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特表2024-524740緑茶葉からの生成物の連続的な抽出のための単一のプロセス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-07-05
(54)【発明の名称】緑茶葉からの生成物の連続的な抽出のための単一のプロセス
(51)【国際特許分類】
A23F 3/16 20060101AFI20240628BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
A23F3/16
A23L33/105
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024503536
(86)(22)【出願日】2022-07-15
(85)【翻訳文提出日】2024-02-26
(86)【国際出願番号】 IN2022050641
(87)【国際公開番号】W WO2023002500
(87)【国際公開日】2023-01-26
(31)【優先権主張番号】202111032421
(32)【優先日】2021-07-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】596020691
【氏名又は名称】カウンスィル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＵＮＣＩＬ ＯＦ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＆ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
(74)【代理人】
【識別番号】110001737
【氏名又は名称】弁理士法人スズエ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ、モヒト
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ、メハク
(72)【発明者】
【氏名】スード、ヴィヴェシュ
【テーマコード（参考）】
4B018
4B027
【Ｆターム（参考）】
4B018MD60
4B018ME03
4B018ME06
4B018ME08
4B018ME09
4B018ME14
4B018MF01
4B027FB17
4B027FP72
4B027FP75
4B027FP78
(57)【要約】
本発明は生の緑茶（カメリア・シネンシス）の葉から、ワックス、クロロフィル、カテキンを同時に単離および精製するための統合された、費用効果の高いプロセスを開示する。さらに、上記生成物の抽出後に残された残留茶葉からカフェインを単離および精製するためのプロセス。様々なプロセスパラメータの最適化も行われている。これに加えて、ＴＬＣ、ＦＴＩＲ、ＨＰＬＣ、ＧＣ－ＭＳ法に基づいて、生成物の品質も評価した。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
緑茶葉から生成物を連続的に抽出するための統合されたプロセスであって、ａ．）カメリア・シネンシスから得られた前記緑茶葉を準備するステップ、
ｂ．）前記緑葉をアルカン溶媒に室温で２～３時間浸漬して溶液を得るステップ、
ｃ．）ステップ（ｂ）で得られた前記溶液を濾過して濾液および残留葉を得るステップ、
ｄ．）ステップ（ｃ）の前記濾液を乾燥させて、第１の生成物としてワックスを得るステップ、
ｅ．）ステップ（ｃ）で得られた前記残留葉をアルコールに浸漬し、続いて３０～４２℃で１～２時間加熱して、緑色溶液および残された葉を得るステップ、
ｆ．）ステップ（ｅ）で得られた前記緑色溶液を乾燥させて、第２の生成物として着色顔料を得るステップ、
ｇ．）ステップ（ｅ）で得られた前記残された葉を乾燥させ、続いて１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出して、抽出物および残留する使用済みの葉を得るステップ、
ｈ．）０．１～０．５ミクロン細孔径精密濾過によって、ステップ（ｇ）の前記抽出物を精製するステップ、
ｉ．）ポリスチレン吸着樹脂－Ａに、ステップ（ｈ）の前記精製された抽出物を通過させるステップ、
ｊ．）ステップ（ｈ）で得られた前記抽出物をアルコールで溶出して褐色カテキン粉末を第３の生成物として得るステップ、
ｋ．）ステップ（ｇ）で得られた残留する使用済みの葉を１００℃で１時間、炭酸ナトリウムと共に水抽出するステップ、
ｌ．）ステップ（ｋ）で得られた前記抽出物を冷却して、ジクロロメタン溶媒による液－液抽出によって第４の生成物としてカフェインを回収するステップ、
を含む、プロセス。
【請求項2】
前記第１の生成物が０．０７％の収率を有するワックスである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記第２の生成物が、８．６％の収率を有する着色顔料である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項4】
前記第３の生成物がカテキンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項5】
樹脂－Ａからの前記カテキンの収率が３．１７％であり、樹脂－Ｃからの収率が１．１６％である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項6】
前記第４の生成物が０．０７％の収率を有するカフェインである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項7】
アルカン溶媒がヘキサンである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項8】
カメリア・シネンシスの上部および下部の葉の両方が準備される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項9】
カテキンが、抗酸化剤、抗変異原性剤、抗菌剤、抗ウイルス剤として使用するためのもので、糖尿病、がん、心血管疾患および炎症などの疾患からの保護効果を有する、請求項１に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、緑茶葉から生成物を連続的に抽出するための単一のプロセスに関する。本発明は、生の緑茶（カメリア・シネンシス）の葉からワックス、クロロフィル、カテキンを同時に単離および精製するための、統合された費用効果の高いプロセスを開示する。さらに残留茶葉を、その中に存在するカフェインの単離および精製のために処理することができる。
