特表 2024-524600 桿体光受容体における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】桿体光受容体における遺伝子の特異的発現のためのプロモーター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240628BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240628BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240628BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240628BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z

C12N15/63 Z ZNA

C12N15/86 Z

C12N5/10

C12N1/15

C12N1/21

C12N1/19

C12N15/864 100Z

C12N7/01

A61P27/02

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/12

A61K38/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024500621

(86)(22)【出願日】2021-07-06

(85)【翻訳文提出日】2024-01-05

(86)【国際出願番号】 EP2021068653

(87)【国際公開番号】W WO2023280388

(87)【国際公開日】2023-01-12

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524008432

【氏名又は名称】インスティテュート オブ モレキュラー アンド クリニカル オフサルモロジー バーゼル

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ロスカ， ボトンド

(72)【発明者】

【氏名】ショル， ヘンドリック ペー．エヌ．

(72)【発明者】

【氏名】ユトナー， ヨゼフィーネ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA23

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA03

4C084CA53

4C084MA58

4C084NA14

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZB211

4C084ZB212

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087BC83

4C087MA58

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZA33

4C087ZB21

(57)【要約】

桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する第１の核酸配列と、該プロモーターに作動可能に連結されている外因性遺伝子をコードする少なくとも１つのさらなる核酸配列とを含む単離された核酸分子であって、該第１の核酸配列が、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的等価配列バリアントを含むかまたはそれからなる、単離された核酸分子。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

－桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する第１の核酸配列と、
－前記プロモーターに作動可能に連結されている前記外因性遺伝子をコードする少なくとも１つのさらなる核酸配列と、
を含むかまたはこれらからなる単離された核酸分子であって、
前記第１の核酸配列が、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的等価配列バリアントを含むかまたはそれからなり、かつ前記さらなる核酸配列に作動可能に連結されている、前記単離された核酸分子。

【請求項2】

前記第１の核酸及び前記さらなる核酸が異種である、請求項１に記載の単離された核酸。

【請求項3】

前記第１の核酸配列が、８００～１０００塩基対の配列長を有する、請求項１または２に記載の核酸分子。

【請求項4】

前記少なくとも１つのさらなる核酸配列が、治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子の１つ以上をコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項5】

先行請求項のいずれか１項に記載の核酸分子を含むかまたはそれからなる、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のための発現カセット。

【請求項6】

請求項５に記載の発現カセットを含む、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのウイルスベクター。

【請求項7】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはＡＶＶ由来ハイブリッドベクターである、請求項６に記載のウイルスベクター。

【請求項8】

ＡＶＶ由来キャプシド及び請求項７に記載のＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子。

【請求項9】

請求項５に記載の発現カセットで形質転換された宿主細胞。

【請求項10】

－請求項５に記載の発現カセット、請求項６～７のいずれか１項に記載のベクター、請求項８に記載のウイルス粒子、または請求項８に記載の形質転換細胞と、
－薬学的に許容される担体または賦形剤と、
を含む医薬組成物。

【請求項11】

ヒトまたは動物における眼疾患の治療または予防に使用するための、請求項５に記載の発現カセット、請求項６～７のいずれか１項に記載のベクター、請求項８に記載のウイルス粒子、請求項９に記載の形質転換細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記眼疾患が、桿体光受容細胞変性に関連する疾患であり、加齢黄斑変性、レーベル遺伝性視神経症、桿体錐体ジストロフィー、桿体機能不全、レーベル先天黒内症、スターガルト病、糖尿病網膜症、ベスト病、網膜色素変性症、コロイデレミア、または壁板網膜変性から選択される、請求項１１に記載の使用のための発現カセット、ベクター、細胞、ウイルス粒子、または医薬組成物。

【請求項13】

桿体光受容細胞での治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子の特異的発現のための、プロモーター活性を有し、請求項１または２または３に規定される核酸分子の使用。

【請求項14】

治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子による桿体光受容細胞の特異的形質転換のための方法であって、前記方法が、
－請求項５に記載の発現カセット、
－請求項６～７のいずれか１項に記載のベクター、
－請求項８に記載のウイルス粒子、
－請求項９に記載の形質転換細胞、もしくは
－請求項１０に記載の医薬組成物
と前記桿体光受容細胞をインキュベートするステップ、または前記桿体光受容細胞においてそれらを導入するステップを含む、前記方法。

【請求項15】

請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、桿体光受容体において遺伝子を発現するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光受容細胞変性に関連する眼疾患の治療及び予防の分野に関する。本発明は、ヒトまたは動物の網膜の桿体光受容細胞において特異的に目的の治療遺伝子を発現させるためのプロモーター活性を有する核酸配列を提供する。

【背景技術】

【0002】

失明は世界中で何百万人もの人々を不自由にし、健康上の大きな問題となっている。失明の最も一般的な原因の１つは、網膜、特に光受容細胞の機能不全である。網膜失明の最も一般的な形態は、網膜色素変性症（ＲＰ）及び黄斑変性症（ＡＭＤ）であり、とりわけ、光受容細胞の変性、及びその結果として生じる光感度の喪失が引き起こされる。光受容体のこのような変性またはその光感度の喪失に関連する問題を回避できるようにする必要がある。これは、好ましくは、治療用分子、特にポリペプチド、キニン、栄養因子、チャネル、オプシンもしくは受容体、または核酸分子を、桿体光受容細胞において特異的に発現させることによって行うことができる。

【0003】

発現のため、組換え遺伝子または外因性もしくは異種遺伝子は、通常、標的細胞、細胞集団、または組織中に、典型的には異種遺伝子の転写を可能とする活性発現カセットの環境下のｃＤＮＡ構築物としてトランスフェクトされる。ＤＮＡ構築物は、シス調節エレメント、例として、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター及びプロモーター（本明細書においてまとめて「調節エレメント」と称される）における多くのトランス作用性転写因子（ＴＦ）の活性を含むプロセスにおいて細胞転写機構により認識される。遺伝子プロモーターは、これらの調節レベルの全てに関与しており、ＤＮＡ配列、転写因子結合、及びエピジェネティックな特徴の影響を組み込むことによって遺伝子転写における決定因子として機能する。これらは、例えば導入遺伝子発現の強度、及び該導入遺伝子が発現される細胞タイプ（複数可）を決定する。

【0004】

哺乳動物細胞における異種遺伝子発現を駆動するために使用される共通のプロモーターは、ヒト及びマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターである。これらは強力な発現をもたらし、いくつかの細胞タイプでロバストであることが判明している。他のウイルスプロモーター、例えばＳＶ４０最初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーターも発現カセットで高頻度で使用される。ウイルスプロモーターの代わりに、細胞プロモーターを使用することもできる。公知のプロモーターの中には、ベータ－アクチン、伸長因子１アルファ（ＥＦ－１アルファ）、またはユビキチンなどの大量に転写される細胞転写産物をコードするハウスキーピング遺伝子由来のプロモーターがある。ウイルスプロモーターと比較して、真核遺伝子の発現は、より複雑であり、多くの異なる因子の正確な協調を必要とする。

【0005】

導入遺伝子発現のための内因性調節エレメントの使用に関して懸念される態様は、安定なｍＲＮＡの生成と、発現が、それに応じてトランス作用性転写因子が提供される宿主細胞の天然環境において行うことができることが挙げられる。真核生物遺伝子の発現は、シス及びトランス作用性調節エレメントの複雑な機構により制御されるため、ほとんどの細胞プロモーターは、広範な機能的特性が欠けている。真核生物プロモーターの部分は、通常、その転写される配列のすぐ上流に位置し、転写開始点として機能する。コアプロモーターは、転写機構により認識されるのに十分である転写開始部位（ＴＳＳ）を直接囲む。近位プロモーターは、コアプロモーターの上流の領域を含み、ＴＳＳ及び転写調節のために必要とされる他の配列特徴を含有する。転写因子は、プロモーター及びエンハンサー配列中の調節モチーフに結合することにより配列特異的に作用する。

【0006】

いくつかのプロモーターは、細胞特異的様式で作用することができ、特定のタイプの細胞内または特定のサブセットの細胞内での導入遺伝子の発現に使用することができる。

【0007】

本発明の１つの目的は、哺乳動物（ヒトまたは動物）細胞において高発現レベルで１つ以上の所望の遺伝子を発現させるために組換え構築物での使用に適した、新規なプロモーター配列と、これらのプロモーター配列を含む遺伝子ツールとを得ることである。特に、桿体光受容細胞特異的様式で所望の遺伝子を高レベルで発現することができ、かつ桿体光受容体の変性を特徴とする障害を含む眼障害の治療及び／または予防に使用するための新規なプロモーターを提供することが目的である。桿体特異的プロモーターは、例えば、神経変性障害、視力回復、創薬、及び桿体光受容体の変性に関連する障害の診断を研究するための系を開発するためのリサーチツールとしての使用にも望まれている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様では、本発明は、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する核酸分子を提供する。１つの特定の核酸分子の核酸配列は以下である：ＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＧＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＴＡＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＣＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＧＡＴＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＧＧＣＣＧＡＧＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＧＡＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＧＧＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＡＣＡＧＴＡＡＡＴＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＡＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＣＴＣＡＧＴＡＴＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧＡＣＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＣＣＡＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＴＣＣＣＡＧＴＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣ（配列番号１）。

【0009】

プロモーター配列である配列番号１は、特にウイルスベクターまたは他の発現系に組み込まれた場合、マウス、オルガノイド及びヒトの桿体光受容体において特異的かつ効率的な遺伝子発現を駆動する。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス網膜及びｉｎ ｖｉｔｒｏヒト網膜オルガノイドのような経済的モデル系における桿体光受容体の基礎的及び前臨床的研究に特異的な操作が、網膜疾患メカニズムを発見し、新たな遺伝子治療アプローチを開発することを可能にする。同じウイルスベクターをヒト網膜上で使用できることは、これらの結果を直接的に反映させることを可能とし、したがって臨床における新規な遺伝子治療の適用が加速されることになる。

【0010】

したがって、本発明は、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を付与する核酸分子を提供し、該核酸分子は、配列番号１、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するその機能的等価配列バリアントを含むかまたはこれらからなり、該機能的等価配列バリアントは、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する。好ましくは、プロモーター活性を付与する核酸は、異種である外因性遺伝子に作動可能に連結されている。

