特表 2024-524534 炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療のための修飾ＩＬ－２ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療のための修飾ＩＬ－２ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/55 20060101AFI20240628BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20240628BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240628BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240628BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240628BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240628BHJP

【ＦＩ】

C07K14/55 ZNA

C07K19/00

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 K

A61K38/20

A61K47/61

A61K47/60

A61K47/64

A61K39/395 Y

A61P29/00

A61P37/08

A61P19/02

A61P17/00

A61P11/06

A61P37/06

A61P13/12

A61P1/16

A61P17/06

A61P9/00

A61P25/00

A61P21/02

A61P1/04

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500133

(86)(22)【出願日】2022-07-09

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 IB2022056367

(87)【国際公開番号】W WO2023281485

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】63/219,989

(32)【優先日】2021-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/219,995

(32)【優先日】2021-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522240265

【氏名又は名称】ブライト ピーク セラピューティクス エージー

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クレフト，ベルトルト

(72)【発明者】

【氏名】パタタビラマン，ウィジャヤ，ラーガヴァン

(72)【発明者】

【氏名】アルバレス サンチェス，ルーベン

(72)【発明者】

【氏名】ミュラー，マガリ

(72)【発明者】

【氏名】キャラロット，ジャン－フィリップ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC18

4C076CC41

4C076EE06

4C076EE16

4C076EE23

4C076EE30

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA37

4C084BA41

4C084CA17

4C084CA41

4C084CA49

4C084DA14

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA36

4C084ZA66

4C084ZA81

4C084ZA89

4C084ZA92

4C084ZA94

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB11

4C084ZB13

4C084ZB15

4C085AA25

4C085BB11

4C085CC01

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045BA56

4H045DA04

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、修飾ＩＬ－２ポリペプチド、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む組成物、その産生方法、及び自己免疫疾患を含む疾患の治療のために修飾ＩＬ－２ポリペプチドを使用する方法に関する。一態様では、本開示は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを使用した自己免疫疾患の治療に関する。いくつかの実施形態では、開示のＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αへの結合の増強及び／又はＩＬ－２受容体βへの結合の減少を示す。別の態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔエフェクター細胞と比較して、制御性Ｔ細胞を活性化する能力の増強を示す。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドであって、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含み、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが最大７個の天然アミノ酸置換を含み、前記７個の天然アミノ酸置換が残基Ｙ３１、Ｋ３５及びＱ７４におけるアミノ酸置換を含み、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項2】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号１に示される配列に対して３、４、５又は６個の天然アミノ酸置換を含む、請求項１に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項3】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、少なくとも１つの非天然アミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項4】

前記少なくとも１つの非天然アミノ酸置換が、
ａ）残基３６～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基、
ｂ）残基６１～８１のいずれか１つに位置するホモセリン残基、及び
ｃ）残基９４～１１４のいずれか１つに位置するホモセリン残基
から選択される、請求項３に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項5】

修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドであって、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含み、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸置換を含み、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸置換が、
ａ）残基３６～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基、
ｂ）残基６１～８１のいずれか１つに位置するホモセリン残基、及び
ｃ）残基９４～１１４のいずれか１つに位置するホモセリン残基
から選択され、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｌ１８、Ｑ２２、Ｎ２９、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｑ７４、Ｌ８０、Ｒ８１、Ｌ８５、Ｉ８６、Ｎ８８、Ｉ８９、Ｉ９２及びＱ１２６から選択される残基において少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含み、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項6】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４又はそれらの組合せを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項7】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１及びＨｓｅ１０４の各々を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項8】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、残基２３、残基３９若しくは残基４６、又はそれらの任意の組合せにおいてノルロイシン（Ｎｌｅ）置換を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項9】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、残基２３、残基３９及び残基４６にＮｌｅ置換を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項10】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８から選択される残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項５～９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項11】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＮ８８Ｄから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項12】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＮ８８Ｄアミノ酸置換のうちの２つ、３つ又は４つを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項13】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ及びＱ７４Ｐアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項14】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、残基Ｎ８８にアミノ酸置換を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項15】

残基Ｎ８８における前記アミノ酸置換がＮ８８Ｄ置換である、請求項１４に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項16】

残基Ｃ１２５における置換を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項17】

Ｃ１２５Ｓ置換を更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項18】

Ｎ末端欠失を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項19】

前記Ｎ末端欠失が単一アミノ酸の欠失である、請求項１８に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項20】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドがＶ６９Ａ置換を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項21】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｉ８９又はＩ９２に天然アミノ酸置換を含まない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項22】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｖ６９Ａ又はＫ４８Ｅ置換を含まない、請求項１～１９又は２１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項23】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、更なる天然アミノ酸置換を含まない、請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項24】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが合成である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項25】

修飾ＩＬ－２ポリペプチドであって、
修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含み、
前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが約０．１ｎＭ～約１００ｎＭであるＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）に対する結合親和性を示し、少なくとも約１０００ｎＭであるＩＬ－２受容体βサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）に対する結合親和性を示す、修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項26】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約２０００ｎＭ、少なくとも約３０００ｎＭ、少なくとも約５０００ｎＭ又は少なくとも約１００００ｎＭであるＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性を示す、請求項１～２５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項27】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、最大で約１００ｎＭ、最大で約７５ｎＭ、最大で約５０ｎＭ、最大で約４０ｎＭ、最大で約３０ｎＭ、最大で約２０ｎＭ、最大で約１０ｎＭ、又は最大で約５ｎＭであるＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性を示す、請求項１～２６のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項28】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２０ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ又は約１ｎＭ～約２０ｎＭであるＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性を示す、請求項１～２７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項29】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、最大で約１００ｎＭ、最大で約７５ｎＭ、最大で約５０ｎＭ、最大で約４０ｎＭ、最大で約３５ｎＭ、最大で約３０ｎＭ又は最大で約２５ｎＭの、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化のＥＣ_５０を有する、請求項１～２８のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項30】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、少なくとも約１０００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化のＥＣ_５０を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項31】

配列番号３～４３のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、修飾ＩＬ－２ポリペプチドであって、配列番号１に対して置換されている参照アミノ配列中の各残基が保持されている、修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項32】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号３、配列番号５、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１又は配列番号４２のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項３１に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項33】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号３に示される配列と少なくとも約９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む、請求項３１に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項34】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、配列番号３に示される配列を含む、請求項３１に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項35】

共有結合したポリマーを更に含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項36】

前記ポリマーが、前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合している、請求項３５に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項37】

前記ポリマーが水溶性ポリマーを含む、請求項３５又は３６に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項38】

前記ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）又はそれらの組合せを含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項39】

前記ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項40】

前記ポリマーがポリエチレングリコールを含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項41】

前記ポリマーが最大約５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項42】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、Ｎ末端残基に結合したコンジュゲーションハンドルを含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項43】

前記Ｎ末端残基が、Ｎ末端アミンに結合している

【化1】

の構造であって、式中、各ｎは独立して１～３０の整数であり、Ｘはコンジュゲーションハンドルである、構造を有する、請求項４２に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項44】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドが、更なるポリペプチドに結合している、請求項１～４３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項45】

前記更なるポリペプチドが、抗体又はその抗原結合断片である、請求項４４に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド。

【請求項46】

請求項１～４５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを発現する宿主細胞。

【請求項47】

前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドを宿主細胞において発現させることを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを産生する方法。

【請求項48】

前記宿主細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項４６又は４７に記載の宿主細胞。

【請求項49】

前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、鳥類細胞又は昆虫細胞である、請求項４６又は４７に記載の宿主細胞。

【請求項50】

前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞又は酵母細胞である、請求項４９に記載の宿主細胞。

【請求項51】

ａ）請求項１～４５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び
ｂ）薬学的に許容される担体又は賦形剤
を含む、医薬組成物。

【請求項52】

炎症性疾患又は障害の治療を必要とする対象において炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、
薬学的有効量の請求項１～４５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は請求項５０に記載の医薬組成物を前記対象に投与すること
を含む、方法。

【請求項53】

前記炎症性疾患又は障害が、炎症（例えば、軟骨炎症）、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ（例えば、活性）、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節性関節リウマチ、少関節性若年性関節リウマチ、多関節性若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、多関節性関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎、反応性関節炎、若年性反応性関節炎、ライター症候群、若年性ライター症候群、若年性皮膚筋炎、若年性強皮症、若年性血管炎、腸性関節炎、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部障害、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性炎、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅斑症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、ベーチェット病、脱毛症、円形脱毛症、総脱毛症、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、スチル病、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、食道好酸球性肝炎、好酸球性肝炎、ギラン・バレー病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病、ステロイド難治性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば、腎臓、肺、心臓、皮膚等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然流産、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、最小変化疾患、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、又はそれらの組合せを含む、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記炎症性疾患又は障害が、自己免疫疾患である、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記自己免疫疾患がＴ細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記炎症性疾患が神経炎症性疾患である、請求項５２に記載の方法。

【請求項57】

請求項１～４５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）前記修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を合成することと、
ｂ）前記断片をライゲーションすることと、
ｃ）ライゲーションされた前記断片をフォールディングすることと、
を含む、方法。

【請求項58】

水溶性ポリマーをフォールディングされたライゲーションされた前記断片に結合させることを更に含む、請求項５７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年７月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１９，９９５号及び２０２１年７月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１９，９８９号の利益を主張し、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、免疫系の調節に重要なサイトカインシグナル伝達分子である。ＩＬ－２は、免疫系が外来細胞型と内因性細胞型との間で分化するのを助け、それによって免疫系が対象自身の細胞を攻撃するのを防ぐことに関与する。ＩＬ－２は、リンパ球によって発現されるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）との相互作用を通じてその活性を達成する。これらの結合相互作用を通して、ＩＬ－２は、Ｔエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の対象の集団を調節することができる。

【0003】

免疫系を調節するＩＬ－２の能力は、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）及びＩＬ－２Ｒβサブユニット（ＣＤ１２２）に対するその異なる親和性によって少なくとも部分的に駆動される。天然のＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγサブユニットからなる中間親和性受容体を介して静止リンパ球に作用する。活性化リンパ球及びＴ_ｒｅｇ細胞は、ＩＬ－２Ｒαサブユニットを更に発現し、これがβ及びγサブユニットと組み合わさってＩＬ－２に対する高い親和性を有する受容体を形成する。高親和性αβγ受容体に作用すると、ＩＬ－２はＴ_ｒｅｇ細胞の活性化及び増殖を増強し、したがって対象の免疫応答を調節することができる。

【0004】

これらの理由から、ＩＬ－２は、単独で、及び他の療法と組み合わせて、免疫系が関与する様々な疾患の治療に使用されてきた。しかし、ＩＬ－２の治療としての使用は、生命を脅かす、時には致命的な血管漏出症候群を含む毒性、並びに８日間にわたって１日３回の投与を必要とするその短い半減期によって制限されてきた。様々なＩＬ－２受容体サブユニットに対する異なる選択性を有する改善されたＩＬ－２ポリペプチド、例えば、治療可能性を高め、ＩＬ－２療法の副作用のリスクを最小限に抑えるためのＩＬ－２Ｒαの結合の増強が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大７個の天然アミノ酸置換を含み、７個の天然アミノ酸置換が残基Ｙ３１、Ｋ３５及びＱ７４におけるアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドが本明細書で提供される。

【0006】

別の態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドであって、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭであるＩＬ－２受容体αサブユニット（ＩＬ－２Ｒα）に対する結合親和性を示し、少なくとも約１０００ｎＭであるＩＬ－２受容体βサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）に対する結合親和性を示す修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む、修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書で提供される。

【0007】

本開示の更なる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され説明される以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の様々な実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、種々の明白な点で修正が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示と見なされるべきであり、限定と見なされるべきではない。

【0008】

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる刊行物及び特許若しくは特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような矛盾する材料に取って代わる及び／又は優先することを意図している。

【図面の簡単な説明】

【0009】

本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴及び利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面（本明細書では「図」及び「ＦＩＧ」も同様である）を参照することによって得られるであろう。

【0010】

【図1】直鎖デプシペプチドとして本明細書中に提供されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチドを合成するために使用される合成スキームを示す図である。

【図2】直鎖デプシペプチドを再配列及びフォールディングして、本明細書中に提供されるようなフォールディングされた修飾ＩＬ－２ポリペプチドを提供するためのスキームを示す図である。

【図3】本明細書中に提供したＰＥＧ化修飾ＩＬ－２ポリペプチドを産生するためのスキームを示す図である。

【図4A】様々な濃度のアルデスロイキン、組成物Ａ及び組成物Ａ１によるＴ_ｅｆｆ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。

【図4B】種々の濃度でのアルデスロイキン、組成物Ａ及び組成物Ａ１によるＴ_ｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化のＭＦＩを示す図である。

【図4C】本明細書中に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドによる種々のＴ細胞サブタイプのＳＴＡＴ５リン酸化のＥＣ５０値を示す図である。

【図5】バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって決定される、ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβサブユニットに対する組成物Ａ１及びアルデスロイキンの結合親和性を示す図である。

【図6】０．１ｍｇ／ｋｇ又は０．３ｍｇ／ｋｇでマウスに皮下投与された組成物Ａ１の薬物動態を示す図である。

【図7】示された用量の投与後の様々な時点における様々なリンパ球集団に対する組成物Ａ１又はアルデスロイキンの免疫薬力学的効果を示す図である。上段左のグラフは、Ｔ_ｒｅｇ％ｐＳＴＡＴ５陽性細胞を示し、上段中央のグラフは、Ｔ_ｅｆｆ％ｐＳＴＡＴ５陽性細胞を示し、上段右のグラフはＮＫ％ｐＳＴＡＴ５陽性細胞を示し、中段左のグラフは、Ｔ_ｒｅｇ％Ｋｉ６７陽性細胞を示し、中段中央のグラフは、Ｔ_ｅｆｆ％Ｋｉ６７陽性細胞を示し、中段右のグラフはＮＫ％Ｋｉ６７陽性細胞を示し、下段左のグラフは、ベースラインに対するＴ_ｒｅｇカウントの倍数変化を示し、下段中央のグラフは、ベースラインに対するＴ_ｅｆｆカウントの倍数変化を示し、下段右のグラフは、ベースラインに対するＮＫカウントの倍数変化を示す。

【図8A】マウスにおけるキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に対する過敏症を遅延させる組成物Ａ１の能力を評価するための実験設計を示す図である。

【図8B】２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間での腫脹の尺度としてｍｍ単位で報告された右耳（ＫＬＨでチャレンジした）と反対側の耳（生理食塩水を注射した）との間の耳厚の差を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡを実施すると、時間（Ｆ（４，２１６）＝４８．１６、ｐ＜０．０００１）及び治療（Ｆ（５，５４）＝１３．７４、ｐ＜０．０００１）の有意な効果が明らかになり、組成物Ａ１による治療によって調節された経時的変化が示唆された。データを平均±ＳＥＭとして報告する（実験群当たりｎ＝１０）。

