特表 2024-524769 組織モデル培養のための積み重ね式プレート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-07-05

(54)【発明の名称】組織モデル培養のための積み重ね式プレート

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240628BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240628BHJP

   C12M 1/22 20060101ALI20240628BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12M1/00 C

C12M1/22

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523378

(86)(22)【出願日】2022-06-27

(85)【翻訳文提出日】2023-12-26

(86)【国際出願番号】 US2022035041

(87)【国際公開番号】W WO2023278285

(87)【国際公開日】2023-01-05

(31)【優先権主張番号】63/215,892

(32)【優先日】2021-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/215,895

(32)【優先日】2021-06-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523488387

【氏名又は名称】マットテック コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】クラウスナー，ミッチェル

(72)【発明者】

【氏名】アイフニー，セヨウム

(72)【発明者】

【氏名】カーニー，ポール

(72)【発明者】

【氏名】アルメント，アレックス

【テーマコード（参考）】

4B029

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA08

4B029BB11

4B029CC02

4B029CC10

4B029GA03

4B029GA06

4B029GB01

4B029GB02

4B029GB03

4B029GB04

4B029GB05

4B029GB09

(57)【要約】

膜底部を有する積み重ね式マルチウェルプレートなどの積み重ね式組織培養支持体が提供され、これにより、近接している複数の生理学的組織の同時培養が可能になり、高スループット分析のために使用される。生分解性膜が含まれていてもよく、これにより、膜が分解するにつれて、異なる細胞型／生理学的組織間の細胞間の接触が可能になる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

頂部から底部に向かって：
（ａ）頂部カバーと；
（ｂ）複数のウェルを有する培養支持プレートと；
（ｃ）液体リザーバープレートと；を備える、
積み重ね式組織培養支持体であって、
ここで、前記ウェルは、前記頂部で開放しており、
前記ウェルの各々の底部の少なくとも一部が、組織培養細胞の播種に好適である微多孔質生分解性膜を含み、
前記リザーバープレートは、前記培養支持プレートの前記ウェルが、前記リザーバープレートの前記ウェル内に入れ子状に収容されるように構成された個別のウェルを備えるか、または、前記リザーバープレートは、前記培養支持プレートの全てのウェルの底部にある前記膜がアクセス可能である液体を保持するための共通領域を含む、
前記積み重ね式組織培養支持体。

【請求項2】

（ｂ）の前記培養支持プレートの上方及び（ａ）の前記頂部カバーの下方に積み重ねられた１つ以上の追加の培養支持プレートをさらに備える、請求項１に記載の積み重ね式組織培養支持体であって、
前記１つ以上の追加の培養支持プレートは、それぞれ、（ｂ）の前記培養支持プレートと同じ数及び配置のウェルを含み、各追加の培養支持プレートの前記ウェルは、真下にある前記培養支持プレートの前記ウェル内に入れ子状に収容されるように構成され、
各追加培養支持プレートの前記ウェルは、それぞれ、前記頂部で開放しており、各追加の培養支持プレートの前記ウェルのそれぞれの底部の少なくとも一部は、組織培養細胞の播種に好適である微多孔膜を含む、前記積み重ね式組織培養支持体。

【請求項3】

頂部から底部に向かって、
（ａ）頂部カバーと；
（ｂ）２つ以上の積み重ねられた培養支持プレートと；
（ｃ）液体リザーバープレートと、
を備える、積み重ね式組織培養支持体であって、
ここで、前記積み重ねられた培養支持プレートのそれぞれは、積み重ねた他の培養支持プレートのそれぞれと同じ数および配置のウェルを含み、各培養支持プレートの前記ウェルは、真下にある前記培養支持プレートの前記ウェル内に入れ子状に収容されるように構成され、
各培養支持プレートは、複数のウェルを含み、前記ウェルは、前記頂部で開放しており、前記ウェルのそれぞれの底部の少なくとも一部は、組織培養細胞の播種に好適である微多孔膜を含み、
前記リザーバープレートは、前記リザーバープレートの真上にある前記培養支持プレートの前記ウェルが、前記リザーバープレートの前記ウェル内に入れ子状に収容されるように構成された個別のウェルを備えるか、または前記リザーバープレートは、前記リザーバープレートの真上にある前記培養支持プレートの全てのウェルの底部にある前記膜がアクセス可能である液体を保持するための共通領域を含む、前記積み重ね式組織培養支持体。

【請求項4】

前記培養支持プレート（複数可）の各ウェルが、前記ウェルの底部の周りに下部隆起部を有し、前記下部隆起部は、前記プレートを反転させたときに、前記膜の側底部面に細胞を播種するための制限された領域を提供し、それによって、細胞及び培地を含む筐体を提供し、
かつ、前記下部隆起部は、各ウェルの下方に別々に取り付けられるか、または前記下部隆起部は、前記プレートの前記ウェルの下に相互連結されたマトリックスとして提供され、各ウェルの下方には、下部隆起部が取り付けられている、請求項１～３のいずれか１項に記載の積み重ね式組織培養支持体。

【請求項5】

請求項１～３のいずれか１項に記載の培養支持プレートの前記ウェルの形状に適合する開口を有する取り外し可能なプレートであって、
前記開口は、前記培養支持プレートを反転させたときに前記微多孔膜の側底部側に嵌入するように先細り状である穴を含み、先細り状の前記開口は、前記膜の側底部面に細胞を播種するための導管を提供し、かつ細胞及び培地を収容するための筐体を提供し、
前記穴には、前記取り外し可能なプレートの各開口と前記培養支持プレートの対応する微多孔膜との間に密閉をもたらす柔軟なエラストマー材料が取り付けられており、これにより、細胞が前記膜の下面に播種されるときの培地の漏れが防止される、前記プレート。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載の培養支持プレートの前記ウェルの形状に適合する開口を有する取り外し可能なプレートであって、
前記取り外し可能なプレートが反転された培養支持プレートの頂部に配置されているときに、ｏリングが、前記膜の側底部面に細胞を播種するためのガイドを提供し、かつ細胞及び培地を収容するための筐体を提供するように、前記ｏリングが、前記穴に埋め込まれている、前記プレート。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか１項に記載の積み重ね式組織培養支持体であって、培養支持プレートと前記液体リザーバープレート及び／または積み重ねられた培養支持プレートとの間に上昇部をさらに有し、
ここで、前記上昇部は、前記プレートを、所望の高さで分離するのに十分な材料を含み、前記上昇部は、前記培養支持プレート及び前記液体リザーバープレートの外縁の長さに対応する長さを有し、
前記上昇部は、前記プレート間の外縁の外周に沿って伸長し、これにより、前記プレートを所望の高さで分離させる、前記積み重ね式組織培養支持体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月２８日に出願の米国仮特許出願第６３／２１５，８９２号及び２０２１年６月２８日に出願の米国仮特許出願第６３／２１５，８９５号の利益を主張し、これらの両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、生理学的システム間のクロストークを可能にする、相互連結された積み重ね式の複数の二次元または三次元組織培養モデルを共培養するための入れ子式支持プレートに関する。

【背景技術】

【0003】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織モデルシステム、すなわち「組織等価物」は、様々な細胞の型に対する様々な剤の効果を研究するために使用され得る。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの皮膚等価物は、皮膚への適用から生じ得る潜在的な毒性、刺激または炎症について、化粧品または医薬品などの物質の効果または光及び熱などの作用物質の効果を試験するために使用され得る。このような組織モデルシステムにより、ヒト対象を使用したｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルまたは実験と比較して、再現性、試験速度、及びコスト削減の点で、実質的な利点がもたらされる。

【0004】

複数の臓器系が関与する用途、例えば、病態のモデル化または薬物候補のスクリーニングにおいては、ｉｎ ｖｉｖｏ多臓器環境を模倣した系での試験が望ましい。互いに相互作用可能な複数の生理学的システムを含む組織モデルの構築が可能なデバイスが所望されている。

【発明の概要】

【0005】

高スループットのマルチウェル組織培養プレートなど、積み重ね式組織培養支持体のシステムが提供される。本明細書に記載のシステムにより、培養培地を保持するように構成されたウェルの底部にそれぞれ位置する１つ以上の微多孔膜（複数可）が、複数、例えば、２つまたはそれ以上の二次元または三次元の生理学的組織モデル（臓器型またはオルガノイド）、これらに限定されないが、腸－肝免疫細胞、肺－肝免疫細胞、または腸－肝－腎臓などの培養を支持できるようになる。積み重ね式支持体により、生理学的組織系間のクロストーク（細胞間通信／代謝産物のシグナル伝達または交換）が可能になる。本明細書に記載の積み重ね式支持システムは、薬物の安全性及び有効性、ナノ粒子の毒性、線維化などを評価するために使用することができる。本明細書に記載の組織培養適合膜を有する積み重ね式高スループットプレートは、複数の種類の組織モデルを高スループット形式で培養するために使用され得る。

