▶ ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】水疱性口内炎ウイルスのレスキュー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20240628BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20240628BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240628BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240628BHJP
C12N 15/47 20060101ALN20240628BHJP
C12N 15/37 20060101ALN20240628BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240628BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 Z ZNA
C12N7/00
C12N5/10
C12N15/09 Z
C12N15/63 Z
C12N15/47
C12N15/37
C12N15/54
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024500141
(86)(22)【出願日】2022-07-08
(85)【翻訳文提出日】2024-02-29
(86)【国際出願番号】 EP2022069046
(87)【国際公開番号】W WO2023281047
(87)【国際公開日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】21184742.1
(32)【優先日】2021-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503385923
【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ノルデン，トビアス
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA23
4B065CA45
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法に関する。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用、あるいは一過性トランスフェクションを用いたＨＥＫ２９３細胞株又はＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程、ここで、上記少なくとも１つのプラスミドは、
（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；
（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び
（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセット
を含む；
（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；並びに
（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程
を含む、
ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法。
【請求項2】
上記回収された細胞培養上清が感染性水疱性口内炎ウイルスを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
(ｉ）上記細胞が、接着細胞として提供され、トランスフェクトされ、そして培養され；（ｉｉ）上記細胞が工程（ｂ）において一過性にトランスフェクトされ；及び／又は
（ｉｉｉ）工程（ｂ）における細胞のトランスフェクションが、化学反応に基づいたトランスフェクション剤の使用を含み、好ましくは上記化学反応に基づいたトランスフェクション剤は、リポフェクション、ポリエチレンイミン、又はリン酸カルシウムから選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
工程（ｂ）における細胞がさらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミド又はヘルパーウイルスを用いてトランスフェクト又は形質導入され；そして、上記水疱性口内炎ウイルスゲノムｃＤＮＡを含む発現カセットは、Ｔ７プロモーター配列及びＴ７転写終結配列の制御下にあるＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含み；そして場合により、上記ＶＳＶ核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質、及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質、リン酸化タンパク質及び／又はラージタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
【請求項5】
上記方法がヘルパーウイルスを含まない方法であり、工程（ｂ）の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされる、請求項４記載の方法。
【請求項6】
（ａ）上記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチド配列が、コドン最適化され；及び／又は（ｂ）上記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４又は５の方法。
【請求項7】
ＶＳＶリン酸化タンパク質、ＶＳＶ核タンパク質、及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている上記少なくとも１つの発現カセットが、１つ以上のヘルパープラスミドとしてトランスフェクトされる、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
【請求項8】
上記１つ以上のヘルパープラスミドが、（ｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第一のヘルパープラスミド；
（ｉｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第二のヘルパープラスミド；及び
（ｉｉｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第三のヘルパープラスミド；及び場合により
（ｉｖ）ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードしている配列を含む発現カセット及び／又はＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む、少なくとも１つのさらなるヘルパープラスミド
を含む、請求項７記載の方法。
【請求項9】
ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている上記発現カセットが、（ａ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含むプラスミドとしてトランスフェクトされ；及び／又は
（ｂ）プロモーターの制御下にあるＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含み、そしてさらに、転写終結配列を含み、好ましくは強力なＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあり；
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
【請求項10】
上記ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株が、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択され、好ましくは上記細胞が、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来し、より好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
【請求項11】
上記細胞がＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項12】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡが、ウイルス完全長ゲノムｃＤＮＡ又は改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項13】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡが、改変されたＧタンパク質をコードしている改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項14】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡにおいて糖タンパク質Ｇをコードしている遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードしている遺伝子によって置換され；好ましくは、糖タンパク質ＧＰが、配列番号７に示されるアミノ酸配列又は配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である機能的変異体を含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項15】
（ｅ）ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁液中の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞を、工程（ｄ）で得られたＶＳＶを用いて形質導入する工程；及び場合により（ｆ）大規模の、好ましくは５０Ｌを超える懸濁培養液中の工程（ｅ）の細胞中でＶＳＶを産生する工程
をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット、並びにＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いた、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用。
【請求項17】
（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドを用いた一過性コトランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法に関する。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株若しくは懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用、又は、一過性トランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株若しくは懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用も提供される。
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法に関する。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株若しくは懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用、又は、一過性トランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株若しくは懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用も提供される。
【0002】
発明の背景
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、狂犬病ウイルスと同様にラブドウイルス科に属する、モノネガウイルス目のマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。マイナス鎖ウイルスＲＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、翻訳前にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってプラス方向ＲＮＡへと変換されなければならない。したがって、マイナス鎖ＲＮＡの精製されたＲＮＡは感染性ではない。なぜならそれはまず転写される必要があり、これには、ウイルス粒子（ビリオン）に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするからである。
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、狂犬病ウイルスと同様にラブドウイルス科に属する、モノネガウイルス目のマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。マイナス鎖ウイルスＲＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、翻訳前にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってプラス方向ＲＮＡへと変換されなければならない。したがって、マイナス鎖ＲＮＡの精製されたＲＮＡは感染性ではない。なぜならそれはまず転写される必要があり、これには、ウイルス粒子（ビリオン）に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするからである。
【0003】
クローニングされたｃＤＮＡからの完全なマイナス鎖ＲＮＡウイルスの回収は、１９９０年代のＲＮＡウイルス学において最も刺激的な打開策の１つである。なぜならそれはウイルスゲノムの直接的な工学操作への門戸を開いたからである。したがって、クローニングされたｃＤＮＡからの完全なマイナス鎖ＲＮＡウイルスの回収は、例えば遺伝子療法のための又は腫瘍溶解性ウイルスとしての、臨床現場におけるＶＳＶのような組換えウイルスの使用のための必要条件である。それは、ＶＳＶが貨物を運ぶように、又はウイルスタンパク質を改変するように、例えば糖タンパク質を、指向性若しくは免疫回避が変化するように工学操作することを可能とする。
【0004】
Schnell et al.は、何年間もその領域を避けていた、セグメント化されていないマイナスＲＮＡウイルスの回収への鍵を発見した（Roberts & Rose, Virology, 1998, 247, 1-6; Schnell et al., EMBO J., 1994, 13(18), 4195-4203）。彼らが記載した方法は、以下の通りである：ウイルス核タンパク質（Ｎ）及びポリメラーゼサブユニット（Ｌ及びＰ）をコードしているプラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼタンパク質（ｖＴＦ７－３）を発現している組換えワクシニアウイルスに事前に感染させた細胞へとトランスフェクトした。これらのプラスミドに加えて、５’末端におけるＴ７プロモーター及び３’末端における自己切断リボザイムの制御下にある完全長アンチゲノムウイルスＲＮＡをコードしているプラスミドも、細胞にトランスフェクトされた。Ｔ７プロモーターからのＲＮＡの転写及びコードされたタンパク質の翻訳後、核タンパク質はアンチゲノムＲＮＡの周囲で構築され、そしてポリメラーゼタンパク質はその後、これらのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を複製して、ゲノムＲＮＡを含有しているＲＮＰを形成した。ゲノムＲＮＰからのｍＲＮＡの転写及び翻訳後、感染性ウイルスが構築される。この手順により、組換え狂犬病ウイルスの成功裏な回収がもたらされた。１９９５年には、非常に類似した戦略を使用して、ｃＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の最初の成功裏の回収が報告された（Lawson et al., 1995, Proc. Natl., Acad. Sci, USA 92(10), 4477-4481; Whelan et al., 1995, Proc. Natl., Acad. Sci, USA 92(18), 8388-8392)。
【0005】
ＢＨＫ細胞におけるＴ７ポリメラーゼタンパク質の安定な発現、又は強力なプロモーターの制御下にあるＴ７ポリメラーゼタンパク質をコードしているプラスミドのコトランスフェクションなどの、このシステムへの小さな適応しか近年実施されていない。しかしながら、ＶＳＶは通常、ＶＳＶ Ｇによって付与される広範な指向性を有するが、ｃＤＮＡからのＶＳＶの成功裏な回収は、ＢＨＫ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む非常に僅かな細胞株に限定されている。
【0006】
高い力価のＶＳＶが臨床用途のために産生される必要があり、これは懸濁培養液中での産生を必要とする。本発明の発明者らは、ｃＤＮＡからのＶＳＶ回収を受け易くない懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株が、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの一過性コトランスフェクションによって、ＶＳＶの回収を受け易くさせることができることを発見した。これは、ＶＳＶの大規模生産のために使用されたのと同じ細胞株からのＶＳＶのレスキューを可能とする。
【0007】
発明の要約
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株、又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法に関する。好ましくは、回収された細胞培養上清は、感染性ＶＳＶを含む。特定の実施態様では、上記方法は、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁液中の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞を、工程（ｄ）で得られたＶＳＶを用いて形質導入することを含む工程（ｅ）；及び場合により、大規模の、好ましくは５０Ｌを超える懸濁培養液中の工程（ｅ）の細胞中でＶＳＶを産生することを含む工程（ｆ）をさらに含み得る。好ましくは、工程（ｅ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、工程（ａ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株と同じ細胞株である。
