特表 2024-524636 ジアスコルビン酸アムシパトリシン（ＡＭＣＩＰＡＴＲＩＣＩＮ）の製造方法、及び従来の抗真菌剤に耐性のある侵襲性真菌感染症の処置のためのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】ジアスコルビン酸アムシパトリシン（ＡＭＣＩＰＡＴＲＩＣＩＮ）の製造方法、及び従来の抗真菌剤に耐性のある侵襲性真菌感染症の処置のためのその使用

(51)【国際特許分類】

   C07H 17/08 20060101AFI20240628BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240628BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240628BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C07H17/08 K

A61P31/10

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K31/7048

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024501563

(86)(22)【出願日】2022-07-08

(85)【翻訳文提出日】2024-03-07

(86)【国際出願番号】 EP2022069172

(87)【国際公開番号】W WO2023285323

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/220,598

(32)【優先日】2021-07-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521495585

【氏名又は名称】バイオセウティカ・べー・フェー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＳＥＵＴＩＣＡ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】フェラーリ，ヴァレリオ・マリア

(72)【発明者】

【氏名】バッジョ，マリア・カーラ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィジランテ，マリオ

(72)【発明者】

【氏名】カリーツィ，アレッサンドロ

(72)【発明者】

【氏名】ブルゼーゼ，ティベリオ

(72)【発明者】

【氏名】グリセンティ，パリーデ

【テーマコード（参考）】

4C057

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C057AA17

4C057AA18

4C057CC03

4C057DD02

4C057KK24

4C084AA19

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4C086MA56

4C086MA58

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4C086MA63

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB35

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの製造方法、及び従来の抗真菌剤に対する耐性の証明／蔓延を有する侵襲性真菌感染症の改善された治療のためのその使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ジアスコルビン酸アムシパトリシンの製造方法であって、次の工程：
ａ）Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、ペンタフルオロフェノール及びカップリング剤からのＮ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルの調製；
ｂ）工程ａ）で得られたＮ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルとパルトリシンＡとを反応させて中間体１を得ること；
ｃ）中間体１を含有する反応混合物にカップリング剤を添加して中間体２を得ること；
ｄ）中間体２を含有する反応混合物へのＮ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミンの添加；
ｅ）水での希釈、濾過及び乾燥による、工程ｄ）からの沈殿物の単離；
ｆ）工程ｅ）からの反応混合物を順相クロマトグラフィーにより精製して、粗アムシパトリシンを得ること；
ｇ）工程ｆ）からの粗アムシパトリシンを逆相クロマトグラフィーにより精製して、精製アムシパトリシンを得ること；
ｈ）工程ｇ）からのアムシパトリシンの水溶液にＬ－アスコルビン酸を添加して、ジアスコルビン酸アムシパトリシンを得ること；
ｉ）凍結乾燥又は噴霧乾燥による固体ジアスコルビン酸アムシパトリシンの単離
を含む方法。

【請求項2】

工程ａ）及びｃ）のカップリング剤が、ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又はＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）から選択される、請求項１記載の方法。

【請求項3】

工程ａ）においてペンタフルオロフェノール／Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン／カップリング剤のモル比が、１．０／１．０÷１．２／１．０÷１．４である、請求項１記載の方法。

【請求項4】

Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルとパルトリシンＡが、工程ｂにおいて、１．０／０．８と１．２の間に含まれるモル比で、１５～３０℃の温度範囲で、－０．６～－１．２の間に含まれるｌｏｇＰを有する非プロトン性有機溶媒を用いて使用される、請求項１記載の方法。

【請求項5】

非プロトン性有機溶媒が、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド若しくはジメチルスルホキシド又はこれらの混合物である、請求項４記載の方法。

【請求項6】

工程ｄ）のパルトリシンＡとＮ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミンとのモル比が、１／３～１／４の範囲に含まれる、請求項１記載の方法。

【請求項7】

工程ｆ）の固定相が、３５～２３０メッシュの間に含まれる粒度分布を有するシリカゲルであり、そして移動相が、８３／１５／２ v/v/vの体積比の非プロトン性有機溶媒、極性有機溶媒及び塩基性水溶液から構成されている、請求項１記載の方法。

【請求項8】

非プロトン性有機溶媒が、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン又は酢酸エチルであり；極性有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロパノール又はｎ－プロパノールであり；塩基性水溶液が、１０～３０％ w/vアンモニア水溶液を含む、請求項７記載の方法。

【請求項9】

工程ｇ）の固定相が、逆相シリカゲルＲＰ１８（４０～６３μm）又は均等物であり；粗アムシパトリシンと固定相との重量比が、１／４０÷７０の範囲に含まれ；溶出が、アセトニトリルと緩衝液との相対比を５：１０÷９５：９０から３０：４０÷７０：６０の範囲まで増加させながら、１カラム床体積／５分の流量で実施される、請求項１記載の方法。

【請求項10】

緩衝液が、Ｌ－アスコルビン酸又はギ酸緩衝液であり：アセトニトリルと水性緩衝液との体積比が、５：１０／９５：９０の範囲に含まれ；酸の濃度が、１０～１００mMの範囲に含まれ；緩衝液の最終ｐＨ値が、３．０から５．０の範囲に含まれる、請求項９記載の方法。

【請求項11】

工程ｈ）の塩形成が、２０～４０℃の範囲の温度で０．１０～０．２０mol/lの間に含まれるアムシパトリシンの濃度で働く水溶液中のＬ－アスコルビン酸２～３当量を用いて達成される、請求項１記載の方法。

【請求項12】

工程ｉ）のジアスコルビン酸アムシパトリシンの単離が、入口温度１３０～１５０℃で働く１～２０％水溶液から噴霧乾燥機を用いて達成される、請求項１記載の方法。

【請求項13】

得られた粒度分布ＤＬ９０が、５μm未満である、請求項１２記載の方法。

【請求項14】

式１：

【化5】

で示される、化合物２－（ジメチルアミノ）－Ｎ－（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－２－（（（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３６－（ヒドロペルオキシ－１２－メチル）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３３－イル）オキシ）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アセトアミド。