【0006】

いくつかの実施形態では、隆起部が、組織培養支持体のウェルの下面に設けられている。隆起部は、培養培地を保持するように構成されており、膜の下面に成長させるように細胞を播種することができ、細胞の成長のための細胞及び培養培地を保持するために十分に反転させる（逆さにする）。細胞が膜の底面に接着した後、ウェルをひっくり返し（正しい方を上にする）、他の細胞を膜の頂面に播種してもよい。他の実施形態では、エラストマー材料（例えば、これに限定されないが、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）及び適切なショア・デュロメータの熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）など）が取り付けられた穴を有する取り外し可能なシーリングプレート、または埋め込まれたＯリングを有する穴を有する取り外し可能なプレートが、細胞を播種し、組織培養支持体のウェル内の膜の下面（側底部側）に細胞及び培地を収容するためのガイド及び筐体として使用される。これらの実施形態では、細胞／培地混合物は、膜の下面に播種され、次いで、細胞が膜に付着して約２～約２４時間後に除去される。

【0007】

本明細書では、異なる生理学的／病理学的システムに由来する組織／細胞懸濁液、例えば、これらに限定されないが、正常免疫細胞または修飾免疫細胞及びがん細胞などを積み重ね式の相互連結形式で培養するための方法も提供される。

【0008】

本明細書に記載の積み重ね式組織培養支持体システムでは、膜は、（ａ）ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）またはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などの不活性な微多孔質非生分解性膜、（ｂ）生分解性、例えばエレクトロスパンナノファイバー、例えば、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（２－シアノアクリレート）（ＰＣＡ）もしくはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の膜；または（ｃ）コラーゲン、キトサンまたはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）などの生物学的膜であり得る。

【0009】

一態様では、積み重ね式組織培養プラットフォームが提供され、ここで、プラットフォームは、頂部から底部に向かって；（ａ）頂部カバーと、（ｂ）複数のウェルを有する培養支持プレートと、（ｃ）液体リザーバープレートと、を備え、ここで、ウェルは、頂部が開放しており、ウェルの各々の底部の少なくとも一部が、組織培養細胞の播種に好適である微多孔質生分解性膜を含み、リザーバープレートは、培養支持プレートのウェルが、リザーバープレートのウェル内に入れ子状に収容されるように構成された個別のウェルを備えるか、または、リザーバープレートは、培養支持プレートの全てのウェルの底部にある膜がアクセス可能である液体を保持するための共通領域を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、積み重ね式組織培養支持体は、（ｂ）の培養支持プレートの上方及び（ａ）の頂部カバーの下方に積み重ねられた１つ以上の追加の培養支持プレートをさらに備え、１つ以上の追加の培養支持プレートは、それぞれ、（ｂ）の培養支持プレートと同じ数及び配置のウェルを含み、各追加の培養支持プレートのウェルは、真下にある培養支持プレートのウェル内に入れ子状に収容されるように構成され、各追加培養支持プレートのウェルは、それぞれ、頂部が開放しており、各追加の培養支持プレートのウェルのそれぞれの底部の少なくとも一部は、組織培養細胞の播種に好適である微多孔膜を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、積み重ね式組織培養支持体は、頂部から底部に向かって、（ａ）頂部カバーと；（ｂ）２つ以上の積み重ねられた培養支持プレートと；（ｃ）液体リザーバープレートと、を備え、ここで、積み重ねられた培養支持プレートのそれぞれは、積み重ねた他の培養支持プレートのそれぞれと同じ数及び配置のウェルを含み、各培養支持プレートのウェルは、真下にある培養支持プレートのウェル内に入れ子状に収容されるように構成され、各培養支持プレートは、複数のウェルを含み、ウェルは、頂部が開放しており、ウェルのそれぞれの底部の少なくとも一部は、組織培養細胞の播種に好適である微多孔膜を含み、リザーバープレートは、リザーバープレートの真上にある培養支持プレートのウェルが、リザーバープレートのウェル内に入れ子状に収容されるように構成された個別のウェルを備えるか、またはリザーバープレートは、リザーバープレートの真上にある培養支持プレートの全てのウェルの底部にある膜がアクセスできる、液体を保持するための共通領域を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、培養支持プレート（複数可）の各ウェルは、ウェルの底部の周りに下部隆起部を有し、この下部隆起部は、プレートを反転させたときに、膜の側底部面に細胞を播種するための制限された領域を提供し、それによって、細胞及び培地を含む筐体を提供し、かつ、下部隆起部は、各ウェルの下方に別々に取り付けられるか、または下部隆起部は、プレートのウェルの下に相互連結されたマトリックスとして提供され、各ウェルの下方には、下部隆起部が取り付けられている。

【0013】

別の態様では、本明細書に記載の組織培養支持プレートのウェルの形状に適合する開口を有する取り外し可能なプレートが提供され、これらの開口は、培養支持プレートを反転させたときに微多孔膜の側底部側に嵌入するように先細り状である穴を含み、これらの先細り状の開口は、膜の側底部面に細胞を播種するための導管を提供し、細胞及び培地を収容するための筐体を提供し、穴には、取り外し可能なプレートの各開口と培養支持プレートの対応する微多孔膜との間に密閉をもたらす柔軟なエラストマー材料が取り付けられており、これにより、細胞が膜の下面に播種されるときの培地の漏れが防止される。

【0014】

別の態様では、本明細書に記載の組織培養支持プレートのウェルの形状に適合する開口を有する取り外し可能なプレートが提供され、この場合、取り外し可能なプレートが反転された培養支持プレートの頂部に配置されているときに、ｏリングが、膜の側底部面に細胞を播種するためのガイドを提供し、かつ細胞及び培地を収容するための筐体を提供するように、ｏリングは、穴に埋め込まれる。

【0015】

別の態様では、本明細書に記載された積み重ね式組織培養支持体は、培養支持プレートと液体リザーバープレート及び／または積み重ねられた培養支持プレートとの間に上昇部をさらに有し、ここで、上昇部は、プレートを、所望の高さで分離するのに十分な材料を含み、上昇部は、培養支持プレート及び液体リザーバープレートの外縁の長さに対応する長さを有し、上昇部は、プレート間の外縁の外周に沿って伸長し、これにより、プレートを所望の高さで分離させる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】Ａは、０日目（１Ａ）に３７℃でＰＢＳ中に貯蔵後のＰＬＧＡエレクトロスパン膜の生分解を示す。Ｂは、２８日目に３７℃でＰＢＳ中に貯蔵後のＰＬＧＡエレクトロスパン膜の生分解を示す。２８日目までに、サンプルのサイズが大幅に増加し、膜はほぼ透明になった。

【図2】ＰＬＧＡエレクトロスパン膜及び下部隆起部（高さ＝０．９ｍｍ）を含む、製造されたシングルウェルの細胞培養インサート（ＣＣＩ）を示し、これは、膜の下面に細胞を播種するために使用することができる。Ａは、４つのインサートの上面図を示す。Ｂは、１６個のインサートを下面図（反転させたもの）であり、下部隆起部を示す。

【図3】Ａは、コーティングされていないＰＬＧＡ膜で構成されたシングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデル（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色された断面を示す。Ｂは、ＰＥＴ、コラーゲンコーティング膜で構成されたシングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデル（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色された断面を示す。Ｃは、ヒト外植性小腸組織で構成されたシングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデル（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色された断面を示す。

【図4】Ａは、１３日間にわたって、ＰＬＧＡ膜を用いて構築された下部隆起部を有する、シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａ（商標）組織モデル（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色された断面を示す。Ｂは、１７日間にわたって、ＰＬＧＡ膜を用いて構築された下部隆起部を有する、シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデル（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のＨ＆Ｅ染色された断面を示す。

【図5】Ａは、１３日間にわたって、ＰＬＧＡ膜を用いて構築された下部隆起部を有する、シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデルのＨ＆Ｅ染色された断面を示す。Ｂは、２１日間にわたって、ＰＬＧＡ膜を用いて構築された下部隆起部を有する、シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデルのＨ＆Ｅ染色された断面を示す。

【図6】ＰＬＧＡ膜を取り付ける前の、成形された９６ウェル細胞培養インサートプレート（ＣＣＩＰ）を示す。Ａは、ウェルの底部を示す反転図である。Ｂは、上面図である。

【図7】Ａは、ＰＬＧＡ膜（７Ａ）の長方形シート（８２ｘ１２４ｍｍ）を取り付けた後の成形された９６ウェルＣＣＩＰの反転図を示す。Ｂは、ウェル間の過剰膜をトリミング後の成形された９６ウェルＣＣＩＰの反転図を示す。

【図8】Ａは、下部リングのメッシュを取り付けた後の、ＰＬＧＡ膜を有する９６ウェルセルＣＣＩＰの反転図である。Ｂは、下部リング間の相互連結片のトリミング後の、ＰＬＧＡ膜を有する９６ウェルセルＣＩＰの反転図である。

【図9】積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリの例を示す。Ａは、頂部カバーを示す。Ｂは、ウェルの底部に微多孔支持膜９１を有する培養プレートを示す。Ｃは、個々のウェルに液体リザーバーを備えた底部リザーバープレートを示す。Ｄは、培養プレートの全てのウェルによりアクセス可能な共通の液体リザーバーを示す。