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株、又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法に関する。好ましくは、回収された細胞培養上清は、感染性ＶＳＶを含む。特定の実施態様では、上記方法は、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁液中の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞を、工程（ｄ）で得られたＶＳＶを用いて形質導入することを含む工程（ｅ）；及び場合により、大規模の、好ましくは５０Ｌを超える懸濁培養液中の工程（ｅ）の細胞中でＶＳＶを産生することを含む工程（ｆ）をさらに含み得る。好ましくは、工程（ｅ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、工程（ａ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株と同じ細胞株である。
【0008】
特定の実施態様では、（ｉ）細胞が、接着細胞として提供され、トランスフェクトされ、そして培養され；（ｉｉ）細胞が工程（ｂ）において一過性にトランスフェクトされ；（ｉｉｉ）工程（ｂ）における細胞のトランスフェクションが、化学反応に基づいたトランスフェクション剤の使用を含み、好ましくはここでの化学反応に基づいたトランスフェクション剤は、リポフェクション、ポリエチレンイミン、又はリン酸カルシウムから選択されるか；又は、（ｉ）、（ｉｉ）若しくは（ｉｉｉ）の任意の組合せである。
【0009】
特定の実施態様では、工程（ｂ）の細胞はさらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミド又はヘルパーウイルスを用いてトランスフェクト又は形質導入され；そしてここでは、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセットは、Ｔ７プロモーター配列及びＴ７転写終結配列の制御下にあるＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含み；そして、場合によりここではＶＳＶ核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質、リン酸化タンパク質及び／又はラージタンパク質を含む。好ましい実施態様では、上記方法は、ヘルパーウイルス非含有方法であり、ここでの工程（ｂ）の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされる。特定の実施態様では、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の代替的な又は追加の実施態様では、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチド配列は、コドンが最適化されている。
【0010】
ＶＳＶ核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、１つ以上のヘルパープラスミドとしてトランスフェクトされ得る。例えば、１つ以上のヘルパープラスミドは、（ｉ）ＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第一のヘルパープラスミド；（ｉｉ）ＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む、発現カセットを含む第二のヘルパープラスミド；及び（ｉｉｉ）ＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む、発現カセットを含む第三のヘルパープラスミド、及び（ｉｖ）場合によりＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードしている配列を含む発現カセット及び／又は、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む、少なくとも１つのさらなるヘルパープラスミドを含む。
【0011】
本発明の方法に記載のＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットは、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている上記発現カセットを含むプラスミドとしてトランスフェクトされ、及び／又は、プロモーターの制御下にあるＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含み、そしてさらに、好ましくは強力なＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーター、より好ましくはカリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はＣＡＧプロモーターの制御下にある転写終結配列を含む。特定の実施態様では、発現カセットは、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含む。
【0012】
ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株（それらに限定されない）は、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞は、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来し、より好ましくは、上記細胞は、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択された懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する。さらにより好ましくは、上記細胞はＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。
【0013】
本発明の方法に記載のＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、ウイルス完全長ゲノムｃＤＮＡ又は改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである。特定の実施態様では、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、改変されたＧタンパク質をコードしている改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである。特定の実施態様では、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、改変されたＧタンパク質をコードしている改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡであり、ここでのＶＳＶゲノムｃＤＮＡ内の糖タンパク質Ｇをコードしている遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードしている遺伝子によって置換され；好ましくは、糖タンパク質ＧＰは、配列番号７に示されるアミノ酸配列、又は配列番号７に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である機能的変異体を含む。
【0014】
特定の実施態様では、本発明に記載の方法において発現カセットによってコードされるＳＶ４０ラージＴ抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。
【0015】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット、並びにＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いた、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用に関する。
【0016】
さらに別の態様では、本発明は、（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドを用いての一過性コトランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞におけるＶＳＶレスキューの図式的概観。
【図2】ＶＳＶのレスキュー及び増幅のプロセスのフロー図。
【図3】抗Ｐタンパク質ポリクローナル抗体（上）又はＶＳＶに対する一般的な血清（下）を用いて染色されたウェスタンブロットにおける、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（レーン１～３）及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（レーン４～６）におけるトランスフェクション後のウイルスタンパク質の発現。陽性対照として、２．３６×１０１０ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）/mlの精製ＶＳＶ－ＧＰビリオン（Ｄ－１０６－４４２）の調製物が、それぞれレーン７及び９に１．０μl及び０．２μlで示されている。Ｐ、Ｎ及びＰ／Ｍは、Ｐタンパク質、Ｎタンパク質、及びＰタンパク質とＭタンパク質とを含む混合バンドの予想される位置をそれぞれ示す。ＮＰＬ－ヘルパーは一般的に、プラスミドｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ、及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌを指し、Ｔ７－Ｐｏｌは、プラスミドｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを指し、ＶＳＶ－ＧＰは、ＶＳＶ－ＧＰのＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含むプラスミドを指す。
【図4A】ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における、ＶＳＶレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原の一過性トランスフェクション＋／－での一過性トランスフェクション。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｌ）、並びにｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを用いて、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μgのＳＶ４０ラージＴ）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）、トランスフェクトした。（Ａ）トランスフェクションから４時間後の代表的な明視野顕微鏡画像が示され（４ｈ p.t.、上の列）、トランスフェクションから４８時間後（４８ｈ p.t.、中央の列）及びトランスフェクションから７２時間後（７２ｈ p.t.、下の列）の代表的な暗視野顕微鏡画像が示されている。左手側には、トランスフェクトされていないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（上）及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞（下）が暗視野画像として、比較のための左上隅にある明視野画像と共に示されている。
【図4B】ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における、ＶＳＶレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原の一過性トランスフェクション＋／－での一過性トランスフェクション。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｌ）、並びにｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを用いて、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μgのＳＶ４０ラージＴ）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）、トランスフェクトした。（Ｂ）トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の回収物の上清の継代をさらに、ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞についての感染について分析した。上記の（Ａ）の回収物の上清を用いた、又は陰性対照としての新鮮な培地を用いた感染から４８時間後の代表的な暗視野顕微鏡画像が示されている（左手の列）。列の下にある（－）の記号は、ＶＳＶレスキューが皆無であることを示し、列の下にある（＋）の記号は、成功裏なＶＳＶレスキューを示す。ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来する、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いて感染させたＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞において、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）を見ることができたが、一方、ＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下においてＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いた感染後には、細胞変性作用は全く観察されなかった。
【図5A】独立した実験で実施されたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における、ＶＳＶレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原の一過性トランスフェクション＋／－での一過性トランスフェクション。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｌ）、並びにｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μgのＳＶ４０ラージＴ）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）、トランスフェクトした。（Ａ）トランスフェクションから４時間後（上の列）、トランスフェクションから４８時間後（中央の列）及びトランスフェクションから７２時間後（下）における代表的な暗視野顕微鏡画像、並びにそれぞれの明視野画像が、左手上の隅に示されている。
【図5B】独立した実験で実施されたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における、ＶＳＶレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原の一過性トランスフェクション＋／－での一過性トランスフェクション。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｌ）、並びにｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μgのＳＶ４０ラージＴ）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）、トランスフェクトした。（Ｂ）トランスフェクションから４時間後（上の列）、トランスフェクションから４８時間後（中央の列）及びトランスフェクションから７２時間後（下）におけるＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の回収物の上清の継代をさらに、接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における感染について分析した。暗視野画像としてトランスフェクションから４時間後（上の列）、トランスフェクションから４８時間後（中央の列）の回収物の上清を用いた、及び明視野画像としてトランスフェクションから７２時間後（下の列）における回収物の上清を用いた感染から２４時間後（p.i.）の代表的な顕微鏡画像が示されている。列の下にある（－）の記号は、ＶＳＶレスキューが皆無であることを示し、列の下にある（＋）の記号は、成功裏なＶＳＶレスキューを示す。５μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来する、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いて感染させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞において、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）を見ることができたが、一方、１μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて又はＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下において一過性にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクトから７２時間後の回収物の上清を用いた感染後には、細胞変性作用は全く観察されなかった。ＨＥＫ２９３－Ｆ陰性対照細胞の暗視野画像が、左手側に示されている。