【請求項15】

式２：

【化6】

で示される、化合物ペルフルオロフェニル（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３３－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－４－（２－（ジメチルアミノ）アセトアミド）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３６－カルボキシラート。

【請求項16】

様々な病因を有する、カンジダ・アウリス（C. auris）によって、並びに／又はムーコル・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）及び／又はリゾプス・ミクロスポレス（Rhizopus microspores）などのケカビ（Mucorales）目の真菌病原体によって引き起こされる感染症の処置方法であって、有効量のジアスコルビン酸アムシパトリシンを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項17】

有効量のアムシパトリシン又はジアコルビン酸アムシパトリシンを、単独で又は他の治療剤と組合せて含み、経口、皮膚／皮下、バッカル、耳介、吸入、心臓内、鼻腔内、眼内、腟内又は注射／輸液投与に適した担体及び／又は賦形剤で製剤化された、医薬組成物。

【請求項18】

他の治療剤が、抗生物質、気管支拡張剤、ステロイド、ホスホジエステラーゼ－４（ＰＤＥ－４）阻害剤から選択される、請求項１７記載の組成物。

【請求項19】

噴霧乾燥によって調製された、ＤＬ９０≦５μmである乳糖一水和物を有するジアスコルビン酸アムシパトリシンの固体製剤としての、請求項１７記載の組成物。

【請求項20】

ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）製剤の形態である、請求項１９記載の組成物。

【請求項21】

液体定量吸入器（ＭＤＩ）の形態である、請求項１７記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の概要
本発明は、ジアスコルビン酸アムシパトリシン（amcipatricin diascorbate）の製造方法、及び従来の抗真菌剤に対する耐性の証拠／蔓延を有する侵襲性真菌感染症の処置の改善のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

侵襲性真菌性疾患は公衆衛生上の脅威であり、現在も罹患率及び死亡率の重要な原因のままである。真菌性疾患により１７０万人以上が死亡し、１０億人以上が罹患している。重篤な真菌感染症は、喘息、エイズ、癌、臓器移植及びコルチコステロイド療法を含む様々な健康問題の結果として発症する。過去には、有効な治療選択肢が限られていたため、多くの侵襲性真菌感染症は予後不良を伴っていた。新たな作用機序を備えた新たな治療活性のある抗真菌剤の発見により、利用可能な薬剤の数が拡大して従来の治療選択肢を上回り、臨床医に治療法の選択肢が提供されてきた。

【0003】

アムホテリシンＢは、１９５０年代に発売されて以来、全身抗真菌療法の至適基準となっている（Gallis et al. Rev Infect Dis 1990; 12:308-29）。この物質はナイスタチンをも含むポリエン系薬物の分類に属すが、ナイスタチンはアムホテリシンＢと比較すると毒性がより強い。ポリエン剤は、真菌の細胞膜内のエルゴステロールに結合することによってその抗真菌活性を発揮する。この相互作用により細胞透過性が破壊され、急速な細胞死が引き起こされる。アムホテリシンＢ及びグリセオフルビンは、真菌細胞におけるＤＮＡ及びタンパク質合成を阻害するピリミジン類似体であるフルシトシンが承認された１９７０年代初頭まで、侵襲性真菌性疾患に対する比類のない全身療法選択肢であり続けた。単独療法として使用した場合のグリセオフルビンの毒性と耐性の急速な発現とにより、侵襲性真菌感染症の処置のためのその日常的な使用は制限されてきた。１９７８年に、最初の全身性アゾール広域スペクトル抗真菌剤であるケトコナゾールが発見された。アゾール剤は、ラノステロールの脱メチル化を遮断することによってその抗真菌活性を発揮し、それによってエルゴステロール合成を阻害する。ケトコナゾールの後から年代順にイトラコナゾール（１９８０年）、フルコナゾール（１９８２年）、ボリコナゾール（１９９１年）及びポサコナゾール（１９９５年）が続いた。拡張スペクトルのトリアゾール類には、広範囲のカビに対する殺真菌活性だけでなく、カンジダ（Candida）属及び他の酵母菌に対する活性が備わっている。エキノカンジン類は新しい種類の抗真菌薬である。カスポファンギンがこの分類に属し、１９９４年に発見され、続いてアニデュラファンギン（１９９３年）及びミカファンギン（１９９６年）が発見された。エキノカンジン類の作用機序は、真菌細胞壁の必須成分である（１→３）－β－Ｄ－グルカンの産生の阻害である。

【0004】

侵襲性真菌感染症の処置に利用できる上記の薬剤全てに、長所と短所がある。アムホテリシンＢは、真菌感染症の処置や、ブラストミセス（Blastomyces）属、カンジダ属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属及びヒストプラズマ（Histoplasma）属によって引き起こされる重篤な播種性の二形性真菌感染症及び酵母感染症に今なお最も広く使用されている薬剤である。アムホテリシンＢは腎毒性、腎血流の減少、吐き気、嘔吐及び食欲不振を引き起こすことが報告されており、更にアムホテリシンＢの水溶性は非常に低い（蒸留水中＜０．００１mg/ml）。ナイスタチンは毒性が強すぎて全身には使用できないが、粘膜カンジダ症の症例では使用される。グリセオフルビンは、表皮糸状菌（Epidermophyton）、小胞子菌（Microsporum）及び白癬菌（Trichophyton）属によって引き起こされる特定の皮膚糸状菌感染症の処置に使用されるが、肝毒性及び胃腸障害を引き起こす可能性がある。アゾール類の主な欠点は、肝壊死及び腹部痙攣を含む毒性が頻繁に発生することである。その結果、アゾール類は主としてカンジダ症、コクシジウム髄膜炎、皮膚糸状菌及びヒストプラズマ症の処置に局所的に使用される。更に、これらの薬剤は多数の薬剤と相互作用し、肝毒性をもたらすことが知られている。アゾール類の別の潜在的限界は、フルコナゾールに耐性のあるカンジダ属の出現である。カスポファンギンは、アスペルギルス（Aspergillus）属及びカンジダ属に対する活性が実証されており、忍容性は良好であるが、発熱、静脈炎、頭痛及び発疹を含む、一般的な副作用がある。これらの入手可能な抗真菌性抗生物質の全てに限界があるため、新規で安全な広域スペクトルの抗真菌性抗生物質の探索が推進されている。

