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特表2024-524707ビエッティ結晶性ジストロフィー治療のための遺伝子組換アデノ随伴ウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】ビエッティ結晶性ジストロフィー治療のための遺伝子組換アデノ随伴ウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240628BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240628BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240628BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20240628BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240628BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/864 100Z
C12N7/01
A61P21/04
A61K35/76
A61K48/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024502112
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-01-12
(86)【国際出願番号】 CN2022106089
(87)【国際公開番号】W WO2023284873
(87)【国際公開日】2023-01-19
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/106619
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524016965
【氏名又は名称】シャンハイ ヴァイタルゲン バイオファーマ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グオ ルゥ
(72)【発明者】
【氏名】タオ イェジョン
(72)【発明者】
【氏名】ティアン シン－シェイ
(72)【発明者】
【氏名】チュー ビン
(72)【発明者】
【氏名】リ ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ヂュー シー
(72)【発明者】
【氏名】チャオ シャオピン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C084AA13
4C084MA41
4C084NA14
4C084ZA941
4C084ZA942
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA41
4C087NA14
4C087ZA94
(57)【要約】
【要約】
【課題】ビエッティ結晶性ジストロフィー治療のための遺伝子組換アデノ随伴ウイルスベクターを提供することを課題とする。
【解決手段】本発明では、所定の遺伝子発現抑制配列と関連付けた ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードしたコドン最適化配列から成る組換アデノ随伴ベクター、及び、ビエッティ結晶性ジストロフィー （ＢＣＤ） の治療におけるこれの使用を提供する。
【課題】ビエッティ結晶性ジストロフィー治療のための遺伝子組換アデノ随伴ウイルスベクターを提供することを課題とする。
【解決手段】本発明では、所定の遺伝子発現抑制配列と関連付けた ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードしたコドン最適化配列から成る組換アデノ随伴ベクター、及び、ビエッティ結晶性ジストロフィー （ＢＣＤ） の治療におけるこれの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２～１７からなる配列群から選択され、かつヒトＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項2】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８、９、１５、１６及び１７から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項3】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８又は配列番号１６である、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項4】
ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードするヌクレオチド配列の５’末端と機能的に連結されたプロモーターを更に有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項5】
前記プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項6】
ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードするヌクレオチド配列の３’末端にポリアデニレーション配列を更に有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項7】