【図10】頂部カバー１０１と、入れ子式に収容されたウェルが積み重ねられた２つの培養細胞プレート１０２、１０３と、個々の液体リザーバーウェルを有する底部リザーバープレート１０４とを有する、積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリの一例の断面図を示す。

【図11】積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリにおいて、膜の底部（側底部）側に細胞を播種するための下部隆起部の例を示す。Ａは、個々の隆起部リングを示す。Ｂは、相互連結された下部隆起部リングを示す。Ｃは、相互連結された下部隆起部が取り付けられている反転させた９６ウェルプレートを示す。Ｄは、下部隆起部間の相互連結を外した９６ウェルプレートを示す。

【図12】積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリの一例の断面図を示す。このアセンブリは、頂部カバー１２１と、入れ子式に収容されているウェルが積み重ねられている２つの培養細胞プレート１２２、１２３と、各ウェルの底部（側底部側）の下部隆起部１２５と、各液体リザーバーウェルを有する底部リザーバープレート１２４とを備える。

【図13】積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリのウェル内の膜の底面に細胞を播種するための密閉リングプレートの一例を示す図である。エラストマー材料が、マルチウェル培養プレートのウェルに対応する穴の内側に位置する。Ａは、マルチウェルプレートの各ウェル内の膜の側底部側に接触するように構成されたプレートの上面図である。Ｂは、プレートの下面図であり、膜の下面（側底部側）に細胞を播種するための導管として機能する先細状の穴を示す。Ｃは、穴の内側にエラストマー材料１３２を有する、プレート１３１の断面を示す。反転させた９６ウェル培養プレート１３３は、エラストマー材料にぴったりと嵌合し、反転させたときに９６ウェル培養プレートの膜１３４の下面に細胞を播種することができる。

【図14】積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリのウェル内の膜の底面に細胞を播種するためのＯリングが埋め込まれたプレートの例を示す図である。Ａは、マルチウェルプレートの各ウェル内の膜の側底部側に接触するように構成されたプレートの上面図である。Ｂは、膜の下面（側底部側）に細胞を播種するための筐体を形成する埋め込まれたｏリングを示す断面図である。Ｃは、反転させた９６ウェル培養プレート１４３の頂面に、埋め込まれたＯリング１４２を有するプレート１４１の下面図である。このデバイスによって、反転させたときに９６ウェル培養プレートの膜１４４の下面に細胞を播種することができる。

【図15】底部リザーバープレートとマルチウェル組織培養プレートとの間に嵌合するように構成された上昇部の一例を示す図である。Ａは、リザーバープレートのフランジと組織培養プレートのフランジとの間に嵌合するように構成された「１型」上昇部である。Ｂは、培養プレート１５１と液体リザーバープレート１５３との間の上昇部１５２を示す。

【図16】底部リザーバープレートとマルチウェル組織培養プレートとの間に嵌合するように構成された上昇部の一例を示す図である。Ａは、「２型」上昇部を示し、フランジが延在部に載置されるように構成された上部延在部を有し、上部延在部は、上昇部の側壁の延在部として機能する。Ｂは、培養プレート１６１と液体リザーバー基部プレート１６３との間の上昇部１６２を示す。

【図17】上昇部を有する場合と有しない場合との、積み重ね式マルチウェル培養プレートアセンブリの側面図の比較を示す図である。Ａは、上昇部を有しない場合を示す。Ｂは、１型上昇部を有する場合を示す。Ｃは、２型上昇部を有する場合を示す。

【図18A】実施例７に記載の腸組織モデルを示す。Ａは、上皮層、線維芽細胞層／コラーゲン層、及び内皮層を含む３Ｄ腸組織の異なる層を示す。

【図18B】実施例７に記載の腸組織モデルを示す。Ｂは、腸上皮層に発現する刷子縁のマーカーであるビリンの免疫組織化学的染色を示す。

【図18C】実施例７に記載の腸組織モデルを示す。Ｃは、線維芽細胞のマーカーであるビメンチンの免疫組織化学的染色を示す。

【図18D】実施例７に記載の腸組織モデルを示す。Ｄは、内皮細胞のマーカーであるフォン・ヴィレブランド因子の免疫組織化学的染色を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、組織培養細胞の成長及び複数の細胞型を有する二次元または三次元組織モデルの共培養のための、積み重ね式または入れ子式組織培養支持システムを提供する。高スループット積み重ね式マルチウェルプレートも提供される。積み重ね式プレートは、各ウェルの底部に、生分解性膜等の微多孔膜を含む少なくとも１つの培養支持プレートを含む。いくつかの実施形態では、頂部プレートのウェルは、微多孔膜も含む第２の／中間プレートに嵌合するように構成されている（すなわち、頂部組織培養支持プレートのウェルは、頂部組織培養プレートの下方に位置する第２の組織培養プレートのウェル内に入れ子状に嵌合するように、例えば、ウェル内に嵌合するように先細り状になるように構成されている）。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）の積み重ね式組織培養プレートがそれぞれ、その真下のプレート内に入れ子状に嵌合するウェルを有するように構成されており、各組織培養プレートのウェルは、ウェルの底部に微多孔膜を含む。複数の積み重ね式プレートが利用されている実施形態における組織培養支持プレートのウェルまたは最下部の組織培養支持プレートのウェルは、底部液体リザーバープレートの内部に嵌合するように構成されている。液体リザーバープレートは、個々のウェル内に保持するか、リザーバープレートの真上にある組織培養支持プレートの全てのウェルによりアクセス可能である共通液体リザーバーとして、液体培地を保持するように構成されており、組織培養プレートのウェルの底部と、個々のウェルを含む液体リザーバープレートのウェルの底部、または共通の液体リザーバーを含む液体リザーバープレートの底部との間に空間を有する。

【0018】

いくつかの実施形態では、２つ以上の組織培養支持プレートが含まれ、すぐ下のプレートのウェル内に入れ子式に収容される（積み重ねる）ように構成されたウェルを有し、各プレートのウェルの多孔膜底部間に空間を有し、最下部の組織培養支持プレートのウェルは、底部液体リザーバープレートのウェル内に入れ子式に収容されるように構成され、最下部の組織培養支持プレートのウェルの多孔膜底部と液体リザーバープレートのウェルの底部、個々のウェルを含む液体リザーバープレート、または共通の液体リザーバーを含む液体リザーバープレートの底部との間に空間を有する。また、本明細書に記載の積み重ね式組織培養支持体上で成長させた二次元または三次元の組織モデルも提供される。

【0019】

本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）では、本発明で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施または試験において使用できる。

【0020】

本明細書で提供される数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。ある範囲の値が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在値は、本発明に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含め得、述べられる範囲内で特に除外される任意の制限に従って、本発明の範囲内にも包含される。表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

【0021】

Ｉ．定義
文脈による明確な別段の定めがない限り、「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、１つ以上の細胞への言及を含み、「システム（ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ）」への言及は、当業者に知られている同等のステップ、方法、及びデバイスなどへの言及が含まれる。さらに、本明細書で使用され得る「左」、「右」、「頂部」、「底部」、「前」、「後部」、「側部」、「高さ」、「幅」、「上部」、「下部」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」などの用語は、単に基準点を示すものであり、必ずしも本開示の実施形態を特定の配向または構成に限定するものではないことが理解されるべきである。さらに、「第１」、「第２」、「第３」等の用語は、本明細書に開示された複数の部分、構成要素、ステップ、操作、機能、及び／または参照ポイントのうちの１つを単に識別するものであり、同様に、本開示の実施形態を任意の特定の構成または配向に必ずしも限定するものではない。

【0022】

本明細書及び特許請求の範囲において、本明細書で使用される「及び／または」という句は、そのように結合されている要素（すなわち、ある場合には結合して存在し、他の場合には分離して存在する要素）の「いずれかまたは両方」を意味することを理解するものとする。「及び／または」句によって具体的に識別される要素以外の他の要素が、明確に反対に示されない限り、具体的に識別される要素に関連するか否かにかかわらず、任意により存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンド言語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａを含みＢを含まない（任意により、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂを含みＡを含まない（任意により、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、Ａ及びＢの両方（任意により、他の要素を含む）などを指すことができる。

【0023】

膜の「頂上」表面は、外部、例えば、気相、環境、例えば空気に面する表面であり、例えば、液体培養培地に面する底面とは反対側の膜の頂面である。

【0024】

膜の「側底部」面は、液体培養培地に面する表面、例えば、空気などの外部環境、例えば気相に面する頂面の反対側にある膜の底面である。

【0025】

「生分解性」とは、天然または合成由来であり、かつｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、酵素または非酵素のいずれかまたは両方で分解されて、生体適合性で毒性的に安全であり、副生成物を生成する生体材料を指し、これらは、細胞の通常の代謝経路によってさらに排除される（例えば、Ｍａｋａｄｉａ ＨＫ，Ｓｉｅｇｅｌ ＳＪ．Ｐｏｌｙ Ｌａｃｔｉｃ－ｃｏ－Ｇｌｙｃｏｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）ａｓ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｃａｒｒｉｅｒ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１１；３（３）：１３７７－１３９７．ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｏｌｙｍ３０３１３７７）。

