特表 2024-524514 ポリヌクレオチドを標的とする新規ＲＮＡプログラム可能システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ポリヌクレオチドを標的とする新規ＲＮＡプログラム可能システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240628BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 11/00 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240628BHJP

   C12N 15/89 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20240628BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N9/22 ZNA

C12N15/55

C12N15/31

C12N11/00

C07K19/00

C07K14/195

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/864 100Z

C12N5/078

C12N15/89 Z

C12N15/88 Z

C12N15/11 Z

C07K14/47

C12P21/02 C

C12N15/63 Z

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500032

(86)(22)【出願日】2021-07-02

(85)【翻訳文提出日】2024-02-13

(86)【国際出願番号】 IB2021055958

(87)【国際公開番号】W WO2023275601

(87)【国際公開日】2023-01-05

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516314125

【氏名又は名称】ヴィリニュス・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｖｉｌｎｉｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】シクスニス、ヴィルギニジュス

(72)【発明者】

【氏名】カルヴェリス、タウトヴィダス

【テーマコード（参考）】

4B033

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B033NA26

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA27

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA11

4H045DA89

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＲＮＡ及びＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を含むエフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法、及び、関連する方法及び産物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法であって、前記ポリヌクレオチドは標的配列を含み、前記エフェクター複合体は：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）
（ｉ）前記標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡが前記ＴｎｐＢタンパク質と結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を含む前記ＲＮＡ
を備え、ここで、前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させ、前記ＴｎｐＢタンパク質が前記ポリヌクレオチドを切断することを可能にする段階を備える
方法。

【請求項2】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの前記可動遺伝因子のＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ｔｎｐＢ遺伝子から取得された前記タンパク質の前記アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又はそれから成る、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＲＮＡの前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端の不完全な回文配列からの配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子の右端の配列からの配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、請求項１４又は請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含む配列を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含み、前記ＴｎｐＢタンパク質は配列番号：１を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記ポリヌクレオチドは、二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す前記標的配列の５'に位置する、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ポリヌクレオチドの前記二本鎖ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴであり、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡの前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ポリヌクレオチドは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれた二本鎖ＤＮＡである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡの切断は段違い二本鎖切断部を産生する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記段違い二本鎖切断部は５'オーバーハングを有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは染色体ＤＮＡである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドは、染色体外ＤＮＡである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記方法はインビボの方法である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記方法はエクスビボの方法である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記方法はインビトロの方法である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞は原核細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記細胞は真核細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記細胞は非ヒト動物細胞である、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞はヒト細胞である、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記細胞は幹細胞である、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞は人工多能性幹細胞である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記細胞は植物細胞である、請求項３７に記載の方法。

【請求項44】

前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ及び／又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含む、請求項１から４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記接触は、細胞内に：（１）前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードする配列を含む第２ポリヌクレオチド配列；及び、（２）前記ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードする配列を含む第３ポリヌクレオチド配列を導入することを含む、請求項１から４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

（１）及び（２）は、少なくとも１つのベクターにおいて前記細胞内に導入される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記少なくとも１つのベクターは、（１）を含む第１ベクター及び（２）を含む第２ベクターを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクター、任意選択的に、プラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの非ウイルス粒子である、請求項４６又は請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記少なくとも１つのベクターは、少なくとも１つのウイルスベクター、任意選択的に、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項４６又は請求項４７に記載の方法。

【請求項50】

前記少なくとも１つのウイルスベクターはＡＡＶベクターである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記接触は、前記第２ポリヌクレオチド配列及び前記第３ポリヌクレオチド配列を前記細胞内に導入することを含み、ここで、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡは、前記細胞において発現される、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記第２ポリヌクレオチド配列は、前記タンパク質をコードする前記配列に動作可能に連結されて前記タンパク質の発現を制御する第１調節因子を含み、及び／又は、前記第３ポリヌクレオチド配列は、前記ＲＮＡをコードする前記配列に動作可能に連結されて前記ＲＮＡの発現を制御する第２調節因子を含む、請求項４５から５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質及び前記ＲＮＡが、エフェクター複合体の形態で前記細胞内に導入される、請求項４５から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記細胞内への前記導入は、マイクロインジェクション又は電気穿孔によるものであり、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わされる、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記細胞内への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記接触は、前記切断されたポリヌクレオチドの非相同末端結合又は相同組換え修復を可能にする条件下で発生する、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記方法は更に、相同組換え修復のために前記ポリヌクレオチドをドナーポリヌクレオチドと接触させる段階を備える、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法ではない、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法ではない、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用ではない、請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へガイドするためのＲＮＡであって、
（ｉ）前記ポリヌクレオチドの前記標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合して前記エフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント
を備えるＲＮＡ。

【請求項62】

前記ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さである、請求項６１に記載のＲＮＡ。

【請求項63】

前記ＲＮＡは、１００～２００ヌクレオチドの長さである、請求項６２に記載のＲＮＡ。

【請求項64】

前記ＲＮＡは、１４０～１５０ヌクレオチドの長さである、請求項６３に記載のＲＮＡ。

【請求項65】

前記ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さである、請求項６１から６４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項66】

前記ガイド配列は、１５～２５ヌクレオチドの長さである、請求項６５に記載のＲＮＡ。

【請求項67】

前記タンパク質結合セグメントは逆位反復配列を含む、請求項６１から６６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項68】

前記タンパク質結合セグメントは、少なくとも部分的な回文配列を含み、少なくとも部分的な前記回文配列は、ヘアピン又は不完全なヘアピンを形成可能である、請求項６１から６７のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項69】

前記タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの右端不完全回文配列からの配列、又は、ＩＳ６０７ファミリーからの可動遺伝因子の右端からの配列を含む、請求項６１から６８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項70】

前記タンパク質結合セグメントは、前記ＴｎｐＢタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入配列の前記右端からの配列を含む、請求項６９に記載のＲＮＡ。

【請求項71】

前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、請求項６１から７０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項72】

前記タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項６１から７１のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項73】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項７２に記載のＲＮＡ。

【請求項74】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有する、請求項７３に記載のＲＮＡ。

【請求項75】

タンパク質結合セグメントが結合可能な前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、又は、それから成る、請求項６１から７４のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項76】

前記タンパク質結合セグメントは、配列番号：２を含み、前記タンパク質結合セグメントが結合可能なＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１を含む、請求項６１から７５のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項77】

前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＤＮＡである、請求項６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項78】

前記ガイド配列がハイブリダイズ可能な前記標的配列を含む前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、請求項６１から７６のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項79】

単離ＲＮＡである、請求項６１から７８のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項80】

前記ＲＮＡは、設計された、天然に発生しないＲＮＡである、請求項６１から７９のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項81】

ポリヌクレオチドにおける標的領域に結合するためのエフェクター複合体であって、前記エフェクター複合体は、タンパク質及びＲＮＡを含み、ここで、前記タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質を含み、又は、それから成り、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的領域に含まれる標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、エフェクター複合体。

【請求項82】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、請求項８１に記載のエフェクター複合体。

【請求項83】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、請求項８２に記載のエフェクター複合体。

【請求項84】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、請求項８３に記載のエフェクター複合体。

【請求項85】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、請求項８１から８４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項86】

前記ＲＮＡは請求項６１から８０のいずれか一項において定義される、請求項８１から８５のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項87】

前記タンパク質結合セグメントは配列番号：２を含む、請求項８１から８６のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項88】

前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナルを含み、及び／又は、前記タンパク質は、前記タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の細胞膜透過ペプチドを含む、請求項８１から８７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項89】

前記エフェクター複合体は、前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を改変するためのものである、請求項８１から８８のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項90】

前記エフェクター複合体は、前記ＴｎｐＢタンパク質を用いて前記ポリヌクレオチドの前記標的領域を切断するためのものである、請求項８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項91】

前記エフェクター複合体は、不活性化されたヌクレアーゼドメインを有するＴｎｐＢタンパク質を含む、請求項８１から８９のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項92】

前記標的領域の改変のための１又は複数のエフェクター分子を含む、請求項８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項93】

１又は複数の前記エフェクター分子は、ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、及び逆転写酵素でないエンドヌクレアーゼから選択される、請求項９２に記載のエフェクター複合体。

【請求項94】

前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、請求項９３に記載のエフェクター複合体。

【請求項95】

前記エフェクター複合体は、シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、請求項９４に記載のエフェクター複合体。

【請求項96】

前記標的領域の標識のために、１又は複数のエフェクター分子を含む、請求項８１から９２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項97】

前記標識は蛍光タンパク質である、請求項９６に記載のエフェクター複合体。

【請求項98】

前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるための１又は複数のエフェクター分子を含む、請求項８１から９１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項99】

１又は複数の前記エフェクター分子は１又は複数の転写活性化因子である、請求項９８に記載のエフェクター複合体。

【請求項100】

１又は複数の前記エフェクター分子は、１又は複数の転写抑制因子である、請求項９８のエフェクター複合体。

【請求項101】

前記タンパク質は、前記ＴｎｐＢタンパク質及び前記１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質である、請求項９２から１００のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項102】

固体支持体に結合される、請求項８１から１０１のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項103】

前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、請求項８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項104】

前記二本鎖ＤＮＡは、スーパーコイル状の、リラックスした、又はほどかれたものである、請求項１０３に記載のエフェクター複合体。

【請求項105】

前記ポリヌクレオチドは、前記二本鎖ＤＮＡの非標的鎖を指す、前記標的配列の５'に位置するＴｎｐＢ会合配列モチーフを含む、請求項１０３又は請求項１０４に記載のエフェクター複合体。

【請求項106】

前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフは、２～６ヌクレオチドの長さである、請求項１０５に記載のエフェクター複合体。

【請求項107】

前記ポリヌクレオチドの前記ＴｎｐＢ会合配列モチーフはＴＴＧＡＴである、請求項１０５又は請求項１０６に記載のエフェクター複合体。

【請求項108】

前記ＴｎｐＢタンパク質は前記二本鎖ＤＮＡを切断して段違い二本鎖切断部を産生することが可能である、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項109】

前記段違い二本鎖切断部は、５'オーバーハングを有する、請求項１０８に記載のエフェクター複合体。

【請求項110】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記二本鎖ＤＮＡを切断して平滑端二本鎖切断部を産生することが可能である、請求項１０３から１０７のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項111】

前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、請求項８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項112】

前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、請求項８１から１０２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項113】

単離されたエフェクター複合体である、請求項８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項114】

前記エフェクター複合体は、設計された、天然に発生しないエフェクター複合体である、請求項８１から１１２のいずれか一項に記載のエフェクター複合体。

【請求項115】

請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを有するエフェクター複合体を形成するための融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、及び、（ｉ）前記融合タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナル及び／又は細胞膜透過ペプチド、及び／又は、（ｉｉ）１又は複数のエフェクター分子を含む、融合タンパク質。

【請求項116】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリー又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するバリアントである、請求項１１５に記載の融合タンパク質。

【請求項117】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、前記ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、請求項１１６に記載の融合タンパク質。

【請求項118】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、デイノコッカス・ラディオデュランスからの可動遺伝因子ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されたタンパク質のアミノ酸配列を有し、又は、それと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するそのバリアントである、請求項１１７に記載の融合タンパク質。

【請求項119】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を含み、又は、それから成り、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、それから成る、請求項１１５から１１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項120】

前記１又は複数のエフェクター分子は、ポリヌクレオチド内の標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるためのものである、請求項１１５から１１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項121】

前記１又は複数のエフェクター分子は、前記ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、請求項１１５から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項122】

前記ベースエディターは、デアミナーゼであり、任意選択的に、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼである、請求項１２１に記載の融合タンパク質。

【請求項123】

シチジンデアミナーゼ及びウラシルグリコシラーゼインヒビターを含む、請求項１２２に記載の融合タンパク質。

【請求項124】

前記標識は、蛍光タンパク質又はレポーター酵素である、請求項１２１に記載の融合タンパク質。

【請求項125】

変異を含む変異ＴｎｐＢタンパク質であって、前記変異は、前記タンパク質のヌクレアーゼドメインを不活性するためのものであり、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡに結合するよう構成され、任意選択的に、前記変異ＴｎｐＢタンパク質は、請求項１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質の前記ＴｎｐＢタンパク質である、変異ＴｎｐＢタンパク質。

【請求項126】

請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【請求項127】

請求項８２から８５のいずれか一項において定義され前記ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードし、又は、請求項１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質を更にコードする、請求項１２６に記載のＤＮＡ。

【請求項128】

請求項１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を更にコードする、請求項１２６に記載のＤＮＡ。

【請求項129】

請求項１１５から１２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項130】

請求項１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項131】

前記ＤＮＡは、設計された、天然に発生しないＤＮＡである、請求項１２６から１３０のいずれか一項に記載のＤＮＡ。

【請求項132】

任意選択的に、プラスミド、又は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターである、請求項１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡを含む組み換え発現ベクター。

【請求項133】

請求項１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、又は、請求項１３２のいずれか一項に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項134】

請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、請求項１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質、請求項１２６から１３１のいずれか一項に記載のＤＮＡ、請求項１３２に記載の組み換え発現ベクター、又は、請求項１３３に記載の宿主細胞、及び緩衝液を備える組成物。

【請求項135】

前記緩衝液は、医薬的に許容可能な緩衝液である、請求項１３４に記載の組成物。

【請求項136】

請求項１２６から１２８のいずれか一項に記載のＤＮＡを発現する段階、又は、前記ＲＮＡを化学的に合成する段階を備える、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡを産生するインビトロ又はエクスビボの方法。

【請求項137】

請求項１２９又は１３０に記載のＤＮＡを発現する段階を備える、請求項１１５から１２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は、請求項１２５に記載の変異ＴｎｐＢタンパク質を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。

【請求項138】

前記ＲＮＡを前記タンパク質と接触させて前記エフェクター複合体を形成する段階を備え、任意選択的に、前記ＴｎｐＢタンパク質を含む前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現する段階、及び、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡを発現する段階を備える、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を産生するインビトロ又はエクスビボの方法。

【請求項139】

前記方法は、細胞においてインビトロで実行される、請求項１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項140】

前記方法は、無細胞系においてインビトロで実行される、請求項１３６から１３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記方法は、産生された前記ＲＮＡ、産生された前記融合タンパク質、産生された前記変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、産生された前記エフェクター複合体を精製する段階を備える、請求項１３６から１４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変するためのシステムであって、前記標的領域は標的配列を含み、前記システムは：
ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む、又は、それから成るタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び
ｂ）ＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ
を備え、前記ＲＮＡは：
（ｉ）前記標的配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）前記ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む、システム。

【請求項143】

（ａ）前記タンパク質及び（ｂ）前記ＲＮＡを備える、請求項１４２に記載のシステム。

【請求項144】

（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＤＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、請求項１４２に記載のシステム。

【請求項145】

（ａ）前記タンパク質をコードする前記ＲＮＡ、及び、（ｂ）前記ＲＮＡを備える、請求項１４２に記載のシステム。

【請求項146】

（ａ）前記タンパク質、（ｂ）前記ＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを備える、請求項１４２に記載のシステム。

【請求項147】

前記ＲＮＡは、請求項６１から８０のいずれか一項において定義される、請求項１４２から１４６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項148】

前記タンパク質は、請求項８２から８５のいずれか一項において定義される、請求項１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項149】

前記タンパク質は、請求項１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質である、請求項１４２から１４７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項150】

前記ＴｎｐＢタンパク質は、不活性化ヌクレアーゼドメインを含む、請求項１４２から１４９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項151】

前記ポリヌクレオチドは、請求項１９から２３又は２９から３１のいずれか一項において定義される、請求項１４２から１５０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項152】

（ａ）及び／又は（ｂ）は少なくとも１つのベクターに含まれる、請求項１４２から１５１のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項153】

少なくとも１つの前記ベクターは、少なくとも１つの非ウイルスベクターである、請求項１５２に記載のシステム。

【請求項154】

少なくとも１つの前記非ウイルスベクターは、少なくとも１つのプラスミド、又は、リポソーム又はエクソソームなどの少なくとも１つの非ウイルス粒子である、請求項１５３に記載のシステム。

【請求項155】

少なくとも１つの前記ベクターは少なくとも１つのウイルスベクターである、請求項１５２に記載のシステム。

【請求項156】

少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は、単純ヘルペスウイルスベクターから選択される、請求項１５５に記載のシステム。

【請求項157】

少なくとも１つの前記ウイルスベクターは、少なくとも１つのＡＡＶベクターである、請求項１５６に記載のシステム。

【請求項158】

前記システムは、設計された、天然に発生しないシステムである、請求項１４２から１５７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項159】

薬剤として使用するための、又は、診断において使用するための、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項160】

対象における疾病を治療又は予防するための薬剤の製造のための、又は、対象における疾病の診断のための診断組成物の製造のための、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。

【請求項161】

前記ＲＮＡは、請求項８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義される前記タンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項162】

前記ＲＮＡは、請求項１１５から１２４のいずれか一項において定義される前記融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと組み合わせて使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。

【請求項163】

請求項８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義されるタンパク質、又は、前記タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、請求項１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【請求項164】

請求項１１５から１２４のいずれか一項において定義される融合タンパク質、又は、前記融合タンパク質をコードするＤＮＡと共に使用される、薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための、請求項１２６に記載のＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【請求項165】

薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するためのタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記タンパク質は、請求項８２から８５又は１２５のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。

【請求項166】

薬剤として使用するための、又は、対象における診断に使用するための融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡであって、前記融合タンパク質は、請求項１１５から１２４のいずれか一項において定義され、前記ＤＮＡは、請求項６１から８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ、又は、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡと共に使用される、ＤＮＡ又はＲＮＡ。

【請求項167】

試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を判定するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。

【請求項168】

標的配列を含むポリヌクレオチドの標的領域を改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。

【請求項169】

細胞を遺伝子改変するためのインビトロ又はエクスビボの方法における、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムの使用。

【請求項170】

前記細胞は、請求項３６から４３のいずれか一項において定義される、請求項１６９に記載の使用。

【請求項171】

対象において薬剤として使用される遺伝子改変細胞であって、前記遺伝子改変細胞は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステム、又は、請求項８１から１１４のいずれか一項に記載のエフェクター複合体を使用して、前記対象から取得される細胞を遺伝子改変する段階を備える方法によって取得される、遺伝子改変細胞。

【請求項172】

前記方法は、前記対象から取得される前記細胞を培養して増やす段階を備える、請求項１７１に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項173】

前記対象から取得される前記細胞は、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）又はＴ細胞である、請求項１７１及び請求項１７２に記載の遺伝子改変細胞。

【請求項174】

エフェクター複合体を用いて、ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変し、標識し、又は、前記標的領域からの発現を制御するための方法であって、前記標的領域は標的配列を含み、
前記エフェクター複合体は：（ｉ）請求項８１から１１４のいずれかのエフェクター複合体であり；（ｉｉ）請求項１１５から１２４のいずれかの融合タンパク質、及び、請求項６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み；又は、（ｉｉｉ）請求項１２５の変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質を含む融合タンパク質、及び、請求項６１から８０のいずれかのＲＮＡを含み、
前記方法は、前記ポリヌクレオチドを前記エフェクター複合体と接触させる段階を備え、前記ＲＮＡのガイド配列は、前記標的配列にハイブリダイズし、前記エフェクター複合体が前記標的領域を改変又は標識すること、又は、前記標的領域からの発現を制御することを可能にする、
方法。

【請求項175】

前記エフェクター複合体は１又は複数のエフェクター分子を含む、請求項１７４に記載の方法。

【請求項176】

１又は複数の前記エフェクター分子は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、標識、転写活性化因子、及び転写抑制因子でないエンドヌクレアーゼから選択される１又は複数である、請求項１７５に記載の方法。

【請求項177】

前記エフェクター複合体は、前記変異ＴｎｐＢタンパク質及び１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質を含む、請求項１７４から１７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項178】

前記ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである、請求項１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項179】

前記ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡである、請求項１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項180】

前記ポリヌクレオチドはＲＮＡである、請求項１７４から１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項181】

前記方法はインビボ方法である、請求項１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項182】

前記方法はエクスビボの方法である、請求項１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項183】

前記方法はインビトロの方法である、請求項１７４から１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項184】

前記ポリヌクレオチドは細胞内にある、請求項１７４から１８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項185】

前記細胞は原核細胞である、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記細胞は真核細胞である、請求項１８４に記載の方法。

【請求項187】

前記細胞は非ヒト動物細胞である、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

前記細胞はヒト細胞である、請求項１８６に記載の方法。

【請求項189】

前記細胞は幹細胞である、請求項１８６から１８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項190】

前記幹細胞がヒト幹細胞であるとき、それは全能性幹細胞でない、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