前記ポリアデニレーション配列がウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ｐｏｌｙＡ、合成 ｐｏｌｙＡ（ＳＰＡ）、又は雑種ウイルス（ＳＶ４０） ｐｏｌｙＡ、より好ましくはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡである、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項8】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調整エレメント（ＷＰＲＥ）を更に有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
【請求項9】
（ａ）又は（ｂ）を更に有する、請求項１～８のいずれかに一項に記載の単離された核酸分子。（ａ） 配列番号１８～３４のいずれか一つのヌクレオチド配列、又は、
（ｂ） 配列番号１８～３４のいずれか一つに対する相同性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるヌクレオチド配列。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸分子を有する、組換ＡＡＶベクター。
【請求項11】
一個又は二個の逆位末端配列（ＩＴＲ）を有する、請求項１０に記載の組換ＡＡＶベクター。
【請求項12】
二個のＡＡＶ２ ＩＴＲを有する、請求項１１に記載の組換ＡＡＶベクター。
【請求項13】
ＡＡＶカプシドにパッケージングされた、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組換ＡＡＶベクターを有する、ウイルス粒子。
【請求項14】
前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１３に記載のウイルス粒子。
【請求項15】
請求項１３又は請求項１４に記載のウイルス粒子、及び医薬上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項16】
ビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）の治療用又は予防用の医薬品の製造における、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組替ＡＡＶベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示では、発現カセット、及びＣＹＰ４Ｖ２をエンコードした核酸を有する遺伝子組替アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供し、更に、ｒＡＡＶベクターを有するウイルス粒子、当該ウイルス粒子の構成、及びこの用途を提供する。
【背景技術】
【0002】
ヒト遺伝子障害の治療においては、近年の進歩から、遺伝子療法が非常に有望であることが分かっている［１］。６，０００以上の遺伝病がこれまでに報告されており［２］、ゲノム配列技術の更なる開示によりその数は増えるばかりである［３］。これまでより安全な導入ベクター及び近年に見られる遺伝子編集技術により、このような遺伝病に対する治療法の選択肢が大いに改善された。その結果、治療ベクターにより運搬される外因性 ＤＮＡ で欠損遺伝子を補足するか、又は遺伝子編集により元の位置で永久補正することができる［４］。但し、こういった有望な見通しがあるにも関わらず、治療可能な遺伝障害の数がそれほど増えていないのが現状である［５］。これは、ヒトに変換可能な動物モデルが無いことがその主因であり、そのため遺伝子療法の効果を評価することができない［６］。
【0003】
常染色体劣勢遺伝の疾病であるビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ、ＭＩＭ ２１０３７０）に関して最初に言及したのが、１９３７ 年に黄白色の結晶析出を患者の眼底にはっきりと確認したイタリアの眼科医 Ｇ． Ｂ． ビエッティであったため、同医師の名前がついている［７］。ＢＣＤ は、欧州において非症候性の網膜色素変性症（ＲＰ）全体の３％ までを占め、非症候性の常染色体劣性遺伝 ＲＰ の １０ ％ までを占めている［８］。ＢＣＤ は、東アジア、特に中国でよく見られるが、遺伝子突然変異が ２ 万人に １ 人の割合で起こると言われている［９］。
【0004】
遺伝学上、ＢＣＤ の原因が染色体 ４ｑ３５ と関連していることが、２０００ 年に確認された［８］。２００４ 年には、チトクロム Ｐ４５０ スーパーファミリーの一員である ＣＹＰ４Ｖ２ が疾病を発現させる ＢＣＤ 遺伝子であることが明らかになった［１０］。 網膜及び角膜内の結晶析出に加え、ＢＣＤ 患者の血清内に改変脂肪酸組成も確認することができたが、これは、脂質代謝の調節不全を示唆するものであった［１１＆１２］。更に、ＢＣＤ 患者が ２０ 歳から ４０ 歳の間に失明や夜盲症が発現し、５０ 歳から ６０ 歳までには法的盲にまで進んでしまう［１１］。遺憾ながら、ＢＣＤ の発見から ８０ 年が経った現在でも、失明にまで至る当該重病に対して、その治療法は未だに見つかっていない。
【0005】
ＡＡＶ は、その長期的な導入遺伝子発現が実証されていることから、ＢＣＤ 等の遺伝子障害の治療に適した手段として今日優先されている。
【0006】
ＣＮ１１１７３３１７４Ｂ は ＡＡＶ ベクターにパッケージング可能な構成を提供し、また、ＢＣＤ 治療のための ＣＹＰ４Ｖ２ 及び ＲｄＣＶＦ のコード配列を有する。
【0007】
ＣＮ１０９１３６２６６Ａ では、ｒＡＡＶ により ＣＹＰ４Ｖ２ を発現させる構成も提供している。そのパッケージング プラスミドにおいては、短鎖ペプチド Ｃ９ をエンコードした配列を挿入することで、ヒト ＲＰＥ 細胞膜上の ＣＤ５９ 抗原との特異結合を可能にする。更に、ＨＲＨ ペプチドをエンコードした配列を ＣＹＰ４Ｖ２ コード配列と共に挿入して ＶＥＧＦ を阻害する。
【0008】
ＣＮ１１１７３３１７４Ｂ 及び ＣＮ１０９１３６２６６Ａ は、共に野生型コード配列 ＣＹＰ４Ｖ２ を使用している。
【0009】