【背景技術】
【0002】
茶樹（カメリア・シネンシス）は、東アジア原産の常緑樹の低木である。それは世界中で消費されており、水に次いで人気が高い。年間約３０億キログラムの茶が生産され消費されている。茶樹は、その芽や２枚または３枚の葉に関して茶の飲料の生成のために古くから使用されているが、現在は科学の進歩によりカテキンの生成のために使用されている。過去にカテキンを抽出するためカメリア・シネンシスについて調査した全研究を、以下に挙げる。Ｆｕｋｕｄａらの米国特許第２００７／００８２０７３号明細書は、カテキンの抽出に焦点を当てており、植物を最大限に利用してはいない。Ｏｋａｄａらの米国特許第４，２４８，７８９号明細書は、様々な極性で抽出を行っており、焦点を主に単一の生成物、すなわちカテキンのみに置いている。Ｈａｒｓｈ Ｐｒａｔａｐ Ｓｉｎｇｈらの国際公開第２０１３／１１８１５２号は、同じ植物材料を使用してバイオアミノ酸に焦点を置いた。この発見では広い視点、すなわち植物の葉は上記の２つの目的のために使用することができるだけでなく、他の価値のある生成物の開発のためにも葉の使用を拡張し得ることが考察されている。最初に葉を溶媒に浸漬して、その脂質成分を抽出する。この脂質層は化粧品産業において使用することができる。次いで植物から緑色顔料を抽出するために、溶媒を用いて同じ葉の第２の抽出を行う。この顔料は食品産業／化粧品産業／繊維産業において、天然着色剤として最も重要である。本発明はさらに、抗酸化剤、抗変異原性剤、抗菌剤、抗ウイルス剤であり、糖尿病、がん、心血管疾患、および炎症のような疾患からの保護効果を有するカテキンとして知られる褐色の化合物の抽出に関する。茶の成分の薬効に関する広範な研究の過程で、いわゆる茶タンニンの主要成分である茶カテキンが強い生理活性を有することが見出された。さらなる調査の結果、経済的なカテキンの生成を可能にする新規な方法が発見された。カテキン抽出後の残された葉（残留物）は、世界で最も広く消費されている興奮剤と考えられ、茶に自然に存在するカフェインの抽出のためにさらに処理される。諸研究はカフェインの消費を様々な健康上の利益と関連付けてきた。カフェインの総生成量のおおよその割合が飲料に使用され、総生成量の約２５％が医薬品調製に使用され、残りが他の目的のために使用される。このプロセスは植物の葉が最大限に使用されるため、効率的かつ経済的である。一般に植物の上部のみが使用されており、葉の残りは使用されないままであるが、このプロセスでは、ワックス、クロロフィル、カテキン、およびカフェインのような様々な生成物の生成のために、下部の葉も使用することができる。これらの化合物の構造を以下で明瞭にする。
【0003】
【化1】
【発明の概要】
【0004】
このように本発明は、緑茶葉から４つの生成物を連続的に抽出するための単一のプロセスを提供する。抽出される生成物（ワックス、着色顔料、カテキン、およびカフェイン）を、ヘキサンなどのアルカン溶媒に室温で２～３時間浸漬して、溶液を得る。次いで溶液を濾過して、残留葉および濾液を得る。濾液を乾燥させることによりワックスが生成される。残留葉をアルコールに浸漬して、緑色溶液および残された葉を得る。緑色溶液を乾燥させて緑色顔料、すなわちクロロフィルを得る。抽出物および残留する使用済みの葉を得るために、残された葉を乾燥させる前に顔料を３０分間水抽出（ｈｙｄｒｏ-ｅｘｔｒａｃｔ）する。抽出物を吸着樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃによる精密濾過によって精製するが、樹脂－Ａはポリスチレンである。抽出物が褐色に溶出した後、カテキン粉末が形成される。残留する使用済みの葉を１００℃で１時間、炭酸ナトリウムと共に水抽出する。ジクロロメタンによる液－液抽出を経て、抽出物を冷却することによりカフェインが回収される。本発明では植物材料の上部の葉および下部の葉の両方が使用されている。プロセスで使用されるポリスチレン吸着剤、すなわち樹脂－Ａは低コストである。本発明は樹脂－Ａの使用により３．５９ｇのカテキンが得られるのに対して、樹脂－Ｃでは１．３２ｇのカテキンが得られることを示す。プロセスは生の緑茶葉から、表皮脂質層、着色顔料、カテキン、およびカフェインを段階的に抽出することを主張する。抽出後に残された残留／使用済みの葉は、堆肥として使用することができる。
【0005】
単一のプロセスに関する本発明の主要な態様は、緑茶葉から生成物を連続的に抽出することに関与し、
ａ．）カメリア・シネンシスから得られた緑茶葉を準備するステップ、
ｂ．）緑葉をアルカン溶媒に室温で２～３時間浸漬して溶液を得るステップ、
ｃ．）ステップ（ｂ）で得られた溶液を濾過して濾液および残留葉を得るステップ、
ｄ．）ステップ（ｃ）の濾液を乾燥させて、第１の生成物としてワックスを得るステップ、
ｅ．）ステップ（ｃ）で得られた残留葉をアルコールに浸漬し、続いて３０～４２℃で１～２時間加熱して緑色溶液および残された葉を得るステップ、
ｆ．）ステップ（ｅ）で得られた緑色溶液を乾燥させて、第２の生成物として着色顔料を得るステップ、
ｇ．）ステップ（ｅ）で得られた残された葉を乾燥させ、続いて１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出して、抽出物および残留する使用済みの葉を得るステップ、
ｈ．）０．１～０．５ミクロン細孔径の精密濾過によって、ステップ（ｇ）の抽出物を精製するステップ、
ｉ．）吸着樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃに精製された抽出物を吸着樹脂通過させるステップ、
ｊ．）ステップ（ｈ）で得られた抽出物をアルコールで溶出して褐色カテキン粉末を第３の生成物として得るステップ、
ｋ．）ステップ（ｇ）で得られた残留する使用済みの葉を１００℃で１時間、炭酸ナトリウムと共に水抽出するステップ、
ｌ．）ステップ（ｋ）で得られた抽出物を冷却して、溶媒による液－液抽出によって第４の生成物としてカフェインを回収するステップ、
を含む。
ａ．）カメリア・シネンシスから得られた緑茶葉を準備するステップ、
ｂ．）緑葉をアルカン溶媒に室温で２～３時間浸漬して溶液を得るステップ、
ｃ．）ステップ（ｂ）で得られた溶液を濾過して濾液および残留葉を得るステップ、
ｄ．）ステップ（ｃ）の濾液を乾燥させて、第１の生成物としてワックスを得るステップ、
ｅ．）ステップ（ｃ）で得られた残留葉をアルコールに浸漬し、続いて３０～４２℃で１～２時間加熱して緑色溶液および残された葉を得るステップ、
ｆ．）ステップ（ｅ）で得られた緑色溶液を乾燥させて、第２の生成物として着色顔料を得るステップ、