【0005】

これらの薬剤の治療的使用により、その使用に伴う抗生物質耐性についての認識を高める必要性が確認された。そのため、例えば、カンジダ・アウリス（Candida auris）のような真菌のタイプは、上記の種類のポリエン剤に対する、エキノカンジン類に対する、並びにピリミジン及びアゾール誘導体に対する耐性を示す可能性があり、真菌感染症を処置するのが困難になる（Lee, Wee Gyo et al., Journal of Clinical Microbiology (2011), 49(9), 3139-3142）。

【0006】

２００９年に初めて検出されたカンジダ・アウリスは、酵母として増殖するカンジダ属の子嚢菌の一種である。ほとんどのカンジダ・アウリス感染症はエキノカンジン類で処置可能である。ただし、一部のカンジダ・アウリス感染症は、主な種類の抗真菌薬剤に耐性がある（Chowdhary, Anuradha; et al, Emerging Infectious Diseases (2013), 19(10), 1670-1673. Kean, Ryan et al., mSphere (2019), 4(4), e00458-19/1-e00458-19/10）。この状況では、この感染症を処置するために高用量の複数の種類の抗真菌薬を必要とするかもしれないが、侵襲性感染症の処置後であっても、通常患者には、長期間カンジダ・アウリスが定着し続ける。カンジダ・アウリスは、カンジダ感染症の処置に一般的に使用される複数の抗真菌薬剤に耐性があるだけでなく、標準的な検査室の手法で同定するのが難しいため（誤同定は不適切な管理につながる可能性がある）、今日では世界的に深刻な健康上の脅威をもたらす真菌であり、それは医療現場で大流行を引き起こしている（Ben-Ami, Ronen et al Emerging Infectious Diseases (2017), 23(2), 195-203）。

【0007】

真菌感染症の中でも、接合真菌症又は黒色真菌症（black fungus）としても知られるムコール菌症は、もう一つの重篤であるがまれな真菌感染症であり、通常、免疫抑制された対象、コントロール不良の糖尿病、及び高用量コルチコステロイド処置を受けている対象に生じる。この真菌感染症は、ケカビ（Mucorales）目の真菌に起因する。場合によっては、この感染症は致死性になる可能性があり、クモノスカビ属（Rhizopus）の真菌（最も一般的）、ケカビ（Mucor）、Lichterman、Apophysomyces、クスダマカビ（Cunninghamella）、モルチエレラ（Mortierella）、及びサクセネア（Saksenaea）の侵入が原因である。これらの真菌の胞子は環境（例えば、カビの生えたパンや果物上など）中に一般に存在し、しばしば息で吸い込まれるが、病気を引き起こすのは一部の人だけである。

【0008】

ムコール菌症の薬物療法には、アムホテリシンＢの使用であって、最初は静脈内にゆっくりと投与され、その後２週間毎日投与されるか、代わりにアゾール類（イサブコナゾール又はポサコナゾール）が投与される使用が含まれる。次いで「真菌球」の外科的除去の必要が示される。

【0009】

２０２１年初めに、インドでは約１万２０００症例の「黒色真菌症」が報告されており、そのほとんどが新型コロナウイルス感染症（Covid-19）から回復中の患者で、おそらく新型コロナウイルス感染症患者の処置に使用されるステロイドの過剰処方が原因と考えられる。実際、ステロイドは、コロナウイルスによる感染を止めることなく体を傷つける過剰な炎症反応（いわゆる「サイトカインストーム」）を防ぐために処方されている。最も感染率が高かったのはインドとパキスタンで、年間感染者数は１００万人あたり約１４０症例であった。

【0010】

ムコール菌症は、しばしば生命を脅かす感染症である。発表されたムコール菌症例の総説では、全体で全死因死亡率の５４％であることが分かった（Roden MM et al., Clin Infect Dis. 2005 Sep 1;41(5):634-53）。専門家らは、新型コロナウイルス感染症の処置にステロイドを多量に投与すると、二次感染や従来使用されてきた抗真菌剤に対する抗生物質耐性を引き起こす可能性があると考えているため、「黒色真菌症」の処置用の更に活性の高い抗真菌剤が必要であることが、この分野の薬理学的研究を刺激した。

【0011】

ジアスコルビン酸アムシパトリシン（化学名：カンジシジンＤ（Candicidin D）、１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール、Ｌ－アスコルビン酸との化合物（１：２）；登録番号 202748-83-2；ＳＰＫ－８４３、ＳＰＡ－８４３又はＳＰＡ－Ｓ－８４３としてもコード化される；別名ＳＰＫ－８４３；ＳＰＡ－８４３、ＳＰＡ－Ｓ－８４３；図１）は１９９２年から知られている（EP 489308）。

【0012】

【化1】

ジアスコルビン酸アムシパトリシンの構造式

【0013】

この化合物は、パルトリシンＡ（partricin A）（化学名：カンジシジンＤ、４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール；登録番号 76551-64-9で識別される化合物；図２）の合成アミド誘導体であり、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）に対する殺菌最小阻止濃度は７．５ng/mLであり、ラット赤血球に対する溶血最小濃度は１８mg/mLである（Bruzzese, T. et al European Journal of Medicinal Chemistry (1996), 31(12), 965-972）。