【0018】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＥＫ２９３細胞又は懸濁に適応させたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション（例えばＣａＰＯ４により媒介されるトランスフェクション）を使用した、ｃＤＮＡからの、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はその遺伝子的に改変された形のレスキュー、及び、ウイルスレスキュー後のウイルスシードストックの作成に関する。
本発明は、ＨＥＫ２９３細胞又は懸濁に適応させたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション（例えばＣａＰＯ４により媒介されるトランスフェクション）を使用した、ｃＤＮＡからの、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）又はその遺伝子的に改変された形のレスキュー、及び、ウイルスレスキュー後のウイルスシードストックの作成に関する。
【0019】
一般的な実施態様「含む」又は「含んだ」は、「からなる」というより具体的な実施態様を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定的な意味で使用されない。本明細書において使用する単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、単数形のみを示すと明記されない限り、単数形と複数形の両方を示す。
【0020】
「タンパク質」という用語は、「アミノ酸配列」又は「ポリペプチド」の同義語として使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、糖化、又はタンパク質プロセシングを含むがこれらに限定されない反応を通して翻訳後修飾されたタンパク質も含む。修飾及び変化、例えばアミノ酸配列の置換、欠失又は挿入は、ポリペプチドの構造内に行なわれ得るが、上記分子は、その生物学的な機能的な活性を維持する。例えば、特定のアミノ酸配列の置換が、ポリペプチド又はその基礎にある核酸コード配列に行なわれ得、同じ特性を有するタンパク質を得ることができる。
【0021】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、狂犬病ウイルスと一緒にラブドウイルス科に属する、モノネガウイルス目のマイナス鎖一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスである。マイナス鎖ウイルスＲＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、翻訳前にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによってプラス方向ＲＮＡへと変換されなければならない。したがって、マイナス鎖ＲＮＡの精製されたＲＮＡは感染性ではない。なぜならそれはまず転写されることが必要とされ、これは、ウイルス粒子（ビリオン）に含まれるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを必要とするからである。ＲＮＡ配列はシークエンスのために逆転写されるので、組換えＲＮＡウイルスの配列は、一般的にｃＤＮＡ配列として提供される。
【0022】
ＶＳＶのマイナス鎖ｓｓＲＮＡゲノムは、３'から５’に向かって、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｇタンパク質及びＬタンパク質をコードしている５つのオープンリーディングフレームを含有している。核タンパク質（Ｎタンパク質）は、ヌクレオカプシドの主成分であり、ゲノム合成の開始に必要とされる。ラージタンパク質（Ｌタンパク質）はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、リン酸化タンパク質（Ｐタンパク質）と結合して、ｍＲＮＡの複製を触媒する。マトリックスタンパク質（Ｍタンパク質）は、ウイルス膜の内側に会合し、糖タンパク質（Ｇタンパク質）は、ウイルス膜内に局在するグリコシル化された膜貫通タンパク質であり、宿主細胞へのウイルスの侵入を可能とする。
【0023】
本発明は、大規模なウイルスの産生のために、例えば治療用途のために典型的には使用される、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における、ＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューに関する。ＶＳＶ血清型が存在するが、最もよく特徴が分かっていて治療に使用されるＶＳＶ血清型は、ＶＳＶインディアナ（ＶＳＩＶ）である。本明細書において開示及び使用される全ての配列は、ＶＳＩＶに由来する。ＶＳＶインディアナはＲＮＡウイルスであるので、入手可能ないくつかの完全なゲノムヌクレオチド配列が存在し、一例が、配列番号６のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＨ９１９３９８．１）である。ＶＳＶ Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、又はＬタンパク質は好ましくは、例えば、それぞれ配列番号１、２、若しくは３のアミノ酸配列を有するＶＳＩＶ、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％若しくはより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列である。
【0024】
本明細書において使用する「ＶＳＶレスキュー」という用語は、プラスミドＤＮＡなどのＤＮＡからの、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの回収を指す。目的は、分析又は大規模な産生のために細胞を形質導入するために使用することのできる、感染性ＶＳＶを産生することである。本明細書において使用する「感染性ＶＳＶ」という用語は、ＢＨＫ細胞又はＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体などの、ＶＳＶ感染に罹り易い細胞に感染するＶＳＶ粒子を指す。感染性ウイルスの産生を確認するために、トランスフェクション後（例えばトランスフェクションから４８時間後又は７２時間後（p.i.））の回収物の上清の継代が、ＶＳＶ感受性細胞（シードストック感染、Ｐ０感染とも呼ばれる）に加えられ、細胞変性作用（ＣＰＥ）について感染から４８時間後に（p.i.）顕微鏡で分析される。
【0025】
本明細書において使用する「ゲノムＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡウイルスの遺伝性の遺伝子情報を指す。当業者は、ＲＮＡウイルスゲノムは、プラスミドなどのベクター内のＤＮＡ配列として提供されてもよいことを理解するだろう。本発明の脈絡において、ＶＳＶゲノムは、「ＶＳＶゲノムｃＤＮＡ」として提供される。これは、それがプラスミドなどのベクター内のＤＮＡ配列として提供されることを意味する。その後、ＲＮＡゲノムは、転写を介して、宿主細胞のトランスフェクション後に宿主細胞内で生成される。典型的には、ベクターは、プロモーターの制御下においてＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含みそしてさらに少なくとも１つの転写終結配列を含む、発現カセットを含む。さらに、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡは典型的には、インサイツでＶＳＶアンチゲノムＲＮＡ（（＋）鎖ＲＮＡ）へと転写される、ゲノムのマイナス鎖をコードしている。好ましくはＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、Ｔ７プロモーターの制御下にあり、さらにＴ７転写終結配列を含む。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、一本鎖ＲＮＡから合成されるＤＮＡである。ＶＳＶゲノムｃＤＮＡの場合、ｃＤＮＡは、ＶＳＶのゲノムＲＮＡから合成される。
【0026】
本明細書において使用する「遺伝子」という用語は、機能的産物として発現されることによって、又は遺伝子発現の調節によって、生物の特質に影響を及ぼす、遺伝性のゲノム配列のＤＮＡ遺伝子座又はＲＮＡ遺伝子座を指す。遺伝子及びポリヌクレオチドは、ゲノム配列内のようなイントロン及びエキソンを、又はｃＤＮＡのようにコード配列だけ、例えば、開始コドン（メチオニンコドン）と翻訳停止コドンを含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。遺伝子及びポリヌクレオチドはまた、転写の開始、翻訳、及び転写の終結などの、その発現を調節する領域も含み得る。したがって、プロモーター配列及び転写終結配列などの調節配列も含まれる。
【0027】
本明細書において使用する「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は同義語として使用され、５′末端から３′末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを指し、これは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ、マイナス鎖及びプラス方向）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、組換えＤＮＡ、又は組換えＲＮＡ及びその誘導体、例えば修飾された骨格を含有しているものを含む。
【0028】
本明細書において使用する「リボ核酸」、「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド配列からなる分子を表わし、これは核酸塩基、リボース糖、及びリン酸基から構築される。ＲＮＡは通常、一本鎖分子であり、様々な機能を発揮することができる。リボ核酸という用語は具体的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含み、その各々は、生物学的細胞において特定の役割を果たす。それは小さなノンコーディングＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含む。「ノンコーディング」という用語は、ＲＮＡ分子がアミノ酸配列へと翻訳されないことを意味する。「コーディング」という用語は、ＲＮＡ分子がアミノ酸配列へと翻訳されることを意味する。
【0029】
「コーディング鎖」又は「プラス方向鎖」という用語は、タンパク質をコードしているＲＮＡ鎖を指す。
【0030】
「ノンコーディング鎖」、「アンチセンス鎖」又は「マイナス方向鎖」又は「マイナス鎖」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、翻訳前にプラス鎖ＲＮＡへと転写される必要のあるＲＮＡ鎖を指す。
【0031】
「ベクター」は、異種ポリヌクレオチドを細胞内へと導入するために使用することのできる、核酸である。ある種類のベクターは「プラスミド」であり、これは鎖状又は環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指し、その中に追加の核酸セグメントをライゲートさせることができる。別の種類のベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＶＳＶ、及びＭｅＶ複製欠陥形又は活動形）では、追加のＤＮＡ又はＲＮＡセグメントをウイルスゲノムに導入することができる。核酸の導入は一般的には、トランスフェクションと称されるが、ウイルス感染を介した核酸の導入は一般的に形質導入と称される。
【0032】
「コードする」及び「をコードする」という用語は広義には、ポリマー巨大分子内の情報を使用して、第一の分子とは異なる第二の分子の生成を指令するための任意のプロセスを指す。第二の分子は、第一の分子の化学的性質とは異なる化学構造を有し得る。例えば、「コードする」という用語は、半保存的ＤＮＡ複製プロセスを表わし、二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって新規に合成される相補的姉妹鎖をコードするための鋳型として使用される。さらに、ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ分子（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの使用による）をコードし得るか、又はＲＮＡ分子（マイナス鎖）は、ＲＮＡ分子（プラス鎖）（例えばＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの使用による）をコードし得る。また、ＲＮＡ分子（プラス鎖）は、翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードし得る。翻訳プロセスを記載するために使用される場合、「コードする」という用語はまた、アミノ酸をコードするトリプレットコドンまで拡大解釈される。ＲＮＡ分子はまた、ＤＮＡ分子を、例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用した逆転写プロセスによってコードし得る。ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子に言及する場合、転写及び翻訳のプロセスが言及される。
【0033】
本明細書において使用する「発現」という用語は、宿主細胞内の（異種）核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。宿主細胞内の関心対象の遺伝子産物の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡ（又はプラス鎖ＲＮＡ）の量、又は、選択された配列によってコードされるポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたＲＮＡは、ノザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞内ＲＮＡに対するインサイツハイブリダイゼーションによって、又はＰＣＲ、例えば定量ＰＣＲによって定量され得る。選択された配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降法によって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、タンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ分析によって、又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイによって定量され得る。異種核酸配列によってコードされる関心対象の産物はまた、ノンコーディングＲＮＡでもあり得る。ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどのノンコーディングＲＮＡの発現レベルは、ＰＣＲ、例えば定量ＰＣＲによって定量され得る。
【0034】
本明細書において使用する「発現カセット」という用語は、ＲＮＡ合成に関与するＤＮＡ分子の個別の成分を指し、これは発現される予定の配列及び調節配列、典型的には少なくともプロモーター配列及び転写終結配列を含む。最終産物がタンパク質である場合、発現される予定の配列は、タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを含む。本発明によると、発現カセットは、１つ以上のタンパク質又はＶＳＶゲノムｃＤＮＡをコードしている。発現カセットは典型的には、ベクターの一部、例えばプラスミド又はウイルスベクターである。
【0035】
「遺伝子産物」という用語は、遺伝子又はＤＮＡポリヌクレオチドによってコードされる、ｍＲＮＡポリヌクレオチド及びポリペプチドの両方を指す。
【0036】
本明細書において使用する「ＨＥＫ２９３細胞株」という用語は、ヒト胚性腎臓を起源とし、１９７３年に第１９番染色体のＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を含む、４ｋｂｐのアデノウイルス５（ａｄ５）ゲノム断片の組み込みによって最初に不死化された、接着性ヒト細胞株を指す（Graham et al., J. Gen. Virol. (1977) 36: 59-72; Malm et al., Nature research, Scientific Reports (220) 10:18996）。この細胞株は例えば、ＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから得ることができる（ATCC-CRL-1573; DSMZ No: ACC305; RRID:CVCL_0045）。この細胞株はまた、親ＨＥＫ２９３細胞株又は親ＨＥＫ２９３細胞系統とも称され得る。当業者は、本明細書において使用するＨＥＫ２９３細胞株という用語は、そのサブクローンを含むことを理解するだろう。「懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株」という用語は、無血清培地中で高密度の懸濁増殖に適応させた、親ＨＥＫ２９３細胞株にクローン的に由来し、バイオリアクター中で治療用タンパク質又はウイルスの大規模な培養及び生物学的産生を可能とする、細胞株を指す。これらは、工業的に妥当な懸濁細胞株のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－Ｈ細胞及びスタイルフリーＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を含むがこれらに限定されない。フリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は、フリースタイル（商標）２９３発現培地中での懸濁培養に適応し、これは例えば、サーモフィッシャー社（Ｒ７９００７；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｄ６０３）から得ることができる。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｈ細胞は、無血清培地（ＳＦＭ）中での迅速な増殖、優れたトランスフェクション効率、及び高いレベルのタンパク質発現のために、ＨＥＫ２９３細胞からのクローン選択によって調製され、これは例えばサーモフィッシャー社（HEK293-F: 11625019, RRID:CVCL_6642; HEK293-H: 11631017, RRID:CVCL_6643）から得ることができる。ＨＥＫ２９３－Ｈ株は変異体であり、これは血清の補充された培地中で増殖させた場合、単層培養液中でのより良好な接着、並びに、プラークアッセイ及び他の足場依存性の応用のための使用し易さを実証する。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ－２９３－Ｈ細胞は、ギブコ社（登録商標）ＣＤ２９３培地に適用させて提供される。細胞培養液中での懸濁増殖に適応させた他のＨＥＫ２９３細胞株は、例えばＨＥＫ２９３．２ｓｕｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３．３）、ＨＥＫ２９３－ＳＦ－３Ｆ６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２５８５；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿４Ｖ９４）、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（サーモフィッシャー社Ａ１４５２７／Ａ１４５２８／１０００４４２０２（ｃＧＭＰ ｂａｎｋｅｄ）；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｄ６１５）及びＨＥＫ２９３－Ｓ（Ｘｉｍｂｉｏ１５４１５５；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ａ７８４）であるがこれらに限定されない。懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株はまた「無血清培地に適応させた、２９３細胞」と称されてもよい。