【図8C】チャレンジ後の全体的な腫脹の尺度として曲線下面積（ＡＵＣ）として報告された右耳（ＫＬＨでチャレンジした）と反対側の耳（生理食塩水を注射した）との間の耳厚の差を示す図である。一元配置ＡＮＯＶＡを実施すると、治療の有意な効果が明らかになり（Ｆ（５，５４）＝１２．５９、ｐ＜０．０００１）、このパラメータが治療によって調節されたことが示唆された。Ｄｕｎｎｅｔｔ検定対ビヒクルの多重比較は、組成物Ａ１が全てのレジメンで耳腫大を有意に減少させることを示した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。データを平均±ＳＥＭとして報告する（実験群当たりｎ＝１０）。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本開示は、治療剤として有用な修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドに関する。本明細書で提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、炎症性又は他の自己免疫疾患を含む様々な疾患及び障害の治療として使用することができる。そのような修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２（配列番号１）又はアルデスロイキン（配列番号２）とは異なるＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に対する結合特性を示し得る。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒα複合体に対する親和性が増加している。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβγ複合体に対する調節されていない親和性を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβγ複合体に対する親和性が低下している。いくつかの実施形態では、本明細書中に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒα受容体サブユニットに対する結合親和性を高めるアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβ受容体サブユニットに対する修飾ＩＬ－２ポリペプチドの親和性を低下させるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２又はアルデスロイキンと比較して、インビボ投与された場合により少ないＴエフェクター（Ｔ_ｅｆｆ）細胞を誘導する生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２又はアルデスロイキンと比較して、インビボで投与した場合、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）を誘導する同等の能力（例えば、ＥＣ_５０が１０倍以下、１００倍以下である）を有する。

【0012】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾アミノ酸残基を含有する。そのような修飾は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１の配列からのアミノ酸の付加若しくは欠失、又はアミノ酸残基への部分の付加等の野生型ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ酸置換の形態をとることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１の配列からの第１のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１の配列を参照配列として使用して、Ｃ１２５Ｓ置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及び／又はＮ８８から選択される１つ以上の残基に置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。これらの置換は、Ｃ１２５Ｓ置換及び／又は配列番号１の配列からの最初のアミノ酸の欠失等のＮ末端欠失と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、Ｙ３１置換は、Ｙ３１Ｈ置換である。いくつかの実施形態では、Ｋ３５置換は、Ｋ３５Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｑ７４置換は、Ｑ７４Ｐ置換である。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、Ｎ８８Ｄ置換である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ置換、Ｋ３５Ｒ置換及びＱ７４Ｐ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ置換、Ｋ３５Ｒ置換、Ｑ７４Ｐ置換及びＮ８８Ｄ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ置換、Ｋ３５Ｓ置換、Ｑ７４Ｐ置換及びＣ１２５Ｓ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ置換、Ｋ３５Ｓ置換、Ｑ７４Ｐ置換、Ｎ８８Ｄ置換及びＣ１２５Ｓ置換を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは合成ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、α－ケト酸－ヒドロキシルアミン（ＫＡＨＡ）アミド形成ライゲーションによって合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、複数のポリペプチド断片を結合して全長修飾ＩＬ－２ポリペプチドを合成するためにＫＡＨＡライゲーション反応中に使用される非天然アミノ酸、例えばホモセリンを含む。いくつかの実施形態では、これらは、修飾ＩＬ－２ポリペプチド中の唯一の非天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、野生型ＩＬ－２又はアルデスロイキンに存在する１つ以上のメチオニン残基においてノルロイシン（Ｎｌｅ）残基置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、２３、３９、及び４６の位置にノルロイシン残基を含む。

【0014】

本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上の非標準アミノ酸（本明細書では「非天然アミノ酸」とも呼ばれる）を含むことができる。「非標準」アミノ酸は、天然に存在するタンパク質に一般に組み込まれる２０個の標準的なアミノ酸の中にないＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を指すことができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸は、１つ以上の非標準アミノ酸で置換されている。非標準アミノ酸には、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－アジドリジン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｎ_３）－ＯＨ）、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－ビフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｂｉｐ－ＯＨ）、及びＮ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｏ－ベンジル－Ｌ－チロシン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ、又はそれらの非保護類似体が含まれるが、これらに限定されない。

【0015】

更に、ポリマーを修飾ＩＬ－２ポリペプチドに添加してもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリペプチドの半減期を増加させるために添加される。かかる半減期延長ポリマーを修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に付加することができる。半減期延長ポリマーは、約６ｋＤａまで、約３０ｋＤａまで、又は約５０ｋＤａまでを含む任意のサイズであり得る。いくつかの実施形態では、半減期延長ポリマーはＰＥＧポリマーである。

【0016】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１から選択される１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を含む。

【0017】

【表1】

【0018】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表２から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0019】

【表2】

【0020】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表３から選択される１つ以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合している。

【0021】

【表3】

【0022】

本明細書中に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドはまた、組換えポリペプチドとして発現されるのではなく、化学的に合成される場合がある。修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、全長修飾ＩＬ－２ポリペプチドの１つ以上の断片を合成し、断片を一緒にライゲーションし、ライゲーションされた全長ポリペプチドをフォールディングすることによって作製することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＣ１２５Ｓ置換と、場合により修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合したＰＥＧポリマーとを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ及びＣ１２５Ｓ置換と、場合により修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合したＰＥＧポリマーとを含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与された場合、調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）細胞増殖又は活性化を増強する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与した場合、Ｔエフェクター細胞（Ｔ_ｅｆｆ）及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を節約しながら、Ｔ_ｒｅｇの増殖又は活性化を増強する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、対象に投与した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を実質的に増加させることなくＴｒｅｇ細胞を増加させる。

【0024】

以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、本開示の範囲内に包含される本開示の多数の変形及び修正が存在することを認識するであろう。

【0025】

本開示の様々な特徴は、単一の実施形態の文脈で記載され得るが、これらの特徴は、別々に又は任意の適切な組合せでも提供され得る。反対に、本開示は、明確にするために別個の実施形態の文脈で本明細書において記載され得るが、本開示は、単一の実施形態でも実施され得る。

【0026】

本明細書で使用される章の見出しは、系統立てのみを目的にしたものであり、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0027】

全ての用語は、それらの用語が当業者によって理解される通りに理解されることが意図されている。別段の定義が為されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0028】

以下の定義は、当技術分野における定義を補足し、本出願を対象とするものであり、関連する又は関連しない事例、例えば、共有される特許又は出願に適用されるべきではない。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本開示の試験のための実施において使用することができるが、本明細書には好ましい材料及び方法が記載されている。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。

【0029】

Ｉ．定義
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。本願では、単数形の使用は、特段明記しない限り複数形の使用を含む。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形も含むことが意図される。

【0030】

本願では、「又は（ｏｒ）」の使用は、特段明記しない限り「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。本明細書で使用される「及び／又は」及び「それらの任意の組合せ」という用語及びそれらの文法上の等価物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組合せが具体的に想定されることを伝えることができる。単に例示を目的として、以下の語句「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの任意の組合せ」は、「Ａ個別、Ｂ個別、Ｃ個別、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＣ、並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味することができる。「又は」という用語は、文脈が特に選言的使用を指す場合を除き、連言的又は選言的に使用することができる。

【0031】

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し得、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内又は１標準偏差超を意味することができる。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、ある値の、５倍以内、又は２倍以内の大きさの程度を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味すると仮定されるべきである。

【0032】

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等の任意のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」等の、任意のｈａｖｉｎｇの形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等の、任意のｉｎｃｌｕｄｉｎｇの形態）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等の任意のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの形態）は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であると考えられる。更に、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用することができる。

【0033】

本明細書における「いくつかの実施形態」、「一実施形態」、「１つの実施形態」又は「他の実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態に含まれるわけではないことを意味する。本開示の理解を容易にするために、多数の用語及び語句を以下に定義する。

【0034】

ＩＬ－２ポリペプチドの残基に「結合している」又は「共有結合している」ポリマーが本明細書で言及される。本明細書で使用される場合、「結合された」又は「共有結合的に結合された」は、ポリマーが示された残基にテザリングされていることを意味し、そのようなテザリングは連結基（すなわち、リンカー）を含むことができる。したがって、残基に「結合した」又は「共有結合した」ポリマーの場合、そのような連結基も包含されることが明確に企図される。

【0035】

結合親和性は、単一分子とそのリガンド／結合パートナとの間の結合相互作用の強度を指す。より高い結合親和性は、より低い結合親和性よりも高い強度の結合を指す。場合によっては、結合親和性は、２つの関連分子間の解離定数（Ｋ_Ｄ）によって測定される。Ｋ_Ｄ値を比較する場合、より低い値を有する結合相互作用は、より高い値を有する結合相互作用よりも高い結合親和性を有する。タンパク質－リガンド相互作用の場合、Ｋ_Ｄは以下の式に従って計算される。

【0036】

【数1】

であって、式中、［Ｌ］はリガンドの濃度であり、［Ｐ］はタンパク質の濃度であり、［ＬＰ］はリガンド／タンパク質複合体の濃度である、式に従って計算される。

【0037】

本明細書では、参照配列に対して特定のパーセント配列同一性を有するか、又は参照配列の位置に対応する位置の残基を指す特定のアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド配列）を指す。配列同一性は、Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、及びＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔのパラメータを使用して、タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定される。このアライメントアルゴリズムはまた、比較される２つの配列のアライメントの分析を通じて残基が「対応する」位置にあるかどうかを評価するために使用される。

【0038】

「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されているか又は承認可能であるか、又はヒトを含む動物における使用のために米国薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを指す。

【0039】

「薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤」は、薬剤と共に対象に投与することができ、その薬理活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である賦形剤、担体又は希釈剤を指す。

【0040】

本開示に適した「薬学的に許容される塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト又は動物の組織と接触して使用するのに適していると当技術分野で一般的に考えられている酸又は塩基の塩であり得る。そのような塩には、アミン等の塩基性残基の無機及び有機酸塩、並びにカルボン酸等の酸性残基のアルカリ又は有機塩が含まれる。特定の医薬塩には、塩酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸等のアルカン酸、ＨＯＯＣ－（ＣＨ_２）ｎ－ＣＯＯＨ（式中、ｎは０～４である）等の酸の塩が含まれるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容されるカチオンには、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム及びアンモニウムが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、本開示及び当技術分野の知識から、更なる薬学的に許容される塩には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）によって列挙されたものが含まれることを認識するであろう。一般に、薬学的に許容される酸又は塩基塩は、任意の従来の化学的方法によって、塩基性又は酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。簡潔には、このような塩は、これらの化合物の遊離酸又は遊離塩基形態を適切な溶媒中で化学量論量の適切な塩基又は酸と反応させることによって調製することができる。

【0041】

本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値の全てに対する省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０、並びに例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９等の前述の整数間の全ての介在する十進値からなる群からの任意の数、数の組合せ又は部分範囲を含むものと理解される。部分範囲に関して、その範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子状部分範囲」が特に企図される。例えば、１～５０の例示的な範囲の入れ子状部分範囲は、一方の方向に１～１０、１～２０、１～３０及び１～４０、又は他方の方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、及び５０～１０を含み得る。

【0042】

「対象」という用語は、治療、観察又は実験の対象である動物を指す。ほんの一例として、対象には、それだけに限らないが、ヒト又は非ヒト哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコが含まれる哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0043】

本明細書で提供される特定の式及び他の例示は、アジド－アルキン環化付加反応から生じるトリアゾール反応生成物を示す。そのような式は、一般に、反応で形成された得られたトリアゾールの単一の位置異性体のみを示すが、式は両方の得られた位置異性体を包含することが意図されている。したがって、式は単一の位置異性体（例えば、

【0044】

【化1】

）のみを示す一方で、他の位置異性体（例えば、

【0045】

【化2】

）も包含されることが意図される。

【0046】

「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、続いて記載される事象又は状況が起こり得るが、起こる必要はないこと、及びその説明が、その事象又は状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。

【0047】

「部分」という用語は、分子の特定のセグメント又は官能基を指す。化学部分は、多くの場合、分子に埋め込まれた又は付加された化学的実体として認識される。

【0048】

本明細書で使用される場合、「グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端」は、以下の構造を有する本明細書で提供されるＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミンの修飾を指す。

【0049】

【化3】

アジド官能性を有すると記載されているが、アジドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドがＮ末端をグルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧと共に含む各場合において、代替的なコンジュゲーションハンドルで置き換えることができると考えられる。

【0050】

「組成物Ａ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号３の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0051】

「組成物Ａ１」は、組成物Ａと、約３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含有するＤＢＣＯとの間に形成される反応生成物を指す。

【0052】

「組成物Ｂ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号４の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0053】

「組成物Ｂ１」は、組成物Ｂと、約３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含有するＤＢＣＯとの間に形成される反応生成物を指す。

【0054】

「組成物Ｃ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号５の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0055】

「組成物Ｃ１」は、組成物Ｂと、約３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含有するＤＢＣＯとの間に形成される反応生成物を指す。

【0056】

「組成物Ｄ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号６の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0057】

「組成物Ｄ１」は、組成物Ｄと、約３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含有するＤＢＣＯとの間に形成される反応生成物を指す。

【0058】

「組成物Ｅ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号７の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0059】

「組成物Ｅ１」は、組成物Ｅと、約３０ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含有するＤＢＣＯとの間に形成される反応生成物を指す。

【0060】

「組成物Ｆ」は、グルタル酸及び０．５ｋＤａアジドＰＥＧを有するＮ末端を含む配列番号８の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを指す。

【0061】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲーションハンドル」は、相補的な反応性基と接触すると結合を形成することができる反応性基を指す。いくつかの例では、コンジュゲーションハンドルは、好ましくは、意図される相補的反応性基を含まない他の分子との実質的な反応性を有さない。コンジュゲーションハンドル、それらのそれぞれの相補的なコンジュゲーションハンドル、及び対応する反応生成物の非限定的な例は、以下の表に見出すことができる。表の見出しは、「コンジュゲーションハンドル」又は「相補的コンジュゲーションハンドル」というタイトルの下に特定の反応性基を記載しているが、コンジュゲーションハンドルへの任意の言及は、代わりに、表に列挙された相補的コンジュゲーションハンドルを包含し得ることを意図している（例えば、トランス－シクロオクテンはコンジュゲーションハンドルであり得、この場合、テトラジンは相補的なコンジュゲーションハンドルである）。いくつかの例では、アミンコンジュゲーションハンドル及びアミンに相補的なコンジュゲーションハンドルは、生物学的系におけるアミンの遍在的存在及び標的外コンジュゲーションの可能性の増加のために、生物学的系における使用にあまり好ましくない。

【0062】

【表4】

【0063】

本明細書で使用される場合、「数平均分子量」（Ｍｎ）という用語は、試料中の全ての個々の単位の統計的平均分子量を意味し、式（１）

【0064】

【数2】

であって、式中、Ｍ_ｉは単位の分子量であり、Ｎ_ｉはその分子量の単位数である、式（２）によって定義される数を意味する。

【0065】

本明細書で使用される場合、「重量平均分子量」（Ｍｗ）という用語は、式（２）

【0066】

【数3】

であって、式中、Ｍ_ｉは単位の分子量であり、Ｎ_ｉはその分子量の単位数である、式（２）によって定義される数を意味する。

【0067】

本明細書で使用される場合、「ピーク分子量」（Ｍｐ）は、所与の分析方法（例えば、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィ、動的光散乱、分析遠心分離等）における最高ピークの分子量を意味する。

