濃度勾配の本発明の抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体で刺激し、タンパク質濃度依存性を有する蛍光リードグラフを得て、それにより抗体のＡＤＣＣ活性を評価することができる。
７．１ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＤＣＣ効果

【0192】

９６ウェルの細胞培養プレートの各ウェルに、５０ μＬの、密度が４×１０^５個の細胞／ｍＬである標的細胞としてのｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞及び４×１０^６個の細胞／ｍＬであるエフェクター細胞としてのＣＤ１６ａ（Ｆ１５８）－ＮＦ－ＡＴ－Ｊｕｒｋａｔ細胞を加え、標的細胞とエフェクター細胞を１：１で混合した後に９６ウェルの白色クリアボトム細胞培養プレートに加え、３７℃のインキュベータに置いて一晩（１６～２０時間）培養した。それぞれ５０ μＬの階段希釈された重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１及びアイソタイプ対照としてのヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を加え、３７℃のインキュベータで６ｈインキュベートした。各ウェルに５０ μＬのＢｒｉｇｈｔ－Ｌｉｆｅ（ｖａｚｙｍｅ、品番：ＤＤ１２０４－０３）を加え、暗所で１０ｍｉｎインキュベートし、蛍光シグナルを検出した。ＡＤＣＣ検出結果は、図７に示すとおりである。

【0193】

図７から分かったように、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果よりも有意に強い効果を示し、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ＨＥＫ２９３細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果と同等の効果を示した。
７．２ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対するＡＤＣＣ効果

【0194】

ｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞でのＡＤＣＣ効果の検出方法は、実施例７．１を参照されたい。ＡＤＣＣ検出結果は、図８に示すとおりである。

【0195】

図８から分かったように、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１及び重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４と比較して、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、ｈＣＬＤＮ１８．２－ＫＡＴＯＩＩＩ細胞に対する最も優れたＡＤＣＣ殺傷効果を引き起こした。
７．３ 抗ＣＬＤＮ１８．２重鎖抗体のｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ効果

【0196】

ｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞でのＡＤＣＣ効果の検出方法は、実施例７．１を参照されたい。ＡＤＣＣ検出結果は、図９に示すとおりである。

【0197】

図９から分かったように、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果よりも有意に強い効果を示し、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ ＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果と同等の効果を示した。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2023-12-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0197】

図９から分かったように、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４－ｈＶＨ６は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果よりも有意に強い効果を示し、重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１－Ｔ４は、対照としての重鎖抗体ＮＡ３ＳＨ１によるｈＣＬＤＮ１８．２－ ＮＵＧＣ４細胞に対するＡＤＣＣ殺傷効果と同等の効果を示した。
本発明は、下記の態様を含む：
〈態様１〉
ＣＬＤＮ１８．２結合分子であって、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、三つの相補性決定領域を含み、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、ここで、
（ａ） ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
（ｂ） ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、及び
（ｃ） ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
ここで、前記アミノ酸変化は、アミノ酸の付加、欠失又は保存的アミノ酸置換であり、好ましくは、前記ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物ＶＨＨ、部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨである、ＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様２〉
前記ｓｄＡｂ部分は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３を含有するＣＤＲ３とを含む、態様１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様３〉
前記ｓｄＡｂ部分は、
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列、又は、
（ｉｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様４〉
前記ｓｄＡｂ部分は、Ｎ末端又はＣ末端で別のタンパク質ドメインに連結され、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域に連結され、例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのＦｃ領域に連結され、又は、例えば、蛍光タンパク質に連結される、態様１～３のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様５〉
（１） ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に高親和性で結合し、例えば、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子と細胞表面ＣＬＤＮ１８．２との間の結合のＥＣ _５０ が約０．１ μｇ／ｍＬ～約１０ μｇ／ｍＬであり、好ましくは、約０．１ μｇ／ｍＬ～約１ μｇ／ｍＬであることと、
（２） ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に結合しないことと、
（３） 抗体依存性細胞傷害及び／又は補体依存性細胞傷害作用によってＣＬＤＮ１８．２－陽性癌細胞を死滅させることとのうちの一つ又は複数の特性を有する、態様１～４のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様６〉
二重特異性又は多重特異性抗体であり、好ましくは、前記二重特異性抗体分子は、ＣＬＤＮ１８．２分子及び第２の標的タンパク質に特異的に結合し、前記第２の標的タンパク質は、例えば、
（１） 腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、癌胎児性抗原、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｍｕｃｉｎ－１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３７、ｃＭｅｔ、又はアンジオポエチン－２（Ａｎｇ－２）、
（２） 免疫細胞の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、又はＬＡＧ－３、
（３） 免疫細胞の免疫共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ２又はＣＤ２７、
（４） サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３３から選択される、態様１～５のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。
〈態様７〉
態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする、単離された核酸。
〈態様８〉
態様７の核酸を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターである、ベクター。
〈態様９〉
態様７の核酸又は態様８のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、さらに好ましくは、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞から選択され、最も好ましくは、前記宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。
〈態様１〉
態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法であって、前記方法は、態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸の発現に適した条件で態様９の宿主細胞を培養し、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を任意に単離させることを含み、任意選択的に、前記方法は、前記宿主細胞から前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を回収することをさらに含む、方法。
〈態様１１〉
態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子及び他の物質、例えば、細胞傷害性薬剤を含む、免疫コンジュゲート。
〈態様１２〉
態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は態様１１の免疫コンジュゲート、及び任意選択的な薬用アジュバントを含む、薬物組成物。
〈態様１３〉
薬物組成物であって、態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は態様１１の免疫コンジュゲート、及び他の治療剤、並びに任意選択的な薬用アジュバントを含み、好ましくは、前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞傷害性薬剤から選択される、薬物組成物。
〈態様１４〉
態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は態様１１の免疫コンジュゲート、及び一つ又は複数の他の治療剤、例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、組み合わせ製品。
〈態様１５〉
ＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患を被験体において治療する方法であって、治療有効量の態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子、態様１１の免疫コンジュゲート、態様１２又は１３の薬物組成物、又は態様１４の組み合わせ製品を被験体に投与することを含み、ここで、ＣＬＤＮ１８．２に関連する前記疾患は、例えば、ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌、例えば、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫及び下垂体腺腫であり、好ましくは、前記癌は、胃癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌又は肺癌である、方法。
〈態様１６〉
試料におけるＣＬＤＮ１８．２を検出するキットであって、前記キットは、態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を含み、
（ａ） 試料を態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子と接触させるステップ、及び
（ｂ） 前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との間の複合体の形成を検出するステップを実施するためのものであり、任意選択的に、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、検出可能に標識される、キット。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＬＤＮ１８．２結合分子であって、ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合する少なくとも一つの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含み、前記ｓｄＡｂ部分は、三つの相補性決定領域を含み、それぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、ここで、
（ａ） ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
（ｂ） ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、及び
（ｃ） ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列における１つ又は２つのアミノ酸変化の変異体を含み、
ここで、前記アミノ酸変化は、アミノ酸の付加、欠失又は保存的アミノ酸置換であり、好ましくは、前記ｓｄＡｂ部分は、ラクダ科動物ＶＨＨ、部分的にヒト化又は完全にヒト化されたＶＨＨ、キメラＶＨＨである、ＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項2】