【0037】
本発明は、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養において懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）上記細胞を少なくとも１つのプラスミドを用いてトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程を含む、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための方法に関する。細胞培養上清は、トランスフェクション後の任意の時点で回収され得、好ましくはそれは、トランスフェクションから２４時間後から９６時間後に、より好ましくはトランスフェクションから４８時間後から７２時間後に回収される。細胞培養液中に準備される細胞は、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から選択される。好ましくは、細胞培養液中に準備される細胞は、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞株は、典型的には血清の非存在下において、懸濁液中で効率的に増殖するように適応し、親ＨＥＫ２９３細胞株と同等な高いウイルス産生能力（例えば細胞の比生産性）を維持している、任意の親ＨＥＫ２９３細胞株であり得る。懸濁増殖に適応させた適したＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－Ｈ細胞、フリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－ＳＦ－３Ｆ６細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３．２ｓｕｓ細胞、及びＨＥＫ２９３－Ｓ細胞であるがそれらに限定されない。本発明の脈絡において懸濁増殖に適応させた好ましいＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－Ｈ細胞、フリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、及びＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、さらにより好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。好ましい実施態様では、回収された細胞培養上清は、感染性ＶＳＶを含む。感染性粒子は、ＶＳＶ感染に罹り易い細胞、例えばＢＨＫ細胞又はＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体に、上記の回収された細胞培養上清を加えることによって決定され得る。ＶＳＶ感染に罹り易い細胞としては、本明細書に記載のＨＥＫ２９３細胞株及び懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株、並びに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３Ｅ細胞を含むがこれらに限定されない他のＨＥＫ２９３誘導体が挙げられる。適切なＢＨＫ細胞としては、ＢＨＫ－２１Ｃｌ．１３細胞が挙げられるがこれらに限定されない（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿１９１５）。感染性ウイルスは、細胞変性作用（ＣＰＥ）について感染から約４８時間後に顕微鏡で検出される。したがって、特定の実施態様では、感染性粒子は、ビリオンの継代によって決定され、ここで（ｉ）回収された細胞培養上清は、ＶＳＶ感染に罹り易い細胞、好ましくはＢＨＫ２１細胞、例えばＢＨＫ－２１Ｃｌ．１３細胞又はＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に加えられ、（ｉｉ）感染性ウイルスは、細胞変性作用について感染から４８時間後に顕微鏡で検出される。
【0038】
ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセットは、典型的には逆方向の配向でＶＳＶゲノムをコードし、さらにプロモーター配列及び転写終結配列を含む。ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、ＶＳＶ核タンパク質、リン酸化タンパク質及び／又はラージタンパク質をコードしている配列を含み、さらにプロモーター配列及び転写終結配列を含む。本明細書において使用する「少なくとも１つの発現カセット」という用語は、核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質、及びラージタンパク質が同じ発現カセット内の配列によってコードされていても、又は別の発現カセット若しくはその組合せによってコードされていてもよいことを示す。１つを超えるタンパク質が発現カセットによってコードされている場合、１つを超えるタンパク質をコードしている配列は、キャップ独立的に、翻訳の開始を可能とする配列、例えば内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって連結されている。さらに、核タンパク質、リン酸化タンパク質、又はラージタンパク質が別々の、すなわち３つの発現カセットによって、又は少なくとも１つを超える発現カセットによってコードされている場合、発現カセットは同じプラスミド上及び／又は別々のプラスミド上に存在し得る。ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットは、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている配列並びにプロモーター配列及び転写終結配列を含む。（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、（ｉｉ）核タンパク質、リン酸化タンパク質、及びラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット、及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原を含む発現カセットは、１、２、３、４又は５つのプラスミド上に存在してもよい。好ましくは、発現カセット（ｉ）、少なくとも１つの発現カセット（ｉｉ）及び発現カセット（ｉｉｉ）は、別々のプラスミド上にある。より好ましくは、少なくとも１つの発現カセット（ｉｉ）は、少なくとも３つの発現カセット、すなわち核タンパク質をコードしている第一の発現カセット、リン酸化タンパク質をコードしている第二の発現カセット、及びラージタンパク質をコードしている第三の発現カセットである。第一、第二及び第三の発現カセットは、１つのプラスミド上に、又は３つの別々のプラスミド上に、又は２つのプラスミド上（一方のプラスミドは上記発現カセットの中の２つを含み、他方のプラスミドは、上記発現カセットの中の１つを含む）に存在し得る。別のプラスミドは、同じプラスミドに由来していても、又は異なるプラスミドに由来していてもよい。
【0039】
特定の実施態様では、核タンパク質、リン酸化タンパク質、及びラージタンパク質は、ＶＳＶインディアナ（ＶＳＩＶ）に由来する。特定の好ましい実施態様では、核タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、リン酸化タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有し、及び／又は、ラージタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列、若しくはそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。当業者は、特定のタンパク質の列挙された配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するタンパク質が、特定のタンパク質の機能的相同体であることを理解するだろう。例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む核タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有する核タンパク質の機能的相同体である。したがって、相同タンパク質はさらに、元来の配列と同じ又は類似したタンパク質活性を示す。
【0040】
特定の実施態様では、本発明に記載の方法はさらに、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁液中の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞を、工程（ｄ）で得られたＶＳＶを用いて形質導入する工程を含む工程（ｅ）；及び場合により大規模で、好ましくは５０Ｌを超える懸濁培養液中で工程（ｅ）の細胞中でＶＳＶを産生する工程を含む工程（ｆ）を含む。好ましくは、工程（ｅ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、工程（ａ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株と同じ細胞株である。ＶＳＶは、接着ＨＥＫ２９３細胞において産生され得るが、ウイルス産生は典型的には、特に大規模での培養液中では、より高い細胞密度により、懸濁液中でより効率的であり、さらに、血清の非存在下におけるウイルスの産生を可能とする。好ましくは、工程（ｅ）及び工程（ａ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３－Ｈ細胞、フリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆ細胞、及びＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞からなる群より選択され、より好ましくは工程（ｅ）及び工程（ａ）に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞であり、さらにより好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。本明細書において使用する「大規模」という用語は、５Ｌを超える、好ましくは１０Ｌを超える、より好ましくは２５Ｌを超える、さらにより好ましくは５０Ｌを超える、培養容量を指す。
【0041】
トランスフェクションは、接着細胞において又は懸濁液中で実施され得るが、典型的にはより高いトランスフェクション効率のために接着細胞において実施される。特定の実施態様では、工程（ａ）の細胞は、接着細胞として提供され、トランスフェクトされ、そして培養される。懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、培養培地の１～１２％、好ましくは３～１０％、より好ましくは５～１０％（ｖ／ｖ）の範囲内のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）の添加によって接着させ得る。典型的には、一過性トランスフェクションは、懸濁細胞よりも接着細胞においてより効率的である。特定の実施態様では、細胞は、工程（ｂ）において一過性にトランスフェクトされ、好ましくは、接着細胞は、工程（ｂ）において一過性にトランスフェクトされる。工程（ｂ）における細胞のトランスフェクションは、化学反応に基づいたトランスフェクション剤、例えばリポフェクション（脂質トランスフェクション）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＤＥＡＥデキストラン、又はリン酸カルシウムトランスフェクション、好ましくはリン酸カルシウムトランスフェクションの使用を含み得る。細胞は好ましくは、化学反応に基づいたトランスフェクション剤を使用して一過性にトランスフェクトされ、より好ましくは、接着細胞は、化学反応に基づいたトランスフェクション剤を使用して一過性にトランスフェクトされる。
【0042】
特定の実施態様では、工程（ｂ）の細胞はさらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミド又はヘルパーウイルスを用いてトランスフェクト又は形質導入され、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセットは、Ｔ７プロモーター配列及びＴ７転写終結配列の制御下にあるＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含み、場合により、ＶＳＶ核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質、及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質、リン酸化タンパク質及び／又はラージタンパク質をコードしている配列を含む。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセット内のＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターは好ましくは、強力なプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルスプロモーター又はＣＡＧプロモーターである。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー配列（Ｃ）、ニワトリβ－アクチン遺伝子のプロモーター、第一エキソン及び第一イントロン（Ａ）、並びにウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター（Ｇ）を含む（Niwa H et al., (1991) Gene 108(2): 193-9）。「Ｔ７転写終結配列」という用語はまた、１つを超えるＴ７転写終結配列、例えば２つ又は３つのＴ７転写終結配列、好ましくは２つのＴ７転写終結配列を含み得る。発現カセットはさらに、転写終結配列、及び場合によりＩＲＥＳ配列によって隔てられたマーカー遺伝子を含む。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの発現のために使用される典型的なヘルパーウイルスは、例えばワクシニアウイルスであるがこれらに限定されない。好ましい実施態様では、上記方法はヘルパーウイルスを含まない方法であり、ここでは工程（ｂ）の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされる。特定の実施態様では、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は、配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。特定の代替的又は追加の実施態様では、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチド配列は、コドンが最適化されている。
【0043】
ＶＳＶ核タンパク質、ＶＳＶリン酸化タンパク質、及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットは、１つ以上のヘルパープラスミドとしてトランスフェクトされ得る。例えば、１つ以上のヘルパープラスミドは、（ｉ）ＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む、発現カセットを含む、第一のヘルパープラスミド；（ｉｉ）ＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む、発現カセットを含む、第二のヘルパープラスミド；及び（ｉｉｉ）ＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第三のヘルパープラスミド、及び（ｉｖ）場合により、ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードしている配列を含む発現カセット、及び／又は、好ましくはプロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む、少なくとも１つのさらなるヘルパープラスミドを含む。ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｌ、Ｇ及び／又はＭをコードしている配列を含む発現カセットに適したプロモーターは、強力なプロモーター、好ましくは強力なＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーター、例えばＣＭＶ又はＣＡＧである。
【0044】