【0068】

ＩＩ．説明
一態様では、Ｔ_ｅｆｆ細胞と比較してＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に有利に偏る修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に記載される。一態様では、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、１つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８から選択される残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｙ３１、Ｋ３５及びＱ７４のそれぞれにアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ及びＱ７４Ｐのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８のそれぞれにアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＮ８８Ｄのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＩＬ－２Ｒα受容体への結合に実質的な影響を及ぼす任意の更なる置換を含まない。

【0069】

別の態様では、修飾インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチドを含む修飾ポリペプチドであって、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも実質的に低いＴ_ｅｆｆ細胞を活性化する能力を示す修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｒｅｇ細胞を活性化する能力を保持する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して、Ｔ_ｒｅｇ細胞を活性化する増強された能力を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも少なくとも約４倍低いＩＬ－２Ｒαの解離定数（Ｋ_ｄ）を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも２倍～１０倍低いＩＬ－２Ｒαの解離定数（Ｋ_ｄ）を示す。

【0070】

結合親和性
一態様では、ＩＬ－２受容体αサブユニットに対して配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも大きい親和性を示す修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２受容体サブユニットに対する親和性は、解離定数（Ｋ_ｄ）によって測定される。本明細書で使用される場合、「修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄ」という語句は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとＣＤ２５との結合相互作用の解離定数を意味する。

【0071】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、１０ｎＭ未満、７．５ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、又は３ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約１ｎＭ～０．１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約１０ｎＭ～約０．１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約１０ｎＭ～約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約７．５ｎＭ～約０．１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約７．５ｎＭ～約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約５ｎＭ～約０．１ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド／ＩＬ－２受容体αサブユニットのＫ_ｄは、約５ｎＭ～約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、Ｋ_ｄは、表面プラズモン共鳴によって測定される。

【0072】

いくつかの実施形態では、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりもＩＬ－２受容体αサブユニットに対して少なくとも約１０％、５０％、１００％、２５０％又は５００％大きい親和性を示す修飾ＩＬ－２ポリペプチド。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αサブユニットに対して、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも最大で約５００％、７５０％又は１０００％大きい親和性を示す。

【0073】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αサブユニットに対して、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドよりも約１．５倍～約１０倍大きい親和性を示す。

【0074】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２Ｒαに対して実質的に同じ結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒαとの間のＫ_ｄの約２倍、約４倍、約６倍、約８倍又は約１０倍以内のＩＬ－２Ｒαを有するＫ_ｄを示す。

【0075】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体βサブユニット（ＩＬ－２Ｒβ）に対する低下した親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対して少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍又は少なくとも約５００倍低い親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対して少なくとも約１００倍低い親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対して実質的に親和性を示さない。いくつかの実施形態では、親和性は、解離定数Ｋ_ｄ（例えば、より高い解離定数と相関するより低い親和性）として測定される。

【0076】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１０００ｎＭ、少なくとも５０００ｎＭ、少なくとも１００００ｎＭ、少なくとも５００００ｎＭ又は少なくとも１０００００ｎＭであるＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対して実質的に結合親和性を示さない。

【0077】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβよりも少なくとも約３０倍大きい、少なくとも約５０倍大きい、少なくとも約７５倍大きい、少なくとも約１００倍大きい、少なくとも約５００倍大きい、又は少なくとも約１０００倍大きいＩＬ－２Ｒαに対する親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性よりも少なくとも約１００倍大きいＩＬ－２Ｒαに対する親和性を示す。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２Ｒβに対する親和性よりも少なくとも約１０００倍大きいＩＬ－２Ｒαに対する親和性を示す。

【0078】

生物学的活性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）細胞集団を増殖させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、エフェクターＴ細胞（Ｔ_ｅｆｆ）の増殖を免れる。

【0079】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して最大で中程度に低下したＴ_ｒｅｇ細胞の活性化のための最大半量有効濃度（ＥＣ_５０）を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化を、修飾ＩＬ－２ポリペプチドと接触したときのＴ細胞の集団におけるＳＴＡＴ５リン酸化の変化を評価することによって測定する。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＣＤ４^＋、ＣＤ２５＋及びＦｏｘＰ３^＋であることによって同定される。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５（ＣＤ２５^Ｈｉ）の発現上昇も示すことによって同定される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で約１００ｎＭ、約７５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ又は約２５ｎＭのＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、又は約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、又は約５ｎＭのＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化に対する最大約１００ｎＭのＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化に対する最大約５０ｎＭのＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｒｅｇ細胞の活性化に対する最大約２５ｎＭのＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭ、約１ｎＭ～約１００ｎＭ、約０．１ｎＭ～約５０ｎＭ、約１ｎＭ～約５０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約２５ｎＭ、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ又は約１ｎＭ～約１０ｎＭのＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。

【0080】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して、最大で２倍、最大で５倍、最大で１０倍、最大で２０倍、最大で５０倍、最大で１００倍、最大で２００倍、最大で５００倍、又は最大で１０００倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で２倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で５倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で１０倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で５０倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で１００倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で２００倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で５００倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で１０００倍大きいＴ_ｒｅｇ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。

【0081】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して実質的に大きい、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対する最大半有効濃度（ＥＣ_５０）を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｅｆｆ細胞は、ＣＤ８ Ｔ_ｅｆｆ細胞（例えば、ＣＤ８^＋）、ナイーブＣＤ８細胞（例えば、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋）、若しくはＣＤ４ Ｃｏｎ細胞（例えば、ＣＤ４^＋、ＦｏｘＰ３^－）の１、２、若しくは３、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の活性化を、修飾ＩＬ－２ポリペプチドと接触したときのＴ細胞の集団におけるＳＴＡＴ５リン酸化の変化を評価することによって測定する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約５０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約１０００ｎＭ、少なくとも約２０００ｎＭ、少なくとも約３０００ｎＭ、少なくとも約４０００ｎＭ又は少なくとも約５０００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも約１００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも約５００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも約１０００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも約５０００ｎＭのＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１及び／又は配列番号２のＩＬ－２ポリペプチドと比較して、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍又は少なくとも１０００倍大きいＴ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０が少なくとも１０倍大きい。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０が少なくとも５０倍大きい。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０が少なくとも１００倍大きい。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０が少なくとも５００倍大きい。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞の活性化に対するＥＣ_５０が少なくとも１０００倍大きい。

【0082】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｔ_ｅｆｆ細胞と比較して、Ｔ_ｒｅｇ細胞を活性化する実質的により大きな能力を示す。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、又は少なくとも２００である。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも１００である。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも２００である。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも３００である。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも５００である。いくつかの実施形態では、Ｔ_ｒｅｇ細胞型の活性化のＥＣ５０に対するＴ_ｅｆｆ細胞型の活性化のＥＣ５０の比は、少なくとも１０００である。

【0083】

いくつかの実施形態では、活性化のレベルが、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとのインキュベーションの約０．５時間後～約１時間後に測定される（例えば、インビトロ実験のために細胞を固定する０．５時間～１時間前）。

【0084】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、半減期延長のための共有結合ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、血漿又は血清半減期延長のための共有結合ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーが結合した修飾ＩＬ－２ポリペプチドの血漿中又は血清中半減期は、ポリマーが結合していない野生型ＩＬ－２ポリペプチド（配列番号１）又はアルデスロイキン（配列番号２）の血漿中又は血清中半減期と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍長い。

【0085】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドの血漿又は血清半減期は、半減期延長ポリマーを含まない修飾ＩＬ－２ポリペプチドの血漿又は血清半減期と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍長い。

【0086】

部位特異的修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての野生型ヒトＩＬ－２ポリペプチドに基づく。

【0087】

本明細書中に記載されるポリペプチドに対する修飾は、アミノ酸置換、種々の官能基の付加、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又はタンパク質若しくはタンパク質断片の野生型バージョンの任意の他の修飾を包含する。ポリペプチドに付加され得る官能基としては、ポリマー、リンカー、アルキル基、検出可能な分子、例えば発色団又はフルオロフォア、反応性官能基、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの個々のアミノ酸に官能基が付加される。いくつかの実施形態では、官能基は、ポリペプチドに部位特異的に付加される。

【0088】

一態様では、１つ以上のアミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－２受容体サブユニット（例えば、α、β又はγサブユニット）又はＩＬ－２受容体複合体（例えば、ＩＬ－２受容体αβγ複合体又はβγ複合体）に対する修飾ＩＬ－２ポリペプチドの結合特性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２受容体サブユニット又はＩＬ－２受容体複合体との間の結合相互作用の界面上の位置にある。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－２受容体αβγ複合体又はαサブユニットに対する親和性の増加を引き起こす。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＬ－２受容体βγ複合体又はβサブユニットに対する親和性の低下を引き起こす。

【0089】

一態様では、ＷＴ ＩＬ－２（配列番号１）と比較して天然アミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大７個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大６個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大４個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大３個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３～７個、３～６個、３～５個、３～４個、４～７個、４～６個、４～５個、５～７個、５～６個又は６～７個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個又は少なくとも６個のアミノ酸置換を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８Ｄの少なくとも１つに天然アミノ酸置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８の少なくとも２つの天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８の少なくとも３つの天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８のそれぞれに天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、アミノ酸置換Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＮ８８Ｄを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、任意のＣ１２５置換（例えば、Ｃ１２５Ｓ又はＣ１２５Ａ）を更に含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ａ１の任意のＡ１欠失又は置換を更に含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、任意のＡ１欠失を更に含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｙ３１置換は、芳香族アミノ酸に対するものである。いくつかの実施形態では、Ｙ３１置換は、塩基性アミノ酸に対するものである。いくつかの実施形態では、塩基性アミノ酸は、弱塩基性である。いくつかの実施形態では、Ｙ３１置換は、Ｙ３１Ｆ、Ｙ３１Ｈ、Ｙ３１Ｗ、Ｙ３１Ｒ及びＹ３１Ｋから選択される。いくつかの実施形態では、Ｙ３１置換は、Ｙ３１Ｈである。

【0092】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｋ３５置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｋ３５置換は、塩基性アミノ酸に対するものである。いくつかの実施形態では、Ｋ３５置換は、正に帯電したアミノ酸に対するものである。いくつかの実施形態では、Ｋ３５置換は、Ｋ３５Ｒ、Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ、又はＫ３５Ｑである。いくつかの実施形態では、Ｋ３５置換はＫ３５Ｒである。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｑ７４置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｑ７４置換は環状アミノ酸である。いくつかの実施形態では、環状アミノ酸は、α炭素に共有結合した環状基及びα炭素に結合した窒素を含む。いくつかの実施形態では、Ｑ７４置換は、Ｑ７４Ｐである。

【0094】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｎ８８置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、荷電アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、負に荷電したアミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、Ｎ８８Ｄ又はＮ８８Ｅである。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、Ｎ８８Ｄ又はＮ８８Ｅである。いくつかの実施形態では、Ｎ８８置換は、Ｎ８８Ｄである。

【0095】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｃ１２５置換を含み、ここで、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｃ１２５置換は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを安定化する。いくつかの実施形態では、Ｃ１２５置換は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの活性を実質的に変化させない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｃ１２５Ｓ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｃ１２５Ａ置換を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ａ１に修飾を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾は、Ａ１欠失である。

【0097】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、更なるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αサブユニット又はαβγ複合体への結合に影響を及ぼす追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体βサブユニット又はβγ複合体への結合に影響を及ぼす追加のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１から選択される少なくとも１つの更なるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｉ８９又はＩ９２に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２から選択される残基に１、２、３又は４個の天然アミノ酸置換を含み、いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｉ８９又はＩ９２から選択される残基に１、２、３又は４個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２から選択される残基に１個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは２個を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２から選択される残基に最大２個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２から選択される残基に最大３個の天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ又はＥ１５Ｓを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｎ２９Ｓを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｎ３０Ｓを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｔ３７Ａ又はＴ３７Ｒを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換はＫ４８Ｅを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換はＶ６９Ａを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｎ７１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｈ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｑ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｔ、Ｎ８８Ｖ又はＮ８８Ｗを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｎ８８Ｄを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｉ８９Ｖを含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸置換は、Ｉ９２Ｋ又はＩ９２Ｒを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及び場合によりＣ１２５Ｓにおける置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αサブユニット又はαβγ複合体への結合に実質的に影響を及ぼすいかなる追加の置換も含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体βサブユニット又はβγ複合体への結合に影響を及ぼす更なるアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１で特定された位置から選択される更なる天然アミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１から選択される更なるアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２に更なる天然アミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｎ８８、Ｉ８９又はＩ９２に更なるアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｋ４８置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｋ４８Ｅ置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９又はＫ４８に置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９又はＫ４８のいずれかに置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ又はＫ４８Ｅ置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ又はＫ４８Ｅ置換のいずれも含まない。

【0099】

いくつかの実施形態では、本明細書中に提供した修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４、Ｎ８８及び場合によりＣ１２５Ｓにおける置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体αサブユニット又はαβγ複合体への結合に実質的に影響を及ぼすいかなる追加の置換も含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２受容体βサブユニット又はβγ複合体への結合に影響を及ぼす追加のアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１で特定された位置から選択される更なる天然アミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表１から選択される更なるアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｉ８９又はＩ９２に更なる天然アミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基Ｅ１５、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｔ３７、Ｋ４８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｉ８９又はＩ９２に更なるアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｋ４８置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｋ４８Ｅ置換を有さない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９又はＫ４８に置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９又はＫ４８のいずれかに置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ又はＫ４８Ｅ置換を含まない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｖ６９Ａ又はＫ４８Ｅ置換のいずれも含まない。

【0100】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｎ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、又はそれを超えるアミノ酸のものである。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、少なくとも１アミノ酸のものである。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０アミノ酸のものである。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、１から１５アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｎ末端欠失は、単一アミノ酸（例えば、配列番号１のＡ１欠失）の欠失である。

【0101】

本明細書中に記載されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる。「非天然」アミノ酸は、天然に存在するタンパク質に一般に組み込まれる２０個の標準的なアミノ酸の中にないＤ型又はＬ型のアミノ酸残基を指すことができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸は、１つ以上の非天然アミノ酸で置換されている。非天然アミノ酸には、Ｌ－アジドリジン及びＬ－ビフェニルアラニンが含まれるが、これらに限定されない。