【0011】

一実施形態では、本発明の機能的バリアントは、配列番号１に対して８０％を上回る配列同一性を有する。好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。別の好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。別の好ましい実施形態では、機能的バリアントは、配列番号１に対して少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する。

【0012】

配列バリアントは、配列中の１つ以上の塩基の欠失または挿入または置換により配列番号１の配列に由来し得る。好ましくは、本発明の配列バリアントは、１～２００塩基対、または１～１００塩基対、または１～５０塩基対、または１～２０塩基対の欠失、挿入及び／または置換により配列番号１の配列に由来する。

【0013】

いくつかの実施形態では、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する核酸配列は、配列番号１の配列に対して、少なくとも４００塩基対、または少なくとも５００塩基対、または少なくとも６００塩基対、または少なくとも７００塩基対、または少なくとも８００塩基対、または少なくとも９００塩基対の配列長（連続ヌクレオチド）にわたって配列同一性を共有する。

【0014】

いくつかの実施形態では、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を有する核酸配列は、少なくとも８００塩基対、少なくとも９００塩基対、少なくとも９５０塩基対、少なくとも８８０塩基対である。その好ましいバリアントでは、配列は、１２００塩基対以下、または１１００塩基対以下、または１０５０塩基対以下、または１０２０塩基対以下である。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、８００～１２００塩基対、好ましくは８００～１０００塩基対の配列長を有する。

【0015】

一実施形態では、本発明のプロモーターは、以下：
－配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、
－配列番号１の少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含む配列、及び
－低、中または高ストリンジェンシー条件下で配列番号１の核酸配列またはその相補鎖とハイブリダイズすることができる配列
からなる群から選択される配列番号１の機能的バリアントを含むかまたはそれからなる。

【0016】

特定の実施形態では、本発明のプロモーターは、配列番号１に対して、好ましくは配列番号１の配列全体にわたって少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する機能的バリアントを含むかまたはそれからなる。本発明のプロモーターは、配列番号１のポリヌクレオチドとは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の置換、欠失及び／または挿入によって異なり得る。

【0017】

特定の実施形態では、本発明のプロモーターは、配列番号１の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個の連続ヌクレオチドを含む配列を有する機能的バリアントを含むかまたはそれからなる。好ましくは、それは、配列番号１の少なくとも５００個の連続したヌクレオチドを含む配列を有する機能的バリアントを含むかまたはそれからなる。

【0018】

さらなる特定の実施形態では、本発明のプロモーターは、配列番号１の核酸配列またはその相補鎖と、低、中または高ストリンジェンシー条件下で、好ましくは中ストリンジェンシー条件下で、より好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる配列を有する機能的バリアントを含むかまたはそれからなる。

【0019】

中ストリンジェントな条件下で上記の本発明の単離された核酸分子またはその相補鎖にハイブリダイズする配列を含む単離された核酸分子もまた提供される。高ストリンジェントな条件下で上記の本発明の単離された核酸分子またはその相補鎖にハイブリダイズする配列を含む単離された核酸分子もまた提供される。

【0020】

本発明の１つの特定の実施形態は、配列番号１、またはその機能的等価配列バリアントを含むかまたはそれからなる、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのプロモーター活性を付与する第１の核酸配列と、桿体光受容体特異的プロモーターに作動可能に連結されている、外因性遺伝子をコードする少なくとも１つのさらなる核酸配列と、を含むかまたはそれからなる単離された核酸分子である。好ましくは、プロモーター活性を付与する核酸は、異種である外因性遺伝子に作動可能に連結されている。

【0021】

したがって、本発明の第２の態様では、遺伝子発現カセットに特に類似する核酸分子が提供される。本発明の発現カセットは、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている１つ以上の核酸を含み得る。少なくとも１つのさらなる核酸配列は、治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子の１つ以上をコードする。例えば、プロモーターは、１つ以上の治療用遺伝子、及びレポータータンパク質をコードする核酸に、または治療用遺伝子、及び光遺伝学的アクチュエーターに作動可能に連結され得る。典型的には、発現カセットは、プロモーターに異種の少なくとも１つの核酸を含む。特に、治療用タンパク質は、ＭＴ－ＮＤ４、ＭＴ－ＮＤ１、ＭＴ－ＮＤ６、ＭＴ－ＣＹＢ、ＭＴ－Ｃ０３、ＭＴ－ＮＤ５、ＭＴ－ＮＤ２、ＭＴ－ＣＯＩ、ＭＴ－ＡＴＰ６、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、及びＡＣ０２からなる群から選択される。

【0022】

特に、治療用タンパク質は神経栄養因子であり、好ましくはＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、及びＥＰＯからなる群から選択される。

【0023】

特に、治療用タンパク質は抗アポトーシス性タンパク質であり、好ましくはＢＣＬ２及びＢＣＬ２Ｌ１からなる群から選択される。

【0024】

特に、治療用タンパク質は抗血管新生因子であり、好ましくはエンドスタチン、アンジオスタチン、及びｓＦｌｔからなる群から選択される。

【0025】

特に、治療用タンパク質は抗炎症因子であり、好ましくはＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、及びＩＬ４からなる群から選択される。

【0026】

特に、治療用タンパク質は桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）である。

【0027】

特に、治療用タンパク質は光遺伝学的活性化因子、好ましくはロドプシン、フォトプシン、メラノプシン、ピノプシン、パラピノプシン、ＶＡオプシン、ペロプシン、ニューロプシン、エンセファロプシン、レチノクロム、ＲＧＲオプシン、レッドシフトしたスペクトル特性を有する微生物オプシン、例えばＲｅａＣｈＲ、Ｃｈｒｉｍｓｏｎ、またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ、Ｇｉ／０シグナル伝達を動員できる脊椎動物オプシン、例えば短波長脊椎動物オプシンまたは長波長脊椎動物オプシン、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属の微細藻類由来のチャネルロドプシン、例えばチャネルロドプシン－１及びチャネルロドプシン－２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来）、ならびにそれらのバリアントからなる群から選択される光遺伝学的活性化因子である。

【0028】

特に、治療用タンパク質は、光遺伝学的阻害因子、好ましくは、ハロロドプシン、例えばハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、増強型ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ２．０及びｅＮｐＨＲ３．０）及びレッドシフトしたハロロドプシンＨａｌｏ５７、アーキロドプシン－３（ＡＲ－３）、アーキロドプシン（Ａｒｃｈ）、バクテリオロドプシン、例えば増強型バクテリオロドプシン（ｅＢＲ）、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ真菌オプシン（Ｍａｃ）、クラックスハロロドプシンＪａｗｓ、ならびにそれらのバリアントからなる群から選択される光遺伝学的阻害因子である。

【0029】

特に、治療用核酸は、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイムからなる群から選択される。

【0030】

特に、レポータータンパク質は、好ましくは蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。好ましいレポータータグは、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＥＹＦＰ及びｔｄＴｏｍａｔｏから選択される。

【0031】

さらなる態様では、本発明は、桿体光受容細胞での外因性遺伝子の特異的発現のためのウイルスベクターに関する。ベクターは、本発明の発現カセットを含む。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターまたは非病原性パルボウイルスである。別の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはＡＡＶ由来ハイブリッドベクターであり、ポリペプチドをコードする核酸または目的の核酸に隣接する２つのＩＴＲを含み得る。

【0032】

さらなる態様では、本発明は、ウイルス粒子、特にＡＶＶ由来キャプシド及び本発明のＡＡＶベクターを含むウイルス粒子に関する。好ましい実施形態では、ＡＡＶ由来キャプシドは、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７ｍ８（ＡＡＶ２－７ｍ８）、ＡＡＶ－ＢＰ２１、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ－４４．９、ＡＡＶ－ＮＨＰ２６（ＬＢ２６）、ＡＡＶ９－７ｍ８、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９血清型キャプシドからなる群から選択される。

【0033】

さらなる態様では、本発明は、細胞または宿主細胞、好ましくは本発明の発現カセットにより、本発明のベクターまたはウイルス粒子により形質転換された桿体光受容細胞に関する。

【0034】

さらなる態様では、本発明は、本発明の発現カセットと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。

【0035】

その一実施形態では、医薬組成物は、本発明のベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。

【0036】

そのさらなる実施形態では、医薬組成物は、本発明のウイルス粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。

【0037】

そのさらなる実施形態では、医薬組成物は、本発明の形質転換細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。

【0038】

別の態様では、本発明は、ヒトまたは哺乳動物における眼疾患の治療または予防に使用するための、本発明の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞に関する。好ましくは、眼疾患は、加齢黄斑変性、桿体錐体ジストロフィー、桿体機能不全、レーベル先天黒内症、スターガルト病、糖尿病網膜症、ベスト病、網膜色素変性症、コロイデレミア、または壁板網膜変性などの、光受容細胞の変性もしくは喪失または光感度の喪失に関連する疾患から選択される。

【0039】

さらなる態様では、本発明は、桿体光受容細胞での治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子の発現のための本発明の核酸、発現カセット、ベクター、またはウイルス粒子の使用に関する。

【0040】

さらなる態様では、本発明は、治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子を桿体光受容細胞において発現させる方法、好ましくは、治療上有効なタンパク質、ペプチドもしくは核酸、またはレポーター分子による桿体光受容細胞の特異的形質転換方法に関し、桿体光受容細胞を、本発明の発現カセット、本発明のベクター、本発明のウイルス粒子、本発明の形質転換細胞、または本発明の医薬組成物とインキュベートする、またはそれらと接触させるステップを含む。

【0041】

代替的または付加的に、本発明の方法は、桿体光受容細胞に、本発明の発現カセット、本発明のベクター、本発明のウイルス粒子、本発明の形質転換細胞、または本発明の医薬組成物を導入するステップを含む。

【0042】

さらなる態様では、本発明は、光受容体の変性もしくは喪失または光感度の喪失に関連する眼疾患を予防または治療するための治療方法であって、治療を必要とするヒト個体または動物に、治療上有効な量の本発明の医薬組成物を投与するステップを含む、治療方法に関する。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療される眼の硝子体に投与される。別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療される眼の前眼房に投与される。別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療される眼の前眼房に投与される。別の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療される眼の網膜の網膜下腔に投与される。

【0043】

さらなる態様では、本発明は、本発明による単離された核酸分子を含む、桿体光受容体において遺伝子を発現するためのキットに関する。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1A】ＡＡＶ作製のために構築されたプラスミド：ｐＡＡＶ－配列番号１－ＣａｔＣｈ－ＧＦＰの配列マップである。