本発明の方法に記載のＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットは、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている上記発現カセットを含むプラスミドとしてトランスフェクトされる。発現カセットは、プロモーターの制御下にあるＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている配列を含み、さらに、好ましくは強力なＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーター、より好ましくはＣＭＶプロモーター又はＣＡＧプロモーターの制御下にある、転写終結配列を含む。特定の実施態様では、本発明に記載の方法において発現カセットによってコードされるＳＶ４０ラージＴ抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。したがって、特定の実施態様では、発現カセットは、配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含む。
【0045】
ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株はそれらに限定されないが、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞は、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来し、より好ましくは、上記細胞は、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択された懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する。さらにより好ましくは、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。ＨＥＫ２９３、特に懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株を使用する利点は、同じ細胞株を、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡからのＶＳＶのレスキューのために（典型的には接着細胞を使用して実施される）、及び懸濁細胞培養液中でのＶＳＶの産生のために使用することができることである。これは、全産生プロセスを、単一の細胞株において実施することを可能とし、これは規制当局の承認を簡単にする。
【0046】
本発明の方法に記載のＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、ウイルス完全長ゲノムｃＤＮＡ又は修飾されたウイルスゲノムｃＤＮＡである。ウイルス完全長ゲノムｃＤＮＡは、ＶＳＶインディアナなどの野生型ウイルスを提供する。ＶＳＶゲノムｃＤＮＡはまた、修飾されたウイルスゲノムｃＤＮＡであり得る。例えば、糖タンパク質（Ｇ）は、異なる（異種）ウイルスに由来する糖タンパク質、例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）に由来する糖タンパク質で置換され得る。糖タンパク質の置換は、ウイルスの指向性、並びにウイルスの他の特徴を変化させ得、例えば野生型ウイルスに伴う神経炎症又はその免疫原性を回避し得る。ＬＣＭＶの糖タンパク質を含むＶＳＶは、ＶＳＶ－ＧＰとも称され得る。特定の実施態様では、本発明の方法に記載のＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、修飾されたウイルスゲノムｃＤＮＡ（修飾されたＶＳＶゲノムｃＤＮＡ）である。修飾されたＶＳＶゲノムｃＤＮＡは、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含むがこれらに限定されず、ここでのＧタンパク質をコードしている遺伝子は、別のウイルス受容体、例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰ、ダンデノン（Dandenong）ウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はモペイア（Mopeia）ウイルス（ＭＯＰＶ）の糖タンパク質（国際公開公報第２０２０／１０４６９４号により詳述されているような）、又はアレナウイルスの糖タンパク質で置換されている。好ましい実施態様では、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡ内の糖タンパク質Ｇは、好ましくはＷＥ－ＨＰＩ株に由来する、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰで置換されている。このようなＶＳＶは例えば、国際公開公報第２０１０／０４０５２６号に記載され、ＶＳＶ－ＧＰと命名されている。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰは、ＧＰ１又はＧＰ２であり得るが、また異なるＬＣＭＶ株に由来する糖タンパク質も含み得る。特に、ＬＣＭＶ－ＧＰは、ＬＣＭＶ野生型又はＬＣＭＶ株のＬＣＭＶ－ＷＥ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰＩ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰＩ optに由来し得る。好ましい実施態様では、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰをコードしている遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているが、配列番号７に示されるようなアミノ酸配列をコードしている糖タンパク質ＧＰを含むＶＳＶの機能的特性は、維持されている。
【0047】
さらに、修飾されたウイルスゲノムｃＤＮＡは、例えばゲノムｃＤＮＡの遺伝子間遺伝子座において、追加の遺伝子を含み得る。追加の遺伝子は好ましくは、異種タンパク質をコードしている異種遺伝子である。したがって、１つの実施態様では、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡはさらに、少なくとも１つの異種タンパク質、例えば治療用タンパク質、及び抗原、例えば腫瘍特異的抗原若しくは腫瘍随伴抗原又はレポーター遺伝子をコードしている。
【0048】
本明細書において使用する「異種ポリペプチド」又は「異種タンパク質」という用語は、レシピエントに由来する異なる生物又は異なる種に由来するタンパク質、すなわちＲＮＡウイルス、例えばＶＳＶを指す。本発明の脈絡において、当業者は、それが、ＶＳＶによって天然に発現されないタンパク質を指すことを理解するだろう。タンパク質の部分に言及して使用される場合の「異種」という用語はまた、上記タンパク質が、天然には互いに同じ関係では見られない、２つ以上のアミノ酸配列を含むことも示し得る。本発明の脈絡では、それは典型的には、治療用タンパク質、抗原、例えば腫瘍特異的抗原又は腫瘍随伴抗原、又はレポーター（例えばルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質）である。異種ポリペプチドは、異種核酸配列又は遺伝子によってコードされている。
【0049】
「治療用タンパク質」という用語は、ヒト及び／又は動物の医学的処置に使用され得るタンパク質を指す。これらには、抗体、増殖因子、血液凝固因子、サイトカイン、例えばインターフェロン及びインターロイキン、ケモカイン及びホルモン、好ましくは増殖因子、サイトカイン、ケモカイン及び抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【0050】
「サイトカイン」という用語は、細胞によって放出され、例えば分泌細胞の周囲にある細胞の行動に影響を及ぼしている細胞内メディエーターとして作用する、小型タンパク質を指す。サイトカインは、免疫細胞又は他の細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージによって分泌され得る。サイトカインは、細胞内シグナル伝達事象、例えば自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達及び内分泌シグナル伝達に関与し得る。それらは、免疫、炎症、及び造血を含むがこれらに限定されない、一連の生物学的プロセスを媒介し得る。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、又は腫瘍壊死因子であり得る。
【0051】
本明細書において使用する「増殖因子」は、細胞増殖を刺激することのできる、タンパク質又はポリペプチドを指す。
【0052】
本明細書において使用する「レポーター遺伝子」は、レポータータンパク質すなわち容易に検出及び定量され得る「レポーター」をコードしているポリヌクレオチドである。したがって、レポーターの発現レベルの測定は典型的には、転写及び／又は翻訳レベルの指標である。レポーターをコードしている遺伝子は、レポーター遺伝子である。例えば、レポーター遺伝子は、レポーター、例えばその活性を定量することのできる酵素、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（例えば分泌された胚性アルカリホスファターゼ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ウミホタル、ガウシア、又はホタルルシフェラーゼタンパク質（群）をコードし得る。レポーターはまた、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はＧＦＰの任意の組換え変異体（増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を含む）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ及び他の誘導体）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ及び他の誘導体）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ及び他の誘導体）、及び赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ及び他の誘導体）、又は他の蛍光タンパク質、例えばｍＣｈｅｒｒｙ及びｍＷａｓａｂｉも含む。
【0053】
異種という用語は、ウイルスに感染した宿主又は患者ではなくむしろ、ＲＮＡウイルスを指し、それ故、真核生物タンパク質、特にヒトタンパク質を明確に包含する。異種タンパク質は、レシピエントに由来する異なる生物又は異なる種に由来するタンパク質、すなわちＲＮＡウイルスＶＳＶである。本発明に記載のＲＮＡウイルスによってコードされる少なくとも１つの異種タンパク質は、治療用タンパク質、レポーター、又は腫瘍抗原であり得る。好ましくは、少なくとも１つの異種タンパク質は、好ましくはサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、及び抗体からなる群より選択された、免疫調節機能又は細胞死調節機能を有する、治療用タンパク質である。治療用タンパク質はまた、膜結合タンパク質であり得るか、又は、好ましくはリンカーを介して連結された、異種タンパク質への、ＣＤ４の膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインとの融合によって膜に結合され得る。治療用タンパク質はまた、自殺遺伝子をコードしていてもよい。代替的には又はそれに加えて、少なくとも１つの異種タンパク質は、腫瘍抗原（腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍随伴抗原を含む）、例えば系統抗原、新生抗原、精巣抗原、及びオンコウイルス抗原である。「腫瘍特異的抗原」という用語は、腫瘍細胞において専ら発現され、生物のいずれかの他の組織には発現されない抗原を指す。「腫瘍随伴抗原」という用語は、生物内の他の組織と比較して腫瘍細胞において過剰発現される、すなわちより高いレベルで発現される抗原を指す。腫瘍抗原はまた、新生抗原又は新生抗原群であってもよい。新生抗原群は、腫瘍体細胞突然変異から生じる新規に形成された抗原である。当業者は、患者から新生抗原をどのように検出し決定するかを知っているだろう。別の実施態様では、異種タンパク質はレポータータンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ又はｍＷａｓａｂｉである。特に治療目的のための異種タンパク質は好ましくは、免疫調節機能又は細胞死滅調節機能を有する治療用タンパク質又は腫瘍抗原である。
【0054】
当業者は、本発明の方法は、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのために例示されているが、それは、モノネガウイルス目、オルトミクソウイルス目、ブニヤウイルス目、及び／又はアレナウイルス目、特にモノネガウイルス目などの他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスにも容易に適応され得ることを理解しているだろう。したがって、別の態様では、（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中での懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）上記細胞を少なくとも１つのプラスミドを用いてトランスフェクトする工程（ここでの少なくとも１つのプラスミドは、（ｉ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；（ｉｉ）マイナス鎖ＲＮＡウイルスのタンパク質、例えばヌクレオカプシドのタンパク質（例えばモノネガウイルス、特にラブドウイルス、パラミクソウイルス、フィロウイルス、及びボルナウイルスの核タンパク質（Ｎ／ＮＰ）タンパク質、リン酸化タンパク質（Ｐ）タンパク質、及びラージ（Ｌ）タンパク質）をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む）；（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；及び（ｄ）レスキューされたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む、細胞培養上清を回収する工程を含む、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのレスキューのための方法。好ましい実施態様では、回収された細胞培養上清は、感染性のマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む。本明細書におけるＶＳＶについて例示されたさらなる実施態様及び態様は、他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスにも適用される。
【0055】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、及び（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット、並びにＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いた、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用に関する。本発明に記載の方法に関する実施態様及び詳細な説明は、本発明に記載の水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用にも同様に適用される。したがって、本発明はまた、本発明に記載のＤＮＡから水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法における、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用にも関する。本発明に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用の特定の実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択された、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株であり、より好ましくは懸濁増殖に適応ＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。
【0056】
さらに別の態様では、本発明は、（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、及び（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドを用いた一過性コトランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用に関する。本発明に記載の方法に関する実施態様及び詳細な説明は、本発明に記載のＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用にも適用される。したがって、本発明はまた、本発明に記載のＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法における、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用にも関する。本発明に記載のＳＶ４０ラージＴをコードしているプラスミドの使用の特定の実施態様では、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、好ましくはＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択された、懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株であり、より好ましくは懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である。
【0057】
実施例