【0102】

例示的な非天然アミノ酸はまた、ホモセリン、ノルロイシン、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、チロシンアミノ酸の類似体、グルタミンアミノ酸の類似体、フェニルアラニンアミノ酸の類似体、セリンアミノ酸の類似体、トレオニンアミノ酸の類似体、β－アミノ酸、プロリン又はヒスチジン以外の環状アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン以外の芳香族アミノ酸、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、β－アミノ酸、ホモアミノ酸及び環状アミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリオ酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ^α－エチルグリシン、Ｎ^α－エチルアスパラギン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ^α－メチルグリシン、Ｎ^α－メチルイソロイシン、Ｎ^α－メチルバリン、γ－カルボキシグルタマート、Ｎ^α－アセチルセリン、Ｎ^α－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、及び／又は他の類似のアミノ酸を含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される非天然アミノ酸置換は、特に明記しない限り、本明細書に提供される天然アミノ酸置換の任意の組合せに加えてＩＬ－２ポリペプチドに組み込むことができる。例えば、例えば、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ及びＱ７４Ｐの天然アミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが記載される場合、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、非天然アミノ酸置換（例えば、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４、Ｎｌｅ２３、Ｎｌｅ３９、及びＮｌｅ４６）も含み得ることが明確に企図される。別の例として、本明細書において提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドがＹ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｑ７４Ｐ及びＮ８８Ｄ天然アミノ酸置換を有するものとして記載される場合、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、非天然アミノ酸置換（例えば、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４、Ｎｌｅ２３、Ｎｌｅ３９、及びＮｌｅ４６）を更に含むことができる。特に、本明細書中に提供される組換え修飾ＩＬ－２ポリペプチド中に存在する天然アミノ酸置換の任意の組合せを、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの合成バージョン（例えば、対応する修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４、Ｎｌｅ２３、Ｎｌｅ３９及びＮｌｅ４６を含む））に組み込むこともできる。

【0104】

一態様では、１つ以上の非天然アミノ酸置換を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも２つの非天然アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｙ３１、Ｋ３５、Ｑ７４及びＮ８８から選択される残基に少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基位置ナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基３６～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基６１～８１のいずれか１つに位置するＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基９４～１１４のいずれか１つに位置するＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１、２、３又はそれを超えるＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１、Ｈｓｅ１０４、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１、Ｈｓｅ７１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸置換を含み、ここで、その少なくとも２つのアミノ酸置換は、（ａ）残基３６～４５のいずれか１つに位置するホモセリン（Ｈｓｅ）残基から選択される。（ｂ）残基６１～８１のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基９４～１１４のいずれか１つに位置するホモセリン残基いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１及びＨｓｅ７１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ７１及びＨｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ４１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ７１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｈｓｅ１０４を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１、２、３又はそれを超えるノルロイシン（Ｎｌｅ）残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基１８～２８のいずれか１つに位置するＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基３４～５０のいずれか１つに位置する１つ以上のＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、残基２０～６０のいずれか１つに位置するＮｌｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３つのＮｌｅ置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｎｌｅ２３、Ｎｌｅ３９及びＮｌｅ４６を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、Ａ１欠失を有する配列番号３を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表７に提供される配列番号３～４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３～４３のいずれか１つの配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３～４３のいずれか１つの配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１に対して置換されている参照アミノ配列中の各残基が保持されている。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３の配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対して配列番号３で置換されている各残基が保持されている、配列番号３の配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号１に対して配列番号４で置換されている各残基が保持されている、配列番号４の配列と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0106】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号３と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、及びＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔのパラメータを使用して、タンパク質－タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって測定される。

【0107】

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個又は少なくとも９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３個又は４個のアミノ酸置換、３個～５個のアミノ酸置換、３個～６個のアミノ酸置換、３個～７個のアミノ酸置換、３個～９個のアミノ酸置換、４個又は５個のアミノ酸置換、４個～６個のアミノ酸置換、４個～７個のアミノ酸置換、４個～９個のアミノ酸置換、５個又は６個のアミノ酸置換、５個～７個のアミノ酸置換、５個～９個のアミノ酸置換、６個又は７個のアミノ酸置換、６個～９個のアミノ酸置換、又は７個～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３個のアミノ酸置換、４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換又は９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、最大で４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換又は９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が表１から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換が表２から選択される。

【0108】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾天然アミノ酸残基の置換を含み、修飾天然アミノ酸残基は、修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、ポリマー）へのコンジュゲーション反応又は様々なペイロードの結合を容易にするために使用することができる更なる官能基の結合のために使用することができる。置換は、追加の官能基（例えば、アスパラギン酸／アスパラギンシステイン、グルタミン酸／グルタミン、リジン、セリン、トレオニン又はチロシン）、任意の天然アミノ酸の修飾バージョンの誘導体、又は任意の非天然アミノ酸（例えば、所望の反応性基を含有するアミノ酸、例えば、アジド、アルキン等のＣＬＩＣＫ化学試薬）の結合により適した天然アミノ酸に対するものであり得る。修飾天然アミノ酸残基の非限定的な例としては、以下に提供される修飾リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸及びシステインが挙げられる。

【0109】

【化4】

式中、各ｎは１～３０の整数である。同様に修飾され得る天然アミノ酸の他の例としては、ポリマー基をアミノ酸に連結するのに適した基と容易に結合を形成することができるヘテロ原子を有するものが挙げられる（例えば、チロシン、セリン、トレオニン）。修飾アミノ酸残基のこれらの非限定的な例は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに更なる官能基（例えば、ポリマー又は更なるポリペプチド）を付加することが望ましい任意の位置で使用することができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ポリマーを含む末端残基（例えば、Ｎ末端残基又はＣ末端残基）の修飾を含む。いくつかの実施形態では、末端残基に対する修飾は、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの末端残基に対するコンジュゲーションハンドルの結合を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基を介して修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミノ基を介して修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合している。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、グルタリルアミノ－ＰＥＧリンカーを介して修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミノ基に結合している。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミノ基に、構造

【0111】

【化5】

を有する付加により結合され、
式中、各ｎは、独立して、１～３０の整数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）であり、Ｘは、コンジュゲーションハンドル（例えば、本明細書に提供されるアジド又は他のコンジュゲーションハンドル、例えばＤＢＣＯ基）である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは上記付加物を含むが、コンジュゲーションハンドルＸは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを更なる部分（例えば、より大きなポリマー又は更なるポリペプチド）に連結するコンジュゲーションハンドル及び相補的コンジュゲーションハンドル（例えば、１，２，３－トリアゾール）の反応生成物で置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端アミノ基は、以下の構造を有する付加物を含む。

【0112】

【化6】

【0113】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、更なるポリペプチドと連結される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチド及び追加ポリペプチドは融合ポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドと追加のポリペプチドを共にコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチドは、抗体又はその結合断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、それらの任意の断片、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体又はその任意の断片（例えば、抗原結合断片）である。

【0114】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、更なるポリペプチドにコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、抗体にコンジュゲートされない。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、抗ＴＮＦα抗体にコンジュゲートされない。

【0115】

ポリマー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、その上に共有結合した１つ以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに共有結合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるポリマーを含む。いくつかの実施形態では、記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合したポリマーを含む。本明細書で提供されるポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの残基に直接結合していてもよく、小さな連結基（例えば、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに組み込まれたコンジュゲーションハンドルとの反応によって結合される）を介して結合していてもよい。

【0116】

本明細書で提供されるポリマーは、ＩＬ－２ポリペプチドの任意の所望の残基に結合することができる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２受容体又は特異的ＩＬ－２受容体サブユニット（例えば、ＩＬ－２受容体αサブユニット）との結合に影響を及ぼさない残基に結合することが好ましい。いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端又はその近くに結合している。いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、Ｎ末端は、ＩＬ－２ポリペプチドの残基Ａ１であり、残基の位置のナンバリングは、参照配列としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｎ末端は、ＩＬ－２ポリペプチドの残基Ｐ２であり、残基の位置のナンバリングは、参照配列（例えば、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、配列からの残基Ａ１の欠失を含む）としての配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２受容体βサブユニットとの結合を遮断又は減少させる残基位置に結合している。そのような残基位置は、参照によりその全体が本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０２００２３１６４４号明細書に提供されており、例えば、残基位置Ｋ８、Ｋ９、Ｌ１２、Ｅ１５、Ｈ１６、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｑ２２、Ｍ２３、Ｎ２６、Ｄ８４、Ｎ８８、Ｅ９５、及びＱ１２６を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、ポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは多糖類である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリ（エチレンオキシド）である。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、ＩＬ－２ポリペプチドのＮ末端に共有結合したポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それに共有結合した第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それに共有結合した第２及び第３のポリマーを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、ポリマー等の付着したポリマーは、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約６，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約３０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、又は約３０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、又は約５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、少なくとも約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、又は約３０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、最大で約１０，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、又は約５０，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0120】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端に結合したポリマー等の結合ポリマーは、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、又は約５００ダルトン～約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、少なくとも約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、又は約５００ダルトンの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、ポリマーは、最大で約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、又は約１，０００ダルトンの重量平均分子量を有する。

【0121】

いくつかの実施形態では、付着したポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレンオキシド）等のポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、修飾ポリ（アルキレンオキシド）を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つ以上のリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー基は、アミド基、エステル基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基等の二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカー基は、アミドリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つ以上のスペーサー基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー基は、置換又は非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー基は、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、又は－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－を含む。いくつかの実施形態では、リンカー基は、双直交反応（例えば、生体適合性及び選択的反応）の生成物である。いくつかの実施形態では、生体直交反応は、Ｃｕ（Ｉ）触媒又は「銅フリー」アルキン－アジドトリアゾール形成反応、シュタウディンガーライゲーション、逆電気オンデマンド型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応、「写真クリック」化学、又はオレフィンメタセシス及び鈴木－宮浦若しくは薗頭クロスカップリング等の金属媒介プロセスである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、クリック化学を介してＩＬ－２ポリペプチドに結合される。

【0123】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドと、抗体及びポリマー（例えば、更なるより大きなポリマー）等の誘導体化分子又は部分とのコンジュゲーションを容易にする反応基を含む。いくつかの実施形態では、反応基は、カルボン酸由来の活性エステル、混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルアジド、ハロゲン化アルキル、Ｎ－マレイミド、イミノエステル、イソシアナート、及びイソチオシアナートの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、反応基はアジドを含む。いくつかの実施形態では、反応基は、アルキンを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、更なる部分を修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、抗体等の更なるポリペプチドの付加）に更に結合させるために使用することができるコンジュゲーションハンドルを含む。別の部分に結合した相補的反応性基と反応することができる任意の適切な反応性基をコンジュゲーションハンドルとして使用することができる。

【0125】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、コンジュゲーションハンドル、又は相補的なコンジュゲーションハンドルを有するコンジュゲーションハンドルの反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物は、ＫＡＴライゲーション（アシルトリフルオロホウ酸カリウムとヒドロキシルアミンとの反応）、シュタウディンガーライゲーション（アジドとホスフィンとの反応）、テトラジン環化付加（テトラジンとトランス－シクロオクテンとの反応）、又はヒュスゲン環化付加（アルキンとアジドとの反応）から生じる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、コンジュゲーションハンドルと、ポリマーを修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合させるために使用された相補的なコンジュゲーションハンドルとの反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはアジド部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはアルキン部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、アジド部分、アルキン部分、又はアジド－アルキン環化付加反応の反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、アジド－アルキン付加環化反応の反応生成物は、１，２，３－トリアゾールである。

【0126】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、二官能性リンカーの使用によって修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、二官能性リンカーは、修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、システインスルフヒドリル）上のアミノ酸残基の反応性基と反応して共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、第２の工程において、二官能性リンカー（例えば、アジド又はアルキン等のコンジュゲーションハンドル）の第２の反応性基を使用して、ポリマー等の第２の部分を結合させる。

【0127】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、式（Ｘ）：

【0128】

【化7】

の構造であって、
式中、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｌ^５、Ｌ^６、Ｌ^７、Ｌ^８及びＬ^９のそれぞれは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓ－、－Ｓ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物、又は存在しない、（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）であり、
各Ｒ^Ｌは、独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数であり、
式中、各

【0129】

【化8】

は、修飾ＩＬ－２ポリペプチド又はポリマーのポリマー部分への結合点である、構造を含むリンカーを含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、式（Ｘ’）：

【0131】

【化9】

の構造であって、
式中、Ｌ’のそれぞれは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲ^Ｌ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－、－Ｎ（Ｒ^Ｌ）_２ ^＋－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ^Ｌ）Ｏ－、－Ｓ－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｓ－、－Ｓ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｓ（＝Ｏ）－、－Ｓ（＝Ｏ）_２－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）ＮＲ^Ｌ－、－ＮＲ^ＬＣ（＝Ｓ）ＮＲ^Ｌ－、－ＣＲ^Ｌ＝Ｎ－、－Ｎ＝ＣＲ^Ｌ、－ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｌ－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ＬＳ（＝Ｏ）_２－、－Ｓ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ＬＣ（＝Ｏ）－、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_６ヘテロアルキレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルキニレン、置換若しくは非置換Ｃ_６～Ｃ_２０アリーレン、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_２０ヘテロアリーレン、－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）_ｑａ－、－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｑｂ－、－（ＣＨ_２－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ）_ｑｃ－、－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２）_ｑｄ－、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物、又は存在しない、（Ｃ_１～Ｃ_６アルキレン）であり、
各Ｒ^Ｌは、独立して、水素、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４アルキル、置換若しくは非置換Ｃ_１～Ｃ_４ヘテロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_６アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_５アルキニル、置換若しくは非置換Ｃ_３～Ｃ_８シクロアルキル、置換若しくは非置換Ｃ_２～Ｃ_７ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、又は置換若しくは非置換ヘテロアリールであり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄの各々は独立して１～１００の整数であり、
ｇは、１～１００の整数であり、
式中、各

【0132】

【化10】

が、修飾ＩＬ－２ポリペプチド又はポリマーのポリマー部分への結合点である、構造を含むリンカーを含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、表４から選択されるリンカーを含むポリマーを含む。表４において、各

【0134】

【化11】

は、修飾ＩＬ－２ポリペプチド（例えば、修飾ＩＬ－２ポリペプチドのアミノ基）又はポリマーのポリマー部分のいずれかに対する結合点である。

【0135】

【表5】

【0136】

いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、１本のポリエチレングリコール鎖～１０本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、１本のポリエチレングリコール鎖～２本のポリエチレングリコール鎖、１本のポリエチレングリコール鎖～４本のポリエチレングリコール鎖、１本のポリエチレングリコール鎖～６本のポリエチレングリコール鎖、１本のポリエチレングリコール鎖～１０本のポリエチレングリコール鎖、２本のポリエチレングリコール鎖～４本のポリエチレングリコール鎖、２本のポリエチレングリコール鎖～６本のポリエチレングリコール鎖、２本のポリエチレングリコール鎖～１０本のポリエチレングリコール鎖、４本のポリエチレングリコール鎖～６本のポリエチレングリコール鎖、４本のポリエチレングリコール鎖～１０本のポリエチレングリコール鎖、又は６本のポリエチレングリコール鎖～１０本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、１本のポリエチレングリコール鎖、２本のポリエチレングリコール鎖、４本のポリエチレングリコール鎖、６本のポリエチレングリコール鎖、又は１０本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、少なくとも１本のポリエチレングリコール鎖、２本のポリエチレングリコール鎖、４本のポリエチレングリコール鎖、又は６本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、最大で２本のポリエチレングリコール鎖、４本のポリエチレングリコール鎖、６本のポリエチレングリコール鎖、又は１０本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは４本のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、式（Ｉ）

【0137】

【化12】

の構造であって、式中、各ｍは独立して４～３０の整数である、構造を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの少なくとも１つのポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩ）

【0138】

【化13】

の構造であって、式中、各ｍは独立して４～３０の整数であり、各ｎは独立して１～１０の整数である、構造を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各ポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩ）の構造を含む。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｍは４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０である。式（ＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である。