ｇ．）ステップ（ｅ）で得られた残された葉を乾燥させ、続いて１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出して、抽出物および残留する使用済みの葉を得るステップ、
ｈ．）０．１～０．５ミクロン細孔径の精密濾過によって、ステップ（ｇ）の抽出物を精製するステップ、
ｉ．）吸着樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃに精製された抽出物を吸着樹脂通過させるステップ、
ｊ．）ステップ（ｈ）で得られた抽出物をアルコールで溶出して褐色カテキン粉末を第３の生成物として得るステップ、
ｋ．）ステップ（ｇ）で得られた残留する使用済みの葉を１００℃で１時間、炭酸ナトリウムと共に水抽出するステップ、
ｌ．）ステップ（ｋ）で得られた抽出物を冷却して、溶媒による液－液抽出によって第４の生成物としてカフェインを回収するステップ、
を含む。
【0006】
前記プロセスを鑑みると、得られる生成物は、ワックス、着色顔料、カテキン、およびカフェインからなる群から選択される。
【0007】
実施形態の１つにおいて、アルカン溶媒はヘキサンである。
【0008】
実施形態の１つにおいて、第１の生成物、つまりワックスの収率は０．０７％である。
【0009】
さらに別の実施形態では、第２の生成物、つまり緑色着色顔料の収率は８．６％である。
【0010】
さらに別の実施形態では、カメリア・シネンシスの上部の葉および下部の葉の両方が、ワックス、クロロフィル、カテキン、およびカフェインのような異なる生成物の生成に使用される。
【0011】
別の実施形態は、ポリスチレン樹脂として樹脂－Ａを必要とする。
【0012】
本発明の別の態様は、抗酸化剤、抗変異原性剤、抗菌剤、抗ウイルス剤として使用するためのカテキンに関し、糖尿病、がん、心血管疾患、および炎症のような疾患からの保護効果を有する。
【0013】
本発明の別の実施形態は、ジクロロメタンである、さらなる抽出のための溶媒を必要とする。
【0014】
カフェインを含むジクロロメタンに関するさらなる実施形態は、乾燥させ、最小限の量のアルコールと共に加熱することによって精製して、０．０７％のカフェインを回収した。
【0015】
さらに別の実施形態では、樹脂－Ａからのカテキンの収量は３．５９ｇであり、樹脂－Ｃは１．３２ｇの収量を与え、カフェインの収量は０．１７ｇである。
【0016】
発明の目的
本発明の主な目的は単一のプロセスを使用して、生の緑茶葉から４つの経済的に実行可能な生成物、すなわちワックス、着色顔料、カテキン、およびカフェインを単離することである。
本発明の主な目的は単一のプロセスを使用して、生の緑茶葉から４つの経済的に実行可能な生成物、すなわちワックス、着色顔料、カテキン、およびカフェインを単離することである。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】各種生成物の抽出手順およびＣ．シネンシスからのカテキンの抽出に使用される２つの樹脂の比較を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
カメリア・シネンシスの葉、茎、根、花は、２０１９年１１月に、ヒマーチャル・プラデーシュ（Ｈｉｍａｃｈａｌ Ｐｒａｄｅｓｈ）（ａｌｔ １４７２ ｍ）のパラムプル（Ｐａｌａｍｐｕｒ）から収集された。植物材料は、インド、ヒマーチャル・プラデーシュ－１７６０６１、パラムプルのＣＳＩＲ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｍａｌａｙａｎ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの植物標本に提出され、証拠標本（番号ＰＬＰ１８５５２）と同定された。
【0019】
本発明は生の緑茶葉から、ワックス、クロロフィル、カテキンおよびカフェインを段階的に抽出するための統合されたプロセスを提供する。第１のステップでは生の緑茶葉からのワックスの抽出は、葉をヘキサンに約２～３時間浸漬し、次いで濾過後にヘキサンを濃縮することによって行われる。第２に、これらの葉をアルコールに浸漬し３０～４０℃で１～２時間加熱して、それらから緑色顔料を抽出する。ワックスおよびクロロフィルを取り除いた後、薄緑色の葉を６０℃で３０分間撹拌しながら水抽出する。抽出後に抽出物を濾過し、次いで選択的ポリスチレン吸着樹脂に通して、その中にカテキンを吸着させた。その後これをアルコールで溶出し、噴霧乾燥して褐色カテキン粉末である一次生成物を得た。残された葉（残留物）は、水と共に１００℃で１時間加熱することによってさらに処理される。後にこの水抽出物をＤＣＭで抽出して、そこからカフェインを分離した。さらにＤＣＭを乾燥させてカフェインフレークを得る。ＴＬＣ、ＦＴＩＲ、ＮＭＲおよびＧＣ－ＭＳによって単離された化合物を明らかにすることができる。
【0020】
このプロセスにおける新規性は、出発原料、すなわち生の緑茶葉から、同時に段階的な方法で４つの生成物、すなわちワックス、着色顔料、カテキンおよびカフェインを抽出することである。主に上側の２つの葉および芽が高品質の茶生成物を製造するために使用されるが、下側の植物全体の残りの生の茶葉は利用されないままである。したがって本発明は、各段階で価値を付加するプロセスステップを設計することを通して、このような残りの葉を活用することによって、価値のある生成物を得ることができるプロセスを開発するものである。先行研究では、乾燥コストがプロセスに加わる、乾燥処理された材料での生成物の抽出が報告されているが、本発明は生の葉の価値の付加に関する。これに加えてカフェインは、資本集約的であり、カフェインの抽出のみをもたらす高圧で稼働するＳＦＥを使用した、乾燥処理のなされた葉からのカフェイン除去によって生成される。しかしカフェインがＳＦＥによって抽出されると、いくらかの量のカテキンも犠牲になり、カテキンの抽出に関してこのプロセスの効率が低下する。これに加えてＳＦＥは、この技術による二酸化炭素の制限を有する。しかし本発明のプロセスは、単純であり、より安価であり、生の茶葉について設計されている。茶樹は常緑樹の植物であり、十分に活用されていないかなりの量のワックスおよび着色顔料が存在している。本発明は化粧品および繊維産業で利用することができるこれらの化合物を抽出するために開発されている。さらにワックスおよび色が除去された茶葉は、より良好な抽出率および高収率のカテキンをもたらす。下流の精製ステップも異なり、カテキンに対してより高い親和性を有する特別なポリスチレン系樹脂を使用することによって効率的になされ、それは大きいサイズの他の樹脂と比較して、特定の小さいサイズ（０．３～１．０ｍｍ）の化学的性質および大きな表面積であることに起因しており、それが後者を前者よりも良好な吸着剤にしており、これは以前に報告されていない。一般的にビーズのサイズが小さいほど表面積が大きくなり、所望の化合物に対する分離および親和性が大きくなる。本発明で使用される樹脂は、より安価で、効果的で、経済的であり、リサイクル可能である。