前記細胞は人工多能性幹細胞である、請求項１８９に記載の方法。

【請求項192】

前記細胞は植物細胞である、請求項１８６に記載の方法。

【請求項193】

前記方法は、エフェクター複合体を細胞内に導入する段階、又は、請求項１４２から１５８のいずれか一項に記載のシステムを細胞内に導入する段階を備える、請求項１７４から１９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項194】

前記導入する段階は、電気穿孔又はマイクロインジェクションを含み、任意選択的に、リポソームの使用と組み合わせる、請求項１９３に記載の方法。

【請求項195】

前記細胞への前記導入は、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション又はカチオン系ポリマートランスフェクションなどの化学ベーストランスフェクションである、請求項１９３に記載の方法。

【請求項196】

前記細胞内への前記導入は、ウイルスベクターを用いる送達による、請求項１９３に記載の方法。

【請求項197】

前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はＡＡＶベクターである、請求項１９６に記載の方法。

【請求項198】

前記方法は、人体又は動物の体の治療の方法でない、請求項１７４から１９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項199】

前記方法は、ヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変するための方法でない、請求項１７４から１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記方法は、産業上の目的のためのヒト胎児の使用でない、請求項１７４から１９９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ポリヌクレオチドにおける標的配列の標的ポリヌクレオチド改変及び検出の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

微生物は、医療を含む幅広い範囲の技術にわたる用途のための、遺伝子工学のための興味深く有用なツールの供給源である。

【0003】

近年、ＤＮＡ改変において使用するために、細菌及び古細菌の適応免疫系に由来するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを適合させることに特に関心が集まっている。天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは非常に多様であり、２つのクラスに分類され、その各々は現在、複数のサブタイプを有する３つの異なるタイプを含む（近年、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０によってレビューされた）。これらのうち最も研究されたものは、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９（クラス１、タイプＩＩ）に基づくシステムであり（Ｊｉａｎｇ ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ，２０１７によってレビューされた）、より近年では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２（クラス２、タイプＶ）に基づくシステムである（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５及びＫａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０に記載される）。これらのシステムは、標的ＤＮＡに部位特異的二本鎖切断を導入することが可能である、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として構成される、ＲＮＡによってガイドされるＤＮＡエンドヌクレアーゼに基づく。両方の場合において、ＲＮＰ複合体による標的認識は、標的部位にフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）する短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を必要とする。それにもかかわらず、（好適なＰＡＭが存在する場合に）ＲＮＡ配列を変更することによって異なる標的にエンドヌクレアーゼを誘導する能力により、これらのシステムは、ＤＮＡ改変のためのツールのソースとして非常に魅力的である。

【発明の概要】

【0004】

本願では、驚くべきことに、ＴｎｐＢタンパク質は、ＲＮＡ分子とリボ核タンパク質エフェクター複合体を形成するＲＮＡ結合タンパク質であることが示された。また、これらのエフェクター複合体は、ポリヌクレオチドにおける標的配列に対するＲＮＡ分子のセグメントの結合、及び、複合体におけるＴｎｐＢタンパク質のその後のヌクレアーゼ活性に基づいて、ポリヌクレオチドを切断することが可能であると示された。

【0005】

ＴｎｐＢタンパク質は、細菌及び古細菌の挿入配列（ＩＳ）のいくつかのファミリーにおいて見られるｔｎｐＢ遺伝子の予測される産物として当技術分野において知られている。挿入配列は、広く見られる原核生物の可動遺伝因子であり、多くの数の真核生物ＤＮＡ転位因子がそれに関連する（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１０）。挿入配列は、転位及び転位の調節に関連する遺伝子のみを含む。挿入配列のいくつかのファミリーは、ｔｎｐＡ遺伝子及びｔｎｐＢ遺伝子を保持する。しかしながら、転位におけるＴｎｐＡの機能は十分に確立されている一方で、ＴｎｐＢの役割は示されていなかった。ＴｎｐＢは転位に必須ではないことが示され、当該タンパク質は、トランスポゾン切除及び挿入の負の調節に関与すると考えられている（Ｋｅｒｓｕｌｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、２００２；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。過去において、ＴｎｐＢタンパク質がＲＮＡに結合しているときにヌクレアーゼとして作用できること、及び、切断がＲＮＡのセグメント及び標的部位の間の結合によって標的にされることは示されなかった。

【0006】

本明細書に記載される実験は、ＴｎｐＢタンパク質を使用して、従来技術のＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ１２システムとは機能的に別個である、新規のＲＮＡによってガイドされるエフェクター複合体を産生できることを示し、ここで、ＴｎｐＢタンパク質はヌクレアーゼとして作用できる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、挿入配列に会合するＣＲＩＳＰＲアレイは無い。むしろ、驚くべきことに、天然においてＴｎｐＢタンパク質が会合するＲＮＡが挿入配列の部分に由来することが示された。

【0007】

本明細書に記載されるこれらのエフェクター複合体は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで、ポリヌクレオチドの標的化において著しい有用性を有し、有利なことに遺伝子改変ツールボックスを拡張する。ＴｎｐＢタンパク質のヌクレアーゼ活性を利用してポリヌクレオチドを改変するだけでなく、ＴｎｐＢタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を不活性化するように変異され得、ポリヌクレオチドの切断を伴うことなくエフェクター複合体が遺伝子発現をブロックするために使用されること、又は、標的配列を検出するために使用されることを可能にする。

【0008】

また、ＴｎｐＢタンパク質の活性又は不活性形態を含む、本明細書に記載のエフェクター複合体は、ポリヌクレオチド内の標的部位に対する１又は複数の追加のエフェクター分子を保持するように設計できる。いくつかの例において、ＴｎｐＢタンパク質又はその不活性化形態は、１又は複数のエフェクター分子との融合タンパク質に含まれ得る。

【0009】

ＴｎｐＢタンパク質はサイズが比較的小さいので、例えば、ＡＡＶベースの送達による細胞への送達及び治療用途における使用に特に好適である。エフェクター複合体のサイズが重要である特定の状況において、本発明のＴｎｐＢベースのエフェクター複合体は、それぞれ１０００～１５００アミノ酸の長さ及び５００～１５００アミノ酸の長さである、より大きいＣａｓ９及びＣａｓ１２タンパク質に比べて有利である。

【0010】

従って、本発明は以下を提供する。

【0011】

第１態様において、本発明は、エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法を提供し、ここでポリヌクレオチドは標的配列を含み、エフェクター複合体は以下を含む：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）以下を含むＲＮＡ：
（ｉ）標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質と結合してエフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント、ここで、方法は、ポリヌクレオチドをエフェクター複合体に接触させ、ＴｎｐＢタンパク質がポリヌクレオチドを切断することを可能にすることを含む。

【0012】

第２態様において、本発明は、エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へガイドするためのＲＮＡを提供し、ＲＮＡは以下を含む：
（ｉ）ポリヌクレオチドの標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能であるガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合してエフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント。

【0013】

第３態様において、本発明は、ポリヌクレオチドにおける標的領域に結合するためのエフェクター複合体を提供し、エフェクター複合体は、タンパク質及びＲＮＡを含み、ここで、タンパク質はＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成り、ここでＲＮＡは以下を含む：
（ｉ）標的領域に含まれる標的配列とハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント。

【0014】

第４態様において、本発明は融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、及び、（ｉ）融合タンパク質のアミノ又はカルボキシル末端上の１又は複数の核局在化シグナル及び／又は細胞膜透過ペプチド、及び／又は（ｉｉ）１又は複数のエフェクター分子を含む。

【0015】

第５態様において、本発明は、任意選択的にタンパク質のヌクレアーゼドメインを不活性するための変異を含む変異ＴｎｐＢタンパク質を提供し、ここで、変異ＴｎｐＢタンパク質は、本発明の融合タンパク質のＴｎｐＢタンパク質である。

【0016】

第６態様において、本発明は、ＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。

【0017】

第７態様において、本発明は、融合タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを提供する。

【0018】

第８態様において、本発明は、変異ＴｎｐＢタンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを提供する。

【0019】

第９態様において、本発明は、本発明のＤＮＡを含む組み換え発現ベクターを提供する。

【0020】

第１０態様において、本発明は、本発明の組み換え発現ベクター又は発明のＤＮＡを含む宿主細胞を提供する。

【0021】

第１１態様において、本発明は、本発明のＲＮＡ、本発明のエフェクター複合体、本発明の融合タンパク質、本発明の変異ＴｎｐＢタンパク質、本発明のＤＮＡ、本発明の組み換え発現ベクター、又は本発明の宿主細胞及び緩衝液を含む組成物を提供する。

【0022】

第１２態様において、本発明は、本発明のＲＮＡ、エフェクター複合体、融合タンパク質、又は変異ＴｎｐＢタンパク質を産生するためのインビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法のための方法を提供する。

【0023】

第１３態様において、本発明は、ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変するためのシステムを提供し、ここで、標的領域は標的配列を含み、システムは以下を含む：
ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質又は当該タンパク質をコードするＤＮＡ、及び
ｂ）ＲＮＡ、又は、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、ＲＮＡは以下を含む：
（ｉ）標的配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント。

【0024】

第１４態様において、本発明は、薬剤として使用される、又は、診断の方法において使用される、ＲＮＡ、エフェクター複合体、変異ＴｎｐＢ、融合タンパク質、上記をコードするＤＮＡ、又は、システムを提供する。

【0025】

第１５態様において、本発明は、試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を判定するエクスビボ又はインビトロの方法における、ＲＮＡ、エフェクター複合体、変異ＴｎｐＢ、融合タンパク質、上記をコードするＤＮＡ、又は、システムの使用を提供する。

【0026】

第１６態様において、本発明は、ポリヌクレオチドの標的領域を改変するためのインビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法における、ＲＮＡ、エフェクター複合体、変異ＴｎｐＢ、融合タンパク質、上記をコードするＤＮＡ、又はシステムの使用を提供し、ここで標的領域は標的配列を含む。

【0027】

第１７態様において、本発明は、細胞を遺伝子改変するためのインビボ、エクスビボ、又はインビトロの方法における、ＲＮＡ、エフェクター複合体、変異ＴｎｐＢ、融合タンパク質、上記をコードするＤＮＡ、又はシステムの使用を提供する。

【0028】

第１８態様において、本発明は、対象における薬剤としての使用のための遺伝子改変細胞を提供し、ここで細胞は、本発明のシステム又はエフェクター複合体を使用して対象から取得される細胞を遺伝子改変する段階を含む方法によって取得される。

【0029】

第１９態様において、本発明は、エフェクター複合体を用いて、ポリヌクレオチドにおける標的領域からの発現を改変、標識、又は制御するための方法を提供し、ここで、標的領域は標的配列を含み、ここで、エフェクター複合体は、（ｉ）本発明のエフェクター複合体であり；（ｉｉ）本発明の融合タンパク質及びＲＮＡを含み；又は（ｉｉｉ）変異ＴｎｐＢタンパク質、又は、変異ＴｎｐＢタンパク質を含む融合タンパク質、及び本発明のＲＮＡを含み、ここで、方法は、ポリヌクレオチドをエフェクター複合体と接触させる段階を備え、それにより、ＲＮＡのガイド配列は標的配列にハイブリダイズし、エフェクター複合体が標的領域を改変又は標識すること又は標的領域からの発現を制御することを可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0030】

本開示の理解を支援するために、及び、実施形態がどのように実施され得るかを示すために、単に例として添付図面が参照される。

【0031】

【図1A】図１はＩＳ２００／ＩＳ６０５可動遺伝因子特性評価に関連する。図１Ａはデイノコッカス・ラディオデュランスＩＳＤｒａ２座位の概略を示す。システムは、左及び右の部分的回文配列（ＬＥ及びＲＥ）にそれぞれフランキングするｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子から成る。

【図1B】ＴｎｐＡによって媒介される「剥離及びペースト」の転位機構の概略を示す。ＴｎｐＡ二量体は、複製中に宿主ＤＮＡラギング鎖からのトランスポゾン切除を媒介し、環状一本鎖ＤＮＡ中間体及びドナージョイントを形成する。次に、切除されたトランスポゾンは、アクセプタジョイントにおいて、短い５'－ＴＴＧＡＴ－３'（ＩＳＤｒａ２）モチーフの次の宿主のラギングＤＮＡ鎖に挿入され、転位サイクルが完了する。トランスポゾン切除／挿入部位は三角形で示される。

【図1C】ＴｎｐＢ複合体発現及び大腸菌細胞からの精製及び結合ＲＮＡ抽出の実験ワークフローの概略を提供する。

【図1D】ＩＳＤｒａ２座位に対するｓＲＮＡシーケンシングリードのアライメントを提供する。トランスポゾン切除／挿入部位が三角形で示される。ＲＥ因子に由来するＲＮＡ配列は、ヘアピン形成に関与し得るリボヌクレオチド、及び、ヘアピン及び三角形の間の２つのリボヌクレオチドであり、一方、シーケンシングされたＲＮＡ３'末端における最後の約１６ｎｔは、三角形の右に示されるトランスポゾンフランキングＤＮＡ－リボヌクレオチドとアラインする。

【0032】

【図2A】図２はＩＳＤｒａ２システム精製からのＴｎｐＢに関連する。図２Ａは単一ＴｎｐＢ発現及び大腸菌細胞からの精製から調製されたＨｉｓＴｒａｐキレートカラムに結合されたタンパク質の溶出画分を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。枠で囲まれたエリアは、予想される１０×ＭＢＰ－ＴｎｐＢタンパク質（９５．４ｋＤａ）サイズのバンドを表す。

【図2B】ＩＳＤｒａ２システム発現及び大腸菌細胞からの精製を用いる、ＴｎｐＢから調製されたＨｉｓＴｒａｐキレートカラムに結合されたタンパク質の溶出画分を示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。枠で囲まれたエリアは、予想される１０×ＭＢＰ－ＴｎｐＢタンパク質（９５．４ｋＤａ）サイズのバンドを表す。

【図2C】１０×ＭＢＰ－ＴｎｐＢタンパク質を含むプールされた画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。

【図2D】ＴｎｐＢタンパク質と共精製する核酸の検出及び解析に関連するゲルを示す。

【0033】

【図3A】図３はＴｎｐＢタンパク質がＲＮＡによってガイドされるｄｓＤＮＡヌクレアーゼであることを示す。図３Ａは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ切断活性検出の実験ワークフローの概略を提供する。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、１６ｎｔガイド配列を含む。Ｆ－連結されたアダプターにアニーリングするフォワードプライマー。Ｒ１及びＲ２－プラスミドバックボーンにアニーリングするリバースプライマー。７Ｎは、標的配列の次のプラスミドライブラリにおけるランダム化領域を表す。

【図3B】標的配列における二本鎖切断（ＤＳＢ）形成を示すアダプター連結位置決定を示す。

【図3C】２０～２１ｂｐ Ｆ＋Ｒ１エンリッチアダプター連結リードにおける７Ｎランダム化領域において識別されるモチーフのＷｅｂＬｏｇｏ表現を提供する。

【図3D】ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体発現及び精製の実験ワークフローを示す概略を提供する。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、１６ｎｔガイド配列を含む。

【図3E】ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体がインビトロでスーパーコイル状を切断し、標的プラスミドをほどき、切断はインタクトなＲｕｖＣ様の活性部位に依存することを示すゲルを提供する。

【図3F】トランスポザーゼ会合モチーフ（ＴＡＭ）及びｒｅＲＮＡ３'末端配列に相補的な標的がプラスミドＤＮＡ切断に必要であることを示すゲルを提供する。

【図3G】５'－ＴＡＭから１５～２１ｂｐの切断位置を明らかにするＴｎｐＢ切断プラスミド産物のサンガーシーケンシングを示す。識別された切断位置は、三角形を用いたマーカである（ＮＴＳ－非標的鎖；ＴＳ－標的鎖）。

【0034】

【図4A】図４はＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体がＴＡＭ依存的な方式でｄｓＤＮＡを切断することを示す。図４Ａは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ切断活性検出の実験ワークフローの概略を示す。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、２０ｎｔガイド配列を含む。Ｆ－連結されたアダプターにアニーリングするフォワードプライマー。Ｒ１及びＲ２－プラスミドバックボーンにアニーリングするリバースプライマー。７Ｎは、標的配列の次のプラスミドライブラリにおけるランダム化領域を表す。

【図4B】標的配列における二本鎖切断（ＤＳＢ）形成を示すアダプター連結位置決定を示す。

【図4C】２０～２１ｂｐ Ｆ＋Ｒ１エンリッチアダプター連結リードにおける７Ｎランダム化領域において識別されるモチーフのＷｅｂＬｏｇｏ表現を示す。

【図4D】２０～２１ｂｐ Ｆ＋Ｒ１（－ＴｎｐＢ）エンリッチアダプター連結リードにおける７Ｎランダム化領域において識別されるモチーフのＷｅｂＬｏｇｏ表現を示す。

【0035】

【図5A】図５はＴｎｐＢがインビボでプラスミド干渉を媒介することを示す。図５Ａは大腸菌におけるプラスミド干渉アッセイの実験ワークフローの概略を示す。標的プラスミドの切断の結果、カナマイシン（Ｋｎ）に対する耐性の喪失が生じる。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、１６ｎｔガイド配列を含む。ＡｍｐＲ－アンピシリン／カルベニシリン（Ａｐ／Ｃｂ）耐性遺伝子、ＫａｎＲ－Ｋｎ耐性遺伝子。

【図5B】形質転換実験の結果を示す。形質転換実験は、連続希釈（１０×）され、大腸菌形質転換体は、Ｃｂ及びＫｎを補足された培地上で、２５℃で４４時間増殖された。

【0036】

【図6A】図６はＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体精製を示す。図６ＡはＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体発現及び多段階精製の実験ワークフローの概略を示す。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、１６ｎｔガイド配列を含む。

【図6B】精製されたＴｎｐＢ及びＴｎｐＢ（Ｄ１９１Ａ）ＲＮＰ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果を示す。

【図6C】マスフォトメトリーによって判定されたＴｎｐＢ及びｒｅＲＮＡ ＲＮＰ複合体の分子量を示す。取得された分子量は、約１５０ｎｔのｒｅＲＮＡに結合されたＴｎｐＢタンパク質から成るＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体に対応する（１：１モル比）。

【0037】

【図7A】図７はＴｎｐＢヌクレアーゼが新規のゲノムエディターであることを示す。図７Ａはヒト細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）ゲノム編集実験の実験ワークフローの概略を示す。

【図7B】ヒトゲノムＤＮＡにおける５つの試験された２０ｂｐ長標的におけるインデル活性検出を示す（３つの反復の平均、±標準偏差として表される）。ｘ軸に沿って、各部位について、「ＴｎｐＢ（非標的）」を表す棒線が左手側にあり、「ＴｎｐＢ」を表す棒線が右手側にある。

【図7C】切断部位にわたる支配的な欠失を示す、ＥＭＸ１－１部位におけるインデルプロファイル解析の結果を示す。グラフの左にある陰影付きの細長い部分は、「ＴＡＭ」を表し、右にある陰影付きの細長い部分は、「標的」を表す。

【0038】

【図8A】図８はＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体による合成ｄｓＤＮＡ切断を示す。図８Ａは精製されたＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体が、ＴＳ（標的鎖）上の配列ＣＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＧ（配列番号：１７）（３'→５'）である標的（緑色で表される）、及び、ＮＴＳ（非標的鎖）上の配列ＴＴＧＡＴ（５'→３'）によって表されるＴＡＭ（赤色）を含むｄｓＤＮＡ基質を切断して段違い切断パターンを生成することを示すゲルを提供する。ＮＴＳ及びＴＳは、非標的及び標的鎖をそれぞれ表す。Ｄ－ＤＮＡ基質と共に６０分間インキュベートされるＴｎｐＢ（Ｄ１９１Ａ）ＲＮＰ複合体。

【図8B】精製されたＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体が、二本鎖ＴＡＭの非存在下で、標的を含むｄｓＤＮＡ基質を切断しないことを示すゲルを提供する。Ｄ－ＤＮＡ基質と共に６０分間インキュベートされるＴｎｐＢ（Ｄ１９１Ａ）ＲＮＰ複合体。

【0039】

【図9A】図９はＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体によって切断された合成ｓｓＤＮＡを示す。図９Ａは精製されたＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体が、ｒｅＲＮＡ標的配列に相補的な配列を含むｓｓＤＮＡ基質を切断することを示すゲルである。ＮＴＳ及びＴＳは、非標的及び標的鎖をそれぞれ表す。Ｄ－ＤＮＡ基質と共に６０分間インキュベートされるＴｎｐＢ（Ｄ１９１Ａ）ＲＮＰ複合体。