【0026】

本明細書で使用される場合、「共培養」という用語及びその変形は、一般に（必須ではないが）気液界面において互いに直接的または間接的に接触している２つ以上の細胞型または臓器系の成長及び／または分化を明示するために使用される。

【0027】

本明細書では、「分化培地」という用語は、気液界面においてまたは深部培養（例えば、スフェロイド、オルガノイド）において、細胞の成長に使用される培地、例えば、培養培地を指すのに使用される。この培地の目的は、細胞を誘導して、構築、分化、及び分極させて、構造及び機能においてｉｎ ｖｉｖｏ組織を模倣する三次元ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織を再生させることである。分化培地はまた、組織を長期間にわたり分化状態に維持するのに使用され得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「腸組織培養モデル」または「腸組織等価物」は、ヒトの初代または非初代ヒト上皮細胞と、線維芽細胞及び任意により免疫細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞）とから構成されているヒト腸組織モデルを指す。腸細胞という用語には、エンテロサイト、パネート細胞、杯細胞及び腸管内分泌細胞が含まれる。

【0029】

特に明記しない限り、本明細書で使用される「培地」という用語は、血清含有培地及び無血清培地の両方を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「微多孔」膜とは、開放形態の孔径、例えば、正確に制御された孔径、典型的には、直径（例えば、平均孔直径）０．０３μｍ（マイクロメートル）～１０μｍまたは約０．４μｍ～約８μｍの範囲の孔径を有する薄壁構造である膜を指す。孔は、膜を通る材料を選択的に継代させることができる直線チャネル孔または蛇行経路孔であり得る。膜の形状に関しては、典型的には、３種類の微多孔膜：フラットシート、中空繊維、及び管状膜が使用される。いくつかの実施形態では、微多孔膜は、フラットシート形状を含む。他の実施形態では、膜は、中空繊維または管状形状を含む。いくつかの実施形態では、微多孔膜（例えば、ＰＥＴまたはＰＣ）は、直線チャネル孔を有する。他の実施形態では、微多孔膜は、蛇行経路孔（例えば、ＰＴＦＥ）を含む。

【0031】

本明細書では、「増殖培地」または「成長培地」という用語は、深部培養において細胞を成長させるために使用される培地、例えば培養培地を指すために使用される。本明細書で使用される用語増殖培地または成長培地は、深部培養における細胞の分化を誘導または支持する補充物を含んでも含まなくてもよく、したがって、この用語の使用は、いずれのレベルの細胞の分化もない細胞の増殖に使用することに制限されない。

【0032】

本明細書で使用される場合、「呼吸組織培養モデル」、「呼吸組織等価物」、「肺胞または気道組織培養モデル」または「肺胞または気道組織等価物」は、互換的に使用され、線維芽細胞、及び任意により免疫細胞（例えばマクロファージ）と共に、初代または非初代ヒト上皮細胞から構成されるヒト気管もしくは気管支の気道または肺胞組織モデルを指す。肺胞細胞という用語は、２つのサブタイプの肺胞上皮細胞（肺細胞）：Ｉ型（主流）及びＩＩ型肺胞細胞を含む。Ｉ型肺胞細胞は、典型的には肺と血液との間のガス交換プロセスに関与する極めて薄い扁平細胞である。呼吸器組織培養モデルは、サイトケラチンについて陽性に染色する初代ヒト鼻上皮細胞（ＨＮＥｐＣ）などの鼻細胞を含むことができる。ＨＮＥｐＣ細胞は、粘液を産生することができ、上皮細胞の毛様体運動によって、典型的には咽頭に輸送され得る粒子を結合する。ＨＮＥｐＣは、これらのプロセスのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に有用である。

【0033】

本明細書で使用される場合、「隆起」または「下部隆起部」という用語は、支持体が直立（反転していない）位置にあるときに、培地リザーバーに面する膜の側で、本明細書に記載の組織培養支持体のウェルの底部から突出し、かつウェルの底部を取り囲む、すなわち、多孔支持膜を取り囲む、例えば、支持膜の外周を取り囲む、構造の持ち上がっている部分（例えば、持ち上がっている最上部）を指す。

【0034】

「無血清培地」とは、血清またはその分画部分を含まない培養培地を指す。無血清培地の全ての成分及び量は、それらの化学組成に関して、従来技術の組織培養基準によって規定されており、かつ比較的純粋である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「組織培養モデル」、「組織培養等価物」または「組織等価物」とは、細胞を成長させ、周囲の細胞外骨格と三次元で相互作用して、臓器様構造を作製することが可能になる組織培養容器内で細胞を成長させることによって再生された、十分に分化及び分極された組織を指す。これは、プレート上の平坦な単層内で細胞が成長する、従来の二次元細胞培養とは対照的である。

【0036】

ＩＩ．入れ子式組織培養支持体
Ａ．積み重ね式支持体
二次元または三次元組織モデルなど、組織培養の成長のための積み重ね式または入れ子式組織培養支持デバイスが提供される。積み重ね式支持デバイスは、（ａ）頂部カバーと；（ｂ）組織培養細胞を成長させるための第１のウェルと；任意により同じく微多孔膜を含む第２／中間ウェルと；（ｃ）液体、例えば液体組織培養分化培地または成長培地を保持するように構成された底部液体リザーバーと、を備え、ここで、第１のウェルの底部の少なくとも一部は、微多孔性の、例えば生分解性膜材料によって形成されており、かつ第１のウェルの頂部は開放しており；第１のウェルは、第１のウェルの膜底部と第２のウェルの膜底部との間に空間を有して、第２のウェルの内側に嵌入することができ、液体リザーバーは、組織培養支持ウェルの底部に、微多孔膜材料の下に位置する底部を有する。液体リザーバーは、第１のウェルまたは任意により第２のウェルが中に入れ子状に収まり、組織培養支持ウェルの底部とリザーバーの底部との間に空間を有するように構成されたウェル（例えば、図９Ｃ）を含むことができるか、または組織培養支持ウェルよりも大きい寸法を有し、かつ組織培養支持ウェル中に積み重ね状（入れ子状）に構成されていないプレート（例えば、図９Ｄ）とすることができる。いくつかの実施形態では、第１のウェルは、第２のウェル内に入れ子状に収容されるように、すなわち、その中に嵌入し、第１のウェルの膜底部と第２のウェルとの間に空間を有するように構成され、これにより、第１のウェルは、第１の組織モデルまたは臓器モデルを保持することができ、任意により、第２のウェルは、第２の組織モデルまたは臓器モデルを深部状態で保持することができ、第１ウェル、または存在する場合は第２ウェルは、液体または「リンパ節」などの三次臓器モデルを含む底部ウェルまたはプレートに嵌入し、液体リザーバーとしても機能するようになる。特定の実施形態では、１つ以上の追加の積み重ね式ウェル（例えば、第３、第４など）を含めてもよい。

【0037】

各ウェルは、真下に、入れ子状のウェルの底部の間に所望の空間を有する、例えば、所望の量の液体及び／または培養細胞をウェルの底部間の空間に保持できるように構成された、ウェル内に嵌入するように先細り状にさせ得る。代替的または付加的に、ウェル間に空間を設けて、底部液体リザーバープレートの真下のウェルの上の所望の高さで、または底部液体リザーバープレート上の所望の高さでウェルを支持してもよい。例えば、所望の高さの外周リングを使用して、ウェルの膜底部と、ウェルと底部液体リザーバープレートの真下またはその間にあるウェルの底部との間を分離して、空間を設けてもよい。

【0038】

いくつかの実施形態では、２つ以上の積み重ね式組織培養支持体が提供される。例えば、２つの組織培養ウェルを互いの頂部に積み重ねてもよく、それぞれのウェルは、微多孔膜の底部を有する。組織培養支持ウェルが積み重ねられ、そのそれぞれが、真下のウェルの内部に入れ子式に収容され、積み重ねた各ウェルの底部の間に空間を有し、最下部の組織培養支持ウェルは、底部液体リザーバーウェルの内側に積み重ねられ、入れ子式に収容され、最下部の組織培養支持ウェルの底部と液体リザーバーウェルの底部との間に空間を有するか、または最下部の組織培養サポートウェルが、液体リザーバープレート内にあり、最下部の組織培養サポートウェルの底部と液体リザーバープレートの底部との間に空間を有する。

【0039】

いくつかの実施形態では、生分解性膜は、組織培養支持ウェルの底部に設けられる。異なる細胞型を、組織培養支持ウェルの生分解性膜の頂部及び底部に、及び／または積み重ねている複数の組織培養支持ウェルの異なる膜上に播種してもよい。生分解性膜により、複数の細胞型を有する組織モデルの臓器内で、または積み重ねた異なるウェル内の臓器間で、細胞と細胞とが接触し、生理学的システム間での細胞間のコミュニケーションが可能になる。