【0021】
さらに本発明によって得られる収率は、３．６１％（生基準のｗ／ｗ）または１２．０３％（乾燥基準のｗ／ｗ）であり、以前に報告された３．２％（乾燥基準のｗ／ｗ）よりも良好で４倍高く、これは連続的な革新的ステップの追加に起因している。最後に、価値ある医薬品および食品化合物カフェイン抽出プロセスは、通常廃棄される使用済みの葉から開発される。
【実施例】
【0022】
以下の実施例は例示として与えられており、したがって本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【0023】
例１
１００ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．０７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。このワックスをＧＣ－ＭＳを用いて評価する。ＧＣ－ＭＳのデータを、ＡＯＣ－２０ｉオートサンプラーおよびＦＦＡＰ１カラムを取り付けたＱＰ２０１０シリーズ（日本、東京都、島津製作所）で測定したところワックスは、エステル、脂肪酸、脂肪アルコール、リン脂質およびポリフェノールを含む結果となった。さらに葉をアルコールに浸漬し、４０℃で１～２時間加熱して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると着色顔料５．０ｇ（５．０％）が得られる。その後乾燥した葉を６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は、０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物を選択的ポリスチレン吸着樹脂（樹脂－Ａ）に通し、これをアルコールで溶出すると、カテキン粉末３．６１ｇ（３．６１％）が得られる。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．０７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
１００ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．０７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。このワックスをＧＣ－ＭＳを用いて評価する。ＧＣ－ＭＳのデータを、ＡＯＣ－２０ｉオートサンプラーおよびＦＦＡＰ１カラムを取り付けたＱＰ２０１０シリーズ（日本、東京都、島津製作所）で測定したところワックスは、エステル、脂肪酸、脂肪アルコール、リン脂質およびポリフェノールを含む結果となった。さらに葉をアルコールに浸漬し、４０℃で１～２時間加熱して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると着色顔料５．０ｇ（５．０％）が得られる。その後乾燥した葉を６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は、０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物を選択的ポリスチレン吸着樹脂（樹脂－Ａ）に通し、これをアルコールで溶出すると、カテキン粉末３．６１ｇ（３．６１％）が得られる。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．０７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
【0024】
例２
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１５ｇ（０．０６％）のワックスを回収した。さらに葉を－１５℃で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると５．８８ｇ（２．３５％）のクロロフィルが得られる。その後乾燥した葉を１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、２つの異なる吸着樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色の粉末が得られ、樹脂Ａからは２．５２ｇ（２．２３％）の収量、樹脂Ｃからは２．１８ｇ（１．９２％）の収量で得られた。カテキンを抽出した後に残った残留／使用済みの葉を、１００℃で１時間、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共にさらに水抽出する。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１５ｇ（０．０６％）のワックスを回収した。さらに葉を－１５℃で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると５．８８ｇ（２．３５％）のクロロフィルが得られる。その後乾燥した葉を１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、２つの異なる吸着樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色の粉末が得られ、樹脂Ａからは２．５２ｇ（２．２３％）の収量、樹脂Ｃからは２．１８ｇ（１．９２％）の収量で得られた。カテキンを抽出した後に残った残留／使用済みの葉を、１００℃で１時間、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共にさらに水抽出する。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
【0025】
例３