【0139】

いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、約５～約３００個、約１０～約２００個、約２０～約１００個又は約２５～約５０個のエチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、５個のエチレングリコール単位～３００個のエチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、５エチレングリコール単位～１０エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～２０エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～２５エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～５０エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～１００エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、５エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～２０エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～２５エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～５０エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～１００エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、１０エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、２０エチレングリコール単位～２５エチレングリコール単位、２０エチレングリコール単位～５０エチレングリコール単位、２０エチレングリコール単位～１００エチレングリコール単位、２０エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、２０エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、２５エチレングリコール単位～５０エチレングリコール単位、２５エチレングリコール単位～１００エチレングリコール単位、２５エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、２５エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、５０エチレングリコール単位～１００エチレングリコール単位、５０エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、５０エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、１００エチレングリコール単位～２００エチレングリコール単位、１００エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位、又は２００エチレングリコール単位～３００エチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、５個のエチレングリコール単位、１０個のエチレングリコール単位、２０個のエチレングリコール単位、２５個のエチレングリコール単位、５０個のエチレングリコール単位、１００個のエチレングリコール単位、２００個のエチレングリコール単位又は３００個のエチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、少なくとも５個のエチレングリコール単位、１０個のエチレングリコール単位、２０個のエチレングリコール単位、２５個のエチレングリコール単位、５０個のエチレングリコール単位、１００個のエチレングリコール単位又は２００個のエチレングリコール単位を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、最大で１０個のエチレングリコール単位、２０個のエチレングリコール単位、２５個のエチレングリコール単位、５０個のエチレングリコール単位、１００個のエチレングリコール単位、２００個のエチレングリコール単位又は３００個のエチレングリコール単位を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、直鎖又は分岐鎖である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、直鎖ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、分岐ポリエチレングリコールである。例えば、いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリマーの各々は、直鎖ポリエチレングリコール鎖を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アミド又はアミノ基で独立して末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アミノ基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アミド基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アルコキシ基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、アルキル基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の各々は、独立して、ヒドロキシ基で末端がキャップされている。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリエチレングリコール鎖は、独立して、構造

【0142】

【化14】

であって、式中、ｎは４～３０の整数である、構造を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリエチレングリコール鎖は、独立して、構造

【0143】

【化15】

であって、式中、ｍは４～３０の整数である、構造を有する。

【0144】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、それに共有結合した複数のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、各ポリマーは水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、多糖類、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーはポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーはポリエチレングリコールである。

【0145】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、共有結合した１～１０個の水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、共有結合した１～１０個の水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、１又は２の共有結合水溶性ポリマー、１～３共有結合水溶性ポリマー、１～４共有結合水溶性ポリマー、１～６共有結合水溶性ポリマー、１～８共有結合水溶性ポリマー、１～１０共有結合水溶性ポリマー、２又は３共有結合水溶性ポリマー、２～４共有結合水溶性ポリマー、２～６共有結合水溶性ポリマー、２～８共有結合水溶性ポリマー、２～１０共有結合水溶性ポリマー、３又は４共有結合水溶性ポリマー、３～６共有結合水溶性ポリマー、３～８共有結合水溶性ポリマー、３～１０共有結合水溶性ポリマー、４～６共有結合水溶性ポリマー、４～８共有結合水溶性ポリマー、４～１０共有結合水溶性ポリマー、６～８共有結合水溶性ポリマー、６～１０共有結合水溶性ポリマー、又は８～１０共有結合水溶性ポリマーを含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができる水溶性ポリマーは、式（Ａ）の構造：

【0147】

【化16】

を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができる水溶性ポリマーは、式（Ｂ）の構造：

【0149】

【化17】

を含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができる水溶性ポリマーは、式（Ｃ）の構造：

【0151】

【化18】

を含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができる水溶性ポリマーは、式（Ｄ）の構造：

【0153】

【化19】

を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合することができる水溶性ポリマーは、式（Ｅ）の構造を含む。

【0155】

【化20】

【0156】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合した水溶性ポリマーは、１つ以上のリンカー及び／又はスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のリジン基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合した水溶性ポリマーは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の構造又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合した水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）の構造又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドに結合した水溶性ポリマーは、以下の構造を含む。

【0157】

【化21】

【0158】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端に結合した水溶性ポリマーは、１つ以上のリンカー及び／又はスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のリンカーは、１つ以上のリジン基を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端に結合した水溶性ポリマーは、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、又はそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端に結合した水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、式（Ｅ）の構造、又はそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、付着した水溶性ポリマーは、以下の構造を含む。

【0159】

【化22】

【0160】

いくつかの実施形態では、ポリマーは、適切な前駆体材料から合成される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、構造５、構造６、構造７、又は構造８の前駆体材料から合成され、構造５は、

【0161】

【化23】

であり、
構造６は、

【0162】

【化24】

であり、
構造７は、

【0163】

【化25】

であり、
また、構造８は、

【0164】

【化26】

である。

【0165】

ＩＩＩ．組成物医薬製剤
一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬製剤が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、複数の修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、糖質、無機塩、抗酸化剤、界面活性剤又は緩衝剤から選択される１つ以上の賦形剤を更に含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、薬学的製剤は糖質を更に含む。特定の実施形態では、糖質は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオスラフィノース、メレチトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0167】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は無機塩を含む。特定の実施形態では、無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

【0168】

特定の実施形態では、医薬製剤は抗酸化剤を含む。特定の実施形態では、抗酸化剤は、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸カリウム、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0169】

特定の実施形態では、医薬製剤は界面活性剤を含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、ソルビタンエステル、脂質、リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、ＥＤＴＡ、亜鉛、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0170】

特定の実施形態では、医薬製剤は緩衝剤を含む。特定の実施形態では、緩衝剤は、クエン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、エタノールアミン、ヒスチジン、アミノ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、乳酸、トリス、ＨＥＰＥＳ、又はそれらの組合せからなる群から選択される。

【0171】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、非経口投与又は経腸投与のために調製される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、静脈内又は皮下投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥形態である。

【0172】

一態様では、本明細書に記載されるのは、記載される修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む液体又は凍結乾燥製剤である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは凍結乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末を緩衝溶液に再懸濁する。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、緩衝剤、糖、塩、界面活性剤、又はそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩はナトリウムＮａ_２ＨＰＯ_４である。いくつかの実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はマンニトールを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末を、１０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝剤ｐＨ７．５、０．０２２％ＳＤＳ及び５０ｍｇ／ｍＬマンニトールを含む溶液に懸濁する。

【0173】

剤形
本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、様々な剤形であり得る。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを凍結乾燥粉末として投入する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを懸濁液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを溶液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを注射可能な溶液として投与する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドをＩＶ溶液として投与する。

【0174】

ＩＶ．処理方法
１つの態様において、本明細書中に記載されるのは、自己免疫疾患又は自己免疫障害の治療を必要とする対象における自己免疫疾患又は自己免疫障害を治療する方法であって、有効量の本明細書中に記載されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法である。１つの態様では、本明細書中に記載されるのは、炎症性疾患又は障害の治療を必要とする対象において炎症性疾患又は障害を治療する方法であって、有効量の本明細書中に記載されるような修飾ＩＬ－２ポリペプチド又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は障害は、炎症（例えば、軟骨炎症）、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、関節炎、関節リウマチ（例えば、活性）、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、少関節性関節リウマチ、少関節性若年性関節リウマチ、多関節性若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性乾癬性関節炎、乾癬性関節炎、多関節性関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎、反応性関節炎、若年性反応性関節炎、ライター症候群、若年性ライター症候群、若年性皮膚筋炎、若年性強皮症、若年性血管炎、腸性関節炎、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部障害、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、血管炎、筋炎、多発性炎、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、動脈炎、リウマチ性筋痛症、サルコイドーシス、硬化症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅斑症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、疱疹状皮膚炎、ベーチェット病、脱毛症、円形脱毛症、総脱毛症、アテローム性動脈硬化症、狼瘡、スチル病、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、喘息、ＣＯＰＤ、鼻副鼻腔炎、ポリープを伴う鼻副鼻腔炎、食道好酸球性肝炎、好酸球性肝炎、ギラン・バレー病、甲状腺炎（例えば、グレーブス病）、アジソン病、レイノー現象、自己免疫性肝炎、移植片対宿主病、ステロイド難治性慢性移植片対宿主病、移植拒絶反応（例えば、腎臓、肺、心臓、皮膚等）、腎臓損傷、Ｃ型肝炎誘発性血管炎、自然流産、白斑、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、最小変化疾患、膜性腎症、ＡＮＣＡ関連糸球体腎症、膜増殖性糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、又はそれらの組合せを含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、炎症性疾患又は障害は神経炎症性障害である。いくつかの実施形態では、神経炎症性障害は、視神経脊髄炎スペクトラム障害、多発性硬化症、抗ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質抗体障害、自己免疫性皮膚炎、横断性脊髄炎、視神経炎又は神経サルコイドーシスである。いくつかの実施形態では、上記疾患又は障害は筋萎縮性側索硬化症である。

【0176】

Ｖ．製造方法
一態様では、本明細書に記載されるのは、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製する方法である。別の態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製する方法であって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を合成し、断片をライゲーションすることを含む方法が本明細書に記載される。別の態様では、ａ．修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を合成することと、ｂ．断片をライゲーションすることと、ｃ．ライゲーションされた断片をフォールディングする工程と、を含む修飾ＩＬ－２ポリペプチドを作製する方法が本明細書に記載される。ＩＬ－２ポリペプチドを合成する方法の例は、例えば、少なくともＰＣＴ国際公開第２０２１１４０４１６号、米国特許出願公開第２０１９００２３７６０号、及びＡｓａｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，８２２６－８２３０に見出され、これらの各々は、あたかもその全体が本明細書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。

【0177】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は化学的に合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は、固相ペプチド合成によって合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片は、自動ペプチド合成機で合成される。

【0178】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれを超えるペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドは、２つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、３つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、４つのペプチド断片からライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、２から１０個のペプチド断片にライゲーションされる。

【0179】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの２つ以上の断片を一緒にライゲーションする。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの３つ以上の断片が、連続的な様式でライゲーションされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドの３つ以上の断片をワンポット反応でライゲーションする。

【0180】

いくつかの実施形態では、ライゲーションされた断片はフォールディングされる。いくつかの実施形態では、フォールディングは、修飾ＩＬ－２ポリペプチド内に１つ以上のジスルフィド結合を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションした断片をフォールディング工程に供する。いくつかの実施形態では、ライゲーションされた断片は、当技術分野で周知の方法を使用してフォールディングされる。いくつかの実施形態では、ライゲーションされたポリペプチド又はフォールディングされたポリペプチドは、１つ以上のポリマーをそれに付着させることによって更に修飾される。いくつかの実施形態では、ライゲーションされたポリペプチド又はフォールディングされたポリペプチドは、ＰＥＧ化によって更に修飾される。

【0181】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは合成である。

【0182】

いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドは組換えである。一態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、又は酵母細胞である。

【0183】

一態様では、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを産生する方法であって、修飾ＩＬ－２ポリペプチドを宿主細胞において発現させることを含む方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞、鳥類細胞及び昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、又は酵母細胞である。
ＶＩ．配列番号

【0184】

【表6-1】

【0185】

【表6-2】

【0186】

【表6-3】

【0187】

【表6-4】

【0188】

【表6-5】

【0189】

【表6-6】

【0190】

【表6-7】

【0191】

【表6-8】

【0192】

本開示及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に定義される本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変更、置換及び修飾を行うことができることを理解されたい。

【0193】

本開示は、例示のみを目的として与えられ、決して本開示を限定することを意図しない以下の実施例において更に例示される。

【実施例】

【0194】

実施例１：修飾ＩＬ－２ポリペプチドの合成－一般的手順
調製ＩＬ－２直鎖タンパク質（代表的なプロトコル）
一般的な戦略：本明細書に記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチド、例えば、配列番号３、又は配列番号３～８若しくは４０～４３のいずれかのアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－２ポリペプチド、又は配列番号９～３９のいずれか１つの合成バージョン、又は本明細書に別途記載の修飾ＩＬ－２ポリペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製された個々のペプチドセグメントをライゲーションすることによって合成することができる。個々のペプチドを、以下に記載される方法を使用して自動ペプチド合成装置で合成した。

【0195】

材料及び溶媒：Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳに適した側鎖保護基を有するＦｍｏｃ－アミノ酸、ペプチド官能化に使用される樹脂ポリエチレングリコール誘導体及び試薬は市販されており、更に精製することなく使用した。ＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮを分析及び分取ＲＰ－ＨＰＬＣ精製に使用した。

【0196】

アミン系樹脂への保護ケト酸誘導体（セグメント１～３）の充填：５ｇのＲｉｎｋ－ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ又はＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂（１．８ｍｍｏｌスケール）をＤＭＦ中で３０分間膨潤させた。Ｆｍｏｃ脱保護は、樹脂を室温で１０分間、ＤＭＦ（ｖ／ｖ）中２０％ピペリジンで２回処理することによって行い、続いてＤＭＦで数回洗浄した。Ｆｍｏｃ－ＡＡ保護α－ケト酸（１．８ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、ＨＡＴＵ（６５０ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ、０．９５当量）及びＤＩＰＥＡ（３９６μＬ、３．６ｍｍｏｌ、２．００当量）で予備活性化した。反応混合物を膨潤樹脂に添加した。室温で６時間、穏やかに撹拌しながら反応させた。樹脂をＤＭＦで十分にすすいだ。無水酢酸（１．１７ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）を含むＤＭＦ（２０ｍＬ）の溶液を添加することによって、未反応アミンの樹脂へのキャッピングを行った。穏やかな撹拌下で１５分間室温で反応させた。樹脂をＤＣＭ、引き続いてジエチルエーテルで十分にすすぎ、乾燥させた。樹脂の充填は、ジベンゾフルベンのＵＶ定量によって０．２５ｍｍｏｌ／ｇであると決定された。

【0197】

【表7】

【0198】

Ｗａｎｇ樹脂（セグメント４）へのＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨの充填：Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨの予備充填をＷａｎｇ樹脂に対して行った。４ｇの樹脂（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．２４ｍｍｏｌスケール）をＤＭＦ中で１５分間膨潤させた。樹脂を室温でＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで２０分間処理した。樹脂をＤＭＦで数回洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ（６３８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）及びＨＡＴＵ（６３８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解した。予備活性化を、ＤＩＰＥＡ（５８５μＬ、３．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）の添加によって３分間室温で行った。反応混合物を膨潤樹脂に添加した。穏やかに撹拌しながら室温で一晩反応させた。樹脂をＤＭＦで十分にすすいだ。無水酢酸（１．２７ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）を含むＤＭＦ（１２ｍＬ）の溶液を添加することによって、未反応アミンの樹脂へのキャッピングを開始した。穏やかな撹拌下で１５分間室温で反応させた。樹脂をＤＣＭで十分にすすぎ、乾燥させた。樹脂の負荷を測定した（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。