【図1B】ヒト網膜オルガノイドで発現するためのＡＡＶ作製のために構築されたプラスミド：ｐＡＡＶ－配列番号１－ＧＦＰの配列マップである。

【図2】ＡＡＶ－配列番号１－Ｃａｔｃｈ－ＧＦＰ及びＡＡＶ－配列番号１－ＧＦＰでそれぞれ感染させたヒト網膜、網膜オルガノイド及びホールマウントマウス網膜の断面のスピニングディスク共焦点顕微鏡画像である。左：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ（緑色）、中央左：錐体マーカーＣＡＲを用いた免疫染色（マゼンタ）、中央右：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ及び錐体マーカー、右：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ及び錐体マーカー及び核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ、白色）。

【図3】ＡＡＶ感染したヒト及びマウス網膜（上面図）及び全ヒト網膜オルガノイドの断面の共焦点画像（ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ（黒色））である。

【図4】ヒト網膜（上段）、ヒト網膜オルガノイド（中段）、及びマウス網膜（下段）における発現の定量プロットであり：左列：桿体光受容体密度に占めるＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ＋細胞密度の割合を定量化したもの；値はｎ＝１２共焦点画像からの平均±標準誤差である；右列：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰを発現する細胞の中での主要な細胞タイプまたはクラス（黒色）及びマイナーな細胞タイプまたはクラス（灰色）の割合（％）として示されたＡＡＶ標的特異性を定量化したものである。

【発明を実施するための形態】

【0045】

桿体光受容体、桿体細胞、または桿体は、眼の網膜にある光受容細胞であり、他の種類の視覚光受容体である錐体細胞よりも強度の低い光で機能することができる。桿体は、網膜の外縁部に集中しており、周辺視野で使用される。平均すると、ヒト網膜には約９０００万個の桿体細胞が存在する。錐体細胞よりも感度が高く、桿体細胞は、夜間視力のほとんど全てを担っている。しかしながら、ヒト錐体細胞が３種類の感光色素を有するのに対し、桿体細胞は１種類の感光色素しか有さないため、桿体は、色覚にほとんど役割を果たさない。

【0046】

本発明の核酸分子は、桿体光受容細胞における外因性遺伝子の非常に特異的な発現を可能にするが、桿体光受容細胞ではない他の細胞では可能にしないプロモーター活性を付与する。特に、本発明の核酸分子は、単離されたヒト細胞から再構成されたオルガノイド細胞培養物のヒト桿体光受容細胞に対して高い細胞特異性で有意なプロモーター活性を有するが、このオルガノイド細胞培養物の他の全ての細胞においてプロモーター活性を有しない。さらに、本発明の核酸分子は、単離されたヒト網膜外植片におけるヒト桿体光受容細胞に対して高い細胞特異性で有意なプロモーター活性を有するが、この網膜外植片の他の全ての細胞においてプロモーター活性を有しない。本発明の核酸分子は、有利には、網膜細胞、特に桿体光受容細胞における遺伝子欠陥を代償するために導入遺伝子または他の医薬化合物をスクリーニングする特異的スクリーニングツールの提供を可能にし、最終的に、そのような遺伝子欠陥に関連する網膜変性または失明から保護する、それらを改善する、または治癒するための１つ以上の治療上有効な化合物を提供及び確立する。

【0047】

本発明のプロモーターを使用する方法はまた、視力回復のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験にも使用することができ、該方法は、本発明のプロモーターの制御下で１つ以上の導入遺伝子を発現する桿体光受容体を薬剤と接触させるステップと、該薬剤との接触後に得られた少なくとも１つの出力を該薬剤との接触前に得られた同じ出力と比較するステップとを含む。本発明の核酸配列を使用する方法は、神経障害または桿体光受容体が関与する網膜の障害の治療のための治療剤を同定するために使用することができ、該方法は、本発明のプロモーター下で１つ以上の導入遺伝子を発現する桿体光受容体を試験化合物と接触させるステップと、試験化合物の存在下で得られた桿体光受容体の少なくとも１つの出力を該試験化合物の非存在下で得られた同じ出力と比較するステップとを含む。

【0048】

さらに、本発明の核酸分子は、患者におけるヒト網膜の桿体光受容細胞において、外因性遺伝子、特に治療的に活性なエフェクターをコードする外因性遺伝子を非常に特異的に発現するためのプロモーター活性を付与する。同時に、本発明の核酸分子は、桿体光受容細胞以外の網膜細胞において外因性遺伝子またはエフェクターの発現が起こらないようにする。本発明の核酸分子は、有利には、桿体光受容細胞における遺伝子欠陥もしくは障害、または桿体光受容細胞、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に機能的に関連する細胞における遺伝子欠陥もしくは障害に関連する網膜変性もしくは失明から保護する、それらを改善する、または治癒するためのヒト眼における治療用エフェクターの特異的発現の提供を可能にする。

【0049】

外因性遺伝子の「特異的発現」とは、「特定のタイプの細胞でのみ発現」とも呼ばれ、目的の遺伝子を発現する細胞の少なくとも７５％超が、指定されたタイプ、すなわち、この場合には桿体光受容体のものであることを意味する。

【0050】

本発明の合成プロモーターは、ヒト網膜のヒト桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を、高特異性で、すなわち８０％超、好ましくは８５．０％超または８６．０％超の発現特異性で駆動し得る。同時に、本発明の合成プロモーターは、マウス網膜のマウス桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を、高特異性で、すなわち９０％超、好ましくは９５％超の発現特異性で駆動し得る。さらに、本発明の合成プロモーターは、ヒト網膜オルガノイドの桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を、高特異性で、すなわち９０％超、好ましくは９８．０％超の発現特異性で駆動し得る。本明細書及び以下では、発現特異性は、目的の遺伝子の細胞集団発現全体における目的の遺伝子の桿体光受容体発現の割合を決定することによって定量化される。

【0051】

より具体的には、本発明の合成プロモーターは、ヒト桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を高い率で、すなわち２５．０％超、好ましくは３０．０％超の発現密度で駆動し得る。さらに、本発明の合成プロモーターは、マウス桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を、３５．０％超、好ましくは４０．０％超の発現密度で駆動し得る。本明細書及び以下では、発現密度は、それぞれ公表されているヒト網膜（Ｊｏｎａｓ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｕｎｔ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２３０，５０５－５１０（１９９２））及びマウス網膜における桿体光受容体の平均密度（細胞／ｍｍ２）に対する、目的の外因性遺伝子を発現する桿体光受容体の密度の割合（％）として定義されている。合成プロモーター配列番号１は、全ヒト桿体光受容体の３０．４％及び全マウス桿体光受容体の４１．２％において発現を駆動した。

【0052】

さらに、本発明の合成プロモーターは、単離されたヒト細胞から得られた網膜オルガノイドにおいてヒト桿体光受容体における目的の外因性遺伝子の発現を、３０％超、好ましくは３４％超の発現密度で駆動し得る。

【0053】

本発明のプロモーター配列の主な利点の１つは、そのサイズが小さいことである。実際に、本発明のプロモーターは、１．２ｋｂ未満の長さを有するため、ＤＮＡペイロードが厳しく制限されているＡＡＶベクターでの使用に特に適している。

【0054】

いくつかの実施形態では、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子、特にヒトＳＮＣＧ遺伝子に作動可能に連結されない。いくつかの他の実施形態では、本発明のプロモーターは、レポータータンパク質をコードする遺伝子、特にルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されない。好ましくは、本発明のプロモーターは、ＳＮＣＧ遺伝子またはルシフェラーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されない。第２の態様では、本発明は、目的の核酸に作動可能に連結されている本発明のプロモーターを含む発現カセットに関する。

【0055】

本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸は、目的のポリペプチドまたは目的の核酸をコードし得る。

【0056】

好ましくは、本発明のプロモーターは、異種核酸に作動可能に連結されている。本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、プロモーターが天然に存在するゲノムにおいて作動可能に連結されている核酸以外の核酸を意味する。ある実施形態では、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸は、目的のポリペプチドをコードする。目的のポリペプチドは、桿体光受容細胞での発現が望まれる任意のポリペプチドであり得る。特に、目的のポリペプチドは、治療用ポリペプチド、レポータータンパク質、または光遺伝学的アクチュエーターであり得る。ある実施形態では、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸は、治療用遺伝子であり、すなわち、治療用ポリペプチドをコードする。

【0057】

治療用遺伝子の例としては、ＭＴ－ＮＤ４（遺伝子ＩＤ：４５３８）、ＭＴ－ＮＤ１（遺伝子ＩＤ：４５３５）、ＭＴ－ＮＤ６（遺伝子ＩＤ：４５４１）、ＭＴ－ＣＹＢ（遺伝子ＩＤ：４５１９）、ＭＴ－Ｃ０３（遺伝子ＩＤ：４５１４）、ＭＴ－ＮＤ５（遺伝子ＩＤ：４５４０）、ＭＴ－ＮＤ２（遺伝子ＩＤ：４５３６）、ＭＴ－ＣＯＩ（遺伝子ＩＤ：４５１２）、ＭＴ－ＡＴＰ６（遺伝子ＩＤ：４５０８）、ＭＴ－ＮＤ４Ｌ（遺伝子ＩＤ：４５３９）、ＯＰＡ１（遺伝子ＩＤ：４９７６）、ＯＰＡ３（遺伝子ＩＤ：８０２０７）、ＯＰＡ７（遺伝子ＩＤ：８４２３３）、及びＡＣ０２（遺伝子ＩＤ：５０）などの網膜疾患を引き起こすことが知られている欠損または変異遺伝子を置換するための核酸が挙げられるが、これらに限定されない。治療用遺伝子はまた、ＧＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：２６６８）、ＣＮＴＦ（遺伝子ＩＤ：１２７０）、ＦＧＦ２（遺伝子ＩＤ：２２４７）、ＢＤＮＦ（遺伝子ＩＤ：６２７）及びＥＰＯ（遺伝子ＩＤ：２０５６）などの神経栄養因子、ＢＣＬ２（遺伝子ＩＤ：５９６）及びＢＣＬ２Ｌ１（遺伝子ＩＤ：５９８）などの抗アポトーシス性遺伝子、エンドスタチン、アンジオスタチン及びｓＦｌｔなどの抗血管新生因子、ＩＬ１０（遺伝子ＩＤ：３５８６）、ＩＬ１Ｒ１（遺伝子ＩＤ：３５５４）、ＴＧＦＢＩ（遺伝子ＩＤ；７０４５）及びＩＬ４（遺伝子ＩＤ：３５６５）などの抗炎症因子、または桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（遺伝子ＩＤ：１１５８６１）をコードし得る。