【0014】

【化2】

パルトリシンＡの構造式

【0015】

ジアスコルビン酸アムシパトリシンの抗菌スペクトルは、数種の酵母菌に対して、また、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、及びカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）を含む様々な種のカンジダ属に対しても更に確認されている（Rimaroli et al; Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 42, 11, 3012-3013, 1998; US 5908834）。ジアスコルビン酸アムシパトリシンの毒性は、様々な哺乳動物細胞株及び骨髄系前駆細胞で評価された。この結果は、ジアスコルビン酸アムシパトリシンが細胞培養物中の酵母汚染を防ぐ予防薬として考えられ、また真菌に感染した細胞培養物を治せることを示している。１３株のアスペルギルス属菌、４株のケカビ属菌、４株のリゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）、２株のペシロミセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、５株のペニシリウム属菌（Penicillium spp.）、１株のスポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenkii）、７株のトリコフィトン属菌（Trichophyton spp.）、及び２株のミクロスポルム属菌（Microsporum spp）に対する、化学的関連化合物であるアムホテリシンＢ（図３）の活性と比較したジアスコルビン酸アムシパトリシンの活性は、ジアスコルビン酸アムシパトリシンがケカビ属及びペシロミセス・バリオッティに対して最も殺菌力があることを示した。ジアスコルビン酸アムシパトリシン及びアムホテリシンＢは、アスペルギルス属菌（最小殺菌濃度の幾何平均 １２．５３μg/mL）、ペニシリウム属菌（約１２μg/mL）及びスポロトリックス・シェンキイ（ＭＦＣ １９．２μg/mL）に対して同じ殺菌活性を示した。アムホテリシンＢは、リゾプス・オリゼ、ミクロスポルム属菌及びトリコフィトン属菌に対してジアスコルビン酸アムシパトリシンのものよりも低い最小殺菌濃度値の幾何平均値を呈する。

【0016】

【化3】

アムホテリシンＢの構造式

【0017】

酵母から菌糸形へのカンジダ属菌の変換を阻害するジアスコルビン酸アムシパトリシンの能力は、薬物濃度０．２５～０．６２mg/Lと明らかである（Strippoli, et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 45, 2, 235-237, 2000）。ジアスコルビン酸アムシパトリシンのインビトロ殺真菌活性及び静真菌活性を、臨床的に重要なカンジダ属菌（ｎ＝１０９）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）（ｎ＝４９）及びアスペルギルス属菌（ｎ＝３６）分離株に対してアンホテリシンＢの活性と比較した（Kantarcioglu, et al. Journal of Chemotherapy Volume: 15, 3, 296-298, 2003）。ジアスコルビン酸アムシパトリシンの血清及び組織濃度を評価するために、ラットにおける単回及び複数回投与試験が実施された（Bruzzese et al., Chemotherapy, 47, 2, 77-85, 2001）。単回投与試験と複数回投与試験の両方に、静脈内経路による１．２５mg/kgの用量を使用した。単回投与試験は、１mg/kgの静脈内用量でアムホテリシンＢと比較して実施された。血漿試料は、注射後１５分から９６時間の間隔で採取された。ジアスコルビン酸アムシパトリシンとアンホテリシンＢではそれぞれ、排出半減期は２２．１５時間と１８．１５時間、無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ（０－∞））値は３５．５２μg時ml^－１と１０．３３μg時ml^－１であった。両薬物は広範な組織分布を示し、ジアスコルビン酸アムシパトリシンについては腎臓による取り込みが多く、次に肝臓、脾臓及び肺であり、アムホテリシンＢについては脾臓による取り込みが多く、次いで肺、肝臓及び腎臓であった。複数回投与試験（１．２５mg/kg/日を７日間）では血清及び組織濃度が持続した。７日目に、投与後５分から９６時間の間隔でラットから採血した。血清排出半減期及びＡＵＣ（０－∞）値は、単回投与試験のおよそ２倍であった（それぞれ４１．４時間及び７２．１μg時ml^－１）。また、組織の半減期とＡＵＣ（０－∞）は、単回投与試験よりも大きかった。

【0018】

全身真菌感染症の見込みある処置法としてのジアスコルビン酸アムシパトリシンに関する総説が２００５年に発表された（Kasanah et al. Current Opinion in Investigational Drugs (Thomson Scientific), 6, 8, 845-853, 2005）。

【0019】

ジアスコルビン酸アムシパトリシンについて実施された有望な予備的インビトロ及びインビボ試験では、アムホテリシンＢと少なくとも同等の広範囲の抗真菌活性が確認され、毒性は低かったにもかかわらず、この化合物は、化学的、技術的理由及びアムホテリシンＢに対してジアスコルビン酸アムシパトリシンの抗真菌スペクトルをより適切に定義する必要性を含む、幾つかの理由で治療に使用されるに至らない。

【0020】

元の製造プロセスをスケールアップする際の化学的及び技術的困難には、総収率の低さ、純度の低さ、製造コストの高さ、猛毒で爆発性の試薬の使用、そして最終生成物が数回のクロマトグラフィー精製を経なければ単離できず非晶質でのみ存在する（結晶質ではない）という事実が含まれる。

【0021】

Bruzzeseらによって開示された元の製造プロセス（Eur J Med Chem, 1996, 31, 965-972）は、出発物質としてパルトリシンＡを使用して２段階合成でＳＰＫ－８４３塩基（アムシパトリシン）の合成を実施した。この合成アプローチは、これをスケールアップするには幾つかの欠点を示した：低いモル収率、得られた生成物の低いクロマトグラフィー純度（著者らはＨＰＬＣで９５％を超える純度の生成物を得ることができなかった）、幾つかのクロマトグラフィー精製法の使用（３つの異なるクロマトグラフィー精製法が記載されている）、及び有毒で爆発性の試薬（ジフェニルホスホリルアジド；登録番号 26386-88-9で識別される化合物）の使用。特に、上述のＨＰＬＣプロフィールを有するアムシパトリシン塩基は、Bruzzeseらによって開示された同じ実験条件で更なるクロマトグラフィー精製に付した場合、クロマトグラフィープロフィールが変化せずに回収された；更に、結晶化によってアムシパトリシン塩基又はジアスコルビン酸アムシパトリシンを精製する試みは失敗し、クロマトグラフィープロフィールが修正されない生成物が得られた。これらの問題を解決するには、クロマトグラフィー純度が向上し、原薬としての使用に適し、有毒で危険な試薬の使用を回避して生成物を提供できる、より着実な代替プロセスを開発する必要があることは明らかであった。