【0040】

ウェルの側部（及びマルチウェルプレートの実施形態ではウェル間の材料）は、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、コポリエステル、ポリプロピレン、または他の生体適合性プラスチックから構築させ得る。

【0041】

典型的には、本明細書に記載のとおり、積み重ね式組織培養デバイスは、頂部カバーまたはプレートの蓋を備える。

【0042】

Ｂ．支持膜
多孔性基材または支持膜により、発育中の組織の下から培地を継代できるようにする必要がある。支持体の多孔性は、培地の継代が可能になるように十分なサイズである必要があり、かつ当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、孔径（平均直径）は、約０．４μｍ～約１０μｍである。

【0043】

支持膜は、不活性（例えば、非生分解性）材料、例えばポリカーボネート、ＰＥＴ、もしくはポリテトラフルオロエチレン、生分解性材料（例えば、エレクトロスパンナノファイバー材料）、例えばＰＬＧＡ、ＰＣＡ、もしくはＰＣＬ、または生物学的材料、例えばコラーゲン、キトサン、またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）またはそれらの組み合わせから構成され得る。

【0044】

いくつかの実施形態では、多孔性基材は、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、または他の培養適合性の多孔性膜、例えば、細胞を培養することができる底部に取り付けられたコラーゲン、湿潤性フルオロポリマー、セルロース、ガラス繊維もしくはナイロン製の膜など、の膜状基材であり得る。他の好適な支持体の例としては、これらに限定されないが、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲンゲル、混合物または格子、ｉｎ ｖｉｖｏ由来結合組織、混合コラーゲン線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス線維芽細胞格子、プラスチック及びコラーゲンスポンジが挙げられる（米国特許第６，０５１，４２５号）。

【0045】

Ｃ．下部隆起部
いくつかの実施形態では、ウェルの底部及び膜の底部の周囲に、下部隆起部、例えば、格納インサートまたはリングが設けられ、これは、膜の底面上に細胞を播種することができる容量を提供するように構成されている。支持デバイスを反転させて、膜の底面へ細胞を播種できるようにし、次いで正しい方を上にして膜の頂面へ細胞を播種できるようにする。下部隆起部の例を、図１２及び図１３に示す。

【0046】

いくつかの実施形態では、下部隆起部は、ウェルの底部（ウェル底部と実質的に同じ形状及び寸法）に嵌入するようなサイズにされたリングまたは他の形状として、３Ｄ印刷または別の手法で構築され、次いで膜の底面側に、例えばウェル頂部開口に面する膜側とは反対の膜側に固定される。

【0047】

下部隆起部は、例えば、高さが約０．４ｍｍ～約２．５ｍｍまたは約０．９ｍｍであり得る。

【0048】

下部隆起部は、例えば、ＰＥＴ、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）または他の押出可能もしくは３Ｄ印刷可能なポリマー材料から構築されていてもよい。

【0049】

Ｄ．取り外し可能なプレート
いくつかの実施形態では、取り外し可能なプレートは、微多孔膜の下面（側底部側）に細胞を播種するための、及び本明細書に記載された積み重ね式組織培養支持体における膜の側底部側に細胞及び培地を収容するためのガイドとして使用される。取り外し可能なプレートは、開口を含み、この開口は、先細り状になっており、これにより、本明細書に記載のとおり、反転型積み重ね式組織培養支持体のウェルの底部において、微多孔膜の形状及び寸法と、実質的に同じ形状及び寸法であるかそれらを上回る、または小さい寸法となるように、開口部の底部が適合するようになる。先細り状の開口は、組織培養支持ウェルを反転させたときに、微多孔膜の底面に細胞及び培地を導入するための導管として使用され得る。膜の反転された底部と接触する開口は、細胞及び培地を収容するための筐体を提供する要素を含み得る。膜の下面に細胞を播種するための取り外し可能なプレートの例を図１４Ａ～１４Ｃ、図１５Ａ～１５Ｃに示す。

【0050】

一実施形態では、取り外し可能なプレートの開口部には、取り外し可能なプレートの開口部と微多孔膜との間に緊密な接触または密閉を提供する柔軟性のエラストマー材料が取り付けられており、それによって膜の下面に細胞を播種する際の液体培地の漏出を防止する。

【0051】

別の実施形態では、取り外し可能なプレートにおける開口は、微多孔膜と実質的に同じレベルである埋め込まれたｏリングを含む。Ｏリングは、細胞の播種のためのガイド、ならびに細胞及び培地を収容する筐体となる。

【0052】

Ｅ．高スループットデバイス
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の積み重ね式組織培養支持体は、例えば、高スループット分析のために、複数の入れ子ウェル（例えば、マルチウェルプレート）で構成されている。例えば、マルチウェルプレートは、６個、１２個、２４個、４８個、９６個または３８４個の入れ子式に収容されたウェルのいずれかを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、各ウェルは、本明細書に記載のとおり、下部隆起部を含む。

【0053】

例えば、マルチウェル高スループット形式を使用して、生理学的組織モデルにおいて、薬物の安全性及び／または有効性、環境毒性、疾患治療、臓器間相互作用、または２つ以上の臓器系が関与する炎症の試験を行うことができる。

【0054】

Ｆ．上昇部
いくつかの実施形態では、培養支持体の間及び／または培養支持体と底部液体リザーバーとの間に上昇部が設けられる。上昇部の例は、図１５Ａ～１５Ｂ及び図１６Ａ～１６Ｂに示す。上昇部は、マルチウェルプレート間に空間を提供するための、周囲に嵌合しかつその支持を提供する外周リングの形態であってもよい。例えば、図１５Ａ～１５Ｂに示されているとおり、上昇部は、２つのマルチウェルプレートの周囲のフランジ（複数可）間に、及び／またはマルチウェルプレートと液体リザーバープレートとの間に嵌合し得る。プレート間に付加的な空間を創出するために、図１６Ａ～１６Ｂに示したとおり、付加的な上側延在部が設けられてよく、これは、延在部に上部プレートのフランジが載置されるように構成されている。

【0055】

ＩＩＩ．三次元組織モデル
本明細書に記載の積み重ね式組織培養支持体上に組織培養細胞を播種及び成長させるための方法が提供され、これにより、積み重ね式支持体内の１つ以上の微多孔培養支持膜（複数可）上に二次元及び／または三次元組織等価物を生成する。いくつかの実施形態では、複数の細胞型が生分解性膜（複数可）上に播種され、膜（複数可）が分解するにつれて、生理学的システムが互いに接触する。本明細書に記載されているとおり、積み重ね式組織培養支持体において成長した組織等価物も提供される。

【0056】

Ａ．細胞
一実施形態では、本明細書に記載の組織培養支持体上に播種して成長させた細胞は、本明細書において初代細胞と称されるｉｎ ｖｉｖｏ組織から直接誘導される。細胞は、培養中に継代した初代細胞であってもよく、本明細書では、継代初代細胞と称する。継代した初代細胞は、好ましくは、最初に単離した初代細胞と区別がつかないままであり、成長パラメータ及び阻害、細胞表面マーカー、生化学的応答及び培養における有限の寿命など、本来の特徴を維持する。当業者は、悪性組織に由来する初代細胞が、成長阻害の特性または有限の寿命の特徴を有し得ないことを認識するであろう。

【0057】

初代細胞は、正常組織または病理学的組織のいずれかから得ることができる。病理学的組織としては、これらに限定されないが、存在する細胞型のうちの１つ以上が病原体に感染している組織、臨床的に定義された疾患状態を有するドナーに由来し、正常な細胞と比較して異常を呈する細胞、または後天性もしくは遺伝性の遺伝的欠陥を有する、または何らかの他の形式で疾患である細胞が挙げられる。

【0058】

初代細胞または継代された初代細胞の使用に代わるものは、不死化または形質転換された細胞の使用である。当該技術分野で知られているように、不死化細胞は、老化を受けることなく細胞培養で多回継代が可能であることを特徴とする。形質転換細胞は、不死化の特徴を共有し、さらに接触阻害を受けない。当業者であれば、不死化細胞は、必ずしも形質転換細胞ではないことが認識されるであろう。当該技術分野で公知のとおり、形質転換されていない非不死化細胞は、細胞培養において、有限の数の継代のみを受けることができ、その最後に細胞は、老化を受け、これは、生存能力の損失として特徴付けられ、培養において、細胞を伝播させる能力の完全な損失となる。初代細胞、継代細胞、形質転換細胞及び不死化細胞の任意の組み合わせを使用して、組織等価物を生成することができる。

【0059】

いくつかの実施形態では、提供される細胞は、最初に初代細胞として単離され、その後、播種の前に、培養中、所望の表現型に分化させられる。例えば、このアプローチは、組織等価物の産生に使用するための免疫細胞の生成に特に有用であり得る。

【0060】

本明細書に記載の組織培養支持体上の組織等価物の産生に使用され得る細胞の非限定的な例としては、上皮（例えば、腸または気道（例えば、肺胞））細胞、線維芽細胞及び免疫細胞（例えば、マクロファージ）ならびにそれらの共培養が挙げられる。