一過性トランスフェクションを使用したプラスミドからのヘルパーウイルス非含有ＶＳＶレスキューのために、細胞を、少なくとも５つのプラスミド、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ベクター、ＣＡＧプロモーター（ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ、及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド）の制御下にあるウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ又はＬをコードしている３つの別々のプラスミド、及び組換え水疱性口内炎ウイルスのｃＤＮＡクローンをコードしているプラスミド（ここでのＶＳＶ糖タンパク質Ｇのコード配列はＬＣＭＶ－ＧＰによって交換されている）を用いてトランスフェクトした。ウイルスゲノムは、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってプラスミドから転写され得、ＶＳＶゲノムに相補的な完全長プラス鎖ＲＮＡを生じ得る。ｃＤＮＡから結果として生じたウイルスは、ＶＳＶ－ＬＣＭＶ－ＧＰと称される。プロセスの略図は、図１に実証されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＶＳＶゲノムをコードしているＤＮＡを、センス鎖配向を有するウイルスＲＮＡへと転写する。核タンパク質Ｎ並びに２つのポリメラーゼサブユニットＰ及びＬも発現している、細胞内におけるこのＲＮＡの発現は、ＶＳＶリボ核タンパク質の産生をもたらし、これは続いて、ＶＳＶ－ＬＣＭＶ－ＧＰビリオンへとパッケージングされ、萌芽によって細胞から放出される。
一過性トランスフェクションを使用したプラスミドからのヘルパーウイルス非含有ＶＳＶレスキューのために、細胞を、少なくとも５つのプラスミド、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ベクター、ＣＡＧプロモーター（ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ、及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド）の制御下にあるウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ又はＬをコードしている３つの別々のプラスミド、及び組換え水疱性口内炎ウイルスのｃＤＮＡクローンをコードしているプラスミド（ここでのＶＳＶ糖タンパク質Ｇのコード配列はＬＣＭＶ－ＧＰによって交換されている）を用いてトランスフェクトした。ウイルスゲノムは、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによってプラスミドから転写され得、ＶＳＶゲノムに相補的な完全長プラス鎖ＲＮＡを生じ得る。ｃＤＮＡから結果として生じたウイルスは、ＶＳＶ－ＬＣＭＶ－ＧＰと称される。プロセスの略図は、図１に実証されている。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、ＶＳＶゲノムをコードしているＤＮＡを、センス鎖配向を有するウイルスＲＮＡへと転写する。核タンパク質Ｎ並びに２つのポリメラーゼサブユニットＰ及びＬも発現している、細胞内におけるこのＲＮＡの発現は、ＶＳＶリボ核タンパク質の産生をもたらし、これは続いて、ＶＳＶ－ＬＣＭＶ－ＧＰビリオンへとパッケージングされ、萌芽によって細胞から放出される。
【0058】
材料
キット
リン酸カルシウムトランスフェクションキット
キットは、以下を含有している：
・５mlの２．５MのＣａＣｌ２
・２５mlの２×ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水
・２５mlの分子生物学的等級の水。
キット
リン酸カルシウムトランスフェクションキット
キットは、以下を含有している：
・５mlの２．５MのＣａＣｌ２
・２５mlの２×ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水
・２５mlの分子生物学的等級の水。
【0059】
化学物質、培地、及び緩衝液
・クロロキン二リン酸塩
・完全ＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ）：
・５００mlのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース、グルタミン非含有）
・５０mlのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、熱で失活させたもの
・１０mlのＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質
・ＴｒｙｐＬＥ（商標）選択酵素（１×）、フェノールレッド非含有
・ＰＢＳ－１×油中水型、カルシウム、マグネシウム
・プラスミド、動物成分非含有、及び品質管理検査済：
１．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド
２．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド
３．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｍプラスミド（任意選択）
４．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｇプラスミド（任意選択）
５．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミドを含む
６．ｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴ
７．ｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ
８．ｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ウイルスｃＤＮＡ、「ＶＳＶ－ＧＰ」とも称される）。
・クロロキン二リン酸塩
・完全ＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ）：
・５００mlのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース、グルタミン非含有）
・５０mlのウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、熱で失活させたもの
・１０mlのＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質
・ＴｒｙｐＬＥ（商標）選択酵素（１×）、フェノールレッド非含有
・ＰＢＳ－１×油中水型、カルシウム、マグネシウム
・プラスミド、動物成分非含有、及び品質管理検査済：
１．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド
２．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド
３．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｍプラスミド（任意選択）
４．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｇプラスミド（任意選択）
５．ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミドを含む
６．ｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴ
７．ｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ
８．ｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ウイルスｃＤＮＡ、「ＶＳＶ－ＧＰ」とも称される）。
【0060】
ヘルパープラスミドｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ、及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌは、核タンパク質（配列番号１）、リン酸化タンパク質（配列番号２）及びラージタンパク質（配列番号３）を含む、ＲＮＰの構築、転写及び複製に必要とされる、ウイルストランス作用タンパク質をコードしている。マトリックス（Ｍ）タンパク質及びウイルス糖タンパク質（Ｇ）タンパク質の追加の発現はさらに、ウイルスのレスキューを増強し得る。プラスミドｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｍ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ及びｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴは、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＳＦ－ＣＡＧ＿ＡＭＰバックグラウンドベクター（シグマアルドリッチ社、製造番号：ＯＧＳ５０４）から作製され、これはＣＡＧプロモーターの制御下のＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、－Ｍ、－Ｇ、－Ｌタンパク質をコードしている。ＶＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬは、インディアナ血清型ゲノムｃＤＮＡクローンに由来していた（Lawson et al., 1995）。コザック共通配列が開始コドンの５′に含まれることにより、翻訳のための最適な配列前後関係を提供した。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ベクターｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ ｐｕｒｏは、ｐＣＡＧＧＳバックグラウンドベクターに最初は由来し（Niwa H et al., (1991) Gene 108(2): 193-9）、アンピシリン耐性遺伝子、ＳＶ４０ｏｒｉ及びｐＢＲ３２２ｏｒｉを含み、そして、ＣＡＧプロモーターの制御下にありそしてＩＲＥＳ配列を介してピューロマイシンコード配列に連結された、コドン最適化されたＴ７ポリメラーゼ（配列番号４）をコードしている。プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰは、完全長のウイルスゲノムｃＤＮＡをコードし、Ｇタンパク質をコードしている遺伝子は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号７）に由来するＧＰタンパク質をコードしている遺伝子によって置換されることにより、ＶＳＶ－ＧＰを生成する。ＳＶ４０ラージＴ抗原（配列番号５）は、ＣＭＶプロモーターの制御下にある。５’末端のＴ７ＲＮＡＰプロモーターは、転写がファージＴ７転写終結配列によって終結される前に、プラス方向ゲノム転写物の合成を指令し、プラスミドは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【0061】
トランスフェクション培地
・５００mlのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース
グルタミン非含有）
・１０mlのＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質
・５００mlのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、高グルコース
グルタミン非含有）
・１０mlのＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質
【0062】
試料及び細胞株
・ＨＥＫ２９３－Ｆ（サーモフィッシャー社、製造番号：１１６２５－０１９）
・ＨＥＫ２９３Ｔ（EUFETS GmbH/BioNTech IMFSによって提供）
・ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３（Cell line services (CLS）製造番号：６０３１２６)
・ＨＥＫ２９３－Ｆ（サーモフィッシャー社、製造番号：１１６２５－０１９）
・ＨＥＫ２９３Ｔ（EUFETS GmbH/BioNTech IMFSによって提供）
・ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３（Cell line services (CLS）製造番号：６０３１２６)
【0063】
接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞培養液の作製
ウイルス回収のために、ＨＥＫ２９３－Ｆ懸濁細胞培養液を、トランスフェクションより少なくとも１継代前に接着細胞液へと形質転換した。ＨＥＫ２９３－Ｆ懸濁細胞は、均衡のとれたＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地（富士フィルム）から、完全に補充されたｃＤＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清、２％ＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質）へと細胞培養条件を変更することによって形質転換された。細胞は、Nucleo counter NC-200装置（ケモメテック社）を使用して計数され、３０mlのｃＤＭＥＭ中でＴ１７５細胞培養フラスコの細胞あたり２．０×１０６個の細胞で播種された。細胞を、３７℃、６％二酸化炭素、及び９５％湿度で２～３日間培養した。接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は、一過性トランスフェクションのためだけでなく、より重要なことには、クローン性ウイルスを得るためのその後のプラークの精製にとっても必要とされる。
ウイルス回収のために、ＨＥＫ２９３－Ｆ懸濁細胞培養液を、トランスフェクションより少なくとも１継代前に接着細胞液へと形質転換した。ＨＥＫ２９３－Ｆ懸濁細胞は、均衡のとれたＣＤ（登録商標）ＨＥＫ２９３培地（富士フィルム）から、完全に補充されたｃＤＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清、２％ＣＴＳ（商標）グルタミン（商標）－Ｉ補充物質）へと細胞培養条件を変更することによって形質転換された。細胞は、Nucleo counter NC-200装置（ケモメテック社）を使用して計数され、３０mlのｃＤＭＥＭ中でＴ１７５細胞培養フラスコの細胞あたり２．０×１０６個の細胞で播種された。細胞を、３７℃、６％二酸化炭素、及び９５％湿度で２～３日間培養した。接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は、一過性トランスフェクションのためだけでなく、より重要なことには、クローン性ウイルスを得るためのその後のプラークの精製にとっても必要とされる。
【0064】
プラスミドＤＮＡを用いたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
細胞を、トランスフェクションから１日前に（ｄ－１）１０cmの皿中の１０mlのｃＤＭＥＭ中に、５×１０６個のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞で播種し、３７℃のインキュベーター中で１６～２４時間培養した。細胞は、トランスフェクション日に８０％の集密度であった。
細胞を、トランスフェクションから１日前に（ｄ－１）１０cmの皿中の１０mlのｃＤＭＥＭ中に、５×１０６個のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞で播種し、３７℃のインキュベーター中で１６～２４時間培養した。細胞は、トランスフェクション日に８０％の集密度であった。
【0065】
トランスフェクション日（ｄ０）に、プラスミドを、１０cmの皿あたり以下の量で混合した：
１０．０μgのウイルスｃＤＮＡ（例えばｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ）
２．４μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド
１．８μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド
０．６μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド
１０．０μgのｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ
１．０～５．０μgのｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴ（任意選択）
１０．０μgのウイルスｃＤＮＡ（例えばｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ）
２．４μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド
１．８μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド
０．６μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド
１０．０μgのｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ
１．０～５．０μgのｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴ（任意選択）
【0066】
本発明の実験には添加されていないが、プラスミドｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｍ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｇは、各々１μgで混合物に添加され得る。
【0067】
トランスフェクションの１時間前に、細胞を、５mlの予め加温したトランスフェクション培地（グルタミンを含むＤＭＥＭ）で注意深く洗浄し、８mlの予め加温したトランスフェクション培地を、細胞層を攪乱することなく細胞に注意深く加え、インキュベーター中で１時間インキュベートした。その間に、ＤＮＡマスター混液を、リン酸カルシウム沈降法を用いたトランスフェクションのために、１．５mlの反応チューブ中で調製し、チューブを揺らすことによって混合し、続いて迅速に回転し沈降させた。
【0068】