【0058】

さらなるシグナルペプチドを治療用タンパク質に追加し、特に、特定のオルガネラ（例えばミトコンドリア）内にそれらを取り込む、細胞からそれらを分泌する、または細胞膜にそれらを挿入することを可能にしてもよい。

【0059】

別の実施形態では、目的のポリペプチドは、その発色団としてビタミンＡまたはそのアイソフォームを使用する光化学反応性ポリペプチドである光遺伝学的アクチュエーターである。光遺伝学的アクチュエーターは特に、光を吸収して光によって活性化する光開閉性イオンポンプまたはチャネルである。光遺伝学的アクチュエーターは、原核生物または真核生物由来であり得る。特に、これは微生物オプシンまたは脊椎動物オプシンであり得る。光遺伝学的アクチュエーターは、光遺伝学的活性化因子または光遺伝学的阻害因子であり得る。

【0060】

光遺伝学的活性化因子は、光に曝露されると細胞を脱分極させる。光遺伝学的活性化因子の例としては、ロドプシン、フォトプシン、メラノプシン、ピノプシン、パラピノプシン、ＶＡオプシン、ペロプシン、ニューロプシン、エンセファロプシン、レチノクロム、ＲＧＲオプシン、レッドシフトしたスペクトル特性を有する微生物オプシン、例えばＲｅａＣｈＲ、Ｃｈｒｉｍｓｏｎ、またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ、Ｇｉ／０シグナル伝達を動員できる脊椎動物オプシン、例えば短波長脊椎動物オプシンまたは長波長脊椎動物オプシン、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ属の微細藻類由来のチャネルロドプシン、例えばチャネルロドプシン－１及びチャネルロドプシン－２（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来）、ならびにそれらの最適化されたまたは機能的に改良されたバリアント（例えば、コドン最適化バリアント、変異体、キメラ）が挙げられる。

【0061】

より具体的な好ましい実施形態では、光遺伝学的アクチュエーターは、好ましくはチャネルロドプシン、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ及びそれらのバリアントから選択される、より好ましくはｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）－ｈＣａｔＣｈ及びＣｈｒｉｍｓｏｎＲ－ｔｄＴｏｍａｔｏから選択される、光遺伝学的活性化因子である。

【0062】

より具体的な好ましい実施形態では、光遺伝学的アクチュエーターは、好ましくはチャネルロドプシン及びそのバリアントから選択される、より好ましくはｈＣｈＲ２（Ｌ１３２Ｃ）－ｈＣａｔＣｈである、光遺伝学的活性化因子である。

【0063】

光遺伝学的阻害因子は、光に曝露されると細胞を過分極させる。光遺伝学的阻害因子の例としては、ハロロドプシン、例えばハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、増強型ハロロドプシン（ｅＮｐＨＲ２．０及びｅＮｐＨＲ３．０）及びレッドシフトしたハロロドプシンＨａｌｏ５７、アーキロドプシン－３（ＡＲ－３）、アーキロドプシン（Ａｒｃｈ）、バクテリオロドプシン、例えば増強型バクテリオロドプシン（ｅＢＲ）、プロテオロドプシン、キサントロドプシン、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ ｍａｃｕｌａｎｓ真菌オプシン（Ｍａｃ）、クラックスハロロドプシンＪａｗｓ、ならびにそれらの最適化されたまたは機能的に改良されたバリアント（例えば、コドン最適化バリアント、変異体、キメラ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0064】

さらなる実施形態では、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸は、レポータータンパク質をコードする。好ましくは、レポータータンパク質は、生きている桿体光受容細胞内で検出可能である。本発明のプロモーターの制御下でレポータータンパク質を発現させることによって、桿体光受容細胞を特異的に検出または同定することができる。レポータータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）、カルシウムインジケーター（例えばＧＣａｍＰ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びそれらのバリアントであり得る。特定の実施形態では、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、カルシウムインジケーター、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。

【0065】

別の実施形態では、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸は、目的の核酸をコードする。目的の核酸は、桿体光受容細胞での発現が望まれる任意の核酸であり得る。特に、目的の核酸は治療用核酸であり得る。核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、またはＤＮＡザイムであり得る。特定の実施形態では、核酸は、本発明のプロモーターに作動可能に連結されている核酸から転写された場合に、障害に関連する異常なまたは過剰なタンパク質の翻訳または転写を妨げることによって眼疾患を治療または予防することができるＲＮＡをコードする。例えば、目的の核酸は、異常な及び／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高度に特異的な除去または低減により疾患を治療するＲＮＡをコードし得る。

【0066】

好ましくは、本発明のベクターは、遺伝子療法または細胞療法での使用に適したベクターであり、特に桿体光受容細胞を標的とするのに適している。

【0067】

本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞において目的のポリペプチドの発現を確立するために必要とされる任意のエレメント、例えば、プロモーター、例えば本発明のプロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、及び／または複製起点を含むウイルスゲノムベクターである。

【0068】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶまたはＳＮＶ由来のベクター、レンチウイルスベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターに由来するベクターである。

【0069】

特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターまたは非病原性パルボウイルスである。当該技術分野で知られているように、使用を検討している特定のウイルスベクターに応じて、機能的なウイルスベクターを得るために本発明のベクターに適切な配列、例えばＡＡＶベクターの場合はＡＡＶ ＩＴＲ、またはレンチウイルスベクターの場合はＬＴＲを導入すべきである。

【0070】

本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは２つのＩＴＲに隣接する１つ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。このようなＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスに感染し（または適切なヘルパー機能を発現する）、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物（すなわちＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞中に存在する場合に、複製して感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。

【0071】

「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、逆向きでウイルスゲノムの末端に見られる比較的短い配列を指す。「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両端に存在する約１４５のヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは２つの別の方向のいずれかで存在することができ、異なるＡＡＶゲノム間に及び単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間に異質性をもたらす。最も外側の１２５ヌクレオチドはまた、自己相補性のいくつかの短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ、及びＤ領域と呼ばれる）を含んでおり、これらの領域がＩＴＲのこの部分内での鎖内塩基対合の発生を可能にする。本発明のベクターで使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有してもよく、または挿入、欠失、もしくは置換によって改変されてもよい。ＡＡＶベクターの逆位末端反復（ＩＴＲ）の血清型は、任意の既知のヒトまたは非ヒトＡＡＶ血清型から選択され得る。

【0072】

ＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体中、またはクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドなどの別のベクター中）組み込まれる場合、ＡＡＶベクターは「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶパッケージング機能及び適切なヘルパー機能の存在下で複製及びキャプシド化（すなわち、キャプシド内でのウイルス核酸の封入）によって「レスキュー」され得る。本発明のＡＡＶベクターは、プラスミド、直鎖状人工染色体、脂質と複合体化、リポソーム内にカプセル封入、及びウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子中にキャプシド化を含むが、これらに限定されない多数の形態のいずれであってもよい。本発明のプロモーターまたは発現カセットは、当業者に知られている任意の方法によってベクターに導入することができる。

【0073】

ベクターは、栄養要求性マーカー（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１またはＨＩＳ３）などの選択可能なマーカー、蛍光もしくは発光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ）などの検出可能な標識、または化学的／毒性化合物に対する耐性を付与するタンパク質（例えば、テモゾロミドに対する耐性を付与するＭＧＭＴ遺伝子）をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含み得る。これらのマーカーは、ベクターを含む宿主細胞を選択または検出するために使用することができ、当業者は宿主細胞に応じて容易に選択することができる。

【0074】

本発明のプロモーター及び発現カセットの全ての実施形態はまた、この態様においても企図される。本発明のベクターは、「ウイルス粒子」を作製するために、ウイルスキャプシド中にパッケージングされ得る。したがって、さらなる態様では、本発明はまた、本発明のベクターを含むウイルス粒子に関する。特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターであり、ＡＡＶ由来キャプシドにパッケージングされて「アデノ随伴ウイルス粒子」または「ＡＡＶ粒子」を作製する。したがって、本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」という用語は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質とキャプシド化されたＡＡＶベクターゲノムとから構成されるウイルス粒子を指す。

【0075】

キャプシド血清型はＡＡＶ粒子の指向性範囲を決定する。現在、１２のヒト血清型、及び非ヒト霊長類に由来する１００を超える血清型を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の複数の血清型が同定されている（Ｈｏｗａｒｔｈ ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ ２６：１－１０）。これらの血清型の中で、ヒト血清型２は遺伝子輸送ベクターとして開発された最初のＡＡＶであった。現在使用されている他のＡＡＶ血清型としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶｄｊなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、非天然の操作されたバリアント及びキメラＡＡＶも有用となり得る。特に、キャプシドタンパク質は、形質導入効率を高める１つ以上のアミノ酸置換を含むバリアントであり得る。

【0076】

種々のＡＡＶ血清型は、特定の標的細胞の形質導入を最適化するために、または特定の標的組織内の特定の細胞型（例えば、桿体光受容細胞）を標的とするために使用される。ＡＡＶ粒子は、同じ血清型またはＡＡＶの任意の天然もしくは人工配列バリアントのウイルスタンパク質及びウイルス核酸を含むことができる。例えば、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質と、少なくとも１つの、好ましくは２つのＡＡＶ２ ＩＴＲとを含み得る。ＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ血清型の任意の組み合わせは、各組み合わせが本明細書に明示的に記載されているかのように本明細書で提供される。好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－７ｍ８（ＡＡＶ２－７ｍ８、Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ（２０１３），５，１８９ｒａ７６）、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８キャプシドからなる群から選択されるＡＡＶ由来キャプシドを含む。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的技術を用いて操作してよく、これにより、核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性及び粒子の寿命の調整、効率的な分解、核への正確な送達のために、これらの粒子を最適化することができる。