【0022】

カンジダ・アウリスなどの既知の抗生物質耐性カンジダ株及びケカビ属の真菌に対するジアスコルビン酸アムシパトリシンの抗真菌効果は、アムホテリシンＢと比較した場合、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・フラブス（C. flavus）及びカンジダ・ニガー（C. niger）に対する抗真菌活性が優れており、忍容性が高く（毒性が低く）そして水溶性が良好という観点から更に評価されている。

【0023】

実際、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの優れた水溶性（１００mg/ml）により、生理的ｐＨ値では実質的に水不溶性であり、そのため胃腸吸収率が低いアムホテリシンＢに比べて、耐性カンジダ・アウリス感染症及び黒色真菌感染症の有効な処置のためのインビボの最適薬物動態パラメータを定義することができる。調査では、薬剤担体としてのリポソームがアンホテリシンＢの毒性及び副作用を大幅に軽減できることが示されているが、リポソーム製剤の抗菌活性はアンホテリシンＢの抗菌活性よりも低く、よって有効治療用量を増やす必要があるため、この代替製剤はまだ十分に満足のいくものではない。

【0024】

最後に、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの優れた水溶性により、ネブライザー溶液、液体製剤及び／又は吸入使用を目的としたネブライザー溶液用の粉末（連続作動ネブライザー若しくは定量ネブライザーによってエアロゾルに変換される溶液、又は加圧吸入溶液）、ネブライザー溶液用粉末及び固体形態（カプセル若しくは錠剤、又は定量剤形で事前に分注された他の定量剤形のいずれかの吸入粉末）などの水性媒体中でのポリエン誘導体の幾つかの未開の投与経路を試験することができる。この最後のアプローチでは、噴霧乾燥法を使用して、粒度分布の９０％が５μm以下（吸入で肺に浸透できる粒度）であるドライパウダーを水溶液から得ることが可能であり、気道の真菌感染症を処置することができる。この粒度は、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの凍結乾燥した粉末を加工して得られるものではない（なぜなら、この生成物は流動性が低く吸湿性が高いため、微粉化工程には適さないからである）。

【発明の概要】

【0025】

本発明は、パルトリシンＡからジアスコルビン酸アムシパトリシンを調製するための改良法を提供する。本発明の方法は、ワンポット法で全収率２２％、９７％を超えるＨＰＬＣクロマトグラフィー純度で、そして有毒で爆発性の試薬の使用を回避しながら所望の化合物を提供する。

【0026】

この化合物は、カンジダ・アウリスによって、並びにムーコル・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、リゾプス・オリゼ及びリゾプス・ミクロスポレス（Rhizopus microspores）などのケカビ目の真菌病原体によって引き起こされる感染症の処置用の、フルコナゾール、ボリコナゾール、ポサコナゾール、アムホテリシンＢ及びミカファンギンに匹敵する抗真菌活性を示すため、ジアスコルビン酸アムシパトリシンも黒色真菌感染症の処置に同様に作用する可能性がある。更に、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの優れた水溶性により、噴霧乾燥法を使用して、粒度分布の９０％が５μm以下（Ｄ９０≦５μm））であるドライパウダーを得ることが可能であり、よって肺真菌感染症の処置用の固体吸入製剤（許容し得る呼吸性を得るために粒度を下げる必要がある）、更には噴霧される液体製剤の開発が可能になる。

【0027】

詳細な説明
アムシパトリシンの調製
ジアスコルビン酸アムシパトリシンの調製プロセスは、次の工程を含む：
ａ）Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、ペンタフルオロフェノール及びカップリング剤からのＮ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルの調製；
ｂ）工程ａ）で得られたＮ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルとパルトリシンＡとを反応させて中間体１を得ること；
ｃ）中間体１を含有する反応混合物にカップリング剤を添加して中間体２を得ること；
ｄ）中間体２を含有する反応混合物へのＮ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミンの添加；
ｅ）水での希釈、濾過及び乾燥による、工程ｄ）からの沈殿物の単離；
ｆ）工程ｅ）からの反応混合物を順相（direct phase）クロマトグラフィーにより精製して、粗アムシパトリシンを得ること；
ｇ）工程ｆ）からの粗アムシパトリシンを逆相クロマトグラフィーにより精製して、精製アムシパトリシンを得ること；
ｈ）工程ｇ）からのアムシパトリシンの水溶液にＬ－アスコルビン酸を添加して、ジアスコルビン酸アムシパトリシンを得ること；
ｉ）凍結乾燥又は噴霧乾燥による固体ジアスコルビン酸アムシパトリシンの単離。
本発明のプロセスの合成スキームをスキーム１に報告する。

【0028】

【化4】

【0029】

Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルの調製は、ジクロロメタン溶液中のペンタフルオロフェノールとＮ，Ｎ－ジメチルグリシンとを、カップリング剤、好ましくはヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、更に好ましくはＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用して、１５～３０℃、好ましくは２０～２５℃の温度範囲で、１０～３４時間の範囲の時間、好ましくは２４時間、反応させることによって行われる。ペンタフルオロフェノール／Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン／Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドのモル比は、０．５～２．０mol/lの範囲にペンタフルオロフェノールの濃度（好ましくは０．７８mol/l）で働く、１．０／１．０÷１．２／１．０÷１．４、好ましくは１．０／１．０／１．３である。