以上から、現在、効率的且つ安全に ＢＣＤ 患者の ＣＹＰ４Ｖ２ 遺伝子機能を復元する遺伝子療法組成物の改善技術及び方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の発明者は、コドン最適化コード配列 ＣＹＰ４Ｖ２ から成る ｒＡＡＶ ベクター及び遺伝子発現調節配列の一定の組み合わせを開発し、これにより過去に発表した形態［１３］ と比較して発現レベルが有意に向上したため（最高２６．１ 倍まで）、本発明を完了した。
【課題を解決するための手段】
【0011】
従い、本開示は、第一に、配列番号 ２～１７ から成るグループから選択したヌクレオチド配列を有し、又、ヒト ＣＹＰ４Ｖ２ をエンコードする、単離された核酸分子に関するものである。好ましい実例において、ヌクレオチド配列は配列番号 ８、９、１５、１６、及び １７ から選択している。更に好ましい実例においては、ヌクレオチド配列は配列番号 ８ 又は配列番号 １６ である。このうち最も好ましいヌクレオチド配列は配列番号１６ である。
【0012】
本開示において、第一に、上記の単離された核酸分子は、更に、ＣＹＰ４Ｖ２ をエンコードしたヌクレオチド ５’ と機能上リンクされたプロモーターを有する。このプロモーターは、配列番号 ３５ の ＣＡＧ プロモーターであることが好ましい。
【0013】
一実施例において、単離された核酸分子は、更に、ＣＹＰ４Ｖ２ ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の ３’ にポリアデニレーション配列を含む。このポリアデニレーション配列は、ウシ成長ホルモン ｐｏｌｙＡ、 合成 ｐｏｌｙＡ （ＳＰＡ）、若しくは雑種ウイルス ４０ （ＳＶ４０）であることが好ましい。更に望ましいのは、ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ である。
【0014】
他実施例において、単離された核酸は、更にウッドチャック ＣＹＰ４Ｖ２ コード配列と ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ 配列の間にあるチャック肝炎ウイルス転写後調整エレメント （ＷＰＲＥ） を含む。
【0015】
望ましい一実施例において、この単離核酸分子は以下を含む。
【0016】
（ａ） 配列番号 １８～３４ のいずれか一のヌクレオチド配列、若しくは、
（ｂ） 配列番号 １８～３４ に対する相同性が少なくとも ８５ ％、９０ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％、若しくは ９９ ％ のヌクレオチド配列。
（ｂ） 配列番号 １８～３４ に対する相同性が少なくとも ８５ ％、９０ ％、９５ ％、９６ ％、９７ ％、９８ ％、若しくは ９９ ％ のヌクレオチド配列。
【0017】
本開示では、第二に、第一に提供した核酸分子を構成する組換 ＡＡＶ （ｒＡＡＶ） ベクターを提供する。
【0018】
一実施例において、ｒＡＡＶ ベクターは少なくとも ＩＴＲ 一個を有し、二個有することが望ましい。好ましい実施例において、当該二個の ＩＴＲ は、 ＡＡＶ２ ＩＴＲ 由来である。
【0019】
本開示にて第三に提供するのは、第二に提供した組換 ＡＡＶ ベクターウイルス粒子、並びに、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０Ｌ６５、及びそのバリアントから選択した ＡＡＶ カプシドである。ここで、当該カプシドは ＡＡＶ８ であることが好ましい。
【0020】
本開示にて第四に提供するのは、第三に提供したウイルス粒子並びに医薬上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物である。
【0021】
本開示にて第五に提供するのは、ビエッティ結晶性ジストロフィー （ＢＣＤ） 若しくは網膜色素上皮症 （ＲＰＥ） 萎縮症系のその他疾病を治療する又は予防するため、薬品メーカーによる、薬品製造過程での ｒＡＡＶ ベクター使用である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図5A-5B】図５Ａ～５Ｂは、ウェスタンブロット （Ａ） 並びにヒストグラム （Ｂ） による ＨＥＫ２９３ 細胞内の構成 ＢＣＤ８、ＢＣＤ９、ＢＣＤ１５、ＢＣＤ１６、及び ＢＣＤ１７ における ＣＹＰ４Ｖ２ 導入遺伝子の発現率を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本書に別段の断りがない限り、本書で使用する技術・科学用語は、本発明の分野における当業者が通常理解できる意味を有する。
【0024】
本書で使用した通り、添付の請求項を含み、文脈から別段の断りが明示されない限り、「一つ」、「一個」、及び 「その」 等の表現は、これらの複数形も含むものとする。
【0025】
本開示の文脈において、別段の断りがない限り、「を有する」、及び、「を含む」、「から成る」 等の表現の変化形は、そのアミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、段階、群等の、記述された部分を含むことが暗に理解されるものとし、アミノ酸配列、ヌクレオチド配列、特性、及び段階等、その他の部分の除外を理解させるものではない。本書で 「を有する」 の表現、又はこれの変化形である 「から成る」、「を含む」、或いは 「から構成される」 若しくはこれに相当する変化形と置き換えることができる。「を有する」 の表現が、 「から成る」 を含む場合の実施例もある。
【0026】
省略形「ＣＹＰ４Ｖ２」は、チトクロム Ｐ４５０ ファミリーのサブファミリー Ｖ のメンバー ２ を意味し、これは、代謝経路内における種々の基盤の酸化に関わるチトクロム Ｐ４５０ ヘム チオレートタンパク質スーパーファミリーの ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の遺伝子コードである。遺伝子 ＣＹＰ４Ｖ２ 内の欠陥が ＢＣＤ 及び眼底ジストロフィーの原因となることが知られている。本書で言述する ＣＹＰ４Ｖ２ は、別段の断りがない限り、本開示におけるヒト ＣＹＰ４Ｖ２ を意味する。