【図9B】精製されたＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体が、ｒｅＲＮＡ標的配列に相補的な配列を含むｓｓＤＮＡ基質を切断することを示すゲルである。ＮＴＳ及びＴＳは、非標的及び標的鎖をそれぞれ表す。Ｄ－ＤＮＡ基質と共に６０分間インキュベートされるＴｎｐＢ（Ｄ１９１Ａ）ＲＮＰ複合体。

【0040】

【図10A】図１０はインビトロのＴｎｐＢ切断条件試験の結果を示す。図１０Ａは様々な温度におけるＴｎｐＢ ＲＮＰプラスミドＤＮＡ切断を判定するアッセイの結果を示す。産物は、プラスミドＤＮＡをＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体と共に１５分間インキュベートした後に解析された。

【図10B】様々なＮａＣｌ濃度におけるＴｎｐＢ ＲＮＰプラスミドＤＮＡ切断を判定するアッセイの結果を示す。産物は、プラスミドＤＮＡをＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体と共に１５分間インキュベートした後に解析された。

【0041】

【図11A】図１１はＴｎｐＢがインビボでプラスミド干渉を媒介すること示す。図１１Ａは大腸菌におけるプラスミド干渉アッセイの実験ワークフローの概略を提供する。標的プラスミドの切断の結果、カナマイシン（Ｋｎ）に対する耐性の喪失が生じる。ｒｅＲＮＡコードコンストラクトは、１６ｎｔガイド配列を含む。ＡｍｐＲ－アンピシリン／カルベニシリン（Ａｐ／Ｃｂ）耐性遺伝子、ＫａｎＲ－Ｋｎ耐性遺伝子。

【図11B】形質転換実験が連続希釈（１０×）され、大腸菌形質転換体が、Ｃｂ及びＫｎで補足された培地上で、２５～３７℃で増殖される結果を示す。

【0042】

【図12】異なる挿入配列からのＴｎｐＢタンパク質のＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及び、ＲｕｖＣ ＩＩＩモチーフのアライメントを提供する。モチーフの配列は、ＩＳＤｒａ２（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１）；ＩＳＨｐ６０８（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：２）；ＩＳ６０５（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：３）；ＩＳ６０６（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：４）；ＩＳ６０９（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：５）；ＩＳ１３４１（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：６）；ＩＳＣ１３１６（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：７）；ＩＳ８９１（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：８）；ＩＳＥｃ４２（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：９）；ＩＳＴｅｌ３（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１０）；ＩＳ６０７（ＩＳ６０７ファミリーＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１１）；ＩＳＴｓｉ１（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１２）；ＩＳ１５３５（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１３）；ＩＳＢｌｏ１２（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１４）；及びＩＳＣ１９２６（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質（配列番号：１５）から取得される。アライメントは、活性部位残基（枠で囲まれたＤ－－－Ｅ－－－Ｄ）が、ＴｎｐＢファミリーにわたって保存されていることを示す。

【0043】

【図13】本開示のＲＮＡによってガイドされるリボ核タンパク質複合体のヌクレアーゼ活性の概略を提供する。リボ核タンパク質複合体（（ＴｎｐＢタンパク質及びＲＮＡを含む）は、二本鎖ＴＡＭ配列（非標的鎖を参照すると、標的配列の５'に位置する）を認識し、リボ核タンパク質複合体におけるＲＮＡのガイド配列は、ポリヌクレオチドの標的鎖（ＴＳ）の標的配列に結合し、それにより、ＴｎｐＢタンパク質のＲｕｖＣ様ドメインによる標的鎖（ＴＳ）及び非標的鎖（ＮＴＳ）の切断をもたらす。

【発明を実施するための形態】

【0044】

本発明者は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ ＤＮＡエンドヌクレアーゼと同様であるが別個である方式で機能する、新規のＲＮＡによってガイドされるリボ核タンパク質（本明細書において「エフェクター複合体」とも称される）を識別した。従って、本開示は特に、これらのエフェクター複合体、インビトロ、エクスビボ、及びインビボ（原核生物及び真核細胞）でポリヌクレオチドを切断又は改変するためのそれらの使用を伴う方法、及び、標的細胞へのそれらの送達のためのシステムに関連する。

【0045】

ＴｎｐＢタンパク質
本開示のタンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質を含む、それから本質的に成る、又は、それから成るタンパク質である。特に、タンパク質がＴｎｐＢタンパク質を「含む」場合、更なるアミノ酸がタンパク質に存在し得る。これは下で更に記載され、１又は複数の追加のエフェクタータンパク質とのＴｎｐＢの融合タンパク質を含む。タンパク質がＴｎｐＢタンパク質から「本質的に成る」場合、ＴｎｐＢタンパク質の必須の特徴、すなわち、ＲＮＡに結合することによって本明細書に記載のエフェクター複合体（ＲＮＡプログラム可能ヌクレアーゼとして作用する能力を有し得、ここで、ＴｎｐＢタンパク質は、そのヌクレアーゼ活性を保持し、又は、ＲＮＡプログラム可能担体又はＲＮＡプログラム可能ポリヌクレオチドブロッカとして作用する能力を有し得、ここで、エフェクター複合体におけるＴｎｐＢは、下で更に記載されるようにそのヌクレアーゼ活性が不活性化された不活性／変異体ＴｎｐＢタンパク質である）を形成するその能力に重大な影響を与えない更なるアミノ酸又はタンパク質配列がタンパク質に存在し得る。タンパク質がＴｎｐＢタンパク質から「成る」場合、更なるアミノ酸は存在しない。

【0046】

ＴｎｐＢタンパク質は、挿入配列（ＩＳ）からのｔｎｐＢ遺伝子によってコードされるタンパク質、又は、本明細書に記載のエフェクター複合体を形成する能力を保持するこれらのＴｎｐＢタンパク質の配列バリアントである。特に、本開示の例において、ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５又はＩＳ６０７ファミリーにおける可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されるタンパク質のアミノ酸配列、又はそれらの配列バリアントを有する。好ましい例において、ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されるタンパク質のアミノ酸配列、又は、それらの配列変バリアントを有する。より具体的には、ＴｎｐＢタンパク質は、細菌のデイノコッカスファミリーにおいて見られるＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーからの可動遺伝因子のｔｎｐＢ遺伝子から取得されるタンパク質のアミノ酸配列、又はそれらの配列バリアントを有し得る。一例において、ＴｎｐＢタンパク質は、ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子から取得されるＴｎｐＢタンパク質のアミノ酸配列（デイノコッカス・ラディオデュランスからの挿入配列ＩＳ２００／ＩＳ６０５）又はそれらの配列バリアントを有する。

【0047】

上に記載されるように、挿入配列は、転位及び転位の調節に関連する遺伝子のみを含む、単純な広く見られる可動遺伝因子（ＭＧＥ）である。挿入配列は、当技術分野において、Ｓｉｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６及びＳｉｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４に記載されるように、及び、細菌及び古細菌から単離された挿入配列のリストを提供するデータベースであるＩＳｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／）に示されるように、異なるファミリーに分類される。これらの挿入配列の配列は多様であり得るが、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーの転位因子は、ＭＧＥの端における、末端に近い回文因子（ＬＥ及びＲＥ）、及び、異なる構成におけるｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子、又は、スタンドアロンｔｎｐＡ又はｔｎｐＢ遺伝子を保持するものとして識別される。特に、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーは更に、（ｔｎｐＡ遺伝子のみを保持する）ＩＳ２００、（場合によりＩＳ６０５とも称され、ｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子、例えば、ヘリコバクター・ピロリからのＩＳ６０８、及び、デイノコッカス・ラディオデュランスのＩＳＤｒａ２を保持する（この因子の構成は図１Ｄに示される））ＩＳ２００／ＩＳ６０５、及び（ｔｎｐＢ遺伝子のみを保持する）ＩＳ１３４１に分類され得る。ＩＳ６０７ ＭＧＥは、ｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子の両方をコードするものとして識別され、そのコード配列は、場合により重複している。これらの因子の端はまた、不完全な、及び／又は、二次的なＲＮＡ構造であることが多い逆位反復配列と会合し得る。

【0048】

ＴｎｐＢタンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質が本明細書に記載のエフェクター複合体を形成することを共に可能にするＲＮＡ結合セグメント及びＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み、当該エフェクター複合体は、ポリヌクレオチドにおける（ＲＮＡのガイド配列が結合する標的部位を含む）標的領域に対するヌクレアーゼ活性を有する。特に、本明細書において実証されるように、ＲｕｖＣ様ドメインは、ＴｎｐＢタンパク質のヌクレアーゼ活性を担う。

【0049】

ＲｕｖＣ自体は、活性のために二価金属イオンを必要とする、細菌におけるホリデイジャンクションを解離する二量体の細菌エンドヌクレアーゼである。ＲｕｖＣ様ドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩモチーフを含み、任意選択的に、ＲｕｖＣ－ＩＩ及びＲｕｖＣ－ＩＩＩモチーフの間のＺｎフィンガーを伴う）は、当技術分野において知られており、Ｃａｓ９タンパク質による１つのＤＮＡ鎖の切断、及び、Ｃａｓ１２タンパク質の二本鎖ヌクレアーゼ活性を担うと認識されている（例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５、及びＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０を参照）。ＲｕｖＣタンパク質と同様に、ＴｎｐＢのＲｕｖＣ様ドメインは通常、活性のために二価金属イオンを必要とする。

【0050】

図１２は、異なる挿入配列からのＴｎｐＢタンパク質のＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ、及びＲｕｖＣ－ＩＩＩモチーフのアライメントを提供する。（挿入配列の名称及びファミリーが左手側に示される。）アライメントは、ＲｕｖＣ活性部位に関与する、モチーフＩ、ＩＩ及びＩＩＩにおける保存されたＤ－－－Ｅ－－－Ｄアミノ酸（図１２における枠で囲まれたアミノ酸）をそれぞれ示す。これらのアミノ酸は、配列アライメントツール、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アライメントプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）（Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）を使用してＴｎｐＢタンパク質内において識別できる。

【0051】

ＴｎｐＢタンパク質がヌクレアーゼ活性を有する標的配列を含むポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであり得る。特に、ＴｎｐＢタンパク質は二本鎖ＤＮＡに対してヌクレアーゼ活性を有し、従って、ＴｎｐＢタンパク質を含むエフェクター複合体は、ゲノム編集において特に有用性を有する。

【0052】

ＴｎｐＢタンパク質のＲＮＡ結合セグメントは、ＲＮＡと相互作用してエフェクター複合体を形成する配列を含む。本明細書において報告される実験において示されるように、本発明者は、大腸菌において単独でマルトース結合タンパク質をコードする配列に融合されたｔｎｐＢ遺伝子の発現、及び、その後のアフィニティクロマトグラフィーが、インタクトなＴｎｐＢタンパク質の低い収量を明らかにしたことを発見した。しかしながら、ＲＮＡとの共発現の結果、ＴｎｐＢタンパク質のより高い収量がもたらされた。理論によって拘束されることを望まないが、本発明者は、ＲＮＡとのＴｎｐＢタンパク質のＲＮＡ結合セグメントの相互作用が、ＴｎｐＢタンパク質を安定化するように作用すると考えている。

【0053】

ＴｎｐＢが二本鎖ＤＮＡを切断することを可能にするために、ポリヌクレオチドは、標的配列のＴｎｐＢ会合配列モチーフ５'（図１３に示される非標的鎖上）を含む必要がある。このＴｎｐＢ会合配列モチーフはまた、本明細書において、トランスポゾン関連モチーフ又はＴＡＭと称される。特に、理論によって拘束されることを望まないが、本発明者は、ＰＡＭについてのＣａｓ９及びＣａｓ１２エフェクタータンパク質の要件と同様の方式で、ＤＮＡ分子のエフェクター複合体切断が、ＴｎｐＢ会合配列モチーフの存在を必要とすると、及び、ＴＡＭがエフェクター複合体によって二本鎖モチーフとして認識されると考える（本明細書において例によって示されるように、その存在は、エフェクター複合体による一本鎖ＤＮＡの切断に必要でないからである）。ＴＡＭの配列は、異なるＴｎｐＢタンパク質の間で変動し得ると予想される。特定のＴｎｐＢタンパク質についてのＴＡＭの配列は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ヌクレアーゼのために過去に開発されたＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）識別アッセイ（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５、２０１９）を使用して判定できる（例２も参照されたい）。

【0054】

ポリヌクレオチドにおけるＴｎＢ会合配列モチーフは、Ｔリッチモチーフであり得、ＴＴＧＡＴであり得る。特に、好ましくは、ＴｎｐＢ会合配列はＴＴＧＡＴであり、ＴｎｐＢタンパク質はＩＳＤｒａ２ファミリーに由来し、より好ましくは、配列番号：１のアミノ酸配列又はそれらの配列バリアントを含む又はそれから成る。

【0055】

ＴｎｐＢタンパク質は、挿入配列において見られるｔｎｐＢ遺伝子又はその配列バリアントの産物であり得、すなわち、それに由来し得る。ＴｎｐＢ配列バリアントは、ＲＮＡ結合セグメント及びＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを保持し、これらは共に、ＴｎｐＢタンパク質が、ポリヌクレオチドにおける標的領域（ＲＮＡが結合する標的部位を含む）に対するヌクレアーゼ活性を有する、本明細書に記載されるエフェクター複合体を形成することを可能にする。エフェクター複合体が、二本鎖ＤＮＡであるポリヌクレオチドを標的とするものである場合、ＴｎｐＢタンパク質バリアントはまた、ポリヌクレオチドの標的領域においてＴｎｐＢ会合モチーフを認識する能力を保持する必要がある。

【0056】

配列バリアントは、上に示されるＩＳファミリーからのｔｎｐＢ遺伝子から産生されたＴｎｐＢタンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。代替的に、バリアントは、ＴｎｐＢタンパク質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列類似性を有し得る（特にＢＬＡＳＴによって判定される）。

【0057】

配列のバリエーションは、保存されたアミノ酸の変化の確立に基づき得る。更に、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２タンパク質の特異性及び活性を増加させるために使用された、当技術分野において記載される方法はまた、特に、減少したオフターゲットのヌクレアーゼ活性を伴うＴｎｐＢバリアントを生成するために利用され得る。１つの例は、指向性進化法である。

【0058】

ＴｎｐＢタンパク質は、３００～６００アミノ酸の長さであり得、任意選択的に３５０～５５０アミノ酸の長さ、更に任意選択的に、３５０～４５０アミノ酸の長さであり得る。

【0059】

一例において、ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を有する４０８アミノ酸配列であるＩＳＤｒａ２（デイノコッカス・ラディオデュランスからの挿入配列ＩＳ２００／ＩＳ６０５）のｔｎｐＢ遺伝子からのＴｎｐＢタンパク質（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＤｒａ２及びＮＣＢＩアクセッション番号ＡＥ０００５１３を参照）、又は、配列番号：１と少なくとも８５％の配列同一性、又は、それと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を伴うＴｎｐＢタンパク質であり得る。
ＭＩＲＮＫＡＦＶＶＲＬＹＰＮＡＡＱＴＥＬＩＮＲＴＬＧＳＡＲＦＶＹＮＨＦＬＡＲＲＩＡＡＹＫＥＳＧＫＧＬＴＹＧＱＴＳＳＥＬＴＬＬＫＱＡＥＥＴＳＷＬＳＥＶＤＫＦＡＬＱＮＳＬＫＮＬＥＴＡＹＫＮＦＦＲＴＶＫＱＳＧＫＫＶＧＦＰＲＦＲＫＫＲＴＧＥＳＹＲＴＱＦＴＮＮＮＩＱＩＧＥＧＲＬＫＬＰＫＬＧＷＶＫＴＫＧＱＱＤＩＱＧＫＩＬＮＶＴＶＲＲＩＨＥＧＨＹＥＡＳＶＬＣＥＶＥＩＰＹＬＰＡＡＰＫＦＡＡＧＶＤＶＧＩＫＤＦＡＩＶＴＤＧＶＲＦＫＨＥＱＮＰＫＹＹＲＳＴＬＫＲＬＲＫＡＱＱＴＬＳＲＲＫＫＧＳＡＲＹＧＫＡＫＴＫＬＡＲＩＨＫＲＩＶＮＫＲＱＤＦＬＨＫＬＴＴＳＬＶＲＥＹＥＩＩＧＴＥＨＬＫＰＤＮＭＲＫＮＲＲＬＡＬＳＩＳＤＡＧＷＧＥＦＩＲＱＬＥＹＫＡＡＷＹＧＲＬＶＳＫＶＳＰＹＦＰＳＳＱＬＣＨＤＣＧＦＫＮＰＥＶＫＮＬＡＶＲＴＷＴＣＰＮＣＧＥＴＨＤＲＤＥＮＡＡＬＮＩＲＲＥＡＬＶＡＡＧＩＳＤＴＬＮＡＨＧＧＹＶＲＰＡＳＡＧＮＧＬＲＳＥＮＨＡＴＬＶＶ（配列番号：１）

【0060】

更なる例において、ＴｎｐＢタンパク質は、以下の１つ、又は、それと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列バリアントであり得る。

【0061】

ＩＳＨｐ６０８（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３８３；ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ３５７２２４
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＨｐ６０８
ＭＬＩＴＹＫＱＫＬＹＫＮＤＫＮＲＲＩＤＴＬＬＲＲＹＧＡＬＹＮＨＣＩＡＬＨＫＲＹＹＲＬＦＫＫＹＬＫＬＹＤＬＱＫＨＩＴＫＬＫＫＴＨＲＹＡＦＬＫＴＬＧＳＱＴＭＱＤＬＴＥＲＩＤＫＡＦＫＫＦＦＮＫＫＡＫＬＰＲＦＫＫＶＡＮＹＫＳＦＴＦＫＳＫＩＤＫＫＴＧＬＮＫＧＶＧＦＡＩＫＤＮＶＶＳＦＮＧＹＳＹＫＦＩＫＴＹＡＦＩＧＫＶＫＴＬＴＩＫＲＤＮＴＧＤＹＦＬＣＬＶＣＥＬＥＮＨＰＮＫＱＴＡＣＤＫＳＶＧＦＤＦＧＬＫＴＦＬＴＧＳＤＨＴＫＩＥＳＰＬＳＦＳＫＹＬＰＬＩＫＲＬＳＫＮＬＳＫＫＶＫＧＳＮＮＦＫＫＡＫＫＫＬＴＱＬＨＱＫＩＫＹＬＲＴＤＦＦＨＫＬＡＬＫＬＳＲＥＹＱＴＩＦＩＥＤＬＮＭＫＡＭＱＫＬＷＧＲＫＶＳＤＬＡＦＳＥＦＶＫＩＬＥＮＫＡＮＶＶＫＩＤＲＦＹＰＳＳＫＴＣＳＮＣＬＦＶＮＥＥＩＮＫＤＦＲＫＩＧＫＴＤＫＥＲＥＹＨＣＫＹＣＧＬＥＬＤＲＤＬＮＡＡＩＮＩＨＲＶＧＡＳＴＬＧＶＥＦＶＲＰＴＣ（配列番号：２）

【0062】

ＩＳ６０５（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４２７；ＮＣＢＩアクセッション番号ＨＰＵ６０１７７から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ６０５
ＭＬＮＡＩＫＦＲＩＹＰＮＡＱＱＫＥＬＩＳＫＨＦＧＣＳＲＶＶＹＮＹＦＬＤＹＲＱＫＱＹＡＫＧＩＫＥＴＹＦＴＭＱＫＶＬＴＱＩＫＨＱＥＫＹＨＹＬＮＥＣＮＳＱＳＬＱＭＡＬＲＱＬＶＳＡＹＤＮＦＦＳＫＲＡＲＹＰＫＦＫＳＫＫＮＡＫＱＳＦＡＩＰＱＮＩＥＩＫＴＥＴＱＴＩＡＬＰＫＦＫＥＧＩＫＡＫＬＨＲＥＬＰＫＤＳＶＩＫＱＡＦＩＳＣＩＡＤＱＹＦＣＳＩＳＹＥＴＫＥＰＩＰＫＰＴＩＩＫＫＡＶＧＬＤＭＧＬＲＴＬＩＶＴＳＤＫＩＥＹＰＨＩＲＦＹＱＫＬＥＫＫＬＴＫＡＱＲＲＬＳＫＫＶＫＧＳＮＮＲＫＫＱＡＫＫＶＡＲＬＨＬＡＣＳＮＴＲＤＤＹＬＨＫＩＳＮＥＩＴＮＱＹＤＬＩＧＶＥＴＬＮＶＫＧＬＭＲＴＹＨＳＫＳＬＡＮＡＳＷＧＫＦＬＴＭＬＫＹＫＡＱＲＫＡＫＴＬＬＧＩＤＲＦＦＰＳＳＱＬＣＳＹＣＧＦＮＴＧＫＫＨＥＮＩＴＫＦＴＣＰＨＣＮＩＴＨＨＲＤＹＮＡＳＶＮＩＲＮＹＡＬＧＭＬＤＤＲＨＫＩＫＩＤＫＳＲＶＧＩＩＲＴＤＹＡＨＹＴＤＥＲＩＫＡＣＧＡＳＳＮＧＶＩＳＫＹＧＮＩＬＤＬＡＳＹＧＡＭＫＱＥＫＡＱＳＬ（配列番号：３）