【0199】

固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）：ペプチドセグメントは、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ化学を用いて自動ペプチド合成装置で合成した。側鎖保護基を有する以下のＦｍｏｃ－アミノ酸を使用した：Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ又はＢｏｃ－Ｏｐｒ－ＯＨ（Ｏｐｒ＝５－（Ｓ）－オキサプロリン）。必要に応じて、Ｆｍｏｃ－シュードプロリンジペプチドを合成に組み込んだ。ＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×８分）又は０．１ＭのＣｌ－ＨＯＢｔを含有するＤＭＦ中２５％ピペリジン（２×８分）又は０．１Ｍ Ｃｌ－ＨＯＢｔを含有するＤＭＦ中２０％ピペリジン（２×８分）でＦｍｏｃ脱保護を行い、完全なＦｍｏｃ除去を確実にするためにフィードバックループを用いて３０４ｎｍでＵＶによって監視した。室温で又は５０℃で、Ｆｍｏｃ－アミノ酸（樹脂置換に対して３．０～５．０当量）、カップリング試薬としてＨＣＴＵ又はＨＡＴＵ（２．９～４．９当量）及びＤＭＦ中ＤＩＰＥＡ又はＮＭＭ（６～１０当量）を用いてカップリングを行った。３分間の予備活性化の後、試薬を含有する溶液を樹脂に添加し、アミノ酸に応じて３０分間又は２時間反応させた。場合によっては、二重結合が必要であった。場合によっては、未反応の遊離アミンをキャッピングするために、樹脂をＤＭＦ中２０％無水酢酸で処理した。

【0200】

ペプチドの樹脂切断及び側鎖脱保護：ペプチド合成が完了したら、切断カクテルを用いて室温で２時間、ペプチドを樹脂から切断した。樹脂を濾別し、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテルで処理し、研和し、遠心分離した。エーテル層を慎重にデカントし、残渣をジエチルエーテルに再び懸濁し、研和し、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返した。得られた粗ペプチドを真空下で乾燥させ、－２０℃で保存した。得られた固体の一定分量を０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含む１：１ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏに可溶化し、６０℃でＣ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ）を使用する分析ＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。生成物の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ又はＬＣ－ＭＳを用いて同定した。

【0201】

ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション並びに光脱保護：ＩＬ－２ Ｓｅｇ１（１．２当量）及びＩＬ－２ Ｓｅｇ２（１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（２０ｍＭペプチド濃度）を含有するＤＭＳＯ：Ｈ_２Ｏ（９：１、ｖ／ｖ）に溶解し、６０℃で２２時間反応させた。ライゲーションバイアルをアルミニウム箔に包むことによって光から保護した。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ）を使用したＨＰＬＣによって６０℃で０．１％ＴＦＡを含むＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを移動相として用いて７分で５から９５％のＣＨ_３ＣＮの勾配で監視した。ライゲーションの完了後、混合物を０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ（１：１）で希釈し、３６５ｎｍの波長で１時間照射した。光分解反応の完了は、前述の方法を使用してＨＰＬＣに試料を注入することによって確認した。次いで、溶液を分取ＨＰＬＣによって精製した。

【0202】

ＩＬ－２セグメント３及び４のライゲーション並びにＦｍｏｃ脱保護：ＩＬ２－Ｓｅｇ３（１．２当量）及びＩＬ２－Ｓｅｇ４（１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（１５ｍＭ）を含有するＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ（９．８：０．２）に溶解し、６０℃で２０時間反応させた。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、移動相として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを使用し、７分で３０から７０％ＣＨ_３ＣＮの勾配で、６０℃でＣ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ）を使用するＨＰＬＣによって監視した。ライゲーションの完了後、反応混合物をＤＭＳＯ（６ｍＬ）で希釈し、５％のジエチルアミン（３００μＬ）を添加し、反応混合物を室温で７分間振盪した。精製用の試料を調製するために、ＴＦＡ（３００μＬ）を含有するＤＭＳＯ（４ｍＬ）で希釈した。

【0203】

最終ライゲーション：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２（１．２当量）及びＩＬ２－Ｓｅｇ３４（１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（１５ｍＭペプチド濃度）を含有するＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ（９：１）又は（９．８：０．２）に溶解し、ライゲーションを６０℃で２４時間進行させた。ＫＡＨＡライゲーションの進行は、６０℃でＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ）及び移動相として０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを使用し、１４分で３０から９５％のＣＨ_３ＣＮの勾配で分析ＨＰＬＣによって監視した。ライゲーションの完了後、反応混合物をＤＭＳＯで希釈し、続いて０．１％ＴＦＡ（７ｍＬ）を含有する（１：１）ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏの混合物で更に希釈した。試料を分取ＨＰＬＣに注入することによって精製した。

【0204】

Ａｃｍ脱保護：２×Ａｃｍを有するＩＬ２直鎖タンパク質をＡｃＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）（０．２５ｍＭタンパク質濃度）に溶解し、ＡｇＯＡｃ（１％ｍ／ｖ）を溶液に添加した。混合物を光から保護して５０℃で２．５時間振盪した。ＨＰＬＣによって確認される反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡを含有するＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（１：１）で希釈し、分取ＨＰＬＣによって精製した。

【0205】

ペプチドの精製：ペプチドセグメント、ライゲーションされたペプチド及び直鎖タンパク質をＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。異なるペプチドに対して異なる勾配を適用した。移動相は、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏ（緩衝剤Ａ）及び０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ（緩衝剤Ｂ）であった。分取ＨＰＬＣを、（５０×２５０ｍｍ）又はＣ１８カラム（５０×２５０ｍｍ）で４０ｍＬ／分の流量にて４０℃又は６０℃で行った。

【0206】

ペプチドの特性決定：ペプチドセグメント、ライゲーションされたペプチド及び直鎖タンパク質をＲＰ－ＨＰＬＣによって分析した。移動相は、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＭｉｌｌｉＱ－Ｈ_２Ｏ（緩衝剤Ａ）及び０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＨＰＬＣグレードＣＨ_３ＣＮ（緩衝剤Ｂ）であった。分析ＨＰＬＣは室温でＣ４カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）、又は流速１ｍＬ／分、６０℃のＣ１８カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）で行った。ペプチド及びタンパク質は、マトリックスとして４－ヒドロキシ－α－シアノケイ皮酸（ＨＣＣＡ）を使用して、二重ＥＳＩ／ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ源を備えたＳｏｌａｒｉＸ（９．４Ｔ磁石）分光計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＵＳＡ）を使用した高分解能フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）によって特徴付けた。

【0207】

実施例２：組成物Ａ及びＩＬ－２のＡ１バリアント（配列番号３）の合成
組成物Ａ（セグメント１Ａ）のＩＬ－２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成

【0208】

【化27】

ペプチド合成：ＩＬ２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸セグメント１Ａ（配列番号３の残基１～４０を参照されたい）を、約０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－保護－α－ケト酸（０．８ｇ）を予備充填したＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上で０．２ｍｍｏｌ規模で合成した。セグメント１Ａの自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを、一般的な手順「固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）」に従って行った。コンジュゲーションハンドルの挿入は以下のように行った。最初の手動カップリング反応を室温で、無水グルタル酸（ＣＡＳ ＲＮ１０８－５５－４、１１４．１０ｍｇ、５当量）及びＤＩＰＥＡ（２４２μＬ、７当量）を含むＤＭＦを樹脂に添加することによって、３０分間行った。次に、ＤＭＦ中の市販のＯ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール（化合物２，４２１ｍｇ、当量）とのカップリングを、ＤＩＰＥＡ（２７６μＬ、８当量）及びＨＡＴＵ（３００ｍｇ、３．９５当量）を含むＤＭＦを樹脂に添加することによって３時間室温で行った。樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥後のペプチジル樹脂の質量は１．６ｇであった。９５：２．５：２．５ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖ／ｖ（１０ｍＬ／ｇ樹脂）のカクテルを室温で２．０時間使用して、「ペプチドの樹脂切断及び側鎖脱保護」の手順に従って粗ペプチドを沈殿させた。

【0209】

【化28】

【0210】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：２５分で３０から８０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１Ａを白色固体として９７％の純度で得た。樹脂充填に基づく単離収率は２６０ｍｇ（２５％）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２２８Ｈ_３９４Ｎ_６４Ｏ_７２、平均同位体計算値５１８２．９１９３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：５１８２．９１１１Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0211】

組成物Ａ（セグメント２Ａ）のＯｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）光保護Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成

【0212】

【化29】

ペプチド合成：Ｏｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）－Ｌｅｕ－光保護－α－ケト酸セグメント２Ａ（配列番号３の４１～７０を参照のこと）を、約０．２５ｍｍｏｌ／ｇの置換容量でＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－光保護－α－ケト酸（０．８ｇ）を予め充填したＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂上で０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。セグメント２Ａの自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを、一般的な手順「固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）」に従って行った。樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥後のペプチジル樹脂の質量は１．８ｇであった。９５：２．５：２．５ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖ／ｖ（１５ｍＬ／ｇ樹脂）のカクテルを室温で２．０時間使用して、「ペプチドの樹脂切断及び側鎖脱保護」の手順に従って粗ペプチドを沈殿させた。

【0213】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で１０から６０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント２Ａを純度９７％の白色固体として得た。樹脂充填に基づく単離収率は２０３ｍｇ（２０％）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１８４Ｈ_２８６Ｎ_４０Ｏ_５２Ｓ、計算された平均同位体：３９２２．０７４２Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］＋、実測値：３９２２．０６８０Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0214】

組成物Ａ（セグメント３Ａ）のＦｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸の合成

【0215】

【化30】

ペプチド合成：Ｆｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント３Ａ（配列番号３の残基７１～１０３を参照のこと）を、約０．２８６ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護されたα－ケト酸（０．８ｇ）を予め充填したＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂上で０．２ｍｍｏｌ規模で合成した。セグメント３Ａの自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを、一般的な手順「固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）」に従って行った。樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥後のペプチジル樹脂の質量は２．１７ｇであった。９５：２．５：２．５ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖ／ｖ（１０ｍＬ／ｇ樹脂）のカクテルを室温で２．０時間使用して、「ペプチドの樹脂切断及び側鎖脱保護」の手順に従って粗ペプチドを沈殿させた。

【0216】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：１０分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から８０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント３Ａを純度９８％の白色固体として得た。樹脂充填に基づく単離収率は２００ｍｇ（１７．６％）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１８４Ｈ_２８３Ｎ_４５Ｏ_５３、平均同位体計算値３９７３．０８９１Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：３９７３．０９９５Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0217】

組成物Ａ（セグメント４Ａ）のＩＬ－２Ｏｐｒ－ＩＬ２（１０５－１３３）の合成

【0218】

【化31】

ペプチド合成：Ｏｐｒ－ＩＬ２（１０５－１３３）セグメント４Ａ（配列番号３の残基１０４～１３３を参照のこと）を、約０．３４ｍｍｏｌ／ｇの置換容量を有するＦｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨ（０．２９４ｇ）を予め充填したＷａｎｇ樹脂で０．１ｍｍｏｌ規模で合成した。セグメント４Ａの自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを、一般的な手順「固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）」に従って行った。樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。乾燥後のペプチジル樹脂の質量は７２５ｍｇであった。９２．５：２．５：２．５：２．５ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ（１０ｍＬ／ｇ樹脂）のカクテルを室温で２時間使用して、「ペプチドの樹脂切断及び側鎖脱保護」の手順に従って粗ペプチドを沈殿させた。

【0219】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：４０分で１０から５０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント４Ａを純度９０．８％の白色固体として得た。樹脂充填に基づく単離収率は４０ｍｇ（８％）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１５８Ｈ_２４１Ｎ_３７Ｏ_５２Ｓ、平均同位体計算値１１７５．２４４９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋３、実測値：１１７５．２４４０［Ｍ＋Ｈ］^＋３。

【0220】

組成物Ａ（セグメント１２Ａ）のＩＬ２－Ｓｅｇ１２を調製するためのＫＡＨＡライゲーション

【0221】

【化32】

ライゲーション及び光脱保護：セグメント１２Ａは、３４ｍｇ（６．５６μｍｏｌ、１．１当量）のセグメント１Ａ及び１９ｍｇ（４．９μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント２Ａを２４１μＬの０．１Ｍシュウ酸を含有する９．５：０．５ｖ／ｖＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ溶液に溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション及び光脱保護」に従って得た。

【0222】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％Ｂ、続いて３０分で４０から７０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２Ａを白色固体として純度９８％で得た。単離収率は５５％（２５．５ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_４００Ｈ_６６７Ｎ_１０３Ｏ_１１９Ｓ、計算された平均同位体：８８５５．２８０６Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：８８５５．９００８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0223】

組成物Ａ（セグメント３４Ａ）のＩＬ２－Ｓｅｇ３４を調製するためのＫＡＨＡライゲーション

【0224】

【化33】

ライゲーション：６９ｍｇ（１７．５μｍｏｌ、１．１当量）のセグメント３Ａ及び５９ｍｇ（１６．６μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント４Ａを、０．１Ｍシュウ酸を含有する１１００μＬの９．９：０．１ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント３及び４のライゲーション及びＦｍｏｃ脱保護」に従って、セグメント３４Ａを得た。

【0225】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：４０分で２０から６０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント３４Ａを白色固体として９５％の純度で得た。単離収率は３３％（４２．３ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３２６Ｈ_５１４Ｎ_８２Ｏ_１０１Ｓ、平均同位体計算値７２２９．７４３７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：７２２９．７６１８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0226】

組成物Ａ（セグメント１２３４Ａ）のＩＬ２直鎖タンパク質を調製するための最終的なＫＡＨＡライゲーション

【0227】

【化34】

ライゲーション：セグメント１２３４Ａは、４５ｍｇ（５．１μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ａ及び３１ｍｇ（１６．６μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ａを、０．１Ｍシュウ酸を含む２２０μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0228】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で３０から８０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ａを白色固体として９５％純度で得た。単離収率は２６％（１８ｍｇ）であった。

【0229】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、１８ｍｇのＡｃｍ保護セグメント１２３４Ａを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0230】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて２０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ａを白色固体として９７％純度で得た。単離収率は１７％（１１．６ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１９Ｈ_１１７１Ｎ_１８３Ｏ_２１６Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８９８．５９６３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８９８．６１１８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0231】

組成物ＡのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ａ直鎖タンパク質（１１．７ｍｇ、０．７３６μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭのＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0232】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング（方法１）：再構成反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭのＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で２０時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、移動相として０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含むＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏを使用して、６０分で０．１％ＴＦＡを含む５から４０から９５％アセトニトリルの２段階勾配で室温に保ったＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用する分取ＨＰＬＣによって１０．０ｍＬ／分の流量で精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なフォールディングされたタンパク質組成物Ａを純度９８％の白色粉末として得た（フォールディング及び精製工程について２．２ｍｇ、収率１９％）。純粋なタンパク質の純度及び同一性を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ及び分析サイズ排除によって確認した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１９Ｈ_１１６９Ｎ_１８３Ｏ_２１６Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８９６．５８０６Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８９６．６３２２Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋

【0233】

ＩＬ－２タンパク質組成物Ａ１の合成
ＩＬ－２組成物Ａフォールディングタンパク質（３９．７６ｍｇ、１当量）を最初に８ｍＬの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤、８．４％スクロース、０．０２％ポリソルベート８０ｐＨ５．０に溶解した。溶液に２２ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ５．０及び３０ｋＤａＤＢＣＯ－ポリエチレングリコールポリマー（３９２．０５ｍｇ、５当量）を添加し、反応物を２５℃で１７時間穏やかに混合した。反応混合物をＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔカラム（５ｍＬ）に１０ｍＬずつ充填し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤ｐＨ５．０から１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤まで２０ＣＶの勾配で２．５ｍＬ／分の流速で精製した。ＩＬ－２組成物Ａ１ ＰＥＧ化タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤、８．４％スクロース、０．０２％ポリソルベート８０（ｐＨ５．０）に対して透析して、ＢＣＡによって測定して１２．２６ｍｇのタンパク質画分ＩＬ－２組成物Ａ１ ＰＥＧ化タンパク質を得た（ＰＥＧ化及び精製工程について収率３１％）。純粋なＰＥＧ化タンパク質の純度及び同一性を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ及び分析サイズ排除によって確認した。
実施例３：組成物Ｂ及びＩＬ－２のＢ１バリアントの合成
この変形例では、セグメント３を除いて、他の全てのセグメントは、組成物Ａに使用されるセグメントと同じである。

【0234】

組成物Ｂ（セグメント３Ｂ）のＦｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸の合成
Ｆｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（７２－１０２）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント３Ｂ（配列番号４の残基７１～１０３を参照のこと）を、セグメント３Ａの合成について記載される手順と同様に自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ合成によって合成して、セグメント３Ｂを白色固体として＞９８％純度で得た。樹脂充填に基づく単離収率は１８％（２００ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１８４Ｈ_２８４Ｎ_４６Ｏ_５２、平均同位体計算値３９７２．１０５１Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：３９７２．１０５４Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0235】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＢのＩＬ２－Ｓｅｇ３４の合成
ライゲーション：３７ｍｇ（９．３μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント３Ｂ及び２７ｍｇ（７．８μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント４Ａを、０．１Ｍシュウ酸を含有する５１７μＬの９．８：０．２ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント３及び４のライゲーション及びＦｍｏｃ脱保護」に従って、セグメント３４Ｂを得た。

【0236】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％％Ｂ、続いて３５分で４０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント３４Ｂを白色固体として＞９９％の純度で得た。単離収率は２２％（１２．６ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３２６Ｈ_５１５Ｎ_８３Ｏ_１００Ｓ、平均同位体計算値７２２８．７５９７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：７２２８．７７３８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0237】

組成物Ｂ（セグメント１２３４Ｂ）のＩＬ２直鎖タンパク質を調製するための最終的なＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：セグメント１２３４Ｂは、３４ｍｇ（３．８μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ａ及び２３ｍｇ（３．２μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ｂを、０．１Ｍシュウ酸を含む２１４μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0238】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％％Ｂ、続いて３５分で４０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ｂを白色固体として９６％純度で得た。単離収率は５２％（２６．８ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７２５Ｈ_１１８２Ｎ_１８６Ｏ_２１７Ｓ_２、平均同位体計算値１６０３９．６８６５Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１６０３９．６３８９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0239】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、２６．８ｍｇのＡｃｍ保護セグメント１２３４Ｂを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0240】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ｂを白色固体として９７％純度で得た。単離収率は５５％（１４．５ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１９Ｈ_１１７２Ｎ_１８４Ｏ_２１５Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８９７．６１１７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８９７．６１９５Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0241】

組成物ＢのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｂ直鎖タンパク質（１４．５ｍｇ、０．９１３μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（６１ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0242】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング：再構成反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭのＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（１２２ｍＬ、５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で２０時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、室温に保ったＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣにより、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配で、１０．０ｍＬ／分の流速で精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なフォールディングされたＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｂタンパク質を白色粉末として９８％超の純度で得た。（フォールディング工程及び精製工程について３．９ｍｇ、収率２７％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１９Ｈ_１１７０Ｎ_１８４Ｏ_２１５Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８９５．５９６６Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８９５．５６６９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0243】

ＩＬ－２タンパク質組成物Ｂ１の合成
ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｂ（２ｍｇ、０．１２６μｍｏｌ、１当量）の１：１ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（５０ｍＭタンパク質濃度）中の溶液に、３０ｋＤａのＤＢＣＯ－ポリエチレングリコールポリマー（１１．７ｍｇ、０．４０３μｍｏｌ、３．２当量）を添加し、反応物を２５℃で２０時間穏やかに混合した。反応混合物を１：１ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで希釈し、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配を有するＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）、流速：１０．０ｍＬ／分を使用して分取ＨＰＬＣで精製した。ＰＥＧ化ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｂ１タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、凍結乾燥して、２．５ｍｇのＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｂ１ＰＥＧ化タンパク質を白色粉末として９８％純度で得た。（ＰＥＧ化及び精製工程について収率２９％）。純粋なＰＥＧ化タンパク質の純度及び同一性を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ｐａｇｅによって確認した。
実施例４：組成物Ｃ及びＩＬ－２のＣ１バリアントの合成
この変形例では、セグメント２を除いて、他の全てのセグメントは、組成物Ａに使用されるセグメントと同じである。

【0244】

組成物Ｃ（セグメント２Ｃ）のＩＬ－２Ｆｍｏｃ－ＯｐｒＩＬ２（４２－６９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成
Ｏｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）－Ｌｅｕ－光保護ａ－ケト酸セグメント２Ｃ（配列番号５の残基４１～７０を参照のこと）を、セグメント２Ａの合成について記載される手順と同様に自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ合成によって合成して、セグメント２Ｃを白色固体として９４％純度で得た。樹脂充填量に基づく単離収率は１９．７％（１５３．７ｍｇ）であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、所望の生成物質量が得られたことを確認した。

【0245】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＣのＩＬ２－Ｓｅｇ１２の合成（セグメント１２Ｃ）
ライゲーション及び光脱保護：セグメント１２Ｃは、９０ｍｇのセグメント１Ａ（１７．４μｍｏｌ、１．１当量）及び５６ｍｇ（１４．５μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント２Ｃを１１５７μＬの０．１Ｍシュウ酸を含有する９．５：０．５ｖ／ｖＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ溶液に溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション及び光脱保護」に従って得た。

【0246】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％Ｂ、続いて３０分で４０から７０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２Ｃを白色固体として＞９９％の純度で得た。単離収率は３６％（４６．７ｍｇ）であった。

【0247】

組成物ＣのＩＬ２直鎖タンパク質（セグメント１２３４Ｃ）を調製するための最終的なＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：セグメント１２３４Ｃは、４６．７ｍｇ（５．２４μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ｃ及び３２ｍｇ（４．４１μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ａを、０．１Ｍシュウ酸を含む６８３μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0248】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で３０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ｃを白色固体として得た。単離収率は３４％（２４．５ｍｇ）であった。

【0249】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、２４．５ｍｇのＡｃｍ保護セグメント１２３４Ｃを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0250】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ｃを白色固体として９４％純度で得た。単離収率は６９％（１６．６ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１７Ｈ_１１６７Ｎ_１８３Ｏ_２１６Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８７０．５６５０Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８７０．６２３２Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0251】

組成物ＣのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｃ直鎖タンパク質（１６．６ｍｇ、１．０４μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（６９ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0252】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング：転位反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（１４０ｍＬ、５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で２０時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、室温に保ったＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣにより、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配で、１０．０ｍＬ／分の流速で精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なフォールディングされたＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｃタンパク質を白色粉末として９９％超の純度で得た（フォールディング及び精製工程について３．４ｍｇ、収率２０．５％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１７Ｈ_１１６５Ｎ_１８３Ｏ_２１６Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８６８．５４９３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８６８．５９７９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0253】

ＩＬ－２タンパク質組成物Ｃ１の合成
ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｃ（２ｍｇ、１当量）の１：１ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（５０μＭタンパク質濃度）中の溶液に、３０ｋＤａのＤＢＣＯ－ポリエチレングリコールポリマー（１１．０ｍｇ、３当量）を添加し、反応物を２５℃で２０時間穏やかに混合した。反応混合物を１：１ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで希釈し、Ｃ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用して分取ＨＰＬＣで精製し、５分で１０から３０％Ｂまでの２段階勾配、続いて３０分で３０から９５％Ｂまで、１０．０ｍＬ／分の流速で行った。ＰＥＧ化ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｃ１タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、凍結乾燥して、白色粉末として１．４ｍｇのＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｃ１ＰＥＧ化タンパク質を９９％超の純度で得た。（ＰＥＧ化及び精製工程について収率２５％）。純粋なＰＥＧ化タンパク質の純度及び同一性を分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって確認した。
実施例５：ＩＬ－２の組成物Ｄ及びＤ１バリアントの合成
この変形例では、セグメント１を除いて、他の全てのセグメントは、組成物Ｂに使用されるセグメントと同じである。

【0254】

組成物Ｄ（セグメント１Ｄ）のＩＬ－２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成
ＩＬ２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸セグメント１Ｄ（配列番号６の残基１～４０を参照されたい）を、セグメント１Ａの合成について記載される手順と同様に自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ合成によって合成して、セグメント１Ｄを白色固体として９８％純度で得た。樹脂充填量に基づく単離収率は２０％（２０９ｍｇ）であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、所望の生成物質量が得られたことを確認した。

【0255】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＤのＩＬ２－Ｓｅｇ１２の合成（セグメント１２Ｄ）
ライゲーション及び光脱保護：セグメント１２Ｄは、６０ｍｇ（１１．７μｍｏｌ、１．１当量）のセグメント１Ｄ及び３８ｍｇ（９．７μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント２Ａを７８０μＬの０．１Ｍシュウ酸を含有する９．５：０．５ｖ／ｖＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ溶液に溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション及び光脱保護」に従って得た。

【0256】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％Ｂ、続いて３０分で４０から７０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２Ｄを白色固体として得た。単離収率は５４％（４６．２ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３９７Ｈ_６６１Ｎ_１０３Ｏ_１１９Ｓ、ｍ／ｚ計算値：８８１２．８６９８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：８８１２．８８３３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0257】

組成物Ｄ（セグメント１２３４Ｄ）のＩＬ２直鎖タンパク質を調製するための最終的なＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：セグメント１２３４Ｄは、３５．２ｍｇ（５．２４μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ｄ及び２６ｍｇ（３．６２μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ｂを、０．１Ｍシュウ酸を含む２７０μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般的な手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0258】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で３０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ｄを白色固体として得た。単離収率は２６％（１５ｍｇ）であった。

【0259】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、１５ｍｇ（０．９５μｍｏｌ）のＡｃｍ保護セグメント１２３４Ｄを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0260】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ｄを白色固体として９４％純度で得た。単離収率は８０％（１２ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１６Ｈ_１１６６Ｎ_１８４Ｏ_２１５Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８５５．５６５３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８５５．５３００Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0261】

組成物ＤのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｄ直鎖タンパク質（９ｍｇ、０．５６８μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（３８ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0262】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング：転位反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（７６ｍＬ、５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で４４時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配、１０．０ｍＬ／分の流速で室温に保ったＳｈｉｓｅｉｄｏ ＰｒｏｔｅｏｎＡｖｉＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用した分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて、フォールディングされたＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｄを白色固体として＞９８％の純度で得た（フォールディング工程及び精製工程について０．３ｍｇ、収率３％）。

【0263】

ＩＬ－２タンパク質組成物Ｄ１の合成
ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｄ（０．３ｍｇ、１当量）の１：１ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（５０μＭタンパク質濃度）中の溶液に、３０ｋＤａのＤＢＣＯ－ポリエチレングリコールポリマー（１．８ｍｇ、３．２当量）を添加し、反応物を２５℃で２０時間穏やかに混合した。反応混合物を１：１ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで希釈し、Ｃ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用して分取ＨＰＬＣで精製し、５分で１０から３０％Ｂまでの２段階勾配、続いて３０分で３０から９５％Ｂまで、１０．０ｍＬ／分の流速で行った。ＰＥＧ化ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｄ１タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、凍結乾燥して、白色粉末として０．１ｍｇのＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｄ１ＰＥＧ化タンパク質を９８％超の純度で得た。（ＰＥＧ化及び精製工程について収率１１％）。

【0264】

純粋なＰＥＧ化タンパク質の純度及び同一性を分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって確認した。
実施例６：ＩＬ－２の組成物Ｅ及びＥ１バリアントの合成
この変形例では、セグメント１を除いて、他の全てのセグメントは、組成物Ｂに使用されるセグメントと同じである。

【0265】

組成物Ｅ（セグメント１Ｅ）のＩＬ－２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸の合成
ＩＬ２（１－３９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸セグメント１Ｅ（配列番号７の残基１～４０を参照されたい）を、セグメント１Ａの合成について記載される手順と同様に自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ合成によって合成して、セグメント１Ｅを白色固体として９７％純度で得た。樹脂充填量に基づく単離収率は１７％（１８０ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_２２５Ｈ_３８８Ｎ_６４Ｏ_７２、平均同位体計算値５１４０．８７２４７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：５１４１．８６９９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0266】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＥのＩＬ２－Ｓｅｇ１２の合成（セグメント１２Ｅ）
ライゲーション及び光脱保護：セグメント１２Ｅは、６０ｍｇ（１１．７μｍｏｌ、１．１当量）のセグメント１Ｅ及び３８ｍｇ（９．７μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント２Ａを７８０μＬの０．１Ｍシュウ酸を含有する９．５：０．５ｖ／ｖＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ溶液に溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション及び光脱保護」に従って得た。

【0267】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％Ｂ、続いて３０分で４０から７０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２Ｅを白色固体として得た。単離収率は５５％（３３．４ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_３９７Ｈ_６６１Ｎ_１０３Ｏ_１１９Ｓ、ｍ／ｚ計算値：８８１２．８６９８Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：８８１２．８８３３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0268】

組成物Ｅ（セグメント１２３４Ｅ）のＩＬ２直鎖タンパク質を調製するための最終的なＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：セグメント１２３４Ｅを、１７．５ｍｇ（１．９８μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ｅ及び１２ｍｇ（１．６６μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ｂを、０．１Ｍシュウ酸を含有する２５６μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0269】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で３０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ｅを白色固体として得た。単離収率は２２％（６．６ｍｇ）であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、所望の生成物質量が得られたことを確認した。

【0270】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、６．６ｍｇ（０．３７μｍｏｌ）のＡｃｍ保護セグメント１２３４Ｅを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0271】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ｅを白色固体として９４％純度で得た。単離収率は９８％（５．８ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１６Ｈ_１１６６Ｎ_１８４Ｏ_２１５Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８５５．５６５３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８５５．５４７９Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0272】

組成物ＥのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｅ直鎖タンパク質（５．８ｍｇ、０．３６６μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（２４ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0273】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング：転位反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（４８ｍＬ、５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で２０時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、室温に保ったＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣにより、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配で、１０．０ｍＬ／分の流速で精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥させて、フォールディングされたＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｅを白色固体として＞９８％の純度で得た（フォールディング工程及び精製工程について０．６ｍｇ、収率１０％）。