【0077】

ＡＡＶ天然血清型を使用する代わりに、天然に存在しないキャプシドタンパク質を有するＡＡＶを含むがこれらに限定されない人工ＡＡＶ血清型を本発明の文脈で使用してもよい。このような人工キャプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ＶＰ１キャプシドタンパク質の断片）を、選択された異なるＡＡＶ血清型から、同じＡＡＶ血清型の非連続的部分から、非ＡＡＶウイルス源から、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、任意の適切な技術によって作製され得る。人工ＡＡＶ血清型は、非限定的に、キメラＡＡＶキャプシドまたは変異型ＡＡＶキャプシドであり得る。キメラキャプシドは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型由来のＶＰキャプシドタンパク質を含む、または少なくとも２つのＡＡＶ血清型由来のＶＰタンパク質領域もしくはドメインを組み合わせた少なくとも１つのキメラＶＰタンパク質を含む。

【0078】

キャプシドタンパク質はまた、特に形質導入効率を高めるために変異したものであってもよい。変異型ＡＡＶキャプシドは、エラープローンＰＣＲによって挿入したキャプシド改変及び／またはペプチド挿入から、または１つもしくは複数のアミノ酸置換を含むことにより、得られ得る。特に、天然または非天然のキャプシドタンパク質（例えばＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３）のチロシン残基のいずれか１つ以上で突異を生じさせることができる。好ましくは、変異した残基は、表面に露出したチロシン残基である。例示的な変異は、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２７５Ｆ、Ｙ２８１Ｆ、Ｙ５０８Ｆ、Ｙ５７６Ｆ、Ｙ６１２Ｇ、Ｙ６７３Ｆ、及びＹ７２０Ｆなどのチロシンからフェニルアラニンへの置換を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２由来キャプシドを含む。本実施形態では、キャプシドは、１つ以上のチロシンからフェニルアラニンへの置換を含んでよく、好ましくはＹ４４４Ｆ置換を含む。

【0079】

さらに、ＡＡＶ粒子のゲノムベクター（すなわち、本発明のベクター）は、一本鎖ゲノムまたは自己相補性二本鎖ゲノムのいずれかであり得る。自己相補性二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端反復のうちの１つから末端分離部位（ｔｒｓ）を欠失することによって作製される。これらの改変ベクターは、その複製ゲノムが野生型ＡＡＶゲノムの半分の長さであり、ＤＮＡ二量体をパッケージングする傾向を有する。好ましい実施形態では、本発明の実践において用いられるＡＡＶ粒子は、一本鎖ゲノムを有する。

【0080】

ＡＡＶウイルス粒子産生のためのＡＡＶ産生培養は全て、以下：１）適切な宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト由来細胞株、２）野生型もしくは変異型アデノウイルス、例えば温度感受性アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物により提供される適切なヘルパーウイルス機能、３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産生物、４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接する目的の核酸、例えば本発明のベクター、ならびに５）当該技術分野において周知のＡＡＶ産生をサポートする適切な培地及び培地成分を必要とする。ＡＡＶ粒子を産生するための宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物、及び酵母を含む。宿主細胞はまた、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞内に安定的に維持されるパッケージング細胞、またはＡＡＶベクターゲノムが安定的に維持されるプロデューサー細胞であり得る。例示的なパッケージング細胞及びプロデューサー細胞は、ＨＥＫ２９３、Ａ５４９またはＨｅＬａ細胞由来である。

【0081】

別の態様では、本発明はまた、本発明の発現カセット、ベクター、またはウイルス粒子により形質転換またはトランスフェクトされた単離された宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の動物細胞、植物細胞、細菌細胞または酵母であり得る。好ましくは、宿主細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞である。より好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、網膜神経節細胞、特にヒト桿体光受容細胞である。本発明の発現カセットまたは発現ベクターは、ウイルス感染を含む任意の既知の技術を使用して宿主細胞に輸送され得、宿主細胞に異所的に維持されてもゲノムに組み込まれてもよい。好ましい実施形態では、本発明の発現カセットまたはベクターは、好ましくは本発明のウイルス粒子を使用して、より好ましくは本発明のＡＡＶ粒子を使用して、ウイルス感染によって宿主細胞に輸送される。

【0082】

動物モデルまたはヒトにおける網膜へのベクターの主な送達経路は、硝子体内注射及び網膜下外科的送達である。硝子体内注射は、眼へのベクター投与のための確立された安全な経路である。本明細書では、ベクターは硝子体内に直接注入される。網膜下注射により、ベクターは外科的処置において網膜色素上皮（ＲＰＥ）と光受容体層との間の局所的な網膜下ブレブ内に送達される。これは、経毛様体扁平部硝子体切除術の際の実用的なアプローチで達成される。網膜下投与は、光受容体及びＲＰＥへの最も直接的なアクセスを提供する。第３のアプローチは、前眼部、特に眼の前眼房へのベクターの送達である。

【0083】

単離された網膜を用いて作業する場合、神経節細胞側を下向きに載置し、その結果、網膜の光受容体側が露出し、したがってより良好にトランスフェクションできるようにすることで、網膜細胞に対する最適なウイルス送達を達成することができる。別の技術は、例えばカミソリの刃で網膜の内境界膜を薄切することにより、送達ウイルスが内部の膜を透過できるようにすることである。さらなる方法は、網膜を寒天に包埋し、網膜を薄切し、その薄切片の面から送達ウイルスを適用することである。

【0084】

網膜細胞の任意の供給源を、本発明に用いることができる。本発明のいくつかの実施形態では、網膜細胞は、ヒト網膜に由来するか、またはヒト網膜の中にある。他の実施形態では、網膜は、動物由来、例えばげっ歯類起源である。ヒト網膜は角膜バンクから容易に入手することができ、そこでは網膜は角膜の解剖後に通常処分される。成人網膜は大きい表面積（約１１００ｍｍ^２）を有し、したがって、いくつかの実験的部分領域に簡単に分けることができる。

【0085】

本発明はまた、本発明の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または細胞を含む医薬組成物に関する。そのような組成物は、治療上有効な量の治療剤（本発明の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または細胞）と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、動物及び／またはヒトでの使用について、規制当局、または欧州薬局方などの公認薬局方によって承認されていることを意味する。「賦形剤」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、担体、またはビヒクルを指す。

【0086】

当該技術分野で周知であるように、薬学的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする相対的に不活性な物質であり、液状の溶液もしくは懸濁液として、エマルションとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに適した固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えたり、または希釈剤として作用したりすることができる。適切な賦形剤としては、安定剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、ｐＨ緩衝物質、ならびに緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤には、眼への直接送達に適し、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の医薬が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、ソルビトール、種々のｔｗｅｅｎ化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩をその中に含んでもよい。最も好ましくは、組成物は、生理食塩水、リンガー平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などと組み合わされる。

【0087】

組成物は、眼に投与されるように、特に眼内注射によって、例えば網膜下及び／または硝子体内投与によって投与されるように製剤化される。硝子体内送達の場合、本発明の医薬組成物は硝子体内に直接注射される。網膜下送達の場合、本発明の医薬組成物は、外科的処置において網膜色素上皮（ＲＰＥ）と光受容体層との間の局所的な網膜下ブレブ内に送達される。これは、経毛様体扁平部硝子体切除術（ｐｐＶ）の際の実用的なアプローチで達成される。網膜下投与は、光受容体及びＲＰＥへの最も直接的なアクセスを提供する。第３のアプローチは、眼の前眼部、特に前眼房への医薬組成物の送達である。

【0088】

投与される医薬組成物の量は、当業者に周知の標準的な手順によって決定することができる。適切な投与量を決定するために、患者の生理学的データ（例えば、年齢、サイズ、及び重量）、ならびに治療される疾患の種類及び重症度を考慮する必要がある。

【0089】

医薬組成物の化合物は、注射による、例えば網膜下または硝子体内注射による投与のために製剤化され得る。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプルでまたは多回投与容器で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤などの調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有してもよい。あるいは、有効成分は、使用前に適切なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であってもよい。

【0090】

先に記載した製剤に加えて、医薬組成物の化合物はまた、デポー製剤として、または埋め込み型送達システムで使用するために製剤化することもできる。そのような長時間作用型製剤は、埋め込み（例えば眼内）または眼内注射により投与することができる。化合物はまた、埋め込み型薬物送達システムまたはデバイスで使用するために、特に埋め込み型薬物送達システムまたはデバイスのリザーバーを繰り返し補充するためにデポー製剤として製剤化されてもよい。したがって、化合物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と共に、または微溶性誘導体として、例えば微溶性塩として製剤化され得る。

【0091】

医薬組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する１つ以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイス中で提供されてもよい。例えば、このパックは、ブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含むことができる。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書を添付することができる。

【0092】

ある実施形態では、医薬組成物は、本発明のベクターまたはウイルス粒子、より好ましくはＡＡＶベクターまたは粒子を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、本発明の宿主細胞、好ましくは本発明のヒト宿主細胞、すなわち本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子により、好ましくはＡＡＶ粒子により形質転換またはトランスフェクションされたものを含む。任意選択で、宿主細胞を含む組成物は、その細胞の保存に適する任意の温度で保存するために凍結されてもよい。特定の実施形態では、組成物は本発明のウイルス粒子を含み、各単位用量は１０Ｅ＋８～１０Ｅ＋１３のウイルス粒子を含む。

【0093】

医薬組成物は、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子、またはそれらの任意の組み合わせなどの１つまたは複数の追加の活性化合物をさらに含み得る。

【0094】

本発明はまた、本発明の治療レジメンを行うためのキットを提供する。そのようなキットは、１つ以上の容器に治療的または予防的に有効な量の組成物を薬学的に許容される形で含む。

【0095】

キットのバイアル中の組成物は、例えば滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、もしくは緩衝溶液、または他の薬学的に許容される滅菌流体と組み合わせた、薬学的に許容される溶液の形態であってよい。あるいは、複合体は凍結乾燥または乾燥させることができ、この場合、キットは任意選択で、複合体を再構成して注射用溶液を形成するための、好ましくは滅菌した、薬学的に許容される溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など）を容器にさらに含む。

【0096】

別の実施形態では、キットは、複合体を注射するための、好ましくは滅菌形態で包装された針またはシリンジ、及び／または包装されたアルコールパッドをさらに含む。臨床医または患者による組成物の投与についての使用説明書が、任意選択で含まれる。

【0097】

本発明の方法はまた、少なくとも１つの追加の治療剤を対象に投与することをさらに含み得る。特に、治療剤は、コルチコステロイド、抗生物質、鎮痛剤、免疫抑制剤、または栄養因子、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。