【0063】

ＩＳ６０６（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４４２。ＮＣＢＩアクセッション番号Ｕ９５９５７から。
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ６０６
ＭＫＶＮＫＧＦＫＦＲＬＹＰＴＫＥＱＱＤＫＬＱＲＣＦＦＶＹＮＱＡＹＮＩＧＬＮＬＬＱＥＱＹＥＴＮＫＤＳＰＰＫＥＲＫＷＫＫＳＳＥＬＤＫＡＩＫＨＨＬＮＡＲＧＬＳＦＳＳＶＩＡＱＱＳＲＭＮＶＥＲＡＬＫＤＡＦＫＶＫＤＲＧＦＰＫＦＫＮＳＫＳＡＫＱＳＦＳＷＮＮＱＧＦＳＩＫＤＳＤＥＥＲＦＫＩＦＴＬＭＫＭＰＬＭＭＲＭＨＲＤＦＰＰＨＳＫＶＫＱＩＶＩＳＷＳＨＲＫＹＦＶＳＦＣＶＥＹＥＱＤＩＴＰＩＫＮＰＫＮＧＶＧＬＤＬＮＩＬＤＩＡＣＳＣＧＶＮＮＨＫＫＬＴＤＦＫＱＹＰＴＤＭＫＥＬＬＧＩＥＩＤＥＥＬＤＴＫＲＬＩＰＴＹＳＫＬＹＳＬＫＫＹＳＫＫＦＫＲＬＱＲＫＱＳＲＲＶＬＫＳＫＱＮＫＴＫＬＧＧＮＦＹＫＴＱＫＫＬＮＱＡＦＤＫＳＳＨＱＫＴＤＲＹＨＫＩＴＳＥＬＳＫＱＦＥＬＶＶＶＥＤＬＱＶＫＮＭＴＫＲＡＫＬＫＮＶＫＱＫＳＧＬＮＱＳＩＬＮＴＳＦＹＱＩＩＳＦＬＤＹＫＱＱＨＮＧＫＬＬＶＫＶＰＰＱＹＴＳＫＴＣＨＣＣＧＮＩＮＨＫＬＫＬＮＨＲＱＹＷＣＬＥＣＧＹＲＥＨＲＤＩＮＡＡＮＮＩＩＳＫＧＬＳＬＦＧＶＧＮＩＨＡＤＦＫＥＱＳＬＳＣ（配列番号：４）

【0064】

ＩＳ６０９（ＩＳ６０５ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４０２；ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡ０００００７から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ６０９
ＭＫＲＬＱＡＦＫＦＱＬＲＰＧＧＱＱＥＲＥＭＲＲＦＡＧＡＣＲＦＶＦＮＲＡＬＡＬＱＮＥＮＨＥＡＧＮＫＹＩＰＹＧＫＭＡＳＷＬＶＥＷＫＮＡＴＥＴＱＷＬＫＤＡＰＳＱＰＬＱＱＳＬＫＤＬＥＲＡＹＫＮＦＦＲＫＲＡＡＦＰＲＦＫＫＲＧＱＮＤＡＦＲＹＰＱＧＶＫＬＤＱＥＮＳＲＩＦＬＰＫＬＧＷＭＲＹＲＮＳＲＱＶＴＧＶＶＫＮＶＴＡＳＱＳＣＧＫＷＹＩＳＩＱＴＥＮＥＶＳＴＰＶＨＰＳＡＬＭＶＧＬＤＡＧＶＡＫＬＡＴＬＳＤＧＴＶＦＧＰＶＮＳＦＱＫＮＱＫＴＬＡＲＬＱＲＱＬＳＲＫＶＫＦＳＮＮＷＱＫＱＫＲＫＩＱＲＬＨＳＣＩＡＮＩＣＲＤＹＬＨＫＶＴＴＴＶＳＫＮＨＡＭＩＶＩＥＤＬＫＶＳＮＭＳＫＳＡＡＧＴＶＳＱＰＧＲＮＶＲＡＫＳＧＬＮＲＳＩＬＤＱＧＷＹＥＭＲＲＱＬＥＹＫＱＬＷＲＧＧＱＶＬＡＶＰＰＡＹＴＳＱＲＣＡＣＣＧＨＴＡＫＥＮＲＬＳＱＳＫＦＲＣＱＡＣＧＹＴＡＮＡＤＶＮＧＡＲＮＩＬＡＡＧＨＡＶＬＡＣＧＥＭＶＱＳＧＲＰＬＫＱＥＰＴＥＭＩＱＡＴＡ（配列番号：５）

【0065】

ＩＳ１３４１（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３６９；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｄ３８７７８
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ１３４１
ＭＡＮＫＡＹＱＦＲＬＹＰＴＫＥＱＥＱＬＬＡＫＴＦＧＣＶＲＦＶＹＮＫＭＬＥＥＲＩＱＭＦＥＫＦＫＤＤＱＥＳＬＫＱＱＴＣＰＴＰＡＫＹＫＫＥＦＰＷＬＫＥＶＤＳＬＡＬＡＮＡＱＬＮＬＱＫＡＦＱＨＦＦＳＧＲＡＧＦＰＫＦＫＮＲＫＡＫＱＳＹＴＴＮＭＶＮＧＮＩＫＬＳＤＧＹＩＫＬＰＫＬＫＷＩＫＬＫＱＨＲＥＩＰＡＨＨＩＩＫＳＣＴＩＴＫＴＫＴＧＫＹＹＩＳＩＬＴＥＹＥＨＱＰＡＰＫＥＶＱＴＶＶＧＬＤＦＳＭＳＴＬＹＶＤＳＥＧＫＲＡＮＹＰＲＦＹＲＫＡＬＥＴＬＡＫＥＱＲＫＷＳＲＫＫＫＧＳＮＲＷＨＫＱＲＬＫＶＡＫＬＨＥＫＩＡＮＱＲＫＤＦＬＨＫＥＳＨＫＬＡＫＲＹＤＣＶＶＩＥＤＬＮＭＫＧＭＳＱＡＬＨＦＧＱＧＶＨＤＮＧＷＧＭＦＴＴＦＬＱＹＫＬＶＥＱＧＫＫＬＩＫＩＤＫＷＦＰＳＳＫＴＣＳＣＣＧＲＶＫＥＳＬＳＬＳＥＲＴＦＲＣＥＣＧＦＥＳＤＲＤＶＮＡＡＩＮＩＫＨＥＧＭＫＲＬＡＩＶ（配列番号：６）

【0066】

ＩＳＣ１３１６（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３９３；ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＣ＿００２７５４から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＣ１３１６
ＭＰＴＬＧＦＲＦＲＡＹＴＤＥＱＴＬＲＡＬＫＡＱＬＫＬＴＣＥＩＹＮＴＬＲＷＡＤＩＹＦＹＱＲＤＧＫＧＬＴＱＴＥＬＲＱＬＡＬＤＬＲＫＱＤＤＥＹＫＱＬＹＳＱＶＶＱＱＶＡＤＲＹＳＥＡＫＫＲＦＦＥＧＬＡＲＦＰＫＥＫＫＰＨＫＹＹＳＬＶＹＴＱＳＧＷＫＩＬＨＶＲＥＩＲＫＧＫＫＮＫＫＫＬＩＴＬＫＬＳＮＬＧＴＦＫＶＩＶＨＲＤＦＰＬＤＫＶＫＲＶＶＶＫＬＴＲＳＥＲＩＹＩＴＦＶＶＤＨＥＦＰＫＬＰＮＴＧＫＶＶＡＩＤＶＧＶＥＫＬＬＩＴＳＤＧＥＹＦＰＮＬＲＰＹＥＫＡＬＷＫＶＫＨＩＨＲＥＬＳＲＫＫＦＬＳＮＮＷＦＫＡＫＶＫＬＡＲＡＹＥＨＬＫＮＬＲＴＤＬＹＭＫＬＧＫＷＦＡＥＨＹＤＶＶＶＭＥＧＩＨＡＫＱＬＶＧＫＳＬＲＳＬＲＲＲＬＳＤＶＧＦＧＥＬＲＧＶＬＫＹＱＬＥＫＹＧＫＫＬＩＬＶＮＰＡＹＴＳＫＴＣＡＲＣＧＹＶＫＮＤＬＳＬＳＤＲＶＦＶＣＰＮＣＧＷＩＡＤＲＤＹＮＡＳＬＮＩＬＲＧＳＧＳＥＲＰＬＶＷＳＳＡＬＹＱＹＳＧＫＶＧＬ（配列番号：７）

【0067】

ＩＳ８９１（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４０１；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｍ２４８５５から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ８９１
ＭＬＶＦＥＴＫＬＥＧＴＮＥＱＹＱＬＬＭＲＲＬＫＬＬＶＬＳＮＡＣＬＲＴＷＩＧＱＰＮＩＧＲＹＤＬＳＡＹＣＡＶＬＬＰＭＫＴＦＲＳＬＰＮＳＴＬＷＬＤＫＬＬＬＫＥＲＧＶＱＬＬＧＦＬＴＩＡＳＫＴＫＰＧＲＫＶＩＨＡＬＫＫＮＲＲＭＧＶＬＳＩＫＬＡＡＧＳＬＶＶＴＶＡＹＶＴＦＳＤＧＦＫＡＧＴＦＫＬＷＧＴＲＤＬＨＦＹＱＬＫＱＦＫＲＶＲＶＶＲＲＡＤＧＹＹＡＱＦＣＩＤＱＥＲＶＥＲＲＥＰＴＬＫＴＩＧＬＤＶＧＬＮＨＦＬＴＤＳＥＧＮＴＶＥＮＰＲＨＬＲＫＳＥＫＳＬＫＲＬＱＲＲＬＳＫＴＫＫＧＳＮＮＲＶＫＡＲＮＲＬＳＲＫＨＬＫＶＳＲＱＲＫＤＦＡＶＫＬＡＲＣＶＶＱＳＳＤＬＶＡＹＥＤＬＱＶＲＮＭＶＲＮＲＨＬＡＫＳＩＳＤＡＡＷＴＱＦＲＱＷＶＥＹＦＧＫＶＦＧＶＶＴＶＡＶＰＰＨＨＴＳＱＮＣＳＮＣＧＥＶＶＫＫＳＬＳＴＲＴＨＡＣＰＨＣＧＨＩＱＤＲＤＷＮＡＡＲＮＩＬＥＬＧＬＲＴＶＧＨＴＧＳＱＶＳＧＤＩＤＬＣＬＧＥＶＴＰＰＮＫＳＳＲＧＫＲＫＰＫＫ（配列番号：８）

【0068】

ＩＳＥｃ４２（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３７６；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００４４３１から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＥｃ４２
ＭＫＲＡＹＫＹＲＦＹＰＴＴＥＱＡＥＬＬＡＱＴＦＧＣＶＲＦＶＹＮＳＩＬＲＷＲＴＤＡＹＹＥＲＫＥＫＩＧＹＬＱＡＮＡＲＬＴＡＬＫＫＥＰＥＹＩＷＬＮＤＶＳＣＶＰＬＱＱＳＬＲＨＱＱＡＡＦＡＮＦＦＡＧＲＡＡＹＰＡＦＫＳＫＲＨＫＱＶＡＥＦＴＡＳＡＦＫＨＲＤＧＥＬＹＩＡＫＳＫＳＰＬＤＶＲＷＳＲＥＬＰＳＡＰＳＴＶＴＩＳＲＤＳＡＧＲＹＦＶＳＣＬＣＥＦＥＰＶＳＭＰＶＴＡＫＴＶＧＩＤＶＧＬＫＤＬＦＶＴＤＴＧＦＫＴＤＮＰＲＨＴＡＫＹＡＫＲＬＴＬＬＱＲＲＬＳＲＫＱＫＧＳＲＮＲＩＫＡＲＬＫＶＡＲＬＨＡＫＩＡＤＣＲＭＤＮＬＨＫＬＳＲＫＬＩＮＥＮＱＶＶＣＶＥＳＬＫＶＫＮＭＩＲＮＰＫＬＳＫＡＩＡＤＡＧＷＳＥＬＶＲＱＬＱＹＫＧＫＷＡＧＲＳＶＶＡＩＤＱＹＬＰＳＳＫＣＣＳＣＣＧＦＴＭＱＫＭＰＬＮＶＲＫＷＨＣＰＥＣＧＡＤＨＤＲＤＩＮＡＡＲＮＩＫＡＡＧＬＡＶＬＡＨＧＥＰＶＮＰＥＳＱＨＡＡ（配列番号：９）

【0069】

ＩＳＴｅｌ３（ＩＳ１３４１ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３９３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００４１１３から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＴｅｌ３
ＭＲＧＶＥＫＡＦＳＹＲＦＹＰＴＴＥＱＥＳＬＬＲＫＴＬＧＣＶＲＬＶＹＮＲＡＬＡＡＲＴＥＡＷＹＥＲＫＥＲＬＤＹＶＱＴＳＡＬＬＴＱＷＫＫＱＤＤＬＱＦＬＮＥＶＳＣＶＰＬＱＱＡＬＲＨＬＱＳＡＦＴＮＦＦＡＧＲＡＫＹＰＮＦＫＫＫＲＮＧＧＳＡＥＦＴＫＳＡＦＲＷＫＤＧＫＶＦＬＡＫＣＮＥＰＬＮＩＰＷＳＲＲＬＰＤＧＶＥＰＳＴＶＴＩＲＬＮＰＡＧＱＷＹＩＳＬＲＦＤＤＰＲＥＬＴＬＱＰＶＤＰＳＶＧＬＤＶＧＭＳＳＬＩＴＬＳＴＧＥＫＩＡＮＰＫＨＦＮＲＹＹＫＲＬＲＫＡＱＲＳＬＳＲＫＱＫＧＳＲＮＷＤＫＡＲＬＫＶＡＫＩＨＱＫＩＳＤＳＲＫＤＨＬＨＱＬＴＴＲＬＩＲＥＮＱＴＩＩＩＥＳＬＡＶＫＮＭＶＫＮＲＱＬＡＲＳＩＳＤＡＧＷＧＥＬＶＲＱＬＥＹＫＡＱＷＹＧＲＴＬＶＫＩＤＲＷＦＰＳＳＫＲＣＧＱＣＧＨＩＶＥＷＬＰＬＳＶＲＥＷＤＣＰＫＣＧＡＨＨＤＲＤＩＮＡＡＧＮＩＬＡＶＧＨＴＶＴＶＣＧＡＧＶＲＰＤＲＨＴＳＧＧＱＬＲＲＮＲＫＳＱＫ（配列番号：１０）

【0070】

ＩＳ６０７（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４１９；ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１８９０１５から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ６０７
ＭＳＡＩＳＩＴＨＫＩＡＬＫＰＮＮＫＨＩＴＹＦＫＫＡＦＧＣＡＲＦＡＹＮＷＧＬＡＫＷＫＥＮＹＱＬＧＩＫＴＳＨＬＱＬＫＫＥＦＮＡＬＫＫＳＱＦＮＦＶＹＥＶＴＫＹＡＴＱＱＰＦＩＨＬＮＬＡＦＮＫＦＦＲＤＬＥＫＧＬＶＳＹＰＫＦＫＫＫＲＥＦＱＧＳＦＹＩＧＧＤＱＩＫＩＩＱＴＡＮＴＤＹＬＫＩＰＮＬＰＰＩＫＬＴＥＫＬＲＦＱＧＫＩＨＮＡＴＩＴＱＫＧＤＨＦＹＶＳＩＳＣＤＩＤＥＳＥＹＫＲＴＨＫＬＱＥＳＨＮＫＬＧＩＤＩＧＩＫＳＦＶＳＬＳＮＧＬＮＩＹＡＰＫＰＬＤＫＬＴＲＫＬＶＲＩＳＲＱＬＳＫＫＩＨＰＫＴＫＧＤＫＴＲＫＳＮＮＹＬＫＨＳＫＫＬＴＨＬＨＥＫＩＡＮＩＲＬＤＦＬＨＫＬＴＳＳＬＩＲＨＳＮＳＦＣＬＥＳＬＫＶＫＮＭＦＫＮＨＲＬＡＫＳＬＳＤＩＳＭＳＶＦＮＴＬＬＥＹＫＡＫＹＳＮＫＥＩＬＲＡＤＴＹＹＰＳＳＫＴＣＳＮＣＱＫＶＫＱＤＬＫＬＫＤＲＩＹＱＣＬＥＣＧＦＥＬＤＲＤＩＮＡＡＩＮＬＬＫＨＬＶＧＲＶＴＡＥＦＴＰＭＤＬＴＡＬＬＮＤＬＳＮＮＲＬＡＴＳＫＶＥＬＧＩＱＱＫＳ（配列番号：１１）

【0071】

ＩＳＴｓｉ１（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：３９３；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿０１２８８３から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＴｓｉ１
ＭＰＳＥＴＩＫＬＡＳＫＦＫＬＫＥＴＰＥＧＬＮＥＬＦＳＴＹＲＤＩＶＮＦＬＩＴＨＡＦＥＮＮＩＴＳＦＹＲＬＫＫＥＩＹＫＳＬＲＫＥＹＰＥＬＰＳＨＹＩＹＴＡＣＱＭＡＡＳＩＹＫＳＹＲＫＲＫＲＲＧＫＡＳＧＲＰＶＦＫＫＥＡＩＭＬＤＤＨＬＦＫＬＤＬＥＫＧＩＩＫＬＳＴＰＮＧＲＩＴＬＫＦＹＰＡＫＨＨＥＫＦＫＮＷＫＶＧＱＡＷＬＶＲＴＰＫＧＶＦＩＮＶＶＦＳＫＥＶＥＶＫＥＰＥＤＦＶＧＶＤＬＮＥＮＮＶＴＬＳＬＳＤＧＥＦＶＱＩＩＴＨＥＫＥＩＲＴＧＹＦＶＫＲＲＫＩＱＫＫＶＫＶＧＫＫＲＱＥＬＬＥＫＹＧＥＲＥＲＮＲＬＮＤＬＹＨＫＬＡＮＫＩＶＥＬＡＥＫＹＧＧＩＡＬＥＤＬＴＥＩＲＮＳＩＲＹＳＡＥＭＮＧＲＬＨＲＷＳＦＲＫＬＱＳＩＩＥＹＫＡＫＬＫＧＶＥＶＶＦＶＤＰＡＹＴＳＳＬＣＰＶＣＧＥＫＬＳＰＮＧＨＲＶＬＫＣＬＮＣＧＦＥＡＤＲＤＶＶＧＳＷＮＶＲＬＲＡＬＫＭＷＧＶＳＶＰＰＥＳＰＰＭＫＭＧＧＧＫＡＳＲＧＤＶＹＥＬＹＴＮＹＧ（配列番号：１２）