【0027】
ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質をエンコードする単離された核酸。
本開示では、ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質、特にヒト ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質のヌクレオチド配列コードから成る、単離された核酸配列を提供している。「単離された核酸」 とは、ポリヌクレオチドの一部若しくは全体から隔離された ＤＮＡ 又は ＲＮＡ を意味し、このヌクレオチド内では、単離されたポリヌクレオチドが自然に存在するか、或いは自然に結合しないヌクレオチドと関連している。一定のヌクレオチド配列を 「有する」 単離された核酸分子には、一定の配列の他に、列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する、機能上関連づけたた制御配列を含むことができる。コドンの縮退により、当業者であれば、一定のアミノ酸配列が異なるヌクレオチド配列によりコーディング可能であることが理解できる。
本開示では、ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質、特にヒト ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質のヌクレオチド配列コードから成る、単離された核酸配列を提供している。「単離された核酸」 とは、ポリヌクレオチドの一部若しくは全体から隔離された ＤＮＡ 又は ＲＮＡ を意味し、このヌクレオチド内では、単離されたポリヌクレオチドが自然に存在するか、或いは自然に結合しないヌクレオチドと関連している。一定のヌクレオチド配列を 「有する」 単離された核酸分子には、一定の配列の他に、列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する、機能上関連づけたた制御配列を含むことができる。コドンの縮退により、当業者であれば、一定のアミノ酸配列が異なるヌクレオチド配列によりコーディング可能であることが理解できる。
【0028】
本開示の ＣＹＰ４Ｖ２ のヌクレオチド配列コーディングはコドン最適化及びスクリーニングの対象となっており、その結果、コドン最適化の無い野生型のコーディング配列と比較し、発現率が改善される。
【0029】
例えば、コドン最適化を行なった ＣＹＰ４Ｖ２ コーディング配列では、ＨＥＫ２９３ 細胞及び ＡＲＰＥ－１９ 細胞内 ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の発現率に関するウェスタンブロット分析により、野生型コーディング配列と比較して約 ２ 倍、約 ３ 倍、約 ４ 倍、約 ５ 倍、約 １０ 倍、約 １５ 倍、若しくは約 ２０ 倍の発現率を実現することができる。
【0030】
コドン最適化を行なった ＣＹＰ４Ｖ２ のコーディング配列に ＣｐＧ 番号及び減らした ＣｐＧ アイランド数又はこのいずれかを含むことが望ましい。例えば、このコドン最適化を行なったコーディング配列に含まれるのは、１００ ＣｐＧ 以下、７０ ＣｐＧ 以下、２０ ＣｐＧ 以下、１５ ＣｐＧ 以下、１０ ＣｐＧ 以下、５ ＣｐＧ 以下、若しくは ０ ＣｐＧ である。例えば、このコドン最適化を行なったコーディング配列は、ＣｐＧ アイランドを含まない。「ＣｐＧ アイランド」 とは、長さが少なくとも ２００ ｂｐ の ＤＮＡ 領域、５０ ％ 以上の ＧＣ 比、及び ６０ ％ 以上の ＣｐＧ 観察値・期待値比を意味する。
【0031】
例えば、コドン最適化を行なったコーディング配列において、配列番号 １ に示す通り、ＣＹＰ４Ｖ２ の野生型コーディング配列と比較して、配列相同性は ８０ ％ 未満である。二種の配列間の相同性比は、本分野で既に使用しているプログラムのいずれかにより求めることができる。配向パラメータや相同性定義の差異により、二種配列間の相同性比の算出は、使用したプログラムにより異なる場合がある。本開示においては、ｂｌａｓｔｎ を使用して二種配列間の相同性比を算出し、「類似性の高い配列 （ＭｅｇａＢＬＡＳＴ）」 モードを特に選択した。
【0032】
コドン最適化を行なったコーディング配列は、配列番号 ２～１７ に示したヌクレオチド配列から成るグループから選択することができる。このコドン最適化を行なったコーディング配列は、配列番号 ８、９、１５、１６、及び １７ のいずれか一であることが望ましい。コドン最適化を行なったコーディング配列のうち更に望ましいのは、 配列番号 １６ である。
【0033】
核酸分子内にある制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニレーション配列、及び翻訳終止信号の内一以上から選択することができる。本開示における制御配列には、コーディング配列の発現効率において想定外の効果を生む組み合わせもある。
【0034】
本開示におけるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、若しくは細胞種特異性プロモーターのいずれであってもよい。例えば、このプロモーターは ＲＰＥ 細胞特異性プロモーターであってもよく、ＣＹＰ４Ｖ２ の天然プロモーターであってもよい。より好ましい実施例において、このプロモーターは配列番号 ３５ の配列を持つ ＣＡＧ プロモーターである。ＣＡＧ プロモーターは、哺乳類発現ベクターにおいて高い遺伝子発現率を繰る、強固な構成的プロモーターである。ＣＡＧ プロモーターは、サイトメガロウイルス （ＣＭＶ） の早期エンハンサー エレメント、ニワトリベタアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロン及びウサギ ベタグロービン遺伝子のスプライス アクセプターから選択したプロモーターを含む。