【0098】

本発明の組成物は、疾患が症状を示す前または後に、例えば、部分的もしくは完全な桿体光受容細胞もしくは光受容細胞の変性の前もしくは後に、及び／または部分的もしくは完全な視力喪失の前もしくは後に投与され得る。

【0099】

したがって、別の態様では、本発明はまた、本発明の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または宿主細胞を含む非ヒト動物モデルに関する。

【0100】

このような動物モデルは、桿体光受容細胞機能のｉｎ ｖｉｖｏ研究に使用することができる。本発明のプロモーター、カセット、ベクター、またはウイルス粒子を使用すると、例えばレポータータンパク質または電圧またはカルシウム感受性タンパク質の発現を通じて、桿体光受容細胞を同定もしくは追跡すること、またはそれらの活性を監視することが可能である。この非ヒト動物モデルはまた、桿体光受容細胞に作用する薬剤を同定または選択するためのスクリーニング方法に使用することもできる。好ましくは、非ヒト動物モデルは哺乳動物、より好ましくは霊長類、げっ歯類、ウサギ、またはミニブタである。

【0101】

プロモーター、発現カセット、またはベクターは、このモデルの細胞内でエピソーム形態で維持されてよく、またはそのゲノムに組み込まれてもよい。動物細胞をトランスフェクトもしくは形質転換するための、または選択されたプロモーター、すなわち本発明のプロモーターの制御下で目的の核酸配列を発現するトランスジェニック動物を産生するための方法は、当業者に周知であり、細胞及び動物に応じて容易に適合させることができる。

【0102】

定義
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、一般に遺伝子の上流に（５’領域に向かって）位置し、かつＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が開始される場所を規定する、シス調節エレメントを指す。ＲＮＡポリメラーゼ及び必要な転写因子は、プロモーターに結合し、遺伝子の転写を開始する。本発明の文脈では、プロモーターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の桿体光受容体における特異的発現をもたらす。

【0103】

本明細書で使用される場合、「プロモーター活性」という用語は、それが作動可能に連結されている核酸の転写を開始するためのプロモーターの能力を指す。プロモーター活性は、当該技術分野で公知の、または実施例に記載される手順を使用して測定することができる。例えば、プロモーター活性は、例えばノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって転写されたｍＲＮＡの量として測定することができる。あるいは、プロモーター活性は、翻訳されたタンパク質産物の量として、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、比色アッセイ、及び様々な活性アッセイ、例えばレポーター遺伝子アッセイ、及び当該技術分野で公知の、または実施例に記載される他の手順によって測定することができる。

【0104】

「作動可能に連結」という用語は、本明細書で使用される場合、一方の機能が他方の機能によって影響されるような単一の核酸分子上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることができる場合、すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合、コード配列に作動可能に連結されている。

【0105】

本明細書で使用される場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖または多本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖または一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子で構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（典型的にＲＮＡまたはＤＮＡに見られ得るように）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホロアミダートなどの合成サブユニットのポリマーを含んでもよく、したがってオリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダート（Ｐ－ＮＨ２）、またはホスホロアミダート－ホスホジエステルオリゴマー混合物であってもよい。本発明の核酸は、化学的合成、組換え及び突然変異誘発を含む当業者に公知の任意の方法により調製され得る。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、ＤＮＡ分子、好ましくは当業者に周知の組換え方法により合成されたＤＮＡ分子である。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含んでもよい。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、及びイノシンなどの通常とは異なる塩基が含まれる。ＤＮＡ及びＲＮＡには様々な修飾がなされることができ、したがって「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含する。

【0106】

本明細書で使用される場合、「単離された核酸」という用語は、その天然環境の構成成分から同定及び分離及び／または回収された核酸分子を指す。特に、この用語は、核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を指す。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然に会合している染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する配列を含まない。

【0107】

本発明では、「単離された」とは、その本来の環境（例えば、それが天然に存在する場合には天然の環境）から取り出された材料を指し、したがってその天然状態から「人工的に」改変されている。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクター、もしくは問題の組成物の一部であり得るか、または細胞内に含まれ得るが、それでもなお「単離」されており、それは、そのベクター、問題の組成物、または特定の細胞がポリヌクレオチドの本来の環境ではないためである。「単離された」という用語は、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー、全細胞トータルまたはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、ブロット上に転写されたものを含む）、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物、または当該技術分野により本発明のポリヌクレオチド／配列の際立った特色が実証されていない他の組成物を指さない。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞において維持された組換えＤＮＡ分子、または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡ転写産物を含む。しかしながら、ライブラリー（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）の他のメンバーから単離されていないライブラリーのメンバーであるクローンに含有される核酸（例えば、クローン及びライブラリーの他のメンバーを含有する均質な溶液の形態で）、または細胞もしくは細胞ライセートから取り出された染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」）、またはランダムに剪断されたゲノムＤＮＡの調製物もしくは１つ以上の制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡの調製物は、本発明の目的では「単離」されていない。本明細書でさらに論じられるように、本発明による単離された核酸分子は、天然に、組換え的に、または合成的に産生され得る。

【0108】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然アミノ酸残基を含んでもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体及び多量体を含むが、これらに限定されない。全長タンパク質及びその断片の両方が、本定義に包含される。

【0109】

本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、元の配列とは異なるが、その本質的な特性を保持しているヌクレオチド配列を指す。一般的に、バリアントは全体として非常に類似しており、多くの領域で元のポリヌクレオチドと同一である。バリアントの配列は、配列内の１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド置換、欠失、または挿入によって異なっていてよく、これはプロモーター活性を損なわない。バリアントは、元の配列と同じ長さを有してもよく、またはより短くてもより長くてもよい。

【0110】

「機能的バリアント」という用語は、配列番号１のプロモーター活性を示す、すなわち桿体光受容細胞に特異的なプロモーター活性を示す、配列番号１のバリアントを指す。

【0111】

本明細書で使用される場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列のアラインメントからの位置における一致（同一の核酸残基）の数（％）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小限に抑えながら、重なり及び同一性を最大化するようにアラインメントされた際の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、任意のいくつかの数学的グローバルまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用して決定され得る。同様の長さの配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適にアラインメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を使用してアラインメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）またはＡｌｔｓｃｈｕｌアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，２００５））を使用してアラインメントされる。核酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えばｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／などのインターネットウェブサイトで入手できる公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術分野の技術範囲内にある種々の方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的では、核酸配列同一性（％）の値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて２つの配列の最適なグローバルアラインメントを生成するペアワイズ配列アライメントプログラムであるＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用いて生成された値を指し、全てのサーチパラメータは初期値、すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップ伸長＝０．５、エンドギャップペナルティ＝ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップ伸長＝０．５に設定した。

【0112】

グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的な一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｌｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントでは、クエリ配列及び対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較することができる。上記のグローバルな配列アラインメントの結果は、パーセント同一性である。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメータは、行列＝ユニタリー、ｋ－タプル＝４、ミスマッチペナルティー１、結合ペナルティー３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティー５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方である。対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のために、クエリ配列より短い場合には、結果を手動で補正する必要がある。これは、パーセント同一性を計算する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは対象配列の５’または３’切断を考慮しないためである。クエリ配列に対して５’または３’末端で切断された対象配列の場合、一致／アラインメントしていない対象配列の５’及び３’であるクエリ配列の塩基数を、クエリ配列の全塩基に対する割合として計算することによりパーセント同一性を補正する。ヌクレオチドが一致／アラインメントしているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、このパーセンテージは、指定されたパラメータを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から差し引かれ、最終パーセント同一性スコアに到達する。この補正されたスコアは、本発明の目的のために使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢアラインメントによって表示されるように、クエリ配列と一致／アラインメントしていない、対象配列の５’及び３’塩基以外の塩基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的のために計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列にアラインメントされ、パーセント同一性が決定される。欠失は対象配列の５’末端で起こり、したがってＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０塩基の一致／アラインメントを示さない。１０個の不対塩基は、配列の１０％（一致しない５’及び３’末端の塩基数／クエリ配列中の塩基の総数）に相当し、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％が差し引かれる。残りの９０塩基が完全に一致した場合、最終のパーセント同一性は９０％となり得る。別の例では、９０塩基の対象配列を１００塩基のクエリ配列と比較する。今回は、欠失は内部欠失であるため、クエリと一致／アラインメントしていない対象配列の５’または３’上の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は手動で補正されない。再び、クエリ配列と一致／アラインメントしていない対象配列の５’及び３’末端の塩基のみが手動で補正される。

【0113】

本明細書で使用される場合、「低ストリンジェンシー条件」という用語は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍＬの断片化した変性サケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング手順に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２～２４時間行うことを意味する。最後に、担体材料を、５０℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、それぞれ３回、１５分間洗浄する。

【0114】

「中ストリンジェンシー条件」という用語は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍＬの断片化した変性サケ精子ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング手順に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２～２４時間行うことを意味する。最後に、担体材料を、５５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、それぞれ３回、１５分間洗浄する。

【0115】

「高ストリンジェンシー条件」という用語は、少なくとも１００ヌクレオチド長のプローブに対して、５×ＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍＬの断片化した変性サケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミド中で、標準的なサザンブロッティング手順に従って４２度でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを１２～２４時間行うことを意味する。最後に、担体材料を、６５℃で２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、それぞれ３回、１５分間洗浄する。

【0116】

「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」における「をコードする」という表現は、そのポリペプチドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびに追加のコード配列及び／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【0117】

本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、コード配列と、該コード配列の発現に必要な１つ以上の制御配列とを含む核酸構築物を指す。特に、これらの制御配列の１つは本発明のプロモーターである。一般的に、発現カセットは、コード配列と、コード配列の前（５’非コード配列）及び後（３’非コード配列）に選択された遺伝子産物の発現に必要な調節配列とを含む。したがって、発現カセットは、典型的にはプロモーター配列、コード配列、ならびに通常はポリアデニル化部位及び／または転写ターミネーターを含む３’非翻訳領域を含む。発現カセットはまた、例えば、エンハンサー配列、ベクター内でのＤＮＡ断片の挿入を容易にするポリリンカー配列及び／またはスプライシングシグナル配列などの追加の調節エレメントを含んでもよい。発現カセットは、通常、クローニング及び形質転換を容易にするためにベクター内に含まれる。

【0118】

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域の前後の領域「リーダー及びトレーラー」と、個々のコードセグメント（エキソン）の間にある介在配列（イントロン）とを含む。