【0072】

ＩＳ１５３５（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。
長さ：５５０；ＮＣＢＩアクセッション番号Ｚ９５２１０から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳ１５３５
ＭＩＶＲＭＲＳＣＡＱＡＡＫＶＡＥＡＴＧＧＶＱＬＡＧＫＰＫＰＤＧＴＰＴＦＳＲＹＶＥＩＧＶＤＦＥＡＨＲＰＶＶＥＳＶＳＶＬＦＥＬＹＤＧＤＡＮＳＹＡＡＴＧＧＰＧＡＱＬＰＳＧＷＭＶＴＡＡＫＦＥＶＥＷＰＡＤＰＱＲＡＧＬＶＲＳＨＦＧＡＲＲＫＡＦＮＷＧＬＡＱＶＫＡＤＬＤＡＫＡＡＤＰＡＨＥＳＶＤＷＤＬＫＳＬＲＷＡＷＮＲＡＫＤＤＶＡＰＷＷＡＥＮＳＫＥＣＹＳＳＧＬＡＤＬＡＱＧＬＡＮＷＫＡＧＫＮＧＴＲＫＧＲＲＶＧＦＰＲＦＫＳＧＲＲＤＰＧＲＶＲＦＴＴＧＴＭＲＩＥＤＤＲＲＴＩＴＶＰＶＩＧＰＬＲＡＫＥＮＴＲＲＶＱＲＨＬＶＳＧＲＡＱＩＬＮＭＴＬＳＱＲＷＧＲＬＦＶＡＶＣＹＡＬＲＴＰＴＴＲＳＰＬＴＱＰＴＶＲＡＧＭＤＬＧＶＲＴＬＡＴＶＡＴＬＤＴＡＴＧＥＱＴＩＩＥＹＰＮＰＡＰＬＫＡＴＬＶＡＲＲＲＡＧＲＥＬＳＲＲＩＰＧＳＨＧＨＲＡＶＫＡＫＬＡＲＬＤＲＲＣＶＨＬＲＲＥＡＡＨＱＬＴＴＥＬＡＧＴＹＧＱＶＶＩＥＤＬＤＶＡＡＭＫＲＳＭＲＲＲＡＦＲＲＳＶＳＤＡＡＭＧＬＶＡＰＱＬＡＹＫＴＡＫＣＳＧＶＬＴＶＡＤＲＷＦＡＳＳＱＩＨＨＧＣＴＳＰＤＧＴＰＣＲＬＱＧＫＧＲＩＤＫＨＬＬＣＰＶＴＧＥＶＶＤＲＤＲＮＡＡＬＮＬＲＤＷＰＤＮＡＳＲＧＰＶＧＴＴＡＰＳＡＰＧＰＴＴＴＶＧＴＧＨＧＡＤＴＧＳＳＧＡＧＧＡＳＶＲＰＲＰＲＲＡＧＲＧＥＡＫＴＱＴＰＱＧＤＡＡ（配列番号：１３）

【0073】

ＩＳＢｌｏ１２（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。
長さ：４４０；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００４３０７から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＢｌｏ１２
ＭＳＡＹＥＡＶＲＩＲＬＤＰＴＰＲＱＴＲＬＬＥＳＨＡＧＧＡＲＦＡＹＮＬＭＬＡＨＶＲＲＱＩＳＬＧＥＫＰＤＷＴＬＹＡＭＲＲＷＷＮＥＷＫＤＥＩＡＰＷＷＲＥＮＳＫＥＡＹＧＳＡＦＥＷＬＳＱＡＬＲＮＷＳＤＳＲＫＧＲＲＡＧＲＲＶＧＷＰＫＹＫＳＫＲＳＳＶＰＲＦＡＹＴＴＧＳＦＧＬＩＥＤＤＰＫＡＬＲＬＰＲＩＧＲＶＨＣＭＥＮＡＴＥＲＶＨＧＲＲＩＶＲＭＴＶＳＲＨＡＧＦＷＹＡＡＬＴＶＥＲＰＴＥＳＶＰＡＫＮＲＫＲＫＮＨＤＲＱＶＧＶＤＬＧＶＲＴＬＡＴＬＳＤＧＴＴＦＰＮＰＲＮＹＶＲＴＱＲＫＬＲＨＡＱＱＳＬＳＲＲＤＲＧＭＳＨＧＣＧＳＫＲＹＮＲＡＬＥＲＶＲＲＩＨＡＲＩＡＡＱＲＡＤＮＩＧＫＬＴＴＷＬＡＤＮＹＳＤＩＳＩＥＤＬＮＶＱＧＭＳＨＮＲＲＬＡＫＨＩＬＤＡＤＦＨＥＦＲＲＱＬＥＹＫＴＡＲＡＧＴＲＬＨＶＩＤＲＷＹＰＳＳＫＴＣＳＮＣＧＴＶＫＡＫＬＳＬＳＥＲＶＹＨＣＥＥＣＧＬＶＩＤＲＤＶＮＡＡＩＮＩＱＶＡＧＳＡＰＥＴＬＮＡＲＧＧＳＶＧＱＴＲＬＥＣＧＴＭＲＨＰＡＫＲＥＰＳＧＧＤＳＲＶＲＬＧＡＧＬＧＮＥＡＭＱＭＴＳＬ（配列番号：１４）

【0074】

ＩＳＣ１９２６（ＩＳ６０７ファミリー）ＴｎｐＢタンパク質。長さ：４１２；ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ６７１９４８から
ＩＳファインダーデータベースエントリ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｓｆｉｎｄｅｒ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｆｉｃｈｅＩＳ．ｐｈｐ？ｎａｍｅ＝ＩＳＣ１９２６
ＭＥＲＴＩＫＬＲＶＲＶＤＹＩＴＹＳＡＬＫＥＶＥＧＥＹＲＥＶＬＥＤＡＩＮＹＧＬＳＮＫＴＴＳＦＴＲＩＫＡＧＶＹＫＴＥＲＥＫＨＫＤＬＰＳＨＹＩＹＴＡＣＥＤＡＳＥＲＬＤＳＦＥＫＬＫＫＲＧＲＳＹＴＥＫＰＳＶＲＫＶＴＶＨＬＤＤＨＬＷＫＦＳＬＤＫＩＳＩＳＴＭＱＧＲＶＦＩＳＰＴＦＰＫＩＦＷＲＹＹＮＴＥＷＲＩＡＳＥＡＲＦＫＬＬＫＧＮＶＶＥＦＦＩＶＦＫＲＤＥＰＫＰＹＥＰＫＧＦＩＰＶＤＬＮＥＤＳＶＳＶＬＶＤＧＫＰＭＬＬＥＴＮＴＫＲＩＴＬＧＹＥＹＲＲＫＡＩＴＴＲＲＳＡＥＤＲＥＶＫＲＫＬＫＲＬＲＥＲＤＫＫＶＶＩＲＲＫＬＡＫＬＩＶＫＥＡＦＥＳＭＳＡＩＶＬＥＡＬＰＲＲＰＰＥＨＭＩＫＤＶＫＤＳＱＬＲＬＲＩＹＲＳＡＦＳＳＭＫＮＡＩＩＥＫＡＫＥＦＲＶＰＶＶＬＶＮＰＳＹＴＳＳＴＣＰＩＨＧＡＫＩＶＹＱＰＤＧＧＤＡＰＲＶＧＶＣＥＫＧＫＥＫＷＨＲＤＶＶＡＬＹＮＬＲＫＲＡＧＤＶＳＰＶＰＬＧＳＫＥＳＨＤＰＰＴＶＫＬＧＲＷＬＲＡＫＳＬＨＳＩＭＮＥＨＫＭＩＥＭＫＶ（配列番号：１５）

【0075】

ＴｎｐＢタンパク質を含むタンパク質は、追加的に、１又は複数のエフェクター分子を含み得、特に、ＴｎｐＢタンパク質に共有結合で連結されて融合タンパク質を形成する１又は複数のエフェクター分子を含み得る。本開示による融合タンパク質は下で更に論述される。

【0076】

本開示はまた、本明細書に記載されるＴｎｐＢタンパク質を含む、それから本質的に成る、又はそれから成るタンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡに関連し、タンパク質はそれから発現によって産生され得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの発現は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで発生し得る。

【0077】

不活性ＴｎｐＢタンパク質
エフェクター複合体において使用されるタンパク質はまた、部分的に又は完全にそのヌクレアーゼ活性が不活性化されている変異体ＴｎｐＢタンパク質を含み得る、それから本質的に成り得る、又は、それから成り得る。そのようなタンパク質は、ＴｎｐＢのヌクレアーゼ活性に影響を与えるタンパク質のＲｕｖＣ様ドメインにおける１又は複数の変異を有する。特に、ヌクレアーゼ活性を除去するＲｕｖＣ様ドメインにおける点変異は、当技術分野において既に知られており、変異体Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）を生成するために使用されている。ＦｎＣｐｆ１の変異Ｄ９１７Ａ及びＥ１００６Ａは、ＦｎＣｐｆ１の切断活性を完全に不活性化するが、変異Ｄ１２２５Ａは核酸分解活性を著しく低減したことが報告された（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＴｎｐＢタンパク質のＲｕｖＣ様ドメインにおける同様の重要な残基の変異はまた、ＴｎｐＢのヌクレアーゼ機能を除去し、本明細書に記載される不活性化された変異体ＴｎｐＢタンパク質を生成するために使用され得る。上に記載されるように、また、図１２に示されるように、ＴｎｐＢタンパク質のＲｕｖＣ様ドメインは典型的には、変異され得る保存されたＤ－－－Ｅ－－－Ｄモチーフを含む。配列番号：１～１５の各々におけるこれらの残基の場所は、図１２に示される。例えば、配列番号：１（ＩＳＤｒａ２からのＴｎｐＢタンパク質）において、これらは、Ｄ１９１、Ｅ２７８、及びＤ３６１である。他のＴｎｐＢタンパク質における同等の残基は、配列アライメントツール、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ配列アライメントプログラム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）を使用して識別され得る（Ｍａｄｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。

【0078】

従って、一例において、不活性の変異体ＴｎｐＢタンパク質は、ヌクレアーゼ活性が不活性化又は部分的に不活性化されるように、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアミノ酸残基の変異を伴う、本明細書に記載されるＴｎｐＢタンパク質を含み得る。特に、変異は、保存されたＤ－－－Ｅ－－－Ｄモチーフにおけるアミノ酸残基のうちの１、２、又は３つであり得る。

【0079】

特定の例において、変異体ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有し、ここで、配列は、ＲｕｖＣ様ドメインが不活性化又は部分的に不活性化されるように、配列番号：１の位置Ｄ１９１、Ｅ２７８、及びＤ３６１のうちの少なくとも１つにおいて変異される。

【0080】

ＭＩＲＮＫＡＦＶＶＲＬＹＰＮＡＡＱＴＥＬＩＮＲＴＬＧＳＡＲＦＶＹＮＨＦＬＡＲＲＩＡＡＹＫＥＳＧＫＧＬＴＹＧＱＴＳＳＥＬＴＬＬＫＱＡＥＥＴＳＷＬＳＥＶＤＫＦＡＬＱＮＳＬＫＮＬＥＴＡＹＫＮＦＦＲＴＶＫＱＳＧＫＫＶＧＦＰＲＦＲＫＫＲＴＧＥＳＹＲＴＱＦＴＮＮＮＩＱＩＧＥＧＲＬＫＬＰＫＬＧＷＶＫＴＫＧＱＱＤＩＱＧＫＩＬＮＶＴＶＲＲＩＨＥＧＨＹＥＡＳＶＬＣＥＶＥＩＰＹＬＰＡＡＰＫＦＡＡＧＶＤＶＧＩＫＤＦＡＩＶＴＤＧＶＲＦＫＨＥＱＮＰＫＹＹＲＳＴＬＫＲＬＲＫＡＱＱＴＬＳＲＲＫＫＧＳＡＲＹＧＫＡＫＴＫＬＡＲＩＨＫＲＩＶＮＫＲＱＤＦＬＨＫＬＴＴＳＬＶＲＥＹＥＩＩＧＴＥＨＬＫＰＤＮＭＲＫＮＲＲＬＡＬＳＩＳＤＡＧＷＧＥＦＩＲＱＬＥＹＫＡＡＷＹＧＲＬＶＳＫＶＳＰＹＦＰＳＳＱＬＣＨＤＣＧＦＫＮＰＥＶＫＮＬＡＶＲＴＷＴＣＰＮＣＧＥＴＨＤＲＤＥＮＡＡＬＮＩＲＲＥＡＬＶＡＡＧＩＳＤＴＬＮＡＨＧＧＹＶＲＰＡＳＡＧＮＧＬＲＳＥＮＨＡＴＬＶＶ（配列番号：１、太字で示される位置Ｄ１９１、Ｅ２７８、及びＤ３６１）
他の例において、変異体ＴｎｐＢタンパク質は、配列番号：２～１５の１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を有し、ここで、配列は、ＲｕｖＣ様ドメインが不活性化又は部分的に不活性化されるように、図１２に示される枠で囲まれたアミノ酸残基のうちの少なくとも１つにおいて変異される。

【0081】

不活性ＴｎｐＢタンパク質を含むエフェクター複合体は、単純に、ポリヌクレオチドにおける標的部位を含む特定の標的領域をブロックするために、例えば、領域における転写を妨害するために使用され得る。それらはまた、例えば、標的部位に対するエフェクター複合体の結合が検出システムの物理的又は化学的特性の測定可能な変化を生じさせる方法において（例えばバイオセンサーの文脈において）、試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を検出するために使用され得る。

【0082】

不活性ＴｎｐＢタンパク質はまた、１又は複数のエフェクター分子を含むエフェクター複合体において使用され得る。これらの態様において、ＴｎｐＢタンパク質は、１又は複数のエフェクター分子をポリヌクレオチドにおける特定の標的領域へ送達するために、１又は複数のエフェクター分子（「１又は複数のカーゴ分子」とも名付けられ得る）のための担体になる。一例において、１又は複数のエフェクター分子（特に、タンパク質ベースであるエフェクター分子、例えば、酵素又はタンパク質標識様蛍光タンパク質であるとき）は、ＴｎｐＢ（下で更に論述される）との融合タンパク質の部分として「保持」され得る。代替的に、又は追加的に、１又は複数のエフェクター分子は、ＲＮＡの部分として「保持」され、又は、下で更に記載されるＲＮＡに結合され得る。

【0083】

本開示はまた、本明細書に記載される不活性ＴｎｐＢタンパク質を含む、それから本質的に成る、又はそれから成るタンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡに関連し、タンパク質はそれから発現によって産生され得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの発現は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで発生し得る。

【0084】

ＴｎｐＢ融合タンパク質
上に記載されるように、エフェクター複合体は、ＴｎｐＢタンパク質との融合タンパク質の形態で１又は複数のエフェクター分子を保持し得る。本開示のそのような例において、エフェクター複合体のタンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、及び、ＴｎｐＢタンパク質のＮ又はＣ末端に融合された１又は複数のエフェクター分子を含む。エフェクター複合体における融合タンパク質の所望の機能に応じて、融合タンパク質は、ＴｎｐＢタンパク質、又は、活性ヌクレアーゼドメインを含まない、上で識別された不活性（変異体）ＴｎｐＢタンパク質を含み得る。

【0085】

１又は複数のエフェクター分子は、核輸送による細胞の核内へのタンパク質の輸送を補助する１又は複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。特に、そのようなＮＬＳは、標的ポリヌクレオチドが細胞の核であるときに使用され得る。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質がＲＮＡと複合体を形成するときにそれらがタンパク質表面上に露出されるように、タンパク質のＮ又はＣ末端に又はその近くに存在する、正に荷電したリシン又はアルギニンの短い配列である。ＮＬＳの非限定的な例は、ＳＶ４０ラージＴ抗原からの配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：１８）、及び、約１０アミノ酸（例えば、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ－配列番号：１９）のスペーサーによって分離される２つのクラスターの塩基性アミノ酸ＫＲ及び４つのＫ残基を含むヌクレオプラスミンの二分ＮＬＳを含む。他のＮＬＳが当技術分野において知られている。

【0086】

エフェクター複合体がどのように細胞に送達されるかに応じて、融合タンパク質はまた、細胞膜透過ペプチド（細胞内への融合タンパク質の取り込みを促進する短いペプチド）を含み得る。

【0087】

更に、又は代替的に、融合タンパク質は、１又は複数のエフェクター分子を含み得る。１又は複数のエフェクター分子は、標的領域におけるポリヌクレオチドを改変可能な１又は複数のエフェクター分子；標的領域の転写を増加又は減少させることが可能な１又は複数のトランス作用因子である１又は複数のエフェクター分子；及び／又は、標的領域を標識可能な１又は複数のエフェクター分子であり得る。

【0088】

Ｃａｓ９及びＣａｓ１２融合タンパク質を利用して、１又は複数のエフェクター分子を標的領域へ送達する方法が当技術分野において既に知られている（例えば、Ｋｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１８、及び、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０に記載されている）。同様の成分がＴｎｐＢタンパク質又は不活性ＴｎｐＢタンパク質に融合され得る。特に、小サイズのＴｎｐＢは、融合タンパク質の生成のための良い足場となる。

【0089】

特に、１又は複数のエフェクター分子は、エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ベースエディター、エピジェネティック修飾子、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、及び逆転写酵素から選択され得る。特に、ベースエディターがデアミナーゼである場合、シチジンデアミナーゼ及び／又はアデノシンデアミナーゼであり得る。シチジンデアミナーゼを含む融合タンパク質はまた、ウラシルグリコシラーゼインヒビターを含み得る。

【0090】

標的領域の標識のための１又は複数のエフェクター分子が融合タンパク質において利用され得る。標識は、ガイドＲＮＡが標的配列にハイブリダイズしたときにエフェクター複合体を検出するために使用され得るＧＦＰなどのレポーター酵素又は蛍光タンパク質であり得る。

【0091】

標的領域の転写又は翻訳を増加又は減少させるための１又は複数のエフェクター分子が、融合タンパク質において利用され得る。これらは、１又は複数の転写活性化因子又は１又は複数の転写抑制因子であり得る。

【0092】

本開示はまた、ＴｎｐＢタンパク質（又は不活性ＴｎｐＢタンパク質）及び本明細書に記載の１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡに関連し、融合タンパク質はそれらから発現によって産生され得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの発現は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで発生し得る。

【0093】

エフェクター複合体において使用されるＲＮＡ
本開示はまた、ＴｎｐＢタンパク質に結合してエフェクター複合体を形成することが可能であり、かつ、エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へガイド又は誘導し得るＲＮＡに関連する。

【0094】

特に、本開示は、以下を含むＲＮＡを提供する：
（ｉ）ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合してエフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント、及び
（ｉｉ）ポリヌクレオチドの標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント。

【0095】

ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、ＴｎｐＢタンパク質と相互作用し、ＲＮＡをＴｎｐＢタンパク質に結合させ、エフェクター複合体を形成する。タンパク質結合セグメントは、ＲＮＡ二次構造を形成することが可能な配列を含み得る。タンパク質結合セグメントは、少なくとも１つの逆位反復配列、すなわち、その逆相補配列が下流に続く配列セクションを含み得、それにより、２つのセクションは、ハイブリダイズして、ヘアピン、不完全なヘアピン、又は、他の二次ＲＮＡ構造などの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）デュプレックスを形成することが可能である。特に、１又は複数の逆位反復配列は、１又は複数の少なくとも部分的に回文構造である配列であり得、それにより、配列は、少なくとも１つのヘアピン又は少なくとも１つの不完全なヘアピン（ステムループ又はヘアピンループとも称され得る）を形成することが可能である。

【0096】

タンパク質結合セグメントは、ＩＳ２００／ＩＳ６０５又はＩＳ６０７ファミリーにおける挿入配列の右端（ＲＥ）からの（ＲＥ ＤＮＡ配列におけるチミン残基がウラシル残基によって置換される）配列を含み得る。ＲＥ配列は、ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーにおける可動遺伝因子からの不完全な回文配列であり得る。ＲＥ配列は、ｔｎｐＢ遺伝子の末端配列の一部を組み込み得る。ＲＥ配列は、エフェクター複合体におけるＴｎｐＢタンパク質の由来であるｔｎｐＢと同一の可動遺伝因子からのものであり得る。特定の挿入配列のＲＥ配列は、当技術分野において知られ得る（例えば、上で参照された配列番号：１から１５を有するＴｎｐＢタンパク質と同一の挿入配列からのものなど、ＩＳｆｉｎｄｅｒデータベースにおいて入手可能であり得る）。代替的に、ＲＥ配列は、転位中にｔｎｐＢ遺伝子と共に移動する挿入配列の右端のシーケンシングに基づいて判定され得る。タンパク質結合セグメントにおいて使用され得るＲＥ配列のセクションは、完全な挿入配列を有する（任意選択的に、これが挿入配列に存在する不活性化されたｔｎｐＡ遺伝子を有する）好適な宿主細胞（大腸菌など）においてｔｎｐＢ遺伝子が共発現され、続いて、例えば本明細書の例１に記載されるようにスモールＲＮＡシーケンシングによってＴｎｐＢ結合ＲＮＡが特性評価されるアッセイにおいて判定され得る。

【0097】

一例において、タンパク質結合セグメントは、配列番号：１６、ＧＡＡＵＣＡＣＧＣＧＡＣＵＵＵＡＧＵＣＧＵＧＵＧＡＧＧＵＵＣＡＡ（図１Ｄに示される不完全なヘアピンを形成することが可能である）を含む又はそれから成る。この配列は挿入配列ＩＳＤｒａ２のＲＥからのものである。従って、好ましくは、上に記載されたタンパク質が、配列番号：１のアミノ酸配列（ＩＳＤｒａ２のｔｎｐＢ遺伝子からのものである）を伴うＴｎｐＢタンパク質を含む場合、ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは配列番号：１６を含む、又はそれから成る。