【0035】
これを発見した科学者の名が付いたコザック共通配列 （コザック配列） は、タンパク質翻訳開始点として自然に機能する、殆どの真核性 ｍＲＮＡ 転写産物に存在する核酸モチーフである［１４］。コザック配列により、タンパク質が正しく翻訳され、タンパク質の発現が向上する。
【0036】
更に、本開示における核酸は、プロモーター・コーディング配列間に挿入されたイントロンも含む。当業者等が周知の通り、真核内遺伝子の発現を向上させるイントロンも存在する。本開示におけるこのイントロンは、ＣＹＰ４Ｖ２ 遺伝子の自然発生イントロンの一部を成すこともできる。
【0037】
本開示のポリアデニレーション配列は、ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ、ＳＰＡ、若しくは ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ［１５］ のいずれであってもよいが、好ましいのは ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ である。ｐｏｌｙＡ のいずれも、ＤＮＡ 配列であるウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント （ＷＰＲＥ）［１６］ と組み合わせることが可能であるが、これにより転写時に立体構造が作られて発現率が向上し、ＷＰＲＥ－ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ、ＷＰＲＥ－ＳＰＡ、若しくは ＷＰＲＥ－ＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ としてそれぞれ設定される。
【0038】
本開示の望ましい実施例において、核酸配列は ＣＡＧ プロモーターのヌクレオチド配列エンコーディング、コザック配列、 ＣＹＰ４Ｖ２ 遺伝子のコドン最適化コーディング配列、及び ＷＰＲＥ－ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ を含む。例えば、単離された核酸の配列は、配列番号 １８～３４ のいずれか一のヌクレオチド配列を含む。更に望ましい実施例において、この単離された核酸の配列は、配列番号 ２５、２６、３２、３３、 及び ３４ のいずれか一のヌクレオチド配列を含む。最も望ましい実施例において、単離された核酸の配列は、配列番号 ３３ を含む。
【0039】
ｒＡＡＶ ベクター及びウイルス粒子
本開示における核酸分子は、ｒＡＡＶ 粒子を得て治療対象者に提供するため、組換 ＡＡＶ ベクターに組み入れることができる。
本開示における核酸分子は、ｒＡＡＶ 粒子を得て治療対象者に提供するため、組換 ＡＡＶ ベクターに組み入れることができる。
【0040】
挿入した上記ヌクレオチド配列に加え、ｒＡＡＶ ベクターは一本鎖形態である。この ｒＡＡＶ ベクターは、通常、挿入したヌクレオチド配列の両端に二個の逆位末端配列 （ＩＴＲ） を有する。本開示の ＩＴＲ は、ＡＡＶ セロタイプから派生したいずれの ＩＴＲ でもよい。ＡＡＶ ＩＴＲ セロタイプを参照する場合、「から派生した」 の表現は、ＩＴＲ が、特定のセロタイプ若しくはそれから派生し変更を加えたバリアントの ＩＴＲ であってよいということを示す。本開示の望ましい実施例において、ｒＡＡＶ ベクターは ＡＡＶ２ から派生した二個の ＩＴＲ から成る［１７］。例えば、ｒＡＡＶ ベクターは二個の ＡＡＶ２ ＩＴＲ を有するか、又は、野生型 ＡＡＶ２ ＩＴＲ 及び Ｃ 領域若しくは Ｃ’ 領域の無い ＡＡＶ２ ＩＴＲ のバリアントを有する。野生型 ＡＡＶ２ ＩＴＲ は、挿入したヌクレオチド配列の ５’ に配置し、その一方で ＡＡＶ２ ＩＴＲ バリアントは挿入したヌクレオチド配列の ３’ に配置する場合がある。その逆も可能である。
【0041】
ｒＡＡＶ ゲノムは、ＡＡＶ カプシドにパッケージングした。このカプシドは、 当業者が周知の又は将来特性が明らかになるであろう ＡＡＶ セロタイプのいずれかから派生したものでよい。このカプシド及び ＩＴＳ は、同じ ＡＡＶ セロタイプ若しくは異なる ＡＡＶ セロタイプから派生したものでよい。当該のカプシドは、眼への提供 （網膜下、硝子体内、又は眼球内への提供等） に適したものであることが望ましい。ある実施例において、この ＡＡＶ ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２．７ｍ８、若しくは ＡＡＶＡｎｃ８０Ｌ６５ セロタイプのカプシド又はそのバリアントから成る。
【0042】
本開示の望ましい実施例において、この ｒＡＡＶ は、ＡＡＶ セロタイプのカプシドを八個有する［１８］。ｓｓＡＡＶ８ による視細胞及び網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の変換は、ｓｓＡＡＶ２ や ｓｓＡＡＶ５ による変換より効率の高いことが実証されている。カプシドタンパク質に誘導され、当該ウイルスは対象細胞を変換し、続いて、ＣＹＰ４Ｖ２ 遺伝子及び制御エレメントを有する導入済みゲノムが対象 ＲＰＥ に放出される。放出された ｒＡＡＶ ゲノムはその安定性を持続し、宿主ゲノムから独立しているため、治療対象者において ＣＹＰ４Ｖ２ 機能タンパク質を安定的に生成することが可能となる。
【0043】
医薬組成物
「医薬組成物」 という用語は、対象者への提供に適した組成物を意味する。本開示の医薬組成物は、単離された核酸、本開示の ｒＡＡＶベクター若しくはウイルス粒子、及び薬学上許容可能な賦形剤である。薬学上許容可能な従来賦形剤は当業者が周知のものであり、固体・液体のいずれでもよい。