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を室温で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると着色顔料８．１３ｇ（３．２５％）が得られる。その後乾燥した葉を、比率１：１０で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色の粉末が得られ、樹脂Ａからは２．２８ｇ（２．０１％）の収量、樹脂Ｃからは１．９７ｇ（１．７４％）の収量が得られた。カテキンを抽出した後に残った残留／使用済みの葉を、１００℃で１時間、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共にさらに水抽出する。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１１ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。このカフェイン（Ｃ１）およびその標準（Ｃ２）のＮＭＲは、ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ（商標）６００ＭＨｚ分光計を用いて行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲピークの比較を両方の試料について行い、データが一致していることが判明し、それによってこれがカフェインであることが確認された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの結果は、１、３、７位の３つのＣＨ３－基および位置番号８に存在する１つのプロトンからのシグナルからなる。１３Ｃ ＮＭＲの結果より、環の２、４、５、６、８位に存在する５－炭素原子および１、３、７位に存在する環の窒素に結合したメチル基の３－炭素原子について８つのシグナルが得られた。スペクトルは以下の通り、１Ｈ ＮＭＲについて４つのシグナル、および１３Ｃ ＮＭＲについて８つのシグナルを与えた：
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を室温で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると着色顔料８．１３ｇ（３．２５％）が得られる。その後乾燥した葉を、比率１：１０で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色の粉末が得られ、樹脂Ａからは２．２８ｇ（２．０１％）の収量、樹脂Ｃからは１．９７ｇ（１．７４％）の収量が得られた。カテキンを抽出した後に残った残留／使用済みの葉を、１００℃で１時間、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共にさらに水抽出する。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１１ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。このカフェイン（Ｃ１）およびその標準（Ｃ２）のＮＭＲは、ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ（商標）６００ＭＨｚ分光計を用いて行った。１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲピークの比較を両方の試料について行い、データが一致していることが判明し、それによってこれがカフェインであることが確認された。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの結果は、１、３、７位の３つのＣＨ３－基および位置番号８に存在する１つのプロトンからのシグナルからなる。１３Ｃ ＮＭＲの結果より、環の２、４、５、６、８位に存在する５－炭素原子および１、３、７位に存在する環の窒素に結合したメチル基の３－炭素原子について８つのシグナルが得られた。スペクトルは以下の通り、１Ｈ ＮＭＲについて４つのシグナル、および１３Ｃ ＮＭＲについて８つのシグナルを与えた：
【0026】
【表1】
【0027】
【表2】
【0028】
ＮＭＲスペクトルにおけるこれらのピークから、この化合物の構造がカフェインであることが予測された。
【0029】
例４
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を４０℃の部屋で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると２１．６６ｇ（８．６％）のクロロフィルが得られる。この着色顔料（クロロフィル）は、島津のＦＴＩＲ－ＩＲ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ－２１ ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１ ＦＴＩＲ－８４００Ｓ Ｓｈｉｍａｄｚｕを用いてＦＴＩＲ分光法により評価される。赤外線透過率のデータは、４０００～５００ｃｍ－１の範囲の波数にわたって収集された。試料のデータを参照と比較して、試料に存在する全ての官能基を特定した。試料の主なピークは、３３４０、２９７０、２９３１、１７５０、１６５０、１４６５、１３７９、１１２８、１１０７、９５０ｃｍ－１に観察される。ＯＨ官能基は、３３４０．７１ｃｍ－１に幅の広いピークをもたらし、そしてこのピークは、ＯＨのピークは３４００～３７００ｃｍ－１に見られると伝えるＦＴＩＲの表に合致している。３０００～２７５０の領域のピークは、アルカン、すなわち化合物に存在するＣＨ３に対応する。さらにカルボニルのピークは、１７４０から１８００の範囲の波数に存在する。芳香族のＣ＝Ｃ結合は、１６００～１４７５ｃｍ－１の間にビーク（ｂｅａｋ）を与え、カルボン酸Ｃ－Ｏは１３００～１０００ｃｍ－１の範囲にピークを与える。脂肪族のアミンは、１３５０～１０００ｃｍ－１にピークを与える。これら全ての範囲はクロロフィルに存在する官能基に対応し、ピークが参照と一致したときこの着色顔料が植物に存在する天然色素であるクロロフィルであると判明した。その後乾燥した葉を１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は、０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色粉末が得られ、樹脂Ａからは収量３．５９ｇ（３．１７％）、樹脂Ｃからは収量１．３２ｇ（１．１６％）で得られた。樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃから得られたカテキン粉末の品質評価は、２７０７オートサンプラー、温度制御モジュールを有する２９９８ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して行われ、樹脂－Ａ粉末の総カテキン含有量は５３～５７％であるが、樹脂－Ｃ粉末では４５～４８％であることが確認された。