【0098】

ＲＮＡのポリヌクレオチドターゲティングセグメントは、ポリヌクレオチドの標的領域における標的配列にハイブリダイズすることが可能な、すなわち相補的であるガイド配列を含む。ＲＮＡのこのセグメントは、ポリヌクレオチドにおける標的領域へエフェクター複合体を誘導する、又は標的とするように作用する。

【0099】

ＲＮＡがハイブリダイズする標的配列は、一本鎖ＤＮＡであり得るか、又は、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。エフェクター複合体が変異体／不活性ＴｎｐＢを含み、標的領域をブロックするために、又は、１又は複数のエフェクタータンパク質を標的領域へ送達するために使用される例において、ＤＮＡがハイブリダイズする標的配列はＲＮＡであり得る。（本明細書に記載されるように、標的配列を含むポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである場合、ポリヌクレオチドの部位特異的切断が発生する場所が、ガイド配列及び標的配列の間の相補的塩基対、及び、ＴｎｐＢタンパク質と相互作用する短いＴｎｐＢ会合配列モチーフ（ＴＡＭ）の両方によって判定される。）ＲＮＡのガイド配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さ、又は、１５～２５ヌクレオチドの長さであり得、エフェクター複合体が使用されている特定の条件下においてガイド配列及び標的配列の間のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な標的配列に対する相補性を有する。大部分の状況において、８０％又はより高い高度の相補性が好ましい。

【0100】

ＲＮＡの２つのセグメントは、単一のＲＮＡ分子として共有結合により連結され、任意選択的に、２つのセグメントを分離する介在リンカーリボヌクレオチドがあり得る。ＲＮＡは、５'タンパク質結合セグメント－（任意選択のリンカー）－ポリヌクレオチドターゲティングセグメント－３'又は５'ポリヌクレオチドターゲティングセグメント－（任意選択のリンカー配列）－タンパク質結合セグメント－３'で構成され得る。好ましくは、構成は、５'タンパク質結合セグメント－（任意選択のリンカー）－ポリヌクレオチドターゲティングセグメント－３'である。

【0101】

全体として、ＲＮＡは、５０～３００ヌクレオチドの長さ、１００～２００ヌクレオチドの長さ、又は、１４０～１５０ヌクレオチドの長さであり得る。

【0102】

ＲＮＡは、天然に発生しない設計されたＲＮＡであり、すなわち、ＲＮＡは人工的に生成され、ポリヌクレオチドターゲティングセグメント及びタンパク質結合セグメントは共に天然で発生しないことに留意されたい。

【0103】

特に、好ましい実施形態において、ガイドＲＮＡは、非細菌、非古細菌遺伝子配列に対して相補的である。

【0104】

本開示によって提供されるＲＮＡは、例えば、標的細胞におけるＲＮＡの分解を低減するために化学的改変を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及びＣａｓ１２システムにおいて使用されるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡにおける改変を試験するための技法が、当技術分野において既に記載されており、適用され得る。（例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８。）ＲＮＡ分子は更に、ポリヌクレオチドの標的配列を含む標的領域へ送達される１又は複数のエフェクター分子にＲＮＡが結合することを可能にするセグメントを含み得る。ＭＳ２ヘアピン又はＰＰ７ヘアピンなどのアプタマーがＲＮＡ内に設計され得、それに対してエフェクター分子（例えば、蛍光タンパク質に融合されたＭＳ２ ＲＮＡ被覆タンパク質ＭＣＰ）が、例えばｄＣａｓ９について当技術分野においてに記載された方式で係留又は結合され得る（Ｓａｊｗａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍａ Ｈ， ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0105】

本開示はまた、本明細書に記載されるＲＮＡをコードするＤＮＡに関連し、ＲＮＡはそれから発現によって産生され得る。ＤＮＡの発現は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで発生し得る。

【0106】

エフェクター複合体
上で識別されたタンパク質及びＲＮＡを含むエフェクター複合体も本開示によって提供される。これらは、ＲＮＡによって、ポリヌクレオチドの標的領域における標的配列へガイドされ、ＲＮＡは、ポリヌクレオチドの標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むポリヌクレオチド結合セグメントを含む。

【0107】

エフェクター複合体が誘導されるポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡである。エフェクター複合体が変異体／不活性ＴｎｐＢを含み、標的領域をブロックするために、又は、１又は複数のエフェクタータンパク質を標的領域へ送達するために使用される例において、エフェクター複合体が誘導される標的配列はＲＮＡであり得る。

【0108】

エフェクター複合体が、活性ヌクレアーゼ部位を伴うＴｎｐＢを含む場合、エフェクター複合体は、標的領域におけるＤＮＡを切断することが可能である。切断は、標的部位の端から３０ｂｐ以内であり得る。切断部位は、標的配列を含む鎖上の標的配列の５'であり得る。

【0109】

一例において、エフェクター複合体は、二本鎖ポリヌクレオチドを切断して段違い二本鎖切断部を生成することが可能である。５'オーバーハングは例えば、４又は５ヌクレオチドの長さであり得る。代替的に、エフェクター複合体は、二本鎖ポリヌクレオチドを切断して平滑末端を生成し得る。

【0110】

本開示のエフェクター複合体は、設計された、天然に発生しない複合体であり得る。特に、複合体のＲＮＡ及びタンパク質は、共に天然に発生しない。

【0111】

エフェクター複合体は、単離又は精製された形態であり得る。

【0112】

本開示の一例において、エフェクター複合体は固体支持体に結合される。特に、エフェクター複合体は、標的配列の存在を検出するために使用され得るバイオセンサーにおける固体支持体に結合され得る（例えば、Ｈａｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１９）において、グラフェンフィールドエフェクタートランジスター上に固定されるＣａｓ９ベースのエフェクター複合体について示されている）。エフェクター複合体を固体表面に接合するために利用され得る、固体表面にタンパク質を接合するための好適な方法が当技術分野において知られている。一例において、エフェクター複合体は、ＴｎｐＢタンパク質（又は不活性化ＴｎｐＢタンパク質）、及び、固体支持体の表面上にエフェクター複合体を捕捉するために利用され得るペプチドタグを含む、上に記載される融合タンパク質を含み得る。

【0113】

本開示のエフェクター複合体は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで産生され得る。特に、方法は、細胞において、又は、無細胞系においてインビトロで、本明細書に記載されるＲＮＡ及びタンパク質からエフェクター複合体を組み立てることを含み得る。

【0114】

エフェクター複合体が細胞において産生される場合、方法は、細胞において以下を提供することを含み得る。
（ｉ）本明細書に記載されるＲＮＡ、及び、本明細書に記載されるタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｉｉ）本明細書に記載されるタンパク質、及び、本明細書に記載されるＲＮＡをコードするＤＮＡ；
（ｉｉｉ）本明細書に記載されるタンパク質をコードするＤＮＡ、及び、本明細書に記載されるＲＮＡをコードするＤＮＡ；
（ｉｖ）本明細書に記載されるタンパク質をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び、本明細書に記載されるＲＮＡ；又は
（ｖ）本明細書に記載されるタンパク質をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び、本明細書に記載されるＲＮＡをコードするＤＮＡ。

【0115】

エフェクター複合体が無細胞系においてインビトロで産生される場合、方法は、ＲＮＡをコードするＤＮＡのインビトロ発現、タンパク質をコードするＤＮＡのインビトロ発現、又は、ＲＮＡをコードするＤＮＡ及びタンパク質をコードするＤＮＡの両方のインビトロ発現を含み得る。

【0116】

タンパク質をコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞において又は無細胞系においてＤＮＡの発現を調節する１又は複数の調節因子を含み得る。特に、タンパク質をコードするＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結される少なくとも１つの第１調節因子を含み得、及び／又は、ＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に動作可能に連結された少なくとも１つの第２調節因子を含み得る。「動作可能に連結」とは、ＲＮＡ及びタンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現に影響を与えることが可能であるように調節因子がＤＮＡ配列に位置することを意味する。調節因子は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位、及び他の発現制御因子であり得る。これらは、ＲＮＡ及びタンパク質を発現するために使用される細胞タイプ、又は、インビトロ無細胞系において使用するために選択された他の成分に応じて選択され得る。

【0117】

本明細書に開示されるＤＮＡ配列はベクターに組み込まれ得る。特に、ベクターは、ＤＮＡ配列の発現、維持、及び／又は伝搬に使用され得る。好適なベクターは、プラスミド及びウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターから選択され得る。特に、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ１２システムと組み合わせて使用するための、当技術分野において既に知られているウイルスベクターが使用され得る（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９に記載される）。好ましい例において、ウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスベクターである。特に、ＴｎｐＢタンパク質の相対的に小さいサイズに起因して、ＡＡＶウイルスベクターは特に、エフェクター複合体についてのＴｎｐＢ（又は不活性化ＴｎｐＢ）が、１又は複数のエフェクター分子を保持する融合タンパク質の部分である場合に利用され得る。

【0118】

本開示はまた、本明細書に記載される、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び／又は、タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本明細書に記載される、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び／又は、タンパク質をコードするＤＮＡのインビトロ発現に使用され得、特に、エフェクター複合体の生成のために使用され得る。宿主細胞は、本明細書に記載される、ＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び／又は、タンパク質をコードするＤＮＡを含む。ＤＮＡは、宿主ゲノムと共に複製されるように、宿主細胞のゲノム内に組み込まれ得る。代替的に、ＤＮＡは、細胞をトランスフェクトするために使用されたベクター上に残り得る。

【0119】

ＤＮＡは、宿主細胞に対して外来のものとして定義され得、すなわち、ＤＮＡを含む宿主細胞は天然で発生しない。

【0120】

いくつかの例において、宿主細胞は単離細胞である。

【0121】

いくつかの例において、宿主細胞は、全能性ヒト胚性幹細胞ではない。

【0122】

いくつかの例において、宿主細胞はヒト卵母細胞ではない。

【0123】

いくつかの例において、宿主細胞は、ＲＮＡのガイド配列に相補的な標的配列を含まない。

【0124】

宿主細胞は、細胞株からの細胞であり得る。

【0125】

本開示の一態様において、宿主細胞は、ここに記載されるエフェクター複合体を産生するために利用でき、その結果、エフェクター複合体は次に、下で論述される方法において使用できる。

【0126】

本開示の代替的な態様において、エフェクター複合体の生成は、本明細書において論述されたエフェクター複合体の方法及び使用の一部として発生し得る。

【0127】

これらの態様の両方は、本開示によっても提供される以下のシステムを伴い得る。

【0128】

ポリヌクレオチドにおける標的領域を改変するためのシステム、ここで、標的領域は標的配列を含み、システムは：
ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質、又は、当該タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、及び、
ｂ）ＲＮＡ、又はＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含み、ＲＮＡは：
（ｉ）標的配列に相補的である配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＴｎｐＢタンパク質に結合するタンパク質結合セグメント
を含む。

【0129】

システムは、（ａ）タンパク質及び（ｂ）ＲＮＡ；（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ及び（ｂ）ＲＮＡをコードするＤＮＡ；（ａ）タンパク質をコードするＤＮＡ及び（ｂ）ＲＮＡ；（ａ）タンパク質及び（ｂ）ＲＮＡをコードするＤＮＡ；（ａ）タンパク質をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び（ｂ）ＲＮＡ；又は（ａ）タンパク質をコードするＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及び（ｂ）ＲＮＡをコードするＤＮＡを含み得る。特定の例において、（ａ）及び（ｂ）は両方ともＲＮＡである（例えば、Ｃａｓ９について示されている（Ｇｉｌｌｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０２１））。

【0130】

ＲＮＡ及びＴｎｐＢを含むタンパク質は本明細書に記載される通りである。特に、タンパク質は、本明細書に記載される融合タンパク質であり得る。ＴｎｐＢは、本明細書に記載される不活性化ＴｎｐＢであり得る。

【0131】

システムにおいて、（ａ）及び／又は（ｂ）は少なくとも１つのベクターに含まれ得る。一例において、（ａ）及び（ｂ）は、同一のベクターに含まれる。代替的な例において、（ａ）及び（ｂ）は別個のベクターに含まれる。

【0132】

ベクターは、ウイルスベクターの非ウイルスベクターであり得る。特に、非ウイルスベクターは、少なくとも１つのプラスミド、及び／又は、リポソーム又はエクソソームなどの少なくとも１つの非ウイルス粒子であり得る。

【0133】

代替的に、少なくとも１つのウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又は単純ヘルペスウイルスベクターから選択され得る。上に記載されたように、特に、タンパク質がＴｎｐＢ及び１又は複数のエフェクター分子を含む融合タンパク質である場合、ＡＡＶベクターが好ましいことがあり得る。

【0134】

本開示のシステムは、天然に発生しないシステムに設計される。

【0135】

システムは、（ａ）及び（ｂ）が別個にパッケージングされたキットの形態であり得、任意選択的に、キットは使用のための指示と共にパッケージングされる。

【0136】

上に記載されたシステム及びエフェクター複合体は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボでの細胞への送達のために上で記載されたベクターに含まれ得る。

【0137】

更に、システム又はエフェクター複合体は、単独で、又は、ベクターの一部としてのいずれかで、マイクロインジェクションによって又は電気穿孔を介して送達され得る。特に、ベクターはリポソームであり得る。

【0138】

システム又はエフェクター複合体は、リポフェクション（脂質によって媒介）、トランスフェクション（カチオンポリマーによって媒介）を介して、又は、リン酸カルシウムトランスフェクションによって化学的に送達され得る。

【0139】

レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びＡＡＶベクターを含むウイルスベクターも送達に利用され得る。

【0140】

特に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９及びＣａｓ１２システムについて既に記載されたものに基づく送達システムが利用され得る（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ－１０１－ｍａｍｍａｌｉａｎ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｓｙｓｔｅｍｓ－ａｎｄ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｍｅｔｈｏｄｓを参照）。

【0141】

上に記載されたように、エフェクター複合体において使用される融合タンパク質は、細胞によるエフェクター複合体又は融合タンパク質の取り込みを促進するために細胞膜透過ペプチドを含み得る。

【0142】

方法及び使用
本明細書に記載されるエフェクター複合体及び／又はシステムは、ポリヌクレオチドにおける標的領域を切断し、改変し、標識とし、又は、それからの発現を制御するための方法に使用され得、ここで、標的領域は標的配列を含む。

【0143】

特に、方法は、エフェクター複合体をポリヌクレオチドにおける標的領域へ送達するための方法であり得、ここで、標的領域は標的配列を含み、エフェクター複合体は以下を含む：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）以下を含むＲＮＡ：
（ｉ）標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質に結合することを可能にするタンパク質結合セグメント。
方法は、エフェクター複合体をポリヌクレオチドと接触させ、ガイド配列が標的配列とハイブリダイズすることを可能にすることにより、エフェクター複合体を標的領域へ送達することを備える。エフェクター複合体は、標的領域へ送達される、本明細書に記載される１又は複数のエフェクター分子を含み得る。

【0144】

更なる態様において、方法は、エフェクター複合体を用いてポリヌクレオチドを切断するための方法であり得、ここで、ポリヌクレオチドは、標的配列を含み、エフェクター複合体は以下を含む：
（ａ）ＴｎｐＢタンパク質を含む又はそれから成るタンパク質；及び
（ｂ）以下を含むＲＮＡ：
（ｉ）標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むポリヌクレオチドターゲティングセグメント；及び
（ｉｉ）ＲＮＡがＴｎｐＢタンパク質と結合してエフェクター複合体を形成することを可能にするタンパク質結合セグメント、ここで、方法は、ポリヌクレオチドをエフェクター複合体に接触させ、ＴｎｐＢタンパク質がポリヌクレオチドを切断することを可能にすることを含む。

【0145】

ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡである場合、切断は、５'オーバーハングを伴う段違い二本鎖切断部を産生し得る。代替的に、切断は、平滑末端二本鎖切断部を産生し得る。

【0146】

方法の接触段階は、切断されたポリヌクレオチドの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で細胞において発生し得、それによりポリヌクレオチドの配列を編集する。更に、方法は更に、ＨＤＲのためにポリヌクレオチドをドナーポリペプチドと接触させる段階を備え得る。Ｃａｓ９及びＣａｓ１２システムについて当技術分野において知られているＮＨＥＪ及びＨＤＲを達成するための好適な方法はまた、本場合において好適である（例えば、Ｍａｒｅｓｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）。

【0147】

これらの態様による方法において、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡであり得、ＴｎｐＢが相互作用する標的配列（上に記載される）のＴｎｐＢ会合配列モチーフ５'を含み得る。

【0148】

代替的に、ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡであり得る。

【0149】

本開示の方法の一例において、ポリヌクレオチドは細胞内にあり得る。細胞は原核細胞又は真核細胞であり得る。細胞が真核細胞である場合、それは非ヒト動物細胞、ヒト細胞又は植物細胞であり得る。特に、細胞は、人工多能性幹細胞などの幹細胞であり得る。

【0150】

Ｃａｓ９及びＣａｓ１２システムと同様に、本開示の方法は、植物細胞において特に有用性を有する。特に、本開示は、改変されたポリヌクレオチドを有する細胞を含む植物を産生するための方法を含み、方法は、植物細胞を、本明細書に記載されるシステム又は本明細書に記載されるエフェクター複合体に接触させ、それにより、当該ポリヌクレオチドの標的領域を改変し、当該植物細胞から植物を再生する段階を備え、ここで、改変された標的領域は、当該細胞における関心のある遺伝子にあり、ここで、改変は、関心のある性質に関連する。

【0151】

エフェクター複合体、システム、及び、複合体及びシステムの成分をコードするＤＮＡは、個人において薬剤として使用するためのものであり得る。代替的に、それらは、個人における診断の方法のために使用され得る。

【0152】

代替的に、エフェクター複合体、システム、及び、複合体及びシステムの成分をコードするＤＮＡは、試料における標的配列を含むポリヌクレオチドの存在を判定するために、又は、ポリヌクレオチドの標的領域を改変するために、インビトロ又はエクスビボの方法において使用され得る。

【0153】

ここでは、単に例として、以下の実験作業を参照して、本開示をより詳細に記載する。

【0154】

例
材料および方法
ＴｎｐＢ発現ベクターの設計
Ｔ７プロモーターの下で合成ＤＮＡ断片としてクローニングされたデイノコッカス・ラディオデュランスＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＥ０００５１３．１）のＩＳ２００／ＩＳ６０５ ＩＳＤｒａ２システムを含むｐＴＷＩＳＴ－ＩＳＤｒａ２プラスミドがＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得された。ｔｎｐＡ遺伝子内に欠失を有するＩＳＤｒａ２バリアントを含むｐＧＤ３プラスミドを取得するために、ｐＴＷＩＳＴ－ＩＳＤｒａ２プラスミドがＮｄｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予め切断され、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して５'－オーバーハングが埋め込まれ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて自己環状化された。ＴｎｐＢ精製のために、２つのｐＢＡＤ由来発現ベクターが、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して構築された。ｐＴＫ１２０－ＩＳＤｒａ２－ＴｎｐＢは、Ｎ末端１０×Ｈｉｓ ＴｗｉｎＳｔｒｅｐ－ＭＢＰタンパク質精製タグに融合されたｔｎｐＢコード配列を含む一方で、ｐＴＫ１５１は、Ｎ末端６×Ｈｉｓ－ＭＢＰに融合されたｔｎｐＢ及びＣ末端ＳｔｒｅｐＴａｇ ＩＩコード配列を含む。ＴｎｐＢ複合体精製に使用されるｒｅＲＮＡ発現ベクター（ｐＧＢ７１）を取得するために、５'末端におけるＴ７プロモーターを保持するｒｅＲＮＡコード配列、及び、３'末端におけるＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス）リボザイム及びＴ７ターミネーター（合成オリゴヌクレオチドからＰＣＲによって組み立てられる）が、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター内に、ＨｉｎｄＩＩＩ 及びＢｃｌＩ 制限部位（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にクローニングされた。７Ｎプラスミドライブラリ切断におけるＴｎｐＢ複合体発現及びプラスミド干渉アッセイに使用されるｐＧＢ７４－７８プラスミドは、Ｔ７及びＴ７ｌａｃプロモーターの下にそれぞれ、ｒｅＲＮＡ及びｔｎｐＢコード配列を含む。ｐＧＢ７４－７８プラスミドは、Ｂｓｕ１５Ｉ及びＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）部位上のｒｅＲＮＡコード断片、及び、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）部位上のｔｎｐＢをｐＥＴ－Ｄｕｅｔ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にクローニングすることによって取得された。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集実験のために、Ｕ６及びＣＡＧプロモーターの下にそれぞれｒｅＲＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡにおける２０ｂｐの部位を標的とする）及びｔｎｐＢ（３'末端においてＳＶ４０ ＮＬＳ－Ｔ２Ａ－ＧＦＰと融合される）をコードする、ｐＸ４５８プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ， Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４８１３８からの寄贈）の派生であるプラスミドベクターｐＲＺ１２２－１２７が、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して構築された。Ｐｈｕｓｉｏｎ部位指向性変異導入キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、変異ＲｕｖＣ活性部位を有するプラスミドのバリアントを取得するために使用された。