「医薬組成物」 という用語は、対象者への提供に適した組成物を意味する。本開示の医薬組成物は、単離された核酸、本開示の ｒＡＡＶベクター若しくはウイルス粒子、及び薬学上許容可能な賦形剤である。薬学上許容可能な従来賦形剤は当業者が周知のものであり、固体・液体のいずれでもよい。
【0044】
治療用途
ｒＡＡＶ、ウイルス粒子、若しくは本開示の組成物は、ＣＹＰ４Ｖ２ 突然変異に関連のある ＢＣＤ の治療や予防に使用可能である。更に、この ｒＡＡＶ、ウイルス粒子、若しくは本開示の組成物は、眼底ジストロフィー等の、網膜色素上皮 （ＲＰＥ） 萎縮関連の他状態や疾病の治療や予防にも効果を示す。
ｒＡＡＶ、ウイルス粒子、若しくは本開示の組成物は、ＣＹＰ４Ｖ２ 突然変異に関連のある ＢＣＤ の治療や予防に使用可能である。更に、この ｒＡＡＶ、ウイルス粒子、若しくは本開示の組成物は、眼底ジストロフィー等の、網膜色素上皮 （ＲＰＥ） 萎縮関連の他状態や疾病の治療や予防にも効果を示す。
【0045】
「治療する」、「治療の」、又は 「治療」 の表現は、ＢＣＤ の症状若しくは ＲＰＥ 萎縮関連の状態や疾病の治癒又は少なくともその軽減を含む。
【0046】
投与
本書における 「投与」 及び 「投与した」 の用語は、動物やヒト、又は細胞、組織、臓器、生体体液等の対象に適用した場合、外因性の医薬用、治療用、診断用薬剤の、若しくは組成物が対象、細胞、組織、臓器、或いは生体体液と接触することを意味する。「投与」 という用語は、試薬、診断用・結合用化合物或いは他細胞による、生体外及びエクスビボでの、細胞等の治療も含む。
本書における 「投与」 及び 「投与した」 の用語は、動物やヒト、又は細胞、組織、臓器、生体体液等の対象に適用した場合、外因性の医薬用、治療用、診断用薬剤の、若しくは組成物が対象、細胞、組織、臓器、或いは生体体液と接触することを意味する。「投与」 という用語は、試薬、診断用・結合用化合物或いは他細胞による、生体外及びエクスビボでの、細胞等の治療も含む。
【0047】
本開示において、本発明の上記ウイルス粒子又は医薬組成物は、網膜下注射等の眼球内で適用することが望ましい。
【0048】
例
例 １． プロモーターの選択
発明者等は、ＩＴＲ 二個、ＣＭＶ プロモーター一個、野生型 ＣＹＰ４Ｖ２ ＣＤＳ 一個、及び ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ から成る ＣＹＰ４Ｖ２ 発現 ＡＡＶ ベクターを最初に準備した［１３］。ＣＭＶ プロモーターにより発現が抑制されるという報告があることから［１９］、その後、ＣＭＶ プロモーターを ＣＡＧ プロモーターに替えたため、「ＣＡＧ－ｈＣｙｐ４ｖ２ （ＢＣＤ１）」 という新しいベクターを使用することになった。その結果、ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の発現率が著しく向上した （図 １、下部）。
例 １． プロモーターの選択
発明者等は、ＩＴＲ 二個、ＣＭＶ プロモーター一個、野生型 ＣＹＰ４Ｖ２ ＣＤＳ 一個、及び ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ から成る ＣＹＰ４Ｖ２ 発現 ＡＡＶ ベクターを最初に準備した［１３］。ＣＭＶ プロモーターにより発現が抑制されるという報告があることから［１９］、その後、ＣＭＶ プロモーターを ＣＡＧ プロモーターに替えたため、「ＣＡＧ－ｈＣｙｐ４ｖ２ （ＢＣＤ１）」 という新しいベクターを使用することになった。その結果、ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の発現率が著しく向上した （図 １、下部）。
【0049】
例 ２． コドン最適化による Ｃｙｐ４ｖ２ 発現率の向上
導入遺伝子の構成により ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の発現率を向上させることができるため、ＣＹＰ４Ｖ２ コーディング配列をコドン最適化しヒト細胞内でのコドン使用頻度を高めた。更に、ＴＬＲ９ を媒介とする生体外の免疫応答の可能性を最小限に抑えるため、変更コーディング配列の ＧＣ 含有物や ＣｐＧ アイランド数を削減した。上記の要件に基づき、十種の異なるコーディング配列 （配列番号 ２～１７） の設計、合成、及び ＣＡＧ プロモーターへのクローン作成を行ない、導入遺伝子の構成を更に十六個得た （ＢＣＤ２～ＢＣＤ１７）。以下の図 １ は、配列番号 ２～１７ の ＣｐＧ 番号、 ＣｐＧ アイランド番号、及び、野生型配列に対するこれ等の配列相同性を示す。
導入遺伝子の構成により ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の発現率を向上させることができるため、ＣＹＰ４Ｖ２ コーディング配列をコドン最適化しヒト細胞内でのコドン使用頻度を高めた。更に、ＴＬＲ９ を媒介とする生体外の免疫応答の可能性を最小限に抑えるため、変更コーディング配列の ＧＣ 含有物や ＣｐＧ アイランド数を削減した。上記の要件に基づき、十種の異なるコーディング配列 （配列番号 ２～１７） の設計、合成、及び ＣＡＧ プロモーターへのクローン作成を行ない、導入遺伝子の構成を更に十六個得た （ＢＣＤ２～ＢＣＤ１７）。以下の図 １ は、配列番号 ２～１７ の ＣｐＧ 番号、 ＣｐＧ アイランド番号、及び、野生型配列に対するこれ等の配列相同性を示す。
【0050】
表 １． ＧＣ 含有物・ ＣｐＧ アイランド番号、及び、コドン最適化した配列十六個の配列と野生型コーディング配列との相同性比較
【0051】
例 ３． ＨＥＫ２９３ 細胞及び ＡＲＰＥ－１９ 細胞の遺伝子導入、並びに、発現率の検出