【0061】

Ｂ．播種
細胞は、気液界面で培養に適した条件下で播種する。これには、気液界面での細胞の成長を促す支持体上へ細胞を播種することを含む。支持体の１つの要件は、下方から細胞へと培地が継代できるのに十分な多孔性であることである。

【0062】

気液界面で培養する前に行われる播種は、標準方法で行う。これには一般に、所望の比及び量の細胞を液体培地中に懸濁させること、及び細胞含有培地を支持体に沈着させることを含み。本明細書に記載のとおり、細胞は、ウェル内に沈着させ得るか、または下部隆起部を有する反転したウェルに沈着させ得る。細胞は、ウェルの底部または反転させたウェルの多孔性支持膜上に沈降する。播種後の支持膜上への細胞の沈降は、典型的には重力によるものであり、数分から数時間要する。当業者は、細胞を支持体上に沈着させる任意の数の他の方法を考案することができ、これらは全て、本明細書の開示に包含されることが意図されている。一実施形態では、播種される細胞の量（数）は、約１ｘ１０^３～約１ｘ１０^７細胞／ｃｍ^２である。別の実施形態では、細胞の量（数）は、約１ｘ１０^５～約１ｘ１０^６細胞／ｃｍ^２である。

【0063】

細胞が沈着されると、支持体は、播種された細胞を気液界面まで上昇させながら、培養培地が培養物の下面にアクセスできるように構成される。

【0064】

多孔性支持体への細胞の播種後のあらゆる中間時点で、さらなる細胞を、支持体に、または支持体上に既に存在する成長／分化細胞のいずれか上にさらに播種してもよい。例えば、気液界面で培養または共培養中に、分化組織培養上に添加する細胞を含む培地を上から少量添加することにより、さらなる播種を行ってもよい。一実施形態では、免疫細胞は、分化組織培養物に添加される。

【0065】

多孔性支持体に播種する前に、細胞を操作してもよい。一実施形態では、線維芽細胞は、多孔性支持体に播種する前に操作される。

【0066】

一実施形態では、細胞、例えば上皮細胞は、多孔性支持体への播種の前に、細胞の増殖に適した条件下で、成長培地中にさらに深部培養される。この培養期間の間、それらは、分化に適した条件下で任意に深部培養され得る。

【0067】

細胞は、任意により、多孔性支持体の下面に、すなわち、支持デバイスが上向きの構成である場合に液体培地に面する支持膜の側に播種され、次いで、多孔性支持体の頂面に播種する前に反転され得る。インサートを上下反転させ、細胞を多孔性支持体の下面に播種してもよい。いくつかの実施形態では、多孔性支持膜の下面に播種する前に細胞を操作する。一実施形態では、細胞は、細胞成長培地に懸濁され、膜の下面に添加され、膜に付着することができ、これは典型的には約１～約２４時間を要する。細胞を培養するために添加される培地の容量は、約２０ｍｌ～約５００ｍｌであってよい。この培養期間の間、細胞は、任意により、特定の細胞型、例えば内皮細胞に適した条件で、深部培養してもよい。

【0068】

Ｃ．気液界面での培養
支持体上に播種した後、分化した組織等価物への分化に適した条件下で、培養のために細胞を気液界面まで上昇させる。気液界面で細胞を増殖及び分化させる方法は、当技術分野において周知である。培養物は、例えば標準的な組織培養インキュベータ中、標準条件下でインキュベートすることができる。組織等価物への分化に適した条件としては、培養物をインキュベートする温度及び大気の内容物、培地含量、及び任意により、発育中の組織への追加の細胞のさらなる播種が挙げられる。典型的には、温度及び大気条件は、約５％ＣＯ_２中で約３７℃であるが、わずかな変動は許容され得る。

【0069】

気液界面での培養期間は、約１～約１２０日に及び得るが、場合によってはより長い期間が許容可能であり得る。気液界面共培養の典型的な期間は、約４～約１４日である。

【0070】

使用される培地の量は、いかなる上限なく、約０．１ｍｌ／ｃｍ^２ほど少なくし得る。いくつかの実施形態では、約２．０～約１０．０ｍｌ／ｃｍ^２の培地が、１日おきに、発育中の組織等価物に供給される。気液界面で成長させるためのフロースルー供給を用いることもできる。フロースルー供給速度は、培養組織１ｃｍ^２あたり０．０５ｍｌ／日、または培養組織１ｃｍ^２あたり約１．０ｍｌ／日～約５．０ｍｌ／日少なくすることができる。

【0071】

Ｄ．培養培地
本発明の組織等価物への細胞の増殖及び分化に使用される培地は、最終的な組織等価産物の特性に影響を及ぼす。

【0072】

当該技術分野で公知の様々な細胞培養培地は、細胞の分化培地培養として使用、すなわち、気液界面での１つの細胞型の培養または複数の細胞型の共培養に好適であり、その測定は、当業者の平均的な能力のうちの１つ内である。いくつかの実施形態では、分化培地は、レチノイド、例えばレチノイン酸、レチノール、酢酸レチニル、１３－シスレチノイン酸、または９－シスレチノイン酸を含む。一実施形態では、培地は、約１０^－５～約１０^－１３Ｍのレチノイド（例えば、約５ｘ１０^－１０Ｍのレチノイン酸などのレチノイド）を含む。いくつかの実施形態では、レチノイドの濃度は、共培養の期間にわたって漸増的に低下してよい。例えば、レチノイン酸のレベルは、気液界面培養期間の経過にわたって、約５ｘ１０^－９Ｍ～約５ｘ１０^－１３Ｍまで低下され得る。

【0073】

いくつかの実施形態では、分化培地は、以下の補充物のうちの１つ以上を含む：アデニン、β－線維芽細胞成長因子、ウシ下垂体抽出物、ウシ血清アルブミン、塩化カルシウム、ウシ血清、カルニチン、コレラ毒素、アデノシン一リン酸、エンドセリン－１、ＥＧＦ（上皮成長因子）、エピネフリン、エストラジオール、エストロゲン、エタノールアミン、ウシ胎児血清、ＦＬＴ－３（Ｆｍｓ様キナーゼ３）、グルカゴン、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ウマ血清、ヒト血清、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子２、イソプロテレノール、ケラチノサイト成長因子、リノール酸、新生児ウシ血清、ノル－エピネフリン、オレイン酸、パルミチン酸、ホスホエタノールアミン、プロゲステロン、幹細胞因子、トランスフェリン、形質転換成長因子－β１、トリイドチロニン、腫瘍壊死因子α、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、及びビタミンＥ。

【0074】

一実施形態では、分化培地は、以下を含む：ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）及びハムＦ１２培地を、３：１～１：１などの比率で、約１０％のウシ胎児血清、約１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子、約０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、約１ｘ１０^－６Ｍイソプロテレノール、約５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、約２ｘ１０^－９Ｍトリヨードチロニン、約１．８ｘ１０^－４Ｍアデニン、約５μｇ／ｍｌインスリン、約１ｘ１０^－６Ｍレチノイン酸。

【0075】

別の実施形態では、分化培地は、無血清である。無血清培地は、当該技術分野で公知の塩基性培地または成分（例えば、ＤＭＥＭ、ＬＨＣ９（＼Ｐａｒｔ ＃１２６８００１３，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）、ハムＦ１２培地、ＭＥＭ（改変必須培地）、マッコイ５Ａ培地、ＭＣＤＢ１５３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ１５３培地）ＫＧＭ（角化細胞増殖培地、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）ＥｐｉＬｉｆｅ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、または（正常ヒト気道上皮細胞増殖培地ＮＨＢＥ－ＧＭ）を使用して作製され得る。一実施形態では、無血清培地は、ＤＭＥＭ：Ｆ１２の約３：１比であり、レチノイン酸などの付加的な定義された（非血清）成分、または本明細書に記載の任意の他の定義された成分のいずれかを補充する。

【0076】

一実施形態では、無血清分化培地は、約３：１比のＤＭＥＭ：Ｆ１２、約５ｘ１０^－１０Ｍのレチノイン酸、約０．３ｎｇ／ｍｌの角化細胞成長因子、約５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、約０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、及び約５μｇ／ｍｌのインスリンを含む。別の実施形態では、無血清分化培地は、レチノイン酸（ＲＡ）を含むＤＭＥＭ：Ｆ１２（約３：１比）、約５ｘ１０^－９Ｍ、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）、約０．１ｎＭ、約０．４μｇ／ｍｌ ヒドロコルチゾン、約５μｇ／ｍｌインスリン、ＳＣＦ（約２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（約２０Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ－α（約０．２５ｎｇ／ｍｌ）、及びＦＬＴ－３（約２ｎｇ／ｍｌ）である。

【0077】

当技術分野で知られている様々な細胞培養培地は、深部培地中での細胞の培養または共培養のための成長培地としての使用に好適である。そのような培地の例としては、これらに限定されないが、ＤＭＥＭ、ＮＨＢＥ－ＧＭ、ＳＦＥＭ（無血清膨張培地）、ＭＥＭ、培地１９９、ＫＧＭ、ＥｐｉＬｉｆｅ、ＭＣＤＢ１５３及びマッコイ５Ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、深部培地中の細胞の培養または共培養のための成長培地は、血清を含まない。使用することができる無血清成長培地の一例は、ＳＣＦ（約２５ｎｇ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（約２００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ－α（約２．５ｎｇ／ｍｌ）及びＦＬＴ－３（約２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＮＨＢＥ－ＧＭである。