【0155】

ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体の発現及び精製
初期ＴｎｐＢタンパク質発現及び事前精製のために、大腸菌ＢＬ２１－ＡＩ細胞が、ｐＴＫ１２０－ＩＳＤｒａ２－ＴｎｐＢ単独で形質転換され、又は、ｐＧＤ３（ｔｎｐＡ遺伝子内に欠失を有するＩＳＤｒａ２トランスポゾンをコードする）で共形質転換され、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）でそれぞれ補足されたＬＢブロスにおいて３７℃で増殖された。０．６～０．８のＯＤ_６００まで培養した後、タンパク質発現が０．２％アラビノースで誘導され、細胞は１６℃の温度で更に１６時間にわたって増殖された。翌日、細胞は、遠心分離によってペレット化され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有緩衝液に再懸濁され、超音波処理によって破砕された。遠心分離によって細胞残屑を除去した後に、上清は、Ｎｉ^２＋がチャージされたＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされ、タンパク質が、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロール緩衝液における２５ｍＭから５００ｍＭまで増加するイミダゾール濃度の直線勾配で溶出された。ＴｎｐＢを含む画分がプールされ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロールに対して透析され、－２０℃で保存された。取得された事前精製ＴｎｐＢ試料は、核酸抽出及び解析に使用された。

【0156】

ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体の発現及び収量の増加のために、大腸菌ＢＬ２１－ＡＩ細胞が、ｒｅＲＮＡ（ｐＧＢ７１）及びＴｎｐＢ（ｐＴＫ１５１）又はＴｎｐＢ^{Ｄ１９１Ａ}（ｐＴＫ１５２）発現ベクターで形質転換され、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を補足された３７℃のＬＢブロスにおいて増殖された。０．６～０．８のＯＤ_６００まで培養した後、タンパク質発現が０．２％アラビノースで誘導され、細胞は１６℃で更に１６時間にわたって増殖された。翌日、細胞は、遠心分離によってペレット化され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２５ｍＭイミダゾール、２ｍＭ ＰＭＳＦ、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロール含有緩衝液に再懸濁され、超音波処理によって破砕された。遠心分離によって細胞残屑を除去した後に、上清は、Ｎｉ^２＋がチャージされたＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされ、結合したタンパク質が、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロール緩衝液における２５から５００ｍＭまで増加するイミダゾール濃度の直線勾配で溶出された。ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体を含む画分はプールされ、６×Ｈｉｓ－ＭＢＰタグは、ＴＥＶプロテアーゼを用いて、８℃で一晩インキュベートすることによって切断された。次に、反応混合物は、ＳｔｒｅｐＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール、及び５％（ｖ／ｖ）グリセロール緩衝液で洗浄され、結合されたＴｎｐＢ複合体は、２．５ｍＭ ｄ－デスチオビオチン溶液で溶出された。ＴｎｐＢを含む画分がプールされ、ＨｉＴｒａｐヘパリンＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされ、０．１５Ｍから１．０Ｍまで増加するＮａＣｌ濃度の直線勾配を使用して溶出された。取得されたＴｎｐＢ複合体画分はプールされ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルタユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して最大０．５ｍｌまで濃縮され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２－メルカプトエタノール緩衝液で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過カラム上にロードされた。ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体を含むピーク画分がプールされ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロール含有緩衝液に対して透析され、－２０℃で保存された。ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体の濃度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質バンドの強度を定量化して、既知の濃度のタンパク質標準と比較することによって判定された。

【0157】

マスフォトメトリーによる分子量測定
測定カバースリップ（Ｎｏ． １．５ Ｈ， ２４×５０ ｍｍ， Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）が、ＭｉｌｌｉＱ水、イソプロパノール及びＭｉｌｌｉＱ水において、連続超音波処理によって５分間清浄化され、次に、清浄な窒素ガスの気流を使用して乾燥された。清浄なカバースリップがＯｎｅＭＰマスフォトメーター（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ．）上に載せられ、ＣｕｌｔｕｒｅＷｅｌｌ（登録商標）再使用可能ガスケット（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ－Ｌａｂｓ）が上に配置された。ガスケットウェルが、１０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５℃、及び２５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で充填され、１０μｌの希釈されたＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体試料（約６０ｎＭ）が添加され、生体分子の吸着が、ＡｃｑｕｉｒｅＭＰソフトウェア（Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ）を使用して、１２０秒間モニタリングされた。測定されたレシオメトリックコントラストを分子量に変換するために、Ｕｎ１Ｃａｓ１２ｆ１タンパク質（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）及び６０～２５０ｋＤａの範囲のそのオリゴマー（単量体又は四量体）が較正に使用された。試料は３連で測定された。マスフォトメトリーの動画が、ＤｉｓｃｏｖｅｒＭＰ （Ｒｅｆｅｙｎ Ｌｔｄ）を使用して解析された。

【0158】

ＴｎｐＢ結合核酸抽出及び解析
ＴｎｐＢ結合核酸を抽出するために、まず、１００μｌの事前精製ＴｎｐＢ試料が５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）のプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で４５分間、１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、３７℃、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び、１ｍＭ ＥＤＴＡ反応緩衝液においてインキュベートされた。次に核酸が、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液によって抽出され、任意の残留フェノールを除去するために水溶液相が追加的にクロロホルムで処理された。核酸を含む溶液は、新鮮なチューブに分割され（各々１９８μｌ）、次に、２μｌのＲＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＤＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が添加され、反応が３７℃で４５分間インキュベートされた。反応産物は、２×ＲＮＡローディングダイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合され、０．５×ＴＢＥ電気泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＴＢＥ－Ｕｒｅａ（８Ｍ）１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離され、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で視覚化された。

【0159】

ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体からのＲＮＡ単離
ＴｎｐＢ結合ＲＮＡ抽出のために、１００μｌの事前精製ＴｎｐＢ複合体が５μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）のプロテイナーゼＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、３７℃で４５分間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１ｍｌの反応緩衝液と共にインキュベートされた。ＤＮＡは、１０μｌのＤＮａｓｅ Ｉ（１０Ｕ／μｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することによって消化され、それに続いて３７℃で更に４５分インキュベートされ、その後、ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製された。次に、３μｇの精製ＲＮＡが、１ｍＭ ＡＴＰを補足された１×反応緩衝液Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）における１μｌ（１０Ｕ／μｌ）のＰＮＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２０μｌ反応体積において３７℃で３０分間にわたってリン酸化され、ＧｅｎｅＪＥＴ ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製された。

【0160】

ＲＮＡシーケンシング及び解析
ＲＮＡライブラリが、スモールＲＮＡについての製造元の指示（プロトコルＭＡＮ００２５３５９）に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のためのＣｏｌｌｉｂｒｉ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して調製され、等モル比においてプールされ、ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上のＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２、３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドシーケンシング（２×７５ｂｐ）された。２０ｂｐより短いペアエンドリードは、Ｃｕｔａｄａｐｔ （Ｍａｒｔｉｎ， ２０１１）でフィルタリングされた。残留リードが、ＢＷＡ（Ｌｉ及びＤｕｒｂｉｎ、２００９）を使用してトランスポゾンコードプラスミド（ｐＴＷＩＳＴ－ＩＳＤｒａ２）にマッピングされ、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）を用いて、．ｂａｍファイルフォーマットに変換された。結果として生じるカバレッジデータが、ＩＧＶ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｔ ａｌ．，２０１１）を使用して視覚化された。

【0161】

ＴｎｐＢ ｄｓＤＮＡ切断の検出及びＴＡＭ認識
Ｃａｓ９及びＣａｓ１２エフェクターについて過去に開発されたＰＡＭ決定アッセイ（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５、２０１９、２０２０）が、ＴｎｐＢ ｄｓＤＮＡ切断要件及びＴＡＭ配列の確立のために採用された。簡潔には、７Ｎランダム化領域に隣接する、プラスミドライブラリにおける１６ｂｐ又は２０ｂｐ配列を標的とするｔｎｐＢ遺伝子及びｒｅＲＮＡコンストラクトが、ｐＥＴ－ｄｕｅｔ１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）ベクター（ｐＧＢ７７－７８）にクローニングされた。次に、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）細胞が、ＴｎｐＢ ＲＮＰをコードするプラスミドを用いて形質転換され、細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）が補足されたＬＢブロスにおいて増殖された。０．５のＯＤ_６００に到達した後に、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いてＴｎｐＢ発現が誘導され、培養液は１６℃で一晩インキュベートされた。１０ｍｌの一晩の培養液からの細胞が遠心分離で収集され、１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、２ｍＭ ＰＭＳＦ）において再懸濁され、超音波処理によて溶解された。細胞残屑は遠心分離で除去され、ＴｎｐＢ ＲＮＰを含む１０μｌの上清が、プラスミドライブラリ消化のために直接使用された。簡潔には、ライセートが、１００μｌの反応緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）において１μｇの７Ｎランダム化プラスミドライブラリ（ｐＴＺ５７）と混合され、３７℃で１時間インキュベートされた。切断されたＤＮＡ末端は、１μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することによって修復され、１１℃で２０分間インキュベートされ、それに続いて、最大７５℃で１０分回加熱された。次に、反応混合物を１μｌのＤｒｅａｍＴａｑポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に７２℃で３０分間インキュベートすることによって、３'－ｄＡオーバーハングが添加された。１μｌのＲＮａｓｅ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートすることによってＲＮＡが除去され、それに続いて、ＧｅｎｅＪｅｔ ＰＣＲ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＤＮＡが精製された。次に、１００ｎｇの精製された切断産物が、３'－ｄＴオーバーハング（１００ｎｇ）を含む１００ｎｇのｄｓＤＮＡアダプターと混合され、２０μｌの反応体積において、１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に２２℃で１時間インキュベートされた。次に、アダプターを含む切断産物がＰＣＲ増幅され、ＧｅｎｅＪｅｔゲル精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してゲル精製された。ＤＮＡライブラリが、製造元の指示に従って、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のためのＣｏｌｌｉｂｒｉ（登録商標）ＰＳ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して調製され、等モル比においてプールされ、ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上のＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２、３００サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドシーケンシング（２×１５０ｂｐ）された。

【0162】

ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体による二本鎖ＤＮＡ切断が、７Ｎプラスミドライブラリにおける標的配列でのアダプター連結を調査することによって評価された。これは、アダプター及びプラスミドバックボーンに由来する配列と完全に一致する１０ｂｐを識別することによって、７Ｎ領域の次の０～３０ｂｐ標的位置に連結されたアダプターを含むすべてのリードを抽出及びカウントすることによって達成された。標的領域（７Ｎランダム化配列から２０～２１ｂｐ）におけるアダプター連結の頻度の上昇を示すリードが、７Ｎ配列（ＴＡＭ）抽出、及び、ＷｅｂＬｏｇｏ （Ｃｒｏｏｋｓ， ２００４）を使用する視覚化に使用された。切断位置識別及びＴＡＭ特性評価に使用されたＰｙｔｈｏｎ（登録商標）スクリプトが、ＧｉｔＨｕｂレポジトリにおいて提供される（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｋａｒｖｅｌｉｓ／Ｎｕｃｌｅａｓｅ＿ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ）。

【0163】

インビトロＴｎｐＢ切断反応のためのＤＮＡ基質
インビトロ切断アッセイにおいて使用されたプラスミドＤＮＡ基質（ｐＧＢ７２－７３）は、合成オリゴデュプレックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で予め切断されたｐＳＧ４Ｋ５プラスミド（Ｘｉａｏ Ｗａｎｇからの寄贈、 Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃７４４９２）にクローニングすることによって取得された。

【0164】

合成直鎖ＤＮＡ基質が、１μＭのオリゴヌクレオチド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１μｌ（１０Ｕ／μｌ）のＰＮＫ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び^３２Ｐ－γ－ＡＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共に、７．５μｌの１×反応緩衝液Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、３７℃で３０分間インキュベートすることによって、５'末端標識された。オリゴデュプレックス（１００ｎＭ）が、^３２Ｐ－標識及び未標識相補的オリゴヌクレオチド（１：１．５モル比）を組み合わせることによって取得され、続いて、９５℃に加熱され、室温までゆっくり冷却された。

【0165】

ＤＮＡ切断アッセイ
プラスミドＤＮＡ切断反応が、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む反応緩衝液において１００ｎＭ ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体を３ｎＭプラスミドＤＮＡ（ｐＧＢ７２－７３）と混合することによって開始され、続いて、３７℃で６０分間インキュベートされた（別の指示がない場合）。反応は、３×ローディングダイ溶液（５０％（ｖ／ｖ）グリセロールにおける０．０１％ブロモフェノールブルー及び７５ｍＭ ＥＤＴＡ）と混合することによって停止され、アガロースゲル電気泳動及び臭化エチジウムによって解析された。ほどかれたプラスミドＤＮＡ基質は、ＮｄｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて切断することによって取得された。

【0166】

合成オリゴデュプレックスを用いる切断反応は、１００μｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３７℃、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００ｍＭ ＮａＣｌ反応緩衝液において、３７℃で、１００ｎＭのＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体を１ｎＭの放射線標識基質と組み合わせることによって開始された。１０μｌの分量が、時間間隔（０分、１分、５分、１５分、及び６０分）で反応混合物から除去され、１．８×体積のローディングダイ（９５％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、０．０１％ブロモフェノールブルー及び２５ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて反応停止され、変性ゲル電気泳動（０．５×ＴＢＥ緩衝液において８．５Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミド）にかけられた。ゲル
プラスミド干渉アッセイ
プラスミド干渉アッセイが、ＴｎｐＢ及びｒｅＲＮＡコードプラスミド（ｐＧＢ７４－７６）を保持する大腸菌Ａｒｃｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）株において実行された。細胞は３７℃で約０．５のＯＤ６００まで増殖され、ｐＳＧ４Ｋ５（Ｘｉａｏ Ｗａｎｇからの寄贈、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃７４４９２）から設計された１００ｎｇの標的プラスミド（ｐＧＢ７２）を用いて電気穿孔された。１時間後、共形質転換細胞が更に、１０倍希釈で連続希釈され、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むプレート上において、２５℃で、３０℃又は３７℃で１６～４４時間にわたって増殖された。

【0167】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴｎｐＢ誘導ＤＮＡ切断
ＡＴＣＣから購入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（カタログ番号ＣＲＬ－３２１６）が、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）において培養された。トランスフェクションの前日に、細胞は、１．４×１０^５細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに蒔かれた。トランスフェクション混合物は、ＮＬＳタグＴｎｐＢ及びそのｒｅＲＮＡをコードする１μｇのプラスミド（ｐＲＺ１２２－１２７）を１００μｌの無血清ＤＭＥＭ及び２μｌのＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合することによって調製された。室温で１５分間インキュベートした後、トランスフェクション混合物が細胞に液滴で添加された。トランスフェクト細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、７２時間にわたって増殖された。

【0168】

インデル特性評価
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞がトリプシン処理され、それらのゲノムＤＮＡが、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出された。各標的部位を囲むＤＮＡ領域を増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング及びインデックス付与に必要な配列を追加するために２ラウンドのＰＣＲが実行された。簡潔には、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、最終体積２０μｌで、５'終端がＩｌｌｕｍｉｎａリード１及びリード２配列である、標的ゲノム座位に特異的なプライマーと共に、１～４μｌのＤＮＡライセートが一次ＰＣＲにおいて使用された。サーモサイクラー設定は、９８℃で３０秒間の初期変性、９８℃で１５秒間、５６．８℃で１５秒間、７２℃で３０秒間の１５サイクル、及び、７２℃で５分間の最終インキュベーションから成る。結果として生じる増幅産物は、１．８×体積の磁気ビーズ（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用して清浄され、３０μｌにおいて溶出された。６μｌの溶出混合物が、最終体積３０μｌで第２ラウンドのＰＣＲのテンプレートとして使用され、ｉ７ ６ ｎｔインデックスセット（Ｌｅｘｏｇｅｎ）と共にＬｅｘｏｇｅｎ ＰＣＲアドオンキット（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに必要なＰ５及びＰ７アダプターをインデックス化及び追加した。サーモサイクラー設定は、９８℃で３０秒間の初期変性、９８℃で１０秒間、６５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間の１５サイクル、及び、７２℃で１分間の最終インキュベーションから成る。ＰＣＲ産物の純度を確実にするために、０．９×体積の磁気ビーズ（Ｌｅｘｏｇｅｎ）を用いる追加の洗浄が実行された。バーコーディング及び精製されたＤＮＡ試料が、Ｑｕｂｉｔ ４ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化され、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ （Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して解析され、等モル比においてプールされ、ＭｉｎｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上のＭｉｎｉＳｅｑ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ、１５０サイクル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドシーケンシングされた（２×７５ｂｐ）。挿入又は欠失変異（インデル）が、以下のパラメータで、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２ （Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）を使用して解析された：増幅産物配列に対するアライメントについて最低７０％の相同性、１０ｂｐの定量ウィンドウ、偽陽性を回避するために置換を無視、及び、平均リードについてｐｈｒｅｄ３３スコア＞１０、及び、単一塩基対品質。

【0169】

例１ デイノコッカス・ラディオデュランスＩＳＤｒａ２転位因子におけるＴｎｐＢの生化学的機能の確立
挿入配列（ＩＳ）は、転位及び転位の調節に関連する遺伝子のみを含む単純で広く見られる可動遺伝因子（ＭＧＥ）である。ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリーの転位因子は、もっとも単純で古い可動遺伝因子（ＭＧＥ）（Ｓｉｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）のうちの１つである。典型的には、それらは、ＭＧＥ末端における末端に近い回文因子（ＬＥ及びＲＥ）及び異なる構成におけるｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子を保持する。しかしながら、このファミリーのいくつかのＭＧＥは、スタンドアロンｔｎｐＡ又はｔｎｐＢ遺伝子（ＩＳｆｉｎｄｅｒデータベース）を含む（Ｓｉｇｕｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６）。最善に実験的に特性評価されたヘリコバクター・ピロリ（Ｈｐ）及びデイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｒａ）ＩＳＤｒａ２のそれぞれのＩＳ６０８及びＩＳ２００／ＩＳ６０５ＭＧＥは、左端（ＬＥ）及び右端（ＲＥ）不完全回文配列（図１Ａ）にフランキングされる、部分的に重複するｔｎｐＡ及びｔｎｐＢ遺伝子から成る（Ｋｅｒｓｕｌｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。転位は、ＤＮＡ複製と組み合わされ、必須の一本鎖ＤＮＡ中間体を含む「剥離及びペースト」機構を介して発生する（Ｈｏａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0170】

ｔｎｐＡによってコードされるＴｎｐＡトランスポザーゼは、細胞及びインビトロの両方で、ＩＳモビリティを促進するのに十分である。ＴｎｐＡチロシンＹ１トランスポザーゼは、ｓｓＤＮＡ中間体の切除及び挿入の両方を触媒する。ＴｎｐＡは、二量体を形成し、一方の単量体における触媒チロシン及び他方の単量体における金属結合ＨＵＨモチーフからできている複合活性部位を含む非常に小さい（約１８ｋＤａ）タンパク質である。それは、環状一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ中間体を生成する「ＴＴＡＣ」（ＩＳ６０８）又は「ＴＴＧＡＣ」（ＩＳＤｒａ２）配列の近くのトランスポゾンコードＤＮＡ鎖を切断する（図１Ｂ）（Ｇｕｙｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。組み込み反応は、具体的には、同一配列の近くのｓｓＤＮＡ内で発生し、標的部位複製無しで転位サイクルを完了する（Ｇｕｙｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。興味深いことに、標的部位選択は、ＴｎｐＡによる直接的な配列読み取りではなくトランスポゾンＬＥ因子配列を伴う塩基対形成相互作用を通じて発生する（Ｂａｒａｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＩＳ６０７ファミリーにおける転位の分子機構は、あまり理解されていない。それは、ＴｎｐＡセリンファミリートランスポザーゼを必要として、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ中間体を伴い得る（Ｂｏｏｃｏｃｋ ａｎｄ Ｒｉｃｅ，２０１３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１８；Ｋｅｒｓｕｌｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００）。