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を４０℃の部屋で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると２１．６６ｇ（８．６％）のクロロフィルが得られる。この着色顔料（クロロフィル）は、島津のＦＴＩＲ－ＩＲ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ－２１ ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１ ＦＴＩＲ－８４００Ｓ Ｓｈｉｍａｄｚｕを用いてＦＴＩＲ分光法により評価される。赤外線透過率のデータは、４０００～５００ｃｍ－１の範囲の波数にわたって収集された。試料のデータを参照と比較して、試料に存在する全ての官能基を特定した。試料の主なピークは、３３４０、２９７０、２９３１、１７５０、１６５０、１４６５、１３７９、１１２８、１１０７、９５０ｃｍ－１に観察される。ＯＨ官能基は、３３４０．７１ｃｍ－１に幅の広いピークをもたらし、そしてこのピークは、ＯＨのピークは３４００～３７００ｃｍ－１に見られると伝えるＦＴＩＲの表に合致している。３０００～２７５０の領域のピークは、アルカン、すなわち化合物に存在するＣＨ３に対応する。さらにカルボニルのピークは、１７４０から１８００の範囲の波数に存在する。芳香族のＣ＝Ｃ結合は、１６００～１４７５ｃｍ－１の間にビーク（ｂｅａｋ）を与え、カルボン酸Ｃ－Ｏは１３００～１０００ｃｍ－１の範囲にピークを与える。脂肪族のアミンは、１３５０～１０００ｃｍ－１にピークを与える。これら全ての範囲はクロロフィルに存在する官能基に対応し、ピークが参照と一致したときこの着色顔料が植物に存在する天然色素であるクロロフィルであると判明した。その後乾燥した葉を１：１０の比で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は、０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色粉末が得られ、樹脂Ａからは収量３．５９ｇ（３．１７％）、樹脂Ｃからは収量１．３２ｇ（１．１６％）で得られた。樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃから得られたカテキン粉末の品質評価は、２７０７オートサンプラー、温度制御モジュールを有する２９９８ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して行われ、樹脂－Ａ粉末の総カテキン含有量は５３～５７％であるが、樹脂－Ｃ粉末では４５～４８％であることが確認された。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
【0030】
例５
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を４０℃の室温で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると２１．６６ｇ（８．６％）のクロロフィルが得られる。その後乾燥した葉を、比率１：１０で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色粉末が得られ、樹脂Ａからは収量３．５９ｇ（３．１７％）、樹脂Ｃからは収量１．３２ｇ（１．１６％）で得られた。樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃから得られたカテキン粉末の品質評価は、２７０７オートサンプラー、温度制御モジュールを有する２９９８ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して行われ、樹脂－Ａ粉末の総カテキン含有量は５３～５７％であるが、樹脂－Ｃ粉末では４５～４８％であることが確認された。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
２５０ｇの生の緑茶葉を室温で２～３時間アルカン系の溶媒に浸漬し、その後濾液を乾燥させて０．１７ｇ（０．０７％）のワックスを回収した。さらに葉を４０℃の室温で１～２時間アルコールに浸漬して緑色の溶媒を得て、これを乾燥させると２１．６６ｇ（８．６％）のクロロフィルが得られる。その後乾燥した葉を、比率１：１０で、６０℃で３０分間水抽出する。この抽出物は０．１ミクロン細孔径の精密濾過によってさらに精製される。さらにこの抽出物をそれぞれ１リットルの２つの部分に分けて、以下の樹脂の吸着能力を調べる。それぞれ３０分間、１リットルの水抽出物を１００ｍｌの樹脂Ａ（ポリスチレン吸着樹脂）に吸着させ、もう１つの１リットルの抽出物を１００ｍｌの樹脂Ｃに吸着させて、これをアルコールで溶出すると褐色粉末が得られ、樹脂Ａからは収量３．５９ｇ（３．１７％）、樹脂Ｃからは収量１．３２ｇ（１．１６％）で得られた。樹脂－Ａおよび樹脂－Ｃから得られたカテキン粉末の品質評価は、２７０７オートサンプラー、温度制御モジュールを有する２９９８ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して行われ、樹脂－Ａ粉末の総カテキン含有量は５３～５７％であるが、樹脂－Ｃ粉末では４５～４８％であることが確認された。カテキンの抽出後、残留／使用済みの葉は、炭酸ナトリウム（残留葉の重量の１０％）と共に１００℃で１時間、さらに水抽出される。抽出物を冷却し、次いでＤＣＭでその液－液抽出を行い、そこからカフェインを回収した。カフェインを含むこのＤＣＭを乾燥させ、最小限の量のアルコールと加熱することによって精製して、０．１７ｇ（０．０７％）のカフェインを回収した。
【0031】
例６
単離された化合物の同時定量のための方法。
単離された化合物の同時定量のための方法。
【0032】