【0030】

粗アムシパトリシンの調製は、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルとパルトリシンＡとを１．０÷０．８と１．２÷１の間に含まれる分子比で、１５～３０℃の温度範囲、好ましくは２５℃で、－０．６～－１．２の間に含まれるｌｏｇＰを有する非プロトン性有機溶媒、好ましくはＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド又はジメチルスルホキシドを用いて、０．１５～０．５モル濃度の間に含まれるパルトリシンＡ濃度（好ましくは０．１７モル濃度）で、１０～６０分間の範囲の時間（好ましくは２０分間）反応させることにより行われた。中間体１（２－（ジメチルアミノ）－Ｎ－（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－２－（（（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３６－（ヒドロペルオキシ－１２－メチル）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３３－イル）オキシ）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アセトアミド）を含有する反応混合物を次に、ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＡＴＵ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）から選択される縮合剤（好ましくはＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）で直接処理して、対応するペンタフルオロエステル中間体（中間体２；ペルフルオロフェニル（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３３－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－４－（２－（ジメチルアミノ）アセトアミド）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３６－カルボキシラート）が得られる。使用されるカップリング剤とパルトリシンＡの初期量とのモル比は、１／１．５÷２．０の範囲に含まれ、好ましくは１／１．６５である。Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミンを、１５～４０℃の範囲の温度、好ましくは２０～２５℃でこの反応混合物に添加する。パルトリシンＡとＮ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミンとのモル比は、１／４の範囲に含まれ、好ましくは１／３である。

【0031】

反応混合物を冷水で希釈して粗アムシパトリシンを直接沈殿させ、これを吸引により回収する。この工程で使用される冷水の量は、使用される非プロトン性有機溶媒の初期量に対して３～４倍、好ましくは３．６倍であり、水温は０～１５℃、好ましくは１０℃である。

【0032】

次に得られた粗生成物（７６～８０ｇ）を、最初に順相シリカゲルクロマトグラフィーによって、次いで逆相シリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。

【0033】

この精製工程で使用される順相シリカゲルとパルトリシンＡの初期量との重量比は１：２０である。この工程で使用される適切な固定相は、３５～２３０メッシュ、好ましくは７０～２３０メッシュの間に含まれる粒度分布を有するシリカゲルである；この工程で使用される移動相は、８３／１５／２ v/v/vの体積比の非プロトン性有機溶媒／極性有機溶媒／塩基性水溶液の３成分で構成されている。移動相の成分として使用するための非プロトン性有機溶媒の例としては、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン及び酢酸エチルが含まれ、好ましくはジクロロメタンである。移動相の成分として使用するための極性有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－プロパノールが含まれ、好ましくはメタノールである。移動相の成分として使用できる適切な塩基性水溶液には、１０～３０％ w/vアンモニア水溶液、好ましくは２５％ w/v溶液が含まれる。

【0034】

溶出画分をＨＰＬＣで分析し、選択した画分を最高３５℃で減圧下で初期体積の約１０～２０％まで濃縮して沈殿を得て、これを吸引により回収し、最高３５℃で真空下で乾燥して、粗アムシパトリシン塩基（１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール）１３．１ｇを得る。

【0035】

粗アムシパトリシンは逆相クロマトグラフィーによって最終的に精製される。使用される固定相は、逆相シリカゲルＲＰ１８（４０～６３μm）であってよい。粗生成物と固定相との重量比は、１／４０÷７０の範囲に含まれ、好ましくは１／６５である。粗生成物は、Ｌ－アスコルビン酸を含有する水溶液にしてカラムにロードされる：粗アムシパトリシンとＬ－アスコルビン酸とのモル比は、１／１÷７の範囲に含まれ、好ましくは１／７であり、そしてカラムにロードされる水溶液の濃度は、粗アムシパトリシンのモル数に対して、１．２～２．０mol/lの範囲に含まれる。カラムはアセトニトリル／Ｌ－アスコルビン酸水溶液又はギ酸緩衝液でコンディショニングされる：アセトニトリルと水性緩衝液との体積比は、５÷１０／９５÷９０の範囲に含まれ、好ましくは５／９５であり、そして酸の濃度は、１０～１００mMの範囲に含まれ、好ましくは５０mMである。緩衝液の最終ｐＨ値は３．０から５．０の範囲に含まれ、好ましくは４．１である。

【0036】

カラムは、アセトニトリルと緩衝液との比を５÷１０／９５÷９０から３０÷４０／７０÷６０まで徐々に増加させながら、１カラム床体積（bed volume、BV）／５分の流量で溶出する。

【0037】

溶出画分をＨＰＬＣで分析し、選択した画分を５℃で撹拌しながら５～１０％アンモニア溶液２５％ v/vで塩基性化する。アンモニア溶液２５％ v/vの添加後の選択した画分の最終ｐＨ値は、８．０～１２．０の範囲に含まれ、好ましくは１２．０である。得られた溶液を撹拌下、０～１５℃、好ましくは５℃で１２～１８時間維持し、沈殿した固体を吸引により回収し、最高温度３５℃で１６～２４時間真空乾燥させて、ＨＰＬＣ純度＞９７％のアムシパトリシン ４．３ｇを得る。

【0038】

ジアスコルビン酸アムシパトリシンは、カンジシジンＤ、１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタールから、０．１０～０．２０mol/lに含まれる、好ましくは０．１３mol/lのアムシパトリシン濃度の水溶液中で、２０～４０℃の範囲の温度、好ましくは３０℃で、Ｌ－アスコルビン酸２～３当量との塩形成によって調製される。固体のジアスコルビン酸アムシパトリシンは、得られた溶液から凍結乾燥又は噴霧乾燥法のいずれかを使用して、アムシパトリシンからの重量収率＞１３０％で単離することができる。