【0171】

転位におけるＴｎｐＡ機能は十分に確立されているが、ＴｎｐＢの役割は分からないままである。ＴｎｐＢは、転位に必須でないが、トランスポゾン切除及び挿入の負の調節に関与すると考えられる（Ｋｅｒｓｕｌｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、２００２；Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。興味深いことに、ＴｎｐＢ配列における保存されたＲｕｖＣ様活性部位のバイオインフォマティクス識別は、ＴｎｐＢが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって採用されたＣａｓ９及びＣａｓ１２ヌクレアーゼの祖先であり得るという推測を生じさせた（Ｋａｐｉｔｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。しかしながら、転位におけるＲｕｖＣモチーフの役割も、ＴｎｐＢのヌクレアーゼ活性も、実験的に実証されていない。

【0172】

デイノコッカス・ラディオデュランスＩＳＤｒａ２転位因子におけるＴｎｐＢの生化学的機能を確立するために、我々は、ＴｎｐＢタンパク質を単離して生化学的に特性評価することを試みた。この目的で、我々は、１０×ＨＩｓ－ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）精製タグをコードする配列に融合された大腸菌ｔｎｐＢ遺伝子（１２２７ｂｐ）を発現させた。Ｎｉ^２＋アフィニティクロマトグラフィーによって抽出された細胞からＴｎｐＢを精製する初期の試みでは、インタクトなＴｎｐＢタンパク質（図２Ａ）の収量が非常に低いことが明らかになった。しかしながら、完全ＩＳＤｒａ２トランスポゾンとの（不活性化ｔｎｐＡとの）ｔｎｐＢの共発現の結果、ＴｎｐＢ収量が著しく増加し、いくつかのトランスポゾン因子が安定的なＴｎｐＢ発現に貢献し得ることが示唆された（図２Ｂ及び２Ｃ）。ＴｎｐＢ試料のその後の解析から、ＲＮＡがＴｎｐＢと共精製されることが明らかになった（図２Ｄ）。ＴｎｐＢ結合ＲＮＡを特性評価するために、我々は、スモールＲＮＡシーケンシング（ｓＲＮＡ－ｓｅｑ）を実行し、我々がｒｅＲＮＡと名付けたＩＳＤｒａ２トランスポゾンＲＥ因子に由来する非コードＲＮＡ（約１５０ｎｔ）のエンリッチメントを明らかにした（図１Ｃ及び１Ｄ）。ＴｐｎＢと共精製されるｒｅＲＮＡは、ｔｎｐＢ遺伝子及びＲＥ配列の３'－末端と一致したが、ＩＳ２００／ＩＳ６０５トランスポゾンにフランキングするプラスミドＤＮＡ配列に由来する３'末端における最後の約１６ｎｔを除く（図１Ｄ）。ＩＳ２００／ＩＳ６０５ファミリートランスポゾンをコードするｔｎｐＢと会合する非コードＲＮＡのエンリッチメントが、ハロバクテリウム・サリナルムについて過去に報告された（Ｇｏｍｅｓ－Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。まとめると、これらのデータは、ＴｎｐＢが、トランスポゾン３'末端由来ｒｅＲＮＡとリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体（ｇＲＮＡとのＣａｓ９又はＣａｓ１２複合体と同様）を形成することを示す。後者の場合、ｇＲＮＡの可変配列部分は、ＣＲＩＳＰＲアレイにおけるスペーサー配列に対応する。

【0173】

例２ ＴｎｐＢタンパク質と会合するＲＮＡがガイド配列として機能する
我々は、トランスポゾンに隣接するＤＮＡに由来し、それ自体で可変である３'末端の約１６ｎｔのｒｅＲＮＡ（図１Ｄ）は、ＴｎｐＢをその標的に誘導してＲｕｖＣ様活性部位によってＤＮＡ切断を活性化するガイド配列として機能し得ると考えた。この仮説を試験するために、我々は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ヌクレアーゼについて過去に開発されたＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）識別アッセイを採用した（Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５、２０１９）。簡潔には、我々はまず、プラスミドに由来する３'末端ＴｎｐＢ ｒｅＲＮＡ配列が７Ｎランダム化プラスミドライブラリの次の標的と一致する１６ｎｔ又は２０ｎｔ配列によって置換されたｒｅＲＮＡバリアントを設計した（図３Ａ及び４Ａ）。次に、大腸菌の形質転換及び発現に続いて、ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体を含む細胞ライセートが、ランダム化されたプラスミドライブラリ切断を確立するために直接使用された。プラスミド切断の結果生じるＤＮＡ末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって修復され、アダプター連結を受け、ＰＣＲ増幅及びシーケンシングされた。アダプター連結断片の解析から、ＴｎｐＢ ＲＮＰ複合体によるプラスミドライブラリ切断を示すランダム化領域から２１～２２ｂｐ及び１５ｂｐの標的部位にアダプターを有する産物のエンリッチメントが明らかになった（図３Ｂ及び４Ｂ）。標的（ＴＳ）及び非標的ＮＴＳ鎖のアダプター連結位置の解析から、５'－オーバーハングを生じさせる段違い切断部が示唆された。ＤＮＡ断片のさらなる解析から、標的配列の５'上流にあるランダム化７Ｎ領域における「ＴＴＧＡＴ」配列のエンリッチメントが明らかになった。特に、ＴｎｐＢによるプラスミドライブラリの切断をライセンスされたＴＴＧＡＴ配列は、ＴｎｐＡ媒介ＩＳＤｒａ２トランスポゾン切除及び挿入に必要な標的部位配列と一致した（図３Ｃ、４Ｃ及び４Ｄ）（Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この配列は、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２ヌクレアーゼによるＤＮＡ切断の開始に必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列と類似するので、我々はそれをトランスポゾン関連モチーフ（ＴＡＭ）と名付けた。次に、プラスミドライブラリを使用して確立されるｄｓＤＮＡ切断要件を確認するために、我々は、ＴｎｐＢ ＲＮＰを大腸菌から精製し、５'－ＴＴＧＡＴ ＴＡＭ配列によってフランキングされる標的配列を含む様々なｄｓＤＮＡ基質を切断するその能力を試験した（図３Ｄ、８、９、及び１０）。ＴｎｐＢ複合体は、ＴＡＭ配列によってフランキングされる標的を含むプラスミドＤＮＡ（スーパーコイル状のもの及びほどかれたものの両方）を切断した（図３Ｅ、４Ｃ、及び４Ｄ）。ｒｅＲＮＡガイド配列と一致するＴＡＭ及び標的配列は、プラスミドＤＮＡ切断に必要であった（図３Ｆ）。ＲｕｖＣ様活性部位における保存された残基の変異は、切断を損ない、ＲｕｖＣがｄｓＤＮＡ切断を担うことが示された（図３Ｅ）。最後に、切断産物のランオフシーケンシングにより、５'－オーバーハングを結果として生じさせる、ＴＡＭから１５～２１ｂｐにおける段違い切断パターンを確認した（図３Ｇ及び８）。まとめると、これらの結果は、インビトロのＴｎｐＢが、ＴＡＭ依存ＲＮＡガイドｄｓＤＮＡヌクレアーゼとして機能することを実証する。

【0174】

例３ ＴｎｐＢはインビボでドナージョイントを切断することが可能である
ＴｎｐＢが細胞においてドナージョイント（図５Ａ）でＤＳＢを生じさせることが可能であるかどうかを試験するために、我々は、ＴＡＭにフランキングする標的を含み、Ｋｎで補足されたアガープレート上で増殖を可能にするカナマイシン（Ｋｎ）耐性遺伝子を保持するプラスミドによってＴｎｐＢ複合体を発現する組み換え大腸菌宿主の形質転換効率をモニタリングした。形質転換体の連続希釈は、インタクトなＲｕｖＣ様活性部位を有するＴｎｐＢバリアントを含む細胞におけるプラスミド干渉を明らかにした。特に、プラスミド干渉は、より低い温度でより顕著であった（図５Ｂ及び図１１Ａ、図１１Ｂ）。したがって、これらの結果から、ＴｎｐＢがインビボでドナージョイントを切断することが可能であると確認された。

【0175】

例４ ＴｎｐＢは細胞における標的ゲノム改変を媒介し得る
我々は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞における標的ゲノム改変にＴｎｐＢを採用できるかどうかを試験した。核局在化配列（ＮＬＳ）を有するＴｎｐＢタンパク質、及び、ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を標的にするｒｅＲＮＡコンストラクトをコードするプラスミドが、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内へ一時的にトランスフェクトされた（図７Ａ）。７２時間後、ｇＤＮＡが抽出され、ＤＳＢ修復イベントを示す標的切断部位における挿入及び欠失（インデル）の存在について、シーケンシングにより解析された。試験された２つの部位（ＡＧＢＬ１－２及びＥＭＸ１－１）において、ＴｎｐＢは、ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ベースの編集において観察されたレベル（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）と同様に、１０～２０％の頻度で変異を導入した（図７Ｂ）。ＡＧＢＬ１－１及びＥＭＸ１－２部位は、適度に（１～５％）改変され、一方、ＨＰＲＴ１部位ではインデルが検出されなかった。取得されたインデルのさらなる解析から、Ｃａｓ１２切断によって生じる変異プロファイル（Ｐａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０２０；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）と同様に、切断部位における支配的な欠失（図７Ｃ）が明らかになった。

【0176】

まとめると、これらの結果は、非常に小さいＲＮＡガイドＴｎｐＢヌクレアーゼが、真核生物ｇＤＮＡを切断可能であり、ゲノム編集のためのツールとして採用され得、ゲノム編集用途についての異なる生化学的要件を伴う、新しいクラスの非常に小さい非Ｃａｓヌクレアーゼを提供することを示す。下の表は、ＲＮＡガイドＴｎｐＢヌクレアーゼとＣａｓ９及びＣａｓ１２ヌクレアーゼとの比較を提供する。

【表1】

本明細書に記載の例は、本発明の実施形態の説明的な例として理解される。更なる実施形態及び例が想定される。任意の１つの例又は実施形態に関連して記載される任意の特徴は、単独で又は他の特徴と組み合わせて使用され得る。更に、任意の１つの例又は実施形態に関連して記載される任意の特徴はまた、任意の他の例又は実施形態の１又は複数の特徴と組み合わせて、又は、任意の他の例又は実施形態の任意の組み合わせで使用され得る。更に、本明細書に記載されない同等物及び改変がまた、請求項において定義される発明の範囲内において採用され得る。

【0177】

本明細書において言及されるすべての公開物は、各個別の公開物が具体的にかつ個別にその全体が参照によって組み込まれることが示される場合と同一の程度で、全体が参照によって組み込まれる。
参考文献
参考文献1. Anzalone et al., (2020) Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology 38, 824-844
参考文献2. Barabas, O., Ronning, D.R., Guynet, C., Hickman, A.B., Ton-Hoang, B., Chandler, M., and Dyda, F. (2008). Mechanism of IS200/IS605 Family DNA Transposases: Activation and Transposon-Directed Target Site Selection. Cell 132, 208-220.
参考文献3. Boocock, M.R., and Rice, P.A. (2013). A proposed mechanism for IS607-family serine transposases. Mob DNA 4, 24.
参考文献4. Chen, W., Mandali, S., Hancock, S.P., Kumar, P., Collazo, M., Cascio, D., and Johnson, R.C. (2018). Multiple serine transposase dimers assemble the transposon-end synaptic complex during IS607-family transposition. ELife 7, e39611.
参考文献5. Clement, K., Rees, H., Canver, M.C., Gehrke, J.M., Farouni, R., Hsu, J.Y., Cole, M.A., Liu, D.R., Joung, J.K., Bauer, D.E., et al. (2019). CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology 37, 224-226.
参考文献6. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819-823.
参考文献7. Crooks, G.E. (2004). WebLogo: A Sequence Logo Generator. Genome Research 14, 1188-1190.
参考文献8. Gillmore et al., (2021) CRISPR-Cas9 in vivo gene-editing for transthyretin amyloidosis. NEJM DOI: 10.1056/NEJMoa2107454, 26 June 2021
参考文献9. Gomes-Filho, J.V., Zaramela, L.S., Italiani, V.C. da S., Baliga, N.S., Vencio, R.Z.N., and Koide, T. (2015). Sense overlapping transcripts in IS1341-type transposase genes are functional non-coding RNAs in archaea. RNA Biol 12, 490-500.
参考文献10. Guynet, C., Hickman, A.B., Barabas, O., Dyda, F., Chandler, M., and Ton-Hoang, B. (2008). In Vitro Reconstitution of a Single-Stranded Transposition Mechanism of IS608. Molecular Cell 29, 302-312.
参考文献11. Hajian et al., (2019) Detection of unamplified target genes via CRISPR-Cas9 immobilized on a graphene field-effect transistor. Nature Biomedical Engineering 3, 427-437
参考文献12. He, S., Hickman, A.B., Dyda, F., Johnson, N.P., Chandler, M., and Ton-Hoang, B. (2011). Reconstitution of a functional IS608 single-strand transpososome: role of non-canonical base pairing. Nucleic Acids Research 39, 8503-8512.
参考文献13. Hickman, A.B., Chandler, M., Dyda, F. (2010) Integrating prokaryotes and eukaryotes: DNA transposases in light of structure. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 45, 50-56.
参考文献14. Hoang, B.T., Pasternak, C., Siguier, P., Guynet, C., Hickman, A.B., Dyda, F., Sommer, S., and Chandler, M. (2010). Single-stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell 142, 398-408.
参考文献15. Islam, M.S., Hua, Y., Ohba, H., Satoh, K., Kikuchi, M., Yanagisawa, T., and Narumi, I. (2003). Characterization and distribution of IS8301 in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans. Genes Genet. Syst. 78, 319-327.
参考文献16. Jiang, F., and Doudna, J. (2017). CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Ann. Rev. Biophys. 46, 505-29.
参考文献17. Jinek, M., East, A., Cheng, A., Lin, S., Ma, E., and Doudna, J. (2013). RNA-programmed genome editing in human cells. ELife 2, e00471.
参考文献18. Kapitonov, V.V., Makarova, K.S., and Koonin, E.V. (2016). ISC, a Novel Group of Bacterial and Archaeal DNA Transposons That Encode Cas9 Homologs. J. Bacteriol. 198, 797-807.
参考文献19. Karvelis, T., Gasiunas, G., Young, J., Bigelyte, G., Silanskas, A., Cigan, M., and Siksnys, V. (2015). Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. Genome Biol 16, 253.
参考文献20. Karvelis, T., Young, J.K., and Siksnys, V. (2019). A pipeline for characterization of novel Cas9 orthologs. In Methods in Enzymology, (Elsevier), pp. 219-240.
参考文献21. Karvelis, T., Bigelyte, G., Young, J.K., Hou, Z., Zedaveinyte, R., Budre, K., Paulraj, S., Djukanovic, V., Gasior, S., Silanskas, A., et al. (2020). PAM recognition by miniature CRISPR-Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage. Nucleic Acids Res 48, 5016-5023.
参考文献22. Kersulyte, D., Mukhopadhyay, A.K., Shirai, M., Nakazawa, T., and Berg, D.E. (2000). Functional Organization and Insertion Specificity of IS607, a Chimeric Element of Helicobacter pylori. Journal of Bacteriology 182, 5300-5308.
参考文献23. Kersulyte, D., Velapatino, B., Dailide, G., Mukhopadhyay, A.K., Ito, Y., Cahuayme, L., Parkinson, A.J., Gilman, R.H., and Berg, D.E. (2002). Transposable Element ISHp608 of Helicobacter pylori: Nonrandom Geographic Distribution, Functional Organization, and Insertion Specificity. Journal of Bacteriology 184, 992-1002.
参考文献24. Knott et al., (2018) CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science 361, 866-869
参考文献25. Krupovic, M., Makarova, K.S., Forterre, P., Prangishvili, D., and Koonin, E.V. (2014). Casposons: a new superfamily of self-synthesizing DNA transposons at the origin of prokaryotic CRISPR-Cas immunity. BMC Biology 12, 36.
参考文献26. Li, H., and Durbin, R. (2009). Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-1760.
参考文献27. Li, H., Handsaker, B., Wysoker, A., Fennell, T., Ruan, J., Homer, N., Marth, G., Abecasis, G., Durbin, R., and 1000 Genome Project Data Processing Subgroup (2009). The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 25, 2078-2079.
参考文献28. Liu, J.-J., Orlova, N., Oakes, B.L., Ma, E., Spinner, H.B., Baney, K.L.M., Chuck, J., Tan, D., Knott, G.J., Harrington, L.B., et al. (2019). CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature 566, 218-223.
参考文献29. Ma H, Tu LC, Naseri A, Chung YC, Grunwald D, Zhang S, Pederson T.. (2018) CRISPR-Sirius: RNA scaffolds for signal amplification in genome imaging. Nat Methods. Nov;15(11):928-931.
参考文献30. Ma H, Tu LC, Naseri A, Huisman M, Zhang S, Grunwald D, Pederson T. (2016) Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol.May;34(5):528-30.
参考文献31. Madeira, F., Park, Y.M., Lee, J., Buso, N., Gur, T., Madhusoodanan, N., Basutkar, P., Tivey, A.R.N., Potter, S.C., Finn, R.D., et al. (2019). The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Res 47, W636-W641.
参考文献32. Makarova, K.S., Wolf, Y.I., Iranzo, J., Shmakov, S.A., Alkhnbashi, O.S., Brouns, S.J.J., Charpentier, E., Cheng, D., Haft, D.H., Horvath, P., et al. (2020). Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol 18, 67-83.
参考文献33. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K.M., Aach, J., Guell, M., DiCarlo, J.E., Norville, J.E., and Church, G.M. (2013). RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339, 823-826.
参考文献34. Maresca et al., (2013). Obligate Ligation-Gated Recombination (ObLiFaRe): Custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research 23, 539-546.
参考文献35. Martin, M. (2011). Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.Journal 17, 10-12.
参考文献36. Mir et al., Heavily and fully modified RNAs guide efficient SpyCas9-mediated genome editing - Nature Communications, 9, Article No. 2641 (2018).
参考文献37. Pasternak, C., Ton-Hoang, B., Coste, G., Bailone, A., Chandler, M., and Sommer, S. (2010). Irradiation-Induced Deinococcus radiodurans Genome Fragmentation Triggers Transposition of a Single Resident Insertion Sequence. PLoS Genet 6, e1000799.
参考文献38. Pasternak, C., Dulermo, R., Ton‐Hoang, B., Debuchy, R., Siguier, P., Coste, G., Chandler, M., and Sommer, S. (2013). ISDra2 transposition in Deinococcus radiodurans is downregulated by TnpB. Molecular Microbiology 88, 443-455.
参考文献39. Pausch, P., Al-Shayeb, B., Bisom-Rapp, E., Tsuchida, C.A., Li, Z., Cress, B.F., Knott, G.J., Jacobsen, S.E., Banfield, J.F., and Doudna, J.A. (2020). CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333-337.
参考文献40. Robinson, J.T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., Guttman, M., Lander, E.S., Getz, G., and Mesirov, J.P. (2011). Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology 29, 24-26.
参考文献41. Sajwan S, Mannervik M (2019) Gene activation by dCas9-CBP and the SAM system differ in target preference. Scientific Reports 9: Article No. 18104
参考文献42. Shmakov, S., Smargon, A., Scott, D., Cox, D., Pyzocha, N., Yan, W., Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Makarova, K.S., Wolf, Y.I., et al. (2017). Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 15, 169-182.
参考文献43. Siguier, P., Perochon, J., Lestrade, L., Mahillon, J., and Chandler, M. (2006). ISfinder: the reference centre for bacterial insertion sequences. Nucleic Acids Res 34, D32-36.
参考文献44. Siguier, P., Gourbeyre, E., and Chandler, M. (2014). Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews 38, 865-891.
参考文献45. Takeda, S.N., Nakagawa, R., Okazaki, S., Hirano, H., Kobayashi, K., Kusakizako, T., Nishizawa, T., Yamashita, K., Nishimasu, H., and Nureki, O. (2020). Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme. Molecular Cell S1097276520308352.
参考文献46. Xiao, R., Li, Z., Wang, S., Han, R., and Chang, L. (2021). Structural basis for substrate recognition and cleavage by the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease. Nucleic Acids Research.
参考文献47. Xu et al., (2019) Viral Delivery Systems for CRISPR. Viruses, 11, No. 28
参考文献48. Zetsche, B., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Slaymaker, I.M., Makarova, K.S., Essletzbichler, P., Volz, S.E., Joung, J., van der Oost, J., Regev, A., et al. (2015). Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell 163, 759-771.

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【配列表】

2024524514000001.app

【国際調査報告】