【0078】

成長培地または分化培地として使用するための本明細書に記載の定義された培地成分または補充物の有用な濃度及び組合せの決定は、追加の補充物または培地成分の特定と同様に、わずかに日常的な実験よりも平均的な当業者の能力の範囲内である。

【0079】

実施例
以下の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、これに限定されない。

【0080】

実施例１．組織培養モデルで使用するための生分解性膜の生成
エレクトロスピニングは、電気力を使用して、ポリマー溶液またはポリマー溶融物の荷電糸を数百ナノメートル桁の繊維直径まで引き出す繊維の製造方法である。エレクトロスパンポリ（乳酸－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）膜を、１μｍ未満の孔径及び１０μｍ未満の厚さを有し、かつ２～６週間以内で生分解性となるように製造した。膜厚及び平均孔径は、それぞれ９．３３μｍ及び０．７３μｍであると決定された。膜の生分解性を特徴付け、重量及び引張強度の測定によって決定されるように、２１～２８日で膜の生分解が起こると決定した。

【0081】

簡潔に言えば、生分解実験は、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ；ＡＳＴＭ）の試験法Ｆ１６３５－１１１、表題：Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｓｉｎｓ ａｎｄ Ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｆｏｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓに準拠して設計した。膜の引張特性を評価することにより、膜の生分解を観測した。

【0082】

使用した試験プロトコルの概要は、以下のとおりである：

【0083】

１．ＰＬＧＡエレクトロスパンサンプルを長方形片（約１２ｍｍｘ５９ｍｍ）に切断し、引張強度実験に使用されるクランプに取り付ける。クランプ間のサンプルの初期長さ（Ｌ_ｏ）及びサンプルの幅を、デジタルキャリパーを使用して±０．５ｍｍまで測定する。

【0084】

２．引張強度測定は、内部で展開させた引張強度計を使用して行う。サンプルを一定速度１７．８ｍｍ／分で引っ張り、その力測定を０．２３７秒毎に行う（２５２回／分の測定）。

【0085】

３．引張強度測定を、元の（生分解の前の）膜サンプル（ｎ＝４、時間＝０日）に対して行い、次いで、追加の長方形の試験サンプルを、生理学的溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４±０．２）中に完全に浸漬し、３７±２℃で貯蔵する。

【0086】

４．ＰＢＳ溶液中で７日、１４日、２１日、２８日、及び３５日の生分解後、長方形の膜サンプル（ｎ＝４）を除去する。各期間で、サンプルを除去し、十分な蒸留水で穏やかに洗い流して、膜サンプルの表面上の残留生理食塩水（ＰＢＳ）を除去する。

【0087】

５．サンプルを室温で４８時間乾燥させて、その後、サンプルを適所にクランプし、引張測定を行う。

【0088】

実施例２エレクトロスパンＰＬＧＡ生分解性膜の生分解プロファイル
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目の生分解データを収集した。２８日目のサンプルが、正確な引張強度測定を行うことができない点まで分解されたため、実験は、２８日目に終了した。

【0089】

引張強度実験では、破断時のひずみは、２週間の生分解後に元のサンプルの約２５％まで減少し、２１日目に同様にそのままであった。すなわち、１４日目及び２１日目のＰＬＧＡ膜は、（破断前に）元のサンプルよりもかなり小さく伸張させることができた。加えて、膜材料は、３週間の期間にわたって、破断がより困難（引張強度の増加）になり、可撓性が低くなった（ヤング率の増加）。２８日目に、膜サンプルは、４つのサンプルのうちの１つのみが、引張強度測定のために、取り付けられ得る程度まで分解した。他のサンプルは、２つのクランプの間に取り付ける間に離れるかまたは割れた（その脆弱な外観のために特に注意していたにもかかわらず）。この１つのサンプルの引張強度、破断時の最大歪み、及びヤング率は、それぞれ元の（分解していない）膜の１６．５％、１５．１％及び１８．０％まで低下した。したがって、２８日目のサンプルは、サンプルの何らかの物理的処理のためにそれらを離れさせる時点まで分解していた。したがって、ＰＬＧＡ膜は、３７℃において、ＰＢＳ中、２１～２８日の間に分解したようであった。

【0090】

実施例３．ＰＬＧＡ膜及び下部隆起部を有するシングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）の産生
シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）は、ＰＬＧＡエレクトロスパン膜を用いて産生され、膜の下面に細胞を播種するための下部隆起部を含めた。上面図は、図２Ａに示し、下面図は、ＣＣＩを反転させて、図２Ｂに示す。ウェルの壁は、コポリエステルで構築されており、ウェルの底部には、実施例１及び２に記載のＰＬＧＡ膜を含めた。

【0091】

ＰＬＧＡ膜を、シングルウェル細胞培養インサート（ＣＣＩ）に取り付けた。下部隆起部（厚さ＝０．９ｍｍ、外径（ＯＤ）＝１３ｍｍ、内径（ＩＤ＝８．８ｍｍ）は、ＡＢＳ材料から３Ｄ印刷した。これらの下部隆起部は、個々の細胞培養インサート（ＣＣＩ）の下面に取り付けるように設計した。生体適合性接着剤を使用して、下部隆起部をＣＣＩの底部に取り付けた。微多孔ＰＬＧＡ膜の下部隆起部及び底面をＣＣＩに取り付けて、高さ０．９ｍｍ、幅８．８ｍｍのウェルを形成し、これを使用して微多孔膜の下面に細胞を播種し、膜の頂面及び底面に細胞が成長する仕組みを提供した。

【0092】

実施例４．生分解性膜及び下部隆起部を有する９６ウェルプレート
金型を製造し、図６Ａ～６Ｂに示すとおり、ウェルの底部に先細り状のウェル及び開口を有する９６ウェルプレートを射出成形（ポリスチレン）した。プレートの製造は、次のように進めた：

【0093】

ＰＬＧＡ膜のシート（８２×１２４ｍｍ）を、生体適合性接着剤を使用して成形部品に取り付けた（図７Ａ）。

【0094】

Ｋｋｍｏｏｎ（ＮＥＪＥ Ｍａｓｔｅｒ ２）２０Ｗのレーザー彫刻機、５．５Ｗ出力を使用して、ウェル間の過剰膜を除去した（図７Ｂ）。

【0095】

高さ０．９ｍｍの下部隆起部の相互連結シート（マトリックス）を３Ｄ印刷（ＡＢＳ）し、生体適合性接着剤を用いてＣＣＩＰの下面に取り付けた（図８Ａ）。

【0096】

下部隆起部間の相互連結は、メスを用いて手動により除去した（図８Ｂ）。相互接続の厚さの最適化により、レーザー彫刻機を使用して、過剰膜及び相互連結の両方を除去することが可能となるものとする。

【0097】

実施例５ ３０日間の培養期間にわたる生分解性ＰＬＧＡ膜を有する９６ウェルプレートの利用
生体適合性実験を、腸細胞及び線維芽細胞を用いて、実施例３に記載のとおりに構築されたＣＣＩ及び実施例４に記載のとおりに構築されたＣＣＩＰにおいて、市販のＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＳＭＩ－２００－ＦＴ）組織モデルを培養することにより行った。標準プロトコルを使用して、全厚のＥｐｉＥｌｅｃｔｒｏｎ（商標）組織モデルを産生した。また、比較のために、市販のＳＭＩ－２００－ＦＴモデルを、非生分解性０．４μｍポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）微多孔膜を有するＣＣＩを用いて培養した。組織を市販の細胞培養培地（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＳＭＩ－１００－ＭＭ）で培養した。ＰＬＧＡ ＣＣＩ上でＳＭＩ－２００－ＦＴ組織の培養に使用した全ての方法は、以下に記載する以外は、ＰＥＴ ＣＣＩに使用した方法と同一であった。

【0098】

ＰＬＧＡ膜を用いたシングルウェルＣＣＩ及び９６ウェルＣＣＩＰでのＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織モデルの成長

【0099】

ＰＬＧＡ及びＰＥＴ ＣＣＩ及びＣＣＩＰにおける組織モデルの成長の手順は、以下のとおりであった：

【0100】

ＰＬＧＡ ＣＣＩ及び９６ウェルＣＣＩＰを細胞外マトリックスコーティングなしで使用した。標準的ＰＥＴ ＣＣＩは、標準生産手順に従って、コラーゲンコーティングを行った。