各レスキューのために、無菌の細胞培養等級の水を含むチューブを調製して、少なくとも４５０μlの容量（ＤＮＡ混合物を含む）の最終総容量を提供した。ウイルスｃＤＮＡ及び／又はｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴの具体的な量をそれぞれのチューブに加え、ピペットを上下させることによって混合し、さらにＤＮＡ－マスター混液を加え、チューブを揺らすことによって混合し迅速に回転し沈降させた。５０．０μlの２．５ＭのＣａＣｌ２（使用まで氷上に保つ）を各チューブに加え、ピペットを上下させることによって混合し、ＤＮＡ／ＣａＣｌ２混合物を、正確に５分間４℃でインキュベートした。
【0069】
各レスキューのために、５００μlの２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマ社）を、１５mlの反応チューブにピペットで入れ、ボルテックスミキサー上に置き、ＤＮＡ／ＣａＣｌ２混合物を、激しくボルテックスにかけながら約３０秒間かけて１０００μlのマイクロタイターピペットを使用してゆっくりと滴下して加え、さらに３０秒間ボルテックスにかけた。混合物を、室温で計２０分間インキュベートし、さらに混合することなく、リン酸カルシウム－ＤＮＡ沈降物の形成を可能とした。
【0070】
２mlのトランスフェクション培地を、１０μlの２５mMのクロロキンストック溶液と混合し、血清用ピペットを使用して、８０％の集密率の細胞を含む１０cmの組織培養皿に注意深く加えた。皿を穏やかに動かして混合し（皿中の全容量：１０ml、最終濃度は２５μMのクロロキン）、細胞を、２０分間のインキュベーションの残りにはインキュベーターに戻した。トランスフェクション混液は、１０００μlのマイクロタイターピペットを用いて、細胞層の異なる領域に滴下して添加され、皿を、リン酸カルシウム－ＤＮＡ複合体の均一な分布のために穏やかに動かした。細胞を、３７℃のインキュベーター中でインキュベートし、クロロキンを含む培地を、５mlのｃＤＭＥＭで細胞を１回洗浄した後、１０mlの予め加温したｃＤＭＥＭと４時間後に交換し、指示されているように培養した。培地の５０％を、必要であれば、２日間毎に交換して培地が酸性になるのを防いだ。
【0071】
レスキューの回収
トランスフェクション後の指定された時点で、１０cm皿の上清を回収し、１５mlのチューブに移した。チューブを、３００ｒｃｆで４分間遠心分離にかけた。上清を、０．２０μmのフィルターを使用してろ過し、１mlのアリコート（レスキュー上清）を使用して、６×１．５mlのチューブに移した。チューブを、さらなる処理まで－８０℃で凍結させたか、又はビリオンの継代がレスキュー回収と同じ日に実施された場合には４℃で保存された。
トランスフェクション後の指定された時点で、１０cm皿の上清を回収し、１５mlのチューブに移した。チューブを、３００ｒｃｆで４分間遠心分離にかけた。上清を、０．２０μmのフィルターを使用してろ過し、１mlのアリコート（レスキュー上清）を使用して、６×１．５mlのチューブに移した。チューブを、さらなる処理まで－８０℃で凍結させたか、又はビリオンの継代がレスキュー回収と同じ日に実施された場合には４℃で保存された。
【0072】
感染性ビリオンの継代
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞を、１０cmの皿あたり５×１０６個で、感染の１日前（ｄ－１）に１０mlのｃＤＭＥＭ中に、又は１０cmの皿あたり１×１０７個の細胞で、３７℃のインキュベーター中で培養されたトランスフェクションの朝（ｄ０）に播種した。細胞は、レスキュー上清を用いた感染日において約８０％の集密率であった。
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞又はＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞を、１０cmの皿あたり５×１０６個で、感染の１日前（ｄ－１）に１０mlのｃＤＭＥＭ中に、又は１０cmの皿あたり１×１０７個の細胞で、３７℃のインキュベーター中で培養されたトランスフェクションの朝（ｄ０）に播種した。細胞は、レスキュー上清を用いた感染日において約８０％の集密率であった。
【0073】
１mlのレスキュー上清（使用まで４℃で保存したか又は感染前に約３０分間かけて解凍した）を、細胞層を攪乱することなく、各プレートに滴下して加えた。培養容器を前後左右に穏やかに振動させて、上清を均一に分布させ、細胞を３７℃のインキュベーター中で２４時間から４８時間インキュベートした。陰性対照として、培地を１枚の皿に添加してもよい。
【0074】
ウイルスシードストックの回収
２４～４８時間後、ウイルスシードストックを、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）が可視化できる場合に回収した。上清を、各皿から取り出し、１５mlのチューブに移した。チューブを、３００rcfで４分間遠心分離にかけた。上清を、０．２０μmのフィルターを使用してろ過し、０．６mlを、１mlのアリコート（レスキュー上清）を使用して、１．５mlのチューブに移した。チューブを、プラークの精製まで－８０℃で凍結した。
２４～４８時間後、ウイルスシードストックを、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）が可視化できる場合に回収した。上清を、各皿から取り出し、１５mlのチューブに移した。チューブを、３００rcfで４分間遠心分離にかけた。上清を、０．２０μmのフィルターを使用してろ過し、０．６mlを、１mlのアリコート（レスキュー上清）を使用して、１．５mlのチューブに移した。チューブを、プラークの精製まで－８０℃で凍結した。
【0075】
一般化されたプロセスの概略が、図２に図で提供されている。
【0076】
実施例１
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞が、ワクチン又は遺伝子療法としての臨床用途のための、ＶＳＶ又は組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ、例えば遺伝子改変された糖タンパク質を含む）のための懸濁産生細胞株として頻繁に使用される。規制の理由のために、一過性トランスフェクションを使用した、プラスミドからのヘルパーウイルス非含有ＶＳＶ又はｒＶＳＶレスキューためにも、懸濁産生細胞株を使用することが有利である。しかしながら、本発明者らは、ＶＳＶ又はｒＶＳＶが、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞において一過性トランスフェクションを使用して効率的にレスキューされなかったことを観察した。容易にトランスフェクトされかつ実験室の状況で頻繁にウイルス産生のために使用されることが知られている関連した細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、他方で、ＶＳＶレスキューのための効率的な細胞株であることが示された。
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞が、ワクチン又は遺伝子療法としての臨床用途のための、ＶＳＶ又は組換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ、例えば遺伝子改変された糖タンパク質を含む）のための懸濁産生細胞株として頻繁に使用される。規制の理由のために、一過性トランスフェクションを使用した、プラスミドからのヘルパーウイルス非含有ＶＳＶ又はｒＶＳＶレスキューためにも、懸濁産生細胞株を使用することが有利である。しかしながら、本発明者らは、ＶＳＶ又はｒＶＳＶが、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞において一過性トランスフェクションを使用して効率的にレスキューされなかったことを観察した。容易にトランスフェクトされかつ実験室の状況で頻繁にウイルス産生のために使用されることが知られている関連した細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、他方で、ＶＳＶレスキューのための効率的な細胞株であることが示された。
【0077】
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞におけるＶＳＶレスキューを最適化するために、ウイルスタンパク質発現を、トランスフェクション後にＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞において分析した。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、上記のような、１０μgのｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ、２．４μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド、１．８μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド、０．６μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド、及び１０μgのｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを使用して接着細胞として一過性にトランスフェクトされた。場合により、１μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－ＧＰプラスミドをトランスフェクションのためにＤＮＡ－混合物に加えたか、又は、全てのＮＰＬ－ヘルパープラスミド（ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ）が、図３に示されるように、陰性対照として省略された。
【0078】
細胞溶解液は、Ｐタンパク質に対するポリクローナル抗体（図３、上のパネル）並びに少なくともＮ、Ｐ及びＭタンパク質を認識するＶＳＶタンパク質に対する一般的な抗体（図３、下のパネル）を使用して、ＳＤＳ ｐａｇｅ及びウェスタンブロットによって分析された。Ｐタンパク質及びＭタンパク質は、１本のバンドとして泳動するので、それらは、この血清を使用して区別することができない。陽性対照として、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって精製されかつタンジェンシャルフローろ過によって２．３６×１０１０のＴＣＩＤ５０/ml（Ｄ－１０６－４４２）まで濃縮されたＶＳＶ－ＧＰウイルスを、別々のレーンで１μl及び０．２μlで使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞におけるＰタンパク質及びＮタンパク質の発現における明瞭な差は観察されなかった（図３、レーン１及び４）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現は、直接検出されなかった。Ｐタンパク質及びＮタンパク質の発現はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ依存性ではないので、データは、少なくともＰタンパク質及びＮタンパク質のトランスフェクション効率及び発現の全体的な相違は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＶＳＶレスキューについて観察された相違を説明できないことを示唆する。
【0079】
実施例２
ＳＶ４０ラージＴ抗原がＨＥＫ２９３－Ｆ細胞においてＶＳＶレスキューを支持することができるかどうかを分析するために、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、ＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下又は存在下において、２つの異なる量のプラスミド（１μg及び５μg）を用いて、上記のようなＶＳＶレスキューのための５つのプラスミドを使用してトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は接着細胞として培養され、１０μgのｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ、２．４μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド、１．８μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド、０．６μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド、及び１０μgのｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを使用して、上記のようなプラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴを用いて（１μg又は５μg）又は用いずに一過性にトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、対照として、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを行なうことなく、同じようにトランスフェクトされた。様々な時点における代表的な写真が、図４Ａに提供される。
ＳＶ４０ラージＴ抗原がＨＥＫ２９３－Ｆ細胞においてＶＳＶレスキューを支持することができるかどうかを分析するために、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、ＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下又は存在下において、２つの異なる量のプラスミド（１μg及び５μg）を用いて、上記のようなＶＳＶレスキューのための５つのプラスミドを使用してトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は接着細胞として培養され、１０μgのｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ、２．４μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎプラスミド、１．８μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐプラスミド、０．６μgのｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌプラスミド、及び１０μgのｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを使用して、上記のようなプラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴを用いて（１μg又は５μg）又は用いずに一過性にトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、対照として、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを行なうことなく、同じようにトランスフェクトされた。様々な時点における代表的な写真が、図４Ａに提供される。
【0080】
ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞における感染性ウイルスの産生を確認するために、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞の回収物の上清の継代を、ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞に加え、感染から４８時間後（p.i.）に細胞変性作用（ＣＰＥ）について顕微鏡で分析した。驚くべきことには、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いてのＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の一過性トランスフェクションが、ＶＳＶ又はｒＶＳＶのレスキューを可能としたことが判明した。明瞭な細胞変性作用が、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来する、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いて感染させたＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞において可視化できたが、一方、ＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下におけるＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いての感染後に細胞変性作用は全く観察されなかった（図４Ｂ）。感染から４８時間後、ＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下におけるＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いての、ＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞の感染は、陰性対照としての回収物の上清の代わりに、培地と共にインキュベートされたＢＨＫ２１Ｃｌ．１３細胞とは識別不可能であった。それ故、Ｔ抗原の存在が、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における感染性ウイルスに必要とされると結論付けられ得る。
【0081】
実施例３