【0039】

乳糖一水和物を有するジアスコルビン酸アムシパトリシンの製剤の調製
本発明の乳糖一水和物を有するジアスコビン酸アムシパトリシンの固体製剤は、ジアスコルビン酸アムシパトリシンの水溶液から噴霧乾燥法を用いて調製されるが、ここで、水中のジアスコルビン酸アムシパトリシンの濃度は０．５～２０％ w/vの範囲に含まれ、好ましくは２％とした。撹拌下、不活性雰囲気下で、０～１０℃の範囲の温度で冷却しながら維持したこの溶液に、乳糖一水和物を添加する。ジアスコルビン酸アムシパトリシンと乳糖一水和物との重量比は、１／１÷３の範囲に含まれ、好ましくは１／２．３である。得られた透明な生成物を濾過し、濾液を噴霧乾燥機（入口温度１３０～１５０℃）で１時間以内に処理して、Ｄ９０粒度分布が５μm未満である乳糖一水和物を有するジアスコルビン酸アムシパトリシンの製剤を得る。

【0040】

実験の項
凡例
ＭＩＣ：最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、静菌性のある抗菌成分の最低濃度として定義される。
Ｄ９０：粉末中の、規定値未満の直径を持つ粒子の割合（９０％）。
呼吸性：呼吸可能な性質又は状態；通常、固体粉末吸入器が作動ごと又は用量ごとに、吸入中に肺に浸透することが可能な粒度（約５μm以下）に関連している。

【0041】

Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステルの調製
丸底フラスコに塩化メチレン（１４０mL）及びペンタフルオロフェノール（２０．１ｇ）を加えた。この混合物を２０～２５℃で撹拌しながら維持して均一溶液を得て、次にＮ，Ｎ－ジメチルグリシン（１１．２ｇ）及びＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（２８．１ｇ）を順次加えた。反応混合物を撹拌しながら２０～２５℃で２４時間維持し、次いで得られた不均一混合物を真空濾過した。濾液を減圧下で蒸発乾固させて、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステル ３６．８ｇを得て、これを更に精製することなく次の工程で使用した。

【0042】

パルトリシンＡからの粗カンジシジンＤ、１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール（粗アムシパトリシン）の調製
丸底フラスコに、窒素流下２０～２５℃で撹拌しながら、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（２５０mL）及びＮ，Ｎ－ジメチルグリシルペンタフルオロフェニルエステル（１３．８ｇ）を順次加えた。得られた混合物を撹拌しながら１０℃に冷却し、パルトリシンＡ（５０ｇ）を何回かに分けて加えた。この溶液には中間体１が含まれており、これを中間体として単離することも、又は次の工程で直接使用することも可能である；この最後のオプションを受けて、得られた混合物を撹拌しながら１０℃で２０分間維持し、次いでＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（１５ｇ）を添加した。得られた反応混合物を窒素下で２４時間撹拌すると、反応温度は自然に２０～２５℃に上昇した。この溶液には中間体２が含まれており、これを中間体として単離することも、次の工程で直接使用することも可能である；この第２のオプションを受けて、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエチルアミン（１５mL）を、２０～２５℃で撹拌しながら反応混合物に６０分かけて滴下した。６０分後、反応混合物を撹拌しながら１０℃の温度の水（９００mL）に加え、得られた沈殿物を吸引により回収し、フィルター上で水（１００mL）及びメタノール（１００mL）で洗浄した。生成物を真空下＋３５～４０℃で乾燥器で乾燥させて固体を得て、これを丸底フラスコ内で２０～２５℃で撹拌しながらメタノール（０．５６Ｌ）に懸濁した。得られた懸濁液に２５％アンモニア水溶液（５６mL）を滴下した。次いで、塩化メチレン（２．２４Ｌ）を加え、混合物を撹拌しながら６０分間維持した。この後、塩化メチレン（２．８Ｌ）及び２５％アンモニア水溶液（５６mL）を順次加え、不均一混合物を吸引濾過した。濾液を、ジクロロメタン／メタノール ９／１ v/v混合物で予め調整したシリカゲルカラム（７０～２３０メッシュ；１０００ｇ）上にロードした。カラムをジクロロメタン／メタノール／２５％アンモニア水溶液（８３／１５／２ v/v/v）８床体積で溶出した。溶出画分をＨＰＬＣで分析し、選択した画分を減圧下最高３５℃で初期体積の約２０％まで濃縮した。

【0043】

次に、得られた不均一混合物を吸引濾過し、得られた湿った固体を最高３５℃で１２時間、真空乾燥して、粗アムシパトリシン １３ｇを得た。

【0044】

中間体１の単離。２－（ジメチルアミノ）－Ｎ－（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－２－（（（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３６－（ヒドロペルオキシ－１２－メチル）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３３－イル）オキシ）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アセトアミド。
この化合物は、これを含有する反応混合物のクロマトグラフィー精製によって単離された。中間体１を含有する反応混合物を減圧下で蒸発させた後、得られた残渣とシリカゲルとの重量比１／１０を用いてシリカゲルクロマトグラフィー（７０～２３０メッシュ）により精製した。ジクロロメタン／メタノールによる勾配溶離後、選択した画分を３５℃で真空下で蒸発させることにより純粋な中間体１を単離した。
Ｃ_６２Ｈ_９０Ｎ_３Ｏ_２０の算出された元素分析：理論値：Ｃ、６２．１９；Ｈ、７．５８；Ｎ、３．５１；Ｏ、２６．７２；実測値：Ｃ、６２．１７；Ｈ、７．５０；Ｎ、３．４９；Ｏ、２６．６８。