前記ｓｄＡｂ部分は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １を含有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２を含有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３を含有するＣＤＲ３とを含む、請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項3】

前記ｓｄＡｂ部分は、
（ｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列、又は、
（ｉｉ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は５のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項4】

前記ｓｄＡｂ部分は、Ｎ末端又はＣ末端で別のタンパク質ドメインに連結され、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域に連結され、例えば、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのＦｃ領域に連結され、又は、例えば、蛍光タンパク質に連結される、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項5】

（１） ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に高親和性で結合し、例えば、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子と細胞表面ＣＬＤＮ１８．２との間の結合のＥＣ_５０が約０．１ μｇ／ｍＬ～約１０ μｇ／ｍＬであり、好ましくは、約０．１ μｇ／ｍＬ～約１ μｇ／ｍＬであることと、
（２） ＣＬＤＮ１８．２に特異的に結合し、ＣＬＤＮ１８．１に結合しないことと、
（３） 抗体依存性細胞傷害及び／又は補体依存性細胞傷害作用によってＣＬＤＮ１８．２－陽性癌細胞を死滅させることとのうちの一つ又は複数の特性を有する、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項6】

二重特異性又は多重特異性抗体であり、好ましくは、前記二重特異性抗体分子は、ＣＬＤＮ１８．２分子及び第２の標的タンパク質に特異的に結合し、前記第２の標的タンパク質は、例えば、
（１） 腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ２０、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）、癌胎児性抗原、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｍｕｃｉｎ－１、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３７、ｃＭｅｔ、又はアンジオポエチン－２（Ａｎｇ－２）、
（２） 免疫細胞の免疫チェックポイント分子、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、又はＬＡＧ－３、
（３） 免疫細胞の免疫共刺激分子、例えば、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ２又はＣＤ２７、
（４） サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５又はＩＬ－３３から選択される、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子。

【請求項7】

請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする、単離された核酸。

【請求項8】

請求項７の核酸を含むベクターであって、好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクターである、ベクター。

【請求項9】

請求項７の核酸又は請求項８のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり、さらに好ましくは、大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞から選択され、最も好ましくは、前記宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。

【請求項10】

請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を調製する方法であって、前記方法は、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子をコードする核酸の発現に適した条件で請求項９の宿主細胞を培養し、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を任意に単離させることを含み、任意選択的に、前記方法は、前記宿主細胞から前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子を回収することをさらに含む、方法。

【請求項11】

請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子及び他の物質、例えば、細胞傷害性薬剤を含む、免疫コンジュゲート。

【請求項12】

請求項１に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び任意選択的な薬用アジュバントを含む、薬物組成物。

【請求項13】

薬物組成物であって、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び他の治療剤、並びに任意選択的な薬用アジュバントを含み、好ましくは、前記他の治療剤は、化学療法剤、他の抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、細胞傷害性薬剤から選択される、薬物組成物。

【請求項14】

請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子又は請求項１１の免疫コンジュゲート、及び一つ又は複数の他の治療剤、例えば、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、他の抗体、例えば、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む、組み合わせ製品。

【請求項15】

請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子、請求項１１の免疫コンジュゲートの、被験体におけるＣＬＤＮ１８．２に関連する疾患、例えば、ＣＬＤＮ １８．２を発現又は過剰発現する癌、例えば、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、食道癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器及び生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫及び下垂体腺腫であり、好ましくは、前記癌は、胃癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌又は肺癌であるの、を治療するための医薬品を調製するための使用。

【請求項16】

試料におけるＣＬＤＮ１８．２を検出するキットであって、前記キットは、請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子を含み、
（ａ） 試料を請求項１又は２に記載のＣＬＤＮ１８．２結合分子と接触させるステップ、及び
（ｂ） 前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子とＣＬＤＮ１８．２との間の複合体の形成を検出するステップを実施するためのものであり、任意選択的に、前記ＣＬＤＮ１８．２結合分子は、検出可能に標識される、キット。

【国際調査報告】