【0274】

ＩＬ－２タンパク質組成物Ｅ１の合成
ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｅ（０．６ｍｇ、１当量）の１：１ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ（５０μＭタンパク質濃度）中の溶液に、３０ｋＤａＤＢＣＯ－ｍＰＥＧ（３ｍｇ、２．７当量）を添加し、反応物を２５℃で２０時間穏やかに混合した。反応混合物を１：１ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ＋０．１％ＴＦＡで希釈し、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ＰｒｏｔｅｏｎａｖｉＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を使用して分取ＨＰＬＣで精製し、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配、１０．０ｍＬ／分の流速で行った。ＰＥＧ化ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｅ１タンパク質を含有する画分を一緒にプールし、凍結乾燥して、白色粉末として０．２ｍｇのＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｅ１ＰＥＧ化タンパク質を９８％超の純度で得た。（ＰＥＧ化及び精製工程について収率１２％）。純粋なＰＥＧ化タンパク質の純度及び同一性を分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって確認した。
実施例７：組成物Ｆの合成
この変形例では、セグメント２を除いて、他の全てのセグメントは、組成物Ｂに使用されるセグメントと同じである。

【0275】

組成物Ｆ（セグメント２Ｆ）のＯｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）－Ｌｅｕ－光保護α－ケト酸の合成
Ｏｐｒ－ＩＬ２（４２－６９）－Ｌｅｕ－光保護されたα－ケト酸セグメント２Ｆ（配列番号８の残基１～４０を参照されたい）を、セグメント２Ａの合成について記載された手順と同様に自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ合成によって合成して、セグメント２Ｆを白色固体として９９％純度で得た。樹脂充填量に基づく単離収率は３５％（２６９ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_１８１Ｈ_２８０Ｎ_４０Ｏ_５２Ｓ、ｍ／ｚ計算値：３８８０．０２７３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：３８８０．０２０７Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0276】

ＫＡＨＡライゲーションによる組成物ＦのＩＬ２－Ｓｅｇ１２の合成（セグメント１２Ｆ）
ライゲーション及び光脱保護：セグメント１Ａ ３４ｍｇ（６．６μｍｏｌ、１．１当量）及びセグメント２Ｆ １９ｍｇ（４．９μｍｏｌ、１．０当量）を０．１Ｍシュウ酸を含有する９．５：０．５ｖ／ｖＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ溶液３８５μＬに溶解した一般手順「ＩＬ－２セグメント１及び２のライゲーション及び光脱保護」に従ってセグメント１２Ｆを得た。
精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速４０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から４０％Ｂ、続いて３０分で４０から７０％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２Ｆを白色固体として純度９６％で得た。単離収率は５９％（２５．５ｍｇ）であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、所望の生成物質量が得られたことを確認した。

【0277】

組成物Ｆ（セグメント１２３４Ｆ）のＩＬ２直鎖タンパク質の調製のための最終ＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：セグメント１２３４Ｆは、２５．５ｍｇ（２．８９μｍｏｌ、１．２当量）のセグメント１２Ｆ及び１７．５ｍｇ（２．４２μｍｏｌ、１．０当量）のセグメント３４Ｂを、０．１Ｍシュウ酸を含む３７３μＬの９．５：０．５ＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏｖ／ｖに溶解した一般手順「最終ライゲーション」に従って得た。

【0278】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、５０×２５０ｍｍ）、６０℃で流速４０ｍＬ／分、勾配：３０分で３０から８０％％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、Ａｃｍ保護セグメント１２３４Ｆを白色固体として得た。単離収率は３１％（１２ｍｇ）であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用して、所望の生成物質量が得られたことを確認した。

【0279】

Ａｃｍ脱保護：システイン残基の脱保護を、１２ｍｇ（０．７５μｍｏｌ）のＡｃｍ保護セグメント１２３４Ｆを出発物質として用いて一般手順「Ａｃｍ脱保護」に従って行った。

【0280】

精製：Ｃ１８カラム（５μｍ、２０×２５０ｍｍ）、４０℃で流速１０ｍＬ／分、２段階勾配：５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂ。精製された生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、セグメント１２３４Ｆを白色固体として９４％純度で得た。単離収率は７３％（８．７ｍｇ）であった。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ_７１６Ｈ_１１６６Ｎ_１８４Ｏ_２１５Ｓ_２、計算された平均同位体：１５８５５．５６５３Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋、実測値：１５８５５．６０６１Ｄａ［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0281】

組成物ＦのＩＬ－２直鎖タンパク質のフォールディング
直鎖タンパク質の再編成：ＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｆ直鎖タンパク質（８．７ｍｇ、０．５４９μｍｏｌ）を、０．１ＭＴｒｉｓ及び３０ｍＭ還元型グルタチオン（３７ｍＬ、１５μＭタンパク質濃度）を含有する６ＭＧｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２時間穏やかに振盪した。

【0282】

直鎖再編成タンパク質のフォールディング：転位反応の完了後、試料を室温に冷却し、０．１ＭＴｒｉｓ及び１．５ｍＭ酸化グルタチオン、ｐＨ８．０（８０ｍＬ、５μＭタンパク質濃度）で希釈した。フォールディングを室温で４４時間進行させた。次いで、試料をＴＦＡでｐＨ３に酸性化し、室温に保ったＣ４カラム（２０×２５０ｍｍ）を用いた分取ＨＰＬＣにより、５分で１０から３０％Ｂ、続いて３０分で３０から９５％Ｂの２段階勾配で、１０．０ｍＬ／分の流速で精製した。生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、純粋なフォールディングされたＩＬ２－Ｓｅｇ１２３４－Ｆ（フォールディング工程及び精製工程について０．２ｍｇ、収率２％）を得た。純粋なフォールディングされたタンパク質の純度及び同一性を、分析ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって確認した。

【0283】

実施例８：非コンジュゲート化及びＰＥＧ化ＩＬ－２バリアントによるＳＴＡＴ５の選択的活性化
ＩＬ－２Ｒの関与は、シグナル伝達兼転写活性化因子５（ＳＴＡＴ５）のリン酸化をもたらし、これは、Ｔ細胞サブセットに対する選択性を評価するための読み出しとして使用することができる。初代ｐａｎＴ細胞を、フィコール勾配遠心分離を使用する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）精製、引き続いて磁気ビーズによる負の単離、次いで更なる使用まで凍結保存によって、健康なドナーのバフィーコートから得た。ｐａｎＴ細胞を解凍し、Ｔ細胞培地（ＲＰＭＩ１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、１％ＮＥＡＡ、２５μＭβＭｅｏＨ、１％ピルビン酸ナトリウム）中で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、ウェル当たり２００，０００細胞で分配した後、アルデスロイキン、非コンジュゲート化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ）、ＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ１）又は本明細書に提供される別の示されたバリアントのいずれかと３７℃／５％ＣＯ_２で４０分間インキュベートした。インキュベーション後、転写因子ホスホ緩衝剤キットを使用して細胞を固定し、透過処理した後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦｏｘＰ３及びｐＳＴＡＴ５についての表面及び細胞内免疫染色を行い、細胞サブセットの同定及びＳＴＡＴ５リン酸化レベルの測定を可能にした。ＦＡＣＳ測定は、Ａｃｅａ製のＮｏｖｏＣｙｔｅ又はＱｕａｎｔｅｏｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒのいずれかを用いて行った。ＴｒｅｇをＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞として分類し、ＴｅｆｆをＣＤ８＋Ｔ細胞として分類した。様々な免疫細胞型における示されたバリアントからのＳＴＡＴ５リン酸化アッセイのＥＣ５０結果を以下の表６に示す。

【0284】

【表8-1】

【0285】

【表8-2】

【0286】

非コンジュゲート化（組成物Ａ）及びＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ１）の両方が、Ｔｒｅｇにおいて選択的にＳＴＡＴ５を活性化し（図４Ｂ）、Ｔｅｆｆ細胞におけるＳＴＡＴ５活性化に対する影響はほとんどなかった（図４Ａ）。一方、アルデスロイキンは、Ｔｒｅｇ細胞及びＴｅｆｆ細胞の両方においてＳＴＡＴ５を非選択的に活性化した。ＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ１）に対するＳＴＡＴ５活性化の効力は、非コンジュゲート化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ）に対する効力よりも低く、ＰＥＧ化が活性のわずかな低下をもたらすことを示唆した。

【0287】

更に、非コンジュゲート化ＩＬ－２ポリペプチド及びＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチドの両方が、ヒトＴｒｅｇに対する効力と同等の効力で、マウス及びカニクイザル由来のＴｒｅｇにおいてＳＴＡＴ５を活性化し、したがって、マウス及びカニクイザルＩＬ－２Ｒに対する交差反応性を実証した（表７）。

【0288】

【表9】

【0289】

実施例９：ＩＬ－２受容体のα及びβサブユニットに対するＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ１）の結合親和性
ＩＬ－２Ｒα及びβサブユニットに対するＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド（組成物Ａ１）及び配列番号２（アルデスロイキン）の結合親和性を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術を用いて測定した。ビオチン化ＩＬ－Ｒ２α及びβ（研究開発、カタログＡＶＩ１０３０５－０５０及びＡＶＩ１０４５９－０５０）をストレプトアビジンバイオセンサＳＡＸ２に個別に負荷し、センサを１×Ｏｃｔｅｔ（登録商標）速度論的緩衝剤に浸漬してベースラインを設定した。センサを分析物溶液中で３００秒間インキュベートした後、カイネティクス緩衝剤中で６００秒間インキュベートして解離を測定した。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ａｎａｌｙｓｉｓスタジオを使用してＫｄ値を計算した。組成物Ａ１は、アルデスロイキンよりもαサブユニットに対する親和性が高かった（それぞれ２．３７ｎＭ対１２．２３ｎＭ）が、βサブユニットへの結合は消失した（図５）。したがって、組成物Ａ１は、α強化型βデッドＩＬ－２ポリペプチドを表す。

【0290】

実施例１０：組成物Ａ１についてのマウスにおける薬物動態学的／薬力学的試験
単回用量の薬物動態学／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）研究を、０．３ｍｇ／ｋｇタンパク質当量のアルデスロイキンの１日５回の皮下（ｓｃ）注射又は０．１若しくは０．３ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド組成物Ａ１の単回皮下注射を受けたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行った。血液をＫ_２ＥＤＴＡの様々な時点でサンプリングし、血漿を遠心分離によって生成し、ＰＫ分析及び細胞ペレットをフローサイトメトリー分析のための染色に新たに供するまで－８０℃で保存した。

【0291】

細胞ペレットを１×Ｌｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝剤（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５８０５０年）で１０分間処理した。洗浄後、細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ３３５及び抗ＣＤ２５抗体で４℃で３０分間染色した。次いで、冷ＢＤ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩを用いて細胞を透過処理し、Ｋｉ６７、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４又はｐＳＴＡＴ５に対する抗体で染色した。ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）測定を、ＢＤ製のＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０フローサイトメーターで行った。各細胞サブセットについて、ｐＳＴＡＴ５陽性細胞の割合、並びにＫｉ６７陽性細胞の割合、細胞数及び細胞頻度を決定した。

【0292】

血漿中の組成物Ａ１の濃度を、適格なヒトＩＬ－２ ＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘビーズアッセイ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃７４０７１７、＃７４０３６８、＃７４０７５８）を用いて決定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３を使用することによって、ＰＫデータをノンコンパートメントＰＫ分析に供した。ＰＫパラメータを得る際に、直鎖／対数台形則を適用した。修飾ＩＬ－２ポリペプチド（図６）のＰＫプロフィールは６時間でピークに達し、濃度はＰＥＧ化によって２６～３０時間の長い半減期で低下した。ＰＫパラメータ（表８）は、曝露の用量比例的増加を示した。このＰＫプロフィールは、マウスにおける半減期が数分以内であると報告されている野生型ポリペプチドよりも優れている。

【0293】

【表10】

【0294】

アルデスロイキン及びＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチド組成物Ａ１の免疫ＰＤプロファイルを同じ研究で同時に評価し、１４日間監視した。ＰＥＧ化ＩＬ－２ポリペプチドによる単回用量治療は、Ｔｒｅｇ集団（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５Ｈｉ、ＦｏｘＰ３＋）において強力かつ持続的なＳＴＡＴ５リン酸化をもたらし、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４－）及びＮＫ細胞（ＣＤ３－、ＣＤ４９ｂ＋）に対する影響はなかったか又は最小限であった（図７）。対照的に、アルデスロイキンを用いた５回用量の治療は、Ｔｒｅｇ細胞においてより控えめなＳＴＡＴ５リン酸化プロファイルをもたらし、また、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞及びＮＫ細胞に影響を及ぼさなかった（図７）。組成物Ａ１で処理したときのＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２受容体シグナル伝達経路の活性化は、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞及びＮＫ細胞では観察されなかった増殖マーカーＫｉ６７の顕著かつ持続的な上方制御に変換された。対照的に、アルデスロイキンを用いた５回用量の治療は、ＴｒｅｇにおいてＫｉ６７のアップレギュレーションを限定的にもたらした（図７）。組成物Ａ１で処理したときのＴｒｅｇ亜集団の増殖活性の増加は、ベースラインと比較してＴｒｅｇ細胞数の非常に顕著な増加をもたらし、５日間の用量のアルデスロイキンで観察されたものよりも優れていた。細胞増殖はＴｒｅｇ亜集団に対して選択的であり、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ及びＮＫ細胞は同程度に変化しないままであった（図７）。

【0295】

実施例１１：組成物Ａ１はキーホールリンペットヘモシアニン誘発遅延型過敏症を抑制する
遅延型過敏症（ＤＴＨ）は、以前に遭遇した抗原に対する局所Ｔエフェクターリコール応答を表す。ここでは、マウスをＫＬＨによる皮下免疫化によってキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に最初に感作させ、次いで、数日後に耳への同じ抗原の皮内注射によって再チャレンジし、局所組織の炎症及び腫脹をもたらす。成体Ｂａｌｂ／ｃマウスを実験群（ｎ＝１０／群）に無作為に割り当て、一週間順応させた。０日目に、動物に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の１００μｇのＫＬＨのエマルジョンを、肩甲骨間のｓ．ｃ．注射によって投与した。組成物Ａ１を、０日目、０日目及び３日目、０、３及び５日目又は０、３、５及び８日目のいずれかに０．３ｍｇ／ｋｇ皮下投与した（図８Ａ参照）。ビヒクルを０、３、５及び８日目に皮下投与した。デジタルキャリパーを使用した左右の耳の厚さのベースライン測定後、７日目に、全ての動物に、１０μｇのＫＬＨを含む０．９％塩化ナトリウムの皮膚内注射を右耳にチャレンジした。対側（左）耳に等量の０．９％塩化ナトリウムを投与した。耳厚を、デジタルキャリパーを使用して２４、４８、７２及び９６時間で測定した。ビヒクル治療群では、耳炎症は抗原刺激の４８時間後にピークに達し、次いでゆっくりと消散した（図８Ａ）。組成物Ａ１の単回投与は、ビヒクルと比較して、全ての時点で耳炎症を強く抑制した。複数回の投与は、抗原刺激の２４時間後に炎症のより早期でより浅いピークをもたらし、その後、ほぼベースラインに戻る急速な消散をもたらした。組成物Ａ１投与の各例では、曲線下面積（ＡＵＣ）によって測定した耳腫脹の差は、ビヒクル対照より有意に小さかった（図８Ｂ及び図８Ｃを参照されたい）。したがって、組成物Ａ１は抗原駆動性組織炎症を強力に抑制する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【配列表】

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【国際調査報告】