【0045】

中間体２の単離。ペルフルオロフェニル（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１３Ｒ，１８Ｓ，１９Ｅ，２１Ｅ，２３Ｚ，２５Ｚ，２７Ｅ，２９Ｅ，３１Ｅ，３３Ｒ，３６Ｒ，３７Ｓ）－３３－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－４－（２－（ジメチルアミノ）アセトアミド）－３，５－ジヒドロキシ－６－メチルテトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）－１，３，５，７，９，１３，３７－ヘプタヒドロキシ－１７－（（２Ｓ，５Ｒ）－５－ヒドロキシ－７－（４－（メチルアミノ）フェニル）－７－オキソヘプタン－２－イル）－１８－メチル－１１，１５－ジオキソ－１６，３９－ジオキサビシクロ［３３．３．１］ノナトリアコンタ－１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１－ヘプタエン－３６－カルボキシラート
この化合物は、これを含有する反応混合物のクロマトグラフィー精製によって単離された。中間体２を含有する反応混合物を３５℃未満の温度で減圧下で蒸発させた後、得られた残渣とシリカゲルとの重量比２／１０を用いてシリカゲルクロマトグラフィー（７０～２３０メッシュ）により精製した。ジクロロメタン／アセトンによる勾配溶離後、選択した画分を３５℃で真空下で蒸発させることにより純粋な中間体２を得た。
Ｃ_６９Ｈ_９２Ｆ_５Ｎ_３Ｏ_２０の算出された元素分析：理論値：Ｃ、６０．１２；Ｈ、６．７３；Ｆ、６．８９；Ｎ、３．０５；Ｏ、２３．２１；実測値：Ｃ、６０．０８；Ｈ、６．６９；Ｆ、６．８２；Ｎ、３．０８；Ｏ、２３．１６。

【0046】

粗カンジシジンＤ、１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール（粗アムシパトリシン）の精製。
丸底フラスコ中で、Ｌ－アスコルビン酸（７．７ｇ）を水（５０mL）に溶解し、次いで、前工程で得られた粗アムシパトリシン（７．７ｇ）を加えた。得られた溶液を、アセトニトリル／Ｌ－アスコルビン酸緩衝液（ｐＨ４．１の５０mM水溶液）５／９５ v/v混合物で予め調整した逆相シリカゲルＲＰ１８（４０～６３μm；５００ｇ）を充填したカラムにロードした。溶離液としてアセトニトリル／Ｌ－アスコルビン酸緩衝液（ｐＨ４．１の５０mM水溶液）５／９５ v/v混合物からアセトニトリル／Ｌ－アスコルビン酸緩衝液（ｐＨ４．１の５０mM水溶液）３０／７０ v/v混合物を用いて、カラムを流量１００ml/分で溶出した。溶出画分をＨＰＬＣで分析し、選択した画分を５℃で撹拌しながら５～１０％アンモニア溶液２５％ v/vで塩基性化した。得られた混合物をこの温度で撹拌しながら１２～１８時間維持し、沈殿した固体を吸引により回収し、最高３５℃で１８時間、真空乾燥して、ＨＰＬＣ純度＞９７％のアムシパトリシン塩基 ４．３ｇを得た。

【0047】

カンジシジンＤのジアスコルビン酸塩、１８－デカルボキシ－４０－デメチル－３，７－ジデオキソ－Ｎ^３’－［（ジメチルアミノ）アセチル］－１８－［［［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミノ］カルボニル］－３，７－ジヒドロキシ－Ｎ^４７－メチル－５－オキソ－、環状１５，１９－ヘミアセタール（ジアスコルビン酸アムシパトリシン）の調製。
丸底フラスコ反応器に脱塩水（４８０mL）を入れ、次いで窒素を３０℃の温度で撹拌しながら３０分間バブリングし、懸濁液を激しく撹拌し続けながらＬ－アスコルビン酸（２４．２ｇ）及びアムシパトリシン（８０ｇ）を順次添加して透明な溶液を得た。この溶液を０．４５μmフィルターで濾過し、濾液を凍結乾燥して、ジアスコルビン酸アムシパトリシン １０４ｇを得た。
あるいは、ジアスコルビン酸アムシパトリシンは、上記の溶液（約２０％ w/v溶液）により、０．４５μmフィルターで濾過した後、そのまま、又は１％ w/v濃度が得られるまで水で希釈した後、入口温度１３０：１５０℃での噴霧乾燥法を用いて単離することもできる。
得られた生成物の物理化学的性質は、公開されている文献データと一致した。

【0048】

乳糖一水和物を有するジアスコルビン酸アムシパトリシンの製剤の調製
丸底フラスコに、０℃で撹拌しながら窒素雰囲気下、ジアスコルビン酸アムシパトリシン（２ｇ）及び水（２００ml）を入れる。この混合物を撹拌しながら０℃で１０分間維持し、次いで乳糖一水和物（４．６ｇ）を何回かに分けて加え、この混合物を更に１０分間撹拌する。得られた溶液を噴霧乾燥機（入口温度１３０～１５０℃）で３～４ml/分の供給速度で１時間以内に処理して、Ｄ９０粒度分布が５μm未満である乳糖一水和物を有するジアスコルビン酸アムシパトリシン ３０／７０ w/wの製剤（５．２８ｇ）を得る。

【0049】

臨床的に分離されたカンジダ・アウリスの様々な菌株におけるジアスコルビン酸アムシパトリシンのＭＩＣ測定
臨床検査標準協会（Clinical and Laboratory Standards Institute）のプロトコール（CLSI, doc M27, 4th edition）により最小阻止濃度（ＭＩＣ）を定義するために、真菌病原体カンジダ・アウリスの臨床分離株２２株に対する化合物ジアスコルビン酸アムシパトリシンの抗真菌活性の試験が実施された。試験は分離株ごとに三重反復測定で実施された。得られた結果を表１に示す。

【0050】

【表1】

【0051】

ケカビ目の真菌病原体の様々なＡＴＣＣ及び臨床分離株に対するジアスコルビン酸アムシパトリシンのＭＩＣ測定
最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定による、真菌感染症のムコール菌症の原因となるケカビ目（ＡＴＣＣ及び臨床分離株）の真菌病原体の様々なＡＴＣＣ及び臨床分離株に対するジアスコルビン酸アムシパトリシンの抗真菌活性の試験が、臨床検査標準協会のプロトコール（CLSI, doc M27, 4th edition）により実施された。試験は分離株ごとに三重反復測定で実施された。
得られた結果を表２にまとめた。

【0052】

【表2】

【国際調査報告】