【0101】

下部隆起部を有するＰＬＧＡ ＣＣＩを反転させ、１５０μＬのプレーティング培地において、７５，０００個の内皮細胞をＰＬＧＡ膜の底部側に播種した（膜の底面への播種は、下部隆起部によって可能になった）。ＰＥＴ ＣＣＩについては、ＣＣＩは直立のままであり、７５，０００個の内皮細胞をＣＣＩ内の膜の上向き側に播種した。下部隆起部を有するＰＬＧＡ ９６ウェルＣＣＩＰを反転させ、３０μＬのプレーティング培地中の１５，０００個の内皮細胞を、ＰＬＧＡ膜の底面に播種した。

【0102】

内皮細胞を播種したＰＬＧＡ及びＰＥＴ ＣＣＩを、「標準培養条件」（３７℃、５％ＣＯ_２）下で２時間インキュベートした。

【0103】

２時間後、内皮細胞を含むＰＬＧＡインサートを、直立位置に入れた。プレーティング培地中の腸線維芽細胞と上皮細胞との４００μＬの播種混合物を、ＰＬＧＡ及びＰＥＴ ＣＣＩの両方に添加した。

【0104】

ＣＣＩ及びＣＣＩＰを、標準培養条件下で、（ＣＣＩの側底部側（膜下）にプレーティング培地５００μＬを用いて及び膜上側に播種混合物４００μＬを用いて、一晩深部培養した。９６ウェルＣＣＩＰでは、膜の上側に８０μＬの播種混合物を加えた。

【0105】

積み重ね式９６ウェルＣＣＩＰを、標準培養条件下で、プレートの側底部側（膜下）に３００μＬのプレーティング培地／ウェルを用いて、膜の上側に８０μＬの播種混合物を用いて、一晩深部培養した。

【0106】

深部条件下で一晩培養後、基底上層培地を穏やかに吸引し、組織の基底上層表面をインキュベータ内の雰囲気に曝露した。ＣＣＩには５．０ｍｌのＳＭＩ－１００－ＭＭ培地を、積み重ね式ＣＣＩＰには２７５ｕｌ／ウェルを使用して、組織を側底部側からのみ供給した。この方法は、気液界面（ＡＬＩ）での培養と称する。

【0107】

組織は、気液界面（ＡＬＩ）において、標準培養条件下で合計１２日間培養した。この期間の間、ＳＭＩ－１００－ＭＭ培地は、隔日、５．０ｍＬまたは２７５μｌの新しいＳＭＩ－１００－ＭＭ培地と交換した。

【0108】

培養期間の１３日目（１日目は、深部培養させ、１２日目はＡＬＩ）に、組織は、１０％ホルマリンを用いて固定し、組織のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された断面を生じさせるために標準組織学的手法を使用した。

【0109】

結果
ヒト小腸外植片と共に、生分解性ＰＬＧＡ及び非生分解性ＰＥＴ膜上で培養されたＥｐｉＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ（商標）組織の組織学を図３Ａ～３Ｃに示す。下部隆起部を有するエレクトロスパンＰＬＧＡ膜ＣＣＩを使用して、十分に発達した絨毛を有する十分に分化した層状腸組織が観察された（図３Ａ）。１３日の培養期間後、三次元組織は、ヒトの外植体組織と同様に、基底上層組織表面に大量の絨毛を伴う腸管構造を呈した（図３Ｃ）。したがって、この１３日間の実験では、ＰＬＧＡ膜で構築されたＣＣＩインサート及び下部隆起部は、生体適合性である。ＰＥＴ ＣＣＩ（図３Ｂ）では、絨毛長は短く、組織構造は、小さかった。

【0110】

１３日より長い培養実験では、Ｈ＆Ｅ染色された断面において、ＰＬＧＡ膜の分解が顕微鏡下で観察された。図４Ａ～４Ｂに示す実験では、培養期間の１３日目（図４Ａ）に、連続的で小さい膜が観察された。しかし、１７日目（図４Ｂ）では、膜は、明確には画定されず、伸張／拡張されるように見え、１３日目よりも空胞を含んでいた。図５Ａ～５Ｂに示す実験では、１３日目（図５Ａ）に、膜は連続的であったが、図４Ａの１３日目に示した膜よりも明確には画定されていなかった。しかし、２１日目（図５Ｂ）には、膜は、隔離された領域でのみ観察され、ある領域では、基底組織層の下方でのみ細胞が観察される程度まで分解された。２１日を超えて拡張された培養では、ＰＬＧＡ含有ＣＣＩ中では、組織はいずれも損傷を受けないままであった。これらの培養結果は、実施例２に記載のとおり、引張強度実験におけるこれまでの観察に近似するものであるが、培養条件下では、膜の分解は、わずかに速いと考えられる。

【0111】

膜の分解が始まると、膜の頂上に播種した表面細胞と、膜の底部に播種した底部細胞とが接触した。

【0112】

実施例６ ＰＬＧＡ膜で構築されたＣＣＩ及びＣＣＩＰの蛍光色素適合性
一般的に使用されている蛍光色素を用いて、実施例３に記載のとおり、ＰＧＬＡ膜と組み立てられたＣＣＩ及びＣＣＩＰの適合性を調査するために実験を行った。標準プロトコルを用いて、全層厚の腸組織であるＳＭＩ－２００－ＦＴを作製した（詳細な方法については実施例４を参照）。組織を７日間、１３日間及び１７日間培養した。組織を固定し、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色して、組織の形態を観察した。

【0113】

切片を、脱パラフィンし、以下の蛍光標識抗体で染色した：ａ）サイトケラチン（ＣＫ－１９）に対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗体、小腸組織の上皮マーカー（緑色）、ｂ）ビメンチンに対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５コンジュゲート抗体、線維芽細胞のマーカー（赤）；及びｃ）核染色４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ＤＮＡ内のアデニン－チミンリッチ領域に強く結合する蛍光染色（青）。

【0114】

組み立てられたＣＣＩ及びＣＣＩＰと一般的に使用されている蛍光プローブとの適合性は、免疫染色により実証された。全ての画像は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡で１０倍対物レンズを使用して収集した。励起波長は以下のとおりである：ＤＡＰＩ：４０５ｎｍ、ＦＩＴＣ：４７３ｎｍ、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、５６１ｎｍ。ＰＬＧＡ膜からの自家蛍光／干渉は観察されなかった。したがって、標準免疫染色技術では、ＰＬＧＡ膜を使用して産生された組織を使用することができる。

【0115】

Ｈ＆Ｅ染色された断面と免疫染色された断面との比較により、興味深い観察結果が得られた。１３日目の培養に対して、１７日目のＨ＆Ｅ染色された断面に基づくと、絨毛は、分解されたかまたは喪失したように見えた。しかし、免疫染色した断面では、サイトケラチンが存在する絨毛が、１７日目でもまだ非常に多いことが示された。

【0116】

実施例７ポリカーボネート（ＰＣ）膜を用いた９６ウェルインサートプレート上での、腸内皮細胞、線維芽細胞、及び上皮細胞を含む腸組織モデルの成長
腸組織モデルを以下のように調製した：

【0117】

１．細胞外マトリックスコーティングなしでＰＣ９６ウェルインサートプレートを使用した。

【0118】

２．７５，０００個の内皮細胞を含む１５０μＬのプレーティング培地を、ＰＣ９６ウェルインサートプレートのウェルに播種した（すなわち、細胞を頂部膜表面上に播種した）。

【0119】

３．内皮細胞を播種した９６ウェルのＰＣインサートプレートを、標準培養条件（３７℃、５％ＣＯ_２）下で２時間インキュベートした。

【0120】

４．２時間後、プレーティング培地中の腸管線維芽細胞と上皮細胞との４００μＬの播種混合物を、ＰＣ９６ウェルインサートプレートのウェルに添加した。

【0121】

５．ＰＣ９６ウェルインサートプレートを、標準培養条件下で一晩深部培養した（膜の側底部側にプレーティング培地３００μＬを用い、膜の頂面に播種混合物１５０μＬを用いた）。

【0122】

６．深部培養条件下で一晩培養後、頂部培地を穏やかに吸引した。この組織を側底部側から、３００μＬのＳＭＩ－１００－ＭＭ（ＭａｔＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、かつ膜の頂面に２０μＬのＳＭＩ－１００－ＭＭを供給した。この方法は、気液界面（ＡＬＩ）での培養と呼ばれる。

【0123】

７．組織をＡＬＩで標準培養条件下で合計１３日間培養した。この期間にわたって、ＳＭＩ－１００－ＭＭ培地を、膜の側底部側及び頂面にそれぞれ、３００μＬ及び２０μＬのＳＭＩ－１００－ＭＭの新鮮培地と隔日で交換した。

【0124】

８．培養期間の１４日目（１日目は、深部培養させ、１３日目はＡＬＩ）に、組織は、１０％ホルマリンを用いて固定し、組織のヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された断面を生じさせるために標準組織学的手法を使用した。

【0125】

結果を図１８Ａ～１８Ｄに示す。

【0126】

理解の明瞭化ために図示及び実施例を用いてある程度詳しく前述の発明を記載しているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の範囲及び改変をそれに対してなし得ることが、当業者には容易に明らかであろう。したがって、この説明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【0127】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のため、また個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A-1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A-6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C-9D】

【図10】

【図11A-11B】

【図11C-11D】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【国際調査報告】