以前の実験は、ＶＳＶの成功裏なレスキューを確認するために、感染性ビリオンの継代について、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を使用して独立して反復された。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、Ｌ）及びｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを用いて、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μg）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）トランスフェクトした。様々な時点における代表的な写真が図５Ａに提供されている。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における感染性ウイルスの産生を確認するために、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の回収物の上清を、８０％の集密率の接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に加え、感染から２４時間後（p.i.）に細胞変性作用（ＣＰＥ）について顕微鏡で分析した。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を使用したこのより早期な時点で、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）が、５μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いて感染させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞において可視できたが、１μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて又はＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下において一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いた感染後に細胞変性作用は全く観察されなかった（図５Ｂ）。
以前の実験は、ＶＳＶの成功裏なレスキューを確認するために、感染性ビリオンの継代について、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を使用して独立して反復された。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を、プラスミドｐＶＳＶ－ＬＣＭＶ ＧＰ（ＶＳＶ－ＧＰ）、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｎ、ｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｐ及びｐＣＡＧ ＶＳＶ－Ｌ（ＶＳＶ－Ｎ、－Ｐ、Ｌ）及びｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏを用いて、プラスミドｐＣＡＧ ＳＶ４０ラージＴのコトランスフェクションを伴い（１μg又は５μg）又は伴うことなく（ＳＶ４０ラージＴは皆無）トランスフェクトした。様々な時点における代表的な写真が図５Ａに提供されている。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞における感染性ウイルスの産生を確認するために、トランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後のＨＥＫ２９３－Ｆ細胞の回収物の上清を、８０％の集密率の接着ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に加え、感染から２４時間後（p.i.）に細胞変性作用（ＣＰＥ）について顕微鏡で分析した。ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を使用したこのより早期な時点で、明瞭な細胞変性作用（ＣＰＥ）が、５μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いて感染させたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞において可視できたが、１μgのＳＶ４０ラージＴ抗原を用いて又はＳＶ４０ラージＴ抗原の非存在下において一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に由来するトランスフェクションから４８時間後及びトランスフェクションから７２時間後の回収物の上清を用いた感染後に細胞変性作用は全く観察されなかった（図５Ｂ）。
【0082】
実施例４
ラージＴ抗原の存在は、ＳＶ４０ｏｒｉを含有しているベクターの増加した増幅に関連していた。ＳＶ４０ｏｒｉを含むＶＳＶレスキューのために使用されるプラスミドのみが、Ｔ７－ＲＮＡＰ（ｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ）をコードしているプラスミドである。対応するｐＣＡＧベクターからのウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬの発現は、人工ＣＡＧプロモーターによって駆動され、Ｔポリメラーゼの存在に依存しないので、ウイルスタンパク質レベルの差は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞と比較して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において観察されたウイルスの回収率の差を説明しない（図３）。しかしながら、本発明者らは、プラスミドのトランスフェクション後の初期工程におけるＶＳＶ－ＧＰゲノムＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ依存性の一次転写が、様々な細胞株におけるウイルスの回復に影響を及ぼすことを排除できない。
ラージＴ抗原の存在は、ＳＶ４０ｏｒｉを含有しているベクターの増加した増幅に関連していた。ＳＶ４０ｏｒｉを含むＶＳＶレスキューのために使用されるプラスミドのみが、Ｔ７－ＲＮＡＰ（ｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏ）をコードしているプラスミドである。対応するｐＣＡＧベクターからのウイルスタンパク質Ｎ、Ｐ及びＬの発現は、人工ＣＡＧプロモーターによって駆動され、Ｔポリメラーゼの存在に依存しないので、ウイルスタンパク質レベルの差は、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞と比較して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において観察されたウイルスの回収率の差を説明しない（図３）。しかしながら、本発明者らは、プラスミドのトランスフェクション後の初期工程におけるＶＳＶ－ＧＰゲノムＲＮＡのＴ７ポリメラーゼ依存性の一次転写が、様々な細胞株におけるウイルスの回復に影響を及ぼすことを排除できない。
【0083】
Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼの存在下において、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞におけるＶＳＶレスキューにおけるＳＶ４０ｏｒｉの効果を分析するために、本発明者らは、Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼの発現のためのＳＶ４０ｏｒｉを含んでいない異なるベクターを使用して、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞においてＶＳＶレスキューを反復した。それ故、プラスミドｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡＰ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏに由来するＴ７－ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを、ＶＳＶ Ｐタンパク質、Ｎタンパク質、及びＬタンパク質の発現のために使用されるｐＣＡＧプラスミドにクローニングした。効率は一般的に、ｐＣＡＧＧＳ Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼ ＩＲＥＳ Ｐｕｒｏと比較して低かったが、ラージＴ抗原依存性ＶＳＶレスキューは依然として、Ｔ７－ＲＮＡポリメラーゼの発現のためのＳＶ４０ｏｒｉを欠失しているプラスミドを使用して観察された。ここでもＶＳＶのレスキューは、ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞においてラージＴ抗原の存在下においてのみ観察された。
【0084】
配列表
配列番号１（水疱性口内炎インディアナウイルス、ＶＳＶ－Ｎ）：
配列番号１（水疱性口内炎インディアナウイルス、ＶＳＶ－Ｎ）：
【化1】
【0085】
配列番号２（水疱性口内炎インディアナウイルス、ＶＳＶ－Ｐ）：
【化2】
【0086】
配列番号３（水疱性口内炎インディアナウイルス、ＶＳＶ－Ｌ）：
【化3】
【0087】
配列番号４（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ）：
【化4】
【0088】
配列番号５（サルウイルス４０、ＳＶ４０ラージＴ抗原）：
【化5】
【0089】
配列番号６（水疱性口内炎インディアナウイルス株Ｔ１０２６Ｒ１完全配列）：
【化6】
【0090】
配列番号７（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＬＣＭＶ ＧＰ）：
【化7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ＨＥＫ２９３細胞株又は細胞培養液中における懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株から細胞を提供する工程、（ｂ）少なくとも１つのプラスミドを用いて上記細胞をトランスフェクトする工程、ここで、上記少なくとも１つのプラスミドは、
（ｉ）水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット；
（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット；及び
（ｉｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセット
を含む；
（ｃ）トランスフェクトされた細胞を培養する工程；並びに
（ｄ）レスキューされたＶＳＶを含む細胞培養上清を回収する工程
を含む、
ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株におけるＤＮＡからの水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキュー法。
【請求項2】
上記回収された細胞培養上清が感染性水疱性口内炎ウイルスを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
(ｉ）上記細胞が、接着細胞として提供され、トランスフェクトされ、そして培養され；（ｉｉ）上記細胞が工程（ｂ）において一過性にトランスフェクトされ；
（ｉｉｉ）工程（ｂ）における細胞のトランスフェクションが、化学反応に基づいたトランスフェクション剤の使用を含み、及び／又は
（ｉｖ）工程（ｂ）における細胞のトランスフェクションが、リポフェクション、ポリエチレンイミン、又はリン酸カルシウムから選択される、上記化学反応に基づいたトランスフェクション剤の使用を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
工程（ｂ）における細胞がさらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミド又はヘルパーウイルスを用いてトランスフェクト又は形質導入され；そして、上記水疱性口内炎ウイルスゲノムｃＤＮＡを含む発現カセットは、Ｔ７プロモーター配列及びＴ７転写終結配列の制御下にあるＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
【請求項5】
上記方法がヘルパーウイルスを含まない方法であり、工程（ｂ）の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性プロモーターの制御下にあるバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしている発現カセットを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされる、請求項４記載の方法。
【請求項6】
（ａ）上記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードしているヌクレオチド配列が、コドン最適化され；及び／又は（ｂ）上記バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼが、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４又は５の方法。
【請求項7】
ＶＳＶリン酸化タンパク質、ＶＳＶ核タンパク質、及びＶＳＶラージタンパク質をコードしている上記少なくとも１つの発現カセットが、１つ以上のヘルパープラスミドとしてトランスフェクトされる、請求項１記載の方法。
【請求項8】
上記１つ以上のヘルパープラスミドが、（ｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶ核タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第一のヘルパープラスミド；
（ｉｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶリン酸化タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第二のヘルパープラスミド；及び
（ｉｉｉ）プロモーター配列及び転写終結配列の制御下にあるＶＳＶラージタンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む第三のヘルパープラスミド
を含む、請求項７記載の方法。
【請求項9】
ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている上記発現カセットが、（ａ）ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含むプラスミドとしてトランスフェクトされ；及び／又は
（ｂ）プロモーターの制御下にあるＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含み、そしてさらに、転写終結配列を含み；
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている核酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項10】
上記ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株が、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ－２９３－Ｈ、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、及びフリースタイルＨＥＫ２９３－Ｆからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項11】
上記細胞がＨＥＫ２９３－Ｆ細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項12】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡが、ウイルス完全長ゲノムｃＤＮＡ又は改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項13】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡが、改変されたＧタンパク質をコードしている改変されたウイルスゲノムｃＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項14】
上記ＶＳＶゲノムｃＤＮＡにおいて糖タンパク質Ｇをコードしている遺伝子が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードしている遺伝子によって置換されている、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項15】
（ｅ）ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁液中の懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株に由来する細胞を、工程（ｄ）で得られたＶＳＶを用いて形質導入する工程
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセット、並びにＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしている発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドの一過性トランスフェクションを用いた、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのためのＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株の使用。
【請求項17】
（ｉ）ＶＳＶゲノムｃＤＮＡを含む発現カセット、並びに（ｉｉ）ＶＳＶ核（Ｎ）タンパク質、ＶＳＶリン酸化（Ｐ）タンパク質、及びＶＳＶラージ（Ｌ）タンパク質をコードしている少なくとも１つの発現カセットを含む、少なくとも１つのプラスミドを用いた一過性コトランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞株又は懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞株における、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のレスキューのための、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードしているプラスミドの使用。
【請求項18】
上記１つ以上のヘルパープラスミドが、
ＶＳＶ糖タンパク質（Ｇ）をコードしている配列を含む発現カセット及び／又はＶＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質をコードしている配列を含む発現カセットを含む、少なくとも１つのさらなるヘルパープラスミドを含む、
請求項８記載の方法。
【請求項19】
さらに（ｆ）大規模の懸濁培養液中の、工程（ｅ）の細胞中でＶＳＶを産生する工程
を含む、
請求項１５記載の方法。
【国際調査報告】