【0119】

本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」という用語は、病態の治療に有用な治療用タンパク質をコードする遺伝子を指す。治療用遺伝子は、発現される場合、それが存在する細胞もしくは組織、または該遺伝子が発現する患者に有益な効果を与える。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の改善、状態もしくは疾患の予防もしくは抑制、または所望の特性の付与が挙げられる。治療用遺伝子には、患者の遺伝子欠陥を部分的または完全に修正する遺伝子が含まれる。特に、治療用遺伝子は、対象の細胞または組織におけるタンパク質の不足、欠陥、または最適以下のレベルにより引き起こされる欠陥を緩和するための遺伝子治療に有用なタンパク質をコードする核酸配列であり得るが、これに限定されない。治療用ポリペプチドは、例えば、桿体光受容細胞に存在しないか、欠陥を有するか、または最適以下のレベルで存在するポリペプチド及び／または酵素活性を供給し得、桿体光受容細胞の不均衡を間接的に中和するポリペプチド及び／または酵素活性を供給し得る。治療用ポリペプチドは、例えばドミナントネガティブポリペプチドとして作用することにより、ポリペプチドの活性を低下させるために使用することもできる。好ましくは、治療用ポリペプチドは、桿体光受容細胞に存在しない、欠陥を有する、または最適以下のレベルで存在するポリペプチド及び／または酵素活性、より好ましくは桿体光受容細胞に存在しない、または欠陥を有するポリペプチド及び／または酵素活性を供給する。

【0120】

「ウイルス」は、宿主細胞外では増殖または複製することができない超顕微鏡的感染性物質である。各ウイルス粒子またはビリオンは、キャプシドと呼ばれる保護的なタンパク質被覆内の遺伝物質、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる。キャプシド形状は、単純ならせん状及び正二十面体（多面体または略球体）形態から、尾部またはエンベロープを有するより複雑な構造まで様々である。ウイルスは、細胞生命体に感染し、感染した宿主の種類に応じて動物型、植物型、及び細菌型に分類される。

【0121】

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかにおいて、遺伝子材料を輸送するための、特に核酸を宿主細胞に送達するための媒体として使用される核酸分子を指す。ベクターとしては、プラスミド、ファスミド、コスミド、転移因子、ウイルス、及び人工染色体（例えばＹＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、または「治療すること」という用語は、疾患の治療、防止、予防、及び遅延などの患者の健康状態を改善することを意図するあらゆる行為を指す。特定の実施形態では、このような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を罹患する対象に１つ以上の治療剤を投与した結果、その疾患の蔓延または悪化を最小限に抑えることを指す。特に、「眼疾患の治療」という用語は、視力の向上を提供する、全盲への疾患の進行を防止する、損傷を受けていない眼細胞への損傷の拡大を防止する、損傷した眼細胞の損傷を改善する、網膜損傷の発生を防止する、または軽度もしくは進行した疾患を有する眼を救済するための治療を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、患者の遺伝子欠陥を修正する治療用タンパク質を提供することにより、桿体光受容細胞の変性を防止、低減、または停止するための治療を指す。いくつかの他の実施形態では、この用語は、光遺伝学を用いて、網膜を復活させるまたは視力を回復するための治療を指す。

【0123】

「治療上有効な量」は、眼疾患の上記で定義した治療を構成するのに十分である、対象に投与される本発明の医薬組成物の量を意図する。

【実施例】

【0124】

ベクター構築物及び産生
配列番号１の配列を有する核酸分子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｉｎｃ．によって化学合成し、最適化されたＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）及びＣｈＲ２－ＧＦＰ（図１Ａ）（ヒト網膜オルガノイドにおける発現のための実施形態においてはＧＦＰコード配列のみ（図１Ｂ））の翻訳開始コドンの前でそれぞれｐＡＡＶプラスミドに挿入し、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が続いた。

【0125】

ＡＡＶは、Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（２００６）：１４１２－１４２８に記載されているように作製した。

【0126】

ゲノムコピー（ＧＣ）数タイトレーションを、リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴａｑＭａｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ）を用いて実施した。ヒト網膜外植片及びマウス網膜を、５．１５Ｅ＋１３ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型ＢＰ２を使用して標的化した。網膜オルガノイドには、４．５Ｅ＋１３ＧＣ／ｍＬの力価を有する血清型ＰＨＰ．ｅＢを適用した。

【0127】

ヒト網膜オルガノイドの調製及びＡＡＶ感染
網膜オルガノイドは、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｗｉｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５（２０１４）：４０４７に記載されているように単離されたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から作製した。簡潔に言えば、分化の０日目に、ｉＰＳＣコロニーを解離させることによって、浮遊胚様体（ＥＢ）を作製した。１０μｍｏｌ／ＬのＡＴＰａｓｅ阻害剤ブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｂ０５６０－５ＭＧ）を添加したｍＴｅｓＲ１培地中でＥＢを懸濁培養した。

【0128】

１日目及び２日目に、培地の３分の１を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ、＃３１３３１－０２８）、１×Ｎ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ、＃１７５０２－０４８）、１％ＮＥＡＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｍ７１４５）、及び２μｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｈ３１４９－５０ＫＵ）を含有する「神経誘導培地」（ＮＩＭ）と交換した。

【0129】

３日目に、死細胞及びデブリを除去するために、ＥＢを重力で沈降させ、ＮＩＭで洗浄し、３．５ｃｍの未処理ペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５１００８）内でＮＩＭ中で培養した。ＮＩＭの半分を毎日交換した。７日目に、１枚の３．５ｃｍ皿のＥＢを、成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３５６２３０）で被覆された６ｃｍ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃４３０１６６）にプレーティングし、次いで、毎日ＮＩＭを交換して維持した。

【0130】

網膜オルガノイドを、２６週目に、１０Ｅ＋１１ＧＣ／オルガノイドの本発明による構築物：ＡＡＶ－ｓ１０００－ＧＦＰ（血清型ＰｈＰ．ｅＢ）で感染させ、増強されたＧＦＰの発現を、新規の合成プロモーター配列番号１の制御下で誘導した。

【0131】

個々のオルガノイドを超低接着Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃７００７）の単一のウェルに入れ、１０Ｅ＋１１ＧＣのＡＡＶを含む３０μＬの培養培地中、５％ＣＯ２で３７℃で維持した。５時間後、７０μＬの新鮮な培地を各ウェルに加えた。１日後、１００μＬの新鮮な培地を各ウェルに加えた。２４時間後、その後４８時間ごとに、溶液を新鮮な培地と完全に交換した。感染したオルガノイドを、２０％のＨａｍ’ｓＦ１２栄養素混合物（ＧＩＢＣＯ、＃３１７６５－０２７）、１０％の非働化ウシ胎児血清（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃ｅｓ－００９－ｂ）、１％のＮ２サプリメント（ＧＩＢＣＯ、＃１７５０２－０４８）、１％のＮＥＡＡ溶液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｍ７１４５）、１００μｍｏｌ／Ｌのタウリン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ０６２５）、及び１μｍｏｌ／Ｌのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、＃Ｒ２６２５）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、＃１０５６９－０１０）中で４週間培養した。

【0132】

オルガノイドを、ＰＢＳ中４％のＰＦＡで４℃で４時間固定した。固定後、試料をＰＢＳで３×３０分間洗浄し、ＰＢＳ中３０％スクロースで４℃で一晩凍結保存した。試料は、使用するまで－８０℃で保存した。クライオスタット（ＭＩＣＲＯＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、＃ＨＭ５６０）を用いて、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ＶＷＲ、＃２５６０８－９３０）に包埋したオルガノイド上で凍結切片（２０～４０μｍ）を作製した。切片をスライドガラス上に載置し、室温で４～１６時間乾燥させ、使用するまで－８０℃で保存した。凍結切片を免疫染色するために、スライドをまず室温で３０分間乾燥させ、次いでＰＢＳ中で５～１０分間再水和させた。次に、スライドを、室温で１時間、ＰＢＳ中１０％の正常ロバ血清（Ｓｉｇｍａ、＃Ｓ３０－１００ＭＬ）、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ、＃０５４８２－２５Ｇ）、ＰＢＳ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、＃Ｔ９２８４－５００ＭＬ）、及び０．０２％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、＃Ｓ２００２－２５Ｇ）でブロックした。

【0133】

第二に、切片を恒湿チャンバー内で、一次抗体（ウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２００）、マウスモノクローナル抗ヒト錐体アレスチン７Ｇ６（ＣＡＲ，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｎｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｃｏｎｅ Ａｒｒｅｓｔｉｎ，Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ７Ｇ６． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．４４（２００３）：２８５８－２８６７）、及びポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：１：２００））と共にインキュベートした。スライドごとに、一次抗体を、３％の正常ロバ血清、１％のＢＳＡ、ＰＢＳ中０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、及び０．０２％のアジ化ナトリウムを添加した１００μＬのＰＢＳ中に室温で一晩希釈した。０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ９４１６－１００ＭＬ）を含むＰＢＳ中で３×１５分間洗浄した後、スライドを１：２００に希釈した二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５６８、または６４７にコンジュゲートしたロバ二次抗体）及びＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０００）と共に暗所で室温で２時間インキュベートした。切片を、０．１％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で２×１５分間洗浄し、ＰＢＳで１度１５分間洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｐ３６９３４）でマウントした。スピニングディスク顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸｐｌｏｒｅ Ｓｐｉｎ共焦点スピニングディスク顕微鏡システム）を用いて画像を取得した。細胞タイプの形態は、０．８５μｍのｚステップのｚスタックでの１０２４×１０２４ピクセル画像から評価した。画像は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（ｖ．９．０．２，Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＩｍａｇｅＪを使用して処理した。

【0134】

図２の中段は、ＡＡＶ－配列番号１－Ｃａｔｃｈ－ＧＦＰ及びＡＡＶ－配列番号１－ＧＦＰでそれぞれ感染させたヒトオルガノイドの調製物のスピニングディスク共焦点顕微鏡画像を示す。一番左の列は解剖した組織の組織学的構造の概略図を表す；２列目は全てＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによりトランスフェクトされた桿体光受容体におけるＧＦＰによってもたらされた典型的な緑色蛍光を示す；３列目は同じ組織を錐体マーカーＣＡＲ（マゼンタ蛍光）で免疫染色した結果を示す；４列目はＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色の結果を示し、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰの緑色蛍光は錐体マーカーＣＡＲ染色を示す細胞では見られない；５列目（一番右）は、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色右：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ及び錐体マーカーＣＡＲ染色及びＨｏｅｃｈｓｔによる核染色（白色）の結果を示す。