ＨＥＫ２９３ 細胞及び ＡＲＰＥ－１９ 細胞を ＤＭＥＭ ＋ １０％ ＦＢＳ に維持し、ＴｒｙｐＬＥ により ３ 日毎に通過させた。遺伝子導入の前日、１ × １０５ 細胞／ｃｍ２ の密度で ＨＥＫ２９３ 細胞を ２４ 穴プレートに植え付け、その一方で、７ × １０４ 細胞／ｃｍ２ の密度で ＡＲＰＥ－１９ 細胞を ２４ 穴プレートに植え付けた。プラスミドは、使用説明書に基づいて、リポフェクタミン ３０００ 導入剤 （インビトロジェン、Ｌ３０００００８） で遺伝子導入を行なった。遺伝子導入 ７２ 時間後に、これらの細胞は、 プロテアーゼ阻害薬の反応混液 （Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１５９００１） 及び ＳＤＳ－ＰＡＧＥ添加液（Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏ、ＣＷ００２７）を用い １２，０００ ｒｐｍ で １０ 分間攪拌を行ない、ＲＩＰＡ 溶解バッファー （碧云天生物、Ｐ００１３Ｃ） 内に採取し、９５°Ｃ で １５ 分間変性を行い、１２，０００ ｒｐｍ で １０分間遠心分離機にかけた。上澄を ４ ％～１０ ％ の ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ゲル （Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏ、 ＣＷ００２２Ｍ）で分離し、０．４５ μｍ の ＮＣ 転写膜 （Ｍｅｒｃｋ、ＨＡＴＦ０００１０） 上に写した。
ＨＥＫ２９３ 細胞及び ＡＲＰＥ－１９ 細胞を ＤＭＥＭ ＋ １０％ ＦＢＳ に維持し、ＴｒｙｐＬＥ により ３ 日毎に通過させた。遺伝子導入の前日、１ × １０５ 細胞／ｃｍ２ の密度で ＨＥＫ２９３ 細胞を ２４ 穴プレートに植え付け、その一方で、７ × １０４ 細胞／ｃｍ２ の密度で ＡＲＰＥ－１９ 細胞を ２４ 穴プレートに植え付けた。プラスミドは、使用説明書に基づいて、リポフェクタミン ３０００ 導入剤 （インビトロジェン、Ｌ３０００００８） で遺伝子導入を行なった。遺伝子導入 ７２ 時間後に、これらの細胞は、 プロテアーゼ阻害薬の反応混液 （Ｒｏｃｈｅ、０４６９３１５９００１） 及び ＳＤＳ－ＰＡＧＥ添加液（Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏ、ＣＷ００２７）を用い １２，０００ ｒｐｍ で １０ 分間攪拌を行ない、ＲＩＰＡ 溶解バッファー （碧云天生物、Ｐ００１３Ｃ） 内に採取し、９５°Ｃ で １５ 分間変性を行い、１２，０００ ｒｐｍ で １０分間遠心分離機にかけた。上澄を ４ ％～１０ ％ の ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ゲル （Ｃｏｗｉｎ Ｂｉｏ、 ＣＷ００２２Ｍ）で分離し、０．４５ μｍ の ＮＣ 転写膜 （Ｍｅｒｃｋ、ＨＡＴＦ０００１０） 上に写した。
【0052】
ＣＹＰ４Ｖ２ 並びにハウスキーピング遺伝子 ＧＡＰＤＨ の発現率は、ヒト ＣＹＰ４Ｖ２（Ｓｉｇｍａ、 ＨＰＡ０２９１２２）及び ＧＡＰＤＨ （Ａｂｃａｍ、ａｂ８２４５） に対するそれぞれの抗体を用いて検出した。帯域内の灰色の値を算出し ＢＣＤ１ に対して正規化した。
【0053】
繰り返し実験を行なった結果、ＨＥＫ２９３ 細胞 （図 ３） 及び ＡＲＰＥ－１９（図 ４）評価で確認された通り、検査を行なったコドン最適化ベクター十六個では、遺伝子導入の構成 ＢＣＤ８、ＢＣＤ９、ＢＣＤ１５、ＢＣＤ１６、及び ＢＣＤ１７ により ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質が多量発現することが確認された。これに伴い、遺伝子導入の構成 ＢＣＤ８、ＢＣＤ９、ＢＣＤ１５、ＢＣＤ１６、及び ＢＣＤ１７ を、ＢＣＤ１ を対照として用いて更なる評価対象として選択した。 ウェスタン ブロット （ＷＢ） の結果は、図 ５ 及び図 ６ の上部に示した。全帯域における灰色の値の算出、分析、ＢＣＤ１ への正規化を行なった （図 ５ 及び図 ６ の下部）。
【0054】
ウェスタン ブロットの結果から、ＨＥＫ２９３ 細胞内で最も高い ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の出現率が ＢＣＤ８ で観察でき （図 ５）、ＡＲＰＥ－１９ 細胞内で最も高い ＣＹＰ４Ｖ２ タンパク質の出現率が ＢＣＤ１６ で観察できた （図 ６）。
【0055】
この後、ＢＣＤ１、ＢＣＤ８、及び ＢＣＤ１６ を複製欠損 ＡＡＶ８ にそれぞれパッケージングした。ヒドロキシ尿素 ２ ｍＭ の条件下、ＭＯＩ ＝ ５ × １０５ で ＡＲＰＥ－１９ を変換するため、ＡＡＶ８－ＢＣＤ１、ＡＡＶ８－ＢＣＤ８、及び ＡＡＶ８－ＢＣＤ１６ ウイルス粒子を用いた。
【0056】
ＡＡＶ 変換の実験では、ＡＡＶ８－ＢＣＤ１６ で最も高い発現率を示すことが確認された （図 ７）。
【0057】
参考文献
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１５． Ｃｏｎｎｅｌｌｙ Ｓ， Ｍａｎｌｅｙ ＪＬ． “Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｒｎａ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｉ． Ｇｅｎｅｓ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ” （「ＲＮＡポリメラーゼ ｉｉ 遺伝子による転写集結及び成長に必要な機能 ｍＲＮＡポリアデニレーション信号」）． １９８８； ２： ４４０－４５２．
１６． Ｚｕｆｆｅｒｅｙ Ｒ， Ｄｏｎｅｌｌｏ ＪＥ， Ｔｒｏｎｏ Ｄ， Ｈｏｐｅ ＴＪ． “Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ” （「ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調整エレメントにより向上する、レトロウイルス ベクターにより導入された導入遺伝子の発現率」）． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９９９； ７３： ２８８６－２８９２．