ワックスの定量分析は、ＧＣ－ＭＳによって行った。ＧＣ－ＭＳのデータは、ＡＯＣ－２０ｉオートサンプラーおよびＦＦＡＰ１カラムを取り付けたＱＰ２０１０シリーズ（日本、東京都、島津製作所）で測定された。ヘリウム（純度９９．９９％）を、全体の流量（ｔｏｔａｌ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）４．８ｍｌ／分、線速度（ｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）３５．２ｃｍ／秒、圧力６９．３ｋＰａ、１．０スキャン／秒のサンプリングレート（ｓａｍｐｌｉｎｇ ｒａｔｅ）におけるスプリット比（ｓｐｌｉｔ ｒａｔｉｏ）１．０、スキャン速度（ｓｃａｎ ｓｐｅｅｄ）：１６６６μ／秒、インターバル（ｉｎｔｅｒｖａｌ）０．５秒で、キャリアガスとして使用した。試料を１ｍｌのＤＣＭ中に１ｍｇとして希釈した（ＨＰＬＣグレード）。オーブンの温度は１２０℃であった。イオン供給源の温度２００℃、インターフェース温度２５０℃、インジェクター温度は２３０℃に維持した。その融点は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｔｈｅｒｍａｌ製のｍ．ｐ．測定機器を使用して測定される。次いで島津のＦＴＩＲ ＩＲ Ｐｒｅｓｔｉｇｅ－２１ ＩＲＡｆｆｉｎｉｔｙ－１ ＦＴＩＲ－８４００Ｓ Ｓｈｉｍａｄｚｕを使用して、緑色着色顔料のさらなる分析を行う。カテキンの定量分析は、２７０７オートサンプラー、温度制御モジュールを有する２９９８ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して行った。粒径４ミクロンの新しいシナジーＭＡＸ ＲＰ Ｃ１２カラム（４．６×２５０ｍｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が使用された。全ての標準のストック溶液を、ＨＰＬＣグレードのメタノール中、１．０μｇ／μｌの濃度で個別に調製した。アセトニトリル（Ａ）および０．０１％トリフルオロ酢酸を含む水（Ｂ）のグラジエント溶媒系を、１．０ｍｌ／分の一定の流量で使用した。グラジエントの条件は以下の通りであった：０分１０％Ａ、３分１５％Ａ、５分２０％、８分２５％Ａ、および１０分３０％Ａ。グラジエントは２０分までに再び１０％溶媒Ａにされた。注入量は１０μｌに維持した。クロマトグラムスペクトルを波長スキャンプログラムによって２００～７００ｎｍで記録し、最終的なデータを各試料および標準について２０５ｎｍで収集した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ２のソフトウェアを用いてデータの解釈を行った。さらに残留／使用済みの茶葉から抽出されたカフェインは、ＮＭＲ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ（商標）６００ＭＨｚ分光計および上記と同じＲＰ－ＨＰＬＣ法を用いて定量される。
【0033】
【表3】
【0034】
本発明の利点
１．この研究は、同一の植物材料から４つの価値のある／商業的に有用な生成物を生成することを可能にする、統合された段階的な方法を提供する。
２．それは生の緑茶葉から、化粧品に利用することができるワックスを抽出するためのプロセスを提供する。
３．それはさらに変換すると油に可溶であり、工業において着色剤として使用することができる、緑色着色化合物が抽出されるプロセスを提供する。
４．この研究は、費用効果が高く、一次化合物、すなわちカテキンの収率を高める方法を提供する。
５．この方法は、経口摂取用のカプセル／錠剤として成形することができる粉末形態のカテキン（抗酸化剤、抗変異原性剤、抗菌剤、抗ウイルス剤であり、糖尿病、がん、心血管疾患、および炎症のような疾患からの保護効果を有する）を提供する。
６．それは緑茶抽出物の形成に使用することができる方法を提供する。
７．それは残留／使用済みの葉を使用してカフェインを抽出することができるプロセスを提供する。
１．この研究は、同一の植物材料から４つの価値のある／商業的に有用な生成物を生成することを可能にする、統合された段階的な方法を提供する。
２．それは生の緑茶葉から、化粧品に利用することができるワックスを抽出するためのプロセスを提供する。
３．それはさらに変換すると油に可溶であり、工業において着色剤として使用することができる、緑色着色化合物が抽出されるプロセスを提供する。
４．この研究は、費用効果が高く、一次化合物、すなわちカテキンの収率を高める方法を提供する。
５．この方法は、経口摂取用のカプセル／錠剤として成形することができる粉末形態のカテキン（抗酸化剤、抗変異原性剤、抗菌剤、抗ウイルス剤であり、糖尿病、がん、心血管疾患、および炎症のような疾患からの保護効果を有する）を提供する。
６．それは緑茶抽出物の形成に使用することができる方法を提供する。
７．それは残留／使用済みの葉を使用してカフェインを抽出することができるプロセスを提供する。
【0035】
参考文献
１．Ａｌｂｅｒｔｏ Ｖａｎ Ｏｌｐｈｅｎ，Ｈｅｒｍａｎ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｎｅｉｌ Ｓｈａｗ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｂｕｒｄａｓｈ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｒｏｇｅｒ，Ｆｌｏｒｉｄａ，２００７．Ｃａｔｅｃｈｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ．
２．Ｌａｕｒｅｎｔ Ｂａｚｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃａｔｅｃｈｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｌｅａｆ．
３．Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｓａｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ Ｕｅｏｋａ，Ｋｅｉｊｉ Ｓｈｉｂａｔａ，Ｔｏｋｙｏ，２０１０．Ｔｅａ Ｅｘｔｒａｃｔ．
４．Ｋｅｎｊｉ Ｓａｉｔｏ，Ｈｉｒａｔｓｕｋａ－ｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，２０１０．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｏｗ ｃａｆｆｅｉｎｅ－ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ．
５．Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｆｕｋｕｄａ，Ｈｉｒｏｋａｚ Ｔａｋａｈａｈａｓｈｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，２０１１．Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｃａｔｅｃｈｉｎ．
６．Ｈａｒｓｈ Ｐｒａｔａｐ Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ａｊａｙ Ｒａｎａ，ＣＳＩＲ－ＩＨＢＴ Ｉｎｄｉａ ２０１３．Ａ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｒｅｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ｂｉｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．
７．Ｑｕａｎ ｖｕｏｎｇ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｄａｎｉｅｌ Ｒｏｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，２０１４．Ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｆｆｅｉｎｅ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ．
８．Ｄｉａｓ Ｉｎｄｒａｓｔｉ，Ｎｕｒｉ ａｎｄ Ａｒｗｕｌａｎ，Ｅｋｏ Ｈａｒｉ Ｐｕｒｎｏｍｏ，ａｎｄ Ｎｕｒ Ｗｕｌａｎｄａｒｉ，Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，２０１８．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｓ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｌｏｒａｎｔ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｓｕｊｉ ｌｅａｖｅｓ．
９．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍａｋｏｔｏ Ｋａｗａｓａｋｉ－ｓｈｉ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０１９．Ｂｅｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃａｔｅｃｈｉｎｓ ａｎｄ ＲｅｂＤ ａｎｄ／ｏｒ ＲｅｂＭ．
１．Ａｌｂｅｒｔｏ Ｖａｎ Ｏｌｐｈｅｎ，Ｈｅｒｍａｎ Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｎｅｉｌ Ｓｈａｗ，Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｂｕｒｄａｓｈ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｒｏｇｅｒ，Ｆｌｏｒｉｄａ，２００７．Ｃａｔｅｃｈｉｎ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ．
２．Ｌａｕｒｅｎｔ Ｂａｚｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃａｔｅｃｈｉｎｓ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ ｌｅａｆ．
３．Ｈｉｔｏｓｈｉ Ｓａｔｏ，Ｈｉｄｅａｋｉ Ｕｅｏｋａ，Ｋｅｉｊｉ Ｓｈｉｂａｔａ，Ｔｏｋｙｏ，２０１０．Ｔｅａ Ｅｘｔｒａｃｔ．
４．Ｋｅｎｊｉ Ｓａｉｔｏ，Ｈｉｒａｔｓｕｋａ－ｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，２０１０．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｌｏｗ ｃａｆｆｅｉｎｅ－ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ．
５．Ｍａｓａｈｉｒｏ Ｆｕｋｕｄａ，Ｈｉｒｏｋａｚ Ｔａｋａｈａｈａｓｈｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，２０１１．Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｅａ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｃａｔｅｃｈｉｎ．
６．Ｈａｒｓｈ Ｐｒａｔａｐ Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ａｊａｙ Ｒａｎａ，ＣＳＩＲ－ＩＨＢＴ Ｉｎｄｉａ ２０１３．Ａ ｓｏｌｖｅｎｔ ｆｒｅｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ｂｉｏ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ．
７．Ｑｕａｎ ｖｕｏｎｇ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｄａｎｉｅｌ Ｒｏｃｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，２０１４．Ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｆｆｅｉｎｅ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｔｅａ．
８．Ｄｉａｓ Ｉｎｄｒａｓｔｉ，Ｎｕｒｉ ａｎｄ Ａｒｗｕｌａｎ，Ｅｋｏ Ｈａｒｉ Ｐｕｒｎｏｍｏ，ａｎｄ Ｎｕｒ Ｗｕｌａｎｄａｒｉ，Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ，２０１８．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｓ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｌｏｒａｎｔ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ ｓｕｊｉ ｌｅａｖｅｓ．
９．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍａｋｏｔｏ Ｋａｗａｓａｋｉ－ｓｈｉ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０１９．Ｂｅｖｅｒａｇｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃａｔｅｃｈｉｎｓ ａｎｄ ＲｅｂＤ ａｎｄ／ｏｒ ＲｅｂＭ．
【図1】
【国際調査報告】