【0135】

図３はＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ－ＡＡＶ感染した全ヒト網膜オルガノイドの断面の共焦点画像を示し、ＧＦＰ蛍光が黒色染色として表されている。

【0136】

ヒト網膜のウイルストランスフェクション及び組織調製
ヒト器官型培養のために、網膜片を冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で単離し、２４ｍｍの培養皿に挿入した０．４μｍ孔のポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に神経節細胞側を上にして入れ、５％ＣＯ２で３７℃で、１ｍＬの培養培地：０．１％ＢＳＡ、１０μｍｏｌ／ＬのＯ－アセチル－Ｌ－カルニチン塩酸塩、１ｍｍｏｌ／Ｌのフマル酸、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのガラクトース、１ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのグリシン、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌのマンノース、１３ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸ナトリウム、３ｍｍｏｌ／Ｌのタウリン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのプトレシン二塩酸塩、０．３５μｍｏｌ／Ｌのレチノール、０．３μｍｏｌ／Ｌの酢酸レチノール、０．２μｍｏｌ／Ｌの（＋）－α－トコフェロール、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのアスコルビン酸、０．０５μｍｏｌ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、０．０２μｍｏｌ／Ｌのヒドロコルチゾン、０．０２μｍｏｌ／Ｌのプロゲステロン、１μｍｏｌ／Ｌのインスリン、０．００３μｍｏｌ／Ｌの３，３’，５－トリヨード－Ｌ－チロニン、２，０００Ｕのペニシリン、及び２ｍｇのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で維持した。

【0137】

ＡＡＶ感染のため、網膜片ごとに本発明による構築物ＡＡＶＢＰ２－ｓ１０００－ＧＦＰ２０μＬを適用した。

【0138】

ＡＡＶにより誘導された導入遺伝子発現を、ウイルス投与の５週間後に調べた。網膜片をＰＢＳ中４％のＰＦＡで３０分間固定し、続いて４ＣのＰＢＳ中で洗浄ステップを行い、ＰＢＳ中１０％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により室温で１時間処理した。ＰＢＳ中３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中でのモノクローナルウサギ抗ＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＡＲ７Ｇ６（Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｏｎｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｃｏｎｅ Ａｒｒｅｓｔｉｎ，Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ７Ｇ６． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．４４（２００３）：２８５８－２８６７）、及びポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：１：２００）による処理を、室温で５日間実施した。二次ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６３３、及びＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０００）による処理を２時間行った。切片を洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｐ３６９３４）を用いてスライドガラス上にマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸｐｌｏｒｅ ＳｐｉｎＳＲ共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて撮像した。細胞タイプの形態は、０．８５μｍのｚステップのｚスタックでの５１２×５１２ピクセル画像から評価した。画像は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（ｖ．９．０．２，Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＩｍａｇｅＪを使用して処理した。

【0139】

図２の上段は、ＡＡＶ－配列番号１－Ｃａｔｃｈ－ＧＦＰ及びＡＡＶ－配列番号１－ＧＦＰでそれぞれ感染させたヒト網膜のスピニングディスク共焦点顕微鏡画像を示す。一番左の列は解剖した組織の組織学的構造の概略図を表す；２列目は全てＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによりトランスフェクトされた桿体光受容体におけるＧＦＰによってもたらされた典型的な緑色蛍光を示す；３列目は同じ組織を錐体マーカーＣＡＲ（マゼンタ蛍光）で免疫染色した結果を示す；４列目はＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色の結果を示し、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰの緑色蛍光は錐体マーカーＣＡＲ染色を示す細胞では見られない；５列目（一番右）は、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色右：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ及び錐体マーカーＣＡＲ染色及びＨｏｅｃｈｓｔによる核染色（白色）の結果を示す。

【0140】

図３はＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ ＡＡＶ感染したヒト網膜（上面図）の共焦点画像を示し、ＧＦＰ蛍光が黒色染色として表されている。

【0141】

マウス網膜のＡＡＶ投与及び組織調製
２．５％イソフルランで麻酔した８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して、眼注射を行った。鋭利な３０ゲージの針で水晶体近くの強膜に小さな切開部を作製し、この切開部から網膜下／硝子体内腔に、マイクロマニピュレーターに保持された鈍い５μＬのハミルトンシリンジを用いて、２μＬのＡＡＶＢＰ２－ｓ１０００－Ｃａｔｃｈ－ＧＦＰ懸濁液を注射した。

【0142】

ＡＡＶ注射３週間後に網膜を眼杯（ｅｙｅｃｕｐ）から切り離し、ＰＢＳ中４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳで４℃で２４時間洗浄した。抗体の浸透を向上させるために、網膜を３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースでの凍結保護後、凍結／融解サイクルに供した。ＰＢＳ中で洗浄後、網膜のホールマウントを、ＰＢＳ中１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の正常ロバ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、及び０．０１％のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を含有するブロッキング緩衝液中で２時間インキュベートした。１：２００に希釈した、ラットモノクローナル抗ＧＦＰ（Ｎａｃａｌａｉ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３１３６５４）、ウサギポリクローナル抗マウスＣＡＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１６３３８７）、ヤギポリクローナル抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０７９７５１）による一次抗体処理を、ＰＢＳ中３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＮＤＳ、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）アジ化ナトリウム、及び０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含有する緩衝液中で室温で５日間行った。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２５３４０１７）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１４１７０９）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ，ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１４２５８１）による二次抗体インキュベーションを、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）を添加した緩衝液中で室温で２時間行った。ＰＢＳ中で洗浄した後、網膜をＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ｐ３６９３４）に包埋した。スピニングディスク顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸｐｌｏｒｅ Ｓｐｉｎ共焦点スピニングディスク顕微鏡システム）を用いて画像を取得した。細胞タイプの形態は、０．８５μｍのｚステップのｚスタックでの１０２４×１０２４ピクセル画像から評価した。画像は、Ｉｍａｒｉｓソフトウェア（ｖ．９．０．２，Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＩｍａｇｅＪを使用して処理した。

【0143】

図２の下の段は、ＡＡＶ－配列番号１－Ｃａｔｃｈ－ＧＦＰ及びＡＡＶ－配列番号１－ＧＦＰでそれぞれ感染させたホールマウントマウス網膜の断面のスピニングディスク共焦点顕微鏡画像を示す。一番左の列は解剖した組織の組織学的構造の概略図を表す；２列目は全てＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによりトランスフェクトされた桿体光受容体におけるＧＦＰによってもたらされた典型的な緑色蛍光を示す；３列目は同じ組織を錐体マーカーＣＡＲ（マゼンタ蛍光）で免疫染色した結果を示す；４列目はＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色の結果を示し、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰの緑色蛍光は錐体マーカーＣＡＲ染色を示す細胞では見られない；５列目（一番右）は、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰによるトランスフェクション及び錐体マーカーＣＡＲ染色右：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ及び錐体マーカーＣＡＲ染色及びＨｏｅｃｈｓｔによる核染色（白色）の結果を示す。

【0144】

さらに、図３は、ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ（黒色染色）と共にＡＡＶ感染したマウス網膜の共焦点画像（上面図）を示す。

【0145】

分析
発現密度は、公表されているヒト網膜（Ｊｏｎａｓ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｕｎｔ ａｎｄ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２３０（１９９２）：５０５－５１０）及びマウス網膜（Ｊｅｏｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｒｅｔｉｎａ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（１９９８）：８９３６－８９４６）における桿体光受容体の平均密度（細胞／ｍｍ^２）に対する、標識された桿体光受容体の密度の割合（％）として定義した。

【0146】

図４は、ヒト網膜（上段）、ヒト網膜オルガノイド（中段）、及びマウス網膜（下段）における発現の定量プロットを示し、左列：桿体光受容体密度に占めるＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰ＋細胞密度の割合を定量化したもの；値はｎ＝１２共焦点画像からの平均±標準誤差である；右列：ＣａｔＣｈ－ＧＦＰ／ＧＦＰを発現する細胞の中での主要な細胞タイプまたはクラス（黒色）及びマイナーな細胞タイプまたはクラス（灰色）の割合（％）として示されたＡＡＶ標的特異性を定量化したものである。

【0147】

合成プロモーター配列番号１は、全ヒト桿体光受容体の３０．４％及び全マウス桿体光受容体の４１．２％において発現を駆動した。網膜オルガノイドにおいて、桿体マーカーＮＲＬで染色された凍結切片におけるｍｍ^２あたりの桿体光受容体の総数を定量化し、配列番号１が網膜オルガノイドにおいてＮＲＬ＋細胞の３４．６％で発現を駆動したことを算出した（図４、左列）。

【0148】

発現特異性は、ＡＡＶにより示されたＧＦＰ＋細胞集団全体における桿体光受容体の割合（％）を決定することにより定量化した。桿体光受容体における発現は、網膜外顆粒層における細胞体の位置及び錐体アレスチン（ＣＡＲ）マーカー発現の欠如により同定した（Ｚｈｕ，Ｍｏｌ Ｖｉｓ ８（２００２）：４６２－４７１．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｖｉｓ．ｏｒｇ／ｍｏｌｖｉｓ／ｖ８／ａ５６／）。

【0149】

ヒト網膜及びヒト網膜オルガノイドでは、それぞれ桿体光受容体の８６．９％及び１００％でＧＦＰ発現が観察された。マウス網膜では、観察されたＣａｔｃｈ－ＧＦＰ＋細胞の９８．４％が桿体光受容体であった（図４、右列）。

【0150】

ＡＡＶに組み込まれたプロモーター配列の配列番号１は、マウス、オルガノイド、及びヒトの桿体光受容体において特異的かつ効率的な遺伝子発現を駆動する。このことは、ｉｎ ｖｉｖｏマウス網膜及びｉｎ ｖｉｔｒｏヒト網膜オルガノイドのような経済的モデル系における桿体光受容体の基礎的及び前臨床的研究に特異的な操作が、網膜疾患メカニズムを発見し、新たな遺伝子治療アプローチを開発することを可能にする。同じウイルスベクターをヒト網膜上で使用できることは、これらの結果を直接的に反映させることを可能とし、したがって臨床における新規な遺伝子治療の適用が加速されることになる。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】