１７． Ｇｒｉｍｍ Ｄ， Ｋｅｒｎ Ａ， Ｒｉｔｔｎｅｒ Ｋ， Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ＪＡ． “Ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ” （「組換アデノ随伴ウイルス ベクター生産及び精製用の新規ツール」）． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８； ９： ２７４５－２７６０．
１８． Ｇａｏ ＧＰ， Ａｌｖｉｒａ ＭＲ， Ｗａｎｇ Ｌ， Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ， Ｊｏｈｎｓｔｏｎ Ｊ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ． “Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ” （「ヒト遺伝子療法用ベクターとしての、アカゲザルから得た新規のアデノ随伴ウイルス」）． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ． ２００２； ９９： １１８５４－１１８５９．
１９． Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ Ｌ， Ｃｈｔａｒｔｏ Ａ， Ｌｅｈｔｏｎｅｎ Ｅ， Ｖｅｌｕ Ｔ， Ｂｒｏｔｃｈｉ Ｊ， Ｌｅｖｉｖｉｅｒ Ｍ． “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａａｖ‐ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ” （「組換 ＡＡＶ 媒介による遺伝子の、中枢神経への導入」）． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ： Ａ ｃｒｏｓｓ‐ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２００４； ６： Ｓ２１２－Ｓ２２２．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２～１７からなる配列群から選択され、かつヒトＣＹＰ４Ｖ２ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項2】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８、９、１５、１６及び１７から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項3】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号８又は配列番号１６である、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項4】
ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードするヌクレオチド配列の５’末端と機能的に連結されたプロモーターを更に有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項5】
前記プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項6】
ＣＹＰ４Ｖ２をエンコードするヌクレオチド配列の３’末端にポリアデニレーション配列を更に有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項7】
前記ポリアデニレーション配列がウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ｐｏｌｙＡ、合成 ｐｏｌｙＡ（ＳＰＡ）、又は雑種ウイルス（ＳＶ４０） ｐｏｌｙＡ、より好ましくはＳＶ４０ ｐｏｌｙＡである、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項8】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調整エレメント（ＷＰＲＥ）を更に有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項9】
（ａ）又は（ｂ）を更に有する、請求項１に記載の単離された核酸分子。（ａ） 配列番号１８～３４のいずれか一つのヌクレオチド配列、又は、
（ｂ） 配列番号１８～３４のいずれか一つに対する相同性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％であるヌクレオチド配列。
【請求項10】
請求項１に記載の核酸分子を有する、組換ＡＡＶベクター。
【請求項11】
一個又は二個の逆位末端配列（ＩＴＲ）を有する、請求項１０に記載の組換ＡＡＶベクター。
【請求項12】
二個のＡＡＶ２ ＩＴＲを有する、請求項１１に記載の組換ＡＡＶベクター。
【請求項13】
ＡＡＶカプシドにパッケージングされた、請求項１０に記載の組換ＡＡＶベクターを有する、ウイルス粒子。
【請求項14】
前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１３に記載のウイルス粒子。
【請求項15】
請求項１３に記載のウイルス粒子、及び医薬上許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項16】
ビエッティ結晶性ジストロフィー（ＢＣＤ）の治療用又は予防用の医薬品の製造における、請求項１０に記載の組替ＡＡＶベクターの使用。
【国際調査報告】